GENÉTICA MOLECULAR

Matilde Monteiro
Índice
Nota Introdutória.....................................................................................................................................................................................3

T1 – Evolução histórica e introdução à Genética...........................................................................................................................4

T2 – Estrutura DNA....................................................................................................................................................................................6
T3 - Análise e Localização de Ácidos Nucleicos e Proteínas...................................................................................................13
T4 – Genoma Humano...........................................................................................................................................................................23
T5 - Substrato da Informação Genética: Aplicações Tecnológicas.......................................................................................27
T6- Replicação do DNA.........................................................................................................................................................................33
T7 - Técnicas de Diagnóstico em Genética Molecular I - Clonagem e PCR......................................................................43
T8 - Técnicas de DNA Recombinante.............................................................................................................................................54
T9 – Técnicas de Diagnóstico em Genética Molecular II - Sequenciação.........................................................................60
T10 – Introdução à Bioinformática....................................................................................................................................................72
T11 – Reparação de DNA......................................................................................................................................................................78
T12- DNA: Recombinação e transposição......................................................................................................................................88
T13- Instabilidade genómica e doenças associadas................................................................................................................101
T14- Técnicas de Diagnóstico em Genética Molecular III - MLPA e Microarrays........................................................107
T15 – Transcrição: RNA mensageiro..............................................................................................................................................114
T16 – Domínios funcionais de proteínas......................................................................................................................................129
T17 - Transcrição: RNA Ribossomal e de Transferência.........................................................................................................134
T18 – Núcleo Celular............................................................................................................................................................................148
T19 – Tradução......................................................................................................................................................................................162
T20- Epigenética...................................................................................................................................................................................178
T21 Desregulação da expressão (epi)genética na doença.....................................................................................................180
T22- Métodos de estudo do epigenoma.....................................................................................................................................184
T23 – Manipulação genética.............................................................................................................................................................187
T24- Mecanismos de silenciamento genético............................................................................................................................196
T25- Terapias genéticas......................................................................................................................................................................199
T26- Aplicações das tecnologias de análise genética em diagnóstico-Teste Genético de pré
implantação............................................................................................................................................................................................205
T27- Medicina Genómica..................................................................................................................................................................209

Matilde Monteiro 2
 Nota Introdutória

A presente sebenta é referente à unidade curricular Genética Molecular, lecionada na

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, no primeiro ano curricular, e tem como objetivo
reunir a informação teórica relativa a esta UC.

De forma a realizar um estudo mais completo, esta pode ser complementada com a consulta da
bibliografia recomendada, da sebenta das desgravadas de Genética Molecular e dos powerpoints
disponíveis no moodle.

Esta sebenta foi revista pela Comissão de Curso 2017/2023, no ano de 2018.

Votos de muito sucesso,

Comissão de Curso 17/23

NOTA ADICIONAL:
No âmbito da renovação da unidade curricular Genética Molecular, do primeiro ano curricular, o
Departamento de Estudos da Comissão de Curso de 21/27 reformulou a sebenta com novas aulas teóricas e
foi adicionada informação às já existentes, com base nos ppts fornecidos pelos docentes. Qualquer erro ou
dúvida que surja podem enviar email para ccfmup2127@gmail.com.

Votos de sucesso,
CC 21/27

Matilde Monteiro 3
 T1 – Evolução histórica e introdução à Genética

História recente da Genética aplicada ao Homem

1) Até 1959: definição de doenças hereditárias de tipo mendeliano, bioquímica do

metabolismo, descrição de malformações congénitas, antropometria e grupos
sanguíneos.
Em 1953, foi definida a estrutura física do DNA (James Watson e Francis Crick) e, em 1956,
foi determinado o número normal (46) de cromossomas na espécie humana (desde os
anos vinte que se pensava que as células humanas tinham 48 cromossomas).
2) Década de 60: cariótipo e definição das grandes cromossomopatias, estudo de enzimas
a nível celular, hereditariedade multifactorial, primeiro diagnóstico pré-natal
cromossómico e aconselhamento genético.
3) Década de 70: polimorfismo cromossómico e génico, localização de genes, genética de
populações e estudo dos efeitos ambienciais, fertilização "in vitro".
4) Década de 80: terapêutica genética por dieta, terapêutica profilática, amplificação de
pequenas sequências de DNA por “polymerase chain reaction” (PCR)
5) Década de 90: introdução da hibridização in situ de fluorescência (FISH) para o estudo
citogenético, intervenção médica e cirúrgica sobre o embrião e o feto, microinjecção
intracitoplasmática de espermatozóide, diagnóstico genético pré-implantação, projecto
do genoma humano.
6) 1ª década do séc. XXI: publicação da sequência completa do genoma humano, rastreio
prenatal de trissomia 21 em DNA fetal livre na circulação materna, sequenciação total do
genoma de um indivíduo, desenvolvimento das técnicas de “array Comparative Genomic
Hybridization” (aCGH) e sequenciação automática de nova geração.

Farmacogenómica - desenvolvimento de novos fármacos baseado no conhecimento do genoma

humano

Patologias genéticas

1) Monogénica (mendeleana) - o marco histórico que estabeleceu pela primeira vez a

relação entre uma doença humana e as leis da hereditariedade publicadas por Mendel
em 1865 é da autoria de Archibald Garrod que, em 1902, propôs uma transmissão
recessiva para a alcaptonúria. O catálogo de Victor McKusick (Mendelian Inheritance in
Man), publicado pela primeira vez em 1966, com uma lista de 1.368 doenças de
transmissão autossómica e 119 transmitidas pelo cromossoma X, tornou-se acessível via
Internet – Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), contém actualmente 23.145
entradas, das quais 21.777 são autossómicas, 1.243 são ligadas ao cromossoma X, 59 ao
cromossoma Y e 66 ao genoma mitocondrial.

2) Cromossómica - em 1959 foi definida a etiologia cromossómica do síndrome de Down

(por Lejeune et al.), 93 anos após o médico britânico Langdon Down ter publicado uma
classificação de atraso mental, que subdividiu em tipos raciais: caucasiano, etíope, malaio
e mongolóide.

Matilde Monteiro 4
 3) Multifactorial - resulta da interacção de um ou mais genes com um ou mais factores
ambienciais. As causas multifactoriais estarão na base de cerca de metade de todas as
malformações congénitas e serão relevantes em muitas doenças crónicas da idade adulta
(ex: doenças cardiovasculares, como a hipertensão arterial e a oclusão das coronárias,
diabetes, artrite reumatóide, psicoses e demências senis). Esta etiologia multifactorial
contribuirá também para diversas alterações psicológicas da infância, incluindo dislexia
(5 a 10% da população), anomalias específicas da linguagem (5% das crianças) e
alterações da atenção, por falta ou hiperactividade (4 a 10% das crianças).

4) Somática (adquirida ou cumulativa) - causada pelos efeitos aditivos de múltiplas

mutações em diferentes genes (ex: cancro, doenças autoimunes, endometriose).

5) Mitocondrial - doenças causadas por mutações que ocorrem no cromossoma

mitocondrial (ex: neuropatia óptica hereditária de Leber, retinite pigmentosa,
encefalomiopatia mitocondrial), cuja manifestação pode ser extremamente variável
devido ao fenómeno de heteroplasmia (a presença de mais do que uma população de
DNA mitocondrial num indivíduo, resultante de uma ou mais mutações; a homoplasmia
ocorre quando todas as cópias de DNA mitocondrial são normais ou mutadas).

Para as doenças mitocondriais haverá um “efeito limiar”, isto é, o nível da quantidade de

mitocôndrias com DNA mutado a partir do qual a doença se manifesta. Este limiar varia em função
do tecido e da mutação mas, em geral, andará pelos 60-90%.

Prevenção da transmissão de doenças mitocondriais pela “doação de mitocôndrias”, através da

técnica de transferência nuclear: o núcleo de cada ovócito doado é retirado para ser substituído
pelo núcleo (normal) da mulher que tem as mitocôndrias com o ADN anormal. Esta técnica
permite que o indivíduo resultante contenha a informação genética dos núcleos do pai e da mãe
(que têm mais de 99,99% dos genes) e o citoplasma da dadora (onde se encontram as
mitocôndrias normais).

Matilde Monteiro 5
 T2 – Estrutura DNA

Watson e Crick – Descreveram a estrutura do DNA

DNA (ácido desoxirribonucleico)

• Estrutura em dupla hélice;

• Existente em todas as células;
• Armazena informação genética em todos os
seres vivos;
• Macromolécula constituída por nucleotídeos.

Nucleotídeos (desoxirribonucleotídeos):

o Desoxirribose – pentose (5C) (o açúcar)

o Base azotada (associada ao grupo hidróxilo do C1 do açúcar)
§ Pirimídicas (1 anel azotado – nucleotídeos mais
pequenos)
• Timina
• Citosina
§ Púricas (2 anéis azotados – nucleotídeos maiores)
• Adenina
• Guanina
o Grupo fosfato
§ Nucleotídeos mono, di ou trifosfatados
§ Quando integrados no DNA mantêm só 1 grupo
fosfato

Nucleosídeos – associação entre o açúcar e a base azotada

Ligações fosfodiéster – ligações covalentes (enzima); liga os nucleotídeos entre si na molécula

de DNA; constituída por duas ligações fosfoéster que se estabelecem entre o C3 (3’) de uma
desoxirribose ao C5 (5’) de outra.

• Por convenção, descreve-se a sequência de nucleotídeos numa molécula de DNA a

partir do nucleotídeo que tem livre o seu carbono 5’ (ligado somente ao grupo fosfato)
no sentido daquele que tem livre o grupo hidroxilo no carbono 3’.

Matilde Monteiro 6
Cadeia dupla de DNA – duas cadeias simples de DNA
ligam-se entre si, orientadas de uma forma antiparalela
(uma em 5’-3’ e outra em 3’-5’), através de pontes de
hidrogénio (interações mais fracas, não necessitam de
intervenção enzimática para serem quebradas) entre as
bases azotadas:

• Adenina e Timina – Duas pontes de hidrogénio

• Citosina e Guanina – Três pontes de hidrogénio

Nota: A ponte de hidrogénio estabelece-se sempre entre uma base

pirimídica e uma base púrica, para que as dimensões da molécula não
variem muito. As bases ficam sempre voltadas para o centro da cadeia
dupla de DNA.

Dupla Hélice de DNA – estrutura mais estável para a molécula; enrola-se

sobre si própria; cada volta completa contém 10,1 pb (3,5 nm de
comprimento; 0,35 nm de espessura)

• Exterior - duas cadeias açúcar-fosfato (Backbone); Interior -

bases azotadas.

Sulcos – regiões em que os pares de bases ficam expostos à superfície da molécula; permite o
reconhecimento por proteínas da sequência de nucleotídeos dessa região de DNA, sem
necessidade de abrir a dupla cadeia.

Ø Sulco maior – major groove

Ø Sulco menor – minor groove

Estruturas do DNA

1. B DNA – mais comum; hélice rodada para lado

direito
2. A DNA – mais compacta (cada volta completa
tem 11 pb); hélice rodada para lado direito;
comum em condições desidratadas
3. Z DNA – hélice rodada para lado esquerdo;
não se sabe qual o seu significado; células com
infeção vírica

Efeito velcro – conjunto de interações fracas (pontes de hidrogénios) resultam numa ligação forte,
permitindo que o DNA seja uma molécula bastante estável

Matilde Monteiro 7
Desnaturação do DNA

• Separação da dupla cadeia em duas cadeias simples

• Permite o acesso à sequência de nucleotídeos (em
laboratório, só é possível fazê-lo em cadeias simples) que
codifica a função daquela região de DNA
• Métodos que destabilizem as ligações por pontes de
hidrogénio:
1. Elevação da temperatura a >85-90ºC
2. Soluções com valores extremos de pH
3. Soluções concentradas de formamida ou ureia
4. Soluções com baixa força iónica (poucos iões)

Renaturação do DNA

• Reforma-se a dupla hélice

• Redução lenta da temperatura de 90ºC para 65ºC
• Volta exatamente à estrutura que tinha inicialmente

Tudo aquilo que altere as cargas externas ou que interaja com os resíduos de ácido fosfórico
vai alterar as características da desnaturação da molécula de DNA.

Monitorização da desnaturação de DNA por espectrofotometria a 260 nm- pico de absorção

• Cadeias simples de DNA - valores de absorvância elevados;

• Cadeias duplas de DNA – valores de absorvância baixos;
• Temperatura de desnaturação / de melting - à medida que se eleva a temperatura,
verifica-se uma variação muito grande da absorvância;

A temperatura de desnaturação varia conforme a composição de DNA

• Alta percentagem de pares C-G – ligadas por 3 pontes de hidrogénio – necessário

fornecer mais energia para quebrar ligações – temperatura de melting mais elevada
• Alta percentagem de pares A-T – ligadas por 2 pontes de hidrogénio – necessário fornecer
menos energia para quebrar ligações – temperatura de melting mais baixa

Nota: A partir de uma temperatura de meltiSCDIng de uma molécula de DNA com tamanho
conhecido, podemos estimar a percentagem de pares A-T e C-G, no entanto não nos dá qualquer
informação acerca da sequência de nucleotídeos.

Matilde Monteiro 8
Localização do DNA na célula

• Em interfase – núcleo contém a maior parte do DNA

• Em divisão celular – com a desagregação do invólucro nuclear, os cromossomas de DNA
encontram-se condensados na célula

Nota: Nas células eucarióticas, as mitocôndrias contêm uma pequena percentagem de DNA, sob
a forma de uma molécula circular (prova da possível origem bacteriana deste organelo)

Territórios cromossómicos – cada cromossoma ocupa uma região restrita no núcleo celular

Cromatina – associação do DNA a proteínas

• Heterocromatina – DNA mais condensado; mais eletronodenso (em TEM) e mais corado
(em ML)

o Perinuclear à periferia do núcleo

o Perinucleolar à periferia do nucléolo

Região transcricionalmente inativa (inacessível a enzimas – estas não leem a sequência de

nucleotídeos e não se forma RNA)

• Eucromatina – DNA menos condensado; menos eletronodenso (em TEM) e menos corado
(em ML)
Região transcricionalmente ativa (acessível a enzimas)

No núcleo, nem todos os cromossomas

se encontram descondensados, têm
regiões que estão mais condensadas e,
por isso, menos ativas, mas não existe
um afastamento muito grande de todo o
cromossoma de uma determinada área.

Nucleossoma – estrutura primária de condensação do DNA; formado por

• Octâmero de histonas (proteínas básicas interagem com o

DNA ácido – este enrola-se à sua volta)
o H3-H4 (duas de cada) Formam um cilindro baixinho

o H2A-H2B (duas de cada) constituído por 8 subunidades.

• Fibra de 10 nm – DNA enrolado nas histonas, visível numa solução hipotónica, com 147
nucleotídeos o Esta começa a fazer um ziguezague e os octâmeros de histonas começam
a empilhar entre si, formando duas pilhas mais ou menos paralelas que espiralam um

Matilde Monteiro 9
 pouco, rodando para o lado esquerdo, formando NUCLEOSSOMAS, que distam entre si
cerca de 200 pares de bases:

• Fibra de 30 nm - formada por duas colunas de

nucleossomas empilhados, enroladas numa dupla hélice
orientada para a esquerda, conforme
demonstração experimental por cristalografia de raio X

• Histona H1 – bloqueia a formação de cada nucleossoma

• DNA linker – 10 a 90 nucleotídeos entre cada dois

nucleossomas;

DNA linker + 147 nucleotídeos em cada nucleossoma (duas

voltas de DNA em torno das histonas) = Cerca de 200
nucleotídeos de distância entre cada 2 nucleossomas.

[Se não percebeste vai ao final da página 13 da sebenta das

desgravadas]

Código das histonas

• Modificações pós-traducionais das histonas em diferentes regiões da cromatina, devido

à ligação de moléculas aos aminoácidos dos prolongamentos que se estendem do
nucleossoma ( no terminal amina e carboxilo)
• Influencia a função das histonas em diferentes regiões do genoma e o grau de
condensação da cromatina
o Acetil transferase de histonas (transferem grupos acetil-
Acetilação)/Desacetilases de histonas
o Metiltransferase de histonas (transferem grupos metil-
Metilação)/Desmetilases de histonas (Desmetilação)
o Fosforilação

o Ubiquitinação

Acetilação de histonas – mais abundante na eucromatina-

provoca a descondensação da cromatina (nucleossomas
separados uns dos outros), permitindo o acesso de enzimas
de transcrição aos nucleossomas – regiões de transcrição
ativa

Sirtuinas – desacetilase de histonas, promovendo a

compactação da cromatina, dependentes de NAD+ (cofator
para remover grupos acetil)

Matilde Monteiro 10
Curiosidade: A Sirtuina 1 é ativada por um composto que existe na uva e no vinho que é o
resveratrol. Este origina uma reprogramação da expressão genética, passando as células a
apresentar um perfil genético correspondente a um animal muito mais jovem.

Estes são mecanismos epigenéticos de regulação da expressão genética, porque apenas alteram
o grau de modificação das histonas, sem haver alterações da sequência de nucleotídeos.

Metilação de histonas- mais abundante na heterocromatina:

• Provoca a condensação de cromatina (nucleossomas interagem entre si e ficam mais

compactados), inibindo o acesso de enzimas de transcrição aos nucleossomas – regiões
de transcrição inativa
• Estas histonas adquirem a capacidade de se ligar à:
• Enzima HP1 (heterocromatine protein 1)
o Liga-se às histonas metiladas o Tem capacidade de oligomerização – liga-se entre si,
criando complexos nucleoproteicos (complexos de nucleossomas com histonas
metiladas)
o Liga-se à metiltransferase H3K9 – promove a metilação de outras histonas ligadas aos
nucleossomas, propagando a formação da heterocromatina em cadeia
o Atua até ao aparecimento de uma sequência de barreira que bloqueia a metilação
das histonas.

SMC (structural maintenance of chromosome)

Ø Estrutura proteica na região central do
cromossoma
Ø Condensina – argolas proteicas interlaçadas entre
sique intervém na condensação dos
cromossomas;
Ø A fibra de DNA passa pelo meio destas argolas,
não se ligando diretamente
Ø Mantém as moléculas de DNA unidas os
cromossomas durante a mitose

Organização do DNA nos cromossomas metafásicos

Ø Nucleossomas com diâmetro de 10 nm enrolam-se entre si para formar a fibra de 30 nm

Ø Esta forma ansas que se unem nas bases por intervenção do SMC
Ø Permitindo a formação dos braços dos cromossomas, com cerca de 500-750 nm de
diâmetro

Matilde Monteiro 11
Centrómero – Constrição primária (ao nível da qual os dois
cromatídeos se mantêm unidos

Telómeros – Extremidades dos braços

Cariótipo - Diagrama organizado dos cromossomas metafásicos de uma espécie; corresponde ao

número de moléculas de DNA que temos nas células (46 nos seres humanos)

O número de cromossomas não está relacionado com o nível de complexidade do ser vivo.

Matilde Monteiro 12
 T3 - Análise e Localização de Ácidos Nucleicos e Proteínas

Moléculas de DNA - carregadas negativamente devido à presença dos ácidos fosfóricos, tendo
todas uma densidade de carga idêntica

• Quanto mais longa a molécula de DNA, maior é o número de cargas negativas

Eletroforese – técnica que consiste em aplicar corrente elétrica de forma a separar as moléculas
de DNA em função do seu tamanho (massa molecular); o campo elétrico criado vai ser constante
já que a forma, a carga e a densidade de carga das moléculas de DNA são idênticas para todas
elas

Gel de agarose – devido ao tamanho dos seus poros, permite a separação das moléculas de
DNA no interior da sua matriz; é relativamente espesso (8mm) e tem um aspeto translúcido

• Preparação da agarose como um líquido

• Solidificação
• Formação de uma placa de gel horizontal

Poços – espaços no gel de agarose formados com a ajuda de um molde numa das extremidades
do gel, sendo o local onde se colocam as amostras

• Aplicando corrente elétrica, as moléculas, estando carregadas negativamente, migram no

sentido do polo positivo (vermelho).
• A velocidade de migração das moléculas de DNA no gel depende do seu tamanho
Quanto menores forem as moléculas, mais rapidamente migram

Padrão de massas moleculares – permite saber o tamanho aproximado das moléculas de DNA da
amostra, já que é uma mistura de vários fragmentos de DNA de massa molecular conhecida

Corante de DNA – necessário de modo a ver as moléculas de DNA no

interior do gel

• Brometo de etídio - fluorescente quando irradiado com

ultravioletas; coloração alaranjada; muito perigoso é
carcinogénico (intercala-se entre as bases de DNA das nossas
células se contactar com a pele)
• Corante Inócuo – Safe green- Corante fluorescente com coloração
verde; não é perigoso.

Matilde Monteiro 13
Medição rigorosa da massa molecular das bandas

• Construção um gráfico
• Eixo das abcissas - distância migrada pelas diversas bandas do padrão
de massa molecular
• Eixo das ordenadas - o logaritmo da massa molecular
• Criação da curva da distância migrada em função do log da massa
molecular

Para determinar a massa molecular de uma banda da amostra:

• Medição da distância migrada

• Interpolação no gráfico
• Obtenção do logaritmo na base de 10 da massa molecular
• Cálculo do antilogaritmo

Gel de poliacrilamida – permite separar moléculas de DNA mais pequenas e com

massas moleculares muito próximas (diferenciando de poucos nucleotídeos)
devido aos poros de tamanho mais reduzido

• Utilizado nas primeiras sequenciações

Eletroforese capilar – técnica de sequenciação mais recente

Enzimas de restrição – endonucleases que permitem cortar moléculas

de DNA de modo não aleatório

• Existem naturalmente em bactérias (EcoR1 existe na E. coli, a

HInd3 existe no haemophilus influenzae)
• Têm sequências de reconhecimento específicas
• Cortam de maneiras diferentes
HPA1 EcoR1
Corta a dupla Corta deixando 2
cadeia sem deixar extremidades
sequências coesivas, de cadeia
coesivas simples

• Importantes na fragmentação da molécula de DNA e em

técnicas de DNA recombinante

Matilde Monteiro 14
Desnaturação do DNA - quebra das pontes de H que mantêm as
duas cadeias simples ligadas

• Elevação da temperatura

Hibridização do DNA – ligação de uma cadeia simples de DNA por

pontes de H com outra de sequência complementar, voltando-se a
formar a dupla hélice

• Diminuição gradual da temperatura

Sondas – oligonucleotídeo de DNA que é complementar à

sequência de interesse, sendo marcado com algo que o torne visível

• Permite determinar a existência da molécula de interesse

• Podem-se formar conjuntos complementares DNA/DNA,
DNA/RNA ou RNA/RNA
• Devem ser suficientemente específicas e com cerca de 100pb de modo a não ser
demasiado difícil a sua manipulação

Southern-blotting – transferência de moléculas de DNA separadas por eletroforese de dentro dos

poros de gel de agarose para a superfície do filtro (membrana de nitro celulose ou de nylon);

Ø Transferência - elétrica ou passiva

• Montagem do sistema
o Peso em cima
o Papel
o Filtro
o Gel de agarose
o Solução condutora de corrente elétrica (com sal)

• Desnaturação do DNA – permite a hibridação com a sonda

Matilde Monteiro 15
 • Obtêm-se moléculas de DNA na superfície da membrana, estando acessíveis à ligação
pela sonda

Marcação das sondas

1. Radioativamente (com radioisótopos)

2. Com grupos fluorescência (fluoresceína-FITC, rodamina)
3. Com grupos químicos - detetados com anticorpos/enzimas de modo a obter produto corado
(digoxigenina, biotina)

Autoradiografia - método que permite detetar radioisótopos

• Radioisótopos - átomos radioativos não visíveis, mas que

emitem radiação em todas as direções (desintegração
radioativa)
• Emulsão fotográfica – camada de gelatina com sais de
brometo de prata que recobre o radioisótopo,
transformando-se em prata metálica (visível à superfície
da membrana)
• Fósforo radioativo – radioisótopo mais utilizado para
marcar as sondas; perigoso porque emite radiações muito
energéticas; tempo de semivida não muito longo (17 dias)

Anemia falciforme - doença grave em que os eritrócitos ganham precocemente uma forma não
funcional (forma de foice)

• Deve-se à mutação dum único nucleotídeo no gene que codifica a cadeia beta da
hemoglobina
• Há uma adenina que surge mutada e é substituída por uma timina
• Perda da sequência de restrição identificada pela enzima de restrição MST2

Diagnóstico da anemia falciforme

1. Isolamento do DNA
2. Digestão com a enzima MST2
3. Eletroforese
4. Southern-blotting
5. Identificar com sonda complementar à sequência normal
o Indivíduo normal - hibridização com uma banda de 1,1 kbase
o Indivíduo mutante – hibridação com uma banda de 1,3 kbase (faltou o local de corte
da enzima)

Matilde Monteiro 16
Hibridação in situ - técnica que permite localizar uma determinada sequência de ácidos nucleicos
diretamente no tecido, através de sondas marcadas que hibridam com o DNA/RNA de interesse:

• Cromossomas - após desnaturação do DNA

• Moléculas específicas de RNA

o Determinar os níveis e padrão de expressão destes RNA’s

o São necessárias condições muito favoráveis visto que o RNA é uma molécula muito frágil,
que se degrada muito facilmente

É necessário fazer uma desnaturação prévia do DNA e depois colocar a sonda em contacto com
este.

Cromossome painting – técnica em que se usam sondas fluorescentes com cores diferentes para
identificar várias regiões cromossómicas em metáfase

• FISH - Fluorescence in situ hybridization o

Sonda marcada com dioxigenina, que é
uma molécula que não existe na célula, que
depois é identificado com ajuda de um
anticorpo específico.
o Exemplo: Presença de telómeros,
centrómeros e de outras
sequências ao longo dos
cromossomas

Northern-blotting - transferência de moléculas de RNA separadas por eletroforese de dentro dos

poros de gel de agarose para a superfície do filtro (membrana de nitro celulose ou de nylon)

• Também podem ser identificadas com ajuda de sondas complementares, permitindo

assim identificar diferentes sequências de nucleotídeos em moléculas de RNA

Matilde Monteiro 17
Proteínas – classe quimicamente mais heterogénea de polímeros de 20 aminoácidos diferentes

• Diferentes conformações;
• Cargas distintas (dependendo da carga do ser terminal amino, do terminal carboxílico e
de outros grupos dos aminoácidos)

SDS-PAGE (Dodecilsulfato de sódio - Eletroforese em gel de poliacrilamida)

Dodecilsulfato de sódio (SDS) - detergente iónico desnaturante com carga negativa (a pH 7) de

modo a eliminar as variáveis carga e forma

• Uma molécula de detergente por ligação peptídica

• A sua carga negativa repele a da proteína, desnaturando-a (linearizam)
Confere-lhe carga negativa

Molécula redutora - agentes redutores quebram as ligações dissulfureto (entre dois grupos –
SH) promovendo a sua linearização

• Ditiotreitol (DTT)
• β-mercaptoetanol

Após o tratamento com SDS e ditioteitrol, as proteínas ficam linearizadas e com uma densidade
de carga negativa igual para todas elas, podendo assim ser separadas somente em função do seu
tamanho (massa molecular)

Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

• Poros de tamanho adequado à separação de proteínas (criados por pente)

• Colocação das proteínas na parte superior de um gel de poliacrilamida (géis verticais)
• Aplicação de corrente elétrica
• Estando as proteínas carregadas negativamente, migram para o polo positivo em função
da sua massa molecular

Glicerol - torna a amostra mais densa para ser mais fácil colocá-la no fundo do poço

Matilde Monteiro 18
Azul de bromofenol – migra à frente das proteínas, permitindo observar a evolução da
eletroforese

Corantes

• Azul de Coomassie – corante azul que cora as proteínas separadas no gel de

poliacrilamida para serem visíveis – 100 ng/banda
• Nitrato de prata – corante mais sensível – 10 ng/banda

Cada uma das bandas azuis corresponde a uma banda de proteínas com massa molecular
diferente.

Cálculo da massa molecular

• Gráfico da logaritmo da massa molecular em função da

distância migrada pelas proteínas
• Interpolação na reta padrão da distância migrada da
proteína da amostra
• Valor do logaritmo da sua massa molecular
• Cálculo do antilogaritmo = valor da massa molecular

Soluções de aminoácidos ou de proteínas = iões

• Grupo carboxílico - carga negativa

• Grupo amina - carga positiva
• Cada proteína formada por diferentes aminoácidos - globalmente neutra

o pH inferior (maior concentração de H+) - proteína carregada positivamente

o pH superior – proteína carregada negativamente

Ponto isoelétrico – valor de Ph para o qual a proteína está globalmente neutra, sendo específico
para cada proteína

• p.i. mais baixo (ácido) – proteína com mais grupos negativos

• p.i. mais alto (básico) – proteína com mais grupos positivos

Focagem isoelétrica – técnica que permite a separação de proteínas em função das suas
características de ionização, ou seja, dos seus pontos isoelétricos

• Gradiente de pH num gel (entre 2 a 10)

• Aplicação da proteína no local mais ácido do gel
• Migração enquanto tiver carga positiva
Matilde Monteiro 19
 • Chegando ao local do ponto isoelétrico, ela deixa de poder migrar
• Se aplicarmos a proteína no extremo oposto, acontece exatamente o mesmo, ela migra
enquanto tiver carga mas, chegando ao ponto isoelétrico, deixa de migrar.

Eletroforese bidimensional – técnica em que se associa a focagem isoeletrónica à SDS-PAGE,

permitindo assim a separação de muito mais proteínas numa amostra

• Numa primeira fase – separam-se em função do ponto isoelétrico.

• Colocação sobre um gel de poliacrilamida
• Tratamento com SDS
• PAGE – separação em função da massa molecular

Western-Blotting – transferência de proteínas, que sob ação de corrente elétrica vão sempre
migar do cátodo para o ânodo, pelo que devemos orientar a membrana para o ânodo, e após
separação por SDS-PAGE, para uma membrana de alta afinidade (nitrocelulose) de modo a
determinar a existência/ausência de determinada proteína numa amostra. As proteínas na
membrana podem ser posteriormente coradas com, por exemplo, o corante Ponceau S ou podem
ser detetadas com anticorpos específicos.

Montagem do sistema - Numa cassete de plástico, colocar umas esponjas, colocar papel de filtro,
o gel, uma membrana (nitrocelulose ou nylon) em contacto com o gel, mais papel de filtro, mais
esponja, fechar a cassete e aplicar corrente elétrica
Nota: A transferência das proteínas não pode ser passiva, terá de ser sempre por aplicação de
corrente elétrica

Corante Ponceau S – corante cor-de-rosa que se liga a todas as proteínas, obtendo-se a sua
distribuição no gel na membrana de nitrocelulose

Matilde Monteiro 20
Imunocitoquímica/Immunoblotting –permite a deteção imunológica duma proteína diretamente
no seu local de expressão na célula (no tecido chama-se imunohistoquímica) - técnicas de
reconhecimento de proteínas que utilizam anticorpos após Western-blotting.

