Carl A.

Burtis

Edward R. Ashwood

David E. Bruns

FUNDAMENTOS
DE QUÍMICA CLÍNICA

TRADUÇÃO DA 6° EDIÇÃO
S U M Á R I O

PARTE I. PRINCÍPIOS LABORATORIAIS, 1 5. Eletroquímica e Sensores Químicos, 87

Paul D'Orazio, P h . D . e Mark E. Meyerhoff, Ph.D.
1. Introdução à Química Clínica e Potenciometria, 88
Voltametria/Amperometria, 94
Medicina Laboratorial Baseada em Conductometria, 97
Evidências, 1 Coulometria, 98
Christopher P. Price, Ph.D., F.R.C. Path., Patrick M.M. Sensores Químicos Ópticos, 98
Bossuyt, Ph.D. e David E. Bruns, M.D. Biossensores, 99
Conceitos, Definições e Relações, 2
Medicina Baseada em Evidências - O que E?, 2 6. Eletroforese, 105
Medicina Baseada em Evidências e Medicina Raymond E. Karcher, P h . D . e James P. Landers, Ph.D.
Laboratorial, 3 Conceitos Básicos e Definições, 105
Informações de Necessidades na Medicina Laboratorial Teoria de Eletroforese, 105
Baseada em Evidências, 4 Descrição da Técnica, 106
Relato de Estudos de Acurácia Diagnostica e o Papel da Tipos de Eletroforese, 109
Iniciativa STARD, 6 Considerações Técnicas, 113
Desfechos, 6
Revisões Sistemáticas dos Exames Diagnósticos, 9
Avaliações Econômicas dos Exames Diagnósticos, 11 7. Cromatografia, 115
Diretrizes da Prática Clínica, 13 M. David Ullman, P h . D . e Carl A. Burtis, Ph.D.
Auditoria Clínica, 16 Conceitos Básicos, 115
Aplicação dos Princípios da Medicina Laboratorial Mecanismos dc Separação; 117
Baseada em Evidências na Prática Rotina, 17 Resolução, 119
Cromatografia Planar, 120
Cromatografia em Coluna, 120
2. Introdução aos Princípios da Análise e Análises Qualitativas e Quantitativas, 129
Segurança Laboratorial, 19
Edward W. Bermes, Jr., Ph.D., Stephen E. Kahn, P h . 8. Espectrometria de Massas, 131
D., D.A.B.C.C., F.A.C.B. e Donald S. Young, M.B.,
Thomas M. Annesley, Ph.D., Alan L. Rockwood,
Ch.B., Ph.D. Ph.D. e Nicholas E. Sherman, Ph.D.
Conceito de Soluto e Solvente, 20
Conceitos Básicos e Definições, 131
Unidades de Medida, 21
Instrumentos, 133
Compostos Químicos e Materiais de Referência, 22
Aplicações Clínicas, 139
Procedimentos e Técnicas Básicos, 24
Segurança, 34 9. Princípios da Enzimologia Clínica, 143
Renze Bais, Ph.D., A.RC.P.A. e Mauro Panteghiní, M.D.
3. Coleta de Amostras e Outras Variáveis Princípios Básicos, 144
Pré-Analíticas, 43 Cinética Enzimática, 147
Donald S. Young, M.B., Ch-B-, Ph.D., Edward W. Enzimologia Analítica, 152
Bermes, Jr., P h . D e Dóris M. Harverstick, Ph.D.
Coleta de Amostra, 43 10. Princípios das Técnicas
Manipulação de Amostras para Análise, 52
Outras Variáveis Pré-Analíticas, 53
Imunoquímicas, 159
L. J. Kricka, D.Phil-, F.A.C.B., C.Chem., F.R.S.C.,
Variabilidade Biológica Normal, 62
F.R.C.Path.
Conceitos Básicos e Definições, 159
PARTE II. INSTRUMENTAÇÃO E TÉCNICAS Interação Antígeno-Anticorpo, 161
ANALÍTICAS
Métodos Qualitativos, 162
Métodos Quantitativos, 165
4. Técnicas Ópticas, 65 Outras Técnicas Imunoquímicas, 174
L.J. Kricka, D. Phil., F.A.C.B., C.Chem., F.R.S.C., F.
R.C.Path. e Jason Y. Park, M.D., Ph.D.
11. Automação em Laboratório de Análises
Fotometria e Espectrometria, 66
Instrumentação, 68 Clínicas, 175
Fotometria de Reflexão, 73 James C. Boyd, M.D. e Charles D. Hawlter, Ph.D., M.
Espectrofotometria de Emissão de Chama, 73 B.Â., F.A.C.B.
Espectrometria de Absorção de Atômica, 73 Conceitos Básicos, 176
Fluorimetria, 74 Automação do Processo Analítico, 176
Fosforimetria, 81 Automação Integrada para o Laboratório Clínico, 184
Luminometria, 81 Considerações Práticas, 189
Nefelometria e Turbidimetria, 82 Outras Áreas de Automação, 190
xviii SUMÁRIO

12. Testagem Laboratorial Remota, 193 Enzimas de Ácidos Nucléicos, 281

Christopher P.Price, Ph.D., F.R.C.Path. e Andrew St. Técnicas de Amplificação, 282
John. Ph.D-, M.A.A.C.B. Técnicas de Detecção, 285
Considerações Analíticas e Tecnológicas; 194 Técnicas de Discriminação, 286
Considerações sobre Implementação e Gerenciamento, Resumo, 293
200
• 18. Aminoácidos e Proteínas, 295
PARTE III. OPERAÇÕES LABORATORIAIS A. Myron Johnson, M.D.
Aminoácidos, 295
13. Seleção e Avaliação Analítica de Métodos Proteínas Plasmáticas, 303
Análise de Proteínas, 319
- Com Técnicas Estatísticas, 205
Kristian Linnet, M.D., D.M.Sc, e James C. Boyd, M.D.
Seleção do Método, 206 ' 19. Enzimas, 327
Estatística Básica, 207 Mauro Panteghini, M.D. e R e m e Bais, Ph.D., A.R.C.P.A,
Conceitos Básicos Relacionados com Métodos Conceitos Básicos, 327
Analíticos, 210 Enzimas Musculares, 328
Metas Analíticas, 215 Enzimas Hepáticas, 332
Comparação de Métodos, 216 Enzimas Pancreáticas, 340
Acompanhamento de Resultados Seriados, 229 Outras Enzimas Clinicamente Importantes, 344
Rastreabilidade e Medição de Incerteza, 229
Orientações, Exigências Reguladoras e Licenciamento, 231 20. Marcadores Tumoraisf 347
Pacotes de Programas de Computadores, 232 Daniel W. Chan, Ph.D., D.A.B.C.C., F.A.C.B.,
Ronald A. Booth, Ph.D., F.C.A.C.B., e Eleftherios
14. Estabelecimento e Uso de Valores de P. Diamandís, M.D., Ph.D., F.R.C.P.(C.)
Câncer, 348
Referência, 233 Passado, Presente e Futuro dos Marcadores Tu morais, 348
Helge Erik Solberg, M.D., P h D .
Aplicações Clínicas, 349
Estabelecimento de Valores de Referência, 233
Avaliação da Utilidade Clínica, 349
Uso de Valores de Referência, 239
Orientações Clínicas, 352
Metodologia Analítica, 352
15. Informática no Laboratório de Análises Enzimas, 354
Clínicas, 243 Hormônios, 359
Brian R. Jackson, M.D., M.S. e James H. Harrison, Jr., Antígenos oncofetais, 360
M.D., P h . D . Citoceratinas, 362
Fundamentos da Computação, 244 Marcadores de carboidrato, 363
Sistemas de Informação Laboratorial, 248 Antígenos de Grupos Sanguíneos, 365
Segurança do Sistema de Informação, 251 Proteínas, 366
Receptores e Outros Marcadores Tumor ais, 367
Marcadores Genéticos, 368
16. Gestão da Qualidade, 255 Diferentes Marcadores, 372
George G. Klee, M.O., P h D . e James O. Westgard, Ph.D.
Fundamentos da Gestão da Qualidade Total, 256
Implementando a TQM, 257
' 21. Creatinina, Uréia e Ácido Úrico, 373
E d m u n d ]. Lamb Ph.D., F.R.C.Path. e Christopher P.
Processo de Teste Completo, 258
Price, P h . D , F.R.C.Path.
Controle das Variáveis Pré-Analíticas, 258
Creatinina, 373
Controle das Variáveis Analíticas, 259
Uréia, 376
Avaliação da Qualidade Externa e Programas de Testes
Ácido Úrico, 378
de Proficiência, 264
Movas Iniciativas de Qualidade, 266
- 22. Carboidratos, 383
PARTE IV. ANALITOS David B. Sacks M.B, Ch.B., F.R.C.Path.
Química, 384
Bioquímica e Fisiologia, 386
17. Ácidos Nucléicos, 271 Significância Clínica, 390
Yuk Ming Dennis Lo, M.A. (Cantab), D.M. (Oxon), Metodologia Analítica, 399
D.Phil. (Oxon), F.R.C.P. (Edin), M.R.C.P. (Lond),
F.R.C.Path., Rossa W.K. Chiu, M.B.B.S., Ph.D.,
F.H.K.A.M. (Patologia), F.R.C.P.A., Noriki * 23. Lipídios, Lipoproteínas,
Kusukawa, P h . D . e Carl T. Wittwer, M.D., Ph.D. Apolipoproteínas e Outros Fatores de
Essencial, 273
Estrutura e Organização dos Ácidos Nucléicos, 274
Risco Cardiovascular\ 413
Nader Rifai, Ph.D., G. Russel Warnick, M.S., M.B.A.
Fisiologia e Regulação Funcional do Acido Nucléico, 277
e Alan T. Remaley, M.D., Ph.D.
Variação de Seqüência dos Ácidos Nucléicos, 280
Lipídios Básicos, 414
 SUMÁRIO xix

Lipoproteínas, 422 Metodologia Analítica, 558

Apolipoproteínas, 424 Grupos Específicos de Drogas, 559
Metabolismo das Lipoproteínas, 424
Importância Clínica, 426 31. Toxicologia Clínica, 575
Análise de Lipídios, Lipoproteínas e Apolipoproteínas, 433 William H . Porter, Ph.D.
Outros Fatores de Risco Cardíaco, 438 Agentes que Causam Hipoxia Celular, 576
Álcoois, 578
24. Etetrólitos e G a s e s Sanguíneos, 443 Analgésicos (isentos de prescrição), 582
Mitchell G. Scott, Ph.D., Vicky A. LeGrys, D.A., Fármacos Anticolinérgicos, 585
M.T.<A.S.C.P.), C.L.S.ÍN.C.A.) e Drogas de Uso Abusivo, 587
J. Stacey Klutts, M.D., Ph.D. Etileno Glicol, 612
Hletrólitos, 444 Ferro, 613
Osmolalidade do Plasma e da Urina, 450 Inseticidas Organofosfarado e de Carbamato, 614
Gases e pH, 452
32. Metais Tóxicos, 617
25. Hormônios, 463 Thomas P. Moyer, Ph.D., Mary F. Burritt, P h . D . e
Michael Kleerekoper, M.D., F.A.C.B., M.A.C.E. John A. Butz, III, B.A.
Classificação, 463 Conceitos Básicos, 617
Ação dos Hormônios, 464 Metais Específicos, 619
Receptores Hormonais, 467
Ações Hormonais Pós-receptor, 468 PARTE V. FISIOPATOLOGIA
Desordens Clínicas dos Hormônios, 469
Formas de Medida dos Hormônios e Analitos * 33. Doença Cardiovascular; 629
Relacionados, 471 Fred S. Apple, Ph.D. e Allan S. Jaffe, M.D.
Anatomia e Fisiologia do Coração, 630
26. Catecolaminas e Serotonina, 473 Doença Cardíaca, 630
Graeme Eisenhofer, Ph.D., Thomas G. Rosano, Ph.D., Bioquímica dos Biomarcadores Cardíacos, 634
D.A.B.F.T., D.A.B.C.C. e Testes e Intervalos de Referência para Proteínas de
Ronald J. Whitley, Ph.D., F.A.C.B., D.A.B.C.C Marcadores Cardíacos, 636
Química, Biossíntese, Liberação e Metabolismo, 474 Lógica Clínica Subjacente ao Uso de Marcadores de
Fisiologia dos Sistemas da Catecolaminérgicos e Dano Cardíaco, 639
Serotoninérgicos, 476 Observações Clínicas Gerais sobre Biomarcadores, 640
Aplicações Clinicas, 479 Marcadores de Lesão Cardíaca na Prática Clínica em
Metodologia Analítica, 483 Geral, 642

27. Vitaminas e Elementos-traço, 489 34. Função Renal e Doença, 647

Alan Shenkin, Ph.D., F.R.C.P., F.R.C.Path. e Malcom Michael P. Delaney, M.D., F.R.C.P,, Christopher P.
Baines, F.R.S.C., F.R.C.Path. Price, Ph.D, F.R.C.Path. e E d m u n d J. Lamh, P h .
Vitaminas, 489 D., F . R C . P a t h .
Elementos-traço, 409 Anatomia, 648
Função Renal, 650
28. Hemoglobina, Ferro e Bilirrubina, 523 Fisiologia do Rim, 652
Trefor Higgins, F.C.A.C.B., Ernest Beutler, M.D. e Fisiopatologia da Insuficiência Renal, 657
Basil T. Doumas, Ph.D. Doenças Renais, 660
Hemoglobina, 524 Terapia de Reposição Renal, 668
Ferro, 530
» Bilirrubina, 534 * 35. Fisiologia e Distúrbios da Água,
Eletróhto e Metabolismo Acido-base, 671
29. Porfirinas e Doenças Associadas ao J. Stacey Klutts, M.D., Ph.D. e Mitchell G. Scott,
Metabolismo das Porfirinas, 541 Ph.D.
Allan Deacon, B.S.C., Ph.D., F.R.C.Path., Sharon D. Agua Corporal total - Volume e Distribuição, 671
Whatley, P h . D . e George H . Élder, M.D. Eletrólitos, 673
Porfirina e Química do Heme, 541 Fisiologia Ácido-Base, 678
As Principais Doenças Associadas às Porfirinas, 545 Condições Associadas ao Status Ácido-Base Anormal e à
Anormalidades do Metabolismo de Porfirinas não Composição de Elerrólito Anormal do Sangue, 684
Causados pela Porfiria, 547
Diagnóstico Laboratorial de Porfirias, 548 36. Doenças do Fígado, 691
Métodos Analíticos, 550 D. Robert Dufour, M.D.
Anatomia do Fígado, 692
30. Drogas Terapêuticas, 553 Funções Bioquímicas do Fígado, 693
Thomas P. Moyer., P h . D . e Gwendolyn A. McMillin, Manifestações Clínicas de Doença Hepática, 696
Ph.D. Doenças Hepáticas, 700
Conceitos Básicos, 554 Estratégia Diagnostica, 710
XX SUMÁRIO
37. Doenças Gastrointestinais, 713
Peter G. Hill, Ph.D., F.R.C.Path.
Anatomia, 714
O Processo Digestivo, 715
Peptídeos Reguladores do Trato GI 13 , 715
Distúrbios e Doenças Estomacais, Intestinais e
Pancreáticas, 718
38. Doenças Ósseas, 729
David B. Endres, P h . D . e Robert K. Rude, M.D.
Visão Geral do Osso e dos Minerais, 730
Cálcio, 730
Fosfato, 736
Magnésio, 737
Hormônios Reguladores do Metabolismo Mineral, 739
Controle Integrado do Metaholismo Mineral, 746
Doenças Osteometabólicas, 747
Marcadores Bioquímicos do Turnover Ósseo, 749
39. Distúrbios Hipofisários, 753
Laurence M. Demers, Ph.D., D.A.B.C.C., F.A.C.B. e
Mary Lee Vance, M.D.
Regulação Hipotalâmica, 754
Hormônios da Adeno-hipófise, 755
Hormônios da Neuro-hipófise, 763
Avaliação da Reserva da Adeno-hipófise, 7Ó5
40. Distúrbios Adrenocorticais, 767
Laurence M. Demers, Ph.D., D.A.B.C.C., F.A.C.B.
Química Geral dos Esteróides, 767
Esteróides Adrenocorticais, 769
Regulação Hormonal - Eixo Hipotalâmico-Hipofisário-
Adrenocortical, 772
Metodologia Analítica, 773
Distúrbios do Córtex Adrenal, 774
Exame do Estado Funcional do Córtex Adrenal, 781
41. Doenças Tireoidianas, 785
Laurence M. Demers, Ph.D., D.A.B.C.C., F.A.C.B.
Hormônios Tireoidianos, 785
Metodologia Analítica, 788
Disfunção Tireoidiana, 793
Diagnóstico da Disfunção Tireoidiana, 797
42. Distúrbios Reprodutivos, 799
A n n M. Gronowski, Ph.D.
Biologia Reprodutiva Masculina, 799
Biologia Reprodutiva Feminina, 805
Infertilidade, 817
43. Distúrbios da Gravidez, 821
Edward R. Ashwood, M.D. e George ]. Knight, Ph.D.
Gravidez Humana, 821
Avaliação da Saúde Materna e Fetal, 825
Complicações da Gravidez, 826
Triagem Sérica Materna para Defeitos Fetais, 830
Testes Laboratoriais, 836
44. Triagem Neonatai, 845
Marzia Pasquali, Ph.D., F.A.C.M.G. e Barbara G.
Sawyer, Ph.D., M.T.(A.S.C.R), C.L.S.ÍN.C.A.), C.
L.Sp(M.B.)
Princípios Básicos, 845
Recomendações de Triagem, 846
Erros Inatos do Metabolismo, 846
Métodos de Triagem Neonatai, 852
Interpretação dos Resultados, 854
PARTE VI. INFORMAÇÕES DE REFERÊNCIA
45. Informações de Referências para
Laboratórios Clínicos, 857
William L. Roberts, M.D., Ph.D., Gwendolyn A.
McMillin, Ph.D., Carl A. Burtis, Ph.D. e David E.
Bruns, M.D.
Glossário, 895
índice Remissivo, 919
 PRINCÍPIOS LABORATORIAIS
C A P Í T U L O 1
Introdução à Química Clínica e
Medicina Laboratorial Baseada
em Evidências
Christopher P. Price, Ph.D., F.R.C. Path., Patrick M.M. Bossuyt, Ph.D.,
OBJETIVOS
1. Listar cinco razões para realização de um exame laboratorial.
2. Especificar os objetivos da prática da medicina baseada em
evidências e da medicina laboratorial baseada em evidências.
3. Listar e descrever as quatro perguntas diagnosticas abordadas pele
processo de tomada de decisões na medicina laboratorial.
4. Descrever os cinco objetivos principais envoividos nos estudos da
medicina laboratorial baseada em evidências.
5. Projetar um experimento que compare um exame de referência
com um teste-índice e avaliar os resultados para estudos
diagnósticos.
6. Comparar e contrastar a validação interna e externa com relação ao
estudo da acurácia diagnostica.
7. Discutir a iniciativa STARD, que inclui seus uses, componentes e
aplicação no laboratório clinico.
8. Explicar a necessidade de estudos de desfechos na prática clínica.
d. Projetar um experimento controlado randomizado, dados os sujeitos
e tratamentos ou intervenções; determinar que resultados devem
ser avaliados e como estes influenciarão na assistência à saúde.
10. Listar os cinco componentes de uma revisão sistemática de um
exame diagnóstico.
11. Definir c "custo" em relação à assistência de saúde e listar cinco
métodos para avaliação do impacto econômico de um exame
diagnóstico.
12. Especificar como as avaliações econômicas são percebidas pelos
diferentes grupos, incluindo pacientes, profissionais de laboratórios,
médicos, companhias de seguros e a sociedade.
13. Discutir a utilidade das diretrizes da prática clínica e das auditorias
clínicas.
14. Listar quatro componentes de uma auditoria clínica.
15. Discutir como os princípios da medicina laboratorial baseada em
evidências podem ser aplicados na prática laboratorial de rolina.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
Acurácia do Diagnóstico: A proximidade de concordância
entre os valores obtidos a partir de u m exame diagnóstico
(teste-índice) e aqueles de padrão de referência (padrão-
ouro) para u m a doença ou distúrbio específico; estes
resultados são expressos de inúmeras formas, incluindo
PARTE I
e David E. Bruns, M.D.
sensibilidade e especificidade, valores preditivos, razões de
probabilidade, odâs ratio diagnósticos e áreas sob curvas
ROC (receiver operaúng characieristic).
A u d i t o r i a Clínica: Revisão de histórias de casos de pacientes
em comparação com o padrão de melhor prática vigente;
usada como ferramenta para melborar a prática clínica.
Desfechos: Os resultados relacionados com qualidade ou
sobrevida dos pacientes; os exemplos incluem mortalidade,
estado funcional, qualidade de vida, bem-estar.
Diagnóstico Molecular: U m campo da medicina laboratorial
n o qual os princípios e técnicas de biologia molecular são
aplicados para o estudo da doença.
Diretrizes da Prática Clinica: Afirmações sistematicamente
desenvolvidas para auxiliar nas decisões do profissional e
do paciente sobre a assistência adequada para circunstâncias
clínicas específicas; no laboratório, elas incluem objetivos
para acurácia, precisão e tempo de execução dos exames.
Estudos dos Desfechos: Estudos realizados para determinar se
u m a intervenção médica (tal c o m o u m exame laboratorial
específico) melhorará o desfecho do paciente.
E x p e r i m e n t o C o n t r o l a d o R a n d o m i z a d o : U m estudo
experimental no qual os participantes do estudo são
randomicamente alocados em um grupo de intervenção
(tratamento) ou e m u m grupo alternativo de tratamento
(controle).
Medicina Baseada e m Evidências (EBM): O uso
consciencioso, criterioso e explícito das melhores evidências
na tomada de decisões sobre o cuidado dos pacientes
ind ividu almente.
Medicina Laboratorial Baseada e m Evidências: Aplicação de
princípios e técnicas da medicina baseada em evidências na
medicina laboratorial; o uso consciencioso, criterioso e
explícito de melhores evidências no uso de investigações da
medicina laboratorial para auxiliar na tomada de decisões
sobre o cuidado de pacientes individualmente.
P a d r ã o d e Referência: O melhor método disponível para
estabelecer a presença ou ausência da doença ou distúrbio-
alvo; este pode ser u m único exame ou uma combinação de
métodos e técnicas.
Revisão Sistemática: U m a revisão metodológica e abrangente
de todas as informações publicadas e não publicadas sobre
2 PARTE I Princípios Laboratoriais
u m assunto específica para responder uma pergunta clínica
precisamente definida.
STARDi D o inglês Standards foi Repoiting of Diagnostic Accu-
racy - Padrões paia Relato de Acurácia Diagnostica; u m piojeto
delineado para melhorar a qualidade dos relatos dos resulta-
dos dos estudos de acurácia diagnostica.
Teste-Indicej Nos estudos de acurácia diagnostica, o "novo" teste
ou o teste de interesse.
Validação: (na pesquisa) o grau até o qual u m exame ou estudo
mede o que ele se p r o p õ e a medit.
Validação Externa: O grau até o qual os resultados de u m estudo
p o d e m ser generalizados para a população como definido
pelos critérios de inclusão do estudo.
Validação I n t e r n a i O grau até o qual se pode confiar nos resul-
tados de u m estudo; para a amostra de pessoas que estão
sendo estudadas.
Viés: Erro sistemático na coleta ou na interpretação dos dados,
superestimado ou subestimado, ou outra forma de desvio dos
resultados ou das inferências a partiT da verdade. O viés p o d e
resultar de falhas sistemáticas na elaboração do estudo, na
mensuração, na coleta de dados ou análise ou na interpreta-
ção dos resultados.
E
ste capítulo introduz os princípios da medicina laborato-
rial. No começo do capítulo, consideramos o significado
do termo "medicina laboratorial" e as relações entre a
química clínica, a medicina laboratorial e a medicina laboratorial
baseada em evidências. O restante do capítulo concentra-se nos
principais conceitos da m e d i c i n a laboratorial baseada e m evi-
dências. Os principais assuntos do capítulo são:
• C o m o avaliar a acurácia do diagnóstico dos exames.
• C o m o usar os estudos de desfechos clínicos.
" Maneiras de avaliar o valor econômico de exames clínicos.
• C o m o conduzir revisões sistemáticas de exames
diagnósticos.
• C o m o usar as diretrizes da prática clínica.
• Q u a n d o e c o m o conduzir uma auditoria clínica.
Estes princípios fornecem uma base para o uso racional e apro-
priado dos exames diagnósticos.
CONCEITOS, DEFINIÇÕES E RELAÇÕES
Nesta seção, a medicina laboratorial e a química clínica são defi-
nidas. As relações entre estas duas especialidades são discutidas,
O que É a Medicina Laboratorial?
O termo "medicina laboratorial" refere-se à disciplina envolvida
na seleção, provisão e interpretação do exame diagnóstico que
usa principalmente amostras de pacientes. O campo inclui a
pesquisa, administração e atividades de ensino e serviço clínico.
Os exames na medicina laboratorial p o d e m ser direcionados para
(1) confirmar uma suspeita clínica (que poderia incluir fazer o
diagnóstico), (2) excluir u m diagnóstico, (3) auxiliar na seleção,
otimização e monitoramento do tratamento, (4) fornecer u m prog-
nóstico ou (5) fazei a triagem para doença na ausência de sinais ou
sintomas clínicos. O exame também é usado para estabelecer e
monitorar a gravidade de u m distúrbio fisiológico.
O campo da medicina laboratorial inclui química clínica e diag-
nósticos moleculares e suas subdisciplinas tradicionais (incluindo
toxicologia e m o n i t o r a m e n t o medicamentoso, provas de função na medicina, mas nem sempre é compreendida.
endócrina e de órgãos e genética "bioquímica" e "molecular") e
áreas como microbiologia, hematologia, hemostasia e trombose,
banco de sangue (medicina de transfusão), imunologia e exame
de identidade. Em algumas partes do m u n d o , a medicina labo-
ratorial t a m b é m abrange citologia e anatomopatologia (histopa-
tologia). O s componentes analíticos destas especialidades são
distribuídos a partir de laboratórios centrais ou através de u m
tipo d e serviço mais distribuído [exames laboratoriais portáteis
(POCT, aqueles realizados fora da área técnica de u m laboratório,
em geral em local próximo do paciente)] ou ambos.
O manejo e a interpretação das informações (incluindo infor-
mática laboratorial) são aspectos essenciais do serviço de medi-
cina laboratorial) assim como o são as atividades relacionadas
com a m a n u t e n ç ã o da qualidade [p.ex., controle de qualidade e
teste d e proficiência, auditoria, aferição (benchmarking) e gestão
clínica (administração das organizações de saúde)].
Química Clínica e Medicina Laboratorial
A ligação entre química clínica (ou bioquímica clínica) e outras
áreas da medicina laboratorial tem raízes profundas. Os indivíduos
que trabalham principalmente na área da química clínica têm
desenvolvido ferramentas e métodos que vêm se tornando parte
da estrutura da medicina laboratorial, Exemplos incluem a teoria
e prática dos intervalos de referência, o uso tanto do controle
(interno) de qualidade como o teste de proficiência, a introdução
de automação no laboratório clínico e conceitos de exame diag-
nóstico, que são discutidos nesta e em outras seções do livro.
As fronteiras entre as partes do laboratório clínico são indis-
tintas devido à ênfase crescente ao uso d e exames químicos e
"moleculares" em todas as áreas do lahoratórío. A relação entre
medicina laboratorial e química clínica desenvolveu-se ainda
mais c o m o advento do laboratório "central". Estes laboratórios,
responsáveis pelo alto volume de exames, incluindo os de emer-
gência, sem muitos hospitais, d e p e n d e m de automação, informá-
tica, computadores, controle de qualidade e administração da
qualidade. Os especialistas em química clínica, que há muito
tempo trabalham nestas áreas, têm assumido u m a u m e n t o de
responsabilidade nos laboratórios centrais e p o r t a n t o tornaram-
se mais envolvidos nas áreas como hematologia, coagulação, uri-
nálise, e mesmo microbiologia.
Química Clínica, Medicina Laboratorial e
Medicina Laboratorial Baseada em Evidências
Neste capítulo, revisamos as novas influências na química clinica
e medicina laboratorial a partir dos campos da epidemiologia
clínica e da medicina baseada e m evidências (EBM). Epidemio-
logistas clínicos têm desenvolvido projetos de estudo para quan-
tificar a acurácia do diagnóstico dos exames desenvolvidos em
medicina laboratorial e os métodos de estudo para avaliar o efeito
e valor do exame laboratorial na assistência à saúde. Os profis-
sionais de EBM priorizam o uso da melhor evidência disponível
a partir dos estudos bem projetados no cuidado dos pacientes
individualmente. A EBM reformula problemas no cuidado clí-
nico dos pacientes em perguntas clínicas estruturadas, procura
evidências disponíveis, avalia a qualidade dos estudos clínicos,
avalia as implicações clínicas dos resultados e fornece ferramentas
para ajudar os médicos a usar de maneira ideal aqueles resultados
no cuidado dos pacientes individualmente.
MEDICINA BASEADA EM EVIDÊNCIAS -
O QUEÉ?
Desde q u e o termo medicina baseada em evidências foi introdu-
zido em 1991, a EBM tem exercido uma influência importante
Definição e Objetivos da Medicina Baseada
em Evidências
Dentre as definições propostas para EBM, provavelmente a prin-
cipal é "uso consciencioso, criterioso e explícito da melhor evidência n a
tomada de decisões sobre o cuidado individual dos pacientes."21 A palavra
T
 Introdução à Química Clínica e Medicina Laboratorial Baseada em Evidências
criterioso significa o uso de habilidades de médicos experientes em
colocar as evidências em u m contexto e em reconhecei a indivi-
dualidade e as preferências do paciente. U m dos objetivos da EBM
é "incorporar as melhores evidências da pesquisa clínica às decisões clíni-
cas."11 A palavra melhores significa a necessidade de avaliação
crítica. As palavras tomar decisões indicam porque os princípios da
EBM podem, e devem, ser aplicados na medicina laboratorial,
pois a medicina laboratorial é uma das ferramentas essenciais
usadas na tomada de decisões na prática da medicina.
As justificativas para u m a abordagem baseada em evidências
para a medicina estão f u n d a m e n t a d a s na constante exigência de
informações, na adição constante de novas informações, na qua-
lidade precária do acesso a boas informações, n o declínio do
conhecimento atualizado e / o u experiência com o passar dos anos
de uma prática médica individual, no tempo limitado disponível
para consultar a literatura, e na variabilidade dos valores e prefe-
rências individuais dos pacientes. A estas se p o d e m adicionar,
especificamente em relação à medicina lahoratorial, (!) o n ú m e r o
limitado e a qualidade precária dos estudos que ligam os resulta-
dos dos exames aos benefícios aos pacientes, (2) a avaliação pre-
cária do valor dos exames diagnósticos, (3) a d e m a n d a sempre
crescente d e exames e (4) a abordagem incoerente à alocação de
recursos (reembolso) na medicina laboratorial, o "orçamento
departamentaliiado (siío budgeting)", que aborda apenas os custos
do laboratório sem considerar os benefícios fora dele. O orça-
mento departamentalizado força decisões paia economizar des-
pesas no laboratório com atenção insuficiente para as
necessidades dos pacientes, seus cuidadores e seus pagadores.
A Prática da Medicina Baseada em Evidências
Guyatt e colaboradores 1 1 resumiram a prática da EBM como se
segue: " U m profissional que se baseia em evidências tem de
compreender as circunstâncias ou a situação aflitiva do paciente,
identificar as lacunas de conhecimento e formular perguntas que
preencham estas lacunas, conduzir uma pesquisa literária efi-
ciente, avaliar criticamente as evidências da pesquisa e aplicar
esta evidência no cuidado do paciente."
A prática eficiente da EBM requer:
• C o n h e c i m e n t o do processo clínico e conversão de u m
objetivo clínico em pergunta que possa ser respondida;
• Facilidade para originar e avaliai criticamente as
informações para gerar conhecimento;
• U m recurso do conhecimento criticamente avaliado;
• Capacidade para usar o recurso do conhecimento;
• U m meio de acessar e distribuir o recurso do
conhecimento;
• U m a estrutura de responsabilidade clínica e econômica
de prestação de contas;
• U m a estrutura de administração da qualidade.
MEDICINA BASEADA EM EVIDÊNCIAS
E MEDICINA LABORATORIAL
Os serviços da medicina laboratorial são ferramentas importan-
tes à disposição dos médicos para responder perguntas diagnos-
ticas e para ajudar a tomar decisões.
As ferramentas fornecidas pela medicina laboratorial são cha-
madas exames diagnósticos, mas os exames são usados muito mais
a m p l a m e n t e do que para fazer u m diagnóstico. C o m o mencio-
n a d o anteriormente e discutido adiante, eles também são usados
para fazer u m prognóstico, excluir u m diagnóstico, monitorar u m
tratamento ou processo de doença e fazei a triagem para a doença.
Assim, a palavra "diagnóstico" é usada (freqüentemente involun-
tariamente) em um sentido muito mais amplo, e u m exemplo
diário disso seria uma previsão do tempo.
CAPÍTULO 1 3
O que É a Medicina Laboratorial Baseada em
Evidências?
A medicina laboratorial baseada em evidências é simplesmente a
aplicação de princípios e técnicas de EBM na medicina laborato-
rial. U m médico que pede uma investigação tem uma pergunta e
tem que tomar uma decisão. O médico espera que o resultado do
exame ajude a responder a pergunta e auxilie na tomada de
decisão. Assim, uma definição da medicina baseada em evidências
poderia ser "a uso consciencioso, criterioso e explícito das melhores evi-
dências nas investigações da medicina laboratorial para ajudar na tomada
de decisão sobre o cuidado de pacientes individualmente." Também
poderia ser expressa mais diretamente em termos dos desfechos
de saúde como a "garantia de que a melhor evidência do exame seja
disponibilizada e que o médico seja auxihada em seu uso, para assegurar
que sejam tomadas as melhores decisões sobre o cuidado dos pacientes
individualmente, e que elas levem a um aumento da probabilidade dos
desfechos de saúde melhorados." C o m o discutido adiante, os desfe-
chos podem ser clínicos, operacionais e / o u econômicos.
Tipos de Perguntas Diagnosticas Abordadas
na Medicina Laboratorial
O processo de tomada de decisão envolve u m dos quatro cenários
tipificados p o r estas perguntas (Figura 1-1):
• Q u a l é o diagnóstico?
" O u t r o diagnóstico pode ser descartado?
• Qual é o prognóstico deste paciente?
• Qual é a condição do paciente?
Na primeira situação, procura-se um diagnóstico. As conclusões
diagnosticas levam a uma decisão e alguma forma de ação, que fre-
qüentemente envolve uma intervenção projetada para melhorar os
desfechos. Assim, quando u m exame do paracetamol revela uma
concentração perigosamente alta do fármaco, a administração de
N-acetilcisteina reduzirá o TÍSCO de u m desfecho fatal. A mensuraçao
do paracetamol neste cenário é chamada de "exame para inclusão".
Na segunda situação, o resultado do exame exclui u m diag-
nóstico; este é chamado de "exame para exclusão". Por exemplo,
q u a n d o u m paciente é admitido com dor torácica e há suspeita
de infarto agudo do miocárdio, o achado de que a t r o p o n i n a
cardíaca é indetectável no plasma pode ser usado para descartar
a necrose miocárdica aguda.
Pergunta clínica
Resultado do
exame diagnóstico
Prognóstico
A
I
Decisão
/
I
A
I
\ Diagnóstico
descartado
I
Monitoramento Diagnóstico
A
Repetir
intervenção
pergunta
F i g u r a 1 -1 Representação esquemática de quatro etapas comuns da
tomada de decisão, nas quais o resultado de uma investigação esteja envolvido.
4 PARTE I Princípios Laboratoriais
O terceiro uso da investigação é para o prognóstico, que pode
ser considerado a avaliação de risco e complementa a aplicação
d o diagnóstico. Por exemplo, a mensuração da concentração de
R N A do vírus da imunodeficiência h u m a n a (HIV) n o plasma
após o diagnósdco inicial de infecção por H I V pode ser usada
para prever o intervalo de tempo antes d o colapso imune se o
distúrbio não for tratado.
O quarto uso amplo de u m Tesultado de exame está relacio-
n a d o com o tratamento d o paciente. O resultado do exame de
u m paciente com u m a doença crônica pode ser usado para sele-
cionar o tipo de intervenção e avaliar a efetividade de u m a
intervenção. Por exemplo, em u m a pessoa com diabetes, as men-
surações de hemoglobina (Hb) A ] c são usadas paTa avaliar o con-
trole glicêmico e, assim, a efetividade da terapia. Se a HbA ] c foi
alta, deve-se considerar a mudança do tratamento. Se a HbAi c não
estiver elevada, o tratamento vigente deve ser mantido.
Em cada u m destes exemplos, três componentes estão presen-
tes: u m a pergunta, uma decisão e u m a ação. Identificar estes três
componentes é crucial para o planejamento de estudos de utili-
dade ou desfechos d o exame (ver adiante neste capítulo). Estes
componentes t a m b é m são importantes na auditoria (veT adiante)
sobre o uso de investigações dos pontos de vista t a n t o da gestão
clínica como da financeira. O reconhecimento desta tríade levou
à definição de u m pedido de exame adequado como aquele n o qual
há uma pergunta clínica para a qual o resultado fornecerá u m a
resposta, possibilitando ao médico t o m a i u m a decisão e iniciar
alguma forma de ação que leve a um benefício de saúde para o
paciente. Este benefício poderia ser estendido ao profissional de
saúde e para a sociedade como u m todo para abranger mais
diretamente o potencial para beneficio econômico.
Exemplos de perguntas que especifiquem o detalhe necessá-
rio para qualificar de maneira precisa o uso de u m resultado de
exame são apresentados na Tabela 1-1. Os critérios para introdu-
ção de u m exame de triagem foram estabelecidos p a n muitos
anos; ressalta-se que um dos critérios principais é a existência de
u m tratamento válido disponível.
Usando o Resultado do Exame
O critério principal para u m exame útil é que o resultado pode
levar a u m a m u d a n ç a na probabilidade da presença do distúrbio-
alvo. A m u d a n ç a na probabilidade em si não é fator decisivo. O
médico tem que usar esta informação, j u n t a m e n t e com outros
achados e o julgamento clínico, para tomar decisões ou fazer
recomendações sobre o cuidado.
Apenas os Resultados de Exames Não
Produzem Desfechos Clínicos
Na maioria dos casos, o exame deve ser seguido de u m a inter-
venção apropriada para produzir u m desfecho desejado. U m
resultado de exame sozinho p o d e fornecer tranquilização ou a
compreensão da origem de u m a queixa, mas mesmo isto pode
exigir explicações e tranquiliiação por parte d o médico. Devido
à dificuldade de se d o c u m e n t a r que aquele exame melhora os
desfechos do paciente, a maioria das pesquisas na medicina labo-
ratorial aborda apenas as características analíticas e o desempe-
n h o diagnóstico dos exames, e não os efeitos dos exames nas
vidas dos pacientes. Esta pesquisa restrita leva a u m a compreen-
são e avaliação precárias da contribuição dada pelo resultado do
exame para melhores desfechos. Por exemplo, um estudo rando-
miiado de u m protocolo rápido de avaliação de dor torácica que
mostra que os resultados normais para marcadores cardíacos
descartaram o infarto do miocárdio não aborda a questão de se
o exame leva a menos admissões na unidade de cuidados coro-
narianos, com redução da morbidade e mortalidade.
NECESSIDADES DE INFORMAÇÕES NA
MEDICINA BASEADA EM EVIDENCIAS
Estudos no campo da medicina laboratorial baseada em evi-
dências têm cinco objetivos principais:
1. Caracterização da acurácia diagnostica dos exames pelo
estudo de grupos de pacientes
2. Determinação d o valor d o exame {desfechos) para os
indivíduos testados
3. Reuisão sistemática dos estudos de acurácia diagnostica ou
desfechos dos exames para responder u m a pergunta clínica
específica
4. Avaliação econômica dos exames para determinar quais
exames usar
5. Auditoria d o d e s e m p e n h o n o decorrer dos exames para
responder questões sobre seu uso.
As seções seguintes deste capítulo fornecem breves introdu-
ções aos princípios de como obter estes importantes tipos de
informações que são necessárias para o cuidado d o paciente.
CARACTERIZAÇÃO DA ACURÁCIA
DIAGNÓSTICA DOS EXAMES
Q u a n d o u m novo exame é desenvolvido ou u m exame antigo é
aplicado para u m a nova pergunta clínica, os usuários precisam
de informações sobre a extensão da concordância dos resultados
do exame com o diagnóstico correto dos pacientes. C h a m a m o s
estes estudos de estudos de acurácia diagnostica.
Planejamento do Estudo
Nos estudos de acurácia diagnostica, os resultados de u m exame
(freqüentemente chamado de teste-índice, o exame de interesse)
são comparados com aqueles do padrão de referência (a melhor
prática vigente para se chegaT a u m diagnóstico). U m padrão de
referência pode ser qualquer método para obtenção de informa-
ções adicionais sobre o estado de saúde de u m paciente. Isto
inclui não apenas os exames laboratoriais, exames de imagens e
provas de função, mas t a m b é m dados da anamnese e d o exame
físico e os dados genéticos.
O padrão de referência é o melhor método disponível para
estabelecer a presença ou ausência d o distúrbio-alvo (a condição
ou doença suspeita para a qual o exame tem que ser aplicado).
O padrão de referência pode ser um exame único ou u m a com-
binação de métodos e técnicas, incluindo o a c o m p a n h a m e n t o
clínico destes pacientes.
H á várias ameaças potenciais à validação i n t e r n a e externa
de u m estudo de acurácia diagnostica, d o qual apenas os princi-
pais serão abordados nesta seção. (Para mais detalhes e exemplos,
ver Capítulo 13.) A validação interna precária (problemas n o pla-
n e j a m e n t o do estudo) produzirá viés, ou erro sistemático, porque
as estimativas de acurácia diagnostica diferem daquelas que
seriam obtidas u s a n d o u m planejamento ideal para o estudo. A
vahdação externa precária limita a capacidade de generalizar os
achados porque os resultados d o estudo, mesmo que sem vieses,
não correspondem às situações encontradas por aquele que toma
a decisão. Por exemplo, estudos realizados exclusivamente nos
h o m e n s idosos p o d e m não ser aplicáveis em mulheres em idade
reprodutiva avaliadas por u m obstetra, que poderia querer usar
os resultados deste estudo.
O estudo ideal examina u m a série consecutiva de pacientes,
inscrevendo todos os pacientes, com consentimento, sob suspeita
de apresentar u m distúrbio alvo em u m periodo específico. Todos
estes pacientes submetem-se ao teste-índice e são então avaliados
pelo padrão de referência. O termo "consecutivo" refere-se à
ausência total de qualquer forma de seleção, fora a definição
(determinada n o início d o estudo) dos critérios para inclusão
 Introdução à Química Clínica e Medicina Laboratorial Baseada em Evidências CAPÍTULO 1 5

TABELA 1-1 E x e m p l o s d e P e r g u n t a s Clínicas nas quais u m a Avaliacao L a b o r a t o r i a l P o d e Ser d e Valor, Ação Associada
e D e s f e c h o P o t e n c i a l (Benefício)
k. '
Exame Pergunta Resultado Possível Ação Potencial Desfecho

INCLUIR
BNP Este paciente com falta de 450 ng/L Confirmar com ultra-sonografia Redução dos sintomasj redução
ar sofre de insuficiência cardíaca, decidir internar e tratar da morbidade e mortalidade
cardíaca?
cTnl Este paciente teve infarto 7,2 (íg/L Decidir se interna e a intensidade Redução da morbidade e
do miocárdio? necessária de tratamento, e tratar mortalidade
TSH Esta criança lem 12,2 mU/L Tratar com tiroxina Redução da morbidade e
hipotirecidismo? mortalidade
LE da urina Este paciente tem infecção LE positivo, nitrito Enviar urina para laboratório Uso apropriado de antibióticas,
e nitrito do trato urinário? positivo, ou ambos para microscopia, cultura e redução da morbidade
sensibilidade e tratar se positivo

DESCARTAR
BNP Este paciente cam falta 56 ng/L Procurar diagnóstico alternativo Evitar diagnóstico e tratamento
de ar sofre de insuficiência incorretos com potencial
cardíaca ? risco
cTnl Este paciente teve infarto <0,1 ug/L Considerar outros passíveis Menos preocupação para o
do miocárdio? diagnósticos e alta precoce paciente, reduzir internações
desnecessárias na unidade
de cuidados cardíacos
TSH 0 paciente tem 2,1 mU/L Nenhuma outra ação Tranqüilizaçãü sobre qualquer
tiipotireoidismo? preocupação do paciente
LE da urina Este paciente tem infecção Resultado normal Não enviar urina para laboratório, Evitam-se antibioticolerapia
e nitritc do trato urinário? do dipstick procurar causa alternativa dos inadequada e trabalha
sintomas laboratorial desnecessário

MO NITOH AMENTO
BNP 0 paciente está tomando Menhuma alteração Revisar dosagem e adesão do Nenhuma alteração dos
a dosagem correta do paciente sintomas, riscc de evento
p-bloqueador? cardíaco, mais consultas
BNP 0 paciente está tomando Queda de 216 para Nenhuma alteração na dosagem, Redução dos sintomas e do
a dosagem correta 160 ng/L incentivar paciente risco de evento cardíaco
do (3-bloqueador?
HbA1c 0 paciente está aderindo 10,6% (nenhuma Considerar alteração do HbA lc persistentemente alto
ac protocolo de alteração em tratamento, monitoramento implica aumento de risco de
tratamento? um ano) rigoroso da adesão, consultas complicações; intervenção
com enfermeiro para auxílio necessária para reduzir risco
no cuidado dc diabetes
HbA,c 0 paciente está aderindo 5,8% Parabenizar paciente, manter Risco reduzido de
ao protocolo de tratamento? esquema de tratamento complicações

PROGNÓSTICO
BNP A insuficiência cardiaca Aumenta de 450 para Ajustar terapia, talvez aconselhar Prognóstico ruim
do paciente está 650 ng/L no último sobre cuidados paliativos
deteriorando? ano
cTnl Qual o risco de um 0,9 |ug/L Considerar intervenção Aumente do risco sem
evento cardíaco posterior intervenção
para este paciente?
Her-2/neu Qual o prognóstico do 3 + por coloração Considerar tratamento ccm Melhora de prognóstico
paciente? imunoistoquimica Herceptina precário pela seleção de
no diagnóstico primário terapia apropriada

BNP, peptideo rmcnurenco tifo B; cTnl, tropanina cardíaca I; TSH, fiormdnio eilimuLuite da tireóide; LE, esterasí leucocitâna.

(e exclusão) no estudo, e requer esforços explícitos para identifi-
cai e inscrever pacientes que se qualificam para a inclusão.
Projetos alternativos são possíveis. Alguns estudos selecionam
primeiro os pacientes que sabidamente apresentam o distÚTbío-alvo
e então contrastam os resultados destes pacientes com aqueles de
u m grupo-controle. Esta abordagem tem sido usada para caracterizar
o desempenho dos exames em situações nas quais o distúrbio de
interesse é incomum, como nos exames de triagem do soro materno
para detectar síndrome de Down no feto. Também é usada nos
estudos preliminares para avaliar o potencial de u m exame antes de
embarcar em estudos prospectivos de uma série de pacientes. C o m
este projeto, a seleção do grupo-controle é crucial. Se o grupocon-
6 PARTE I Princípios Laboratoriais
tTole consiste em indivíduos sadios apenas, a acurácia diagnostica do
exame tenderá a ser superestimada. O grupo-controle deve incluir
pacientes nos quais a doença é suspeita, mas é excluída.16
N o estudo ideal, os resultados de todos os pacientes subme-
tidos ao exame sob avaliação são contrastados com os resultados
de um Único padrão de referência. Se o padrão de referência não
for aplicado em todos os pacientes, então existe uma verificação
parcial. Em u m caso típico, alguns pacientes com resultados de
exames negativos (negativos para o exame) não são verificados
por u m padrão de referência caro o u invasivo e estes pacientes
são excluídos da análise. Isto p o d e resultaT em u m a subestimação
do n ú m e r o de resultados falso-negativos.
Pode ocorrer u m a forma diferente de viés de verificação se
mais de u m padrão de referência for usado e se os dois padrões
de referência correspondem a diferentes manifestações da doença.
Este projeto de estudo pode produzir uiás de verificação diferencial,
s u p o n d o que os diagnósticos dos pacientes com exame positivo
são verificados por meio do uso de exames adicionais, mas os
diagnósticos dos pacientes com exame negativo são verificados por
a c o m p a n h a m e n t o clínico. U m exemplo é a verificação de suspeita
de apendicite, com histopatologia do apêndice versus acompanha-
m e n t o como os dois padrões de referência. U m paciente é classi-
ficado como tendo u m resultado de exame falso-positivo se o
exame adicional n ã o confirmar a presença de doença após u m
resultado de teste-índice positivo. Alternativamente, u m paciente
é classificado com exame falso-negativo se um evento compatível
com apendicite for observado durante o a c o m p a n h a m e n t o após
u m resultado de exame negativo. Entretanto, estas são definições
diferentes da doença, p o r q u e n e m todos os pacientes que apre-
sentam resultados de exame positivos por meio do padrão de
referência passariam por u m evento durante o a c o m p a n h a m e n t o
se não fossem tratados. O uso de dois padrões de referência, u m
patológico e outro baseado n o prognóstico clínico, p o d e afetar a
avaliação da acurácia diagnostica. Isso t a m b é m p o d e levar a u m a
variabilidade entre os estudos q u a n d o estes diferem nas propor-
ções dos pacientes verificados com cada um dos dois padrões.
As informações clínicas devem ser fornecidas para os que
estão realizando ou fazendo a leitura d o teste-índice para o estudo
de sua acurácia diagnostica? Por exemplo, o radiologista que vai
fa^er a leitura d o novo tipo de imagem de raio X deve saber os
resultados dos exames anteriores do paciente? A retenção destas
informações é conhecida c o m o mascaramento. Algumas informa-
ções clínicas são rotineiramente conhecidas pelo leitor do exame,
c o m o q u a n d o u m patologista fica sabendo de o n d e a amostra
para biópsia foi retirada. A tentativa de reter estas informações
n o contexto de u m estudo de acurácia diagnostica pode criar u m
cenário artificial q u e não tem contrapartida n o cuidado d o
paciente. Para a maioria das perguntas do estudo, c o n t u d o , o
mascaramento é preferível p o r q u e o c o n h e c i m e n t o dos resulta-
dos tenderá a a u m e n t a r a concordância entre o resultado d o
exame (índice) estudado e o (exame) padrão de referência.
A gravidade da doença nos pacientes estudados com o distúr-
bio-alvo e a gama de outros distúrbios nos outros pacientes (con-
troles) p o d e m afetar a aparente acurácia diagnostica de u m
exame. Por exemplo, se u m exame projetado para detectar câncer
precoce for avaliado em pacientes com câncer clinicamente apa-
rente, é provável que o exame tenha u m melhor d e s e m p e n h o do
que q u a n d o usado para pessoas que ainda n ã o apresentam sinais
d o distúrbio. Este problema t e m sido c h a m a d o de "uiés de espec-
tro". D e maneira semelhante, se u m exame é desenvolvido para
distinguir paciences com u m distúrbio-alvo dos pacientes com u m
distúrbio semelhante, p o d e ser enganoso usar sujeitos sadios
c o m o controles, e n ã o pacientes com sintomas semelhantes, na
avaliação da acurácia diagnostica do exame.
Relato de Estudos de Acurácia Diagnóstica e
o Papel da Iniciativa STARD
O relato completo e preciso dos estudos de acurácia diagnóstica
deve possibilitar ao responsável pela leitura d o escame detectar o
potencial para viés no estudo e avaliar a capacidade de generalizar
os resultados e sua aplicabilidade em u m paciente isoladamente
ou no grupo. Reid, Lachs e Feinstein 2 0 d o c u m e n t a r a m que a
maioria dos estudos de acurácia diagnostica publicados nos prin-
cipais periódicos médicos gerais tinha adesão precária aos padrões
da pesquisa epidemiológica clínica ou falhou e m fornecer infor-
mações sobre a adesão àqueles padrões. Este e outros relatos
fizeram com q u e o periódico Clinicai CfiemistT} e m 1997 se empe-
nhasse em produzir u m a lista de verificação para relatar os
estudos de acurácia diagnostica. A qualidade deste relato naquele
periódico a u m e n t o u após a introdução desta lista de verificação, 17
embora não em u m nivel ideal. e
E m 1999, Lijmer et al16 mostraram que o p l a n e j a m e n t o e o
relato precários do estudo estão associados a estimativas exagera-
das da acurácia diagnostica dos exames avaliados. Estes dados
reforçaram a necessidade de melhorar os relatos dos estudos de
acurácia diagnostica para todos os tipos de exames, n ã o apenas
aqueles na química clínica. U m a iniciativa relacionada c o m os
Padrões para Relato de Acurácia Diagnostica (STARD) foi ini-
ciada em 1999 e tinha c o m o objetivo melhoraT a qualidade dos
relatos dos estudos de acurácia diagnostica.
Os principais componentes do d o c u m e n t o 1 do STARD são
u m a lista de verificação dos itens a serem incluídos nos relatos
dos estudos de acUTácia diagnóstica e u m diagrama para documen-
tar o fluxo dos participantes n o estudo. Vale a pena ler e compre-
ender os 25 itens da lista de verificação (Figura 1-2). O fluxograma
(Figura 1-3) pode fornecer informações vitais sobre o planejamento
de um estudo - incluindo o método de recrutamento e a ordem de
execução do exame - e sobre o fluxo dos participantes.
O d o c u m e n t o S T A R D foi endossado por inúmeros periódi-
cos, incluindo todos os mais importantes de química clínica. U m
o u t r o d o c u m e n t o com explicações do significado e do funda-
m e n t o lógico de cada item e o resumo breve das evidências está
disponível 5 . O uso da iniciativa STARD é r e c o m e n d a d o para
todos os relatos de estudos de acurácia diagnostica. A maior parte,
se n ã o todo o c o n t e ú d o do STARD, aplica-se aos estudos de
exames usados para prognóstico, m o n i t o r a m e n t o ou tTiagem.
ESTUDOS DOS DESFECHOS
As intervenções clínicas e de saúde pública têm c o m o objetivo
m e l h o r a r o bem-estar dos pacientes, da população em geral ou
d e segmentos da população. Para as intervenções terapêuticas, os
pacientes estão interessados, por exemplo, n ã o apenas se u m
fármaco Teduz o colesterol sérico ou a pressão arterial (fatores de
risco), mas, mais importante, se ele reduz o risco de ataque car-
díaco, AVC e m o r t e cardiovascular. N o aspecto diagnóstico da
medicina, a maioria dos pacientes tem pouco interesse em saber
sua concentração séTÍca de colesterol, a m e n o s q u e o conheci-
m e n t o leve a ações que melhorem sua qualidade ou q u a n t i d a d e
de vida. As pessoas q u e r e m melhorar os desfechos.
O que São Estudos de Desfechos?
O s desfechos p o d e m ser definidos c o m o resultados de interven-
ções clínicas em termos de saúde ou custo. "Desfechos do
paciente" são resultados q u e são perceptíveis para o paciente. 2 Os
desfechos que foram estudados c o m u m e n t e incluem mortali-
dade, taxas de complicação, tempo de estada n o hospital, tempos
d e espera em u m consultório, custo da assistência e satisfação dos
pacientes com o atendimento. Os resultados dos exames em si
n ã o são a m p l a m e n t e considerados c o m o desfechos. Entretanto,
 Introdução à Química Clínica e Medicina Laboratorial Baseada em Evidências CAPÍTULO 1 7

Seção e Tópico Item Na página #

TITULO/RESUMO/ 1 Identificar o artigo como um estudo de acurácia diagnostica (recomendar
PALAVRAS-CHAVE sensibilidade e especificidade do cabeçalho MeSH)
INTRODUÇÃO 2 Especificar as perguntas da pesquisa ou os objetivos do estudo, como estimar acurácia
diagnostica ou comparar a acurácia entre os exames ou através dos grupos participantes.

MÉTODOS Descrever

Participantes 3 A população do estudo: os critérios de inclusão e exclusão, cenário e locais onde os

dados foram coletados.

4 Recrutamento dos participantes: 0 recrutamento baseou-se nos sintomas apresentados,

resultados de exames anteriores ou no fato de que os participantes receberam os
testes-Indices ou o padrão de referência?

5 Amostragem de participantes: a população do estudo era uma série consecutiva de

participantes definida pelos critérios de seleção no itens 3 e 4? Se não, especificar
como os participantes foram posteriormente selecionados.

6 Coleta de dados: a coleta de dados foi planejada antes (estudo prospectivo) ou depois
(estudo retrospectivo) do teste-índice e do padrão de referência serem realizados?
V

Métodos do exame 7 0 padrão de referência e seu fundamento lógico.

8 Especificações técnicas dos materiais e métodos envolvidos, incluindo como e quando as
mensurações foram feitas e/ou citação de referências para testes-índices e padrão de referência.

9 Definição e fundamento lógico para as unidades, cortes e/ou categorias dos

resultados dos testes-índices e padrão de referência.

10 O número, treinamento e especialidade das pessoas que executam e analisam os

testes-índices e o padrão de referência.

11 Se os responsáveis pela leitura dos testes-índices e do padrão de referência eram cegos

(mascarados) para os resultados do outro exame e descrever qualquer outra informação
clínica disponível para os leitores.

Métodos estatísticos 12 Métodos para cálculo ou medidas de comparação de acurácia diagnostica e métodos
estatísticos usados para quantificar incerteza (p.ex., 95% de intervalos de confiança).
13 Métodos para cálculo da reprodutibilidade do exame, se realizado.

RESULTADOS Relato
Participantes 14 Quando o estudo foi realizado, incluindo datas de início e final do recrutamento.
15 Características clínicas e demográficas da população do estudo (p.ex., idade, sexo, espectro dos
sintomas apresentados, co-morbidade, tratamentos vigentes, centros de recrutamento).

16 O número de participantes que satisfazem os critérios para inclusão que se submeteram

ou não aos testes-indices e/ou padrão de referência; descrever por que os participantes
falharam em receber um ou outro exame (um fluxograma é altamente recomendado).

Resultados dos exames 17 Intervalo de tempo desde os testes-indices até o padrão de referência e qualquer
tratamento administrado entre eles.

18 Distribuição da gravidade da doença (definir critérios) naqueles com distúrbio-aivo;

outros diagnósticos nos participantes sem o distúrbio-aivo.

19 Uma tabulação cruzada dos resultados dos testes-índices (incluindo resultados indeterminados
e perdidos) por meio dos resultados do padrão de referência; para resultados contínuos, a
distribuição dos resultados do exame por meio do padrão de referência.

20 Quaisquer eventos adversos devidos à realização dos testes-indices ou padrão de referência.

Estimativas 21 Estimativas da acurácia diagnostica e medidas de incerteza estatística (p.ex., 95% de

intervalos de confiança).
22 Como os resultados indeterminados, respostas perdidas e valores discrepantes dos
testes-índices foram gerenciados.

23 Estimativas de variabilidade da acurácia diagnostica entre subgrupos de participantes,

responsáveis pela leitura ou centros, se realizadas.

24 Estimativas da reprodutibilidade do exame, se realizadas.

DISCUSSÃO 25 Discutir a aplicabilidade clínica dos achados do estudo.

Figura 1 - 2 Lista de verificaçao de STARD.

8 PARTE I Princípios Laboratoriais

Exemplo geral

Pacientes elegíveis
n=

Pacientes exduídOb \
Razões n - J

Toste-
indioe n =

V
Resultado anormal
n=
N
J 0 Resultado normalf \
n= C Resultado inooncunivo \
J

Nenhum padrão de \ r Nenhum padrão de \ / Nenhum padrão do \

referência n = r~ Kv referência n =
s
referência n =
/
r
Padrão de referência Padrão dc referência Padrão de referência
=
n n n•

/ i n c o n c l u s IVO Inconclusivo Inconclusivo

r -
n -
r n=

X
Distúrbio-aivo \ Distúrbio-aivo Distúrbio-aivo Distúrbio-aivo Dislúrbio-aivo f Distúrbio-aivo
presente ausente presente ausente presente ausente
n =
V
• n= n=
J V V
n=
J V. n= J
Figura 1 - 3 Fluxcgrama STARD.

u m exame a p r i m o r a d o melhorará os desfechos q u a n d o estes a taxa d e m o r t a l i d a d e após infarto d o miocárdio?" U m estudo

d e p e n d e m da realização do diagnóstico correto. (Desfechos
melhorados p o d e m ser difíceis de ser estabelecidos se n ã o houver
t r a t a m e n t o bem-sucedido para o distúrbio diagnosticado ou se
este ou outros distúrbios, c o m os quais foi c o n f u n d i d o , forem
tratados da mesma maneira).
Alguns exames são usados como marcadores de desfecho subs-
tituto nos estudos de intervenções q u a n d o se documenta uma foite
relação entre o resultado d o exame e a morbidade ou mortalidade;
exemplos incluem o uso de H b A l e e a razão albumina:creatinina na
urina nos estudos sobre o tratamento de diabetes me/iitits.
O s estudos de desfechos têm de ser distinguidos dos estudos
de prognóstico. O s estudos d o valor prognóstico de u m exame
perguntam: " O exame p o d e ser usado para prever u m desfecho?"
Em contrapartida, os estudos de desfechos p e r g u n t a m : " O uso
de um exame melhora os desfechos?" Por exemplo, u m estudo
da capacidade prognóstica de u m exame poderia perguntar: "A
concentração séríca de t r o p o n i n a I cardíaca correlaciona-se com
de desfechos poderia perguntar: "A taxa de mortalidade dos
pacientes c o m suspeita de i n f a r t o d o miocárdio é reduzida
q u a n d o os médicos u s a m dosagem de t r o p o n i n a I para orientar
as decisões?"
Muitos atributos do exame são receptivos aos estudos de
desfechos. O s estudos p o d e m abordaT não apenas a disponibili-
dade do exame, relativamente à não-disponibilidade, mas t a m b é m
atributos c o m o a metodologia usada para a mensuração, a quali-
dade analítica do d e s e m p e n h o d o exame, o t e m p o de execução
(como para o P O C T n o Setor d e Emergência) e o m é t o d o de
relato dos resultados dos exames (p.ex., c o m ou sem interpreta-
ção extensa do resultado).
Por que os Estudos sobre Desfechos?
O s estudos sobre desfechos têm tido considerável importância na
medicina. N o aspecto terapêutico da medicina, poucos fármacos
p o d e m ser aprovados pelas agências governamentais m o d e r n a s
 Introdução à Química Clínica e Medicina Laboratorial Baseada em Evidências
(ou pagos pelas organizações de assistência médica ou segurado-
ras de saúde) sem experimentos controlados randomizados de
sua segurança e eficácia. C a d a dia mais, o exame diagnóstico
entra em u m a m b i e n t e semelhante, n o qual médicos, governos,
seguradoras comerciais de saúde e pacientes exigem evidências
da efetividade dos procedimentos diagnósticos. Para analisar isto,
é necessário apenas lembrar o e n o r m e interesse nas controvérsias
sobre o valor da mamografia e a efetividade de se m e n s u r a r o
antígeno específico da próstata n o soro. Estas questões (e muitas
outras) d e p e n d e m da d e m o n s t r a ç ã o da melhora dos desfechos.
Nos EUA, a i m p o r t a n t e Joint C o m m i s s i o n on Accreditation
of Health Care Organizations (JCAHO) define qualidade c o m o
a u m e n t o da probabilidade de des/eckos desejados e redução da
probabilidade de desfechos indesejados. Se u m a organização de
assistência à saúde, ou sua unidade, c o m o u m laboratório clinico,
quer p r o p o r que sua qualidade é alta ou que esta contribui para
a qualidade da instituição, a mensagem é clara: d e m o n s t r a r
melhora dos desfechos.
Planejamento dos Estudos de Desfechos
Clínicos
O e x p e r i m e n t o c o n t r o l a d o r a n d o m i z a d o (RCT) é o padrão de
fato para estudos dos efeitos na saúde das intervenções clínicas.
Nestes estudos, os pacientes são randomizados para receber a
intervenção a ser testada (como u m novo fármaco ou exame) ou
u m a alternativa (tipicamente u m placebo ou u m fármaco ou u m
exame convencional), e u m desfecho é medido. O s RCTs têm sido
usados para avaliar as intervenções terapêuticas, incluindo fárma-
cos, radioterapia e intervenções cirúrgicas, entre outras. O s desfe-
chos medidos variam de fortes evidências, como mortalidade e
morbidade, até evidências mais fracas, c o m o a satisfação relatada
pelo paciente e os p o n t o s finais substitutos tipificados pelos mar-
cadores da atividade da doença (p.ex., HbAi c e razão albumina:
creatinina na urina c o m o m e n c i o n a d o anteriormente).
O alto impacto dos RCTs das intervenções terapêuticas levou
ao escrutínio de sua c o n d u t a e relato. U m grupo interdisciplinar
(principalmente epidemiologistas e editores clínicos de periódicos
médicos) desenvolveu u m a diretriz conhecida c o m o C O N S O R T 1 0
para a condução destes estudos. Embora inicialmente planejado
para avaliação de terapias, o C O N S O R T fornece lembretes úteis
q u a n d o do planejamento ou avaliação dos estudos de desfechos
dos exames na química clínica. Assim c o m o para o STARD, as
principais características das diretrizes d o C O N S O R T são uma
lista de verificação d e itens a serem incluídos n o relato e u m
fluxograma dos pacientes n o estudo.
O planejamento ideal de u m R C T de u m exame diagnóstico
n e m sempre é evidente. U m planejamento clássico é randomizar
pacientes para receber ou não u m exame, e então modificar a
terapia, da convencional para u m a diferente, baseada n o resultado
do exame nos pacientes testados. Esta abordagem leva a problemas
interpretativos. 3 Por exemplo, se a nova terapia é sempre efetiva, o
grupo examinado sempre se sairá melhor mesmo se o exame for
u m jogo de cara/coroa porque apenas o grupo examinado tem
acesso à nova terapia. A conclusão de que o exame teve valor seria
então errônea. U m problema semelhante ocorre se o grupo exami-
n a d o teve meramente u m acesso a u m e n t a d o à terapia. (Um
exemplo possível é o aparente benefício da prova de sangue oculto
nas fezes na redução da incidência de câncer de cólon o n d e o
grupo examinado é mais propenso a submeter-se a u m a colonos-
copia e remoção das lesões pré-malignas n o cólon. U m a seleção
randomizada dos pacientes para colonoscopia poderia atingir resul-
tados semelhantes aos resultados para o grupo examinado para
sangue oculto nas fezes). Este problema levará à conclusão errônea
de que o exame em si é útil. E m contrapartida, se a nova terapia
CAPÍTULO 1 9
for sempre pior do que o tratamento convencional, os pacientes
n o grupo testado se sairão pior e o exame será considerado inútil
i n d e p e n d e n t e de quão diagnosticamente preciso ele seja. De
maneira semelhante, se dois tratamentos são igualmente efetivos,
os desfechos serão os mesmos com ou sem exame; esta situação
levará à conclusão de que o exame não é bom, independente da
precisão do diagnóstico. Q u a n d o uma terapia verdadeiramente melhor
torna-se disponível, o exame pode ser comprovadamente valioso, por-
tanto é importante não desprezar o potencial do exame com base em
u m estudo com uma nova terapia que não oferece n e n h u m a vantagem
sobre a terapia antiga.
O s projetos alternativos foram descritos para abordar a questão
do uso do exame em u m RCT. 3 Em u m projeto, todos os pacien-
tes submetem-se a u m novo exame, mas os resultados são oculta-
dos d u r a n t e o experimento. O s pacientes são randomizados para
receber ou não a nova terapia. Neste projeto, o novo exame deve
ser a d o t a d o apenas se houver u m a melhora n o desfecho do
paciente causada por u m a m u d a n ç a para a nova terapia e se a
m e l h o r a n o desfecho estiver associada ao desfecho do exame.
U m R C T n e m sempre é viável. Alternativas ao R C T incluem
estudos que u s a m pacientes-controle históricos ou contemporâ-
neos nos quais a intervenção não foi empreendida. Estes estudos
são c h a m a d o s estudos de caso-controle. A incerteza sobre a com-
parabilidade entre os controles e os pacientes em tais projetos é
u m a ameaça à validação destes estudos.
REVISÕES SISTEMÁTICAS DOS EXAMES
DIAGNÓSTICOS
As revisões sistemáticas são adições recentes à literatura médica. A o
contrário das revisões "narrativas" tradicionais, estas revisões têm
c o m o objetivo responder u m a p e r g u n t a clínica definida com
precisão e fazer isto de f o r m a que seja transparente e p r o j e t a d o
para minimizar o viés. Algumas das características de definição
das revisões sistemáticas são: (1) definição clara da p e r g u n t a
clínica a ser abordada; (2) estratégia extensa e explícita para
encontrar todos os estudos (publicados ou n ã o publicados) que
possam ser adequados para a inclusão na revisão; (3) critérios
pelos quais os estudos são incluídos e excluídos; (4) mecanismo
para avaliar a qualidade de cada estudo; e, em alguns casos, (5)
síntese dos resultados pelo uso de técnicas estatísticas d e meta-
nálise. E m contrapartida, as revisões tradicionais são subjetivas,
r a r a m e n t e são b e m focadas em u m a p e r g u n t a clinica, n ã o
p o s s u e m critérios explícitos para seleção dos estudos a serem
revisados, não indicam critérios para avaliar a qualidade dos
estudos incluídos e r a r a m e n t e p o d e m usar metanálise.
A metodologia explícita das revisões sistemáticas sugere que
as pessoas habilitadas na arte da revisão sistemática devem ser
capazes de reproduzir os dados de u m a revisão sistemática, exa-
t a m e n t e c o m o os pesquisadores na química e bioquímica esperam
ser capazes de reproduzir estudos primários publicados em seus
campos. Este conceito fortalece a credibilidade das revisões siste-
máticas, e os profissionais da área de EBM geralmente conside-
ram revisões sistemáticas bem conduzidas de estudos primários
de alta qualidade para constituir o mais alto nível de evidências
em u m a questão médica.
Por que Revisões Sistemáticas?
A literatura médica é tão vasta que n i n g u é m p o d e ler, muito
m e n o s compreender, todos os trabalhos relevantes. Este é u m
impulso em direção às revisões sistemáticas. O u t r a s motivações
i n c l u e m a q u a n t i d a d e maciça de nova tecnologia, a baixa quali-
d a d e das revisões narrativas e a necessidade de fornecer u m
r e s u m o preciso para os médicos em atuação.
A s revisões sistemáticas p o d e m atingir múltiplos objetivos.
Elas p o d e m identificar o n ú m e r o , o escopo e a qualidade dos
10 PARTE I Princípios Laboratoriais

estudos primários; fornecer u m resumo da acurácia diagnostica QUADRO 1 - 1 Etapas Principais Selecionadas em uma
de u m exame; comparar as acurácias diagnosticas dos exames; Revisão Sistemática de um Exame Diagnóstico
determinar a d e p e n d ê n c i a das acurácias diagnosticas relatadas à
qualidade d o projeto d o estudo; identificar a d e p e n d ê n c i a da Identificar a pergunta clínica
acurácia do diagnóstico às características dos pacientes estuda' Definir os critérios de inclusão e exclusão
dos ou d o m é t o d o usado para o exame; e identificar as áreas q u e Pesquisar na literatura
requerem mais pesquisas e reconhecem as perguntas que são Identificar os estudos relevantes
Selecionar estudos usando critérios de qualidade explícitos
bem respondidas e para as quais os estudos adicionais p o d e m
Extrair dados e avaliar a qualidade
n ã o ser necessários.
Analisar e interpretar cs dados
Apresentar e resumir os achados
Condução de uma Revisão Sistemática
A revisão sistemática c o n s o m e t e m p o e requer múltiplas habili-
dades. Em geral é necessária u m a equipe, a qual deve incluir pelo
Exemplos:
menos u m a pessoa com experiência em ciência e arte da revisão
Pergunta d o tipo 1, relacionada com a acurácia diagnostica
sistemática. A equipe tem q u e concordar sobre o problema clínico
de u m exame:
a ser e n f r e n t a d o n o escopo da revisão.
Nos pacientes que p r o c u r a m o Setor de Emergência de u m
A etapa inicial na preparação para realização de uma revisão
hospital com falta de ar, quão b e m o peptídeo natriurético tipo
sistemática é identificar se uma revisão semelhante foi realizada
B (BNP) ou fragmento N-terminal d o pro-BNP prevê (identifica
recentemente. D e n t r e outras coisas, esta busca ajudará a enfocar
a presença de) insuficiência cardíaca c o m o avaliado pela fração
a revisão. O C o c h r a n e Collaboration fornece u m excelente
de ejeção cardíaca m e d i d a pela ecocardiografia?
recurso para revisões, mas infelizmente poucas são revisões de
Pergunta d o tipo 2, com relação ao valor de u m exame na
exames diagnósticos. A base de dados dos Abstracts of Review of
melhora d o desfecho para o paciente (chamada de avaliação de
Effectiveness (DARE), que é administrada pelo C e n t r o de Revi-
fase 4 de u m exame):
sões e Disseminação da Universidade de York n o Reino U n i d o ,
Nos pacientes admitidos n o hospital para t r a t a m e n t o de insu-
contém revisões de alguns exames diagnósticos. U m terceiro
ficiência cardíaca, q u ã o bem o uso de B N P ou N-terminal do
recurso é a biblioteca Bayes Library of Diagnostic Studies and
pro-BNP ajuda c o m o guia da terapia ou melhora a capacidade de
Reviews, que é associada ao C o c h r a n e Collaboration 1 2 ( h t t p : / /
se tratar a insuficiência cardíaca, como avaliado pela taxa de rea-
www.bice.ch/engl/content_e/bayes_librarv.htm, acessado em 4
dmissão subseqüente por insuficiência cardíaca?
de janeiro de 2007). O u t r o s recursos incluem bases de dados
Observar que cada pergunta identifica: (1) o problema do
eletrônicas, c o m o P u b M e d e Embase, e diretrizes recentes da
paciente [falta d e ar e local de a t e n d i m e n t o (Setor de Emergência
prática clínica, que provavelmente citam revisões sistemáticas q u e
o u hospital)]; (2) o exame que está sendo usado (BNP o u N-ter-
estavam disponíveis n o m o m e n t o d o desenvolvimento das dire-
minal pro-BNP); (3) padrão de referência para o diagnóstico {fração
trizes (ver seção sobre diretrizes, adiante neste capítulo).
de ejeção como medida pelo eco) ou para desfecho clínico (taxa
A equipe de revisão tem de desenvolver u m protocolo para o
de readmissão subseqüente) e (4) u m desfecho (capacidade para
projeto. O protocolo deve incluir:
detectar a presença de insuficiência cardíaca ou capacidade para
U m título;
tratar insuficiência cardíaca).
Informações sobre antecedentes;
F r e q ü e n t e m e n t e , surgem perguntas mais complexas. Por
C o m p o s i ç ã o do grupo de revisão;
exemplo, u m a p e r g u n t a do tipo 1 p o d e envolver a comparação
U m cronograma;
entre as acurácias diagnosticas de dois ou mais exames, ou p o d e
A(s) pergunta(s) clínicas a serem abordadas n a revisão;
abordar a melhoria na acurácia diagnostica a partir dos resultados
Estratégia de pesquisa;
acrescentados de u m novo exame aos resultados do exame ou
Critérios de inclusão e exclusão para seleção de estudos;
exames existentes. E m todos os casos, c o n t u d o , em geral é melhor
Metodologia das listas de verificação e listas de
que a pergunta clínica seja específica e focada em cenários clíni-
verificação para avaliação crítica dos estudos;
cos definidos.
Metodologia e formas de extração dos dados;
A pergunta clínica leva aos critérios de inclusão e exclusão
Metodologia de medidas para síntese e r e s u m o de
paTa estudos a serem incluídos na revisão. Estes critérios incluem
estudo a ser usada.
a coorte de pacientes e o local n o qual o exame será usado, assim
A descrição de todos os detalhes está além d o escopo deste
c o m o as medidas d e desfecho a serem consideradas. Eles são
capítulo e apenas alguns mais importantes serão discutidos. A
todos importantes, pois tanto o "local d o paciente" c o m o a
revisão das referências citadas aqui, c o m o a H o r v a r t h et aí.,13 é natureza da pergunta afetam o d e s e m p e n h o diagnóstico de u m
recomendada antes de se embarcar em uma revisão sistemática, exame.
Até recentemente, os metodologistas interessados e m revisões
A Pergunta Clínica e os Critérios para Seleção de sistemáticas se concentravam em estudos dos efeitos das interven-
Estudos ções, especialmente fármacos, nos desfechos do paciente. O tra-
Dentre as etapas na condução de u m a revisão sistemática de u m balho deles geralmente é aplicável nas revisões sistemáticas dos
exame diagnóstico ( Q u a d r o 1-1), o mais i m p o r t a n t e é a identifi- exames diagnósticos q u e começam com u m a pergunta d o segundo
cação da questão clínica para a qual o resultado d o exame é tipo anteriormente citado. Infelizmente, para as revisões sistemá-
necessário para que se dê u m a resposta e, p o r t a n t o , a formulação ticas dos exames diagnósticos, é incomum, atualmente, e n c o n t r a r
da pergunta q u e f o r m a a base da revisão. Dois tipos d e perguntas mais de u m estudo sobre qualquer combinação de u m exame
p o d e m ser abordados em u m a revisão sistemática n a medicina com u m desfecho. Nós, p o r t a n t o , nos concentramos nas revisões
diagnostica: u m tipo está relacionado à acurácia diagnostica de sistemáticas da acurácia diagnostica dos exames.
u m exame, e a outra, ao valor clínico (para pacientes ou para os Q u a n d o as perguntas a serem feitas são definidas, o g r u p o de
outros) d o uso d o exame. As perguntas q u e surgem são seme- revisão tem que entrar e m u m acordo sobre o escopo da revisão.
lhantes em estrutura, mas requerem abordagens diferentes. O grupo de revisão pode:
 Introdução à Química Clínica e Medicina Laboratorial Baseada em Evidências
• Restringir a revisão a estudos d e alta q u a l i d a d e direta-
m e n t e aplicáveis ao p r o b l e m a de interesse imediato, o u
• Explorar o efeito d a variabilidade n a q u a l i d a d e d o e s t u d o
e outras características (local, t i p o d e p o p u l a ç ã o , espectro
d a d o e n ç a etc) nas estimativas d e acurácia, u s a n d o análise
ou modelagem d o subgrupo.
A s e g u n d a a b o r d a g e m é mais complexa, mas possibilita
avaliar, p o r exemplo, a aplicabilidade das estimativas da acurácia
diagnostica e m diferentes locais e o efeito d o p l a n e j a m e n t o d o
e s t u d o e das características inerentes ao paciente ( c o m o idade,
sexo e sintomas) nas estimativas da acurácia diagnóstica d e u m
exame.
Estratégia de Pesquisa
A pesquisa da literatura p r i m á r i a e m geral é realizada de três
maneiras: (1) busca eletrônica nas bases d e dados da literatura;
(2) pesquisa m a n u a l dos principais periódicos e (3) revisão das
referências dos principais artigos de revisão. N o r m a l m e n t e , faz-se
pesquisa t a n t o n o M e d l i n e c o m o n o E m b a s e p o r q u e as coinci-
dências e n t r e os dois p o d e m ser d e a p e n a s 3 5 % . A busca e m
bases de d a d o s é u m exercício d e t a l h a d o , e a a j u d a d e u m biblio-
tecário o u d e u m cientista é r e c o m e n d a d a . As orientações p a r a
pesquisas d e estudos de acurácia diagnóstica publicados n a lite-
ratura estão disponíveis e m Irwig e Glasziou (www.cochrane.
o r g / d o c s / s a d t d o c l . h t m . Acesso e m 4 de j a n e i r o d e 2007). 14
E s t u d o s adicionais p o d e m ser e n c o n t r a d o s n a literatura
"cinza" (literatura n ã o convencional) das teses, atas d e conferên-
cias, relatos técnicos e monografias. A consulta de indivíduos
ativos n a área p o d e desvendar estudos nestas f o n t e s e estudos q u e
estão s e n d o p r e p a r a d o s para publicação.
Extração de Dados e Avaliação Crítica dos
Estudos
T r a b a l h o s identificados devem ser lidos i n d e p e n d e n t e m e n t e por
d u a s pessoas, e os dados, extraídos d e acordo c o m u m m o d e l o .
H á , disponível online, u m a lista d e verificação d o s itens a serem
extraídos d e estudos p r i m á r i o s ao se p r e p a r a r u m a revisão siste-
mática sobre a acurácia d o exame. 1 4 A lista de verificação 4 S T A R D
p o d e t a m b é m ser usada c o m o u m guia adicional n o planeja-
mento do modelo.
A q u a l i d a d e dos estudos deve ser avaliada c o m o p a r t e da
revisão sistemática. O p l a n e j a m e n t o d o e s t u d o é u m a considera-
ção i m p o r t a n t e . Para muitas p e r g u n t a s relacionadas c o m os des-
fechos, u m R C T será o p l a n e j a m e n t o d e mais alta qualidade. Para
estudos de acurácia diagnostica, os e s t u d o s d e séries consecutivas
d e pacientes estarão localizados acima d o s estudos q u e u s a m
controles históricos. O b v i a m e n t e , u m e s t u d o p o d e usar u m b o m
projeto, mas ter graves desvantagens e m outras dimensões; por
exemplo, muitos pacientes p o d e m ser perdidos d u r a n t e o acompa-
n h a m e n t o (follüw-up) o u o exame estudado p o d e ser realizado de
maneira precária d u r a n t e o estudo, c o m o indicado por precisão
diária precária. Assim, a graduação adequada da qualidade dos
estudos deve ir além da categorização d o p l a n e j a m e n t o d o estudo.
Resumo dos Dados
As características e os d a d o s d e estudos criticamente avaliados
devem ser a p r e s e n t a d o s e m tabelas. O s d a d o s dos estudos d e
acurácia diagnostica devem incluir sensibilidades, especificidades
e razões d e probabilidade, s e m p r e q u e possível. Estes p o d e m ,
então, ser r e s u m i d o s e m gráficos q u e f o r n e c e m u m a indicação
da variação e n t r e os estudos. O r e s u m o deve t a m b é m incluir u m a
avaliação da q u a l i d a d e d e cada estudo, u s a n d o u m sistema d e
escores explícito. A revisão deve t a m b é m apresentar análise
crítica dos d a d o s destacados.
CAPÍTULO 1 11
Metanálise
A m e t a n á l i s e é u m a m a n e i r a estatística de analisar d a d o s de
múltiplos estudos. Pode ser possível realizar u m a metanálise se
os d a d o s estiverem disponíveis a p a r t i r de i n ú m e r o s estudos
s e m e l h a n t e s (isto é, fazer a m e s m a p e r g u n t a p a r a o m e s m o tipo
d e paciente e n o m e s m o local clinico o u e m local semelhante).
As metanálises p o d e m explorar f o n t e s d e variabilidade n o s resul-
t a d o s d e e s t u d o s clínicos, a u m e n t a r a c o n f i a n ç a n o s d a d o s e
conclusões e sinalizar q u a n d o mais n e n h u m e s t u d o for necessá-
rio. Para diretrizes sobre c o n d u t a d e metanálises d e RCTs, ver a
i n s t r u ç ã o d a Q u a l i d a d e d o Relato das Metanálises ( Q U O R O M )
e m w w w . c o n s o r t s t a t e m e n t . o r g ^ ' Q U O R O M . p d f (acesso e m 4 de
janeiro d e 2007).
Para descrições d e técnicas metanalíticas n a pesquisa diagnos-
tica, c o m o o r e s u m o d a curva R O C , ver trabalhos feitos p o r Irwig
et allj e Deeks 9 e o capítulo d o livro de Boyd e Deeks. 7 Deeks
a r g u m e n t o u q u e as razões de p r o b a b i l i d a d e f o r n e c e m a expressão
mais t r a n s p a r e n t e da utilidade de u m e x a m e p o r q u e elas possi-
bilitam ao m é d i c o calcular a p r o b a b i l i d a d e pós-exame se a p r o
habilidade pré-exame for conhecida. 9
AVALIAÇÕES ECONÔMICAS DOS EXAMES
DIAGNÓSTICOS _
O s custos c o m assistência à s a ú d e e m t o d o o m u n d o a u m e n t a r a m
s u b i t a m e n t e nas ú l t i m a s décadas. Por exemplo, os E U A gastaram
1,68 trilhões d e dólares e m assistência à s a ú d e e m 2 0 0 3 , o i
1 5 , 3 % de seu p r o d u t o i n t e r n o b r u t o . E m b o r a os custos labora
toriais diretos sejam c o m p a r a t i v a m e n t e p e q u e n o s , os exames têir
u m a i n f l u ê n c i a p r o f u n d a nas decisões médicas e, p o r t a n t o , noí
custos totais.
Uma Hierarquia de Evidências
U m a h i e r a r q u i a d e evidências c o m relação aos exames clínicof
começa c o m a avaliação d o d e s e m p e n h o técnico d o exame £
c o n t i n u a c o m o e s t u d o d o d e s e m p e n h o diagnóstico d o exam(
até u m a identificação de potenciais benefícios e, p o r t a n t o , até í
avaliação e c o n ô m i c a . Esta h i e r a r q u i a d e evidências t a m b é m podt
ser observada n o c o n t e x t o dos d a d o s q u e são necessários par:
t o m a r decisões sobre a i m p l e m e n t a ç ã o d e u m exame. Ela s<
baseia, p o r t a n t o , n o n ú c l e o d o processo de elaboração d e políti
cas e a d m i n i s t r a ç ã o d o serviço. A avaliação e c o n ô m i c a forneci
u m m e i o de avaliação d o s custos comparativos d e estratégias di
c u i d a d o s alternativas.
Metodologias para Avaliações Econômicas
A e c o n o m i a e m S a ú d e está relacionada c o m o custo e as const
qüências de decisões t o m a d a s sobre o c u i d a d o dos pacientes
Envolve, p o r t a n t o , a identificação, m e n s u r a ç ã o e estipulação d o
valores dos custos e conseqüências. O processo é complexo e i
u m a "ciência inexata", As a b o r d a g e n s à avaliação econòmic;
i n c l u e m análise de: (1) custo-minimização, (2) custo-benefício, (3
custo-efetividade e (4) custo-utilidade (Tabela 1-2).
A análise d e custo-minimização d e t e r m i n a os custos de a b o r d í
gens alternativas q u e p r o d u z e m o m e s m o desfecho. Ela p o d e se
c o n s i d e r a d a o t i p o d e avaliação e c o n ô m i c a mais simples, m a
m e n o s informativo. N a área d e e x a m e diagnóstico, ela é aplicáve
ao custo de provedores alternativos d o m e s m o exame, dispositivi
o u i n s t r u m e n t o . E, p o r t a n t o , u m a técnica q u e está l i m i t a d a ai
processo d e aquisição o n d e as especificações d o serviço já sã>
estabelecidas e os desfechos, c l a r a m e n t e d e f i n i d o s . Poderia se
c o n s i d e r a d a f o r n e c e d o r a d o "custo p o r exame", u m indicado
f r e q ü e n t e m e n t e citado q u e n ã o é, c o n t u d o , u m a avaliação ecc
n ô m i c a verdadeira p o r q u e n ã o identifica u m desfecho, exceto i
f o r n e c i m e n t o d e u m resultado d e e x a m e .
12 PARTE I Princípios Laboratoriais
TABELA 1-2 A b o r d a g e n s para Avaliações E c o n ô m i c a s
Tipo de Avaliação E x a m e Avaliado
Minimização do custo Exames alternativos ou opções de fornecimento
Custo-benefíoio Exames alternativos ou opções de f o r n e c i m e n t o
Custo-efetividade Exames alternativos ou opções de fornecimento
Custo-utilidade Exames alternativos ou opções de fornecimento
A análise cusLo-beneficio determina se o valor do benefício
excede o custo da intervenção e, p o r t a n t o , se a intervenção é
compensadora. O valor da conseqüência o u benefício é avaliado
em termos monetários; isto pode ser bastante desafiador p o r q u e
p o d e exigir que o analista equacione u m a n o de vida com u m a
quantia monetária. H á inúmeros métodos, incluindo a "aborda-
gem de capital h u m a n o " , que avalia a produtividade do indiví-
d u o (em termos de lucros) e a "abordagem da vontade de pagar",
q u e avalia q u a n t o s indivíduos estão preparados para pagar.
A análise cust&efetividade contempla a maneira mais eficiente
de gastar u m o r ç a m e n t o fixo. O s efeitos são m e n s u r a d o s em
termos de u m a u n i d a d e natural, c o m o u m a n o de vida ou o
n ú m e r o de AVC que são evitados. As medidas substitutivas com
relações claras para morbidade e mortalidade t a m b é m foram
usadas (p.ex., m u d a n ç a na pressão arterial). Q u a n d o se avalia
u m a intervenção, o n ú m e r o de casos de doenças evitadas pode
ser usado c o m o m e d i d a de beneficio.
A análise custoutilidade inclui a qualidade e quantidade d o des-
fecho de saúde ou, em outras palavras, a contemplação da qualidade
de anos de vida ganhos. O custo da intervenção é avaliado em
termos monetários, mas os desfechos são expressos em "anos de
vida ajustados pela qualidade" (QALYs). A análise custo-utilidade
foi usada para avaliar a utilidade de alguns programas de triagem.
A adição de nova tecnologia f r e q ü e n t e m e n t e a u m e n t a t a n t o
o custo c o m o o beneficio. U m estudo d e custo-efetividade 10 da
triagem para câncer colorretal (versus n e n h u m a triagem) mostrou
q u e a estratégia "menos caca" foi u m a sigmoidoscopia simples
aos 5 5 anos de idade, com u m a u m e n t o da razão custo-efetivi-
dade incremental de 1.200 dólares p o r ano de vida salvo. Estra-
tégias alternativas conferiram razões custo-efetividade incrementais
de 21.200, 51.200 e 92.900 dólares com a adição de triagem cada
vez mais complexa e freqüente para sangue oculto nas fezes.
Q u a n d o os exames a u m e n t a m tanto o custo como o benefí-
cio, as decisões acerca de seu uso d e p e n d e r ã o de fatores c o m o
v o n t a d e de pagar e outras pressões políticas e individuais. U m a
q u a n t i a de 50.000 dólares por QALY foi usada nos EUA como
p o n t o de referência. Isto reflete u m a decisão t o m a d a pelo Con-
gresso norte-americano de aprovar o tratamento de diálise para
insuficiência renal em estágio final, u m t r a t a m e n t o com aproxi-
m a d a m e n t e este custo p o r QALY.
H á quatro possíveis achados advindos das análises custo-uti-
lidade e possíveis decisões correspondentes:
• Exame mais caro, mas que fornece maior benefício -
possivelmente introduzir o exame, d e p e n d e n d o do ganho
geral
• Exame mais caro, mas que promove m e n o s benefício -
n ã o introduzir o exame
• Exame m e n o s caro, mas q u e promove maior benefício -
introduzir o exame
• Exame menos caro, mas que promove menos benefício -
possivelmente introduzir o exame, dependendo do
t a m a n h o da perda n o benefício e da magnitude dos ganhos
Efeito ou Desfecho Critérios de Decisão
Desfechos idênticos Alternativa menos cara
Efeito ou desfecho melhorado Efeito avaliado puramente e m t e r m o s
monetários
Unidade c o m u m de efeito, porém Custo por unidade de efeito (p.ex., dólares
efeito diferencial por anos de vida ganhos)
Efeito ou desfecha melhorado Desfecho expresso e m termos da
sobrevida e qualidade de vida
(que podem ser capazes de produzir u m beneficio
demonstravelmente maior se gasto em uma intervenção ou
exame diferente).
Perspectivas de Avaliações Econômicas
A perspectiva a partir da qual u m a avaliação é realizada afeta o
projeto, a conduta e os resultados da avaliação. A perspectiva pode,
por exemplo, ser aquela de u m paciente, de u m pagador (agência
de saúde do governo ou companhia de seguros de saúde) ou da
sociedade. A perspectiva pode ser de longo prazo ou de curto prazo.
As perguntas adiante ilustram a importância da perspectiva:
• Q u a l é o custo do resultado d o exame produzido n o
analisador A c o m p a r a d o com o analisador B?
• Q u a l é o custo do resultado d o exame produzido pelo
laboratório A c o m p a r a d o com o laboratório B?
• Q u a l é o custo do resultado d o exame produzido p o r
P O C T comparado com o laboratório?
• O fornecimento de exames rápidos de sangue para o
Setor de Emergência reduzirá o t e m p o de estada dos
pacientes na Emergência e, p o r t a n t o , reduzirá o custo
para o hospital?
• O exame rápido de H b A l c em u m a clínica (e não em
u m laboratório distante) economiza t e m p o para os
pacientes ao fornecer os resultados n o m o m e n t o da
consulta? Ele economizará dinheiro para os empregadores
dos pacientes ao reduzir o t e m p o que o empregado fica
fora do trabalho para ir a consultas médicas repetidas?
Economizará t e m p o para o médico e, portanto,
dinheiro para a cíínica? Melhorará o cuidado do
diabetes (talvez facilitando o a c o n s e l h a m e n t o n o
m o m e n t o da consulta) p a r a o paciente c o m o indicado
pelas medidas i n d e p e n d e n t e s d o controle glicêmico? Ele
economizará dinheiro para o sistema de saúde ao
m e l h o r a i o controle glicêmico e, portanto, reduzirá as
hospitalizações relacionadas com o controle glicêmico
precário? Ele promoverá o benefício para a sociedade
reduzindo os custos de assistência à saúde da sociedade
(paTa hospitalizações) e a u m e n t a n d o a f u n ç ã o e a
contribuição dos pacientes para a sociedade?
O primeiro cenário é o tipo d e avaliação feita q u a n d o se faz
u m acordo e é u m exercício simples de aquisição. O desfecho é
o mesmo - o fornecimento de u m d e t e r m i n a d o resultado de
exame, para u m d e t e r m i n a d o padrão de acurácia e precisão em
u m d e t e r m i n a d o período de t e m p o (a especificação). A segunda
p e r g u n t a poderia parecer a mesma, mas não é e, indubitavel-
m e n t e , deve levar em consideração outras questões, isto é, as
questões logísticas associadas ao transporte de amostras ou ao
suporte d o nível de comunicação fornecido pelos laboratórios.
Para fazer u m a avaliação relevante d o terceiro cenário relacionada
ao valor d o P O C T , é i m p o r t a n t e t a m b é m levar em consideração
as implicações fora do laboratório que p o d e m resultar de atraso
n o envio da amostra para o laboratório. As implicações das per-
 Introdução à Química Clínica e Medicina Laboratorial Baseada em Evidências
guntas restantes são semelhantes, e deve-se observar que as com-
plicações clínicas do controle glicêmico precário são a m p l a m e n t e
de longo prazo e p o d e m estar além do intervalo de tempo reco-
m e n d a d o dos interesses financeiros daqueles que realizam u m a
análise econômica. N a verdade, avaliações econômicas rigorosas
de longo prazo do uso dos exames são raras.
Qualidade das Avaliações Econômicas
O s critérios para avaliação de u m estudo e c o n ô m i c o de u m exame
diagnóstico incluem:
• Definição nítida da p e r g u n t a econômica, c o m o a
perspectiva da avaliação (p.ex., perspectiva de u m
paciente, sociedade, empregador, c o m p a n h i a de seguros
de saúde o u u m a d m i n i s t r a d o r de hospital; perspectiva
de longo prazo uersi^s d e curto prazo);
• Descrição de alternativas conflitantes;
• Evidências de efetividade da intervenção;
• Identificação e quantificação claras dos custos e
conseqüências que incluem análise incremental;
• C o n s i d e r a ç ã o apropriada dos efeitos da ocorrência
temporal diferencial dos custos e benefícios;
• D e s e m p e n h o da análise de sensibilidade (quão sensíveis
são os resultados a m u d a n ç a s nas suposições ou na
entrada? [p.ex., m u d a n ç a s n o custo dos fármacos o u
benefício nos anos d e vidai);
• Inclusão de medidas sumárias de eficiência, assegurando
que todas as questões são abordadas.
Muitas avaliações econômicas dos exames diagnósticos n ã o
a t e n d e m estes critérios.
Uso de Avaliações Econômicas na Tomada de
Decisão
O fluxo de novos exames e m m e d i c i n a laboratorial exige decisões
f r e q ü e n t e s sobre implementá-los o u não. Avaliações econômicas
p o d e m a j u d a r a t o m a r decisões. O s recursos limitados para a
assistência à saúde r e q u e r e m o uso de u m meio objetivo de
d e t e r m i n a r c o m o os recursos são alocados e c o m o a eficiência e
a efetividade da distribuição d o serviço p o d e m ser melhoradas.
As avaliações econômicas p o d e m ser i m p o r t a n t e s para os
laboratórios. Primeiramente, o o r ç a m e n t o d o laboratório em
geral é "controlado" i n d e p e n d e n t e m e n t e dos outros custos de
assistência à saúde. Isto f r e q ü e n t e m e n t e é c h a m a d o de "orça-
m e n t o departamentalizado". O o r ç a m e n t o para o exame é esta-
belecido i n d e p e n d e n t e m e n t e dos o r ç a m e n t o s para serviços que
possam alcançar algum benefício se u m novo exame diagnóstico
for introduzido. E m segundo, atingir u m desfecho favorável
(p.ex., u m a redução n o t e m p o de estada o u a r e d u ç ã o das inter-
nações na u n i d a d e de cuidados coronarianos) é útil do p o n t o de
vista de administração apenas se aquele desfecho p u d e r ser trans-
f o r m a d o e m g a n h o m o n e t á r i o real. Em terceiro lugar, a introdu-
cão de u m novo exame ou m o d a l i d a d e de exame (p.ex., P O C T )
irá produzir benefícios apenas se u m a alteração c o r r e s p o n d e n t e
n a prática for i m p l e m e n t a d a . Por exemplo, o teste do D-dímero
t e m sido usado para excluir diagnósticos de d o e n ç a t r o m b o e m -
bolítica e, p o r t a n t o , evitar a necessidade de p r o c e d i m e n t o s radio-
lógicos caros. Esta a b o r d a g e m f u n c i o n a apenas se os médicos
realmente consideram os resultados do D-dímero e p a r a m de
pedir os caros exames de imagens, q u a n d o o resultado d o D-
d í m e r o e os achados clínicos indicarem que estes exames n ã o são
necessários. Finalmente, m e s m o s e n d o atingida a economia de
custo desejada, o o r ç a m e n t o d e p a r t a m e n t a l i z a d o assegura que as
economias são observadas em u m o r ç a m e n t o diferente daquele
d o laboratório e o o r ç a m e n t o d o laboratório mostra apenas u m
a u m e n t o d o custo. Felizmente, as desvantagens do o r ç a m e n t o
CAPÍTULO 1 13
d e p a r t a m e n t a l i z a d o estão s e n d o reconhecidas e u m a visão mais
ampla da e c o n o m i a de saúde parece estar se desenvolvendo e m
alguns serviços de assistência à saúde.
DIRETRIZES PARA A PRÁTICA CLÍNICA
N ã o se consegue atingir os objetivos o r ie n ta d o s para o paciente
da medicina laboratorial baseada em evidências por meio de
estudos primários e revisões sistemáticas apenas. O s resultados
destas investigações devem se t r a n s f o r m a r em ação. C a d a dia
mais, os sistemas de saúde e grupos de profissionais na medicina
têm se voltado para o uso de diretrizes da prática clínica. As
diretrizes são u m a f e r r a m e n t a para facilitar a i m p l e m e n t a ç ã o de
lições a partir de estudos primários e revisões sistemáticas. O s
impulsos i m p o r t a n t e s para o desenvolvimento de diretrizes têm
sido os de reduzir a variabilidade n a prática (e desenvolver o uso
de melhores práticas) e reduzir o ( f r e q ü e n t e m e n t e prolongado)
tempo necessário para que novas informações sejam usadas em
benefício dos pacientes o u p a r a prevenção de doenças.
O desenvolvimento das diretrizes práticas para o laboratório
clinico é u m a nova área desafiadora. H á poucas informações
disponíveis sobre c o m o p r e p a r a r tais diretrizes, mas r e c e n t e m e n t e
surgiu u m impulso inicial nesta direção. 19
O que É uma Diretriz de Prática Clínica?
D e acordo com o Instituto d e Medicina dos EUA, "As diretrizes
da prática clínica são instruções sistematicamente desenvolvidas
para auxiliar nas decisões do profissional e do paciente sobre os
cuidados apropriados em circunstâncias clínicas específicas". Dire-
trizes de vários tipos há m u i t o abordam questões de interesse para
os profissionais que trabalham em laboratórios, c o m o exigências
o u metas para acurácia, precisão e o tempo de execução dos exames
e as considerações sobre a freqüência de repetição de exames n o
m o n i t o r a m e n t o dos pacientes. O foco das direrrizes da m o d e r n a
prática clínica, c o m o as mais recentes sobre exames laboratoriais
no diabetes e doença hepática, é o paciente em "circunstâncias
clínicas específicas" referidas n a definição das diretrizes de prática
clínica. As ferramentas de EBM e epidemiologia clínica possibili-
tam que as diretrizes sejam desenvolvidas de f o r m a mais transpa-
rente a partir de estudos b e m conduzidos e revisões sistemáticas.
Deve Ser Usado um Processo Transparente
no Desenvolvimento de Diretrizes
N a ausência de u m processo transparente p a r a desenvolvimento
de u m a diretriz, a credibilidade d o p r o d u t o está c o m p r o m e t i d a
e p o d e ser legitimamente questionada. Q u a n d o as diretrizes são
desenvolvidas por u m g r u p o de profissionais (como médicos
especialistas ou profissionais d e laboratórios)) as recomendações
(p.ex., para realizar u m p r o c e d i m e n t o diagnóstico e m determi-
n a d o local) p o d e m ser suspeitas de promover o bem-estar do
g r u p o de profissionais. E m contrapartida, q u a n d o as diretrizes
são preparadas sob auspicioso controle dos que pagam pela assis-
tência de saúde (governos e c o m p a n h i a s de seguro), as recomen-
dações p o d e m ser suspeitas de serem medidas de controle de
custos, que p o d e m prejudicar os pacientes. Neste ú l t i m o caso,
corre-se o grande perigo de q u e a ausência de evidências de u m
benefício a partir de u m a intervenção médica seja interpretada
c o m o prova de ausência d o benefício.
Etapas do Desenvolvimento de Diretrizes
O desenvolvimento de diretrizes é mais b e m a d o t a d o seguindo-se
u m p l a n o etapa por etapa. U m e s q u e m a c o m o este é m o s t r a d a
na Figura 1-4, da qual apenas as questões selecionadas serão
discutidas aqui. Para u m a discussão mais detalhada, ver B r u n s e
O o s t e r h u i s s ou Oosterhuis et al.ig
14 PARTE ! Princípios Laboratoriais

1. Seleção do tópico

2 OftarrniriaçãiD d o grupo-afw e estabelecimento <te

uivtç) equipo rníjltidígdpftiaf de dss&nvatvJniento da <fwv*ri?

3. Identificação de d«sfer.hn

4. rounufaçíto d* pergunta o busca por ovldèitdae,

tr>cli>lnc*o < ü r a » r l a e & e x i s t e n t e s

5. Avalia çfco cfiíica de <Jtt esti l a » e*_>u evidências prirnárae

a, resumo de dados na tabala de ewid^ioMs

\
Evidências de alto grau para \ nao
Chegamos a um
nao
todas as recomendações?
/ -•< consenso?
\
srrri sim
Desenvolvimento de recomenda-
ções baseadas no consenso
fif FôrmuJeiç^o da r<3>oornendaçõ*s da dhreute

Afirmações ou opiniões curtas não

baseadas e m um consenso

7. Consulta, revisão p<jr especiaUstes, conferência de

consenscv teste piloto
Figura 1 - 4 Enapas n o
desenvolvimento de u m a diretriz de
prática clínica (Modificado dc
<3. Apresentação da diretriz
Oosterhuis WP, Biuns DE, Watine J,
Sandberg S, H o r v a t h AR. Evidence-
based guidelines in laborafcory
9. Ütesair.i nação, iryt(jlémeotapâo
medieme: principies and methods.
Cün Chem 2004;50:806-18.)