Anticorpos – têm grande especificidade para proteínas, mas, tal como as sondas, não conseguem
identifica-las dentro de um gel de poliacrilamida (necessário WB)

• Primário – vai-se ligar à proteína de interesse por ligação antigénio-anticorpo

• Secundário – muitas vezes transporta uma enzima ou uma molécula fluorescente que
depois torna visível todo este complexo (ex: fosfatase alcalina- azul; peroxídase-
castanho), sendo que o resultado final é observado após reação com substratos
adequados - vai-se ligar ao anticorpo primário porque, se estes dois anticorpos forem
produzidos em animais diferentes, o anticorpo primário vai funcionar como um antigénio
para o anticorpo secundário

Tipos de imunocitoquímica

1) Direta – utilização do anticorpo primário isoladamente, que para ser visível terá de ter
algum marcador como um fluorocromo ou alguma enzima que se faça reagir
2) Indireta – utilização de um anticorpo primário que reconhece a molécula de interesse e
um anticorpo secundário que se liga ao primário

Matilde Monteiro 21
 Ø Muito mais sensível - a razão de ligação de anticorpo secundário ao primário é
normalmente superior a 1 (a um só anticorpo primário vamos ter vários
anticorpos secundários ligados, cada um marcado com seu fluorocromo/enzima)

Enzimas – conjugadas a anticorpos, fazendo-se reagir para dar um produto de reação visível que
nos permita identificar as bandas correspondentes às proteínas de interesse

Fosfatase alcalina – produto de reação azul-escuro

Peroxidase – produto de reação castanho-escuro

Imunocitoquímica ultra-estrutural – utiliza partículas eletronodensas conjugadas aos anticorpos,

permitindo a identificação de proteínas através de TEM (ex: partículas de ouro coloidal)

Southern-blotting Northern-blotting Western-blotting

DNA RNA Proteínas

Desnaturação prévia Já estão em cadeia simples Transferência apenas por

corrente elétrica (ativa)

Sondas Sondas Anticorpos

Matilde Monteiro 22
 T4 – Genoma Humano

Genoma Humano - possui dois componentes:

• Genoma nuclear – compreende cerca de 3 biliões de desoxirribonucleotídeos divididos

por 24 moléculas lineares de DNA (componente haploide dos cromossomas da espécie
humana)

• Genoma mitocondrial – consiste numa molécula circular de DNA de cadeia dupla sem
intrões com 16 mil desoxirribonucleotídeos, presente na mitocôndria o De “herança”
materna o Código genético específico, incompatível com o código genético nuclear o
Replicação e transcrição semiautónoma o Elevada taxa de mutação (sistema de reparação
incompleto) o Não tem histonas o Todos os genes do mtDNA produzem proteínas
envolvidas na cadeia respiratória

História do processo de sequenciação do

Genoma Humano

1970 Desenvolvimento dos métodos de sequenciação

1990 Início do PGH - National Institutes of Health (NIH) e Departamento de Energia dos
Estados Unidos (USDE) juntaram-se a grupos internacionais para sequenciar os 3
biliões de bases

2001 Primeiro rascunho da sequência do genoma humano

2003 Investigadores terminam com sucesso o PGH, abaixo do orçamento e 2 anos antes do
prazo

Objetivos do projeto: (PGH)

• Mapear e sequenciar o genoma humano;

• Mapear e sequenciar o genoma de organismos modelo;
• Coleção de informação e sua distribuição
• Desenvolvimento tecnológico

Matilde Monteiro 23
Sequenciação Manual (lento...)

• Géis de Poliacrilamida
• Radioisótopos

Sequenciação Automática

• Capilar (500 bases/segundo)

Conclusões do PGH

• 1-1.5% do genoma humano são sequências

codificadoras de proteínas
• 25% do genoma humano são sequências
intrónicas
• 80-90% do genoma humano representa material genético não codificado, mas altamente
informativo
• 30% do DNA não codificado é DNA repetitivo (em tandem ou disperso), e é fundamental
para estudos de evolução
• O nº de genes humanos é muito menor do que o esperado
• Genes humanos fazem mais proteínas
o 1 gene humano → 3 transcritos diferentes
o 1 gene C. elegans → 1.3 transcritos diferentes
• A maior parte do “junk DNA” (que não é transcrito) tem uma função importante

Matilde Monteiro 24
 Sequências repetitivas existentes no genoma

-Funcionais

Famílias de genes (dispersas ou em tandem) (pseudogenes – não transcritos)

Sequências não codificantes (telómeros – repetições em tandem TTAGG)

-Não-funcionais

• DNA centromérico repetitivo – DNA satélite

• VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) minissatélites e microssatélites
• Transposões – sequências repetitivas que se podem mover de um local para outro
• Rettrotransposões – sequências de DNA que se propagam através da ação da
Transcriptase Reversa – LINES e SINES

Sequências repetitivas existentes no DNA

Transposões - elementos móveis que sofrem transposição através de intermediários de DNA

• Mecanismo “Cut and Paste”

• Mais abundante em bactérias

Retrotransposões - elementos móveis que sofrem transposição através de intermediários de

RNA

• Mecanismo “Copy and Paste” através de

enzima transcriptase reversa
• Mais abundante em eucariontes

Nota: o nº de genes não se relaciona diretamente

com a complexidade biológica!

Projeto Genoma Humano

Vantagens Desvantagens
Catálogo completo do genoma humano Custo elevado

Investigação biomédica Uso inadequado da informação genética

Estudo de patologias hereditárias Uso inadequado de terapia genética
Teste de eficácia de terapias
Uso inadequado de testes genéticos
Adaptação de fármacos a cada indivíduo

Matilde Monteiro 25
 Dogma central da biologia molecular: a síntese proteica:

Regulação da expressão génica

1) Durante a transcrição, há sequências...:

• Promotoras – locais a montante do gene (“upstream”) promovem a ligação e atuação
da enzima RNA Polimerase II (“TATA box” ou “CCAAT box” – comuns a alguns genes)
• Enhancers – modulam a ação de um promotor na transcrição; podem-se localizar
quer a montante (“upstream”) quer a jusante (“downstream”) na molécula de DNA e
por vezes em zonas afastadas do local de início da transcrição

2) Durante o processamento do mRNA

• Alternative splicing gene → diferentes mRNA's → diferentes proteínas

3) Durante o processamento proteico (modificações pós-tradução)

• Clivagem por uma enzima proteolítica
• Fosforilação
• Glicosilação

4) Epigenética
• Empacotamento da cromatina
• Modificação das histonas
• Metilação do DNA

Matilde Monteiro 26
 T5 - Substrato da Informação Genética: Aplicações Tecnológicas

• Para que nos serve a informação acerca do genoma?

• Qual é de facto o substrato da nossa informação e que tipo de variações é que nós temos
no nosso ADN?

Ser humano - cerca de 19000 genes (número muito inferior ao que era expectável)

• Material codificante - 1 a 1,5% do genoma

• Material não codificante – grande parte é repetitivo (antes considerado “junk DNA”, no
entanto mostra-se altamente informativo)

Complexidade de uma espécie - determinada não pelo número de genes que interessa, mas sim
pela forma como esses são processamos

• Os cromossomas diferem entre si no número de genes

A mutação (na sua variação patogénica) é uma alteração com uma frequência de 1% ou menos.

A maior parte dos indivíduos partilham entre si cerca de 99,9% da sua sequência de DNA, sendo
apenas 0,1% responsável por:

• Variação fenotípica
• Suscetibilidade às infeções
• Predisposição para determinadas doenças genéticas

Nota: isto significa que o conceito de raça é um conceito totalmente despropositado num
contexto genético, já que complementaridade da informação genética entre todas é enorme.

Polimorfismo (benigno) - variação natural de bases para a mesma posição no DNA, sem efeitos
adversos e com uma frequência superior a 1%

• Em sequências codificantes - variantes proteicas e fenótipos distintos

(ex.: Sistemas ABO e Rh)
• Em sequências não codificantes

• Variantes raras - frequência inferior a 1%

1) Single nucleotide polymorphisms (SNPs)

• Variações de uma única base
• Pouco polimórficos
• 1 SNP por 100-1000 pb
o Regiões não-codificantes (mais frequentes)
o Regiões codificantes

Matilde Monteiro 27
2) Minissatélites / VNTR’s (Variable Number of Tandem Repeats)
• Sequências repetitivas em tandem com mais de 5 nucleótidos na unidade de
repetição (até 100 pb)

• Muito polimórficos - alelos variam no número de repetições (elevada taxa de

heterozigotia)
• Mais comuns nas regiões subteloméricas

3) Microssatélites / STR’s (Short Tandem Repeats)

• Sequências repetitivas em tandem com 1-5 nucleótidos na unidade de repetição
• Distribuídos por todo o genoma
• Muito polimórficos – alelos variam no número de repetições (elevada taxa de
heterozigotia)
• CA mais vulgares
• Determinação do tamanho das repetições por PCR

DNA fingerprinting - técnica que permite estabelecer um padrão de DNA específico de cada
indivíduo.

• Baseia-se no estudo do número de sequências repetitivas em cada posição do

genoma, altamente variáveis na população
• Fingerprint – padrão estabelecido pela análise simultânea de várias destas regiões
repetitivas, cuja probabilidade de se repetir entre indivíduos não relacionados é quase
nula

Matilde Monteiro 28
4) Copy number variations (CNVs)

• Variações no número de cópias de grandes segmentos (200 bp a 2Mb)

• Presença ou ausência do segmento

• Presença de 0, 1, 2, 3 ou mais cópias do segmento em tandem

Mutação - alteração na sequência do DNA, associada a uma patologia e com frequências

inferiores a 1%

Espontâneas
Surgem naturalmente por falha na replicação/reparação do DNA
Causa Induzidas
Exposição a agentes mutagénicos (radiação ionizante, formaldeído,
benzeno

de Herdadas
Células da linha germinativa do progenitor (afetam todas as células)
Modo
Somáticas
aquisição
Células dos tecidos diferenciados, adquiridas ao longo da vida do
indivíduo

Em sequências codificantes
Local
Em sequências não codificantes
Wild type - Variante mais frequente
Alelos
Mutant type - Variante rara
Patologias várias
Consequências
Motor de evolução (seleção de indivíduos)

Alelos - diferentes versões de uma sequência de DNA num determinado locus

• O ser humano herda um cromossoma materno e um cromossoma paterno

• Para um determinado gene, temos dois alelos (o herdado materno e o paterno), num
determinado locus

Matilde Monteiro 29
Mutações sinónimas – Mutações no limite entre polimorfismo e alteração, mas apenas se trata de
polimorfismo se prevalecer tanto em indivíduos saudáveis como em indivíduos com a doença.

Tipos de mutações génicas

Silenciosas
Mutações Troca de base, não trocando o aa e o polipeptídeo final
sinónimas
(redundância do código genético)

Missense Não conservadoras - o novo

Codificação de aa diferente
e síntese de uma proteína
Substituição alterada (alteração de 1
única base)
Ø Transversão Ex: Anemia falciforme
Pirimidina ←→ Purina
aa é quimicamente
diferente do original
Conservadoras - o novo aa é
quimicamente parecido
com o original (a proteína
mantém alguma atividade)

Mutações Nonsense
Ø Transição não Substituição do codão mRNA resultante instável -
Pirimidina → Pirimidina sinónimas normal por um codão STOP não há tradução
Purina → Purina (3) (troca de 1
base)
Ex: Síndrome de mRNA suficientemente
Papillon-Lefevre estável - proteína truncada
(deficiência de catepsina c) não funcional

Splice site
Promotor
In-frame
Inserção/deleção de 3 ou múltiplos de 3 nucleótidos, não alterando a
reading frame. Há inserção ou deleção dos aa correspondentes, com
perda parcial de funcionalidade. Ex.: Distrofia Muscular de Becker

Frameshift
Inserção/deleção de nucleótidos (número não múltiplo de 3),
alterando a reading frame. Surge com grande frequência um codão
stop prematuro (a downstream da mutação) e, consequentemente,
uma proteína truncada (com perda da sua função biológica)
Ex.: Inserção de 4 bases – Doença de Tay-Sachs
Deleção / inserção Deleção – Distrofia Muscular de Duchenne
Grande deleção/inserção
Deleção/duplicação parcial do gene
Deleção/duplicação integral do gene
Ex.: Deleção integral – Neuropatia Hereditária co disposição para
paralisia por pressão
Duplicação integral – Doença de Charcot-Marie-Tooth do tipo 1A
Dinâmicas (inserção)
Expansão de sequências repetidas de tri-nucleotídeos (em regiões
codificantes e não codificantes) que se vão tornando mais instáveis
Ex: Doença de Huntington

Matilde Monteiro 30
Mutação splicing (splice-site)

• Alteração no local normal de splicing, ativando cryptic splice sites

• Maquinaria enzimática não distingue intrão de exão
§ Exon skipping (perda da sequência codificante)
§ Retenção da sequência intrónica
• Podem resultar em mutações frameshift
• Perda funcional

Mutação intrónica

• Uma mutação (normalmente substituição de uma base) num intrão cria locais de splicing
alternativos que competem com os locais normais durante processamento
• Perda funcional
• Exemplo: Síndrome de X Frágil

ESQUEMATIZANDO…

MUTAÇÕES:

-TIPOS: Substituição- Transcrição ou Tranversão

Inserção

Deleção

EFEITOS ESTRUTURAIS: Sinónimas

Não sinónimas: Missense- Conservadoras ou não conservadoras

Nonsense- proteína ainda funcional

Framshift: codão stop- proteina perde função

EFEITOS FUNCIONAIS: Perda de função- Hipomorfismo ou Amorfismo

Ganho de função

Dominantes negativas

Matilde Monteiro 31

Perda de função
Hipomórficas- proteína resultante Resultam
com atividade reduzida
Amórficas-proteína resultante com desenvolvimento de uma nova função
atividade nula
(alelo nulo ou amorfo)
Haploinsuficiência: em indivíduos
heterozigóticos, metade da
proteína produzida é normal e
outra metade apresenta alteração;
Recetores (ou outros limitantes)
afetados – poderão não ser
suficientes para colmatar a
atividade da célula
Enzimas afetadas- atividade
catalítica do produto do gene
normal é suficiente para levar a
cabo as reações da maioria das
vias metabólicas
Matilde Monteiro
Efeitos Funcionais das Mutações
Ganho de função
em níveis
aumentados da expressão genética ou
Não têm de conferir vantagem seletiva
ao
indivíduo
Podem estar na origem de várias
doenças (doença de
Huntington)
Predominantemente herdadas
No caso de indivíduos homozigóticos,
os efeitos no seu fenótipo são mais
severos (síndrome de
Waardenburg tipo I)
Dominante-negativa ou
antimórfica
Em indivíduos heterozigóticos a
proteína com alteração interfere
com a proteína normal
O gene mutado, no estado
heterozigótico, atua
antagonisticamente com o alelo
correspondente (sem mutação)
Atividade proteica alterada ou
inativada
É comum genes que codificam
proteínas estruturais, como o
colagénio
(Ex: Osteogenesis imperfecta)
32
 T6 – Replicação do DNA

DNA polimerases – enzimas que catalisam a replicação do DNA (síntese de novas moléculas de
DNA dentro das células); têm como funções:

• Reconhecimento da base nucleotídica

• Adição da base complementar
• Formação da ligação fosfodiéster (entre as riboses e grupos fosfato)

Replicação semi-conservativa do DNA

• Cada molécula de DNA sintetizada conserva uma cadeia simples da cadeia-mãe; a outra
é sintetizada de novo.
• Demonstrada em 1958 por Meselsen e Stahl

1) Bactérias num meio com azoto normal (azoto-14)

Ultracentrifucação contra gradiente de cloreto de césio (isolamento do DNA) - molécula
boiava relativamente próxima da superfície do tubo de ultracentrifugação
2) Bactérias num meio com azoto pesado (azoto-15)
Ultracentrifugação – molécula boiava mais distante da superfície do tubo (mais pesada).
3) Bactérias que normalmente tinham acesso a nucleotídeos com azoto-15 numa única divisão
num meio com azoto-14
Ultracentrifugação - massa intermédia entre as observadas para o azoto leve e para o azoto
pesado
• As moléculas de DNA conservaram uma cadeia simples de DNA com azoto pesado e uma
cadeia de DNA com azoto normal.

As DNA polimerases sintetizam DNA

de 5’ para 3’; são incapazes de começar
a fazê-lo do zero logo são necessárias
outras enzimas!

Matilde Monteiro 33
Forquilha de replicação - região onde a cadeia de DNA se abre para expor as bases nucleotídicas
e modo a adicionar novos nucleotídeos, formando duas cadeias novas no sentido 5’ – 3’ e de
modo assimétrico

Cadeia condutora / leading - sintetizada de forma contínua, no sentido da abertura da forquilha

(5’ – 3’);
Cadeia lenta / lagging - sintetizada de um modo descontínuo, no sentido inverso ao da abertura
da forquilha (5’ – 3’).
Primer – pequeno segmento de RNA (5 a 10 nucleotídeos) que serve como local de ancoragem
da DNA polimerase para que esta inicie a replicação

• Cadeia condutora – só um primer no início;

• Cadeia lenta - aparecem primers regularmente para que DNA polimerase prossiga a síntese
da molécula de DNA, formando os fragmentos de Okazaki entre eles

Fragmentos de Okazaki – ligam os primers na cadeia lenta (100 a 200 nucleotídeos nas células
eucarióticas; 1000 a 2000 nas procarióticas)
O nome não coincide
DNA primase / DNA pol α – enzima que sintetiza os primers; é uma RNA
com a função
polimerase, uma vez que o que vai adicionar são ribonucleotídeos Deal with it

RNase H – enzima que remove e degrada os primers de RNA, já que estes não podem persistir
nas moléculas finais de DNA

• A DNA polimerase vai preencher os “buracos”, deixando de existir um local de cadeia

simples de DNA

Nick - interrupção na cadeia DNA por falta de uma ligação fosfodiéster entre nucleotídeos

DNA ligase – enzima que, encontrando o nick, o vai fechar ao estabelecer uma ligação
fosfodiéster, fundindo 2 ligamentos de okasaki entre si.

Matilde Monteiro 34
Células procarióticas Células eucarióticas Função
Primase Primase / DNA polimerase α Adição primers

DNA polimerase III DNA polimerase σ Cadeia lagging

DNA polimerase ε Cadeia leading

Helicase – enzima que liga à dupla cadeia de DNA e catalisa a

abertura da hélice. Deste modo, permite o reconhecimento
das bases nucleotídicas pela DNA polimerase.

• Constituída por 6 subunidades

• Quebra as ligações por ponte de hidrogénio com gasto
de ATP

Single-stranded DNA-binding proteins – enzimas que se

ligam à cadeia simples de DNA de modo a manter a abertura
da dupla hélice (caso contrário voltaria à sua estrutura mais
estável)

As DNA polimerases têm de manter-se unidas às moléculas

de DNA durante períodos longos. Como estas são muito
grandes, mas a sua afinidade não o é, são necessárias:

Proteínas estabilizadoras da DNA polimerase

1) PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) – permite a

ligação da DNA polimerase às cadeias de DNA que
estão a replicar, com gasto de ATP; forma um anel
heterotrimérico (3 proteínas diferentes)

2) RFC (Replication factor C) – estabiliza a ligação da

PCNA à molécula de DNA, com gasto de ATP
Eucariotas Procariotas
PCNA Sliding-clamp protein
RFC Clamp-loading protein

Matilde Monteiro 35
Na cadeia lagging, este complexo vai permitir a
síntese da molécula de DNA até encontrar a
extremidade de outro primer, desagregando-
se, para se voltar a formar num local mais à
frente

Topoisomerase – enzima que forma nicks (corta ligações fosfodiéster) para aliviar o
sobreenrolamento (provocado pela abertura por ação da Helicase).

Topoisomerase I
Quebra uma ligação fosfodiéster na cadeia
simples, havendo rotação da molécula de
DNA para aliviar o sobre enrolamento
É também ela que, sem gasto de energia, vai
voltar a fechar/restabelecer aquela ligação
fosfodiéster (Entre nucleotídeos)
Topoisomerase II
Catalisa a quebra da dupla cadeia de DNA É
mais importante na separação das cadeias
duplas durante a divisão celular (na fase de
condensação dos cromossomas) do que na
replicação, permitindo a segregação para as
células filhas (evita que fiquem enroladas
entre si); também é capaz de fechar/
restabelecer as cadeias de DNA sem gasto de
energia adicional.

Matilde Monteiro 36
Modelo da forquilha de replicação com as proteínas
acessórias (observável em TEM) na E. Coli

• DNA primases;
• RNA polimerases, associadas ao PCNA e RFC
nas células eucariotas;
• DNA Helicase no local de início de abertura da
dupla hélice;
• Single-stranded binding proteins; mantem a
abaertura da cadeira dupla de DNA
• Topoisomerases; Evita o sobreenrolamento do
DNA
• RNAse H, que vai digerindo os primers de RNA.

Mecanismos de reparação – entram em ação aquando da incorporação errada de um nucleotídeo

durante a replicação do DNA; permitem que só 1 em cada 109 nucleotídeos seja incorporado
incorretamente.

• Verificação/proofreading das DNA polimerases;

• Mecanismo de Mismatch repair
Proofreading da DNA polimerase – deve-se ao facto de a enzima
conter dois centros ativos:

Primeiro centro ativo - polimeriza nucleotídeos no

Quando há uma incorporação errada de um

nucleotídeo, deixa de haver uma região de perfeita
dupla hélice (dimensões anormais) e a DNA
polimerase para de adicionar nucleotídeos.

Segundo centro ativo – função de exonuclease no

sentido 3’-5’ (inverso ao d a polimerização), retirando
o nucleotídeo mal emparelhado (quebra a ligação
fosfodiéster). Permite que a região de dupla hélice
volte a estar apta à adição de novas subunidades por
ação da DNA polimerase.

Matilde Monteiro 37
 • Mecanismo transversal a quase todas as DNA polimerases;
• Permite impedir a maioria das incorporações erradas de nucleotídeos, sendo um processo
muito eficaz.

O mecanismo de proofreading justifica porque é que todas as DNA polimerases evoluíram no sentido de
adicionar nucleotídeos sempre no sentido 5’-3’

• Os nucleotídeos têm 3 grupos fosfato que fornecem a energia para a sua incorporação
na cadeia crescente, através da sua hidrólise.
• Não estando correto, é removido por ação de proofreading da DNA polimerase e a cadeia
continua em condições de continuar a crescer, com uma extremidade 3’ livre.
• Se fosse ao contrário, no sentido 3’-5’, já iam existir grupos fosfato com ligações muito
energéticas na extremidade da cadeia crescente de DNA. Um nucleotídeo mal
incorporado seria removido, mas a cadeia ficava incapaz de polimerizar mais, dado que,
por já lá conter um grupo fosfato, não poderia ocorrer qualquer hidrólise.

Crescimento bidirecional das cadeias de DNA com formação de

duas forquilhas de replicação

Num vírus, dá-se a quebra da molécula de DNA circular

e a forquilha de replicação vai crescendo nos 2 sentidos – há
um crescimento bidirecional e simétrico de 2 forquilhas de
replicação durante a replicação de DNA.

Ø Vírus
Ø Bactérias
Ø Eucariontes

Matilde Monteiro 38
BACTÉRIAS

Origem de replicação – sequência particularmente rica em pares Adenina/Timina (unidos por duas
pontes de hidrogénio, zona mais fácil de abrir a dupla hélice) por onde se
inicia a replicação de um cromossoma. Após a abertura, a molécula é toda
replicada até que se encontrem as DNA polimerases do lado oposto ao
da origem de replicação.

• De modo a assegurar que o genoma é replicado somente uma

vez e que não há regiões que estão a ser duplamente replicadas
em simultâneo nas O.R., estas sequências tendem a estar
metiladas.
• Assim, ao iniciar a replicação, no estado semimetilado, a O.R. está
ligada a uma proteína inibidora que bloqueia o acesso das
proteínas iniciadoras à origem de replicação.
• Só após a nova cadeia estar metilada é que a helicase se pode
ligar e ativar-se um novo ciclo de replicação.

Velocidade de replicação → 500 a 1000 nucleotídeos/s.

Se apenas existisse uma origem de replicação por cromossoma, seriam

necessárias 800 horas para replicar todo o genoma, no entanto este
processo realiza-se em 8 horas, pois é possível ter 10 mil origens.

Replicação em eucariotas - em cada cromossoma há múltiplas origens de replicação que distam

em intervalos mais ou menos regulares. No entanto, em comparação com as bactérias, a
velocidade da replicação continua cerca de 10 vezes inferior (DNA estar mais compactado em
nucleossomas)

Velocidade nos humanos → 50 nucleotídeos/s

Cascatas de sinalização – permitem a regulação das várias origens de replicação nos eucariotas,
mais ou menos em simultâneo (dentro do período S do ciclo celular)

ORC (Origin Recognition Complex) - Complexo proteico ligado às origens de replicação das
células eucarióticas, durante a maior parte do ciclo celular, juntamente com as proteínas CDC6 e
CDT1.

Cinase CDK – é ativada perto da fase S do ciclo celular, e vai fosforilar algumas das proteínas deste
complexo, levando à sua desagregação e permitindo a atividade da helicase, iniciando assim a
atividade da replicação por ação da DNA polimerase.

É a fosforilação que vai ativar em simultâneo as origens de replicação, permitindo assim

que a replicação seja realizada num intervalo de tempo mais curto.

Matilde Monteiro 39
Fábricas de replicação (Replication Factories) – focos de origens de replicação, distando entre si
cerca de 30 mil a 250 mil pares de nucleotídeos.

O DNA não replica todo em simultâneo (não começa numa extremidade e progride linearmente até
à outra):

• A cromatina menos condensada replica antes da heterocromatina

• As regiões que são transcritas ativamente (genes que normalmente estão em atividade)
são as primeiras a serem replicadas.
• As regiões que replicam mais tardiamente são aquelas que estão na extremidade dos
cromossomas (telómeros) ou na região centromérica - regiões não codificantes.

O que acontece aos nucleossomas na replicação?

1) Os conjuntos de histonas H3/H4 mantêm-se unidos e dividem-se equitativamente entre

o DNA das duas moléculas filhas;
2) Os conjuntos H2A/H2B tendem-se a dissociar completamente;

3) São sintetizadas novas histonas (das poucas proteínas cuja transcrição e síntese ocorre
durante a fase S)

Chaperonas de histonas – enzimas que intervêm na formação dos nucleossomas logo após a
replicação, ao trazerem as novas histonas

• NAP (nucleosome assembly protein)

• CAF (cromossome assembly factor)

• O DNA praticamente nunca fica dissociado de proteínas, apenas

transitoriamente durante o período em que as enzimas
intervenientes na replicação passam através da molécula.

Reader-writer complex – têm a capacidade de ler as modificações nas histonas H3/H4, que são
herdadas da célula-mãe e de imediato vão transferir grupos metilo ou acetilo para que aquela

Matilde Monteiro 40
região do genoma mantenha as características de modificações de histonas idênticas à da
molécula de DNA que está a ser replicada

Encurtamento dos telómeros

• A cadeia leading chegando ao fim, termina com uma

molécula sintetizada perfeitamente;
• Na cadeia lagging vai ser formado um primer final, mas sem
espaço para se formar o subsequente fragmento de Okazaki.
• Assim, a RNAse H vai digerir esse primer, ficando uma
extremidade 3’ de cadeia simples porque a transcrição não
pode ser completada.
• Ao longo de vários ciclos celulares e durante o
envelhecimento, vai haver um encurtamento progressivo
dos telómeros.

Telomerase – enzima com ação de

transcriptase reversa que, ao integrar uma
sequência de RNA complementar à da
extremidade final do telómero (cadeia
repetitiva GGGTTA), vai produzir DNA a partir
desse, permitindo assim estender essa
extremidade. Assim, passa a haver espaço
para se formar o novo primer e o novo
fragmento de Okazaki, evitando o
encurtamento dos telómeros.

A telomerase é muitas vezes usada como

alvo terapêutico nos tratamentos anti
tumorais.

Matilde Monteiro 41
 Há telomerase
Células embrionárias /
São capazes de se replicar indefinidamente
células estaminais
Com a diferenciação celular essa capacidade reduz-se.
Há telomerase em quantidade muito reduzida
Células somáticas
Número de replicações limitado
Quase que não têm telomerase
Células senescentes Telómeros tendem a desaparecer
(em envelhecimento) Pode haver fusão de cromossomas entre si, o que leva à morte celular

Muitas têm telomerase

Células tumorais
São capazes de se dividir indefinidamente.

Matilde Monteiro 42
 T7 - Técnicas de Diagnóstico em Genética Molecular I - Clonagem e PCR

Tecnologia de DNA - pode ser dividida em duas grandes áreas:

• Clonagem de DNA
• Métodos de análise de DNA

Clonagem de DNA - amplificação seletiva de um fragmento de DNA de forma a produzir elevada

quantidade de DNA, passível de ser analisada em termos de estrutura e função

• In vivo cell-based cloning (rDNA)

• Cell-free DNA cloning (PCR)

In vivo cell-based cloning (rDNA)

Vetores - meio de suporte para o DNA a clonar

Plasmídeos - moléculas de DNA circulares, extra-cromossómicas e com capacidade de

autoreplicação (na natureza existem em grandes quantidades)

• Em laboratório sofrem modificações genéticas que lhes conferem características úteis

• Codificam proteínas de resistência a antibióticos, metais pesados, mutagéneos,
bacteriófagos, enzimas para a produção de aminoácidos raros ou para catabolismo de
moléculas orgânicas complexas

Tipos de vetores Tamanho

Plasmídeos 2-3kb
Fagos lambda 20kb
Cosmídeos 50kb
Bacterial artificial chromosomes
300kb
(BACs)

Yeast artificial
1Mb
chromosomes (YACs)

Enzimas de restrição – endonucleases que permitem a introdução do DNA de interesse no

plasmídeo

• Reconhecem pequenas sequências de DNA

• Clivam o DNA de dupla cadeia nos locais próximos dos locais de reconhecimento
• O corte pode ser feito:
o No eixo de simetria – Blunt ends
o “Em escada” – sticky ends

Matilde Monteiro 43
Locais de reconhecimento – têm cerca de 4 a 6 nucleótidos

• “Dyad symmetry” - a sequência 5’-3’ de uma das cadeias é semelhante à da cadeia

complementar

Transformação bacteriana

• Introdução dos plasmídeos na bactéria (E. coli)

• Método químico – adição de CaCl2 (iões Ca2+ tornam as bactérias permissivas à entrada
de DNA)
• Eletroporação - aplicação de um campo elétrico de alta voltagem que produz “buracos”
temporários na membrana celular por onde entra o DNA

Matilde Monteiro 44
 Cell-free DNA cloning (PCR)

PCR (Polymerase Chain Reaction)

• Permite a amplificação enzimática de um fragmento específico de DNA (localizado entre

duas regiões de DNA de sequência conhecida - primers)
• Produto resultante - fragmento de DNA de cadeia dupla cujas extremidades são definidas
pelas extremidades 5’ dos primers

Material
DNA molde
DNA polimerase (Taq DNA polimerase)

Primers (iniciadores)
Desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTPs)
Solução tampão (com MgCl2)
3 etapas
Termociclador

1) Desnaturação
• Quebra das pontes de hidrogénio da cadeia dupla de DNA,
gerando cadeias simples de DNA
• Entre os 94ºC e os 96ºC

2) Annealing
• Ligação dos primers às regiões complementares do DNA
molde;
• Entre 50ºC e 65ºC

Primers – oligonucleotídeos que se ligam à cadeia simples de DNA na região complementar,

delimitando o segmento a amplificar

• Definição da sequência a amplificar o Manualmente - tendo acesso à sequência, decide-

se onde colocar o primer forward e o primer reverse
o Ferramentas bioinformáticas

Desenho dos primers consoante essa região, tendo em conta os parâmetros:

• Comprimento do primer – normalmente, entre 18 e 22 pb

Matilde Monteiro 45
 • Melting/annealing temperature (Tm) – temperatura à qual os primers se ligam ao DNA
(entre 55ºC e 60ºC) o Conteúdo em C+G – sendo as pontes de hidrogénio 3, a Tm será
maior (7580ºC)

• Especificidade – entre o primer e a sequência alvo o Pode haver competição entre os

vários primers presentes na solução o É necessário testar o primer para verificar que ele
só se liga à região genómica de interesse e não outras, de modo a não amplificar
segmentos que não têm interesse

• Evitar a formação de dímeros de primers - é mais fácil a ligação entre eles do que com o
DNA molde

3) Extensão - adição de desoxirribonucleotídeos (dNTPs), formando a cadeia complementar de

DNA, com recurso à enzima TaqPolimerase (mais estável a temperaturas elevadas - 72ºC)

Nota: A TaqPolimerase não tem atividade de exonuclease 3´→5’ (proofreading) para correção de
erros durante a síntese de DNA, o que pode alterar a amostra, com risco de haver uma leitura
diferente do que seria correto

Temperatura de Temperatura de annealing

Temperatura de extensão
desnaturação / melting
94º a 96º 50º a 60º 72º
Quebra da dupla cadeia de Dependendo do primer Temperatura ótima de
DNA atuação da TaqPolimerase

Matilde Monteiro 46
Repetição do processo por ciclos

• Número de ciclos - depende de como se programa o aparelho

• Em média, faz-se 30 a 35 ciclos numa reação de PCR
Só a partir do 3º ciclo é que se obtêm fragmentos que correspondem exatamente à sequência de
interesse
No fim da extensão (1 minuto), a enzima para de adicionar nucleotídeos devido ao novo
aumento da temperatura (94º)

Alternância dos ciclos

• Permite que haja a produção exponencial de cópias de um segmento

• Se não fosse utilizada (1 ciclo de maior duração) obter-se-ia uma única extensão com um
comprimento muito maior do pretendido

Matilde Monteiro 47
Fases do PCR

1) Fase exponencial – o produto é duplicado a cada ciclo (amplificação exponencial)

2) Fase linear – os reagentes vão sendo consumidos, diminuindo a velocidade da reação