10. Monhofafifefikj. avaliação, revteSo

Seleção e Refinamento de um Tópico blema de diabetes e obesidade? H á uma necessidade percebida

A importância crucial desta primeira etapa é semelhante à impor-
tância da etapa correspondente no desenvolvimento de uma
revisão sistemática. O escopo não pode exceder as capacidades (de
tempo, financiamento e especialidade) d o grupo, o tópico não
pode ser sem evidências (ou a diretriz não terá credibilidade) e a
área tem de ser uma que requeira atenção (ou a diretriz terá pouco
valor)
As diretrizes podem abordar distúrbios clínicos (como diabe-
tes e doença hepática), sintomas (dor torácica), sinais (sangra-
mento anormal) ou intervenções, sejam elas terapêuticas
(angioplastia coronariana e ácido acetilsalicílico) ou diagnosticas
(marcadores cardíacos). A prioridade paia urna diretriz deve ser:
Há uma variação na prática que sugira incerteza? A questão é de
importância para a saúde pública, como no aumento do pro-
para redução do custo?
O refinamento do tópico envolve idealmente u m grupo mul-
tidisciplinar que inclui médicos, especialistas em laboratórios,
pacientes e prováveis usuários das diretrizes. O escopo será
afetado pela equipe de apoio (se houver) e suporte financeiro
disponível para o grupo da diretriz. O custo em geral é subesti-
mado.
Determinação de Grupo-Alvo e Estabelecimento
de uma Equipe Multidisciplinar de
Desen voivimen to
O público almejado deve ser identificado: são enfermeiros,
médicos clínicos gerais, médicos especialistas, especialistas de
laboratórios ou pacientes?
 Introdução à Química Clínica e Medicina Laboratorial Baseada em Evidências
Esquema para Graduação da Força das
Nível
Recomendações nas Diretrizes Clínicas
Características
L nivei
A Diretamente baseada na metanálise de RCTs ou em pelo
menos um RCT
B Diretamente baseado em pelo menos um estudo controlado
sem ranúomização ou pelo menos um outro tipo de
estudo "quase-experimental" ou extrapolado de RCTs
C Diretamente baseado em estudos não experimentais
ou extrapolado de RCTs ou estudos não randomizados
• Diretamente baseado em relatos de especialistas ou
opinlãc ou experiência de autoridades, ou extrapolado
de RCTs, estudos não randomizados ou estudos não
experimentais
De Sfifilueile PG, Woolf SH, Eccles iA, Grimshauj ]. CIÍTIÍMI giiídelincsr jgveloping
gHÍddmfs. BMJ 1999-,318:593-6.
QUADRO 1 - 2 Sistema de Classificação da Força de um
Corpo de Evidências19
QUALIDADE DOS ESTUDOS PRIMÁRIOS E REVISÕES: CLASSIFICAÇÃO DO
NÍVEL DE EVIDÊNCIA DOS ARTIGOS ISOLADAMENTE
la Metanálise ou revisão sistemática baseada em pelo menos vários
estudos de nível lb
lb Experimento diagnóstico ou estudo de desfecho de boa qualidade
II Experimento diagnóstico ou estudo de desfecho de qualidade
média, pacientes insuficientes ou outros experimentos (controle de
caso, outros projetos)
III Estudos descritivos, relatos de casos, outros estudos
IV instruções de comitês, opinião de especialistas etc, revisão; não
sistemático
CLASSIFICAÇÃO DA FORÇA DA EVIDÊNCIA QUE SUSTENTA AS
RECOMENDAÇÕES DAS DIRETRIZES
A Sustentado por pelo menos dois estudos independentes de nível lb ou
uma revisão de nível la ("foi mostrado/demnnstrado")
B Sustentado por pelo menos dois estudos Independentes de nível II
("é plausível")
C Não sustentado por estudos suficientes de nível I ou li ("indicações")
D Conselho de especialistas etc. ("não há provas")
A e q u i p e deve incluir representantes de todos os grupos
principais envolvidos n o t r a t a m e n t o d o distúrbio-alvo. N o desen-
volvimento de diretrizes na medicina laboratorial, as equipes
incluem idealmente especialistas clinicos relevantes, especialistas
em laboratórios, metodologistas (para experiência em estatística,
pesquisa na literatura, avaliação crítica e desenvolvimento de
diretrizes) e aquelas q u e p r e s t a m serviços (como os profissionais
de e n f e r m a g e m e pacientes para diretrizes de m o n i t o r a m e n t o
doméstico da glicose; técnicos de laboratório e administradores
para u m a diretriz q u e aborde os tempos de execução para marca-
dores cardíacos).
O s potenciais conflitos d e interesse de todos os m e m b r o s têm
que ser observados. O papel dos patrocinadores (comerciais ou
sem fins lucrativos) n o processo de desenvolvimento da diretriz,
se há, deve ser consensual e registrado. Idealmente, h á u m a
equipe d e apoio disponível para a organização de reuniões e
conferências e paTa o auxílio com publicação e outras formas de
disseminação (p.ex., audioconferências).
Recomendam-se grupos m í n i m o s de seis c o m p o n e n t e s .
G r u p o s c o m mais de 12 a 15 pessoas p o d e m inibir a expressão
CAPÍTULO 1 15
TABELA 1 - 4 I Hierarquia dc Critérios para Especificações
•ase
de Qualidade
1A Tomada de decisão clínica: uso de exame em situações
clinicas específicas
18 Tomada de decisão clínica: uso de exame na medicina
em geral
2 Diretrizes - "especialistas"
3 Reguladores ou organizadores de projetas de garantia de
qualidade externos
4 Estado da arte em dados publicados
CG, Petersen PH. Anafyrical performance chmacter
De FIOSCT
againsi objective quality speci/icarions. Ciin CFiem. 1999;45m3
das opiniões de cada pessoa. Recomenda-se o uso de subgrupos
q u e e n f o q u e m questões específicas, com u m comitê geral de
gestão responsável pela coordenação e produção da diretriz final.
O u t r a s formas de uso dos subgrupos p o d e m ser empregadas.
identificação e Avaliação das Evidências
Q u a n d o disponíveis, as revisões sistemáticas bem realizadas
f o r m a m a parte mais i m p o r t a n t e da base de evidências para as
diretrizes. As revisões sistemáticas são necessárias q u a n d o se
espera variação entre os estudos, algumas vezes atribuível a efeitos
p e q u e n o s demais para serem m e d i d o s . O n d e não existem revi-
sões sistemáticas, o grupo efetivamente deve adotar medidas para
produzir u m a . O nível de evidências q u e sustentam cada conclu-
são na revisão afetará as r e c o m e n d a ç õ e s feitas nas diretrizes.
A Tradução das Evidências em uma Diretriz e a
Graduação da Força das Recomendações
O s processos para atingir as recomendações d e n t r o de u m g r u p o
especialista são precariamente compreendidos. Para as diretrizes
da prática clínica, o processo p o d e envolver o equilíbrio de custos
e benefícios após os valores serem determinados e a força das
evidências ser avaliada. Evidências conclusivas para as recomen-
dações estão r a r a m e n t e disponíveis. O s autores das diretrizes,
p o r t a n t o , têm u m a responsabilidade ética de esclarecer b e m o
nível de evidências que sustenta cada recomendação.
Vários esquemas estão disponíveis para graduação d o nível
de evidência e u m deles deve ser a d o t a d o e usado de m a n e i r a
explícita. U m bem simples, c o m quatro níveis b e m típicos (A até
D), é m o s t r a d o na Tabela 1-3. U m esquema mais complexo é
m o s t r a d o n o Q u a d r o 1-2. Para u m a abordagem recente e dife-
rente, ver Atkins et al O nível de evidências n e m sempre prevê
a força de u m a r e c o m e n d a ç ã o p o r q u e as recomendações p o d e m
requerer extrapolação dos resultados dos estudos. Por exemplo,
múltiplos estudos que s u s t e n t a m o uso de u m fármaco p o d e m
ter sido b e m feitos e u m a revisão sistemática competente p o d e
estar disponível, de forma q u e as evidências possam ser graduadas
n o m e s m o nível. E n t r e t a n t o , se os estudos foram feitos em
adultos e as diretrizes forem p a r a crianças, a força da recomen-
dação p o d e ser pequena. 8
O nível mais alto de evidências é raro nas diretrizes n o uso de
exames diagnósticos. Na m a i o r parte destas diretrizes, a maioria
das recomendações é baseada na opinião de u m especialista. A
medida que mais estudos são publicados sobre a acurácia diagnós-
tica dos exames e sobre a relação destes exames com os desfechos,
deve-se reduzir a dependência das diretrizes em uma "opinião".
Para estabelecimento de u m objetivo analítico ou "especifica-
ções de qualidade" para métodos analíticos nas diretrizes, rara-
1G PARTE I Princípios Laboratoriais
mente os experimentos clínicos controlados randomizados
(estudos de desfecho) estão disponíveis. U m a diferente hierarquia
de evidências (Tabela 1-4) p o d e ser útil para graduar estas reco-
mendações relacionadas c o m laboratórios. O nível mais alto de
evidências é a evidência relacionada com necessidades clínicas. E
concebível que mesmo a modelagem estatística de decisões clíni-
cas específicas poderia ser considerada como u m subtipo de
evidência relacionado com as necessidades médicas. Por exemplo,
u m estuda de modelagem p o d e mostrar como as taxas de classi-
ficação errônea d o risco cardíaco são aumentadas q u a n d o os
exames de colesterol apresentam viés analítico. E m b o r a estes
estudos n ã o d e m o n s t r e m u m efeito nos desfechos do paciente
("real"), eles p o d e m ser u m avanço marcante sobre os relatos de
casos isolados.
O nível 1B na Tabela 1-4 refere-se primariamente aos conceitos
de variação biológica intrapessoal e interpessoal. Os níveis de
desempenho ótimo, desejável e mínimo tanto para imprecisão
como viés foram definidos com base nesres conceitos. Atender a
estes objetivos de desempenho assegura que a imprecisão analítica
é pequena se comparada com as variações normais diárias que
ocorrem em u m indivíduo. Assim, q u a n d o um exame é usado para
monitorar u m distúrbio d o paciente, a variabilidade analítica não
é uma questão importante. D e maneira semelhante, o objetivo para
o viés é tomá-lo pequeno se comparado com a variação entre os
indivíduos. Então, os intervalos de referência (anteriormente cha-
mados de "faixas normais") para um exame em u m determinado
grupo de referência não será afetado pela pequena quantidade de
erro ou viés analíticos. O uso deste tipo de especificação de quali-
dade para imprecisão e viés parece apropriado nas diretrizes. Na
verdade, a falha em usat esta abordagem é difícil de justificar porque
as dados sobre a variação biológica intrapessoal e interpessoal estão
disponíveis para praticamente todos os exames comumente usados.
A capacidade de usar exames para monitoramento e a capacidade
de usar intervalos de referência comuns dentro de u m a população
podem ser consideradas objetivos centrados n o paciente em u m
sentido amplo, ou mesmo em u m sentido estreito.
Obtenção de Revisão Externa e Atualização
das Diretrizes
Três tipos de examinadores externos p o d e m avaliar a diretriz22-.
• Especialistas clínicos n a área - para avaliar a integridade
da revisão literária e a racionalidade das recomendações;
• Especialistas em revisão sistemática e desenvolvimento
de diretrizes - para revisar o processo de
desenvolvimento da diretriz;
• Potenciais usuários das diretrizes.
Além disso, periódicos, organizações patrocinadoras e outros
potenciais endossantes das diretrizes p o d e m empreender revisões
formais. C a d a u m a destas revisões pode adicionar valor.
C o m o parte do processo de desenvolvimento de diretrizes,
deve-se desenvolver u m p l a n o para atualização. A importância
desta etapa é enfatizada pelo achado de que u m a das razoes mais
c o m u n s para não adesão às diretrizes é sua desatualização. Cerca
de metade das diretrizes publicadas estão desatualizadas em 5 a
7 anos e não mais que 9 0 % das conclusões ainda são válidas após
3 a 5 anos. Estes achados sugerem que n intervalo de t e m p o entre
a conclusão e revisão de u m a diretriz deve ser curto.
AUDITORIA CLÍNICA
Na assistência à saúde, o termo "auditoria" refere-se à revisão das
histórias de casos dos pacientes comparando-a com o referencial
de excelência da prática clínica vigente. A auditoria clínica pode
melhorar a prática clínica, embora os efeitos sejam modestos. U m
papel mais geral para a auditoria, contudo, é que ela pode ser
identificar a
pergunta
auditar a
prática
procurar
evidências
modificar a
prática
\
aplicar na
prática
avaliar
evidências
criticamente
Figura 1-S Ciclo de auditoria. {De Price CP. Evidence-based
laboratory medicine: s u p p o i t i n g decision-making. Clin C h e m
2000:4^:1041-50.)
usada como parte do exercício de administração mais amplo de
aferição do d e s e m p e n h o com o uso d e indicadores de desempe-
n h o relevantes em comparação ao desempenho dos especialistas.
A auditoria pode ser usada para: (1) resolver problemas, (2)
m o n i t o r a r a carga de trabalho n o contexto da d e m a n d a de con-
trole, (3) monitorar a introdução de u m novo exame e / o u
mudança n a prática e (4) m o n i t o r a r a adesão às melhores práticas
(p.ex., com diretrizes).
Os componentes do ciclo de auditoria são descritos na Figura
1-5. Todas as atividades da auditoria são encontradas na prática
da medicina laboratorial baseada em evidências. Há uma pergunta
clínica para a qual o resultado do exame deve fornecer u m a res-
posta, e a resposta conduzirá a uma decisão a ser feita e u m a ação
a ser adotada, levando a u m a melhora do desfecho de saúde.
Auditoria para Ajudar a Resolver Problemas
Todas as auditorias envolvem a coleta de dados observacionais e
a comparação com u m p a d r ã o ou especificação. Em muitos casos
não existe u m padrão e talvez n e m m e s m o u m a especificação.
Nestes casos, o primeiro passo do processo de auditoria é estabe-
lecer u m a especificação. Esta especificação pode então gerar
observações, que p o d e m levar à criação de u m padrão. N o prin-
cípio, ela fornece a medida comparativa com a qual julgar os
dad os de d e s e m p e n h o coletados.
Resolver u m problema relacionado com u m processo pode
primeiramente envolver a coleta de dados sobre aspectos do pro-
cesso q u e são considerados como t e n d o influência n o desfecho
com o objetivo de identificar as etapas limitantes. Por exemplo,
u m estudo dos tempos de execução para o resultado do exame
pode coletar dados sobre t e m p o de espera da flebotomia, quali-
dade da identificação do paciente, tempo de transporte, tempo de
registro da amostra, qualidade de identificação da amostra, tempo
de preparação da amostra, tempo de análise, tempo de validação
do resultado do exame e t e m p o para entrega do exame.
Auditoria para Monitorar Carga de Trabalho e
Demanda
A verdadeira d e m a n d a para u m exame dependerá d o n ú m e r o
de pacientes e do espectro da doença n o grupo para o qual o
 Introdução à Química Clínica e Medicina Laboratorial Baseada em Evidências
exame e apropriado. D u r a n t e a c o n d u ç ã o de u m a auditoria de
carga de trabalho para u m exame, é possível fazer algumas per-
guntas que a b o r d e m a adequação dos pedidos de exame. Estas
perguntas, que p o d e m ser feitas por m e i o de u m questionário,
incluem:
• Q u e pergunta clínica está sendo feita?
• Q u e decisão será auxiliada pelos resultados d o exame?
• Q u e ação será adotada após a decisão?
• Q u e riscos estão associados ao não-recebimento d o
resultado?
• Quais são os desfechos esperados?
• H á evidências que sustentem o uso d o exame neste caso?
• E, para exames pedidos com urgência, p o i que este
resultado de exame foi p e d i d o com urgência?
Esta abordagem é propensa a identificar o uso desnecessário
ou equivocado dos exames e exemplos de uso d o exame errado.
C o m o advento d o p e d i d o eletrônico e do p r o n t u á r i o eletrônico,
é possível construir esta abordagem em u m a prática rotineira.
As ações que p o d e m seguir as respostas a estas perguntas
incluem: (1) feedback dos resultados aos usuários; (2) reeducação
dos usuários; (3) identificação de necessidades n ã o atendidas e
pesquisa para satisfazer, p o r exemplo, u m a necessidade de acon-
s e l h a m e n t o sobre u m exame alternativo; (4) criação de u m algo-
r i t m o ou diretriz sobre o uso do exame e (5) fazer n o v a m e n t e
u m a auditoria após 6 meses para revisar as m u d a n ç a s na prática.
U m algoritmo p o d e ser integrado ao pacote de pedidos eletrô-
nicos para fornecer uma barreira automática paTa pedidos ina-
propriados (p.ex., evitar que provas de f u n ç ã o hepática sejam
pedidas todos os dias).
Auditoria para Monitorar a Introdução de um
Novo Exame
U m a auditoria p o d e ser usada para assegurar: (1) que a m u d a n ç a
na prática que deve a c o m p a n h a r a introdução de u m novo
exame ocorreu e (2) que os desfechos originalmente previstos
estão sendo atingidos. O desenvolvimento de qualquer novo
exame deve levar a evidências que identifiquem a maneira c o m o
o exame está sendo usado, incluindo:
• Identificação da(s) pergunta(s) clínicas, coorte de
pacientes e local clínico;
• Identificação de exigências pré-analíticas e analíticas
para o exame;
• Identificação de qualquer algoritmo n o qual o exame
possa ser inserido (p.ex., em c o n j u n ç ã o com outros
exames, sinais ou sintomas);
• Identificação da(s) decisão(ões) com probabilidade de
ser(em) tomada(s) ao se receber o resultado;
• Identificação dã(s) ação(ões) com probabilidade de
ser(em) empreendida(s) ao se receber o resultado;
• Identificação do(s) desfecho(s) provável(is);
• Identificação de quaisquer riscos associados à
introdução de u m novo exame;
• As evidências (e força destas evidências) que sustentam
o uso do exame e os desfechos a serem esperados;
• Identificação de quaisquer mudanças na prática (p ex.,
exclusão de outro exame da análise laboratorial,
m u d a n ç a para P O C T e redução da carga de trabalho
no laboratório)
Este "resumo d o uso" e portfólio de evidências f o r m a a base
do " p r o c e d i m e n t o de operação padrão" para o uso clínico do
exame, o cerne d o material educacional para usuários do serviço
e a base para c o n d u ç ã o da auditoria.
Antes de fazer a auditoria da introdução de u m novo exame,
obviamente é i m p o r t a n t e ter assegurado que u m programa com-
CAPÍTULO 1 17
pleto de educação dos usuários foi concluído e que quaisquer
outras mudanças na prática foram acomodadas na clínica e / o u
rotinas da enfermaria.
Auditoria para Monitorar Adesão à Melhor
Prática
Este é o cenário q u e provavelmente melhor reflete a f o r m a pela
qual a "auditoria clínica" foi primeiramente contemplada e pra-
ticada. Tipicamente, ela se baseia na revisão de casos randomi-
camente selecionados a partir de uma equipe clínica com a
revisão feita p o r u m médico i n d e p e n d e n t e . Esta abordagem é
que apresenta maior probabilidade de identificar q u a n d o u m
exame n ã o foi realizado e de identificar exames desnecessários.
A auditoria é mais b e m realizada q u a n d o comparada com alguma
forma de referencial de excelência, que pode ser u m a diretriz
local, regional ou nacional; u m a diretriz terá usado a melhor
evidência e p o r t a n t o removido as diferenças de opinião que
p o d e m existir entre as equipes clínicas.
APLICAÇÃO DOS PRINCÍPIOS DE MEDICINA
LABORATORIAL BASEADA EM EVIDÊNCIAS
NA PRÁTICA DE ROTINA
O s princípios da medicina laboratorial baseada em evidências
p o d e m servir de base para a forma c o m o a medicina laboratorial
é praticada, desde a descoberta de u m novo exame diagnóstico
até sua aplicação n o cuidado de rotina do paciente. O s princí-
pios fornecem a lógica pela qual todos os elementos da prática
são f u n d a m e n t a d o s . As ferramentas da medicina laboratorial
baseada em evidências fornecem os meios para a prestação da
mais alta qualidade de serviço ao a t e n d e i às necessidades dos
pacientes e profissionais de saúde que os servem. A aplicação da
prática baseada em evidências é m u i t o mais complexa para a
medicina laboratorial d o que para as intervenções terapêuticas,
mas são cruciais para o sucesso.
REFERÊNCIAS
1. Atldns D, Best D, Briss PA, Eccles M, Falclc-YttcT Y, Flottorp S, et al.
(GRADE Working Group). Grading quality of evidence and strength of
recommendations. BMJ 2004;328:1490.
2 Bissel MG Laboratoiy related measures of parient outcomes: an
introduction. "Washington, DC. AACC Press, 2000; 194pp.
3. Bossuyr PM, Lijmei JG, Mol BW. Randomised comparisons of
medicai tests: sometimes invalid, not always efficient Lancei
2000;356:1844-7.
4 Bossuyt PM, Reitsma JB, Bnms DE, Gatsonis CA, Glasziou PP, Iiwig
LM, et al. Towards complete and accurate reporting of studies of
diagnostic accmacy: the STARD initiatíve. Standards for Repotting of
Diagnostic Accuracy. Clin Chem 2003;49:1-6.
5. Bossuyt PM, Reitsma JB, Bruns DE, Gatsonis CA, Glasziou PP,
Irwig LM, et al. The STARD statement for reporting studies of
diagnostic accuracy: explanation and elaboration. Clin Chem
2003;49:7-18.
6. Bossuyt PM The quallry of reporting in diagnostic cest research: getring
better, still not opcimal Clin Chem 2004,50.458-6.
7. Boyd JC, Deeks JJ. Analysis and presentation of data. In: Piice CP,
Christenson RH, eds. Evidence-based laboratory medicine: from
principies to outcomes. Washington: AACC Press, 2003:115-36.
8. Bruns DE, Oosterhuis WP. From evidence to guidelines. In. Price CP,
Christenson RH, eds. Evidence-based laboratoiy medicine: from
principies to outcomes, Washington: AACC Press, 2003:187-208.
9. Deeks JJ. Systematic reviews in health care: systematic revíews of
evaluations of diagnostic and screening tests. BMJ 2001^323 157-62
ia PARTE I Princípios Laboratoriais
10. Frazier AL, Colditz GA, Fuchs CS, Kuncz KM. Cosr-eFfectiveness of
screening for colorectal câncer iri the general populatíon. JAMA
2000;284:1954-61.
11. Guyatt GH, Rennie D, eds. Users 1 guides to the medicai líterature: a
manual for evidcnce-based clinicai practice. Chicago: A M A Press,
2002;736 pp.
12. Hnrvath AR, Pewsner D, Eggcr M. Systcmacic reviews in laboratory
medicine-, porentials, principies and pitfalls. In. Price CP, Christenson
RFI, eds Evidence-based laboratory medicine, from principies to
ourrnmes Washington, DC: A A C C Press, 2003.137-58.
13. Hnrvath AR, Pewsner D. Systematic reviews in laboratory medicine:
principies, processes and practical consideracions. Clin C h i m Acta
2004;342:23-39.
14. Irwiy L, Glaszíou P. Cochrarie Methods G r o u p on Systematic Review of
Screening and Diagnostic Tests: recommended methods. Updated 6
June 1996. http://www.cochrane.org/docs/sadtdocl.htm {Accessed on
January 4, 2007).
15. Irwig L, Tosteson ANA, Gatsonis C, Lau ], Colduz G, Chalmers T C ,
Mosreller F. Guidelines for meta-analyses evaluatíng diagnostic cesta,
Ann Intern Med 1994;120:667-76.
16. Líjmer JG, Mol BW, Heisterkamp S, Bonsel GJ, Prins M H , van der
Meulen JH, Bossuyt PM. Empirical evidence of design-relared bias in
srudics of diagnostic tests. JAMA 1999;282:1061-6.
17. Lu mbreras-La carra B, Ramos-Rincon JM, Hernández-Agviado T
Methodology in diagnostic laboratoTy test research in Clinicai ChímisíT}
and Clinicai C/iemistn and Laboraiory Medicine. Clin C h e m
2004:50 530-6.
18. Moher D, Schulz KF, Altman D G for the C O N S O R T group. The
C O N S O R T statement: revised recommcndations for improving the
qualíty of reports of parallel group randomizcd criais 2001. JAMA
2001;28í».iytí7-91
19. Oosterhuis WP, Bruns DE, Warine J, Sandberg S, Horvath A R
Evidence-based guidelines in laboratory medicine: principies and
methods, Clin C h e m 2004;50:806-18
20. Reid M C , Lachs MS, Feinstein AR. Use of methodological standards in
diagnostic test research. Getting better but still nnt good JAMA
1995;274:645-51.
21. Sacketc DL, Rosenberg W M C , Muir Gray JA, Haynes RR, Richardson
WS. Evidence-based medicine: what it is and what ir isn'r. BMJ
1996;312:71-2.
22. Shekelle PG, Woolf SH, Eccles M, Grimshaw J. Clinicai guidelines:
developing guidelines. BMJ 1999;318:593-6.
CAPÍTULO 2
Introdução aos Princípios de
Análise e Segurança Laboratorial
Edward W. Bermes, Jr., Ph.D., Stephen E. Kahn, Ph.D., D.A.B.C.C., F.A.C.B.,
e Donald S. Young, M.B., Ch.B., Ph.D.
OBJETIVOS
1. Explicar as propriedades de solutos, solventes e soluções e
expressar e calcular a concentração de soluções usando vários
métodos.
2. Definir unidades de medida e relacionar as diferenças entre várias
unidades.
3. Distinguir os diferentes tipos de água usados em laboratório de
acordo com o preparo e o uso.
4. Listar as diferentes pipetas disponíveis, de acordo com seu uso, tipo
e capacidade, e descrever como calibrá-las.
5. Entender centrifugação e balanças e a terminologia relacionada a
cada uma delas e calcular RCF e rpm quando a informação
apropriada é dada.
6. Descrever um átomo e definir número atômico, número de massa,
isótopo, meia-vida e nuclídeo.
7. Definir decaimento radioativo.
8. Listar quatro tipos de decaimento radioativo, o tipo de partícula
produzida por cada um e o modo como cada tipo interage com a
matéria.
9. Explicar os princípios de auto-radiografia e de contagem de
cintilação.
10. Listar dois tipos de contadores de cintilação e seus usos no
laboratório.
11. Descrever os perigos da radiação e os riscos da exposição à
radiação.
12. Reconhecer e interpretar os vários sinais de risco em laboratório e
explicar o método de ação apropriado quando ocorre um acidente.
13. Descrever as Precauções Universais e o Plano de Exposição ao
Perigo da OSHA.
14. Explicar a proposta de um programa ergonômico.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
Agua de Grau Reagentes Agua purificada e classificada para
usos analíticos específicos.
Análise: As etapas de procedimento desenvolvidas para
determinar o tipo ou a quantidade de u m analito em um
espécime.
Analito: Uma substância ou u m constituinte para o qual o
laboratório conduz o teste.
Auto-radiografia: Uso de uma emulsão fotográfica (filme de
raios X) para visualizai moléculas radioativamente
marcadas.
Balança: U m instrumento usado para pesar.
Centrifugação: O processo de separação de moléculas por
tamanho ou densidade usando foiças centrífugas geradas
por uma rotação do rotor. Forças G de várias centenas de
milhares de vezes a gravidade são geradas na
ultracentrifugação.
Diluição: O processo (diluindo) de redução da concentração de
um soluto pela adição de solvente adicional.
Ergonomia: O estudo de suscetibilidades em lelação ao
trabalho exigido pela definição de posturas que minimizam
o trabalho estático desnecessário e reduzem as forças que
atuam sobre o corpo.
Ficha de Informação de Segurança de P r o d u t o (MSDS): U m
boletim técnico que contém informações sobre uma
substância química perigosa, tais como a composição
química, os riscos químicos e físicos e as precauções para
manuseio e uso seguros.
Gravimetria: O processo de medição da massa (peso) de uma
substância.
Material de Referência: U m material ou substância, com uma
ou mais propriedades físicas ou químicas suficientemente
bem estabelecidas, para ser usado para a calibração de um
aparelho, para a verificação de u m método de medida ou
para atribuir valores a materiais. Certificados primário e
secundário são tipos de materiais de referência.
Material de Referência Certificado: U m material de referência
que tem um ou mais valores certificados por um
procedimento tecnicamente válido e é acompanhado, ou
reconhecido, por um certificado ou outro documento, por
um corpo certificador.
Material de Referência Primário: U m material perfeitamente
caracterizado, estável, homogêneo, do qual uma ou mais
propriedades físicas ou químicas foram determinadas
experimentalmente dentro de medidas fixadas. Usado para
calibração de métodos definitivos; no desenvolvimento)
estimativa e calibração de métodos de referência; e para
atribuir valores a um material de referência secundário.
Material de Referência-Padrão (SRM): Um material de
referência certificado (CRM) que é certificado e distribuído
pelo National Institute of Standards and Technology
(NIST), uma agência do governo dos EUA antes conhecida
como National Bureau of Standards (NBS).
Material de Referência Secundário: U m material de referência
que contém u m ou mais analitos em uma matriz que
reproduz ou estimula a matriz esperada. Usado
primariamente para propósitos internos ou externos de
garantia de qualidade.
Meia-vida: O período de tempo necessário para um
radionuclídeo decair à metade da quantidade presente
originalmente.
Partícula Beta (P): Elétron de alta energia emitido como
resultado de um decaimento radioativo.
Patógenos Hematogênicos: Microrganismos patogênicos que
estão presentes no sangue humano. Estes patógenos incluem
o vírus da hepatite B (HBV) e o vírus da imunodeficiência
humana (HIV), mas não se limitam a eles.
Plano de Controle de Exposição: U m conjunto de instruções
escritas descrevendo os procedimentos necessários para
proteger trabalhadores de laboratório contra a exposição
potencial a patógenos hematogênicos.
20 PARTE I Princípios Laboratoriais
P l a n o d e H i g i e n e Q u í m i c a s U m c o n j u n t o de instruções
escritas d e s c r e v e n d o os p r o c e d i m e n t o s necessários para
prot eger os e m p r e g a d o s d e riscos à s a ú d e , r e l a c i o n a d o s às
substâncias q u í m i c a s presentes rio l a b o r a t ó r i o .
Precauções Universais: U m a abordagem para o controle de
infecção. D e a c o r d o c o m o c o n c e i t o das Precauções
Universais, t o d o s a n g u e h u m a n o ou certos f l u i d o s
orgânicos h u m a n o s são t r a t a d o s c o m o se f o s s e m i n f e c t a d o s
p e l o HIV, H B V e o u t r o s p a t ó g e n o s h e m a t o g ê n i c o s .
Radioatividade! Decaimento espontâneo de átomos
(radionuclídeos) q u e p r o d u z r a d i a ç ã o detectável.
R a i o G a m a : F ó t o n d e alta energia e m i t i d o c o m o r e s u l t a d o de
d e c a i m e n t o radioativo.
S i s t e m a I n t e r n a c i o n a l d e U n i d a d e s (SI): U m sistema d e
m e d i d a s a d o t a d o i n t e r n a c i o n a l m e n t e . As u n i d a d e s d o
sistema são c h a m a d a s u n i d a d e s d o SI.
S i s t e m a M é t r i c o : U m sistema de pesos e m e d i d a s b a s e a d o n o
metro como unidade padrão de comprimento.
T a m p ã o : U m a solução o u u m r e a g e n t e q u e resiste à m u d a n ç a
d e p H após a adição de u m á c i d o o u u m a base.
T e s t e : N o l a b o r a t ó r i o clínico, u m teste é u m p r o c e d i m e n t o
qualitativo, semiqualitativo, q u a n t i t a t i v o o u
s e m i q u a n t i t a t i v o p a r a detectar a presença ou m e d i r a
q u a n t i d a d e d e u m a n a l i t o e m u m espécime.
P
ara realizar análises qualitativas o u quantitativas confiáveis de
fluidos e tecidos d o corpo, o laboratorista precisa e n t e n d e r
os princípios e procedimentos básicos que afetam o processo e a
operação analíticos d o laboratório clínico. Estes incluem o conhe-
c i m e n t o d e (1) conceito d e soluto e solvente; (2) u n i d a d e s de
medida; (3) materiais d e referência e substâncias químicas; (4)
técnicas básicas, tais c o m o amostragem volumétrica e descarte, cen-
trifugação, m e d i d a de radioatividade, gravimetria, termometria,
solução t a m p ã o e processamento de soluções e (5) segurança.*
CONCEITO DE SOLUTO E SOLVENTE
M u i t a s análises n o l a b o r a t ó r i o clínico estão interessadas n a deter-
m i n a ç ã o da p r e s e n ç a d e substâncias ou n a c o n c e n t r a ç ã o destas
substâncias e m soluções, s e n d o a m a i o r i a das soluções f r e q ü e n -
t e m e n t e sangue, soro, u r i n a , l í q u i d o e s p i n h a l o u o u t r o s f l u i d o s
d o c o r p o ( C a p í t u l o 3).
Definições
U m a solução é u m a mistura h o m o g ê n e a de u m o u mais solutos
dispersos m o l e c u l a r m e n t e n u m a q u a n t i d a d e suficiente d e u m sol-
vente. N a prática d e laboratório, os solutos são t i p i c a m e n t e m e d i d o s
e são f r e q ü e n t e m e n t e conhecidos c o m o analitos U m a solução
p o d e ser gasosa, líquida ou sólida. U m laboratorista clínico está
interessado p r i n c i p a l m e n t e nas m e d i d a s de gases o u sólidos e m
líquidos, o n d e há sempre q u a n t i d a d e s relativamente grandes d e
solvente e m comparação c o m a q u a n t i d a d e d e soluto.
Expressando Concentrações de Soluções
N o s Estados LJnidos, os resultados analíticos são t i p i c a m e n t e
r e l a t a d o s e m t e r m o s de massa de s o l u t o p o r u n i d a d e d e v o l u m e
"Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições prévias dos Drs.
Edward R. Powsner e J o h n C. W i d m a n nas quais se baseia a parte Medição
d e Radioatividade deste capítulo.
d e solução, u s u a l m e n t e o decilitro. E n t r e t a n t o , o S i s t e m a I n t e r
n a c i o n a l d e U n i d a d e s (SI) r e c o m e n d a o u s o d e moles d e solute
p o r v o l u m e d e solução p a r a c o n c e n t r a ç õ e s d e a n a l i t o ( c o n c e n t r a
ções d e substância), s e m p r e q u e possível, e o u s o d e litro comc
o v o l u m e d e referência. E m b o r a c o n s i d e r a d o i n c o r r e t o e i n a p r o
p r i a d o p o r metrologistas, a c o n c e n t r a ç ã o d e massa t a m b é m <
relatada c o m o gramas p o r c e n t o ou p o r c e n t o . É assim q u e aí
c o n c e n t r a ç õ e s d e e t a n o l n o s a n g u e são t i p i c a m e n t e expressas
Essa t e r m i n o l o g i a indica u m a q u a n t i d a d e d e s o l u t o p o r massí
d e solução (p. ex., g r a m a s p o r 100 g) e seria a p r o p r i a d a somentE
se o material d e referência c o n t r a o qual o d e s c o n h e c i d o fosse
c o m p a r a d o tivesse s i d o t a m b é m m e d i d o d o m e s m o m o d o . U m í
exceção à expressão u s u a l d e c o n c e n t r a ç õ e s d e analito e m termos
d e v o l u m e de solução é a m e d i d a d e o s m o l a l i d a d e , n a q u a l a;
c o n c e n t r a ç õ e s são expressas c o m o massa d e solvente ( m O s m o l /
kg o u m m o l / k g ) .
Q u a n d o a solução e o solvente são a m b o s líquidos, c o m o naí
soluções alcoólicas, a c o n c e n t r a ç ã o de tal solução é freqüente-
m e n t e expressa c o m o v o l u m e p o r v o l u m e (vol/vol). Adicionando-
se 70 m L d e álcool a u m frasco e c o m p l e t a n d o c o m água para um
v o l u m e d e 100 mL, u m a solução cuja c o n c e n t r a ç ã o é 7 0 0 m L / L
p o d e r i a ser obtida. A expressão "700 m L / L " p o d e ser substituída
p o r alternativas 70 v o l u m e s p o r c e n t o o u 7 0 % (vol/vol).
As equações abaixo d e f i n e m as expressões d e concentrações:
massa (g)
mol =
p e s o m o l e c u l a r e m gramas (g)
n ú m e r o d e moles de s o l u t o
M o l a r i d a d e d e u m a solução =
n ú m e r o d e litros d a solução
n ú m e r o de moles d o s o l u t o
Mol ali d a d e da solução =
n ú m e r o d e q u i l o g r a m a s d o solvente
N o r m a l i d a d e d e u m a solução
n ú m e r o d e equivalentes g r a m a d o s o l u t o
n ú m e r o d e litros d o solvente
Peso d o equivalente g r a m a ( c o m o o x i d a n t e o u r e d u t o r )
p e s o da f ó r m u l a (g)
d i f e r e n ç a n o estado d e oxidação
Por exemplo, u s a n d o estas equações, u m a solução 1 molar d e H 2 S 0 4
c o n t é m 9 8 , 0 8 g de H 2 S 0 4 p o r litro de solução. (Nota: O símbolo
M, para d e n o t a r molaridade n ã o é mais aceito e t e m sido substituído
p o r m o l / L ) . U m a solução molal c o n t é m 1 m o l de soluto e m 1 k g
de solvente e é a d e q u a d a m e n t e expressa c o m o m o l / k g .
N o passado, miliequivalente ( m E q ) foi u s a d o p a r a expressar
a c o n c e n t r a ç ã o de u m eletrólito n o plasma. A g o r a , a u n i d a d e
 Introdução aos Princípios de Análise e Segurança Laboratorial CAPÍTULO 2 21

recomendada pata expressar a concentração de u m eletrólito n o acordo com o SI, mas que n ã o foi classificada n e m c o m o básica
plasma é milimoles por litro (mmol/L). Por exemplo, se u m a n e m como derivada. N o m o m e n t o somente o radiano (para
amostra contém 322 mg de Na por litro, a concentração molar ângulos planos) e o esterradiano (para ângulos sólidos) são clas-
de Na é: sificados desta forma.
A Conférénce Générales des Poids et Measures (CGPM) reco-
1 /t mg/L 3 2 2 x 10 x 1 1, nhece que algumas unidades fora d o SI c o n t i n u a m a ser impor-
mmol/L = — = 140 m m o l / L
massa molecular em mg 23 tantes e úteis em aplicações particulares. U m exemplo é o litro
c o m o volume de referência em análises clínicas. Litro é o n o m e
do submúltiplo (decímetro cúbico) da unidade do SI para volume,
N a prática do laboratório clínico, u m a titulação é conceituada
o metro cúbico. Considerando que 1 metro cúbico representa
c o m o a m e n o r diluição na qual u m a determinada reação ocorre.
cerca de 200 vezes o volume sanguíneo de u m adulto h u m a n o , a
A titulação é usualmente expressa c o m o u m a razão, p. ex., LIO
unidade de volume do SI não é u m volume de referência adequado
ou 1 para 10.
ou razoável n u m contexto clínico. C o n t u d o , a C G P M recomenda
C o m relação aos gases em solução, a lei de H e n r y afirma que
que tais unidades excepcionais, como o litro, n ã o devem ser com-
a solubilidade de u m gás em u m líquido é diretamente proporcio-
binadas com unidades do SI e devem ser preferencialmente subs-
nal à pressão do gás sobre o líquido em equilíbrio. Então, q u a n d o
tituídas por unidades do SI sempre que possível.
a pressão de u m gás dobra, sua solubilidade também é duplicada.
M i n u t o , hora e dia têm sido usados há t a n t o tempo na vida
A relação entre a pressão e a solubilidade varia com a natureza do
cotidiana que é improvável que novas unidades do SI derivadas
gás Q u a n d o vários gases são dissolvidos ao mesmo t e m p o em u m
do segundo possam substituí-los. Algumas outras unidades não-
único solvente, a solubilidade de cada gás é proporcional à sua
SI são ainda aceitas, embora sejam raramente usadas pela maioria
pressão parcial na mistura. A solubilidade da maioria dos gases
dos indivíduos nas suas vidas diárias, e têm sido m u i t o impor-
em líquidos diminui com um a u m e n t o de temperatura e, de fato,
tantes em alguns campos especializados. Detalhes do SI são
a fervura de u m líquido f r e q ü e n t e m e n t e expulsa todos os gases
encontrados na versão ampliada deste capítulo. 1
dissolvidos. Tradicionalmente a unidade usada para descrever a
concentração de gases em líquidos tem sido volume por cento de
gases (vol/vcil). Usando-se n SI, as concentrações de gases são
Múltiplos e Submúltiplos Decimais
Na aplicação prática de unidades, certos valores são muito gran-
expressas em moles por metro cúbico (mol/m 1 ).
des ou m u i t o pequenos para serem expressos convenientemente.
Valores numéricos são trazidos para o t a m a n h o conveniente
UNIDADES DE MEDIDA
q u a n d o a u n i d a d e é apropriadamente modificada por prefixos
U m a medida significativa é expressa com u m n ú m e r o e uma uni-
oficiais (Tabela 2-3).
dade. A unidade identifica a dimensão — massa, volume ou con-
centração — de uma propriedade medida. O n ú m e r o indica quantas
unidades estão contidas na propriedade.
Aplicações do SI no Laboratório Médico
Muitas organizações internacionais de laboratórios clínicos e
Tradicionalmente, as medidas n o laboratório clínico têm sido
sociedades profissionais nacionais têm aceitado as unidades do
feitas em unidades métricas. N o início d o desenvolvimento d o
sistema métrico, foram recomendadas unidades para compri-
m e n t o , massa e tempo. Os primeiros sistemas absolutos foram
baseados em centímetro, grama e segundo (CGS) e posterior-
TABELA 2-1 U n i d a d e s - B a s e d o SI
mente, em metro, quilograma e segundo (MKS). O SI é u m
sistema diferente que foi aceito internacionalmente em 1960. As Quantidade Nome Símbolo

unidades do sistema são d e n o m i n a d a s unidades d o SL Comprimento metro m

Massa quilograma kg
Sistema Internacional de Unidades Tempo segundo s
As unidades básicas, derivadas e suplementares são as três classes Corrente elétrica ampere A
das u n i d a d e s do SL 13 As oito unidades f u n d a m e n t a i s básicas Temperatura termodinâmica kelvin K
estão listadas na Tabela 2-1. U m a unidade derivada é derivada Quantidade de substância mol mel
matematicamente a partir de duas ou mais unidades básicas Intensidade luminosa cardela cd

(Tabela 2-2). U m a unidade suplementar é u m a u n i d a d e q u e está de Quantidade catalítica katal kat

T A B E L A 2 - 2 I Exemplo de Unidades Derivadas do SI I m p o r t a n t e s cm Medicina Clínica, Expressas cm Termos de Unidades-Base

Expressão e m Termos de Expressão e m Termos

Quantidade Nome Símbolo do SI outras Unidades do SI d e Unidades do SI

3 3
Volume metro cúbico m m
Densidade de massa quilograma por metro cúbico kg/m3 kg/m a
Concentração de quantidade de substância mol por metro cúbico mol/m 3
mol/m 3
Freqüência hertz Hz s1
Força newton N m kg s 2
Pressão pascal Pa N/m 2
m1kgs~2
Energia, trabalho, quantidade de calor joule J Mm m2 kQS'2
Potência watt W J/seg m2 kgs 3
Potencial elétriGo, diferença de potencial, volt V WA1 m2kgsaA"
força eletromotriz
22 PARTE I Princípios Laboratoriais

SI na sua aplicação ampla. O s Estados U n i d o s são um dos poucos
países que ainda estão p o r aceitar as unidades do SI. A compa-
ração de resultados d e alguns dos constituintes séricos comu-
m e n t e medidos, na concentração encontrada em indivíduos
saudáveis, é mostrada na Tabela 2-4.
Relatório Padronizado de Resultados de
Exames
Para descrever resultados de exames a d e q u a d a m e n t e , é impor-
tante que todas as informações necessárias sejam incluídas na
descrição do exame. O s sistemas desenvolvidos para expressar os
resultados produzidos pelo laboratório clínico incluem os siste-
mas Logical Observation Identifier Names and Codes ( L O I N C )
e International Federation of Clinicai C h e m i s t r y / I n t e r n a t i o n a l
U n i o n of Pure a n d Applied Chemistry ( I F C C / I U P A C ) .
Sistema LOINC
O sistema L O I N C é u m sistema de código universal para infor-
mar observações de laboratório e outras observações clínicas para
facilitar a transmissão eletrônica de dados laboratoriais intra e
entre instituições (http://www.loinc.org). 1 0 Estes códigos devem
ser usados n o contexto com outras n o r m a s existentes, tais c o m o
a A S T M E1238 (American Sociecy for Testing and Materials),
H L 7 Versão 2.2, (Health Levei Seven; h t t p : / / w w w . K I 7 . o r g / ) e a
Systematized N o m e n c l a t u r e of Medicine, Reference Technology
(SNOMED-RT). U m a n o r m a similar, conhecida c o m o C E N
E N V 1613, está sendo desenvolvida pelo E u r o p e a n C o m m i t t e e
for Standardization of the C o m i t é Européen de Normalisation
(CEN) Technical C o m m i t t e e 251 ( h t t p : / / w w w . c e n o i m . b e ) .
A base de dados do L O I N C atualmente tem registros de mais
de 3 0 . 0 0 0 observações. 10 Para cada observação, existe u m código,
um n o m e convencional por extenso, u m n o m e curto com 30
caracteres e sinônimos. U m programa m a p e a d o r d e n o m i n a d o
"Regenstrief L O I N C m a p p i n g assistam" (RELMA) está disponí-
vel para mapear códigos locais de exames para os códigos L O I N C
e facilitar a busca na base de dados do L O I N C . T a n t o o L O I N C
q u a n t o o R E L M A estão disponíveis sem custo em h t t p : / / w w w .
regenstrief.org/loinc/.

Sistema IFCC/IUPAC
O sistema I F C C / I U P A C r e c o m e n d a que os seguintes itens sejam
TABELA 2 - 3 Prefixos Métricos de Unidades do SI* incluídos em cada resultado de exame:
Fator Prefixa Símbolo Fator Prefhco Símbolo 1. O n o m e d o sistema ou sua abreviação;
1
2. U m travessão (dois hífens);
10" yotta Y 10 deci d
3. O n o m e d o analito (nunca abreviado) com u m a letra inicial
1051 zetta Z 10z centi c
maiúscula;
101B exa E 1G"3 mili m
101S
4. U m a vírgula;
peta P 10' 6 micra V-
101S tera T 10"9 nano
5. O n o m e da m e d i d a ou sua abreviação;
n
10 s giga G 10-12 pico
6. U m símbolo de igualdade;
P
10 a mega M 10"15 fento f 7. O valor numérico e a u n i d a d e o u sua abreviação.
10 3 kilo K 10 1 0 ato a
10* hectc H 10"21 zepto z
COMPOSTOS QUÍMICOS E MATERIAIS DE
10' deca* da 10 M
iocto y REFERÊNCIA
Do Sistema Internacional de Unidades (SI). Washington, DC, National institute of A qualidade dos resultados analíticos produzidos p o r u m labora-
Standards and Tecfinology, 1991. tório é u m a indicação direta da puresa dos compostos químicos
'A Eleve ntfi Conférínce Génévale da Foids ei Mesurei (CGFM) (1960, ReiOÍuçdü 12) usados como reagentes analíticos. A disponibilidade e a qualidade
adowu a primeira série de prefixos t símbolos de pwfíxas para formar os nomes e. símbolos dos materiais de referência usados para calibrar ensaios e para
Ji
dos múIí[/j!os e íuírnirilliploi decimais d as unidades do Sí. Os prefixos para 10" e m o n i t o r a r seu desempenho analítico t a m b é m são importantes.
10" foram adicionaAós [:rL; ildcima segunda C G PM (1964, Resolução 8], aqueles para
O s compostos químicos laboratoriais estão disponíveis em
30H e J0IS pela décima quinza CGPM {1975, Resolução 10) e aqueles para IO21, IO24
vários graus. O s solutos e solventes usados n o trabalho analítico
Ê ICr24 foram propostos pelo Cl PM (1990) para aprovação peia décimã nona CGPM
(1991). são compostos químicos de grau reagente, dentre os quais a água é
1
Fora dos Estados Unidos, a ortografia "deca" é usada ealensiuamence. u m solvente de importância primária. A I U P A C tem estabelecido
critérios para os "padrões primários". O National lnstitute of

TABELA 2-4 Valores Típicos para Analíticos e Incrementos Relatados

Unidades
Recomendadas Menor Incremento
Unidades Convencionais Unidades Recomendadas Arredondadas Relatado Recomendado

Albumina 3,8 g/dL 550,6 pmol/L 550,0 pmol/L 10,0 pmol/L

Bílirrubina 0,2 mg/dL 3,42 pmol/L 3 gmoi/L 2 pmol/L
Cálcio 9,8 mg/dL 2,45 mmol/L 2,45 mmol/L 0,02 mmol/L
CG leste rol 200 mg/dL 5,17 mmol/L 5,2 mmol/L 0,05 mmol/L
Creatinina 0,8 mg/dL 904S pmol/L 90 pmol/L 10 pmol/L
Glicose 90 mg/dL 5,00 mmol/L 5,0 mmol/L 0,1 mmol/L
Fósforo 3,0 mg/dL 0,97 mmol/L 1,0 mmol/L 0,05 mmol/L
Tiroxina 7,0 mg/dL 90,09 mmol/L 90 mmol/L 10 mmol/L
Triglicerídeos 100 mg/dL 1,14 mmol/L 1,15 mmnl/L 0,05 mmol/L
Nitrogênio da uréia* 10 mg/dL 3,57 mmol/L 3,5 mmol/L 0,05 mmol/L
Acido úrico 5,0 mg/dL 297 pmol/L 300 pmol/L 10 pmol/L

'Nitrogénio da uréia ê relatado como uréia (mmol/L) eivando as unidades d o SI são usados.
 Introdução aos Princípios de Análise e Segurança Laboratorial CAPÍTULO 2 23

Standards a n d Technology (NIST; h t t p : / / t s . n i s t . g o v / t s / h t d o c s / Troca Iônica

2 3 0 / 2 3 2 / 2 3 2 . h t m ) tem vários Materiais de Referência-Padrão
(SRMs) disponíveis para o laboratório químico clínico. O Clini-
cai Laboratory Standards Institute (CLSI) — anteriormente Natio-
nal C o m m i t t e e for Clinicai Laboratory Standards (NCCLS;
http://www.nccls.org) — tem publicado vários documentos que
descrevem e discutem o uso de materiais de referência em medi-
cina laboratorial clínica. Materiais d e r e f e r ê n c i a certificados de
relevância clínica também estão disponíveis n o Institute for Refe-
rence Materials and Measurements (IRMM) em Geel, Bélgica
(http://www.irmm.jrc.be/) e na Organização M u n d i a l de Saúde
(OMS; http://www.who.int/biologicals).
Água Grau Reagente
O preparo d e muitos reagentes e soluções usados n o laboratório
clínico requer água "pura". A água simplesmente destilada n ã o
possui as especificações para a Clinicai Laboratory Reagent Water
(CLRW) estabelecida pelo C L S I / N C C L S . 6 U m a vez que os
termos "água deionizada" e "água destilada" descrevem técnicas
de preparação, eles precisam ser substituídos por água grau rea-
gente, seguido pela designação da CLRW, a qual define melhor
as especificações da água e é i n d e p e n d e n t e d o m é t o d o de prepa-
ração (Tabela 2-5).
Preparo de Água Grau Reagente
Destilação, troca iônica, osmose reversa e oxidação ultravioleta
são processos usados para preparar água grau reagente. Na prática,
a água é filtrada antes q u e qualquer destes processos seja
usado.
Destilação
Destilação é o processo de vaporizar e condensar u m líquido para
purificar o u concentrar u m a substância ou para separar u m a
substância volátil de substâncias m e n o s voláteis. Este é o m é t o d o
mais antigo de purificação de água. Os problemas com destilação
para preparar água reagente são o transporte d e impurezas volá-
teis e as gotículas de água aprisionadas q u e p o d e m carrear impu-
rezas à água purificada. Isto resultará em contaminação do desti-
lado com substâncias voláteis, sódio, potássio, manganês, carbo-
natos e sulfatos. C o m o resultado, a água tratada por destilação
sozinha n ã o tem o requerimento de condutividade específico da
água tipo I.
Troca iônica é u m processo q u e remove os íons para produzir água
deionizada livre de minerais. Tal água é mais convenientemente
preparada usando-se equipamentos comerciais, que variam em
t a m a n h o desde pequenos cartuchos descartáveis até grandes
reservatórios c o n t e n d o resina. A deionização é alcançada pas-
sando-se a água através de colunas contendo polímeros de resina
insolúveis q u e trocam H + e O H ' pelas impurezas presentes sob
forma ionizada na água. As colunas p o d e m conter trocadores
catiônicos, trocadores amônicos ou u m a "resina de troca mista",
a qual é u m a mistura de resinas trocadoras de ânions e de cátions
n o mesmo recipiente.
U m deionizador de troca simples geralmente é capaz de produ-
zir água que tem uma resistência específica que excede 1 M D / c m .
Q u a n d o conectado em série, deonizadores de troca mista normal-
mente produzem água com uma resistência específica que excede
10 M Q / c m .
Osmose Reversa
Osmose Reversa é u m processo pelo qual a água é forçada através
de u m a m e m b r a n a semipermeável que age c o m o u m filtro mole-
cular. A m e m b r a n a remove de 9 5 % a 9 9 % dos composcos orgâ-
nicos, bactérias e outras substâncias particuladas e de 9 0 % a 9 7 %
de todos os minerais ionizados e dissolvidos, porém pouco das
impurezas gasosas. Embora o processo seja i n a d e q u a d o para pro-
duzir água grau reagente para o laboratório, ele p o d e ser usado
como u m m é t o d o de purificação preliminar.
Oxidação Ultravioleta
Oxidação ultravioleta é outro m é t o d o que é bem empregado
q u a n d o faz parte de u m sistema. O uso de radiação ultravioleta
n o c o m p r i m e n t o de o n d a biocida de 254 n a n ô m e t r o s elimina
muitas bactérias e cliva muitas das substâncias orgânicas ionizá-
veis, que são, então, removidas pela deionização.
Qualidade, Uso e Estocagem de Água Grau
Reagente
A água tipo 111 p o d e ser usada para lavagem d e vidraria. (A rinsa-
gem final, entretanto, precisa ser feita com água em grau ade-
q u a d o para o uso pretendido da vidraria). Ela t a m b é m pode ser
usada para certos procedimentos qualitativos, tais como aqueles
utilizados em urinálise.

TABELA 2 - 5 Especificações do CLSI/NCCLS para a Água Reagente

CLRW
Conteúdo microbiológico*, unidades formadoras de colônia por mL, 10
ufc/mL (máximo)
pH N.A.
Resistividade,por centímetro (Wlíí/cm), 25°C > 10 na linha
Silicato, mg SiO,/L (máximo) 0,05
Substâncias particuladaé Água passada através de filtra de 0,2
Orgânicas Água passada através de carbono ativado

Do Clinicai Laboratory Standards Institute (CLSI); Prepara Lion and Teíring of Reagem Wacer m the Clinicai Laboratory, 4'h ed, CLSI
Document C3A4- W I I W É , PA, CLSI, 2006.
*Conie údo microbiológico. O conte titio micro biológico tie organismos wdveis, como de termina tio pela contagem total de colônias após incubação
a 36 ± 1 °C por 14 h, seguido de 48 h a 25 ± 1 °C, e descrito como unidades formadoras de colônias poT mL (u/c/niL).
1
Resistência específica ou ras is ti cidade. A resistência elétrica em ohms entre faces opostas de um cubo de l cm de uma solução aquosa numa
temperatura especificada. Para estas especificações, a resistividade será corrigida pãra 25°C e descri tu em M Q / c m . Quanto maior a quantidade
de materiais ionijmreis, menor a TEsism/idade e maior a condutividade.
* Substâncias particuladas: quando a ãgcia é passada através de um /rltro de membrana com poros de 0,2 JJTTI, eia é considerada livre de subs-
tâncias particuladas; Orgânicas'. Quando a água é passadã atraués de um suporte de carbono ativado, consitkra-sé que ela contém õ mínimo ds.
material orgânico.
24 PARTE I Princípios Laboratoriais
A água tipo II é usada paia exames de laboratório q u e não
requerem água tipo I. A estocagem p o d e ser mantida em u m
m í n i m o ; os sistemas de estocagem e distribuição devem ser cons-
truídos para assegurar o m í n i m o de contaminação química ou
bacteriana.
A água tipo I deve ser usada em métodos de exames q u e
requerem interferência m í n i m a e precisão máxima. Tais procedi-
m e n t o s incluem metais traço, enzimas e medidas eletrolíticas e o
preparo de todos os calibradores e soluções de materiais de refe-
rência. Esta água deve ser usada imediatamente após sua produ-
ção. N e n h u m a especificação de sistemas de estocagem para água
tipo I é dada p o r q u e n ã o é possível m a n t e r a alta resistividade
q u a n d o se retira a água e a estoca.
Teste de Pureza da Água
N o mínimo, a água p o d e ser testada para c o n t e ú d o microbioló-
gico, p H , resistividade e sílica solúvel 8 , e o intervalo máximo n o
ciclo de testes para pureza da água reagente deve ser 1 semana.
Note-se que as medidas realizadas n o m o m e n t o da p r o d u ç ã o
p o d e m diferir daquelas n o m o m e n t o e n o local de uso. Por
exemplo, se a água corre em canos por u m a longa distância, deve-
se considerar a deterioração na via até o local de uso. Para con-
seguir as especificações para a cromatografia líquida alta eficiên-
cia (HPLC), em alguns casos, é necessário adicionar u m filtro
final com u m a m e m b r a n a de 0,1 p m . A água p o d e ser testada
por H P L C usando-se u m programa de gradiente e m o n i t o r a n d o -
se com u m detector ultravioleta. N e n h u m pico que exceda o
ruído analítico do sistema p o d e ser encontrado.
Substâncias Químicas de Grau Reagente
Analítico (AR) ou de Grau Reagente
As substâncias químicas que satisfazem as especificações da Ame-
rican Chemical Society (ACS) são descritas como de grau reagente
ou reagente analítico. Estas especificações têm se tornado, também,
as normas usadas em muitas aplicações de alta pureza Estão dis-
poníveis em duas formas: (1) reagentes analisados em lotes, na qual
cada lote individual é analisado e a quantidade real de impureza é
informada, e (2) reagentes com impureza máxima, paia os quais as
impurezas máximas são listadas. O Committee o n Analytical Rea-
gents da ACS periodicamente publica "Reagents Chemicals" lis-
tando as especificações (htpp-//pubs.acs.org/Teagents/index html).
Estas substâncias de grau reagente são de pureza muito alta e são
recomendadas para análises qualitativas e quantitativas.
Reagentes Ultrapuros
Muitas técnicas analíticas necessitam de reagentes cuja pureza
excede as especificações daquelas descritas previamente. Os fabri-
cantes oferecem substâncias químicas selecionadas pata satisfazer
as exigências específicas. N ã o há u m a designação uniforme para
estas substâncias e solventes orgânicos. Termos como "grau espec-
trométrico", "grau nano" e "pureza H P L C " têm sido usados. Dados
de interesse para o usuário (p. ex., a absorvância em u m compri-
m e n t o de onda específico) são fornecidos com o reagente.
Outras designações de pureza química incluem. Quimica-
mente Pura (CP); Graus U S P e N F (substâncias químicas produ-
zidas para satisfazer as especificações registradas na U n i t e d States
Pharmacopeia (USP) ou n o National Formulary (NF)]. As subs-
tâncias químicas rotuladas c o m o grau purificado, prático, técnico
ou comercial n ã o devem ser usadas em análises químicas clínicas
sem purificação anterior.
Materiais de Referência
Materiais d e referência p r i m á r i o s são substâncias químicas alta-
m e n t e purificadas q u e são diretamente pesadas ou medidas para
produzir u m a solução cuja concentração é exatamente conhe-
cida. A I U P A C tem proposto u m grau de 9 9 , 9 8 % de pureza para
materiais de referência primários.
Estas substâncias químicas altamente purificadas p o d e m ser
pesadas diretamente para o preparo de soluções de concentração
selecionada ou para a calibração de soluções de força desconhe-
cida. Elas são fornecidas com u m certificado de análise para cada
lote. Estas substâncias químicas precisam ser substâncias estáveis
de composição definida q u e p o d e m ser secas, preferencialmente
de 104°C a 110°C, sem u m a m u d a n ç a n a composição. Elas n ã o
devem ser higroscópicas, de tal forma que a água n ã o seja absor-
vida d u r a n t e a pesagem.
Materiais d e referência secundários são soluções cujas con-
centrações n ã o p o d e m ser preparadas pesando-se o soluto e dis-
solvendo-o em u m volume de solução. A concentração de mate-
riais de referência secundários é usualmente determinada pela
análise de u m a alíquota da solução através de u m m é t o d o de
referência satisfatório, u s a n d o u m material de referência primá-
rio para calibrar o m é t o d o .
Padrões de Referência Certificados (Materiais de Referência-
Padrão, SRMs) para laboratórios clínicos estão disponíveis n o
N I S T e n o I R M M . O colesterol, o primeiro SRM desenvolvido
pelo NIST, foi emitido em 1967 Exemplos de tais padrões dis-
poníveis n o N I S T e n o I R M M estão listados nas Tabelas 2-6 e
2-7. N e m todos os materiais de referencia-padrão têm as proprie-
dades e o grau de pureza especificado por u m padrão primário,
mas cada u m tem sido b e m caracterizado para certas proprieda-
des químicas ou físicas e é emitido com u m certificado q u e
oferece os resultados da caracterização. Estes p o d e m , então, ser
usados para caracterizar outros materiais.
PROCEDIMENTOS E TÉCNICAS BÁSICOS
As práticas básicas usadas nos laboratórios de diagnósticos clíni-
cos e moleculares incluem técnicas óticas, cromatográficas, eletro-
químicas, eletroforéticas, espectro métricas de massa, enzimáticas
e de imunoensaio Estas técnicas são discutidas em detalhes nos
Capítulos 4 a 10. Aqui serão discutidas as técnicas básicas de-
amostragem e distribuição volumétricas, centrifugação, medição
de radioatividade, gravimetria, termometria, verificação da con-
centração do íon hidrogênio e processamento de soluções.
Amostragem e Distribuição Volumétricas
Os procedimentos químicos clínicos necessitam de medidas volu-
métricas acuradas para garantir resultados precisos. Para o traba-
lho acurado, somente vidraria Classe A deve ser usada. A vidraria
Classe A é certificada para obedecer às especificações descritas
na circular C-602 d o NIST.
Pipetas
As pipetas são usadas para a transferência de u m volume de
líquido de u m recipiente para outro. Elas são projetadas para (1)
contei (TC, to contam) u m volume específico de líquido ou (2)
liberar (TD, to deliver) u m volume específico. As pipetas usadas em
laboratórios clínicos, de diagnósticos moleculares e de análise
incluem (1) pipetas de m e d i d a e transferência manual, (2) micro-
pipetas e (3) dispositivos mecânicos e eletrônicos de pipetagem.
O desenvolvimento de melhorias d o projeto de sistemas de pipe-
tagem inclui a automação robótica, a capacidade de permitir o
controle eletrônico e por computadores pessoais (PC) dos dispo-
sitivos de pipetagem e a atenção cuidadosa com os aspectos
ergonômicos d o projeto. Existem, t a m b é m , os sistemas de cali-
bração de pipetas fotométricos automáticos que reduzem o t e m p o
de checagem periódica da pipeta e potencialmente supre o uso
mais eficiente de pessoal.
 Introdução aos Princípios de Análise e Segurança Laboratorial CAPÍTULO 2 25

TABELA 2-6 M a t e r iais d e R e f e r ê n c i a - P a d r ã o ( S R M s ) T A B E L A 2 - 7 I M a t e riais d e R e f e r ê n c i a ( M R s ) D i s p o n í v e i s n o

D i s p o n í v e i s n o N a t i o n a l I n s t i t u t e of S t a n d a r d s National Institute for Reference Materials and
a n d T e c h n o l o g y (www.nist.gov) Measurements (www.irmm.jrc.be)

Analito Número SRM Analiteo N ú m e r o UM í

Ensaio para níveis de drogas antiepilepsia (fenitoína, 900 Soro humano liotilizado BCR-304
etosuximida, tenobarbital e priiriidona) Creatinina no soro humano BCR-573; 5 7 4 ; 5 7 5
Soro humano 909b Esferas de látex de tamanho certificado BCR-165; 166; 167
Piruvatü de sódio 910 (tamanho de célula sanguínea)
Colesterol 911b Painel de reterència do cortisol mnWIFCC-451
Uréia 912a Pnogesterona no soro humane BCR-347
Acido úrico 913a Estradiol no soro humano BCR-57G; 577; 578

Creatinina 911a Chumbo e cádmio no sangue BCR-194; 195; 196

Carbonato de cálcio 915a Creatinina quinase (placenta humana] BCR-299

Bilirrubina 916a Gama-glutamiltransíerase (rim de porco) BCR-319; IRRM/IFCC-452

D-gliccse (dextrose] 917b Fosfatase alcalina (rim de porco) BCR-371

Cloreto de potássio 918a Lactato desidrogenase (isoenzima BCR-404; IRRM/IFCC-453

Cloreto de sódio 919a humana)

D-manitcl 920 Fosfatase ácida prostática (próstata BCR-410

humana)
Cortisol (hidrocortisona) 921
Alanina aminotransterase (coração de BCR-426; IRRM/IFCC-454
Carbonato de lítio 924a
porco)
VMA (ácido 4-fiidroxi-3-metoximandélico) 925
a - a m i l a s e (pâncreas humano) BCB-476; IRRM/1FCG-456
Albumina sérica bovina 927c
Creatina quinase (coração humana) BCR-608; IRRIWIFCC-455
Nitrato de chumbo 928
Adenosina desaminase (eritrccitos BCR-647
Gluconato de magnésio (clínico) 929
humanas)
Ferro metálico (clínico) 937
Cortisol no soro humano BCR-192; 193
4-nitrofenol 938
Proteínas séricas BCR-470
Chumbo sanguíneo 955b
Hemoglobina glicada BCR-405
Eletrólitos no soro humano congelado 956a
Hemiglobinacianeto BCR-522
Glicose no soro humano congelado 965
Antigeno prostático específico BCR-613
Elementos tóxicos sanguíneos 966
Tromboplastinas BCR-148; 149S
Vitaminas lipossolúveis, carotenóides e colesterol 968c
Apolipoproteínas BCR-393; 3 9 4
no soro humano
Alfa-tetoproteína fiCR-486
Ácido ascórbico no som humano congelado 970
Tirecglcbulina BCR-457
Angictensina 1 (humana) 998
Cinza óssea 1.400 BCR, Bureau CommMTumtaire de Re/erence (Community Bureflii of ReJfereTtce);

Farinha óssea 1.486 IRMM, Institute for Re/erettce Materials and Meítsiíremertts; IFCC, Internationãl
Fedcratío n of Cimiítfl Ctamisfq
Metabólito de maconha na urina 1,507b
Benzoilecgonina (metabólito da cocaína] na urina 1.508b
Palmitina 1.595
PCBs, pesticidas e dicxína/turanos no soro humano 1.589c
Constituintes inorgânicos no soro bovino 1.598
Ensaio para niveis de drogas anticonvulsivantes 1.599
consistem em u m bulbo cilíndrico ligado nas duas extremidades
(ácido valpróico e carbamazepina)
por tubos de vidro mais estreitos. U m a marca de calibração é
Solução etanol-água 1.828
gravada ao redor do tubo de sucção superior, e o tubo de dispensa
Lipídios no soro humano congelado (liotilizado) 1.951a
inferior é prolongado até u m cone gradual. O calibre do orifício
Colesterol no soro humano Gongelado (liotilizado) 1.952a
de dispensa deve ser suficientemente estreito de tal forma que o
Ponto de fusão do gálio 1.968
rápido fluxo de líquido e a drenagem incompleta não causem
Drogas de abuso no cabelo humano I 2.379
erros de medição acima da tolerância especificada.
Drogas de abuso no cabelo humano II 2.380
U m a pipeta volumétrica de transferência (Figura 2-1, A) é
Gliouronídeo de morfina 2.382
calibrada para liberar exatamente u m volume fixo de uma solução
Aminoácidos/ácido tiidroclóricc 2.389
Metais tóxicos 2.670
aquosa diluída. A confiabilidade da calibração de uma pipeta
Fluoreto urinário (liotilizado] 2.671 a
volumétrica diminui com a diminuição do tamanho, e, portanto,
Mercúrio urinário (liotilizado) 2.672a
micropipetas especiais têm sido desenvolvidas.
Cotinina na urina humana (liotilizado) 8.444
As pipetas de Ostwald-Folin (Figura 2-1, B) são similares às
pipetas volumétricas, mas têm seu bulbo mais próximo da pon-
teira de dispensa e são usadas para a medição exata de fluidos
viscosos, tais como sangue ou soro. Ao contrário de u m a pipeta
Pipetas de Transferência e de Medição volumétrica, uma pipeta de Ostwald-Folin tem u m anel gravado
U m a pipeta de referência é projetada para transferir u m volume próximo ao bocal, indicando que é uma pipeta de escape. C o m
conhecido de líquido. As pipetas de medição e sorológicas são o uso de u m bulbo pipetador, o líquido é empurrado da pipeta
marcadas em unidades tais que qualquer volume, ao chegar na somente depois que o sangue ou o soro tenham drenado até a
capacidade máxima, é liberado. última gota na ponteira de dispensa. Q u a n d o cheia com fluidos
Pipetas de Transferência. As pipetas de transferência abrangem opacos tal como o sangue, deve-se observar a parte superior do
as pipetas volumétricas e as de Ostwald-Folin (Figura 2-1). Elas menisco. A drenagem lenta controlada é necessária com todas as
26 PARTE I Princípios Laboratoriais
n
SI
J
•20 * C
i[
20 X
mL 0
0 estão disponíveis para volumes tão baixos q u a n t o 0,2. pL.
V
C veis os dispositivos permitem a aspiração e a dispensa simultânea
Figura 2-1 Pipetas. A, Volumétrica (transferência) B, de OsCwald-
Folin (transferência). C, de M o h r (medição). D , Sorológica (graduada até
a ponteira).
soluções viscosas de tal forma que n e n h u m filme residual seja
deixado nas paredes da pipeta.
Pipetas de Medição. O segundo tipo principal de pipetas é a
pipeta graduada ou de medição (Figura 2-1, C). Ela é u m pedaço
de t u b o de vidro que é alongada até uma ponteira e graduada
u n i f o r m e m e n t e ao longo de seu c o m p r i m e n t o . Dois tipos estão
disponíveis. A pipeta de M o h r é calibrada entre duas marcas na
direção da ponteira. A pipeta sorológica (Figura 2-1, D) precisa
ser assoprada para liberar t o d o o volume da pipeta e tem um anel
gravado (ou u m par de anéis) próximo ao bulbo terminal da
pipeta, significando que é u m a pipeta de escape. As pipetas de
M o h r requerem u m a dispensa controlada da solução entre as
marcas de calibração. As pipetas sorológicas têm u m orifício
maior do que os das pipetas de M o h r e, portanto, d r e n a m mais
rapidamente. Na prática, as pipetas de medição são usadas prin-
cipalmente para a medição de reagentes e geralmente n ã o são
consideradas suficientemente exatas para a medição de amostras
e calibradores.
Técnica de Pipetagem
Existem técnicas gerais de pipetagem q u e se aplicam às pipetas
descritas a n t e r i o r m e n t e . Por exemplo, bulbos pipetadores devem
sempre ser usados e as pipetas devem ser seguradas n a posição
durante o ajuste do nível de líquido na linha de calibração e durante
a dispensa. A parte inferior d o menisco, q u a n d o é olhada n o
nível dos olhos, deve se: nivelada com a linha de calibração da
pipeta. O fluxo de líquido deve ser irrestrito n o uso de pipetas
volumétricas, e as ponteiras devem tocar a superfície inclinada
d o recipiente por 2 segundos após o líquido ter p a r a d o de
fluir.
C o m pipetas graduadas, o fluxo do líquido deve ser lento
d u r a n t e a dispensa. As pipetas sorológicas são calibradas em
direção à ponteira, e o anel gravado n o t o p o da pipeta significa
que ela é para ser assoprada. Primeiro permite-se que a pipeta
seja drenada, e então o líquido remanescente é assoprado.
Micropi petas
As micropipetas são pipetas usadas para a medição de volumes
em microlitro. Em tais dispositivos, o volume restante que reveste
a parede interna da pipeta causa u m erro notável. Por esta razão,
a maioria das micropipetas é calibrada para conter (TC) o volume
declarado, e não para dispensá-lo. O uso a d e q u a d o requer a
rinsagem da pipeta com a solução final após a dispensa dos
c o n t e ú d o s n o diluente. O s volumes são expressos em microlitros
(pL); o termo antigo lambda n ã o é mais r e c o m e n d a d o . (Um
lambda [Aj = í pL = 0,001 mL) As micropipetas geralmente estão
disponíveis em t a m a n h o s pequenos, de 1 a 5 0 0 pL, Elas t a m b é m
Pipetas e Dispensadores Automáticos e Semi-automáticos
A Figura 2-2, A e B ilustra dois tipos de dispositivos de micropi-
petagem ajustáveis que t a m b é m contêm características de projeto
ergonômico ímpar. Estes dispositivos são programáveis e são
usados para dispensar alíquotas de liquido s i m u l t a n e a m e n t e em
vários poços. Na práticaj usando-se ponteiras plásticas descartá-
em múltiplos micropoços. C a d a canal é impulsionado p o r
êmbolo e permite ao usuário pipetar com tantas ponteiras q u a n t o
necessárias. Alíquotas de líquidos tão pequenas q u a n t o 0,2 p L
são dispensadas em três diferentes velocidades de aspiração ou
dispensa.
As versões de pipetas e dispensadores semi-automáticos
manuais ou eletrônicos estão disponíveis em t a m a n h o s de 0,5 pL
a 10 mL. A Figura 2-2, C ilustra u m pipetador multicanal de
deslocamento positivo eletronicamente operado. Este dispositivo
aspira e dispensa seus volumes predefinidos (de 0,5 a 200 pL)
q u a n d o seu pistão é movido através de u m ciclo completo. Suas
ponteiras descartáveis são feitas de u m material plástico que
t e n d e a reter menos filme na superfície interna d o que o vidro.
Tais pipetas: (1) evitam o risco de c o n t a m i n a ç ã o cruzada entre as
amostras, (2) eliminam a necessidade de lavagem entre as amos-
tras e (3) melhoram a precisão das medidas. Modelos que permi-
tem O ajuste digital d o volume, aspirado p dispensado estão dis-
poníveis.
A Figura 2-3, A mostra u m aparelho de dispensa automático
que aspira e dispensa volumes pré-ajustados de dois diferentes
líquidos por meio de duas seringas impulsionadas por motor, uma
para medir o volume da amostra e outra para medir o volume do
diluente. E possível ajustar este dispositivo para aspirar tão pouco
q u a n t o 1 pL de u m líquido e dispensá-lo em até 999 p L de outro.
Este tipo de dispositivo, disponível como diluidor ou dispensador,
é adquirido na forma manual, eletrônica e de dispositivo contro-
lado p o r computador. O dispositivo é controlado por u m micro-
processador e é facilmente programado. Vinte e dois programas
de dispensação são armazenados na memória e recuperados. Este
tipo de dispositivo de dispensa de líquido está t a m b é m disponível
c o m o u m sistema controlado p o r computador.
U m e q u i p a m e n t o mais versátil é a estação robótica de traba-
lho dc manipulação de líquidos mostrada na Figura 2-3, B. Esta
estação de pipetagem automatizada é usada com tubos de reação
individuais e t a m b é m com placas de microtítulo de 96 e 3 8 4
poços. D e p e n d e n d o d o projeto do sistema, uma ou múltiplas
sondas são usadas r a p i d a m e n t e para transferir volumes de solução
programados de u m recipiente para as placas de microtítulo
(p. ex., de tal forma que a transferência para todos os 9 6 poços
esteja completa em 1 minuto). Em alguns sistemas, sensores de
líquido são incorporados nas sondas de amostras para minimizar
o contato da amostra e reagentes, m e s m o que a lavagem automa-
tizada das sondas seja feita entre exemplares. O m o v i m e n t o bidi-
mensional (X-Y) das sondas e tubos ou placas de microtítulo é
 introdução aos Princípios de Análise e Segurança Laboratorial CAPÍTULO 2 27

Figura 2 - 2 A, Dispositivo de micropipetagem de v o l u m e ajustável com projeto ergométrico. B , Dispositivo

de micropipetagem eletrônico de v o l u m e ajustável com projeto eTgnmérrico. C, Pipeta multicanal programável
eletrônica. (A, Cortesia Biohit Plc, B, Cortesia VistaLab Technologies, Inc C, Cortesia R a i n i n I n s t r i i m e n t L L C )

desenvolvido nas estações de pipetagem paia minimizar a neces-
sidade de intervenção do operador. Este dispositivo dispensa
volumes programados de 0,5 |J,La 1.000 jiL em diluições seriadas
de 4 a 16 canais empregando u m sistema autocarregado com
códigos de barra para a identificação positiva.
Frascos Volumétricos
O s frascos volumétricos (Figura 2-4) são usados para medir
volumes exatos; eles são c o m u m e n t e encontrados em t a m a n h o s
que variam de 1 a 4-000 mL. N a prática, eles são usados prima-
riamente n o preparo de soluções de concentração conhecida, e
estão disponíveis em vários graus. Os mais exatos são certificados
para satisfazer padrões publicados pelo NIST.
U m fator importante n o uso de u m utensílio volumétrico é
a necessidade de u m ajuste exato do menisco. U m p e q u e n o
cartão, que é m e t a d e branco e metade preto, é m u i t o útil. O
cartão é colocado 1 cm atrás do utensílio com a metade branca
para cima e a parte superior da área preta cerca de 1 m m abaixo
d o menisco- O menisco então aparece c o m o u m a linha preta fina
e claramente definida. Este cartão t a m b é m é útil na leitura do
menisco de uma bureta.
O e q u i p a m e n t o volumétrico deve ser usado com soluções
equilibradas na temperatura ambiente. As soluções diluídas em
frascos volumétricos precisam ser repetidamente misturadas
d u r a n t e a diluição de tal forma que os c o n t e ú d o s estejam homo-
gêneos antes que a solução seja elevada ao volume final. O s erros
causados pela expansão ou contração dos líquidos na mistura são,
p o r t a n t o , minimizados.
O s frascos volumétricos devem ser perfeitamente limpos e
secos antes da calibração. O frasco é então pesado e preenchido
com água deionizada, livre de dióxido de carbono, logo acima da
marca de graduação. O gargalo do frasco logo acima d o nível da
água deve ser m a n t i d o livre de água. A marca do menisco é
d e t e r m i n a d a na linha de graduação removendo-se o excesso de
água e o frasco é pesado novamente. O peso final é corrigido para
a água equilibrada na temperatura ambiente a fim de obter o
volume do frasco.
28 PARTE I Princípios Laboratoriais
Figura 2 - 3 A, Aparelho diluidor e/ou dispensador controlado por
PC que aspira e dispensa volumes pré-ajustados de um ou dois
diferentes líquidos, tais como o diluente e a amostra através de seringas
impulsionadas por motor. B, Estações de trabalho robóticas de
manipulação de líquidos. (A e B, Cortesia Hamilton Co.)
Figura 2-4 Fra*co» Volumetria» \ , Mu iu. ü> Mlcjo.
Centrifugação
C e n t r i f u g a ç ã o é o processo d e uso da força c e n t r í f u g a p a r a
separar a p o r ç ã o mais leve de u m a solução, m i s t u r a o u s u s p e n s ã o
das porções mais pesadas. U m a centrífuga é u m a p a r e l h o pelo q u a l
a c e n t r i f u g a ç ã o é realizada.
N o l a b o r a t ó r i o clínico, a c e n t r i f u g a ç ã o é usada para:
1. R e m o v e r e l e m e n t o s celulares d o sangue para p r o d u z i r plasma
ou s o r o livre d e células p a r a análise ( C a p í t u l o 3);
2. C o n c e n t r a r e l e m e n t o s celulares e o u t r o s c o m p o n e n t e s d e
f l u i d o s biológicos p a r a o e x a m e microscópico o u análise
química;
3. R e m o v e r p r o t e í n a p r e c i p i t a d a q u i m i c a m e n t e de u m exemplar
analítico;
4. Separar ligantes livres d a q u e l e s ligados a p r o t e í n a s o u anti-
c o r p o s e m i m u n o q u í m i c a o u o u t r o s ensaios ( C a p í t u l o 10);
5. Extrair solutos e m f l u i d o s biológicos d e solventes aquosos
p a r a orgânicos;
6. Separar os c o m p o n e n t e s lipídicos tais c o m o os q u i l o m í c r o n s
d e o u t r o s c o m p o n e n t e s d o p l a s m a o u soro, e u m a l i p o p r o t e í n a
da o u t r a ( C a p í t u l o 23).
Tipos de Centrífugas
O s tipos de centrífugas utilizadas n o l a b o r a t ó r i o clínico são de
cruzeta h o r i z o n t a l o u c a ç a m b a móvel, d e â n g u l o fixo ou d e cru-
zeta angular, u l t r a c e n t r í f u g a e axial. A l é m disso, o desenvolvi-
m e n t o d e centrífugas de b a l a n c e a m e n t o a u t o m á t i c o t e m permi-
t i d o q u e a c e n t r i f u g a ç ã o seja i n c o r p o r a d a c o m o u m a e t a p a inte-
gral na a u t o m a ç ã o total dos testes laboratoriais.
Princípios da Centrifugação
O t e r m o c o r r e t o p a r a descrever a força necessária p a r a separar
d u a s fases e m u m a c e n t r í f u g a é a força c e n t r í f u g a relativa (RCF),
t a m b é m c h a m a d o d e campo centrífugo relativo. As u n i d a d e s são
expressas c o m o n ú m e r o de vezes a gravidade (p. ex., 5 0 0 x g).
 Introdução aos Princípios ds Análise e Segurança Laboratorial
A R C F é calculada c o m o a seguir:
R C F = 1,118 x IO 5 x r x r p m 2
Onde
1,118 X 10^= u m fator empírico
r = raio em centímetros a partir do centro de rotação até a
parte inferior do tubo n a cavidade d o rotor ou na caçamba
d u r a n t e a centrifugação
r p m = a velocidade de rotação d o rotor em rotações por
minuto
A R C F de u m a centrífuga t a m b é m p o d e ser determinada a partir
de u m n o m o g r a m a distribuído pelos fabricantes de centrífugas.
A R C F é deduzida a partir da distância d o centro d o rotor até a
parte inferior d o tubo, se o t u b o é horizontal ou a u m ângulo
até o centro do rotor.
O tempo necessário para sedimentar partículas depende: (1)
da velocidade d o rotor, (2) do raio do rotor e (3) do c o m p r i m e n t o
do trajeto efetivo percorrido pelas partículas sedimentadas, que
é a p r o f u n d i d a d e d o líquido n o tubo. A duplicação das condições
de centrifugação é f r e q ü e n t e m e n t e desejável. A fórmula seguinte
é útil para calcular a velocidade necessária de u m rotor cujo raio
difere daquele que u m a R C F d e t e r m i n a d a foi originalmente defi-
nida:
r p m (rotor substituto)
— 1 ooox I R C F
' r Q t o r origma
^ taminação, necessitando-se da limpeza da câmara. Os vidros que-
\ 1 1 , 18 X r ( c m ) , rotor substituto
A duração de tempo para a centrifugação é calculada de tal forma
que a corrida com u m rotor substituto de u m t a m a n h o diferente
é equivalente à corrida com o rotor original:
t e m p o X R C F (rotor original)
t e m p o (rotur substituto) =
R C F (rotor substituto)
Note, entretanto, que p o d e n ã o ser possível reproduzir as condi-
ções exatamente q u a n d o u m a centrífuga diferente é usada. As
descrições dos tempos de centrifugação incluem o tempo para o
Totor atingir a velocidade de operação (a qual p o d e variar de
i n s t r u m e n t o para i n s t r u m e n t o ) e n ã o incluem o t e m p o de desa-
celeração, d u r a n t e o qual a sedimentação ainda está ocorrendo
embora menos eficientemente. M e s m o na frenagem máxima, a
desaceleração p o d e levar até 3 m i n u t o s em algumas centrífugas.
Operação da Centrífuga
Para a operação adequada de u m a centrífuga, somente aqueles
tubos recomendados pelo fabricante devem ser usados. O material
usado para o tubo precisa resistir à RCF a qual o tubo estará pro-
vavelmente submetido. Os tubos de polipropileno são geralmente
capazes de resistir a RCFs maiores do que 5.000 xg. Os tubos
precisam ter u m f u n d o cónico, particularmente se o sobrenadante
vir a ser Temovido, e devem ser de u m t a m a n h o que se ajuste
seguramente na estante o n d e será centrifugado. A parte superior
do tubo n ã o pode se projetar acima da caçamba para que o balanço
n u m a posição horizontal não seja impedido pelo rotor.
CAPÍTULO 2 29
Para u m a operação da centrífuga de forma suave, o rotor deve
ser balanceado adequadamente. O peso das estantes, dos tubos
e de outros conteúdos em lados opostos de u m rotor n ã o deve
diferir mais d o q u e 1% ou em u m limite estabelecido pelo fabri-
cante. Centrífugas que balanceiam automaticamente seus rotores
estão disponíveis atualmente.
Os tubos de sangue coletados devem ser centrifugados antes
de serem destampados para reduzir a probabilidade de u m aeros-
sol ser produzido q u a n d o o t u b o é aberto. A prática de se usar
u m aplicador de madeira para liberar u m coágulo aderido à parte
superior d o tubo ou à sua tampa deve ser evitada; esta é u m a
causa potencial de hemólise. A centrifugação em u m a R C F apro-
priada geralmente garante que o coágulo seja liberado da parede
d o tubo e e m p u r r a d o para o f u n d o .
Apesar de anos de experiência com centrífugas, existem
poucas recomendações específicas para RCFs ou tempo de cen-
trifugação para amostras de sangue. Por exemplo, a n o r m a H18-
A3 3 do CLSI propõe u m a R C F de 1.000 a 1.200 xg por 1 0 + 5
minutos. As n o r m a s n ã o foram estabelecidas para a centrifugação
de outras amostras, tais c o m o o soro ao qual u m a proteína pre-
cipitante t e n h a sido adicionada.
Prática de Operação
A limpeza de u m a centrífuga é i m p o r t a n t e para minimizar u m a
possível propagação de u m agente infeccioso, tais c o m o os vírus
da hepatite. C o m a operação a d e q u a d a da centrífuga, poucos
tubos se q u e b r a m . N o caso de quebra, as estantes e a câmara da
centrífuga precisam ser cuidadosamente limpas. Q u a l q u e r derra-
m a m e n t o deve ser considerado u m possível risco de patógenos
hematogênicos. O pó cinza q u e surge do jateamento da câmara
pelos fragmentos de vidro indica q u e b r a de tubo e possível con-
brados enterrados nos amortecedores dos recipientes de tubos
p o d e m ser uma causa contínua de quebra se estes n ã o forem
inspecionados e substituídos n o processo de limpeza.
A velocidade da centrífuga deve ser checada pelo m e n o s u m a
vez a cada 3 meses. A velocidade m e d i d a n ã o p o d e diferir mais
d o que 5 % da velocidade padronizada sob condições especifica-
das. Todas as velocidades nas quais a centrífuga é c o m u m e n t e
operada devem ser checadas. O tímer da centrífuga deve ser checado
semanalmente contra um tímer de referência (como um cronôme-
tro) e não p o d e ter mais d o que 10% de erro. Os comutadores e
as escovas devem ser checados pelo m e n o s a cada 3 meses. As
escovas ( q u a n d o usadas) devem ser substituídas q u a n d o parecem
consideravelmente gastas. Entretanto, em muitos dos motores de
indução modernos, as escovas f o r a m eliminadas, r e m o v e n d o
então uma fonte de p ó que causa falha n o motor.
C o m o as centrífugas geram calor, a temperatura n a câmara
em muitos modelos de centrífugas p o d e a u m e n t a r 5°C após u m a
única centrifugação. Q u a n d o o material a ser centrifugado apre-
senta uma temperatura lábil, u m a centrífuga refrigerada deve ser
usada. Na f o r m a mais simples, u m a u n i d a d e refrigeradora é
montada ao lado da centrífuga, e o ar frio é soprado para d e n t r o
da câmara do rotor. Esta técnica é n o r m a l m e n t e inadequada para
estabilizar a baixa temperatura. E m centrífugas mais sofisticadas,
a refrigeração em espiral em t o r n o da câmara torna possível
manter u m a temperatura pré-ajustada dentro de ± 1°C. A tempe-
ratura da centrífuga refrigerada p o d e ser m e d i d a m e n s a l m e n t e
sob condições reprodutíveis e deve variar até 2"C da temperatura
esperada.
Medição de Radioatividade
A rápida aceitação e o extenso uso de ímunoensaios não-isotópi-
cos pelo laboratório clínico têm resultado na diminuição do uso
30 PARTE 1 Princípios Laboratoriais

de r a d í o i m u n o e n s a i o s (RIAs) e, e n f i m , n a redução da necessi- moléculas provocam u m a série de d a n o s ; p o r t a n t o , emissores a

dade de medição de radioatividade. Em virtude dessa m e n o r
ênfase dada à necessidade de se m e d i r radioatividade) s o m e n t e
u m a breve discussão deste tópico será apresentada aqui.
Conceitos Básicos
U m átomo é a m e n o r u n i d a d e de u m e l e m e n t o t e n d o as proprie-
dades daquele elemento. U m á t o m o individual consiste em u m
n ú c l e o carregado positivamente ao r e d o r do qual giram elétrons
carregados negativamente. O núcleo é c o m p o s t o de p r ó t o n s car-
regados positivamente e n ê u t r o n s n e u t r o s . O número atômico (Z)
de u m elemento é o n ú m e r o de p r ó t o n s em seu núcleo; o n ú m e r o
total de núcleons, p r ó t o n s mais n ê u t r o n s , é seu n ú m e r o de massa
(A). U m nuclideo é u m a espécie atômica c o m u m d a d o n ú m e r o
atômico e u m d a d o n ú m e r o de massa. O s isótopos são nuclídeos
com o m e s m o n ú m e r o atômico, mas diferentes n ú m e r o s de
massa. Eles r e p r e s e n t a m várias espécies nucleares do m e s m o ele-
m e n t o . Os radionuclídeos de interesse clínico estão listados na
Tabela 2-8.
Decaimento Radioativo
O d e c a i m e n t o radioativo é u m a p r o p r i e d a d e de u m núcleo
a t ô m i c o e é evidência de instabilidade nuclear. A taxa de decai-
m e n t o n ã o é afetada pela t e m p e r a t u r a , pela pressão o u por qual-
q u e r outra condição química o u física, mas é característica de
cada r a d i o n u c l í d e o individual.
D6C3Íl7IBnt0 Alfa. Para alcançar configurações estáveis, os ele-
m e n t o s pesados, p a r t i c u l a r m e n t e aqueles c o m n ú m e r o s atômicos
acima de 70, p o d e m perder parte de sua massa nuclear e m i t i n d o
u m f r a g m e n t o de dois p r ó t o n s e dois n ê u t r o n s identificável, após
a emissão, c o m o u m núcleo de hélio. C o m o as radiações nucle-
ares f o r a m observadas antes q u e suas identidades fossem conhe-
cidas, este f r a g m e n t o foi c h a m a d o d e parzícula alfa (a-), e sua
emissão foi d e n o m i n a d a d e c a i m e n t o a . As partículas alfa são
relativamente grandes e m massa, interagem f o r t e m e n t e com a
matéria, mas são absorvidas p o r algo tão f i n o q u a n t o u m a folha
de papel. E n t r e t a n t o , por serem tão pesadas, m e s m o c o m baixa
velocidade, suas cinéticas são altas. C o n s e q ü e n t e m e n t e , elas n ã o
p e r c o r r e m longas distâncias, mas q u a n d o colidem c o m outras
são considerados a l t a m e n t e perigosos.
Decaimento Beta. Para alguns nuclídeos pesados e para a
maioria daqueles c o m n ú m e r o s atômicos abaixo de 60, a estabi-
lidade é conseguida pelo r e a r r a n j o do n ú c l e o n o qual o n ú m e r o
total de n ú c l e o n s está inalterado. Em termos d o m o d e l o nêutron-
p r ó t o n d o núcleo, este r e a r r a n j o é a conversão de u m n ê u t r o n
para u m p r ó t o n o u vice-versa. D u r a n t e tais conversões, o núcleo
emire u m elétron negativo o u seu equivalente positivo, u m pási-
tron. A emissão do elétron negativo, d e n o m i n a d o p a r t í c u l a beta
íp ), é n o r m a l m e n t e c o n h e c i d a pelo t e r m o decaimento p-,
A emissão de u m a partícula p negativa deixa o núcleo c o m
u m a carga positiva adicional, u m n ê u t r o n é convertido em u m
p r ó t o n e o núcleo assume o maior n ú m e r o atômico seguinte. A
emissão p- negativa é característica de u m núcleo q u e t e m mais
n ê u t r o n s d o q u e o exigido por seus p r ó t o n s para estabilidade.
Por exemplo, o trítio ( 3 H) é u m isótopo instável do hidrogênio,
consistindo e m u m p r ó t o n , u m elétron e dois n ê u t r o n s . Q u a n d o
u m á t o m o de trítio decai, u m dos n ê u t r o n s é convertido a u m
p r ó t o n , u m a partícula beta e u m n e u t r i n o são liberados e u m
isótopo de hélio { 3 He) p e r m a n e c e . O trítio é c o n h e c i d o c o m o
u m emissor (3- fraco, u m a vez q u e suas partículas p têm baixas
velocidades. U m emissOT p- forte tal c o m o o fósforo 32 ( 32 P) é mais
perigoso p o r q u e suas partículas p- carregam mais energia cinética;
entretanto, é mais fácil de detectaT.
O u t r o s exemplos de nuclídeos q u e decaem através da emissão
P' negativa são o carbono-14 ( 14 C), o ferro-59 ( 59 Fe) e o iodo 131
( l31 I). As partículas p negativamente carregadas são m e n o r e s e m
massa e interagem m e n o s c o m a matéria d o q u e as partículas 0-,
atravessando facilmente papel e papel-cartão, mas absorvidas p o r
folhas de metal.
Captura Eletrônica. U m processo de d e c a i m e n t o alternativo
para a emissão de partículas P positivas é a captura de u m elétron.
Neste processo, u m elétron orbital é "absorvido" pelo núcleo. O
efeito final na estrutura nuclear é o mesmo: u m p r ó t o n parece ter
se transformado em u m n ê u t r o n , o n ú m e r o atômico d i m i n u i em
Um e a massa atômica p e r m a n e c e a mesma. Por exemplo, o 125I
decai exclusivamente por captura eletrônica para telúrio 125.
Radiação Gama e Conversão Interna. A radiação gama é u m a
radiação eletromagnética de alta energia q u e se assemelha aos

TABELA 2-8 Propriedades da Radiação de Alguns Radionuclídeos Usados em Laboratório Clínico

EMERGIA MÁXIMA DA RADIAÇÃO ( M E V ) 1
Nuclídeos Meia-uida Tipo de D e c a i m e n t o * Bela Gama

H 3
12,3 anos P 0,186 Nenhuma
n c
5.730 anos P- 0,155 Nenhuma
32 p
14,3 dias P' 1.71 Nenhuma
87 dias P" D,167 Nenhuma
51
Cr 27,7 dias EC Nenhuma 0,320
57
Co 2 7 2 dias EC Nenhuma 0,122; 0 , 1 3 6 : 0 , 0 1 4
^Co 71 dias EC. p + 0,474 0 , 8 1 1 , s o m e n t e fátons de destruição
M
Fe 4 5 dias P" 0,475; 0 , 2 7 3 1,10; 1,29
afl
Mc 6 6 horas P 1,21; 0 , 4 5 0 0,740; 0,181; 0,778
S9m
Tc 6,0 horas IT Nenhuma 0,141
12S|
GO dias EC Nenhuma 0,035

P"
131 |
8,04 dias 0,607; 0 , 3 3 6 0,364; 0,637; 0,284

*P P', E C e I T SÉ referem d decãímento P~, decaimento (jósitron, captura eleirânica e Eransiçáo isomériai, respectivamente. Q u a n d o i conhecido que u m nuclideo tem mais do que u m
modo de decaimento, eles jãn listados n a ordem de sicas prevalências
energias são dadas somente porá as radiações p~ r y mais prevalentes e estão em ordem aproximada de prevalência. O decaimento par captura eletrônica ( E C ) também gera raios X
característicos dN núcleo filhe; as energias dos raios 'X nãa estão mcluldcls nesta iistafem. Como notado na coluna Y, o decaimento £ÓSÍ£TOTI (p") ê acompanhado pela radiação de destruição,
a qual consiste principalmente em u m par de fátons de 0 , 5 / 1 M.eV.
 Introdução aos Princípios de Análise e Segurança Lahoratorial
raios X. U m exemplo de emissor y é o ,31 I. U m a vez que os raios
y são fótons de alta energia, seu poder de penetração é muito
alto e mais difícil de proteger.
Atividade e Meia-vida
A taxa de decaimento de u m a fonte radioativa é chamada de sua
atividade e é simplesmente a taxa na qual os átomos originais
radioativos decaem a átomos filhos mais estáveis. Na prática, é
sempre conveniente descrever a taxa de decaimento em termos
da meia-vida ( t ^ ) , o tempo necessário para a atividade de u m
nuclideo diminuir à metade de seu valor inicial:
ln 2 0,693
,V2
~ I ~~T
O n d e X é a constante de decaimento característica de u m dado
nuclideo.
Esta equação é útil no planejamento de experimentos e na
dispensação de lixo radioativo. Paia a dispensação, a norma
prática é que o tempo de decaimento de 7 meias-vidas reduz a
atividade a menos d e 1% de seu valor original (2"7 = 1/128 =
0,78%) e após 10 meias-vidas, a menos de 0,1%.
Unidades de Radioatividade
O becqucrcl (Bq) é a unidade SI de radioatividade e é definida
como u m decaimento por segundo (dps). U m a vez que 1 Bq é
uma quantidade muito pequena de atividade, a atividade de
amostras químicas típicas é f r e q ü e n t e m e n t e expressa em quilobe-
cqueTéis (kBq). O cwrie (Ci) é a unidade mais antiga, a unidade
convencional, é definida como 3,7 x IO10 dps. U m curie equivale
a 37 gigabecqueréis (GBq). U m a vez que o becquerel é inconve-
nientemente p e q u e n o e o curie muito grande, eles são tipica-
mente usados como seus múltiplos ou submúlriplos, p. ex., mega-
becqueréis (MBq) e milicuiies (mCi). U m m C i equivale a 37
MBq.
Atividade Específica
O termo "atividade específica" tem vários significados. Pode
referir-se a: (1) radioatividade por unidade de massa de u m ele-
mento, (2) radioatividade por massa de composto marcado ou
(3) radioatividade por unidade de volume de uma solução. O
d e n o m i n a d o r de referência precisa ser especificado. Em termos
de radioarividade por u n i d a d e de massa, a atividade específica
máxima atingível para cada radionuclídeo é aquela para o radio-
nuclideo puro. Por exemplo, o 14 C puro tem uma atividade espe-
cífica de 62 C i / m o l ou 4.400 Ci/kg. C o m o normalmente dispo-
nível, o 14 C é u m traçador para compostos nos quais ele repre-
senta somente uma pequena fração do carbono total, cuja maior
parte é uma mistura de ocorrência natural de 12 C estável e 13 C
estável. Se não existe elemento estável presente, o radionuclídeo
é dito ser livre de portador (carrier free).
Detecção e Medida de Radioatividade
A auto-radiografia, a ionização gasosa e a cintilação fluorescente
são as bases para as técnicas usadas para detectar e medir a radio-
atividade no laboratório clínico.
Auto-radiografia. Na auto-radiografia u m a emulsão fotográfica
é usada para visualizar as moléculas marcadas com o elemento
radioativo. Por exemplo, esta técnica é usada para visualizar
ácidos nucléicos e fragmentos hibridizados com sondas de ácidos
nucléicos marcadas com 32 P (Capítulo 17). C o m tais técnicas, as
CAPÍTULO 2 31
sondas de ácidos nucléicos marcadas com 32 P radioativo são
incubadas com o ácido nucléico-alvo. Após a hibridização, a
hidrólise e a separação dos fragmentos por eletToforese e m gel,
u m filme fotográfico é aplicado ao gel coberto e incubado. Alter-
nativamente os fragmentos de ácidos nucléicos são transferidos
para uma membrana de náilon e o filme fotográfico é aplicado
à m e m b r a n a (Capítulo 6). Nos dois casos o filme é revelado com
a imagem resultante refletindo a radioatividade dos fragmentos
de ácidos nucléicos.
Detectores Preenchidos com Gás. Detectores preenchidos com
certos gases ou misturas de gases são feitos para capturar e medir
os íons produzidos pela radiação dentro do detector. O s detec-
tores preenchidos com gás usados para medir radioatividade
i n c l u e m : (1) a câmara de ionização, (2) o contador proporcional e (3)
o contador Geiger. No laboratório químico clínico, o contador
Geiger é usado como u m monitor de radiação poTtátil.
Contagem de Cintilação. N o processo de cintilação, a abs
da radiação produz u m / k s h de luz. Os tipos principais d e detec-
tores de cintilação encontrados n o laboratório químico clínico
são: o detector de cintilação de cristal de iodeto de sódio e o detector
de cintilação líquido orgânico. Devido à facilidade relativa de ope-
ração do detector de cristal e a economia de preparo da amostra,
a maioria dos procedimentos de laboratórios clínicos tem sido
desenvolvida para medir nuclídeos, tais como o 125I, os quais são
contados eficientemente em u m detector de cristal. U m detector
de cintilação liquida é usado para medir emissores P-puros, tais
c o m o o trítio e o 14 C.
D e te c to r d e Cintilação de Cristal. O detector de poço (freqüen-
t e m e n t e conhecido como u m contador y) é u m tipo c o m u m de
detector de cintilação de cristal e tem u m orifício p e r f u r a d o na
extremidade ou na lateral do cristal cilíndrico para Teceber u m
t u b o teste. Por ser higroscópico, o cristal é hermeticamente
lacrado em u m container de alumínio com uma janela de quartzo
transparente em uma extremidade através da qual as cintilações
azuis violetas (420 nm) são detectadas. Os fótons dos emissores
gama, tais como o s l Cr, o 57 Co, o 59 Fe, o I25I e o 1311 (Tabela 2-8)
na amostra facilmente penetram o tubo da amostra e o container
fino e de baixa densidade, e entram no cristal o n d e eles serão
provavelmente absorvidos n o iodeto de sódio espesso e de alta
densidade. U m contador de poço não é adequado para medir
radiação fi- poTque tal radiação não penetra no recipiente da
amostra e na camada de alumínio da parede.
D e te c to r de Cintilação Líquida. Este detector mede a radio-
atividade pelo registro de cintilações que ocorrem dentro de u m
frasco que contém a amostra desconhecida e o líquido d e cinti-
lação. C o m o o radionuclídeo está intimamente misturado ou
realmente dissolvido no líquido de cintilação, a técnica é ideal
para emissores (3-puros, como o J H , o 14 C e o "2P. As eficiências
típicas para a contagem por cintilação líquida sem perda de efi-
ciência de detecção {íjitónc/iing) significativa são de 6 0 % para o
trítio e de 9 0 % para o M C.
O líquido de cintilação é conhecido como coquetel de cintila-
ção e contém pelo menos dois componentes (o solvente primário
e o cintilador primário). O solvente primário é n o r m a l m e n t e u m
dos hidrocarbonetos aromáticos tais como o tolueno, o xileno
ou o pseudocumeno (1,2,4-trimetil benzeno). O cintilador primário
absorve a energia do solvente primário e a converte e m luz. O
material usual é o 2,5-difeniloxazol (PPO) usado em uma concen-
tração de 3 a 6 g/L. O P P O emite luz ultravioleta de 380 n m .
Além disso, outros componentes adicionados ao líquido cintila-
dor são: (1) u m solvente secundário para melhorar a solubilidade
de amostras aquosas, (2) u m surfactante para estabilizar o u emul-
sificar a amostra, (3) u m cintilador secundário, algumas vezes
c h a m a d o de deslocador de comprimento de onda, para absorver
32 PARTE I Princípios Laboratoriais
os f ó t o n s ultravioletas d o cintilador primário e reemitir a energia
em u m c o m p r i m e n t o de o n d a m a i s longo, o q u e facilita a res-
posta de alguns tubos fotomultiplicadores, e (4) u m ou mais
adjuvantes, tais c o m o agentes de suspensão, solubilizadores para
tecidos biológicos e anticongelantes, para prevenir o congela-
m e n t o e a separação da água e m baixas temperaturas.
A descrição de o u t r o s c o m p o n e n t e s de u m c o n t a d o r de cin-
tilação e a discussão de tópicos relevante é e n c o n t r a d a n a edição
anterior deste livro texto. 15
Gravimetria
Massa é u m a p r o p r i e d a d e invariável da matéria. A gravimetria é
o processo u s a d o para m e d i r a massa de u m a substância. O peso
é u m a f u n ç ã o da massa sob a i n f l u ê n c i a da gravidade, u m a
relação expressa por:
Peso = massa x gravidade
Duas substâncias de igual peso e sujeitas a m e s m a força gravita-
cional têm massas iguais. A d e t e r m i n a ç ã o da massa é feita usando-
se u m a balança para c o m p a r a r a massa de u m a desconhecida com
aquela de u m a massa conhecida. Esta comparação é d e n o m i n a d a
pesagem, e os padrões absolutos c o m os quais as massas são com-
paradas são d e n o m i n a d o s pesos. N a prática, os teTmos nmssa e
peso são usados c o m o s i n ô n i m o s .
A forma clássica de u m a balança é u m travessão equilibrado
em u m sustentáculo com gume de ágata, com u m prato suspenso
em cada extremidade do travessão e u m ponteiro mclinado-se do
travessão até o p o n t o de equilíbrio. C o m o objeto a seT pesado em
u m prato e pesos de igual massa n o outro prato, o ponteiro pára
n u m equilíbrio ou p o n t o de balanço entre os extremos do caminho.
O peso necessário para atingir o equilíbrio é, portanto, igual ao
peso da substância q u e está s e n d o pesada.
Princípios de Pesagem
Na prática, dois m o d o s de pesagem são usados: (1) pesos analíti-
cos são adicionados para se e q u i p a r a r e m ao peso d o objeto a ser
p e s a d o ou (2) o material a ser p e s a d o é a d i c i o n a d o a u m prato
de balança para atingir o equilíbrio c o m u m peso presente. Este
s egundo m o d o é usado mais c o r a u m e n t e e m laboratórios clíni-
cos, o n d e a principal necessidade é pesar u m a q u a n t i d a d e fixa
de u m p r o d u t o q u í m i c o de tal f o r m a q u e u m calibrador ou u m a
solução reagente de concentração c o n h e c i d a possa ser preparada.
A n t e s da pesagem de u m a amostra de u m p r o d u t o químico, o
peso d o recipiente precisa ser d e t e r m i n a d o para subseqüente-
m e n t e permitir a subtração d o peso d o recipiente do peso h r u t o
do recipiente mais a amostra para se obter o peso real da amostra.
Isto é c h a m a d o de "tara". Q u a n d o a tara é impraticável, o peso
d o recipiente vazio precisa ser s u b t r a í d o d o peso c o m b i n a d o d o
recipiente e do material para se obter o peso do material
sozinho.
Tipos de Balanças
Balanças com u m o u dois pratos e eletrônicas são freqüente-
m e n t e usadas n o laboratório clínico.
Balança de Dois Pratos
IJma balança c o m dois pratos c o n f o r m e o m o d e l o clássico, con-
sistindo e m u m ú n i c o travessão c o m dois braços de c o m p r i m e n -
tos iguais. Pesos-padrão são n o r m a l m e n t e adicionados manual-
m e n t e ao prato d o lado direito para contrabalançar o peso d o
objeto n o o u t r o lado, mas, em alguns modelos, u m indicador ou
calibrador c o m corrente é usado para fazer ajustes finos à massa
associada ao p r a t o do lado direito. N a s balanças de prato único, os
braços são de c o m p r i m e n t o s diferentes. O objeto a ser pesado é
colocado sobre o prato a n e x a d o ao b r a ç o mais curto. U m a força
de restauração é aplicada m e c a n i c a m e n t e o u e le t r o n i c a m e n t e ao
o u t r o braço para retornar o travessão a sua posição nula. Balanças
c o m dois o u três travessões são f o r m a s de balanças de braços
des iguais.
Balança de Prato Único
A balança de p r a t o ú n i c o é u m a balança c o m u m e n t e usada n o
laboratório clinico. Ela é mais f r e q ü e n t e m e n t e operada eletroni-
c a m e n t e e de a u t o b a l a n c e a m e n t o . Tal balança p o d e estar aco-
plada d i r e t a m e n t e a u m c o m p u t a d o r o u a u m dispositivo de
registro. N u m a balança de prato ú n ic o , u m carregamento n o
prato faz o travessão inclinar-se para baixo. U m detector nulo
percebe a posição d o travessão e indica q u a n d o o travessão
desviou do p o n t o de equilíbrio.
Balança Eletrônica
Em u m a balança eletrônica, u m a força eletromagnética é aplicada
para restituir o travessão para sua posição nula. Esta força é
proporcional a o peso do prato. A maioria das balanças eletrôni-
cas tem u m dispositivo e m b u t i d o para a taTa, de tal f o r m a q u e a
massa do recipiente é facilmente s u b t r a í d a da massa total medida.
Além disso, e m muitas balanças m o d e r n a s , u m c o m p u t a d o r
e m b u t i d o c o m p e n s a as m u d a n ç a s na t e m p e r a t u r a e p r o p o r c i o n a
o rastreamento do 2ero a u t o m á t i c o e a calibração.
Pesos Analíticos
O s pesos analíticos são usados para contrabalançar o peso de
objetos pesados em balanças de dois pratos e para verificar o
d e s e m p e n h o de balanças de u m e dois pratos. O N I S T reconhece
cinco classes de pesos analíticos. O s pesos classe S são usados para
a calibração de balanças. N o laboratório clínico, as balanças
devem ser calibradas pelo menos m e n s a l m e n t e e antes da condu-
ção de trabalho analítico m u i t o acurado. Estes pesos são feitos
tipicamente de latão ou de aço inoxidável e são envernizados o u
blindados para a proteção. Os pesos fracionais de u m c o n j u n t o
de padrões classe S são n o r m a l m e n t e feitos de platina ou alumí-
nio. As tolerâncias de diferentes pesos f o r a m definidas pelo NIST.
Para pesos classe S de 1 a 5 g, a tolerância é ±0,054 mg; de 100 a
500 mg, ela é ±0,025 mg; e de I a 50 mg, ela é ±0,014 mg.
Termometria
N o laboratório q u í m i c o clínico, as m e d i d a s de temperatura são
feitas p r i m a r i a m e n t e para verificar q u e aparelhos estão d e n t r o de
seus limites de t e m p e r a t u r a prescritos. O s banhos-maria ou as
células aquecedoras o n d e as reações são realizadas são exemplos
de tais aparelhos, assim c o m o os refrigeradores, cujas temperatu-
ras precisam ser m e d i d a s e registradas d i a r i a m e n t e para satisfazer
as exigências reguladoras do laboratório.
Os dois tipos mais populares de t e r m ô m e t r o s n o laboratório
q u í m i c o são os t e r m ô m e t r o s de líquido em vidro e as sondas
termistor.
Todos os t e r m ô m e t r o s devem ser verificados contra u m ter-
m ô m e t r o certificado antes de serem colocados e m uso. Por exem-
pla, o N I S T S R M 934 é u m t e r m ô m e t r o de mercúrio em vidro
c o m p o n t o s de calibração a 0 C , 25 C , 3 0 C e 37 C. Alguns
fabricantes f o r n e c e m t e r m ô m e t r o s de líquido e m vidro q u e têm
faixas maiores d o q u e o t e r m ô m e t r o S R M e q u e são calibrados
c o m os t e r m ô m e t r o s NIST. O s detalhes d a verificação da calibra-
ção de u m t e r m ô m e t r o têm sido descritos. 7 O N I S T t a m b é m
fornece vários materiais que f u n d e m em temperaturas conheci-
das, c o m o o gálio (SRM 1968), que f u n d e a 29,7723 C , e o
r u b í d i o (SRM 1969), q u e f u n d e a 39,3 C .
 Introdução aos Princípios de Análise e Segurança Laboratorial CAPÍTULO 2 33

Verificação da Concentração de Ion Esta derivação d e m o n s t r a que o p H d o sistema é determi-

Hidrogênio
N o laboratório, a concentração de íon hidrogênio é verificada
com tampões. O s t a m p õ e s são definidos c o m o substâncias que
resistem a m u d a n ç a s n o p H de u m sistema- Todos os ácidos ou
bases fracos, na presença de seus sais, f o r m a m sistemas tampões.
A ação de tampões e seu papel na m a n u t e n ç ã o do p H de u m a
solução são explicados com a ajuda da equação de Henderson-
Hasselbach, que é derivada c o m o a seguir.
Q u i m i c a m e n t e , a ionização de u m ácido fraco, H A , e de u m
sal daquele ácido, BA, é representada como:
n a d o pela pK;i d o ácido e pela proporção de [A ] para [HA]. O
tampão tem sua maior capacidade t a m p o n a n t e no seu pK 3 , que
é o p H n o qual a [A~] = [HA].
A capacidade d o campão d i m i n u i com o desvio da proporção
de 1. Em geral, os tampões n ã o devem ser usados em u m p H
maior d o que 1 u n i d a d e de seus pK a . Se a proporção é além de
5 0 / 1 ou 1 / 5 0 , considera-se que o sistema perdeu sua capacidade
tamponante. Este p o n t o é a p r o x i m a d a m e n t e 1,7 unidades acima
e abaixo do pK a d o ácido p o r q u e
p H = pK a ± 1,7

HA 4 H + + A~ Procedimentos para o Processamento de

-*

Soluções
BA B+ + A " Vários procedimentos são rotineiramente usados para processar
soluções n o laboratório clínico, inclusive aqueles para diluição,
A constante de dissociação para u m ácido fraco (KJ pode ser concentração e filtragem de soluções.
calculada a partir da seguinte equação:
Diluição
Diluição é o processo através d o qual a concentração ou atividade
K, - de u m a dada solução é d i m i n u í d a pela adição de u m solvente.
[HA] N a prática laboratorial, a maioria das diluições é feita transfe-
rindo-se u m volume exato de u m a solução concentrada para u m
Então frasco apropriado e então adicionando-se água ou outro diluente
até o volume necessário, m i s t u r a n d o apropriadamente para
garantir a h o m o g e n e i d a d e . U m a diluição seriada é o c o n j u n t o
[HA]
[H4]= K, x seqüencial de diluições em seqüência matemática. U m a dada
[ A " ] solução é expressa como a quantidade, em volume ou peso, de
u m soluto (analito) em u m volume específico. Por exemplo, uma
OU diluição 1:5 volume a volume (vol/vol) c o n t é m u m volume em
u m total de cinco volumes (um volume mais quatro volumes).
Para evitar erros que surgem q u a n d o dois líquidos de com-
[HA]
l o g [ H + ] = l o g Ka + l o g posições m u i t o diferentes são misturados, a técnica de diluição
ao volume é usada. Em vez de se adicionar 90 m L de água a
10 m L de solução concentrada, os 10 m L de solução concentrada
o n d e os colchetes indicam a concentração d o composto d e n t r o devem ser pipetados em u m frasco volumétrico de 100 mL. A
deles. Agora multiplicando-se por - 1 ; água é adicionada elevando o volume até a marca de 100 m L
n o gargalo do frasco.
Q u a n d o se efetua u m a diluição, a equação seguinte é usada
- l o g [ H + ] - - l o g Ka - l o g p ^ j para determinar o volume (V2) necessário para diluir u m d a d o
L A
J volume (Vj) de solução de u m a concentração conhecida (Ci) até
a concentração mais baixa desejada (C 2 ):
Por definição, p H = -log[H + ] e pK a = -log[KJ, p o r t a n t o
Cj x V j = C 2 X V 2

= fK + log
K]
[HA]

V2 = C, x X
Esta equação é conhecida c o m o a equação de Henderson-Has-
selbach. C o m o A" é derivada principalmente d o sal, a equação
t a m b é m é escrita como:
D o m e s m o modo, a equação t a m b é m é usada para calcular
a concentração da solução diluida q u a n d o u m d a d o volume é
[sal] adicionado à solução inicial.
pH = pK a + log
\[áciâo não dissociado]
Evaporação
Evaporação é u m processo usado para converter u m liquido ou
ou simplesmente:
u m sólido volátil em vapor. Ela é usada n o laboratório clínico
| [sal] para remover liquido de u m a amostra e dessa maneira a u m e n t a r
= pK a + l o g as concentrações de analito(s) que permanece(m).
|íácido]
Liofilização
o n d e [sal] = [A ] = concentração do sal dissociado e [ácidoj = [HA] Liofilização (também conhecida c o m o "desidratação por coiige-
= concentração d o sal não dissociado. lamento") é usada na medicina de laboratório para o preparo de
34 PARTE I Princípios Laboratoriais
(1) calibradores, (2) materiais de controle, (3) reagentes e (4)
amostras individuais para análise. Primeiro, a liofilização requer
o congelamento de u m material a "40°C ou menos e depois
submete-o a u m alto vácuo. As temperaturas m u i t o baixas causam
a sublimação do gelo a um estado de vapor. O material sólido
n ã o sublimado permanece em u m estado seco.
Filtração
A filtração é definida c o m o a passagem de u m líquido através de
u m filtro e é efetuada pela gravidade, pressão ou vácuo. O filtrado
é o líquido que passa através do filtro. O propósito da filtração é
remover material particulado do líquido. Muitas filtrações no
laboratório clinico são realizadas com papel de filtro e com membra-
nas plásticas de t a m a n h o de p o r o controlado.
O s filtros de m e m b r a n a são usados (1) sob vácuo, (2) com
pressão positiva ou (3) com gravidade. O s filtros têm sido incor-
porados em certas ponteiras descartáveis para o uso em pipetas
semi-automáticas. Estes filtros minimizam a troca de gotas de
aerossol entre as ponteiras e a pipeta. Isto é de grande importân-
cia para a amplificação de D N A e procedimentos microbiológi-
cos. O u t r o s filtros de m e m b r a n a são projetados para a ultrafiltra-
ção e estão disponíveis em u m a variedade de t a m a n h o s de poros
para filtração seletiva. Ultrafiltração é a técnica para a remoção de
partículas dissolvidas com o uso de u m filtro extremamente fino.
Ela é usada para concentrar macromoléculas, tais c o m o proteí-
nas, p o r q u e moléculas menores dissolvidas passam através do
filtro.
SEGURANÇA
Nos Estados Unidos, o A t o de Saúde e Segurança Ocupacional
Federal de 1970 foi o início da vigilância reguladora formal da
segurança de empregados. Desde 1970 a Occupntional Safety and
Health A d m i n i s t r a t i o n (OSHA) e o Centers for Disease C o n t r o l
and Prevention ( C D C ) têm publicado numerosas n o r m a s de
segurança que se aplicam aos laboratórios clínicos. A cada a n o
que a Joint C o m m i s s i o n o n Accreditation of Healthcare Organi-
zations (JCAHO) e o College of A m e r i c a n Pathologists (CAP)
revisam suas diretrizes, mais atenção é devotada à segurança. As
deliberações para a saúde e responsabilidade pela segurança dos
empregados são agora aceitas c o m o obrigações de todos os empre-
gados e diretores de laboratórios. E m maio de 1988, a O S H A
expandiu o Hazard C o m m u n i c a t i o n Standard para a aplicação a
trabalhadores de hospitais. Parte destas n o r m a s é f r e q ü e n t e m e n t e
referida c o m o a "Lab Right to Know Standard".
Existem vários aspectos para a operação segura de u m labo-
ratório clínico. O s elementos-chave para segurança n o laborató-
rio clínico incluem:
1. U m programa de segurança formal;
2. Orientações d o c u m e n t a d a s e uso efetivo de planos delegados
e / o u programas nas áreas d e higiene química, controle de
exposição a patógenos hematogênicos, controle de tubercu-
lose e e r g o n o m i a ;
3. Identificação de riscos ocupacionais significantes, c o m o bio-
lógicos, químicos, fogo e riscos elétricos, e orientações clara-
m e n t e identificadas e d o c u m e n t a d a s para os empregados
lidarem com cada tipo de risca (p. ex., e m p a c o t a m e n t o e
remessa de amostras diagnosticas e substâncias infecciosas);
4. R e c o n h e c i m e n t o de que existem áreas de interesse e m segu-
rança relevantes e importantes. Estas áreas incluem o m a n e j o
efetivo de resíduos e planos de resposta ao bioterrorismo e
terrorismo químico n o caso de ameaças ou acidentes envol-
v e n d o estes tipos de agentes
Programa de Segurança
Todo laboratório clínico deve ter u m programa de segurança
formal ampln e efetivo. I n d e p e n d e n t e m e n t e do t a m a n h o d o labo-
ratório clínico, deve-se designar u m individuo específico como o
"Oficial de Segurança" ou "Presidente d o C o m i t ê de Segurança"
e dar a ele a responsabilidade d e implementar e m a n t e r u m
programa de segurança. A segurança é responsabilidade de cada
empregado, mas a responsabilidade pelo programa como u m
t o d o se inicia com a chefia d o laboratório (diretores, diretores
administrativos, supervisores, gerentes etc.) e é delegada através
da chefia ao oficial de segurança o u ao comitê de segurança. Este
indivíduo ou comitê, então, tem a obrigação de prover as orien-
tações à chefia do laboratório em relação a assuntos relacionados
à provisão de u m local seguro de trabalho para todos os empre-
gados. E m b o r a uma instituição p e q u e n a precise ter u m indivíduo
que lide com todos os assuntos relacionados à segurança para
todos os departamentos, inclusive o laboratório, a O S H A ordena
q u e o laboratório tenha especificamente u m oficial de higiene
química que é designado com base em t r e i n a m e n t o ou experiên-
cia para prover orientação técnica n o desenvolvimento do p l a n o
de higiene q u í m i c a (CHP) discutido posteriormente.
U m a parte integral d o programa de segurança do laboratório
é a educação e a motivação de todos os empregados d o laborató-
rio em todos os assuntos relacionados à segurança. A todos os
novos empregados deve ser dada u m a cópia do m a n u a l geral de
segurança d o laboratório c o m o parte de suas orientações. O pro-
grama de educação continuada d o laboratório deve incluir pales-
tras periódicas sobre segurança. Vários recursos audiovisuais estão
disponíveis a partir de uma variedade de fontes para auxiliar na
parte de educação continuada do programa de segurança. 4 , e
U m a o u t r a parte i m p o r t a n t e d o programa de segurança do
laboratório diz respeito à garantia de que o ambiente d o labora-
tório satisfaz os padrões de segurança aceitos. Este esforço inclui-
ria, mas n ã o se limitaria à atenção para itens tais como: (1)
rótulos apropriados dos produtos químicos, (2) tipos e localiza-
ções dos extintores de incêndio, (3) capelas em boas condições
de trabalho, (4) aterramento adequado de e q u i p a m e n t o s elétri-
cos, (5) questões ergonômicas (as quais incluem equipamento,
tais c o m o dispositivos de pipetagem, mobília de laboratório e a
prevenção de desordens musculoesqueléticas) 1 2 e (6) meios de
manipulação e descarte apropriados dos materiais biologicamente
perigosos, incluindo as amostras de todos os pacientes. 5
Equipamento de Segurança
A O S H A requer que as instituições forneçam a seus empregados
todos os e q u i p a m e n t o s de proteção pessoal (PPE) necessários.
I m p o r t a n t e s itens-chave de segurança são: (1) vestimentas (tais
c o m o jalecos e guarda-pós), (2) luvas e (3) proteção para os olhos.
Estes itens de segurança devem ser usados em áreas o n d e são
apropriados. Lavadores de olhos e de face devem estar disponíveis
em todos os laboratórios químicos. Muitos tipos estão disponí-
veis e alguns simplesmente se c o n e c t a m a e n c a n a m e n t o s existen-
tes. U m sfmry de segurança para olhos e / o u face à m ã o é u m
dispositivo de segurança necessário e é colocado n o r m a l m e n t e
próximo a cada pia, o c u p a n d o s o m e n t e poucos centímetros de
espaço. Chuveiros de segurança localizados estrategicamente n o
laboratório devem estar disponíveis e devem ser testados regular-
mente.
Luvas resistentes ao calor (não-asbesto) devem estar disponíveis
para manipulação de vidro quente e de gelo seco. Óculos de pro-
teção, óculos e visores de segurança, inclusive aqueles que se
ajustam convenientemente sobre óculos comuns, estão disponíveis
em vários tamanhos e formatos. Os funcionários que usam lentes
de contato devem ser advertidos do risco de substâncias irritantes
 Introdução aos Princípios de Análise e Segurança Laboratorial
sob as lentes, pois estas dificultam a irrigação adequada do olho.
Proteções à prova de estilhaçamento devem ser usadas em frente a
sistemas que apresentam u m risco potencial devido à implosão
(colapso por vácuo) ou explosões de pressão. Protetores de desseca-
dores devem ser usados em dessecadores a vácuo. Os béqueres
quentes devem ser manuseados com pinças. Bombas de polietileno
de baixo custo estão disponíveis para bombear ácidos de frascos
grandes. Equipamentos para despejo de ácidos, materiais cáusticos
ou solventes inflamáveis existem em vários tamanhos. Tais equipa-
mentos e outros materiais de segurança devem estar localizados em
locais convenientes e apropriados no laboratório.
U m a capela de exaustão é necessária para rodo laboratório
químico clínico. A capela de exaustão é o único lugar seguro para:
(1) abrir u m recipiente de u m material que desprende vapores
nocivos, (2) preparar reagentes que produzem fumaça e (3)
aquecer solventes inflamáveis. Em caso de u m a explosão ou fogo
na capela, o fechamento de sua janela controla o fogo.
Inspeções de Segurança
É uma boa prática de laboratório organizar uma equipe de ins-
peção de segurança entre o pessoal do laboratório. Esta equipe
é, então, responsável pela condução periódica e programada de
inspeções do laboratório. 6
Nos Estados U n i d o s existem várias organizações reguladoras
privadas autorizadas, estaduais e federais que podem conduzir
uma inspeção de segurança do laboratório Algumas destas ins-
peções de segurança podem ocorrer sem aviso. A partir de uma
perspectiva externa, os inspetores da O S H A têm a autoridade de
entrar em um laboratório clínico sem aviso e, apresentando suas
credenciais, inspecioná-lo. A inspeção pode ser de rotina ou
como resultado de uma queixa. Além disso, a Comissão de Ins-
peção e Autorização do CAP inspeciona laboratórios clínicos e
usa várias listas de checagem de segurança (disponíveis ao labo-
ratório antes da inspeção) na avaliação de u m laboratório para
aprovação. Embora a J C A H O vá aceitar uma autorização de u m
laboratório pelo CAP, ela pode ainda conduzir u m a inspeção de
segurança do laboratório q u a n d o inspecionar o hospital. A
J C A H O e o CAP conduzem suas inspeções de aprovação, as
quais p o d e m incluir o laboratório completo ou o componente
de segurança do laboratório, sem aviso.
D e p e n d e n d o do grupo responsável designado para aprovação
de um laboratório particular, laboratórios selecionados podem
ser submetidos a inspeções com propósito de aprovação e / o u
segurança somente pelas agências estatais ou grupos Center for
Medicate and Medicaid Services (CMS) locais. As inspeções
também p o d e m ser feitas regularmente pelos departamentos de
saúde local ou estadual ou pelo departamento de incêndio local
para determinar a conformidade com suas exigências de segu-
rança. Geralmente u m laboratório que satisfaz as exigências da
O S H A estadual ou federal provavelmente irá satisfazer as normas
de qualquer outra agência de inspeção.
Planos Delegados
Em 1991 a O S H A ordenou que todos os laboratórios clínicos
nos Estados Unidos tivessem u m C H P e um plano de controle
de exposição. A O S H A tinha, então, atualizado suas exigências
para o plano de controle de exposição para estabelecer novos
exemplos de controles de manejo e colocar responsabilidades
significativamente maiores nos empregadores para minimizar e
gerenciar a exposição ocupacional dos empregados a patógenos
hematogênicos. 14 O C A P e outros grupos exigem que um labora-
tório autorizado renha plano de controle de exposição à tubercu-
lose d o c u m e n t a d o de acordo com as diretrizes de biossegurança
publicadas pelo C D C / A l é m disso, atualmente, é reconhecido
CAPÍTULO 2 35
que o ambiente do local de trabalho expõe os empregados ao
risco ocupacional de desenvolver várias desordens musculoesque-
Iéticas. C o m o resultado, o foco da O S H A em laboratórios com
um programa ergonômico efetivo tem levado grupos de aprova-
ção federal, estaduais e privados a tratar desta área de segurança
ocupacional. Tem havido, entretanto, considerável controvérsia
sobre este assunto com uma regra final de ergonomia publicada
e, então, revogada em 2001. 9
Plano de Higiene Química
Os principais elementos de u m C H P incluem a listagem de
responsabilidades para empregadores e empregados e u m oficial
de higiene química. Também, cada laboratório precisa ter um
inventário químico completo que é atualizado anualmente.
U m a cópia da Ficha de I n f o r m a ç ã o de Segurança de P r o d u t o
(MSDS), a qual define cada composto químico como tóxico,
carcinogênico ou perigoso, precisa ser arquivada e p r o n t a m e n t e
acessível a todos os empregados 24 horas p o r dia, sete dias por
semana. A M S D S contém informações importantes para o
benefício dos empregados do laboratório. A informação do
fabricante da substância química, como fornecida na MSDS, é
usada para averiguar se certa substância química é perigosa
Cada MSDS precisa fornecer a identidade do p r o d u t o como ela
aparece no rótulo do frasco e o composto químico e nomes
comuns de seus componentes nocivos. A MSDS t a m b é m fornece
dados físicos sobre o produto, tais como o p o n t o de ebulição, a
pressão de vapor e a gravidade específica. As características facil-
mente reconhecidas do p r o d u t o químico t a m b é m estão listadas
n o item "aparência e odor". As informações sobre propriedades
nocivas são dadas em detalhes n a MSDS; elas incluem dados
sobre o risco de fogo e explosão e dados relacionados à saúde,
incluindo o valor limite limiar (TLV), os limites de exposição e
os valores de toxicidade. O TLV é a exposição permissível para
um empregado durante 8 horas por dia. A M S D s também
aponta os efeitos de superexposição e fornece informações sobre
os procedimentos de primeiros socorros e de d e r r a m a m e n t o e
descarte, e sobre equipamentos de proteção pessoal e os requisi-
tos dos equipamentos.
Plano de Controle de Exposição
Os regulamentos da O S H A exigem que cada laboratório desen-
volva, implemente e adira a um plano que garanta a proteção dos
trabalhadores de laboratório contra a exposição potencial a pató-
genos hematogênicos 4 f 5 e garanta que os resíduos médicos produ-
zidos pelo laboratório sejam gerenciados e manipulados de uma
maneira segura e efetiva. 5,6 Os regulamentos da O S H A também
colocam a responsabilidade nos empregados para implementar
novos desenvolvimentos na tecnologia de controle da exposição,
para solicitar sugestões dos empregados diretamente envolvidos
n o cuidado d o paciente na identificação, avaliação e seleção
deste controles de prática de trabalho e, em alguns casos, manter
um registro para injúrias percutâneas dos empregados com dis-
positivos afiados, tais como agulhas de seringas. 14 Em termos da
organização, o plano deve incluir seções sobre: (1) propósito, (2)
finalidade, (3) referências aplicáveis, (4) definições aplicáveis, (5)
definição das responsabilidades e (6) etapas detalhadas de pro-
cedimento.
Na implementação do plano, cada empregado do laboratório
precisa ser colocado em u m dos três grupos. As crês classificações
são feitas como a seguir:
Grupo I: U m a classificação de emprego na qual todos os empre-
gados têm exposição ocupacional a sangue ou outros mate-
riais potencialmente infecciosos.
36 PARTE I Princípios Laboratoriais

Grupo II: U m a classificação de emprego na q u a l alguns empre-
gados t ê m exposição o c u p a c i o n a l a sangue o u o u t r o s mate-
riais p o t e n c i a l m e n t e infecciosos.
Grupo III: U m a classificação de emprego n a q u a l os empregados
n ã o t ê m qualquer exposição o c u p a c i o n a l a sangue o u outros
materiais p o t e n c i a l m e n t e infecciosos.
Plano de Controle da Tuberculose
O p r o p ó s i t o d o p l a n o de c o n t r o l e da tuberculose é p r e v e n i r a
transmissão da tuberculose (TB), a q u a l ocorre q u a n d o u m i n d i -
v í d u o inala u m a gotícula que c o n t é m M.ycobacterium tuberculosis.
M . tubérculos is se propaga e m aerossol q u a n d o u m i n d i v í d u o
i n f e c t a d o espirra, fala o u tosse. A transmissão e a exposição à T B
são f o r t e m e n t e d i m i n u í d a s c o m : ( I ) a i d e n t i f i c a ç ã o precoce e o
i s o l a m e n t o de pacientes e m risco, (2) controles ambientais, (3)
uso a p r o p r i a d o de e q u i p a m e n t o de proteção respiratório, (4)
educação dos empregados d o l a b o r a t ó r i o e (5) i n í c i o precoce de
terapia.
U m p l a n o de c o n t r o l e da tuberculose efetivo i n c l u i r á a deter-
m i n a ç ã o da exposição e m intervalos regulares para todos os
empregados que estão e m risco o c u p a c i o n a l . Os controles de
m a n e j o e práticas de t r a b a l h o são p a r t i c u l a r m e n t e i m p o r t a n t e s
nas áreas d o l a b o r a t ó r i o , tais c o m o m i c r o b i o l o g i a e c i r u r g i a pato-
lógica. Mas existe claramente u m risco de exposição a p a r t i r de
amostras de pacientes c o m tuberculose, suspeita o u c o n f i r m a d a ,
e m todas as seções do l a b o r a t ó r i o , i n c l u i n d o a q u í m i c a .
6, especificamente os materiais hiológicos e p o t e n c i a l m e n t e infec-
ciosos, t ê m recebido considerável atenção. E m 2 0 0 2 , o Departa-
m e n t o de Transportes N o r t e - a m e r i c a n o ( D O T ) l i b e r o u u m a regra
revisada c o m n o r m a s para m a n i p u l a ç ã o de m a t e r i a l perigoso
c o n t e n d o substância infecciosa. O i m p a c t o e as exigências destes
regulamentos estão descritos n a seção He riscos biológicos.
Etiquetas de advertência a j u d a m na identificação de riscos
químicos d u r a n t e o transporte. Sob os regulamentos d o D O T ,
os compostos q u í m i c o s q u e são transportados nos Estados
U n i d o s d e v e m possuir etiquetas de acordo c o m a classificação
das N U , Os cartazes o u etiquetas d o D O T são em f o r m a de
losango c o m u m d í g i t o impresso n o canto i n f e r i o r que i d e n t i f i c a
a classe de risco das N U (1 a 9). O risco é i d e n t i f i c a d o mais
especificamente e m palavras impressas colocadas ao l o n g o d o
eixo h o r i z o n t a l d o losango. O c ó d i g o de cor e uma descrição
ilustrada d o risco s u p l e m e n t a m a identificação d o m a t e r i a l peri-
goso n a etiqueta; a ilustração aparece n o c a n t o superior d o
losango (Figura 2-5, A ) .
O sistema é usado pelo D O T para o t r a n s p o r t e de materiais
perigosos; e n t r e t a n t o , q u a n d o o m a t e r i a l perigoso chega ao seu
destino e é r e t i r a d o de seu r e c i p i e n t e de transporte, esta i d e n t i -
ficação é p e r d i d a . O l a b o r a t ó r i o precisa então etiquetar cada

Programa Ergonômico
Existem várias áreas de risco o c u p a c i o n a l para o d e s e n v o l v i m e n t o
de desordens musculoesqueléticas n o l a b o r a t ó r i o c l í n i c o . Estas
i n c l u e m a atividade de l a b o r a t ó r i o de r o t i n a , a f u n c i o n a l i d a d e
d o local de t r a b a l h o ( i n c l u i n d o o revestimento d o piso d o labo-
r a t ó r i o , a i l u m i n a ç ã o clara e a geração de b a r u l h o ) e o p r o j e t o
d o e q u i p a m e n t o (teclados e telas de computadores, estações de
t r a b a l h o e cadeiras). U m a f u n ç ã o p a r t i c u l a r d o l a b o r a t ó r i o , a
p i p e t a g e m e o projeto da pipeta, t e m recebido atenção conside-
rável. C o m o descrito n a Figura 2-2, as pipetas têm sido desenha-
X /
das c o m o o b j e t i v o de reduzir o risco de o empregado ter desor-
dens de estresse cumulativas causadas pela postura inadequada,
m o v i m e n t o repetitivo e uso r e p e t i d o de força. HAZARDOUS MATERIALS
CLASSIF1CATI0N
O C A P exige que laboratórios autorizados t e n h a m u m pro-
grama e r g o n ô m i c o d e f i n i d o e abrangente que é p r o j e t a d o para
prevenir desordens musculoesqueléticas relacionadas ao t r a b a l h o
HEALTH HA2ARD FIRE HAZARD
através de controles de prevenção e m a n e j o . O p l a n o e r g o n ô m i c o FlBEÍ Poinís
4- Desdly
d o c u m e n t a d o deve i n c l u i r elementos de t r e i n a m e n t o de empre- 3 - EjdreiTB i- Be Iam 73' F
dinger 3- BelWs10(]"F
gados relativos a área? de risco, controles de m a n e j o para m i n i - i - HHjrítw . I -fchA'330t
1- «j»«P2È0' f
mizar o u e l i m i n a r riscos e u m processo de determinação para • • 8 S í » X 0 - Wilf r;jl ísLjn
i d e n t i f i c a r problemas para d o c u m e n t a ç ã o e reparação. 0- Norma! /
maiwlal /

Riscos no Laboratório
V á r i o s tipos de risco são enc ontr ados na operação de u m labo-
r a t ó r i o clínico. Estes riscos precisam ser i d e n t i f i c a d o s e marcados,
e as práticas de trabalho, desenvolvidas para lidar c o m eles. As
p r i n c i p a i s categorias de riscos encontradas i n c l u e m : (1) b i o l ó g i c o ,
REACT1VITY
(2) q u í m i c o , (3) elétrico e (4) risco de i n c ê n d i o . I • f*r aelMíV
3- âhacfc afld lieal
Oildber may dllonâlá
Identificação do Risco Aci d Iffolcfll tíümlul
CHaH iej
Al Hall 1- Unsl atile II
Os l a b o r a t ó r i o s clínicos l i d a m c o m cada u m a de nove classes de CflilOíiíí h o ate d
materiais perigosos. Eles estão classificados pelas Nações U n i d a s Ut NC Vi Min 0- Sladle
Fadalion Hoiarri
( N U ) c o m o : (1) explosivos, (2) gases c o m p r i m i d o s , (3) l í q u i d o s
inflamáveis, (4) sólidos inflamáveis, (5) materiais oxidantes, (6) B
materiais tóxicos, (7) materiais radioativos, (8) materiais corrosi-
Figura 2 - 5 A, Etiqueta d o D e p a r t m e n t of Transportation para
vos e (9) materiais variados q u e não estão classificados e m o u t r o
corrosivos. B, Sistema de identificação da National Fíre Protection
lugar. O t r a n s p o r t e e a m a n i p u l a ç ã o dos materiais tóxicos classe
Associatíon. (Cortesia do Lab Safety Supply Inc, Janesville, Wis.)
 Introdução aos Princípios de Análise e Segurança Laboratorial
recipiente individualmente. Geralmente, a informação necessária
para classificar apropriadamente o conteúdo do recipiente está
contida na etiqueta de transporte e pode ser notada. Informações
importantes de primeiros socorros t a m b é m são geralmente for-
necidas nesta etiqueta.
M e s m o que a O S H A determine o uso de etiquetas ou outras
advertências apropriadas atualmente, não existe u m sistema
ú n i c o de marcação u n i f o r m e para compostos químicos perigosos
para laboratórios clínicos. As advertências de risco apropriadas
incluem palavras, figuras e símbolos, combinados o u não, que
t r a n s m i t a m os riscos físicos ou para a saúde do conteúdo dos
recipientes e precisam ser especificadas pelo efeito do composto
químico e os órgãos-alvo específicos envolvidos. A N a t i o n a l Fire
Protection Association (NFPA) desenvolveu o Sistema de Identi-
ficação 704-M, o qual classifica os materiais perigosos de 0 a 4
(o mais perigoso) de acordo com a inflamabilidade e a reatividade
(instabilidade). Este sistema usa etiquetas em forma de losango
(Figura 2-5, B), as quais estão disponíveis na maioria das compa-
nhias que vendem equipamentos de segurança para laboratórios.
As etiquetas são codificadas pela cor e divididas em quadrantes.
Três dos quadrantes têm u m a cor característica e representa u m
dpo de risco. U m n ú m e r o n o quadrante indica o grau de risco.
O quarto (inferior) quadrante contém informação de especial
interesse para os bombeiros.
Riscos Biológicos
E essencial m i n i m i z a r a exposição dos trabalhadores do labora-
tório a agentes infecciosos, tais como as hepatites e H I V . A
exposição a agentes infecciosos resulta de: (1) perfuração aciden-
tal com agulhas, (2) pulverização de materiais infecciosos por uma
seringa o u derramamento e espirro destes materiais nos tampos
das bancadas o u no chão, (3) acidentes na centrifugação e (4)
cortes o u arranhões com vasilhas contaminadas. Qualquer tecido
não fixado, inclusive lâminas com sangue, precisam ser tratados
como materiais infecciosos potenciais.
A O S H A t e m ordenado que todos os laboratórios dos E U A
tenham u m plano de controle de exposição. A l é m disso, o Natio-
nal Institute for Occupational Safety and H e a l t h ( N I O S H ) , uma
unidade f u n c i o n a l do C D C , tem preparado e distribuído ampla-
mente u m d o c u m e n t o i n t i t u l a d o Precauções Universais que
especifica c o m o os laboratórios clínicos dos E U A devem lidar
c o m agentes infecciosos. 11 E m geral ele ordena que os laborató-
rios clínicos tratem todo sangue h u m a n o e outros materiais
potencialmente infecciosos como se eles contivessem agentes
infecciosos, tais como H B V , H I V e outros patógenos hematogê-
nicos. Estas exigências se aplicam a todas as amostras de: (1)
sangue, (2) soro, (3) plasma, (4) produtos sanguíneos, (5) secre-
ções vaginais, (6) sêmen, (7) f l u i d o cerebrospinal, (8) f l u i d o sino-
vial e (9) vírus H B V ou H I V concentrados. A l é m disso, qualquer
amostra de qualquer t i p o que contenha traços visíveis de sangue
deve ser manuseada usando-se estas Precauções Universais.
As Precauções Universais também especificam que barreiras
de proteção devem ser usadas pelos trabalhadores de laboratório
para evitar a contaminação da pele e membranas mucosas com
as amostras. Estas barreiras, também conhecidas como PPE,
incluem: (1) luvas, (2) jalecos, (3) casacos de laboratório, (4)
proteção para a face ou máscara e proteção para os olhos, (5)
máscara de ressuscitação, (6) sacos de ressuscitação, (7) máscaras
portáteis o u (8) outros dispositivos ventiladores. Para alguns indi-
víduos, a alergia a látex é u m problema durante o uso de luvas
de látex para a barreira de proteção. Para tais indivíduos, luvas
de grau médico feitas de materiais como vinil, nitrila, neoprene
o u elastômero termoplástico estão disponíveis. Se luvas de látex
CAPÍTULO 2 37
tiverem de ser usadas, elas devem ser sem talco e de látex pouco
alergênico.
Novos produtos para o a u m e n t o da proteção de empregados
contra perfuração com agulhas i n c l u e m uma série de novos reci'
pientes para objetos afiados (p.ex., agulhas, escalpes e vidro) e
sacos de descarte de segurança biológica e revestimento para
agulhas que podem ser fechados após uma punção venosa sem
que exista contato físico c o m a agulha ou o revestimento. E m b o r a
sejam necessários estudos adicionais sobre sua eficácia e efeitos
sobre os resultados de testes de laboratório, dispositivos de micro
laser estão atualmente disponíveis para perfuração da pele de u m
paciente para coletar u m a amostra de sangue capilar.
O C S L I também tem publicado u m c o n j u n t o similar de
recomendações, 4,6 muitas das quais são especificadas como exi-
gências no plano de controle de exposição da O S H A . Elas
incluem:
1. Nunca pipetar com a boca e nunca assoprar pipetas que
contêm material potencialmente infeccioso.
2. Não misturar material potencialmente infeccioso
b o r b u l h a n d o ar através do líquido.
3. As barreiras de proteção, tais como: luvas, máscaras e
protetores dos olhos e jalecos, devem estar disponíveis e ser
usadas quando o sangue de u m paciente é coletado e
quando todas as amostras de pacientes são manuseadas.
Isso i n c l u i a remoção das tampas dos tubos. As luvas
devem ser descartáveis, de látex não estéril, o u de outro
material que forneça barreira adequada. Os flebotomistas
devem trocar de luvas e descartá-las adequadamente entre
as retiradas de sangue de diferentes pacientes.
4. Lavar as mãos quando trocar de luvas.
5. A barreira de proteção facial deve ser usada se existe u m
potencial significante de respingo de sangue o u fluidos
corporais.
6. Evitar o uso de seringas sempre que possível e descartar as
agulhas em recipientes rígidos (Figura 2-6, A) sem
manuseá-las (Figura 2-6, B).
7. Descartar apropriadamente todos os objetos afiados.
8. Vestir roupas protetoras, as quais servem como uma barreira
efetiva contra materiais potencialmente infecciosos. Q u a n d o
deixar o laboratório, as roupas protetoras devem ser retiradas.
9. Esforçar-se para evitar ferimentos acidentais.
10. Encorajar a freqüente lavagem de mãos no laboratório; os
empregados devem lavar suas mãos sempre que deixarem o
laboratório.
11. Tornar u m hábito manter as mãos longe da boca, nariz,
olhos e qualquer outra membrana mucosa Isso reduz a
possibilidade de auto-inoculação.
12. M i n i m i z a r os derramamentos e os respingos.
13. Descontaminar todas as superfícies e dispositivos
reutilizáveis, após o uso, c o m desinfetantes hospitalares
apropriados registrados na U S. Environmental Protection
Agency (EPA). Esterilização, desinfecção e descontaminação
são discutidas em detalhes na publicação M29-A3 do CLSI. 4
14. N e n h u m a etiqueta de advertência deve ser usada em
amostras de pacientes, uma vez que todas devem ser
tratadas como potencialmente perigosas.
15. Os procedimentos de biossegurança nível 2 devem ser
usados sempre que apropriado.
16. Antes de centrifugar tubos, veja se eles possuem
rachaduras. Inspecione o interior do rotor para sinais de
erosão o u de material aderido. Certifique-se que os
amortecedores de borracha estão livres de qualquer
partícula de vidro.
38 PARTE I Princípios Laboratoriais
>L
F i g u r a 2 - 6 A , Sistema de descarte de agulha, conveniente pata
ofcjetos pontiagudos. B, Dispositivos de revestimento de agulhas para
prevenir o contato d o c o r p o com a agulha. (B, Cortesia de MarketLab
Inc.).
17. U s e técnicas de descarte de materiais b i o l ó g i c o s perigosos
(p. ex., "Saco V e r m e l h o " ) .
18. N u n c a deixe u m t u b o descartado o u u m m a t e r i a l
i n f e c t a d o a b a n d o n a d o o u sem etiqueta.
19. P e r i o d i c a m e n t e , l i m p e o freezev e as caixas de gelo seco
para r e m o v e r ampolas quebradas e tubos de amostras
biológicas. Use luvas de b o r r a c h a e proteção r e s p i r a t ó r i a
d u r a n t e esta limpeza.
20. A O S H A exige q u e a v a c i n a c o n t r a hepatite B seja
oferecida a todos os empregados e m risco de exposição
p o t e n c i a l c o m o u m a par te regular o u ocasional de suas
tarefas. O A d v i s o r y C o m m i t t e e o n I m m u n i - a t i o n Practices
( A C I P ) d o C D C r e c o m e n d a que tecnólogos médicos,
f l e b o t o m i s t a s e patologistas sejam vacinados c o m a v a c i n a
c o n t r a hepatite B. É u m a exigência reguladora que p e l o
m e n o s aos empregados de l a b o r a t ó r i o s a n t e r i o r m e n t e
descritos seja dada a opção de receber a vacina c o n t r a
h e p a t i t e B de graça,
A investigação de acidentes aéreos trágicos n o f i n a l dos anos
de 1990 pela U . S . N a t i o n a l T r a n s p o r t a t i o n Safety B o a r d ( N T S B )
levou ao DOT, em cooperação com a International Air Transport
Association (IATA) e a International Civil Aviation Organization
( I C A O ) , o d e s e n v o l v i m e n t o das exigências estritas e revisadas
p a r a o t r a n s p o r t e e m a n u s e i o de materiais perigosos. 2 C o m a
ciência c o n t i n u a d a da necessidade das Precauções Universais, d o
risco d e patógenos h e m a t o g ê n i c o s e das conseqüências adversas
de infecções sérias e m p o t e n c i a l , o t r a n s p o r t e e o m a n u s e i o de
materiais classe 6 — materiais b i o l ó g i c o s —são p o n t o s críticos de
segurança.
A s n o r m a s de t r a n s p o r t e f e d e r a l e e m p a c o t a m e n t o d i v i d e m
amostras p o t e n c i a l m e n t e infecciosas e m q u a t r o grupos de risco
q u e v a r i a m de risco b a i x o a alto.
Estas n o r m a s c o l o c a m p a r t i c u l a r ênfase n o t r e i n a m e n t o para
m a t e r i a l perigoso ( H A Z M A T ) q u e deve ser d a d o a empregados
de l a b o r a t ó r i o q u a n d o t r a n s p o r t a n d o e m a n u s e a n d o substâncias
infecciosas. O s elementos i n c l u e m a conscientização geral e fami-
lirização, e o t r e i n a m e n t o de segurança e específico de cada
f u n ç ã o . O t r e i n a m e n t o a d e q u a d o , p a r t i c u l a r m e n t e e m áreas de
marcação de pacotes e d o c u m e n t a ç ã o ( i n c l u i n d o u m a declaração
de c o n t e ú d o d o r e m e t e n t e para cargas perigosas), é o b r i g a t ó r i o ,
c o m certificação d o c u m e n t a d a , exigida dos empregadores, de q u e
os empregados relevantes t e n h a m t i d o programas de t r e i n a m e n t o
a p r o p r i a d o s . E m b o r a o i m p a c t o adverso de t r e i n a m e n t o inade-
q u a d o possa ser r e f l e t i d o p r i n c i p a l m e n t e pela m o r t a l i d a d e e
m o r b i d a d e h u m a n a s potenciais, as violações a estas regias iden-
tificadas t a m b é m i m p õ e grandes m u l t a s e p u n i ç ã o para o i n d i v i -
d u o e o empregador o u i n s t i t u i ç ã o .
Riscos Químicos
O a r m a z e n a m e n t o e o uso adequados de p r o d u t o s q u í m i c o s são
necessários para evitar riscos, tais c o m o queimas, explosões, fogos
e fumaças tóxicas. P o r t a n t o , o c o n h e c i m e n t o das p r o p r i e d a d e s
dos compostos q u í m i c o s e m uso e dos p r o c e d i m e n t o s de m a n u -
seio adequados reduz bastante as situações perigosas. A s garrafas
de substâncias químicas e soluções d e v e m t a m b é m ser manusea-
das c u i d a d o s a m e n t e , e u m a caçamba deve ser usada para trans-
p o r t a r recipientes pesados o u m u i t o s recipientes de u m a área para
o u t r a . Recipientes de vidros c o m substâncias químicas d e v e m ser
t r a n s p o r t a d o s e m caixas de b o r r a c h a o u plástico que os p r o t e g e m
da quebra e, e m caso de quebra, c o n t r o l a m o d e r r a m a m e n t o .
Estojos de d e r r a m a m e n t o a p r o p r i a d o s devem estar disponíveis e m
locais estratégicos. U m kit de d e r r a m a m e n t o usual, t a l c o m o o
Sasco S o l i d i f i e r S p i l l Response K i t ( h t t p ; / / w w w . s a s c o c h e m i c a l .
com), p o d e conter materiais específicos p a t a ser usado c o m der-
rames d e ácido o u de materiais orgânicos o u cáusticos. A s i n s t r u -
ções d e uso destes materiais estão contidas n o estojo.
O r e s p i n g o de ácidos, materiais cáusticos e agentes o x i d a n t e s
fortes é u m perigo para as roupas e o l h o s e é u m a f o n t e p o t e n c i a l
de q u e i m a d u r a s químicas. U m a garrafa n u n c a deve ser segurada
pelo seu gargalo e s i m f i r m e m e n t e e m v o l t a de seu c o r p o c o m
u m a o u ambas as mãos, d e p e n d e n d o d o t a m a n h o d a garrafa. O s
ácidos precisam ser d i l u í d o s adicionando-se l e n t a m e n t e a eles
água e n q u a n t o se m i s t u r a ; a água n u n c a deve ser a d i c i o n a d a a
ácido c o n c e n t r a d o . A o se t r a b a l h a r c o m soluções ácidas o u alca-
linas, os óculos de segurança d e v e m ser usados. M a t e r i a i s ácidos
e cáusticos e agentes oxidantes fortes d e v e m ser m i s t u r a d o s na
 Introdução aos Princípios de Análise e Segurança Laboratorial
pia. Esta fornece água paia o resfriamento e para a contenção do
reagente n o caso de o frasco o u garrafa quebrar.
Todas as garrafas contendo reagentes devem ser etiquetadas
adequadamente. E u m a boa prática de laboratório etiquetar o
recipiente antes de adicionar o reagente, evitando então a possi-
bilidade de se ter u m reagente sem etiqueta. A etiqueta deve
exibir: (1) o n o m e e a concentração do reagente, (2) as iniciais
da pessoa que fez o reagente e (3) a data na qual o reagente f o i
preparado. Q u a n d o apropriado, a data de validade deve ser
também incluída. As etiquetas devem ter u m código de cor ou
u m a etiqueta adicional para designar as condições específicas de
estocagem, tais como a necessidade de refrigeração o u estocagem
especial relacionada a u m risco potencial. Todos os reagentes
encontrados em garrafas sem etiquetas devem ser descartados
c o m o uso de procedimentos e precauções adequados.
Ácidos fortes, materiais cáusticos e agentes oxidantes fortes
devem ser distribuídos airavés de u m dispositivo de dispensação
disponível comercialmente. E m n e n h u m a circunstância a pipeta-
gem com a boca é permitida.
E m alguns casos, os materiais para o lixo não são coletados
no mesmo recipiente. C o m certos tipos de equipamento, os
ácidos fortes o u outros materiais perigosos são bombeados dire-
tamente n o ralo. Isso sempre precisa ser associado a u m f l u x o
constante de água da torneira. Óculos de segurança devem ser
usados pelos operadores do instrumento quando ácidos são bom-
beados sob pressão.
O ácido perclórico, por ser potencialmente explosivo em
contato com materiais orgânicos, requer manuseio cuidadoso. O
ácido perclórico não deve ser usado em bancadas c o m tampo de
madeira, e as garrafas deste ácido devem ser estocadas em uma
cápsula de vidro. O descarte deve set acompanhado pela adição
de ácido gotejante (usando-se u m a proteção contra respingos) em
pelo menos 100 volumes de água fria, derramando-se o ácido
d i l u í d o no ralo com quantidades adicionais de água fria. Capelas
especiais de ácido perclórico, c o m facilidades especiais de lavagem,
devem ser instaladas se quantidades grandes deste ácido são
usadas.
C u i d a d o especial é necessário quando lidar c o m mercúrio.
Mesmo pequenas gotas de mercúrio nos tampos das bancadas e
no chão podem contaminar a atmosfera n u m a sala pouco venti-
lada. A capacidade d o elemento de amalgamar c o m vários metais
é bem conhecida. A p ó s u m derramamento acidental de mercú-
rio, a área contaminada deve ser limpa cuidadosamente até que
não tenha gotas remanescentes. Todos os recipientes c o m mercú-
rio devem ser mantidos bem tampados. C o m o é altamente peri-
goso, é recomendado que não se use mercúrio n o laboratório.
A EPA controla o descarte de resíduos perigosos não-radioa-
civos. O Resource Conservation and Recovety A c t ( R C R A ) de
1976 define que o descarte de materiais classificados em uma das
nove classes de materiais das N U é obrigado, de tal maneira que
os profissionais de segurança e saúde envolvidos neste descarte
são pessoalmente responsáveis por cada violação individual.
U m a publicação 5 do C L S I abrange o descarte de resíduos
perigosos, entretanto, muitos municípios e estados têm suas pró-
prias normas. As agências devem ser contatadas pelo laboratório
para as peculiaridades.
Substâncias químicas voláteis e gases c o m p r i m i d o s apresen-
tam perigos específicos.
Riscos de Substâncias Voláteis
O uso de solventes orgânicos em u m laboratório clínico repre-
senta u m risco potencial de incêndio e perigo pela inalação de
vapores tóxicos o u contato c o m a pele. Estes solventes devem ser
usados em uma capela. A estocagem de solventes orgânicos é
CAPÍTULO 2 39
regulada por regras atribuídas pela O S H A . Entretanto, algumas
regras locais de departamentos de incêndio são mais severas. Os
solventes devem ser estocados em u m gabinete metálico de esto-
cagem aprovado pela O S H A que é adequadamente ventilado. O
v o l u m e de trabalho m á x i m o de solventes inflamáveis p e r m i t i d o
fora dos gabinetes de estocagem é de 18,9 L por sala. N ã o mais
do que 227,1 L de solventes dos tipos I e I I podem ser estocados
em u m único gabinete. N ã o mais do que três gabinetes p o d e m
estar localizados em cada 464,5 m z de espaço de laboratório.
A vaporização é o principal problema na ignição e n o espa-
l h a m e n t o de fogo. Os vapores de líquidos e sólidos combustíveis
e inflamáveis f o r m a m uma mistura inflamável c o m o ar. Eles são
caracterizados pelos seus pontos de flash; o p o n t o de flash é defi-
n i d o como a menor temperatura na qual u m solvente desprende
vapores inflamáveis na proximidade da sua superfície. A mistura
em seu p o n t o de flash inflama-se quando exposta a uma fonte de
ignição. E m temperaturas abaixo do p o n t o de fkish, o vapor
desprendido é considerado m u i t o pobre para ignição.
O descarte de solventes inflamáveis no esgoto pluvial ou
sanitário não é normalmente permitido. As exceções são peque-
nas quantidades daqueles materiais misciveis c o m a água, mas
mesmo o descarte destes deve ser seguido por grandes quantida-
des de água fria. Outros solventes podem ser coletados e m latas
de segurança. Latas separadas p o d e m ser utilizadas para éter e
para solventes clorados; todos os outros solventes p o d e m ser
misturados em uma terceira lata. As latas podem ser estocadas,
mantendo-se as regras de quantidade de estocagem, em u m gabi-
nete seguro até serem recolhidas por u m a firma de descarte de
Tesíduos. U m a abordagem mais econômica é transferir os solven-
tes para latas maiores, ou tambores, em u m depósito externo, de
tal f o r m a que a coleta pode ser menos freqüente. Algumas
grandes instituições têm seus próprios depósitos de descarte.
Riscos de Gases Comprimidos
A regulação do D O T exige a marcação de cilindros de gases com-
p r i m i d o s que são transportados por transportadores interestadu-
ais. As marcações em forma de losango descritas anteriormente
são usadas em todos os grandes cilindros e em qualquer caixa
contendo cilindros pequenos. Algumas regras gerais para a mani-
pulação de grandes cilindros de gás c o m p r i m i d o são:
1. Sempre transportar cilindros usando u m catTinho no qual o
c i l i n d r o esteja seguro.
2. Deixar a tampa de proteção da válvula n o cilindro até que
ele esteja p r o n t o para o uso, quando o cilindro deverá estar
seguro por u m suporte em torno do terço superior de seu
corpo. Desconectar a luva o u regulador, fechar a válvula e
recolocar a proteção antes que o cilindro esteja completa-
mente vazio paia evitar a possibilidade de desenvolvimento
de uma pressão negativa. Colocar uma etiqueta o u sinal
"vazio" n o cilindro.
3. Acorrentar o u amarrar os cilindros todo o tempo, mesmo
q u a n d o vazios.
4. Sempre checar a composição dos conteúdos dos cilindros
antes da conexão.
5. N u n c a forçar as roscas; se u m regulador não rosquear facil-
mente, algo está errado.
As precauções citadas para cilindros de gás recarregáveis
grandes também se aplicam a cilindros menores que não são
recarregáveis. Os cilindros de propano e os cilindros de gases
calibrados para equipamento de gás sanguíneo são exemplos de
cilindros descartáveis. Os cilindros em suportes com base para
serem usados n o chão necessitam da segurança adicional de uma
corrente o u alça presa a uma parede o u fixada a uma mobília.
As normas do departamento de incêndio local (as quais variam
40 PARTE I Princípios Laboratoriais
TABELA 2-9 Classificação dos Incêndios e as Exigências dos Extintores de I n c ê n d i o
Tipo de Risca
Combustíveis comuns: Madeira, roupa, papel
Líquidos G gases inflamáveis: Solventes e graxas, gases naturais ou
manufaturados
Equipamento elétrico: Qualquer equipamento elétrico ligado na fonte de energia.
Se a eletricidade está desligada na fonte, este se toma Classe A ou B
Combinações de: Combustíveis comuns e líquidos e gases inflamáveis
Combinações de: Combustíveis comuns e equipamento elétrico
Combinações de: Líquidos e gases inflamáveis e equipamento elétrico
Combinações de: Combustíveis comuns, líquidos e gases inflamáveis e
equipamento elétrico
consideravelmente de u m lugar para o u t r o ) d i t a m o descarte dos
c i l i n d r o s descarregados.
Riscos Elétricos
Os fios elétricos e as conexões são riscos de choque e i n c ê n d i o . O s
fios gastos de qualquer e q u i p a m e n t o elétrico devem ser substituí-
dos i m e d i a t a m e n t e e t o d o e q u i p a m e n t o deve ser aterrado usando-
se tomadas de três pinos. A s n o r m a s da O S H A e s t i p u l a m q u e as
exigências para a t e r r a m e n t o de e q u i p a m e n t o s elétricos d o N a t i o -
n a l Electrical C o d e ( p u b l i c a d o pela N F P A ) sejam satisfeitas. Se
as hastes para a t e r r a m e n t o não estiverem disponíveis, u m eletri-
cista autorizado deve ser c o n s u l t a d o sobre técnicas alternativas
de aterramenro adequadas. A l g u n s códigos locais são mais severos
d o q u e as exigências da O S H A e n ã o p e r m i t e m o uso de tomadas
de dois p i n o s c o m adaptadores para crês p i n o s .
O uso de fios d e extensão é p r o i b i d o . Esta n o r m a é mais severa
d o q u e q u a l q u e r o u t r a regra existente. E m alguns casos, u m f i o
de extensão p o d e ser usado t e m p o r a r i a m e n t e . Nestes casos, a
extensão deve: (1) ser m e n o r d o que 3,66 m de c o m p r i m e n t o , (2)
ter u m f i o de pelo m e n o s 1,3 m m , (3) ser aprovado pelo U n d e r w r í -
ters Laborarory ( U L ) e (4) ter somente u m a saída na extremidade.
Se várias saídas são necessárias e m u m a área, u m f i l t r o de l i n h a
c o m seu p r ó p r i o fusível o u d i s j u n t o r deve ser instalado a pelo
m e n o s 7,6 c m acima d o nível d o t a m p o da bancada. V á r i o s fabri-
cantes agora v e n d e m dispositivos para checar a alta resistência n a
fiação neutra o u terra o u a voltagem excessiva na fiação neutra.
Os e q u i p a m e n t o s elétricos e as conexões não devem ser m a n i -
pulados c o m as mãos úmidas, n e m u m e q u i p a m e n t o elétrico p o d e
ser usado após a l g u m l í q u i d o ter sido d e r r a m a d o sobre ele. O
e q u i p a m e n t o deve ser desligado i m e d i a t a m e n t e e c o m p l e t a m e n t e
seco. N o caso de u m i n s t r u m e n t o elétrico ú m i d o o u e m m a u
f u n c i o n a m e n t o q u e seja usado p o r várias pessoas, a t o m a d a deve
ser desconectada e u m a n o t a a l e r t a n d o os trabalhadores deve ser
deixada sobre o i n s t r u m e n t o .
Riscos de incêndio
A N F P A e a O S H A p u b l i c a m n o r m a s abrangendo assuntos desde
as saídas de emergência (inclusive rotas de fuga) até a segurança e
os equipamentos de combate a incêndios. A N F P A t a m b é m p u b l i c a
o N a t i o n a l Fire Codes. M u i t o s estados e agências locais t ê m
adotado estes códigos (alguns dos quais são mais severos d o que as
exigências da O S H A ) e então os t o r n a legalmente obrigatórios.
T o d o l a b o r a t ó r i o deve ter o e q u i p a m e n t o necessário para extin-
guir o u controlar u m i n c ê n d i o n o laboratório e extinguir o fogo
n a roupa de u m i n d i v í d u o . O acesso fácil a chuveiros de segurança
é essencial. U m chuveiro de segurança deve ter u m a corrente, para
ser puxada e liberar a água, instalada na parede n u m a altura con-
Classe de Incêndio Agentes Extintores Recomendados
A Água, espuma química seca, vapor
B Químico seco, dióxido de carbono, vapor, espuma
de Halon 1211 ou 1301
C Químico seco, dióxido de carbono, espuma de Halon
1211 ou 1301
A&B Químico seco, vapor, espuma
A&C Químico seco
B&C Químico seco, dióxido de carbono, espuma de Halon
1211 ou 1301
A, B&C Pó multiuso
veniente o u pendente d o chuveiro; a corrente deve ter u m grande
anel, de cal forma que o chuveiro possa ser facilmente ativado,
mesmo c o m os olhos fechados. M a n t a s de i n c ê n d i o para extin-
guir o fogo e m roupas devem estar disponíveis e m u m a caixa
facilmente acessível fixada na parede. A m a n t a é desenrolada da
caixa e enrolada e m t o r n o d o c o r p o tiiando-se o cordão que está
na m a n t a e enrolando-a e m volta d o corpo. A localização deste
e q u i p a m e n t o e as localizações dos alarmes de i n c ê n d i o e mapas
das vias de evacuação são diradas pelo oficial de i n c ê n d i o local.
V á r i o s t i p o s de extintores de i n c ê n d i o estão disponíveis. O
t i p o a ser usado depende d o t i p o de i n c ê n d i o . U m a vez que é
i m p r a t i c á v e l ter vários tipos de extintores de i n c ê n d i o presentes
e m todas as áreas, os extintores de i n c ê n d i o de p ó q u í m i c o seco
estão e n t r e os melhores extintores m u l t i u s o para áreas de labo-
r a t ó r i o . U m e x t i n t o r deve ser localizado p r ó x i m o a cada p o r t a
d o l a b o r a t ó r i o e, e m u m l a b o r a t ó r i o maior, n o f i n a l da sala
oposta à p o r t a . Todos n o l a b o r a t ó r i o d e v e m ser i n s t r u í d o s sobre
o uso destes extintores e de q u a l q u e r o u t r o e q u i p a m e n t o de
c o m b a t e a i n c ê n d i o . T o d o s os extintores de i n c ê n d i o devem ser
testados p o r pessoas qualificadas e m intervalos especificados
pelo fabricante. As três classes de i n c ê n d i o e os tipos de extin-
tores de i n c ê n d i o a serem usados para cada classe estão listados
n a Tabela 2-9. T o d o e x t i n t o r de i n c ê n d i o é r o t u l a d o q u a n t o ao
t i p o de i n c ê n d i o e m que p o d e ser usado.
D o i s tipos adicionais de i n c ê n d i o s , designados " D " e " E " ,
devem ser c o n t r o l a d o s p o r pessoal t r e i n a d o . Os incêndios t i p o
" D " são aqueles envolvendo materiais metálicos e m p ó (p. ex.,
magnésio). U m p ó especial é usado para combater este perigo.
U m i n c ê n d i o t i p o " E " n ã o p o d e ser e x t i n t o o u é provável que
resulte e m explosão ( c o m o u m i n c ê n d i o e m u m arsenal). U m
incêndio tipo "E" é normalmente deixado a queimar enquanto
materiais p r ó x i m o s estão sendo a d e q u a d a m e n t e protegidos.
M u i t o s laboratórios clínicos agora t ê m u m c o m p u t a d o r que
é abrigado e m u m a sala c o m t e m p e r a t u r a e u m i d a d e controla-
das. O sistema de c o n t r o l e de i n c ê n d i o a u t o m a t i z a d o mais
p o p u l a r para estas salas é o H a l o n 1301 ( b r o m o t r i f l u o r o m e -
tano). E m b o r a este seja o m e n o s t ó x i c o dos halons, as n o r m a s
da N F P A exigem u m sinal de aviso n a entrada da sala e a dis-
p o n i b i l i d a d e de u m a máscara para respiração.
REFERÊNCIAS
1. Bermes EW Jr, Kahn SE, Young DS. General laborarory techniques
and procedures. In: Burtis CA, Ashwond ER, eds, Tietz textbook
of clinicai chemistry 4ch ed. Philadelphía: WB Saunders, 2006:3-
40.
2. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 4th ed.
Washington, DC: Department of Health and Human Services,
Centers for Disease Contro I and Prevention and the National
 Introdução aos Princípios de Análise e Segurança Laboratorial
Institutes of Health. Washington, D C US Government Piinting Office,
May, 1999
3. Clinicai and Laboratoiy Standards Institute/NCCLS. Ptocedures for the
Handling and Processing of Blood Specimens- Approved Guideline. 3rd
ed C L S I / N C C L S Document HI8-A3. Wayne PA- Clinicai and
Laboratory Standards Instimte, 2004.
4. Clinicai and Laboratoiy Standards Institute/NCCLS. Protection of
Laboratory Workers frorn Occupationally Acquired Infections. Approved
Guideline. 3rd ed. C L S I / N C C L S Document M29-A3. Wayne PA'
Clinicai and Laboratory Standards Institute, 2005.
5. Clinicai and Laboratory Standards In sti tu t e / N CCLS Clinicai
Laboratory Waste Management: Approved Guideline. 2nd ed. C L S I /
N C C L S Document GP5-A2. Wayne PA: Clinicai and Laboratory
Standards Institute, 2002.
6. Clinicai and Laboratory Standards In sti tu t e / N CCLS. Clinicai
Laboratory Safety, 2nd ed. C L S I / N C C L S Document GP17-A2. Wayne
PA:Clinical and Laboratory Standards Institute, 2004
7. Clinicai and Laboratory Standards Institu te/N CCLS. Tempera rure
Calibration Of Water Baths, Instruments, And Temperature Sensois, 2lld
ed. Approved Guideline. C L S I / N C C L S Document I02-A2. Wayne PA:
Clinicai and Laboratory Standards Institute, 1990.
8. Clinicai and Laboratory Standards Institu t e / N CCLS. Preparation and
Testing of Reagent Water in the Clinicai Laboratoiy. Approved
Guideline. 4th ed C L S I / N C C L S Document C03-A4. Wayne PA:
Clinicai and Laboratoiy Standards Institute, 2006.
9. Ergonomics program. Final tule: remova! Occupational Safety and
Health Administration (OSHA). Fed Reg 2001;666:20403.
CAPÍTULO 2 41
10. McDonald CJ, Huff SM, Suico JG, Hill G, Leavelle D, et al LOINC, a
universal standard for identifying laboratory observations: a 5-year
update. Clin C h e m 2003;49:624-33.
11 National Institute for Occupational Safety and Health. Guidelines for
Prevention of Transmission of H u m a n Immunodeficiency Vírus and
Hepatitis B Virus of HealtlvCare and Public Safety Workers DHSS
(NIOSH) Publication No. 89-107- Washington DC: Department of
Health and Social Services, Februaiy, 1989.
12. National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH).
Musculoskeletal disorders and workplace factors: a criticai review of
epidemiologic evidence for work-related musculoskeletal disorders of the
neck, upper extremities, and low back. Centers for Disease Control
(NIOSH) Publication No. 97-141. Atlanta, GA: Centers for Disease
Control, July, 1997.
13 Nacional Instimte of Standards and Technology. The International
System of Units (SI) NIST Special Publication 811. Gaithersburg, MD:
National Institute of Standards and Technology (http://www.nist.gov),
1994.
14. Occupational exposure to bloodborne pathogens: needlesticks and other
shaips injuiies: final rule. Occupational Safety and Health
Administration (OSHA). Fed Reg 2001;66:5318-25
15. Powsner ER, W i d m a n JC. Basic principies of radioactivity and
its measurement. In: Buitis CA, Ashwood ER, eds. Tietz textbook
of clinicai chemistry. 3rd ed. Pblladelphia: W B Saunders,
1999:113-32.
 Coleta de Amostras e Outras
Variáveis Pré-analíticas
Donald S. Young, M.B., Ch.B., Ph.D., Edward W. Bermes, Jr., Ph.D.,
OBJETIVOS
1. Determinar o que é uma variável pré-analítica.
2. Determinar os tipos de amostras coletados rotineiramente e não
rotineiramente para exames e as vantagens e desvantagens de
cada um.
3. Descrever as variáveis pré-analíticas, controláveis e não
controláveis, vinculadas à coleta da amostra propriamente dita,
manipulação e transporte para a maioria dos tipos de amostras
comuns examinadas.
4. Determinar qual tipo do código de cor do tubo a vácuo é apropriado
para a avaliação dos vários analitos e a ordem correta de uso.
5. Listar os anticoagulantes e determinar tanto sua ação no sangue
total, como seus usos apropriados para os vários exames
laboratoriais.
6. Determinar os efeitos dos fatores psicológicos, biológicos e
ambientais nas análises laboratoriais e como diferenciar uma
alteração esperada/fisiologicamente aceitável de uma alteração que
pode indicar um erro pré-analítico.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A d i t i v o s : C o m p o n e n t e s adicionados a amostras biológicas para
evitar que coagulem o u para preservar seus constituintes.
A m o s t r a : U m exemplar o u parte de u m f l u i d o c o r p ó r e o o u
tecido coletado para exame, estudo o u análise.
A n t i c o a g u l a n t e s : Q u a l q u e r substrato q u e evite a coagulação d o
sangue.
C o n s e r v a n t e s : U m a substância usada o u preparação a d i c i o n a d a
a u m a amostra para evitar alterações e m seus c o n s t i t u i n t e s .
D e l t a C l i e c k : A diferença entre duas mensurações consecutivas
d o m e s m o analito d o m e s m o paciente, p a d r o n i z a d o de
a c o r d o c o m porcentagem, valor absoluto e / o u t e m p o e
usado c o m o u m a m e d i d a de c o n t r o l e de qualidade.
F l e b o t o m i a : A punção de u m vaso sanguíneo para coletar
sangue.
F l e b o t o m i s t a : Q u e m pratica a f l e b o t o m i a ; o i n d i v í d u o retira
u m a amostra de sangue.
H e m o c o n c e n t r a ç ã o : D i m i n u i ç ã o do conteúdo f l u i d o do
sangue que resulta e m a u m e n t o da concentração dos
c o n s t i t u i n t e s sanguíneos.
H e m o d i l u i ç ã o : A u m e n t o d o c o n t e ú d o f l u i d o d o sangue q u e
resulta e m d i m i n u i ç ã o da concentração dos c o n s t i t u i n t e s
sanguíneos.
H e m ó l i s e ; R u p t u r a da m e m b r a n a das hemácias causando
liberação de h e m o g l o b i n a e outros c o m p o n e n t e s das células
vermelhas d o sangue
O c l u s ã o Venosa: B l o q u e i o t e m p o r á r i o d o r e t o r n o d o f l u x o
sanguíneo ao coração através da aplicação de pressão,
geralmente usando u m t o r n i q u e t e .
e Dóris M. Haverstick, Ph.D.
Plasma A p o r ç ã o f l u i d a d o sangue n a q u a l as células estão e m
suspensão. D i f e r e d o soro p o r conter f i b r i n o g è n i o e
c o m p o n e n t e s relacionados que são removidos d o soro
q u a n d o o sangue coagula,
P u n ç ã o da Pele: C o l e t a de sangue capilar geralmente de u m
paciente pediátrico, p o r m e i o de u m p e q u e n o corte feito n a
pele, f r e q ü e n t e m e n t e n o calcanhar.
S o r o : O l í q u i d o claro que se separa q u a n d o o sangue coagula.
T o r n i q u e t e : U m dispositivo aplicado ao redor da extremidade
para c o n t r o l a r a circulação e evitar o f l u x o de sangue para
o u a d v i n d o da área distai.
Variáveis Pré-analíticas: Fatores q u e afetam as amostras ances
de serem realizados os exames; são classificadas c o m o
controláveis o u não controláveis.
V e n o p u n t u r a : O processo e n v o l v i d o na obtenção de u m a
amostra de sangue da veia d o paciente.
A
coleta p r o p r i a m e n t e dita, o processamento e estoque de
tipos c o m u n s de amostras associados a requisições para
testes diagnósticos são imprescindíveis para a provisão de
resultados de exames de qualidade, e m u i t o s erros p o d e m ocorrer
d u r a n t e esses passos. Esses erros são considerados erros pré-anãlí-
ticos e são conhecidos p o r c o n t r i b u i r para u m a t e n d i m e n t o demo-
rado e s u b o t i m i z a d o d o paciente. O r e c o n h e c i m e n t o e a
m i n i m i z a ç ã o desses erros através de cuidadosa adesão aos concei-
tos a seguÍT e quaisquer políticas i n s t i t u c i o n a i s i n d i v i d u a i s resul-
tarão em i n f o r m a ç ã o mais confiável para uso n o a t e n d i m e n t o de
qualidade ao paciente p o r profissionais de saúde.
C o n t r o l á v e l e não c o n t r o l á v e l são duas classificações das vari-
áveis pré-analíticas. As variáveis controláveis referem-se à padro-
nização da coleta, t r a n s p o r t e e processamento das amostras. As
variáveis não controláveis são aquelas relacionadas c o m a fisiolo-
gia d o paciente e m p a r t i c u l a r (idade, sexo, doenças de base etc.).
Os laboratoristas precisam entender as i n f l u ê n c i a s das variáveis
controláveis e não controláveis n a composição dos f l u i d o s corpó-
reos e ser capazes de i n t e r p r e t a r os resultados dos exames.
COLETA DA AMOSTRA
Os exemplos de amostras biológicas analisadas e m l a b o r a t ó r i o de
análises clínicas i n c l u e m : (1) sangue total; (2) soro; (3) plasma;
(4) u r i n a ; (5) fezes; (6) saliva; (7) l í q u i d o espinal, sinovial, a m n i -
ótico, pleural, pericárdico e ascítico; e (8) diversos tipos de tecido
sólido, i n c l u i n d o tipos celulares específicos. O C l i n i c a i a n d Labo-
r a t o r y Standards I n s t i t u t e ( C L S I , f o r m a l m e n t e c o n h e c i d o c o m o
National Committee for Clinicai Laboratory Standards ou
N C C L S ) p u b l i c o u diversos p r o c e d i m e n t o s para coleta de m u i t o s
dos mais c o m u n s tipos de amostras sob condições padronizadas 1 " 4 ,
assim c o m o de amostras especiais, c o m o para diagnóstico mole-
cular 5 e para análise de cloro n o suor. 8
43
44 PARTE I Princípios Laboratoriais
Sangue
O sangue, para análise, é obtido de veias, artérias ou capilares. O
sangue venoso é geralmente a amostra preferencial, e a venopun-
t u r a é o método para a obtenção da amostra. E m crianças peque-
nas e para muitos testes "ao leito", a punção da pele é freqüen-
temente usada para obter o que é em sua maioria sangue capilar;
a punção arterial é usada principalmente para a análise de gases
sanguíneos. O processo de coleta de uma amostra de sangue é
conhecido como f l e b o t o m i a e deve sempre ser realizado por u m
flehotomista treinado. Após a coleta, a amostra pode ser exami-
nada como sangue total, plasma (o l í q u i d o amarelo claro que
permanece após os componentes celulares serem removidos por
centrifugação) ou soro (líquido normalmente claro que se separa
do sangue que se permite coagular).
Venopuntura
A venopuntura é definida como todos os passos envolvidos na
obtenção de uma amostra de sangue apropriada e identificada da
veia do paciente.
Passos Preliminares
Antes de qualquer amostra ser coletada, o flebotomista precisa
confirmar a identidade do paciente. Dois o u três itens da iden-
tificação devem ser usados (p.ex., nome, n ú m e r o de registro
médico, data de nascimento, endereço se o paciente for ambula-
torial). E m situações especiais, como testes de uso de drogas ou
outros testes de importância médico-legal, o estabelecimento de
uma cadeia de custódia para a amostra requer uma identificação
extra do paciente, como identificação por fotografia.
A identificação é u m processo ativo O n d e for possível, o
paciente deve declarar seu n o m e e o flebotomista deve verificar
a informação na pulseira de identificação do paciente, se este
estiver hospitalizado. Se o paciente for ambulatoiial, o fleboto-
mista deve pedir ao paciente que diga seu nome e confirmar a
informação na requisição de exame com informações de identi-
ficação fornecidas pelo paciente. N o caso de pacientes pediátri-
cos, o pai ou responsável deve estar presente e fornecei a identi-
ficação ativa da criança. E m muitas instituições, nesta fase do
processo, deve-se perguntar ao paciente sobre alergia a látex. Se
houver histórico ou preocupação com alergias a luvas de látex o u
torniquete de látex, o flebotomista deve ter u m t o r n i q u e t e alter-
nativo e luvas sem látex.
Antes da coleta de uma amostra, o flebotomista deve estar
vestido adequadamente e com equipamento pessoal de segu-
rança. Esses equipamentos i n c l u e m u m jaleco impermeável e
luvas calçadas imediatamente antes da abordagem do paciente*"
para aderir às precauções padiões contra material potencialmente
infeccioso e para limitar a disseminação de doenças infecciosas
de u m paciente para outro. Se o flebotomista for coletar uma
amostra de u m paciente em isolamento no hospital, precisa
colocar jaleco e luvas limpas e uma máscara facial para limitar a
disseminação de gotículas potencialmente infecciosas e óculos de
proteção para limitar a possível entrada de material infeccioso no
o l h o antes de entrar na sala do paciente. A extensão das precau-
ções requeridas varia com a natureza da doença do paciente e as
políticas da instituição e programa para patógenos veiculados
pelo sangue, aos quais o flebotomista precisa aderir. Se forem
indicadas precauções para patógenos veiculados pelo ar, o flebo-
tomista deve usar u m respirador N 9 5 para proteção contra tuber-
culose (TB).
O paciente deve estar confortável: sentado o u deitado de
costas, se não for possível sentar, e deve ficar nessa posição quanto
tempo for possível antes da coleta da amostra ser feita (veja a seção
a seguir sobre efeitos da postura nos valores de exames). Para o
paciente ambulatorial, geralmente se recomenda que esses pacien-
tes f i q u e m sentados até o processo de identificação estar com-
pleto, para maximizar seu relaxamento. A venopuntura nunca
deve ser feita em u m paciente em pé. Os braços do paciente
devem estar estendidos em linha reta a partir do o m b r o até o
pulso Deve-se evitar u m braço com linha intravenosa inserida,
assim como se deve evitar u m braço com escoriação excessiva o u
hematoma n o local em que se pretende fazer a coleta. Se uma
m u l h e r tiver sido submetida e mastectomia, as veias do braço
nesse lado do corpo não devem ser usadas, pois a cirurgia pode
ter causado linfoestasia (interrupção do f l u x o de sangue n o r m a l
e drenagem de l i n f a por esse local), afetando a composição do
sangue. Se a m u l h e r foi submetida a dupla mastectomia, o
sangue deve ser coletado do braço n o lado em que foi feito o
p r i m e i r o procedimento. Se a cirurgia tiver sido feita dentro de
6 meses nos dois lados, deve ser usada uma veia n o dorso da
mão o u tornozelo.
Antes de realizar a venopuntura, o flebotomista deve (1) veri-
ficar os exames pedidos, (2) estimai o volume de sangue a ser
coletado e (3) selecionar os números e os tipos de tubos apropria-
dos para sangue, plasma ou soro necessários. E m muitas situações,
isto será facilitado por uma coleção de recomendações gerada por
computador e deverá ser planejado para coletar a m í n i m a quan-
tidade de sangue necessária para o teste. As seções a seguir, Coleta
de Sangue com Tubos ã Vácuo e Ordem de Obtenção para Coletas
Múltiplas, discutem os tipos de tubos e a ordem de coleta reco-
mendada para múltiplas amostras com mais detalhes.
A l é m dos tubos, é preciso selecionar uma agulha apropriada.
Os calibres mais comumente utilizados são os gauges 19 a 22.
Q u a n t o maior o gauge, menor o calibre. A escolha usual para
u m adulto com veias normais é o gauge 20; se as veias tendem a
colabar facilmente, prefere-se u m gauge 21. Para volumes de
sangue de 30 a 50 m L , pode ser necessária uma agulha 18 gauge,
que garanta u m fluxo de sangue adequado. Geralmente as
agulhas têm 1,5 polegadas (3,7 cm) de comprimento, embora
também se usem agulhas de 1 polegada (2,5 em), geralmente
conectadas a u m dispositivo de coleta escalpe ou "butterfly" (bor-
boleta). Todas as agulhas precisam ser estéreis, afiadas e sem
rebarbas. Q u a n d o o sangue for coletado para a mensuração de
elementos-traço, a agulha deve ser de aço inoxidável e livre de
contaminação
Localização
A veia cubital média na fossa antecubital, o u curva do cotovelo,
é o local preferido em adultos, pois a veia é larga e próxima à
superfície da pele.13 As veias no dorso da mão e no tornozelo
podem ser usadas, embora sejam menos desejáveis e devam ser
evitadas em diabéticos e outros indivíduos com problemas circu-
latórios. Nos pacientes internados, é apropriado coletar o sangue
através de uma cânula que é inserida para infusões de líquido
por longos períodos n o m o m e n t o da primeira inserção, para
evitar uma segunda picada. Não se deve usar u m braço canulado
ou com fístula arteriovenosa sem o consentimento do médico do
paciente. Se o f l u i d o estiver v i n d o de u m membro i n f u n d i d o por
via intravenosa, deve-se interromper o fluxo por 3 minutos antes
da coleta da amostra e deve ser feita uma anotação pertinente n o
prontuário do paciente. Os primeiros 5 a 10 m L de sangue cole-
tados devem ser descartados e não podem ser usados na realiza-
ção de exames devido a possíveis contaminações pelo l í q u i d o
i n f u n d i d o . As amostras obtidas d o braço oposto o u abaixo do
local de infusão no mesmo braço são satisfatórias para a maioria
dos exames, pois o fluxo retrógrado de sangue não ocorre nas
veias e o f l u i d o i n f u n d i d o precisa p r i m e i r o circular pelo coração
e então retornar antes de atingir o local de coleta.
 Coleta de Amostras e Outras Variáveis Pré-analíticas
Preparo do Local da Coleta
A área ao redor do local onde se pretende fazer a punção deve
ser limpa com qualquer substância anti-séptica que seja aprovada
para o uso pela instituição. Os materiais mais comumente utili-
zados são (1) swab pré-embalado com álcool, (2) u m a gaze satu-
Tada em isopropanol a 7 0 % e (3) solução de cloreto de benzalcõ-
n i o (solução cloreto de Zephiran 1:750). Esta ú l t i m a deve ser
usada quando as amostras são coletadas para a determinação de
etanol. A limpeza do local da p u n ç ã o deve ser feita c o m movi-
m e n t o circular e a partir do centro em direção centrífuga. Deve-
se deixar que a pele seque naturalmente ao ar. N e n h u m anti-
séptico o u álcool deve permanecer sobre a pele, pois os traços
podem causar hemólise e invalidar os resultados dos exames.
U m a vez que a pele esteja limpaj não deve ser tocada até após o
t é r m i n o da venopuntura.
Tempo de Coleta
O m o m e n t o no qual u m a coleta é obtida é importante para
aqueles constituintes do sangue sujeitos a variações diurnas mar-
cantes (p.ex., corticosteróides e ferro) e para aqueles usados paia
m o n i t o r a r o tratamento medicamentoso (Capítulos 28, 30 e 40).
O m o m e n t o da coleta t a m b é m é importante em relação às amos-
tras destinadas a mensurações de álcool e drogas em associação
a considerações médico-legais.
Oclusão Venosa
Após a pele ser limpa, deve-se aplicar u m manguito de aferir
pressão arterial ou u m torniquete de 4 a 6 polegadas (10 a 15
cm) acima do local em que se pretende puncionar (distância para
adultos). Essa oclusão venosa obstrui o retorno do sangue venoso
para o coração e distende as veias. Q u a n d o se utiliza u m manguito
de aferir pTessão arterial, este deve ser inflado a aproximada-
mente 60 m m H g (8,0 kPa). Os torniquetes são geralmente feitos
de tiras de borracha ou bandas de fita tipo Velcro. Raramente é
necessário manter o torniquete n o local por mais de 1 m i n u t o .
O c o r r e m pequenas mudanças na composição do sangue dentro
de 1 m i n u t o , p o r é m mudanças marcantes podem ser observadas
após 3 minutos.
A composição do primeiro sangue drenado, o sangue mais
próximo ao torniquete, é mais representativa da composição do
sangue circulante. A primeira amostra coletada deveria, portanto,
ser usada para aqueles analitos, como cálcio, que são pertinentes
para decisões médicas críticas. O sangue coletado depois mostra
um efeito maior do baixo fluxo de sangue (estase venosa), e a
ordem recomendada de coleta (veja a seguir) foi desenvolvida com
essas alterações em mente. C o m a estase venosa, água e pequenas
moléculas são absorvidas para dentro das células, concentrando os
materiais não dissolvidos, como proteínas e constituintes ligados à
proteína. Assim, o primeiro tubo pode mostrar u m aumento de
5 % de proteína, enquanto o terceiro tubo pode mostrar uma
alteração de 10%. A estase prolongada pode aumentar a concen-
tração de constituintes ligados à proteína em até 15%.
O bombeamento d o p u n h o antes da venopuntura deve ser
evitado, pois causa u m aumento das concentrações de potássio,
fosfato e lactato plasmático. A d i m i n u i ç ã o do p H sanguíneo pelo
lactato acumulado pode causar o aumento da concentração de
cálcio ionizado, embora isso se reverta ao n o r m a l dentro de 10
minutos após o torniquete ser liberado.
Coleta de Sangue com Tubos a Vácuo
Os tubos a vácuo para coleta de sangue geralmente são conside-
rados (1) menos caros, (2) mais convenientes e (3) mais fáceis de
usar do que as seringas. Os tubos a vácuo podem ser de vidro
soda-cal ou borossilicato, ou plástico (tereftalato de polietileno).
CAPÍTULO 3 45
Muitas instituições têm substituído os tubos de vidro por tubos
de plástico devido à d i m i n u i ç ã o na probabilidade de quebra e
conseqüente exposição a materiais infectantes. C o n t u d o , o vácuo
nesses tubos se perde c o m o tempo e se deve prestar atenção
especial às datas de expiração impressas em cada tubo.
Existem diversos tipos de tubos usados para a coleta por
venopuntura. 7 Eles variam pelo t i p o de aditivo presente e seu
volume. A COT da tampa usada identifica o aditivo (Tabela 3-1).
Alguns tubos de vidro são siliconizados para reduzir a adesão de
coágulos às paredes e à tampa e para diminuÍT o risco de hemó-
lise. Os tubos de v i d r o podem liberar ele mentos-traço e existem
tubos especiais para essas coletas. A l é m disso, a tampa pode
c o n t r i b u i r para u m erro pié-analítico através da liberação de
zinco o u interferência por T B E P (tri[2-butoxietil]fosfato), u m
constituinte da borracha.
A coleta de sangue em tubo contendo aditivo nunca deve ser
transferida para outro tubo, pois o primeiro aditivo pode inter-
ferir nos exames para amostras especificadas com outro aditivo.
A l é m disso, a transferência de aditivo de u m t u b o para o u t r o
deve ser minimizada (ou seus efeitos adversos reduzidos) através
de u m a adesão estrita às recomendações para a ordem dos tubos
utilizados (Tabela 3-2).'
A Figura 3-1 mostra u m sistema típico de coleta de sangue
com t u b o a vácuo. Este é u m exemplo de u m dispositivo de uso
ú n i c o c o m u m que incorpora uma cobertura que é seguramente
acoplada sobre a agulha quando a coleta está completa, de m o d o
a Teduzir o risco de o flebotomista se picar c o m uma agulha
recém-contaminada. U m a agulha o u escalpe ("kwtter/ty") é conec-
tada n o adaptador para tubos de coleta (Figura 3-2), e o tubo é
então cuidadosamente inserido nesse adaptador. Antes de ser
usado, deve se bater levemente no tubo pata desalojar qualquer
aditivo da tampa antes de a agulha ser inserida na veia. Isso evita
a aspiração do aditivo pela veia do paciente.
Após a pele estar limpa, a agulha deve ser guiada gentilmente
pata dentro da veia do paciente (Figura 3-3); uma vez a agulha
posicionada, o tubo deve ser pressionado contra o adaptador
paTa perfurar a tampa e liberar o vácuo. Q u a n d o o sangue começa
a f l u i r para dentro do tubo, o torniquete deve ser liberado sem
movimentar a agulha. O t u b o é preenchido até acabar o vácuo.
E de suma importância que o tubo a vácuo seja completamente
preenchido. M u i t o s aditivos são colocados no t u b o com base na
coleta "total". U m a vez que o tuho esteja completamente cheio,
este é então retirado do adaptador, levemente agitado por inver-
são e substituído por outro tubo, se necessário. Outros tubos
podem ser preenchidos usando-se o mesmo torniquete com o
adaptador no local. Q u a n d o forem necessários diversos tubos
para uma única coleta de sangue, uma válvula de interrupção—
contida no dispositivo de coleta e consistindo em uma borracha
tubular que desliza sobre a agulha que se abre para dentro do
tubo — é usada para evitar derramamento de sangue durante a
troca de tubos.
m
\ ,• , \. . .- y
Figura 3-1 Conjunto de venopuntura montado. (De Flynn JC:
Procedures in phlebotomy. 3rd ed. St Louis:Saunders, 2005:84 )
46 PARTE I Princípios Laboratoriais

TABELA 3-1 C n d i f i c a ç a o da C o r da T a m p a p a r a I n d i c a r o A d i t i v o n o T u b o de C o l e t a de Sangue a V á c u o

Tipo de Tubo Aditivo Cor da Tampa Alternativa

Tubos com gel separador Gel polímero sílica-ativador Vermelha/preta Ouro

Gel polímero/sílioa-ativador/heparina lítio Verde/cinza Verde-clara
Tubos para soro (sem aditivo) Interior revestido de silicone Vermelha Vermelha
Interior não revestido Vermelha Cor-de-rosa
Tubos para soro (com aditivos) Trombina (aditivo seco) Cinza/amarela Laranja
Ativados de coágulo particulado Amarela/vermelha Vermelha
Trombina (aditivo seco] Azul-clara Azul-clara
Tubos para sangue total/ plasma KjEDTA (aditivo seco) Roxa Roxa
KjEDTA (aditivo liquido) Roxa Roxa
Na2EDTA (aditivo seca) Roxa Roxa
Citrato, trissódio (coagulação) Azul-clara Azul-clara
Citrato, trissódio (taxa de sedimentação eritrocítária) Preta Preta
Fluoreto de sódio (agente anticoagulante) Cinza Verde clara
Heparina, lítio (aditivo líquido ou seco) Verde Verde
Oxalato de potássio/fluoreto de sódio Verde-clara Verde-clara
Heparina lítio/iodoacetato Verde-clara Verde-clara
Specialty tube (microbiologia)
Cultura de sangue Polianelo! sulfonato de sódio (SPS) Amarela-clara Amarela- clara
SpeciaUy tube (bioquímica)
Chumbo Heparina, potássio (aditivo líquido) Bege Bege
Heparina, sódio (aditivo seco) Azul royal Azul royal
Elementos-traço Interior revestido com silicone (tubo para soro) Azul royal Azul royal
Bioquímica (urgência) Trombina Cinza/amarela Laranja
Specialty tube (diagnóstico molecular)
Plasma K2EDTA (aditivo seco)/ polímero Opalescente Opalescente
Gel sílica-ativada Branca Branca
Solução ACD-A (NaaCitrato, 22,0 g/L; Amarelo-brilbante Amarelo-brilhante
ácido cítrico, 8,0 g/L; dextrose, 24,5 g/L)
Solução ACD-A (Na3Citrato, 13,2 g/L; ácido cítrico, Amarelo-brilhante Amarelo-brilhante
4,8 g/L; dextrose, 14,7 g/L)
Tubo para preparo de células Citrato de sódio com polímero líquido para gradiente Azul/preta Azul/preta
mononucleares de densidade
Heparina sódica com polímero líquido para Verdes/vermelha Verde/vermelha
gradiente de densidade

Modificado de Clinicai and Laboratory Standards Instititte/NCCLS. Evacuaied Tubes and Additives for Blood Spííimen Collectiov: CLSI/NCCLS Approved Standíirds HLA5, 5a
ed. Wtfyne, PA, Cíínical Lãbordiory institu te, 2003 e informação listada na página elenôníca à& Becion Dietiman (http://wvuw.bd.cam/)..

TABELA 3-2 O r d e m de C o l e t a R e c o m e n d a d a para C o l e t a de M ú l t i p l a s A m o s t r a s

Cor da Tampa Conteúdo Número de Inversões

Amarela Meio estéril para cultura de sangue 8

Azul royal Sem aditivo 0
Claro Sem aditivo, descartar o tubo se o azul royal não for usado 0
Azul-clara Citrato de sódio 3-4
Ouro/vermelha Tubo separador de soro 5
Vermelha/vermelha, laranjaVamarela, aiul royat Tudo para soro, com ou sem ativados de coágulo, com ou sem gel 5
Verde Tubo com heparina com ou sem gel 8
Bege (vidro) Heparina sódica 8
Azul myal Heparina sódica, EDTA sódico 8
Roxa, branca perolada, cor-de-rosa/cor-de-rosa, bege (plástico) Tubos com EDTA, com ou sem gel 8
Cinza Inibidor glicolítico 8
Amarela (vidro) AC D para estudos moleculares e cultura celular 8

Modificado das infuimaçâes nas referências. Cíinical and Laboratoiy Standards Injtitute/NCCLS. Evacua ted Tufa ar and AdcJitiiies for Blood SjJÉcimín Collection. CLSi/NCCLS
Approved Stãndar.s H1-A5, 5" ed. Wayne, PA, Clinicai Laboratory Institute, 2003 e 5o youte going to colifict a blood sperímen: An introducritm to phlehotomy. íla ed. Kieàile Fl
Noríhfifilíí, Í L Í CoIlegÉ of American Patluilogisti, 2005.