3) Fase de plateau – são atingidos os 30 ciclos, deixando de haver aumento significativo da

quantidade de produto a ser produzido; é feita a deteção no end-point

Eletroforese – serve para verificar se se conseguiu um PCR eficiente após o término da reação

• Em gel de agarose / capilar

• Brometo de etídio - corante cancerígeno que se intercala na cadeia dupla de DNA,
emitindo fluorescência quando é colocado sob uma luz ultravioleta

Visualização no transiluminador de UV + Fotografia do gel + Registo da informação

Variantes do PCR
PCR Multiplex
PCR Fluorescente
PCR Multiplex Fluorescente
Real-Time PCR
PCR Multiplex Real-Time

Matilde Monteiro 48
PCR Multiplex

Permite amplificar múltiplas sequências numa única

reação, através da utilização de múltiplos pares de
primers na mistura
o Os fragmentos têm de ter tamanhos
diferentes – permite que haja separação
destes na eletroforese final
o Os primers têm de ser específicos para os
diferentes genes
o Os primers têm de ter temperaturas de
annealing semelhantes (no aparelho só se
pode programar uma)

PCR Fluorescente

• Primers com fluorocromos

• Na eletroforese capilar (sequenciador automático)

o Capilares contêm gel

o Amostras migram dentro do gel (tanto mais rápido quanto mais pequeno for)

o Laser captura a fluorescência dos produtos

o Observam-se picos (em vez de bandas) – informação sobre a fluorescência e sobre o

peso

Nota: A diferença entre o PCR fluorescente e a sequenciação é que no primeiro são marcados os
primers enquanto que no último são marcadas as bases (os dideoxinucleotídeos)

PCR Multiplex Fluorescente

• PCR múltiplo dentro do mesmo tubo e ao mesmo tempo, onde os vários primers são
marcados com diferentes cores
• Permite separar os fragmentos por tamanho e por cores

o Eletroforese capilar - maior resolução (permite distinguir fragmentos que diferem

numa base); adiciona-se o standart de tamanho (picos vermelhos) que permite o
cálculo, pelo aparelho, dos tamanhos dos picos das amostras
(referência)

Matilde Monteiro 49
 Um único molde de DNA,
Single Template PCR de modo a amplificar várias
Reaction sequências deste (vários
primers)

PCR Multiplex

Vários moldes moldes

Multiple Template PCR amplificados apenas por um
Reaction conjunto de primers ou por
vários primers

Importância do PCR

• Revolução em termos médicos da análise do DNA

• Capacidade de, a partir de uma única molécula, produzir milhares de cópias da sequência
de DNA, que podem depois ser analisadas de diversas formas
• A maior parte dos diagnósticos genéticos são feitos utilizando um PCR seguido de
técnicas adicionais

Vantagens Desvantagens
Muito rápida e fácil de executar Risco de contaminação
Amostra pode ser de tamanho variável Desenho dos primers tem de ser correto

Técnica seletiva Dificuldades na determinação do end-point

Enzima TaqDNA Polimerase não tem a
Elevada sensibilidade
capacidade de correção de erros

Nota: existência, nos laboratórios, de sala pré-PCR (onde são preparadas as reações) e sala pósPCR
(onde são manipulados os produtos amplificados), de modo a evitar a abertura dos tubos no
mesmo espaço físico, o que levaria a contaminação com aerossóis

Real-Time PCR / PCR em tempo real / cinético / quantitativo

• Quantificação, em tempo real, dos produtos de PCR, usando marcadores fluorescentes e

um equipamento específico
• Capacidade de fazer uma relação direta para calcular o número de moléculas que vão
sendo sintetizadas o Metodologia do SYBR Green o Metodologia das sondas Taq

Matilde Monteiro 50
 Metodologia do SYBR

SYBR green - marcador fluorescente que se vai intercalar na cadeia dupla de DNA (absorve luz
azul e emite luz verde)

• A quantidade de luz verde (produzida em cada ciclo pelo número de moléculas de cadeia
dupla sintetizadas) é registada desde o início
• Como o SYBR Green é um corante não específico, vai-se ligar todas as cadeias duplas,
inclusivamente dímeros de primers, podendo gerar falsos positivos

Metodologia das Sondas Taq

Sonda Taq - sonda oligonucleotídica específica que se liga à cadeia de DNA complementar entre
os primers forward e reverse

• Reporter fluorescente na extremidade 5’

• Quencher (supressor) na extremidade 3’

Técnica baseada no Princípio FRET (Förster Resonance Energy Transfer)

1) Sonda intacta - a fluorescência que é emitida pelo reporter é absorvida pelo Quencher -
não está a libertar fluorescência nenhuma
2) Extensão - atividade exonuclease da Taq polimerase 5’ -> 3’ parte a sonda, separando o
reporter e o Quencher
3) Deixa de haver transferência de energia
4) Libertação de fluorescência pelo reporter
5) Deteção pelo aparelho

Matilde Monteiro 51
Real-time PCR multiplex

• Só é possível usando sondas TaqMan

• Gene A - sonda tem um reporter marcado a verde
• Gene B - sonda tem o reporter marcado a azul

SYRB Green TaqMan

Método simples, económico Amplificação de duas ou mais sequências
e prático distintas numa única reação (Multiplex)

Vantagens
Mais económico Maior especificidade

Eliminação de qualquer tipo de processo de quantificação pós-PCR

Necessidade de utilização de diferentes
sondas de acordo com as sequências alvo a
amplificar
Tamanhos têm de ser menores que o PCR
Ligação não específica do convencional
corante (pode ligar-se a
Tem diversas sondas para os diversos genes,
Desvantagens dímeros de primers)
o que implica uma leitura, não só dos
Podendo assim gerar falsos
primers, mas também das sondas
positivos...
Os segmentos analisados nunca podem ser
tão grandes quanto os de PCR convencional,
porque se não perder-se-ia a linearidade em
termos de fluorescência que é imitida.

Matilde Monteiro 52
Deteção da quantidade de produto na fase exponencial (e não na final)

A quantidade de fluorescência é
proporcional à quantidade de produto de
PCR desde que:
- A quantificação seja feita na fase
exponencial da reação
- A amplificação prossiga com uma
eficiência comparável pra todas as
amostras.

Based Line/linha basal - fluorescência basal não específica que o aparelho regista sempre
(“ruído”)

Linha de Threshold - linha a partir da qual há efetivamente um registo de fluorescência

significativamente superior à fluorescência basal

Ciclo de Threshold – ciclo a partir do qual, para a amostra em questão, houve registo de
fluorescência válido (interseção do gráfico com a linha de Threshold)

Amostra A = 20 Na amostra A, são necessários menos ciclos para produzir um

Amostra B = 30 certo número de moléculas, em comparação com a amostra

Quantificação do Real-Time PCR

• Absoluta - determina o número de cópias de uma determinada sequência

• Relativa - quociente entre uma sequência específica e uma sequência de controlo

Aplicações práticas do PCR

• PCR convencional - sequenciação de DNA, mapeamento genético e

clonagem
• Variantes do PCR – aumento da extensão dessas aplicações
o Quantificação viral
o Deteção patogénica
o Diagnóstico e análise da expressão genética
o Eficácia de terapia com drogas
o Controlo de qualidade e validação de ensaios
o Deteção de OGMs

Matilde Monteiro 53
 T8 - Técnicas de DNA Recombinante

DNA recombinante - tecnologia que permite a manipulação de DNA por meios artificiais,
baseando-se na clonagem molecular (formação de clones, que são coleções de moléculas ou
células idênticas à original)

Aplicações do DNA recombinante

Propagação de DNA (gene de

interesse; bibliotecas de cDNA)
De clonagem

Manipulação de DNA (sequenciação)

Vetor
Promotor

De expressão (de Codão de iniciação seguido de

proteínas) polylinker

Local de ligação ao ribossoma

Clonagem

Corte de um fragmento de DNA de um organismo e inserção num vetor que permite a sua replicação num
organismo hospedeiro. Usa-se DNA nuclear de um organismo para criar um segundo com o mesmo
material genético. EX: ovelha Dolly

Técnica DNA recombinante

1) Síntese do cDNA – a partir do mRNA do gene de interesse, com recurso a primers e à enzima
transcriptase reversa

• Não se pode colocar o DNA com gene de interesse (com exões e intrões) numa bactéria,
já que esta é incapaz de realizar splicing (remover intrões de mRNA)
• Também não se pode colocar o mRNA visto que este seria logo degradado (radioativo)

Orientação das cadeias do cDNA em cadeia dupla

• Cadeia sense - de 5’ para 3’ o Sequência “igual” à do mRNA que vai dar origem à proteína
desejada (tirando uracilos)
• Cadeia anti-sense – de 3’ para 5’
o Usada no processo de transcrição
o Contribui para a síntese da proteína recombinante

2) Inserção das enzimas de restrição

Matilde Monteiro 54
 Enzimas de restrição - endonucleases específicas que reconhece sequências de 4-8

nucleótidos; Sequências

palindrómicas (com um eixo de

simetria)

Extremidades blunt (abruptas) Extremidades sticky (coesivas)

Sem nucleotídeos desemparelhados Com nucleotídeos desemparelhados

São utilizadas enzimas de restrição de extremidades coesivas, de modo a clivar o vetor e o cDNA
de interesse
• Todas as extremidades formadas vão ser complementares, sendo possível a junção das
duas porções de DNA
• Com enzimas que dão origem a extremidades blunt, esta técnica não seria possível

3) Ligação do cDNA ao vetor (transporta o gene de interesse, na forma de cDNA, para a bactéria),
com recurso a:
• T4 DNA ligase
• Gasto de energia

Matilde Monteiro 55
EcoRI: (na E.coli) Dá-se, assim, o nome às enzimas de restrição onde foram descobertas

Tipos de vetores Tamanho

Plasmídeos 2-3kb
Fagos lambda 20kb
Cosmídeos 50kb
Bacterial artificial chromosomes (BACs) 300kb
Yeast artificial chromosomes (YACs) 1Mb

Nota: os BACs e os YACs são utilizados na sequenciação

de genomas

Plasmídeos – vetores circulares de DNA

extracromossomais (não se integram no genoma), de
cadeia dupla, e autorreplicativas

• Origem de replicação – capacidade de

replicação independente do cromossoma
bacteriano

• Marcador seletivo (ampR) - permite selecionar apenas as bactérias que contém o

plasmídeo; ex: resistência a um antibiótico (ampicilina)

• Polylinker - local rico em sequências de restrição (local de inserção do DNA)

• Os vetores de expressão para sistemas eucarióticos devem ter mais informação, como a
região promotora ou o local de ligação ao ribossoma…

4) Formação do plasmídeo recombinante

• Resultante da inserção do fragmento de DNA exógeno no plasmídeo, após a sua clivagem

com enzimas de restrição

• O plasmídeo pode replicar quando colocado num hospedeiro adequado

Matilde Monteiro 56
Proteína recombinante - produto resultante da
expressão do plasmídeo recombinante
Ampicilina- gene que confere resistência ao antibiótico
ampicilina

Ori - origem de replicação, permite a replicação

dos plasmídeos dentro da bactéria

GJP - gene de interesse. Mapa de restrição ->

5) Transformação bacteriana
Inserção do plasmídeo recombinante, com cDNA, na bactéria

Bactéria E. Coli - bactéria com genoma circular

Gram negativa - tem uma parede externa e uma interna, não possuindo “peptidoglicano”

Não se podem utilizar bactérias de coloração gram positiva para se inserir um plasmídeo pois
estas possuem uma parede/armadura extra de peptidoglicano, impedindo a sua entrada

5.1 Método químico (cloreto de cálcio)

• Tanto a membrana plasmática da bactéria como o plasmídeo apresentam cargas

negativas, e, por isso, repelem-se
• Cálcio – como tem duas cargas positivas, vai “forrar” a membrana da bactéria e o
plasmídeo, permitindo a sua aproximação física
• Choque térmico – aquecimento da temperatura a 42 graus, aumentando a fluidez e,
consequentemente, a permeabilidade da membrana, o que permite a entrada do
plasmídeo
• Não é muito eficiente

5.2 Eletroporação (corrente elétrica)

• Carga elétrica obriga o plasmídeo a entrar na bactéria

• Formam-se buracos na membrana (depois reparados pela bactéria)
• Mais eficiente

6) Crescimento e multiplicação das bactérias com DNA recombinante

Matilde Monteiro 57
Colónia – conjunto de milhões de bactérias geneticamente todas iguais (clones), já que contém
todas o mesmo plasmídeo

7) Purificação das proteínas (por cromotografia de afinidade)

8) Teste da eficiência do possível tratamento em animais

9) Ensaio clínico em seres humanos (no caso da insulina, por exemplo)

Nota: nem todas as proteínas humanas podem ser produzidas em bactérias - estas não têm
organelos (retículos endoplasmáticos) que permitem as alterações pós-
traducionais/amadurecimento que tornam essas proteínas funcionais (fosforilações, acetilações)

Transfeção - inserção do plasmídeo recombinante em células eucarióticas

Matilde Monteiro 58
 Necessidade de utilizar métodos muito mais eficientes pois a população inicial é muito
reduzida

1) Métodos físicos
a. Microinjeção com uma micropipeta –
injeção do DNA no embrião dos seres

b. Gene guns – nano balas com DNA que

provocam buracos na parede celular das
células vegetais, obrigando o DNA a
entrar

2) Vírus - infetam as células com o RNA de

interesse que carregam

3) Vesículas lipídicas (lipossomas) - transportam o

DNA através da membrana, num processo semelhante à endocitose

A escolha do melhor organismo depende do custo de produção, e de imperativos científicos

(conformação proteica, modificações pós-tradução) que garante funcionalidade da proteína.

Matilde Monteiro 59
 T9 – Técnicas de Diagnóstico em Genética Molecular II - Sequenciação

Mutação já
RFLP
identificada

SSCP
Métodos Métodos físicos
laboratoriais Deteção de alterações físicas no HA
para DNA geradas pela mutação, em
identificação de comparação com o DNA normal
mutações DGGE

Mutação não
identificada Mismatch Cleavage Methods
Deteção e corte em erros de
Deteção e corte em erros de
complementaridade entre o ADN PTT
mutado e normal

DNA
microarrays
Outros métodos

dHPLC

Sequenciação

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

• Variação do tamanho do fragmento de DNA provocada pela atividade diferencial de

enzimas de restrição
• A presença de polimorfismo ou mutação causa perda ou ganho de local de restrição,
levando a uma variação no tamanho de fragmentos de DNA.
< tamanho -> > distância percorrida em eletroforese

Paramiloidose/doença dos pezinhos

1) Sabe-se exatamente onde está a mutação daquele DNA

1) Amplificação do DNA (PCR)
2) Enzima de restrição NsiI - só corta quando existe a sequência mutada 3) Análise
de resultados
• Indivíduo normal - 2 alelos normais com a base
guanina – não vai haver corte, não há digestão -
uma banda observada
• Indivíduo heterozigótico - um alelo normal com
guanina e um alelo mutado com adenina - o alelo
normal não é digerido e o mutado é – três bandas
observadas

Matilde Monteiro 60
Fibrose cística - patologia recessiva, os dois alelos têm de estar mutados

• Gene muito grande

• Não se sabe, a priori, em que exão se encontra a alteração

Métodos físicos - tiram partido da mobilidade diferente em eletroforese que apresentam as

sequências a analisar de modo a detetar mutações ainda não identificadas

• Single Strand Conformation Polymorfism (SSCP)

• Análise de Heteroduplexes (HA)
• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Material de análise = DNA

• Composto por duas cadeias com estrutura

tridimensional em dupla hélice
• Possibilidade de desnaturação
• A mobilidade eletroforética das cadeias depende do comprimento e conformação dessas
estruturas complexas

Single Strand Conformation Polymorfism (SSCP)

1) Amplificação por PCR

2) Desnaturação da dupla hélice
3) Arrefecimento rápido
4) Eletroforese em gel de poliacrilamida não-desnaturante

Diferenças de sequência de um único nucleótido são suficientes para que cadeias simples
de DNA adquiram uma conformação tridimensional diferente

Matilde Monteiro 61
 SSCP permite discriminar estas alterações conformacionais por eletroforese de DNA
desnaturado (cadeias simples) em géis não desnaturantes

• Indivíduo normal - uma banda com as duas cadeias sense e outra com as duas antisense.
As cadeias sense têm uma estrutura tridimensional em cadeia simples que é igual em
ambas, assim como nas anti-sense
• Indivíduo mutante - duas bandas do alelo normal e duas bandas do alelo mutado,
diferentes das do indivíduo normal. A estrutura das cadeias é diferente

Eletroforese após PCR

• Só serve para verificar se o PCR foi eficiente

• As bandas do indivíduo normal e do indivíduo com alteração teriam exatamente o mesmo
tamanho porque aqui a variação é a troca de uma base por outra, e não o tamanho
• Se não mudou de tamanho, a diferença entre as bandas não é observável num gel de
agarose

Nota: é possível ver a diferença num gel de SSCP porque estão a romper as cadeias duplas em
cadeias simples (desnaturação), tirando partido da sua estrutura tridimensional em cadeia simples

Aspetos importantes no SSCP

Ø Quantidade de G/C no fragmento – condiciona a estrutura

Ø Localização da variação de sequência do DNA – onde se localiza no gene
Ø Tamanho do fragmento de DNA (ótimo = 150pb)
o 90% de mutações detetadas até 200 pb
o80% mutações detetadas entre 200 pb e 350 pb Sequenciação após SSCP

Matilde Monteiro 62
 Ø Indivíduo normal - CCTTAG
Ø Indivíduo mutado – CCTCAG e CCTTAG (um alelo vai ter um C e outro alelo vai ter um T
- mutação pontual)

Nota: Não se sequencia diretamente por esse ser um método relativamente dispendioso e, em
genes que são muito grandes (onde não se sabe onde está a alteração) é mais fácil fazer rastreio
para os exões e só depois de encontrar a alteração do padrão de mobilidade, sequenciar.

Vantagens Desvantagens
A sensibilidade decresce com o aumento do
Simples e rápido
tamanho do fragmento

Baixo custo Baixa taxa de deteção nas transições G → C

Eficaz na análise de pequenos fragmentos Necessária sequenciação do DNA para se
caracterizar a mutação
Permite ver diferenças num só nucleotídeo

Heteroduplex Analysis (HA) / análise de Heteroduplexes

1) Amplificação por PCR

2) Desnaturação das duplas cadeias por ação do calor
3) Por restabelecimento das condições de temperatura, as cadeias simples de DNA
presentes no meio emparelham → cadeias renaturadas
4) Eletroforese em gel de poliacrilamida não-desnaturante

Meio - amostra de controlo misturada com a amostra que se pretende testar

Tipos de sequências emparelhadas

Emparelhamen
• Homoduplexes wild-type - onde cadeias normais se ligam com cadeias normais
to total, volta a
• Homoduplexes mutados - onde cadeias mutadas se ligam com cadeias mutadas cadeia dupla

• Heteroduplexes - onde uma cadeia normal se liga a uma cadeia mutada

Matilde Monteiro 63
Zona de Mismatch – região onde se encontra a mutação, não havendo emparelhamento

Ø As alterações estruturais produzem diferenças de mobilidade em eletroforese com géis

nãodesnaturantes
Cadeias heteroduplexes vão migrar menos que as homoduplexes devido à dificuldade
que têm em atravessar os poros do gel

Vantagens Desvantagens
Pouco sensível para deteção de mutações
Sensível para deteção de inserções/deleções
pontuais (só numa base)

Baixo custo Sensibilidade limitada

Rápido Necessária sequenciação do DNA para se
caracterizar a mutação
Simples

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

1) Amplificação do segmento por PCR

2) Desnaturação por aumento de temperatura
3) Mistura de quantidades iguais de segmentos wild-type e mutados
4) Emparelhamento de cadeias por diminuição da temperatura (renaturação)
• Obtêm-se, novamente, homoduplexes wild-type, homoduplexes mutados e
heteroduplexes
5) Eletroforese em gel de gradiente crescente de solução desnaturante
6) Homoduplexes e heteroduplexes desnaturam em diferentes pontos do gel de gradiente

Matilde Monteiro 64
Melting-point - ponto em que o DNA atinge a concentração de reagentes desnaturantes que o
fazem desnaturar, ficando constituído por duas cadeias simples (pára a migração)

• Quanto maior a semelhança/homologia entre as moléculas da dupla cadeia, mais

“difícil” é a desnaturação
• Homoduplexes têm melting point superior aos heteroduplexes, logo a sua distância de
migração é superior

Vantagens Desvantagens
Muito sensível Difícil de estabelecer a técnica

Ótimo para PCR multiplex (usa gel de Pouco eficiente para analisar fragmentos grandes
gradiente) de DNA

Necessária sequenciação do DNA para se

Baixo custo
caracterizar a mutação

Matilde Monteiro 65
 Comparação das três técnicas

Semelhança

• PCR prévio, para amplificar o segmento

• Sempre complementados com a sequenciação para caracterizar a mutação
• Permitem fazer um rastreio e, tirando partido do padrão de mobilidade eletroforética
diferente, fazer apenas a sequenciação dos exões que têm alteração no padrão de
mobilidade

Sequenciação do DNA

Matilde Monteiro 66
Dideoxinucleotídeos (ddNTPs)

Têm o grupo -OH na posição 3C da pentose substituído por um H

Método enzimático (Sanger e Coulson)

1) Primer para amplificação de amostra de DNA que se pretenda sequenciar 2)

Mistura de PCR em quatro tubos, em que a amostra é dividida em quatro
• Em todos os tubos, tem-se a amostra a sequenciar igual, a polimerase e os nucleotídeos
normais
• Em cada um, usa-se dideoxinucleotídeos diferentes (guanina, adenina, timina e citosina),
cada um deles marcado com um isótopo radioativo
3) Termociclador
4) Ciclos (desnaturação, annealing, extensão)
5) Aleatoriamente, são incorporadas bases normais ou dideoxinucleotídeos
Quando são incorporados dideoxinucleotídeos, a síntese para
6) Eletroforese em gel para os quatro tubos

Matilde Monteiro 67
 Sequenciação automática

1) PCR prévio
2) Desenho do primer
3) Preparação de reação PCR
o Cadeia molde (que é o produto de PCR purificado)
o Nucleotídeos normais (dNTPs) o Dideoxinucleotídeos (ddNTPs) – cada um identificado com
um fluorocromo diferente
o Um primer
4) Ciclos (desnaturação, annealing e extensão)
5) Incorporação aleatória de nucleotídeos normais ou dideoxinucleotídeos pela polimerase
(quando é incorporado o segundo, a síntese para)
6) Em cada posição vai ser incorporado um dideoxinucleotídeo, que tem uma cor específica
(consoante base azotada)

7) Ressuspensão do pellet na formaída (permite que o DNA fique em cadeia simples)

8) Eletroforese capilar 9) Eletrofluorograma

Só é necessário um primer porque só se A proporção de dNTPs e ddNTPs é

pretende que os fragmentos sejam formados
num sentido. Se se usasse dois primers, um
num sentido e o outro no outro sentido, estar-
se-ia a incorporar bases aleatoriamente dos
dois lados
uma proporção que é estabelecida
de forma a que os que estão
marcados estejam muito menos
concentrados do que os que não
estão marcados.

Eletroforese capilar

• Eletroforese dentro de um aparelho, onde existe um capilar e dentro desse capilar um

gel, onde se vai separar as amostras por tamanho
• Os fragmentos mais pequenos vão correr primeiro que os fragmentos maiores
• Laser – existe numa determinada região do capilar e vai capturar a cor e o tamanho dos
fragmentos à medida que passam
• Ao identificar a cor, o software vai compondo a sequência do DNA tendo em conta a sua
correspondência

Matilde Monteiro 68
Eletrofluorograma

Representação gráfica dos picos que vão saindo na

eletroforese e das respetivas letras

Interpretação dos gráficos

• Visual e manual (ver se há picos sobrepostos,

desfasamento das sequências)
• Comparação com bases de dados (NCBI,
Ensemble, GenBank)

Diferenças entre a sequenciação manual e a automática

Vantagens e desvantagens da sequenciação

Vantagens Desvantagens
Muito sensível Relativamente dispendiosa

Mutação caracterizada com precisão Pouco eficiente para analisar fragmentos grandes
(complemento a outros métodos) de DNA

Matilde Monteiro 69
Sequenciação de Nova Geração

• Necessidade de reduzir os custos associados à sequenciação

• Conseguem sequenciar um exoma inteiro num determinado período de tempo que é
curto

Plataformas de 2ª geração - amplificação clonal

• Ancoragem de fragmentos de DNA a um suporte físico

• Sequenciação em paralelo
• Sequenciação in situ

Sequenciação em paralelo

A - Amostra de DNA

B - Fragmentação do DNA em vários segmentos que vão ser sequenciados em paralelo (Há várias
leituras de cada segmento – READS)

C - Alinhamento dos Reads (leituras dos segmentos) a um genoma de referência D - Sequência

total do genoma gerada pelo alinhamento de todos os Reads

Multiplexing

Plataforma da Illumina

1) Fragmentos de DNA numa superfície sólida

2) Adição de nucleotídeos reversíveis (cada um tem uma cor diferente)

Matilde Monteiro 70
 3) Software deteta a cor
4) Lavagem
5) Adição de novo nucleotídeo
6) Leitura e lavagem sucessivas
7) A plataforma consegue fazer a deteção dos nucleotídeos que vão sendo incorporados

Plataforma da Roche / Pirossequenciação

1) Moléculas de DNA associadas com grânulos, envolvidos em gotas (contêm todos os

componentes necessários para amplificar o DNA) colocadas numa espécie de poço,
sendo que em cada poço vai haver uma gota com uma sequência de DNA para ser
determinada
2) Sempre que é adicionado um nucleotídeo pela polimerase, há libertação de um
pirofosfato que, com a ação da luciferase, leva
à produção de luz
3) Deteção da emissão de luz, cuja intensidade
varia em função do número de nucleotídeos
que se ligam à cadeia
4) O PPi libertado é utilizado pela ATP sulfurilase
para produzir ATP (fonte de energia para a
luciferase)

Desvantagem da sequenciação de nova geração

• Dificuldade que existe em ler com precisão homopolímeros (sequências com um grande
número de nucleotídeos iguais seguidos)
• Dificuldades de armazenamento da informação
• Possibilidade de erros de leituras na sequenciação de regiões de homopolímeros

Matilde Monteiro 71
 T10 – Introdução à Bioinformática

Bioinformática:

Uso de computadores para compilar e integrar dados biológicos, bioquímicos e clínicos em

bases de dados oferecendo novas ferramentas para estudar processos moleculares.

Criação de bases de dados

O conhecimento científico tem aumentado de forma exponencial, pelo que a complexidade

e a quantidade de informação disponíveis tornaram necessário armazena-lo e torná-lo
acessível e compreensível a todos, mesmo que não possuam formação na área da
informática

Objetivos da bioinformática

1) Computação de anotações (criação de bases de dados) a partir de informações

genómicas, proteómicas, clínicas…

2) Transformação e manipulação dos dados (software de acesso livre)

3) Procura de genes no genoma (cromossoma), parâmetros moleculares de cDNA e

proteínas, localização de região codificante, previsão de função

4) Informações básicas sobre proteínas (tamanho, ponto isoelétrico, localização subcelular,

topologia, domínios funcionais)

5) Informações sobre genes (função conhecida, evolução, estrutura, relação com via
metabólica, redes de interação genética, perfis de expressão)

6) Homólogos vs Parálogos – saber se determinado gene de interesse encontrado num

animal (ex.: num rato) existe também no ser humano;

7) Polimorfismos, doenças genéticas - procura de associações já existentes de

mutações/polimorfismos encontrados num determinado doente com proteína
afetada/fenótipo por este apresentado, procurando oferecer o tratamento mais
adequado

Matilde Monteiro 72
 Bases de dados
GenBank
EMBL
DDBJ
Contêm sequências anotadas de ácidos
Genómicas Ensembl genome browser
nucleicos e proteínas
UCSC Genome
Bioinformatics

Dados para estrutura primária/secundária de • Swiss-Prot

Proteicas proteínas, taxonomia, aspeto funcional, • Uniprot
famílias proteicas e domínios • pFam

Compilam dados de expressão génica nos Gene Expression Omnibus

tecidos ou em situações patológicas (GEO)
De Expressão
(cancro) a partir de dados experimentais Cancer Gene Expression
(microarrays, SAGE, large-scale hibridization database (CGED)
in situ) ONCOMINE

Ontológicas Associam os genes às suas funções • Gene Ontology (GO)

De Vias Genéticas e • Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)

Proteómicas • Biocarta database

• OMIM – Online Mendelian Inheritance in Man – base de dados que

associa doenças genéticas conhecidas aos genes disfuncionais nessas
Clínicas
doenças
• SNP consortium database

Todas as bases de dados se integram, ou seja, em cada base de dados existem hiperligações que
permitem reunir informações distribuídas por diferentes bases de dados de forma mais rápida e
eficiente

Servidores de acesso (Todas as 3 db contêm os mesmos dados. Elas diferem na organização dos
dados, ferramentas e hiperligações para outras bases de dados)
Ø NCBI
Ø EBI

Ø NIG

Notas:

- As bases de dados em sequências de RNA escrevem “T” em vez de “U” (base azotada exclusiva
de RNA) só por convenção, apesar de não existir Timina numa molécula de RNA.

-Uma sequência de aminoácidos escreve-se por uma sucessão de letras, por convenção da
extremidade amina para o terminal carboxílico.

ORF- Open Reading Frame: encontra determinada parte do DNA para sintetizar uma proteína.

sequência de DNA que começa no codão de iniciação “ATG” (não é necessariamente o primeiro
da sequência) e acaba com um codão de terminação (TAA, TAG ou TGA);

- Qualquer região da sequência de DNA pode, em princípio, codificar seis sequências de

aminoácidos diferentes (grelhas de leitura);

Matilde Monteiro 73
- Qualquer uma das três grelhas de leitura diferentes pode ser usada para interpretar cada uma
das duas cadeias de DNA.

O QUE VEM A SEGUIR?

Secção 1- Bases de dados de sequências

Fazendo buscas usando texto podemos obter sequências das bases de dados

Secção 2- Comparação de sequências

Fazendo buscas usando sequências podemos obter sequências similares das bases de dados

Secção 3 – Análise de sequências

Fazendo a análise de sequências podemos inferir propriedades biológicas

Secção 4 – Ontologia genética (GO)

Anotação Funcional; Estruturas 3D; Dados de Interação; Dados de Expressão; Vias de sinalização
(Pathways), etc

_______________

O que é que um registo de sequência contém? Registo de sequência está anotado com informação
biológica

A. Anotação (secção superior): Informação sobre a sequência, gene, componentes da sequência,

autores da submissão e a literatura

B. Dados (secção inferior): A sequência propriamente dita

Anotações comuns em sequências

Anotações da sequência (ou propriedades), feita de acordo com o tipo de sequência, definem
componentes da sequência como o CDS, intrões, exões, etc, e estão ligados à posição na sequência

Tipos de sequências: genómica, mRNA e proteína

Ferramentas bioinformáticas

Formato FASTA (“Padrão”)

As sequências obtidas nos eletroforogramas são apresentadas no formato FASTA. O

formato universal FASTA é reconhecido por todas as bases de dados e consiste na primeira linha
no símbolo “>” seguido do nome da sequência e na segunda linha a sequência nucleotídica (DNA
ou RNA) ou peptídica.
Como criar um ficheiro FASTA?
- Usar um processador de texto (WordPad, Word)
- Inclui o ID da sequência e comentários antes da sequência propriamente dita:
>IDsequência + comentários (opcional)
ATGCATGCATGC...
- Guardar o ficheiro com a extensão .txt
- Usado para sequências de nucleótidos ou aminoácidos

Matilde Monteiro 74
MultAlin

• Alinhamento de sequências
• O alinhamento das sequências irá então aparecer estando a cores os nucleotídeos/
aminoácidos idênticos

UniProt

Base de dados especializada em proteínas. Foca-se na função biológica de proteínas, informação recolhida
da literatura

Tem 2 secções separadas:

- Swiss-Prot – registros manualmente anotados e curados com mais informação (ex. Locais de ligação para
drogas, etc)

- TrEMBL – registro derivados de simulações computacionais sem anotação ou verificação por curadores

Expasy

• Traduzir sequências e avaliar se a mutação levou à alteração da sequência primária da

CFTR
• Traduzir a sequência peptídica

SMART

Caracterização das proteínas. Para avaliar o impacto de uma mutação é importante determinar se
a mutação ocorre num domínio funcional da proteína

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

É possível alinhar uma dada sequência com bases de dados de diferentes organismos do
programa BLAST.

E value (expected value)

Representa a probabilidade de duas sequências serem homólogas apenas por acaso, ou seja,
valores muito baixos significam grandes probabilidades de homologia real.

OMIM Mutações associadas a doenças genéticas

Dados relativos a estrutura, função, organização genómica das proteínas e suas implicações em
situações patológicas.

Ensembl Genome Browser

Base de dados para genomas eucariotas; Um genoma de referência/organismo. O Genoma de

referência é o resultado de um ou mais indivíduos. Ensembl tem o seu próprio sistema de
anotação

Matilde Monteiro 75
O que é um genoma de referência?
- Genoma oficial divulgado
- Fornece as coordenadas genómicas para as anotações
- As anotações são colocadas no genoma nos locais corretos
- Não é necessariamente o genoma que todos têm
- Ainda contém alguns erros

- Identificadores de sequências: Accession numbers

Identifica uma só sequência; Não altera, mesmo no caso em que a informação no registo seja alterada;

- Diferentes versões duma sequência tem o mesmo número de acesso (ou identificador), mas com a versão
refletida no número de acesso.

- A versão é incrementada sempre que existe uma modificação da sequência.

Formato: accession#.version

Normalmente os números de acesso são consistentes entre as bases de dados do NCBI, ENA e DDBJ

Porque é importante o alinhamento de múltiplas sequências ?

- Para gerar árvores filogenéticas

- Para detetar regiões conservadas (que não/pouco se alteraram durante a evolução)
- Regiões conservadas são funcionalmente importantes, por ex. domínios emotivos proteicos
- Podem ser usados para encontrar homólogos distantes

Domínios vs Motivos proteicos:

Domínio
- Parte da estrutura terciária que pode existir, fold, funcionar e evoluir independentemente
- Tem função biológica
- Comprimento: 20-100 aminoácidos (longo)
Motivo
- Parte da estrutura primária que se repete em todas as sequências de um alinhamento
- Pode estar associado a um domínio, sendo estes os aminoácidos mais conservados do domínio
- Parte crítica de um domínio essencial para a função biológica (ex. local ativo de uma enzima)
- Comprimento curto

Podem-se inferir propriedades biológicas a partir de sequências

Para uma dada sequência de nucleótidos, podem-se responder a questões como:

Esta é uma sequência codificante ?

Pode esta sequência ligar um dado fator de transcrição ?
Qual é a temperatura de melting ?
Qual é o conteúdo em GC ?
Será que pode adquirir uma conformação secundária estável ?
Etc ...

Matilde Monteiro 76
Como são inferidas a maioria das propriedades biológicas ?

Baseiam-se em dados provenientes de: Milhares de sequências verificadas experimentalmente com uma
certa propriedade; Machine learning.

Ferramentas que fazem estas predições são treinadas: O que é que todas as sequências conhecidas com
uma determinada propriedade têm em comum?; Reconhecem esses padrões em sequências sob consulta
(dão um score e um p-value); Esta abordagem é denominada Classificação

Atenção: Estas são meramente predições ! Necessitam de ser verificadas experimentalmente.

Ontologia genética (GO): GO está organizada numa hierarquia de termos biológicos, estrutura
em árvore, a partir do geral para o específico. Fornece termos que descrevem como o gene se
comporta numa célula. Os produtos do gene são associados com termos de GO com base em
evidências (experimentais ou computacionais).
GO consiste em 3 categorias:

1. Componente celular (biologia celular)

2. Função molecular (biologia molecular)

3. Processo biológico (biologia de sistemas)

Nem toda a informação funcional é recolhida pela GO

Outras bases de dados:
- Vias Metabólicas
- Interações
- Mutações
- Expressão Genética

Matilde Monteiro 77
 T11 – Reparação de DNA

Manutenção da integridade do genoma

• Fiabilidade do processo de replicação (DNA polimerase com capacidade de reconhecer e
remover nucleotídeos mal incorporados)
• Processos de reparação, aquando da ocorrência de um dano no DNA

Nota: estima-se que em cada célula, por dia, há 104 a 106 eventos conducentes a dano do DNA

Causas dos danos no DNA

• Reações espontâneas
• Fatores externos (radiações UV)
• Interação com moléculas resultantes
do metabolismo celular

Modificações espontâneas no DNA

1. Reações de hidrólise – podem resultar em:
o Perda de bases púricas (mais instáveis – 2 anéis azotados)
o Perda de bases pirimídicas (menos frequente)
o Desaminações (metilcitosina transformada em timina; frequente)

2. Reações oxidativas
Causadas por radicais livres (resultantes da atividade da mitocôndria) migram para o
núcleo, causando danos nas moléculas de DNA

3. Reações de metilação - raras nos eucariotas em geral, mas muito comuns nas bactérias

Fatores externos

1. Radiações UV – podem levar à formação de dímeros de bases pirimídicas

o Dímero de timina/citosina - anel ciclobutano entre duas bases seguidas

Matilde Monteiro 78
 2. Ligação de grupos químicos volumosos prejudiciais às bases de DNA
o Benzopirenos - formam-se com o aquecimento de carros, na carbonização e ligam-
se às bases do DNA, causando mutações

Interação com moléculas resultantes do metabolismo celular

Aflatoxina - toxina produzida por fungos no amendoim; liga-se às moléculas de DNA
o Comer muitos amendoins está associado a cancro do estômago

Reparação direta de mutações por intervenção de radiações luminosas ou por recurso a enzimas

• Dímeros de Timina (bactérias)

• Enzimas reconhecem metilações e desaminações e corrigem-nas imediatamente

o O6-Metilguanina - forma-se por ligação de um grupo metilo à guanina

o O6-Metilguanina-metiltransférase - corta a ligação entre o átomo de oxigénio e o
grupo metilo, revertendo a mutação ocorrida

• No entanto, a reparação direta não se adequa a todas as mutações

Matilde Monteiro 79
 Mecanismos de Reparação de DNA

Base Excision Repair (BER)

• Remoção/excisão da base mutada e substituição dessa por
uma base complementar à da cadeia não mutada, não
ocorrendo alteração na sequência das bases na cadeia
• Ocorre antes da replicação do DNA

1) Reconhecimento da mutação pelas glicosidades - as

bases são expostas para o exterior da molécula de DNA
2) Remoção da base mutada o DNA-glicosilase –
reconhece e cliva a ligação entre a base e a
desoxirribose
3) Formação de um AP sit e–local apúrico/apírimidico
(espaço no nucleotídeo sem base)
4) AP endonuclease – cliva a ligação fosfodiéster a meio
da cadeia nucleotídica, no AP site
5) Desoxirribosefosfodiesterase- endonuclease quebra a
outra ligação fosfodiéster
6) Formação de um local sem nucleotídeo
7) DNA polimerase – preenche esse local com o
nucleotídeo complementar
8) DNA ligase – liga os nucleotídeos
9) Formação de uma região correta/reparada de DNA

Nota: quando há a perda de uma base, o início da reparação

por BER começa já na 3ª fase

Matilde Monteiro 80
Dímeros de timina, por exemplo, não podem ser removidos por BER, é necessário remover todo
o nucleotídeo:

Nucleotide Excision Repair (NER)

Ø Mutação presente num oligonucleotídeo, tendo este de
ser todo removido

1) Proteínas XP – sete famílias de proteínas que

reconhecem dano no DNA
o Ligam-se à região lesada
o Função de helicase – separam a dupla hélice
o Função de endonuclease - cortam as extremidades da
região que contém a mutação
o XPA e a XPG
2) Excisão da região lesada
3) DNA polimerase – preenche o espaço
4) DNA ligase – catalisa a ligação fosfodiéster

Xeroderma pigmentosum
• Doença causada por mutações nas proteínas XP
• Indivíduos não possuem as proteínas que assistem nos
mecanismos de reparação dos dímeros de timina
causados pela radiação luminosa
• Maior risco de cancros de pele e do globo ocular, uma vez
que são regiões com maior exposição a radiações
luminosas

Transcription-coupled Repair (reparação do DNA associada à

transcrição)

• RNA polimerase - enzima que, ao transcrever o DNA em

RNA, caso encontre uma mutação, para
• Proteínas CSA e CSB - reconhecem a RNA polimerase
parada na molécula de DNA
o Reconhecimento da região mutada
• Proteínas XP - abrem a dupla hélice e cortam as
extremidades da região lesada, removendo-a
• DNA polimerase
• DNA ligase

Matilde Monteiro 81
Síndrome de Cockayne
• Doença causada por mutações nas proteínas CSA e CSB
• Não vai existir reconhecimento de mutações na cadeia nucleotídica aquando da
transcrição, acumulando-se regiões de DNA em processo de transcrição (RNA
polimerases paradas)
• Atrasos no crescimento e deficiências neurológicas,
aparecendo na infância (não a cancro)

Mismatch Repair
Mau emparelhamento de duas bases que escapa ao
proofreading da DNA polimerase após replicação

1) Reconhecimento da cadeia recém-formada – é

necessário, dado que se a reparação fosse feita na
cadeia de DNA original, reforçar-se-ia a mutação

Proteínas MutS, MutL e MutH Proteínas MSH2 e MSH6

Procariontes
As metilações nos nucleotídeos ocorrem
algum tempo após a replicação - remove-se o
nucleotídeo mal emparelhado na cadeia que
ainda não tem metilações
Eucariontes
As metilações são menos frequentes, sendo
a identificação da cadeia recémformada de
DNA é feita ainda durante a replicação

2) Clivagem e remoção da região lesada

3) Função de helicase e de exonuclease das Mut’s
4) DNA polimerase
5) DNA ligase

Matilde Monteiro 82
Cancro colo-retal não poliposo hereditário (HNPCC)
Doença causada por mutações nas proteínas MSH2 e MSH6

Ineficiência de mecanismo de reparação do DNA → acumulação de mutações → transformação

tumoral das células

Reparação translesão / Error-prone

1) Reconhecimento da mutação durante a

replicação pela DNA polimerase, deixando
esta de replicar

2) DNA polimerase V - faz a síntese de DNA

sobre a região mutada “às cegas”,
estimando que nucleotídeos estão ali e
adiciona nucleotídeos que assume serem
complementares à região lesada (não possui
atividade de exonuclease 3´- 5´)

A maior parte das vezes assume tratar-se de um

dímero de timina e adiciona, por isso, duas
adeninas

3) Mecanismo de NER (nucleotide excision repair)

– ativado sobre aquela lesão após a síntese
da molécula de DNA, levando à remoção e
reparação da região mutada

Este mecanismo apresenta uma grande

probabilidade de erro, já que pode introduzir uma
outra mutação. No entanto, para a célula isto é
preferível a parar a replicação, o que levaria à morte
celular. Assim, acaba por ser um mecanismo de
defesa da célula, permitindo a sua sobrevivência
ainda que à custa de uma nova mutação

DNA no armazenamento da informação genética

• As moléculas de DNA são as mais adequadas para guardar a informação genética pois
cada cadeia possui uma cópia – um “backup” (aquando de uma mutação, a cadeia
complementar serve de molde para fazer a reparação)
• Nos genomas diploides, existem ainda pares de cromossomas homólogos

Matilde Monteiro 83
 • Sendo constituídas só por combinações de 4 nucleotídeos qualquer alteração na cadeia
de DNA é mais eficientemente identificável

• Foi por estes motivos que todas as células se desenvolveram de modo a guardar a sua
informação genética em moléculas de DNA

Nota: se fosse o RNA a conservar a informação genética, nunca se saberia se o uracilo (resultante
da desaminação da citosina) seria ou não um infiltrado

Reparação de dano na dupla cadeia de DNA

Lesão no DNA em que há perda de uma região da dupla cadeia do DNA

Causa: radiação ionizante (raio-X, radioativa)

Reparação não homóloga por junção dos extremos (end-joining)

• Ocorre quando há perda de nucleotídeos na dupla cadeia, levando à junção das duas
extremidades da cadeia de forma a manter a integridade da molécula de DNA, caso
contrário uma destas regiões do cromossoma perder-se-ia e seria pior para a célula.

Heterodímeros Ku – proteínas que reconhecem o dano e ligam as duas extremidades

• Reparação grosseira e com mutações associadas (devido à deleção de nucleotídeos) mas

que, caso não fosse reparada, a lesão seria muito maior
• À medida que envelhecemos, tornam-se “cicatrizes” nas moléculas de DNA, resultantes
de lesões que se foram acumulando ao longo da vida das células

Matilde Monteiro 84
Recombinação homóloga

• Entre duas cadeias durante ou imediatamente a

seguir à replicação, quando as moléculas
recémreplicadas estão ainda muito próximas, de
modo a reparar a quebra de uma delas, sem perda
de nucleotídeos, usando a outra como “molde”.

1) Nick numa das cadeias que vão ser replicadas

2) Quebra da forquilha de replicação
3) Exonuclease – degrada extremidade da
cadeia-mãe, deixando uma região de cadeia
simples
4) Scanning da molécula dupla do DNA até
encontrar uma sequência de homologia
5) Strand invasion - invasão da cadeia dupla pela
simples, por emparelhamento de bases
complementares
6) Formação do heteroduplex -molécula híbrida
com regiões de cadeias simples provenientes
de moléculas diferentes
7) Clivagem
8) Recomeço da replicação

Matilde Monteiro 85
RecA (bactérias) / Rad51 (eucariontes) – liga-se ao longo da
cadeia simples de DNA em mais de um local e permite:
• Catalisa a formação da ligação entre a cadeia simples e
a dupla de DNA
• Permite a invasão da cadeia dupla (vermelha) pela
simples (amarela) quando esta encontra homologia
entre sequências de bases nucleotídicas

Rad52 - favorece a ligação à Rad51, aumentando a eficiência

da recombinação

Heteroduplex’s estendidos por branch migration

• Se não houver intervenção de outras proteínas, a migração do ponto de união (branch

point) dá-se indiferenciadamente nas duas direções.
• Com intervenção de outras enzimas a migração torna-se unidirecional

Helicases – permitem a migração unidirecional dos branch points (ponto de união)

• Entre dois cromatídeos irmãos de modo a reparar a rotura de um deles na sua dupla
cadeia, evitando a perda de nucleotídeos

Matilde Monteiro 86
 1) Exonuclease - criação de
duas regiões de cadeia
simples
2) Rad51/Rad52 - invasão e
scanning
3) Refaz-se a região de perda,
servindo de molde a
informação que consta da
região homóloga

Experiência
• Célula submetida a radiações que levaram à perda de sequências de DNA

• Azul - DNA
• Verde - Bromodesoxiuridina (marcador de síntese de
DNA, a última fase na reparação)
• Vermelho - Mre11 (proteína que intervém no
mecanismo de reparação por recombinação homóloga)

• Grelha metálica - protegeu algumas zonas das radiações

ionizantes (representadas em tons mais escuros)

Mutações nas proteínas BRCA-1 e BRCA-2 (ajudam a

reconhecer regiões de corte na dupla hélice)
• Risco aumentado de cancro hereditário da mama e dos
ovários

Matilde Monteiro 87
 T12 – DNA: Recombinação e transposição

Reparação de DNA

• Numa única base; BER

• Numa sequência de nucleotídeos; NER
• Na dupla cadeia de DNA

Mecanismos de reparação na dupla cadeia de DNA:

• Junção não homóloga - junção dos bordos da região lesada

• Recombinação homóloga - tomando por molde uma cadeia íntegra de DNA

Recombinação homóloga na meiose Recombinação homóloga na reparação

Troca induzida de sequências entre Mecanismo de reparação no dano da dupla
cromossomas homólogos (ex: crossing-over) cadeia de DNA

Entre os dois cromossomas homólogos dos Entre dois cromatídeos do mesmo

genomas diplóides (entre um cromossoma de cromossoma, após a replicação de DNA
origem materna e um cromossoma de origem
paterna)

Enzimas que induzem o início da recombinação

homóloga:

• SPO11 – endonuclease que cortar uma

ligação fosfodiéster numa das cadeias de
DNA;
• MRE11 – exonuclease que vai removendo
nucleotídeos de modo a formar regiões de
cadeia simples.
• Essas regiões de cadeia simples invadem a
cadeia dupla do cromossoma homólogo, e
vão invadi-la até encontrar uma zona de
homologia.

Matilde Monteiro 88
Zona de homologia – regiões com sequências de nucleotídeos semelhantes, para que possa haver
ligação por complementaridade de bases.

Proteínas RAD51 e RAD52 - ajudam a estabelecer esta interação entre cromossomas homólogos

• Uma vez encontrando a homologia, vão formar-se, por complementaridade de bases, as

cadeias complementares (cadeias verdes)

Regiões de heteroduplex – ligação de duas moléculas distintas de DNA por complementaridade

de bases. Estas vão desfazer-se, por quebra das ligações fosfodiéster, havendo várias formas de
isso acontecer:

• Recombinação sem crossing-over - só uma região restrita das cadeias de DNA sofre
recombinação, não havendo uma troca metade a metade das moléculas de DNA

• Recombinação com crossing-over – numa região de heteroduplex há corte das cadeias

exteriores, provocando uma troca metade a metade das moléculas de DNA (cadeia
vermelha numa das extremidades ligada a uma cadeia amarela, e, na outra, o contrário).
Pode existir mais do que um fenómeno de crossing-over ao longo de toda a extensão do
cromossoma, porque existem vários locais de recombinação genética homóloga.

Junção de Holliday – intervém na ligação entre as duas moléculas de DNA por

complementaridade de bases, mas pode depois assumir diferentes conformações:

• Se a resolução ocorrer no eixo que separa as duas

moléculas, não há crossing-over;
• Se a resolução ocorrer num eixo diferente da junção
de Holliday, já vai haver crossing-over, ou seja,
partilha mais ao menos de metade-metade das
moléculas de DNA entre si.

Nota: há moléculas de ação enzimática que vão fazer mover

aquela região de complementaridade de bases de
heteroduplex, num sentido diferente, variando o local de
recombinação homóloga.

Matilde Monteiro 89
Diversidade genética

• A recombinação genética ocorre na formação de gâmetas, e leva à criação de diferentes

características genéticas em cada uma das células sexuais;
• Mesmo alterações num único nucleotídeo são o suficiente para conferir uma grande
diversidade fenotípica de características dos indivíduos da mesma espécie.

Conversão genética

• Fenómeno que ocorre devido à recombinação genética

• Mismatch nas regiões de heteroduplex (ligação de duas cadeias simples provenientes de
duas cadeias de DNA originais distintas)
• O nucleotídeo que esta numa cadeia não emparelha com o que está na cadeia que tem
origem diferente
• O mecanismo de mismatch repair corrige este erro de acordo com uma das cadeias,
criando-se mais cópias de uma determinada sequência de DNA no gâmeta
• É por isso que em certos casos, os gâmetas apresentam-se com maior número de
características provenientes de um dos
progenitores.

O mecanismo de mismatch repair é abortado se a falta de

emparelhamento for elevada. A recombinação só continua
se o proofreading falhar.

Isto é importante já que, caso houvesse ligação

aleatoriamente de duas regiões de DNA que não
fossem perfeitamente homólogas, podia haver uma
correção extensa dos nucleotídeos presentes
naquela região, e isso resultaria em mutações
grandes naquela região do genoma.

Assim, a conversão genética muito pontual e ocorre apenas em regiões em que o

emparelhamento só não é perfeito num pequeno número de nucleotídeos (mutação num
polimorfismo).

Matilde Monteiro 90
Recombinação não-homóloga conservativa (conservative site-specific recombination)

• Recombinação de elementos do DNA que são transportados de um local no genoma para

outro determinado local.
• Jumping genes - elementos móveis no DNA
• Integração / excisão / inversão
• Ex: infeção e entrada de DNA de um vírus ou de uma bactéria no genoma das nossas
células

Recombinase – enzima que favorece a integração/saída de um DNA estranho noutra região

dadora do genoma. Muitas vezes codificada pelo próprio elemento móvel.

• Mecanismo importante na formação de anticorpos ao longo do desenvolvimento

embrionário e na formação das diferentes linhagens de linfócitos.

Anticorpo/Imunoglobulina - proteínas grandes que são

constituídas por 4 cadeias polipeptídicas:

• 2 cadeias pesadas (têm uma fração constante)

• 2 cadeias leves
• Região variável de aminoácidos no terminal amina de
todas as cadeias (diferente entre imunoglobulinas)

Recombinação genética na formação de imunoglobulinas

Ø Há muita mais variedade de anticorpos produzidos do que nos genes os codificam nos
linfócitos B, e isto deve-se à recombinação genética (não homóloga) site specific que
ocorre antes da produção do respetivo mRNA.

Cadeias leves – recombinação VJ (variability and joining)

• Sequências no genoma dos linfócitos que codificam para as cadeias leves dos anticorpos
• Rearranjo de DNA – uma região V (de 250) liga-se a uma das 4 regiões J
• Produção do transcrito primário (o pré-mRNA) que depois sofre splicing, dando origem
a um mRNA (com região V, J e C) que codifica a cadeia leve da imunoglobulina É
produzido um mRNA único de entre outras 1000 combinações possíveis

Matilde Monteiro 91
 Cadeias pesadas – recombinação VDJ (variability, diversity and joining)

• Sequências no genoma dos linfócitos que codificam para as cadeias pesadas dos
anticorpos
• Rearranjo de DNA – uma região V (de 500) liga-se a uma das 12 regiões D, que por sua
vez se vai combinar com uma das 4 regiões J
• Produção do transcrito primário (o pré-mRNA) que depois sofre splicing, dando origem
a um mRNA (com região V, D, J e C) que codifica a cadeia pesada da imunoglobulina É
produzido um mRNA único de entre outras 24000 combinações possíveis

• No final, uma sequência codificante da cadeia leve junta-se a uma sequência da cadeia
codificante da cadeia pesada
• O conjunto destas diversas combinações vai permitir criar uma grande variabilidade de
anticorpos diferentes

Matilde Monteiro 92
Recombinases Rag1 e Rag2 – enzimas que catalisam a
recombinação VDJ; são expressas especificamente nos
linfócitos; mutações nos genes que as codificam, dão origem
a imunodeficiências severas.

• Catalisam a ligação das regiões V, D e J (D na cadeia

pesada)
o Catalisam o corte das regiões de uma sequência da
região V e outra da J
o Na cadeia pesada, ligam a V à D e depois a D à J
• Corte nos locais de interface entre as regiões a
manter, sendo uma parte excluída

Hairpin - região de ligação entre as duas cadeias

complementares do DNA, que posteriormente será quebrada; essa quebra pode ser:

• Simétrica - transferase de desoxirribonucleotídeos terminal adiciona nucleotídeos na

extremidade, formando uma cadeia simples
• Assimétrica - quebrando assimetricamente as ligações por pontes de hidrogénio, fica uma
região de cadeia simples

Nota: as duas possibilidades de corte criam uma variabilidade adicional na formação dos
anticorpos

DNA polimerase – preenche esses locais de cadeia simples

DNA ligase IV – liga as duas extremidades das regiões

Estes mecanismos conjugados vão

permitir que nós consigamos ter um
número de anticorpos suficiente para
podermos combater a maior parte das
infeções (uma vez produzidos os
anticorpos, eles são mantidos no nosso
sistema imunitário)

Matilde Monteiro 93
 Transposição de DNA

Transposões de DNA-only (3% do DNA) – elementos móveis de DNA com regiões codificantes
(ex: o próprio gene da transposase); podem ser reconhecidos nos cromossomas pelas sequências
de repetição invertidas nas extremidades (20 pb). Nas extremidades, têm target site direct repeat,
que são sequências que depois vão ser transferidas para o local onde se vão
inserir (5 a 11 pb)

Transposase – enzima que catalisa a transposição do elemento móvel de DNA, através de um

movimento de cut-paste

Matilde Monteiro 94
 1) Clivagem do transposão pelas suas extremidades invertidas pela transposase
2) Cortes alternados (de modo assimétrico) no DNA recetor pela transposase, formando
regiões de cadeia simples
3) Inserção (catalisada pela transposase)
4) Correção das regiões de cadeia simples pela DNA-polimerase e ligase
5) Target-site direct repeat no local de inserção
6) Junção da quebra no cromossoma dador

Se este processo acontecer durante a replicação e se uma sequência, um transposão, for inserido
numa região que ainda não foi replicada, pode acontecer a formação de um novo transposão
naquele genoma. Estes dificilmente são excluídos.

Mecanismo da infeção por retrovírus (vírus de RNA)

1) RNA entra na célula hospedeira

2) Transcriptase reversa (codificada no seu RNA) produz DNA complementar
3) Integração do DNA Complementar no genoma da célula hospedeira
4) Transcrição e tradução do DNA vírico
5) Formação de novos retrovírus

Matilde Monteiro 95
Retrotransposões do tipo retroviral / retrovirus-like / endogenous retroviruses (8% do DNA)

• Partilham com os retrovírus (vírus de RNA) os mecanismos de infeção assim como quase
toda a informação genética, à exceção das proteínas do invólucro:
o Região codificante das enzimas transcriptase reversa e integrase
o Long terminal repeats (LTR)
o Target-site direct repeat
• Inserem-se em diferentes locais do genoma na célula onde existem

1) Transcrição do retrotransposão – produção de mRNA através do DNA retroviral que codifica

o retrotransposão

2) Transcrição reversa do mRNA do retrotransposão – síntese de cDNA de cadeia dupla a partir

da molécula de RNA pela enzima transcriptase reversa no citoplasma

1. Ligação de tRNA ao mRNA

2. Formação de cDNA a partir de uma das extremidades do m RNA (5’-3’) usando como
primer o tRNA
3. Degradação do mRNA dessa região híbrida DNA
4. Jumping – salto da região passa para a outra extremidade (emparelhamento das
regiões R do LTR)
5. Síntese do resto do cDNA a partir do fragmento que saltou
6. Digestão da maioria do mRNA
7. Pequena região restante de mRNA como primer para a formação do resto do cDNA
8. Remoção de todo o mRNA
9. Fim da síntese de cDNA complementar

Matilde Monteiro 96
3) Integração do DNA do retrotransposão -
molécula de DNA linear é integrada no local
recetor pela ação da enzima integrase,
também codificada pelo retrotransposão
1. Migração do cDNA para o núcleo em
conjunto com a integrase
2. Inserção no DNA nuclear

Retrotransposões não-retrovíricos (34% do DNA)

1) LINE (Long Interspersed Nuclear Element)

• 3 tipos - L1, L2 e L3 (Só as L1 é que se mantém móveis nos genomas humanos)

Matilde Monteiro 97
 • ORF1 (Open Reading Frame 1) - codifica uma RNA
binding protein (proteína que se liga ao RNA)
• ORF2 (Open Reading Frame 2) - codifica uma enzima
que tanto é transcriptase reversa como endonuclease
(corta a molécula de DNA)
• Regiões ricas em adenina-timina
• Target site direct repeat

1. Síntese de mRNA
2. Formação, a partir desse mRNA, das proteínas
que codificam nomeadamente a transcriptase
reversa/endonuclease
3. Golpe na molécula de DNA-alvo pela
endonuclease
4. Produção da sequência de cDNA por ação da
transcriptase reversa
5. Afastamento das extremidades do DNA-alvo
6. Integração do cDNA

2) SINE (Short Interspersed Nuclear Element)

• Sendo mais pequenos, não codificam as enzimas
necessárias para a sua retrotransposição
• Movem-se recorrendo às enzimas codificadas nos
LINE (parasitismo)
• Os mais comuns são as sequências Alu (têm locais de restrição para a enzima de restrição
Alu)

No genoma humano

• Cerca de 3% do DNA constitui transposões, não se sabendo muito bem qual a sua
vantagem. Uma vez inseridos, dificilmente são removidos do genoma, mesmo em termos
evolutivos, tendem a acumular-se.
• Os retrotransposões do tipo não vírico constituem no seu conjunto 34% do genoma e do
tipo retrovírico constituem 8%
• Felizmente, no humano eles movem-se pouco porque podem mover-se de modo a
inativar um gene e podem levar a uma transformação tumoral ou à morte da célula.

Matilde Monteiro 98
Pseudogenes processados - Regiões de DNA
complementares a mRNA já processados
aparecem integrados no genoma já sem
intrões e com cadeias poli A integradas e
flanqueadas pelo Short Direct Repeats

• Enzimas transcriptase reversa e

endonuclease apanharam aqueles
mRNA, formaram DNA complementar
e integraram-no no genoma
• Têm mutações acumuladas, o que mostra que esta inserção no genoma já teve lugar há
muito tempo em termos filogenéticos

Consequências da transposição

1) Morte celular - se houver uma transposição de uma região de DNA para o meio de um
gene que comprometa a viabilidade daquela célula

2) Transformação tumoral /surgimento de uma doença

3) Duplicação de exões

4) Duplicação de genes

5) Partilha de exões entre moléculas de DNA

Matilde Monteiro 99
 6) Inserção de dois transposões com uma região codificante no meio

7) Inserção de um gene transcrito (pseudogene) juntamente com um elemento móvel

A transposição de elementos móveis do DNA influencia a evolução das características dos

genomas

Amplificação genética

• Fenómeno que altera significativamente as características das células

• Restringe-se a células que estão em muito rápido crescimento como ovócitos ou células
tumorais
• Multiplicação da replicação de um determinado gene várias vezes como que em paralelo

Matilde Monteiro 100

 T13- Instabilidade genómica e doenças associadas

Dano no DNA – alteração na estrutura física ou química da molécula de DNA. Ex.: perda ou
alteração química de uma base, quebra da dupla cadeia.

Se não for reparado…

Mutação genética – mudanças na sequência de nucleotídeos na molécula de DNA. Podem dever-

se a inserções, deleções, substituições ou rearranjos dos pares de bases.

Instabilidade genómica – tendência acrescida para adquirir mutações no genoma das células ao
longo da vida.

Minimizada por 4 mecanismos principais:

• Grande fidelidade da replicação do DNA na fase S do ciclo celular

• Reparação do dano no DNA (os mecanismos de reparação são redundantes,
portanto se falha um, intervém outro)
• Segregação precisa dos cromossomas durante a mitose

• Progressão coordenada do ciclo celular

A instabilidade genómica origina manifestações diversas:

- Deleções ou alterações num único nucleotídeo (modificação genética menor que pode inativar ou
sobreativar um gene)

- Rearranjos genómicos extensos, deleções, inserções, repetições, inversões, translocações

- Falência da reparação de danos no DNA (quando o dano é muito extenso), em especial das quebras da
dupla cadeia do DNA (impede a progressão da replicação)

A instabilidade genómica promove a tumorigénese.

As deleções genómicas extensas podem existir em mosaico (quando apenas algumas células do
tecido sofrem alterações), contribuindo para o fenótipo do envelhecimento com acumulação de
células disfuncionais nos tecidos.

Matilde Monteiro 101

 Resposta celular ao dano no DNA (DDR)
O mecanismo de reparação ativado depende do tipo de lesão que ocorre no DNA:

• Dano numa única base à BER (base excision

repair) ou DR (direct repair)
• Dano em mais do que 1 nucleotídeo à NER
(nucleotide excision repair)
• Incorreto emparelhamento dos nucleotídeos
na dupla cadeia de DNA à Mismatch Repair
• Dano na dupla cadeia de DNA à HR
(homologous rejoin) ou NHEJ (non-
homologous end jointing) Quando estes
mecanismos de reparação não funcionam de
modo adequado surgem doenças.

A falência do mecanismo de reparação da quebra na cadeia simples de DNA envolve várias

moléculas, como a PARP1/2 (esta enzima funciona como um marcador do local onde se encontra
o dano) e a TDP1 (participa também no reconhecimento do dano na cadeia simples de DNA,
intervindo no reconhecimento da Topoisomerase I bloqueada junto do dano de DNA).

• Ataxia com apraxia oculomotora tipo 1

Nesta doença, para além de ocorrer ataxia (descoordenação motora), há também uma
apraxia oculomotora (dissociação do movimento dos olhos relativamente ao da cabeça).
• Ataxia espinocerebelosa com neuropatia axonal tipo 1
Doença onde ocorre ataxia e outras manifestações, nomeadamente malformações
esqueléticas. Os doentes possuem atrofia difusa do cerebelo e alguns apresentam défice
cognitivo.

A falência do mecanismo de reparação NER deve-se a alterações nas proteínas capazes de

reconhecer o dano (proteínas XP e proteínas CSA e CSB).