O c o n t a t o d i r e t o d e c o á g u l o o u células c o m o s o r o o u p l a s m a
p o d e l e v a r a alterações m e t a b ó l i c a s , p o r isso e x i s t e m t u b o s d e
c o l e t a c o m s e p a r a d o r p a r a e l i m i n a r esse p r o b l e m a ( T a b e l a 3-1).
Cada tubo c o n t é m u m material de p o l í m e r o de gel i n e r t e e
t í x o t r ó p i c o c o m u m a g r a v i d a d e específica d e a p r o x i m a d a m e n t e
1,04, a q u a l é i n t e r m e d i á r i a e n t r e o p l a s m a o u s o r o e os c o m p o -
n e n t e s c e l u l a r e s d o s a n g u e . Q u a n d o os t u b o s p r e e n c h i d o s são
c e n t r i f u g a d o s , esse gel sobe d o f u n d o d o tubo e forma uma
c a m a d a e n t r e o l í q u i d o e os c o m p o n e n t e s c e l u l a r e s d a a m o s t r a .
U m a vez c e n t r i f u g a d o , o gel serve c o m o u m a b a t r e i r a m e c â n i c a
 Coleta de Amostras e Outras Variáveis Pré-analíticas
Figura 3-2 Diversos adaptadores para tubos usados na venopuntura
(De Ftynn J C Procedures in phlebotomy. 3rd ed. St Louis.Saunders,
2005:79.)
Figura 3-3 V en o p u n tu r a (Cortesia de R u t h A n n M. Jacobsen,
Assistente Médica, Tecnóloga Médica (ASCP [Sociedade Americana de
Patologistas Clínicos]), Cientista de Laboratório Clínico & Flebotomista
de laboratório clinico (NCA [National Credentialing Agency for
Laboratory Personnel]), Mayo Clinic, Rochesrer, MN.)
e e l i m i n a as alterações metabólicas que o c o r r e m q u a n d o da per-
m a n ê n c i a de coágulo o u células e m c o n t a t o d i r e t o c o m o soro
o u plasma. A força centrífuga relativa (RCF) precisa ser de pelo
m e n o s 1.100 x g para a liberação d o gel e f o r m a ç ã o da barreira.
A liberação de c o m p o n e n t e s intracelulares para o sobrenadante
é evitada pela barreira p o r diversas horas ou, e m alguns casos,
p o r alguns dias.
CAPÍTULO 3 47
Ordem de Obtenção para Coletas Múltiplas
E m alguns pacientes pode o c o r r e r u m r e t o r n o d o f l u x o dos t u b o s
para as veias e m decorrência da d i m i n u i ç ã o da pressão venosa.
Esse f l u x o r e t r ó g r a d o é m i n i m i z a d o se o braço estiver posicio-
n a d o para baixo e o sangue for m a n t i d o sem c o n t a t o c o m a
t a m p a d u r a n t e o p r o c e d i m e n t o de coleta. Para m i n i m i z a r os
problemas, se ocorrer esse c o n t r a f l u x o , e para o t i m i z a r a quali-
dade das amostras — especialmente para evitar a c o n t a m i n a ç ã o
cruzada c o m a n t i c o a g u l a n t e s — o sangue deve ser coletado e m
tubos c o m a o r d e m delineada na Tabela 3-2.' Essa tabela t a m b é m
fornece o n ú m e r o r e c o m e n d a d o de inversões para cada t i p o de
t u b o , pois é f u n d a m e n t a l q u e a c o m p l e t a m i s t u r a de q u a l q u e r
aditivo c o m o sangue coletado seja c o m p l e t a d a o mais r á p i d o
possível.
Coleta de Sangue com Seringa
A s seringas são c o s t u m e i r a m e n t e usadas para pacientes c o m veias
das quais é d i f í c i l coletar sangue e para a análise de gases n o
sangue. Q u a n d o se usa u m a seringa, a agulha é colocada f i r m e -
m e n t e sobre o b i c o da seringa e a c o b e r t u r a da agulha é r e m o v i d a .
A seringa e a agulha devem estar alinhadas c o m a veia para ser
i n t r o d u z i d a e a agulha e m p u r r a d a para d e n t r o da veia n o â n g u l o
c o m a pele de a p r o x i m a d a m e n t e 15°. Q u a n d o a resistência i n i c i a l
da parede da veia é v e n c i d a n o m o m e n t o da perfuração, d i m m u i -
se pressão aplicada na seringa. Se f o r necessária u m a segunda
seringa, u m a gaze p o d e ser colocada sob o conector da agulha
para absorver o derrame; a p r i m e i r a seringa é então r a p i d a m e n t e
desconectada e a segunda colocada e m seu lugar para c o n t i n u a i
a coleta A p ó s remover a agulha da seringa, o sangue coletado
deve ser r a p i d a m e n t e t r a n s f e r i d o p o r ejeção suave e m t u b o s pre-
parados para sua recepção o u p r o n t a m e n t e analisado n o caso de
gases sanguíneos. Os tubos devem então ser fechados e cuidado-
samente agitados.
A retirada vigorosa de sangue para a seringa d u r a n t e a coleta
o u a transferência c o m força da seringa para o t u b o receptor p o d e
causar h c m ó l i s c d o sangue. A h c m ó l i s c geralmente é m e n o r
q u a n d o o sangue é d r e n a d o através de u m a agulha de calibre
p e q u e n o d o q u a n d o se usa u m a agulha de calibre maior.
Término da Coleta
Q u a n d o a coleta de sangue está c o m p l e t a e a agulha é retirada,
o paciente é i n s t r u í d o a segurar u m a gaze seca sobre o local da
p u n ç ã o , c o m o braço elevado para d i m i n u i r a p r o b a b i l i d a d e de
extravasamento de sangue. U m a nova compressa é subseqüente-
m e n t e segura n o local p o r u m a bandagem, a q u a l é r e m o v i d a
após 15 m i n u t o s . C o m u m dispositivo de coleta c o m o o mos-
trado n a Figura 3-1, a agulha é coberta e a agulha e o a d a p t a d o r
são i m e d i a t a m e n t e descartados e m u m a caixa para descarte de
objetos p e r f u r o c o r t a n t e s . N o caso de se usar u m escalpe ("butter-
fly"), as abas são puxadas para frente para c o b r i r a agulha, o u ,
c o m u m novo e q u i p a m e n t o disponível, u m b o t ã o é pressionado,
l i b e r a n d o u m a m o l a que retrai a agulha.
T o d o s os t u b o s d e v e m então ser etiquetados para a p o l i t i c a
i n s t i t u c i o n a l ; r a r a m e n t e é aceitável u m t u b o pré-etiquetado. A s
luvas devem ser descartadas e m u m receptáculo para resíduos
perigosos se estiver visivelmente c o n t a m i n a d a . D e p e n d e n d o da
p o l í t i c a i n s t i t u c i o n a l , as mãos devem ser lavadas c o m sabão e
água o u u m anti-séptico à base de álcool deve ser usado antes de
se calçarem luvas novas e atender o p r ó x i m o paciente.
Venopuntura e m Crianças
A s técnicas de v e n o p u n t u r a e m crianças e adultos são semelhan-
tes. C o n t u d o , as crianças apresentam m a i o r p r o b a b i l i d a d e de
fazer m o v i m e n t o s inesperados e f r e q ü e n t e m e n t e é desejável ajuda
48 PARTE I Princípios Laboratoriais
para contê-las. Pode-se usar o u u m a seringa o u u m tubo a vácuo para
coletar as amostras. A seringa deve ser d o t i p o t u b e r c u l i n a o u
u m a seringa de capacidade para 3 m L , exceto q u a n d o se necessita
u m grande v o l u m e de sangue para a análise. U m a agulha de 21
a 23 gauge o u u m escalpe de 20 a 23 gauge c o m sonda conectada
são apropriados para coletar as amostras.
Punção da Pele
A p u n ç ã o da pele é u m a técnica de coleta aberta na q u a l a pele
é puncionada por u m a lanceta e u m pequeno v o l u m e de sangue é
coletado e m u m m i c r o dispositivo. N a prática, é usada e m situa-
ções nas quais (1) o v o l u m e da amostra é l i m i t a d o (p.ex., aplica-
ções pediátricas), (2) as v e n o p u n t u r a s repetidas t e n h a m resultado
e m grave d a n o à veia o u (3) os pacientes t e n h a m s o f r i d o queima-
duras o u estejam c o m b a n d a g e m e as veias estejam, p o r t a n t o ,
indisponíveis para a v e n o p u n t u r a . Essa técnica é t a m b é m c o m u -
m e n t e utilizada q u a n d o a amostra é aplicada d i r e t a m e n t e ao
aparelho de exame e m u m a situação de exame ao pé d o leito o u
papel de f i l t r o . E mais f r e q ü e n t e m e n t e realizada (1) n a p o n t a do
dedo, (2) n o lobo da o r e l h a e (3) n o calcanhar o u dedão d o pé
de crianças. Por exemplo, e m u m a criança c o m menos de 1 ano
de idade, a superfície p l a n t a r (sola) lateral o u m e d i a l d o pé deve
ser usada para a punção da pele (Figura 3^4). E m crianças mais
velhas, pode ser usada a superfície p l a n t a r d o dedão d o pé,
e m b o r a a coleta de sangue de qualquer local d o pé deva ser
evitada e m pacientes ambulatoriais. O p r o c e d i m e n t o c o m p l e t o
para coleta de sangue de crianças usando a p u n ç ã o de pele é
descrita n o CLS1 padrão H 4 - H 5 . 2
Para coletar uma amostra de sangue p o r p u n ç ã o da pele, o
f l e b o t o m i s t a precisa p r i m e i r o l i m p a r m i n u c i o s a m e n t e a pele c o m
u m a compressa de gaze satuiada e m u m a solução anri-séptica
aprovada para o uso pela i n s t i t u i ç ã o c o m o descrito a n t e r i o r m e n t e
para a v e n o p u n t u r a . Q u a n d o a pele estiver seca, é r a p i d a m e n t e
p u n c i o n a d a p o r uma lanceta. A p r o f u n d i d a d e da incisão deve
ser m e n o r que 2,5 m m para evitar c o n t a t o c o m o osso. Para
m i n i m i z a r a p r o b a b i l i d a d e de infecção, deve-se selecionar u m
local diferente a cada p u n ç ã o . Se f o r usado u m dedo, este deve
ficar e m u m a posição de m o d o q u e a gravidade auxilie a coleta
d o sangue na p o n t a d o d e d o e a lanceta deve ser segura de m o d o
a realizar a incisão o mais p e r p e n d i c u l a r possível à unha. 1 3 Deve-
se evitar massagear o dedo para estimular o f l u x o de sangue, pois
isso causa a saída de debris e o tecido f l u i d o q u e não t e m a mesma
composição d o plasma. Para m e l h o r a r a circulação d o sangue, o
dedo ( o u o calcanhar n o caso de p u n ç ã o p l a n t a r ) p o d e ser aque-
cid o p o r m e i o da aplicação de u m a toalha seca aquecida o u u m
dispositivo especializado, c o m o u m aquecedor de calcanhar, p o r
3 m i n u t o s antes de aplicar a lanceta. A p r i m e i r a gota de sangue
Figura 3-4 Locais aceitáveis para a punção de pele para coleta de
sangue do pé de um bebê. (Modificado de Blumenfeld, TA, Turi GK,
Blanc "WA. Recommended sice and depth of new b o r n heel punctures
base on anatomical measurements and histopathology. Reimpresso com
permissão da Elsevier [Lancei: 1979:1:230-3]).
é r e m o v i d a , e as gotas subseqüentes são transferidas para u m t u b o
de coleta a p r o p r i a d o p o r leve c o n t a t o . O p r e e n c h i m e n t o deve ser
feito r a p i d a m e n t e para evitar a coagulação, e a i n t r o d u ç ã o de
bolhas de ar deve ser evitada.
O sangue é coletado e m t u b o s capilares p o r ação capilar.
Existem diversos tipos de t u b o s capilares disponíveis comercial-
m e n t e , i n c l u i n d o aqueles q u e c o n t ê m diferentes anticoagulantes,
c o m o heparina sódica e h e p a r i n a a m ó n i o , e alguns estão dispo-
níveis e m v i d r o escuro para a coleta de analitos sensíveis à luz,
c o m o a b i l i r r u b i n a . A s s i m c o m o para os tubos a vácuo, para
evitar a p r o b a b i l i d a d e de q u e b r a e disseminação da infecção, os
capilares f r e q ü e n t e m e n t e são de plástico o u revestidos p o r plás-
ticos. U m a desvantagem de alguns desses dispositivos de coleta
é que o sangue tende a se a c u m u l a r na boca d o t u b o e precisa
ser r e m o v i d o c o m u m leve peteleco, c r i a n d o o risco de hemólise.
A coleta gota-a-gota deve ser evitada, pois a u m e n t a a hemólise.
Para a coleta de amostras de sangue e m papel de f i l t r o para
exames neonatais, e crescentemente para testes de genética mole-
cular, o papel de f i l t r o é levemente tocado contra u m a grande
gota de sangue a q u a l se p e r m i t e absorver pelo papel para preen-
cher u m c i r c u l o marcado. Deve-se fazer apenas u m a ú n i c a apli-
cação p o r círculo. T a l c o m o n a coleta e m tubos capilares, deve-se
evitar espremer o u " o r d e n h a r " o dedo o u o pé. Os papéis de
f i l t r o devem ser secos ao ar (geralmente 2 a 3 horas para evitar
m o f o e supercrescimento bacteriano) antes de serem armazena-
dos e m u m envelope de papel etiquetado a p r o p r i a d a m e n t e . O
sangue n u n c a deve ser transferido pata o papel de f i l t r o após ter
sido coletado e m tubos capilares, p o r q u e p o d e ter o c o r r i d o coa-
gulação parcial, c o m p r o m e t e n d o a q u a l i d a d e da amostra.
P u n ç ã o Arterial
As punções arteriais r e q u e r e m u m a considerável h a b i l i d a d e e
geralmente são realizadas apenas p o r médicos o u técnicos e enfer-
meiras especialmente treinados. As amostras arteriais são usadas
p r i m o r d i a l m e n t e para a análise de gases sanguíneos. Os locais
preferidos para a p u n ç ã o arterial são (1) a artéria radial n o pulso,
(2) a artéria b r a q u i a l n o cotovelo e (3) a artéria f e m o r a l na v i r i l h a .
Faz-se uso mais f r e q ü e n t e dos locais n o braço, pois o extravasa-
m e n t o de sangue da artéria f e m o r a l t e n d e a ser m a i o r , especial-
m e n t e e m idosos. A técnica apropriada para a punção arterial é
descrita n o CLS1 p a d r ã o H 1 1 - A 4 J
Fatores que Afetam a Coleta de Sangue
Os fatores que afetam a coleta de sangue i n c l u e m o uso de anti-
coagulantes e conservantes, local da coleta e hemólise.
Anticoagulantes e Conservantes para o Sangue
Para coletar o plasma o u u m a amostra de sangue na ausência de
coagulação, é preciso a d i c i o n a r u m anticoagulante n o sangue
total. Existe u m a variedade de anticoagulantes, i n c l u i n d o hepa-
rina, e t i l e n o d i a m i n o tetr acético ( E D T A ) , ácido citrato dextrose
( A C D ) , f l u o r e t o de sódio, c i t r a t o , oxalato e iodoacetato.
Heparina. A h e p a r i n a é o anticoagulante mais a m p l a m e n t e
utilizado para exames b i o q u í m i c o s e hematológicos, mas é ina-
ceitável para a m a i o r i a dos exames realizados utilizando-se reação
em cadeia da polimerase (PCR), p o r q u e este grande polissacari-
deo i n i b e a enzima polimerase. A h e p a r i n a é u m glicosaminogli-
cano e é d i s p o n i b i l i z a d a c o m o sais de sódio, potássio, l í t i o e
a m ó n i o , todos os quais evitam adequadamente a coagulação. A
h e p a r i n a t e m a desvantagem d o custo elevado e produz u m f u n d o
azul nos esfregaços de sangue corados c o m o corante de W r i g h t .
Tem-se relatado que a h e p a r i n a inibe a atividade da fosfatase
ácida e interfere na ligação d o cálcio c o m o E D T A em métodos
analíticos para mensuração de cálcio envolvendo a formação de u m
 Coleta de Amostras e Outras Variáveis Pré-analíticas CAPÍTULO 3 49

complexo com o E D T A . Também tem sido relatado que afeta a O sangue obtido por punção da pele é contaminado de
ligação da t r i i o d o t i r o n i n a (T 3 ) e da tiroxina (T 4 ) às suas proteínas alguma forma com fluidos intersticial e intracelular, resultando
carreadoras, produzindo assim altas concentrações livres desses no aumento da glicose e potássio e com diminuição da bilirru-
hormônios. bina, cálcio, cloro, sódio e proteína total, comparado ao sangue
EDTA. O E D T A é u m agente quelante, ligando-se a cátions venoso."
hivalentes como o Ca 2+ e o Mg 2 ". E particularmente ú t i l para
exames hematológicos e isolamento de D N A genômico, pois
preserva os componentes celulares do sangue. O E D T A é usado Coleta de Sangue de Linhas Intravenosa ou Arterial
como sal dissódico, dipotássico e tripotássico, sendo os dois Q u a n d o o sangue é coletado através de u m cateter venoso central
últimos mais solúveis. É efetivo na concentração final de 1 a 2 g / L ou uma linha arterial, é necessário garantir que a composição da
de sangue. Altas concentrações hipertõnicas retraem as células amostra não seja afetada pelo f l u i d o que está sendo i n f u n d i d o
vermelhas. O E D T A evita a coagulação por se ligar ao cálcio, o n o paciente. Os fluidos devem ser interrompidos usando u m a
qual é essencial para o mecanismo de coagulação. Os novos válvula de interrupção de fluxo no cateter e 10 m L de sangue são
avanços no uso do E D T A compreendem a inclusão de uma aspirados através da válvula de três vias e descartados antes de a
barreira de gel {tubos brancos, Tabela 3-1). amostra a ser analisada ser coletada. O sangue coletado adequa-
ACD. C o m o indicado anteriormente, a coleta de amostras n o damente através de u m cateter venoso central e comparado com
E D T A pode ser usada para o isolamento do D N A genômico do o sangue retirado de uma veia periférica no mesmo m o m e n t o
paciente, e, simultaneamente a esse teste, exames diagnósticos mostra diferenças notáveis na concentração de alguns componen-
adicionais e complementares, como exames de citogenética, serão tes como ilustrado na Tabela 3-3.
cada vez mais requisitados. Por essa razão, as amostras para diag-
nóstico molecular são freqüentemente coletadas em anticoagu-
lante A C D de modo a preservar tanto a forma como a função dos Hemólise
componentes celulares. Existem dois aditivos A C D comumente A hemólise é definida como a ruptura da membrana das hemá-
utilizados (Tabela 3-1), que diferem entre si pela concentração dos cias e resulta na liberação de hemoglobina e outros componentes
aditivos com base no volume da amostra a ser coletada. celulares. O soro mostra evidência visual de hemólise quando as
Outros Anticoagulantes. O fluoreto de sódio é u m anticoagu- concentrações de hemoglobina excedem 200 m g / L . A hemólise
lante fraco, mas é freqüentemente adicionado como u m conser- leve apresenta pouco efeito na maioria dos valoies dos exames.
vante da glicose no sangue. C o m o conservante, j u n t o com outro Para os testes bioquímicos comuns, a hemólise grave causa u m
anticoagulante, como o oxalato de potássio, é efetivo na concen- ligeiro efeito de diluição naqueles constituintes presentes em
tração de aproximadamente 2 g / L de sangue; quando usado menor concentração nos eritrócitos do que no plasma. C o n t u d o ,
sozinho para evitar a coagulação, é necessária uma concentração u m efeito notável pode ser observado naqueles constituintes que
3 a 5 vezes maior. Exerce sua ação conservante p o i i n i b i r os sis- estão presentes em concentração maior nos eritrócitos do que no
temas enzimáticos envolvidos na glicólise, mas interfere em plasma, como a lactato desidrogenase (LD), potássio, magnésio e
muitos exames comuns para uréia nitrogenada através da inibi- fosfato. A interferência espectral pela hemoglobina em sistemas
ção da enzima urease. de exames bioquímicos deve ser avaliada no m o m e n t o da imple-
A solução de citrato de sódio (não confunda com a solução mentação do novo método.
A C D descrita anteriormente), a uma concentração de 24 a 28 g / L
em uma razão de 1 parte para 9 partes de sangue, é amplamente
usada para estudos de coagulação porque seu efeito é facilmente
reversível pela ação do Ca 2+ . Justamente por o citrato quelar o
cálcio, este anticoagulante é claramente inapropriado para as TABELA 3-3 Influência do Local de Coleta na
amostras destinadas à mensuração deste elemento. Composição do Plasma*
Os oxalatos de sódio, potássio, a m ó n i o e lítio i n i b e m a coa- Venoso Venosa
gulação sanguínea pela formação de complexos u m pouco inso- Arterial Central Periférica
lúveis com íons cálcio. O oxalato de potássio (K2C2O4 • H 2 0 ) ,
Alanina aminotransferase (U/L) 62 61 81
na concentração de aproximadamente 1 a 2 g / L de sangue, é o
Fosfatase alcalina (U/L) 114 113 107
oxalato mais amplamente utilizado.
Amilase (U/L) 149 148 177
O iodoacetato de sódio na concentração de 2 g / L é u m
CálCiD (mg/L) 81 82 83
agente anticoagulante efetivo e u m substituto do fluoreto de Cloro (mmol/L) 99 97 101
sódio. Por não exercer n e n h u m efeito sobre a urease, é usado Creatinina quinase (U/L) 82 73 91
quando são realizados testes de glicose e uréia na mesma amostra. Potássio (mmol/L) 4,0 3,9 3,8
Apresenta pouco efeito na maioria dos testes. Sódio (mmol/L) 144 145 144
Proteína total (g/L) 66 60 77
Uréia nitrogenada (mg/L) 320 310 250
Local da Coleta Modificado de Rom-meí K Koch CD, Spiiler D. Ein/liiss der macerkiÍgí«línnung auf
As amostras de sangue obtidas de diferentes locais diferem em ícliniíchrcfiemiíchÉ Parameter in BÍIÍE, PIÍUTTW und Serum bei Taiiemen míi stflbílem
composição. O sangue obtido por punção da pele é mais seme- und centra li siCTtem Kreislau/. J Clin Ctiem Clin Biocfiem 1978; 16:373-80
lhante ao sangue arterial do que ao sangue venoso. Não existem *Para estimar o provável efeito de um famr seW cs TÊSUIIÜAJÍ, •ráíflrions 0 aumento
diferenças clinicamente significantes entre o sangue capilar livre- pzrcemual ou diminuição mostrada (ou sugerida) na tabela para variação analítica
(±% CV) rotineiramente encontrada para analhos.
mente circulante e o sangue arterial em p H , P C 0 2 , P02 e satura-
Não foi mostrada diferença entre albumina, A,ST, aeaiinma, G G T & ácido lírico.
ção de oxigênio, enquanto a P C 0 2 do sangue venoso é maior do
que 6 a 7 m m H g (0,8 a 0,9 kPa). A glicose do sangue venoso é
cerca de 70 m g / L (0,39 m m o l / L ) u m pouco menor que a glicose
do sangue capilar como resultado do metabolismo tecidual.
50 PARTE I Princípios Laboratoriais
Urina
O tipo de amostra de urina a ser coletada é ditado pelos exames
a serem realizados. As amostras aleatórias o u com tempo de
coleta não determinado são confiáveis para apenas poucos testes
bioquímicos; geralmente as amostras de urina são coletadas
durante u m intervalo de tempo predeterminado, como 1, 4 ou
24 horas. U m a amostra colhida pela manhã cedo, em j e j u m e
limpa é geralmente a amostra mais concentrada e, assim, prefe-
rida para exames de microscopia e para a detecção de quantida-
des anormais de constituintes, como proteínas, ou de compo-
nentes não usuais, como a gonadotrofina coriônica.
A amostra limpa com tempo exato pode ser obtida em
momentos específicos do dia o u durante certas fases do ato de
micção. O exame bacteriológico dos primeiros 10 m L de urina
eliminados é mais apropriado para detectar uretrite, enquanto
o jato médio é melhor para a investigação de problemas na
bexiga. A amostra por micção dupla é a urina excretada durante
u m período de tempo após o completo esvaziamento da bexiga;
é usada, por exemplo, para avaliar a excreção de glicose durante
o teste de tolerância à glicose. De m o d o semelhante, em alguns
distúrbios metabólicos, a urina precisa ser coletada durante ou
imediatamente após os sintomas da doença aparecerem.
Embora os exames n o laboratório He análises bioquímicas
não sejam usualmente afetados pela coleta de amostras não
estéreis, a genitália do paciente deve ser higienizada antes de
cada micção para minimizar a transferência de bactérias da
superfície para a urina. A higiene é essencial quando se pretende
obter a verdadeira concentração de células brancas na urina. Os
detalhes para a coleta de amostras de u r i n a estão contidos em
u m manual do CLSI.^
A m o s t r a s de Urina Minutadas
O período de coleta para amostras minutadas deve ser de
duração longa o suficiente para minimizar a influência de varia-
ções biológicas de curta duração. Q u a n d o as amostras são cole-
tadas durante u m período de tempo determinado, é importante
a adesão do paciente às instruções. A bexiga precisa ser esvaziada
no m o m e n t o em que a coleta se inicia, e, assim, a primeira urina
é descartada. Depois, toda a urina precisa ser coletada até o f i m
do tempo estabelecido. Se o paciente apresentar uma movimen-
tação intestinal durante o período de coleta, devem-se tomar
precauções para evitar a contaminação fecal. Se a coleta for feita
durante várias horas, a u r i n a deve ser passada para u m frasco
separado em cada micção e então esvaziada em u m frasco maior
para completar a amostra. Esse procedimento em dois passos
evita o perigo de o paciente derramar sobre si mesmo conser-
vantes, como ácido. O frasco maior deve ser armazenado a 4°C
em u m refrigerador durante todo o período de coleta.
Para urina de 2 horas, geralmente é adequado u m frasco de
u m litro pré-etiquetado. Para a urina de 12 horas, geralmente
u m frasco de 2 litros é o suficiente; para a urina de 24 horas, é
apropriado, para a maioria dos pacientes, u m frasco de 3 a 4
litros. U m único frasco permite a mistura adequada da amostra
e evita a possível perda de alguma parte da amostTa se u m
segundo frasco não chegar ao laboratório. A urina não deve ser
coletada ao mesmo tempo para dois ou mais exames que neces-
sitem de conservantes diferentes. As alíquotas para cada análise,
como exame microscópico o u testes moleculares, não devem ser
removidas enquanto a coleta de 24 horas estiver em processo.
A remoção das alíquotas não é permissível mesmo quando o
volume removido é medido e corrigido, pois a excreção da
maioria dos componentes varia ao longo do dia e os resultados
dos exames serão afetados. A informação apropriada a respeito
da coleta, incluindo alertas a respeito da manipulação da amostra,
deve aparecer na etiqueta do frasco.
Coleta de Urina de Crianças
Para coletar uma amostra de urina aleatória de uma criança, o
pênis e a área perineal e escrotal são primeiro limpos e secos, para
remover qualquer óleo da pele, natural ou aplicado. U m a bolsa
plástica (U-bag, Hollister Inc, Chicago; o u Tink-Col, C.R. Bard,
Inc, Murray H i l l , N.J.) é colocada ao redor da genitália do bebê e
deixada no local até a urina ser excretada. Para coleta minutada
de bebês, usa-se uma cama metabólica. O bebê é deitado sobre
uma fina tela sobre u m a base em forma de f u n i l contendo u m
dreno sob o qual o coletor é colocado para receber a urina. A tela
fina retém o material fecal. Todavia, é provável que a urina esteja
contaminada, em alguma quantidade, poT esse material. A coleta
de amostras de crianças mais velhas é feita como em adultos,
usando a ajuda de u m dos pais quando necessário.
Conservantes de Urina
Os conservantes mais comuns e os volumes recomendados para
a coleta m i n u t a d a estão listados na Tabela 3-4. Os conservantes
possuem papéis diferentes, mas geralmente são adicionados para
reduzir a ação bacteriana o u decomposição química ou para solu-
bilizar constituintes que possam de outra forma precipitar na
solução. As amostras para alguns testes não devem ter quaisquer
conservantes adicionados devido à possibilidade de interferência
com os métodos analíticos.
U m a das formas mais satisfatórias de conservação da urina é
a refrigeração imediatamente após a coleta. A refrigeração tem
ainda mais sucesso quando combinada com a conservação
química, como pastilhas de conservante urinário ou acidificação.
A acidificação para p H abaixo de 3 é amplamente usada para
conservar as amostras de 24 horas e é particularmente ú t i l para
as amostras destinadas à mensuração de cálcio, esteróides e ácido
vanililmandélico ( V M A ) .
U m a base fraca, como o bicarbonato de sódio ou u m a
pequena quantidade de h i d r ó x i d o de sódio (NaOH), é usada
para conservar as amostras para determinações de porfirinas,
urobilinogênio e ácido úrico. U m a quantidade suficiente deve
ser adicionada para ajustar o p H entre 8 e 9.
Quando uma coleta minutada é completada, a amostra deve
ser entregue sem demora no laboratório de análises clínicas, onde
o volume deve ser mensurado. Isto pode ser feito usandn-se cilin-
dros graduados ou por pesagem do frasco e urina quando são
usados frascos pré-pesados ou uniformes. A massa em gramas pode
ser registrada como se fosse o volume em mililitros. Raramente
TABELA 3-4 Conservantes de U r i n a C o m u m e n t e U f i l h a d o s *
Conservante Concentrações/Volumes
HCI 6 mol/L; 30 mL por coleta de 24 lioras
Acido Acético 50%; 25 mL por coleta de 24 horas
NajCOa 5 g por nnifita dfi 24 horas
HNOa 6 mol/L; 15 mL por coleta de 24 horas
Acido bórico 10 g por coleta de 24 horas
"Modificado das in/ormaçõâs disponiueij em Cínica! and Laboratory Standartk
J[rtlí[c/Tv'( "C1S Rouline (jVí^Lií}'n anti CoiíecriDn, Transportai! on, and
Preseruarion of Urine SpÉcim^ns: CLSI/NCCLS Approved Guiíleíine GP16-A2, 2"
ed. Wayn£, PA: Ciínica! arul Laboraíory Standards insrituce, 200].
 Coleta de Amostras e Outras Variáveis Pré-analíticas
existe a necessidade de medir a gravidade específica de uma amostra
pesada, pois os erros na análise geralmente excedem o erro que
advém da falha em corrigir o volume da urina por sua massa.
Para cada exame solicitado, antes de a amostra ser transferida
paia fiascos pequenos, esta precisa ser minuciosamente misturada
para. garantir a liornogeneidade, pois a composicão da urina irá
variar durante o período de coleta. A etiqueta nos frascos menores
precisa ser colocada no próprio frasco, e não na tampa.
Fezes
As fezes são mais comumente testadas para microrganismos
como causa de diarréia e p a r a o g r u p o heme como indicador de
uma úlcera sangrante o u doença maligna no trato gastrointesti-
nal. As fezes de crianças podem ser examinadas para a atividade
tríptica para determinar a fibrose cística. E m adultos, a excreção
fecal de nitrogênio e gordura é usada para avaliar a gravidade da
malabsorção e a mensuração das porfirinas fecais é ocasional-
mente requerida para caracterizar o tipo de porfiria.
Geralmente não se adiciona n e n h u m conservante nas fezes,
mas o coletor pode ser mantido refrigerado durante o período
de coleta e deve-se tomar cuidado paia evitar a contaminação
com urina.
Líquido Cerebrospinal
O liquido espinal é normalmente obtido da região lombar,
embora o médico possa ocasionalmente solicitar o líquido obtido
durante a cirurgia de região cervical o u de uma cisterna ou ven-
trículo do cérebro. O líquido espinal é examinado quando existe
dúvida a respeito da presença de (1) acidente vascular cerebral,
(2) meningite, (3) doença desmielinizante ou (4) envolvimento
da meninge em doença maligna. As punções lombares devem ser
sempre realizadas pelo médico. Os tubos de coleta devem estar
estéreis, especialmente se forem solicitados testes microbiológi-
cos. O primeiro tubo deve ser usado para testes bioquímicos e
sorológicos; o segundo, para testes microbiológicos; e o terceiro,
para exame microscópico e citológico, pois a amostra inicial pode
estar contaminada por deferis teciduais o u bactérias da pele.
Líquido Sinovial
A técnica de obtenção do líquido sinovial para exame é chamada
de artrocentese. O líquido sinovial é retirado das articulações
para auxiliar a caracterizar o tipo de artrite e para diferenciar
efusões não-inflamatórias de fluidos inflamatórios. Normal-
mente, nas condições inflamatórias, está presente apenas uma
quantidade m u i t o pequena de líquido. A artrocentese deve ser
realizada pelo médico usando-se procedimento estéril, e a técnica
precisa ser modificada para cada articulação dependendo da loca-
lização anatômica e do tamanho da articulação. O médico deve
estabelecer prioridades para os exames a serem realizados no caso
de o volume de líquido disponível ser insuficiente para todos os
testes. Os tubos estéreis devem ser usados para diagnóstico mole-
cular, cultura e para mensuração de glicose e proteínas; é preciso
u m tubo com E D T A para contagem total e diferencial de leucó-
citos e de eritrócitos, As lâminas de microscopia são preparadas
com coloração de G r a m ou outras colorações indicadas e para a
inspeção visual macroscópica.
Líquido Amniótico
A coleta do líquido amniótico (amniocentese) é realizada por u m
médico para (1) diagnóstico pré-natal de doenças congênitas, (2)
avaliar a maturidade fetal ou (3) procurar por isoimunização R h
o u infecção intra-uterina.
Para obter uma amostra de líquido amniótico, a pele é pri-
meiro limpa e anestesiada, e são aspirados 10 m L de líquido em
CAPÍTULO 3 51
uma seringa conectada a uma agulha espinal. Para o transporte
do líquido para o laboratório são utilizados coletores estéreis,
como tubos de ensaio de polipropileno o u coletores de utina. O
coletor deve seT colocado imediatamente no gelo se a amostra for
destinada à determinação do desenvolvimento do pulmão fetal
u s a n d o a relação lecitiiia/esfingoiiiieliiia (L/S) ou u m a razão
albumina/surfactante. Para análise por espectofotometria, a
amostra deve ser transferida para u m tubo escuro para se evitar
a fotodegradação da bilirrubina. C o m o alternativa, o coletor da
amostra pode ser embrulhado em papel de alumínio.
Líquidos Pleural, Pericárdico e Ascítico
Normalmente as cavidades pleural, pericárdica e peritoneal contêm
uma pequena quantidade de liquido seroso que lubrifica as super-
fícies das membranas parietal e visceral. As inflamações o u infec-
ções que afetam as cavidades causam o acúmulo de líquido. O
líquido pode seT removido para determinar se é uma efusão ou u m
exsudato, uma distinção possível por análise de proteínas o u
enzimas. O procedimento de coleta é chamado de paracentese.
Quando especificamente aplicado à cavidade pleural, o procedi-
mento chama-se toracocentese; se aplicado à cavidade pericárdica,
pericardiocentese. As parecenteses devem ser realizadas apenas por
médicos treinados c experientes. Atualmente, a pcricardiocentcsc
tem sido largamente suplantada pela ecocardiografia.
Saliva
Embora se defenda mensurar concentrações de certos analitos
na saliva, as aplicações clínicas dos métodos usando saliva são
limitadas. As exceções são as mensurações de substâncias do
grupo sanguíneo para determinar o estado secretor e o genótipo
e, mais recentemente, para detectar a presença de anticorpos
anti-HIV. Veja nos Capítulos 30 e 31 discussões sobre a mensu-
ração de drogas na saliva.
Q u a n d o se necessita de uma amostra de saliva, pede-se ao
indivíduo que enxágüe a boca com água e então masque u m
material inerte, como u m pedaço de borracha o u cera de parafina
por 30 segundos ou até alguns minutos. A primeira saliva que
preenche a boca é descartada; depois a saliva é coletada em u m
pequeno frasco de vidro.
Células Específicas
A coleta de células bucais especificas da cavidade bucal tem sido
identificada como uma excelente fonte de D N A genômico.
Existem dois métodos comuns de coleta. Em u m método, uma
pequena quantidade de enxágüe bucal é dada ao paciente, que
deve bochechar e então devolver o líquido do enxágüe a u m tubo
de coleta. E preciso testar a presença de fenol e etanol no líquido
de enxágüe bucal específico para garantir a recuperação de células
viáveis. N o segundo método, utiliza-se swab para coleta de amostra
para exames microbiológicos; contudo, swab são algumas vezes
utilizados para coletar células bucais. Dá-se preferência siuaf) de
Dacron ou íayon com haste plástica, porque siuaks de alginato de
cálcio inibem os testes com base em PCR. Após a coleta, o mwb
pede ser armazenado em u m frasco plástico hermeticamente
fechado ou imerso em líquido, como solução salina tamponada
com fosfato (PBS) ou meio de transporte virai. U m a coleta adi-
cional do tipo de células individuais é amostra do vilo coriõnico
(CVS). E uma técnica que insere u m cateter o u u m a agulha dentro
da placenta e remove u m pouco das vilosidades coriônicas, que
são projeções vasculares do córion. Este tecido tem a mesma
constituição genética e cromossômica do feto e é utilizado para
testes para detecção de anomalias fetais. C o m uma amostra de
CVS, é possível realizar o teste entre a lO^e a 12- semana deges-
tação enquanto que o teste com a amostra do líquido amniótico
não pode ser realizado até a 15a e a 20a semana de gestação.
52 PARTE I Princípios Laboratoriais
Tecido Sólido
O tecido maligno da mama é u m tecido sólido que é analisado
quanto a receptores de estrógeno e progesterona. Nesses ensaios,
pelo menos 0,5 a 1,0 g de tecido são removidos durante a cirur-
gia e devem ser livres de gordura e material não tumoral. O tecido
é freqüentemente congelado dentro de 20 minutos, preferivel-
mente em nitrogênio l í q u i d o ou em uma mistura de gelo seco e
álcool. A secção histológica é examinada para confirmar que a
amostra é de fato de tecido maligno. O mesmo procedimento
pode ser usado para se obter e preparar tecido sólido para análise
toxicológica; contudo, quando são solicitadas determinações de
elementos-traço, todos os materiais usados na coleta e manipula-
ção do tecido devem ser feitos de plástico ou materiais livres de
contaminação por elementos-traço.
Mais recentemente, as análises de genes somáticos, como o
rearranjo do receptor de célula T e expansão clonal, estão gerando
informações importantes para os clínicos. Por esses estudos, o
laboratório de diagnóstico molecular freqüentemente recebe
material que foi fixado e m formalina e embebido em parafina
(tecido FFPE). E m geral, prefere-se a formalina neutra tamponada
que não contém metais pesados. C o m o alternativa, a retenção
da estrutura do tecido sem fixação permanente é conseguida pelo
congelamento da amostra em u m meio para corte histológico
( O C T , optimal cutting compoMnd). O O C T è uma mistura de álcool
p o l i v i n i l e polietileno glicol que envolve, mas não se i n f i l t r a no
tecido.
Cabelo e Unhas
Os cabelos e as unhas da mão e do pé têm sido usados para a
análise de metal-traço. C o n t u d o , os procedimentos de coleta
estão pouco padronizados e as mensurações quantitativas são
mais bem obtidas no sangue o u na urina. O uso de amostras de
cabelo o u unha geralmente é l i m i t a d o para as análises forenses
hoje em dia (Capítulo 31).
MANIPULAÇÃO DE AMOSTRAS
PARA ANÁLISE
Os resultados válidos de exames requerem uma amostra repre-
sentativa, coletada e preservada adequadamente. A identificação
adequada da amostra precisa ser mantida em cada paço do pro-
cesso de teste para evitar erros (Veja n o Capítulo 1 1 a discussão
sobre o uso de códigos de barras para identificar amostras). Cada
frasco de amostra precisa ser adequadamente etiquetado mesmo
se a amostra precisar ser colocada no gelo o u se o frasco for tão
pequeno que a etiqueta não possa ser colocada ao redor do tubo,
como pode acontecer com u m tubo de sangue capilar. Prefere-se
etiquetar diretamente o t u b o de sangue capilar pela dobra da
etiqueta c o m o uma bandeira ao redor do tubo. Para qualquer
amostra enviada em u m t u b o de ensaio ou frasco c o m tampa
rosca, a etiqueta deve ser colocada diretamente no frasco o u tubo,
e não na tampa. A informação m í n i m a na etiqueta deve i n c l u i r
o nome do paciente, n ú m e r o de identificação e data e hora da
coleta. Todas as etiquetas devem estar conforme os requisitos do
estado do laboratório para facilitar o adequado processamento
das amostras. N ã o se deve colocar etiqueta específica nas amos-
tras dos pacientes c o m doenças infecciosas para sugerir que
aquela amostra deve ser manipulada c o m cuidado especial. Todas
as amostras devem ser tratadas como se fossem potencialmente
infecciosas.
Conservação das Amostras em Trânsito
Embora os atrasos de uma amostra em trânsito do paciente em
u m hospital para o laboratório sejam geralmente de curta
duração, o tempo gasto desde a separação do componente da
amostra a ser analisada até a análise pode ser considerável.
A amostra precisa ser tratada adequadamente tanto durante o
trânsito para o laboratório q u a n t o em relação ao tempo da sepa-
ração do soro, células etc., até a análise começar. Para alguns
testes, as amostras precisam ser mantidas a 4° C desde o m o m e n t o
em que o sangue é coletado até as amostras serem analisadas;
outros requerem permanência à temperatura ambiente ou
p r ó x i m o dela.
Para todos os constituintes dos testes que são termolábeis, o
soro e o plasma devem ser separados das células em centrífuga
refrigerada. As amostras para análise de b i l i r r u b i n a e caroteno e
algumas drogas, como metotrexano, precisam ser protegidas
tanto da luz solar como da luz fluorescente para evitar a fotode-
gradação.
Embora o transporte das amostras a partir do paciente para
o laboratório de análises clínicas seja freqüentemente realizado
por u m mensageiro, os sistemas de tubos pneumáticos têm sido
usados para transportar as amostras mais rapidamente por
longas distâncias d e n t r o do hospital. Nesses sistemas pode
ocorrer hemólise, a menos que os tubos sejam completamente
preenchidos e o m o v i m e n t o dos tubos de sangue d e n t r o do
transportador de amostras seja m i n i m i z a d o ou, m e l h o r ainda,
evitado. O sistema de tubos pneumáticos deve ser projetado para
eliminar curvas acentuadas e paradas súbitas das amostras trans-
portadas, pois esses fatores p o d e m provocar hemólise. C o m
muitos sistemas, entretanto, a concentração de hemoglobina
plasmática pode aumentar, e a quantidade de hemólise, contri-
b u i r para a interferência em exames químicos c o m base em
espectofotometria. E m casos especiais, como em u m paciente
submetido à quimioterapia e que possui células frágeis, as amos-
tras devem ser centrifugadas antes de ser colocadas n o sistema
de tubos pneumáticos o u identificadas como "entrega apenas
por mensageiro".
Para as amostras que forem coletas em instalações remotas
c o m transporte pouco freqüente por correio a u m laboratório
central, o processamento adequado da amostra precisa ser feito
na instalação remota para que os componentes separados e
preservados adequadamente sejam entregues ao laboratório. É
necessário que as instalações remotas possuam p r o n t o acesso a
todos os conservantes c o m u m e n t e utilizados, congeladores e
gelo seco.
Separação e Armazenamento de Amostras
O soro e o plasma devem ser separados das células o mais breve-
mente possível e preferencialmente dentro de duas horas. A
sepaiação prematura do soro, c o n t u d o , pode p e r m i t i r a formação
continuada de b i l i r r u b i n a e levar à obstrução da sondas da
amostra em equipamentos de exames. Se for impossível centrifu-
gar uma amostra de sangue dentro de duas horas, a amostra deve
ser m a n t i d a em temperatura ambiente, em vez de a 4 °C, para
d i m i n u i r a hemólise. Para muitos analitos lábeis, como os hor-
mônios, o plasma e o soro devem ser congelados imediatamente
após a centrifugação. Devem-se evitar os congeladores livres de
gelo (frost free freezers), pois possuem uma ampla oscilação de
temperatura durante ciclo congelamento/descongelamento, e os
ciclos repetidos de congelamento/descongelamento p o d e m
degradar o analito de interesse.14
Os tubos de amostras devem ser centrifugados com tampa de
m o d o a (1) reduzir a evaporação particularmente de voláteis,
como etanol, (2) evitar a aerolização de partículas infecciosas e
(3) manter condições anaeróbicas, o que é i m p o r t a n t e na men-
suração de d i ó x i d o de carbono e cálcio ionizado.
 Coleta de Amostras e Outras Variáveis Pré-analíticas
Transporte de Amostras
O tempo necessário para transportar uma amostra a partir do
m o m e n t o de sua coleta até esta atingir o laboratório varia de
poucos minutos a 72 horas. O frasco ou tubo usado para conter
a amostra (frasco p i i m á t i o ) deve ser construído de m o d o que o
conteúdo não escape caso o frasco seja exposto a extremos de
calor, frio ou luz solar. Pode-se encontrar pressão reduzida de
0,50 atmosfera (50kPa) durante o transporte de ar j u n t o com
vibração e as amoscras devem ser protegidas dentro de u m frasco
apropriado para essas condições adversas.
O frasco expedidor, ou secundário, usado para contei u m o u
mais tubos o u frascos de amostras deve ser construído de m o d o
a evitar quebras. Podem ser usadas caixas corrugadas de painéis
de fibra ou Styrofoam (espuma de poliestireno extrudido), proje-
tadas para circundar u m único tubo de amostra. U m envelope
almofadado pode gerar a proteção adequada para a expedição de
amostras únicas Q u a n d o as amostras são expedidas como gotas
de sangue sobre u m filtro de papel (por exemplo, para triagem
neonatal), o papel pode ser colocado em u m envelope de expe-
dição, e raramente se requer uma expedição rápida.
Para o transporte de amostras congeladas o u refrigeradas,
usa-se u m frasco isolado. Deve ser ventilado para evitar o acúmulo
de dióxido de carbono sob pressão e possível explosão. Os pacotes
de gelo são comumente utilizados para amostras refrigeradas.
O dióxido de carbono sólido (gelo seco) é u m material refrige-
rante conveniente que pode ajudar a manter amostras congela-
das, alcançando temperaturas de até -70°C.
Diversas leis e regulamentações se aplicam ao envio de amos-
tras biológicas. Embora essas regulamentações se apliquem teori-
camente apenas a agentes etiológicos (conhecidos como agentes
infecciosos), todas as amostras devem ser transportadas como se
a elas fossem aplicadas as mesmas regulamentações. 9 As linhas
aéreas possuem regulamentações rígidas com relação ao trans-
porte de amostras. As empresas aéreas consideram o gelo seco
u m material perigoso. Portanto, o transporte da maioria das
amostras para laboratórios de análises clínicas é afetado por essas
regulamentações, e é preciso treinar os funcionários para as regu-
lamentações apropriadas.
Os vários meios de transporte de amostras i n f l u e n c i a m no
t e m p o de envio e custo, e cada l a b o r a t ó r i o necessitará fazer sua
p i ó p r i a avaliação quanto ao serviço adequado. O objetivo é
garantir que a amostra corretamente coletada e identificada
chegue o local de exame a t e m p o e sob condições corretas de
armazenamento para que a p r ó x i m a fase (analítica) possa pro-
ceder.
L
OUTRAS VARIÁVEIS PRÉ-ANALÍTICAS
As variáveis pré-analíticas são classificadas como controláveis ou
não controláveis.' 5,17
Variáveis Controláveis
Muitas das variáveis pré-analíticas relacionadas à coleta da amostra
discutidas anteriormente são exemplos de variáveis controláveis.
Outras incluem as variáveis fisiológicas 12 e aquelas associadas a (1)
dieta, (2) estilo cie vida, (3) estimulantes, (4) medicamentos, (5)
preparações de ervas e (6) ingestão de drogas recreativas.
Variáveis Fisiológicas
As variáveis pessoais controláveis que afetam os resultados analí-
ticos incluem (1) postura, (2) prolongado repouso n o leito, (3)
exercício, (4) treinamento físico, (5) variação circadiana e (6) ciclo
menstrual.
CAPÍTULO 3 53
Postura
E m u m adulto, a troca de uma posição em decúbito para uma
posição em estação resulta em uma redução de volume de sangue
do indivíduo em cerca de 10% (perda de - 6 0 0 a 700 mL). U m a
vez que só o f l u i d o livre de proteína passa através dos capilares
para o tecido, essa alteração na postura resulta na redução do
volume de plasma no sangue e em u m aumento ( - 8 % a 10%)
na concentração de proteínas do plasma. N o r m a l m e n t e o volume
d i m i n u í d o de sangue seguido de uma troca de posição em decú-
b i t o por estação acaba em 10 minutos, exceto em casos especiais
de prolongado repouso n o leito. C o n t u d o , são necessários 30
minutos para que essa alteração ocorra quando se muda da
posição em estação para decúbito.
D e m o d o geral, as concentrações de constituintes livremente
difundíveis, com pesos moleculares de menos de 5.000 Da, não
são afetados pelas alterações de postura. Entretanto, ocorre u m
aumento significativo no potássio (—0,2 a 0,3 m m o l / L ) após u m
i n d i v í d u o ficar em estação por 30 minutos. As alterações nas
concentrações de alguns dos principais constituintes do soro com
a mudança de postura estão listadas na Tabela 3-5.
As alterações na concentração de proteínas e componentes
ligados a proteínas no soro são maiores em (1) pacientes hipertensos
do que em normotensos, (2) indivíduos com uma baixa concentra-
ção de proteína no plasma do que naqueles com uma concentração
normal e (3) nos idosos, comparados aos jovens. A maior parte da
pressão oncótica plasmática é atribuída à albumina p o i causa da
sua alta concentração, de modo que a malnutrição protéica—asso-
ciada à redução na concentração plasmática de albumina—reduz a
retenção de fluido dentro dos capilares. De modo contrário, o
impacto das alterações de postura é menor em indivíduos com
concentrações de proteína anormalmente altas, como aqueles como
gamopatia monoclonal (mieloma múltiplo).
As condições descritas anteriormente referem-se a alterações
de postura em períodos curtos; a situação é mais pronunciada
em paciente sob prolongado repouso ao leito. O plasma e os
volumes de fluidos extracelulares d i m i n u e m em poucos dias do
início do repouso- Inicialmente, há uma ligeira redução da água
do sangue total resultante do prolongado repouso ao leito. C o m
o repouso prolongado, ocorre a retenção de fluidos e a d i m i n u í -
TABELA 3 - 5 Variação na Concentração do Soro com a
Mudança da Posição Deitada para a de
Estacão
Constituinte Aumento Médio (%)
Alar ira aminotransíerase 7
Albumina g
Fosfatase alcalina 7
Amílase 6
Aspartato aminotransíerase 5
Cálcio 3
Colesterol 7
igA 7
igG 7
igM 5
Tírcxina 11
Tfiglicerídeos 6
De Feldins P, Tryáng N, Hykofí Fecmen F, Horder M . Effects of posturc on
concentrariam of bíood eon<íir«£nfs in heahhy adalts: prãctical application of bíooíl
Specimen colíecticm jyrocedures rei
còiAme-nded tí\£ ScwnAmíivinn Ccrnimiitee on 1
Referente Volnei. Scflruí J Clifi Lab Muesi 1980,40:615 21.
54 PARTE I Princípios Laboratoriais
cão da concentração plasmática de proteína, albumina e consti-
tuintes ligados à proteína através de efeitos de diluição. A mobi-
lização do cálcio dos ossos como aumento da fração de ferro
ionizado livre é compensada pela redução de cálcio ligado à
proteína, e, portanto, o cálcio sérico total é menos afetado. O
potássio séiico pode estar reduzido em mais de 0,5 m m o l / L
devido à redução da massa de músculo esquelético.
O prolongado repouso ao leito está associado ao aumento da
excreção de nitrogênio urinário assim como à excreção de cálcio,
sódio, potássio, fosfato e sulfeto. A excreção de íons hidrogênio
fica reduzida, presumivelmente devido ao metabolismo diminu-
ído do músculo esquelético. A amplitude da variação citcadiana
do cortisol plasmático é reduzida pela imobilização prolongada,
e a excreção urinária de catecolaminas pode estar reduzida a u m
terço da concentração em u m indivíduo ativo. A excreção de
V M A (ácido vanilmandélico) é reduzida em u m quarto após 2
ou 3 semanas de repouso ao leito.
Q u a n d o o indivíduo volta a ficar ativo após u m período de
repouso ao leito, são necessárias mais de 3 semanas até que a
excreção de cálcio volte ao n o r m a l e mais outras 3 semanas para
que seja alcançado o equilíbrio positivo do cálcio. São necessárias
várias semanas para o equilíbrio positivo de nitrogênio ser res-
taurado.
Exercício e Treinamento Físico
A natureza e a extensão do exercício devem ser levadas em con-
sideração. O exercício estático o u isométrico, geralmente de curta
d u r a ç ã o , m a s d e alta i n t e n s i d a d e , utiliza a a d e n o s m a trifosfato
(ATP) e a creatinina fosfato previamente armazenadas, enquanto
o exercício mais prolongado precisa de A T P gerado pelas vias
metabólicas normais. As alterações nas concentrações de analitos
como resultado do exercício se devem, em sua maioria, a (1) troca
de fluidos entre os compartimentos intravascular e intersticial,
(2) alteração na concentração de h o r m ô n i o estimulada pela troca
da atividade e (3) perda de f l u i d o devido ao suor. A boa forma
física de u m indivíduo também pode afetar a extensão da altera-
ção na concentração de u m constituinte. O fato de uma quanti-
dade de exercício afetar de maneira significativa os resultados
laboratoriais também depende de quanto tempo após a atividade
física a amostra foi coletada.
C o m o exercício moderado, a resposta ao estresse provocado
causa u m aumento da glicose sanguínea, o que estimula a secre-
ção de insulina. A diferença arteriovenosa na concentração de
glicose é aumentada pela maior demanda tecidual por glicose. O
piruvato e o lactato plasmáticos aumentam devido à maior ativi-
dade metabólica do músculo esquelético. O exercício d i m i n u i o
p H e a PC O 2 arterial. O uso do A T P celular aumenta a permea-
bilidade celular levando a pequenos aumentos da atividade sérica
de enzimas originárias do músculo esquelético. O aumento da
atividade enzimática tende a ser maior em indivíduos sem preparo
físico do que em indivíduos em forma- O exercício leve produz
uma ligeira diminuição nas concentrações de colesterol e trigli-
cerídeos séricos que pode persistir por diversos dias. As pessoas
que caminham cerca de 4 horas a cada semana possuem uma
concentração média de colesterol 5% menor e a concentração de
lipoproteína de alta densidade ( H D L ) 3,4% maior do que os
indivíduos inativos.
D e m o d o geral, os efeitos do exercício e x t e n u a n t e são exacer-
bações daqueles que ocorrem com o exercício médio. Assim,
podem ocorrer a bipoglicemia e o aumento da tolerância à
glicose. O lactato plasmático pode aumentar dez vezes. O exercí-
cio intenso aumenta a concentração n o plasma de proteínas
devido ao i n f l u x o de proteínas dos espaços intersticiais, o que
ocorre após uma perda inicial de f l u i d o e proteína através dos
capilares.15
O treinamento físico minimiza muitos dos efeitos de curto
prazo relacionados anteriormente. Geralmente os atletas possuem
uma maior atividade sérica de enzimas de origem muscular esque-
lética em repouso do que os não atletas. C o n t u d o , a resposta
dessas enzimas ao exercício é menor em atletas do que em outros
indivíduos. A proporção de creatinina quinase (CK) que é CK-
M B (isoenzíma do músculo e cérebro) é m u i t o maior em u m
indivíduo treinado do que em u m não treinado. As concentra-
ções séricas de uréia, ácido úrico, creatinina e tiroxina são maiores
em atletas em comparação a indivíduos não treinados. Essas
alterações estão provavelmente relacionadas à massa muscular
aumentada e a uma maior renovação da massa muscular em
atletas.
A concentração sérica total de lipídios é reduzida pelo con-
dicionamento físico. Por exemplo, o colesterol sérico pode estar
d i m i n u í d o em até 25%. A fração H D L do colesterol, contudo,
está aumentada. Assim, a diminuição na concentração total do
colesterol se deve à redução na lipoproteína de baixa densidade
(LDL) do colesterol.
Variação Circadiana
A variação circadiana se refere ao padrão de produção, excreção
e concentração de analitos a cada 24 horas. 15 Muitos constituin-
tes dos fluidos sanguíneos exibem uma variação cíclica ao longo
do d ia. Os fatores que contribuem para essas variações incluem
postura, atividade, ingestão de alimento, estresse, luz do dia o u
escuridão e sono ou aleita. Essas variações cíclicas podem yer
m u i t o grandes e, portanto, a coleta da amostra precisa ser m u i t o
bem controlada. Por exemplo, a concentração de ferro sérico
pode mudar em até 5 0 % das 08:00 horas (h) às 14:00 h, e o
cortisol, em quantidade semelhante entre 08'00 h e 16:00 h.
Tem-se relatado que o potássio sérico d i m i n u i de 5,4 m m o l / L às
08:00 h para 4,3 m m o l / L às 14-.00 h. A variação total típica da
concentração dos diversos constituintes séricos comumente men-
surados durante 6 horas está ilustrada na Tabela 3-6; a variação
total está listada j u n t o com o erro analítico.
Os hormônios são secretados em pulsos, e isso, j u n t o com a
variação circadiana a qual a maioria dos hormônios está sujeita,
pode tornar m u i t o difícil a interpretação adequada de suas con-
centrações séricas (Capítulos 35 e 38-42). A l é m disso, o efeito
dos hormônios sobre outros analitos torna extremamente impor-
tante o tempo de coleta da amostra. Por exemplo, a insulina
plasmática basal é mais elevada pela manhã do que em outras
horas do dia, e sua resposta à glicose também é maior pela manhã
e menor por volta da meia-noite. Q u a n d o o teste de tolerância à
glicose é feito durante a tarde, p o d e m ocorrer valores mais altos
de glicose do que se o teste fosse realizado pela manhã cedo. A
glicose plasmática mais elevada ocorre apesar de uma maior res-
posta à insulina, a qual é, n o entanto, mais demorada e menos
efetiva.
Ciclo Menstrual
As concentrações plasmáticas de muitos hormônios sexuais femi-
ninos e outros hormônios são afetadas pelo ciclo menstrual (Veja
também os Capítulos 42 e 43). N o dia pré-ovulatório, a concen-
tração de aldosterona pode ser na realidade o dobro daquela na
parte precoce da fase folicular. A alteração na atividade da renina
é quase tão grande quanto à da aldosterona. Essas alterações são
geralmente mais pronunciadas em mulheres que retêm f l u i d o
antes da menstruação. A excreção urinária de catecolaminas
aumenta n o meio do ciclo e permanece alta durante toda a fase
lútea. Essas alterações dentro do ciclo menstrual tornam essen-
 Coleta de Amostras e Outras Variáveis Pré-analíticas CAPÍTULO 3 55

TABELA 3-6 Variação T o t a l e A n a l í t i c a para Exames Séricos de Amostras O b t i d a s às 8 : 0 0 horas e 14:00 horas 4

Constituinte Média Variação Total (%) Variação Analítica (%)

Sódio (mmol/L) 141 1,9 1.8

Potássio (mmol/L) 4,4 7,1 2,8
Cálcio (mg/dL) 10,8 3,2 2,7
Cloro (mmo!/L) 102 3,8 3,4
Fcsfato (mg/dL) 3,8 10,7 2,4
Uréia nitrogenada (mg/dL) 14 22,5 2,5
Creatinina (mg/dL) 1,0 14,5 6,3
Ácido úrico (mg/dL) 5,6 11,5 2,6
Ferra (jig/dL) 116 36,6 3,4
Colesterol (mg/dL) 193 14,8 5,7
Albumina (g/dL) 4,5 5,5 3,9
Proteína total (mg/dL) 7,3 4,8 1,7
Lipídios totais (g/L) 5,3 25,0 3,6
Aspartato aminotransferase (U/L) 9 25 6
Alanina aminotransíerase (U/L) 6 56 17
Fosfatase ácida (U/L) 3 15 8
Foslatase alcalina (U/L) 63 20 3
Lactato desidrogenase (U/L) 195 16 12

De Winkel P, StoclflncJ, BE, Bokdu-nd H The efjects of time of venipunciuK on vajiatiçn of sewtn conítiiwents. A m J Cim Pa th oi 1975;64:433-47. Todos os direitos reservados 1975
pela American Socieiy of Clinicai Pathologists. Reimpiesso com permissão.
*11 indivíduos da sexn masculino, idade de 21-27 anos, ÉUudados às 08:00, J J -00 e. 14:00 fioras.

ciais as mensurações repetidas na mulher no mesmo m o m e n t o
durante o ciclo.
As concentrações plasmáticas de colesterol e triglicerídeos
tendem a estar altas no meio do ciclo, o m o m e n t o de secreção
máxima de estrógeno, embora a variação cíclica n o colesterol não
seja observada com ciclos anovulatórios. As concentrações de
proteína total e albumina d i m i n u e m no m o m e n t o da ovulação,
e o cálcio sérico está correlacionado com as alterações de albu-
mina. As concentrações de fibrinogênio plasmático e fosfato
séiico d i m i n u e m drasticamente na menstruação. As concentra-
ções de creatinina e ácido úrico são maiores nesse m o m e n t o e
são menores n o final do período inteimenstrual.
A concentração plasmática de ferro pode estar m u i t o baixa
com o início da menstruação; a concentração de magnésio é
menor nesse p o n t o do ciclo. As concentrações plasmáticas de
sódio e cloro aumentam até o início da menstruação, mas podem
cair em 2 m m o l / L com a diurese pós-mens trual.
Viagem
Viajar através de diversos fusos horários afeta o r i t m o circadiano.
São necessários cinco dias para se estabelecer u m novo r i t m o
d i u r n o estável após uma viagem por 10 fusos horários. As altera-
ções nos resultados dos exames laboratoriais são geralmente atri-
buídas à função alterada da hipófise e da adrenal. A excreção
urinária de catecolaminas geralmente fica aumentada por 2 dias;
o cortisol sérico d i m i n u i . D u r a n t e u m vôo, as concentrações
séricas de glicose e triglicerídeos aumentam, enquanto a secreção
de glicocorticóide é estimulada. Durante u m vôo prolongado,
ocorre retenção de líquido e sódio, mas a excreção urinária
retorna ao n o r m a l após 2 dias.
Quatro dias após a mudança de uma dieta n o r m a l para u m a
dieta rica em proteína, ocorre a duplicação da concentração da
uréia plasmática com u m aumento de sua excreção urinária. As
concentrações séricas de colesterol, fosfato, ácido úrico e amónia
também aumentam. U m a dieta rica em gordura, ao contrário,
causa depleção do reservatório de nitrogênio devido à necessi-
dade de excreção dos íons amónio para manter a homeostase
ácido-base. U m a dieta rica em gordura aumenta a concentração
sérica dc trigliccrídcos, mas t a m b é m reduz o á c i d o ú r i c o sérico.
A redução da ingestão de gordura reduz a atividade sérica de L D
(lactato desidrogenase). A ingestão cie quantidades m u i t o diferen-
tes de colesterol tem pouco efeito na concentração do colesterol
sérico. A ingestão de gordura monoinsaturada em vez de gordura
saturada reduz o colesterol e as concentrações de L D L . Q u a n d o
a gordura polmsaturada é substituída pela gordura saturada, as
concentrações de triglicerídeos e colesterol H D L são reduzidas.
Q u a n d o os carboidratos da dieta consistem principalmente
em amido o u sacarose, em vez de outros açúcares, as atividades
séticas da fosfatase alcalina (ALP) e da L D aumentam. D e modo
contrário, a concentração plasmática de triglicerideos é reduzida
quando se d i m i n u i a ingestão de sacarose. São observadas curvas
mais achatadas de tolerância à glicose quando se tem uma dieta
à base de pão do que quando se faz ingestão de uma dieta rica
em sacarose. A dieta rica em carboidrato d i m i n u i as concentra-
ções séricas da lipoproteína de densidade m u i t o baixa ( V L D L )
de colesterol, triglicerídeos, colesterol e proteína. Os indivíduos
que comem muitas refeições pequenas durante o dia tendem a
ter concentrações menores de colesterol L D L e H D L totais do
que quando o alimento de mesmo t i p o e quantidade é ingerido
em três refeições.

Dieta Ingestão de Alimento

A dieta tem influência considerável na composição do plasma.
Estudos com dietas sintéticas têm mostrado que as alterações do
dia-a-dia na quantidade de proteína são refletidas em poucos dias
na composição do plasma e na excreção de produtos finais do
metabolismo das proteínas.
A concencração de certos constituintes plasmáticos é afetada pela
ingestão de u m a refeição, sendo que o tempo entre a ingestão da
refeição e a coleta de sangue afeta as concentrações plasmáticas
de muitos analitos Por exemplo, o j e j u m n o t u r n o por 10 a 14
horas d i m i n u i notavelmente a variabilidade nas concentrações
56 PARTE I Princípios Laboratoriais
de muitos analitos e é visto como o tempo ó t i m o de j e j u m pelo
qual se devem padronizar as coletas de sanguej particularmente
para análise de lipídios. Os maiores aumentos nas concentrações
plasmáticas após uma refeição ocorrem para a glicose, ferro,
lipídios totais e fosfatase alcalina. O aumento desta ú l t i m a se dá
principalmente pela isoenzima intestinal e é maior quando se
ingere uma refeição gordurosa. A alteração é influenciada pelo
grupo sanguíneo do indivíduo e o substrato utilizado para o
ensaio enzimático. A l é m disso, a lipemia associada à refeição
gordurosa pode contribuir para erros analíticos na mensuração
de alguns constituintes séricos e requer passos adicionais no
tratamento pré-analítico, como a ultracentrifugação ou uso de
u m branco da amostra, para reduzir os efeitos analíticos adversos
da lipemia.
Os efeitos da uma refeição podem ser de longa duração e
variam com os diferentes grupos de alimento. 15 Assim, a ingestão
de u m a refeição rica em proteína à noite pode causar aumentos
nas concentrações séricas de uréia nitrogenada, fósforo e urato,
as quais ainda são aparentes 12 horas depois. Todavia, essas
alterações podem ser menores que a variabilidade individual
típica. Grandes refeições proteicas no almoço ou à noite também
aumentam as concentrações séricas de colesterol e h o r m ô n i o do
crescimento por pelo menos 1 hora após a refeição. O efeito das
refeições ricas em carboidratos na composição do sangue é menor
do que o das refeições protéicas. As secreções de glucagon e
insulina são estimuladas pela refeição protéica e a insulina
também é estimulada pelas refeições ricas em carboidratos.
Vegetaríanism o
Nos indivíduos vegetarianos há m u i t o tempo, as concentrações
de L D L e V L D L são reduzidas tipicamente em 37% a 12%, res-
pectivamente. A l é m disso, suas concentrações de lipídios totais
e de fosfolipídios são reduzidas e as concentrações de colesterol
e de triglicerídeos podem ser apenas dois terços daquelas encon-
tradas em pessoas com uma dieta mista. As concentrações de H D L
e L D L são afetadas. Nos vegetarianos estritos, a concentração de
L D L pode ser 37% menor e a de H D L 12% menor do que nos
não vegetarianos. Os efeitos são menos notados em indivíduos
que adotam u m a dieta vegetariana apenas por u m curto período
de tempo. As concentrações de lipídios também são menores nos
indivíduos que consomem apenas uma dieta vegetariana do que
naqueles que também consomem ovos e leite. Q u a n d o os indi-
víduos que anteriormente eram adeptos de u m a dita mista se
tornam vegetarianos, suas concentrações séricas de albumina
podem cair cerca de 10% e sua concentração de uréia em cerca
de 50%. C o n t u d o , pouca diferença existe entre as concentração
de proteína o u atividade de enzimas no soro de indivíduos que
são vegetarianos há u m longo tempo e nas daqueles adeptos da
dieta mista.
Malnutriçào
Na malnutriçào, as concentrações séricas de proteína total, albu-
m i n a e (3-globulina estão diminuídas. O aumento da concentra-
ção de y-globulina não compensa totalmente essa diminuição em
outras proteínas. As concentrações de (1) complemento C3, (2)
globulina ligada ao retinol, (3) transferrina e (4) pré-albumina
d i m i n u e m rapidamente com o início da malnutriçào e são men-
suradas para definir a gravidade da condição. As concentrações
plasmáticas de lipoproteínas estão reduzidas e o colesterol e tri-
glicerídeos séricos podem estar com concentração de apenas 5 0 %
daquela encontrada em indivíduos saudáveis. Apesar da malnu-
triçào grave, as concentrações de glicose se mantêm iguais às dos
indivíduos saudáveis. C o n t u d o , as concentrações séricas de uréia
nitrogenada e creatinina são bastante reduzidas como resultado
da diminuição da massa esquelética, e a depuração de creatinina
também é diminuída.
A concentração plasmática de cortisol fica aumentada devido
à depuração metabólica diminuída. As concentrações plasmáticas
totais de T3, T 4 e h o r m ô n i o tireoestimulante (TSH) são conside-
ravelmente reduzidas, com a concentração de tiroxma sendo a
mais afetada. Isso se deve parcialmente às reduzidas concentra-
ções de globulina ligada à tiroxina e pré-albumina.
As concentrações de eritrócitos e folato plasmático são redu-
zidas na malnutriçào protéica-calórica, mas a concentração sérica
de vitamina B n não é afetada o u pode estar ligeiramente aumen-
tada. A concentração plasmática de vitaminas A e E estão m u i t o
reduzidas. Embora a concentração de hemoglobina no sangue
esteja reduzida, a concentração de ferro sérico é, inicialmente,
pouco afetada pela malnutriçào.
A atividade da maioria das enzimas comumente mensuradas
é reduzida, mas aumenta com a restauração da boa nutrição.
Jejum e Inanição
C o m o conseqüências de u m j e j u m de mais de 24 horas ou ina-
nição, o corpo tenta conservar a proteína com o gasto de outras
fontes de energia, como a gordura. A concentração de glicose cai
para níveis de até 18 m g / d L (1 m m o l / L ) dentro dos primeiros 3
dias do mício do jejum, apesar de o corpo tentar manter a pro-
dução de glicose, A secreção de insulina fica bastante reduzida,
enquanto a secreção de glucagon pode dobrar n u m a tentativa de
manter a concentração normal de glicose. A lipólise e a cetogê-
nese hepática são estimuladas. Os cetoácidos e os ácidos graxos
tornam-se a principal fonte de energia para o músculo. Isso
resulta no acúmulo de ácidos orgânicos que leva à acidose meta-
bólica com redução do p H sanguíneo, P C 0 2 e concentrações de
bicarbonato. A l é m disso, as concentrações de corpos cetônicos
{ácido cetoacético e ácido p-hidroxibutil), ácidos graxos e glicerol
no soro aumentam consideravelmente. Freqüentemente a P 0 2
do sangue também está reduzida. O j e j u m por 6 dias aumenta
as concentrações plasmáticas de colesterol e triglicerídeos, mas
causa a d i m i n u i ç ã o da concentração de H D L . C o m o j e j u m mais
prolongado, as concentrações de colesterol e triglicerídeos caem-
Os aminoácidos são liberados do músculo esquelético e a con-
centração plasmática dos aminoácidos de cadeia ramificada pode
aumentar em até 10% com 1 dia de jejum.
Estilo de Vida
O tabagismo e a ingestão de álcool são fatores do estilo de vida
que afetam a concentração dos analitos comumente mensurados.
Tabagismo
O tabagismo, através da ação da nicotina, pode afetar diversos
exames laboratoriais. A extensão desses efeitos está relacionada ao
número de cigarros fumados e à quantidade de fumaça inalada.
Através da estimulação da medula adrenal, a nicotina aumenta
as concentrações de epinefrina n o plasma e a excreção urinária
de catecolaminas e seus metabólicos. A concentração de glicose
pode estar aumentada em 10 m g / d L (0,56 m m o l / L ) após fumar
por 10 minutos. O aumento pode persistir por 1 hora. O lactato
plasmático aumenta, e como a concentração de piruvato está
reduzida, a razão lactato/píruvato aumenta. As concentrações de
insulina plasmática mostram u m a resposta tardia ao aumento da
glicose sanguínea, elevando-se cerca de 1 hora após o cigarro ter
sido fumado. Tipicamente, a concentração plasmática de glicose
é maior em fumantes do que em não-fumantes e a tolerância à
glicose é levemente prejudicada nos fumantes. A concentração
plasmática do h o r m ô n i o do crescimento é particularmente sen-
 Coleta de Amostras e Outras Variáveis Pré-analíticas
sível ao tabagismo e pode aumentar dez vezes dentro de 30
minutos após u m indivíduo ter fumado u m cigarro.
As concentrações no plasma de colesterol, triglicerídeos e coles-
terol L D L s ã o maiores (cerca de 3%, 9,1% e 1,7%, respectivamente)
e o H D L é menor em fumantes do que em não-fumantes. O taba-
gismo afeta tanto o córtex como a medula adrenal. Os 11-hidra cor-
ticos ter óides plasmáticos podem estar aumentados em 75% com o
tabagismo intenso. A l é m disso, a concentração de cortisol plasmá-
tico pode aumentar era até 40% dentro de 5 minutos após se
começar a fumar u m cigarro. Embora a ritmicidade diurna normal
do cortisol não seja afetada. Os fumantes excretam mais ácido 5-
hidroxindoleacético do que os não-fumantes.
A contagem de eritrócitos no sangue é aumentada em fuman-
tes. A quantidade de carboxiemoglobina pode exceder 10% do
total de hemoglobina nos fumantes pesados, e o número aumen-
tado de células compensa a habilidade prejudicada das células
vermelhas em transportar oxigênio. A P 0 2 do sangue de u m
fumante habitual é geralmente cerca de 5 m m H g (0,7 kPa) menor
que a de u m não-fumante, enquanto a P C 0 2 não é afetada. A
concentração de leucócitos no sangue é aumentada em até 3 0 %
nos fumantes, mas a concentração leucocitária de ácido ascórbico
fica bastante diminuída. A contagem de linfócitos aumenta em
proporção à contagem total de leucócitos.
O tabagismo afeta a resposta i m u n e do organismo. Por
exemplo, os níveis séricos de IgA, IgG e I g M geralmente são
menores nos fumantes do que nos não-fumantes, enquanto a
concentração de IgE é maior. Os fumantes podem mostrar, com
maior freqüência do que os não-fumantes, a presença de anti-
corpos antinucleares e apresentarem teste fracamente positivo
para antígeno carcinoembriogênico. A contagem espermática
dos homens fumantes é freqüentemente reduzida se comparada
à dos não-fumantes: o número de formas anormais é maior e a
motilidade espermática menor.
A concentração sérica de vitamina B ] z muitas vezes é notavel-
mente reduzida nos fumantes, e essa diminuição é inversamente
proporcional à concentração sérica de tiocianato.
Ingestão de Álcool
U m a única dose moderada de álcool tem poucos efeitos nos
exames laboratoriais. A ingestão de álcool suficiente para produzir
uma embriaguez leve pode aumentar a concentração de glicose
n o s a n g u e de 2 0 % a 5 0 % . O aumento pode ser a i n d a maior cm
diabéticos. Mais comumente, a inibição da glicogênese ocorre e
torna-se aparente como hipoglicemia e cetose quando o etanol é
metabolizado a acetaldeído e a acetato. O lactato acumula-se e
compete com o ácido úrico pela excreção pelos rins, de modo que
o ácido úrico sérico também aumenta. O lactato e o acetato,
juntos, d i m i n u e m o bicarbonato plasmático, o que leva à acidose
metabólica. Q u a n d o quantidades moderadas de álcool são inge-
ridas durante 1 semana, a concentração sérica de triglicerídeos
aumenta em mais de 20 m g / d L (0,23 m m o l / L ) . A ingestão mode-
rada e prolongada de álcool pode aumentar a concentração de
H D L , o que está associado à reduzida concentração plasmática de
proteínas de transferência de ésteres de colesterol (CETP). Os
fenóis n o v i n h o com potente atividade antioxidante são provavel-
mente responsáveis pela redução da oxidação do colesterol L D L .
Quantidades tóxicas de álcool estimulam a liberação de cor-
tisol, embora o efeito seja mais relacionado à intoxicação do que
ao álcool per se. A atividade simpaticomedular é aumentada pela
ingestão aguda de álcool, mas sem efeito detectável na concen-
tração plasmática de epinefrina e apenas efeito leve sobre a note-
pinefrina. C o m a intoxicação, as concentrações plasmáticas de
catecolamínas ficam substancialmente elevadas. A ingestão aguda
de álcool leva à redução drástica da testosterona plasmática no
CAPÍTULO 3 57
homem, com u m aumento da concentração plasmática do hor-
m ô n i o luteinizante.
A ingestão crônica de álcool afeta a atividade de muitas
enzimas plasmáticas. Por exemplo, a atividade aumentada de
gamaglutamiltransferase (GGT) é usada como u m marcador do
ato permanente de beber. O alcoolismo está relacionado com
muitas anormalidades bioquímicas características, que incluem
funções anormais da hipófise, adrenocortical e medular. A men-
suração de transferrina deficiente em carboidratos é usada para
identificar a ingestão habitual de álcool. O volume corpuscular
médio ( M C V ) também tem sido usado como u m marcador do
uso habitual de álcool e pode estar relacionado à deficiência de
ácido fólico o u a u m efeito tóxico direto do álcool sobre os pre-
cursores de células vermelhas.
Administração de Medicamentos
Os efeitos dos medicamentos nos exames laboratoriais complica-
dos pela ingestão conhecida ou não de medicações prescritas, uso
de drogas ilícitas e extratos fitoterápicos.
Tipicamente, os paciente hospitalizados recebem medicação.
Para certas condições médicas, podem ser administrados mais de
10 medicamentos de uma só vez. Mesmo muitos indivíduos sau-
dáveis t o m a m diversos medicamentos regularmente, como vita-
minas, contraceptivos orais ou pílulas para dormir. Os indivíduos
com doenças crônicas muitas vezes ingerem medicamentos de
uso contínuo. Foi publicada uma lista abrangente dos efeitos dos
medicamentos nos exames laboratoriais. 16 É importante entender
as diferenças entre (1) o ato de receber uma medicação, (2) o
efeito fisiológico de u m a medicação e (3) a interferência analitica
com o método usado no teste específico.
Muitas drogas, quando administradas por via intramuscular,
causam uma irritação muscular suficiente para aumentar as quan-
tidades de enzimas liberadas, como a C K e a L D , n o soro. As
atividades enzimáticas podem persistir por diversos dias após
uma única injeção, e p o d e m ser observados valores consistente-
mente elevados durante o curso do tratamento. Isto contrasta
com a redução na concentração plasmática de potássio e possível
hiponatremia seguida à administração prolongada de u m medi-
camento diurético devida à excreção urinária (resposta fisioló-
gica). As interferências analíticas variam significativamente entre
os métodos dos exames.
Ingestão de Drogas Recreativas
A ingestão de drogas recreativas refere-se à ingestão de compo-
nentes com propósito entorpecente. Muitas medicações comu-
mente prescritas para dor têm migrado do uso farmacêutico para
a categoria de "droga de abuso" (Capítulo 31). Entre as mais
clássicas drogas de abuso, as anfetaminas aumentam a concentra-
ção de ácidos graxos livres. A m o r f i n a aumenta a atividade da
amilase, lípase, ALT, A S T e A L P e a concentração sérica de
b i l i r r u b i n a . As concentrações de gastrina, T S H e prolactina
ta mb é m aumentam. E m contraste, as concentrações de insulina,
norepinefrina, polipeptídeo pancreático e neurotensina dimi-
n u e m A heroína aumenta a concentração plasmática de coleste-
rol, T , e potássio. A P C 0 2 aumenta, mas a P 0 2 d i m i n u i . A
concentração de albumina plasmática também d i m i n u i . A Cdn-
natus aumenta a concentração plasmática de sódio, potássio,
uréia, cloro e insulina, mas d i m i n u i as concentrações de creati-
nina, glicose e urato.
Preparações de Ervas
As preparações de ervas não são regulamentadas pelas práticas
padronizadas de fabricação, resultando em grande variabilidade
em sua composição e, assim, nos efeitos a elas atribuídos. O uso
58 PARTE I Princípios Laboratoriais
p o r l o n g o t e m p o de aloe vera, sândalo e cáscara sagrada p o d e m
causai h e m a t ú r i a e a l b u m i n ú r i a . O uso p r o l o n g a d o de ãloe vera,
r u i b a r b o chinês, cascas de frângula, sene e e s p i n h e i r o p o d e m
levar a h i p o c a l e m i a , p r o v o c a n d o h i p e r a l d o s t e r o m s m o . O arbusto
rasteiro (trailing arbutus—Epigeac repens) p o d e causar anemia hemo-
lítica e d a n o ao fígado. F o i relatado que o chá verde causa anemia
microcítica. F o i observado que a q u i n i n a e a q u i n i d i n a causam
t r o m b o c i t o p e n i a . A p i m e n t a caiena (Caímcum annuum) a u m e n t a
a atividade f i b r i n o l í t i c a e i n d u z à h i p o c o a g u l a b i l i d a d e . O fucus
causa h i p e r t i r e o i d i s m o .
M u i t a s preparações de ervas afetam a f u n ç ã o d o fígado. Por
exemplo, relatou-se q u e o t ê u c r i o causa necrose das células hepá-
ticas e a podagráTia r a r a m e n t e causa icterícia colestática. O
c u m a r u é c o n h e c i d o por causar d a n o reversivel ao fígado. O
c o n f r e i é associado à m o r t e p o r i n s u f i c i ê n c i a hepática. A ajuga
reduz a concentração plasmática de p r o l a c t i n a e reduz a d e i o m -
zação do T 4 . M u i t o s dos efeitos das preparações de ervas na
f u n ç ã o hepática p o d e m estar associados aos c o n t a m i n a n t e s
advindos d o processo de fabricação.
Variáveis Não Controláveis
Os exemplos de variáveis pié-analíticas não controláveis i n c l u e m
aqueles relacionados a i n f l u ê n c i a s (1) biológicas, (2) ambientais,
(3) cíclicas de longa duração e (4) relacionadas às condições
médicas de base.13
Influências Biológicas
A idade, o sexo e a raça i n f l u e n c i a m os resultados de exames
laboratoriais d o i n d i v í d u o e são discutidos i n d i v i d u a l m e n t e e m
vários capítulos desse livro, e os intervalos de referência para os
diversos analitos e m f u n ç ã o dessas i n f l u ê n c i a s biológicas estão
listados n a Tabela 45-1, n o C a p i t u l o 45.
Idade
A idade t e m u m efeito n o t á v e l sobre os intervalos de referência
( p a r t i c u l a r m e n t e de h o r m ô n i o s ) , e m b o r a o grau de alteração
d i f i r a e m diversos relatos e pode depender d o m é t o d o analítico
utilizado. D e m o d o geral, os i n d i v í d u o s são categorizados e m 4
grupos—recém-nascido, criança o u púbere, a d u l t o sexualmente
m a d u r o e a d u l t o idoso.
Recém-nascido. Os f l u i d o s corporais de u m a criança recém-
nascida r e f l e t e m (1) a m a t u r i d a d e d o bebê ao n a s c i m e n t o , (2) o
t r a u m a d o n a s c i m e n t o e (3) as alterações relacionadas à adapta-
ção d o bebê a u m a existência i n d e p e n d e n t e . A c o n t a g e m de
hemácias e a concentração de h e m o g l o b i n a n o n e o n a t o ao nas-
c i m e n t o são m u i t o maiores d o que aquelas do a d u l t o , mas,
d e n t r o de poucos dias após o n a s c i m e n t o , os e n t r o c i t o s degra-
d a m c m resposta à m a i o r concentração de o x i g ê n i o c o m p a r a d a
àquela que o feto era exposto n o útero. N o bebê m a d u r o , a m a i o r
parte da h e m o g l o b i n a é d a f o r m a adulta, h e m o g l o b i n a A ,
e n q u a n t o n o bebê i m a t u r a , a m a i o r parte da h e m o g l o b i n a pode
ser da f o r m a fetal, h e m o g l o b i n a F. T a n t o n o bebê m a d u r o c o m o
i m a t u r o , a saturação de oxigênio d o sangue arterial é m u i t o baixa
i n i c i a l m e n t e . N o s recém-nascidos, desenvolve-se u m a acidose
metabólica decorrente d o a c ú m u l o de ácidos orgânicos, especial'
m e n t e ácido lático. Esse estado ácido-base, c o n t u d o , se reverte
ao n o r m a l d e n t r o de 24 horas n a ausência de doença.
D e n t r o de poucos m i n u t o s após o n a s c i m e n t o d o bebê, o
l í q u i d o passa dos vasos sanguíneos para os espaços extravascula-
res. O l í q u i d o é semelhante ao plasma, exceto pelo l í q u i d o
p e r d i d o para o espaço intravascular c o n t e r m e n o s proteína. C o n -
seqüentemente, a concentração de p r o t e í n a n o plasma a u m e n t a .
As atividades séricas de diversas enzimas, i n c l u i n d o C K , G G T e
A S T , são elevadas ao n a s c i m e n t o , mas o a u m e n t o da atividade
da A L T é m e n o r que das outras enzimas.
H m bebês, m e s m o na ausência de doença, a concentração de
b i l i r r u b i n a se eleva d e v i d o à destruição e r i t r o c i t á r i a a u m e n t a d a
e chega ao pico entre o terceiro e o q u i n t o dia de vida. A conju-
gação da b i l i r r u b i n a é relativamente pobre n o n e o n a t o c o m o
resultado da f u n ç ã o hepática i m a t u r a . A icterícia fisiológica d o
recém-nascido raramente p r o d u z valores de b i l i r r u b i n a sérica
maiores q u e 5 m g / d L (85 | U m o l / L ) . Pode ser d i f í c i l d i s t i n g u i r
esse f e n ô m e n o que ocorre n a t u r a l m e n t e de outras condições que
p r o d u z e m a h i p e r b i l i r r u b i n e m i a n e o n a t a l , e o curso c r o n o l ó g i c o
da h i p e r b i l i r r u b i n e m i a é i m p o r t a n t e .
A concentração de glicose n o sangue é baixa e m recém-nas-
cidos d e v i d o às suas pequenas reservas de glicogênio, e m b o r a
alguns a t r i b u a m a baixa glicose à i m a t u r i d a d e adrenal. As con-
centrações de lípídios n o sangue são baixas, mas a t i n g e m 8 0 %
dos valores de adultos após 2 semanas. A concentração plasmá-
tica de sódio e m u m bebê ao n a s c i m e n t o é ligeiramente mais alta
que a de u m a d u l t o ; e m 12 horas, esta d i m i n u i e fica abaixo d o
valor de a d u l t o antes de se elevai a u m valor l i g e i r a m e n t e maiOT
d o que o de u m a d u l t o . A concentração de cloro se altera de
m o d o semelhante e as alterações são largamente relacionadas à
transferência de l í q u i d o para d e n t r o e fora dos capilares sanguí-
neos. A concentração de potássio n o plasma p o d e estar alta, e m
até 7 m m o l / L ao n a s c i m e n t o , mas cai r a p i d a m e n t e depois disso.
O cálcio plasmático i n i c i a l m e n t e t a m b é m está elevado, mas
d i m i n u i e m cerca de 1,4 m g / d L (0,35 m m o l / L ) d u i a n t e o pri-
m e i r o dia de vida.
A concentração de uréia nitrogenada n o plasma d i m i n u i após
o n a s c i m e n t o , c o n f o r m e o bebê passa a sintetizar novas proteínas,
e n ã o v o l t a a a u m e n t a r até que o catabolismo tecidual se t o r n e
p r o e m i n e n t e . D e o u t r o m o d o , n a ausência de doença metabólica
( C a p í t u l o 44), a concentração plasmática de a m i n o á c i d o s é baixa
c o m o resultado da síntese de tecido protéico, e m b o i a a excreção
u r i n á r i a de a m i n o á c i d o s possa estar u m p o u c o alta p o r causa da
i m a t u r i d a d e dos mecanismos de reabsorção tubular. A concen-
tração plasmática d o ácido ú r i c o é elevada ao nascimento, mas a
alta depuração logo reduz a concentração plasmática a valores
abaixo dos d o a d u l t o .
A concentração de T 4 sérico d o recém-nascido saudável, assim
c o m o na m u l h e r grávida, é consideravelmente m a i o r d o que e m
mulheres n ã o grávidas. O bebê, após o n a s c i m e n t o , secreta T S H ,
o qual causa u m a u m e n t o a d i c i o n a l na concentração de T 4 s é r i c o .
O h i p e r t i r e o i d i s m o fisiológico declina g r a d u a l m e n t e d u r a n t e o
p r i m e i r o a n o de vida.
Infância e Puberdade O c o r r e m m u i t a s mudanças n a c o m p o -
sição dos f l u i d o s sanguíneos entre a infância e a puberdade.
As mudanças, e m sua maioria, são graduais, e raramente ocorrem
mudanças abruptas para concentrações de adultos.
As concentrações de proteína plasmática a u m e n t a m após a
infância, e os valores de concentração e m adultos são atingidos por
volta dos 10 anos de idade. A atividade sérica da m a i o r i a das
enzimas d i m i n u i d u r a n t e a i n f â n c i a para valores de adultos até
a puberdade, o u antes, e m b o r a a atividade da A L T possa conti-
n u a r a aumentar, pelo m e n o s n o h o m e m , até a meia-idade. A
atividade sérica de A L P é m a i o r na p r i m e i r a i n f â n c i a , mas
d i m i n u i d u r a n t e a i n f â n c i a e a u m e n t a n o v a m e n t e c o m o cresci-
m e n t o antes da puberdade. A atividade da enzima é mais b e m
l e l a c i o n a d a c o m o crescimento esquelético e a m a t u i i d a d e sexual
d o que c o m a idade cronológica, e é m a i o r n o m o m e n t o de ati-
vidade osteoblástica m á x i m a que ocorre c o m o crescimento dos
ossos. A atividade d i m i n u i r a p i d a m e n t e após a puberdade, espe-
c i a l m e n t e nas meninas. A s concentrações totais de L D L aumen-
t a m t a m b é m d u i a n t e a rápida estirada de crescimento.
 Coleta de Amostras e Outras Variáveis Pré-analíticas
A creatinina sérica aumenta constantemente da infância à
puberdade, paralelamente ao desenvolvimento da musculatura
esquelética; até a puberdade, existe pouca diferença nas concen-
trações dos dois sexos. A concentração sérica de ácido úrico
d i m i n u i de seu valor elevado ao nascimento até a idade entre 7
e 10 anos, m o m e n t o no qual começa a aumentar, especialmente
em meninos, até cerca dos 16 anos de idade.
0 Adulto. Os valores para adultos são geralmente tidos como
intervalo de referência para comparações com aqueles de jovens
e idosos. As concentrações da maioria dos constituintes perma-
necem quase constantes entre a puberdade e a menopausa nas
mulheres e entre a puberdade e a meia-idade nos homens.
D u r a n t e os anos da maturidade, as concentrações séricas de
proteína total e albumina d i m i n u e m ligeiramente. Pode haver
uma ligeira diminuição na concentração sérica de cálcio em
ambos os sexos. Nos homens, o fosfato séiico d i m i n u i bastante
após os 20 anos de idade; nas mulheres, o fosfato também
d i m i n u i até a menopausa, quando ocoire u m aumento agudo, A
A L P sérica começa a aumentar nas mulheres na menopausa, de
m o d o que a atividade dessa enzima em mulheres idosas possa ser
realmente maior do que em homens.
As concentrações de ácido úrico atingem seu pico em homens
por volta dos vinte anos e em mulheres durante a meia-idade. A
concentração de uréia em ambos os sexos aumenta na meia-idade.
A idade não afeta a concentração de creatinina sérica n o homem,
mas aumenta nas mulheres. A s concentrações séricas de colesterol
total e triglicerídeos aumentam tanto em homens como em
mulheres a uma taxa de 2 m g / d L (0,02 m m o l / L ) por ano a u m
máximo entre as idades de 50 e 60 anos. A atividade da maioria
das enzimas no soro é maior durante a adolescência do que
durante a vida adulta. Essa atividade enzimática aumentada pre-
sumivelmente reflete a maior atividade física dos adolescentes.
0 Adulto IdOSO. As concentrações plasmáticas de muitos cons-
tituintes aumentam nas mulheres após a menopausa (Tabela 3-7).
A habilidade renal de concentração fica reduzida na idade avan-
çada, de m o d o que a depuração da creatinina pode declinar em
até 5 0 % entre a terceira e n o n a década de vida. Essa depuração
d i m i n u í d a é causada mais p o r uma diminuição na excreção da
creatinina urinária como resultado da massa magra corpórea
d i m i n u í d a do que pela função renal alterada. A capacidade
tubular máxima para a glicose fica diminuída. A concentração
TABELA 3-7 Alterações na Composição do Soro com a
Menopausa
Constituinte % de Aumento
Alanina aminotransferase
Albumina
Fosfatase alcalina
Apolipoproteina A-1
Aspartato aminotransferase
Colesterol
Glicose
Fosfato
Fosfolipídios
Sódio
Proteína total
Ácido úrico
De WiUing P, Roííáson JG, Robinson D. PdICem of change for varwus bíochamicdl
coiiítúwents detecmd in uiel-populntion screening, Clin Cfiem Acta 1972-
41.375-87-
CAPÍTULO 3 59
de uréia no plasma aumenta com a idade, assim como a excreção
urinária de proteína. As concentrações médias de IgG e I g M no
soro são reduzidas nos idosos embora as concentrações séricas de
IgA nos homens aumentem ligeiramente na idade avançada.
As concentrações de hormônios também são afetadas pela
idade. Por exemplo, a concentração de T 3 d i m i n u i em até 4 0 %
em pessoas com mais 40 anos de idade. Embora a secreção de
T4 esteja diminuída, sua concentração não se altera porque sua
degradação também está d i m i n u í d a . N o entanto, a concentração
plasmática do paratormônio d i m i n u i com a idade. A secreção de
cortisol é reduzida, embora a concentração sérica possa não ser
afetada, e a secreção reduzida leva à redução da excreção urinária
de 17-hidroxicorticosteróides. A excreção de 17-cetosteróides n o
adulto idoso é cerca da metade da de u m adulto jovem. A secre-
ção e a depuração metabólica da aldosterona decrescem, com
uma redução de 5 0 % na concentração plasmática. A resposta da
aldosterona à restrição de sódio é diminuída. A concentração
basal de insulina não é afetada pela idade, mas sua resposta à
glicose é reduzida. E m homens, a taxa de secreção e a concentra-
ção da testosterona são reduzidas após os 50 anos de idade. Nas
mulheres, a concentração das gonadotrofinas hipofisárias, espe-
cialmente o h o r m ô n i o folículo-estimulante (FSH), estão aumen-
tadas n o sangue e na urina.
A secreção de estrõgeno na mulher começa a decrescer antes
da menopausa e continua a decrescer a uma maior velocidade
após a menopausa, enquanto as gonadotrofinas mostram u m
aumento recíproco mediado por retroalimentação. As concentra-
ções séricas de estrógenos d i m i n u e m em 7 0 % ou mais, e a excre-
ção urinária dos estrógenos d i m i n u i de m o d o compatível. A
secreção diminuída de estrõgeno pode ser responsável pelo
aumento do colesterol sérico que ocorre até os 60 anos de idade
nas mulheres. A secreção de estrógeno em homens, embora
sempre menor que nas mulheres, declina com a idade.
Sexo
A t é a puberdade existem poucas diferenças nos dad os laborato-
riais entre moças e moços jovens. Após a puberdade, as alterações
características nas concentrações dos hormônios sexuais, incluindo
prolactina, se tornam aparentes. Após a puberdade, a maior ati-
vidade sérica de enzima originada do músculo esquelético em
homens está relacionada à sua maior massa muscular. Após a
menopausa, a atividade da A L P aumenta nas mulheres e pode
até ficar tão elevada quanto nos homens. Embora a atividade
total de L D seja similar e m homens e mulheres, as atividades das
isoenzimas LD-1 e LD-3 são altas, e a LD-2 é menor em mulheres
jovens do que em homens. Essas diferenças desaparecem após a
menopausa.
As concentrações de albumina, cálcio e magnésio são maiores
nos homens que nas mulheres, mas a concentração de y-globu-
12 lina é menor. As concentrações de hemoglobina n o sangue são
2 menores na mulher; assim, as concentrações de b i l i r r u b i n a sérica
25 também são menores. A renovação aumentada dos eritrócitos nas
4 mulheres as leva a ter u m a contagem de reticulócitos maior que
11 a dos homens. O ferro sérico é baixo durante os anos férteis da
10 mulher, e sua concentração de ferritma pode ser apenas u m terço
2 da concentração n o h o m e m . A concentração reduzida de ferro
10 na mulher é atribuída à perda menstrual de sangue. E m con-
8 traste, a concentração sérica de cobre tende a seT mais elevada
1,5 em mulheres que em homens. As concentrações de colesterol e
0,7 L D L são tipicamente maiores no h o m e m , enquanto as concen-
10 trações de a-lipoproteína, apolipoproteina A - l e o H D L são
menores. As concentrações plasmáticas de aminoácidos e de
creatinina, uréia e ácido úrico são maiores no h o m e m do que na
mulher. 13
60 PARTE I Princípios Laboratoriais
Raça
Muitas vezes é difícil diferenciar se os efeitos nos exames labora-
toriais advêm da raça ou das condições socioeconómicas, assim
como é difícil, muitas vezes, determinar a raça do paciente.
Todavia, a concentração sérica de proteína total é conhecida por
ser mais elevada em negros do que em brancos. Isso se atribui
bastante a uma concentração m u i t o maior de y-globulina, embora
usualmente as concentrações de (X|- e p-globulinas também sejam
mais elevadas A albumina sérica é tipicamente menor em negros
que em brancos. Nos homens negros, a IgG sérica é freqüente-
mente 40% maior e a IgA sérica pode ser até 20% maior do que
no homem branco.
A atividade de C K e L D geralmente é m u i t o maior em negros,
homens e mulheres, do que nos brancos. Esse efeito é presumi-
velmente relacionado à quantidade de músculo esquelético, que
tende a ser maior nos negros que nos brancos. Devido ao seu
maior desenvolvimento esquelético, as crianças negras geralmente
apresentam uma atividade sérica de A L P mais elevada na puber-
dade que as crianças brancas. A atividade da amilase nos imigran-
tes das índias Ocidentais no Reino U n i d o é tipicamente maior
que nos nativos britânicos.
O metabolismo do carboidrato e dos lipídios difere em negros
e em brancos. A tolerância à glicose é menor em negros, poliné-
sios, nativos das Américas e inuítes se comparados a brancos com
sexo e idade equivalentes. Após os 40 anos de idade, as concen-
trações séricas de colesterol e triglicerídeos são consistentemente
maiores em brancos, tanto homens quanto mulheres, que em
negros. A concentração de lipoproreina (a) em negros pode ser
duas vezes mais elevada que em brancos. Esses podem ser fatores
da dieta, e não raciais, pois a concentração plasmática de lipídios
tem se mostrado diferente para o mesmo grupo racial em dife-
rentes partes do m u n d o . A concentração de hemoglobina no
sangue é de até 10 g / L mais elevada em brancos que em negros.
Os negros americanos de ambos os sexos possuem uma baixa
contagem de leucócitos, comparados aos brancos americanos,
causada em grande parte por um baixo número de granulócitos,
mas sua contagem de monócitos também é menor.
Fatores Ambientais
Os fatores ambientais que afetam os resultados incluem (1) alti-
tude, (2) temperatura ambiente, (3) localização geográfica da resi-
dência e (4) influências sazonais.
Altitude
Nos indivíduos que vivem em alta altitude, a hemoglobina do
sangue e o hematócTito são bastante aumentados, por causa
da reduzida PO z atmosférica. O 2,3-difosfoglicerato eritrocitário
também está aumentado, e a curva de dissociação dn oxigênio é
inclinada para a direita. A concentração aumentada de hemácias
leva à renovação de nucleoproteínas e excreção de ácido úrico
aumentadas. A concentração basal em jejum do h o r m ô n i o de
crescimento é alta em indivíduos que vivem em altas altitudes,
mas a concentração de renina e aldosterona são diminuídas em
indivíduos saudáveis. As concentrações plasmáticas de sódio e
potássio tipicamente não são afetadas pela alta altitude, embora
a osmolaridade seja reduzida. As concentrações séricas de proteína
C-reativa, transferrina e p 2 -globulina são notavelmente aumenta-
das com a transição a uma alta altitude. A adaptação completa a
uma altitude elevada leva muitas semanas, enquanto o ajuste a
baixas altitudes leva menos tempo.
Temperatura Ambiente
A temperatura ambiente afeta a composição dos líquidos sanguí-
neos. A exposição aguda ao calor causa a expansão do volume
plasmático pelo influxo de líquido intersticial para o espaço
intravascular, e pela redução da filtração glomerular. A concen-
tração de proteína plasmática pode d i m i n u i r em mais de 10%.
A sudorese pode causar perda de sais e água, mas geralmente não
há alterações nas concentrações plasmáticas de sódio e cloro. A
concentração de potássio no plasma pode cair a até 10% quando
o potássio é capturado pelas células. Se houver uma sudorese
excessiva, pode ocorrer hemoconcen tração em vez de hemodi-
luição.
Localização Geográfica da Residência
A localização geográfica de onde o indivíduo vive pode afetar
a composição de seus líquidos corpóreos. Por exemple, existe u m
aumento significativo na concentração sérica de colesterol, trigli-
cerídeos e magnésio em pessoas que vivem em áreas de água dura.
As concentrações de elementos-traço também são afetadas pela
localização geográfica; por exemplo, em áreas onde há fusão de
muitos minérios, as concentrações de elementos-traço envolvidos
pode estar aumentada. As concentrações de carboxiemoglobina
são elevadas nas áreas onde há tráfego m u i t o intenso de automó-
veis em comparação às áreas rurais (assim como ocorreu com o
chumbo sanguíneo na década de 1970 nos Estados Unidos). Os
indivíduos que trabalham primordialmente em recintos fechados
apresentam tipicamente menores concentrações de 25-hidroxivi-
tamina D do que os que trabalham ao ar livre, levando a uma
concentração sérica de cálcio mais elevada e maior excreção uri-
nária de cálcio.
Influências Sazonais
As influências sazonais na composição dos fluidos corpóreos são
comparadas com aquelas relacionadas a alterações na postura ou
uso impróprio do torniquete. Os fatores prováveis são as mudan-
ças na dieta conforme os diferentes alimentos da estação e a
atividade física diferente quando mais e diferentes formas de
esportes se tornam possíveis. A avaliação da variação sazonal é
difícil, pois depende da definição da estação e da magnitude da
mudança de temperatura de uma estação para a outra. A variabi-
lidade do dia-a-dia na composição dos fluidos corpóreos é maior
no verão do que no inverno. Todavia, a variabilidade biológica é,
em geral, apenas pouco menor que a variabilidade analítica. 15
Condições Médicas de Base
Algumas condições médicas gerais apresentam efeito na composi-
ção dos fluidos corpóreos. Essas incluem (1) obesidade, (2) cegueira,
(3) febre, (4) choque e trauma e (5) transfusões e infusões.
Obesidade
As concentrações séricas de colesterol, triglicerídeos e (i-lipopro-
teínas estão positivamente relacionadas com a obesidade. O
aumento na concentração de colesterol é atribuída à fração L D L ,
pois o H D L está tipicamente d i m i n u í d o . A concentração sérica
de ácido Úrico também se relaciona com o peso corporal, espe-
cialmente em indivíduos que pesam mais de 80 kg. A atividade
sérica de L D e a concentração de glicose aumentam nos dois
sexos com o ganho de peso. C o m o ganho de peso, as concen-
trações séricas de AST, creatinina, proteína total e hemoglobina
aumentam nos homens, e o cálcio sérico aumenta nas mulheres,
E m ambos os sexos, o fosfato sérico d i m i n u i com o aumento da
massa corpórea.
A produção de cortisol é aumentada em indivíduos obesos
C o n t u d o , o metabolismo aumentado mantém a concentração
sérica inalterada, de modo que a excreção urinária de 17-hidro-
corticosteróides e 17-cetosteróides é aumentada. Os indivíduos
 Coleta de Amostras e Outras Variáveis Pré-analíticas
obesos respondem pouco aos desafios normais, pois sua concen-
tração do h o r m ô n i o de crescimento é reduzida. A concentração
plasmática de insulina é aumentada, mas a tolerância à glicose é
prejudicada n o obeso (Capítulo 22). Embora a concentração de
T 4 sérico não seja afetada pela obesidade, o T 3 sérico se relaciona
significativamente com o peso corporal e aumenta mais com o
sobrepeso. N o h o m e m obeso, a concentração sérica de testoste-
rona está reduzida.
As concentrações em jejum de (1) piruvato, (2) lactato, (3)
citrato e (4) ácidos graxos não esterificados são maiores nos
obesos que nos indivíduos de peso normal. As concentrações
séricas de ferro e transferrina são baixas.
Cegueira
O estímulo n o r m a l do eixo hipotalâmico-hipofisário é reduzido
com a cegueira. Conseqüentemente, p o d e m ser observadas certas
características do hipo-hipofisarismo e hipoadrenalismo. E m
alguns indivíduos cegos, a variação diurna n o r m a l de cortisol
pode o u não persistir. A excreção urinária de 17-cetosteróides e
17-hidrocorticosteióides é reduzida. O sódio e o cloro plasmáti'
cos são muitas vezes baixos nos indivíduos cegos, provavelmente
como resultado de u m a secreção reduzida de aldosterona. A
glicose plasmática pode estar reduzida em pessoas cegas, e a
tolerância à insulina geralmente é menor. A excreção de ácido
úrico é d i m i n u í d a . A função renal pode estar ligeiramente com-
prometida, como evidenciado pelo leve aumento da creatinina e
uréia nitrogenada séricas.
Nas pessoas cegas, pode ocorrer o equilíbrio negativo do nitro-
gênio, e a concentração sérica de proteína pode estar reduzida. O
colesterol sérico está freqüentemente aumentado, e a concentra-
ção sérica de b i l i r r u b i n a também excede o l i m i t e superior ao
normal. A variação diurna do ferro sérico muitas vezes se perde.
Gravidez
O c o r r e m muitas mudanças nas concentrações dos analitos
duiante a gravidez, e a interpretação apropriada dos resultados
dos exames depende do conhecimento da duração da gestação
(Capítulo 43).
Durante a gestação ocorrem mudanças substanciais nos hor-
mônios, i n c l u i n d o muitas n o r m a l m e n t e não associadas à repro-
dução. Muitas das mudanças estão relacionadas ao grande
aumento no volume de sangue que ocorre durante a gravidez, de
cerca de 2.600 m L no início a 3.500 m L por volta de 35 semanas.
Essa hemodiluição reduz a concentração de proteínas plasmáti-
cas. Entretanto, as concentrações de algumas proteínas de trans-
porte, i n c l u i n d o a ceruloplasmma e a globulina ligada à tiroxina,
estão aumentadas, resultando no aumento da concentração de
cobre e T 4 . As concentrações de colesterol e triglicerídeos são
notavelmente aumentadas. E m contraste, a gestação cria uma
relativa deficiência de ferro e ferritina.
O volume u r i n á r i o aumenta durante a gravidez, de m o d o que
é tipicamente 2 5 % maior n o terceiro trimestre da gestação, com-
parado ao de mulheres não grávidas. A taxa de filtração glome-
rular aumenta em 5 0 % durante o terceiro trimestre. Isto resulta
em uma excreção urinária aumentada de h i d r o x i p r o l m a e uma
maior depuração de creatinina. A gestação engatilha muitas
reações de estresse fisiológico e está associada às concentrações
aumentadas de proteínas reativas de fase aguda. A taxa de sedi-
mentação eritiocitáiia aumenta cinco vezes durante a gravidez.
Esiresse
O estresse físico e mental influencia as concentrações de muitos
c nnstiruintes do plasma. A ansiedade estimula a secreção aumen-
tada de (1) aldosterona, (2) angiotensina, (3) catecolaminas, (4)
CAPÍTULO 3 61
cortisol, (5) prolactma, (ó) renina, (7) somatotrofina, (8) T S H e
(9) vasopressina. As concentrações plasmáticas de (1) albumina,
(2) colesterol, (3) fibrmogênio, (4) glicose, (5) insulina e (6) lactato
também aumentam.
Febre
A febre provoca muitas respostas hormonais. Por exemplo, a
hiperglicemia ocorre n o início e estimula a secreção de insulina.
Isto melhora a tolerância à glicose, mas a secreção de insuli-
na não reduz necessariamente a concentração de glicose n o
sangue por causa da aumentada secreção de h o r m ô n i o de cresci-
mento e glucagon. A febre parece Teduzir a secreção de T 4 assim
como faz a doença aguda mesmo sem febre. C o m o resposta a
maior secreção de corticotrofina, a concentração de cortisol no
plasma aumenta e a variação diurna n o r m a l pode ser abolida. A
excreção urinária do cortisol livre, 17-hidrocorticosteróides e 17-
cetosteróides aumenta. Q u a n d o a febre aguda cede, o u é mais
branda e ainda persiste por u m longo período, as respostas hor-
monais d i m i n u e m .
A glicogenólise e o equilíbrio negativo de nitrogênio ocorrem
com o início da febre. Isto é provocado pela ingestão de alimento
tipicamente d i m i n u í d a e perda de músculo esquelético que acom-
panha a febre. Embora seja n o r m a l u m aumento no volume
sanguíneo com a febre, as concentrações séricas de creatinina e
ácido úrico geralmente se elevam. A secreção de aldosterona
aumenta com a retenção de sódio e cloro. A secreção de hormô-
n i o antidiurético ta mb é m contribui para a retenção de água pelos
rins. Mas a síntese aumentada de proteína ocorre n o fígado, e as
concentrações plasmáticas de proteínas de fase aguda e glicopro-
teínas aumentam.
Muitas vezes a febre está associada a u m a alcalose respiratória
causada pela hiperventilação. Esse aumento de p H causa redução
da concentração plasmática de fosfato com uma excreção aumen-
tada de fosfato e outros eletrólitos. As concentrações séricas de
ferro e zinco declinam com o acúmulo de ambos os elementos
no fígado. A concentração de cobre aumenta devido a maior
produção de ceruloplasmina pelo fígado.
Choque e Trauma
Apesar da causa do choque ou do trauma, ocorrem certas altera-
ções bioquímicas características. Por exemplo, a secreção de cor-
ticotrofina é estimulada a produzir u m aumento de três a cinco
vezes na concentração sérica de cortisol. A excreção de 17-hidro-
corticosteróides está bastante aumentada, embora a excreção de
17-cetosteróides e metabólitos dos andrógenos adrenais possa
não ser afetada. A secreção de aldosterona é estimulada. A ativi-
dade plasmática da renina aumenta, assim como as secreções de
h o r m ô n i o do crescimento, glucagon e insulina. A ansiedade e o
estresse reduzem o T 3 sérico em 5 0 % nos pacientes sem doença
na tireóide. As alterações nas concentrações dos componentes do
sangue refletem a resposta fisiológica a essas mudanças hormo-
nais. D e m o d o geral, a resposta metabólica ao choque i n c l u i a
resposta n o r m a l ao estresse.
Imediatamente após a injúria, ocorre uma perda de líquido
para o tecido extravascular, resultando em uma diminuição do
volume plasmático. Q u a n d o a diminuição é suficiente para com-
prometer a circulação, a filtração glomerular d i m i n u i . A função
renal d i m i n u í d a leva ao acúmulo de uréia e outros produtos do
metabolismo da proteína na circulação. E m pacientes queimados,
a concentração de proteína total sérica cai em até 0,8 g / d L devido
à perda para espaços extravasculares e catabolismo de proteína.
As concentrações séricas de ÜJ-, a 2 - e P-globulina aumentam, mas
não o suficiente para compensar a concentração reduzida de albumina.
A concentração plasmática de fibrinogênio responde dramatica-
62 PARTE I Princípios Laboratoriais
mente ao t r a u m a e pode dobrar e m 2 a 8 dias após uma cirurgia.
A concentração de proteína C-reativa se eleva n o mesmo
período.
O dano muscular associado ao t r a u m a da cirurgia a u m e n t a
a atividade sérica de enzimas originárias d o m ú s c u l o esquelético,
e esse a u m e n t o na atividade pode persistir por diversos dias. 15 O
m a i o r catabolismo tecidual requer u m m a i o r c o n s u m o de oxigê-
n i o e t a m b é m leva à p r o d u ç ã o de metabólitos ácidos. Assim, o
lactato sanguíneo pode a u m e n t a r de duas a três vezes. A acidose
metabólica ocorre c o m a anóxia t e c i d u a l e o c o m p r o m e t i m e n t o
das funções renal e respiratória. C o m a destruição tecidual,
ocorre o a u m e n t o da excreção u r i n á r i a de componentes b i o q u í -
micos principais do m ú s c u l o esquelético.
Transfusões e Infusões
A perda de l í q u i d o rico e m proteínas d o espaço intravascular
após o t r a u m a é reposta c o m f l u i d o p o b r e e m proteínas do
espaço intersticial. Sub s eqüentem ente este f l u i d o é reposto p o r
u m l í q u i d o semelhante à c ons ti tui ç ão do plasma. A transfusão
de sangue t o t a l o u plasma eleva a concentração de proteína
plasmática; a dimensão dessa elevação depende da q u a n t i d a d e
de sangue a d m i n i s t r a d o . A atividade sérica da L D , principal-
m e n t e isoenzimas L D - 1 e L D - 2 e b i l i r r u b i n a , a u m e n t a devido à
r u p t u r a dos eritrócitos t r a n s f u n d i d o s . A transfusão para repor
perda de sangue em função da i n j ú r i a reduz a retenção de sódio,
cloro e água p r e c i p i t a d a pela i n j ú r i a . As concentrações séricas de
ferro e transferrina reduzem i m e d i a t a m e n t e após a i n j ú r i a , mas
grandes transfusões de sangue p o d e m levar a siderose e a u m
a u m e n t o da concentração de ferro sérico. O potássio sérico pode
a u m e n t a r c o m a transfusão de sangue armazenado.
As infusões de glicose geralmente resultam n u m a redução das
concentrações plasmáticas de fosfato e potássio. As infusões de
soluções de a l b u m i n a p o d e m a u m e n t a r a atividade plasmática de
A L P se a a l b u m i n a tiver sido preparada a p a r t i r de placentas.
D e v i d o à possível i n f l u ê n c i a dos componentes i n f u n d i d o s da
concentração dos constituintes circulantes, não é confiável coletar
sangue para a análise menos de 8 horas após a infusão de u m a
emulsão de gordura o u 1 h o r a após a infusão de carboidratos,
aminoácidos e proteínas hidrolisadas o u eletrólitos.
VARIABILIDADE BIOLÓGICA NORMAL
Os dados de estudos de variação biológica p o d e m ser usados para
(1) avaliar a i m p o r t â n c i a das mudanças nos valores dos testes de
u m i n d i v í d u o de u m a ocasião para outra, (2) d e t e r m i n a r adequa-
cidade dos intervalos de referência e em c o n j u n t o c o m dados de
variação analítica, (3) estabelecer objetivos analíticos laborato-
riais. A aplicação pelos clínicos da i n f o r m a ç ã o sobre variabilidade
biológica m e l h o r a sua h a b i l i d a d e de i d e n t i f i c a r precisamente
mudanças i m p o r t a n t e s nos resultados dos exames de seus pacien-
tes. As categorias de variação biológicas i n c l u e m (1) variações de
u m mesmo i n d i v í d u o e (2) entre diferentes i n d i v í d u o s . A altera-
ção nos dados laboratoriais ao r e d o r de u m p o n t o de e q u i l í b r i o
homeostático de u m a ocasião para a o u t r a de u m a mesma pessoa
é chamada de variação intra-sujeito o u i n t r a d i v i d u a l . A diferença
entre o p o n t o de e q u i l í b r i o dos diferentes i n d i v í d u o s é chamada
de variação i n t e r d i v i d u a l . A v a r i a b i l i d a d e i n t r a d i v i d u a l m é d i a
varia bastante para diferentes analitos, mesmo d e n t r o da mesma
classe de c o m p o n e n t e s b i o q u í m i c o s .
O s mecanismos usados para avaliar a v a r i a b i l i d a d e i n c l u e m
o delta cfiecíc e valores de referência da variação.
Delta Check
Q u a n d o a c o n d i ç ã o clínica d o paciente está estável e as diferenças
entre resultados de exames sucessivos são pequenas, a diferença
entre os resultados sucessivos p o d e ser usada c o m o u m a f o r m a
de controle de qualidade ( C a p í t u l o 16). A m a i o r i a dos médicos
decide a r b i t r a r i a m e n t e q u a n d o há diferença c l i n i c a m e n t e signi-
ficativa entre mensurações repetidas de u m m e s m o analito.
C o n t u d o , é possível c o n d u z i r o tema mais sistemática e logica-
mente. O conceito de delta check é aplicado a dois valores suces-
sivos i n d e p e n d e n t e m e n t e do i n t e r v a l o de t e m p o entre eles. Os
valores de delta check são t i p i c a m e n t e gerados de u m o u dois
modos: o p r i m e i r o é derivado de diferença entre os valores con-
secutivos coletados para u m anahto e m m u i t o s i n d i v í d u o s , os
quais são então diagramados e m u m histograma c o m o central
9 5 % ou 9 9 % de todos os valores usados para i d e n t i f i c a r u m a
alteração significativa nos valores. Os delta cfiecks p o d e m envolver
a diferença absoluta o u a variação percentual entre n ú m e r o s
consecutivos. A segunda abordagem para estabelecer os valores
de delta check conta c o m a m e l h o r estimativa de u m laboratorista
o u de u m m é d i c o de u m a a m p l i t u d e (delta (A]) a p r o p r i a d a para
a q u a l se deve coletar u m n ú m e r o gerenciável de resultados sina-
lizados para a c o m p a n h a m e n t o . T a m b é m se usa a taxa de verifi-
cações envolvida na divisão de u m valor de delta check pelo
intervalo de t e m p o entre as mensurações consecutivas. Diversos
métodos diferentes de delta check f o r a m propostos, i n c l u i n d o (1)
delta diferença: resultado atual menos resultado anterior; (2)
delta variação percentual: (resultado atual - resultado anterior)
x 1 0 0 % / r e s u l t a d o anterior; (3) taxa de diferença: delta d i f e r e n ç a /
delta t e m p o ; e (4) taxa de variação percentual: delta variação
p e r c e n t u a l / d e l t a t e m p o (onde o delta t e m p o é o i n t e r v a l o entre
os m o m e n t o s de coleta da amostra atual e anterior). A l g u n s sis-
temas de i n f o r m a ç ã o l a b o r a t o r i a l i n c l u e m delta checícs n o r e l a t ó r i o
dos resultados dos exames, mas geralmente o m e i o mais simples,
c o m o o delta diferença o u o delta variação percentual.
E m indivíduos saudáveis e e m pacientes estáveis, o valor de
delta entre dois resultados deve ser pequeno. Os valores aceitáveis
de delta p o d e m ser calculados d e n t r o de u m a população de indi-
víduos saudáveis, e então é feita a média, sendo esta usada c o m o
u m guia para d e t e r m i n a r se ocorreu u m a diferença de possível
significado clínico entre mensurações seriadas em pacientes.
Valores de Referência da Variação
Para d e t e r m i n a r se a diferença entre resultados consecutivos de
u m ú n i c o analito de u m paciente pode ter significância clínica,
H a r r i s e Yasaka 11 desenvolveram o conceito de valores de referên-
cia da variação (RCVs). U m R C V , t a m b é m c o n h e c i d o c o m o
diferença crítica (criticai difference), é o valor que precisa ser exce-
d i d o antes que u m a alteração e m resultados de exames consecu-
tivos seja estatisticamente significativa em u m a p r o b a b i l i d a d e
predeterminada. O conceito i n t r o d u z u m a abordagem científica
para u m a área o n d e os clínicos t ê m se apoiado bastante em sua
intuição e experiência. H i s t o r i c a m e n t e , as impressões de u m
clínico de diferenças c l i n i c a m e n t e significativas t ê m variado con-
sideravelmente. Fraser e colaboradores m o s t r a r a m que as diferen-
ças críticas calculadas sistematicamente para m u i t o s analitos
t e n d e m a ser menores d o que assumem os médicos a respeito das
diferenças c l i n i c a m e n t e significativas. 10
U m R C V leva e m consideração tanto a variação analítica
c o m o a i n t r a - i n d i v í d u o . Para m e l h o r a r a u t i l i d a d e d o R C V , a
variabilidade i n t r a - i n d i v i d u a l t a m b é m deve ser m i n i m i z a d a c o m
a padronização da preparação d o paciente e práticas de coleta e
processamento da amostra. A padronização é mais r a p i d a m e n t e
conseguida na prática hospitalar, na q u a l muitas vezes são possí-
veis coletas em intervalos de t e m p o u n i f o r m e s p o r flebotomistas
treinados, do que e m pacientes ambulatoriais.
- A variação nos valores entre mensurações sucessivas em u m
paciente i n t e r n a d o geralmente é m a i o r d o que os valores relata-
 Coleta de Amostras e Outras Variáveis Pré-a na líticas
dos na l i t e r a t u r a derivados de estudos c o m i n d i v í d u o s saudáveis
devido à variação na c o n d i ç ã o m é d i c a d o paciente e à resposta
ao t r a t a m e n t o . O s R C V s não são constantes, e a variação signi-
ficativa é provavelmente m e n o r d u r a n t e u m p e r í o d o mais c u r t o
do que d u i a n t e u m p e r í o d o mais longo. Assim, a aplicação dos
R C V s de i n d i v í d u o s saudáveis derivados de u m c u r t o p e r í o d o irá
i d e n t i f i c a r u m n u m e r o i n a d e q u a d a m e n t e grande de variações
aparentemente significativas nos pacientes hospitalizados.
REFERÊNCIAS
1. Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS Procedures for the
collection of diagnostic blood specimens by venipuncture: CLSI/
NCCLS Approved Standard H3-A5 5th ed. Wayne, PA- Clinicai and
Laboratory Standards Institute, 2003.
2. Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Procedures and
devices for the collection of capillary blood specimens1 CLSI/NCCLS
Approved Standard H4-A5. 5th ed. Wayne, PA. Clinicai and Laboratory
Standards Institute, 2004.
3 Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Procedures for the
collecrion of arterial specimens- CLSI/NCCLS Approved Standard H l l -
A4 4th ed. Wayne, PA: Clinicai and Laboratory Standards Institute,
2004.
4- Clinicai and Laboratory Standards Instirute/NCCLS Routine urinalysis
and collection, transportation, and pTesetvation of urine specimens
CLSI/NCCLS Approved Guideline GP16-A2. 2nd ed. Wayne, PA:
Clinicai and Laboratory Standards Institute, 2001.
5 Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Collection,
transport, preparation, and storage of specimens for molecular methods.
CLSI/NCCLS Approved Guideline MM13-A. lst ed. Wayne, PA:
Clinicai and Laboratory Standards Institute, 2006.
6. Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Piotection of
laboratory workers from occupationally acquired infections. CLSI/
NCCLS Approved Guideline M29-A3. Wayne, PA: National Clinica!
and Laboratory Standards Institute, 2005.
7 Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Evacuated tubes
and additives for blood specimen collection: CLSI/NCCLS Approved
CAPÍTULO 3 63
Standard H1-A5. 5th ed. Wayne, PA. National Clinicai and Laboratory
Standards Institute, 2003.
8. Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Sweat testing:
sample collection and quantitative analysis- CLSI/NCCLS Approved
Standard C34-A2 2nd ed Wayne, PA: National Clinicai and Laboratory
Standards Institute, 2000.
9. Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Procedures for the
handling and transport of domesric diagnostic specimens and etiologic
agents: Approved Standard H5-A3 3rd ed. Wayne, PA: National
C l i n i c a i a n d L a b o r a t o r y Standards Institute, 1994
10. Fraser CG, Oummings ST, Wilkinson SP, Neville RG, Knox JDE, et al.
Biological vatiabílity of 26 clinicai chemistry analytes in elderly people.
Clin Chem 1989;5:783-6.
11 Harris EK, Yasaka T. On the calculation of a "Reference Change" for
comparmg two consecutive measurements. Clin Chem 1983:29.
25-30.
12. Ladenson JH. Nonanalyrical sources of variation in clinicai chemistry
results. In: GradwohPs clinicai laboratory methods and diagnosis. 8th
ed. Sonnenwirth AC, Jarett L, eds. St. Louis: CV Mosby Co, 19S0-
149-92.
13. So you're going to collect a blood specimen: an introduction to
phlebotomy 11 th ed Kiechle FL, ed. Northfield, IL. College of
American Pathologísts, 2005.
14. Young DS, Bermes EW, Haverstick DM. Specimen collection and
processing In: Tietz textbook of clinicai chemistry and molecular
diagnostics. 4th ed. Burtis CA, Ashwood ER, Btuns DE, eds. St Louis.-
Elsevier Saunders, 2006-41-58.
15 Young DS, Bermes EW. Preanalytical variables and biological variation.
In: Tietz textbook of clinicai chemistry and molecular diagnostics 4th
ed. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. St Louis: Elsevier,
2006:449-73.
16. Young DS. Effects of drugs on clinicai laboratory tests, 5 th ed.
Washington, DC: AACC Press, 2001.
17. Young DS; Effects of Preanalytical Variables on Clinicai Laboratory
Teses 3rd ed. Washington DC: AACC Press, 2007. Note: An electronic
version of this book is also availahle with subscription information
available at www.fxol org.
INSTRUMENTAÇÃO E TÉCNICAS
ANALÍTICAS
CAPÍTULO 4
L.J. Kricka, D. PhiL, F.A.C.B., C.Chem., F.R.S.C., F.R.C.Path.,
OBJETIVOS
1. Fornecer duas definições para radiação eletromagnética em termos
de fóton e comprimento de onda e descrever os comprimentos de
ondas associados aos espectros ultravioleta, infravermelho e visível.
2. Descrever a lei de Beer e calcular a absorvância ou concentração
de uma solução utilizando a fórmula.
3. Definir fotometria, absorvância, percentagem de transmitância,
amplitude de banda, desvio da luz e linearidade.
4. Determinar absorvância a partir da medida de percentagem de
transmitância.
5. Listar os componentes de um espectrofotômetro e fornecer
exemplos de cada componente.
6. Determinar os princípios de espectrofotometria de absorção atômica
e listar as substâncias analisadas por essa técnica.
7. Definir luminescência, fluorescência, polarização da fluorescência,
nefelcmelria e turbidimetria.
8. Descrever o princípio da fiuorimetria e os fatores que interferem
nas medidas de fluorescência.
9. Listar os componentes de um fluorímetro básico.
10. Descrever os princípios da nefelometria e turbidimetria e os fatores
que interferem nas medidas de dispersão da luz.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A b s o r t i v i d a d e : A m e d i d a da absorção de energia radiante em
u m dado c o m p r i m e n t o de o n d a e / o u a freqüência ao
passar p o r u m a solução de u m a substância na concentração
de 1 m o l / L ; expressa c o m o a absorvância d i v i d i d a pelo
p r o d u t o da concentração de u m a substância e o
c o m p r i m e n t o da trajetória da amostra.
A b s o r t i v i d a d e M o l a r (E): U m a constante para u m a solução u m
m o l a r de u m d e t e r m i n a d o composto, e m u m d e t e r m i n a d o
c o m p r i m e n t o de o n d a e c o m 1 c m de espessura, sob
condições prescritas do solvente, temperatura, p H etc.;
expressa e m L / m o l X cm' 1 .
*Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições prévias dos Drs.
Merle A. Evenson e DT. Thomas O. Tifíany, nas quais se baseiam partes deste
capitula.
P A R T E II
Técnicas Ópticas*
e Jason Y. Park, M.D., Ph.D.
A h s o r v â n c i a (A): A capacidade de u m a substância em absorver
radiação; ela é expressa c o m o o l o g a r i t m o (log) do recíproco
da transmitância (T) da substância:
A = log ( l / T ) = log (T)
A r r a n j o de F o t o d i o d o : M a t r i z b i d i m e n s i o n a l de
semicondutores sensíveis à luz, que é utilizada para registrar
a completa absorção d o espectro em milissegundos.
B i o l u m i n e s c ê n c i a : E a emissão de luz c o m o conseqüência da
oxidação de a l g u m substrato celular (luciferinas) na
presença de u m a enzima (luciferases); existe em bactérias,
fungos, protozoários e espécies pertencentes a 40 diferentes
ordens de animais.
B r a n c o : Solução composta de todos os componentes de u m a
reação, exceto a substância a ser analisada.
C o m p r i m e n t o de O n d a : U m a característica da radiação
electromagnética, a distância entre duas cristas de onda.
D e s l o c a m e n t o de Stokes: O f e n ô m e n o pelo q u a l substâncias
luminescentes o u fluorescentes e m i t e m luz em
c o m p r i m e n t o s de ondas superiores ao c o m p r i m e n t o de
o n d a de excitação em que a luz é absorvida.
Dispersão d a L u z : A dispersão da luz ocorre q u a n d o a energia
radiante, passando p o r u m a solução, encontra u m a
partícula e é dispersada em todas as direções.
Espectro de Absorção: Descrição gráfica da absorvância uersus
c o m p r i m e n t o de onda (espectro absorvância) para u m
composto específico.
E s p e c t r o f o t o m e t r i a de A b s o r ç ã o A t ô m i c a ( A A ) : U m m é t o d o
analítico o n d e a amostra é vaporizada e a concentração de
u m m e t a l é d e t e r m i n a d a a p a r t i r da absorção de luz pelo
á t o m o n e u t r o , e m u m a das linhas fortes de emissão do
elemento.
E s p e c t r o f o t o m e t r i a : M e d i d a da intensidade da luz em
c o m p r i m e n t o s de ondas selecionados.
Fenda (Bandfiass): A faixa de c o m p r i m e n t o de o n d a que passa
p o r u m f i l t r o o u m o n o c r o m a d o r ; t a m b é m chamada de
largura da banda, é expressa c o m o o i n t e r v a l o de
c o m p r i m e n t o s de ondas t r a n s m i t i d o s em u m p o n t o igual à
metade do m á x i m o de intensidade t r a n s m i t i d a .
Fosforescência: Luminescência p r o d u z i d a p o r cenas substâncias
após terem absorvido energia radiante o u de outros tipos;
65
66 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
distinguida da fluorescência na medida em que continua
mesmo depois que a radiação incidente tenha desaparecido.
Fluorescência: A emissão de radiação eletromagnética por uma
substância após a absorção de energia de alguma forma (por
exemplo, a emissão de luz de uma cor [comprimento de
onda], quando uma substância é excitada por irradiação
com luz de diferente comprimento de onda); distinguida de
fosforescência por apresentar vida ú t i l inferior a 10
milissegundos, após cessada a excitação.
Fotodetector; U m dispositivo utilizado para medir ou indicar a
presença de luz.
Fotometria: A medição de luz.
Fotometria de Reflexão: Técnica de espectro fotometria em que
a luz é refletida da superfície de uma reação e é utilizada
para medir a quantidade da substância analisada.
Fotômetro/Espectrofotômetro. Dispositivo utilizado para
medir a intensidade da luz emitida que atravessa ou é
refletida por uma substância.
Fóton: U m quantum de energia radiante.
í n d i c e Refrativo (índice de Refração): Razão entre as
velocidades da luz em u m meio e em u m segundo meio.
L e i de Beer: Equação matemática que estipula que a
absorvância da luz monocromática por uma solução é
proporcional à absortividade (a), ac comprimento da
trajetória da luz (b) e à concentração (c)
A = abe
Luminescência: Luminescência é a emissão de luz ou de
energia radiante quando u m elétron retorna de u m nível
excitado ou de u m nível de energia superior para u m nível
energético inferior.
Luz Parasita: Qualquer luz de fora de u m fotômetro ou
espectrofotômetro, ou de dispersão dentro do instrumento,
que é detectada e provoca erros na medida da transmitància
ou absorvância.
Luz Visível: Região do espectro eletromagnético com
comprimento de onda entre 390 e 780 tirti, visível para o
olho humano.
M o n o c r o m á t i c a : A radiação electromagnética de um
comprimento de onda ou de uma faixa m u i t o restrita de
comprimento de onda.
Nefelometria: U m a técnica que utiliza u m nefelômetro para
medir o número e o tamanho de partículas em suspensão;
mede a intensidade da luz dispersa pelas partículas, com
u m detector em ângulo com o feixe luz incidente.
Quimioluminescência: Emissão de luz por moléculas nos
estados excitados produzidos por uma reação química,
como em vagalumes.
Radiação Infravermelha (IR): Região do espectro
eletromagnético entre 770 e 12.000 n m .
Radiação Ultravioleta (UV): Região do espectro eletromagnético
com comprimento de onda entre 180 e 390 nm.
Refração: Desvio oblíquo de u m raio de luz ou comprimento
de onda em trajetória linear, quando passa de u m meio
para outro.
Turbidez: Opacidade de u m a solução causada por partículas
em suspensão que dispersam luz, sendo que a quantidade
de luz dispersa está relacionada de maneira complexa com a
concentração, tamanhos e formas das partículas.
T u r b i d i m e t r i a . A medição de turbidez; geralmente executada
em instrumento (espectrofotômetro ou fotômetro) que
mede a razão entre a intensidade de luz transmitida por
dispersão e a intensidade de luz incidente.
M
uitas determinações realizadas em u m laboratório
clínico baseiam-se em medições da energia radiante (1)
emitida, (2) transmitida, (3) absorvida, (4) dispersa ou
(5) refletida sob condições controladas (Tabela 4-1). Os princípios
envolvidos em tais medições são considerados neste capítulo.
FOTOMETRIA E ESPECT RO FOTO M ET R IA
A fotometria é a medida da intensidade luminosa ou a quanti-
dade de luminosidade incidente em uma superfície. A espectro-
fotometria é a medida da intensidade da luz em comprimentos
de ondas selecionados.5 O termo medida fotométnea foi original-
mente definido como o processo utilizado para medir a intensi-
dade de luz independente do comprimento de onda. Os instru-
mentos modernos, no entanto, isolam uma faixa estreita do com-
primento de onda do espectro para as medições. Aqueles que
utilizam filtros para este f i m são referidos como fotômetros de
fiítro, enquanto aqueles que utilizam prismas ou grades são cha-
mados espectrofotômetros. A principal utilidade analítica dos
fotômetros de filtro ou espectrofotômetros é o isolamento e a
utilização de regiões discretas do espectro para fins de medição.
Conceitos Básicos
A energia é transmitida por ondas eletromagnéticas que são
caracterizadas pela freqüência e c o m p r i m e n t o de onda. Analiti-
camente, o termo comprimento de onda descreve uma posição
dentro de u m espectro. A radiação eletromagnética inclui energia
radiante que se estende desde raios cósmicos, com comprimentos
de ondas tão pequenos quanto 10 q nm, até as ondas de rádio,
com mais de 1 000 k m de comprimento. C o n t u d o , neste capí-
tulo, o termo luz é utilizado para descrever a energia radiante das
regiões de luz visível e ultravioleta do espectro (290 a 800 nm).
Entretanto, a luz não é apenas uma onda eletromagnética
com suas características usuais, a luz também se comporta como
se fosse composta de pacotes discretos de energia chamados
fótons, cuja energia é inversamente proporcional ao compri-
mento de onda. Por exemplo, radiação ultravioleta ( U V ) em 200
n m possui energia maior que a radiação infravermelha (IR) em
750 nm.
A Tabela 4-2 mostra as relações aproximadas entre compri-
mento de onda e as cores características das regiões de U V visíveis
e I R do espectro.
Relação entre Transmitància e Absorvância
Quando u m feixe de luz incidente com intensidade IQ passa
através de uma célula quadrada contendo uma solução com u m
composto que absorve luz em u m comprimento de onda especí-
TABELA 4-1 Identificação dos Métodos Ópticos
Tipo Exemplo
Absorção Absorção atômica, densitornetria. espectroscopia de luz
infravermelha com transformação de Fouríer, fotometria,
espectrofotometria, fotometria de reflexão, espectroscopia
de raio X
Em iasão Espectrofotometria de emissão de cliama, espectroscopia
de correlação de fluorescência (fes), espectroscopia de
transferência de energia de fluorescência (fret),
fluorimetria, luminometria (luz emitida de luminiscência,
quimioluminescência ou reação de
eletroquimioiuminescência), fosforimetria, fluorimetria com
resolução temporal
Polarização Espectroscopia de polarização de fluorescência, polarimetria
Dispersão Nefelometria. turbidimetria
 Técnicas Ópticas CAPÍTULO 4 67