• Xeroderma Pigmentosum (XP)

Mutações nos genes das proteínas XP(A, B, C, …).Clinicamente associa-se a manifestações:

Matilde Monteiro 102

 - Mucocutâneas
- Oculares
- Neurológicas

Intervenções preventivas:
- Evicção de todas as fontes de radiação UV
- Correção de défice de vitamina D
- Tratamento com retinoides orais, 5-fluouracilo ou enzimas de reparação de DNA – endonuclease T4 de
bacteriófago ou fotoliase
(intervém nos dímeros de pirimidina)
- Vigilância por dermatologia, oftalmologia e neurologia

• Síndrome de Cockayne (CS)

Mutações nos genes das proteínas CSA e CSB. Alguns dos sintomas são a falta de crescimento,
cataratas, alterações do neurodesenvolvimento, problemas neurológicos, problemas
gastrointestinais, hepáticos, renais, respiratórios e endócrinos.
O fenótipo facial característico é a perda de tecido adiposo, em especial do subcutâneo (aspeto de olhos
encovados).

• XP-CS
Mutações nos genes XPB, XPD e XPG. Conduz a sintomas típicos da Síndrome de Cockayne
com queimaduras solares severas e pigmentação.

• Síndrome cérebro-óculo-fácio-esquelética
Para além de mutações no gene que codifica a proteína ERCC6/CSB, pode haver também
mutações no gene ERCC5.
O fenótipo dos pacientes é caracterizado por microcefalia, microftalmia (olhos encovados), nariz
proeminente e pavilhão auricular grande.

• Tricotiodistrofia
Associada a mutações nas proteínas da família XP.
Verifica-se cabelo frágil, síntese anómala das queratinas que contêm enxofre e cisteína, défice
intelectual e fotossensibilidade.

A falência do mecanismo de reparação de crosslink entre cadeias de DNA (ICL) também origina
doenças.

Em células quiescentes, a remoção das ICL é efetuada por NER. Em células em proliferação, as
ICL são reparadas de modo diverso.

è Anemia de Fanconi
Trata-se de uma anemia perniciosa que se deve à perda da proliferação das células
hematopoiéticas na medula óssea.
O fenótipo é variável (tanto pode estar quase ausente, como pode ser bastante presente
e implicar o transplante de medula óssea).
Estes doentes apresentam um risco aumentado de cancros, nomeadamente cancros de
sangue.

Características físicas: manchas pigmentadas (manchas café-au-lait), baixa estatura,

anomalias nos membros, alterações no aparelho genital, malformações renais, …

Matilde Monteiro 103

A falência do mecanismo de reparação da quebra da dupla cadeia do DNA origina certas
patologias.

è Ataxia telangiectasia
Mutação na proteína ATM ataxia telangiectasia mutated (proteína que reconhece a quebra
na dupla cadeia).
Principais características: degeneração cerebelar, telangiectasias oculocutâneas (vasos
sanguíneos subcutâneos visíveis na pele), alterações oculomotoras, hipersensibilidade a
radiações ionizantes, imunodeficiência, instabilidade genómica e predisposição para
cancro.

ATM – Enzima responsável pelo reconhecimento dos danos no DNA e pela ativação dos
mecanismos de resposta ao dano na dupla cadeia de DNA. É ativada pela dissociação das 2
subunidades que a constituem.

Mutações na proteína NBS1 dão origem à Síndrome de Nijmegen breakage. É uma doença
rara que se caracteriza por microcefalia, atraso de crescimento, imunodeficiência e
predisposição para cancro.

O cancro da mama hereditário pode resultar de mutações em proteínas que intervêm na reparação
do dano na dupla cadeia de DNA: BRCA1 / BRCA2.

A falência do mecanismo de mismatch repair deve-se a mutações nas proteínas MLH1, MSH2,
MSH6 e PMS2.

è Síndrome de Lynch
Caracterizada por lesões no intestino. Estas aumentam o risco de cancro, como o cancro
colorretal não poliposo hereditário.
Os doentes apresentam instabilidade dos microssatélites (regiões não codificantes nos
cromossomas), sendo que esta pode ser analisada por PCR.

Matilde Monteiro 104

A instabilidade genómica também se pode associar a alterações estruturais no núcleo celular.

A heterocromatina, em especial a constitutiva, tem um papel importante na arquitetura nuclear e

na manutenção da estabilidade do genoma ao manter imóveis os transposões, suprimir a
recombinação e diminuir a transcrição.

Alterações nas proteínas que constituem o invólucro nuclear vão estar na origem de síndromes
associadas a instabilidade genómica.

Laminopatias – alterações nas proteínas que constituem a lâmina nuclear. Manifestam-se como
doenças do envelhecimento acelerado (progeria) ou distrofia muscular

Há perda da heterocromatina.

A progeria deve-se a mutações no gene que codifica a lamina A.

Doença associada a outras proteínas que conferem estabilidade ao invólucro nuclear:

Distrofia muscular de Emery-Dreifuss - alterações na morfologia do núcleo celular com

distribuição anómala da emerina. Conduz a interações deficientes entre emerina e laminas.

O envelhecimento também está associado à instabilidade genómica.

Este define-se como o declínio funcional, dependente do tempo que conduz no limite à morte do
organismo.

• Ao longo do tempo, os danos celulares acumulam-se, levando à perda de função.

• Os danos celulares podem ocasionalmente levar a transformações aberrantes das células que lhes
conferem vantagem sobre as outras, podendo originar um cancro.
• Deste modo, o envelhecimento e o cancro podem ser vistos como diferentes manifestações de dano
celular.

Matilde Monteiro 105

Ao longo do tempo pode haver ainda translocações de regiões dos cromossomas, ganhos ou
perdas de cromossomas e disrupção genética devido a integração de genomas víricos ou
transposões / retrotransposões.

Além disso, os mecanismos de reparação do DNA tornam-se menos eficientes com o passar do
tempo.
Deficiências nos mecanismos de reparação do DNA estão na origem de diversas síndromes
progeróides. A falência ou lentidão (slowrepairing) da reparação das DNA double-strands conduz
à senescência replicativa de um modo independente do encurtamento dos telómeros.

Genoma mitocondrial no envelhecimento

Particularmente suscetível a danos devido ao ambiente pro-oxidativo da mitocôndria, à não-
ligação a histonas (DNA menos compactado) e à ação limitada dos mecanismos de reparação de
DNA. Mutações na DNA polimerase γ estão na base de síndromes progeróides, diminuição da
esperança de vida e acumulação de mutações e deleções no DNA mitocondrial do ratinho.

Metilação do DNA
As próprias modificações epigenéticas associam-se ao envelhecimento, pois à medida que
envelhecemos verifica-se uma perda gradual da metilação do DNA. Consequentemente, o DNA
passa a estar menos compactado e a expressão genética menos reprimida.

A arquitetura do núcleo celular intervém na estabilidade genómica e altera-se ao longo do

envelhecimento.

- A lâmina nuclear estabiliza a cromatina no núcleo e regula estabilidade genómica

- Mutações nos genes que codificam as laminas originam síndromes progeróides

- No envelhecimento há produção de progerina – forma truncada da lamina A

- A disfunção telomérica associada ao envelhecimento também promove o aumento da produção da

progerina

- A expressão da lamina B1 diminui ao longo do envelhecimento

Os telómeros são assumidos na célula como DNA breaks que não são reconhecidos pela
maquinaria de reparação de DNA.
Para além do encurtamento a que estão sujeitos, as mutações geradas nos telómeros são
inacessíveis às moléculas de reconhecimento de danos, devido à ligação das shelterins aos
telómeros. As mutações nos telómeros são, assim, das mais persistentes que ocorrem no núcleo
celular.

Doenças associadas a deficiência de Telomerase ou mutações nas shelterins:

• Fibrose pulmonar idiopática

• Disqueratose congénita Resultam da perda de
capacidade regenerativa dos tecidos
• Anemia aplástica

Matilde Monteiro 106

 T14- Técnicas de Diagnóstico em Genética Molecular III - MLPA e Microarrays

MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification)

Identifica alterações cromossomicas (rearranjos cromossómicos)

• Amplificação de sondas dependente da ligação
• Variação do PCR que permite a amplificação de múltiplas sequências-alvo com a utilização
de apenas um par de primers.
• Permite:
1) Análise de muitas sequências-alvo de DNA numa única reação de PCR (40-50
sequências)
2) Determinar alterações no número de cópias de sequências específicas de DNA e
RNA
3) Deteção da quantidade relativa de sequências-alvo
4) Deteção de mutações
• Ex: utilização após amniocentese para rastreio ecográfico de patologias

1) Desnaturação e hibridação

Sondas (fragmentos de DNA que são complementares a uma determinada região do genoma) -
constituídas por duas hemi-sondas

• Sequência de hibridação - complementar à sequência-alvo (azul)

• Região constante, igual a todas as sondas (preto)
• Sequência stuffer - segmento que confere tamanho à sonda (verde)

2) Ligação
• As hemi-sondas hibridizam com as sequências-alvo adjacentes
• Ligase termoestável - une as duas hemi-sondas que hibridaram com o DNA-alvo o Esta
união só ocorre se o processo de hibridação não contiver nenhuma falha de
emparelhamento

Matilde Monteiro 107

3) Amplificação das sondas por PCR
• Desnaturação dos híbridos
1) Temperaturas elevadas (96ºC) – quebra das pontes de hidrogénio
2) Libertação das sondas do DNA original
3) Dentro do tubo - DNA original (molde para as sondas se unirem) e sondas
(unidas pela ligase)
• Amplificação das sondas ligadas (não do DNA)
o Cada sonda tem um comprimento único
o Primers – um só par permite amplificar todos os produtos das ligações já que as
sondas foram criadas para que as extremidades fossem iguais
• Fluorocromo no primer – permite a visualização de picos num perfil de amplificação,
que correspondem à amplificação de cada uma das sondas
• Picos – cada um tem um tamanho específico, permitindo deduzir a que região do
cromossoma é que corresponde

4) Eletroforese capilar e análise dos resultados

Cálculo em que consideramos:

• Tamanho (saber exatamente a que posição e a que cromossoma corresponde cada um

dos picos obtidos)
• Área dos picos

Quanto mais sinal (quantidade amplificada), mais sondas se ligaram, logo maior é a quantidade
do segmento no genoma a estudar

• Rácio – cálculo da divisão entre a área média de um pico para um cromossoma e a de

outro
• Serve para comparar entre vários rácios até encontrar uma anormalidade
• No caso de trissomias, dará um rácio de 1,5 (há 3 cromossomas para os 2 normais)
• Útil para deteção de inserções e deleções, porque se as sondas não se ligarem devido à
existência de uma região que está deletada ou onde há alteração de um único
nucleotídeo, isso é suficiente para que não haja uma hibridação completa
• Possível detetar:
o Microdeleções
o Microinserções
o Mudança de um único nucleotídeo

Matilde Monteiro 108

 Exemplo - Cromossoma X
Homem Mulher com síndrome de triplo X
O pico para o cromossoma X vai ter uma menor O pico para o cromossoma X vai ter uma
área, só existe um cromossoma (as sondas só se maior área, porque existem mais sítios para
ligaram a este e, quando amplificamos, só vamos a sonda se ligar (3 cromossomas), sendo
ter metade da quantidade das sondas que assim maior o sinal de amplificação
teríamos se realizássemos a amplificação das
sondas para o cromossoma X numa mulher, que
tem dois cromossomas X e, portanto, dois locais
para as sondas se ligarem)

Deteção da deleção dos exões 1-6 em homozigotia/heterozigotia no gene ASPA:

Diagnóstico pré-natal de aneuploidias:

Matilde Monteiro 109

Kits de sondas

• Sondas para um único gene - verificar se há ganho ou perda de exões

• Sondas para cromossomas – verificar se há ganho ou perda de cromossomas inteiros
(aneuploidias) o Ex: 8 sondas para os cromossomas 13, 18, 21, x e y, já que são as únicas
trissomias compatíveis com a vida, para além das que podem existir nos
cromossomas sexuais – as sondas vão-se ligar oito vezes ao longo de todos esses
cromossomas

Vantagens Desvantagens
Deteção do número de cópias de 40 a 50
A técnica não consegue determinar a
sequências de DNA genómico numa única
localização exata da alteração
reação

Rapidez na obtenção de resultados (24h) São necessárias, pelo menos, 3000 células
Apenas um par de primers é necessário para É mais sensível a contaminantes do que as
amplificar todos os segmentos reações de PCR normais

Útil para avaliar microdeleções e

Focado na análise do DNA humano
microduplicações

Sensível a sequências que diferem em apenas um Não permite detetar situações de triploidia
nucleótido (rácios mantinham-se)
Exige poucos equipamentos e o preço dos Não deteta anomalias cromossómicas
reagentes 12€/ reação estruturais equilibradas (translocações)

Protocolo simples e controlo de qualidade de fácil Não deteta contaminação materna

execução (podemos estar a analisar DNA da mãe)

Variantes da MLPA

Reverse transcriptase MLPA – análise da expressão

génica

• Extração do mRNA
• Conversão em cDNA pela transcriptase
reversa
• De resto é em tudo semelhante MLPA
• As sondas são desenhadas para hibridar em
2 exões consecutivos na sequência alvo,
evitando a hibridação em intrões
• Permite detetar os genes “on” e “off”

A Ligase-65 usada no MLPA não consegue ligar as

sondas associadas a RNA.

Matilde Monteiro 110

Methylation-Specific MLPA - estudo de metilação em
genes, permitindo a avaliação do imprinting
genómico

• Duas reações - uma com DNA metilado e a

outra sem DNA metilado
• Amostra sem metilação - MLPA padrão, de
modo a detetar o número de cópias
• Amostra com metilação - endonuclease,
HHA1 digere o DNA não metilado, sendo
apenas amplificados os fragmentos que
estão
• Rácio entre os metilados e os não metilados para detetar a percentagem de metilação
daquele gene

Microarrays

Análise simultânea de várias amostras (com diferentes origens) dispostas ordenadamente, num
microchip; Permite analisar ácidos nucleicos (mais comuns), tecidos, proteínas ou células

Microarray de ácidos nucleicos

• Conjunto ordenado de milhares de diferentes sequências nucleotídicas específicas dispostas

sobre uma superfície sólida (lâmina de vidro de microscópio)
• Permite determinar os padrões de expressão de genes em:
o Diferentes tipos de células
o Célula em diferentes estádios de desenvolvimento
o Célula em condições diferentes
Permite avaliar:
o Deleções e duplicações de material genético

o Expressão genética

Processo:

1) Selecionar um semento de DNA de cada gene de interesse

2) Amplificação por PCR
3) As amostras amplificadas são impressas nas lâminas de vidro por um sistema
robótico funcionando como sondas

Matilde Monteiro 111

Preparação do DNA shop (oligonucleotide array)
• Cada spot da lâmina contém a sequência de DNA
correspondente a um único gene
• Obtém-se uma lâmina à qual estão ligadas variadas
sequências (oligonucleotídeos) de DNA representativas
dos genes em análise (funcionam como sondas)
• Cada sequência possui várias cópias, o que permite a
ligação de diversas cópias do mesmo gene no mesmo
ponto
• São conhecidas a sequência e a posição exatas de cada
sonda no chip
• Múltiplos oligonucleotídeos de DNA (20 nucleotídeos) são
sintetizados (in situ) a partir de um nucleotídeo inicial que
se encontra covalentemente ligado numa região específica da superfícies da lâmina
• Múltiplos oligonucleotídeos são sintetizados primeiro (não in situ) sendo depois efetuado o
spotting por um sistema robótico
• Produção de oligonucleotídeos representando milhares de genes ou todo o genoma
• Quanto mais densa for a impressão, maior será a cobertura do genoma

1) Extração de mRNA de cada uma das amostras

2) Transcrição-reversa (mRNA-cDNA)
3) Marcação dos cDNA com fluorocromos diferentes (verde e vermelho)
4) Hibridação dos cDNA marcados, em igual quantidade, com o microarray (sondas)
5) Análise da intensidade da fluorescência expressa em cada ponto através de um scanner
e software adequado

Matilde Monteiro 112

Resultados

Spot => várias cópias da mesma sequência => a intensidade relativa da fluorescência observada
corresponde ao nível de expressão de cada gene

Aplicações

• Determinar o padrão de expressão de milhares de genes ao mesmo tempo, permitindo

que fenótipos complexos e semelhantes sejam definidos a um nível molecular
• Determinar o perfil de expressão génica de certas patologias poligénicas (como a
esquizofrenia ou a doença de Alzheimer
• Terapia individualizada: prever resposta terapêutica a fármacos e otimizar a sua utilização

Microarray-based Comparative Genomic Hybridization

(arrayCGH)

• Utiliza DNA cromossómico para analisar mutações no

DNA
• Permite identificar amplificação ou deleção de genes ou
regiões genómicas
• Os fragmentos são hibridados num microarray
juntamente com fragmentos pertencentes a um “DNA
de referência”, cuja posição no respetivo cromossoma é
conhecida

Microarray de Proteínas

• Proteínas estão ligadas à lâmina constituinte do chip

• O chip é hibridado com outras proteínas, ácidos nucleicos ou pequenas moléculas de forma
a identificar possíveis interações existentes:
o Proteína-proteína

o Proteína-molécula(s) a testar

o Proteína-ácido nucleico

Microarray de Tecidos

Análise simultânea de várias amostras de tecidos,

células de biopsia ou de cultura in vitro que
foram dispostas num microchip

Matilde Monteiro 113

 T15 – Transcrição: RNA mensageiro

DNA

• Molécula que existe no núcleo das células, nas mitocôndrias e nos plasmas das células
vegetais
• Codifica a formação de RNA (ácido ribonucleico) e este, por sua vez, vai servir para formar
proteínas (que vão constituir o fenótipo da célula)

Dogma central da biologia molecular

A transcrição molecular é transmitida resíduo por resíduo, de um modo unidirecional e sempre

neste sentido: de DNA para RNA e de RNA para proteínas

Transcrição Tradução

Passagem de informação molecular de ácido

Passagem de informação molecular do ácido ribonucleico para proteína
desoxirribonucleico (DNA), resíduo por (moléculas muito diferentes, uma vez que o RNA é
resíduo, ao ácido ribonucleico (RNA) formado por nucleotídeos e as proteínas são
polímeros de aminoácidos)

Gene - sequência de DNA que contém a informação necessária para a síntese de uma cadeia
polipeptídica ou um RNA funcional

Ø Não só a codificante, mas também a ativadora ou a reguladora

RNA (ácido ribonucleico)

• Polímero de nucleótidos
• Molécula com características ácidas marcadas
• Existe no núcleo, no citoplasma e na mitocôndria
• Açúcar – ribose (pentose)
• Tem mais um grupo hidroxilo do que o DNA no carbono 2 (mais
reativa e mais instável)

Matilde Monteiro 114

• Enquanto no DNA existe timina, esta base azotada é substituída, no RNA, por uracilo, sendo
este capaz de emparelhar com a adenina, formando duas pontes de hidrogénio

Backbone do RNA - coluna de resíduos de ácidos fosfóricos, alternados

com resíduos de açúcares

• As bases azotadas estão todas voltadas para dentro

• Pode formar regiões de cadeia dupla, localmente

Funções catalíticas do RNA

Ribozima – enzima de RNA que catalisa reações químicas

o Para criar um centro ativo, é necessário que o RNA assuma
uma estrutura tridimensional (acolher os substratos)
o Harpin, Stem-loop e Pseudoknot

RNP= RIBONUCLEOPROTEÍNAS

Ribonucleoproteínas = RNA + RNA binding proteins

• Uma vez que a cadeia simples de RNA tem mais um grupo hidroxilo
na ribose, o que o torna uma molécula extremamente instável, o RNA,
nas células, está sempre associado a proteínas

• Caso contrário, a molécula de RNA, sem proteínas, é degradada

(RNAses)

Transcrição do DNA

A passagem de informação molecular do DNA para o RNA, catalisada por RNA polimerases
II

RNA polimerases

• Abrem a dupla cadeia de DNA

• Identificam os nucleotídeos que existem na cadeia
de DNA
• Polimerizam a adição de nucleotídeos
complementares
• Estabelecem a formação das ligações fosfodiéster
entre eles
• Forma-se uma cadeia de RNA complementar, com
a exceção de onde deveria aparecer timina,
aparece uracilo

Matilde Monteiro 115

 • Proofreading - quando incorpora mal um nucleotídeo, tem a capacidade de o remover
por ação de exonucleases e depois permite acrescentar um novo nucleotídeo já
emparelhado corretamente

Nota: O proofreading da RNA polimerase não é tão acentuado como o da DNA polimerase, dado
a menor gravidade dos possíveis danos - um DNA mal replicado pode ser transmitido à
descendência, enquanto que uma proteína mal sintetizada pode ser substituída por outra

Transcriptase bubble – abertura da dupla cadeia de DNA pela RNA polimerase, com ajuda de
fatores de transcrição, permitindo a leitura da cadeia simples de DNA e a incorporação de
ribonucleotídeos

Considera-se por convenção que o primeiro nucleotídeo a ser transcrito é o +1 e faz-se contagem
crescente a partir dele no sentido 5'-> 3'

A polimerização do RNA ocorre sempre de 5´para 3´

Upstream/a montante

• O que está antes do local de início da transcrição, no local de contagem negativa

• Embora não sejam transcritas, são sequências que vão ser importantes para regular o
processo da transcrição

Downstream/a jusante

O que é transcrito, no local de contagem positiva da transcrição

Matilde Monteiro 116

As RNA polimerases podem iniciar a polimerização de ribonucleotídeos sem primers (de novo)

Diferentes tipos de RNA polimerases

Nota: nos procariotas, há uma única RNA polimerase responsável pela síntese das moléculas todas

Matilde Monteiro 117

Subunidades das RNA polimerases

• A estrutura das subunidades das RNA polimerases é muito conservada durante a

evolução
• As diferentes RNA polimerases partilham muitas subunidades, sendo outras caraterísticas
de cada uma das enzimas

CTD (carboxil terminal domain)

• Cadeia carboxílica terminal, numa das suas subunidades beta da RNA polimerase II, que
se estende para além da região glomerular da enzima
• Importante para o amadurecimento dos RNA mensageiros
• Sequência de Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser repetida, fosforilada durante a transcrição
• Quando a enzima está em grande atividade, a cadeia apresenta-se hiperfosforilada

Diferentes sensibilidades a α-amanitina

• Amanitina - toxina produzida pelos cogumelos Amanita phalloides

• Provoca a inibição da RNA polimerase II, eliminando a transcrição de todos os mRNA

RNA polimerase I RNA polimerase III RNA polimerase II

Só é sensível em
Absolutamente insensível a
concentrações muito Inativada pela α amanitina
esta toxina
elevadas

Fatores de transcrição - moléculas que reconhecem e se ligam à RNA polimerase II para que se
inicie a transcrição

• TFII (Transcription factor II) - fatores de transcrição geral para que a RNA polimerase II se
consiga ligar ao DNA
• Fatores de transcrição específicos

Matilde Monteiro 118

1) TFIID liga-se à região de inicio de transcrição e reconhece a TATA box
Ø TATA binding protein (TBP) é um dos seus domínios
Ø TBP (TATA Binding Protein) liga-se à TATA box (promotor)
2) TFIIB liga-se
3) TFIIF liga-se juntamente com a RNA polimerase II (ainda com a cadeia CTD desfosforilada)
4) TFIIE e TFIIH ligam-se
5) Complexo de pré-iniciação
6) TFIIH tem função de helicase (abre a dupla cadeia de DNA, expondo sequências de
nucleotídeos na cadeia simples)
7) TFIIH tem função de cinase (fosforila a cadeia CTD da RNA polimerase II)
8) Complexo de iniciação da transcrição da RNA polimerase II desagrega-se
9) Enzima começa a sua atividade de polimerização de ribonucleotídeos

Matilde Monteiro 119

Promotores – sequências de consenso de nucleotídeos reconhecidas pelos fatores de transcrição,
promovendo assim a transcrição

TATA box - região que se localiza a montante (upstream) 25 a 35 nucleotídeos do local de inicio
da transcrição

• Lida pela TATA binding protein

• Rica em A e T
• Região mais fácil de abrir (só duas pontes de H)
• Muitos dos genes transcritos pela RNA polimerase II são assim precedidos pela TATA box
• Lido pelo TFIID

Genes de house keeping “de manutenção”

• Genes transcritos em taxas baixas

• Proteínas que estão sempre a ser transcritas mas sem picos de ativação
• CpG islands – promotores para a transcrição destes genes
o Regiões de citosina e guanina
o Normalmente upstream a cerca de 100 pb
• Sequências de DNA que não estão enroladas à volta de nucleossomas (sempre acessíveis
à ligação de fatores de transcrição e à enzima RNA polimerase II) Ex: actina, tubolina e
outras proteínas do citoesqueleto

Promoters proximal elements – regiões reguladoras a 100 a 200 pares de bases do início de
transcrição

Enhancers – regiões reguladoras localizadas muito longe do local de início da transcrição

• Podem estar dentro de intrões

• Também fazem parte do gene - condicionam a sua atividade

Mediador – proteína que liga os enhancers, através de uma ponte molecular, ao complexo de
iniciação de transcrição

Matilde Monteiro 120

Nota: nas células eucarióticas a transcrição depende ainda da participação de proteínas que
modificam as histonas e remodelam a cromatina (ex.: na cromatina metilada, as proteínas não
conseguem aceder ao DNA e a transcrição fica inibida)

Super-enrolamento - gerado pela RNA Polimerase a

downstream da transcrição

• Dificulta a abertura da dupla hélice

• Facilita o desenrolamento do DNA à volta das
histonas nos nucleossomas
• Antes de ser aliviado, ajuda na progressão da
RNA polimerase ao longo da cadeia

Topoisomerases

Proteínas que se ligam à molécula de DNA para aliviar o super-enrolamento

Processamento/amadurecimento dos mRNA (eucariotas)

Ocorre concomitantemente com a sua síntese

Matilde Monteiro 121

Cadeia CTD fosforilada – importante já que transporta de fatores envolvidos no capping, no
splicing, na clivagem e na poliadenilação

Capping

Ocorre na extremidade 5' do pré-mRNA ao fim de 25

nucleotídeos transcritos (a partir do momento em que a
molécula de mRNA nascente começa a sair da região
globular da RNA polimerase II)

Ligação a uma 7-metilguanosina

O carbono 5’ da ribose da 7-metilguanosina liga-se, através de
3 grupos fosfato, ao carbono 5’ do primeiro nucleotídeo da
molécula de mRNA que se está a sintetizar

Reconhecimento do mRNA

Exportação para o citoplasma – evita a degradação da

extremidade 5' do Mrna

1) Hidrólise do grupo fosfato

2) Ligação do GTP
3) Ligação de mais dois fosfatos
4) Metilação da guanosina (metiltransferase)
5) Metilação da ribose do 1º nucleotídeo do mRNA
Enzimas que intervêm no capping são transportadas na cadeia CTD da RNA polimerase II

Clivagem e poliadenilação

Matilde Monteiro 122

Clivagem – Acontece porque o genoma não é todo
transcrito e inicia em pontos específicos e termina num
ponto específico e aí é necessário parar a transcrição

Sinal de poliadenilação – provoca a paragem na transcrição

• Sequência AAUAAA
• Aparece seguido de uma região rica em guanina e
uracilo

1) Ligação dos fatores de clivagem ao mRNA que está a

terminar a sua transcrição
o Cleavage and poliadenilation specificity sector
(CPSF)
o Cleavage stimulatory factor (CStF)
o Cleavage factor I (CFI)
o Cleavage factor II (CFII)

2) Ligação à PAP (poly-A polimerase)

3) Clivagem da região rica em G/U

4) PAP (poly-A polimerase)

o Catalisa a adição de adeninas (sem a necessidade de
molde de DNA – cerca de 200)
o Adicionar ATP

o Formação da cadeia poliadenilada na extremidade 3’ do RNA

mensageiro, sem que haja um molde da cadeia de DNA

o Começa por funcionar lentamente e depois mais rapidamente

Nota: os mRNAs das histonas são dos poucos que não têm cadeia poli A na extremidade 3´

Splicing

• Remoção dos intrões e ligação dos exões entre si, na molécula de mRNA
o Intrões - regiões não codificantes intercaladas entre os exões
o Exões - regiões conservadas nos mRNA maduros; incluem sequências codificantes

• Ocorre no final da síntese da molécula de mRNA

• Em moléculas muito longas pode acontecer ainda antes de terminar a transcrição

Matilde Monteiro 123

Reações de transesterificação (2) - ligações fosfoéster
passam dum sítio para o outro

1) Primeira ligação fosfoéster entre o Branch point A

(adenina) e o fosfato na
extremidade 5’ do intrão

2) Formação do “lariat” (laço)

3) Segunda ligação fosfoéster entre a extremidade 5’

do exão 2 e a extremidade 3’ do exão 1

4) Ligação dos exões entre si

Nucleotídeos fundamentais do intrão para que o splicing ocorra

• Extremidade 5’ - guanina, uracilo, adenina/guanina (GUA/G)

• Extremidade 3’ – adenina, guanina (AG)
• Branch point – contém uma adenina a cerca de 150 bases da extremidade 3’

SnRNA/snRNP (pequenos RNA/ribonucleoproteínas)

• Medeiam o splicing do pré-mRNA

• Chamam-se U’S porque são muito ricos em uracilo
• Por complementaridade de bases vão reconhecer as extremidades dos intrões

Permitem catalisar as reações de transesterificação

(Os intrões são geralmente mais extensos)

Matilde Monteiro 124

Mutação nas sequências - não há o emparelhamento perfeito, sendo o splicing bloqueado

Mutação compensatória – mutação nos próprios SnRNA de modo a permitir o emparelhamento

e o splicing

1) SnRNA U1 emparelha com a extremidade 5’ do intrão, por

complementaridade de bases

2) Ligação do SF1 (splicing sector one) na proximidade da adenina

do branch point

3) Ligação do U2AF (U2 activating sector)

4) Saída desses sectors, que dão lugar ao

5) SnRNA U2 emparelha com o branch point, deixando a adenina

saliente (não emparelha) para que ela possa invadir a
extremidade 5’ do intrão

6) Primeira reação de transesterificação (lariat)

7) SnRNA U4, U5 e U6 facilitam a ligação dos dois exões entre si

8) Segunda transesterificação

9) Degradação do intrão livre dentro da célula por enzimas

Spliceossoma – conjunto dos snRNP e de outras proteínas

• Reconhece os sinais de splicing na molécula de pré-Mrna

• Junta as duas extremidades do intrão
• Providencia a atividade enzimática para os dois passos da
reação

Rearranjos durante o splicing

• Gasto de energia
• Substituição da ligação do U1 pelo U6
• Substituição da ligação da Branch point binding protein (BBP) pelo U2, durante a 2ª reação

Matilde Monteiro 125

Proteínas SR – reconhecem e marcam os exões (muito mais pequenos que os intrões – 150 a 200
nucleotídeos)

• Ricas em serina e arginina

• Ligam-se às sequências Exonic splicing enhancers
• Formam uma ponte entre os SnRNAs e os exões
• Funcionam como marcadores de exões

Mutações nestas sequências do Exonic Splicing Enhancer podem levar à perda de exões

Exemplo: Ratinho com atrofia muscular espinhal em que o gene da proteína SMN apresenta uma
mutação que impede a ligação das proteínas SR levando a perda de um exão aquando do splicing

A transcrição do mRNA, a poliadenilação e o splicing ocorrem

concomitantemente no núcleo

RNA Polimerase II, na sua cadeia CTD, transporta todas as

moléculas que intervêm no processo de amadurecimento dos
RNAs mensageiros

Azul – DNA; Vermelho - regiões de Poliadenilação; Verde - fatores

de splicing

Matilde Monteiro 126

 Mecanismos alternativos de splicing nas células eucarióticas

Trans-splicing - não acontece nos humanos, mas sim em alguns protozoários

• Duas moléculas distintas de mRNA ligam-se entre si, formando uma molécula madura
• SL snRNP transporta um exão que depois passa a ser incluído no mRNA final
Self-splicing

• RNA é capaz de sofrer splicing através da sua própria capacidade catalítica (ribozima) do
próprio RNA (sem enzimas)
• Quebrar e formação de ligações covalentes, sem intervenção de um centro ativo de uma
enzima
• Há uma analogia funcional entre o Grupo II do self-splicing e o splicing do RNA que
acontece nas células dos mamíferos

Matilde Monteiro 127

Em 95% dos genes pode ser que nem todos os exões sejam utilizados para formar os RNAs
mensageiros finais

Splicing alternativo

• Permite que se formem múltiplas proteínas a partir de um mesmo gene

• Por exemplo, a fibronectina do fibroblasto e do fígado é sintetizada a partir do mesmo
gene:
o Fibroblasto - têm domínios de ligação à matriz extracelular
o Hepatócitos – não têm domínios de ligação do hepatócito à matriz