Amostra

Concentração Concentração
Luz * 1 1 , 1 1
monocromática ( | | |

Unidades de 1„ „ „
absorvância '° °'5 °'25 °'125 °'06

lR Referência %T 10 31 56 75 87

Figura 4-2 Relação entre absorvância e % T

F i g u r a 4 - 1 Transmitância de luz através da amostra e das células de

postos em solução é d e f i n i d a , então, c o m o l s d i v i d i d o p o r I R .
referência. Transmitância da amostra contra a referência IS/IR.
N a prática, a célula de referência é inserida e o i n s t r u m e n t o
10 = intensidade da luz incidente; Is = intensidade de luz transmitida
ajustado p o r u m a escala arbitrária de l e i t u r a de 100 (corres-
por compostos da solução; I R = intensidade de luz transmitida através
p o n d e n t e a 100% transmitância), após o q u a l a l e i t u r a d o
da célula de referência.
percentual de t r a n s m i t â n c i a da amostra é realizada. A quan-
tidade de luz absorvida (A) e n q u a n t o a luz i n c i d e n t e passa
através da amostra é equivalente a

TABELA 4-2 Características das Cores dos Espectros

U l t r a v i o l e t a , Visível e I n f r a v e r m e l h o C u r t o A = — log = —1 oa; T (2)
4
Comprimento de Onda (nm) Nome da Faixa Observado

<380 UltraviolEtat Invisível Lei de Beer

380-440 Visível Violeta A Lei de Beer estabelece que a concentração de u m a substân-
440-500 Visível Azul
cia é diretamente p r o p o r c i o n a l à q u a n t i d a d e de luz absorvida
500-580 Visível Verde
o u inversamente p r o p o r c i o n a l ao l o g a r i t m o da luz t r a n s m i t i d a
580-600 Visível Amarelo
(Figura 4-2). M a t e m a t i c a m e n t e , a lei de Beer é expressa c o m o
600-620 Visível Laranja
620-750 Visível Vermelho
A = abe (3)
800-2.500 Infravermelho Próximo Não perceptível
onde
2,500-15.000 Infravermelho Médic Não perceptível
A = Absorvância
15.000-1.000.000 Infravermelho Distante Não perceptível
a = C o n s t a n t e de p r o p o r c i o n a l i d a d e d e f i n i d a c o m o absor-
*Em uirtudá da natureza subjetiva das cores, os iníerajlos de comprimento de onda
tividade
müSÊrcídüs sâo aproximações. b =
f
Trajetória da luz em centímetros
A regido ultravioleta (UV) do espectro é por vezes subdividida em UV "próximo"
c = C o n c e n t r a ç ã o d o c o m p o s t o absorvido, usualmente
(200-350 nm) e UV "distante" (<2Z0 nm). Esta distinção arbitrária tem base prática
porque a sílita utilizada para fazer cri fie tas tTa-nsTnjte ã lu; eficazmente em expresso e m gramas p o r l i t r o .
comjmitiíntos de ondas i220 nm.
i Esta equação é a base da análise q u a n t i t a t i v a p o r absorção
f o t o m é t r i c a . Os valores de absorvância (A) não t ê m unidades;
então, as unidades para a são as recíprocas daquelas para b e
c. Q u a n d o b é 1 c m e c é expressa em moles p o r l i t r o , o
fico, X (Figura 4-1), a inte ns i dade do feixe de luz t r a n s m i t i d a I s é s í m b o l o £ (épsilon) é s u b s t i t u í d o pela constante a. O v a l o r de
i n f e r i o r a I 0 , e a luz t r a n s m i t i d a (T) é d e f i n i d a c o m o E é constante para u m d e t e r m i n a d o c o m p o s t o , em u m deter-
m i n a d o c o m p r i m e n t o de o n d a , sob condições prescritas d o
solvente, da temperatura, d o p H etc., e é c h a m a d o de absor-
T = — t i v i d a d e m o l a r (E). A n o m e n c l a t u r a da espectrofotometria
(1)
está r e s u m i d a na Tabela 4-3.

Aplicação da Lei de Beer

Parte da luz i n c i d e n t e , e n t r e t a n t o , p o d e ser r e f l e t i d a pela superfície
da célula o u absorvida pela parede da célula o u solvente. Estes fatores
são e l i m i n a d o s pela utilização de u m a célula de referência i d ê n t i c a a
da amostra, c o m exceção do c o m p o s t o de interesse que é o m i t i d o d o
solvente na célula de referência. A t r a n s m i t â n c i a (T) através desta
célula de referência é I R d i v i d i d o por IQ; a t r a n s m i t â n c i a pata os com-
N a prática, a p r o p o r c i o n a l i d a d e direta entre a absorvância e
a concentração deve sei estabelecida e x p e r i m e n t a l m e n t e para
u m d e t e r m i n a d o i n s t r u m e n t o sob condições especificadas.
F r e q ü e n t e m e n t e existe u m a relação linear até certa concentra-
ção o u absorvância. Q u a n d o essa relação ocorre, é d i t o que a
solução obedece à lei de Beer até aquele p o n t o . D e n t r o desta
68 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

TABELA 4-3 Nomenclatura da Espectrofotometria concentrações variadas, é i n c l u í d o para c o b r i r todas as faixas de

leituras desconhecidas.
Nome Símbolo Definição
E m alguns casos, u m m a t e r i a l p u r o de referência p o d e não
Absorvância A iog T ou log V f estar f a c i l m e n t e disponível e as constantes obtidas para o m a t e r i a l
Absortividade a A/bc (c ín g/L) p u r o , relatadas na literatura, p o d e m ser utilizadas. E m geral,
Absortividade molar E A/bc (c in mol/L) constantes publicadas devem ser utilizadas apenas se o m é t o d o é
Largura da trajetória b Largura interna da seguido em detalhes e as leituras são realizadas em u m espectro-
célula ou da amostra,
f o t ô m e t r o capaz de fornecer luz c o m alta pureza espectral n o
em cm
c o m p r i m e n t o de o n d a verificado. A utilização de fontes l u m i n o -
Transmitància r IV
sas mais c o m ampla faixa de luz geralmente c o n d u z à d i m i n u i ç ã o
Unidade de comprimento de onda nm 10 a m
Absorção máxima Comprimento de onda da absorvância. A absorvância da n i c o t i n a m i d a a d e n i n a dinucle-
^-rn.tx
onde ocorre absorção otídeo reduzida ( N A D H ) e m 3 4 0 n m , p o r exemplo, é freqüente-
máxima m e n t e utilizada c o m o referência para a determinação da ativi-
dade enzimática, c o m base e m absortividade m o l a r de 6,22 X 103
"I/ln é d razão entre as intensidades da lu* incidente e da luz transmitida.
( C a p í t u l o 19). Este v a l o r é aceitável apenas sob condições cuida-
dosamente controladas a n t e r i o r m e n t e descritas e não deve ser
utilizado a menos que essas condições sejam satisfeitas. Valores
publicados para absortividades molares e coeficientes de absor-
limitação, u m a constante de calibração (K) pode ser derivada e
ção devem ser utilizados apenas c o m o orientações até que sejam
utilizada para calcular a concentração de u m a solução desconhecida
c o n f i r m a d o s p o r leituras do m a t e r i a l de referência p u r o em u m
pela comparação c o m u m a solução de calibração. D a equação (3)
d e t e r m i n a d o i n s t r u m e n t o . E m adição, a lei de Beer é seguida
apenas se as seguintes condições estiverem reunidas;
(4) • A radiação incidente sohre a substância de interesse é
monocromática.
• A absorção pelo solvente é insignificante, q u a n d o compa-
Portanto, rada c o m a absorvância do soluto.
• A concentração do s o l u t o está d e n t r o dos limites.
A, • Interferência óptica não está presente.
(5) • N ã o ocorre reação q u í m i c a entre a m o l é c u l a de interesse
bf\ bf2
e o u t r a molécula do s o l u t o o u solvente.

o n d e os n ú m e r o s subscritos 1 e 2 i n d i c a m a absorvância (a),

Erros de Medição
distância da trajetória (fc) e concentração (c) das soluções de
Para a m a i o r i a dos fotômetros, a resposta d o detector a u m sinal
calibração e desconhecidas, respectivamente.
de luz t r a n s m i n d a é de tal o r d e m que qualquer incerteza e m % T
E m v i r t u d e de a trajetória da luz (fc) se m a n t e r constante em
é constante em relação à escala % T completa. A incerteza p r o v é m
u m d e t e r m i n a d o m é t o d o de análise para u m valor fixe do
de imperfeições elétricas e mecânicas d o e q u i p a m e n t o e de varia-
t a m a n h o da cubeta, !)! = b 2l a equação (8) torna-se
ções i n d i v i d u a i s na utilização d o i n s t r u m e n t o .
U m a distância fixa na escala linear (p. ex., \ % T ) representa
mudanças maiores na absorvância para valores baixos de % T d o
A, A- A^_ A^
(6) que para os valores altos de % T . Por esta razão, o erro da con-
centração absoluta, o u incerteza, é m a i o r q u a n d o as leituras de
absorvâncías obtidas são altas. N o e n t a n t o , o erro de concentra-
o n d e c e u representam calibrador e desconhecido, respectiva- ção relativa é alto t a n t o para leituras de absorvãncias baixas
mente. q u a n t o para altas. Estudos t ê m d e m o n s t r a d o que o erro relativo
Resolvendo para a concentração do desconhecido é m í n i m o para u m a absorvância de 0 , 4 3 4 ( 3 6 , 8 % T ) . Conseqüen-
temente, os métodos deveriam ser desenhados c o m u m intervalo
• , = — *ce de absorvância de 0,1 a 0,7 ( 2 0 % a 8 0 % T ) .
(7)
A,

o u a expressão equivalente
= A. x K
<8)
x = a
^ 7 ' que u t i l i z a m prismas o u grades são chamados espectrofotômeiros.
o n d e K ~ c.JÀc. O valor d a c o n s t a n t e K é o b t i d o pela m e d i d a da
absorvância ( A j de u m calibrador de concentração conhecida ( c j .
Certas precauções devem ser observadas c o m a utilização de
tais constantes de calibração. Sob n e n h u m a circunstância, a cons-
tante deve ser utilizada q u a n d o o calibrador o u as leituras desco-
nhecidas excedem a porção linear da curva de calibração (isto é,
q u a n d o a curva já não obedece a lei de Beer). Pelo menos dois
o u , de preferência, mais calibradores devem ser incluídos para
gerar a curva de calibração. U m a curva de calibração não linear
p o d e ser utilizada se u m n ú m e r o suficiente de calibradores, c o m
INSTRUMENTAÇÃO
I n s t r u m e n t o s m o d e r n o s isolam u m i n t e r v a l o de c o m p r i m e n t o de
o n d a estreito do espectro para as medições. Aqueles que u t i l i z a m
filtros para este f i m são referidos c o m o fotômetios de filtro-, aqueles
Os espectrofotômetros são classificados c o m o port adores de feixe
simples o u d u p l o s .
Os principais componentes de u m espectrofotômetro de feixe
simpteí são mostrados, esquematicamente, na Figura 4-3. Nesse
i n s t r u m e n t o , u m feixe de luz é t r a n s m i t i d o através de u m m o n o -
c r o m a d o r q u e isola a região d o espectro desejada para as m e d i -
ções. Fendas são utilizadas para isolar u m feixe de luz estreito e
o t i m i z a r a pureza cromática. E m seguida, a luz atravessa u m a
célula de absorção (cubeta), o n d e u m a p a r t e da energia radiante
é absorvida, d e p e n d e n d o da natureza e concentração da substân-
cia em solução. Q u a l q u e r luz não absorvida é t r a n s m i t i d a para
 Técnicas Ópticas CAPÍTULO 4 69

O ÜJLU

Figura 4-3 Principais componentes de um Fonte Fenda de Monocromador Fenda de Cubeta Detector Medidor
espectrofotômetrro com feixe simples. luminosa entrada saída

Fonie
luminosa Amostra

O — >

Referência

\ — >
Espelho v

Figura 4-4 Especttofotômetro de feixe duplo Fendas de Monocromadores Fenda Cubetas Detectores Medidor
espacial. entrada de
saída

Amostra

Espelhos

Modulador

x.
y
O Referência
5 "
l l l l l

Detector Medidor
Fonte Fenda de Monocromador Fenda de
luminosa entrada saída
\
Espelhos Espelho

Cubetas

Figura 4 - 5 Espectrofotômetro de feixe duplo com resolução temporal.

u m detector (fotocélula o u f o t o t u b o ) , que converte a luz e m
energia elétrica, que p o d e ser registrada e m u m m e d i d o r o u
registrador, o u ser d i g i t a l m e n t e exibida.
N a operação m a n u a l , a cubeta é substituída p o r u m b l o c o
opaco, de m o d o que n e n h u m a luz atinge a fotocélula e o m e d i d o r
é ajustado para 0 % T. E n t ã o , u m a cubeta c o n t e n d o o b r a n c o é
inserida e o m e d i d o r é ajustado para 100% T (zero de absorvân-
cia). A composição do branco deve ser idêntica à de calibragem
o u da amostra, exceto pela presença da substância a ser m e d i d a
c o n t i d a na amostra. Soluções de calibração, c o n t e n d o diversas
concentrações conhecidas da substância são inseridas, e as leitu-
ras são registradas. F i n a l m e n t e , é realizada a l e i t u r a da solução
desconhecida e, p o r comparação c o m as leituras obtidas na cali-
bração, a concentração é d e t e r m i n a d a . N a m a i o r i a dos espectro-
fotômetros, periféricos e aplicativos digitais são c o m p o n e n t e s
integrantes, o que possibilita executar essas funções automatica-
mente.
A Figura 4-4 ilustra, esquematicamente, u m sistema de feixe
d u p l o c o m resolução espacial, o n d e todos os c o m p o n e n t e s ,
exceto a f o n t e de luz, estão d u p l i c a d o s . O u t r a abordagem utiliza
u m i n s t r u m e n t o c o m resolução t e m p o r a l , o n d e u m m o d u l a d o r
de feixe de luz ( u m círculo c o m rotação e c o m seções alternadas
de p r a t a e i n t e r r u p t o r e s ) é i n s e r i d o após a fenda de saída (Figura
4-5). U m sistema de espelhos c o n d u z as frações de luz refletidas
fora d o m o d u l a d o r , alternadamente, através da amostra e de u m a
cubeta referência para u m detector c o m u m . A abordagem de
m o d u l a d o r de feixe, u t i l i z a n d o u m detector, compensa a variação
da f o n t e l u m i n o s a e as mudanças de sensibilidade d o detector.
70 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

Componentes TABELA 4-4 Vários T i p os de Laser e C o m p r i m e n t o s de

Os c o m p o n e n t e s básicos de u m espectrofotômetro i n c l u e m (1)
Ondas em que O p e r a m
f o n t e de luz, (2) u m m e i o para isolar a luz, c o m u m c o m p r i m e n t o
de o n d a desejado, (3) fibras ópticas, (4) cubetas, (5) fotodetector, Laser Comprimento(s] de Onda(s) (mm)
(6) dispositivo de leitura, (7) registrador e (8) c o m p u t a d o r . Fluoreto de argônio 193
Fluoreto de argônio 248
Fontes Luminosas Hélio-cádmio 325 ou 442
Os tipos d e fontes l u m i n o s a s utilizadas e m espectro f o t ô m e t r o s Nitrogênio 337
i n c l u e m lâmpadas incandescentes e laser. Argônio (azul) 488
Argônio (verde) 514
Lâmpadas Incandescentes Hélio-néon (verde) 543
A fonte l u m i n o s a para medidas na região visível d o espectro é Emissor de luz diodo - GaP 550 ou 700
n o r m a l m e n t e u m a lâmpada de tungsténio. A v i d a de u m f i l a m e n t o Corante rodamina GG (ajustado) 570-650
tungsténio é grandemente a u m e n t a d a pela presença de vapores de Laser diodo (AlGalnP, GaAIAs) 634-1,660
i o d o o u b r o m o e m baixa pressão d e n t r o da lâmpada. U m exemplo Hélio-néon (vermelho) 633
é a lâmpada de quartzo-halogênio, que t e m u m envelope de sílica Rubi (CrAlOa) (vermelho) 694
f u n d i d a e q u e p r o p o r c i o n a alta intensidade d e luz e m u m a m p l o Emissor de luz diodo - GaAs 880
espectro e p o r longos períodos de f u n c i o n a m e n t o . Emissor de luz diodo - Si 1.100
Neodímio - YAG (rtrio alumínio granada) 1.064
A fonte l u m i n o s a de t u n g s t é n i o n ã o fornece energia radiante
Dióxido de carbono 9.300, 9.600,1G.3G0 ou 10.600
suficiente para medições inferiores a 3 2 0 n m . N a região de ultra-
violeta do espectro, u m a l â m p a d a de vapor d e m e r c ú r i o e m baixa
pressão, q u e e m i t e u m espectro d e s c o n t í n u o o u u m a l i n h a espec-
tral é ú t i l para calibração, mas n ã o é p r á t i c o para medidas de
absorvância, pois p o d e ser utilizada apenas e m d e t e r m i n a d o s
c o m p r i m e n t o s de ondas. Lâmpadas de h i d r o g ê n i o e d e u t é r i o são
fontes de espectros c o n t í n u o s n a região de U V , c o m algumas
linhas intensas de emissões, c o m o íazem as lâmpadas de v a p o r
de m e r c ú r i o e m alta pressão e de arco de x e n ô n i o . Estas fontes
são mais c o m u m e n t e utilizadas nas medidas de absorção de U V .
U m a l â m p a d a de d e u t é r i o é mais estável e t e m vida mais longa
que u m a l â m p a d a de h i d r o g ê n i o .
U m f o t ô m e t r o a m p l a m e n t e u t i l i z a d o c o m o u m detector de
c r o m a t o g r a f i a l í q u i d a de alta pressão ( H P L C ) utiliza u m a l i n h a
de ressonância intensa a 254 n m , p r o d u z i d a p o r u m a l â m p a d a
de arco de m e r c ú r i o ( C a p í t u l o 7). O u t r o s e m p r e g a m u m a l â m p a d a
m i n i a t u r a de tubos de raios catódicos c o m o f o n t e intensa, e m
faixa m u i t o estreita de c o m p r i m e n t o de o n d a . Por exemplo, u m a
l â m p a d a d e cátodo o c o de zinco fornece u m a l i n h a e m 214 n m ,
que está a d e q u a d a m e n t e p r ó x i m a d o c o m p r i m e n t o de o n d a
m á x i m o de absorção da ligação p e p t í d i c a (206 n m ) e t e m sido
utilizada para m e d i r peptidíos e proteínas. Detalhes sobre
l â m p a d a de cátodo oco são e n c o n t r a d o s na seção sobre Espectro- Comprimento dQ onda
f o t o m e t r i a de A b s o r ç ã o A t ô m i c a .
Figura 4-6 Características dn espectro de filtro corta-banda
Fontes de Laser pronunciado (a) e (b) filtro de fenda amplo. O filtro de fenda restrito (c)
O laser (amplificação de luz p o r emissão e s t i m u l a d a de radiação) é obtido da combinação dos filtros a e b. A largura de banda espectral
é u m dispositivo que t a m b é m é u t i l i z a d o c o m o fonte de luz e m do filtro c (distância n-m) é definida como a largura, em nanômetros, da
espectrofotômetros. Estes dispositivos t r a n s f o r m a m a luz de várias curva da rtansmitância espectral em um ponto igual à metade do
freqüências e m u m feixe de luz m o n o c r o m á t i c o e x t r e m a m e n t e máximo da transmitância.
intenso, focalizado e quase não divergente. Pela seleção de dife-
rentes materiais, diferentes c o m p r i m e n t o s de ondas da luz e m i t i d a
p o r laser são o b t i d o s (Tabela 4-4).
Filtros
O t i p o mais simples de f i l t r o é f o r m a d o p o i u m a f i n a camada de
Isolamento Espectral v i d r o c o l o r i d o . D e u m p o n t o de vista estrito, u m f i l t r o de v i d r o
U m sistema de i s o l a m e n t o de energia r a d i a n t e c o m c o m p r i m e n t o não é u m verdadeiro m o n o c r o m a d o r , p o r q u e esse t r a n s m i t e luz
de o n d a desejado, e x c l u i n d o outros c o m p r i m e n t o s de ondas, é sobre u m a faixa relativamente vasta de c o m p r i m e n t o de onda. A
chamado d e monocromador. Os dispositivos utilizados para isola- pureza espectral de u m f i l t r o o u o u t r o m o n o c r o m a d o r é n o r m a l -
m e n t o espectral i n c l u e m (1) filtros, (2) prismas e (3) grades de mente descrita em termos da respectiva lãrgma dã bãndã d o espec-
difração. A l é m disso, combinações de lentes e fendas são freqüen- tro. Esta é d e f i n i d a c o m o a largura, e m n a n ô m e t r o s , da curva de
t e m e n t e inseridas antes ou depois d o m o n o c r o m a d o r para t o r n a r t r a n s m i t â n c i a espectral, e m u m p o n t o igual à metade d o pi co de
os raios de luz paralelos o u para isolar regiões estreitas d o feixe. transmitância (Figura 4-6). Os filtros de v i d r o c o m u m e n t e utiliza-
Fendas variáveis t a m b é m são utilizadas para p e r m i t i r ajustes n o dos apresentam largura de banda espectral de a p r o x i m a d a m e n t e
t o t a l de energia r a d i a n t e que chega à fotocélula. 5 0 n m e são referidos c o m o filtros fenda (bandpass) amplos.
 Técnicas Ópticas CAPÍTULO <4 71

O u t r o s filtros de v i d r o i n c l u e m os tipos fenda estreita e corta- tificar e resolver os picos de absorção acentuados q u e estão i n t i -
b a n d a {Figura 4-6). C o m o d e m o n s t r a d o , u m f i l t r o corta-banda m a m e n t e adjacentes. Q u a n d o u m a p a r t e do espectro de energia
t i p i c a m e n t e mostra u m crescimento p r o n u n c i a d o na t r a n s m i t à n - t r a n s m i t i d a pelo m o n o c r o r n a d o r n ã o for absorvida pela substân-
cia ao l o n g o de u m a região estreita d o espectro e é utilizado p a i a cia a ser m e d i d a , u m a discrepância c o m a lei de Beer deverá
e l i m i n a r a luz abaixo de u m c o m p r i m e n t o de o n d a d e t e r m i n a d o . ocorrer. Isto é mais c o m u m e n c e observado em i n s t r u m e n t o s c o m
Filtros do t i p o fenda estreita são construídos pela c o m b i n a ç ã o de fenda ampla.
dois o u mais filtros corta-banda o u regular. A l g u m a u m e n t o da absorvância e u m a m e l h o r linearidade
Filtros d e interferência t a m b é m são utilizados c o m o m o n o c r o - c o m a concentração são geralmente observados em i n s t r u m e n t o s
madores. Esses filtros apresentam larguras espectrais estreitas, que o p e r a m em u m a faixa estreita de luz. Isto é especialmente
geralmente, entre 5 a 15 n m . E m v i r t u d e de t a m b é m t r a n s m i t i r e m verdade para as substâncias q u e apresentam u m pico de absorção
c o m p r i m e n t o s de ondas h a r m ô n i c o s o u m ú l t i p l o s além do com- p r o n u n c i a d o A s curvas de absorvâncias espectrais de u m a
p r i m e n t o desejado, f i l t r o s de v i d r o a c e s s ó r i o s são necessários p a r a solução de c o p r o p o i T i d n a I (Figura 4-7) d e m o n s t r a m uma notável
e l i m i n a r esses c o m p r i m e n t o s de ondas indesejáveis. Assim, u m d i m i n u i ç ã o na absorvância m á x i m a espectral q u a n d o a largura
f i l t r o de interferência projetado para 6 2 0 n m t a m b é m irá trans- da b a n d a é a u m e n t a d a de 1 a 20 n m . As larguras de banda naturais
m i t i r alguma radiação e m 310 e 1.240 n m , salvo se filtros de corte de u m a substância absorvente são definidas c o m o "curva de
acessórios f o r e m adicionados, para absorver esta luz parasita. absorvância espectral de u m a largura de b a n d a em u m p o n t o
igual à metade da absorvância m á x i m a " . A curva da Figura 4-7
Prismas e Grades de Difração apresenta u m a varredura de laTgura de b a n d a espectral de 1 n m
Prismas e grades de difração t a m b é m são a m p l a m e n t e utilizados e mostra u m a b a n d a natural de a p r o x i m a d a m e n t e 10 n m . C o m o
c o m o m o n o c r o m a d o r e s . Por refração, u m fmsma separa a luz regra geral, para leituras de picos de absorvância estarem d e n t r o
branca em u m espectro c o n t í n u o , sendo mais d o b r a d a o u refra- de 9 9 , 5 % dos valores verdadeiros, a largura de b a n d a espectral
tada em c o m p r i m e n t o s de ondas curtos do q u e e m longos. U m a não deve ultrapassar 10% da banda n a t u r a l . Por exemplo, m u i t o s
grade de difração é preparada pela deposição de u m a f i n a camada
de u m a liga de a l u m í n i o e cobre na superfície de u m a placa de
v i d r o plana e, em seguida, pequenos sulcos paralelos são riscados
n o revestimento metálico.
As grades holográficas m oder nas são construídas utilizando-se
u m laser na m o d a l i d a d e "usinagem de alta precisão". A superfície
de u m material fotossensível, designado "fotorresistente" é varrida
acuradamente p o r u m feixe do User focalizado. Depois de diversas
linhas t e r e m sido gravadas no material fotorresistente, p r o d u t o s
q u í m i c o s são utilizados para dissolver e eluir o material fotorresis-
tente exposto, para criar os canais que se t o m a r ã o as linhas da
grade. U m a camada de u m m a t e r i a l altamente reflexivo é então
depositada na superfície dos canais construídos a laser, e a grade
está p r o n t a para ser utilizada. T a n t o as superfícies fotorresistentes
planas q u a n t o as côncavas são utilizadas para c o n s t r u i r este t i p o
de grade. Estes tipos de grade (1) são extremamente precisos, (2)
apresentam baixa dispersão de luz e (3) são componentes freqüen-
tes de espectrofotômetros utilizados na q u í m i c a clínica. Por
exemplo, a m a i o r i a dos espectrofotômetros de U V visível e prati-
camente todos os espectrofotômetros de IR u t i l i z a m grades refle'
xivas. A l é m dissOj detectores de H P L C freqüentemente u t i l i z a m
u m a grade reflexiva holográfica côncava nos sistemas ópticos.
Q u a n d o i l u m i n a d a , cada t r i l h o sobre a grade dá origem a u m
espectro estreito. Frentes de c o m p r i m e n t o de o n d a são formadas
para reforçar esses c o m p r i m e n t o s de ondas em fase e cancelar os
que não estão em fase. O resultado l íqui do é u m espectro linear
u n i f o r m e . A l g u n s instrumentos c o n t ê m grades de difração que
p r o d u z e m amplitudes de faixas espectrais de 2 0 n m o u mais; ins-
t r u m e n t o s mais caros p o d e m ter resolução de 0,5 n m o u menos.
A grade de superfície p l a n a discutida a n t e r i o r m e n t e é
chamada de grade de transmissão plana. A s linhas são gravadas na
superfície de u m espelho, que p o d e ser t a n t o u m a placa de m e t a l
p o l i d o q u a n t o de v i d r o , o n d e u m f i n o f i l m e metálico é deposi- 370 380 390 400 410 420
tado. A grade t a m b é m p o d e ser riscada n u m d e t e r m i n a d o ângulo, Comprimento de onda (nm)
de m o d o q u e a fração m á x i m a de energia radiante é d i r e c i o n a d a
para c o m p r i m e n t o s de ondas difratados e m ângulos seleciona-
Figura 4-7 Efeito da largura de banda espectral (SBW) sobre o
dos. Este t i p o de grade é d e n o m i n a d a echektte e é c o n h e c i d a p o r
espectro de absorção de coproporfirina I. Concentração n o m m a l de 1
brilhar em u m d e t e r m i n a d o â n g u l o o u ter b r i l h a d o e m certo
\ig/mb d e H C I 0,1 m o l / L . S B W : curva a, 1 n m , e s p e c t r o f o t ô m e t r o
c o m p r i m e n t o de o n d a (p. ex., 2 5 0 n m ) .
B e c k m a n D B - G ; curva b, 10 n m ; e curva c, 2 0 n m , e s p e c t r o f o t ô m e t r o
Beckman DB. A linha pontilhada horizontal mostra largura de banda
Seleção de um Monocrornador natural de 10 nm para coproporfirina I, quando varrida em faixa de
O t i p o de m o n o c r o r n a d o r a ser escolhido depende dos objetivos espectro de 1 n m . A mudança de para comprimentos de ondas
das análises a q u e se destinam. Por exemplo, e m espectrofotôme- inferiores enquanto a SBW é aumentada está relacionada à inclinação
tros são exigidas bandas de larguras espectrais estreitas para iden- do espectro de absorção para a esquerda.
72 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
procedimentos químicos utilizados em laboratório clínico produ-
zem espécies absorventes para a qual a largura natural varia de
40 a mais de 200 n m . A largura de banda natural do N A D H é
58 n m (Àmáx = 339 nm). Portanto, para medições precisas desse
composto, u m instrumenrn que tenha uma largura de banda
espectral de 6 n m ou menos deve sei utilizado.
Na prática, para atingir a sensibilidade máxima, o compri-
mento de onda é normalmente selecionado no pico máximo de
absorvância; entretanto, pode ser desejável escolher outro com-
primento de onda para minimizar substâncias interferentes. Por
exemplo, leituras de turhidez são maiores na região azul do
espectro que na região vermelha; nn entanto, esta ú l t i m a região
é escolhida para medidas de turbidez para evitar a absorção de
luz por bilir r ubina (460 nm) ou hemoglobina (417 e 575 nm).
A l é m disso, as medições não devem ser realizadas no limite da
linearidade de uma curva de absorção, porque u m ligeiro erro
no ajuste do comprimento de onda irá introduzir erros nas lei-
turas das absorvâncias.
Fibras Ópticas
Nos e sp ectro foto metros de feixe simples e duplo apresentados nos
diagramas das Figuras 4-4 e 4-1), o posicionamento dos componentes
individuais dita a trajetória que o feixe de luz deve seguir enquanto
esse viaja desde a fonte até o detector. Esta abordagem impõe certas
restrições ao formato, tamanho e custo de tais instrumentos. Essas
restrições estão sendo superadas pela integração de fibras ópticas ao
desenho óptico dos espectrofotômetros. Fibra óptica, também
conhecida como tubos de hiz, são feixes de fibras finas e transparentes
de vidro, quaTtzo ou plástico, revestidas com material com índice de
refração baixo, e que, por reflexões internas, transmitem luz em toda
a superfície. A utilização de fibras ópticas em espectrofotômetros
oferece a vantagem de otimizar o controle direcional do feixe de luz
dentro dos limites geométricos de u m instrumento. Isto permite a
concepção e fabricação de subsistemas ópticos em miniatura e de
baixo custo, utilizados em instrumentos automatizados. Por exemplo,
em u m sistema automatizado, uma única fonte luminosa pode ser
multiplicada por fibra óptica, ter detectores múltiplos e, assim, deter-
minar o posicionamento ótimo da fonte e dos detectores. As des-
vantagens das fibras ópticas incluem uma maior quantidade de luz
parasita; mudanças no índice de refração das hastes de vidro, quartzo
ou plástico, bem como perda da energia transmitida após utilização
continuada na região ultravioleta do espectro. Esta perda de energia
é conhecida como solarização e resulta na diminuição de sensibili-
dade de u m instrumento óptico.
Cubetas
A cubeta (freqüentemente também designada euvette) é u m
pequeno vaso utilizado para manter uma amostra líquida a ser
analisada na trajetória da luz em u m espectro metro. As cubetas
podem ser redondas, quadradas ou retangulares e são construídas
de vidro, sílica (quartzo) ou plástico. Cubetas quadradas ou retan-
gulares apresentam superfícies ópticas planas e paralelas, com
trajetória de luz constante. A maioria tem u m 1,0 cm de espessura
(trajetória da luz), com tolerância baixa (limite de erro). Cubetas
ordinárias, de vidro de borossilicato, são adequadas para as medi-
ções na região do visível do espectro. Para leituras abaixo de 340
n m , no entanto, células de quartzo são geralmente exigidas.
Algumas células de plástico oferecem transparência adequada,
tanto na região de U V quanto do visível, porém, freqüentemente
apresentam problemas relacionados a limite de erro, limpeza,
corrosão por solventes e deformações p o i temperatura. Muitas
cubetas plásticas são descartáveis, utilizáveis uma única vez.
As cubetas devem ser limpas e opticamente transparentes
porque a corrosão ou os depósitos na superfície afetam os valores
de absorvância. As cubetas utilizadas na região do visível devem
ser lavadas abundantemente com água de torneira e enxaguadas
com água destilada. Soluções alcalinas não devem ser deixadas no
interior das cubetas por períodos prolongados, já que essas
corroem lentamente o vidro. As cubetas podem ser lavadas com
detergente suave ou ser colocadas de m o l h o em mistura de HC1
concentrado: água:etanol (1:3:4). As cubetas nunca devem ser
colocadas de m o l h o em solução sulfocrómica pata limpeza, porque
a solução é perigosa e tende a adsorver-se e corroer o vidro.
As cubetas utilizadas para medidas na região U V devem ser
manipuladas com cuidados especiais. Arranhões invisíveis,
impressões digitais ou traços de substâncias previamente medidas
podem estar presentes e absorver significativamente a luz. U m a
boa prática é preencher ã capacidade total dessas cubetas com
água destilada e medir, por diversos comprimentos de ondas, a
absorvância de cada uma contra u m branco. Este valor deve ser
essencialmente zero.
Fotodetectores
Fotodetectores são dispositivos que convertem luz em sinal elé-
trico, proporcional ao número de fótons que colidem com a
superfície fotossensivel. O tubo fotomultiplicador (PMT) é u m
fotodetector comumente utilizado para medir a intensidade lumi-
nosa das regiões U V e visível do espectro. Os PMTs exibem
tempos de respostas extremamente rápidos, são m u i t o sensíveis
e se desgastam lentamente. Nos instrumentos mais antigos, bar-
reiras de camadas de células (também conhecidas como células
fotovoltaicas) foram utilizadas como fotodetectores, pois eram
robustas e menos dispendiosas.
Fotodiodos também são utilizados como fotodetectores. Esses
são dispositivos sólidos, fabricados a partir de materiais semicon-
dutores fotossensíveis, tais como silício, arsenieto de gálio, anti-
m o n í d i o de índio, arsenieto de índio, seleneto de chumbo e
sulfeto de chumbo. Esses materiais absorvem luz em uma faixa
característica de comprimento de onda (p. ex., 250 a 1.100 n m
paTa o silicone). O desenvolvimento e utilização desses materiais
como detectores em espectrofotômetros deram origem a instru-
mentos capazes de medir a luz em múltiplos comprimentos de
ondas. Quando u m fotodetector consiste em dois arranjos bidi-
mensionais de diodo, cada u m responde a u m comprimento de
onda específico e é conhecido como arranjo de fotodiodo. Por
exemplo, arranjos de fotodiodos foram concebidos pata ter uma
resolução de 2 n m por diodo, entre 200 e 340 n m e resolução
de 1 n m por diodo, entre 340 a 800 n m .
Dispositivos de Leitura
A energia elétrica captada por u m detector é exibida em algum
tipo de medidor ou sistema de leitura. N o passado, aparelhos
analógicos eram amplamente utilizados como dispositivos de
leitura em espectrofotômetros. N o entanto, esses foram substituí-
dos pelos leitores digitais, dispositivos que exibem o número
relativo à absorvância ou a conversão em valores de concentra-
ções. Estes operam com base n o princípio de iluminação seletiva
de frações de u m banco de diodos emissores de luz (LEDs),
controlada pela tensão de sinal gerado. LEDs visiveis incorporam
gálio como componente principal, e, no momento, diodos
GaAs x P„ que emitem luz vermelha são os mais utilizados. Com-
parados com medidores, dispositivos com leitura digital forne-
cem resposta mais rápida e são mais fáceis de ler.
Computadores
Computadores são incorporados e integrados em ambos os fotõ-
metros e espectrofotômetros. C o m computador e aplicativos resi-
dentes, (l) a saída de u m calibrador é armazenada digitalmente,

(2) sinais digitais d o b r a n c o são subtraídos dos calibradores e das
amostras desconhecidas e (3) as concentrações desconhecidas são
a u t o m a t i c a m e n t e calculadas. D a d o s de m ú l t i p l o s calibradores
são f r e q ü e n t e m e n t e utilizados para (1) armazenar u m a c u r v a de
calibração c o m p l e t a , (2) e x i b i r o u i m p r i m i r a curva para inspeção
visual e (3) calcular os resultados desconhecidos baseando-se n a
curva o u t r a n s f o r m a ç ã o m a t e m á t i c a dos dados. Os c o m p u t a d o r e s
e os aplicativos instalados t a m b é m são utilizados para converter
dados cinéticos e m concentração o u atividade enzimática
Registradores
Os espectrofotômetros p o d e m ser equipados c o m registradores, e m
adição à exposição digital o u n o lugar dela. Estes são sincronizados
para fornecer traços de transmitància o u absorvância e m função d o
tempo ou c o m p r i m e n t o de onda. Q u a n d o u m a detecção contínua
de absorvância tJerws c o m p r i m e n t o de onda é registrada, o valor
resultante é chamado de espectro de absorção. Se u m a substância
absorve lua, picos distintos de absorvância serão observados. A
medida do espectro de absorção de u m a amostra desconhecida
pode ser comparada ao espectro de compostos conhecidos e é m u i t o
ú t i l para fins qualitativos. Por exemplo, este t i p o de procedimento
é especialmente ú t i l para identificação de drogas que absorvem na
região d o U V . Vários critérios são utilizados, i n c l u i n d o a determi-
nação daqueles c o m p r i m e n t o s de ondas que apresentam absorvân-
cias m á x i m a e m í n i m a em ambas as soluções ácidas e alcalinas
diluídas; a absortividade n o c o m p r i m e n t o de o n d a de absorvância
máxima; e a razão entre absorvâncias obtidas e m dois c o m p r i m e n -
tos de ondas. Finalmente, o espectro inteiro é comparado c o m u m
o b t i d o para amostra conhecida da droga investigada.
Parâmetros de Desempenho
N a m a i o r i a dos p r o c e d i m e n t o s analíticas espectrofotométricos, a
absorvância de u m a amostra desconhecida é comparada direta-
mente c o m a de u m calibrador o u séries de calibradores. Nestas
circunstâncias, pequenos erros na calibração de c o m p r i m e n t o de
onda, a variação espectral das larguras de b a n d a o u a presença de
luz parasita são compensados e, e m geral, não c o n t r i b u e m para
erros graves. A utilização de u m a série de calibradores abrangendo
u m a vasta faixa de concentração t a m b é m fornece u m a m e d i d a de
linearidade e a validação da lei de Beer para u m d e t e r m i n a d o
p r o c e d i m e n t o e i n s t r u m e n t o . N o e n t a n t o , q u a n d o os cálculos são
baseados e m valores de absortividades molares o u de coeficientes
de absorção publicados o u previamente determinados, o espectro-
f o t ô m e t r o deve ser inspecionado c o m m a i o r rigor.
O N a t i o n a l I n s t i t u t e o f Standards a n d T e c h n o l o g y ( N I S T )
fornece diversos materiais de referência-padrão (SRMs) para
espectrofotometria, que são úteis para a calibração o u verificação
de d e s e m p e n h o de f o t ô m e t r o s o u espectrofotômetros (p. ex.,
S R M 930e é u t i l i z a d o para verificar e calibrar escalas de transmi-
tància e absorvância da absorção espectrométrica d o visível)
( h t t p : / / w w w . n i s t . g o v ) . O I n s t i t u t e f o r Reference Materials a n d
M e a s u r e m e n t s ( I R M M ) , u m i n s t i t u t o de m e t r o l o g i a que pertence
à comissão européia, t a m b é m fornece materiais de referência
para a verificação de desempenho de f o t ô m e t r o s o u espectrofo-
tômetros ( h t t p - / / w w w . u m m . j r c . b e / ) .
FOTOMETRIA DE REFLEXÃO
N a f o t o m e t r i a de reflexão, a luz d i f u n d i d a i n c i d e e m u m a
m i s t u r a de reação localizada e m u m carreador e a luz r e f l e t i d a é
medida. 4 A l t e r n a t i v a m e n t e , o carreador é i l u m i n a d o e a m i s t u r a
de reação gera u m a luz r e f l e t i d a difusa, que é m e d i d a . A inten-
sidade da luz r e f l e t i d a a p a r t i r d o reagente carreador é c o m p a r a d a
c o m a i n t e n s i d a d e da luz r e f l e t i d a de u m a superfície de referên-
cia. E m v i r t u d e de a intensidade da luz r e f l e t i d a n ã o ser linear
e m relação à concentração da substância analisada, a equação de
K u b e l k a - M u n k o u a t r a n s f o r m a ç ã o de C l a p p e r - W i l l i a m s são
Técnicas Ópticas CAPÍTULO 4 73
c o m u m e n t e utilizadas para converter os dados e m u m f o r m a t o
l i n e a r ( C a p í t u l o 10). Os c o m p o n e n t e s eletroópticos utilizados na
f o t o m e t r i a de reflexão são essencialmente os mesmos exigidos
para a f o t o m e t r i a de absorvância. A f o t o m e t r i a de reflexão é
utilizada para medidas em sistemas q u í m i c o s c o m película seca.
ESPECTROFOTOMETRIA DE EMISSÃO DE
CHAMA
A espectrofotometria de emissão de chama baseia-se nas caracte-
rísticas de emissão de luz p o r átomos de diversos elementos
metálicos q u a n d o é f o r n e c i d a energia suficiente, c o m o , p o r
exemplo, u m a chama quente. O c o m p r i m e n t o de o n d a a seT
u t i l i z a d o para a m e d i ç ã o de u m e l e m e n t o d e p e n d e da seleção de
u m a l i n h a c o m i n t e n s i d a d e suficiente para p r o p o r c i o n a r sensibi-
lidade adequada e da ausência de i n t e r f e r ê n c i a de outras l i n h a s
n o c o m p r i m e n t o de o n d a selecionado o u p r ó x i m o dele. Por
exemplo, a c h a m a de l í t i o p r o d u z u m a cor v e r m e l h a ; a de sódio,
amarela; de potássio, violeta; de r u b í d i o , v e r m e l h a ; e de magné-
sio, azul. Essas cores são características dos á t o m o s de metal, que
estão presentes c o m o cátions n a solução. Sob condições cont ro-
ladas e constantes, a intensidade l u m i n o s a característica d o com-
p r i m e n t o de o n d a p r o d u z i d a p o r cada u m dos átomos é direta-
m e n t e p r o p o r c i o n a l a o n ú m e r o de átomos q u e está e m i t i n d o
energia, que, p o r sua vez, é d i r e t a m e n t e p r o p o r c i o n a l à concen-
tração da substância de interesse na amostra. E m b o r a esta técnica
tenha sido a m p l a m e n t e utilizada para a análise de sódio, potássio
e l í t i o e m f l u i d o s corporais, ela foi substituída, e m grande parte,
p o r técnicas eletroquimicas.
ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO
ATÔMICA
A e s p e c t r o f o t o m e t r i a de absorção a t ô m i c a ( A A ) é a m p l a m e n t e
utilizada e m l a b o r a t ó r i o s clínicos para m e d i r elementos, tais
c o m o (1) a l u m í n i o , (2) cálcio, (3) cobre, (4) c h u m b o , (5) l í t i o , (6)
magnésio e (7) zinco
Conceitos Básicos
A A A é u m a técnica de emissão e m que u m e l e m e n t o na amostra
é excitado e a energia radiante, o b t i d a ao l o n g o d o processo, é
m e d i d a e n q u a n t o o e l e m e n t o r e t o r n a ao nível energético mais
baixo. N o e n t a n t o , o e l e m e n t o n ã o é apreciavelmente excitado
pela chama, mas é m e r a m e n t e dissociado das respectivas ligações
químicas (atomizado) e transferido para o estado não excitado o u
f u n d a m e n t a l ( á t o m o n e u t r o ) . A s s i m , o á t o m o está e m u m nível
de energia b a i x o e é capaz de absorver radiação e m largura de
b a n d a m u i t o estreita, c o i r e s p o n d e n t e à p r ó p r i a l i n h a espectral.
A l â m p a d a de c á t o d o oco c o m o cátodo c o n s t i t u í d o d o m a t e r i a l
a ser analisado, é utilizada para p r o d u z i r u m c o m p r i m e n t o de
o n d a de luz específico d o material. Dessa f o r m a , se o cátodo é
c o m p o s t o de sódio, a luz de sódio, p r e d o m i n a n t e m e n t e de 5 8 9
n m , será e m i t i d a pela lâmpada. Q u a n d o a luz da l â m p a d a de
cátodo oco penetra na chama, parte dessa é absorvida pelos
átomos n o estado f u n d a m e n t a l , r e s u l t a n d o e m u m a redução
l í q u i d a de i n t e n s i d a d e dos raios n a chama. Este processo é desig-
n a d o absorção atômica.
E m geral, métodos de A A são a p r o x i m a d a m e n t e 100 vezes
mais sensíveis que os métodos de emissão de chama. E m adição,
graças à especificidade ú n i c a d o c o m p r i m e n t o de o n d a da
l â m p a d a de cátodo oco, esses métodos são a l t a m e n t e específicos
para o e l e m e n t o a ser m e d i d o .
Instrumentação
Os c o m p o n e n t e s de u m espectrofotômecro de A A são mostrados
n a Figura 4-8 U m a l â m p a d a de cátodo oco f u n c i o n a c o m o f o n t e
74 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
Cátodo oco Modulador Chama Fenda de
entrada
Figura 4-8 Componentes básicos de um especcrofotômetro de absorção atômica.
de luz e m u m espectrofotômetro de A A . Essas lâmpadas são
constituídas d o metal de interesse presente na substância a ser
analisada, sendo específica para cada análise. Q u a n d o u m a liga
é utilizada para c o n s t r u i r o cátodo, resulta e m u m a lâmpada
multielemento.
E m técnicas de A A sem chama (haste de carbono o u " f o r n o de
grafite")) a amostra é colocada em u m a depressão da vareta de
carbono e m u m a câmara fechada. Tiras de tântalo o u platina
metálica t a m b é m são utilizadas c o m o copos de amostra. E m etapas
sucessivas, a temperatura da haste é aumentada para secar, carbo-
nizar e, finalmente, atomizar a amostra na câmara. O elemento
atomizado então absorve energia da lâmpada de cátodo oco cor-
respondente. Esta abordagem é mais sensível que os métodos
convencionais que utilizam chama e permite a determinação de
traços de metais em pequenas amostras de sangue o u tecido.
Para técnicas de A A sem chama, urna abordagem designada
de correção de Zeeman t e m sido utilizada para corrigir a absorção
de fundo. 1 0 N a correção do r u í d o de f u n d o de Zeeman, a subs-
tância a ser analisada é s u b m e t i d a a u m f o r t e campo magnético.
Esse intenso campo magnético d i v i d e os níveis de energia a t ô m i c a
degenerada (isto é, energia semelhante) em dois componentes
que são polarizados em paralelo e p e r p e n d i c u l a r ao campo mag-
nético, respectivamente. O c o m p o n e n t e paralelo está n a l i n h a de
ressonância da fonte, e n q u a n t o os dois componentes perpendi-
culares são deslocados para diferentes c o m p r i m e n t o s de ondas.
Os dois c o m p o n e n t e s interagem de maneira diferente c o m luz
polarizada. U m polarizador é colocado entre a f o n t e e o atomi-
zador, e duas medidas, em diferentes configurações d o polariza-
dor, são realizadas. U m a m e d i d a é feita da absorção do (A c ) da
substância a ser analisada e de r u í d o de f u n d o , a o u t r a apenas
da absorção de r u í d o de f u n d o (Aj, c ). A diferença entre as duas
leituras de absorção é a absorvância corrigida.
A grande vantagem do m é t o d o de correção de Zeeman é que
a mesma f o n t e l u m i n o s a c o m c o m p r i m e n t o de o n d a semelhante
é utilizada para m e d i r a absorção total e d o r u í d o de f u n d o . A
execução é complexa e de alto custo, e a intensidade do campo
magnético precisa ser o t i m i z a d a para cada elemento, mas o
m é t o d o p r o p o r c i o n a resultados mais precisos em medidas c o m
r u í d o de f u n d o elevado que as outras técnicas de correção.
Limitações da Espectrofotometria de
Absorção Atômica
Interferências espectrais e n ã o espectrais são limitações da espec-
t r o f o t o m e t r i a de A A .
Interferências Espectrais
As interferências espectrais i n c l u e m (1) a absorção de outras espé-
cies atômicas relacionadas, (2) absorção p o r espécies moleculares,
0 ) dispersão p o r partículas de sais não voláteis o u de óxidos e
(4) emissões de r u í d o de f u n d o (que p o d e m ser filtradas eletro-
nicamente). E m v i r t u d e da laTgura de banda ser extremamente
estreita (0,01 n m ) , a absorção por outras espécies atômicas não
c o n s t i t u i u m problema. A absorção e dispersão p o r espécies
moleculares são p a r t i c u l a r m e n t e problemáticas q u a n d o a atomi-
zação é realizada em temperaturas baixas.
d -
Monocromador Fenda de Detector
saída
Interferências Não Espectrais
As interferências não espectrais p o d e m ser inespecíficas o u específicas.
As interferências inespecíficas afetam a nebulização, alterando a vis-
cosidade, tensão superficial o u densidade da solução da substância
a ser analisada e, conseqüentemente, a velocidade do f l u x o de
amostra. As interferências específicas (interferências químicas) são
dependentes da substância a ser analisada. A interferência de volati-
liza çã o do soluto refere-se à situação em que o c o n t a m i n a n t e forma
c o m a substância analisada espécies não voláteis. U m exemplo é a
interferência de fosfato na determinação do cálcio, causada pela
formação de complexos de cálcio-fosfato. A interferência de fosfato
é e l i m i n a d a c o m a adição de u m cátion, geralmente lantânio o u
estrôncio, que competem c o m o cálcio p o r fosfato. U m incremento
de efeito t a m b é m é observado q u a n d o a adição de contaminantes
aumenta a eficiência de volatilização. É o caso do a l u m í n i o , que
n o r m a l m e n t e produz óxidos n ã o voláteis, mas, na presença de
ácido h i d r o f l u ó r i c o , foTma f l u o r e t o de a l u m í n i o , u m composto
mais volátil, interferências de dissociação afetam o grau de dissociação
da substância analisada. Estas substâncias f o r m a m óxidos e hidró-
xidos que são especialmente sensíveis às interferências de dissocia-
ção. A interferência de ionização ocorre q u a n d o a p r e s e n ç a de u m
elemento facilmente ionizável, c o m o o K , afeta o grau de ionização
da substância, o que leva a alterações n o sinal da substância anali-
sada. E m caso de interferência de excitação, os átomos da substância
são excitados no atomizador, c o m subseqüente emissão n o com-
p r i m e n t o de o n d a de absorção adequado. Este t i p o de interferên-
cia é mais p r o n u n c i a d o em temperaturas mais elevadas.
FLUORIMETRIA
A f l u o r e s c ê n c i a ocorre q u a n d o u m a m o l é c u l a absorve luz e m u m
c o m p r i m e n t o de o n d a e reemite essa luz em c o m p r i m e n t o de
o n d a m a i o r . U m á t o m o o u m o l é c u l a que apresenta fluorescência
é considerado u m f l u o r ó f o r o . A fluarametria é d e f i n i d a c o m o a
medição da fluorescência da luz e m i t i d a . A análise f l u o r i m é t r i c a
é u m m é t o d o m u i t o sensível e a m p l a m e n t e utilizado em análises
quantitativas na q u í m i c a e ciências biológicas.
Conceitos Básicos
A relação entre a absorção, a fluorescência e a fosforescência é
mostrada na Figura 4-9. C o m o i n d i c a d o , cada m o l é c u l a c o n t é m
u m a série de níveis de energia m u i t o p r ó x i m o s espacialmente. A
absorção de u m quantum de energia da luz p o r u m a m o l é c u l a
provoca a transição de u m e l é t r o n n o estado f u n d a m e n t a l sin-
gleto (singlet) para u m dos diversos níveis vibracionais possíveis
do seu p r i m e i r o estado singleto. O n ú m e r o real de moléculas n o
estado excitado sob condições de u m a reação típica e excitado
c o m u m a f o n t e l u m i n o s a c o n v e n c i o n a l de 1 5 0 W é m u i t o
p e q u e n o e é estimado e m cerca de 10 n m o l por m o l do f l u o r ó -
foro. U m a vez q u e a molécula está n u m estado excitado, essa
r e t o m a ao estado i n i c i a l de energia p o r diferentes mecanismos.
Estes i n c l u e m (1) o e q u i l í b r i o v i b r a c i o n a l não radioativo, (2) o
processo de fluorescência, (3) a dissipação do estado excitado
singleto, (4) o c r u z a m e n t o não r a d i o a t i v o para u m estado t r i p l e t o
 Técnicas Ópticas CAPÍTULO 4 75

Excitação

l
Itv
I O

I * \

F i g u r a 4 - 9 Diagrama do nível de energia luminescente de uma
molécula orgânica típica. SQ é o estado f u n d a m e n t a l singleto; S[ é o
primeiro estado excitado singleto; A é o processo de absorção; T] é o
primeiro estado excitado tripleto; e RVD é a desativação vibracional não
radioativa. Q é atenuação do estado excitado d o singleto ou tripleto. F é
o processo de fluorescência de primeiro estado excitado d o singleto. P é
o processo de fosforescência de primeiro estado excitado do tripleto. RC
é o cruzamento não radioativo de primeiro estado de excitação singleto
para o primeiro estado de excitação tripleto.
(tripíet), (5) a dissipação d o p r i m e i r o estado t r i p l e t o e (6) o pTO-
cesso de fosforescência.
C o n f o r m e m o s t r a d o n a Figura 4-9, o e q u i l í b r i o v i b r a c i o n a l
antes da fluorescência resulta e m perda de energia de excitação.
A fluorescência e m i t i d a c o n t é m , p o r t a n t o , m e n o s energia o u tem
u m c o m p r i m e n t o de o n d a m a i o r que o de excitação da luz. A
diferença entre os c o m p r i m e n t o s de o n d a m á x i m o s de excitação
da luz e de fluorescência e m i t i d a é u m a constante designada
" d e s l o c a m e n t o de Stokes". Esta constante é u m a m e d i d a de
energia p e r d i d a durante a vigência d o estado excitado (desativa-
ção v i b r a c i o n a l não radioativa) antes de r e t o r n a r ao n í v e l funda-
m e n t a l singleto (emissão de fluorescência).
Relações do Tempo de Emissão de Fluorescência
O t e m p o necessário para u m a m o l é c u l a absorver energia radiante
e p r o m o v e r essa para u m estado excitado é de a p r o x i m a d a m e n t e
IO'15 s. A duração d o t e m p o para o e q u i l í b r i o v i b r a c i o n a l ocorrer,
em u m estado de m e n o r excitação, é da o r d e m de I0*1lt a IO"12 s.
A duração d o t e m p o necessário para a emissão de fluorescência
ocorrer é da o r d e m de IO 8 a IO*7 s. E m termos relativos, ocorre
u m t e m p o considerável entre (1) a absorção da energia l u m i n o s a ,
(2) o r e t o r n o ao estado de m e n o r excitação e (3) a emissão de
fluorescência. A relação entre esse p e r í o d o de t e m p o é mostrada
na Figura 4-10. A fase I representa o t e m p o entre a absorção da
energia l u m i n o s a e a perda de energia n ã o r a d i o a t i v a d u r a n t e o
rearranjo v i b r a c i o n a l n o estado de m e n o r energia de excitação.
Este p e r í o d o de t e m p o está representado n o diagrama p o r setas
apontadas para cima e para baixo. A fase I I mostra a emissão e
o d e c a i m e n t o de u m f l u o r ó f o r o de v i d a c u r t a (b) e de v i d a longa
(a). Se a emissão de fluorescência é m e d i d a ao l o n g o de u m
t e m p o subseqüente a u m p u l s o de luz, o r i g i n á r i o de u m a f o n t e
de excitação c o m o u m a lâmpada de x e n ô n i o o u laser, a intensi-
dade d o d e c a i m e n t o de luz e m i t i d a é de p r i m e i r a o r d e m , pro-
cesso s i m i l a r ao decaimento r a d i o a t i v o O t e m p o necessário para
a luz e m i t i d a alcançar l / e da i n t e n s i d a d e i n i c i a l , o n d e e é o
l o g a r i t m o n e p e r i a n o n a base 2,718, é d e n o m i n a d o v i d a média
d o estado excitado da m o l é c u l a o u t e m p o de d e c a i m e n t o de
f l u orescência.
1 1 1 1 1 Y I 1 1 1
10~ 15 10" 14 10~ 13 10" 12 1Q^ 11 10 _10 10" 9 10 -0 10" 7 10~s 10~5 10~4 10~3
Tempo (segundos)
Figura 4 - 1 0 Processo de decaimento de fluorescência. E é a
absorção de energia; I é a fase d o tempo de desativação vibracional; II é
a fase do tempo de emissão de fluorescência; a é u m tempo longo de
decaimento de fluorescência, e b é u m tempo CUTEO de decaimento de
fluorescência.
O t e m p o entre a absorção de u m quantum de energia e a
fluorescência é u t i l i z a d o e m i n s t r u m e n t a ç ã o de fluorescência
d e n o m i n a d o f l u o r í m e t r o de resolução temporal. A vantagem da
f l u o r i m e t r i a de resolução t e m p o r a l é a e l i m i n a ç ã o dos r u í d o s de
f u n d o provocados pela luz dispersa, resultantes dos sinais Ray-
leigb e R a m a n e de ruídos de f u n d o de fluorescência de v i d a
curta. C o n s e q ü e n t e m e n t e , isto resulta n u m expressivo a u m e n t o
d o sinal de interesse e n a d i m i n u i ç ã o d o l i m i t e de detecção d o
equipamento.
D e p e n d e n d o de c o m o a resposta de emissão de fluorescência
é m e d i d a , a f l u o r i m e t r i a de resolução t e m p o r a l ' é classificada
c o m o f l u o r i m e t r i a de pulso o u de fase. N a f l u o r i m e t r i a de pulso,
a amostra é i l u m i n a d a p o r u m pulso de luz i n t e n s o e breve e a
intensidade de fluorescência e m i t i d a é avaliada e m função d o
t e m p o , p o r u m sistema de detecção r á p i d a N a f l u o r i m e t r i a de
fase, a amostra é i l u m i n a d a p o r u m a o n d a c o n t í n u a de laser, e a
resposta da emissão de fluorescência é acompanhada pela res-
posta de i m p u l s o e freqüência. ú
Relação entre a Concentração e a Intensidade de
Fluorescência
A relação entre a concentração e a intensidade de fluorescência
e m i t i d a é derivada da lei de Beer-Lambert e é expressa, c o m o :
F = (Dloflbc (9)
onde
F = a i n t e n s i d a d e relativa
CD = a eficiência de fluorescência (ou seja, a relação entre os
quanta de luz e m i t i d o s e os quanta de luz absorvidos)
I 0 = a intensidade de excitação i n i c i a l
a = a absortividade m o l a r
h = o v o l u m e d o e l e m e n t o , d e f i n i d o pela geometria das fendas
de excitação e emissão
c = a concentração e m m o l / L
A equação (9) i n d i c a que a i n t e n s i d a d e de fluorescência é
diretamente p r o p o r c i o n a l à concentração d o f l u o r ó f o r o e à inten-
sidade de excitação. Esta relação é a p r o p r i a d a apenas para solu-
ções diluídas, o n d e a absorvância é i n f e r i o r a 2 % da radiação
excitante. Para intensidade de fluorescência superior a 2 % , a
76 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
relação não é linear. Este f e n ô m e n o é c h a m a d o de efeito de filtro
interior e é d i s c u t i d o c o m mais detalhes em seção a seguir. O u t r o s
fatores que i n f l u e n c i a m a medição de intensidade de fluorescên-
cia são a sensibilidade d o detector e o grau d o r u í d o de f u n d o
da luz dispersa captada pelo detector.
As medições de intensidade de fluorescência são mais sensí-
veis que da absorvância. A m a g n i t u d e de absorção de u m cromó-
f o r o em solução é determinada pela concentração desse e da
espessma da cubeta. A m a g n i t u d e de intensidade de fluorescência
de u m f l u o r ó f o r o é d e t e r m i n a d a (1) pela concentração, (2) pelo
c o m p r i m e n t o da trajetória e (3) pela intensidade da f o n t e l u m i -
nosa. C o m p a r a t i v a m e n t e , as medições de fluorescência são de 100
a 1.000 vezes mais sensíveis que as de absorvância. Isto acontece
graças a (1) fontes luminosas mais intensas, (2) técnicas de filtra-
ção d i g i t a l do sinal e (3) fotômetros de emissão sensíveis.
F r e q ü e n t e m e n t e , medidas de fluorescência são expressas em
unidades de intensidade relativa. A palavra relativa é utilizada
p o r q u e a i n t e n s i d a d e m e d i d a não é u m a q u a n t i d a d e absoluta.
Trata-se de u m a p e q u e n a parte d o total de emissões de fluores-
cência, e a m a g n i t u d e ê d e f i n i d a pela (1) largura da fenda do
i n s t r u m e n t o , (2) sensibilidade do detector, (3) eficiência do
m o n o c r o m a d o r e (4) intensidade de excitação. E m v i r t u d e de
essas características serem variáveis associadas ao i n s t r u m e n t o , é
difícil, se não impossível, estabelecer u m a u n i d a d e de i n t e n s i d a d e
absoluta para u m a d e t e r m i n a d a concentração de f l u o r ó f o r o que
seja válida para i n s t r u m e n t o s diferentes.
Polarização de Fluorescência
A luz é c o m p o s t a p o r ondas elétricas e magnéticas dispostas e m
ângulos perpendiculares. O n d a s de luz produzidas p o r fontes de
excitação-padrão t ê m vetores elétricos orientados aleatoriamente.
As ondas de luz, q u e atravessam certos materiais cristalinos (pola-
rizadores), t ê m os vetores elétricos o r i e n t a d o s para u m ú n i c o
p l a n o e são ditas ondas de p l a n o polarizado. Os f l u o r ó f o r o s
absorvem luz mais eficientemente nos planos dos respectivos
níveis de energia eletrônica. Se o relaxamento r o t a c i o n a l (movi-
m e n t o b r o w n i a n o ) f o r mais lento que o t e m p o de d e c a i m e n t o da
fluorescência, c o m o é o caso de grandes moléculas marcadas c o m
moléculas fluorescentes, a fluorescência e m i t i d a será polarizada.
E m função de apresentarem t e m p o de relaxamento r o t a c i o n a l
m u i t o mais curtos que o t e m p o de d e c a i m e n t o de fluorescência,
nas pequenas moléculas a luz de fluorescência e m i t i d a é despo-
larizada. N o e n t a n t o , se a pequena m o l é c u l a fluorescente for
ligada a u m a m a c r o m o l é c u l a , o u se for colocada e m solução
viscosa, a p e q u e n a m o l é c u l a e m i t i r á luz polarizada. Polarização
de fluorescência, P, é d e f i n i d a pela seguinte equação:
P = k z k
(10)
K + k
onde
I v = a intensidade de luz e m i t i d a p o r fluorescência n o p l a n o
vertical
Ih = a intensidade de luz e m i t i d a p o r fluorescência n o p l a n o
horizontal
C o m o i n d i c a d o , P é a diferença entre as duas intensidades
observadas, d i v i d i d a pela soma dessas intensidades. A polarização
da fluorescência é m e d i d a pela inserção de u m polarizador i m p u l -
s i o n a d o mecânica o u eletricamente entre a cubeta de amostra e
o detector. U m diagrama de u m sistema de m e d i d a de fluores-
cência polarizada é m o s t r a d o na Figura 4-11. Para o b t e n ç ã o de
sensibilidade m á x i m a , a amostra é excitada c o m luz polarizada
I
ExM P
v / X / A ™
\
Figura 4-11 Diagrama esquemático de um analisador de polarização
da fluorescência. Ia é a intensidade de luz de excitação. P é o
polarizador que fornece excitação de luz polarizada. PA é o analisador
da polarização, que é girado para fornecer a medição de intensidade de
emissão de fluorescências polarizadas paralelas e perpendiculares. ExM é
o monocromador de excitação, EmM é o monocromador de emissão, D
é o detector, e C é a célula de reação cu cubeta.
n o m o d o de i n s t r u m e n t a ç ã o n o r m a l . O analisador de polarização
é p o s i c i o n a d o para m e d i r p r i m e i r o a intensidade de luz de f l u o -
rescência, e m i t i d a n o p l a n o vertical ( I J , e, em seguida, o analisa-
d o r de polarização é g i r a d o p o r 90° para m e d i r a intensidade da
luz de fluorescência e m i t i d a no p l a n o h o r i z o n t a l (I h ). P é, então,
calculado m a n u a l o u a u t o m a t i c a m e n t e pela equação (10).
A polarização de fluorescência é utilizada para quantificar subs-
tâncias pela detecção da mudança de despolarização de fluorescência,
que sucedem reações imunológicas (Capitulo 10). A quantificação é
realizada adicionando u m a quantidade conhecida de moléculas da
substância marcada c o m fluorescência a u m a solução de reação con-
tendo u m anticorpo específico para a substância analisada. A subs-
tância marcada liga-se ao anticorpo, resultando em mudança n o
tempo de relaxamento rotacional e de polarização de fluorescência.
A adição de u m a suhstância não marcada, como u m a quantidade
desconhecida de u m a droga terapêutica em u m a amostra de soro,
resultará em competição pela ligação ao anticorpo c o m a substância
marcada. Esta mudança na ligação da substância mamada c o m u m
fluoróforo provoca uma mudança de polarização de fluorescência,
inversamente proporcional à quantidade da substância contida n u m a
determinada amostra. C o m o a mudança de polarização de fluores-
cência é u m a resposta direta à mistura de reação, o f l uoróf oro ligado
não precisa ser separado do f l u o r ó f o r o livre. Assim, a polarização de
fluorescência é aplicável aos ensaios homogêneos de substâncias de
baixa massa molecular c o m o drogas terapêuticas. 7
Instrumentação
F l u o r í m e t r o s e espectrofluo ri metros são utilizados para m e d i r
fluorescência. O p e r a c i o n a l m e n t e , u m f l u o r í m e t r o utiliza filtros
de interferência o u filtros de v i d r o pata p r o d u z i r luz m o n o c r o -
m á t i c a para a excitação da amostra e para o isolamento da emissão
de fluorescência, e n q u a n t o u m e s p e c t r o f l u o r í m e t r o utiliza u m
m o n o c r o m a d o r de grade o u prisma.
Componentes
C o m p o n e n t e s básicos de f l u o r í m e t r o s e espectrofluorimetros
i n c l u e m (1) u m a f o n t e de excitação, (2) u m m o n o c r o m a d o r de
excitação, (3) u m a cubeta, (4) u m m o n o c r o m a d o r de emissão e

Mi
PS — I Xs 1-
F i g u r a 4 - 1 2 Diagrama de bloco de espectrofluorímetro típico: XS é
a fonce de xenônio; PS é a fonte de alimentação; M j é o monocrornador
de excitação; C é a célula de amostra; M 2 é o monocrornador de
emissão. D j e D 2 são detectores; D, monitora a variação da intensidade
de excitação, e D 2 mede a intensidade da emissão de fluorescência. A j e
A j são sinais de excitação e amplificação, respectivamente.
(5) u m detector. N a Figura 4-12, esses c o m p o n e n t e s são mostra-
dos c o m o sistema ó p t i c o c o n f i g u r a d o para 90°.
E m fluoiímetros e espectrofluorimetros, o posicionamento
da cubeta e d o feixe de excitação, relativos à célula fotoelétrica,
é essencial para estabelecer a geometria óptica para medições de
fluorescência. C o m o a fluorescência é e m i t i d a a p a r t i r de u m a
molécula, e m todas as direções, diversas geometrias de e x c i t a ç ã o /
emissão são utilizadas para m e d i r a fluorescência (Figura 4-13).
A m a i o r p a r t e dos f l u o r í m e t r o s e e s p e c t r o f l u o r i m e t r o s c o m e r '
ciais utiliza detector de ângulo reto, p o r q u e essa abordagem m i n i -
miza o r u í d o de f u n d o , que l i m i t a a detecção analítica. A abor-
dagem ponta-a-ponta p e r m i t e a adaptação de u m detector de
fluorescência aos i n s t r u m e n t o s de 180° de absorção existentes.
O l i m i t e de detecção é l i m i t a d o pela (1) q u a l i d a d e d o par de f i l t r o
de interferências de excitação e / o u emissão, (2) sobreposição de
b a n d a espectral de excitação e / o u e m i s s ã o e (3) efeito de f i l t r o
i n t e r n o , que é d i s c u t i d o p o s t e r i o r m e n t e . A abordagem de super-
fície f r o n t a l p r o p o r c i o n a a m a i o r l i n e a r i d a d e ao l o n g o de u m
vasto n ú m e r o de concentração, u m a vez que m i n i m i z a o efeito
do f i l t r o i n t e r n o . A abordagem de superfície f r o n t a l apresenta
limites de detecção comparáveis àqueles alcançados p o r detecto-
res de ângulo reto, mas são mais suscetíveis ao r u í d o de f u n d o
causado pela luz dispersa. A f l u o r i m e t r i a de superfície f r o n t a l
t e m sido a m p l a m e n t e aplicada a sistemas heterogêneos de i m u -
noensaios c o m fluorescência de fase sólida.
Para a c o m o d a r essas diferentes geometrias, a célula de amostra
é o r i e n t a d a em diferentes ângulos e m relação à f o n t e de excitação
e ao detector. A s p r i n c i p a i s preocupações relacionadas c o m a
geometria da célula de amostra são (1) a dispersão da luz, (2) o
Técnicas Ópticas CAPÍTULO 4 77
•>
ExM EmM
Geometria ponta-a-ponla
ExM
| | EmM
V
Geometria de ângulo reta
Geometria de superfície frontal
Figura 4-13 Geometiias de excitação/emissão de fluorescência: I 0 é
a energia inicial de excitação; ExM é o monocrornador de excitação; C é
a cubeta de amostra; If é a intensidade de fluorescência; EmM é o
monocrornador de emissão; e D é o detector.
efeito de f i l t r o i n t e r n o e (3) o v o l u m e da amostra visto pelo
d e t e c t o r A Figura 4-14 mostra a célula de amostra e o arranjo de
fenda para u m espectrofotômetro de fluorescência convencional,
c o m as fendas de excitação e emissão orientadas em ângulo reto.
Sx e S 2 designam as fendas de excitação e emissão, respectiva-
m e n t e . A posição e a largura da fenda de emissão são i m p o r t a n -
tes. Se a fenda de emissão está localizada p e r t o da b o r d a a n t e r i o r
da célula de amostra, c o m o m o s t r a d o na Figura 4-14, B, o efeito
de f i l t r o i n t e r i o r é m i n i m i z a d o . Se a largura da fenda de emissão
é aumentada, o detector p o d e se t o r n a r mais sensível, mas a
especificidade p o d e d i m i n u i r .
Verificação de Desempenho
Tal c o m o acontece c o m espectrofotômetros, o N I S T fornece u m a
série n u m e r o s a de S R M s para calibração o u verificação de desem-
p e n h o de f l u o r í m e t r o s o u espectrofotômetros de fluorescência.
Estes i n c l u e m S R M 936a (sulfato de q u i n i n a d i i d r a t a d o ) , para
calibrar tais i n s t r u m e n t o s , e S R M 1932 (fluoresceína), para esta-
belecer u m a escala de referência para medidas de fluorescência
(http://www.nist.gov).
Tipos de Fluorímetros e Espectrofluorimetros
F l u o r í m e t r o s e espectrofotômetros de fluorescência q u e oferecem
u m a variedade de recursos estão disponíveis. Esses recursos
i n c l u e m (1) razão de referência, (2) m o n o c r o m a d o r e s de excita-
78 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
i
¥
Si _L
• d o r são m e d i d o s p r i m e i r a m e n t e e, e m seguida, as a m o s t r a s des-
T c o n h e c i d a s são lidas. O e s p e c t r o f l u o r í m e t r o d e razão d e referên-
32 1)
H energia d a l â m p a d a d e x e n ô n i o , a c u r t o e l o n g o prazo (ou seja,
\ r
M2
¥ Fluorimetros com Resolução Temporal
Figura 4 - 1 4 Posições de cubeta de fluorescência de ângulo reco. A é
a configuração padrão em 90°. B é o posicionamento de compensação
da cubeta para minimizar os efeitos internos de filtro.
ção e emissão c o n t r o l a d o s p o r c o m p u t a d o r , (3) f o n t e s de luz de
x e n ô n i o p u l s a d o , (4) c o n t a d o r e s de f ó t o n , (5) célula d e r o d a m i n a
p a r a espectros corrigidos, (6) polarizadores, (7) células d e fluxo,
(8) a d a p t a d o r e s de visor d e superfície f r o n t a l , (9) c o m p a r t i m e n t o
m ú l t i p l o de c u b e t a s e (10) sistemas d e r e d u ç ã o d e d a d o s c o m p u -
tadorizados.
E m a d i ç ã o ao e s p e c t r o f l u o r í m e t r o básico d i s c u t i d o anterior-
m e n t e (Figura 4-12), o u t r o s tipos de i n s t r u m e n t o s f l ú o r i m é t r i c o s
i n c l u e m (1) e s p e c t r o f l u o r í m e t r o de razão d e referência, (2) fluo-
r í m e t r o c o m resolução t e m p o r a l , (3) c i t ô m e t r o de f l u x o e (4)
h e m ato flu o r í m e t r o .
Espectrofluorímetro de Razão de Referência
U m e s p e c t r o f l u o r í m e t r o de razão de referência típico é ilustrado
n a Figura 4-15. Basicamente, este é u m i n s t r u m e n t o d e â n g u l o
reto simples q u e utiliza dois m o n n c r o m a d o r e s ( M l , M 2 ) , dois
detectores d e t u b o s f o t o m u l t i p l i c a d o r e s ( D l e D 2 , referência e
a m o s t r a d e F M T s ) e u m a l â m p a d a d e x e n ô n i o . A luz d o m o n o -
c r o m a d o r excitador (Ml) é dividida, e u m a p e q u e n a p a r t e (10%)
é d i r e c i o n a d a à referência F M T ( D l ) para fins de razão de refe-
rência. O r e s t a n t e de luz d e excitação é focalizado n a cubeta de
a m o s t r a (C). O s dispositivos ópticos de emissão são p o s i c i o n a d o s
p e r p e n d i c u l a r m e n t e àqueles d e excitação. U m m o n o c r o m a d o r
de emissão (M2) é utilizado p a r a selecionar o u varrer a região d o
espectro d e emissão desejada, q u e é d i r e c i o n a d o para a a m o s t r a
do P M T (D2) p a r a m e d i r a i n t e n s i d a d e d e emissão. O s sinais
e m i t i d o s pela referência e a m o s t r a de P M T s são a m p l i a d o s (AI e
A2), e a razão e n t r e esses sinais é f o r n e c i d a e m f o r m a d e u m
gráfico digital e m u m m o n i t o r ou e m u m registrador. O m o d o
o p e r a c i o n a l de u m f l u o r í m e t r o de razão é s e m e l h a n t e ao de u m
espectrofluorímetro; entretanto, apenas poucos comprimentos
de o n d a s de excitação e emissão são disponíveis, b e m c o m o a
utilização deste tipo de i n s t r u m e n t o é l i m i t a d a à v a r r e d u r a de
f l u o r ó f o r o s p a t a o b t e n ç ã o d e espectros d e excitação e emissão.
O f l u o r í m e t r o de razão d e referência é mais útil p a r a a avaliação
d e c o n c e n t r a ç ã o e m c o m p r i m e n t o s d e o n d a s de excitação e
emissão d e f i n i d a s .
O e s p e c t r o f l u o r í m e t r o d e razão d e referência é o p e r a d o e m
q u a l q u e r c o m p r i m e n t o de o n d a de excitação e emissão fixas para
m e d i r c o n c e n t r a ç ã o o u utilizado para avaliar espectro de excita-
ção o u emissão de u m d e t e r m i n a d o c o m p o s t o , A m e d i d a d e
c o n c e n t r a ç õ e s d e s c o n h e c i d a s é realizada d e f o r m a s e m e l h a n t e a
de u m fluoTÍmetro c o m u m ú n i c o feixe. O b r a n c o e u m calibra-
cia da Figura 4-15 f o r n e c e d u a s v a n t a g e n s e m relação a espectro-
f l u o r í m e t r o s d e feixe simples. Primeira, elimina as f l u t u a ç õ e s d e
o d e c a i m e n t o d a l â m p a d a e o m o v i m e n t o d o arco) e, p o r t a n t o ,
m i n i m i z a a necessidade f r e q ü e n t e d e calibração d o i n s t r u m e n t o
d u r a n t e a análise. E m s e g u n d o lugar, oferece "essencialmente"
espectros d e excitação corrigidos para c o m p e n s a ç ã o de f l u t u a ç õ e s
d e energia d e p e n d e n t e s d o c o m p r i m e n t o d e o n d a .
Os fluorimetros com resolução temporal foram introduzidos em
m e a d o s d o s a n o s 1970, q u a n d o W e i d e r desenvolveu u m fluorí-
m e t r o a laser de n i t r o g ê n i o p u l s a d o e m c o n j u n t o c o m u m sistema
de i m u n o e n s a i o b a s e a d o e m l a n t a n í d e o s . Este i n s t r u m e n t o
m e d i a o d e c a i m e n t o de f l u o r e s c ê n c i a d e quelatos d e l a n t a n í d e o s
c o m o u m m e i o de e l i m i n a r interferências de luz de f u n d o dis-
persa e d e c o m p o s t o s c o m t e m p o d e d e c a i m e n t o de f l u o r e s c ê n c i a
c u r t o . O f l u o r í m e t r o c o m resolução t e m p o r a l 3 é s e m e l h a n t e ao
f l u o r í m e t r o de razão de referência, c o m a ressalva de q u e a f o n t e
de luz é p u l s a d a 9 e q u e , e m m o d o de c o n t a g e m rápida, o detector
m o n i t o r a o d e c a i m e n t o e x p o n e n c i a l de sinal d e f l u o r e s c ê n c i a
após a excitação. O f l u o r í m e t r o c o m resolução t e m p o r a l r e q u e r
a utilização de f l u o r ó f o r o s d e longa d u r a ç ã o , c o m o o íons metá-
licos d e l a n t a n í d e o s (terras raras), e u r ó p i o (Eu 3 *) e s a m á r i o (Sm 3+ ).
C o n s i d e r a n d o que a maioria dos compostos de fluorescência
possui t e m p o de d e c a i m e n t o de 5 a 100 ns, os q u e l a t o s d e
e u r ó p i o d e c a e m e m 0,6 a 100 s. Assim, ensaios d e f l u o r i m e t r i a
c o m resolução t e m p o r a l t i r a m p a r t i d o d e diferenças de t e m p o s
d e vida de f l u o r ó f o r o s e d e f l u o r e s c ê n c i a d o r u í d o d e f u n d o ,
a v a l i a n d o o d e c a i m e n t o d o sinal d e fluorescência. Isso e l i m i n a
interferências d e r u í d o d e f u n d o e, ao m e s m o t e m p o , lê o sinal
m é d i o p a r a otimizar a precisão da leitura. Limites de detecção d e
a p r o x i m a d a m e n t e 10" lj m o l / L f o r a m alcançados c o m f l u o r i m e -
tria c o m resolução t e m p o r a l ; u m avanço de cerca de q u a t r o
o r d e n s d e m a g n i t u d e , c o m p a r a n d o c o m avaliações f l u o r i m é t r i c a s
c o n v e n c i o n a i s . Por e x e m p l o , n a n o p a r t í c u l a s m a r c a d a s c o m Eu 3 + ,
e m c o m b i n a ç ã o c o m f l u o r i m e t r i a de resolução t e m p o r a l , f o r a m