Transporte do mRNA

• São transportados para o citoplasma através do complexo poro nuclear

• Substituição das proteínas que se ligam ao mRNA no citoplasma
o O Cap-binding complex (CBC) é substituído por fatores de iniciação da tradução
o As proteínas que se ligam à cadeia Poly-A são também substituídas por outras

Cleevage Alternativo – RNA mensageiros podem ser clivados mais cedo ou mais tarde e ter, assim,
diferentes sequências de nucleotídeos e codificar diferentes proteínas

Matilde Monteiro 128

 T16 – Domínios funcionais de proteínas

Replicação e a transcrição do DNA – ocorrem no núcleo celular

Processos dependentes de proteínas que se ligam ao DNA

Superfície da molécula de DNA

• Dois “back bones” (colunas vertebrais)

• Bases azotadas emparelhadas no centro da dupla hélice
• Major grooves (sulcos maiores) – exposição das bases
azotadas
• Minor grooves (sulcos menores)

Proteínas reguladoras

• Estabelecem ligações com as bases expostas no sulco maior da cadeia de DNA

• Contêm saliências na sua estrutura globular que permitem a interação molecular com
essas bases
• A sua ligação à molécula de DNA é muito frágil
• “Efeito velcro” - muitas ligações fracas associadas formam uma interação forte

Estrutura tridimensional/conformação do DNA

• Pode variar ligeiramente conforme a sequência de nucleotídeos

• Condicionada também pela ligação de proteínas

DNA binding proteins - proteínas que contém domínios de ligação ao DNA (ex: fatores de
transcrição, ativadores ou repressores)

• Os domínios de DNA-binding das DBP’s apresentam estruturas variáveis de modo a

reconhecer sequências específicas de DNA

• O reconhecimento das sequências resulta de interações não-covalentes entre átomos de

hélice α no domínio DNA-binding e átomos nas bordas das bases azotadas do sulco
maior do DNA

Matilde Monteiro 129

 Domínios de ligação ao DNA presentes nas DNA binding proteins

Helix-turn-helix/Hélix-ansa-hélix (bactérias)

• Hélice α de reconhecimento no terminal carboxilo -

liga-se diretamente ao sulco maior, estabelecendo
ligações dos seus aminoácidos com os nucleotídeos
• Hélice α no terminal amino
• Ligadas por uma sequência pequena de aminoácidos
• Formam um ângulo fixo (cerca de 30 graus)
• Há várias proteínas que partilham esta estrutura

• Tendência a formar homodímeros (dímeros simétricos) – 2 subunidades iguais

• Apresenta homologias com o homeodomain, por ser um mecanismo igual Homeodomain
(eucariotas)

• Caso particular de helix-turn-helix

• Conjunto de 60 resíduos de DNAbinding que
existe nos repressores bacterianos
• Hélice α de reconhecimento – liga-se através
de alguns aminoácidos aos pares de
nucleotídeos da cadeia dupla de DNA

Matilde Monteiro 130

• Proteínas Hox - possuem 3 α-hélices o Hélice de reconhecimento (a 3ª hélice) – liga-se através
de alguns aminoácidos aos pares de nucleotídeos da cadeia dupla de DNA (major groove)
por pontes de hidrogénio
o Terminal amino - ainda se estabelecem ligações a pb’s através de um resíduo de
arginina → meeting perfeito entre proteínas e DNA

Zinc-finger

• Domínio mais abundante de ligação ao DNA nas

células animais
• Interagem com o DNA através de átomos de
zinco, que estabelecem ligações com
aminoácidos da região peptídica das proteínas
(cisteína, histidina)
• Hélice α para ligação direta à molécula de DNA
• Um átomo de zinco a estabelecer as ligações entre hélices α e cadeias β (β-sheets)
• Ligam-se ao longo da cadeia de DNA, através de várias subunidades que vão “encaixando”
no major groove

Finger do tipo C4 Zinc-finger do tipo C2H2

Pertencem à superfamília dos recetores nucleares GL1 - contém cinco zinc-fingers C2H2
(hormonas esteroides) • Finger 1 - não interage com o DNA
o Cisteínas nas duas extremidades do domínio que • Finger 3 - interage diretamente com a
molécula de DNA
vão interagir com os átomos de zinco
• Finger 2 - interage primariamente com o
o Formam homo ou heterodímeros que se ligam de
átomo de zinco
forma simétrica à molécula de DNA
Recetor de glucocorticoide - proteína zinc-finger
homodimérica C4
• Roxo e vermelho = hélices α
• Setas verdes = cadeias β
• Duas hélices, uma em cada monómero,
interagem com o DNA
• Simetria rotacional sobre dois eixos

Matilde Monteiro 131

 Leucin-zipper

• Hélices α interagem com a cadeia de DNA nos sulcos

maiores adjacentes (extremidade amina)
• Duas hélices α interagem entre si perto da extremidade
carboxílica, através de aminoácidos leucina (hidrofóbica),
formando uma estrutura coiled coil que mantém a união
• De 7 em 7 aminoácidos, existe uma leucina
• Formação de homodímeros ou heterodímeros
o Domínio de dimerização estabilizado por interações
hidrofóbicas entre os monómeros
o Varia consoante as diferentes especificidades de ligação ao DNA

Proteínas bHLH

• Variante de leucin-zipper em que existem ansas a meio das alfa-hélices Heterodímeros

de leucin-zipper e hélice-ansa-hélices básicas

• Diferentes especificidades de ligação ao DNA

• A capacidade de ligação entre diferentes sequências é fundamental para a regulação da
transcrição (visto que existem mais genes do que fatores de transcrição)
• No entanto, número de combinações em cada célula é limitado, dependendo da
sequência de aminoácidos de cada cadeia

Beta-sheet como domínio de ligação

Não são tão comuns

Proteína repressora da metionina da bactéria
A abundância de metionina faz com que também se forme mais S-adenosil-metionina
A S-adenosil-metionina liga-se ao repressor, expondo a beta-sheet que se liga ao DNA Duas
beta-sheets ligam-se ao major groove do DNA

Matilde Monteiro 132

Ansas polipeptídicas como domínios de ligação

• Não são estruturas organizadas em estrutura secundária

• Proteína p53 (repressor tumoral)
• As regiões hélice-alfa e beta-sheet desta proteína não estão envolvidas na ligação ao
DNA
• Arginina 248 liga-se diretamente ao DNA

Heterodímeros de homeodomains

• Aumentando muito o reportório das especificidades de ligação ao DNA

• Podem ser ligados por uma cadeia peptídica

Diferentes combinações nos heterodímeros dos fatores de transcrição aumentam as alternativas

de regulação genética

• NFAT e AP1 regulam a transcrição do gene que codifica a interleucina-2 após ligação
cooperativa (a capacidade de ligação individual é baixa, mas juntos é alta)
• SAP-1 e SRF regulam a transcrição do gene EGR1 (early growth response protein 1), mesmo
estando separados 30 pares de bases
•
A ligação a diferentes sequências de DNA
também aumenta a regulação combinatória da
transcrição, já que fatores ligados a promotores
diferentes desencadeiam respostas diferentes

Matilde Monteiro 133

 T17 - Transcrição: RNA Ribossomal e de Transferência
RNA polimerases - enzimas que catalisam a formação de RNA, usando como molde uma cadeia
de DNA

• Procariotas - uma única RNA polimerase transcreve todos os tipos de RNA

• Eucariotas - três RNA polimerases diferentes:

rRNA corresponde a 80% do RNA existente, já o tRNA corresponde a 15%

Nota: a iniciação da transcrição pelas RNA polimerases I e III depende do ritmo de crescimento e
proliferação celular

RNA uracilo - único nucleotídeo que existe apenas no RNA (não integra as moléculas de DNA)

• Permite detetar, ao ser marcado com radioisótopos, o RNA na célula

(núcleo)

o No nucléolo (tRNA e rRNA)

o No nucleoplasma (mRNA)

Nucléolo

• Síntese dos RNA ribossomais (RNA polimerase I)

• Associação dos rRNA a proteínas
• Aspeto heterogéneo em TEM

Matilde Monteiro 134

 Componente fibrilar denso Centro fibrilar Componente granular
Pequenos grânulos em redor
Região mais clara/menos
Estruturas mais (subunidades dos ribossomas
eletronodensa
eletronodensas em processo de
Rodeado pelo
Síntese das moléculas de amadurecimento)
componente fibrilar
RNA ribossomal (ativamente) Amadurecimento do DNA
denso
ribossomal vindo do CFD

Variação do tamanho e número de nucléolos ao longo do ciclo celula

Telófase - quando a RNA polimerase I entra em atividade e

começa a sintetizar RNA ribossomais
o Pequenos nucléolos
Interfase – um ou dois grandes nucléolos por célula

O tamanho dos nucléolos indica a taxa de síntese de subunidades do

ribossoma, sendo tanto maior quanto maior a síntese de RNA
ribossomal e de ribossomas

Organizadores nucleolares / NOR (Nucleolus Organizer Region)

• Regiões do genoma que contêm os genes que codificam o

RNA ribossomal

• Microscopia de luz - com coloração com sais de prata (afinidade grande para as
proteínas existentes no nucléolo)
• Presentes em apenas alguns cromossomas – na metáfase apresentam uma
constrição primária a nível do centrómero diferente dos restantes (13,14,15, 21 e
22) (explicação: cada cromossoma metafásico tem uma constrição primária ao

Matilde Monteiro 135

 nível do centrómero e aqueles que contêm os organizadores celulares têm uma
outra constrição, um outro aperto na suas estrutura, que indica a presença dos
NOR)

Componente fibrilar denso

• Constituído por fibrilas

• Estruturas em árvore de natal
• A molécula de DNA que codifica para o RNA
ribossomal, ao ser transcrita, aparece associada a esses
RNA ribossomais nascentes e crescentes

Unidade transcritiva – DNA que codifica para rRNA é

transcrito em simultâneo por várias moléculas de RNA
polimerase I. Pode variar de temanho

• Algumas estão a iniciar a síntese e outras já estão a terminá-la

• Cada unidade transcritiva tem os genes que codificam o RNA ribossomal sempre na mesma
sequência
• Permite que se possam formar em simultâneo um grande número de rRNA, algo necessário
para células que necessitem de novas (após divisão) ou muitas proteínas

o Células de sangue

o Células epiteliais (dividem-se frequentemente)

Ribossomas (eucariotas)

• Subunidade pequena - molécula de 18S (o S é a unidade de sedimentação que

normalmente se utiliza para definir o tamanho destas moléculas de RNA
• Subunidade grande - moléculas de 5.8S, de 28S e de 5S (esta última transcrita pela RNA
polimerase III)

Na unidade transcritiva (de todos os seres) estas moléculas aparecem sempre na mesma
sequência:

18S - 5.8S - 28S

Matilde Monteiro 136

DNA spacer – região na molécula de DNA entre unidades transcritivas, não sendo transcrito

Os genes para o rRNA aparecem em tandem arrays

• Havendo várias unidades transcritivas codificantes do rRNA, há um aumento exponencial do

número de moléculas que a célula é capaz de sintetizar em simultâneo (na espécie humana
há cerca de 200 a 250 cópias)

• Não é comum que estas unidades transcritivas estejam todas ativas em simultâneo o
Componente fibrilar denso - unidades transcritivas em transcrição ativa – região mais escura
do nucléolo
o Centro fibrilar – unidades transcritivas não transcritas ativamente (podem rapidamente
ser ativadas se necessário) - região mais clara do nucléolo

NORC

• Liga-se a enzimas que vão desacetilar/metilar as

histonas (desacetilase e metil-transferases de
histonas) do DNA que codifica o rRNA, levando-o a
compactar em heterocromatina
• Inativação destas regiões, enquanto outras mantêm a
sua atividade

• Esta proteína tem assim um papel muito importante

na repressão de alguns genes que codificam RNA
ribossomal

Os RNA ribossomais, após serem transcritos, sofrem

clivagens e processamento de modo a originar as
subunidades integrantes do ribossoma

Matilde Monteiro 137

Promotores da RNA polimerase I – permitem o início da sua transcrição

1) UCE (Upstream Control Element) - a montante do local de inicio da transcrição

Upstream Binding Factor (UBF) – reconhece-o (fator de transcrição geral)

2) CORE Element - no local de início de transcrição

Selectivity Factor One (SL1) – reconhece-o
o Constituído por varias subunidades, entre as quais a TATA binding protein (não faz muito
sentido, já que a TATA box não participa aqui)

Transcription Iniciation Factor 1A (TIF-1A)

• Liga-se após a ligação do Selectivity Factor One

• Permite a ligação RNA polimerase I (início da transcrição)

Outros fatores de transcrição

Caseína cinase 2 Fosforila alguns fatores, aumentando a sua atividade

Sirtuina 7 Desacetilase de histonas, que neste caso intervém na ativação

Actina e Miosina
nuclear

Permite o alívio do sobre-enrolamento do DNA, favorecendo a

Topoisomerase 1 progressão da RNA polimerase I, já que é necessário uma transcrição
muito rápida

Matilde Monteiro 138

Processamento das moléculas de RNA ribossomal

• Clivagem - corte das moléculas de RNA

(primeiro na 3’)
Precursor grande 45S → moléculas funcionais 18S,
5,8S e 28S

• Modificação
o Metilação de bases e de riboses
o Pseudouridinação - Rotação no anel da
uridina, sendo transformada em
pseudouridina

Nota: no esquema tem 25S porque é na levedura

(mais pequena)
Pequenos RNA’s nucleolares (snoRNA)-
complexados com proteínas, intervêm no
amadurecimento das moléculas de RNA
ribossomal

U3 Clivagem da extremidade 5´do transcrito primário

U8 Clivagem do 5,8S
U14 Clivagem do 28S
U22 Clivagem do 18S (subunidade pequena)
Complexo MRP Corta e separa o 18S dos outros dois

Small nucleolar RNAs (snoRNAs)

• Associados a proteínas - Small nucleolar ribonucleoprotein (snoRNP)

• Reconhecimento dos nucleotídeos que é necessário modificar, através de

complementaridade de bases (como no splicing dos RNAs mensageiros)

Matilde Monteiro 139

 • Pseudouridinação - box H e ACA o Emparelhamento por complementaridade de bases o
Uracilo (base uridina) não emparelha o Exposição às enzimas que o vão transformar em
pseudouridina (rotação no anel)

• Metilação – boxes C e D
o Emparelhamento por complementaridade de bases o Expõem os nucleotídeos à
enzima (metiltransferase) o Ligação do grupo metilo àqueles nucleotídeos e aos
pequenos RNA que integram a box A e
ACA
o Não há emparelhamento completo
o Deixam um uracilo exposto às
enzimas que vão transformar o
uracilo, a uridina, em pseudouridina
o Dá-se a rotação do anel

Estrutura dos ribossomas

Os ribossomas são estruturas ribonucleoproteicas de grandes dimensões (100nm de diâmetro),

constituídos por duas subunidades que apenas se associam durante a tradução dos mRNA no
citoplasma

• 80S - quando associadas em eucariontes

• 70S – procariontes
• 60S – subunidade grande separada

Matilde Monteiro 140

 o Moléculas de 28; 5,8 e 5S (transcrita pela RNA
polimerase III), e mais 50 proteínas

• 40S – subunidade pequena separada

O Molécula de 18S e mais 33 proteínas

Exportação e modificações no citosol

No citosol vão-se ainda dar pequenas modificações das

subunidades, de modo a que esta só se torne completamente
funcional aí (mecanismo que impede que haja tradução de
proteínas no núcleo)

• Subunidade pequena - exportada através do CPN em 5

minutos (desde o início da transcrição de genes) com 20S
• No citosol ocorre a última clivagem (18S) e metilações de
adeninas, que vão levar à formação subunidade funcional
• Subunidade grande - demora um pouco mais a ser
exportada (30 minutos), sendo transportada primeiro do nucléolo para o nucleoplasma,
e só depois através do CPN para o citosol

É no complexo ribonucleico que são sempre transportadas as subunidades do ribossoma do

núcleo para o citoplasma

Fatores de exportação

Nmd3

• Nxt1 (também intervém na exportação dos mRNAs)

• Ran-GTP - medeiam o processo de transporte, após a ligação da grande subunidade do
ribossoma à exportina 1

Matilde Monteiro 141

 RNA helicases - intervêm no processo de amadurecimento da subunidade grande do ribossoma

• Quebram as ligações duplas que se podem formar por complementaridade de bases

(perda da estrutura secundária dos ribossomas)
• Dissociar proteínas que se associam

Síntese de RNA pela RNA polimerase III

A deleção das sequências de DNA que estão a montante (upstream) do local de início da transcrição pela
RNA polimerase III não afetam a sua atividade

• Pensava-se que esta não continha promotores

Promotores da RNA pol III - sequências necessárias ao início da atividade da RNA pol III que se
encontram a downstream do local de início da transcrição por esta enzima

• Box A e Box B – promovem a síntese dos tRNAs

o Ansas D e as ansa T (ou psi)

• Box C – promovem a síntese de outros RNAs

Matilde Monteiro 142

Estrutura dos RNAs de transferência

• Ansa do anticodão

• Ansa D e ansa T - correspondem no DNA a

regiões que servem de promotor

Complexo de iniciação da transcrição pela RNA pol III

1) Ligação dos fatores de transcrição aos promotores

2) Ligação de fatores de transcrição a seguir
3) Ligação e posicionamento da RNA polimerase III, de modo a iniciar a transcrição

Transcrição do gene para tRNA

Box A e B → TFIIIC → TFIIIB → RNA polimerase III

Transcrição do gene para o 5S-rRNA

Box C → TFIIIA → TFIIIC → TFIIIB → RNA polimerase III

Transcrição do gene para o U6 snRNA

PSE e TATABOX → TFIIIB-like → SNAPc → RNA polimerase III

Matilde Monteiro 143

Nota: O TFIIIB e o TFIIIB-like têm como uma das suas subunidades a TATA binding protein (faz
sentido porque a TATABOX funciona como um promotor)
Amadurecimento dos RNAs de transferência (70 a 80 nucleotídeos)

Clivagem da extremidade 5´ - catalisada por uma RNAse P (ribozima = enzima de RNA)

Substituição dos 2 uracilos na extremidade 3´ pela sequência CCA
Modificação de 10% das bases - 10% dos nucleotídeos integrantes dos RNA de
transferência têm bases modificadas, sendo estas modificações variadas, o que permite
diferenciar, em termos moleculares, os RNAs de transferência (e não apenas pelas
sequências de nucleotídeos no anticodão)
o Dihidrouridina
o Ribotimidina
o Pseudouridina (como nos rRNAs)
o Timosina
o Metil-guanosina

Matilde Monteiro 144

• Splicing - remoção de intrões e junção de exões
o Reconhecimento das sequências intrónica através da sua estrutura secundária (tridimensional),
não havendo sequências de consenso entre intrão-exão
o Catalisado por endonucleases (cortam o intrão nas suas extremidades)
o Fosforilação (fosfotransférase)
o Ligação dos dois exões entre si (ligase)
o Formação de tRNA maduro

Compartimentação no núcleo

Compartimentos - associação molecular que permite que, num determinado local do núcleo,
possam acontecer determinados processos
Compartimento do núcleo onde ocorre todo o processamento das moléculas do
RNA ribossomal, desde a sua síntese até à sua integração nas subunidades dos
Nucléolo
ribossomas (excetuando pequenas modificações que têm lugar no citosol)

Focos de
replicação

Focos de
transcrição

Pequenos corpos Papel importante no funcionamento e na regulação das funções nucleares

nucleares

Matilde Monteiro 145

 Funções:
• Amadurecimento dos pequenos RNA’s – modificam os seus
nucleotídeos, permitindo que eles atinjam a sua maturidade
• Reciclagem dos pequenos RNA’s - terminando o splicing dos mRNA,

Corpos de Cajal / estes são libertos mas sofrem modificações que os tornam não funcionais
Constituídos por:
Corpos
espiralados / • Pequenos RNA’s em amadurecimento
Coiled bodies • Coilina – proteína característica
• Fibrilharina – também existe no nucléolo Identificáveis em microscopia:
• Coráveis pelo Método de Cajal
• Estruturas espiraladas em TEM

Grânulos Aspeto ponteado

intercromatínicos Reserva de pequenos RNA’s - só quando são necessários para o splicing dos
/ Speckles mRNA, é que saem dos speckles para intervirem na síntese proteica

Matilde Monteiro 146

 Identificação com imunofluorescência

• DNA – azul (DAPI)

• Fibrilharina – vermelho (nucléolos e coiled bodies)
• Speckles – verdes
• Coilina – púrpura

Sobreposição da imagem = compartimentação do núcleo

Matilde Monteiro 147

 T18 – Núcleo Celular

Núcleo – organelo de maiores dimensões (8 a 10 micrometros de diâmetro) que, quando

presente, distingue os eucariontes dos procariontes;

Observação do núcleo em interfase

Hematoxilina – corante básico que evidencia componentes ácidos (basófilos):

• Periferia do núcleo – heterocromatina perinuclear

• Periferia do nucléolo - heterocromatina perinucleolar

Método de Feulgen – método de citoquímica seletivo para corar as moléculas de DNA no núcleo

1. Hidrólise ácida dos cortes histológicos, com ácido clorídrico aquecido a 57ºC
2. Remoção do RNA (não é corado, portanto) e provocar a queda da ligação entre a
desoxirribose e as bases púricas.
3. Grupos aldeído livres (nos resíduos de desoxirribose) bastantes reativos
4. Reação com o reagente de Feulgen.
5. Moléculas de DNA coradas a vermelho, evidenciando:
o Heterocromatina perinuclear - contorno dos núcleos
o Heterocromatina perinucleolar – contorno dos nucléolos (o interior deste é
fundamentalmente constituído por RNA e proteínas – subunidades dos ribossomas)

DAPI – corante fluorescente azul a marcar os núcleos usado em imunofluorescência e microscopia

de fluorescência.

No interior do núcleo, há um conjunto de moléculas que mudam permanentemente de posição,

o que revela o dinamismo grande deste organelo.

Matilde Monteiro 148

Isolamento do núcleo – permite estudar o que é transportado do núcleo
para o exterior e vice-versa

• Ultracentrifugação – núcleo é a primeira fração a sedimentar

quando se isolam organelos de um homogeneizado celular, já que
é o componente mais denso

• Purificação da fração - após a sedimentação dos núcleos, é feita

uma centrifugação contra um gradiente de sacarose (solução muito
concentrada de sacarose em gradiente), conseguindo-se isolar uma
fração pura de núcleos – a mais de 30000x a força da gravidade

• Processo com pouco rendimento (perda de núcleos)

TEM - Microscopia Electrónica de Transmissão

Permite a visualização de:

Ø Invólucro nuclear
Ø Heterocromatina perinuclear
Ø Heterocromatina perinucleolar

Cromatina constitutiva – região do DNA que está sempre condensada (heterocromatina) em todas
as células

Domínios de heterocromatina com afinidade para componentes da lâmina nuclear do nucléolo e

para os recetores da lâmina nuclear (moléculas transmembranares que se associam às proteínas
da lâmina nuclear)

Estudos concluíram que regiões da heterocromatina que numa célula estão associadas a lâmina
nuclear, após a divisão celular, passam a estar associados ao nucléolo Isto demonstra que:
o Estes mecanismos de ancoragem são sobreponíveis;
o Regiões de heterocromatina tendem sempre a estar associada ou à lâmina nuclear ou
ao nucléolo, pela forma como se associam também às enzimas que vão metilar as
histonas e desacetilá-las

Matilde Monteiro 149

 Método da contrastação regressiva do EDTA

Permite ver nos núcleos ribonucleoproteínas, que em microscopia normal aparecem ofuscadas
pela cromatina.

EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético; tem capacidade de se ligar e retirar catiões bivalentes

1) Contrastação com citrato de chumbo – como não existe uranilo no DNA, o chumbo não
se associa a este;
2) EDTA – sequestra primeiro o uranilo do DNA (sequestra alguns catiões bivalentes ligados
ao uranilo, que está ligado às regiões ricas em DNA);
3) Acetato de uranilo – uranilo (catião bivalente) liga-se às regiões ricas em DNA na célula.

Resultado:

• Regiões claras - Regiões ricas em DNA, não tendo uranilo nem chumbo; Junto do nucléolo
e a periferia do núcleo
• Regiões escuras – Regiões ricas em RNA

Este método mostrou a existência de estruturas de natureza ribonucleoproteíca, antes

ofuscadas pela cromatina. Não é muito rigoroso

Processos que têm lugar no núcleo:

1) Organização e compactação da cromatina - responsável pela exposição das regiões

transcricionalmente ativas às enzimas responsáveis por estes processos;
2) Replicação do DNA;
3) Transcrição do DNA;
4) Regulação da expressão genética;
5) Amadurecimento e processamento dos RNAs;
6) Exportação seletiva dos RNAs (mRNA, tRNA, subunidades ribossomais);
7) Importação de proteínas;
8) Transporte de snRNPs (pequenos RNA’s);
9) Desorganização (metáfase) e re-organização (final da telófase) a cada ciclo celular.

Matilde Monteiro 150

Compartimentos do núcleo – associações de moléculas que
exercem uma determinada função (pode ser transitória); não
rodeados por membrana; conferem ao núcleo uma grande
organização.

Territórios cromossómicos – territórios restritos ocupados pelo

DNA no núcleo, quando este se encontra extremamente
compactado e organizado, não se misturando entre si, durante a
interfase – cada cromossoma ocupa um território específico –
entre cada território temos domínios intercromatínicos (separam os territórios).

Cromossoma Painting – Localização dos cromossomas do

núcleo em simultâneo, através de sondas de cores diferentes
complementares a regiões específicas dos cromossomas
(hibridização in situ)

Cromatina

• Mais condensada (constitutiva) – heterocromatina - não é transcricionalmente ativa -

periferia do núcleo e proximidade do nucléolo
• Menos condensada – eucromatina – pode ser acedida mais facilmente pelas enzimas
responsáveis pela transcrição do DNA – territórios intercromatínicos (entre os
cromossomas condensados)

Focos de replicação - locais restritos do núcleo onde tem lugar a replicação do DNA; podem ser
localizados através de:

• Bromodesoxiuridina – integra-se nas moléculas de DNA, ligada a um anticorpo marcado

com fluorocromo;
• Imunocitoquímica com PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) – estabiliza a DNA
polimerase junto da molécula de DNA (forma um anel)

Nucléolo – compartimento que mais facilmente se visualiza dentro do núcleo

1) Centros fibrilares
2) Componente fibrilar denso
3) Componente granular

Matilde Monteiro 151

Funções:

1) Síntese do rRNA;
2) Montagem das subunidades do ribossomas;
3) Formação e amadurecimento de ribonucleoproteínas, por exemplo:
Telomerase – enzima responsável pela replicação das extremidades dos
telómeros; formada por:
o Molécula de RNA (sequência complementar à sequência repetitiva
dos telómeros)
o Componente proteica.
A ligação entre a molécula de RNA e a componente proteica da Telomerase
é feita no nucléolo.

Domínios de transcrição – locais de síntese de RNA

1) Nucleolares – dentro do nucléolo – deve-se somente à RNA polimerase I

2) Nucleoplásmicas – dentro do nucleoplasma, no espaço intercromatínico – RNA
polimerase II E III

Microscopia de fluorescência

Bromouridina – integra-se somente nas moléculas de RNA, ligada a anticorpo fluorescente,

permitindo localizar os focos de transcrição

Microscopia electrónica de transmissão – permite localizar:

1) Fibrilas pericromatínicas – Locais de transcrição onde é

sintetizado mRNA e tRNA no nucleoplasma, pela RNA
polimerase II e III, respetivamente; 5 nm de diâmetro.

2) Grânulos pericromatínicos – Contêm transcriptos primários da

RNApolimerase II que não sofreram splicing; 45 nm de diâmetro.
Rodeados por um halo claro.

Locais de splicing - A localização dos fatores de splicing quando em atividade

é sobreponível ao local onde tem lugar a transcrição do mRNA.

• Pequenos RNA’s – intervenientes no splicing do mRNA (standart - 1,2,4,5 e 6; em minoria

– 11 e 12); Localizados por sondas complementares – hibridação in situ

• Outros fatores de splicing (proteínas)

• RNA polimerase II – Enzima responsável pela transcrição, cuja cadeia fosforilada terminal
(C-terminal domain) associa-se às moléculas que intervêm no splicing do m RNA,
podendo estas intervir de imediato.

Matilde Monteiro 152

Grânulos intercromatínicos / Speckles – locais de reserva com aspecto ponteado (25 nm de
diâmetro) de pequenos RNA’s (fatores de splicing que não estão a ser utilizados).

Corpo espiralado ou de Cajal – constituído por coilina (exclusiva deste corpo) e fibrilhina; contêm
scaRNA’s (Small Cajal body - specific RNA) que intervêm no:
• Amadurecimento dos pequenos RNA’s envolvidos no splicing - modificação das bases de
modo a torná-los funcionais;
• Reciclagem dos pequenos RNA’s – reestabelecimento da estrutura tridimensional e
características moleculares iniciais, dadas as alterações conformacionais que sofrem
durante a sua intervenção no splicing.
• Possuem pequenos RNA’s próprios – small cajal ribonucleoproteins

Corpos nucleares PML (Promyelocytic Leukemia Nuclear Bodies)

Estruturas responsáveis por:

1) Ativação de mecanismos de reparação do DNA;

2) Amadurecimento proteína P53 – supressor tumoral que desencadeia apoptose em algumas
células; apresentando mutações, há um risco acrescido de desenvolvimento de cancro
acrescido; sofre acetilação e fosforilação nos corpos PML;
3) Modificação de fatores de transcrição, tornando-os repressores de transcrição, através da
ligação a resíduos SUMO - SUMOilação

Os anticorpos produzidos por doentes com leucemia promielocítica (causada por mutações na
proteína PML) têm afinidade para estes corpos.

Corpos nucleares - Não se sabe para que servem; aparecem em algumas células quando
estimuladas; não contêm DNA.

• Simples – não estão rodeados por cápsula proteica;

• Complexos – granulares ou espiralados; rodeados por cápsula proteica.

Matilde Monteiro 153

 Isolamento da matriz nuclear/nucleoesqueleto

• Extração do DNA do núcleo, isolando a matriz nuclear;

• Estudar os componentes do núcleo que não o DNA;
1) Detergente – remove as membranas do núcleo;
2) DNAses – enzimas que degradam o DNA;
3) Tampões de alta e baixa força iónica – mantêm a matriz.

Resultado: componentes de natureza proteica e ribonucleoproteica (RNA)

• Resíduo do nucléolo;
• Lâmina nuclear;
• Estruturas fibrilo-granulares (como os grânulos intercromatínicos/speckles)

Invólucro nuclear – estrutura que separa o núcleo do citoplasma; constituído por:

• Duas membranas de bicamada bifosfolipídica (uma voltada para o citosol e outra voltada para
o nucleoplasma)
• Lâmina nuclear fibrosa - constituída por proteínas da família dos filamentos intermediários;
• Complexos poro nuclear (CPN) - locais que permitem a passagem de moléculas entre o
citoplasma e o interior do núcleo; junção dos 3 componentes.

A membrana externa do núcleo está em continuidade física com as membranas do retículo

endoplasmático rugoso (RER)

• O núcleo, ao passar da interfase para a prófase, sofre um aumento de volume devido à

replicação do DNA
• Este aumento vai ser feito à custa da cedência de membranas do RER, o que justifica a
continuidade física das estruturas.

Matilde Monteiro 154

Lâmina nuclear fibrosa – constituídas por laminas, proteínas
da família dos filamentos intermediários, sendo as mais
abundantes a lamina A, B e C;

• Filamentos entrecruzam-se para formar uma rede;

• Local de ancoragem da heterocromatina perinuclear
(associa-se tão fortemente à lâmina nuclear fibrosa
que dificilmente a distinguimos)
• Por fosforilação e desfosforilação, controlam a
desagregação do invólucro e a sua reformação ao
longo do ciclo celular
o Divisão celular - desagrega-se, por
fosforilação das laminas (ficam isoladas ou
em associação com vesículas membranosas);
o No final da telófase – reforma-se, por desfosforilação.

Laminopatias

• Patologias muito raras e graves que se devem a mutações esporádicas nas laminas
• Atingem todas as células, uma vez que as laminas integram o invólucro nuclear de todas
as células
• São na sua maioria progerias (doenças do envelhecimento acelerado) ou distrofias
musculares (falta de resistência das células na interligação do núcleo ao citoplasma, já
que está comprometida a ligação da lâmina nuclear aos filamentos do citoesqueleto),
ambas com esperança de vida muito curta:
o Progeria de Hutchinson-Gilford

o Distrofia muscular de Emery-Dreifuss

Complexos de poro nuclear

• Canais - permitem a comunicação entre o citosol e o interior do núcleo (nucleoplasma)

• Simetria octaédrica - constituídos por oito subunidades idênticas
• Associam-se às membranas e às moléculas que vão transportando

Matilde Monteiro 155

Nota: o LBR (recetor da lamina B) e a Emerina vão estabilizar a lâmina nuclear, ligando-a à
membrana interna do invólucro nuclear.

• Nuclear basket – cesto que os filamentos constituintes das nucleoporinas formam face
nuclear do CPN, ao unirem-se, diferindo assim esta face da face citosólica (onde não se
unem)
• Canal aquoso – no interior do CPN, que permite a passagem moléculas carregadas, com
dimensões menores que 40 kDa (kilodaltons)
• Interações com as nucleoporinas – permitem a
passagem de moléculas de maiores dimensões
(ex: subunidade grande do ribossoma)

Matilde Monteiro 156

Nucleoporinas – proteínas que constituem o complexo poro nuclear

Estruturais Membranares FG
Formam o Ligam-se às Apresentam prolongamentos constituídos por
complexo Y membranas do resíduos de fenilalanina e glicina. Estes interagem
invólucro nuclear, entre si no lúmen do complexo de poro nuclear
(Structural levando à sua formando uma rede
Nucleoproteins – curvatura • Moléculas de menores dimensões - passam
scNUP) através dos espaços na rede
• Moléculas de maiores dimensões - têm de
cisterna perinuclear
afastar os prolongamentos ricos em fenilalanina
Voltadas para o e glicina para aumentar o diâmetro do poro, de
lúmen do poro modo a poderem passar

Carioferinas – proteínas que interagem com os resíduos FG (fenilalanina, glicina) para permitir a
passagem de moléculas maiores através do complexo de poro nuclear. Ligam-se a sequências de
reconhecimento nas moléculas que a transportar.

ü Importinas - envolvidas na importação de moléculas do citoplasma para o núcleo;

ü Exportinas - envolvidas na exportação de moléculas do núcleo para o citoplasma.

Matilde Monteiro 157

 Processo de importação nuclear

Importinas - reconhecem a NLS (nucleus localization sequence = sequência de reconhecimento

nuclear) nas moléculas a transportar para o núcleo. Estas sequências podem ser formadas por
aminoácidos básicos, ser bipartidas ou hidrofóbicas. São formadas por duas subunidades, uma
que se liga à proteína a transportar, outra que vai interagir com os resíduos FG do CPN.

1) Ligação da molécula a transportar para o núcleo à importina – reconhecimento da

sequência de localização nuclear e formação de um complexo de duas unidades;
2) Transporte através do CPN - interações com os resíduos de fenilalanina-glicina das
nucleoporinas;
3) Desagregação do complexo no núcleo - interação com a proteína RAN-GTP, ficando esta
ligada à importina;
4) Libertação da carga;
5) Transporte do complexo RAN-GTP e importina para o citosol;
6) Desagregação do complexo por intervenção da GAP (GTPase-activating protein) -
desfosforilação do GTP do RAN-GTP;
7) Importina pronta para entrar um novo ciclo de transporte;
8) Transporte do RAN-GDP por difusão para o núcleo;
9) Fosforilação do GDP pela proteína GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor), ficando
pronto para outro ciclo de transporte.

Matilde Monteiro 158

 Processo de exportação nuclear

Exportinas - reconhecem o sinal NES (Nuclear Export Signal) nas moléculas a transportar para o
citoplasma.

1) Formação do complexo a exportar - exportina, a proteína a transportar e RAN-GTP (3

componentes;
2) Transporte para o citoplasma;
3) Deagregação pela RAN-GAP – desfosforilação do RAN-GTP

Nota: Diferenças de concentração facilitam o transporte de proteínas ao longo do complexo de

poro nuclear: o facto dos complexos chegarem ao destino final e se desagregarem vai estimular
o transporte, porque este ocorre sempre de uma maior concentração para uma menor
concentração.

Proteínas que fazem shuttle – Estão permanentemente a ser transportadas do núcleo para o
citoplasma e vice-versa

Transporte das subunidades dos ribossomas e tRNA - Transporte mediado por exportinas, já que
estão sempre em complexos ribonucleoproteicos (contém proteínas associadas, a ser
reconhecidas pela exportina) (se o RNA não estivesse associado, a exportina não reconheceria)

• Exportina T – medeia o transporte de tRNA;

• Exportina 1 / Crm 1 – medeia o transporte das subunidades dos ribossomas.

Transporte do mRNA

• Controlado por fosforilação e

desfosforilação de proteínas.
• Não depende de RAN-GTP para o seu
transporte
• O mRNA sofre remodeling
• O mRNA está associado a proteínas que se
ligam ao longa de toda a sua extensão
• Em RNA de grandes dimensões, há uma
mudança de conformação à medida que os
mRNA são transportados ao longo do CPN

Matilde Monteiro 159

Exporter do mRNA - funciona como uma exportina, interagindo com as cadeias FG das
nucleoporinas; constituída por duas subunidades que se ligam ao longo de toda a molécula de
mRNA:

• Nuclear exporter factor 1 (NXF1);

• Nuclear exporter transporter 1 (Nxt1)

1) Fosforilação do exporter – permite a sua ligação às proteínas de transporte de mRNA para o

citoplasma;
2) Transporte do mRNA (extremidade Cap, 5’, primeiro; a cadeia poli-adenilada é a que fica na
outra extremidade, que é transportada depois)
3) Enzima DBP5 (Helicase do RNA) – no citoplasma, dissocia o mRNA das proteínas a que está
associado, com gasto de energia sob a forma de ATP
4) Remodeling - troca das proteínas de associação nuclear por outras de associação
citoplasmática.
Ø O Cap Binding Complex (CBC) substituído por fator de transcrição.

Matilde Monteiro 160

 Mecanismo de controlo da qualidade dos RNA’s transcritos

Há reconhecimento da maturidade da molécula prévio ao transporte:

• Os tRNAs só são exportados após modificações das bases nucleotídicas, clivagem e

splicing (quando tem lugar).
• Os mRNAs só são transportados após splicing completo.
• Os pequenos RNA’s só são transportados quando maduros.

Mecanismo de controlo da expressão genética

Fatores de transcrição que existem no citoplasma sofrem modificações (ex: fosforilação)

e são transportados para o núcleo, onde depois podem intervir na ativação ou repressão de
cascatas genéticas.

A exportação de RNA’s funciona como um sistema de controlo de qualidade dos RNA’s transcritos, pois há
reconhecimento da maturidade da molécula prévio ao transporte.

Os tRNA’s só são exportados após modificações das bases nucleotídicas, clivagem e splicing (quando tem
lugar).

Os mRNA’s só são transportados após splicing completo.

Matilde Monteiro 161

 T19 – Tradução

Tradução – é a passagem da linguagem molecular existente numa molécula de mRNA para uma
sequência de aminoácidos, uma vez que quimicamente estas moléculas são bastante distintas e
tem lugar ou no citosol, ou em ribossomas, ou no RER.

Implica a utilização e articulação de funções de 3 classes de RNA

• RNA mensageiro - contém a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de

aminoácidos na proteína

• RNA ribossomal - integra as subunidades dos ribossomas que vão catalisar a ligação dos
aminoácidos das proteínas entre si, através da formação de ligações peptídicas

• RNA de transferência – cada um transporta um aminoácido correspondente à sequência

de nucleotídeos que contém na ansa do anticodão

Local da tradução

• Ribossomas livres/polirribossomas
• Retículo endoplasmático rugoso (ribossomas associados às membranas)

O que inclui o processo da tradução:

• Preparação prévia das moléculas intervenientes

• Tradução propriamente dita Síntese da proteína

Matilde Monteiro 162

Código genético

• Cada conjunto de 3 nucleotídeos (codão) do mRNA codifica um aminoácido

• Cada aminoácido pode ser codificado por mais do que um codão (código genético
degenerado, redundante)

• Existem 64 codões, dos quais 61 codificam aminoácidos e 3 deles são codões STOP –
UAA, UAG, UGA

Nota: são só 2 os aminoácidos codificados por um único codão

o Metionionina – AUG o
Triptofano – UGG

O código genético é quase universal

• Sugere uma evolução simultânea de todas as formas de vida (com posterior divergência)
• Exceção: em algumas mitocôndrias/organismos, existem codões que não codificam o
mesmo aminoácido/codão STOP

mRNA - não são completamente codificantes:

• Extremidade 5’ - Cap 7-metil guanosina

• Extremidade 3’ - cadeia poliadenilada (200 a 250 adeninas)
• ORF (Open Reading Frame) - região codificante central, estendendo-se desde o codão de
iniciação (AUG) até ao codão STOP
• UTRs (Untranslated Regions) – duas regiões que precedem e sucedem a ORF; não são
transcritas ( a 3’ é um pouco mais longa do que a 5’)

Matilde Monteiro 163

 Teoricamente, há três hipóteses de leitura:

No entanto, cada mRNA tem uma única frame de leitura - em todas as outras, aparecem
precocemente codões de terminação, o que leva à formação de proteínas truncadas anómalas e sua
posterior destruição

Nota: Alguns mRNAs (virais) permitem mais do que uma leitura da mesma sequência de
nucleotídeos, inclusivamente a síntese de proteínas diferentes a partir do mesmo mRNA

Preparação dos intervenientes no processo de tradução

Ligação dos aminoácidos aos RNAs de transferência correspondentes

O número de regiões de anticodão dos vários tRNAs (entre 50 a 100) é diferente do número
de codões (61) e do número de aminoácidos (20) o Cada aminoácido liga-se a mais do
que um tRNA (anticodão) o Alguns tRNAs (anticodões) emparelham com mais do que
um codão

Estrutura do tRNA

• Estrutura em L
• Região CCA – liga-se ao aminoácido
• Ansa do anticodão

AminoaciltRNA sintetase – enzima capaz de ligar os aminoácidos aos tRNAs (cujo anticodões vão
emparelhar com os codões respetivos) – tem de reconhecer o conjunto de tRNA’s que pode
associar ao aminoácido que entra no seu centro ativo, sendo que algumas aminoaciltRNA
sintetases reconhecem o anticodão, mas a maioria reconhece toda a estrutura tri-dimensional,
estabelecendo interações com várias regiões do aminoácido. São 20, sendo uma para cada
aminoácido:

1) Reconhecem o aminoácido no seu centro ativo

2) Reconhecem os tRNAs respetivos
3) Catalisam a formação de uma ligação éster de elevada energia entre o terminal
carboxílico do aminoácido e o tRNA
4) Não têm só um centro ativo têm um domínio onde se liga o ATP

Matilde Monteiro 164

Proofreading pela aminoaciltRNA sintetase

• Se o aminoácido não entrar bem no centro ativo da enzima, é rejeitado e é permitida a

entrada de outro
• Se não é reconhecido tRNA perfeitamente, quebra a ligação que antes se estabeleceu
com o aminoácido e fica de novo preparada para ligar outro tRNA ao aminoácido
• A adição do aminoácido aos RNA’s de transferência é uma região muito fidedigna,
havendo 1 erro em cada 40000 reações.

Emparelhamentos não-standard

• Permite que haja um número diferente de aminoácidos, tRNA e codões no mRNA

• Cada aminoácido pode-se ligar a mais que um tRNA e cada tRNA pode emparelhar com
mais do que um codão.
• Posição vacilante/wobble - na primeira posição do anticodão (tRNA) e terceira posição
do codão (mRNA)
• O anticodão pode apresentar nucleotídeos modificados (10%) que não integram o mRNA
, o que permite que anticodões com sequências diferentes possam todos emparelhar com
o mesmo tRNA (ex.: inosina permite o emparelhamento com o uracilo, adenina e citosina)

Matilde Monteiro 165

 Ribossoma

• Local onde ocorre a tradução, a ligação dos aminoácidos entre si e a formação das ligações
peptídicas o Associam-se às membranas, formando o retículo endoplasmático rugoso o
Aparecem livres no citosol

• Estruturas de natureza ribonucleoproteica, sendo o maior componente o de RNA

• Têm duas subunidades: a subunidade grande e a subunidade pequena, que quando estão
associadas, formam três compartimentos dentro do ribossoma:
• No seu interior existem três locais de ligação aos tRNAs:
o Local A (de aminoacil)
o Local P (de peptidil)
o Local E (de exit)
• Qualquer um deles pode acolher tRNAs

• Cinzento – regiões ocupadas por RNA

• Cores - Regiões ocupadas por proteínas - mais periférica das subunidades dos ribossomas,
quer na pequena, quer na grande subunidade do ribossoma
• As regiões de contato com os tRNAs e com os aminoácidos é maioritariamente formada por
RNA

Matilde Monteiro 166

Fases da tradução

1. Iniciação
2. Elongação
3. Terminação

eIF (Eukaryotic Initiation Factor) - fatores de iniciação

eEF (Eukaryotic Elongation Factor) – fatores de elongação
eRF (Eukaryotic Release Factor) – fatores de terminação.

Matilde Monteiro 167

 Fase de Iniciação (maior intervenção de fatores moleculares)

1- A subunidade pequena do ribossoma (40S, dissociada)

liga-se à eIF-3, eIF-1 e eIF-1a

2- O tRNA (ligado à metionina) liga-se ao eIF-2 GTP

3- A metionina (ligada ao tRNA e eIF-2 GTP) liga-se à

subunidade pequena do ribossoma no local P

Nota: O primeiro tRNA a ser integrado

4- Forma-se o complexo de pré-iniciação com 43S
na síntese de proteica é aquele que
transporta a metionina, sendo este o
5- Ocorre o scanning: a pequena subunidade do ribossoma vai
primeiro aminoácido nas proteínas
percorrer o mRNA até encontrar o codão de iniciação.
(podendo ser depois clivada),
constituindo a extremidade amina das
6- mRNA liga-se ao eIF-4 proteínas

7-mRNA organizado como um círculo, possibilitando controlo de qualidade das duas

extremidades

8- O complexo de pré-iniciação liga-se mRNA (ligado ao eIF-4)

7- A subunidade pequena do ribossoma liga-se à molécula do mRNA

8- Scanning pelo eIF-4A (helicase) – elimina duplas ligações e desaloja proteínas ligadas ao
mRNA

9- Continuação do scanning até que se encontre o codão de iniciação (AUG)

10- Emparelhamento perfeito entre o tRNA (transporta a

metionina) e o codão AUG Fator de iniciação eIF-4

Subunidade 4E – liga-se à
11- Hidrólise da molécula de GTP ligada ao eIF-2 extremidade Cap

Subunidade 4G - interage
12- A metionina, ligada ao seu tRNA, vai ficar localizada no com a cadeia poliadenilada
local P da subunidade pequena da molécula do ribossoma (mais precisamente, com a
PAB protein, que se liga à
13- Formação do complexo de iniciação cadeia polidadenilada)

Subunidades 4A (e 4B) -
14- Ligação da subunidade grande do ribossoma atividade de RNA helicase,
formando um círculo
15- Desalojar de todos os fatores de iniciação (exceto o IF-1A,
que fica ligado ao IF-5B ligado a GTP)

16- Hidrólise do GTP, libertando o IF-1A e o IF-5B

17- Formação do complexo de iniciação de 80S

Matilde Monteiro 168

Matilde Monteiro 169
Sequência Kozak

Sequência um pouco mais longa que normalmente integra o primeiro AUG (ACCAUGG),
ajudando ao reconhecimento do codão de iniciação

IRES (Internal Ribossome Entry Sites)

• Ligação direta entre mRNA e codão de iniciação, sem necessidade de scanning

• A subunidade pequena do ribossoma liga-se diretamente ao codão de iniciação AUG

(que não o primeiro), sem necessidade de intervenção de nenhum fator de iniciação de
tradução

• Independente do Cap

• Comum nos mRNA virais

Matilde Monteiro 170

 Fase de Elongação

1) Entrada do tRNA no local A livre do complexo de

iniciação (com anticodão correspondente ao
codão que está neste local no
mRNA,
transportando o respetivo aminoácido)

2) tRNA ligado ao eEF-1α ligado a GTP

3) Emparelhamento entre codão e anticodão

4) Mudança de conformação concomitante com a hidrólise do GTP, passando a GDP+Pi

5) Aproximação do grupo amina do novo aminoácido à ligação éster entre o grupo carboxilo
do aminoácido que foi anteriormente inserido e o tRNA

6) Formação da ligação peptídica (catalisada exclusivamente por RNAs ribossomais) com o

grupo amina livre do aminoácido ligado ao tRNA no local A, catalisada por ribozimas (enzimas
de RNA existentes na subunidade grande da molécula do
ribossoma) - reação de peptidiltransferase – o aminoácido
ligado ao tRNA no local P é transferido para o local A

7) A cadeia polipeptídica passa, muito temporariamente, para

o tRNA que está no local A

8) Translocação do ribossoma (primeiro a subunidade grande

do ribossoma e depois a pequena), transportando a cadeia
peptídica para o local, libertando o local Apara que possa
haver entrada de outro tRNA, avançando um codão no
mRNA

9) Cadeia polipeptídica passa a localizar-se no local P do ribossoma

10) Local A fica livre para entrar o novo tRNA ligado ao aminoácido respetivo

11) O primeiro tRNA que fica livre passa para o local E (Exit)

12) Mudança de conformação cada vez que entra um novo tRNA e emparelha perfeitamente,
saindo definitivamente o tRNA do local E

A elongação dá-se por repetição sucessiva destes passos:

• Entrada de tRNA ligado a aminoácido

• Reação peptidiltransferase

• Translocação do ribossoma na extensão de um codão

Matilde Monteiro 171

 Reação de peptidiltransferase

Matilde Monteiro 172

 Fase da terminação

Como não há tRNAs com sequência de anticodão complementar aos codões STOP, a síntese
proteica termina quando um aparece

Release factors (fatores proteicos de terminação)

eRF-1 - semelhança estrutural muito grande com os tRNAs

(mimetismo molecular) o Entra no local A ligado ao eRF-3
ligado a GTP
o Reconhece os codões STOP
o Hidrólise deste GTP
Dissociação de todo o complexo de tradução
(separação das duas subunidades do ribossoma,
corte da cadeia polipeptídica terminada,
dissociação dos fatores moleculares)
o Formação da sequência de aminoácidos de uma
proteína

Proofreading na tradução

• Na ligação dos aminoácidos ao tRNA, para que o

aminoácido seja o correto
• No emparelhamento entre anticodão e codão, que, não
sendo perfeito, leva à saída do tRNA (não há ligação)
• Assim, a probabilidade de um aminoácido ser mal inserido
durante a tradução é pequena

A hidrólise de GTP vai funcionar em vários passos como um

controlo de qualidade

Polirribossomas - estruturas com vários

ribossomas associados ao mesmo mRNA,
estando este a ser traduzido
simultaneamente
• Levam à formação de várias
cópias idênticas da proteína
• Só nos eucariontes
• Visível por TEM

Matilde Monteiro 173

Tradução = processo que consome muita energia às células

Charging do tRNA (requer 2 ATPs porque ATP --> AMP)

Em forma de
ATP
Iniciação (eucariotas)

Energia Na iniciação

Na ligação do tRNA ao ribossoma

Durante a
elongação
Em forma de Translocação do peptidil tRNA e
GTP crescimento da cadeia peptídica

Terminação

Variações da leitura do código genético standard (Translation recoding)

Selenocisteína – forma-se por transformação da serina, após esta se ligar ao tRNA

• Quando aparece o codão de STOP UGA, o tRNA ligado à selenocisteína pode associarse,
desde que haja o sinal down-stream no mRNA que permita a sua ligação.

Nota: outros aminoácidos podem sofrer hidroxilações, fosforilações ou outras modificações

posteriormente.

Matilde Monteiro 174

Frameshifting - mudança do quadro de leitura durante a tradução, comum em mRNAs virais (e
não comum em células eucarióticas)

• No vírus da SIDA, um único mRNA, na maior parte das vezes, é lido e é traduzido de
modo a produzir as proteínas da cápside proteica
• No entanto, o mesmo mRNA, em cerca de 10% dos casos, pode sofrer um frameshifting,
começando a ser lido um nucleotídeo atrás
• Formação da proteína de fusão - na primeira parte tem a proteína cápside na parte
Cterminal, a transcriptase reversa (e a integrase) Clivagem posterior desta proteína de
fusão

Antibióticos - podem impedir a síntese de proteínas pelas células procarióticas

• Os inibidores da síntese proteica, exclusivamente nos procariotas podem ser usados

como antibióticos.
• Toxinas produzidas por fungos que vão ocupar os locais chave nas subunidades do
ribossoma e impedem, assim, a progressão da tradução

Degradação de mRNA (mRNA decay)

• Ocorre se o ribossoma, ao traduzir o mRNA, sentir que depois do primeiro codão STOP,
existem ainda complexos de junção exónica
• É detetado que o mRNA não sofreu o splicing correto
• Proteínas Upf – ligam-se ao m RNA mal transcrito e encaminham-no para os P-bodies

Matilde Monteiro 175

Non-sense mediated mRNA decay- leva à degradação dos mRNA que tenham codões non-sense
que levam à interrupção precoce

• Este mecanismo faz um proofreading da qualidade do mRNA na primeira vez que este é
traduzido. Evita a acumulação de mRNA não funcionais e de proteínas truncadas na
célula.

P-Bodies (Processing Bodies) – corpos dinâmicos, que se podem mover no citosol, onde tem lugar
a degradação dos mRNAs não funcionais, impedindo a acumulação molecular desses mRNAs e
de proteínas truncadas (toxicidade no citosol) – ocorre um deccaping pela enzima Dcp1 e de
seguida a degradação dos mRNA por ação de exonucleases.

• Doença de Alzheimer, Parkinson e Huntington resultam da acumulação de proteínas não

funcionais, afetando o tecido nervoso

Folding de proteínas

• As proteínas só se tornam funcionais após o folding (aquisição da conformação

tridimensional) que inicia enquanto são sintetizadas
• Ocorre depois de sintetizadas, podendo começar ainda durante a tradução

Matilde Monteiro 176

HSPs (Heat Shock Proteins)/chaperonas - medeiam o folding de proteínas (aumentam a sua
expressão em situações de choque térmico)

• Hsp70 - importante na formação da conformação tridimensional das proteínas

• Hsp60 – intervém quando o folding não ocorre corretamente, permitindo um folding

mais lento numa região protegida deste complexo

Matilde Monteiro 177

 T20 – Epigenética

A perspetiva mais molecular dá relevo a marcas epigenéticas como mecanismo de regulação da

expressão génica e tenta compreender a forma como o epigenoma:

• É modulado por fatores ambientais

• Intervém na formação de tipos celulares diferentes com origem numa única célula
(zigoto)
• Persiste entre células do mesmo tipo
• É transmitido há geração seguinte
• Intervém na etiologia de algumas doenças (ex. cancro)

O epigenoma apresenta uma função similar ao genoma:

• Marcam o início e o fim dos genes O que leva ao controlo
• Fornece base estrutural à organização cromossómica da expressão do gene
• Altera a forma como cada gene é lido

Os nucleossomas limitam o acesso à cromatina – são as marcas epigenéticas que vão controlar o
enrolamento da cromatina, sendo que existem várias marcas epigenéticas quer no DNA quer nas
histonas, que podem ser silenciadoras ou ativadoras

• São as modificações epigenéticas (ativadoras ou silenciadoras) que regulam a

compactação da cromatina e dessa forma modulam a expressão genética

Epigenoma – conjunto de modificações epigenéticas presentes no genoma – as marcas

epigenéticas são modificações REVERSÍVEIS!

1- Metilação de DNA

- Ocorre em locais muito específicos – Cpg

- Temos uma metilação da citosina que ocorre em ambas as cadeias (citosina –

metil-citosina)

- A grande maioria dos motivos (99%) Cpg no genoma encontram-se metilados,

sendo que os restantes 1% correspondem a “ilhas” não metiladas que se
encontram em regiões promotoras

2- Modificação de histonas

- As duas marcas epigenéticas mais comuns são a acetilação e metilação no

aminoácido lisina

Mas porquê a lisina?

§ A lisina é um aminoácido indispensável. Nos humanos não é sintetizada

e deve ser obtida através da alimentação.

§ A lisina sofre múltiplas modificações pós-traducionais que que modifica

a ação de muitas proteínas – não é algo restrito às histonas.

Matilde Monteiro 178

 § As modificações pós traducionais da lisina estão relacionadas com o
metabolismo dos lipídeos, glicose e aminoácidos, pelo que podem ser
vistas como um sensor celular para o status metabólico em resposta a
estímulos fisiológicos (incluindo estímulos externos)

§ Dessa forma, as modificações pós-traducionais na lisina modulam a

atividade das proteínas incluindo as histonas, permitindo uma ligação
direta entre o status metabólico e a regulação da expressão génica

A acetilação das histonas está SEMPRE associada à sua ativação.

A metilação das histonas pode estar associada à sua ativação ou repressão.

Proteínas que regulam o epigenoma

Writer – enzimas que catalisam a adição de modificações epigenéticas

Readers – proteínas que reconhecem e ligam a modificações epigenéticas

Erasers – enzimas que catalisam a remoção de modificações epigenéticas

• A ação controlada destes 3 grupos de enzimas garantem a manutenção e regulação do

epigenoma.

Epigenoma e fatores ambientais

• Tempo, drogas, status económico, exercício físico, microbioma, interação social, estado
psicológico, alimentação

• A determinação do sexo das tartarugas é dependente da temperatura

• As abelhas são todas geneticamente idênticas. No entanto, algumas desenvolvem-se

como abelhas obreiras e outras como abelhas rainhas, com fenótipo muito diferente

o As larvas rainha alimentam-se de geleia real, que leva ao silenciamento e ao

levantamento da metilação do DNA – único fator determinante.

Matilde Monteiro 179

 T21- Desregulação da expressão (epi)genética na doença

Muitas doenças têm uma componente genética e/ou epigenética que leva frequentemente a alterações da
expressão génica

As doenças genéticas podem ser monogénicas, ou seja resultam de mutações num único gene (transmissão
mendeliana), ou poligénicas (mais complexas) que resultam da ação combinatória de vários genes
polimórficos (p.e. diabetes tipo II).

As doenças poligénicas ocorram com maior frequência e apresentam um impacto social e económico elevado.

Anomalias epigenéticas e patologias (acumulam com a idade)

• Diabetes tipo II
• Esquizofrenia
• Síndrome do QT Longo
• Autismo
• Doenças autoimunes como o lúpus

Matilde Monteiro 180

Epigenética e Cancro

• Alterações nos fenómenos que controlam esta epigenética levam ao aparecimento

cancro
• As células cancerígenas são células com ritmos de divisão anormais
• Genes supressores tumorais controlam as células, impedindo-as de aumentarem o ritmo
de divisão
• Quando há inativação dos genes supressores tumorais, não há controlo na divisão das
células, podendo formar-se um tumor
• Ativação de genes promotores do crescimento
• Têm genes mais metilados, tendo em conta os genes que interessam para que a célula
seja normal
• Os tumores podem ser classificados pela especificidade do seu perfil epigenético

Tipos de modificações epigenéticas

Metiltransferases (DNMTs) - adicionam grupos metilo à sequência,
inativando a transcrição do gene

CpG islands – grupos de citosina e guanina próximos dos promotores;

são essas citosinas que costumam ser metiladas

à Regulação genética
à Estrutura da cromatina
à Diferenciação
à Inativação do cromossoma X*
Metilação do DNA
à Cancro**

Matilde Monteiro 181

 Modificações nas histonas (N-terminal) condicionam o grau de
condensação da cromatina
• Condensada → heterocromatina → gene off
• Descondensada → eucromatina → gene on
• Acetilação → descondensada → gene on
• Metilação → gene off
• Fosforilação
Modificações de
Histonas

RNAs de dupla cadeia, pouco comuns, resultantes da junção de duas

cadeias simples de RNA
MiRNA’s Contêm uma sequência para a qual outros RNAs têm uma
(micro RNA’s) complementar, unindo-se e impedindo que aquele RNA seja transcrito
A cadeia dupla de RNA é degradada por enzimas que reconhecem a
anormalidade ocorrida

* Inativação do cromossoma X

• Ocorre nas mulheres

• Dá-se aleatoriamente
• Em 50% das células é inativado o cromossoma X proveniente do pai e nas restantes
50% é inativado o cromossoma X proveniente da mãe
• Em doenças ligadas ao cromossoma X, só nas células em que o cromossoma X ativado é
portador da doença é que esta se vai manifestar

** Células cancerígenas

• Crescimento descontrolado
• Genes não metilados - promotores de crescimento
• Genes metilados - supressores tumorais; genes que vigiam o crescimento celular;
reparadores do DNA;

Matilde Monteiro 182

A regulação da expressão génica pode ocorrer a vários níveis como a replicação do DNA, da transcrição
de DNA em RNA, no processamento, no transporte e até mesmo na tradução das proteínas

Perfil molecular de tumores

• 96 amostras experimentais de linfomas fenoticamente similares

• 18000 genes com expressão alterada

• O perfil de expressão génica dos tumores permite classificá-los em subtipos e

identificar quais os pacientes que melhor responderá a uma determinada terapia
(oncologia de precisão)

DNMT3A e leucemias

Enzima implicada na metilação de novo de motivos CpGs após a replicação de DNA.

Mutações na DNMT3A são das mutações somáticas mais frequentes e ocorrem em 25% das leucemias
mieloides agudas (AML).

Genética e epigenética: dois lados da mesma moeda : Os genes podem podem ser inactivados quer por
mutações como por metilação de DNA/histonas

Síndromas associadas a expressão de MeCP2

MeCP2 (methyl cytosine binding protein 2) é uma proteína “reader “
o Síndroma de Rett (RTT): perda de expressão de MeCP2; É uma doença neurológia que
afeta principalmente o desenvolvimento cerebral (encefalopatia), em que os sintomas
agravam-se com a idade;
• Esperança de vida ~ 40 anos
Não há tratamento efetivo
Doentes aparentemente normal nos
1os meses de vida
Encefalopatia progressiva
Perda da linguagem expressiva
Movimentos repetitivos da mão
Dificuldade na respiração

o Síndroma de Duplicação de MECP2 (MDS): aumento da expressão de MeCP2

o Doença do Espectro Autista (ASD): redução da expressão de MeCP2

Matilde Monteiro 183

 T22- Métodos de estudo do epigenoma

O 1º nível de controlo da expressão génica estabelece-se no acesso ou não à cromatina: se esta

estiver condensada não irá ser transcrita → Genes OFF.

Este estado de condensação da cromatina depende das modificações pós-traducionais das

histonas que compõem os nucleossomas.

Histone post-translational modification code – conjunto de modificações póstraducionais

que ocorrem nas histonas que compõem os nucleossomas.

A acetilação das histonas leva

sempre à sua
ativação. Já a metilação pode levar
à ativação ou à repressão.

Ao conjunto de enhancers reconhecido por fatores de transcrição numa dada região reguladora
de DNA dá-se o nome de “enhanceossoma”.

É a interação entre um segmento de DNA (elementos reguladores: enhancers, repressores,

promotores) e proteínas (fatores de transcrição) que regulariza a expressão génica. Estes fatores
de transcrição possuem 3 domínios funcionais:
• Domínio de ligação ao DNA
• Domínio de regulação
• Domínio de interação proteica

Distribuição das regiões reguladoras no DNA

Estas podem estar localizadas junto ou afastadas do promotor. Na
verdade, podem estar localizadas nas regiões intrónicas do próprio
gene.
Para as identificar, pode-se recorrer a uma abordagem in silico, ou
seja, bioinformática.
Como se tratam de regiões muito conservadas ao longo da evolução,
estas são identificadas por comparação entre genomas de diferentes espécies.

Estas regiões reguladoras podem ser testadas através da técnica de Gene

Reporter Assay:

Matilde Monteiro 184

Para esta técnica utiliza-se um gene repórter (gene cuja presença é facilmente mensurável). Este
permite monitorizar a expressão de um gene quando associado às regiões reguladoras de DNA.
São exemplos o GFP, lacZ, Luciferase, etc.

Para identificar TODAS as regiões reguladoras de um gene efetua-se a deleção em série:

Relativamente aos fatores de transcrição, é frequente utilizar-se proteínas truncadas em série

de modo a identificar a região da mesma que se liga aos locais de regulação do DNA.