Figura 4 - 1 5 Diagrama de espectrofluorimetro de razão de referência típico.
utilizadas para desenvolver u m i m u n o e n s a i o a l t a m e n t e sensível
para os a n t í g e n o s específicos prostáticos livre e total e c o m sen-
sibilidade f u n c i o n a l de 0,5 n g/L. 11
Citômeíro de Fluxo
A citometria refere-se à m e d i d a física e / o u q u í m i c a d e caracterís-
ticas celulares ou, p o r extensão, outras partículas biológicas. A
citometria de f l u x o é u m processo e m q u e essas m e d i ç õ e s são
realizadas e n q u a n t o as células o u partículas p a s s a m c o m o u m
f l u x o d e f l u i d o , de preferência e m linha ú n i c a , através d o
m e d i d o r . A t r i a g e m de f l u x o a m p l i a a utilidade da c i t o m e t r i a de
fluxo, pois e m p r e g a m e i o s m e c â n i c o s ou elétricos p a r a desviar e
coletar células, c o m u m a o u m a i s características, d e n t r o d e u m
intervalo ou intervalos d e valores d e f i n i d o s pelo usuário. 8 , 9
E m t e r m o s operacionais, a c i t o m e t r i a de f l u x o c o m b i n a fluo-
rimetria i n d u z i d a p o r laser e análise d e dispersão da luz e m par-
tículas, q u e p e r m i t e diferenciar p o p u l a ç õ e s de moléculas, células
ou partículas pela f o r m a e t a m a n h o , utilizando luz baixa e dis-
persão d e luz e m â n g u l o reto. O laser é i d e a l m e n t e a d e q u a d o p a r a
dispersão de luz e m â n g u l o baixo. As células, m o l é c u l a s o u par-
tículas são m a r c a d a s c o m fluorescências diferentes e específicas,
c o m o P-ficoeritiina, isotiocianato de fluoresceína, r o d a m i n a - 6 G
e a n t i c o r p o s m a r c a d o s c o m corantes. E n q u a n t o esses p a s s a m pela
célula de f l u x o , medições s i m u l t â n e a s de fluorescência e luz
dispersa são a u t o m a t i c a m e n t e executadas p e l o c i t ô m e t r o de
fluxo. A m a i o r i a dos c i t ô m e t r o s d e f l u x o i n c o r p o r a d o i s ou mais
sistemas d e d e t e c ç ã o de emissão de fluorescência, p a r a q u e vários
m a r c a d o r e s f l u o r e s c e n t e s p o s s a m ser utilizados. D e s t a f o r m a ,
moléculas, células ou partículas são classificadas p o r t a m a n h o ,
f o r m a e tipo, d e a c o r d o c o m a dispersão de luz e as p r o p r i e d a d e s
f l u o r e s c e n t e s . U m d e s e n h o e s q u e m á t i c o de u m c i t ô m e t r o de
f l u x o é m o s t r a d o n a Figura 4-16.
Técnicas Ópticas CAPÍTULO 4 79
0Lâmpada
de Xe
C i t ô m e t r o s de f l u x o são capazes d e m e d i r m ú l t i p l o s p a r â m e -
tros, i n c l u i n d o (1) t a m a n h o das células (dispersão p a r a frente),
(2) g r a n u l o s i d a d e (dispersão e m 90°), (3) c o n t e ú d o de D N A e
R N A , (4) p e r c e n t u a l d e n u c l e o t í d e o s ( A T ) / ( G C ) d o D N A , (5)
e s t r u t u r a de c r o m a t i n a , (6) antígenos, (7) c o n t e ú d o p r o t é i c o
total, (8) receptores celulares, (9) potencial de m e m b r a n a e (10)
c o n c e n t r a ç ã o d o íon cálcio e m f u n ç ã o d o p H . O desenvolvi-
m e n t o e a utilização d e ensaios d e citometria de f l u x o de partí-
culas são de relevância especial. C o m esta tecnologia, u m citôme-
tro d e f l u x o é c o m b i n a d o c o m microesferas q u e são utilizadas
c o m o s u p o r t e sólido p a r a i m u n o e n s a i o c o n v e n c i o n a l , ensaio de
a f i n i d a d e ou h i b r i d a ç ã o de D N A M O sistema r e s u l t a n t e é m u i t o
flexível e levou ao d e s e n v o l v i m e n t o d e ensaios m ú l t i p l o s q u e
analisam, s i m u l t a n e a m e n t e , várias substâncias, e m u m p e q u e n o
v o l u m e d e amostra.
Hematoflucrímetro
O hematofluorímetro é u m f o t o f l u o r í m e t r o de superfície f r o n t a l
c o m canal simples d e d i c a d o à análise de zinco p r o t o p o r f i r i n a n o
s a n g u e total ( C a p í t u l o 29). U m h e m a t o f l u o r í m e t r o típico utiliza
u m a l â m p a d a d e q u a r t z o e t u n g s t é n i o , filtro de excitação c o m
largura d e b a n d a estreita (420 n m ) , óptica d e superfície f r o n t a l ,
u m filtro c o m largura de b a n d a estreita (594 n m ) e u m P M T .
U m a gota d e sangue t o t a l é d e p o s i t a d a sobre u m p e q u e n o v i d r o
r e t a n g u l a r q u e f u n c i o n a c o m o cubefca.
Limitações de Medidas de Fluorescência
Fatores q u e i n f l u e n c i a m as m e d i ç õ e s de fluorescência i n c l u e m
(1) efeitos d e c o n c e n t r a ç ã o (p. ex., efeito de filtro i n t e r i o r e dis-
sipação de c o n c e n t r a ç ã o ) , (2) efeitos d e r u í d o de f u n d o (em
f u n ç ã o das dispersões d e Rayleigh e R a m a n ) , (3) efeitos de sol-
v e n t e (p. ex., i n t e r f e r ê n c i a d e f l u o r e s c ê n c i a inespecífica e d e
dissipação de solvente), (4) efeitos de a m o s t r a (p. ex., d i s p e r s ã o
80 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
Amostra
Fluido
envol-
0 ^ vente
Dispersar de Objetiva
luz frontal de microscópio
(20x)
20x) . -
Interruptor de
1)
feixe de laser j
Lentes
Janela de quartzo
Lentes
cilíndricas
a de
triagem
Figura 4 - 1 6 Diagrama esquemático de um citômetro de fluxo.
de luz, fluorescência i n t e r f e r e n t e e adsorção da amostra), (5)
efeitos d e t e m p e r a t u r a e (6) f o t o d e c o m p o s i ç ã o (clareamento) de
amostra.
Efeito de Filtro Interno
A relação linear e n t r e a c o n c e n t r a ç ã o e a emissão de fluorescên-
cia (equação [9]) è válida q u a n d o soluções q u e a b s o r v e m m e n o s
de 2 % d e luz excitada são utilizadas. Q u a n d o a absorvância da
solução a u m e n t a acima desse valor, a relação torna-se n ã o linear,
u m f e n ô m e n o c o n h e c i d o c o m o o "efeito de filtro interno". Esse
é c o n s e q ü ê n c i a da perda d e i n t e n s i d a d e d e excitação e n q u a n t o
a luz é absorvida p e l o f l u o r ó f o r o ao l o n g o da trajetória através
da cubeta. Assim, q u a n d o o f l u o r ó f o r o se t o r n a mais concen-
trado, a absorvância da i n t e n s i d a d e d e excitação a u m e n t a , assim
c o m o ocorre p e r d a de luz excitante e n q u a n t o essa passa através
da cubeta. Este efeito é mais f r e q ü e n t e e m i n s t r u m e n t o d e fluo-
rescência c o m ângulo reto, o n d e as f e n d a s d e emissão são confi-
guradas p a r a m o n i t o r a r o c e n t r o da a m o s t r a , o n d e a a b s o r v â n c i a
da luz d e excitação é s u p e r i o r àquela da superfície f r o n t a l da
cubeta. Assim, o efeito será m i n i m i z a d o se u m i n s t r u m e n t o d e
fluorescência d e superfície f r o n t a l for utilizado. C o n t u d o , c o m o
a maioria das medições de fluorescência é Tealizada e m soluções
m u i t o diluídas, esse efeito n ã o é u m p r o b l e m a .
Atenuação de Concentração
O u t r o f e n ô m e n o relacionado, q u e resulta e m geração d e q u a n t i -
d a d e d e energia q u â n t i c a i n f e r i o r ao esperado, é a atenuação de
concentração (do inglês ^uencfiing). Essa ocorre q u a n d o u m a macro-
molécula, c o m o u m a n t i c o r p o , é f o r t e m e n t e m a r c a d a p o r u m
f l u o r ó f o r o , c o m o isotiocianato de f l u o r e s c e í n a . Q u a n d o este
c o m p o s t o é excitado, o m a r c a d o r de fluorescência está de tal
m o d o p r ó x i m o , q u e o c o r r e t r a n s f e r ê n c i a d e energia n ã o radioa-
tiva. Assim, a fluorescência r e s u l t a n t e é m u i t o inferior à esperada
p a r a a c o n c e n t r a ç ã o d o m a r c a d o r . Este é u m p r o b l e m a c o m u m
e m citometria d e fluxo e fluorescência i n d u z i d a p o r laser, q u a n d o
Dispersor de fluo-
Filtro rescência/luz
Divisor
l > °
de feixe
f
^
Abertura
â Fluorescência
PMT
Filtro Sinais para o
analisador de
pulso alto
Feixe de laser
se t e n t a baixar a s e n s i b i l i d a d e d e detecção, a u m e n t a n d o a densi-
d a d e d o m a r c a d o r d e fluorescência.
Dispersão da Luz
A dispersão d e Rayleigh e R a m a n limita a utilização de fluores-
cência. A dispersão de Rayleigh ocorre sem alteração n o compri-
m e n t o de o n d a . Para f l u o r ó f o r o s c o m p e q u e n o s d e s l o c a m e n t o s
de Stokes, os espectros de excitação e emissão se s o b r e p õ e m ;
assim, a detecção é p a r t i c u l a r m e n t e afetada p e l o r u i d o d e f u n d o
de dispersão de luz. A d i s p e r s ã o d e Rayleigh é c o n t r o l a d a pela
utilização d e filtros de i n t e r f e r ê n c i a s de emissão e excitação b e m
definidos, por configurações apropriadas do m o n o c r o m a d o r e
utilização d e polarizadores.
A dispersão d e R a m a n o c o r r e com u m a l o n g a m e n t o d o com-
p r i m e n t o de o n d a . Este tipo d e dispersão d e luz é i n d e p e n d e n t e
d o c o m p r i m e n t o de o n d a d e excitação e é p r o p r i e d a d e d o sol-
vente. E m v i r t u d e de a dispersão d e R a m a n a c o n t e c e r e m com-
p r i m e n t o s d e o n d a s maiores q u e aqueles de radiação excitante,
e l i m i n a r essa i n t e r f e r ê n c i a é u m a tarefa difícíl q u a n d o se trabalha
c o m c o n c e n t r a ç õ e s m u i t o baixas d e f l u o r ó f o r o s .
Material da Cubeta e Efeitos do Solvente
C e r t o s vidros de q u a r t z o e material plástico q u e c o n t ê m absor-
ventes de ultravioleta irão a p r e s e n t a r fluorescência. A l g u n s sol-
ventes c o m o o e t a n o l t a m b é m são c o n h e c i d o s p o r a p r e s e n t a r e m
apreciável fluorescência. Por isso, a o se desenvolver u m ensaio d e
fluorescência é i m p o r t a n t e avaliar o r u i d o de f u n d o de todos os
c o m p o n e n t e s da m i s t u r a de reação. Solventes de grau d e fluores-
cência e cubetas c o m emissão d e fluorescência m í n i m a , q u e
m i n i m i z a m estes p r o b l e m a s , estão disponíveis c o m e r c i a l m e n t e .
Efeitos da Matriz de Amostra
A m o s t r a s d e soro o u u r i n a c o n t ê m m u i t o s c o m p o s t o s q u e apre-
s e n t a m fluorescência. Assim, a matriz de a m o s t r a é u m a f o n t e
potencial d e r u i d o s d e f u n d o indesejáveis e deve ser e x a m i n a d a

q u a n d o n o v o s m é t o d o s f o r e m desenvolvidos. Proteínas e bilirru-
b i n a c o n t r i b u e m e m grau m a i s a c e n t u a d o para a p r o d u ç ã o de
f l u o r e s c ê n c i a i n d e s e j a d a . N o e n t a n t o , c o m o a excitação m á x i m a
d e p r o t e í n a o c o r r e n a região d o espectro d e 260 a 2 9 0 n m , a
c o n t r i b u i ç ã o dessa para o r u í d o de f u n d o d e f l u o r e s c ê n c i a global
é m e n o r q u a n d o a excitação o c o r r e acima d e 3 0 0 n m .
A dispersão d e luz p o r p r o t e í n a s e o u t r a s m a c i o m o l é c u l a s da
matriz d e a m o s t r a é c o n h e c i d a c a u s a d o r a de r u í d o s de f u n d o d e
f l u o r e s c ê n c i a indesejáveis. A m o s t r a s c o m c o n t e ú d o s lipídicos,
p o r exemplo, são dispersores i n t e n s o s de luz, dessa m a n e i r a ,
q u a n d o u m n o v o m é t o d o for criado, a c o n t r i b u i ç ã o relativa d o s
lipídios p a r a o r u í d o d e f u n d o deve ser investigada.
E m a d i ç ã o às i n t e r f e r ê n c i a s causadas p e l o r u í d o d e f u n d o ,
diluir soluções d e alguns f l u o r ó f o r o s n u m intervalo de c o n c e n -
tração d e IO"9 m o l / L o u i n f e r i o r leva, e n t r e o u t r a s reações, à
absorção desses às p a r e d e s d e v i d r o das cubetas. A l é m disso, as
soluções diluídas d e f l u o r ó f o r o s , excitados p o r l o n g o s p e r í o d o s
de t e m p o , são sensíveis à f o t o d e c o m p o s i ç ã o pela excitação de luz
i n t e n s a . O p e r a c i o n a l m e n t e , estes p r o b l e m a s são evitados esco-
lhendo-se a d e q u a d a m e n t e o r e c i p i e n t e de reação, a d i c i o n a n d o - s e
agentes h u m e c t a n t e s e m i n i m i z a n d o - s e o t e m p o de exposição d a
a m o s t r a à luz de excitação.
Efeitos da Temperatura
A eficiência q u â n t i c a de f l u o r e s c ê n c i a de vários c o m p o s t o s é
sensível a f l u t u a ç õ e s d e t e m p e r a t u r a . P o r t a n t o , a t e m p e r a t u r a de
reação deve ser r e g u l a d a c o m variação d e ± 0,1 ° C . E m geral, a
i n t e n s i d a d e de f l u o r e s c ê n c i a d i m i n u i c o m o a u m e n t o de tempe-
r a t u r a e m cerca d e 1% a 5 % p o r grau Celsius. A l é m disso, a
conversão e x t e r n a o u supressão colisional (colíisionaí ^uenching)
d i m i n u i c o m o a u m e n t o de viscosidade, r e d u z i n d o assim a ate-
n u a ç ã o d e f l u o r e s c ê n c i a . O p e r a c i o n a l m e n t e , a i n t e n s i d a d e de
f l u o r e s c ê n c i a é, p o r t a n t o , r e f o r ç a d a p e l o a u m e n t o de viscosidade
d e reação ou pela d i m i n u i ç ã o d e t e m p e r a t u r a d o solvente. O s
efeitos de t e m p e r a t u r a são m i n i m i z a d o s p e l o c o n t r o l e de tempe-
r a t u r a d e reação e p e l o p r é v i o equilíbrio d e t e m p e r a t u r a s de
a m o s t r a s o u reagentes, ou a m b o s , q u a n d o esses a p r e s e n t a r e m
t e m p e r a t u r a s inferiores à da reação.
Fo todecomposição
N a f l u o r i m e t r i a c o n v e n c i o n a l , a exposição de soluções fraca-
m e n t e f l u o r e s c e n t e s o u diluídas, a f o n t e d e excitação l u m i n o s a
d e alta i n t e n s i d a d e p o d e levar à d e c o m p o s i ç ã o f o t o q u í m i c a d a
substância ( f o t o c l a r e a m e n t o ) .
O s seguintes passos a j u d a m a m i n i m i z a r os efeitos de f o t o d e -
composição:
1. S e m p r e utilize c o m p r i m e n t o de o n d a d e excitação o mais
l o n g o possivel e q u e n ã o i n t r o d u z a efeitos de d i s p e r s ã o da
luz.
2. D i m i n u a a d u r a ç ã o de excitação de amostra, m e d i n d o a
i n t e n s i d a d e de f l u o r e s c ê n c i a i m e d i a t a m e n t e após a excita-
ção.
3. Proteja d a luz a m b i e n t e as soluções instáveis, a r m a z e n a n d o - a s
e m vidrarias escuras.
4. R e m o v a o oxigênio dissolvido da solução.
A l é m disso, f o n t e s de laser m u i t o intensas, c o m saída de
energia s u p e r i o r a 5 a 10 m W , utilizadas n a citometria d e fluxo,
microscopia de f l u o r e s c ê n c i a e f l u o r e s c ê n c i a i n d u z i d a p o r laser,
irão r a p i d a m e n t e d e c o m p o r algumas substâncias de f l u o r e s c ê n -
cia Esta d e c o m p o s i ç ã o i n t r o d u z curvas d e resposta n ã o lineares
e a p e r d a d a m a i o r p a r t e d a f l u o r e s c ê n c i a da a m o s t r a . E n s a i o s
de f l u o r e s c ê n c i a b a s e a d o s e m substâncias c o m c o n c e n t r a ç õ e s
ultrabaixas exigem a otimização de i n t e n s i d a d e d e laser e a utili-
zação de u m d e t e c t o r sensível.
Técnicas Ópticas CAPÍTULO 4 81
FOSFORIMETRIA
F o s f o r i m e t r i a é a m e d i ç ã o da f o s f o r e s c ê n c i a , u m tipo de l u m i -
n e s c ê n c i a p r o d u z i d a p o r certas substâncias após a a b s o r ç ã o d e
energia r a d i a n t e ou o u t r o s tipos d e energia. A fosforescência
distingue-se da fluorescência n a m e d i d a e m q u e c o n t i n u a pre-
s e n t e m e s m o após o d e s a p a r e c i d o d a radiação. O t e m p o d e
d e c a i m e n t o de emissão de luz d a fosforescência é mais l o n g o
(IO*4 a IO'2 s) q u e o t e m p o de d e c a i m e n t o d e emissão d a fluores-
cência. T e m p o s de d e c a i m e n t o são expressos e m intervalos de
várias o r d e n s d e grandeza e v a r i a m de a c o r d o c o m a m o l é c u l a e
as características da solução. A fosforescência a p r e s e n t a m a i o r
alteração n o c o m p r i m e n t o d e o n d a d a luz e m i t i d a q u e a fluores-
cência.
LUMINOMETRIA
A q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a , b i o l u m i n e s c ê n c i a e eletroquimiolumines-
cênáã são tipos de l u m i n e s c ê n c i a n o s quais o e v e n t o excitatório
é p r o v o c a d o p o r u m a reação q u í m i c a , b i o q u í m i c a ou eletroquí-
mica, e n ã o p o r f o t o i l u m i n a ç ã o . I n s t r u m e n t o s para m e d i r esse
tipo de emissão de luz são c o n h e c i d o s , g e n e r i c a m e n t e , c o m o
luminômetros.
Conceitos Básicos
O e v e n t o físico emissão d e luz n a q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a , biolu-
minescência e eletroquimioluminescência é semelhante àquele
d a fluorescência, n a m e d i d a e m q u e o c o r r e a partir de u m e s t a d o
excitado singleto, e a luz é e m i t i d a q u a n d o o e l é t r o n r e t o r n a ao
estado fundamental.
Quimioluminescência e Bioluminescência
A q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a é a e m i s s ã o d e luz q u a n d o u m e l é t r o n
r e t o r n a de u m nível excitado o u s u p e r i o r de energia a u m nível
energético mais baixo. O e v e n t o excitatório é c a u s a d o p o r u m a
reação q u í m i c a e envolve a oxidação de u m c o m p o s t o orgânico,
c o m o l u m i n o l , i s o l u m i n o l , ésteres d e acridina o u luciferina, c o m
o auxílio d e u m oxidante, c o m o água oxigenada, h i p o c l o r i t o o u
oxigênio. A luz é e m i t i d a a p a r t i r de u m p r o d u t o excitado,
f o r m a d o pela reação d e oxidação. Estas reações o c o r r e m n a pre-
sença de catalisadores, tais c o m o enzimas [p. ex., fosfatase alca-
lina, peroxidase d o r á b a n o silvestre (raiz-forte) e microperoxi-
dase], íons metálicos o u d e metais c o m p l e x o s {p. ex., c o m p l e x o
d e f t a l o c i a n i n a Cu 2 + e Fe 3+ ), e h e m i n a . 2 1 5
A b i o l u m i n e s c ê n c i a é u m a f o r m a especial d e q u i m i o l u m i n e s -
cência e n c o n t r a d a e m sistemas biológicos. N a b i o l u m i n e s c ê n c i a ,
u m a enzima ou u m a f o t o p r o t e í n a a u m e n t a a eficiência d a reação
d e l u m i n e s c ê n c i a . A luciferase e a a q u o r i n a são dois exemplos
desses catalisadores biológicos. O r e n d i m e n t o q u â n t i c o (p. ex., o
total d e f ó t o n s e m i t i d o s p o r m o l é c u l a s reativas totais) é d e cerca
d e 0,1% a 10% para q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a e de 10% a 3 0 % p a r a
a bioluminescência.
O s ensaios d e q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a são ultra-sensíveis (limites
d e detecção de a t o m o l e a zeptomole), a p r e s e n t a n d o u m a faixa
d i n â m i c a ampla. Eles são agora f r e q ü e n t e m e n t e utilizados e m
i m u n o e n s a i o a u t o m a t i z a d o e e m ensaios e n v o l v e n d o s o n d a de
D N A [p. ex., m a r c a d o r e s d e éster de acridina e acridina sulfa-
m i d a , substratos d o 1,2-dioxetano, p a r a m a r c a d o r e s de fosfatase
alcalina, e a reação otimizada de l u m i n o l , para m a r c a d o r e s d e
peroxidase de r á b a n o silvestre (raiz-forte) ( C a p í t u l o 10)].
Eletroquimioluminescência
A e l e t r o q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a difere d a q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a
p o r q u e as espécies reativas q u e p r o d u z e m q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a
são geradas e l e t r o q u u n i c a m e n t e , p o r p r e c u r s o r e s estáveis, n a
superfície de u m eletrodo.' O q u e l a t o tris (bipiridil) r u t ê n i o
82 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

(Ru í+ ) é o marcador de eletroquimioluminescêncía mais comu- Tamanho da Partícula

mente utilizado e a eletroquimioluminescêncía é gerada, em u m
eletrodo, a partir de u m tipo de reação de oxidação-redução com
tripropilamina. Este quelato é muito estável e relativamente
pequeno e tem sido utilizado para marcar haprenos o u grandes
moléculas (p. ex., proteínas ou oligonucleótidos). O processo de
eletroquimioluminescêncía tem sido utilizado em ensaios imuno-
lógicos e de ácidos nucléicos. A vantagem desse processo consiste
na preparação simples, na alta estabilidade dos reagentes e em
uma grande sensibilidade. A utilização desse processo propor-
ciona limites de detecção de 200 f m o l / L e uma escala dinâmica,
que se estende por seis ordens de magnitude.
Instrumentação
Os componentes básicos de u m luminômetro são (l) a célula de
amostra alojada em uma câmara protegida da luz, (2) u m sistema
paia injeção dos reagentes na célula de amostra e (3) o detec-
tor.2,13 O detecroT é n o r m a l m e n t e u m tubo fotomultiplicador. N o
entanto, u m detector carregado acoplado (CCD), um filme de
raio X ou u m filme fotográfico foram utilizados para capturar a
imagem bioluminescente ou de reações de quimioluminescência
realizada em m e m b r a n a ou em poços de microplaca. Para a ele-
troquimioluminescência, é incorporado u m eletrodo ao reci-
piente de reação, o n d e a eletroquimioluminescêncía é gerada.
Limitações de Medidas de
Quimioluminescência, Bioluminescência e
Eletroquimioluminescêncía
Vazamentos e canalizações de luz e alta luminescência d e f u n d o s
provenientes de ensaios e recipientes de reação (p. ex., tubos de
plástico expostos à luz) são fatores comuns que degradam o
desempenho analítico nas medições de luminescência. A natu-
reza ultra-sensível de ensaios de quimioluminescência exige con-
troles rigorosos na pureza de reagentes e solventes (p. ex., a água)
utilizados para preparar soluções reagentes. A captação eficiente
das emissões provenientes de reações que produzem clarão de luz
requeT que o reagente desencadeador seja adicionado à reação
por injeção e homogeinização adequadas. Os ensaios de biolumi-
nescência, quimioluminescência e eletroquimioluminescêncía
apresentam alta linearidade, geralmente de várias ordens de gran-
deza, mas a altíssima intensidade de emissão de luz levou à utili-
zação de tubos fotomultiplicadores de pulsos em cadeia, ocasio-
n a n d o uma grave subestimação da verdadeira intensidade da
emissão.
NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA
A dispersão da luz é u m f e n ô m e n o físico resultante da interação
da luz com partículas em solução. Nefelometria e t u r b i d i m e t r i a
são técnicas analíticas utilizadas para medir l m dispersa. Medi-
ções de luz dispersa são aplicadas a imunoensaios de proteínas
específicas e haptenos. As aplicações específicas são descritas nos
Capítulos 10, 18 e 23.
A equação de dispersão de Rayleigh (11) aplica-se à dispersão de
luz por pequenas partículas, com dimensões muito menores que
as do comprimento de onda da luz incidente (p. ex., t a m a n h o
das partículas inferior a X/ÍO). Q u a n d o as dimensões das partí-
culas são muito menores que as d o comprimento de o n d a de luz
incidente, cada partícula está sujeita, ao mesmo tempo, às foiças
de campo elétrico similares. As ondas reincidentes ou de luz
dispersa de pequenas partículas estão em fase e reforçam-se mutu-
amente. A medida que as partículas se tornam maiores que o
c o m p r im e n to de onda da luz incidente, a luz irradiada já não
está em fase. O reforço da radiação ocorre em algumas direções
e a interferência destrutiva ocorre em outras. Os padrões de
dispersão dessas partículas maiores são característicos da forma
e do t a m a n h o da partícula.
Dependência do Comprimento de Onda da Luz
Dispersa
E m 1871, Lord Rayleigh desenvolveu a seguinte equação, que
mostra a relação entre a intensidade (Is) da luz dispersa e a inten-
sidade (J0) da luz incidente:
I5 \6jT2aá.n2 6
(u)
i r AV
onde
I, = intensidade da luz dispersa
10 = intensidade da luz excitante
a = polarização de pequenas partículas
0 = ângulo de observação
X = comprimento de onda da luz incidente
r = distância entre a luz dispersa e o detector
C o m o indicado, a intensidade da luz dispersa a u m e n t a com
a quarta potência do comprimento de onda, q u a n d o o compri-
m e n t o de onda da luz incidente é diminuído. Outra observação
útil sobre a equação (11) é o fato de que a intensidade da luz
d i m i n u i com o quadrado da distância entre o r das partículas
dispersoras da luz e o detector. Assim, o detector deve ser locali-
zado próximo à célula analítica, o que pode ser viabilizado pela
combinação da célula e do detector ou pela utilização de b o m
dispositivo óptico.
Fatores de Concentração e Massa Molecular na
Dispersão da Luz
A relação direta entre a luz dispersa e a concentração e massa mole-
cular de partículas é derivada da equação (11), mostrando que:
4íT2(cM /<£ ) 2 M c s i n 2 #
<12)
Io N.AV

Conceitos Básicos onde

A dispersão da luz ocorre q u a n d o a energia radiante atravessando 1 = a intensidade da luz dispersa por pequenas partículas
u m a solução colide elasticamente com u m a molécula, o que ío = a intensidade da luz excitante
resulta no espalhamento da luz por todas as direções. Ao contrá- dn/dc = a mudança n o índice de refração do solvente em relação
rio da emissão de fluorescência, o comprimento de onda da luz à mudança de concentração do soluto
dispersa é o mesmo que o da luz incidente M = massa molecular (g/mol)
Fatores que influenciam na dispersão da luz incluem (1) o c = concentração (g/mL) de partículas
efeito do t a m a n h o da partícula, (2) a dependência do compri- e = ângulo de observação
mento de onda, (3) a distância de observação, (4) o efeito de Nfl = n ú m e r o de Avogadro
polarização da luz incidente, (5) a concentração das partículas e X = c o m p r im e n to de onda da luz incidente
(6) a massa molecular das partículas. i = distância entre a luz dispersa e o detectot
 Técnicas Ópticas CAPÍTULO 4 83

C o m o indicado n a e q u a ç ã o (12), n ã o exisre relaçao direta e n t r e a Dispersão de Rayleigh

luz dispersa e a c o n c e n tr a ç ã o e a massa m o l e c u l a r de partículas^. 90'

0 Efeito da Luz Polarizada na Dispersão da Luz

As e q u a ç õ e s (11) e (12) são f o r m a s d i f e r e n t e s d a expressão d e
Rayleigh aplicadas à dispersão da luz p o r p e q u e n a s partículas,
q u a n d o excitadas pela luz polarizada. A Figura 4-17, A m o s t r a o Luz
efeito d a luz polarizada e n ã o polarizada s o b r e a i n t e n s i d a d e d a incidente
luz dispersa p o r p e q u e n a s partículas, e m f u n ç ã o d o â n g u l o d e
dispersão. A c u r v a 2 m o s t r a u m d i a g r a m a d e i n t e n s i d a d e c o m
simetria esférica, c o m o previsto pela e q u a ç ã o (11). A curva 3 é o
diagrama r e s u l t a n t e d a i n t e n s i d a d e , q u a n d o as curvas 1 e 2 são
somadas e o d i a g r a m a d e i n t e n s i d a d e angulai d a dispersão o b t i d o
q u a n d o a luz n ã o polarizada excita p e q u e n a s partículas. A s curvas Dispersão para trás Dispersão para
1 e 2 r e p r e s e n t a m diagramas d e i n t e n s i d a d e d e c o m p o n e n t e s d a frente
luz polarizada vertical e h o r i z o n t a l m e n t e , c o n s i d e r a d a s c o m o luz
n ã o polarizada. A expressão da d i s p e r s ã o da luz de Rayleigh para Dispersor de Rayleigh-Debye
p e q u e n a s partículas excitadas p o r luz n ã o polarizada é d a d a pela 90'
e q u a ç ã o (13):

Is 27l2(ân/<k)7Mc(\ + cosÔ)
(13)
L ~ Í\LÃV
Luz incidente B

A Dependência Angular de Dispersão da Luz

A d e p e n d ê n c i a angular de d i s p e r s ã o de luz p o r p e q u e n a s partí-
Dispersão para frente
culas ( m e n o r q u e X./10) está r e p r e s e n t a d a p e l a Figura 4-17, A.
C o m o foi m o s t r a d o n a curva 3, a i n t e n s i d a d e d e lus dispersa p a r a Partícula >
f r e n t e e paTa trás (Io e m 0 o e 180°), a partir de p e q u e n a s partícu-
las excitadas p o r luz n ã o polarizada, é igual. C o n t u d o , a intensi-
Figura 4 - 1 7 A dependência angular da intensidade da luz dispersa
d a d e de dispersão d a luz e m 90° é m u i t o m e n o r . Q u a n d o as
com luz incidente não polarizada e polarizada para pequenas partículas
partículas se t o r n a m maiores (p. ex., superiores a À/10), a d e p e n -
(A) e a dependência angular da luz dispersa com luz não polarizada para
dência a n g u l a r de dispersão d a luz a s s u m e u m a relação assimé-
partículas maiores (B).
trica m o s t r a d a n a Figura 4-17, B. Nesta situação, as i n t e n s i d a d e s
de dispersão e m â n g u l o s p a r a f r e n t e e p a r a trás n ã o são iguais; a
i n t e n s i d a d e d e dispersão de â n g u l o p a r a f r e n t e é m u i t o maior.
A l é m disso, a i n t e n s i d a d e d e d i s p e r s ã o a 90° é m u i t o m e n o r d o
que a i n t e n s i d a d e d o â n g u l o para f r e n t e (0 o ). Q u a n d o as partí- onde
culas se t o r n a r e m a i n d a maiores, esta assimetria a u m e n t a r á a i n d a t - turbidez
mais. Esta assimetria e a m u d a n ç a n a d e p e n d ê n c i a angular de h = distância d a trajetória de luz i n c i d e n t e através d a solução de
e s p a l h a m e n t o d a luz c o m a m u d a n ç a d o t a m a n h o d e partículas partículas dispersoras da luz
são m u i t o úteis para a caracterização e d i f e r e n c i a ç ã o d e diversas I = i n t e n s i d a d e d a luz t r a n s m i t i d a
classes de m a c r o m o l é c u l a s e células. L - i n t e n s i d a d e d a luz i n c i d e n t e

Medidas de Luz Dispersa A t u r b i d i m e t r i a é utilizada p a r a m e d i r a i n t e n s i d a d e d a luz

A t u r b i d i m e t r i a e a n e f e l o m e t r i a são m é t o d o s utilizados para
m e d i r a luz dispersa. Eles se revelaram úteis p a r a a q u a n t i f i c a ç ã o
de p r o t e í n a s séricas ( C a p í t u l o s 10 e 18).
Turbidimetria
A turbidez d i m i n u i a i n t e n s i d a d e d o feixe d e luz i n c i d e n t e ,
e n q u a n t o este passa p o r u m a solução c o n t e n d o partículas. A
m e d i d a desta d i m i n u i ç ã o de i n t e n s i d a d e é c h a m a d a t u r b i d i m e -
tria. A n á l o g a à espectroscopia de absorção, a t u r b i d e z é d e f i n i d a
como:
dispersa. F o t ô m e t r o s o u e s p e c t r o f o t â m e t r o s são f r e q ü e n t e m e n t e
utilizados c o m o t u r b í d í m e t r o s , u m a vez q u e m e d i d a s t u r b i d i m é -
tricas são f a c i l m e n t e executáveis nesses e q u i p a m e n t o s , exigindo
p o u c a otimização. A p r i n c i p a l p r e o c u p a ç ã o r e l a c i o n a d a às
m e d i d a s t u r b i d i m é t r i c a s é a relação e n t r e o sinal e r u í d o d e
f u n d o . Sistemas f o t o m é t r i c o s c o m r u í d o e l e t r o ó p t i c o n o inter-
valo d e ± 0 , 0 0 0 2 u n i d a d e d e a b s o r v â n c i a o u inferiores são úteis
para m e d i ç õ e s de turbidez.

-bi
Nefelometria
1 = 4< (14) A n e f e l o m e t r i a é d e f i n i d a c o m o a detecção d e energia d a luz
dispersa o u refletida e m direção a u m detector q u e n ã o se e n c o n -
tra n a trajetória direta d a luz t r a n s m i t i d a . N e f e l ô m e t r o s c o m u -
m e n t e m e d e m luz dispersa e m â n g u l o reto e m relação à luz
ou
i n c i d e n t e . A l g u n s n e f e l ô m e t r o s são p r o j e t a d o s p a r a m e d i r a luz
dispersa e m ângulos d i f e r e n t e s de 90°, p a r a aproveitar o a u m e n t o
1, In k
t = — — (15) n a i n t e n s i d a d e p a r a f r e n t e causada pela dispersão d a luz p o r
b i partículas m a i o r e s (p. ex., complexos i m u n e s ) .
84 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
O s f l u o r í m e t r o s são f r e q ü e n t e m e n t e utilizados para executar
medições nefelométricas. N o e n t a n t o , a d e p e n d ê n c i a a n g u l a r da
i n t e n s i d a d e de dispersão r e s u l t o u n a c o n c e p ç ã o d e n e f e l ô m e t r o s
especiais. Nesses dispositivos o d e t e c t o r foto m u l t i p l i c a d o r é colo-
c a d o e m ângulos a d e q u a d o s p a r a o feixe d e luz de excitação. O
p r i n c í p i o de d e s e n h o d e u m n e f e l õ m e t r o é s e m e l h a n t e àquele
aplicado e m f l u o r e s c ê n c i a . A d i f e r e n ç a o p e r a c i o n a l p r i n c i p a l
e n t r e u m f l u o r i m e t r o e u m n e f e l õ m e t r o é q u e os c o m p r i m e n t o s
de o n d a de excitação e detecção t ê m o m e s m o valor n o ú l t i m o .
As principais p r e o c u p a ç õ e s relativas à i n s t r u m e n t a ç ã o d e disper-
são d a luz são (1) a i n t e n s i d a d e d e excitação, (2) o c o m p r i m e n t o
de o n d a , (3) a distância e n t r e o d e t e c t o r e a c u b e t a de a m o s t r a e
(4) a m i n i m i z a ç ã o d a luz parasita externa. C o m o m o s t r a d o n a
Figura 4-18, os c o m p o n e n t e s básicos de u m n e f e l õ m e t r o i n c l u e m
(1) f o n t e de lu2, (2) c o l i m a d o r óptico, (3) célula de a m o s t r a e (4)
sistema óptico, q u e inclui u m d i s p e r s o i óptico, filtro óptico p a i a
o detector e u m detector. O d e s e n h o e s q u e m á t i c o t a m b é m
m o s t r a os diferentes ângulos de feixe de luz i n c i d e n t e , e m q u e o
detector, o filtro e d e m a i s dispositivos ópticos são o r i e n t a d o s para
m e d i r a dispersão d a luz. N a Figura 4-18, a é o a r r a n j o linear d a
t u r b i d i m e t r i a , e n q u a n t o b e c são a r r a n j o s f r e q ü e n t e m e n t e e n c o n -
trados e m n e f e l ô m e t r o s . A disposição d o detector m o s t r a d o n a
Figura 4-18, b se aplica a m e d i d a s d e dispersão para f r e n t e a 30°,
a r r a n j o óptico utilizado e m alguns n e f e l ô m e t r o s comerciais.
E m t e r m o s o p e r a c i o n a i s , os c o m p o n e n t e s ópticos utilizados
e m t u r b i d í m e t r o s e n e f e l ô m e t r o s são s e m e l h a n t e s àqueles utiliza-
d o s e m f l u o r í m e t r o s ou f o t ô m e t r o s . Por exemplo, as fontes lumi-
nosas c o m u m e n t e utilizadas são l â m p a d a s de q u a r t z o h a l o g ê n i o
d e x e n ô n i o e laser. Laser He-Ne, q u e o p e r a m e m 633 n m , t ê m
sido t r a d i c i o n a l m e n t e aplicados e m dispersão d a luz, tais c o m o
i m u n o e n s a i o s n e f e l o m é t r i c o s e d e t e r m i n a ç õ e s de t a m a n h o e
f o r m a de partículas. O raio laser é utilizado e s p e c i f i c a m e n t e e m
alguns n e f e l ô m e t r o s e m f u n ç ã o da elevada i n t e n s i d a d e ; e m
adição, a natureza c o e r e n t e da luz d e Liser é i d e a l m e n t e a d e q u a d a
para aplicações n e f e l o m é t r i c a s . A l é m disso, os f l u o r í m e t r o s d e
(a) = Turbidímetra 0 o
(b) = Nefelâmelro de
dispersão para
frente 30°
(c) = Nefelõmetro 90G
razao d e referência t a m b é m estão b e m a p r o p r i a d o s às m e d i ç õ e s
nefelométricas.
Limitações das Medidas de Dispersão de Luz
O excesso d e a n t í g e n o e efeitos d e matriz são limitações e n c o n -
t r a d a s n a utilização d e t u r b i d í m e t r o s e n e f e l ô m e t r o s nas medi-
ções d e substâncias d e interesse clínico.
Excesso de Antígeno
A s reações antígeno-anticorpo são complexas e r e s u l t a m e m
mistura heterogênea d e t a m a n h o s d e agregados. C o m o a turbidez
a u m e n t a d u r a n t e a adição de a n t i c o r p o s ao a n t í g e n o , o sinal
a u m e n t a para u m valor m á x i m o e depois d i m i n u i . O p o n t o e m
q u e a d i m i n u i ç ã o começa m a r c a o início da fase d e excesso d e
antígeno; este f e n ô m e n o é explicado n o C a p í t u l o 10. C o n s e q ü e n -
t e m e n t e , os m é t o d o s de q u a n t i f i c a ç ã o d e dispersão d e luz e m
reações antígeno-anticorpo f o r n e c e m u m m é t o d o de detecção d e
excesso d e a n t í g e n o . As cinéticas d e f o r m a ç ã o de complexos
i m u n e s m e d i d a s p o r nefelometria ou t u r b i d i m e t r i a são suficien-
t e m e n t e diferentes nas três fases — excesso de a n t i c o r p o , equiva-
lência e excesso d e antígeno — , e algoritmos desenvolvidos e m
c o m p u t a d o r sinalizam o excesso de a n t í g e n o a u t o m a t i c a m e n t e . 1 2
Efeitos de Matriz
Partículas, solvente e todas as m a c r o moléculas d o s o r o d i s p e r s a m
a luz. L i p o p r o t e í n a s e q u i l o m í c r c n s e m s o r o lipêmico f o r n e c e m
os r u í d o s de f u n d o mais i n t e n s o s n a t u r b i d e z o u n e f e l o m e t r i a .
Para diluições a d e q u a d a s , a i n t e n s i d a d e relativa d e dispersão d e
luz e m u m a a m o s t r a lipêmica é i n f e r i o r a d o b r a n c o . N o e n t a n t o ,
e n q u a n t o a c o n c e n t r a ç ã o d o a n t í g e n o n o soro d i m i n u i e, conse-
q ü e n t e m e n t e , amostras m e n o s d i l u í d a s são utilizadas, a interfe-
r ê n c i a d o r u í d o d e f u n d o de u m a a m o s t r a lipêmica torna-se
maior. U m m é t o d o eficaz para m i n i m i z a r este c e n á r i o de inter-
ferência é a utilização d e taxas d e medições, o n d e o b r a n c o inicial
é eliminado.
Figura 4 - 1 8 Diagrama esquemático de
instrumentação da dispersão da luz mostrando a,
posição do dispositivo óptico para turbidimetro; b,
posição do dispositivo óptico para nefelõmetro de
dispersão para trás e c, posição do dispositivo óptico
para nefelõmetro de ângulo reto.

Partículas grandes, c o m o p o e i r a suspensa, t a m b é m c a u s a m
i n t e r f e r ê n c i a significativa n o r u í d o de f u n d o . Esta i n t e r f e r ê n c i a
é c o n t r o l a d a pela filtração prévia de todos os t a m p õ e s e s o r o
diluído.
REFERÊNCIAS
1. Blackburn GF, Shah HP, Kenten JH, Leland ], Kamin RA, Link ], et
al. Electrochemiluminescence development of immunoassays and
DNA probe assays for clinicai diagnostics. Cíin Chem 1991;37:1534-9.
2. DeLuca M, McElroy WD. Bioluminescence and
Chemduminescence, Part B. Methods in Enzymology, vol 133. San
Diego: Academic Press, 1986:1-649.
3. Diamandis E, Christopoiilos TK. Europium cheia te labels in time-
resolved fluorescence immunoassays and DNA hybridization assays.
Anal Chem 1990;62:1149A-57A.
4. Evenson ME Spectrophofcometric techniques In: Burtis CA,
Ashwood ER, eds. Tietz textboolc of clinicai chemistry, 3rd ed.
Philadelphia; WB Saunders Co, 1999-75-93.
5. Gore MG, ed. Spectrophotometry and spectrofluorimetry: a
practical approach, 2nd ed. London: Oxford Univetsity Press,
2000:1-368.
6. Heifçe GM, Vogelstein EE A linear response theory approach to
time-resolved fluorometiy. In: Wehry EL, ed. Modern fluorescence
spectroscopy, vol 4. New York: Plenum Press, 1981:25-50.
Técnicas Ópticas CAPÍTULO 4 85
7. Jolley ME, Stroupe SD, Schwenzer KS, et al. Fluorescence
polarization immunoassay. III. An automated system for therapeutic
drug determination. Clin Chem 1981;27:1575-9.
8. Patrick CW. Clinicai flow cytometry. MLO 2002;34:10-16.
9. Shapiro HM. Piacrical flow cytometry, 4th ed. Hoboken, NJ: John
Wiley Sl Sons, 2003:576 pp.
10. Slavin W. Atomic absorption spectroscopy: The present and future.
Anal Chem 1982;54:685A-94A.
11. Soulcka T, Antonen K, Haima H, Pelkkikangas AM, Huhtinen P,
Lovgren T. Hrghly sensitive immunoassay of free prostate-specific
antigen in serum using europium(III) nanopaiticle label technology.
Clin Chim Acta 2003;328-45-58
12. Steinberg J. A rate nephelometer for measunng specific proteins by
immunoprecipitin reactions. Clin Chem 1977;25:1456-64-
13. Tiffany TO. Fluorometry, nephelometry, and turbidimetry. In:
Burtis CA, Ashwood ER, eds. Tietz textbook of clinicai chemistry,
3rd ed. Philadelphia: WB Saunders Co, 1999:94-112.
14- Vignali DA. Mukiplexed parcicle-based flow cytometric assays. ]
Immunol Methods 2000;243:244-55.
15. Ziegíer MM, Baldwm TO, eds. Bioluminescence and
Chemiliimmescence, Part C Methods in Enzymology, vol 305. San
Diego: Academic Piess, 2000:1-732.
CAPÍTULO O

Eletroquímica e
Sensores Químicos*
Paul DJOrazio, Ph.D., e Mark E. Meyerhoff, Ph.D.

OBJETIVOS C o u l o m e t r i a : U m processo e l e t r o q u í m i c o n o q u a l a
1. Definir eletroquímica e desenhar uma célula eletroquímica. q u a n t i d a d e t o t a l d e eletricidade (ou seja, carga = c o r r e n t e X
2. Definir potencial e descrever o princípio da potenciometria e a sua t e m p o ) necessária p a r a eletrolisar u m a espécie eletroativa
específica é m e d i d a e m soluções s o b agitação e e m
utilização em laboratório.
c o n d i ç õ e s de p o t e n c i a l c o n t r o l a d o ou c o r r e n t e c o n s t a n t e .
3. Listar quatro tipos de eletrodos potenciométricos disponíveis para a
E l e t r o d o : U m c o n d u t o r através d o q u a l a c o r r e n t e elétrica
utilização laboratorial.
e n t r a o u sai de u m a região n ã o metálica de u m circuito. O s
4. Descrever os princípios de amperometria e coulometria e listar as
eletrodos i n d i c a d o r , de t r a b a l h o e d e referência são
utilizações de cada técnica em laboratório clínico.
utilizados c o m p r o p ó s i t o s eletroanalíticos. U m e l e t r o d o
5. Definir biossensor e fornecer exemplos de biossensores
i n d i c a d o r , utilizado e m p o t e n c i o m e t r i a , p r o d u z u m
configurados para a utilização clínica. p o t e n c i a l representativo d a espécie a ser m e d i d a . U m
6. Definir optodo e fornecer exemplas de optodos configurados para a e l e t r o d o d e t r a b a l h o é utilizado e m células eletrolíticas o n d e
utilização clínica. o c o r r e a reação d e interesse. U m eletrodo de referência,
o n d e n ã o é p e r m i t i d o u m f l u x o apreciável de c o r r e n t e , é
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES utilizado p a r a observar o u c o n t r o l a r o p o t e n c i a l dos
eletrodos i n d i c a d o r ou d e t r a b a l h o , respectivamente. E m
A m p e r o m e t r i a : U m processo e l e t r o q u í m i c a e m q u e a c o r r e n t e
certos tipos d e células, u m e l e t r o d o c o n t a d o r o u auxiliar é
é d e t e r m i n a d a e m d i f e r e n ç a d e p o t e n c i a l fixo ( c o n t r o l a d o )
utilizado para t r a n s p o r t a r a c o r r e n t e q u e passa através d o
e n t r e os e le tr o d o s d e t r a b a l h o e d e referência e m u m a
e l e t r o d o d e trabalho.
célula e l e t r o q u i m i c a .
Eletrodo de M e m b r a n a de V i d r o : U m eletrodo contendo u m a
Biossensor: U m tipo especial d e sensor, n o qual u m
fina m e m b r a n a de vidro (geralmente em forma de u m
c o m p o n e n t e b i o l ó g i c o / b i o q u í m i c o , capaz d e interagir c o m o
b u l b o n o f i n a l d e u m t u b o d e vidro) c o m o e l e m e n t o
analito e p r o d u z i r u m sinal p r o p o r c i o n a l à c o n c e n t r a ç ã o d o
sensor. É a m p l a m e n t e utilizado c o m o e l e t r o d o d e p H , m a s
analito, é imobilizado n a superfície d o eletrodo, ou e m
algumas c o m p o s i ç õ e s de v i d r o são sensíveis a c o n c e n t r a ç õ e s
p r o x i m i d a d e a ela. A interação entre o b i o c o m p o n e n t e e o
de cátions, c o m o o s ó d i o .
analito é u m a reação b i o q u í m i c a (p. ex., enzimas) ou u m
E l e t r o d o s Seletivos d e í o n s (ISEs): U m tipo de e l e t r o d o
processo de ligação (p. ex., anticorpos), que é p e r c e b i d o pelo
p o t e n c i o m é t r i c o c o m f i n a l i d a d e s especiais, c o n s t i t u í d o de
t r a n s d u t o r eletioquímico.
u m a m e m b r a n a seletivamente permeável a u m a única
C é l u l a E l e t r o q u í m i c a : U m dispositivo e l e t r o q u í m i c o q u e
espécie iônica. O p o t e n c i a l p r o d u z i d o n a i n t e r f a c e e n t r e a
p r o d u z u m a força eletromotiva. C é l u l a s galvânicas e
m e m b r a n a e a solução de a m o s t r a é p r o p o r c i o n a l ao
eletrolíticas s ã o classes d e células e l e t r o q u í m i c a s .
l o g a r i t m o d a c o n c e n t r a ç ã o o u atividade iônica.
C é l u l a E l e t r o q u í m i c a E l e t r o l í t k a : U m t i p o d e célula
Equação de N e r n s t : Equação n o m e a d a em h o m e n a g e m a
e l e t r o q u í m i c a e m q u e o c o r r e m reações q u í m i c a s pela
W a l t h e r H . N e r n s t , q u e c o r r e l a c i o n o u energia q u í m i c a e
aplicação de u m a diferença de p o t e n c i a l e x t e r n o . Este t i p o
p o t e n c i a l elétrico de u m a célula o u p i l h a galvânica.
d e célula f o r m a a base p a r a técnicas eletroanalíticas
O p t o d o : O o p t o d o é u m sensor óptico que mede opticamente
amperométricas, condutimétricas, coulométricas e
substâncias específicas, c o m o p H , gases sanguíneos e eletrólitos.
voltamétricas.
P o t e n c i o m e t r i a : U m processo e l e t r o q u í m i c o n o q u a l a
C é l u l a E l e t r o q u í m i c a G a l v â n i c a : U m t i p o d e célula
diferença d e p o t e n c i a l e n t r e u m e l e t r o d o i n d i c a d o r e u m
eletroquímica que opera espontaneamente e produz u m a
e l e t r o d o d e referência (ou s e g u n d o e l e t r o d o i n d i c a d o r ) é
d i f e r e n ç a de p o t e n c i a l {força eletromotiva) pela conversão
medida e n q u a n t o não é permitido fluxo de corrente na
d e energia q u í m i c a e m elétrica. Estas células f o r m a m a base
célula eletroquímica.
para técnicas eletroanalíticas p o t e n c i o m é t r i c a s .
V o l t a m e t r i a : U m processo e l e t r o q u í m i c o q u e envolve a m e d i d a
C o n d u t o m e t r i a : U m processo e l e t r o q u í m i c o utilizado p a r a
d e c o r r e n t e d a célula c o m o u m a f u n ç ã o de potenci al ,
m e d i r a c a p a c i d a d e d e u m a solução d e eletrólito e m
q u a n d o o p o t e n c i a l d o e l e t r o d o d e t r a b a l h o versus o
t r a n s p o r t a r u m a c o r r e n t e elétrica pela migração de í o n s e m
e l e t r o d o de referência varia e m f u n ç ã o d o t e m p o .
u m g r a d i e n t e de c a m p o potencial. U m p o t e n c i a l a l t e r n a d o é

aplicado e n t r e dois eletrodos e m u m a célula d e d i m e n s õ e s
definidas.
*Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições prévias dos Drs. Richard
A. Dutst e Ole Siggard-Andersen, nas quais se baseiam partes deste capítulo.
D
iversos m é t o d o s analíticos utilizados n o l a b o r a t ó r i o
clínico baseiam-se e m m e d i d a s eletroquímicas. N e s t e
capítulo, os princípios e l e t r o q u í m i c o s f u n d a m e n t a i s d e
(1) p o t e n c i o m e t r i a , (2) v o l t a m e t r i a / a m p e r o m e t r i a , (3) c o n d u t o -
metria e (4) c o u l o m e t r i a s e r ã o r e s u m i d o s , e as aplicações clínicas,
apresentadas. O p t o d o s e b i o s s e n s o r e s t a m b é m são discutidos.

87
88 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
POTENCIOMETRIA
Sensores p o t e n c i o métricos são a m p l a m e n t e utilizados n a clínica
p a r a m e d i r p H , P C 0 2 e eletrólitos (Na*, K \ C l , Ca 2 ", Mg 2 * e Li+)
e m s a n g u e total, soro, p l a s m a e u r i n a e c o m o t r a n s d u t o r e s para
o d e s e n v o l v i m e n t o de biossensores d e metabólitos de interesse
clínico.
Conceitos Básicos
P o t e n c i o m e t r i a é a m e d i d a de d i f e r e n ç a d e p o t e n c i a l elétrico
e n t r e dois eletrodos (semicélulas), e m u m a célula e l e t r o q u í m i c a
(Figura 5 4 ) . Este t i p o de célula e l e t r o q u í m i c a galvânica consiste
e m dois eletrodos (elétron o u c o n d u t o r e s metálicos), q u e estão
c o n e c t a d o s p o r u m a s o l u ç ã o eletrolítica q u e c o n d u z íons. U m
eletrodo, o u semicélula, consiste e m u m ú n i c o c o n d u t o r metálico,
q u e está e m c o n t a t o c o m u m a solução d e eletrólito. O s c o n d u -
tores d e í o n consistem e m u m a o u mais fases q u e estão e m
c o n t a t o direto u n s c o m os o u t r o s o u separados p o r m e m b r a n a s
permeáveis u n i c a m e n t e a ânions o u cátions específicos (Figura 5 -1).
U m a das soluções d e eletrólito é a a m o s t r a c o n t e n d o o(s) analito
(s) a ser medido(s). Esta s o l u ç ã o p o d e ser substituída p o r u m a
solução de referência a d e q u a d a p a r a f i n s d e calibração. Por con-
venção, a n o t a ç ã o d e célula é m o s t r a d a de m a n e i r a q u e o eletrodo
e s q u e r d o ( M j é o e l e t r o d o d e referência; o eletrodo direito (M R )
é o eletrodo indicador (medida) (ver mais a d i a n t e a e q u a ç ã o 3). 3
A força eleiromotiva (E o u EMF) é d e f i n i d a c o m o a diferença
m á x i m a de potencial entre dois eletrodos (direito m e n o s esquerdo),
o b t i d a q u a n d o a corrente d a célula é zero. O potencial da célula
é m e d i d o através de potenciómetros, d e n t r e os quais o p H m e t r o
c o m u m é u m t i p o especial. O potenciâmetro de leitura direta é u m
voltímetro q u e m e d e o potencial através da célula (entre os dois
eletrodos); e n t r e t a n t o , para a o b t e n ç ã o d e u m a m e d i d a exata d o
potencial é necessário q u e o f l u x o de c o r r e n t e através da célula
seja zero. Isso é realizado pela i n c o r p o r a ç ã o d e u m a alta resistên-
cia ao voltímetro (impedância d e e n t r a d a > IO12 £2). O s potenció-
metros d e leitura direta m o d e r n o s são acurados e f o r a m modifi-
cados para exibir imagem digital direta o u impressas.
D e n t r o de q u a l q u e r fase c o n d u t o r a , d e s d e q u e o f l u x o d e
c o r r e n t e seja zero, o p o t e n c i a l é c o n s t a n t e . N o e n t a n t o , u m a
diferença de potencial surge entre d u a s fases distintas e m c o n t a t o
u m a c o m a o u t r a . O p o t e n c i a l global de u m a célula e l e t r o q u í m i c a
é a s o m a d e todas as diferenças d e p o t e n c i a l existentes e n t r e as
fases adjacentes da célula. E n t r e t a n t o , o potencial de u m ú n i c o
eletrodo, c o m relação ao eletrólito c i r c u n d a n t e e a m a g n i t u d e
Voltímetro de alta
impedância de entrada
Ag/Ag Cl
Ag/AgCI
Eletrólito
interno
Membrana
seletiva para íon
Figura 5 - 1 Diagrama de eletrodo de membrana seletiva para Ion
baseado em célula potenciomctrica.
absoluta d o s g r a d i e n t e s d e p o t e n c i a l individuais e n t r e as fases, é
d e s c o n h e c i d o e n ã o p o d e ser m e d i d o . A p e n a s as diferenças de
potencial e n t r e dois eletrodos (semicélulas) são m e d i d a s . O s gra-
d i e n t e s d e p o t e n c i a l f o r a m classificados c o m o (1) potenciais d e
redox, (2) potenciais de m e m b r a n a o u (3) potenciais de d i f u s ã o .
G e r a l m e n t e , é possível c o n c e b e r u m a célula d e tal f o r m a q u e
todos os gradientes d e potencial, exceto u m , sejam c o n s t a n t e s .
Esse p o t e n c i a l é e n t ã o r e l a c i o n a d o c o m a atividade d e u m deter-
m i n a d o í o n d e interesse (p. ex., H* o u Na*).
Tipos de Eletrodos
M u i t o s t i p o s diferentes d e eletrodos p o t e n c i o m é t r i c o s são utili-
zados e m aplicações clínicas. Esses i n c l u e m (1) redox, (2) m e m -
b r a n a seletiva paTa í o n (vidro e polímero) e (3) eletrodos d e
PC02.
Eletrodos Redox
Potenciais redox são os resultados d o equilíbrio q u í m i c o envol-
v e n d o reações d e transferência d e elétrons:
F o r m a oxidada (Ox) + n e F o r m a Reduzida (Red) (1)
o n d e n r e p r e s e n t a o n ú m e r o d e elétrons envolvidos na reação.
Q u a l q u e r substância q u e aceita elétrons é oxidante (Ox) e qual-
q u e r substância q u e d o a elétrons é redutora (Red). As d u a s formas,
O x e Red, r e p r e s e n t a m u m p a r redox (par c o n j u g a d o d e redox).
N o r m a l m e n t e , processos d e iedox h o m o g ê n e o s a c o n t e c e m
apenas e n t r e dois pares redox. Nesses casos, os elétrons são trans-
feridos d e u m r e d u t o r (Redi) para u m o x i d a n t e (OX 2 ). N e s t e
processo, R e d i é o x i d a d o p a r a o c o n j u g a d o c o r r e s p o n d e n t e Ox!,
e n q u a n t o OX 2 é r e d u z i d o para R e d i :
Red] + 0 x 2 <—-> O x , + R e d 2 (2)
E m u m a célula eletroquímica, elétrons p o d e m ser aceitos a p a r t i r
de, o u d o a d o s a u m c o n d u t o r metálico i n e r t e (p. ex., platina).
U m processo d e r e d u ç ã o t e n d e a carregar o e l e t r o d o positiva-
m e n t e (remover elétrons) e u m processo d e oxidação t e n d e a
carregar o eletrodo n e g a t i v a m e n t e (adicionar elétrons). Por con-
venção, u m equilíbrio r e d o x h e t e r o g ê n e o (equação 2) é represen-
t a d o pela célula:
ML| R e d , — 0 x ^ : 0 x 2 - R e d 2 | M, (3)
U m p o t e n c i a l positivo (E > 0) para esta célula significa que a
reação da célula a c o n t e c e e s p o n t a n e a m e n t e da e s q u e r d a p a r a a
direita; E < 0 significa q u e a reação p r o c e d e da direita para a
esquerda, e E = 0 indica q u e os dois pares Tedox estão e m equi-
líbrio m ú t u o .
O potencial do eletrodo (potencial de redução) para u m p a r
r e d o x é d e f i n i d o c o m o o p o t e n c i a l d o par m e d i d o e m relação ao
eletrodo-padrão de h i d r o g ê n i o , q u e é a j u s t a d o p a r a zero (ver
eletrodo d e h i d r o g ê n i o p o s t e r i o r m e n t e ) . Este potencial, p o r con-
venção, é a força eletromotiva de u m a célula, o n d e o eletrodo-
p a d r ã o d e h i d r o g ê n i o é o e l e t r o d o de referência (eletrodo
esquerdo) e u m a dada semicélula é o eletrodo i n d i c a d o r (eletrodo
direito). O p o t e n c i a l d e r e d u ç ã o de u m d e t e r m i n a d o par redox
é d a d o pela e q u a ç ã o d e N e r n s t :
 Eletroquímica e S e n s o r e s Químicos CAPÍTULO 5 89

3 0 , 0 5 9 2 V
Eletrodos de Metal que Participam em Reações Redox
E = E -—x l o g ^ - = E°- x l o g ^ - Í4)
O e l e t r o d o de cloreto prata-prata é u m exemplo de e l e t r o d o d e
» «:>, » «o*
m e t a l d o s e g u n d o t i p o q u e p a r t i c i p a c o m o m e m b r o de u m par
Tedox. O e l e t r o d o d e cloreto prata-prata é c o n s t i t u í d o p o r u m fio
onde
de p r a t a ou haste revestida c o m AgCI(6Ó],a0), q u e está i m e r s o e m
E = p o t e n c i a l d o e l e t r o d o da sernicélula
u m a s o l u ç ã o de cloreto d e atividade c o n s t a n t e ; isso d e f i n e o
E° = potencial d o eletrodo-padrão q u a n d o a^d/aox = 1
p o t e n c i a l da sernicélula. O e l e t r o d o d e A g / A g C l é, p o r si só,
n = n ú m e r o d e elétrons envolvidos na reação de r e d u ç ã o
c o n s i d e r a d o u m eletrodo p o t e n c i o m é t r i c o p o r q u e o p o t e n c i a l d e
N = (R x T x l n 1 0 ) / F (fator d e N e r n s t , se n = 1)
f r o n t e i r a d e fase é g o v e r n a d o p o r u m a reação d e equilíbrio d e
N = 0 , 0 5 9 2 V, se T = 2 9 8 , 1 5 K (25 °C)
t r a n s f e r ê n c i a de elétrons p o r oxidação-redução q u e o c o r r e na
N - 0,0615 V, se T = 310,15 K (37 °C)
s u p e r f í c i e da p r a t a :
R = c o n s t a n t e d o s gases (= 8,31431 Joules X K 1 x mol" 1 )
T = t e m p e r a t u r a a b s o l u t a ( u n i d a d e : K, Kelvin)
A g C Í(5(lii[íj + e < > A g(soM) + C í (8)
F = c o n s t a n t e d e Faraday (= 9 6 . 4 8 7 C o u l o m b s X mol' 1 )
ln 10 = l o g a r i t m o n a t u r a l d e 10 = 2 , 3 0 3
a = atividade A e q u a ç a o de N e r n s t para o p o t e n c i a l de sernicélula de r e f e r ê n c i a
ü RejJ /«q, = p r o d u t o d e ação das massas p a t a a reação de r e d u ç ã o e m u m e l e t r o d o de referência de A g / A g C l t a m b é m é escrito
como;
O s eletrodos d e r e d o x e m utilização a t u a l m e n t e são (1) eletrodos
metálicos inertes i m e r s o s e m soluções c o n t e n d o pares r e d o x ou
RT MgCI
(2) eletrodos metálicos cujos metais f u n c i o n a m c o m o m e m b r o =
E w i ^Ag/AgCl + ~ r T X
(9)
d o par redox. nr a .«ac. r

Eletrodos de Metais Inertes D e s d e que A g C l e A g são a m b o s sólidos, as atividades desses

Platina e ouro são e x e m p l o s de m e t a i s inertes utilizados para
registrar o p o t e n c i a l r e d o x de u m par r e d o x dissolvido n u m a
solução eletrolítica. O eletrodo de hidrogênio é u m e l e t r o d o r e d o x
especial p a r a m e d i r p H . Esse consiste e m u m eletrodo d e platina
o u o u r o revestido e l e t r o l i t i c a m e n t e (platinizado) c o m platina alta-
m e n t e p o r o s a (platina preta) para catalisar a reação eletrodo.
H + + e <- -»^H2
O potencial d e e l e t r o d o é d a d o p o r
1/2
Í/H,)
E = E ° - N xlog
ou
E= F-NxllogtiJ^-loga ] (7)
onde
E° = 0 e m t o d a s as t e m p e r a t u r a s (por convenção)
Íhz = f u g a c i d a d e d o gás h i d r o g ê n i o
ÍÍH-t = atividade d o s íons h i d r o g ê n i o
- log = log negativo da atividade ET (f«zH+ o u p H )
Q u a n d o a pressão parcial de h i d r o g ê n i o (PH 2 ) da solução (e,
c o n s e q ü e n t e m e n t e , fn2) é m a n t i d a c o n s t a n t e , p e l o b o r b u l h a -
m e n t o d e h i d r o g ê n i o n a solução, o p o t e n c i a l é u m a f u n ç ã o linear
d o log flH+, q u e é e q u i v a l e n t e a o p H da solução. E m u m eletrodo-
padrão de hidrogênio (SHE), o eletrólito consiste e m solução aquosa
de cloreto de h i d r o g ê n i o c o m u m a aHci igual a 1,000 (ou CHa =
1,2 m o l / L ) , e m e q u i l í b r i o c o m u m a fase gasosa e c o m igual a
1,000 (ou PH 2 = 101,3 k P a = 1 atm). U m S H E t a m b é m é utilizado
c o m o e l e t r o d o de referência.
são iguais à u n i d a d e (fl/^ci = a°Ai, = 1). P o r t a n t o , a p a r t i r d e
e q u a ç ã o 9 o potencial d e sernicélula é c o n t r o l a d o pela atividade
d o í o n cloreto n a solução ( a ^ ) e m c o n t a t o c o m o e l e t r o d o .
O e l e t r o d o d e A g / A g C l é utilizado t a n t o c o m o u m e l e m e n t o
d e r e f e r ê n c i a i n t e r n a e m eletrodos p o t e n c i o m é t r i c o s específicos
para í o n s (ISEs) q u a n t o u m a sernicélula externa d e e l e t r o d o d e
referência com p o t e n c i a l c o n s t a n t e , necessário p a r a c o m p l e t a r
u m a célula p o t e n c i o m é t r i c a (Figura 5-1). E m a m b o s os casos, o
(5) e l e t r o d o de A g / A g C l deve estar e m equilíbrio c o m u m a s o l u ç ã o
c o m atividade d o í o n cloreto c o n s t a n t e .
O e l e m e n t o A g / A g C l da sernicélula externa d o e l e t r o d o d e
referência está e m c o n t a t o c o m u m a solução a l t a m e n t e c o n c e n -
t r a d a d e u m sal de cloreto solúvel. C l o r e t o d e potássio s a t u r a d o
é c o m u m e n t e utilizado. U m a m e m b r a n a porosa o u frita é fre-
q ü e n t e m e n t e utilizada p a r a separar KC1 c o n c e n t r a d o da s o l u ç ã o
de a m o s t r a . A frita serve t a n t o c o m o u m a barreira física p a i a
(6)
m a n t e r a concentração d o eletrólito n o interior d o eletrodo q u a n t o
u m a barreira de d i f u s ã o para prevenir o contato de proteínas e d e
outras espécies da amostra c o m o e l e m e n t o A g / A g C l i n t e r n o , q u e
p o d e r i a m c o r r o m p e r e alterar o potencial desse último. A interface
entre dois eletrólitos diferentes (KC1 c o n c e n t r a d o / c a l i b r a d o r ou
amostra) ocorre d e n t r o da frita e Tesulfca n o potencial d e j u n ç ã o
líquido-líquido (Ej), u m a f o n t e d e erro e m medidas potenciométri-
cas. A diferença d e potencial d e j u n ç ã o líquido-líquido e n t r e u m
calibrador e u m a amostra (potencial d e junção líquida residual), é
responsável p o r esse erro, que é m i n i m i z a d o e geralmente negli-
genciado na prática se as composições das soluções de calibração
apresentam composição o mais p r ó x i m a possível da amostra, com
respeito ao c o n t e ú d o iônico e à força iônica. E m adição, u m ele-
trólito equitransferente* c o m c o n c e n t r a ç ã o tão elevada q u a n t o a
c o n c e n t r a ç ã o d o eletrólito de referência contribui para m i n i m i z a r
o potencial de junção líquida residual. O cloreto de potássio n u m a
c o n c e n t r a ç ã o > 2 m o l / L é mais a p r o p r i a d o .
A presença d e eritrócitos n a a m o s t r a t a m b é m p o d e afetar a
m a g n i t u d e d e p o t e n c i a l d e j u n ç ã o d e líquida residual de m a n e i r a
m e n o s previsível. Por exemplo, estima-se q u e eritrócitos e m
h e m a t ó c r i t o n o r m a l p r o d u z e m cerca d e 1,8 m m o l / L d e erro
*Uma solução é equitransferente se os íons têm a mesma mobilidade.
* Matéria-prima utilizada na fabricação da porcelana.
90 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
positivo na m e d i d a d e s ó d i o p o r ISEs, q u a n d o é utilizada u m a
j u n ç ã o líquido-líquido aberta, irrestrita. 5 Esta t e n d ê n c i a p o d e sei
minimizada se u m a m e m b r a n a restritiva o u frita é utilizada para
m o d i f i c a r a j u n ç ã o líquido-líquido.
O eletrodo de cflíomelano consiste em m e r c ú r i o c o b e r t o p o r
u m a c a m a d a de c a l o m e l a n o (Hg 2 CI z ), q u e está em c o n t a t o c o m
u m a solução de eletrólito c o n t e n d o Cl~. Eletrodos d e c a l o m e l a n o
são f r e q ü e n t e m e n t e utilizados c o m o e l e t r o d o d e referências para
m e d i d a s d e p H utilizando eletrodos d e vidro.
Eletrodos Seietivos para íons
O s potenciais d e m e m b r a n a são gerados pela p e r m e a b i l i d a d e de
certos tip os d e m e m b r a n a s a â n i o n s o u cátions selecionados.
Essas m e m b r a n a s são utilizadas p a r a fabricar eletrodos seletivos
p a r a íons (ISEs), q u e seletivamente interagem c o m u m a única
espécie iônica. O potencial p r o d u z i d o na interface da solução
m e m b r a n a - a m o s t r a é p r o p o r c i o n a l ao l o g a r i t m o da atividade
iônica ou c o n c e n t r a ç ã o d o íon e m questão. M e d i d a s c o m ISEs
são simples, m u i t a s vezes rápidas, n ã o destrutivas e aplicáveis a
u m a vasta gama de concentrações.
A m e m b r a n a seletiva para íon é o "coração" d e u m ISE, u m a
vez q u e c o n t r o l a a seletividade d o eletrodo. As m e m b r a n a s sele-
tivas p a r a íons t i p i c a m e n t e consistem e m material d e vidro, cris-
talino o u p o l i m é r i c o . A c o m p o s i ç ã o q u í m i c a da m e m b r a n a é
c o n c e b i d a p a r a alcançai u m a ó t i m a q u a l i d a d e d e p e r m e a b i l i d a d e
seletiva p a r a u m íon d e interesse. N a prática, o u t r o s íons e x i b e m
interações l i m i t a d a s c o m as faces da m e m b r a n a e ÍTão a p r e s e n t a r
u m certo grau d e interferência p a r a a d e t e r m i n a ç ã o de u m íon.
N a prática clínica, se a interferência excede u m valor aceitável,
u m a correção é necessária.
A e q u a ç ã o d e Nicolsky-Eisenman descreve a seletividade de
u m ISE para u m íon d e interesse e m d e t r i m e n t o de íons interfe-
rentes:
E = p + (2!3TORT ) l o g ( a + ^. (10)
onde
a, = atividade d o í o n d e interesse
a] = atividade d o í o n d e interferência
Kj/j = coeficiente de seletividade para o í o n p r i m á r i o sobre o íon
de interferência. Valores baixos i n d i c a m b o a seletividade
para o a n a l i t o "i" sobre a interferência d o íon "j".
Zj = carga d o í o n p r i m á r i o
Zj = carga d o í o n de interferência
T o d o s os d e m a i s t e r m o s são idênticos aos da e q u a ç ã o N e r n s t
(equação 4).
Eletrodos d e m e m b r a n a de v i d r o e de p o l í m e r o s São dois
tipos d e ISEs, q u e são c o m u m e n t e utilizados e m aplicações de
q u í m i c a clínica.
0 Eletrodo de Vidro
E l e t r o d o s d e m e m b r a n a d e v i d r o são utilizados p a r a m e d i r p H
e Na + , e t a m b é m c o m o t r a n s d u t o r i n t e r n o p a r a sensores de PCO2.
A resposta d e 1HT à m e m b r a n a f i n a d e vidro foi d e m o n s t r a d a pela
p r i m e i r a vez e m 1906 p o r C r e m e r . N a década de 1930, a aplica-
ção prática deste f e n ô m e n o p a r a m e d i r acidez e m s u m o d e limão
tornou-se possível graças à invenção d o p H m e t r o p o r A r n o l d
B e c k m a n . 3 As m e m b r a n a s de vidro para eletrodos são f o r m u l a d a s
a partir d e óxidos d e silício e / o u a l u m í n i o f u n d i d o s , m i s t u r a d o s
c o m óxidos de alcalino terrosos o u cátions de metais alcalinos.
V a r i a n d o a c o m p o s i ç ã o de vidro, eletrodos seletivos p a r a H + , Na 1 ,
K \ L f , Rb*, C s \ A g ' , T T e N H 4 + f o r a m p r o d u z i d o s . N o e n t a n t o ,
eletrodos de vidro p a r a H + e Na + são h n j e os ú n i c o s tipos q u e
a p r e s e n t a m seletividade suficiente p a r a evitai interferência d e
o u t r o s íons e p e r m i t i r a aplicação prática e m q u í m i c a clínica.
U m a f o r m u l a ç ã o típica d e vidro seletiva p a r a bT é: 7 2 % S i 0 2 ;
2 2 % N a 2 0 ; 6 % C a O , q u e tem u m a o r d e m de seletividade H*
» > Na*> IO. Esta m e m b r a n a de vidro t e m seletividade suficiente
para H + s o b r e o Na + , p e r m i t i n d o m e d i d a s d e p H n o intervalo de
7,0 a 8,0 ([H + ] = IO"7 a IO"8 m o l / L ) n a p r e s e n ç a d e > 0,l m o l / L
d e Na +1 livres d e erro. A l t e r a n d o ligeiramente a f o r m u l a ç ã o da
m e m b r a n a de vidro para: 71% S i 0 2 ; 11% N a 2 0 ; 18% Á l z 0 3 a
o r d e m de seletividade torna-se H + > Na + > K + e a preferência d a
m e m b r a n a d e vidro p a r a H + sobre o Na + é r e d u z i d a g r a n d e m e n t e ,
r e s u l t a n d o e m u m sensor p r á t i c o p a r a N a + e m valores de p H
t i p i c a m e n t e e n c o n t r a d o s n o sangue.
Eletrodos de Membranas Pcliméricas
ISEs c o m m e m b r a n a s poliméricas são e m p r e g a d o s para o acom-
p a n h a m e n t o de p H e medir eletrólitos, i n c l u i n d o K \ Na + , C l ,
Ca 2 + , Li+, M g 2 ' e C 0 3 z " (para m e d i r C 0 2 total). Esses são a classe
p r e d o m i n a n t e d e eletrodos p o t e n c i o m é t r i c o s utilizada n o s instru-
m e n t o s m o d e r n o s d e análises clínicas.
O m e c a n i s m o de resposta destes ISEs divide-se e m três cate-
gorias: (1) p e r m u t a d o r de í o n dissociado, carregado; (2) carreador
associado carregado e (3) carreador de í o n n e u t r o (ionóforo). U m
dos p r i m e i r a s tipos d e ISE p e r m u t a d o r d e íons associados carre-
gados p a r a Ca z + foi desenvolvido e comercializado para a aplica-
ção clínica na d é c a d a d e 1960. Este e l e t r o d o foi b a s e a d o nas
p r o p r i e d a d e s d e c o m p l e x a ç ã o / t r o c a seletiva d e íon Ca 2 + d o ácido
fosfórico 2-etil-hexil dissolvido e m dioctil fenil f o s f o n a t o (carrea-
d o r associado carregado). U m a m e m b r a n a p o r o s a foi i m p r e g n a d a
c o m esta solução e m o n t a d a n a e x t r e m i d a d e d o c o r p o d e u m
eletrodo. Este t i p o d e sensor foi designado ISE d e " m e m b r a n a
líquida". Mais tarde foi c o n c e b i d o u m m é t o d o o n d e estes ingre-
dientes f o r a m m o n t a d o s em u m a m e m b r a n a d e poli (cloreto de
vinilo) (PVC) q u e era mais resistente e c o n v e n i e n t e p a r a ser uti-
lizado que o antecessor u m e d e c i d o c o m l í q u i d o . Esta m e s m a
a b o r d a g e m é utilizada ainda h o j e para f o r m u l a r ISEs baseados
e m P V C , p a r a utilização clínica.
U m grande avanço n o desenvolvimento e aplicação rotineira
de ISEs d o tipo P V C foi a descoberta da possibilidade de incorpo-
ração d o antibiótico n e u t r o valinomicina e m m e m b r a n a s orgânicas
líquidas (e mais tarde m e m b r a n a s d e P V C plastificadas), resul-
t a n d o em u m sensor com alta seletividade p a r a IC sobre o Na +
( K ^ a = 2,5 X IO4).17 O ISE de K + b a s e a d o em valinomicina é
a m p l a m e n t e utilizado hoje para a medir r o t i n e i r a m e n t e K+ n o
sangue. U m a faixa linear vasta sobre três o r d e n s de m a g n i t u d e
t o m a este ISE a d e q u a d o para medir K+ n o sangue e na urina. A
faixa d e K + n o sangue é apenas u m a p e q u e n a p a r t e da faixa linear
d o eletrodo e é atravessada por u m a E M F total de cerca de 9 mV.
Interferência de outros cátions, interpretada c o m o desvio de line-
aridade, n ã o é perceptível para atividades d e IC > 10^ m o l / L .
O u t r o s ISEs m e n o s seletivos, baseados e m polímeros (p. ex., para
medir Mg 2 * e Li+), estão sujeitos a interferências d e C a 3 i / N a * eNa*,
respectivamente, exigindo d e t e r m i n a ç ã o s i m u l t â n e a e correção da
presença de concentrações significativas d e íons interferentes.
E s t u d o s envolvendo a relação e n t r e a e s t r u t u r a m o l e c u l a r e a
seletividade iônica, r e s u l t a r a m n o d e s e n v o l v i m e n t o de ISEs base-
ados e m p o l í m e r o s utilizando u m g r a n d e n ú m e r o d e i o n ó f o r o s
d e ocorrência n a t u r a l e sintéticos, c o m seletividade suficiente
p a r a aplicação e m análises clínicas. As e s t r u t u r a s químicas de
diversos destes i o n ó f o r o s n e u t r o s estão ilusrradas n a Figura 5-2.
 Eletroquímica e Sensores Químicos CAPÍTULO 5 91

v W , Tridodecilamina: H+
X
ortí'
w

y u Juuu^
o. R O

* | ^
N
H^ N^° C
o—/ \—CH-
1 o o
v ° o i V ii,c O
( o. ,L, , .o. y
A V I Y1 Yo Y T Y~\
e r '•——
Noacetina: NH„+
3
1

Valinomicina: K"

H
Ha S
r \ / V U V J ^ Z J V^cii
H3C N
r ° H3C-0 "X-Ô
\
H —("^
> .'II Oll OH
11,r / VH* Mfitilmonenslrifl: Na"
.N.. yv
V-®»
o
o.

T
JNL
o
ETH 227: Na*

<r

" v ' °
Di(benzo-15-coroa-5)-heptanoatQ): K"
.N.
ETH 1117: Mg"
XX y

O W
-o o—s o Y"
o
>\ t
/ Figura 5 - 2 Estruturas de ionóforos

x > O 2
1 comuns utilizados para fabricai
membrana do tipo polimérica de ISEs
ETH 157; Na' ETH 1001: Ca" paia análise clínica.

Eletrodos baseados e m p e r m u t a d o r e s d e â n i o n s dissociados a amostras q u e n ã o c o n t e n h a m c o n c e n t r a ç õ e s significativas d e

e m p r e g a n d o sais de a m ó n i o q u a t e r n á r i o lipofílicos c o m o c o m p o -
n e n t e s ativos de m e m b i a n a a i n d a são utilizados c o m e r c i a l m e n t e
para a d e t e i m i n a ç ã o d e Cl" n o s a n g u e total, s o t o e plasma, apesar
de algumas limitações. A seletividade para este tipo de ISE é
c o n t r o l a d a pela extração d e íons da fase orgânica d a m e m b r a n a e
é u m a f u n ç ã o d o caráter lipofílico d o í o n (porque, ao c o n t r á r i o
d o s carreadores desciitos a n t e r i o r m e n t e , n ã o existe i n t e i a ç ã o
direta e n t r e o sítio p e r m u t a d o r e o â n i o n n a fase de m e m b r a n a ) .
Assim, a o r d e m d e seletividade de u m ISE de Cl" b a s e a d o e m
p e r m u t a d o r de â n i o n s é fixada e m R > CIO4 > T > N 0 3 ' > Bf >
Cl" > F , o n d e R' r e p r e s e n t a â n i o n s mais lipofílicos q u e C10 4 *. A
aplicação d o e l e t r o d o p e r m u t a d o r de íon Cl' é, p o r t a n t o , limitada
íons mais lipofílicos q u e Cl'. A m o s t r a s de sangue c o n t e n d o salici-
lato o u tiocianato, p o r exemplo, levarão à i n t e i f e i ê n c i a positiva
n a m e d i d a de Cl'. A exposição r e p e t i d a d o eletrodo ao anticoagu-
l a n t e h e p a r i n a conduzirá à p e r d a d e sensibilidade d o eletrodo ao
Cl', e m v i r t u d e da extração da h e p a r i n a carregada n e g a t i v a m e n t e
n o interior da m e m b r a n a . N a verdade, este processo de extração
foi utilizado c o m sucesso para elaborar u m m é t o d o d e detecção
p o r p o t e n c i o m e t r i a d e c o n c e n t r a ç õ e s d e h e p a r i n a n o sangue.
A elevada seletividade p a r a â n i o n s c a r b o n a t o foi alcançada
utilizando-se c o m o c a r r e a d o r u m i o n ó f o r o n e u t r o a p r e s e n t a n d o
g r u p o s t r i f l u o r o a c e t o f e n o n a ligados e m u m a m e m b r a n a pol i m é-
rica. 10 Tais i o n ó f o r o s f o r m a m a d u t o s carregados n e g a t i v a m e n t e
92 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

c o m â n i o n s c a r b o n a t o , e os eletrodos resultantes são úteis e m
i n s t r u m e n t o s disponíveis c o m e r c i a l m e n t e para d e t e r m i n a ç ã o de
d i ó x i d o d e c a r b o n o total n o s o r o / p l a s m a , após a diluição d o
s a n g u e p a r a o intervalo d e valor de p H de 8,5 a 9,0, o n d e a fração
significativa d o d i ó x i d o d e c a r b o n o total se a p r e s e n t a c o m o
ânions carbonato.
N a prática, os limites finais de detecção d e ISEs de m e m b r a n a
polimérica são c o n t r o l a d o s p a r c i a l m e n t e p e l o v a z a m e n t o d e ana-
litos iónicos, a p a r t i r da s o l u ç ã o i n t e r n a p a r a a superfície exterior
d a m e m b r a n a e p a r a a fase da a m o s t r a q u e está e m estreito
c o n t a t o c o m a m e m b r a n a . 1 3 Assim, limites d e detecção m u i t o
m e n o r e s são alcançados pela d i m i n u i ç ã o da c o n c e n t r a ç ã o d o
analito iônico p r i m á r i o da solução i n t e r n a d o eletrodo. A l é m
disso, este v a z a m e n t o de a n a l i t o iônico, a c o p l a d o ao processo de
troca iônica n a i n t e r f a c e da m e m b r a n a de amostra, q u a n d o for
acessada a seletividade da m e m b r a n a sobre o u t r o s íons, f r e q ü e n -
t e m e n t e gera m e d i d a s p o t e n c i o m á t r i c a s d e coeficiente de seleti-
vidade q u e s u b e s t i m a m a seletividade real da m e m b r a n a . Para
d e t e r m i n a r coeficientes de seletividade "imparciais" pelo m é t o d o
de solução de diferenciação, a m e m b r a n a n ã o deve ser exposta
ao íon analisado p o r longos p e r í o d o s d e t e m p o , b e m c o m o a
c o n c e n t r a c ã o deste n a s o l u ç ã o i n t e r n a deve ser baixa.
pressão parcial de dióxido de carbono. 2 Este i m p o r t a n t e aconteci-
m e n t o levou à disponibilidade comercial de analisador d e sangue de
três canais (pH, P C 0 2 ) P0 2 ), q u e demonstra clinicamente o q u a d r o
completo d o estado de oxigenação e ácido-básico d o sangue.
A Figura 5-3 m o s t r a u m d i a g r a m a d e u m eletrodo p a r a P C 0 2
n o estilo Severinghaus típico. U m a m e m b r a n a f i n a c o m aproxi-
m a d a m e n t e 20 p.m d e espessura e permeável apenas a gases e
vapores d e água está e m c o n t a t o c o m a a m o s t r a . M e m b r a n a s de
b o r r a c h a d e silicone, T e f l o n e o u t r o s materiais p o l i m é r i c o s são
a d e q u a d a s para esse p r o p ó s i t o . N o lado o p o s t o da m e m b r a n a
está u m a f i n a c a m a d a d e eletrólito c o n s t i t u í d a d e u m sal f r a c o
d e b i c a r b o n a t o (cerca d e 5 m m o l / L ) e u m sal d e cloreto. U m
e l e t r o d o de p H e u m eletrodo d e referência de A g / A g C l estão
e m c o n t a t o c o m esta solução. O e l e t r o d o para P C 0 2 p o r si só
equivale a u m a célula p o t e n c i o m é t r i c a . O gás d i ó x i d o d e c a r b o n o
da a m o s t r a o u da matriz d e calibração d i f u n d e - s e a através da
m e m b r a n a e dissolve-se n a c a m a d a i n t e r n a d o eletrólito. O ácido
c a r b ô n i c o é f o r m a d o e dissocia-se, m u d a n d o o p H da solução de
b i c a r b o n a t o da c a m a d a i n t e r n a :
C 0 2 + H 2 0 f ^H2C0 3 <- H+ +HCCX (11)

Eletrodos para PC0 2

Eletrodos para medir P C 0 2 e m fluidos corporais estão disponíveis.
O primeiro eletrodo d e P C 0 2 , desenvolvido na década de 1950 p o r A l o g P C O 2( ífflUEcra) - "*í " 1T( mmaja Imana) (12)
Stow e Severinghaus, utilizara u m eletrodo vidro para p H c o m o
elemento i n t e r n o d e u m a célula potenciométrica para a m e d i d a de

Haste do eletrodo de vidro

Coldre plástico

Encaixe do eletrodo

Eletrodo de referência (Ag/AgCl) — Eletrodo interno (Ag/AgCl)

Bicarhonato de sódio Tampão fosfato

Anel O

Entrada de amostra Saída de Amostra

Membrana de vidro sensível a pH

Espaçador poroso
Membrana permeável a C 0 2 (borracha de silicone)
Cubeta
Janela de vidro

Figura 5 - 3 Diagrama do sensor de PC0 2 estilo Severinghaus utilizado para monitorar concentrações de CO2
em amostras de sangue. (De Siggard-Andersen O. The acid-base status of the blood, 4th ed. Baltimore: Williams
£l Willcins, 1974:172.)
 Eletroquímica e S e n s o r e s Químicos
! pH
Membrana
de PVC ( H >
i (HO.r r í Solução contendoJyr (H'},
bic-ait»nato 1
Eletrodo
interno (Ag/
AgClj
Figura 5 - 4 Esquema do sensor potenciométtico de PC0 2 planar,
baseado em dois eletrodos de pH com membranas poliméricas idênticas,
mas com soluções de referência internas contendo eletrólitos diferentes.
Ambas as membranas sensoras de pH são preparadas com ionóforos
seletivos para H*.
A relação e n t r e a PC02 da a m o s t r a e d o sinal g e r a d o p e l o e l e t r o d o
i n t e r n o d e p H é logarítmica e regulada pela e q u a ç ã o de N e r n s t
(equação 4). O e l e t r o d o p o d e ser calibrado utilizando-se m i s t u r a s
gasosas exatas o u p o r soluções c o m c o n c e n t r a ç õ e s estáveis de
P C 0 2 . E m b o r a os eletrodos p a r a PC02 estilo Severinghaus
t e n h a m a l c a n ç a d o u t i l i d a d e generalizada p a r a os analisadores de
gases d o sangue, o f o r m a t o desses sensores é l i m i t a d o p e l o
t a m a n h o , f o r m a e c a p a c idade de gerat o e l e m e n t o i n t e r n o sensí-
vel ao p H .
U m a célula p o t e n c i o m é t r i c a para PC02 u m p o u c o d i f e r e n t e
é m o s t r a d a na Figura 5-4- O a r r a n j o dessa célula envolve dois
eletrodos de P V C seletivos p a r a p H e m u m m o d o diferencial. As
m e m b r a n a s dos eletrodos c o n t ê m u m i o n ó f o r o n e u t r o d o tipo
a m i n a lipofílica, c o m altíssima seletividade para FT (Figura 5-2).
U m e l e t r o d o tem u m a c a m a d a i n t e r n a t a m p o n a d a , e n q u a n t o n o
o u t r o a c a m a d a n ã o é t a m p o n a d a , s e n d o c o n s t i t u í d a p o r baixa
c o n c e n t r a ç ã o de sal d e b i c a r b o n a t o . O gás d i ó x i d o d e c a r b o n o
da a m o s t r a o u da matriz d e calibração d i f u n d e - s e através das
m e m b r a n a s externas d e P V C seletivas p a r a FT d e a m b o s os sen-
sores. N o lado n ã o t a m p o n a d o , a d i f u s ã o d e C 0 2 provoca u m a
m u d a n ç a n o p o t e n c i a l da interface i n t e r n a da m e m b r a n a respon-
siva ao p H , q u e é p r o p o r c i o n a l à c o n c e n t r a ç ã o d e P C 0 2 da
amostra. O sinal n o e l e t r o d o c o m c a m a d a i n t e r n a t a m p o n a d a
n ã o é a f e t a d o pela d i f u s ã o d o C 0 2 através da m e m b r a n a . C o n -
s e q ü e n t e m e n t e , m e t a d e d o sensor r e s p o n d e ao p H u n i c a m e n t e ,
e n q u a n t o a o u t r a m e t a d e r e s p o n d e a a m b o s , p H e PC02. A
diferença de sinal e n t r e os dois eletrodos a n u l a q u a l q u e r contri-
b u i ç ã o d o p H da a m o s t r a na m e d i d a global d o p o t e n c i a l da
célula. O sinal diferencial é p r o p o r c i o n a l a p e n a s a P C 0 2 . A o
c o n t r á r i o d o s eletrodos tradicionais n o estilo Severinghaus, este
sensor diferencial de PCO2 d e célula p o t e n c i o m é t r i c a foi comer-
cializado e m u m f o r m a t o p l a n a r e é mais f a c i l m e n t e adaptável à
p r o d u ç ã o e m massa e m a r r a n j o d e sensores.
Potenciometria Direta por ISE — Unidades de
Medida e Aplicações Clínicas
M é t o d o s analíticos, c o m o f o t o m e t r i a d e c h a m a , m e d e m a concen-
tração total (c) de u m d a d o í o n n u m a a m o s t r a , n o r m a l m e n t e
expressa e m u n i d a d e s d e m i l i m o l e s d o í o n p o r litro d e a m o s t r a
( m r n o l / L ) . Molalidade (m) é u m a m e d i d a d o n ú m e r o d e moles d e
íon p o r massa d e água ( m m o l / k g ) na a m o s t r a . U t i l i z a n d o o íon
CAPÍTULO 5 93
sódio c o m o exemplo, a relação e n t r e a c o n c e n t r a ç ã o e a molali-
d a d e é d a d a por:
cNa+ - m N / x p H 2 0 (13)
o n d e p H 2 0 é a c o n c e n t r a ç ã o da massa de água e m k g / L . Para o
plasma s a n g u í n e o n o r m a l , a concentração da massa d e água é de,
a p r o x i m a d a m e n t e , 0,93 kg/L, mas e m espécimes c o m concentra-
ções elevadas de lipídios ou proteínas, o valor p o d e ser tão baixo
q u a n t o 0,8 kg/L. Nestes espécimes, a diferença entre c o n c e n t r a ç ã o
e molalidade p o d e ser tão elevada q u a n t o 2 0 % . U m a v a n t a g e m
significativa de p o t e n c i o m e t r i a direta p o r ISE para m e d i d a de
eletrólitos é q u e a técnica é sensível à molalidade e n ã o é, p o r t a n t o ,
afetada p o r variações e m concentração d e proteínas ou lipídios da
amostra. Técnicas c o m o fotometria de c h a m a e outros m é t o d o s
fotométricos, q u e necessitam de diluição de amostra, são afetadas
pela presença de proteínas e lipídios. Nestes m é t o d o s , apenas a fase
aquosa da amostra é diluída, p r o d u z i n d o resultados inferiores à
molalidade c o m o f u n ç ã o da concentração de proteínas e lipídios
na amostra. Assim, existe o risco de erros, c o m o u m a falsa baixa
c o n c e n t r a ç ã o de Na + (pseudo-hiponatremia) e m casos de extrema
elevação das concentrações de proteínas e lipídios. 1
E m adição à diferença entre molalidade e concentração, a
m e d i d a d e íons p o r p o t e n c i o m e t r i a direta fornece ainda u m a o u t r a
u n i d a d e de m e d i d a conhecida c o m o atividade (a), a c o n c e n t r a ç ã o
d e íons n ã o associados, livres e m solução. A o contrário de m é t o d o s
sensíveis à concentração de íons, os ISEs n ã o d e t e c t a m a presença
d e íons complexados ou eletrostaticamente "obstruídos" n a amostra.
A relação entre a atividade e a concentração utilizando-se, nova-
m e n t e , íons de sódio c o m o exemplo, é expressa c o m o :
~ 7N«' X
Cfr a (14)
o n d e y é u m a q u a n t i d a d e a d i m e n s i o n a l c o n h e c i d a c o m o coefi-
ciente d e atividade. O coeficiente d e atividade é p r i m a r i a m e n t e
d e p e n d e n t e da força iônica da a m o s t r a , c o n f o r m e descrito pela
e q u a ç ã o de Debye-Huckel:
( A x r j
x r )
logy = - (15)
l + ( B x axl1/2)
o n d e A e B são c o n s t a n t e s d e p e n d e n t e s d e t e m p e r a t u r a (A =
0,5213 e B = 3 , 3 0 5 e m água a 37 °C), a é o p a r â m e t r o d o t a m a n h o
d o í o n p a r a u m í o n específico e í é a força iônica (I = 0 , 5 H m x
z2, o n d e z é o n ú m e r o de carga d o íons). A e q u a ç ã o 15 m o s t r a
q u e u m a r e d u ç ã o n o c o e f i c i e n t e d e atividade ocorre c o m o
a u m e n t o da força iônica. Este efeito é mais a c e n t u a d o q u a n d o a
carga (2) d o í o n é elevada. O s coeficientes de atividade d e í o n s
e m f l u i d o s biológicos, c o m o s a n g u e e soro, são difíceis de s e r e m
calculados c o m precisão p o r causa da incerteza da c o n t r i b u i ç ã o
d e íons d e m a c r o m o l é c u l a s , c o m o proteínas, p a i a a força iônica
total. N o e n t a n t o , a s s u m i n d o q u e a força iônica n o r m a l d o
p l a s m a s a n g u í n e o é 0,160 m o l / k g , as estimativas de coeficientes
de atividade a 37 ° C são: Na + = 0,75, K + = 0,74 e Ca 2 * = 0,31.
T o m a n d o a e q u a ç ã o 14 c o m o referência, a atividade e c o n c e n t r a -
ção irão diferir g r a n d e m e n t e e m a m o s t r a s c o m força iônica fisio-
lógica, e s p e c i a l m e n t e p a r a os íons dívalentes.
Fisiologicamente, q u a n d o se c o n s i d e r a m equilíbrios q u í m i c o s
ou processos biológicos, a atividade iônica é c o n s i d e r a d a mais
relevante q u e a c o n c e n t r a ç ã o . P o r é m , a c o n c e n t r a ç ã o iônica é o
t e r m o mais familiar na prática clínica, c o n s t i t u i n d o a base de
94 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

intervalos de referência p a t a eletrólitos e o p a r â m e t r o para esses Cátodo

na t o m a d a de decisão médica. Logo n o início da evolução de ISEs
c o m o i n s t r u m e n t o s práticos em química clínica, foi decidido q u e Potencial de
/ \
Corrente limitante
a alteração dos intervalos d e referência clínica para u m sistema decomposição
b a s e a d o e m atividade, e m vez d e concentração, n ã o seria prática
e poderia levar ao risco d e interpretação errônea d o estado clínico.
U m a a b o r d a g e m prática da utilização ISEs nos analisadores
m o d e r n o s , sem alterar os intervalos de referência baseados em
i 0
V
concentração estabelecidas, é f o r m u l a r soluções de calibração com
força e composição iónicas o mais próximas possível daquelas E 1C - Potencial no qual
e n c o n t r a d a s nn plasma sanguíneo. Assim, o coeficiente de ativi- ocorre 1/2 da corrente
d a d e de cada íon nas soluções d e calibração se aproximaria limitante
daquele da matriz de amostra, p e r m i t i n d o a calibração e a m e d i d a Ânodo
de eletrólitos e m u n i d a d e s d e concentracão e m vez de atividade.