No geral...
Quando se quer estudar a ação de uma região reguladora do DNA ou de um fator de transcrição
procede-se à truncação ou deleção de nucleótidos ou aminoácidos.

Técnica de EMSA (electrophoretic mobility shift assays)

Permite estudar a interação física entre proteínas e regiões

reguladoras do DNA in vitro.
• Eletroforese onde se vai colocar uma sonda de DNA
marcada radiativamente (que corresponde à região
enhancer que será reconhecida pelo fator de
transcrição);
• Junção de fatores de transcrição;
• As sondas de DNA que se ligam aos fatores de
transcrição apresentam um peso molecular superior
às que não se ligam, logo irão percorrer um menor
caminho no gel da eletroforese;
• Também se pode adicionar um anticorpo contra o
fator de transcrição.

Para se testar os resultados obtidos pode-se utilizar uma sonda mutada ou um competidor.

Matilde Monteiro 185

Técnica de ChIP (Chromatin immunoprecipitation)

Permite estudar a interação entre proteínas e regiões reguladoras

do DNA in vivo. Também possibilita o estudo do estado de
modificação das histonas - para tal, utilizam-se anticorpos
específicos contra as marcas epigenéticas das histonas.

1. Estabelecimento de cross-links entre o DNA e a proteína

(de modo a fixar a interação)
2. Lise celular
3. Fragmentação do DNA por sonificação ou digestão
enzimática
4. Imunoprecipitação (utilizando um anticorpo contra a
proteína que se pretende testar: fator de transcrição,
histona ou marcas epigenéticas da histona)
5. Purificação do DNA
6. Análise da ligação entre DNA e proteína (PCR, microarray, sequenciação, ...)

Matilde Monteiro 186

 T23 – Engenharia genética. Modelos experimentais de manipulação da expressão genética

Tipos de manipulação da expressão genética

Gene Knockin / Alteração da sequência nucleotídica do gene, sem impacto na sua

Replacement expressão (gene mutante é expresso na mesma)

Gene sem expressão (ambos alelos de um gene, num organismo

Gene Knockout
diploide, podem ser inativados ou eliminados)

Níveis de expressão anormalmente elevados (ex.: adição de cópias do

Gene Overexpression
gene)

Expressão em células ou tecidos que normalmente não expressam o

Ectopic gene expression
gene em causa

Gene Misexpression Expressão temporal errada no desenvolvimento

Gene sob o controlo de

Expressão pode ser ligada ou desligada a qualquer momento
um promotor induzível

Expressão de proteínas mutantes não-funcionais que são capazes de

Mutações
inativar complexos proteicos mesmo na presença da proteína normal
dominantenegativas

Matilde Monteiro 187

Mutagénese de genes - “Site-directed mutagenesis” (mutagénese dirigida) por substituição,
inserção ou deleção

Mutações específicas da sequência codificante de uma proteína servem para determinar

aminoácidos ou domínios proteicos importantes para um determinado processo
biológico:
o “Folding” proteico, interações proteína-proteína, catálise enzimática (ex.
fosforilação)

Matilde Monteiro 188

Manipulação da expressão genética

• Perda (Loss Of Function-LOF) remoção do gene, indução da degradação do mRNA,

inativação da proteína
• Ganho (Gain Of Function-GOF) de função expressão ectópica da proteína, em células
onde normalmente não existe expressão

Atuação em:

• DNA - ablação/introdução do gene usando técnicas de DNA recombinante

• mRNA - silenciamento usando RNA de interferência (RNAi)
• Proteína - sequestração usando anticorpos ou proteínas recombinantes
Modelos experimentais - modelos animais (in vivo) ou células em cultura (in vitro)

Eletroporação

• Introdução de DNA recombinante (geralmente plasmídeos) nas células pela ação de um

campo elétrico
• Em certos tecidos, como por exemplo a medula espinhal, o plasmídeo é eletroporado
numa hemi-medula mantendo a outra hemi-medula intacta, a qual serve de controlo
interno
• Dependendo do tipo de plasmídeo, podem ser realizadas experiências de LOF (RNAi) ou
GOF (sobre expressão ectópica)

Porquê Gerar Animais Geneticamente Modificados?

1) Estudar a função e a regulação de um dado gene (desenvolvimento, comportamento e

fisiologia)
2) Estudar doenças humanas
3) Produzir biomoléculas com interesse farmacológico (antitrombina (tratamento da fibrose
cística), albumina humana sérica (hemoderivado), anticorpos policlonais (vacinação))

Nota: utilizam-se ovelhas para a produção do ativador do plasminogénio (TPA), no seu leite, devido
às modificações pós-traducionais que o animal mamífero permite (N-glicosilação), ao contrário das
bactérias

Murganho (ratinho) como modelo animal

• É um mamífero, pequeno e com gestação curta (~20 dias)

• É de longe o modelo mais usado para estudos de genética molecular em vertebrados
• Mutações espontâneas em murganhos frequentemente mimetizam o fenótipo das
mesmas mutações em humanos

Matilde Monteiro 189

 • Existe um elevado grau de conservação entre os genomas do murganho e humano
99% dos genes do ratinho tem um gene homólogo humano

Microinjeção de DNA recombinante em embriões unicelulares

• Ratinhos Transgénicos - Cópias múltiplas do transgene (usados para modificar o genoma

dum certo organismo) são inseridas em locais desconhecidos e de forma aleatória no
genoma
• Desvantagens:
o Mutagénese nos locais de inserção o Alguns dos transgenes podem ficar sob o
controlo de diferentes genes e serem regulados de forma inapropriada;
o Níveis de expressão dependentes do número de cópias, por isso torna-se
necessária a comparação entre diferentes linhas de transgénicos.
• Os ratinhos transgénicos são gerados muito mais facilmente do que os ratinhos mutantes

• Usando um micromanipulador, 10-30% dos ovos sobrevivem à manipulação, sendo que

estes têm o DNA recombinante integrado no genoma.

O transgene é
injetado em um
Os ovos injetados são 10 a 30% da
pronúcleo de um ovo
transferidos para uma descendência contém
fertilizado antes da
mãe adotiva o DNA recombinante
fusão dos pronúcleos
masculino e feminino

Cruzamento dos
ratinhos transgénicos
Os ratinhos são
até produzir
testados por Southern
linhagens puras de
blots e/ou PCR de
transgénicos
DNA isolado de cauda
homozigóticas para o
transgene

Recombinação homóloga em células estaminais embrionárias (ES cells)

• Ratinhos Mutantes (“targeted”)

• Knockins, knockouts, knockouts condicionais, knockouts induzíveis

• O transgene é inserido num local genómico definido
• Os ratinhos transgénicos são gerados muito mais facilmente do
que os ratinhos mutantes

Matilde Monteiro 190

“KnockOut” (KO) dum gene

Ø Inserir o gene Neor + um gene repórter no interior do gene alvo

Ø Neor = gene que confere resistência ao G418 (antibiótico neomicina) => seleção positiva

Plasmídeo

Plasmídeo target gene

KO

+ LacZ/GFP

Ratinhos Knockout - gerados por recombinação homóloga em células embrionárias estaminais

(ES cells)

ES cells - derivam da massa interna de células de blastocistos, colhidos do útero de uma

fêmea 3 dias após a fertilização

1) Geração do DNA recombinante

2) Colheita das ES cells – células pluripotentes recolhidas do blastocisto

3) O plasmídeo KO é inserido nas “ES cells” por eletroporação (transfeção)

4) Recombinação homóloga nas ES cells

1. Troca da sequência genómica pelo construto de DNA existente no plasmídeo KO
após emparelhamento das sequências homólogas
2. Esta inserção deste DNA recombinante leva à deleção ou interrupção de uma cópia
genómica do gene

5) As ES cells, contento um alelo mutante, são microinjetadas num embrião de ratinho no

estádio de blastocisto

6) Os ratinhos resultantes são quimeras, contendo tecidos que derivam de ES cells préexistentes
e transplantadas

Matilde Monteiro 191

7) Os ratinhos quimeras são acasalados para produzirem ratinhos nos quais o alelo mutante foi
incorporado na linha germinativa

8) Os ratinhos heterozigóticos para a mutação KO são acasalados entre si para produzir ratinhos
homozigóticos knockout

As diferenças na cor do pêlo dos ratinhos dadores de ES cells (Agouti/castanho) em relação aos
ratinhos recipientes de blastocistos (Albino/branco) são usadas para identificar os ratinhos
knockout “founders”, os quais têm uma mistura das 2 cores de pêlo, mostrando o seu genótipo
quimérico

Os fundadores (founders) são identificados pela capacidade destes gerarem ratinhos com a cor
de pêlo correspondente à fonte de ES cells, quando cruzados com ratinhos com outra cor de pelo

Matilde Monteiro 192

 Knockouts Globais/Clássicos

Podem não ser os modelos ideais para estudar genes:

• Necessários durante o desenvolvimento embrionário

• Têm expressão em vários tecidos
Knockouts em Tecidos Específicos “Tissue-Specific” (Condicionais)

Sistema Cre-Lox

Desenvolvido para permitir a interrupção da expressão de um dado gene somente num tipo
particular de tecido

• LoxP - Local especifico para a ocorrência de recombinação

• Cre recombinase – reconhece os locais Lox P - Enzima que catalisa a recombinação entre
2 locais loxP, os quais derivam do bacteriófago P1 de E. coli

1) Linha Floxed – linha de ratinhos em que são inseridos os locais loxP de modo a flanquear o
gene de interesse

2) Linha Cre - linha de ratinhos transgénicos contendo o gene Cre sob o controlo de um
promotor específico de um tipo celular

3) Cruzamento das duas linhas de ratinhos transgénicos produz uma descendência contento: o
Locais loxP a flanquear o gene de interesse o Gene da Cre recombinase sob o controlo de um
promotor “cell-type specific”
o A recombinação só ocorre nas células onde o promotor está ativo, assim o gene só é
eliminado em certos tecidos

4) Ratinhos contendo o alelo mutante loxP podem ser cruzados com diferentes linhas de
ratinhos transgénicos com a Cre recombinase sob o controlo de diferentes promotores
(específicos de um determinado tecido), com o objetivo de investigar os efeitos fenotípicos
nos diversos tecidos onde a expressão do gene é interrompida/eliminada

Matilde Monteiro 193

RNA de Interferência (RNAi)

Fenómeno de silenciamento pós-transcricional de genes, específico conservado

evolutivamente.

Uso de siRNA em linhagens celulares

• Eficiente (existem agentes de transfeção disponíveis comercialmente)

• Facilmente controlável e exequível
• Inibição transiente => siRNA (oligonucleótidos) o siRNA scramble – Não fez annealing com
RNA nenhum ou fez com algum que não é desta linhagem de células
• Inibição sustentada => shRNA (plasmídeo)

Podemos colocar os siRNA em partículas víricas que depois têm moléculas que permitem
reconhecer as células alvo, complexar com moléculas sintéticas, anti-corpos, lisossomas,
nanopartículas, ect.

Matilde Monteiro 194

Ratinhos mutantes CRISPR

Os ratinhos mutantes podem ser produzidos com CRISPR/COS9 injetando o mRNA de COS9 e
um ou vários RNAs guia (sgRNA) diretamente nos embriões de ratinho para editar o genoma em
locais específicos.

Os ratinhos que se desenvolvem a partir destes embriões são genotipadas ou sequenciadas para
determinar se a mutação desejada está presente. Estes são depois cruzados para confirmar a
transmissão da mutação para a linha germinativa.

Matilde Monteiro 195

 T24- Mecanismos de silenciamento genético

Se a interação entre a extremidade cap 5’ e a cauda poly-A 3’ não ocorrer, o RNA é degradado.

Como é que os RNA’s são degradados?

o São degradados por proteínas específicas com atividade de RNAse, sendo estas proteínas
diferentes quando se trata de uma deleção na extremidade 5’ ou 3’

Onde é que são degradados?

o Ocorre no citoplasma por ação de estruturas que acumulam as enzimas necessárias ao

processo – Processing Bodies (Pbodies)

Várias proteínas se encontram nestas estruturas, tal como a GFP e a Argonaute

Existem no genoma sequências genéticas que levam à

Proteína que está envolvida
transcrição de microRNA’s, e existem regiões que vão
com o complexo RISC que
ser transcritas e dar origem aos pri-miRNA’s – são
degrada o mRNA através de
regiões tipicamente policistrónicas, ou seja, sintetizam
RNA de interferência
mais do que um microRNA de cada vez

Cerca de 30% do genoma humano é controlado por microRNA’s.

Matilde Monteiro 196

Como é que o pri-miRNA dá origem ao microRNA?

1. Ao pri-miRNA junta-se o complexo DROSHA que os torna em pre-miRNA

2. O pre-miRNA vai para o citoplasma através da exportina 5
3. No citoplasma, os pre-miRNA’s juntam-se ao complexo DICER que remove o hairpin loop,
dando origema um microRNA duplex-com duas cadeias
4. O microRNA maduro junta-se ao complexo RISC e pode induzir clivagem de mRNAS’s ou
silenciamento de RNA’s

Os microRNA’s são muito importantes em diversos mecanismos celulares, especialmente

associados a patologias (ex: aumento dos miRNA no cancro da mama).

Como beneficiamos deste conhecimento?

• Mecanismo do RNAi – RNA interferência

o É introduzido nas células um DNA de cadeia dupla, seja pequeno – siRNA (small
interference RNA) - ou maior – dsRNA (double stranded RNA), que são
reconhecidos pela proteína DICER (sendo que neste caso, se for dsRNA dá origem
a mais pequenos)
o Os siRNA’s, que são artificiais exógenos, pretendem mimetizar os microRNA’s
endógenos, reportando o mesmo mecanismo que leva à deleção do mRNA

§ Quando os siRNA’s são introduzidos na célula, vão ser reconhecidos pelo

complexo RISC, e uma das cadeias vai levar ao reconhecimento do
mRNA, induzindo assim a sua degradação nos Pbodies

Matilde Monteiro 197

Comparação entre siRNA e microRNA

São ambos agentes terapêuticos.

siRNA - Moléculas exógenas artificiais

• Limitação: o tratamentocom siRNA é sempre transiente (não dura)

o Como contornamos esta limitação?

Utilização de plasmídeos que contêm a informação da sequência de RNA que

contêm uma sequência sense e antisense complementar – vai levar à formação
do hairpin loop

shRNA – short hairpin RNA

A utilização do plasmídeo permite a

utilização duma região promotora que
permite a utilização contínua no tempo do
shRNA – induzindo o silenciamento

microRNA – moléculas endógenas, produzidas nas nossas células, que levam à indução do
mecanismo de RNA interferência e são específicas de determinados alvos de RNA mensageiro.

Matilde Monteiro 198

 T25 - Terapias Genéticas

Terapia genética - conjunto de abordagens que, através da administração de material genético

recombinante, permite corrigir uma doença genética ou outras (ex. cancro)

RNA interferência - moléculas de RNA com dupla

cadeia que levam a que, no citoplasma, haja ativação
enzimática:

• Enzima Dicer - liga-se à componente de

duplo RNA, clivando-a em segmentos mais
pequenos

• Enzima RISC – digere o duplo RNA, e liga-o

a uma cadeia de mRNA por
complementaridade de bases, sendo esta
porção do Mrna clivada – não há produção
da proteína.

• Uso em laboratório - RNAi’s interferem com

o mRNA e impedem a expressão de um
gene, de modo a analisar o seu papel na
célula.

Matilde Monteiro 199

Trasndução- processo através do qual DNA estranho é introduzido numa célula por um vetor
vírico.
Transgene – sequências com RNAi para regular/reparar/aumentar/diminuir o produto de
expressão de um ou mais genes
Vetores – veículos para transportar o material genético recombinante para as células
Víricos
1) Inserção do transgene no genoma vírico
modificado
2) Os genes víricos responsáveis pela
replicação, patogenicidade são removidos e
substituídos pelo material genético
Integração em partículas víricas - Lentivírus
Limitado ao tamanho do genoma do vírus
Genoma de retrovírus e lentivírus insere-se no
genoma da célula transduzida
Podem induzir resposta imunitária
Eficiência de transfeção muito elevada
Transdução por vetores víricos
• Capacidade inata para transduzir as
células
• Evitam facilmente a degradação no
citoplasma da célula
• Transferem de forma muito eficaz o seu
material genético para o núcleo
Maior parte dos vetores víricos são gerados a
partir de:
• Vírus herpes simplex tipo 1
• Adenovírus
• Vírus adeno associado
• Retrovírus
Matilde Monteiro
Não víricos
1) Inserção do siRNA num plasmídeo
2) Integração do plasmídeo em partículas
lipídicas (lipossomas) / biomateriais /
polímeros sintéticos
Tamanho ilimitado do DNA que podem
transportar
Não se inserem no genoma
Mais seguros
Eficiência de transfeção muito baixa
Transfeção por vetores não víricos
• Evitar ataques das nucleases
• As células endoteliais normalmente
dificultam difusão exceto a vasculatura
tumoral
• Barreiras intracelulares
o Ligação à membrana
citoplasmática/internalização
depende do tamanho, carga das
partículas (algumas partículas têm
recetores acoplados)
o No citoplasma - acidificação no
endossoma
o Levar o material genético para o
núcleo
200
Como se gera um vetor vírico?

1- Coding genes (replication + structure) are placed in a plasmide – helper DNA

2- Cis-acting sequences (packaging signal) are linked to the transgene cassete in another plasmide: vector
construct

Ciclo de vida de um vírus normal | Ciclo de vida de um vetor vírico não replicativo

Matilde Monteiro 201

 Construção de vetores derivados de vírus

Partículas víricas de retrovírus não replicativas que transportam o material genético “cassete de
expressão” de interesse

Terapia genética in vivo

Administração direta de vetores (víricos /não víricos) nos pacientes

Terapia genética ex vivo

• Uso de células do paciente, tratamento das células com um vetor (vírico), e re-infusão das
células tratadas no paciente
• Podem ser usadas células germinativas e células somáticas, mas a legislação atual só
autoriza terapia génica ex-vivo com células somáticas.

O vetor é introduzido nas

células do paciente

Matilde Monteiro 202

Genes suicidas – para o tratamento de gliomas (cancro)

1) Injeção localizada (cérebro) do vetor adenovírico que expressa a timidina cinase (TK) do
vírus HSV-1
2) Injeção intravenosa da droga ganciclovir
3) 2- A TK converte a droga ganciclovir (GCV) em GCVmonofosfato que é depois convertido
por cinases intracelulares num produto tóxico para a célula que inibe a DNA polimerase
4) Apoptose

Vetores víricos oncolíticos

• Vírus replicativos com deleção de genes responsáveis pela replicação em células normais
• Os vírus replicam-se seletivamente nas células tumorais induzindo a sua lise

Vetores víricos oncolíticos + imunoterapia

Vírus expressam citocinas que recrutam uma resposta imunitária anti tumoral

Matilde Monteiro 203

SCID- Imunodeficiências combinadas severas

Na maioria das SCID, o tratamento é por transplantes de medula óssea de dadores

compatíveis

ADA-SCID X-linked-SCIDs
Mutação na enzima adenosina desaminase o SCID-X1 (mutação numa s.u. (γc) de recetor de
Enzima envolvida no metabolismo de ATP IL) –afeta desenvolvimento e função dos
presente em grandes quantidades nos linfócitos
linfócitos Granulomatosa crónica (mutações na NADPH
o Ausência da enzima induz acumulação de oxidase) - afeta função dos neutrófilos
dATP que é tóxico para os linfócitos Sindrome Wiskott-Aldrich - mutações que
afetam a proteína do citoesqueleto actina
expressa nas células hematopoiéticas
Tratamento - administração da enzima
(caro e pouco eficaz)

Restaurar expressão/função de genes - Ex-vivo

Retrovírus transfere gene normal ADA para as células hematopoiéticas auto-transplantadas

depois no paciente

Terapia génica para tratamento da dor crónica

• Causada pela transmissão nociceptiva

• Bloqueio da transmissão nociceptiva através do aumento da inibição da transmissão
nociceptiva o Injecção subcutânea de HSV-1 o Expressão de opióides

• Bloqueio da libertação de noradrenalina o HSV-1 migra retrogradamente para várias

áreas do encéfalo incluindo áreas noradrenérgicas
o Limitar a expressão aos aferentes noradrenérgicos: “tissue specific”- promotor da
tirosina hidroxilase (TH) o O bloqueio da libertação de noradrenalina no DRt induz
analgesia sustentada

Matilde Monteiro 204

 T26- Aplicações das tecnologias de análise genética em diagnostico- Teste Genético de
pré-implantação

Efetuado ou no ovócito ou no embrião em desenvolvimento.

1) Hiperestimulação hormonal controlada da mulher para obter múltiplos ovócitos maduros sincronizados

2) Microinjeção intracitoplasmática do espermatozoide (ICSI)

3) Biopsia embrionária (pode ser realizada em diferentes momentos)

a) Biopsia do glóbulo polar

- só́ pode ser efetuada quando é a mulher a portadora da patologia

- análise de material descartado pela divisão meiótica feminina

- só é analisado o genoma materno

- é um diagnóstico indireto

- não existe interferência de mosaicismo

b) Biopsia do embrião em divisão

- é o método mais utilizado

- é efetuado no 3o dia pós-ICS
- mosaicismo (15-90%)
- são removidos por aspiração 1 ou 2 blastómeros

c) Biopsia do blastocisto

- efetuada no 5o/6o dia pós-ICSI

-permite a análise de múltiplas células (3-10)

- não são analisados todos os embriões

- possibilidade de mosaicismo, embora em menor grau (15-30%)

- trofectoderme (células que originam a placenta) pode não ser representativa da massa
celular interna

d) Blastocentese

- efetuada no 5o/6o dia pós-ICSI

- método menos invasivo
- aspiração do fluído do blastocélio

e) Análise de DNA livre no meio de cultura

- método não invasivo (niPGT-A)

4) Análise genética da(s) célula(s) isolada(s)

Matilde Monteiro 205

Teste genético pré-implantação

• PGT-M ou PGT-SR: para casais em risco de transmitirem a patologia genética à descendência;

• PGT-A: para casais inférteis, com o objetivo de aumentar as taxas de gravidez após procriação
medicamente assistida.

Métodos para a realização de PGT-A

Matilde Monteiro 206

Apesar do potencial reduzido para dar origem a uma gravidez, os embriões mosaicos podem resultar em
nascimentos.

Patologia cromossómica (PGT-SR)

• Anomalias cromossómicas estruturais: translocações recíprocas, translocações robertsonianas,

inversões, deleções

• Anomalias cromossómicas numéricas

Utilização da técnica de FISH

• Sondas que permitam detetar todas as combinações viáveis

• Combinação das sondas otimizada em linfócitos dos progenitores

• Avaliação de eventuais polimorfismos

Matilde Monteiro 207

Fatores que influenciam o diagnóstico:

• Eficiência e rigor do PCR de uma célula isolada

• ADO – Alelle dropout (falha na amplificação de 1 dos alelos)
• Contaminação (com DNA materno/ parterno/ externo)
• Mosaicismo

Matilde Monteiro 208

 T27- Medicina Genómica

Trata-se de uma área da Medicina que inclui o uso da informação genética de um indivíduo como parte
integrante da sua abordagem terapêutica.

• Avaliação associações genótipo-fenótipo

• Avaliação do risco de doenças em indivíduos e famílias

• Diagnóstico doenças raras

• Melhoria segurança e eficácia dos medicamentos

Variações genómicas clinicamente importantes

• Alterações nas regiões codificantes dos genes (exões)

o Pode levar à inatividade de proteínas (perda de função) ou à ativação de novas

proteínas (ganho de função).
o Na grande maioria estas alterações são SNPs (single-nucleotide polymorphism)

É relevante avaliar variantes em genes envolvidos na resposta a fármacos e risco de aquisição de doenças.

• Variações estruturais

o Deleções ≥ 1 base da sequência

§ Podem ter milhares ou até milhões de pares de bases de comprimento

§ Potencial relevância clínica se removerem uma região cromossómica

necessária para o funcionamento normal

o Inserções ≥ 1 base da sequência

§ Podem introduzir uma cópia extra de um gene podendo levar aumento de

função da proteína/enzima

§ Aumentar o metabolismo do fármaco produzindo níveis subterapêuticos/

efeitos tóxicos

Matilde Monteiro 209

 - Alterações nas sequências não codificantes (intrões – 98% do genoma humano)

Os elementos principais no DNA não codificante incluem promotores,

enhancers, locais de ligação a fatores de transcrição e RNAs não
codificantes à podem influenciar expressão do gene.

Embora não mudando diretamente a sequência de DNA, as alterações

epigenéticas nos nucleotídeos ou proteínas associadas (ex.: metilação
de resíduos de citosina ou variação nas histonas que compactam o
DNA em cromossomas) podem afetar a acessibilidade dos
segmentos de DNA para a transcrição, resultando em diminuição ou
ausência transcrição.

É importante salientar que os SNPs têm alguns pontos fracos que limitam a sua aplicabilidade num doente
específico, particularmente se a variação genómica subjacente à patologia for rara.

§ Avaliação de SNPs conhecidos (previamente identificados) - tipicamente presentes numa

grande proporção de uma população (dificulta a interpretação de variantes raras ou mesmo únicas
num indivíduo)
§ Menos precisos para analisar algumas regiões genómicas (ex.: regiões com DNA altamente
repetitivo)
§ Normalmente inadequadas para avaliar a maioria dos tipos de variações estruturais

Para combater estas dificuldades utiliza-se a

sequenciação do DNA…

- Testes gene único e painéis de gene

Gene ou pequeno grupo de genes fortemente implicado na aquisição da

patologia (pelas características clínicas do doente)

- Sequenciação do exoma (regiões codificantes da proteína) e genoma

Características clínicas não indicam claramente gene ou grupo de genes
envolvidos.

Genoma vs exoma:

• Sequenciação do genoma produz leitura base a base de cada nucleotídeo do

genoma
• Sequenciação do genoma fornece cobertura mais uniforme de todo o genoma
evitando problemas de amplificação diferencial de segmentos; melhorando resolução de
variantes estruturais e geração mais rápida de dados Desvantagens do genoma:
produz substancialmente mais dados que requerem interpretação e alto custo.

A escolha do método de sequenciação é influenciada por fatores como: custos, recursos de informática do
laboratório e recursos para interpretação dos resultados.

Matilde Monteiro 210

Interpretação de variantes genómicas / Avaliação da patogenicidade de variantes

Milhares de variantes terão pouca ou nenhuma informação disponível nos bancos de dados atuais.

Determinar qual dessas variantes pode causar um fenótipo específico, ou pode colocar um indivíduo em
risco de doença ou resposta adversa ao medicamento, é um processo complexo.

É necessário filtrar as variantes que provavelmente não causam doenças.

As mutações podem ser:

§ Claramente causadoras de doenças (Patogénicas);

§ Claramente não causadoras de doenças (Benignas);
§ Relação com doença é desconhecida (variantes de significado desconhecido (VUS));
§ Patogenicidade não conhecida, mas inferida (mesmo efeito na função do gene de variante previamente
classificada - provavelmente patogénica (LP) ou provavelmente benigna (LB)).

As variantes de significado desconhecido (VUS) são problemáticas…

Relevância clínica desconhecida
• Cada indivíduo é portador milhões de variantes à muitas ocorrerão por acaso nos genes
causadores de doenças, especialmente em genes grandes
o Quando as VUS são detetadas num doente com fenótipo presumivelmente relacionado com
gene causador da doença, pode ser mal interpretada como causadora do fenótipo quando,
na verdade, são coincidentes e não relacionadas
o Pode levar médicos a intervenções invasivas
• Conhecimento destas variantes é importante para ficarem disponíveis em bases de dados,
podendo mais tarde passar a patogénica ou LP

o Mudanças podem ocorrer entre classificações mais definitivas - benigno ou LB para

patogénico ou LP e vice-versa – menos frequente

A genética do cancro
O cancro é uma doença genética.
As alterações genéticas promotoras do cancro podem ser:

• Hereditárias / germinativas – presentes em todas as células da

descendência
• Adquiridas / somáticas – ocorrem durante a vida. São o resultado de
erros durante a divisão celular ou exposição a carcinogéneos que
danificam o DNA.

O cancro de um doente apresenta uma combinação única de alterações genéticas. Estas podem resultar do
cancro em vez de serem a sua causa – à medida que o cancro prolifera vai acumulando alterações adicionais.

Matilde Monteiro 211

Heterogeneidade intratumoral – células cancerígenas de um cancro podem ter diferentes alterações
genéticas.

è Síndromes hereditários o Mutações genéticas hereditárias ocorrem em cerca de 5-10%

cancros
o Nem todos os que a herdam a mutação irão necessariamente desenvolver cancro
o Exemplos de genes que podem predispor a Síndromes de cancro hereditário:
§ TP53 - Mutações germinativas associadas a Síndrome de Li-Fraumeni
(patologia rara que leva aumento do risco de desenvolvimento de cancro
da mama, SNC, sarcomas, leucemia e outros)
§ Mutações herdadas nos genes BRCA1 e BRCA2 - Associadas a Síndrome
Hereditário Cancro da Mama e Ovário; cancro do pâncreas e próstata
§ Mutação germinativa no gene PTEN - Associa-se ao Síndrome de Cowden
(patologia herdada que aumenta o risco do cancro da mama, tiróide,
endométrio e outros)
o Embora técnicas moleculares para avaliar variações do genoma humano sejam mais
sofisticadas, a história familiar cuidadosa é crucial e possui bastante relevância.

Testes genéticos

- Identificar se o membro de uma família com sinais de síndrome de cancro

hereditário é portador de mutação;

-Detetar se membros da família sem doença herdaram a mesma mutação do

membro com cancro associado à mutação;

- Recomendados quando a história pessoal ou familiar sugere patologia

hereditária predisponente de cancro, desde que o resultado possa ser adequadamente
interpretado (isto é, claramente dizer se alteração genética específica está presente ou
ausente) e quando os resultados fornecem informação que irá auxiliar na abordagem
clínica do doente.

Matilde Monteiro 212

 Biomarcadores
São moléculas biológicas encontradas no sangue, outros fluidos corporais ou tecidos que são um sinal de
um processo normal ou anormal, ou de uma condição ou doença.

è 2 indivíduos com o mesmo tipo de cancro podem não apresentar as mesmas alterações!

Tipos de biomarcadores

§ Genes únicos/conjunto de genes

o Sequenciação do gene, painel gene, exoma e genoma
o Análise do número de alterações genéticas de um cancro (carga mutacional do tumor) – avaliar
indicação imunoterapia
Avaliação de biomarcadores feita rotineiramente para selecionar tratamento em certos tipos de
cancro
§ Marcadores tumorais
o Proteínas ou outras substâncias encontradas em quantidades mais elevadas em doentes com
cancro
o Alguns associados a um tipo de cancro enquanto outros podem associarse a vários tipos
o Embora um nível elevado possa sugerir cancro e auxiliar no diagnóstico, não é suficiente
para o diagnóstico. Geralmente são combinados com resultados de outros testes
o Doseados periodicamente durante o tratamento ou após para avaliar resposta/ recidiva

Para realizar a avaliação de um biomarcador realizam-se colheitas de amostras por biópsia ou durante a
cirurgia.

É possível realizar uma biópsia líquida nos tumores que libertam células e material genético para sangue.

Possíveis resultados do estudo dos biomarcadores:

§ Biomarcador associado a ausência de eficácia de determinado tratamento à indicação para não

realizar tratamento
§ Biomarcador associado a eficácia de tratamento, mas aprovado para outro tipo cancro
§ Biomarcador encontrado sem terapêutica correspondente disponível

Embora o cancro apresente um biomarcador com tratamento disponível, a terapêutica pode não funcionar!

Características do doente podem afetar eficácia (ex.: farmacocinética - absorção, distribuição, metabolismo
e eliminação)

Nem todas as células cancerígenas têm os mesmos biomarcadores, logo o tratamento irá eliminar algumas
mas não todas

Biomarcadores num tumor podem ser dinâmicos (mudar com o tempo) à resultados de um teste feito no
passado podem não refletir os biomarcadores atuais

Matilde Monteiro 213

 Terapêuticas alvo no tratamento de cancro

Existem 2 grandes grupos de terapêuticas alvo:

• Pequenas moléculas – proteínas que conseguem entrar nas células, sendo usadas para alvos
celulares;
• Anticorpos monoclonais - proteínas relativamente grandes e geralmente não conseguem entrar
nas células, sendo usadas para alvos fora ou na superfície celular.

Matilde Monteiro 214

Matilde Monteiro 215