VOLTAMETR IA/AM PERO METR IA Figura 5 - 5 Ilustração da curva de corrente contra a de tensão
Técnicas voltamétricas e amperométricas estão entre as mais sensíveis
(voltamograma) obtida para espécie oxidada (Ox) sendo reduzida a Red
e amplamente aplicáveis dentre todos os métodos eletroanalíticos.
na superfície do elecrodo de trabalho, quando Eapi é varrida mais
negativamente e a solução é agitada para resultar em resposta de estado
Conceitos Básicos de equilíbrio.
E m contraste c o m a p o t e n c i o m e t r i a , os m é t o d o s voltamétricos e
amperométricos são baseados em células e l e t r o q u í m i c a s eletrolí-
ticas, o n d e u m a tensão externa é aplicada a u m eletrodo de tra-
b a l h o polarizável ( m e d i d o contra u m eletrodo de referência ade-
d e corrente observada t a m b é m é a l t a m e n t e d e p e n d e n t e da área
q u a d o : E ap] = Entalho - E ief ) e as correntes catódicas (para reduções
da superfície (A) d o eletrodo d e t r a b a l h o .
analíticas) o u anódicas (para oxidações analíticas) resultantes da
Q u a n d o u m p o t e n c i a l é aplicado a u m eletrodo d e t r a b a l h o
célula são m o n i t o r a d a s e proporcionais à concentração d o analito
q u e irá oxidar o u reduzir u m a espécie na fase d e solução e m
presente n a amostra teste. A corrente é transmitida apenas se Eap]
c o n t a t o c o m o eletrodo, a reação eletroquímica provoca a dimi-
é superior a u m a certa tensão (tensão de decomposição), determi-
n u i ç ã o d e c o n c e n t r a ç ã o de espécies eletroativas n a superfície d o
n a d a pela t e r m o d i n â m i c a para u m a d a d a reação redox d e interesse
eletrodo (Figura 5-6), u m processo d e n o m i n a d o "polarização d e
(Ox + ne* Red; d e f i n i d a pelo valor de E° para aquela reação
concentração". Este, p o r sua vez, provoca u m gradiente de con-
[potencial d e r e d u ç ã o padrão]) e a cinética heterogénea d e trans-
centração d e analito entre a solução de amostra total e a super-
ferência d e elétrons na interface d o eletrodo de trabalho. Muitas
fície d o eletrodo. Q u a n d o toda a solução é agitada, a c a m a d a d e
vezes, a cinética lenta de transferência d e elétrons para a reação
d i f u s ã o d e analito cresce m u i t o r a p i d a m e n t e para fora da super-
redox e m u m d a d o eletrodo de trabalho inerte (Pt, c a r b o n o , o u r o
fície d o eletrodo p a r a u m a distância fixa c o n t r o l a d a pela vigoro-
etc.) exjge a utilização de E a p i m u i t o mais negativa (para reduções)
sidade da agitação d a solução. Esta c a m a d a de d i f u s ã o é desig-
o u positiva (para oxidações) q u e o previsto, baseando-se mera-
n a d a c a m a d a N e r n s t e tem espessura finita (5), após u m espaço
m e n t e e m E° para u m a dada reação redox. Isto é designado
d e t e m p o relativamente c u r t o (Figura 5-6), q u a n d o a solução está
sobretensão (t|). I n d e p e n d e n t e m e n t e de haver o u n ã o sobretensão
e m m o v i m e n t o (convecção). A voltametria realizada n a presença
para a transferência d e elétrons, em v o l t a m e t r i a / a m p e r o m e t r i a ,
d e convecção (pela agitação da solução, pelo giro d o eletrodo,
ocorre u m a reação de oxidação ou redução especifica na superfície
circulação da solução pelo eletrodo etc.) é designada voltametria
d o eletrodo d e trabalho e é a transferência d e carga nesta interface
d o estado d e equilíbrio. Q u a n d o a solução está imóvel, a c a m a d a
(fluxo d e corrente) q u e f o r n e c e a i n f o r m a ç ã o analítica.
d e d i f u s ã o cresce mais e mais c o m o t e m p o (isto é, n ã o é cons-
Para células eletrolíticas q u e c o n s t i t u e m a base dos m é t o d o s
tante), criando valores de S c o n t i n u a m e n t e maiores c o m o t e m p o .
voltamétricos e a m p e r o m é t r i c o s :
Esta é designada voltametria d e estado de não-equilíbrio e fre-
q ü e n t e m e n t e resulta e m picos de corrente e m gráficos represen-
Egpl Ecí| T| - Í-Rc^l (16)
t a n d o i versus E a p l p a r a células eletrolíticas.
N a voltametria d e estado de equilíbrio, q u a n d o o potencial
o n d e E Ié i é o potencial t e r m o d i n â m i c o e n t r e os eletrodos de
d o eletrodo de t r a b a l h o é varrido, p a s s a n d o p o r u m valor q u e irá
t r a b a l h o e de referência n a ausência de u m a tensão aplicada
provocar u m a reação eletroquímica, a corrente irá a u m e n t a r rapi-
e x t e r n a m e n t e . Q u a n d o a tensão externa é m a i o r ou m e n o r q u e
d a m e n t e e, e m seguida, baixar para valor p r ó x i m o d o constante,
este potencial de equilíbrio, a sobretensão (rj) positiva o u nega-
m e s m o q u a n d o o c o r r e m m u d a n ç a s s u b s e q ü e n t e s d e Eapi_ A
tiva, e n t ã o a corrente será t r a n s m i t i d a graças a u m a reação de
Figura 5-5 ilustra tal o n d a para u m a r e d u ç ã o hipotética d e u m a
oxidação o u r e d u ç ã o n o e l e t r o d o d e trabalho. U m v o l t a m o g r a m a
espécie oxidada (Ox) pela r e d u ç ã o n d e u m e l é t r o n a u m a espécie
é s i m p le sm e n te o gráfico da corrente observada, i, contra E a p l
reduzida (Red). Q u a n d o o p o t e n c i a l aplicado é m u i t o mais nega-
(Figura 5-5). E m a m p e r o m e t r i a (ver a seguir), u m valor fixo de
tivo d o q u e o exigido, a corrente atinge u m valor limite (deno-
tensão é aplicado e a c o r r e n t e r e s u l t a n t e é m o n i t o r a d a . A quan-
m i n a d o o limite corrente, ij). Esta limitação de c o r r e n t e é pro-
tidade de c o r r e n t e é i n v e r s a m e n t e relacionada à resistência da
porcional à c o n c e n t r a ç ã o da espécie eletroativa ( Q x n e s t e caso),
solução de eletrólito, b e m c o m o q u a l q u e r resistência "aparente"
tal c o m o expressa pela seguinte equação:
q u e se desenvolve p o r causa da transferência d e massa de u m a
espécie de analito para a superfície d o eletrodo de trabalho. E m
v i r t u d e de as reações eletroquímicas serem heterogéneas, ocor- i, = n F A ^ jC„, (17)
r e n d o apenas n a superfície d o eletrodo de t r a b a l h o , a q u a n t i d a d e
 Eletroquímica e Sensores Químicos
Solução de amostra
Eletrodo
Ox
n©~
\ ções de dois o u três eletrodos. N a c o n f i g u r a ç ã o d e dois eletrodos,
V .
Red
c*
i / /
ti/ W ly/
r / /
t f /
c,« / /
iàAKVfy.V
/ / /
++-/-/-* *
// /
ir Distância
Figura 5 - 6 Conceito de reação eletroquímica aumentando a
espessura da camada de difusão (polarização de concentração) do analito
por redução (ou oxidação) na superfície eletrodo de trabalho. Quando o
tempo (t) aumenta, a espessura da camada de difusão cresce
rapidamente para um valor determinado pelo grau de convecção na
solução de amostra.
o n d e i é a c o r r e n t e m e d i d a e m a m p è r e s , n é igual ao n ú m e r o de
elétrons n a reação e l e t r o q u í m i c a (redução n e s t e caso), F é a
c o n s t a n t e d e Faraday (96.487 c o u l o m b s / m o l ) , A é a área d a
superfície e l e t r o q u í m i c a d o e l e t r o d o de t r a b a l h o ( e m cm 2 ) (assu-
m i n d o u m a g e o m e t r i a p l a n a r d o eletrodo), D é o c o e f i c i e n t e de
d i f u s ã o (em c m 2 / s e c ) d a espécie eletroativa (neste caso Ox), 5 é
a espessura d a c a m a d a de d i f u s ã o (em cm) e C é a c o n c e n t r a ç ã o
d a espécie de a n a l i t o e m m o l / c m 3 . O t e r m o D / 5 é f r e q ü e n t e -
m e n t e d e s i g n a d o m 0 1 o coeficiente d e t rans ferênci a d e massa da
espécie O x p a r a a superfície d o e l e t r o d o d e t r a b a l h o . N o t e q u e
a e q u a ç ã o 17 indica u m a relação linear e n t r e a c o r r e n t e l i m i t a n t e
e a c o n c e n t r a ç ã o . A m e s m a e q u a ç ã o se aplica p a r a detectar espé-
cies reduzidas, p o r u m a r e a ç ã o d e oxidação, n o e l e t r o d o d e tra-
b a l h o . N e s s e caso, p o r c o n v e n ç ã o , a c o r r e n t e a n ó d i c a r e s u l t a n t e
é c o n s i d e r a d a c o r r e n t e negativa. C o n f o r m e m o s t r a d o n a Figura
5-5, o p o t e n c i a l d o e l e t r o d o d e t r a b a l h o que c o r r e s p o n d e a u m a
c o r r e n t e q u e é e x a t a m e n t e a m e t a d e da c o r r e n t e l i m i t a n t e é
d e s i g n a d o valor E y 2 . Este valor n ã o é d e p e n d e n t e d a c o n c e n t r a -
ção d o analito. O E y i é d e t e r m i n a d o pela t e r m o d i n â m i c a (E°)
de u m a d e t e r m i n a d a reação r e d o x , pelas c o n d i ç õ e s de solução
(p. ex., se p r ó t o n s estão envolvidos n a reação, e n t ã o o p H irá
i n f l u e n c i a r o valor d e E]/ 2 ), j u n t a m e n t e c o m q u a l q u e r sobreten-
são c a u s a d a pela t r a n s f e r ê n c i a l e n t a d e elétrons etc., e m superfí-
cie de u m e l e t r o d o d e t r a b a l h o particular. Valores Eyz são indi-
cativos de u m a d e t e r m i n a d a espécie s o f r e n d o r e a ç ã o eletroquí-
mica s o b c o n d i ç õ e s especificas; p o r t a n t o , os valores d e E ] / z per-
m i t e m distinguir u m a espécie eletroativa d e o u t r a , n a m e s m a
a m o s t r a . Se os valores de Ei/z para várias espécies d i f e r e m signi-
CAPÍTULO 5 95
f i c a t i v a m e n t e (p. ex., > 120 mV), e n t ã o m e d i d a s d e diversas
c o r r e n t e s limitantes, e m u m d a d o v o l t a m o g r a m a , são capazes de
p r o d u z i r r e s u l t a d o s q u a n t i t a t i v o s de diversas espécies s i m u l t a n e -
amente.
C é l u l a s e l e t r o q u í m i c a s e m p r e g a d a s p a r a realizar m e d i d a s vol-
t a m é t r i c a s o u a m p e r o m é t r i c a s t i p i c a m e n t e envolvem configura-
a t e n s ã o externa é aplicada e n t r e os eletrodos de t r a b a l h o e de
referência e a c o r r e n t e é m o n i t o r i z a d a . D e s d e q u e a c o r r e n t e
t a m b é m deve passar p e l o e l e t r o d o d e referência, este f l u x o de
c o r r e n t e irá alterar a c o n c e n t r a ç ã o de superfície d a espécie ele-
troativa q u e equilibra o p o t e n c i a l real d e sernicélula d n e l e t r o d o
de referência, a l t e r a n d o o valor p o r u m processo de polarização
d e c o n c e n t r a ç ã o . Por exemplo, se u m e l e t r o d o d e referência
A g / A g C l fosse utilizado e m u m a célula o n d e a reação d e r e d u ç ã o
d o analito o c o r r e n o e l e t r o d o de t r a b a l h o , u m a reação d e oxida-
ção aconteceria n a superfície d o e l e t r o d o d e referência:
A g ° + C r —^AgCi^ + l e (18)
C o n s e q ü e n t e m e n t e , a a t i v i d a d e / c o n c e n t r a ç ã o d e íons cloreto
p e r t o d a superfície d o e l e t r o d o iria d i m i n u i r , o q u e t o r n a r i a o
p o t e n c i a l d o e l e t r o d o d e r e f e r ê n c i a mais positivo q u e o verda-
d e i r o valor de equilíbrio, c o m base n a atividade real d o íon
cloreto n a sernicélula d e referência, d e s d e q u e a e q u a ç ã o de
N e r n s t para esta sernicélula é:
E E
Ag/Agci = A fi A g ci - 0 , 0 5 9 log (a cr
(19)
Essa polarização de c o n c e n t r a ç ã o d o e l e t r o d o d e referência é
p r e v e n i d a pela m a n u t e n ç ã o d a d e n s i d a d e d e c o r r e n t e (J; a m p è r e s /
cm 2 ) m u i t o baixa n o e l e t r o d o de referência Isto é a l c a n ç a d o , n a
prática, certificando-se d e q u e a área d e t r a b a l h o d o e l e t r o d o n a
célula e l e t r o q u í m i c a é m u i t o m e n o r d o q u e a superfície d o ele-
t r o d o d e referência; c o n s e q ü e n t e m e n t e , o f l u x o de c o r r e n t e total
será l i m i t a d o p o r esta área m u i t o m e n o r , e os valores de J para
referência serão m u i t o p e q u e n o s c o m o p r e t e n d i d o p a r a evitar a
polarização d e c o n c e n t r a ç ã o .
Para e l i m i n a r c o m p l e t a m e n t e as m u d a n ç a s e m potenciais da
sernicélula d o e l e t r o d o d e referência, u m p o t e n c i o s t a t o d e três
eletrodos é f r e q ü e n t e m e n t e utilizado. S i m p l i f i c a n d o , o potencios-
tato aplica u m a tensão n o e l e t r o d o de t r a b a l h o , q u e é m e d i d a
c o n t r a u m e l e t r o d o d e r e f e r ê n c i a via m e d i ç ã o p o t e n c i o m é t r i c a
c o r r e n t e zero, mas o f l u x o de c o r r e n t e o c o r r e e n t r e o e l e t r o d o de
t r a b a l h o e u m terceiro eletrodo, d e n o m i n a d o contra-eletrodo.
Assim, se ocorre r e d u ç ã o n o e l e t r o d o d e t r a b a l h o , a oxidação irá
ocorrer n o contra-eletrodo; mas n ã o a c o n t e c e r i a reação líquida
n a superfície d o e l e t r o d o de referência, u m a vez q u e a c o r r e n t e
n ã o circula p o r este e l e t r o d o .
E m m é t o d o s voltamétricos, o E apl é v a r i a d o p o r a l g u m a s
f o r m a s d e o n d a q u e alteram o p o t e n c i a l d o e l e t r o d o d e t r a b a l h o
e m f u n ç ã o d o t e m p o , e a c o r r e n t e r e s u l t a n t e é m e d i d a - A altera-
ção d e c o r r e n t e o c o r r e n a faixa d e p o t e n c i a l d e d e c o m p o s i ç ã o ,
q u e se espera ser específica p a r a u m d a d o analito. Todavia, a
p o s i ç ã o da resposta d e c o r r e n t e , c o m o f u n ç ã o de E apl , f o r n e c e
i n f o r m a ç õ e s sobre a n a t u r e z a das espécies p r e s e n t e s (p. ex., Ei/ 2 ),
j u n t a m e n t e c o m sinal d e p e n d e n t e d a c o n c e n t r a ç ã o . Esta varre-
d u r a d e E a p l é linear (voltametria d e v a r r e d u r a linear) ou p o d e ter
f o r m a s mais c o m p l e x a s q u e p e r m i t e m significativa m e l h o r i a de
sensibilidade p a r a ser alcançada p a r a o m o n i t o r a m e n t o d a con-
c e n t r a ç ã o d e u m a d a d a espécie eletroativa (p. ex-, v o l t a m e t r i a
p u l s a d a n o r m a l , v o l t a m e t r i a de p u l s o diferencial, v o l t a m e t r i a de
96 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

o n d a q u a d r a d a etc.). Q u a n d o u m e l e t r o d o gotejante de m e r c ú r i o p i l e n o , b o r r a c h a d e silicone, T e f l o n etc.) é m a n t i d a n a extremi-

( D M E ) é utilizado, esses m é t o d o s voltamétricos são c o n s i d e r a d o s
m é t o d o s de análise polarográficas.
M é t o d o s a m p e r o m é t r i c o s d i f e r e m dos voltamétricos, pelo fato
d e q u e o Eap] é fixado g e r a l m e n t e e m u m valor de potenciai q u e
ocorre n a região de platô d e c o r r e n t e l i m i t a n t e d o v o l t a m o g r a m a
e a c o r r e n t e r e s u l t a n t e s i m p l e s m e n t e é a c o m p a n h a d a , e será pro-
p o r c i o n a l à c o n c e n t r a ç ã o . A a m p e r o m e t r i a n o r m a l m e n t e é mais
sensível q u e os m é t o d o s voltamétricos c o m u n s p o r q u e as corren-
tes carregadas de f u n d o , q u e surgem c o m a m u d a n ç a de Eapi c o m o
f u n ç ã o d o t e m p o e q u e o c o r r e m e m voltametria, n ã o existem.
Assim, para o b t e r m e d i d a s quantitativas mais sensíveis q u a n d o a
seletividade é g a r a n t i d a e m u m d a d o valor E ap] , a a m p e r o m e t r i a
p o d e ser preferida e m d e t r i m e n t o de m é t o d o s voltamétricos.
Aplicações
O oxigênio m o l e c u l a r é capaz de sofrer diversas reações d e
r e d u ç ã o , t o d a s c o m so bret ens ões significativas e m eletrodos
sólidos, c o m o Pt, A u ou Ag. Por exemplo, a s e g u i n t e reação;
0 2 +2H 2 0 + 4e~ —> 4 0 H "
(E° = + 0 , 1 7 9 ws Ag/A tPl-.lmd/LCÍ~) (20)
exibe u m E y i d e a p r o x i m a d a m e n t e -0,500 V e m u m e l e t r o d o Pt
(versus A g / A g C l ) , c o m p l a t ô d e c o r r e n t e l i m i t a n t e e m cerca d e
- 0 , 6 0 0 V. Esta reação t e m sido utilizada pata m o n i t o r a r a pressão
parcial de oxigênio n o sangue ( P 0 2 ) e é a base d o sensor ampe-
r o m é t r i c o d e oxigênio n o estilo Clark, a m p l a m e n t e utilizado
(Figura 5-7). Este dispositivo utiliza eletrodo d e p l a t i n a c o m
p e q u e n a área p l a n a r c o m o e l e t r o d o de t r a b a l h o (envolvido p o r
v i d r o isolante o u o u t r o material) e u m e l e t r o d o de referência
A g / A g C l , t i p i c a m e n t e c o m d e s e n h o cilíndrico (Figura 5-7). Essa
célula eletrolítica d e dois eletrodos é colocada d e n t r o de u m
sensor, o n d e u m a m e m b r a n a p e r m e á v e l a gases (p. ex., polipro-
d a d e distai. O i n t e r i o r que c o n t é m o e l e t r o d o d e t r a b a l h o de
platina é fortemente pressionado contra a m e m b r a n a permeável
a gás p a r a criar u m a f i n a película d e solução i n t e r n a de eletrólito
( n o r m a l m e n t e t a m p ã o a d i c i o n a d o de KC1). O oxigênio da
a m o s t r a p e r m e i a a m e m b r a n a e é reduzido, e m c o n f o r m i d a d e
c o m a reação eletroquímica a c i m a . U m Eap] de -0,050 o u - 0 , 7 0 0
V versus A g / A g C l ( d e n t r o d o regime de c o r r e n t e l i m i t a n t e ) p a r a
o e l e t r o d o d e t r a b a l h o de Pt irá resultar e m c o r r e n t e o b s e r v a d a
p r o p o r c i o n a l à P 0 2 p r e s e n t e n a a m o s t r a ( i n c l u i n d o sangue total).
N a ausência de oxigênio e sob c o n d i ç õ e s a m p e r o m é t r i c a s dessa
t e n s ã o aplicada, a c o r r e n t e será quase nula-
A m e m b r a n a externa permeável a gás p e r m i t e que o eletrodo
de Clark detecte oxigênio c o m elevada seletividade e m relação a
outras espécies f a c i l m e n t e reduzidas que p o d e m estar presentes e m
u m a d e t e r m i n a d a amostra (p. ex., íons metálicos, cistina etc.) De
fato, apenas outras espécies gasosas ou orgânicas, a l t a m e n t e lipofí-
licas, seião separadas e passarão pelas m e m b r a n a s externas perme-
áveis a gases. U m tipo de interferência e m amostras clínicas é
atribuída a certos gases anestésicos, tais c o m o óxido nitroso, halo-
t a n o e isoflurano. Estas espécies t a m b é m (1) se d i f u n d e m através
da m e m b r a n a exterior d o sensor, (2) são e l e t r o q u i m i c a m e n t e redu-
zidas n o eletrodo d e platina e (3) resultam e m falso positivo para
m e d i d a s de P 0 2 . N o e n t a n t o , o uso de materiais de m e m b r a n a s
permeáveis a gases otimizados e o controle a d e q u a d o d o potencial
aplicado para o c á t o d o d o sensor reduziram m u i t o este p r o b l e m a
e m i n s t r u m e n t o s m o d e r n o s . As m e m b r a n a s externas permeáveis a
gases t a m b é m c o n t r i b u e m para limitar a difusão d o analito para o
eletrodo de trabalho interior; assim, a m e m b r a n a p o d e controlar
o ttansporte de massa d o analito ( t e r m o D / 8 n a e q u a ç ã o 17), de
tal m o d o que, n a presença o u ausência d e convecção d e amostra,
o t r a n s p o r t e de massa de oxigênio para a superfície d o eletrodo de
t r a b a l h o de platina é essencialmente o m e s m o .
A l t e r a n d o a tensão aplicada a o e l e t r o d o d e t r a b a l h o , o p r o j e t o
básico d o sensor a m p e r o m é t r i c o de P 0 2 de C l a r k foi a m p l i a d o
para detectar o u t r a s espécies de gases. Por exemplo, é possível

Solução de eletrólito
i tamponada
O z + H 2 0 + 4a" ^ 4 0 H

Superfície de Pt

Solução tamponada de -4-

eletrólito e
e
,4 e e e
// [
Eletrodo de
trabalho de platina
H2O OH
Detentor de
membrana do \
anel "O" 02

Membrana
permeável a gás O2 O2 O2 O2 Membrana
permeável a g á s

Eletrodo cilíndrico de Ag/AgCl

Figura 5 - 7 Esquema de sensor amperométrico de oxigênio do tipo Clark utilizado para monitorar
concentrações de P0 2 no sangue.
 Eletroquímica e Sensores Químicos
detectar o ó x i d o n í t r i c o ( N O ) , c o m alta seletividade, utilizando
u m e l e t r o d o para gás s e m e l h a n t e , c o m c o n f i g u r a ç ã o e m q u e a
p l a t i n a é polarizada e m + 0 , 9 0 0 A g / A g C l p a r a oxidar N O
a n i t r a t o n o â n o d o d e platina. 11 Esses sensores de N O f o r a m
utilizados e m g r a n d e v a r i e d a d e de estudos b i o m é d i c o s i m p o r t a n -
tes, para d e d u z i r a q u a n t i d a d e de N O local ou n a v i z i n h a n ç a da
superfície de várias células p r o d u t o r a s de N O .
A l é m d e dispositivos a m p e r o m é t r i c o s , u m m é t o d o especiali-
zado p a r a detectar traços d e c o n c e n t r a ç õ e s d e í o n s metálicos
tóxicos de amostras clínicas é a voltametria d e redissolução
a n ó d i c a (ASV). E m ASV, u m e l e t r o d o de t r a b a l h o d e c a r b o n o é
utilizado (algumas vezes revestido c o m película de H g adicional)
e o E a p l é i n i c i a l m e n t e f i x a d o e m nível m u i t o negativo, a f i m d e
q u e t o d o s os í o n s metálicos e m solução sejam reduzidos para
metais e l e m e n t a r e s (M°) n o i n t e r i o r d o f i l m e de m e r c ú r i o e / o u
n a s u p e r f í c i e de c a r b o n o . E n t ã o , o E apl é v a r r i d o d e m a n e i r a mais
positiva, e os metais r e d u z i d o s d e p o s i t a d o s n o e l e t r o d o de traba-
l h o o u n a superfície deste são reoxidados, r e s u l t a n d o e m u m alto
pico de c o r r e n t e a n ó d i c a , p r o p o r c i o n a l à c o n c e n t r a ç ã o d e íons
metálicos d a a m o str a inicial. O potencial e m que esses picos são
o b s e r v a d o s indica q u e cada m e t a l está presente, e a altura d o pico
d e c o r r e n t e d e redissolução é d i r e t a m e n t e p r o p o r c i o n a l à con-
c e n t r a ç ã o d o í o n m e t á l i c o n a a m o s t r a inicial. Tais técnicas de
A S V t ê m sido utilizadas para detectar a c o n c e n t r a ç ã o de P b e m
a m o s t r a s d e sangue total, p r o p o r c i o n a n d o u m m é t o d o r á p i d o de
v a r r e d u r a de exposição e e n v e n e n a m e n t o p o r c h u m b o . 9
O u t r o exemplo b i o m é d i c o d e voltametria m o d e r n a é u m a
técnica v o l t a m é t r i c a cíclica d e varredura r á p i d a q u e t e m sido
utilizada p a r a q u a n t i f i c a r d o p a m i n a n o tecido cerebral de animais
d e m o v i m e n t a ç ã o livre. 18 N e s t a aplicação, a oxidação d e dopa-
m i n a a u m tipo de q u i n o n a n o e l e t r o d o de m i c r o c a r b o n o implan-
t a d o (em a p r o x i m a d a m e n t e + 0 , 6 0 0 V uersus A g / A g C l ) p r o d u z
picos d e c o r r e n t e p r o p o r c i o n a i s às c o n c e n t r a ç õ e s d e d o p a m i n a .
O e l e t r o d o t e m sido utilizado para medir esse n e u r o t r a n s m i s s o r
e m diferentes regiões d o cérebro o u n u m local fixo.
E m b o r a técnicas v o l t a m é t r i c a / a m p e r o m é c r i c a sejam aplica-
das p a r a detectar u m a g r a n d e v a r i e d a d e de espécies, a seletividade
oferecida e m m e d i d a s de a m o s t r a s clínicas c o m p l e x a s — e m q u e
F i g u r a 5 - 8 Diagrama de sistema LC-EC, com detector eletroquímico monitorando a eluição de analitos de
coluna de HPLC por oxidação ou redução (mostrado aqui como exemplo) em camada fina de eletrodo de
trabalho adequada.
CAPÍTULO 5 97
m u i t a s espécies p o d e m ser eletroativas - é b a s t a n t e limitada. Por
exemplo, c o m o r e l a t a d o n a discussão a n t e r i o r relativa ao sensor
de oxigênio de Clark, n a ausência d e m e m b r a n a p e r m e á v e l a gás,
o u t r a s espécies são reduzidas p a r a o m e s m o E a p i, ou p r ó x i m o
dele, u m a vez q u e o oxigênio causaria i n t e r f e r ê n c i a significa-
tiva.
C o m o objetivo de e x p a n d i r g r a n d e m e n t e o elenco d e anali-
tos d e t e c t a d o s p o r m é t o d o s v o l t a m é c r i c o s / a m p e r o m é t r i c ô s , téc-
nicas e l e t r o q u í m i c a s t ê m sido utilizadas c o m o detectores alta-
m e n t e sensíveis para o m o d e r n o sistema de c r o m a t o g r a f i a líquida
d e alto d e s e m p e n h o ( H P L C ) ( C a p í t u l o 7). E m c r o m a t o g r a f i a
l í q u i d a c o m detecção e l e t r o q u í m i c a (LC-EC), solutos eluidos são
d e t e c t a d o s p o r e l e t r o d o d e f l u x o ( g e r a l m e n t e c a r b o n o o u mercú-
rio), p r o j e t a d o s para a p r e s e n t a r e m v o l u m e m o r t o (ou vazio) extre-
m a m e n t e baixo (Figura 5-8). O s eletrodos são o p e r a d o s em
m o d o s a m p e r o m é t r i c o ou v o l t a m é t t i c o (com altas velocidades de
varredura), e vários eletrodos p o d e m ser o p e r a d o s s i m u l t a n e a -
m e n t e e m a r r a n j o s de f l u x o e m série ou e m paralelo p a r a obter
g a n h o adicional de seletividade. Por exemplo, a h o m o c i s t e í n a
t e m sido m e d i d a c o m (1) a adição d e agentes r e d u t o r e s à am os t r a
de soro paTa gerar h o m o c i s t e í n a livre, (2) p r e c i p i t a ç ã o de proteí-
nas n a a m o s t r a (com ácido tricloroacético) e (3) separação de
c o m p o n e n t e s d o soro e m c o l u n a de H P L C de octadecilsilano
c o m fase reversa. Por oxidação d e h o m o c i s t e í n a ao c o m p l e x o de
ditiolato de m e r c ú r i o c o r r e s p o n d e n t e , a h o m o c i s t e í n a eluida é
d e t e c t a d a e m e d i d a e m t e m p o real.
CQNDUTOMETRIA
A c o n d u t o m e t r i a é u m a técnica eletroquímica utilizada para
d e t e r m i n a r a q u a n t i d a d e de u m analito p r e s e n t e e m u m a mistura,
m e d i n d o o efeito dele sobre a c o n d u t i v i d a d e elétrica d a mistura.
Essa é a m e d i d a d a capacidade d o s íons e m solução de t r a n s p o r t a r
c o r r e n t e sob a i n f l u ê n c i a de u m a diferença d e potencial. E m u m a
célula c o n d u t o m é t r i c a , o p o t e n c i a l é aplicado e n t r e dois eletrodos
metálicos inertes. U m potencial alternado, c o m u m a f r e q ü ê n c i a
e n t r e 100 e 3 . 0 0 0 Hz é utilizado para evitar a polarização dos
eletrodos. A d i m i n u i ç ã o n a resistência d a solução resulta em u m
a u m e n t o de c o n d u t â n c i a , e m a i s c o r r e n t e é passada e n t r e os ele-
98 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
trodos. O fluxo de corrente resultante também é alternado. A
corrente é diretamente proporcional à condutância da solução. A
condutância é considerada o inverso da resistência e pode ser
expressa em unidades de ohms" 1 (siemens). Em análises clínicas,
a condutometria é freqüentemente utiliiada para medir a fração
de volume de eritrócitos em sangue total (hematócrito) e como o
mecanismo de transdução para alguns biossensores.
Os eritrócitos agem como insuladores elétricos graças à compo-
sição da membrana lipídica. Este fenômeno foi inicialmente utili-
zado nos anos 1940 para medir a fração de volume de eritrócitos
n o sangue total (hematócrito) por condutividade e atualmente é
Utilizado para medir O hematócrito em instrumentos multianalíti-
cos para a análise clínica. Além disso, geralmente concentrações de
Na e K+ também são medidas em conjugação com o hematócrito,
em sistemas concebidos para análises clínicas.
Medidas d o hematócrito baseadas em condutividade são limi-
tadas. Por exemplo, concentrações anormais de proteínas alteram
a condutividade plasmática e interferem na medida. Concentra-
ções baixas de proteínas, resultantes de diluição de sangue con-
t e n d o soluções de eletrólitos livres de proteínas em circunvalação
cirúrgica cardiopulmonar resultará em valores de hematócrito
com valores baixos de condutividade falsos. Variáveis pré-analíti-
cas, como homogeneização insuficiente de amostra, t a m b é m
induzem a erros. A hemoglobina é o analito de eleição para
acompanhar a perda sanguínea e a necessidade de transfusão
d u r a n t e trauma e cirurgia. No entanto, a medida eletroquímica
de hematócrito em conjugação com os gases d o sangue e eletró-
litos permanece em utilização, principalmente, em f u n ç ã o da
simplicidade e conveniência, apesar de algumas limitações.
O u t r a aplicação clínica de condutância é a contagem eletrô-
nica de células sanguíneas em suspensão. D e n o m i n a d a "princípio
Coulter", baseia-se n o fato de que a condutividade de células
sanguíneas é inferior à da solução salina utilizada como meio de
suspensão. 0 A suspensão de células é forçada através de u m tubo
com p e q u e n o orifício. Dois eletrodos são colocados em ambas as
extremidades d o tubo e u m a corrente constante é estabelecida
entre os eletrodos. Cada vez que u m a célula passa através do
orifício, a resistência aumenta; isto causa u m a mudança na dife-
rença de potencial elétrico entre os eletrodos. Os pulsos são então
amplificados e contados.
COULOMETRIA
A coulometria mede a carga elétrica que atravessa dois eletrodos
de u m a célula eletroquímica. A quantidade de carga passada
entre os eletrodos é diretamente proporcional à oxidação ou
redução de u m a substância eletroativa em u m dos eletrodos. O
n ú m e r o de coulombs transferidos neste processo está relacionado
com a quantidade absoluta de substância eletroativa descrita na
lei de Faraday:
Q =n x N x F (21)
Onde
Q = a quantidade de carga que atravessa a célula (unidade:
C = coulomb = ampere • segundo)
n •= o n ú m e r o de elétrons transferidos na reação de oxidação ou
redução
N = a quantidade de substância reduzida ou oxidada em moles
F •= constante de Faraday (96.487 coulombs/mole)
A medida de corrente está relacionada com a carga, sendo a
quantidade de carga transmitida por unidade de tempo (ampère
•= coulomb/segundo). A coulometria é utilizada em aplicações
clínicas para a determinação de cloreto n o soro ou plasma e como
m o d o de transdução em certos tipos de biossensores.
Tituladores coulométricos comerciais foram desenvolvidos
para a determinação de cloreto n o sangue, plasma ou soro. U m a
corrente constante é aplicada entre um fio de prata (ânodo) e um
fio de platina (cátodo). N o ânodo, Ag é oxidada a Ag*. N o cátodo,
FT é Teduzido a gás hidrogênio. Em aplicação de corrente cons-
tante, o n ú m e r o de coulombs que passa entre o â n o d o e cátodo
é diretamente proporcional ao t e m p o (coulombs = amperes x
segundos). Assim, o n ú m e r o absoluto de íons de prata produzi-
dos n o â n o d o p o d e ser calculado a partir da quantidade de tempo
em que a corrente passa por esse. N a presença de Cl", os íons AgH
formados são precipitados como A g C l ^ ^ ) e a quantidade de Ag+
livre em solução é baixa. Q u a n d o todos os íons Cl' são comple-
xados, acontece u m a u m e n t o súbito da concentração de Ag" em
solução. O excesso de Ag+ é percebido amperometricamente em
u m segundo eletrodo de Ag, polarizado em potencial negativo.
O excesso Ag" é reduzido para Ag, produzindo u m a corrente.
Q u a n d o essa corrente ultrapassa u m certo valor, a titulação é
interrompida. O n ú m e r o absoluto de íons Cl" presentes na
amostra é calculado a partir do tempo d u r a n t e o qual a titulação
com Ag* estava em a n d a m e n t o . C o n h e c e n d o o volume de amostra
de soro ou plasma originalmente utilizado, é possível calcular a
concentração de C l ' n a amostra. A titulação coulométrica é u m a
das técnicas eletroquímicas mais precisas desde que o método
mede a quantidade absoluta de substância eletroativa da amostra.
A coulometria é considerada o padrão-ouro para a determinação
de cloreto n o soro ou plasma. Entretanto, o método está sujeito
à interferência de ânions da amostra com maior afinidade por
Ag+ que o cloreto, tal como o brometo.
SENSORES QUÍMICOS ÓPTICOS
U m "optodo" é u m sensor óptico utilizado em instrumentos
analíticos para medir p H , gases d o sangue e eletrólitos. Optodos
apresentam certas vantagens sobre eletrodos, incluindo (1) a
facilidade de miniaturização, (2) menos ruído eletrônico (sem
fios para transdução), (3) estabilidade a longo prazo utilizando
medidas d o tipo radiométricas e m múltiplos comprimentos de
onda e (4) não exige u m eletrodo de referência em separado.
Estas vantagens promoveram o desenvolvimento da tecnologia
de sensores ópticos inicialmente para a concepção de sensores
intravasculares de gases do sangue. N o entanto, os mesmos prin-
cípios básicos de sensoriamento foram utilizados na instrumen-
tação da química clínica projetada para medidas, in vitro, mais
clássicas em amostras distintas. Nesses sistemas, a luz é transmi-
tida para o local de sensoriamento, e a partir dele, quer seja por
fibras ópticas ou simplesmente pelo posicionamento adequado
das fontes luminosas (luz emissora de diodos, LEDs), filtros e
fotodetecrores para acompanhar a absorvância (por reflectãncia),
fluorescência ou fosforescência (Figura 5-9).
Conceitos Básicos
Sensores ópticos concebidos para medidas de P02 são tipica-
mente baseados na imobilização d e certos corantes orgânicos, tais
como (1) pireno, (2) difenilfenantreno, (3) fenantreno, (4) fluo-
ranteno ou (5) complexos de metais ligantes, tais como rutênio
[II] tris[dipiridina], Pt e Pd metaloporfirinas n o interior de filmes
de polímeros hidrofóbicos (p. ex., borracha de silicone), o n d e o
oxigênio é muito solúvel. A fluorescência ou fosforescência de
tais espécies em u m determinado comprimento de onda é fre-
q ü e n t e m e n t e atenuada na presença de espécies paramagnéticas,
incluindo oxigênio molecular. N o caso de corantes fluorescentes
embutidos, a intensidade de fluorescência emitida desses filmes
diminuirá proporcionalmente ao nível da pressão parcial de 0 3
da amostra em contato com o filme polimérico, de acordo com
a equação de Stern-Volmer para atenuação:
 Eletroquímica e Sensores Químicos CAPÍTULO 5 99

Isoladc r óptico
c o m fins de s e n s o r i a m e n t o . U m p r o b l e m a c o m relação à utiliza-
Camada de sensor fluorescente ção de i n d i c a d o r e s imobilizados p a r a m e d i d a s precisas de p H
SANGUfcA fisiológico é o efeito d a força iônica sobre o p K a d o i n d i c a d o r .
A A A fl
1 \ Variações n a força iônica em a m o s t r a s fisiológicas são c o n h e c i d a s

lllliil •
i
>
+W M M .
Lcnlú-
v Aplicações
Plástico
Luz dâ
oxcitaçáo
Luz emitida ou
refletida
s o p H varia d e p e n d e n d o d a pressão parcial d e P C 0 2 e m e q u i l í b r i o
/ \
* *
Detector Fonte
Figura 5 - 9 Esquema geial de sensor óptico de vidro para detecção
de um dado analito no sangue. O filme de polímero contém corante
que modifica as propriedades espectrais proporcionalmente à
quantidade de analito na fase de amostra. O exemplo mostrado é para
filme de sensoriamento que muda a luminescência (fluorescência ou
fosforescência).
= kPOz +1
(22)
Onde
In = i n t e n s i d a d e d e f l u o r e s c ê n c i a n a ausência d e oxigênio
IpTJ7 ~ i n t e n s i d a d e de f l u o r e s c ê n c i a e m u m a d e t e r m i n a d a pressão
parcial de P 0 3
k = c o n s t a n t e de a t e n u a ç ã o para f l u o r ó f o r o s particulares uti-
lizados
C o m o indicado, a relação e n t r e a razão Iq/Ipoj e P 0 3 da fase
de a m o s t r a é linear. A l é m disso, q u a n t o m a i o r a c o n s t a n t e d e
a t e n u a ç ã o , m a i o r será o grau d e a t e n u a ç ã o para u m d a d o fluo-
r ó f o r o . N o e n t a n t o , é i m p o r t a n t e q u e a c o n s t a n t e de a t e n u a ç ã o
esteja e m u m a faixa q u e vá p r o d u z i r c o m p o r t a m e n t o linear d e
Stern-Volmer ao l o n g o d e i n t e r v a l o fisiologicamente relevante de
P 0 2 n o sangue.
M e d i d a s de i n t e n s i d a d e d e fosforescência o u vida útil de
fosforescência d e complexos d e metais ligantes imobilizados
t a m b é m t ê m sido utilizadas p a r a m e d i r p H , gases d o sangue ou
eletrólitos. Sensores b a s e a d o s e m alterações n a vida útil de lumi-
nescência t ê m a v a n t a g e m inerente de serem insensíveis a pertur-
b a ç õ e s n o t a m a n h o d o p e r c u r s o ó p t i c o e q u a n t i d a d e de c o r a n t e
ativo p r e s e n t e n a c a m a d a de s e n s o r i a m e n t o .
Sensores ópticos d e p H r e q u e r e m imobilização d e indicado-
res de p H a p r o p r i a d o s d e n t r o das c a m a d a s f i n a s de p o l í m e r o s
hidrofílicos (p. ex., hidrogéis) p o r q u e o acesso e q u i l i b r a d o de
p r ó t o n s para o i n d i c a d o r é essencial. Fluoresceína, 8-hidroxi-
1,2,6-pireno trissulfonato ( H P T S ) e v e r m e l h o de f e n o l são utili-
zados c o m o indicadores. A a b s o r v â n c i a o u f l u o r e s c ê n c i a d e
f o r m a s p r o t o n a d a s o u d e s p r o t o n a d a s d o c o r a n t e são utilizadas
p o r i n f l u e n c i a r a precisão d a m e d i d a de p H , p o r q u e sensores
ópticos m e d e m a c o n c e n t r a ç ã o d e c o r a n t e s p r o t o n a d o s ou des-
p r o t o n a d o s c o m o m e d i d a i n d i r e t a d a atividade í o n h i d r o g ê n i o .
Sensores ópticos a d e q u a d o s p a r a a d e t e r m i n a ç ã o d o PCO? empre-
gam t r a n s d u t o r e s ópticos de p H (com i n d i c a d o r e s imobilizados),
c o m o t r a n s d u t o r e s i n t e r n o s c o m a r r a n j o b a s t a n t e similar ao
p r o j e t o d o sensor e l e t r o q u í m i c o n o estilo clássico Severinghaus
(Figura 5-3). A a d i ç ã o d e sal de b i c a r b o n a t o à c a m a d a de hidrogel,
sensora d e p H , cria a c a m a d a de f i l m e d o eletrólito exigido, o n d e
com o filme. O sensor óptico d e p H é c o b e r t o p o r u m f i l m e
e x t e r n o h i d r o f ó b i c o e permeável a gás (p. ex., b o r r a c h a de sili-
cone), para i m p e d i r o acesso de p r ó t o n s e a i n d a p e r m i t e o equi-
líbrio de C 0 2 c o m a c a m a d a de s e n s o r i a m e n t o de p H . E n q u a n t o
a pressão parcial d e PCO? n a a m o s t r a a u m e n t a , o p H da c a m a d a
de b i c a r b o n a t o d i m i n u i e a c o r r e s p o n d e n t e d i m i n u i ç ã o d e con-
c e n t r a ç ã o da f o r m a d e s p r o t o n a d a d o i n d i c a d o r (ou a u m e n t o da
c o n c e n t r a ç ã o da f o r m a p r o t o n a d a ) é percebida o p t i c a m e n t e .
D u a s a b o r d a g e n s t ê m sido utilizadas p a r a detecção óptica d e
íons eletrólitos e m amostras fisiológicas. U m m é t o d o e m p r e g a
m u i t o s d o s m e s m o s i o n ó f o r o s lipofílicos desenvolvidos para ele-
t r o d o s seletivos p a r a íon c o m m e m b r a n a s poliméricas (Figura
5-2). Estas espécies são ligadas e m f i l m e s p o l i m é r i c o s h i d r o f ó b i -
cos m u i t o finos, j u n t a m e n t e c o m u m i n d i c a d o r de p H lipofílico.
N o caso de i o n ó f o r o s catiônicos (p. ex., v a l m o m i c i n a para senso-
r i a m e n t o de potássio), q u a n d o os cátions d a a m o s t r a são extraí-
d o s pelo i o n ó f o r o da f i n a película, o p H i n d i c a d o r ( R H ) p e r d e
u m p r ó t o n para a fase de a m o s t r a , para m a n t e r a carga n e u t r a
d e n t r o d o f i l m e o r g â n i c o ( p r o d u z i n d o R"). Isto resulta e m u m a
m u d a n ç a da absorção óptica ou d o espectro d e f l u o r e s c ê n c i a da
c a m a d a de p o l í m e r o . Se a espessura dos filmes é m a n t i d a <10
Um, t e m p o s d e resposta de equilíbrio < 1 m i n u t o são atingidos.
A principal limitação deste d e s e n h o é q u e o p H da fase de
a m o s t r a t a m b é m i n f l u e n c i a o equilíbrio global d e extração de
íons d e n t r o d o filme. Assim, p a r a o b t e r valores precisos de ele-
trólitos, são necessárias m e d i d a s s i m u l t â n e a e i n d e p e n d e n t e d e
p H d a amostra o u a diluição d o t a m p ã o e / o u c o n t r o l e d e p H d a
fase de a m o s t r a são exigidos.
U m a s e g u n d a m e t o d o l o g i a utilizada para detectar íons eletró-
litos é imobilizar u m agente d e r e c o n h e c i m e n t o de cátion e / o u
â n i o n d e n t r o de u m a matriz de hidrogel, s e m e l h a n t e às d e sen-
sores d e p H descritos a n t e r i o r m e n t e . O agente d e reconheci-
m e n t o , neste caso, g e r a l m e n t e n ã o é lipofílico e, p o r isso, deve
ser a n c o r a d o c o v a l e n t e m e n t e ao h i d r o g e l para q u e n ã o seja lixi-
viado p a r a a fase d e a m o s t r a . O agente é p r o j e t a d o para q u e a
ligação seletiva d e cátion ou â n i o n altere o espectro de absorvân-
cia ou f l u o r e s c ê n c i a d a espécie n o interior d o h i d r o g e l Tipica-
m e n t e , isto é a l c a n ç a d o pela associação de r e c o n h e c i m e n t o d o
íon e das p r o p r i e d a d e s d o c r o m ó f o r o d e n t r o de u m a ú n i c a molé-
cula orgânica. Tais sensores de íons f o r a m e m p r e g a d o s c o m
sucesso e m p e l o m e n o s u m analisador e l e t r o q u í m i c o de gases
s a n g u í n e o s comercial, c o m a r r a n j o de sensores de d e s e n h o uni-
versal, similar ao q u e é ilustrado n a Figura 5-9.
BIOSSENSORES
U m b i o s s e n s o r é u m t i p o específico de sensor q u í m i c o constitu-
ído d e u m e l e m e n t o biológico d e r e c o n h e c i m e n t o e u m t r a n s d u -
t o r físico-químico, f r e q u e n t e m e n t e u m dispositivo eletroquí-
100 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
mico 1 9 ou óptico. O e l e m e n t o biológico é capaz de r e c o n h e c e r a
p r e s e n ç a e atividade e / o u c o n c e n t r a ç ã o de u m d e t e r m i n a d o
a n a l i t o e m solução. O r e c o n h e c i m e n t o p o d e ser t a n t o u m a reação
biocatalítica (biosseruor baseado em enzima) quaiiLu u m processo de
ligação (biossemor baseado em afinidade), q u a n d o o e l e m e n t o d e
r e c o n h e c i m e n t o é, p o r exemplo, u m a n t i c o r p o , s e g m e n t o d e
D N A o u receptores celulares. A interação d o e l e m e n t o de reco-
n h e c i m e n t o c o m u m analito-alvo resulta n a m u d a n ç a m e n s u r á v e l
e m p r o p r i e d a d e local d e u m a s o l u ç ã o n a s u p e r f í c i e d o disposi-
tivo, tais c o m o a f o r m a ç ã o d e u m p r o d u t o o u o c o n s u m o d e u m
reagente. O t r a n s d u t o r e n t ã o c o n v e r t e a m u d a n ç a de p r o p r i e d a d e
d a solução e m sinal elétrico. O m o d o d e t r a n s d u ç ã o p o d e ser u m
d e n t r e vários, i n c l u i n d o e l e t r o q u f m i c o e ó p t i c o , b e m c o m o a
m e d i d a d e massa ou calor. A p r e s e n t e discussão será l i m i t a d a aos
b i o s s e n s o r e s baseados e m m o d o s de t r a n s d u ç ã o c l c t r o q u í m i c o s
e ópticos, u m a vez q u e c o m p õ e m a m a i o r i a d o s biossensores
aplicados à clínica,
Biossensores Baseados em Enzimas com
Detecção Amperométrica
Biossensores baseados e m enzimas e f u n d a m e n t a d o s e m t r a n s d u -
tores eletroquímicos, e s p e c i f i c a m e n t e eletrodos a m p e r o m é t r i c o s ,
são a m p l a m e n t e utilizados p a r a análises clínicas e f r e q ü e n t e -
m e n t e citados na literatura. E m 1962, Clarlc e Lyons desenvolve-
r a m u m e l e t r o d o d e e n z i m a para glicose, q u e acopla u m e l e t r o d o
de P ü 2 c o m reação catalisada pela glicose oxidase. A d i m i n u i ç ã o
d e P 0 3 l r e s u l t a n t e d a ação d e glicose oxidase n a glicose, foi pro-
p o r c i o n a l à c o n c e n t r a ç ã o d e glicose d a a m o s t r a . C o m isso, u m a
s o l u ç ã o de glicose oxidase foi f i s i c a m e n t e imobilizada e n t r e a
m e m b r a n a permeável a gás d o e l e t r o d o d e P 0 2 e u m a m e m b r a n a
s e m i p e r m e á v e l externa (Figura 5-10, p r o j e t o geral). A m e m b r a n a
externa p e r m i t i u a d i f u s ã o de s u b s t r a t o (glicose) e oxigênio da
a m o s t r a , mas excluiu p r o t e í n a s e o u t r a s m a c r o m o l é c u l a s .
Se a tensão polarizante d o eletrodo de P 0 2 é invertida, tor-
n a n d o o eletrodo de platina positivo (ânodo) relativamente ao
eletrodo de referência A g / A g C l , e, se a m e m b r a n a permeável a gás
é substituída por u m a m e m b r a n a hidrofílica c o n t e n d o a enzima
imobilizada, é possível oxidar H2O2 p r o d u z i d o pela reação da
glicose oxidase. A c o r r e n t e d o estado de equilíbrio produzida é
d i r e t a m e n t e proporcional à c o n c e n t r a ç ã o d e glicose na amostra.
Platina r~
\
Vidro M l
.
'A
Camada
de enzima
x
Substrato (p ex.,
Diminuição d e
oxigênio dentro da
glicose)
camada de enzima
Figura 5 - 1 0 Ilustração de eletrodo de enzima preparado utilizando-se enzima oxidase imobilizada na
superfície do sensor amperométrico de P0 2 . O aumento na concentração do substrato S reduz a quantidade de
oxigênio presente na superfície do sensor.
N a prática, u m a t e n s ã o s u f i c i e n t e m e n t e alta (sobretensão)
aplicada ao â n o d o de p l a t i n a p a r a c o n d u z i r a oxidação d o p e r c
x i d o d e h i d r o g ê n i o . U m a t e n s ã o de +0,7 volt, ou s u p e r i o r , apli
cada (relativa à A g / A g C l ) é t i p i c a m e n t e utilizada. A Figura 5-1
ilustra o e s q u e m a básico de detecção d o p e r ó x i d o de h i d r o g ê n i o
q u e é a d e q u a d o p a r a a e l a b o r a ç ã o d e sensores de glicose útei:
c l i n i c a m e n t e , mas t a m b é m para a a c o m o d a ç ã o de o u t r o s substra
tos p a r a os quais existem enzimas oxidases a d e q u a d a s para gera
peróxido de hidrogênio.
A imobilização d e enzimas n o s biossensores iniciais era m e r a
m e n t e a r e t e n ç ã o e m u m a m e m b r a n a d e baixo corte de mass;
molecular, e esta a b o r d a g e m é a i n d a utilizada em algumas apli
cações comerciais. M u i t o s o u t r o s e s q u e m a s para a imobilizaçãc
de enzimas p a r a o d e s e n v o l v i m e n t o de biossensores f o r a m suge
lidos. O s mais c o m u n s são (1) ligações cruzadas e n t r e a enzimE
e u m a p r o t e í n a inerte, c o m o a a l b u m i n a bovina sérica (BSA).
utilizando-se g l u t a r a l d e í d o , (2) simples adsorção d a e n z i m a em
superfícies de e l e t r o d o s o u (3) ligação covalente e n t r e a enzima
e carreadores insolúveis, tais c o m o n á i l o n o u vidro. O u t r a técnica
d e imobilização envolve m o d i f i c a ç ã o global d o m a t e r i a l d e ele-
t r o d o , m i s t u r a n d o - s e enzimas c o m pasta de c a r b o n o , q u e serve
t a n t o c o m o matriz de imobilização d e e n z i m a c o m o s u p e r f í c i e
eletroativa.
U m dos p r i m e i r o s sistemas b a s e a d o s e m biossensores para
dosar glicose n o s a n g u e foi comercializado pela Yellow Springs
I n s t r u m e n t s , Inc. (YSI), Yellow Springs, O h i o , e m 1975, e utilizava
detecção a m p e r o m é t r i c a de H 2 0 2 c o m o p r i n c í p i o d e m e d i d a
(Figura 5-11). A d e p e n d ê n c i a d o valor m e d i d o de glicose pela
c o n c e n t r a ç ã o de oxigênio d a a m o s t r a era u m p r o b l e m a , p o r q u e a
q u a n t i d a d e d e oxigênio dissolvido n o s a n g u e é significativamente
inferior à e s t e q u i o m e t r i a necessária para m a n t e r a reação da
glicose oxidase e p r o d u z i r u m a relação linear d o sinal c o m a con-
c e n t r a ç ã o de glicose. Isto é e s p e c i a l m e n t e verdadeiro e m altas
c o n c e n t r a ç õ e s d e glicose e n c o n t r a d a s e m amostras d e pacientes
diabéticos (>500 m g / d L ) . N o p r o j e t o d o YSI, este p r o b l e m a foi
resolvido c o m a diluição de a m o s t r a e soluções de calibração, pelo
m e n o s 1:10 c o m t a m p ã o , assim f i x a n d o a c o n c e n t r a ç ã o d e oxigê-
n i o e m calibrador e a m o s t r a e m u m a c o n c e n t r a ç ã o c o n s t a n t e .
O p r o b l e m a d a limitação d e oxigênio para biossensores rela-
c i o n a d o s ás enzimas oxidases t a m b é m foi resolvido (1) proje-
1N Eletrodo úe
referência
mÊÊÊ Membrana
semipermeável
o> a gás
P 4 HVOÍ
Membrana
semipermeável
 Eletroquímica e Sensores Químicos CAPÍTULO 5 101

+0,7V Eletrodo

MC< ...--£>GOo* P> Produto

Corrente =
glicose] V \/

A
y/ \ v
Ag/AgCl A ••
Ânodo — \J" *" Glicose
de Pt
Figura 5 - 1 2 Esquema mostrando a utilização de mediador
eletioatívo no projeto de eletrodo amperométrico de enzima. O
mediador aceita elétrons diretamente da enzima e é oxidado na
superfície do eletrodo de trabalho, criando um mediador mais oxidado
Membranas para continuar este processo. {De D'Orazio P. Electroehemistty. ín:
externa e Lewandrowski, K, ed. Clinicai ctamísrrç labotaiory managemenL and clinica!
interna correÍíttiotvs, Pliiladelphia: Lippincott, Williams and Wilkms, 2002:464.)
Enzima
imobilizada
cinéticas (pouca o u n e n h u m a s o b r e t e n s ã o ) mais favoráveis q u e a
d o oxigênio p e r m i t e m a o p e r a ç ã o d o sensor e m valores m e n o r e s
de potenciais aplicados (+0,2 V versus A g / A g C l ou inferior) q u e
Ânodo
o n o r m a l m e n t e utilizado p a r a a oxidação de H 2 0 2 . Esta aborda-
de Pt
gem n ã o a p e n a s e l i m i n a a d e p e n d ê n c i a da velocidade de reação
H 2 0 2 - 2e —>0 2 + 2H pelo oxigênio, m a s t a m b é m serve p a r a reduzir a c o n t r i b u i ç ã o d e
Membrana de
baixo corte substâncias oxidáveis i n t e r f e r e n t e s (p. ex., ácido úrico, ácido
de massa ascórbico, a c e t a m i n o f e n o etc.) sobre a resposta d o sensor. Exem-
molecular Glicose B plos de aceptores q u e t ê m sido utilizados i n c l u e m (1) q u i n o n a s ,
Membrana — oxidase (2) sais orgânicos c o n d u t i v o s , c o m o tetratiafulvaleno-tetraciano-
externa q u i n o d i m e t a n o ( T T F - T C N Q ) , e (3) derivados de f e r n c i a n i d a e
_^'uc Ç fbtT) Gluc (. rbc *) ferrocena.
- —- •••._ y O u t r a técnica para d i m i n u i r interferências de espécie facil-
rbc
(frtic) Gluc m e n t e oxidável e m u m a a m o s t r a s a n g u í n e a , q u a n d o a d e t e c ç ã o
Gluc
e l e t r o q u í m i c a d e H 2 0 2 t r a d i c i o n a l f o r utilizada, é e m p r e g a r m e m -
b r a n a s seletivamente permeáveis e m p r o x i m i d a d e c o m a superfí-
Figura 5 - 1 1 Esquema do eletrodo amperométrico de enzima
cie d o eletrodo, q u e p e r m i t e o t r a n s p o r t e de H 2 0 2 para a super-
baseado na detecção anódica de peróxido de hidrogênio gerado a partir
fície d o eletrodo, mas rejeita as substâncias i n t e r f e r e n t e s c o m
de reação de oxidação enzimática (p. ex, glicose oxidase) (A) e visão
base n a exclusão p o r t a m a n h o (Figura 5-11, B). U m exemplo é
ampliada de superfície de sensoriamento mostrando as diferentes
u m a m e m b r a n a de baixo c o r t e d e massa molecular, c o m o o
membranas e os processos eletroquimicos que produzem a corrente
acetato d e celulose, utilizada e m m u i t o s biossensores a m p e r o m é -
anódica proporcional à concentração do substrato na amostra (B). (De
trícos comerciais. T a m b é m são utilizados filmes eletropolimeriza-
Meyerhoff M. New m vitro analyticãl apfiroaches for clinicai chemistiy
dos, tais c o m o poli ( f e n i l e n o d i a m i n a ) , f o r m a d o in si tu p a r a rejei-
memuremenis in criticai eme. Clin Ctam 1990; 36:1570.)
tar substâncias i n t e r f e r e n t e s c o m b a s e n o r a m a n h o . 8 O u t r a abor-
d a g e m comercial envolve a utilização de u m s e g u n d o e l e t r o d o de
correção, i d ê n t i c o ao e l e t r o d o d e trabalho, m a s s e m e n z i m a ,
t a n d o s e membranas semipermeáveis que restringem a difusão d o sensível a p e n a s à p r e s e n ç a d e substâncias i n t e r f e r e n t e s oxidáveis.
analito p r i m á r i o (substrato) p a r a a c a m a d a d e e n z i m a , (2) evi- O sinal diferencial r e s u l t a n t e é proporcional à c o n c e n t r a ç ã o d o
tando-se a s a t u r a ç ã o da e n z i m a e (3) m a n t e n d o - s e a razão de analito.
oxigênio para analito s e m p r e s u p e r i o r a 1. Isto e s t e n d e a lineari- U m a n o v a a b o r d a g e m utilizada p a r a a e l i m i n a ç ã o de substân-
d a d e d e resposta ao analito p a r a c o n c e n t r a ç õ e s s u b s t a n c i a l m e n t e cias eletroativas i n t e r f e r e n t e s e m sensor de glicose, disponível
superiores ao da e n z i m a e reduz a d e p e n d ê n c i a d o sinal ao c o m e r c i a l m e n t e , é d i r e t a m e n t e "telegrafar" o c e n t r o r e d o x d a
oxigênio. M e m b r a n a s externas de p o l i c a r b o n a t o c o m trilhas gra- e n z i m a glicose oxidase para u m e l e t r o d o a m p e r o m é t r i c o metá-
vadas são c o m u m e n t e utilizadas, b e m c o m o m e m b r a n a s de poli lico, utilizando-se hidrogel r e d o x b a s e a d o e m ó s m i o (III/IV). 1 5 O s
(cloreto de vinilo), p o l i u r e t a n o s e e m u l s õ e s de silicone. O u t r a sítios de ó s m i o e f e t i v a m e n t e s e r v e m c o m o m e d i a d o r e s e p o d e m
estratégia é utilizar u m e l e t r o d o d e m a t e r i a l rico e m oxigênio, aceitar elétrons d i r e t a m e n t e da e n z i m a a p r i s i o n a d a , s e m a neces-
q u e serve c o m o reservatório d e oxigênio para auxiliar a biorrea- sidade d e oxigênio. Essa a b o r d a g e m p e r m i t e q u e o p o t e n c i a l de
ção. U m f l u o r o c a r b o n o (óleo Kel-F) foi utilizado p a r a f o r m u l a r o p e r a ç ã o de e l e t r o d o seja d r a m a t i c a m e n t e r e b a i x a d o a +0,2 V
u m e l e t r o d o de pasta d e c a r b o n o q u e age c o m o f o n t e de oxigênio versus S C E ( e l e t r o d o de referência d e c a l o m e l a n o saturado), o n d e
e c o m o e l e t r o d o d e trabalho. 2 1 c o r r e n t e s r e s u l t a n t e s de eletrooxidação d o ascorbato, u r a t o , ace-
A c e p t o r e s de elétrons d i f e r e n t e s d e oxigênio t a m b é m f o r a m t a m i n o f e n o e L-cisteína sejam negligenciáveis.
utilizados n a reação d e glicose oxidase, o q u e e l i m i n o u comple- A s u b s t i t u i ç ã o de o u t r a s enzimas o x o r r e d u t a s e p o r glicose
t a m e n t e q u a l q u e r d e p e n d ê n c i a da resposta a m p e r o m é t r i c a à con- oxidase p e r m i t e a c o n s t r u ç ã o d e biossensores a m p e r o m é t r i c o s
c e n t r a ç ã o de oxigênio d a a m o s t r a . O a c e p t o r de elétrons, geral- para o u t r o s substratos d e interesse clínico. Por exemplo, f o r a m
m e n t e imobilizados j u n t a m e n t e c o m a enzima, t r a n s p o r t a elé- desenvolvidos sensores p a r a m e d i r (1) lactato s a n g u í n e o , (2)
t r o n s à s u p e r f í c i e d o â n o d o , o n d e esse é r e o x i d a d o , r e s u l t a n d o colesterol, (3) p i r u v a t o , (4) a l a n i n a , (5) g l u t a m a t o e (6) g l u t a m i n a .
e m u m m e c a n i s m o de reação cíclica (Figura 5-12). A c e p t o r e s c o m E m adição, c o m a utilização d e cascata m u l t i e n z i m á t i c a , u m
102 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
b i o s s e n s o r a m p e r o m é t r i c o p a r a c r e a t i n i n a t a m b é m foi desenvol-
vido.
Biossensores Potenciométricos e
Condutimétricos Baseados em Enzimas
E l e t r o d o s seletivos para í o n s t a m b é m t ê m sido utilizados c o m o
t r a n s d u t o r e s e m biossensores p o t e n c i o m é t r i c o s . U m exemplo é
o b i o s s e n s o r para uréia (do inglês n i t r o g ê n i o d e uréia s a n g u í n e a ,
B U N ) b a s e a d o e m u m ISE d e p o l i m e m b r a n a (cloreto d e vinilo)
para o íon a m ó n i o (Figura 5-13). A e n z i m a urease é imobilizada
n a superfície de u m ISE seletivo p a r a a m ó n i a , baseado n o anti-
b i ó t i c o n o n a c t i n a (veja a e s t r u t u r a d o l o n ó f o r o n a Figura 5-2), e
catalisa a hidrólise d e uréia a N H 3 e C O ^ . A a m ó n i a p r o d u z i d a
dissolvesse para f o r m a r N H / , q u e é p e r c e b i d o p e l o ISE. O sinal
g e r a d o pelo N H 4 T p r o d u z i d o é p r o p o r c i o n a l ao l o g a r i t m o da
c o n c e n t r a ç ã o de uréia d a a m o s t r a . A resposta p o d e ser o e s t a d o
e s t a c i o n á r i o ou o transitório. T i p i c a m e n t e , a correção d e r u í d o
d e f u n d o d e potássio é necessária p o r q u e o i o n ó f o r o n o n a c t i n a
a p r e s e n t a seletividade l i m i t a d a p a r a a m ó n i a sobre c potássio
(Knh4+/k = Ojl)- O potássio é m e d i d o s i m u l t a n e a m e n t e com uréia
e é utilizado para corrigir a saída d o sensor de uréia utilizando-se
a e q u a ç ã o d e Nicolsky-Eisenman (equação 10).
A a b o r d a g e m descrita a n t e r i o r m e n t e p a r a m e d i r uréia, utili-
zando-se u m biossensor p o t e n c i o m é t r i c o b a s e a d o em enzima,
a s s u m e q u e a renovação d e c o n c e n t r a ç ã o de a m ó n i a , a partir de
u r é i a n o estado estacionário, f o r n e c e u m a relação c o n s t a n t e e n t r e
íons a m ó n i o e uréia, i n d e p e n d e n t e d a c o n c e n t r a ç ã o . R a r a m e n t e
este é o caso, especialmente e m c o n c e n t r a ç õ e s elevadas de subs-
trato, r e s u l t a n d o e m u m a resposta n ã o linear d o sensoT. A line-
a r i d a d e d o sensor t a m b é m é l i m i t a d a p e l o f a t o d e a hidrólise d a
Nonactina —
Camada com urease
uiuirna asso-
2NH* i COg « — uréia
ciada por
ligação * /
cruzada / ( rbc { rbc) •
uréia
ureia / K'
rbc j
rbc ( rbc)
uréia
F i g u r a 5 - 1 3 Eletrodo potenciométrico de enzima para determinação
da uréia sanguínea, baseado na imohilizacãa da enzima urease na
superfície de eletrodo de membrana polimérica seletivo para ions de
amAnia.
uréia p r o d u z i r p H local alcalino n a v i z i n h a n ç a d a m e m b r a n a de
s e n s o r i a m e n t o de a m ó n i o , c o n v e r t e n d o p a r c i a l m e n t e N H / e m
N H 3 (pKa 9,3). A a m ó n i a ( N l l j ) a ã u é p e r c e b i d a p e l o ISE. O
grau de n ã o l i n e a r i d a d e p o d e ser r e d u z i d o pela inserção d e u m a
m e m b r a n a s e m i p e r m e á v e l e n t r e e n z i m a e amostr a p a r a restringir
a d i f u s ã o de uréia p a r a a c a m a d a d e e n z i m a imobilizada.
A m u d a n ç a de c o n d u t i v i d a d e de solução t a m b é m t e m sido
utilizada c o m o u m m e c a n i s m o d e t r a n s d u ç ã o e m biossensores
b a s e a d o s e m enzimas. O s e x e m p l o s i n c l u e m m e d i d a s d e glicose,
c r e a t i n i n a e a c e t a m i n o f e n o , utilizando-se eletrodos interdigitais. 7
E m f u n ç ã o d a variação do r u í d o de f u n d o iônico de a m o s t r a s
clínicas e d a exigência e m m e d i r p e q u e n a s variações d e c o n d u t i -
v i d a d e de u m m e i o c o m força iônica elevada, as aplicações prá-
ticas de biossensores c o n d u t i m é t r i c o s são p o u c a s . U m sistema
comercial para m e d i r uréia de soro, p l a s m a e u r i n a é o a n a l i s a d o r
B U N ( B e c k m a n - C o u l t e r , F u l l e r t o n , CA), b a s e a d o n a e n z i m a
urease. A dissolução d e p r o d u t o s a N H ^ 4 e H C O j " gera u m a
m u d a n ç a n a c o n d u t i v i d a d e d a a m o s t r a . A taxa inicial d e variação
d e c o n d u t i v i d a d e é m e d i d a p a r a c o m p e n s a r a c o n d u t i v i d a d e de
f u n d o da a m o s t r a . Esta a b o r d a g e m é l i m i t a d a a dosagens de
analitos e m c o n c e n t r a ç õ e s r e l a t i v a m e n t e elevadas e m f u n ç ã o das
p e q u e n a s alterações n a c o n d u t i v i d a d e p r o d u z i d a s p o r baixas con-
centrações de analito.
Biossensores Baseados em Enzimas com
Detecção Óptica
Sensores ópticos c o m enzimas e c o r a n t e s i n d i c a d o r e s imobiliza-
d o s f o r a m desenvolvidos para m e d i r glicose e o u t r o s substratos
de interesse clínico. Estes biossensores c o n t a m c o m a b s o r v â n c i a /
reflexão, f l u o r e s c ê n c i a e l u m i n e s c ê n c i a c o m o m o d o s d e detecção
d e valores de p H e oxigênio. O s m é t o d o s d e imobilização de
enzimas l e m b r a m aqueles utilizados p a r a c o n s t r u i r biossensores
eletroquimicos, i n c l u i n d o a p r i s i o n a m e n t o físico ou encapsula-
m e n t o n a matriz de u m gel, adsorção física e m substratos e
ligação covalente ou absorção e m u m s u p o r t e insolúvel. Utili-
zando-se u m exemplo b a s e a d o n u m o p t o d o para P02l u m indi-
c a d o r sensível é co-imobilizado c o m u m a enzima oxidase, n a
e x t r e m i d a d e d e u m a s o n d a d e f i b r a óptica. A s o n d a é utilizada
para m o n i t o r a r a fluorescência d o i n d i c a d o r . A a t e n u a ç ã o de
f l u o r e s c ê n c i a d o i n d i c a d o r pelo 0 2 a c o n t e c e n a s e q ü ê n c i a . A
d i m i n u i ç ã o n a P 0 2 r e s u l t a n t e d e u m a reação catalisada pela
e n z i m a resultará e m m e n o r a t e n u a ç ã o d o i n d i c a d o r f l u o r e s c e n t e
e u m sinal d i r e t a m e n t e p r o p o r c i o n a l à c o n c e n t r a ç ã o d o subs-
trato. E m u m exemplo d e s o n d a d e b i o s s e n s o r óptico para glicose,
u m c o r a n t e c a t i õ n i c o sensível ao oxigênio (Ru[fen] 3 z + ) é imobili-
zado, j u n t a m e n t e c o m a glicose oxidase, n a superfície de u m a
fibra óptica. 1 4 A d i m i n u i ç ã o na P 0 2 , d e c o r r e n t e de oxidação
enzimática d e glicose, resulta e m u m a u m e n t o n a i n t e n s i d a d e d e
l u m i n e s c ê n c i a d o r u t ê n i o tris ( f e n a n t r e n o ) .
Biossensores ópticos similares f o r a m p r e p a r a d o s para o u t r o s
analitos. Por exemplo, u m biossensor óptico para colesterol foi
e l a b o r a d o c o m base e m a t e n u a ç ã o de f l u o r e s c ê n c i a de u m c o r a n t e
sensível ao oxigênio, q u e é a c o p l a d o ao c o n s u m o d e oxigênio
r e s u l t a n t e d a oxidação enzimática d e colesterol pela e n z i m a coles-
terol oxidase. 2 0 B i l i r r u b i n a sérica foi d e t e c t a d a utilizando-se bilir-
r u b i n a oxidase, co-imobilizada c o m o c o r a n t e r u t ê n i o , e m fibra
ó p t i c a . " Foi r e l a t a d o q u e sensoT de b i l i r r u b i n a a p r e s e n t a baixo
limite d e detecção, d e 10 p m o l / L , faixa linear até 3 0 m m o l / L e
r e p r o d u t i b i l i d a d e típica de 3 % (coeficiente d e variação [CV]),
c e r t a m e n t e a d e q u a d o p a r a aplicações clínicas.
A m u d a n ç a de p H r e s u l t a n t e d e reações enzimáticas t a m b é m
foi m e d i d a o p t i c a m e n t e . O c o r a n t e i n d i c a d o r f i u o r e s c e í n a é fre-
q ü e n t e m e n t e utilizado c o m o i n d i c a d o r sensível ao p H p a r a cons-
truir tais sensores. A f o r m a p r o t o n a d a de f i u o r e s c e í n a n ã o p r o d u z
 Eletroquímica e S e n s o r e s Químicos CAPÍTULO 5 103

f l u o r e s c ê n c i a , m a s a base c o n j u g a d a a p r e s e n t a f o r t e f l u o r e s c ê n c i a e v i t a n d o , assim, a n e c e s s i d a d e d e a l g u m a etapa de r e g e n e r a ç ã o

a 5 3 0 n m , q u a n d o excitado a 4 9 0 n m . U t i l i z a n d o glicose oxidase
c o m o e n z i m a , u m o p t o d o de p H foi e m p r e g a d o p a r a a c o m p a n h a r
a f o r m a ç ã o d e ácido glicônico. A d e s v a n t a g e m de sensores ópticos
b a s e a d o s e m m u d a n ç a s de p H é q u e eles são f o r t e m e n t e d e p e n -
d e n t e s d e p H e d a c a p a c i d a d e t a m p o n a n t e da a m o s t r a . A l é m
disso, a faixa de t r a b a l h o d o s e n s o r é d e t e r m i n a d a pela p K a do
i n d i c a d o r , de 6,8 a 7,2 p a r a a f i u o r e s c e í n a , d e p e n d e n d o d a força
iônica da matriz de a m o s t r a . U m i n d i c a d o r sensível ao p H
t a m b é m p o d e ser utilizado p a r a m o n i t o r a r reações enzimáticas
p r o d u t o r a s de a m ó n i a (p. es., a ação d a u r e a s e s o b r e a uréia).
Sensores de Afinidade
S e n s o r e s d e a f i n i d a d e c o n s i s t e m e m u m a classe especial de bios-
sensores e m q u e os e l e m e n t o s d e r e c o n h e c i m e n t o s biológicos
imobilizados são o b r i g a t o r i a m e n t e p r o t e í n a s , a n t i c o r p o s (imu-
n o s s e n s o r e s ) o u o l i g o n u c l e o t í d e o s (p. ex., D N A , R N A , aptâme-
ros etc.) c o m altas a f i n i d a d e e especificidade p a r a u m analito
c l i n i c a m e n t e i m p o r t a n t e . Esses sensores f o r a m desenvolvidos
c o m o alternativas aos ensaios c o n v e n c i o n a i s p a r a a u m e n t a r a
v e l o c i d a d e e a c o n v e n i ê n c i a de u m vasto n ú m e r o d e testes q u e
s e r i a m n o r m a l m e n t e e x e c u t a d o s e m a n a l i s a d o r e s de i m u n o e n -
saio sofisticados. D e m a n e i r a ideal, a ligação direta e n t r e a espécie
imobilizada e o respectivo alvo e m u m a a m o s t r a clínica deve
p r o d u z i r u m sinal p r o p o r c i o n a l à c o n c e n t r a ç ã o d o a n a l i t o . N o
e n t a n t o , o s e n s o r i a m e n t o "direto" e m c o n c e n t r a ç õ e s de analito
q u e c o b r e m t o d a a g a m a de aplicações clínicas é m u i t o difícil de
alcançar. A l é m disso, a g r a n d e a f i n i d a d e d e tais reações de
ligação, necessária p a r a atingir a s e n s i b i l i d a d e ó t i m a , t a m b é m
limita a reversibilidade destes dispositivos. A s s i m , sensores eletro-
químicos baseados em afinidade, ópticos ou em outros modos
d e t r a n s d u ç ã o , são t i p i c a m e n t e dispositivos d e utilização única,
( m u d a n ç a d e p H etc.) p a r a a dissociação d a ligação f o r t e e n t r e o
e l e m e n t o de r e c o n h e c i m e n t o e o alvo.
Esses sensores, q u e são utilizados n a clínica, t i p i c a m e n t e são
b a s e a d o s e m reagentes m a r c a d o s , tais c o m o enzimas, f l u o r ó f o r o s ,
e t i q u e t a s e l e t r o q u í m i c a s , e, p o r c o n s e g u i n t e , f u n c i o n a m m a i s
c o m o i m u n o e n s a i o s / e n s a i o s de ligação t r a d i c i o n a i s , exceto p e l o
f a t o de q u e u m e l e m e n t o d e r e c o n h e c i m e n t o é i m o b i l i z a d o n a
s u p e r f í c i e de u m e l e t r o d o a d e q u a d o o u o u t r o t i p o d e t r a n s d u t o r .
Por e x e m p l o , sensores e l e t r o q u í m i c o s de oxigênio f o r a m u s a d o s
p a r a executar i m u n o e n s a i o s enzimáticos h e t e r o g ê n e o s (do t i p o
s a n d u í c h e o u competitivo), u t i l i z a n d o catalases c o m o e n z i m a
m a r c a d o r a (catalisa H2O2 —> 2 H + e O2) e i m o b i l i z a n d o a n t i c o r p o s
de c a p t u r a s o b r e a s u p e r f í c i e exterior da m e m b r a n a p e r m e á v e l a
gás. A p ó s as etapas d e e q u i l í b r i o e lavagem, a q u a n t i d a d e d e
e n z i m a ligada é d e t e c t a d a pela adição de s u b s t r a t o e pelo acom-
p a n h a m e n t o d o a u m e n t o d e c o r r e n t e gerada, e m f u n ç ã o d a
p r o d u ç ã o local de oxigênio p r ó x i m o à s u p e r f í c i e d o sensor.
F o r a m desenvolvidos i m u n o e n s a i o s enzimáticos h e t e r o g ê n e o s ,
baseados em detecção de peróxido por eletrodo, com o uso de
e t i q u e t a s de e n z i m a oxidase o u alterações d e p H u t i l i z a n d o a
urease como u m a enzima rotuladora.
S e n s o r e s de a f i n i d a d e b a s e a d o s e m ligação de oligonucleóti-
deos t a m b é m estão disponíveis. Por exemplo, foi desenvolvida
u m a série d e sensores d e D N A , o n d e u m s e g m e n t o de D N A
c o m p l e m e n t a r à fita-alvo é i m o b i l i z a d o e m u m s e n s o r eletroquí-
m i c o a d e q u a d o . Estes dispositivos o p e r a m direta ( c o m b a s e n a
o x i d a ç ã o e l e t r o q u í m i c a d a g u a n i n a n o DNA-alvo) (Figura 5-14,
A) o u i n d i r e t a m e n t e ( c o m m a r c a d o r e s / r ó t u l o s e l e t r o q u í m i c o s
e x ó g e n o s (veja o texto a seguir e a Figura 5-14, B) e m m o d o s de
t r a n s d u ç ã o . Por e x e m p l o , foi d e m o n s t r a d o u m "sensor geno"
e l e t r o q u í m i c o sem r ó t u l o r e l a t i v a m e n t e simples paTa d e t e c ç ã o da

A Sonda de captura Amostra Oxidação de guanina no DNA-alvo

1..-T
I I 1 1 1 1 UC 1 I I
A I AT T 1CC

"1 1 ] I I ] I I / 11 11

)
1 i 1 1 0 O 1 1
A I ATT I C C
v I I 1 1
/ V -.

v
1 v
A I AT T I C C W / C
A s , /

Espécie de intercalação redox

B Senda de captura Amostra de oxidação/redução

I.--T Ox I I I I I I I I
:
L.-C Ox
cX
A I A T T I C C O* Ox Ox Ox
Ox I I I I I I I I

~i 1 1
A I AT T I CC
i 1 1 .V®,
%
A
I I
.Ox. Ox
I
1—I
I I
I
Ox , Ox
I
I
I
I
I

I I I 1
Sa
~i I l i I I I 11
A I AT T I CC
n
; S.Rad

F i g u r a 5 - 1 4 Exemplos de configurações de biossensores de DNA: (A) detecção direta de eletrooxidação de bases

de guanosina no DNA-alvo após hibridação com sonda de captura imobilizada tia superfície do eletrodo, (B)
eletrodetecção de hibridação utilizando espécies redox exógenas que se inceicalam em complexo hibridado, entre a
sonda de DNA de captura imobilizada e o DNA-alvo.
104 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
p r e s e n ç a d e m u t a ç õ e s d e L e i d e n n o fator V, utilizando s o n d a s
de c a p t u r a c o m a i n o s i n a s u b s t i t u i n d o g u a n o s i n a d e ácidos
nacléicos. 1 6 S o n d a s t a m b é m f o r a m desenvolvidos para se ligarem
ao D N A selvagem e m u t a n t e , c o m base n o c o n h e c i m e n t o de
s e q ü ê n c i a s d e bases d o D N A selvagem e m u t a n t e na região da
m u t a ç ã o . Estas s o n d a s f o r a m imobilizadas n a superfície d o s ele-
t r o d o s d e t r a b a l h o d e pasta d e c a r b o n o . A p ó s a amplificação e m
cadeia d a p o l i m e r a s e ( P C R ) d a amos t ra d e D N A , u m p e q u e n o
v o l u m e dessas a m o s t r a s (10 (iL) é i n c u b a d o d u r a n t e seis m i n u t o s
c o m e l e t r o d o d e s o n d a m o d i f i c a d a . E m seguida, após u m a r á p i d a
e t a p a d e lavagem, a p r e s e n ç a d o amplicon-alvo ligado à superfície
é o b s e r v a d a p o r voltametria de p u l s o diferencial utilizando-se
v a r r e d u r a a n ó d i c a . A p r e s e n ç a d e u m pico de oxidação de
g u a n i n a , q u e o c o r r e e m +1,00 V versus referência de A g / A g C l ,
indica a p r e s e n ç a d o DNA-al vo n a amos t ra original.
Diversos a r r a n j o s de sensores d e "genes" utilizam oligonucle-
otídeos m a r c a d o s e l e t r o q u i m i c a m e n t e ou s o n d a s eletroquímicas
q u e estão inseridas seletivamente e m D N A d u p l e x h i b r i d a d o s .
C o m o ilustrado n a Figura 5-14, B, q u a n d o n ã o se estiver utili-
z a n d o a eletro atividade i n t r í n s e c a d a g u a n i n a {que r e q u e r s o n d a s
d e oligo de c a p t u r a imobilizada e m eletrodos, c o m a inosina
s u b s t i t u i n d o g u a n o s i n a , veja a n t e r i o r m e n t e ) , a detecção d a hibri-
d a ç ã o d a s e q ü ê n c i a d e DNA-al vo é alcançada e m u m a das duas
m a n e i r a s . E m u m a a b o r d a g e m , após p e r m i t i r a ligação d o oligo
de c a p t u r a imobilizado d o a n c o r a d o à superfície d o e l e t r o d o à
seqüência-alvo, a h i b r i d a ç ã o é d e t e c t a d a pela exposição d a super-
fície d o e l e t r o d o a u m a espécie eletroativa exógena ( C o [III]
tris-fenantrolina, c o m p l e x o s d e r u t ê n i o etc.) q u e interage (inter-
cala) c o m o duplex, m a s n ã o c o m D N A de fita simples. A p ó s a
r e m o ç ã o d e espécies eletroativas n ã o associadas p o r lavagem, a
p r e s e n ç a d a h i b r i d a ç ã o é f a c i l m e n t e detectada p o r voltametria,
v a r r e n d o o potencial d o e l e t r o d o s u b j a c e n t e para oxidar ou
reduzir q u a l q u e r espécie eletroativa intercalada, s e n d o q u e o
nível d e c o r r e n t e d e t e c t a d a é p r o p o r c i o n a l ao n ú m e r o d e espécies
de D N A d u p l e x n a superfície d o eletrodo.
U m a s e g u n d a a b o r d a g e m envolve a detecção de DNA-alvo via
ensaio d e ligação d o t i p o s a n d u í c h e , utilizando u m oligonucleo-
t í d e o m a r c a d o e l e t r o q u i m i c a m e n t e (oligo m a r c a d o c o m ferro-
ceno, ó s m i o [III] t r i s b i p i r i d i n a etc. p a r a ligar-se a o u t r a s e q ü ê n c i a
de DNA-alvo d i f e r e n t e da d o oligo de captura imobilizado n a
s u p e r f í c i e d o eletrodo). Exposição s e q ü e n c i a l d o e l e t r o d o à
a m o s t r a de D N A ( g e r a l ment e após amplificação p o r P C R ) , u
excesso de oligo r e p ó r t e r m a r c a d o é r e m o v i d o p o r lavagem, e, e m
seguida, o m a r c a d o r ligado à superfície é e l e t r o q u i m i c a m e n t e
medido. Novamente, a quantidade de corrente medida é propor-
cional ao n ú m e r o de espécies de DNA-alvo p r e s e n t e n a a m o s t r a
inicial.
REFERÊNCIAS
1. Apple FS, Koch DD, Graves S, Ladenson JH. Relationship berween
direct potentiometric and flame photometric measurement of sodium in
blood. Clin Chem 1982;28:1931-5.
2. Astrup P, Severinghaus JW. The hístory of blood gases, acids and bases.
CopenhagemMunksgaard, 1986.
3. Bates RG. Determination of pH: theory and piactice. New York: John
Wiley & Sons, 1973.
4. Eedioui F, Villeneuve N. Electrochemical nitric oxide sensors for
biological samples: principie, selected exampies and applications.
Electroanalysis 2003;15:5-18.
5. Btjster P, Vader HL, Vink CLJ. Influence of erythrocytes on direct
potentiometric determination of sodium and potassium. Ann Clin
Biochem 1983;20:116-20.
6. Coulier WH. Means for counting parti cies suspended in a fluid.
LIS Parent 2,656,508, Oct 20, 1953. Washington DC: US Patent
Office.
7 Cullen D, Sethi R, Lowe C. A multi-analyte miniature conductance
biosensor. Anal Chim Acta 1990;231:33-40.
8. Emr S, Yacynych A. Use of polymer films in amperometric biosensors.
Electroanalysis 1995;7:913-23.
9. Feldman BJ, Oserioh JD, Hata BH, D'Alessandro A. Determinadon of
lead in blood by square wave anodic stripping voltammetry at a carbon
disk ultramicroelectrode. Anal Chem 1994;66 1983-7.
10. Lcc HJ, Yoon IJ, Yoo CL, Pyun HJ, Cha GS, Nam H. Potentiometric
evaluatinn of solvenr polymeric carbonate-selective membranes based on
molecular tweezer-type neutral camers. Anal Chem 2000;72:
4694-9.
11. Li X, Rosenwcig Z. A fiber-optic sensor for rapid analysis of bilirubin in
seium. Anal Chim Acta 1997;353:263-73.
12. Ma SC, Meyerhoff ME, Yang V. Heparin-responsive electrochemical
sensor: a preliminary report. Anal Chem 1992;64:694-7.
13. Mathison S, Bakker E. Effect of transmembtane electrolyte diffusion on
the detection limk of carrier-based potentiometric ion sensors. Anal
Chem 1998;70:303-9.
14. Moreno-Bondi MC, Wnlfbeis OS, Leinei MJP, Schaffar BPH. Oxygen
optode for use in a fiber-opttc glucose biosensor. Anal Chem
1990;62:2377-80.
15. Ohara TJ, Rajagopalan R, Heller A. "Wired" enzyme ele ctro d es for
amperometric determination of glucose or lactate in the presence of
intetfering substances. Anal Chem 1994;66:2451-7.
16. Ozkan D, Erdem A, Kara P, Ketman K, Meric B, Hassmann J, et al.
Allele-speciftc genotype detection of factor V leiden mutation from
polymerasc chain reaction amplicons based on label-free e 1 ectrochemical
genosensor. Anal Chem 2002:74:5931-6.
17. Pioda LA, Simon W, Bosshard HR, Curtius CH. Determination of
potassium íon concentration in serum using a highly selective liquid-
membrane electrodc. Clin Chim AtU 1970;29-289-93.
18. Robinson DL, Venton BJ, Helen MLAV, Wightman RM. Detecting sub-
second dopamine release with fast-scan voltammetry in freely moving
rats. Clin Chem 2003;49:1763-73.
19. Thevenot DR, Toth K, Durst RA, Wilson GS. Electrcchemical
biosensors: recommended definitions and classifications. Biosen
Bioelectron 2001;16:121-31.
20. Trettnak W, Wolfbeis OS. A fiber-optic cholesterol hiosensor with
an oxygen optrode as the transducer. Anal Biochem 1990; 184:
124-7,
21. Wang J, Lu F Oxygen rich oxidase enzyme electrodes for operation in
oxygen-free solutions. J Am Chem Soe 1998;120:1048-50.
CAPÍTULO 6
Raymond E. Karcher, Ph.D., e James P. Landers, Ph.D.
OBJETIVOS
1. Definir "eletroforese" e dar uma breve descrição da teoria da
eletroforese.
2. Citar os usos dos procedimentos eletroforéticos em um laboratório.
3. Citar as funções dos seguintes constituintes em um procedimento
eletroforético: tampões, corantes, meios de suporte e fonte de
energia.
4. Discutir separação, detecção e quantificação em um procedimento
eletroforético.
5. Listar cinco tipos diferentes de eletroforese.
6. Definir "blotting" e seu uso em um laboratório clínico.
7. Definir eletroendosmose.
8. Identificar como cada um dos seguintes fatores afeta a eletroforese;
pH inapropriado do tampão, eletroendosmose, solução de coloração
deficiente, sobrecarga de amostra, voltagem alta, meio de suporte
inapropriado e amostra hemolisada.
9. Listar os componentes essenciais de um sistema de eletroforese
capilar.
10. Citar três vantagens da eletroforese capilar sobre a eletroforese
convencional.
11. Descrever a diferença entre injeção de amostra hidrodinâmica e
eletrocinética na eletroforese capilar.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A n f ó l i t o : U m a molécula q u e c o n t é m grupos ácidos e básicos
( t a m b é m d e n o m i n a d a zwitterion).
Cromatografia Eletrocinética Micelar (MEKC): U m híbrido
de eletroforese e c r o m a t o g r a f i a e n v o l v e n d o a adição de
agentes q u í m i c o s ao t a m p ã o para p r o d u z i r micelas, as quais
auxiliam na separação de moléculas sem carga.
Densitometria: U m método instrumental para medir a
absorvância, a r e f l e c t â n c i a ou a fluorescência de cada
f r a ç ã o separada e m u m a fita eletroforética (ou o u t r o meio)
à m e d i d a q u e esta passa p o r u m sistema óptico de m e d i ç ã o .
E l e t r o f e r o g r a m a : U m a r e p r e s e n t a ç ã o d e n s i t o m é t r i c a de zonas
de p r o t e í n a s e m u m m a t e r i a l de s u p o r t e após separação e
coloração
E l e t r o f o r e s e ; A m i g r a ç ã o de p a r t í c u l a s ou solutos carregados
e m u m m e i o l í q u i d o s o b a i n f l u ê n c i a de u m c a m p o
elétrico.
E l e t r o f o r e s e C a p i l a r : U m m é t o d o n o qual as técnicas clássicas
d e eletroforese e m placa são realizadas e m u m t u b o capilar
de sílica f u n d i d a de p e q u e n o calibre.
E l e t r o f o r e s e e m M í c r o c h i f : U m tipo de eletroforese o n d e a
separação é c o n d u z i d a e m canais f l u i d o s e m u m microchif.
E l e t r o f o r e s e p o r Focalização I s o e l é t r i c a (IEF): U m m é t o d o
eletroforético q u e separa c o m p o s t o s anfotéricos e m u m
m e i o q u e c o n t é m u m g r a d i e n t e de p H estável.
*Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições originais dos D rs.
Emmanucl Epstein e Kern L. Kluttall, nas quais se baseiam partes deste capítulo.
Eletroforese*
E n d o s m o s e (fluxo e n d o s m ó t i c o , e l e t r o e n d o s m ó t i c o ) j
M o v i m e n t o preferencial da água e m u m a direção através d e
u m m e i o eletroforético devido à ligação seletiva d e u m t i p o
de carga na superfície d o meio.
M o b i l i d a d e E l e t r o f o r é t i c a : A velocidade d e m i g r a ç ã o ( c m / s ) de
u m s o l u t o carregado e m u m c a m p o elétrico, expressa pela
u n i d a d e de força d o c a m p o (volts/cm). Ela t e m o s í m b o l o
\x e u n i d a d e s de cm 2 /(V)(s).
P r o t e ô m i c a : U m tipo de análise r e l a c i o n a d o às m u d a n ç a s
globais da expressão de p r o t e í n a s q u a n d o visualizadas mais
c o m u m e n t e p o r eletroforese e m gel b i d i m e n s i o n a l e
analisadas p o r espectrometria de massa.
Wicít Flow (Fluxo p o r C a p i l a r i d a d e ) : M o v i m e n t o da água d o s
reservatórios de tampão e m direção ao centro de u m gel ou
u m a fita de eletroforese p a r a reposição da água p e r d i d a pela
evaporação.
A
eletroforese é u m a técnica analítica p o d e r o s a e versátil
capaz de separar e analisar u m a v a r i e d a d e de analitos
ionizados. Este capítulo discute as d e f i n i ç õ e s e os concei-
tos básicos, a teoria, a descrição e os tipos de eletroforese, i n c l u i n d o
as eletroforeses p o r microchifi e capilar e suas aplicações n a rotina
d o laboratório clínico, assim c o m o os campos e m desenvolvi-
m e n t o da g e n ô m i c a e da p r o t e ô m i c a .
CONCEITOS BÁSICOS E DEFINIÇÕES
E l e t r o f o r e s e é u m t e r m o a b r a n g e n t e q u e se refere à migração de
partículas ou solutos carregados e m u m m e i o l í q u i d o sob a influ-
ência de u m c a m p o elétrico, /onto/orese é u m t e r m o similar, mas
se aplica s o m e n t e à migração de íons p e q u e n o s . Eletroforese de
zona é a técnica mais c o m u m e n t e u s a d a e m aplicações clínicas.
Nesta técnica, as moléculas carregadas m i g r a m e m zonas, n o r m a l -
m e n t e e m u m m e i o de s u p o r t e poroso, c o m o u m gel de agarose,
após a a m o s t r a ter sido m i s t u r a d a a u m a s o l u ç ã o t a m p ã o . E
gerado u m e l e t r o f e r o g r a m a , u m a r e p r e s e n t a ç ã o d e zonas de pro-
teínas, cada u m a f i n a m e n t e separada das zonas vizinhas, sobre o
material d e s u p o r t e . As zonas de p r o t e í n a são visualizadas q u a n d o
o m e i o de s u p o r t e é c o r a d o c o m u m c o r a n t e especifico para
p r o t e í n a ; o m e i o é, e n t ã o , seco, e as zonas são q u a n t i f i c a d a s e m
u m d e n s i t ô m e t r o . O m e i o de s u p o r t e é seco e m a n t i d o c o m o u m
registro p e r m a n e n t e .
TEORIA DA ELETROFORESE
E m u m sistema eletroforético, as espécies químicas, as quais
a d q u i r e m carga elétrica ao se t o m a r e m ionizadas, movem-se e m
direção ao c á t o d o (eletrodo negativo) ou ao â n o d o (eletrodo
positivo), d e p e n d e n d o d o t i p o d e carga q u e p o s s u e m . O s í o n s
positivos (cátions) m i g r a m e m direção ao c á t o d o e os íons nega-
tivos (ânions) m i g r a m e m direção ao â n o d o (Figura 6-1). U m
a n f ó l i t o , u m a molécula q u e é carregada p o s i t i v a m e n t e o u nega-
tivamente, a d q u i r e u m a carga positiva (liga p r ó t o n s ) e m u m a
solução mais ácida d o q u e seu p o n t o isoelétrico (pi),* e migra e m
direção ao cátodo. E m u m a solução mais alcalina, o anfólito está
105
106 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

0
— 2 2 —

r n
Fonle de energia:
corrente constante ou
voltagem constante
Cátodo
(eletrodo
F i g u r a 6 - 2 Um diagrama esquemático de um aparelho de
negativo)
eletroforese típico mostrando dois reservatórios para tampão com placas
lisas para direcionar o fluxo de energia (1J, eletrodos (2J, suporte
eletroforético (3J, fitas de contara (4), tampa (5) e fonte de energia.

P o r t a n t o , a m o b i l i d a d e eletroforética é d i r e t a m e n t e p r o p o r c i o n a l
à carga líquida e i n v e r s a m e n t e p r o p o r c i o n a l ao t a m a n h o mole-
cular e à viscosidade d o m e i o eletroforético.
O u t r o s fatores q u e a f e t a m a m o b i l i d a d e i n c l u e m o fluxo
e n d o s m ó t i c o (discutido p o s t e r i o r m e n t e ) e o <wick flow (fluxo p o r
c a p i l a r i d a d e ) . O ú l t i m o resulta d o calor g e r a d o p e l o processo
eletroforético, o q u e causa e v a p o r a ç ã o d o solvente d o s u p o r t e .
Este efeito de secagem faz o t a m p ã o subir p a r a o s u p o r t e eletro-
forético a p a r t i r d e a m b o s os c o m p a r t i m e n t o s de t a m p ã o . Este
f l u x o de t a m p ã o a partir d e a m b a s as direções é c h a m a d o u<icít
floiv e afeta a migração d e p r o t e í n a s e, p o r t a n t o , a m o b i l i d a d e .

DESCRICÃO DA TÉCNICA
Figura 6-1 Movimento de cátions e âniotis em um campo elétrico. A i n s t r u m e n t a ç ã o d a eletroforese, os reagentes e o p r o c e d i m e n t o
geral são discutidos n e s t a seção.

n e g a t i v a m e n t e ionizado (libera p r ó t o n s ) e migra e m direção ao
â n o d o . C o m o as p r o t e í n a s c o n t ê m m u i t o s g r u p o s a m i n o ( - N H 2 )
e carboxila ( - O O O H ) ionizáveis, elas se c o m p o r t a m c o m o anfó-
litos e m solução.
A velocidade d e migração é d e p e n d e n t e d e fatores tais c o m o
(1) carga elétrica liquida d a m o l é c u l a , (2) t a m a n h o e f o r m a d a
m o l é c u l a , (3) fnrça d o c a m p o elétrico, (4) p r o p r i e d a d e s d o m e i o
de s u p o r t e c (5) t e m p e r a t u r a de operação. A m o b i l i d a d e eleLru-
f o r é t i c a (p) é d e f i n i d a c o m o a velocidade de m i g r a ç ã o ( c m / s ) p o r
u n i d a d e de força d e c a m p o (volts/cm). A E q u a ç ã o 1 expressa a
m o b i l i d a d e eletroforética e é derivada de d u a s f ó r m u l a s : u m a
e x p r e s s a n d o a força de i m p u l s o d o c a m p o elétrico sobre o íon e
a o u t r a e x p r e s s a n d o a força de r e t a r d a m e n t o causada pela resis-
tência friccionai d o m e i o . 5
Instrumentação e Reagentes
U m d i a g r a m a e s q u e m á t i c o de u m sistema de eletroforese conven-
cional é m o s t r a d o n a Figura 6-2. Dois reservatórios (1), c o m
placas lisas para c o n t r o l a r o f l u x o d e energia, c o n t ê m o t a m p ã o
u s a d o n o processo. C a d a reservatório de t a m p ã o c o n t é m u m
e l e t r o d o (2) feito de p l a t i n a o u d e c a r b o n o , cuja p o l a r i d a d e é
d e t e r m i n a d a pelo m o d o d e c o n e x ã o à f o n t e d e energia. O s u p o r t e
eletroforético (3), n o qual a separação ocorTe, p o d e c o n t a t a r o
t a m p ã o d i r e t a m e n t e , ou por m e i o d e fitas de c o n t a t o (4). T o d o
o e q u i p a m e n t o é c o b e r t o (5), para m i n i m i z a r a evaporação e
proteger o sistema, e é ligado p o r u m a f o n t e de c o r r e n t e direta.
F o n t e s d e Energia
A f u n ç ã o d e u m a f o n t e d e energia e m u m processo eletroforético
é f o r n e c e r força elétrica. As f o n t e s de energia disponíveis comer-
c i a l m e n t e p e r m i t e m a o p e r a ç ã o e m c o n d i ç õ e s c o n s t a n t e s de (1)
c o r r e n t e , (2) voltagem ou (3) potência, s e n d o todas ajustáveis. O
f l u x o d e c o r r e n t e através d e u m m e i o q u e oferece resistência
elétrica está associado à p r o d u ç ã o d e caloT Joule:

onde C a l o r - (E)(í)(t) (Z)

ji = m o b i l i d a d e elerr o forética e m cm 2 /(V)(s)
Q • a carga l í q u i d a d o íon Onde
r = o raio i ô n i c o d o s o l u t o E = força eletromotriz (EMF) e m volts (V)
T| = a viscosidade d a solução t a m p ã o na qual a m i g r a ç ã o está I = c o r r e n t e e m a m p e r e s (A)
ocorrendo t = t e m p o e m s e g u n d o s (s)

*0 ponto isoelétrico de uma molécula é o pH no qual ela não tem carga
liquida e não se moverá em um campo elétrico.
O calor g e r a d o d u r a n t e a eletroforese a u m e n t a a c o n d u t â n c i a d o
sistema ( d i m i n u i a resistência). C o m f o n t e s d e energia c o m vol-
tagem c o n s t a n t e , o a u m e n t o r e s u l t a n t e da c o r r e n t e , d e v i d o ao
a u m e n t o da agitação térmica d e t o d o s os íons dissolvidos, causa
u m a u m e n t o d a velocidade de m i g r a ç ã o da p r o t e í n a e d a taxa de

evaporação de água d o meio d e s u p o r t e estacionário. A perda de
água causa u m a u m e n t o da c o n c e n t r a ç ã o iônica e u m a d i m i n u i -
ção a i n d a m a i o r da resistência (fi). Para m i n i m i z a r estes efeitos
na velocidade de migração, é m e l h o r usar u m a f o n t e d e energia
c o m c o r r e n t e c o n s t a n t e . D e a c o r d o c o m a lei de O h m :
E = (I)(R) (3)
Portanto, se R d i m i n u i , a E M F aplicada t a m b é m diminui (a corrente
permanece constante). Isto, por sua vez, d i m i n u i o efeito d o calor e
m a n t é m a velocidade de migração relativamente constante.
Para a e l e t r o f o r e s e p o r focalização isoelétrica (IFE), u m a
f o n t e d e energia capaz de m a n t e r a p o t ê n c i a c o n s t a n t e é n o r m a l -
m e n t e usada, u m a vez q u e a c o r r e n t e e a voltagem m u d a m à
m e d i d a q u e a separação o c o r r e nesta técnica. O s sistemas d e
e l e t r o f o r e s e c a p i l a r (CE) (discutidos p o s t e r i o r m e n t e ) u s a m f o n t e s
d e energia capazes de f o r n e c e r voltagens n a faixa de quilovolts.
As técnicas de p o t ê n c i a p u l s a d a e d e c a m p o p u l s a d o m u d a m
p e r i o d i c a m e n t e a o r i e n t a ç ã o d o c a m p o e m relação aplicado à
direção de m i g r a ç ã o pela alternância de p o t ê n c i a aplicada a dife-
rentes pares d e e l e t r o d o s ou g r u p o s d e eletrodos. D u r a n t e cada
ciclo, as m o l é c u l a s precisam se r e o r i e n t a r na nova direção de
c a m p o para se e n c a i x a r e m através dos p o r o s d o gel antes q u e a
migração c o n t i n u e . C o m o o t e m p o de r e o r i e n t a ç ã o d e p e n d e d o
t a m a n h o da m o l é c u l a , a mi gração real se t o r n a u m a f u n ç ã o da
f r e q ü ê n c i a d e alteração de c a m p o . Isto p e r m i t e a separação d e
moléculas m u i t o grandes, cais c o m o f r a g m e n t o s de D N A q u e n ã o
são separados pelos poros r e l a t i v a m e n t e p e q u e n o s d o s géis de
agarose ou poliacrilamida. 1 2
Tampões
O t a m p ã o serve c o m o u m c o m p o n e n t e m u l t i f u n c i o n a l n o pro-
cesso eletroforético já q u e ele (1) c o n d u z a c o r r e n t e aplicada, (2)
estabiliza o p H n o qual a eletroforese é realizada e (3) d e t e r m i n a
a carga elétrica d o soluto. A força iônica d o t a m p ã o i n f l u e n c i a
(1) a c o n d u t â n c i a d o s u p o r t e , (2) a d e n s i d a d e da n u v e m iônica
(íons d o t a m p ã o e í o n s diversos) e m t o r n o da m o l é c u l a carregada,
(3) a velocidade d e sua m igração e (4) a nitidez das zonas eletro-
foréticas. C o m o a u m e n t o da c o n c e n t r a ç ã o de tampão, a n u v e m
iônica a u m e n t a e m t a m a n h o e a molécula se t o r n a r e t a r d a d a e m
seu m o v i m e n t o . O s t a m p õ e s d e alta força iônica geram separa-
ções d e b a n d a s m a i s nítidas, m a s t a m b é m p r o d u z e m mais calor
Joule devido aos níveis a u m e n t a d o s d e corrente, u m efeito q u e
leva à d e s n a t u r a ç ã o de p r o t e í n a s termolábeis.
A força iônica ( t a m b é m d e s i g n a d a pelo s í m b o l o ]u) é calcu-
lada de acordo c o m o seguinte-.
V- = 0,5^ C£ f (4)
onde
c, = c o n c e n t r a ç ã o iônica e m m o l / L
^ = a carga d o í o n
A força iônica de u m eletrólito ( t a m p ã o ) c o m p o s t o de íons m o n o -
valentes é igual à sua m o l a r i d a d e ( m o l / L ) . A força iônica de u m a
solução de eletrólito a 1 m o l / L c o m u m íon m o n o v a l e n t e e u m
íon divalente é 3 m o l / L e para u m eletrólito d u p l a m e n t e diva-
lente ela é 4 m o l / L .
Meios de Suporte
O m e i o d e s u p o r t e f o r n e c e a matriz na qual a separação ocorre.
Vários tipos de m e i o s de s u p o r t e são usados e m eletroforese e
Eletroforese CAPÍTULO 6 107
variam de soluções t a m p ã o p u r a s e m u m capilar a géis insolúveis
(p. ex., papéis, placa o u colunas de a m i d o , agarose o u poliacrila-
mída) ou m e m b r a n a s d e acetato d e celulose. O s géis são molda-
dos n o m e s m o t a m p ã o q u e será u s a d o n o p r o c e d i m e n t o e p o d e m
ser u s a d o s na direção horizontal o u vertical. N o s dois casos, a
resolução m á x i m a é alcançada se a a m o s t r a é aplicada e m u m a
zona d e início b e m fina. A separação é b a s e a d a nas diferenças
das razões c a r g a / m a s s a das p r o t e í n a s e, d e p e n d e n d o d o t a m a n h o
d o p o r o d o meio, possivelmente n o t a m a n h o molecular.
Gel de Amido e Acetato de Celulose
O gel d e a m i d o foi o p r i m e i r o m a t e r i a l a ser u s a d o c o m o u m
meio de s u p o r t e para eletroforese. Ele foi u s a d o p a r a separar
m a c r o moléculas d e a c o r d o c o m suas cargas superficiais e seus
t a m a n h o s . C o m o o p r e p a r o de u m gel d e a m i d o r e p r o d u t í v e l é
difícil, este m e i o agora é r a r a m e n t e u s a d o n o l a b o r a t ó r i o clínico.
As m e m b r a n a s de acetato de celulose são filmes secos, opacos e
q u e b r a d i ç o s feitos através d o t r a t a m e n t o da celulose c o m ani-
d r i d o acético. C o m o elas precisam ser e m b e b i d a s em t a m p ã o
p a r a a m o l e c e r e m antes d o u s o e t a m b é m p o r necessitarem de
c l a r e a m e n t o antes de serem analisadas p o r d e n s i t o m e t r i a , elas
r a r a m e n t e t ê m sido usadas e m aplicações clínicas de r o t i n a . Atu-
a l m e n t e , os géis de agarose e d e p o l i a c r i l a m i d a t ê m sido os meios
de s u p o r t e preferidos para a eletroforese.
Agarose
A agarose é u m a fração e s s e n c i a l m e n t e n e u t r a , p u r i f i c a d a d o
ágar, o b t i d a pela separação e n t r e a agarose e a agaropectina, u m a
fração mais a l t a m e n t e carregada graças aos g r u p o s laterais carbo-
xílicos e sulfatos ácidos. Ela é usada e m eletroforese e m gel de
agarose (AGE) para a separação de (1) p r o t e í n a s d o soro, da u r i n a
e d o f l u i d o cerebrospinal (CSF), (2) v a r i a n t e s da h e m o g l o b i n a ,
(3) isoenzimas, (4) l i p o p r o t e í n a s e (5) o u t r a s substâncias. C o m o
o t a m a n h o d o p o r o n o gel de agarose é g r a n d e o b a s t a n t e p a r a
q u e todas as p r o t e í n a s p a s s e m s e m i m p e d i m e n t o , a separação é
baseada s o m e n t e n a razão c a r g a / m a s s a da p r o t e í n a . As v a n t a g e n s
d o gel de agarose i n c l u e m sua baixa a f i n i d a d e p o r proteínas e sua
t r a n s p a r ê n c i a após secagem, o q u e p e r m i t e u m a análise densito-
métrica excelente. E e s s e n c i a l m e n t e livre d e grupos ionizáveis e,
p o r t a n t o , exibe p e q u e n a e n d o s m o s e (discutida p o s t e r i o r m e n t e ) .
A maioria d o s p r o c e d i m e n t o s de r o t i n a p o r A G E é realizada
em géis de m i c r o z o n a p r é - e m p a c o t a d o s , p r o d u z i d o s comercial-
m e n t e . A amostra é aplicada através d e u m m o l d e plástico f i n o
com p e q u e n a s f e n d a s c o r r e s p o n d e n t e s aos p o n t o s d e aplicação
de a m o s t r a (poços) e m p r o c e d i m e n t o s m a n u a i s , ou através d e u m
p e n t e aplicador se u m sistema a u t o m a t i z a d o é u s a d o . O m o l d e
é c o l o c a d o n a superfície da agarose, e a m o s t r a s d e 5 a 7 |uL são
colocadas e m cada p o ç o . A p ó s p e r m i t i r q u e a a m o s t r a se d i f u n d a
n a agarose p o r 5 m i n u t o s , q u a l q u e r excesso é r e m o v i d o p o r
capilaridade e o m o l d e é r e m o v i d o . U m a separação p o r A G E para
a m a i o r i a das aplicações de r o t i n a para soro exige u m t e m p o de
eletroforese de 20 a 30 m i n u t o s .
O p e r a c i o n a l m e n t e , de 0 , 5 a 1,0 g de a g a r o s e / d L de t a m p ã o
f o r n e c e u m gel c o m resistência a d e q u a d a e boas p r o p r i e d a d e s de
migração para proteínas e f r a g m e n t o s de D N A n a faixa d e 0,5 a
20,0 k p b (quilopares de bases; C a p í t u l o 17). F r a g m e n t o s de D N A
m e n o r e s p o d e m ser s e p a r a d o s c o m agarose d e graus especiais de
t e m p e r a t u r a d e gelificação baixa. C o m o os ácidos nucléicos t ê m
essencialmente as m e s m a s razões c a r g a / m a s s a , a separação é
baseada p r i n c i p a l m e n t e n o t a m a n h o da m o l é c u l a e p a r c i a l m e n t e
n a f o r m a molecular, os quais d e t e r m i n a m o q u ã o r á p i d o a molé-
cula o u o f r a g m e n t o p o d e m m i g r a r através dos p o r o s d o gel.
F r a g m e n t o s d e D N A m e n o r e s t ê m velocidades d e migração e m
agarose q u e são i n v e r s a m e n t e p r o p o r c i o n a i s aos logaritmos de
108 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

seus pesos moleculares, mas esta relação diminui à medida que
o t a m a n h o do fragmento aumenta. Todos os fragmentos maiores
que 50 a 100 kpb migram à mesma velocidade pelo gel de agarose
e requerem u m a técnica alternativa, tal como a eletroforese de
campo pulsado para a separação.
Poliacrilamida
A poliacrilamida é u m polimero preparado pelo aquecimento da
poliacrilamida com vários catalisadores, com ou sem agentes de
ligações cruzadas. O gel de poliacrilamida é (1) termoestável, (2)
transparente, (3) durável e (4) relativamente inerte quimicamente.
Além disso, estes géis não têm carga, eliminado, portanto, a
endosmose, e são preparados em uma variedade de t a m a n h o de
poros Q u a n d o comparado ao gel de agarose, o t a m a n h o médio
de u m poro em u m gel de poliacrilamida a 7,5% típico é cerca
de 5 n m (.50 Ã), grande o suficiente para permitir que a maioria
das proteínas séiicas migre sem impedimento, mas as proteínas
com u m raio molecular e / o u u m comprimento que exceda os
limites críticos serão mais ou menos retardadas em sua migração.
Algumas destas proteínas são (1) fibrinogênio, (2) p r lipoproteína,
(3) a7-macroglobina e (4) y-globulinas. C o m a poliacrilamida, as
proteínas são separadas com base na razão carga/massa e no
t a m a n h o molecular, u m f e n ô m e n o conhecido como peneira
molecular. Devido ao caráter carcinogênico potencial da acrila-
mida, o cuidado adequado deve ser t o m a d o durante a manipu-
lação deste material q u a n d o o gel é preparado manualmente.
Q u a n d o usada para a separação de ácidos nucléicos, a polia-
crilamida é capaz de separar moléculas de D N A que diferem tão
pouco quanto 2% em comprimento (1 pb em 50 pb). Ela t a m b é m
acomoda maior quantidade de amostra (até 10 pg) em u m único
poço de amostra, e comparado com o D N A a partir da agarose,
o D N A recuperado d e u m gel de poliacrilamida é extremamente
puro, sem inibidores- A poliacrilamida é principalmente útil para
misturas de fragmentos menores de D N A e separa fragmentos
menores do que 1 kpb; entretanto, seu poro p e q u e n o impede
que D N A superespiralado entre n o gel.
Sistemas Automatizados
Devido ao volume a u m e n t a d o de exames, principalmente de
proteínas séricas, muitos laboratórios estão passando a usar siste-
mas automatizados de eletroforese, como os sistemas Helena
SP1FE 3.000 (http://www.helena.com) ou Sebia Hydragel-
Hydrasys (http://www.sebia-usa.com). Estes sistemas oferecem a
operação automatizada de (1) aplicação da amostra e reagente,
(2) separação eletroforética, (3) coloração dos analitos e (4)
Separação
Para realizar uma separação eletroforética, u m material de suporte
hidratado, como u m gel de poliacrilamida ou de agarose pré-
m o n t a d o , tem o excesso de tampão retirado e, então, é colocado
na câmara de eletroforese. Deve-se tomar cuidado para que o gel
não tenha bolhas nem excesso de líquido. A seguir, a amostra é
adicionada ao suporte e colocada em contato com o tampão
previamente adicionado às câmaras dos eletrodos. A eletroforese
é realizada por u m determinado período de tempo sob condições
de voltagem ou corrente constante.
Coloração
Q u a n d o a eletroforese está completa, o suporte é removido da
célula eletroforética e é rapidamente seco ou colocado e m u m
fixador para evitar a difusão dos componentes da amostra. Ele é
então corado para a visualização das zonas de proteínas indivi-
duais. Após a lavagem do excesso de corante, o suporte é seco.
O s corantes usados para a visualização das frações de protei-
nas separadas estão listados na Tabela 6-1 e diferem de acordo
com o tipo de aplicação. A quantidade de corante absorvida pela
amostra é afetada por muitos fatores, tais como o tipo de proteína
e o grau de sua desnaturação pelos agentes fixadores, A maioria
dos métodos comerciais para a eletroforese de proteínas séricas
usa A m i d o Black B ou os membros das séries de Azul Brilhante
de Coomassie como corantes para coloração. As ísoenzimas são
tipicamente visualizadas pela incubação do gel em contato com
uma solução de substrato, o qual está ligado estrutural ou quimi-
camente a u m corante, antes da fixação. O nitrato de prata ou o
d i a m i n o de prata têm sido usados para corar proteínas e polipep-
tídios com uma sensibilidade de 10 a 100 vezes maior do que a
dos corantes usados com o mesmo propósito. 1 '' A fixação e a
coloração seletivas de subclasses de proteínas também são alcan-
çadas pela combinação de uma molécula corante com u m a anti-
globulina como é feito na imunofixação.
Detecção e Quantificação
U m a vez que a separação eletroforética e a coloração estejam
completas, é possível quantificar as zonas individuais como por-
TABELA 6-1 Comprimentos de Onda Sugeridos para a Quantificação
de Zonas de Proteínas por De n s iro me t ria Direta
Comprimento
Tipo de de Onda
Separação Coloração Nominal (nm)

secagem de vários t a m a n h o s de gel. Eles são capazes de processar Proteínas séricas em geral Amido Black B 640
de 10 a 100 amostras simultaneamente A maioria dos sistemas (Naftol Azul Preto)
capilares tem a capacidade de auto-amostragem para o processa- Azul Brilhante d e 595
m e n t o seqüencial de amostras, mas o sistema Beckman Coulter C o o m a s s i e G-25G
(Azul Brilhante G)
Capilary Zone Eletrophoresis (CZE) (http://www.beckman.com)
Azul Brilhante d e 560
permite o processamento simultâneo de sete amostras pelo uso C o o m a s s i e R-250
de capilares múltiplos Analisadores por microchip mais moder- (Azul Briliiante R)
nos, como o Agilent 2.100 Bioanalyzer (http://www.chem. Ponceau S 520
agilent.com), ficaram significativamente menores e aumentaram ísoenzimas NAD(P)H(NBTH) Azul de nitrotetrazólici 570
a velocidade do processo de separação de proteínas, ácidos nucléi- formazan (como o íormazan)
cos ou m e s m o células inteiras Estes avanços reduziram substan- 2 o n a s d e iipoproteínas Fat Red 7fl (Vermeiho 540
cialmente o trabalho associado a esta técnica. d e S u d a n 7B)
Óleo Vermeiho 0 520
(Oil Red 0)
Procedimento Geral Preto d e Sudan B 600
As operações gerais feitas na eletroforese convencional incluem (Sudan Black B)
(1) separação, (2) coloração, (3) detecção e (4) quantificação. F r a g m e n t o s de DNA Brometo de etídeo 2 5 4 (Ex)
(fluorescente) 5 9 0 (Em)
Além disso, várias técnicas eletroforéticas por "bíotting" têm sido
Proteínas de CSF Nitrato de prata *
desenvolvidas.

c e n t a g e m d o total o u c o m o c o n c e n t r a ç ã o a b s o l u t a pela d e n s i t o -
m e t r i a direta, se a c o n c e n t r a ç ã o total d e p r o t e í n a s é c o n h e c i d a .
N o d e n s i t ô m e t r o , o gel (ou o u t r o meio) passa p o r u m sistema
óptico d e m e d i ç ã o e a absorvância de cada fração é exibida e m
u m registrador o u e m u m m o s t r a d o r eletrônico. N a m a i o r i a d o s
casos, a área sob cada pico é a u t o m a t i c a m e n t e i n t e g r a d a . A
q u a n t i f i c a ç ã o confiável das zonas coradas pela d e n s i t o m e t r i a
exige (1) u m a luz d e c o m p r i m e n t o d e o n d a a p r o p r i a d o , (2) u m a
resposta linear d o i n s t r u m e n t o e (3) u m f u n d o t r a n s p a r e n t e n a
fita q u e está s e n d o analisada. A l i n e a r i d a d e de resposta p o d e ser
verificada c o m u m filtro de d e n s i d a d e n e u t r o p r o j e t a d o c o m
zonas separadas ou a d j a c e n t e s d e d e n s i d a d e , as quais a u m e n t a m
de f o r m a linear e t ê m valores d e absorvância esperados. O regis-
tro d o p a d r ã o d e absorvância o b t i d o para cada zona checa as
f u n ç õ e s ópticas, m e c â n i c a s e elétricas d o d e n s i t ô m e t r o .
As características g e r a l m e n t e e n c o n t r a d a s e m u m d e n s i t ô m e -
tro i n c l u e m (1) a c a p a c i d a d e d e analisar géis d e 2 5 a 100 m m de
c o m p r i m e n t o ; (2) o c o n t r o l e a u t o m á t i c o de g a n h o , o q u a l ajusta
o p i c o mais i n t e n s o d e u m eletroferograma p a r a a escala com-
pleta; (3) a zeragem d e f u n d o a u t o m á t i c a , q u e seleciona o p o n t o
mais baixo n o e l e t r o f e r o g r a m a c o m o linha de base, d e tal f o r m a
q u e os picos m e n o r e s n ã o são p e r d i d o s ou "removidos"; (4)
c o n t r o l e d e c o m p r i m e n t o de o n d a variável e m u m a faixa d e 4 0 0
a 700 n m , (5) f e n d a s variáveis p a r a p e r m i t i r o ajuste d o t a m a n h o
d o feixe; (6) u m dispositivo d e integração com seleção a u t o m á t i c a
e m a n u a l dos p o n t o s de c o r t e e n t r e os picos; (7) escala a u t o m á -
tica, u m a característica q u e avança a fita eletro forética de u m
canal d e a m o s t r a para o p r ó x i m o e (8) a c a p a c i d a d e de m e d i r
f l u o r e s c ê n c i a ultravioleta.
O u t r a s características desejáveis i n c l u e m (1) integração com-
p u t a d o r i z a d a e impressão, (2) diagnóstico e m b u t i d o p a r a proble-
mas n o aparelho, (3) escolha d e u m a das várias velocidades de
análise e (4) c a p a c i d a d e de m e d i r n o m o d o reflectância. O s
m o d e l o s c o m u m c o m p u t a d o r pessoal s e p a r a d o p a r a o processa-
m e n t o de d a d o s p e r m i t e m o a r m a z e n a m e n t o e a r e f o r m a t a ç ã o
dos d a d o s , se desejado, e r e i m p r e s s ã o ou transmissão posterior
para u m computador hospedeiro.
As técnicas m o d e r n a s d e análise d e D N A , as q u a i s p o d e m
p r o d u z i r dúzias de b a n d a s de f r a g m e n t o s d e D N A de diferentes
c o m p r i m e n t o s , r e q u e r e m u m n o v o tipo de d e n s i t ô m e t r o desig-
n a d o c o m o u m "analisador d e c a m a d a plana" ou "analisador d e
imagem digital". 3 Estes i n s t r u m e n t o s (1) u s a m detectores o u
câmeras c o m u m dispositivo a c o p l a d o d e c o m a n d o ( C C D ) ultra-
sensível, (2) t ê m resolução de até 1.200 p o n t o s p o r polegada e
(3) são capazes d e analisar e a r m a z e n a r as leituras de i n t e n s i d a d e
d e luz digitalizada a p a r t i r de g r a n d e s áreas.
A l é m d a análise p o r d e n s i t o m e t r i a , os géis d e eletroforese
agora estão s e n d o analisados p o r e s p e c t r ó m e t r o s de massa para
d e t e r m i n a r os pesos m o l e c u l a r e s das p r o t e í n a s e seus p r o d u t o s
d e clivagem, 11 e p a r a o s e q ü e n c i a m e n t o de peptídios.' 1
TIPOS DE ELETROFORESE
O sistema d e eletroforese d e f r o n t e i r a móvel original desenvol-
v i d o p o r Tiselius, e m 1937, separava as p r o t e í n a s séricas em
a p e n a s p o u c a s frações. As técnicas m o d e r n a s u s a m diferentes
m e i o s e m diversos f o r m a t o s físicos e u m a v a r i e d a d e de configu-
rações i n s t r u m e n t a i s p a r a alcançar separações m u i t o m e l h o r e s d o
q u e aquelas o b t i d a s p o r Tíselius A seção seguinte descreve várias
técnicas diferentes usadas para a separação d e u m a diversidade
de analitos.
Eletroforese de Zona
As técnicas de eletroforese de zona p r o d u z e m zonas de proteínas,
q u e são h e t e r o g ê n e a s e fisicamente separadas u m a das outras
Eletroforese CAPÍTULO 6 109
Gama C3 BLP AMG ALB
FIB TRF HP AAT
F i g u r a 6 - 3 Um esquema simplificado de um padrão de proteínas do
soro de um indivíduo com haptoglobina tipo 2-1 (separação por PAGE).
Algumas zonas conccm mais do que uma proteína, como demonstrado
por técnicas imunológicas. AAT, alfa^antitripsina; ALB, albumina;
AMG, alfa^macroglobulina; BLP, beta-lipo proteína; C3, complemento 3;
FIB, fibrinogênio; gama, gama-globulina; HP, haptoglobina; TRF,
transferrina.
c o m o m o s t r a d o n a Figura 6-3. Elas são classificadas d e acordo c o m
o t i p o e a estrutura d o m a t e r i a l de s u p o r t e u s a d o e são c o m u m e n t e
designadas c o m o A G E , eletroforese e m gel de acetato de celulose
(CAE), eletroforese e m gel d e poliacrilamida (PAGE) etc.
Eletroforese em Placa de Gel
O s m é t o d o s tradicionais, u s a n d o u m gel retangular i n d e p e n d e n -
t e m e n t e d a espessura, são designados pelo t e r m o eletroforese e m
placa d e gel. Sua principal v a n t a g e m é sua capacidade de separar
s i m u l t a n e a m e n t e várias amostras e m u m a m e s m a corrida. O s
meios de amido, agarose (AGE) e poliacrilamida (PAGE) têm sido
usados neste f o r m a t o . E o p r i n c i p a l m é t o d o u s a d o e m laboratórios
de química clínica para a separação de várias classes de p r o t e í n a s
séricas e de C S F e f r a g m e n t o s d e D N A ou R N A . O s géis (normal-
m e n t e agarose) p o d e m ser m o l d a d o s e m u m a superfície plástica
de apoio ou inseridos c o m p l e t a m e n t e e m u m a célula plástica
vedada, o q u e p e r m i t e t a n t o a eletroforese h o r i z o n t a l q u a n t o a
vertical e a s u b m e r s ã o para r e s f r i a m e n t o , se necessário.
O s géis e m placa p o d e m ser m o l d a d o s c o m aditivos, tais c o m o
(1) anfólitos, q u e criam u m g r a d i e n t e d e p H (ver Eletroforese p o r
Focalização Isoelétrica [IEF]) ou (2) dodecil sulfato d e sódio
(SDS), q u e d e s n a t u r a p r o t e í n a s (ver Eletroforese B i d i m e n s i o n a l
[2-D]). A l é m das p r o t e í n a s séricas convencionais, as aplicações
i n c l u e m a separação d e isoenzimas, l i p o p r o t e í n a s , h e m o g l o b i n a s
e f r a g m e n t o s d e D N A e R N A . As separações e m u m a ú n i c a
d i m e n s ã o d o s dois ú l t i m o s f r e q ü e n t e m e n t e envolvem a adição d e
u m a m i s t u r a de m a r c a d o r e s de t a m a n h o s de f r a g m e n t o s c o n h e -
cidos, d e n o m i n a d o s laddert e m u m p o ç o para p e r m i t i r a identifi-
cação d o t a m a n h o dos f r a g m e n t o s d a a m o s t r a .
Eletroforese em Disco
A eletroforese de p r o t e í n a s séricas u s a n d o gel de agarose gera
s o m e n t e cinco zonas, d e n o m i n a d a s : (1) a l b u m i n a , (2) a r , (3)
a
r i (4) p- e (5) y-globulinas, e m b o r a algum s u b f r a c i o n a m e n t o das
a r e p-globulmas seja possível c o m géis d e alta resolução. C o m o
o t a m a n h o d o p o r o e m u m gel d e poliacrilamida é c o n t r o l a d o
pela c o m p o s i ç ã o e m p o r c e n t a g e m da acrilamida e é m u i t o m e n o r
d o q u e o e n c o n t r a d o e m u m gel d e agarose, estes géis p o d e m
gerar 20 ou mais frações e são a m p l a m e n t e u s a d o s para e s t u d a r
p r o t e í n a s séricas individuais, e s p e c i a l m e n t e as variantes genéticas
e as isoenzimas.
C o m PAGE, as amostras são separadas e m géis individuais
p r e p a r a d o s e m tubos de v i d r o abertos nas extremidades ( d e n o m i -
n a d o s PAGE e m bastão), os quais f o r m a m u m a p o n t e entre dois
reservatórios de t a m p ã o . E m b o r a os t u b o s de géis pré-moldados
estejam agora disponíveis c o m e r c i a l m e n t e , a técnica original
envolvia u m sistema triplo de gel c o n s i s t i n d o em u m gel separador
110 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
de p o r o p e q u e n o , u m gel espaçador de p o i o m a i o r e u m a c a m a d a
fina de u m a solução de m o n ô m e i o d e p o r o grande c o n t e n d o
cerca de 3 [J.L d e soro. As composições diferentes causavam des-
continuidades; na matriz eletroforética, o q u e d e u o n o m e original
à técnica, eletroforese e m disco. N e s t e sistema, q u a n d o a eletrofo-
rese começa, t o d o s os íons das proteínas m i g r a m facilmente
através dos géis d e p o r o g r a n d e (os quais n ã o i m p e d e m o movi-
m e n t o da maioria das proteínas d o soro) e se a m o n t o a m n o gel
de separação e m u m a zona m u i t o estreita. Este processo m e l h o r a
a resolução e c o n c e n t r a os c o m p o n e n t e s proteicos na b o r d a (ou
zona d e início), d e tal f o r m a q u e a pré-concentração das amostras
c o m baixo c o n t e ú d o protéico (p. ex., CSF) p o d e n ã o ser necessá-
ria. A separação ocorre, então, n o gel inferior d e separação c o m
a d i m i n u i ç ã o d e velocidade de migração d e algumas proteínas
causada pelo f e n ô m e n o de peneira molecular.
Eletroforese por Focalização Isoelétrica
A e l e t r o f o r e s e p o r focalização isoelétrica (TEF) separa c o m p o s t o s
anfotéricos, tais c o m o as proteínas, c o m m a i o r resolução e m u m
m e i o p o s s u i n d o u m g r a d i e n t e d e p H estável. A p r o t e í n a migra
para u m a zona n o m e i o o n d e o p H d o gel c o i n c i d e c o m o p l da
proteína. Neste p o n t o , a carga da p r o t e í n a torna-se zero e sua
migração cessa. A Figura 6-4 ilustra o p r o c e d i m e n t o e m o s t r a as
c o n d i ç õ e s eletroforéticas antes e d e p o i s da c o r r e n t e ser aplicada.
As zonas de p r o t e í n a s são m u i t o finas p o r q u e a região associada
a u m d a d o p H é m u i t o estreita. A d i f u s ã o n o r m a l é t a m b é m
c o n t r a b a l a n ç a d a p o r q u e a p r o t e í n a a d q u i r e u m a carga q u a n d o
migra a partir d e sua posição d e pi e s u b s e q ü e n t e m e n t e migra
de volta d e v i d o às forças eletroforéticas. As p r o t e í n a s q u e d i f e r e m
e m seus valores de p i d e s o m e n r e 0 , 0 2 u n i d a d e s de p H p o d e m
ser separadas pela IEF.
O g r a d i e n t e d e p H é criado p o r anfólitos carreadores, u m
g r u p o d e ácidos p o l i a m i n o c a r b o x í l i c o s anfotéricos, q u e t ê m dife-
renças t ê n u e s n o s valores d e pKa e pesos moleculares de 3 0 0 a
1.000 Da. Misturas d e 50 a 100 diferentes c o m p o s t o s são adicio-
n a d a s ao m e i o e c r i a m u m "gradiente d e p H n a t u r a l " q u a n d o os
Cátodo Q
(íons OH")
pH ~7
Anfólitos
listiirados
Proteínas
A, B e C
Figura 6 - 4 Esquema de um procedimento de IFE. I, Uma mistura
homogânea de anfólitos caneadores, faixa de pH de 3 a 10, na qual as
proteínas A, B e C, com pi 8, 6 e 4, respectivamente, são adicionadas.
II, A corrente é aplicada e os anfólitos carreadores rapidamente migram
para as zonas de pH onde a carga líquida é zero (o valor de pi). Ill, As
proteínas A, B e C migram mais lentamente até suas respectivas zonas
de pi onde a migração pára. A alta capacidade tamponante dos anfólitos
carreadores cria zonas de pH estável nas quais cada proteína pode
alcançar o seu pi.
a n f ó l i t o s individuais a t i n g e m seus valores d e pl d u r a n t e a eletro-
forese. Eles estabelecem zonas t a m p o n a d a s estreitas, c o m p H s
estáveis, mas ligeiramente diferentes, através das quais as proteí-
n a s c o m m o v i m e n t o s mais lentos m i g r a m e p a r a m e m seus pis
individuais. C o m o os anfólitos carreadores são g e r a l m e n t e usados
e m c o n c e n t r a ç õ e s relativamente altas, u m a f o n t e d e alta voltagem
(acima d e 2 . 0 0 0 V) é necessária. C o m o resultado, a matriz ele-
troforética deve ser resfriada. A IEF é a m p l a m e n t e u s a d a e m
p r o g r a m a s d e r a s t r e a m e n t o n e o n a t a l p a r a o teste d e v a r i a n t e s d e
hemoglobinas.
Eletroforese Bidimensional (2-D)
A eletroforese b i d i m e n s i o n a l (2-D) é a m p l a m e n t e u s a d a para
e s t u d a r famílias de proteínas e pesquisar diferenças genéticas ou
d e d o e n ç a s o u p a r a estudar o c o n t e ú d o protéico de células d e
vários tipos. 6 Esta técnica usa IEF d e p e n d e n t e d e carga na prU
m e i r a d i m e n s ã o e a eletroforese d e p e n d e n t e d o peso m o l e c u l a r
na s e g u n d a d i m e n s ã o . A p r i m e i r a eletroforese d i m e n s i o n a l é
realizada e m u m m e i o de p o r o g r a n d e , tal c o m o u m gel d e
agarose ou u m gel de poliacrilamida de p o r o g r a n d e . O s a n f ó l i t o s
são a d i c i o n a d o s p a r a gerar u m g r a d i e n t e d e p H . A s e g u n d a
d i m e n s ã o é f r e q ü e n t e m e n t e poliacrilamida e m u m f o r m a t o linear
ou e m gradiente. Este tipo d e eletroforese alcança o m a i o r p o d e r
d e resolução para a separação de f r a g m e n t o s de D N A . N e s t a
aplicação, u m a A G E n o r m a l é realizada na p r i m e i r a d i m e n s ã o e
b r o m e t o de etídeo é a d i c i o n a d o ao gel para a s e g u n d a d i m e n s ã o
p a r a abrir os f r a g m e n t o s e causar m u d a n ç a s e m suas m o b i l i d a d e s
eletroforéticas.
O m é t o d o d e eletroforese 2-D de O ' Farre 11 usa PAGE-IEF
e m bastão n a p r i m e i r a d i m e n s ã o e i n c o r p o r a a n f ó l i t o s q u e
c o b r e m u m a faixa de p H d e 3 a 10 u n i d a d e s . O gel é r e t i r a d o d o
t u b o d e gel ao final da eletroforese e c o l o c a d o e m c o n t a t o c o m
u m gel f i n o d e poliacrilamida c o m g r a d i e n t e e m placa, q u e incor-
p o r a o S D S . As p r o t e í n a s separadas p o d e m ser detectadas u s a n d o -
se (1) corantes de C o o m a s s i e , (2) coloração pela prata, (3) radio-
grafia (exposição d o filme radiográfico a emissões d e polipeptí-
dios m a r c a d o s r a d i o a t i v a m e n t e ) o u (4) análises f l u o r o g r á f i c a s
(filme de raio X exposto a p o l i p e p t í d i o s m a r c a d o s c o m trítio e m
p r e s e n ç a d e u m cintilador). O s dois ú l t i m o s m é t o d o s são 100 a
1.000 vezes mais sensíveis d o q u e os corantes d e C o o m a s s i e .
A s eletroforeses b i d i m e n s i o n a i s preparativas e analíticas for-
n e c e m técnicas d e alta resolução para a separação d e p r o t e í n a s e
são os m é t o d o s preferidos q u a n d o amostras complexas p r e c i s a m
9
ser agrupadas para caracterização, c o m o na p r o t e ô m i c a . U m
8
proteoma é a expressão d o c o m p l e m e n t o protéico d e u m g e n o m a .
7 A p r o t e ô m i c a , então, é o e s t u d o de m u d a n ç a s globais n a expres-
6 são de proteínas e o e s t u d o sistemático de interações proceína-
•5 p r o t e í n a através d o i s o l a m e n t o de complexos protéicos ( C a p i m l o
8). O objetivo da p r o t e ô m i c a é a descrição geral, q u a n t i t a t i v a da
4
expressão proteica e suas m u d a n ç a s sob a i n f l u ê n c i a d e pertur-
bações biológicas, tais c o m o d o e n ç a s o u t r a t a m e n t o c o m
drogas. 1
D e s e n v o l v i m e n t o s mais recentes nesta área c o m b i n a m técni-
cas analíticas p a r a alcançar u m a separação e m 2-D pela u n i ã o ,
p o r exemplo, d e IEF líquida c o m c r o m a t o g r a f i a líquida de alta
eficiência ( H P L C ; C a p í t u l o 7) e m fase reversa c o m sílica n ã o
porosa, e detecção de proteínas intactas p o r e s p e c t r o m e t r i a de
massa p o r t e m p o d e vôo e ionização p o r eletrospray.
Técnicas de Blotting
E m 1975, E d w a r d S o u t h e r n desenvolveu u m a técnica q u e é
a m p l a m e n t e u s a d a para d e t e c t a r f r a g m e n t o s d e D N A . Esta
técnica, c o n h e c i d a c o m o " S o u t h e r n Blotting", r e q u e r primeira-
m e n t e u m a separação eletroforética de f r a g m e n t o s d e D N A o u

d e R N A p o t A G E . A seguir, u m a tira de n i t i o c e l u l o s e ou u m a
m e m b r a n a d e n á i l o n é colocada sobre o gel de agarose, e os
D N A s ou f r a g m e n t o s de D N A são t r a n s f e r i d o s (ou "blotted") para
ela p o r c a p i l a r i d a d e ou p o r tj/otímg elétrico ou a v á c u o . Eles são,
e n t ã o , d e t e c t a d o s e i d e n t i f i c a d o s pela hibridização c o m u m a
s o n d a m a r c a d a de ácido n u c l é i c o c o m p l e m e n t a r . Esta técnica é
a m p l a m e n t e usada e m biologia molecular para (1) i d e n t i f i c a r
u m a s e q ü ê n c i a específica d e D N A , (2) d e t e r m i n a r a presença, a
p o s i ç ã o e o n ú m e r o de cópias d e u m gene e m u m g e n o m a , e (3)
tipar o D N A (ver C a p í t u l o 17 p a r a maiores detalhes).
As técnicas de " N o r t h e r n " e " W e s t e m " Mottmg, d e n o m i n a d a s
p o r analogia ao S o u t h e r n bíotting, f o r a m s u b s e q ü e n t e m e n t e
desenvolvidas para separar e d e t e c t a r ácidos n b o n u c l é i c o s (RNAs)
e proteínas, r e s p e c t i v a m e n t e . O N o r t h e r n bloíting é realizado
e x a t a m e n t e d a m e s m a f o r m a q u e o S o u t h e r n fclotíing, exceto q u e
u m a s o n d a m a r c a d a de R N A é u s a d a para a hibridização. O
W e s t e r n bíotting é u s a d o p a r a separar, detectar e identificar u m a
o u mais p r o t e í n a s e m u m a m i s t u r a complexa. Ela envolve primei-
r a m e n t e a separação d e p r o t e í n a s individuais e m gel de poliacri-
l a m i d a e, e n t ã o , a t r a n s f e r ê n c i a , ou "blottmg", p a r a u m a tira de
n i t r o c e l u l o s e ou e m u m a m e m b r a n a d e n i t r o c e l u l o s e p o r electra-
bíotting (transferência p o r aplicação de u m c a m p o elétrico). A tira
ou a m e m b r a n a reage, e n t ã o , c o m u m reagente q u e c o n t é m u m
a n t i c o r p o p r o d u z i d o c o n t r a a p r o t e í n a d e interesse, (ver C a p í t u l o
10 para m a i o r e s d e t a l h e s e aplicações desta técnica).
Eletroforese Capilar
N a C E , as técnicas clássicas de eletroforese são realizadas e m u m
t u b o capilar d e sílica f u n d i d a , d e d i â m e t r o i n t e r n o p e q u e n o ,
tipicamente coberto (externamente) com u m a camada polimérica
( p o h i m i d a ) fina. Por exemplo, o d i â m e t r o e x t e r n o d o t u b o capilar
u s a d o p a r a fazer tais t u b o s varia c o m u m e n t e de 180 a 375 fim;
o d i â m e t r o i n t e r n o , de 20 a 180 [im; e o c o m p r i m e n t o total, de
20 cm até vários metros. Este t u b o capilar f u n c i o n a c o m o u m a
câmara eletroforética capilar q u e é c o n e c t a d a a u m d e t e c t o r n a
sua e x t r e m i d a d e terminal i f i e, através d e reservatórios de t a m p ã o ,
a u m a f o n t e d e alta voltagem (Figura 6-5). A p r i n c i p a l v a n t a g e m
d a C E é sua dissipação eficiente de calor c o m p a r a d a c o m a d a
eletroforese tradicional. A m e l h o r a n a dissipação de calor p e r m i t e
a aplicação d e voltagens n a faixa d e 2 5 a 30 kV, a q u a l a u m e n t a
a eficiência de separação e r e d u z o t e m p o de separação e m alguns
casos a m e n o s d e 1 m i n u t o . 9 O s v o l u m e s d e a m o s t r a são m a n t i -
d o s n a faixa de picolitro a n a n o l i t r o para m i n i m i z a r distorções
n o c a m p o aplicado causadas pela presença de a m o s t r a .
Eletroforese
^V 4 O
Coleta de
Capilar
dadosyArmaze-
// namento
sflC;
Lâmpada 7j. yjr" Dggdorj
/
Fonte de alta MIL
voltagem
Tampão de Tarripãu de
entrada/Injeção saída B i
da amostra
Figura 6 - 5 Esquema da instrumentação de CE
Eletroforese CAPÍTULO 6 111
Tampões para CE
C o m o n a eletroforese c o n v e n c i o n a l , a escolha d e u m t a m p ã o é
essencial para se o b t e r u m a separação b e m - s u c e d i d a com a C E .
N a prática, é indispensável selecionar u m t a m p ã o q u e (1) n ã o
i n t e r f i r a n a c a p a c i d a d e d e detecção d e analitos d e interesse, (2)
m a n t e n h a a s o l u b i l i d a d e dos analitos, (3) m a n t e n h a a capacidade
t a m p o n a n t e d u r a n t e análise e (4) p r o d u z a a separação desejada.
Para t a m p õ e s de p H baixos, (1) fosfato, (2) acetato, (3) f o r m a t o
e (4) citrato t ê m sido u s a d o s efetivamente. Para t a m p õ e s n a faixa
d e p H básico, (1) Tris, (2) tricina, (3) b o r a t o e (4) C A P S (ácido
N-cicloexil-3-aminopropanossulfônico) são eletrólitos aceitáveis.
A força iônica é u m a variável i m p o r t a n t e q u e t e m efeitos
adversos ( t a n t o positivos q u a n t o negativos) n a separação, princi-
p a l m e n t e p o r q u e t a m p õ e s de alta força iônica geram calor Joule
excessivo. E m b o r a a termostatização capilar (dissipação i n e r e n t e
c o m b i n a d a c o m r e s f r i a m e n t o ativo) seja m u i t o efetiva, a c o r r e n t e
(calor Joule) associada a c o n c e n t r a ç õ e s d e t a m p ã o m a i o r e s d o que
100 m m o l / L p o d e s u p e r a r a termostatização capilar e m voltagens
maiores. U m a exceção a essa regra é o t a m p ã o b o r a t o , u m t a m p ã o
clássico p a r a C E , q u e gera c o r r e n t e r e l a t i v a m e n t e baixa (e, por-
t a n t o , calor Joule) e m c a m p o s aplicados altos. C o n s e q ü e n t e -
m e n t e , n a faixa de p H d e 7 a 9, é r e c o m e n d a d o t a m p ã o b o r a t o
a 500 mmol/L.
Injeção da Amostra
Para realizar u m a separação p o r C E , v o l u m e s de a m o s t r a de 1 a
5 0 n L são i n j e t a d o s n a c â m a r a capilar p o r injeção hidrodinâmica
ou p o r injeção eletrocinética. N a i n j e ç ã o h i d r o d i n â m i c a , u m a alí-
q u o t a d e amostra é i n t r o d u z i d a pela aplicação de u m a pressão
positiva ao frasco de e n t r a d a d a a m o s t r a . A l t e r n a t i v a m e n t e , a
gravidade p o d e ser usada pela elevação d o frasco de e n t r a d a (ou
p e l o a b a i x a m e n t o d o r e s e r v a t ó r i o d e saída) para p e r m i t i r que o
s i f o n a m e n t o o c o r r a . O v o l u m e d e a m o s t r a aplicado é i n f l u e n -
ciado p o r vários p a r â m e t r o s , inclusive p o r (mas n ã o restrito a) (1)
d i â m e t r o i n t e r n o d o capilar, (2) viscosidade d o t a m p ã o , (3)
pressão aplicada, (4) t e m p e r a t u r a e (5) t e m p o . N a i n j e ç ã o eletro-
cinética (EK), u m a alíquota de u m a a m o s t r a é i n t r o d u z i d a pela
aplicação de u m a voltagem e n t r e u m frasco d e a m o s t r a e o reser-
v a t ó r i o d e t a m p ã o de saída p o r u m intervalo d e t e m p o determi-
n a d o . A m a g n i t u d e d a voltagem é d e p e n d e n t e d o analito e d o
sistema t a m p ã o u s a d o , m a s envolve t i p i c a m e n t e u m a força de
c a m p o d e 3 a 5 vezes m e n o r d o q u e aquela usada para a separa-
ção. E i m p o r t a n t e n o t a r q u e , e n q u a n t o os m é t o d o s h i d r o d i n â -
m i c o s i n t r o d u z e m u m a a m o s t r a representativa da a m o s t r a c o m o
u m t o d o , a i n j e ç ã o eletrocinética favorece aqueles analitos que
t ê m m a i o r m o b i l i d a d e eletro forética e, p o r t a n t o , é c o n s i d e r a d a
u m a f o r m a d e i n j e ç ã o " t e n d e n c i o s a " . C o m q u a l q u e r d o s dois
m o d o s , para m a n t e r u m a alta eficiência de separação, o compri-
m e n t o d o espaço o c u p a d o pela a m o s t r a deve p e r m a n e c e r <2%
d o c o m p r i m e n t o total d o capilar.
Detecção
O s m o d o s d e detecção q u e têm s i d o u s a d o s p a r a a c r o m a t o g r a f i a
l i q u i d a de alta eficiência são i g u a l m e n t e aplicáveis para a C E . Por
exemplo, os f o t ô m e t r o s ultravioleta-visível são a m p l a m e n t e usados
c o m o detectores p a r a m o n i t o r a r as separações p o r CE. 1 3 Entre-
t a n t o , ao c o n t r á r i o das células de f l u x o nos sistemas d e cromato-
grafia líquida (LC), o d i â m e t r o i n t e r n o d o t u b o capilar (20 a 100
fim) d e f i n e o c a m i n h o óptico ( O P L ) p a r a a detecção. U m a vez
q u e a detecção óptica é d e t e r m i n a d a pela lei d e Beer, o d i â m e t r o
i n t e r n o d o capilar d e 20 a 100 f i m limita a detecção da absor-
vância UV-VIS de I0~ 6 a 10~8 m o l / L . A l é m das limitações d o
O P L , q u a n d o v o l u m e s e m n a n o l i t r o s são i n j e t a d o s , a massa
i n j e t a d a de analito é e x t r e m a m e n t e p e q u e n a . T é c n i c a s ópticas
112 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
mais sensíveis q u e t ê m sido empregadas c o m C E i n c l u e m (1)
f l u o r e s c ê n c i a , (2) índice d e refração, (3) q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a e
(4) f l u o r e s c ê n c i a i n d u z i d a p o r lasei (LIF), a ú l t i m a s e n d o capaz
d e limites d e detecção de IO"18 a IO"21 m o l / L .
A l é m d o u s o d e d e t e c t o r e s sensíveis, técnicas t ê m sido desen-
volvidas p a r a p r é - c o n c e n t r a r a a m o s t r a . U m a das técnicas mais
simples para isto é induzir u m efeito d e " e m p i l h a m e n t o " dos
c o m p o n e n t e s da amostra, algo f a c i l m e n t e c o n s e g u i d o pela explo-
ração das diferenças d e força iônica e n t r e a matriz d a a m o s t r a e
o t a m p ã o de separação. 2 Isto resulta do f a t o de q u e íons da
a m o s t r a t ê m m o b i l i d a d e eletroforética d i m i n u í d a e m u m
a m b i e n t e d e m a i o r c o n d u t i v i d a d e . Q u a n d o u m a voltagem é apli-
cada ao sistema, íons d o espaço c o r r e s p o n d e n t e à a m o s t r a ins-
t a n t a n e a m e n t e aceleram e m d i r e ç ã o à zona d e t a m p ã o d e sepa-
ração a d j a c e n t e . A o cruzar a fronteira, o a m b i e n t e de m a i o r
c o n d u t i v i d a d e i n d u z u m a d i m i n u i ç ã o da velocidade eletroforé-
tica e s u b s e q ü e n t e " e m p i l h a m e n t o " dos c o m p o n e n t e s d a a m o s t r a
e m u m a zona de t a m p ã o m e n o r d o que o espaço o r i g i n a l m e n t e
o c u p a d o pela a m o s t r a . D e n t r o de u m c u r t o espaço de t e m p o , o
g r a d i e n t e d e força iônica se dissipa e as moléculas carregadas de
analito c o m e ç a m a se mover da zona de amos t ra " e m p i l h a d a " e m
direção ao c á t o d o . O e m p i l h a m e n t o é u s a d o c o m i n j e ç ã o hidros-
tática ou E K e t i p i c a m e n t e resulta e m u m a u m e n t o d e 10 vezes
da c o n c e n t r a ç ã o d a a m o s t r a e, p o r t a n t o , u m l i m i t e de detecção
menoT.
U m a a b o r d a g e m alternativa d e e m p i l h a m e n t o é u m a técnica
d e "focalização" q u e se baseia nas diferenças d e p H e n t r e o espaço
o c u p a d o pela a m o s t r a e o t a m p ã o de separação. Isto t e m d e m o n s -
t r a d o ser m u i t o ú t i l p a r a a análise de peptídios, p r i n c i p a l m e n t e
c o m o r e s u l t a d o d e sua relativa estabilidade e m u m a a m p l a faixa
de pH. 1 0
Modos de Operação
A C E p e r m i t e múltiplos m o d o s de operação i n c l u i n d o (1) eletro-
forese de zona, (2) isotacoforese, (3) IEF e (4) eletroforese e m gel.
A C Z E é a f o r m a mais simples de C E e é ú n i c a p o r sua capa-
c i d a d e de separar e l e t r o f o r e t i c a m e n t e analitos n a a u s ê n c i a d e u m
m e i o d e s e p a r a ç ã o ( p o l í m e r o , anfólitos). O p o d e r da C Z E é a
c a p a c i d a d e de separar espécies carregadas p o r eletroforese s e m
u m a matriz d o tipo p e n e i r a e é a m p l a m e n t e aplicável a vários
analitos. 1 5 U m s u b m o d o da C Z E é a eletroforese capilar iônica, q u e
se refere à análise d e íons inorgânicos por CZE, p a r t i c u l a r m e n t e
q u a n d o se usa detecção indireta. Neste m o d o de detecção, u m
íon f o r t e m e n t e a b s o r v e n t e é a d i c i o n a d o ao eletrólito d e corrida
e m o n i t o r a d o e m u m c o m p r i m e n t o de o n d a q u e f o r n e c e u m a
absorvãncia de f u n d o alta e c o n s t a n t e . A m e d i d a q u e os íons d o
soluto se m o v e m e m suas zonas discretas d u r a n t e o processo de
eletroforese, eles d e s l o c a m o agente d e detecção i n d i r e t a e este
p r o d u z u m a d i m i n u i ç ã o na a b s o r v ã n c i a de f u n d o q u a n d o a zona
passa através d o detector.
A c r o m a t o g r a f i a e l e t r o c i n é t i c a micelar ( M E K C ) é u m h í b r i d o
de eletroforese e cromatografia, mas é diferente d a cromatografia
eletrocinética capilar ( C E C ) , n a qual o capilar é d e fato preen-
chido c o m u m a fase sólida. A M E K C é u m a técnica eletroforética
r a r a m e n t e efetiva u m a vez q u e separa t a n t o solutos n e u t r o s c o m o
carregados. A separação de espécies neutras é conseguida pelo uso
d e micelas f o r m a d a s p o r aditivos n o t a m p ã o de separação (p. ex.,
d o d e c i l sulfato de sódio). A i n t e r a ç ã o diferencial de analitos com
as micelas d e t e r m i n a a separação c o m base n a cromatografia,
e n q u a n t o a aplicação de u m c a m p o elétrico d e t e r m i n a a separação
eletroforética d o s analitos carregados e o fluxo.
A eletroforese capilar em gel (CGE) é d i r e t a m e n t e comparável à
eletroforese tradicional e m placa o u t u b o p o r q u e os m e c a n i s m o s
de separação são idênticos. 6 O t a m a n h o de s e p a r a ç ã o é a l c a n ç a d o
c o m u m p o l í m e r o a d e q u a d o q u e é aplicado n o i n t e r i o r d o capilar,
u s a d o p a r a u m a separação e, e n t ã o , s u b s t i t u í d o . A separação é
b a s e a d a n o t a m a n h o p a r a D N A e p a r a p r o t e í n a s s a t u r a d a s por
S D S e r e q u e r u m gel p o r q u e eles c o n t ê m razões c a r g a / m a s s a que
n ã o variam. U m a v a r i e d a d e d e matrizes políméricas t e m sido
d e f i n i d a p a r a análise t a n t o d e D N A (p. ex., poliacrilamida e
materiais celulósicos) q u a n t o d e p r o t e í n a s (p. ex., matrizes deri-
vadas d o dextran). U m a das exigências q u e f r e q ü e n t e m e n t e
a c o m p a n h a este t i p o d e análise é a r e d u ç ã o d o f l u x o eletrosmó-
tico. Isto é c o n s e g u i d o p o r r e v e s t i m e n t o d a superfície (1) cova-
l e n t e m e n t e , (2) a b s o r t i v a m e n t e o u (3) d i n a m i c a m e n t e .
O u t r o m o d o de C E é a IEF capilar (cIEF). A I E F em u m
capilar é c o m p a r á v e l a I E F e m t u b o e é d e t e r m i n a d a pelos
m e s m o s p r i n c í p i o s e p r o c e d i m e n t o s . Ela difere d a I E F conven-
c i o n a l n a m e d i d a q u e é realizada u s a n d o u m a solução livre de
anfólitos o u u m gel p r é - m o l d a d o . C o m o e s p e r a d o para o m o d o
de C E e improvável p a r a a IEF c o n v e n c i o n a l , as zonas focalizadas
m i g r a m p e l o detector e m linha d u r a n t e o processo de focalização
ou d e p o i s dele.
Eletroforese e m Microchíp
As p l a t a f o r m a s de eletroforese e m m i c r o c h i f j f o r a m primeira-
m e n t e desenvolvidas n o s a n o s d e 1990.' O s desenvolvimentos
s u b s e q ü e n t e s por i n ú m e r o s laboratórios levaram à tecnologia de
micro chip analítica ao p o n t o e m q u e ela r e p r e s e n t a b e m u m a pla-
t a f o r m a alternativa à C E . E similar e m p r i n c í p i o à C E , mas os
mícrocKips d i f e r e m dos capilares p o r q u e os canais d e separação, cs
canais de injeção de a m o s t r a e os reservatórios são todos fabrica-
d o s n o m e s m o substrato planar usando-se u m processo fotolito-
gráfico d e f i n i d o pela indústria microelerrônica. A l é m disso, o
p r e p a r o da a m o s t r a e / o u os Teatores p r é e pós-coluna, os detecto-
res e as f o n t e s d e excitação t a m b é m t ê m sido integrados aos
chips.
Microchíp
Reservatório >
de tampão *
Amostra „/•
O r Cruz em T para a
injeção da amostra
Injeção
r
Detecção
Resíduos
F i g u r a 6 - 6 Desenho simplificado da microestrutura de cruz em T
de chips usados para a separação eletroforética

O m o d e l o de cruz e m T clássico de u m microchip d e canal
ú n i c o {Figura ó-6) envolve u m canal p e q u e n o (injeção) q u e inter-
cepta u m c a n a l m a i s l o n g o (separação) c o m u m reservatório n a s
e x t r e m i d a d e s de cada u m desses canais. O m o d e l o de cruz e m T
é i m p o r t a n t e p a r a a injeção de v o l u m e s de a m o s t r a u m a o r d e m
de m a g n i t u d e m e n o r n o sistema de cKiJ; d o q u e n o sistema
capilar. Isto é realizado através da i n j e ç ã o eletrocinética d a
a m o s t r a pela aplicação de u m c a m p o de várias c e n t e n a s d e volts
através d a a m o s t r a e d o s reservatórios de d e s p e j o de a m o s t r a ,
i n d u z i n d o , assim, a m i g r a ç ã o d e 5 0 a 5 0 0 p L d e a m o s t r a n a cruz
de injeção, U m a v o l t a g e m m a i o r (1 a 4 kV) é e n t ã o aplicada ao
canal de separação, a q u a l m d u z a s e p a r a ç ã o das zonas d e analitos
a n t e s q u e elas a l c a n c e m a j a n e l a de d e t e c ç ã o posterior.
D o m e s m o m o d o q u e a detecção óptica é c o n d u z i d a e m u m
sistema capilar, ela p o d e ser realizada e m u m ú n i c o canal de u m
microcfiip. Por exemplo, a detecção p o r absorvância UV-VIS t e m
sido usada, m a s é mais difícil d o q u e n a C E p o r q u e os substratos
usados p a r a fabricar os chips f r e q ü e n t e m e n t e n ã o são t ã o " p u r o s "
q u a n t o a sílica f u n d i d a u s a d a n o s capilares, o u têm d i f e r e n t e s
p r o p r i e d a d e s espectrais e algumas vezes a b s o r v e m até m e s m o luz.
C o n s e q ü e n t e m e n t e , a detecção é p r i n c i p a l m e n t e através de LIF
p o r q u e este é f a c i l m e n t e i m p l e m e n t a d o c o m a c o n f i g u r a ç ã o
p l a n a r d o microchip. O s limites cie detecção para os f l u o r o c r o m o s
s e m e l h a n t e s à f l u o r e s c e í n a t ê m sido f a c i l m e n t e d e m o n s t r a d o s n o
nível de 10~ n m o l / L e e s t e n d i d o s a limites tão baixos q u a n t o 10 13
m o l / L — u m limite de detecção de massa de p o u c a s c e n t e n a s de
moléculas. Isso p e r m i t e a detecção, por exemplo, d e f r a g m e n t o s de
D N A amplificados p o r reação em cadeia da polimerase (PCR) e m
u m nível q u e c o m p e t e c o m a auto-radíografia de ''P a partir d e
S o u t h e r n blots. 6 O s t e m p o s de separação de u m microcKifi típico
são de a p r o x i m a d a m e n t e 50 a 200 segundos. N o c e n á r i o de diag-
nóstico clínico, os principais analitos de interesse p a r a a extrapo-
lação da p l a t a f o r m a de mieroc/ii/) são as p r o t e í n a s e o D N A .
C o m o r e s u l t a d o d o g r a n d e n ú m e r o d e intercaladores fluores-
c e n t e s q u e p o d e m set i n c o r p o r a d o s n o D N A dupla-fita ( d s D N A )
e d o excelente limite de d e t e c ç ã o q u e resulta da LIF, as separações
de D N A p o r microchipa t ê m se desenvolvido mais r a p i d a m e n t e d o
q u e as separações de p r o t e í n a s . Isso t e m acelerado a v e l o c i d a d e
n a q u a l os m é t o d o s de eletroforese capilar e p o r microchzf t ê m
e m e r g i d o c o m o alternativas à eletroforese e m placa d e gel tradi-
c i o n a l para a análise d e D N A , p a r t i c u l a r m e n t e p a r a aplicações
e m s e q ü e n c i a m e n t o . Isso tem sido d e m o n s t r a d o p e l o seqüencia-
m e n t o d o G e n o m a H u m a n o usando-se C L .
CONSIDERAÇÕES TÉCNICAS
Vários aspectos técnicos d o processo eletroforético d e v e m ser
c o n s i d e r a d o s p a r a se o b t e r u m a eficiência aceitável. Eles i n c l u e m
(1) a e l e t r o e n d o s m o s e , (2) o m a n u s e i o de t a m p õ e s e de soluções
d e corantes, (3) as c o n s i d e r a ç õ e s sobre as a m o s t r a s e (4) os m u i t o s
p r o b l e m a s c o m u m e n t e e n c o n t r a d o s n a execução da eletroforese.
Endosmose ou Fluxo Eletroendosmótico
C e r t o s m e i o s de s u p o r t e eletro for éticos e m c o n t a t o c o m a água
a d q u i r e m carga negativa devido à absorção de íons hidtoxila. Estes
íons se t o r n a m fixados à superfície e se t o r n a m imóveis. O s íons
positivos e m solução se a g r u p a m e m t o r n o dos sítios de carga
negativa fixos, f o r m a n d o u m a n u v e m iônica p r i n c i p a l m e n t e d e
íons positivos. O n ú m e r o de íons negativos associados a esta
n u v e m iônica a u m e n t a c o m o a u m e n t o da distância dos sítios de
carga negativa fixos até que, e v e n t u a l m e n t e , íons positivos e nega-
tivos estejam presentes e m c o n c e n t r a ç õ e s iguais (Figura 6-7)-
Q u a n d o se aplica c o r r e n t e a tal sistema, as cargas ligadas ao
s u p o r t e imóvel p e r m a n e c e m fixas, m a s a n u v e m d e íons e m
solução está livre para se m o v e r p a r a o e l e t r o d o de p o l a r i d a d e
Eletroforese CAPÍTULO 6 113
Cargas fixadas na superfície
íons imóveis
íons móveis
-c
o
D.
• I I
01
u
•fc
03
Q_
3
00
Solução
homogênea
Potencial de Stern Potencial Zeta (Ç)
Figura 6 - 7 Distribuição de íons + e - em tomo da superfície de um
suporte eletroforético. Uma camada de íons - está fixada na superfície
do sólido. (Esta pode ser de íors + sob condições adequadas). Uma
segunda camada de íons + é atraída para a superfície. Uma solução
homogênea se estende além da superfície do sólido.
o p o s t a . C o m o estes í o n s são a l t a m e n t e h i d r a t a d o s , seus movi-
m e n t o s t a m b é m c a u s a m o m o v i m e n t o d o solvente. Este f e n ô -
m e n o , d e n o m i n a d o endosmose, causa o m o v i m e n t o pr ef er enci al
da água e m u m a direção. As m a c r o m o l é c u l a s e m solução q u e de
o u t r a m a n e i r a se m o v e r i a m n a direção o p o s t a a este f l u x o p o d e m
p e r m a n e c e r imóveis o u até m e s m o ser a r r a s t a d a s d e volta e m
d i r e ç ã o ao p ó l o o p o s t o se estiverem i n s u f i c i e n t e m e n t e carrega-
das. N o s m e i o s eletroforéticos n o s quais as cargas superficiais são
m í n i m a s (gel de a m i d o , agarose p u r i f i c a d a o u gel de poliacrila-
mida), a endosmose t a m b é m é m í n i m a . C o m o a superfície
i n t e r n a de u m capilar de vidro c o n t é m m u i t o s destes g r u p o s
carregados, a e n d o s m o s e é m u i t o f o r t e e é r e a l m e n t e a p r i n c i p a l
força i m p u l s i o n a d o r a da migração e m sistemas de C E .
Tampões
O s t a m p õ e s são b o n s m e i o s d e c u l t u r a para o c r e s c i m e n t o d e
m i c r o r g a n i s m o s e d e v e m ser r e f r i g e r a d o s q u a n d o n ã o estão e m
uso. A l é m disso, u m t a m p ã o gelado m e l h o r a a r e s o l u ç ã o e reduz
a e v a p o r a ç ã o d o s u p o r t e eletroforético. O t a m p ã o u s a d o e m u m
e q u i p a m e n t o d e v o l u m e p e q u e n o deve ser d e s c a r t a d o após cada
corrida devido às m u d a n ç a s de p H causadas pela eletrólise d a
água q u e a c o m p a n h a a eletroforese. Se os v o l u m e s u s a d o s são
m a i o r e s d o q u e 100 mL, os t a m p õ e s dos dois reservatórios p o d e m
ser c o m b i n a d o s , m i s t u r a d o s , a r m a z e n a d o s a 4 o C e reutilizados
e m q u a t r o corridas eletrofotéticas s u b s e q ü e n t e s .
Solução de Coloração
Lima solução d e c o l o r a ç ã o típica p o d e ser u s a d a várias vezes. O
c o r a n t e o u o s u b s t r a t o reagente, n o caso d e isoenzimas, p o d e ser
c o n s i d e r a d o i n a d e q u a d o s e m p r e q u e as zonas de p r o t e í n a s pare-
c e r e m m u i t o f r a c a m e n t e coradas. A s o l u ç ã o de c o l o r a ç ã o deve
ser g u a r d a d a h e r m e t i c a m e n t e f e c h a d a p a r a evitar a e v a p o r a ç ã o .
114 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
Amostragem
U m a vez que a a l b u m i n a n o soro é dez vezes mais concentrada do
que as oci-globulinas, a q u a n t i d a d e de soro aplicada deve evitar a
sobrecarga d o gel com albumina, mas deve ser a d e q u a d a para quan-
tificar OCi-globulma. As quantidades típicas de soro aplicadas n a
eletroforese e m gel de agarose são de 0,6 a 2,0 [_iL, d e p e n d e n d o das
necessidades d o teste. Se os procedimentos exigem múltiplas aplica-
ções, tal c o m o n a análise de ísoenzimas, a preocupação com relação
à sobrecarga de albumina n ã o é mais u m fator importante. As
amostras de urina necessitam da concentração de 5 0 a 100 vezes
para a sensibilidade adequada, e as de C S F p o d e m ou n ã o necessitar
de concentração, d e p e n d e n d o da tccnica dc coloração empregada.
Manutenção de um Capilar Saudável
A p r e p a r a ç ã o e a m a n u t e n ç ã o d e u m capilar t ê m u m p a p e l vital
n a o b t e n ç ã o de resultados reprodutíveis c o m C E . Q u a n d o se usa
u m capilar n o v o o u se m u d a para u m novo t a m p ã o de separação,
o capilar deve ser a d e q u a d a m e n t e e q u i l i b r a d o c o m o t a m p ã o d e
separação, u m processo d e n o m i n a d o c o n d i c i o n a m e n t o . O con-
d i c i o n a m e n t o é p a r t i c u l a r m e n t e i m p o r t a n t e q u a n d o se usa u m
t a m p ã o c o n t e n d o fosfato. Para a r e p r o d u t i b i l i d a d e aceitável, u m
t a m p ã o c o n t e n d o fosfato deve ser e q u i l i b r a d o n o capilar p o r n o
m í n i m o 4 h o r a s antes da eletroforese. C o m o c o m q u a l q u e r
superfície de sílica n ã o t r a t a d a , os grupos silanol ionizados são
ideais p a r a a i n t e r a ç ã o c o m os analitos carregados, particular-
m e n t e p e p t í d i o s e p r o t e í n a s e m t a m p õ e s de p H n e u t r o / b á s i c o .
C o n s e q ü e n t e m e n t e , após cada separação, a superfície d o capilar
deve ser " r e g e n e r a d a " ou " r e c o n d i c i o n a d a " p a t a remover qual-
q u e r material a d s o r v i d o n a p a r e d e . Isto é c o n s e g u i d o lavando-se,
a cada corrida, a c o l u n a c o m 3 a 5 v o l u m e s de c o l u n a de N a O H
100 m m o l / L , e, e m seguida, e n x a g ü a n d o - a c o m 5 a 8 v o l u m e s
d e c o l u n a de u m a p r e p a r a ç ã o fresca de t a m p ã o de separação.
Problemas Comuns
O s seguintes p r o b l e m a s p o d e m ser e n c o n t r a d o s q u a n d o se realiza
u m a eletroforese em placa d e gel.
1. A s descontinuidades n a aplicação d a a m o s t r a p o d e m ser
devidas a aplicadores sujos, os quais são mais b e m l i m p o s
pela agitação e m água seguida de pressão delicada d o
aplicador c o n t r a u m p a p e l absorvente. Deve-se ter c u i d a d o ,
e n ã o é aconselhável l i m p a r fios ou p e n t e s m a n u a l m e n t e .
2. A migração desigual das amostras através d a extensão d o gel
p o d e ser devida a eletrodos sujos que c a u s a m a aplicação
irregular d o c a m p o elétrico o u ao u m e d e c i m e n t o desigual
d o gel.
3. As £0?Txl5 áütorcidets de proteínas p o d e m ser devidas (a) a
aplicadores curvos, (b) à i n c o r p o r a ç ã o de u m a b o l h a de at
d u r a n t e a aplicação da a m o s t r a , (c) à sobrecarga de a m o s t r a
ou (d) à secagem excessiva d o s u p o r t e eletroforético antes
ou d u r a n t e a eletroforese.
4. A s megulaiidades (outras além das zonas q u e b r a d a s ) n a
aplicação da a m o s t r a p r o v a v e l m e n t e são devidas aos géis de
agarose excessivamente ú m i d o s . Partes das amostras
aplicadas p o d e m p a r e c e r desbotadas.
5. As bandas não usuais são n o r m a l m e n t e artefatos q u e p o d e m
ser f a c i l m e n t e r e c o n h e c i d o s . As amostras h e m o l i s a d a s são
causas f r e q ü e n t e s de u m a p-globulina a u m e n t a d a ( o n d e a
h e m o g l o b i n a livre migra) o u d e u m a b a n d a n ã o usual e n t r e
as a 2 - e p-globulinas, o r e s u l t a d o de u m c o m p l e x o
h e m o g l o b i n a - h a p t o g l o b i n a . U m a b a n d a n o p o n t o de
partida p o d e ser d o f i b r i n o g ê n i o , e deve-se verificar se a
a m o s t r a é soro a n t e s q u e esta b a n d a seja r e p o r t a d a c o m o
u m a p r o t e í n a a n o r m a l . B a n d a s de a]-, a 2 - e |3-globuIinas
divididas n ã o são i n c o m u n s e n ã o d e v e m ser c o n s i d e r a d a s
erros. E m algumas amostras, as a r e p-lipoproteínas p o d e m
migrar à f r e n t e de suas posições n o i m a i s e parecer c o m o
u m a b a n d a atípica. O c a s i o n a l m e n t e , u m a zona de
a l b u m i n a dividida é o b s e r v a d a n a bis-albuminemia, mas
u m a zona de a l b u m i n a g r o s s e i r a m e n t e alargada p o d e ser
devida a certos m e d i c a m e n t o s q u e se ligam à a l b u m i n a .
6. As bandas atípicas e m u m p a d r ã o de Ísoenzimas p o d e m ser
r e s u l t a d o da ligação p o r u m a i m u n o g l o b u l i n a . U m a zona
de p r o t e í n a irregular, m a s nítida, n o p o n t o de p a r t i d a , que
n ã o t e m a aparência regular e u m t a n t o d i f u s a das
proteínas, p o d e ser de f a t o p r o t e í n a d e s n a t u r a d a r e s u l t a n t e
de u m soro d e t e r i o r a d o . Q u a n d o se d e p a r a c o m u m a
b a n d a n ã o usual e m q u a l q u e r lugar d e u m p a d r ã o de
p r o t e í n a sérica, a p o s s i b i l i d a d e de que seja u m a
p a r a p r o t e í n a verdadeira (Ver C a p í t u l o 18 para maiores
detalhes) deve s e m p r e ser c o n s i d e r a d a . F i n a l m e n t e , é u m a
b o a prática de l a b o r a t ó r i o incluir u m soro- c o n t r o l e e m
cada corrida eletroforética p a r a avaliar sua q u a l i d a d e e a d o
densitômetro.
R E F E R E N CI A S
1. Anderson NL, Anderson NG. The human plasma proteome: History,
character, and diagnostic prospeets. Mol Celi Pro 2002;1:845-67.
2. Chien RL, Burgi DS. Pield amplified samplc injcction in high-
performance capillary electrophoresis. J Chromatog 1991;559:141-52.
3. Horgan G, Glasbey CA. Uses of digital image analysis in electrophoresis.
Electrophoresis 1995;16:298-305.
4 Jensen ON, Wilm M, Shevchenko A, Mann M. Peptide sequencing of
2-DE gel isolaced proteins by nanoeleclrospray tandem mass
spectrometry. Methods Mol Biol 1999;112:571-88.
5 Karcher RE, Landers JP. Electrophoresis. In: Burtis CA, Ashwood ER,
Bruns DE, eds: Tietz cextbook of clinicai chemistry and molecular
diagnostica, 4th ed, Philadelphia: Saunders, 2006:121-40.
6. Landers JP Molecular diagnostica on electrophoretic microchips. Anal
Chem 2003;75:2919-27.
7. Manz A, Graber N, "Widmer HM. Miniaturized total chemical analysis
systems: a novel concept for chemical sensing. Sens Actuators
1990;Bl-244-8.
8. Molloy MP Two-dimensional electrophoresis of membrane proteins
using immobilized pH gradients. Anal Biochem 2000;280:1-10.
9. Nelson R], Burgi DS. Temperature concrol in capillary electrophoresis.
In: Landers JP, ed. Handbook of capillary electrophoresis Boca Raton:
CRC Press, 1994-549-62,
10. Oda RP, Bush VJ, Landers JP. Clinicai applications of capillary
electrophoresis. In: Landers JP, ed. Handbook of capillary
electrophoresis, 2nd ed. Boca Raton: CRC Press, 1997:639-73.
11 Ogorzalek RR, Loo JA, Andrews PC. Obtaining molecular weights of
proteins and their cleavage produets by directly combining gel
electrophoresis with mass spectrometry. Methods Mol Biol
1999;112 473-85.
12. 0'ReilIy MJ, Kinnon C. The cechnique of pulsed field gel
electrophoresis and its impact on molecular immunology. J Immunol
Methods 1990;131:1-31.
13 Pentoney Jr SL, Sweedler JV Op tical detection techniques for capillary
electrophoresis. In: Landers JP, ed. Handbook of capillary
electrophoresis, 2nd ed. Boca Raton- CRC Press, 1997:379-423.
14 Rabilloud T. A comparison between low background silver diamiriine
and silver nitrate protein stains Electrophoresis 1992; 13-429-39.
15 St Claire III RL. Capillary electrophoresis. Anal Chem 1996;68:569-86.
16. Viskari P, Landers JP. Unconventional derection methods for
microfluidic devices. Electrophoresis 2006;27i 1797-810
CAPÍTULO 7
OBJETIVOS
1. Definir cromatografia, fase estaciona riaj fase móvel e resolução.
2. Apresentar as duas formas básicas de cromatografia e os princípios
básicos de cada uma delas.
3. Citar cinco técnicas de separação utilizadas em procedimentos
cromatográficos e apresentar o princípio de cada uma delas.
4. Apresentar o princípio da cromatografia em camada delgada e seu
uso em um laboratório clínico.
5. Definir e calcular fator de retenção e discutir como este fator é
usado para identificar compostos em um procedimento
cromatográfico.
6. Apresentar a teoria da cromatografia em fase gasosa e seu uso em
um laboratório clínico.
7. Apresentar o princípio da cromatografia em fase líquida de alta
eficiência e seu uso em um laboratório clínico.
8. Citar exemplos de detectores usados em procedimentos
cromatográficos e como eles quantificam a concentração de
substâncias.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
C r o m a t o g r a f i a : U m m é t o d o físico de separação n o qual os
c o m p o n e n t e s a s e r e m s e p a r a d o s são distribuídos e n t r e duas
fases: u m a delas é estacionária (fase estacionária), e n q u a n t o
a o u t r a (a fase móvel) se m o v i m e n t a e m u m a di reção
definida.
C r o m a t o g r a f i a d e Fase R e v e r s a : U m tipo d e cromat ografia de
p a r t i ç ã o líquida na qual a fase móvel é significativamente
mais polaT d o q u e a fase estacionária.
C r o m a t o g r a f i a d e P a r t i ç ã o : M o d o de cromat ografi a n o qual a
separação é b a s e a d a , p r i n c i p a l m e n t e , nas diferenças entre as
solubilidades d o s c o m p o n e n t e s da a m o s t r a na fase
estacionária (cromatografia e m fase gasosa) ou nas
diferenças e n t r e as solubilidades dos c o m p o n e n t e s n a s fases
móvel e estacionária (cromatografia líquida).
C r o m a t o g r a f i a e m C o l u n a : U m a técnica d e separação na qual
o leito estacionário está d e n t r o de u m t u b o .
C r o m a t o g r a f i a e m Fase G a s o s a (GC): U m t i p o de
c r o m a t o g r a f i a e m c o l u n a n o qual a fase móvel é u m gás.
C r o m a t o g r a f i a e m Fase G a s o s a — E s p e c t r o m e t r i a d e Massa
(GC-MS): U m processo analítico q u e usa a cromat ografia
e m fase gasosa acoplada a u m e s p e c t r ô m e t r o de massa.
C r o m a t o g r a f i a L í q u i d a (LC): F o r m a de c r o m a t o g r a f i a de
c o l u n a na q u a l a fase móvel é u m líquido.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC): U m tipo
d e L C q u e usa u m a eficiente c o l u n a c o n t e n d o p e q u e n a s
partículas de fase estacionária.
*Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições prévias do Dr.
LarryD. Bowers, nas quais se baseiam partes deste capítulo.
Cromatografia*
M. David Ullman, Ph.D., e Carl A. Burtis, Ph.D.
C r o m a t o g r a f i a L í q u i d a — E s p e c t r o m e t r i a d e Massa (LC-MS):
U m processo analítico q u e usa u m c r o m a t ó g r a f o l í q u i d o
a c o p l a d o a u m e s p e c t r ô m e t r o d e massa.
C r o m a t o g r a f i a P l a n a r : U m a técnica de separação n a qual a
fase estacionária é u m papel (cromatografia e m papel, [PC])
o u u m a c a m a d a de partículas sólidas dispersas e m u m
s u p o r t e (cromatografia e m c a m a d a f i n a , [TLC]).
C r o m a t o g r a f i a p o r T r o c a d e í o n s : T i p o de cromatogr af i a e m
q u e a separação é baseada, p r i n c i p a l m e n t e , nas diferenças
das a f i n i d a d e s de troca iônica d o s c o m p o n e n t e s da amostra.
C r o m a t o g r a m a : U m gráfico ou o u t r a a p r e s e n t a ç ã o da resposta
d o detector, c o n c e n t r a ç ã o de u m a substância a ser analisada
(analito) n o e f l u e n t e o u o u t r a q u a n t i d a d e u s a d a c o m o
m e d i d a de c o n c e n t r a ç ã o d e e f l u e n t e uersus v o l u m e de
e f l u e n t e ou t e m p o .
Fase E s t a c i o n á r i a : A fase estacionária é u m a das d u a s fases q u e
f o r m a m o sistema cromatográfico. P o d e sei u m sólido, u m
gel o u u m l í q u i d o . Se f o r líquido, p o d e ser d i s t r i b u í d o
s o b r e u m s u p o r t e sólido. Esse s u p o r t e sólido p o d e o u n ã o
c o n t r i b u i r para o processo de p r e p a r a ç ã o .
Fase M ó v e l : U m gás o u l í q u i d o q u e se infiltra através ou ao
l o n g o d o leito estacionário n u m a direção d e f i n i d a .
R e s o l u ç ã o : U m a m e d i d a d o q u ã o e f i c a z m e n t e dois picos
a d j a c e n t e s estão separados.
A
cromatografia é utilizada n o laboratório clínico p a r a
separar e q u a n t i f i c a r vários analitos clínicos relevantes.
.Este capítulo inclui discussões gerais sobre (1) conceitos
básicos, (2) m e c a n i s m o s de separação, (3) resolução e (4) tipos
específicos d e cromatografia, i n c l u i n d o o planar, na f o r m a gasosa
e líquida de alta eficiência. Ele se e n c e r r a c o m u m a discussão
sobre c o m o a cromatografia é utilizada n a s análises qualitativa e
quantitativa.
CONCEITOS BÁSICOS
A c r o m a t o g r a f i a é u m processo físico o n d e os c o m p o n e n t e s
(solutos) d e u m a m i s t u r a de amostras são separados c o m o resul-
tado d e sua distribuição diferencial e n t r e as fases estacionária e
móvel. D u r a n t e esse processo, a fase m ó v e l t r a n s p o r t a a a m o s t r a
através d e u m leito, c a m a d a o u c o l u n a q u e c o n t e n h a a fase esta-
cionária. A m e d i d a q u e a fase móvel f l u í ao passar pela fase
estacionária, os solutos p o d e m (1) se fixar a p e n a s n a fase estacio-
nária (sem migração); (2) p e r m a n e c e r a p e n a s na fase móvel
(migração c o m a fase móvel); o u (3) se distribuir e n t r e as d u a s
fases (migração diferencial). Esses solutos c o m a f i n i d a d e mais
elevada pela fase estacionária se p r e n d e m n a m e s m a e m i g r a m
mais l e n t a m e n t e d o q u e os q u e t ê m m e n o r a f i n i d a d e . O s c o m
m e n o r a f i n i d a d e p e r m a n e c e m p r i n c i p a l m e n t e n a fase móvel e
m i g r a m mais r á p i d o . Assim, os solutos c o m m e n o r a f i n i d a d e
separam-se d o s solutos c o m m a i o r a f i n i d a d e pela fase estacioná-
ria. O s solutos f o r t e m e n t e ligados são deslocados, s u b s e q ü e n t e -
m e n t e , da fase estacionária, alterando-se a natureza física o u
q u í m i c a da fase móvel. Neste capítulo, o t e r m o e m inglês chroma-
115
116 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

Figura 7 - 1 Formas de cromatografia.

togrãph. foi traduzido t a n t o c o m o v e r b o q u a n t o c o m o s u b s t a n t i v o .

C o m o verbo, significa separar p o r cromatografia; c o m o substan-
tivo, se refere à m o n t a g e m d o s c o m p o n e n t e s necessários para
realizai u m a separação p o r cromatografia.
A s d u a s f o r m a s básicas d e cromatografia são a p l a n a r e a
c r o m a t o g r a f i a e m c o l u n a (Figura 7-1). N a c r o m a t o g r a f i a p l a n a r ,
a fase e s t a c i o n á r i a reveste u m a tira de papel (cromatografia e m
papel) o u u m a superfície sólida (cromatografia e m c a m a d a f i n a
[TLC]). N a c r o m a t o g r a f i a e m papel, a fase estacionária é u m a
c a m a d a de água ou u m solvente polar q u e Teveste as fibras d o
papel. N a T L C , u m a fina c a m a d a d e partículas d e u m m a t e r i a l
c o m o a sílica gel é e s p a l h a d a u n i f o r m e m e n t e n u m a placa d e v i d r o
o u n u m a folha d e plástico ou a l u m í n i o . Q u a n d o a c a m a d a f i n a
consiste de partículas de d i â m e t r o p e q u e n o (4,5 y m ) , a técnica é
c o n h e c i d a c o m o cromatografia em camada fina de alta eficiência
(HPTLC).
N a c r o m a t o g r a f i a e m c o l u n a , a fase estacionária p o d e ser
sílica p u r a o u u m p o l í m e r o , o u p o d e ser u m r e v e s t i m e n t o sobre
O
partículas de s u p o r t e o u ligada q u i m i c a m e n t e a elas. A fase esta-
— V \i
c i o n á r i a p o d e ser " e m p a c o t a d a " n u m t u b o o u revestir a superfície
i n t e r n a d o m e s m o . A c r o m a t o g r a f i a em c o l u n a inclui t a n t o a 1 r~
2 3
c r o m a t o g r a f i a e m fase gasosa (GC) q u a n t o a c r o m a t o g r a f i a
Minutos
l í q u i d a (LC), d e p e n d e n d o se a fase móvel é u m gás ou u m
l í q u i d o . O p e r a c i o n a l m e n t e , o i n s t r u m e n t o u s a d o p a r a realizar
u m a separação G C ou L C é c o n h e c i d o c o m o cromatógrafo a gds Coluna: C18, 3 |J, 0,46 x 10 cm
ou líquido. Q u a n d o a fase estacionária na L C consiste e m partí- Eluente: lsocrálico, fosfato 0,025 M
culas de d i â m e t r o p e q u e n o , a técnica é a c r o m a t o g r a f i a l í q u i d a Tampão: pH 3,0 em acetonitrila a 25%
d e alta e f i c i ê n c i a ( H P L C ) . Q u a n d o u m c r o m a t ó g r a f o a gás ou Taxa de vazão: 2 mL/min
l i q u i d o é c o n e c t a d o a u m espectro m e t r o de massa, as técnicas Detecção: 215 nm, 0,1 AUFS
c o m b i n a d a s o u "hifenizadas" são a c r o m a t o g r a f i a e m fase
gasosa—espectrometria d e m a s s a (GC-MS), e a c r o m a t o g r a f i a Componentes 1. Doxepina
2. Desipramína
l í q u i d a — e s p e c t r o m e t r i a d e m a s s a (LC-MS).
3. Imipramina
N a G C e n a L C analíticas, a fase móvel (ou eluente) sai da
4. Nortriptilina
c o l u n a e passa através d e u m d e t e c t o r que p r o d u z u m sinal ele-
5. Amitriptilína
t r ô n i c o o qual. é t r a ç a d o c o m o f u n ç ã o d o t e m p o , da distância ou
d o v o l u m e . O gráfico r e s u l t a n t e é u m c r o m a t o g r a m a (Figura 7-2).
O t e m p o de retenção, ou v o l u m e de retenção, ocorre q u a n d o u m
soluto sai d o i n j e t o r e passa através da coluna e d o detector. O s Figura 7 - 2 Cromatograma de uma separação por HPLC de fase
d a d o s r e p r e s e n t a d o s p e l o c r o m a t o g r a m a são u s a d o s para a j u d a r reversa de antidepressivos triciclicos com o uso de um detector com
a i d e n t i f i c a r e q u a n t i f i c a r o(s) soluto(s). C o m o os solutos e m fotômetro UV configurado para 215 nm. O sinal é exibido a 0,1 AUFS.
eluição são exibidos g r a f i c a m e n t e c o m o u m a série de picos, eles HPLC, cromatografia líquida de aita eficiência; UV, ultravioleta;
f r e q ü e n t e m e n t e são c h a m a d o s de Jricos croma tográficos. Esses picos AUFS, unidades de absorvãncia em escala completa. (Cortesia de
são descritos e m t e r m o s de (1) a m p l i t u d e , (2) altura e (3) área. Vydac/The Separa ti ons Group, Hesperia, Calif.)

N a cromatografia planar, as zonas separadas são detectadas p o r
suas cores n a t u r a i s ou visualizadas através da modificação q u í m i c a
q u e p r o d u z " m a n c h a s " ou "faixas", q u e são usadas d e m a n e i r a
qualitativa para identificar vários analitos o u p a r a quantificá-los.
MECANISMOS DE SEPARAÇÃO
As separações cromatográficas são classificadas pelos m e c a n i s m o s
q u í m i c o s ou físicos u s a d o s para separar os solutos. Estes i n c l u e m
(1) a troca de íons, (2) a partição, (3) a adsorção, (4) a exclusão
p o r t a m a n h o e (5) os m e c a n i s m o s de a f i n i d a d e . Basicamente, as
aplicações clínicas u s a m as separações cromatográficas baseadas
n o s m e c a n i s m o s d e troca d e íons e d e partição.
Cromatografia de Troca Iônica
A cromatografia d e troca iônica baseia-se e m u m a troca d e íons
e n t r e u m a s u p e r f í c i e estacionária carregada e os í o n s d e carga
oposta na fase móvel (Figura 7-3). D e p e n d e n d o das condições,
os solutos são c á t i o n s (carregados p o s i t i v a m e n t e ) o u â n i o n s (car-
regados n e g a t i v a m e n t e ) . Eles são s e p a r a d o s de a c o r d o c o m as
diferenças e m sua caTga iônica ou c o m a m a g n i t u d e desta carga
iônica. O p e r a c i o n a l m e n t e , as superfícies das partículas de u m a
resina plástica o u de sílica s e r v e m c o m o fase estacionária na qual
os g r u p o s f u n c i o n a i s c o m cargas c a n ó n i c a s ou iónicas fixas são
revestidas ou ligadas. Para m a n t e r a n e u t r a l i d a d e eletroquímica,
u m íon intercambiável, c h a m a d o íon de contagem, é e n c o n t r a d o
b e m p r ó x i m o á carga fixa e os íons de s o l u t o n a fase móvel fazem
Cromatografia de troca iônica
A separação baseia-se na troca de
íons entre a superfície e os eluentes.
Cromatografia de a d s o r ç ã o
A separação deve-se a uma série de
etapas de adsorção/dessorção.
Figura 7 - 3 Exemplos de mecanismos de separação usados em cromatografia. (Cortesia de James K. Hardy,
Akron, Obio [http://ull.ciieinistrvuakron.edu/].)
Cromatografia CAPÍTULO 7 117
trocas c o m os íons de c o n r a ^ e m . E n t ã o , os íons d o s o l u t o são
seletivamente eluídos pela m o d i f i c a ç ã o d o p H ou da força iônica,
o u a m b o s , da fase móvel.
A s partículas da troca d e cátions c o n t ê m grupos f u n c i o n a i s
carregados n e g a t i v a m e n t e e são u s a d a s p a r a separar ou "trocar"
solutos catiônicos. O s exemplos i n c l u e m g r u p o s f o r t e m e n t e
ácidos, tais c o m o os íons s u l f o n a d o s , ou g r u p o s p o u c o ácidos,
c o m o os íons carboxilados o u os g r u p o s carboximetil (CM),
fosfato (F), sulfometil (SM), sulfoetil (SE) o u s u l f o p r o p i l (SP). O s
a g r u p a m e n t o s de troca d e â n i o n s são u s a d o s para separar os
solutos aniônicos. Eles p o s s u e m a m i n a s q u a t e r n á r i a s f o r t e m e n t e
básicas c o m cargas positivas. O s e x e m p l o s i n c l u e m os grupos
trietilaminoetil ou os g r u p o s p o u c o básicos, tais c o m o a m i n o e t i l
(AE), dietilaminoetil (DEAE), g u a n í d o e t i l (GE) e epicloridrina-
trietanolamina (ECTEOLA).
A cromatografia de troca iônica tem m u i t a s aplicações clínicas,
i n c l u i n d o a separação de (1) aminoácidos, (2) peptídios, (3) proteí-
nas, (4) nucleotídios, (5) oligonucleotídios e (6) ácidos nucléicos.
O u t r a s aplicações i m p o r t a n t e s da cromatografia de troca iônica são
a separação e a r e m o ç ã o de íons inorgânicos das misturas aquosas.
Por exemplo, a água d e i o n k a d a é p r e p a r a d a utilizando-se colunas
d e "leito misto" de resinas de cátion e â n i o n .
Cromatografia de Partição
A distribuição diferencial de solutos e n t r e dois líquidos imiscíveis
é a base para a separação pela cromatografia d e partição (FigUTa
Cromatografia de partição
A separação baseia-se no particionamento
dos solutos entre duas fases liquidas.
Cromatografia por e x c l u s ã o de tamanho
A separação baseia-se no tamanho molecular.
118 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

7-3). O p e r a c i o n a l m e n t e , u m dos líquidos imiscíveis serve c o m o Solvente em eluição

fase estacionária. Para p r e p a r a r essa fase, u m a película f i n a d o
l í q u i d o é a d s o r v i d a ou ligada q u i m i c a m e n t e n a superfície das
l
partículas d e s u p o r t e ou s o b r e a p a r e d e i n t e r n a de u m a c o l u n a Frente d e _ Moléculas
capilar. A separação baseia-se nas diferenças d a s o l u b i l i d a d e rela- solvente pequenas
tiva das moléculas d e s o l u t o e n t r e as fases estacionária e móvel. 1 / atrasadas
A c r o m a t o g r a f i a de p a r t i ç ã o é classificada c o m o cromatogra- (capturadas
fia líquido-gasosa ( G L C ) ou c r o m a t o g r a f i a líquida-líquida (LLC). em leitos)
A L L C é categorizada, a d i c i o n a l m e n t e , c o m o de fase n o r m a l ou Frente -
d e fase reversa. N a L L C de fase n o r m a l , u m l í q u i d o polar é uti-
lizado c o m o fase estacionária e u m solvente r e l a t i v a m e n t e n ã o -
p o l a r o u u m a m i s t u r a d e solventes é u s a d a c o m o fase móvel. N a
c r o m a t o g r a f i a d e fase reversa, a fase estacionária é não-polar e a Moléculas
fase móvel é r e l a t i v a m e n t e polar. y Í & V grandes
eluídas (ultra-
A cromatografia de supressão iônica e a d e p a r e a m e n t o iônico
Frente passaram os
são duas f o r m a s d e c r o m a t o g r a f i a d e fase reversa usadas p a r a
leitos)
separar solutos iónicos. N a cromatografia de supressão iônica, a
n a t u r e z a iônica d e u m analito p o u c o ácido ou básico é neutrali-
zada o u " s u p r i m i d a " através da alteração do p H d a fase móvel. A o O Partícula d e gel
se neutralizar esse g r u p o iônico, o soluto se torna m e n o s p o l a r e
• Molécula grande
mais c a p a c i t a d o para interagir c o m a fase estacionária não-polar.
C o m isso, o analito s u p r i m i d o a d q u i r e as p r o p r i e d a d e s de u m a • Molécula pequena
espécie n e u t r a e é s e p a r a d o pela cromatografia de fase reversa. N a
cromatografia d e p a r e a m e n t o iônico, u m íon de c o n t a g e m — d e Figura 7 - 4 Representação esquemática da cromatografia em coluna
carga oposta ao d o analito — é a d i c i o n a d o à fase móvel, o n d e de filtração em gel. (Modificado de Bennett TP. Graphic biochemistry,
f o r m a pares de íons c o m os analitos iónicos, desloca os pares de vol I. Chemistry ofbiological molecules ISIew York. Macmillan, 1968.)
base habituais e neutraliza o(s) íon(s) d o analito. E n t ã o , esses pares
de íons são separados pela cromatografia de fase reversa. N a
prática, a cromatografia de p a r e a m e n t o iônico é p a r t i c u l a r m e n t e
útil para separações de drogas terapêuticas e seus metabólitos.

Cromatografia de Adsorção
A base d a s e p a r a ç ã o pela c r o m a t o g r a f i a de a d s o r ç ã o encontra-se
n a s diferenças e n t r e a a d s o r ç ã o e a dessorção dos solutos n a
superfície de u m a partícula sólida (Figura 7-3). A s interações
eletrostáticas, dispersivas e as p o n t e s d e h i d r o g ê n i o são as forças
físicas q u e c o n t r o l a m esse t i p o d e cromatografia. N a G C , esse
p r i n c í p i o é utilizado para s e p a r a r c o m p o s t o s d e baixo peso mole-
cular (p. ex., metila, etila e álcoois isopropílicos) e c o m p o s t o s q u e
n o r m a l m e n t e são gases e m t e m p e r a t u r a a m b i e n t e .

Cromatografia por Exclusão de Tamanho

A cromatografia p o r exclusão de t a m a n h o , t a m b é m c o n h e c i d a
c o m o cromatografia de filtração em gei, permeaçâo em geí, exclusão
estérica, exclusão molecular o u peneira molecular, separa os solutos
c o m base e m seu t a m a n h o m o l e c u l a r (Figura 7-3). O f o r m a t o e
a h i d r a t a ç ã o moleculares t a m b é m são fatores desse processo,
Diversos materiais são utilizados c o m o fases estacionárias n a
c r o m a t o g r a f i a p o r exclusão d e t a m a n h o , i n c l u i n d o (1) d e x t r a n
de ligação cruzada, (2) poliacrilamida, (3) agarose, (4) poliesti-
reno-divinil-benzeno, (5) v i d r o p o r o s o e (6) c o m b i n a ç õ e s desses
itens. As esferas desses materiais são porosas, s e n d o seus p o r o s
de t a m a n h o s q u e p e r m i t a m q u e as moléculas p e q u e n a s sejam
t e m p o r a r i a m e n t e a p r i s i o n a d a s (Figura 7-4). As moléculas grandes
d e m a i s p a r a a d e n t r a r os p o r o s p e r m a n e c e m i n t e i r a m e n t e n a fase
m ó v e l e são r a p i d a m e n t e eluídas d a coluna. As moléculas c o m
t a m a n h o i n t e r m e d i á r i o t ê m acesso a várias frações d o v o l u m e d o
p o r o e e l u e m e n t r e as moléculas g r a n d e s e p e q u e n a s . N a prática,
esse t i p o de c r o m a t o g r a f i a é mais u s a d o c o m p r o p ó s i t o s prepara-
tórios d o q u e analíticos.
Cromatografia por Afinidade
N a c r o m a t o g r a f i a p o r a f i n i d a d e , a interação biológica ú n i c a e
específica d o analito e d o ligante é utilizada p a r a a s e p a r a ç ã o
Suporte
Braço espaçador Ligante
Figura 7 - 5 Princípio da cromatografia por afinidade O analito
(enzima, anticorpo, antígeno, receptor de tecido etc.) liga-se ao ligante
de apoio. Subsequentemente, é eluído com um eluente geral {tal como
um agente caotrópico), uma alteração de pH ou eluente bioespecífico
{tal como um inibidor ou substrato).
(Figura 7-5). As interações e n z i m a / s u b s t r a t o , h o r m ô n i o / r e c e p t o r
o u a n t í g e n o / a n t i c o r p o são u s a d a s nesse tipo d e cromatografia.
O p o d e r da c r o m a t o g r a f i a p o r a f i n i d a d e reside e m s u a seleti-
vidade. N o l a b o r a t ó r i o clínico, a c r o m a t o g r a f i a p o r a f i n i d a d e t e m
sido utilizada p a r a separar os analitos, tais c o m o h e m o g l o b i n a s
glicosiladas (colunas d e b o r o n a t o de fenila) e l i p o p r o t e í n a s d e
baixa e m u i t o baixa d e n s i d a d e (colunas de h e p a r i n a ) . ' T a m b é m
t e m sido utilizada p a r a p r e p a r a r grandes q u a n t i d a d e s de proteí-
nas e a n t i c o r p o s p a r a e s t u d o s s u b s e q ü e n t e s .
 Cromatografia CAPÍTULO 7 119

RESOLUÇÃO A separação incompleta ocorre q u a n d o o valor calculado de

A r e s o l u ç ã o (R s ) é u m a m e d i d a d e s e p a r a ç ã o c r o m a t o g r á f i c a e jRs é m e n o r d o q u e 0 , 8 , e n q u a n t o a s e p a r a ç ã o basal é o b t i d a
r e q u e r q u e dois picos t e n h a m t e m p o s d e eluição diferentes para q u a n d o Rs é m a i o r d o q u e 1,25 ( F i g u r a 7-7). C o n f o r m e d e m o n s -
os c e n t r o s d o s p i c o s e a m p l i t u d e s u f i c i e n t e m e n t e e s t r e i t a p a r a t r a d o n a F i g u r a 7-8, q u a n d o R s f o r inaceitável p a r a u m a d e t e r m i -
e l i m i n a r o u m i n i m i z a r a s o b r e p o s i ç ã o ( F i g u r a 7-6). 4 Ela é expressa, n a d a s e p a r a ç ã o , ele p o d e r á ser m e l h o r a d o através d e u m a altera-
m a t e m a t i c a m e n t e , c o m o segue: ç ã o n o (1) f a t o r d e r e t e n ç ã o da. c o l u n a (k*), (2) n a e f i c i ê n c i a d a
c o l u n a (N) o u (3) n a s e l e r i v i d a d e d a c o l u n a ( a ) . O f a t o r d e r e t e n -
V. ( B ) - V T ( A) ç ã o descreve a d i s t r i b u i ç ã o d o s s o l u t o s e n t r e as fases e s t a c i o n á r i a
Rs = (D
w(A) +uj(B) e móvel. A e f i c i ê n c i a d a c o l u n a é u m a f u n ç ã o da i n t e r a ç ã o fisica
e n t r e as m o l é c u l a s d o s o l u t o e o m a t e r i a l d e c o m p o s i ç ã o d a
c o l u n a . A s e l e t i v i d a d e caracteriza a a f i n i d a d e q u í m i c a específica
e n t r e as m o l é c u l a s d o s o l u t o e a c o m p o s i ç ã o d a c o l u n a . D e s s a
onde f o r m a , r e a r r a n j a n d o a e q u a ç ã o (1) e e x p r e s s a n d o os p a r â m e t r o s
V r (A) = v o l u m e d e r e t e n ç ã o d o soluto A e m termos d e retenção, eficiência e seletividade, a resolução
V r (B) = v o l u m e d e r e t e n ç ã o d o soluto B t a m b é m é expressa c o m o :
u-'{A) = a m p l i t u d e ( u n i d a d e s d e volume) medida na base para
o soluto A
w(B) - amplitude (unidades de volume) m e d i d a na base para
o soluto B
0,5 0,6 0,7

A resolução t a m b é m é expressa e m t e r m o s de tempo, com

Vj(A) e V r (B) s e n d o s u b s t i t u í d o s p e l o s t e m p o s d e r e t e n ç ã o t r (A)
e t r (B), e c o m if(A) e u<(B) s e n d o e x p r e s s o s e m u n i d a d e s d e
tempo.

0,B 1,0 1,25

Ponto de
injeção
Figura 7-7 Separação dos picos cromatográficos presentes n u m a
p r o p o r ç ã o d e 1:1 c o m o u m a f u n ç ã o da r e s o l u ç ã o (RJ. ( E x t r a í d o d e
S n y d e r LR: A r a p i d a p p r o a c h to s e l e c d n g t h e b e s t e x p e r i m e n t a l
c o n d i t i o n s for high-speed liquid c o l u m n c h r o m a t o g r a p b y Part 1
E s t i m a t i n g inicial s a m p l e r e s o l u t i o n r e q u i r e d by a given p r o b l e m . J
C h r o m a t o g r Sei 1 9 7 2 , 1 0 . 2 0 2 . )

R e s o l u ç ã o ruim

o
Ponto de Frente de

V solvente

Resolução boa em
decorrência da
eficiência d a coluna

Resolução boa em
virtude da seletividade
Figura 7-6 D i a g r a m a e s q u e m á t i c o d e u m c r o m a to g r a m a o b t i d o a da coluna
p a r t i r d e u m cro m a t o grafo d e c o l u n a e leito a b e r t o ( p l a n a r ) N a
c r o m a t o g r a f i a e m leito a b e r t o (embaixo) os c o m p o s t o s f o r t e m e n t e r e t i d o s
(B) m o v e m - s e m a i s l e n t a m e n t e d o q u e os c o m p o n e n t e s m e n o s r e t i d o s .
N a c r o m a t o g r a f i a e m c o l u n a (em cima) o c o m p o s t o B é e l u í d o m a i s t a r d e
q u e o c o m p o s t o A , m a i s u m a vez e m v i r t u d e da r e t e n ç ã o m a i s f o r t e .
R„ R e s o l u ç ã o , V r (A), v o l u m e d e r e t e n ç ã o p a r a o s o l u t o A , Vv(B), v o l u m e
d e r e t e n ç ã o p a t a o s o l u t o B, w(A), l a r g u r a d e b a n d a ( u n i d a d e s d e Figura 7-8 Efeito da selecividade e d a e f i c i ê n c i a n a r e s o l u ç ã o
v o l u m e ) m e d i d a n a b a s e p a r a o s o l u t o A; tu(B), l a r g u r a d e b a n d a cromatográfica. A , Resolução ruim. B , Resolução boa e m decorrência
( u n i d a d e s d e v o l u m e ) m e d i d a n a b a s e p a r a o s o l u t o B; V m , v o l u m e e n t r e da e f i c i ê n c i a da c o l u n a . C , R e s o l u ç ã o b o a e m v i r t u d e da s e l e t i v i d a d e da
o i n j e t o r e os detectores; d(A) d i s t â n c i a p e r c o r r i d a p e l o soluço A; c o l u n a . ( E x t r a í d o d e J o h n s o n EL, S t e v e n s o n R- Basic l i q u i d
A, s o l u t o A; B, s o l u t o B. r h r o m a t o g r a p h y - Palo A l t o , C a l i f : V a n a n A s s o c i a t e s , 1978.)
 120 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
Frente de
mento do
solvente
solvente
Cuba
Placa de Solvente
com a camada de
aplicação da
f i n a d e sílica g e l Ponto para o qual
amostra
a a m o s t r a migrou
Figura 7-9 Ilustração da T L C . O solvente sobe pela c a m a d a f i n a de
a d s o r v e n t e através da ação capilar. TLC, C r o m a t o g r a f i a d e c a m a d a f i n a .
{Modificado de B e n n e t t T P : G r a p h i c biochemistry, vol 1. C h e m i s t r y of
biological molecules. N e w York: M a c m i l l a n , 1968.)
VN ( a -
R, = x XI —
lc'l 1 4 { a
o n d e Ic' = fator d e r e t e n ç ã o o u capaci dade (um t e r m o t e r m o d i -
nâmico), N = n ú m e r o d e p r a t o s teóricos ( u m t e r m o cinético q u e
r e p r e s e n t a a eficiência da coluna) e a = fator de seletividade ( u m
termo termodinâmico).
Esses fatores s o f r e m variação p a r a afetar o grau d e resolução
de u m a d e t e r m i n a d a separação.* E n t r e t a n t o , u m a a b o r d a g e m
prática p a r a m e l h o r a r a resolução é p r i m e i r a m e n t e ajustar o fator
de r e t e n ç ã o p a r a u m valor aceitável, m e l h o r a n d o e n t ã o sua efici-
ência. Por f i m , se necessário, a seletividade. deverá ser modifi-
cada.
CROMATOGRAF]A_PLANAR
N a c r o m a t o g r a f i a p l a n a r os solutos são separados n u m a superfí-
cie p l a n a da fase estacionária A cromat ografi a em p a p e l e a T L C
são subclassificações da c r o m a t o g r a f i a p l a n a r (Figura 7-1). N a
c r o ma t o g r a f ia e m papel, a fase estacionária é u m a c a m a d a d e
água o u solvente p o la r q u e reveste as fibras d o papel.
Na T L C uma fina camada de adsorvente é u n i f o r m e m e n t e
e s p a l h a d a n u m a placa de v i d r o o u n u m a l â m i n a de plástico ou
a l u m í n i o . As placas p r o n t a s estão c o m e r c i a l m e n t e disponíveis e
são cobertas p o r diversos adsorventes (p. ex., sílica gel, microce-
lulose, ó x i d o d e a l u m í n i o o u d e x t r a n d e ligação cruzada). A
amostra é a d i c i o n a d a c o m o u m a p e q u e n a m a n c h a ou faixa
p r ó x i m a à b o r d a inferior d a placa. E n t ã o , a placa é colocada n u m
r e c i p i e n t e ou cuba f e c h a d a de vidro c o m a b o r d a inferior mergu-
l h a d a e a faixa de amostra logo acima da fase móvel (Figura 7-9).
A fase móvel migra ao subir na placa pela ação capilar. A p ó s a
fase móvel deslocar-se p o r u m a distância desejada, a placa é
r e m o v i d a da cuba e seca. A separação adicional é o b t i d a na T L C
se a placa for trabalhada n u m a s e g u n d a direção. A l é m dessa
técnica "ascendente", as placas de c a m a d a f i n a t a m b é m são tra-
b a l h a d a s de m a n e i r a radial.
*Para descrição mais detalhada desses parâmetros e de seu impacto na resolução
cromaiográfica, o leitor deve consultar Ullman MD, Burtis CA. Chromatography.
In: Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. Tietz textbook of clinicai chemistry
and molecular diagnostícs, 4th ed. Fhiladelphia. Saunders, 2006-141-63
A p ó s a secagem da placa, OK c o m p o n e n t e s separados são
localizados e i d e n t i f i c a d o s por diversos p r o c e d i m e n t o s , tais c o m o
i l u m i n a ç ã o ultravioleta (LA/), fluorescência, b o i r i f a ç ã o c o m rea-
gentes q u e geram cores específicas ou auto-radiografia. A migra-
ção d e u m soluto é expressa p o r seu valor de Rf, o qual é calculado
a partir da relação:
distância d o p o n t o de aplicacão até o c e n t r o d o soluto
Kf — :
distância d o p o n t o de aplicação até a f r e n t e da fase móvel
(3)
A sílica gel c o n t i n u a s e n d o u m a d s o r v e n t e a m p l a m e n t e uti-
lizado n a T L C . O u t r o s adsorventes i n c l u e m os inorgânicos e
orgânicos, tais c o m o o (1) óxido d e a l u m í n i o ( n e u t r o e ácido), o
(2) silicato d e m a g n é s i o , a (3) terra d e d i a t o m á c e a (fueseigi/hr), a
(4) celulose, a (5) p o l i a m i d a , as (6) resinas de troca iônica e a (7)
sílica alquilada, A s placas c o b e r t a s c o m u m agente c o m p l e x a n t e
quiral t a m b é m estão disponíveis e são usadas p a r a a separação
dos e n a n t i ô m e r o s d e a m i n o á c i d o s e c o m p o s t o s similares. As
placas c o m sílica são usadas na T L C d e fase reversa, o q u e t e m
se m o s t r a d o útil na c r o m a t o g r a f i a d e c o m p o s t o s polares. O u s o
d e partículas de d i â m e t r o p e q u e n o n a fase estacionária levou ao
(2) d e s e n v o l v i m e n t o da H P T L C . As separações p o r H P T L C são mais
eficientes e reprodutíveis e m v i r t u d e d o u s o das partículas de
d i â m e t r o p e q u e n o . A h i d r a t a ç ã o i n a d e q u a d a e a evaporação d o
solvente devem ser c u i d a d o s a m e n t e controladas. E n c o n t r a m - s e
disponíveis placas de T L C codificadas a laser, o n d e cada placa é
identificada d e f o r m a individual a fim de impedir erros de regis-
tro e a r q u i v a m e n t o .
N a prática, a m a i o r i a das separações poT T L C é qualitativa
o u s e m i q u a n t i t a t i v a ( c o m p a r a ç ã o visual). Porém, existem densi-
t ô m e t r o s m o d e r n o s c o n t r o l a d o s p o r c o m p u t a d o r q u e varrem, e m
faixas, os c r o m a t o g r a m a s das a m o s t r a s e de u m calibrador nas
placas d e H P T L C e q u e disponibilizam capacidades q u a n t i t a t i -
vas. 11 A s v a n t a g e n s da T L C i n c l u e m (1) simplicidade, (2) rapidez,
(3) versatilidade, (4) c a p a c i d a d e d e processar u m a g r a n d e q u a n -
t i d a d e d e amostras e m u m t e m p o m í n i m o e (5) baixo custo e m
t e r m o s d e reagentes e e q u i p a m e n t o s . '
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
N a cromatografia e m coluna, a fase estacionária recobre o u é
q u i m i c a m e n t e ligada a partículas d e a p o i o q u e são, s u b s e q ü e n t e -
m e n t e , " e m p a c o t a d a s " n u m t u b o , ou esta m e s m a fase reveste a
superfície i n t e r n a desse t u b o . A G C e a L C são subclassificações
da cromatografia e m c o l u n a (Figura 7-1).
Cromatografia e m Fase Gasosa
N a G C , u m a fase móvel gasosa é utilizada para passar u m a
m i s t u r a de solutos voláteis através de u m a c o l u n a q u e c o n t e n h a
a fase estacionária. A fase móvel, c h a m a d a c o m f r e q ü ê n c i a de gás
de arraste, é t i p i c a m e n t e u m gás inerte, tal c o m o o ni t r ogêni o, o
hélio o u o argônio. A separação d o s o l u t o baseia-se n a s diferenças
relativas n a s pressões d e v a p o r d o s solutos e e m suas interações
c o m a fase estacionária. Assim, u m soluto mais volátil elui da
c o l u n a antes d o m e n o s volátil. A l é m disso, u m s o l u t o q u e inte-
raja seletivamente c o m a fase estacionária elui da c o l u n a d e p o i s
d e u m o u t r o com u m m e n o r grau de interação. O e f l u e n t e da
c o l u n a c o n d u z os solutos s e p a r a d o s até o d e t e c t o r na o r d e m de
sua eluição. O s solutos são identificados, q u a l i t a t i v a m e n t e , pela
s e m e l h a n ç a entre seus t e m p o s de r e t e n ç ã o o u sua massa espec-
tral. O t a m a n h o d o pico (área o u altura) é p r o p o r c i o n a l à q u a n -
tidade de soluto d e t e c t a d o e é utilizado p a r a quantificá-lo.

A cromatografia sólido-gasosa (GSC) e a cromatografia
líquido-gasosa de partição (GLC) são categorias da G C . N a GSC,
as separações ocorrem, basicamente, pelas diferenças na adsorção
na superfície da fase sólida. N a LCG u m líquido não-volátil
reveste, ou é quimicamente ligado a partículas da coluna, o u é
ligado diretamente na parede interna da coluna capilar. A sepa-
ração ocorre, basicamente, pelas diferenças na repartição d o s
solutos entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida.
Instrumen tação
U m cromatógrafo básico a gás (Figura 7-10) consiste n o seguinte:
1. U m a coluna cromatográfica para separar os solutos
2. U m suprimento de gás de arraste e u m aparelho de controle
de vazão para regular o f l u x o desse gás de arraste através d o
sistema
3. U m injetor para introduzir uma alíquota de amostra o u de
analito derivado dentro da coluna
4. U m aquecedoT de coluna para esquentá-la
5. U m detector acoplado para detectar os analitos separados
conforme eluem da coluna
6. U m computador para controlar o sistema e processar os
dados
Coluna Cromatográfica
O s dois tipos principais de coluna usados na cromatografia em
fase gasosa são a empacotada e a capilar. As colunas empacotadas
são preenchidas c o m partículas de apoio usadas sem revestimento
(GSC) o u que foram revestidas o u quimicamente ligadas à fase
estacionária (GLC). Elas variam de 1 a 4 m m de diâmetro interno
(ID), a partir de 1 m ou mais de comprimento, e são fabricadas
a partir de tubos de vidro ou aço inoxidável. Embora as colunas
estreitas sejam mais eficientes, as colunas mais largas suportam
maiores quantidades de amostra. A G C rápida è u m tipo de G C
n o qual separações de alta velocidade são obtidas usando-se
colunas convencionais de c o m p r i m e n t o curto. As colunas maiores
são mais eficientes, mas requerem pressões maiores do gás de
arraste.
Suprimento de
f a s e móvel
Controlador de vazão
Compuíador/
( G C ) ou b o m b a (LC)
controlador
Integrador/
registrador
Detector(as)
Descarta
Figura 7 - 1 0 D i a g r a m a e s q u e m á t i c o de u m c r o m a t ó g r a f o d e gás o u
liquido. GC, Cromatografia em fase gasosa; LC, Cromatografia líquida.
Cromatografia CAPÍTULO 7 121
As colunas capilares, também conhecidas c o m o coluruis tubu-
lares abenas de parede revestida, são fabricadas revestindo-se a parede
interna de u m tubo de sílica fundida c o m uma fina película da
fase líquida. Elas variam de 0,1 a 0,5 m m de ID e de 10 a 150 m
de comprimento. A tubulação capilar de sílica fundida ultrapura
usada e m tais colunas é muito frágil. Para reforçar fisicamente a
tubulação adiciona-se u m fino revestimento externo de poliamida
ou alumínio, o que aumenta a durabilidade da coluna.
As colunas capilares são muito eficientes, mas possuem baixa
capacidade de amostra. A l é m das colunas empacotadas e capila-
res, h o u v e progresso n o desenvolvimento de microcolunas de G C
em cfuf?í de s i l í c i o /
Vários materiais têm sido utilizados c o m o fase estacionária
na GLC. Esses incluem os polímeros metilsilicone, polímeros de
silicone substituído e os poliésteres de silicone. Tais materiais são
revestidos o u quimicamente ligados na superfície das partículas
de apoio o u nas paredes da coluna.
Suprimento e Controle de Vazão do Gás de Arraste
U m a vazão constante de gás de arraste é necessária pata a efici-
ência da coluna e para tempos de eluição reprodutíveis. O s siste-
mas que fornecem taxas de vazão constantes variam de dispositi-
vos mecânicos simples a dispositivos eletrônicos sofisticados. Por
exemplo, u m sistema simples consistindo n u m tanque de gás
comprimido, uma válvula de agulha para ajustar a vazão, u m
medidor de vazão e uma válvula de pressão é suficiente para
muitas aplicações. A operação que demanda temperatura progra-
mada requer u m controlador de vazão diferencial sofisticado, tal
c o m o u m sistema de controle eletrônico de pressão programado
para regular a vazão e a pressão d o gás de arraste durante u m a
corrida cromatográfica. Tal controlador é operado n u m m o d o de
vazão ou de pressão constante. N o m o d o de vazão constante, é
calculada a pressão necessária para manter esse fluxo consranre
i n d e p e n d e n t e m e n t e da viscosidade d o gás de arraste. Então, u m
transdutor de pressão m e d e e m a n t é m a pressão interna necessá-
ria para a vazão constante.
A magnitude da vazão d o gás de arraste d e p e n d e d o tipo de
coluna. Por exemplo, as colunas empacotadas requerem uma taxa
de vazao de 10 a 6 0 m i y m i n . As taxas de vazão para as colunas
capilares são muito menores (de 1 a 2 m L / m i n ) e a manutenção
de uma taxa de vazão constante é ainda mais crítica pata a ope-
ração eficiente dessas colunas.
Diversos gases são utilizados para arraste, d e p e n d e n d o da
coluna e do detector. O hidrogênio e o hélio são os gases de
arraste preferidos paTa as colunas capilares. Entretanto, só devem
ser usados hidrogênio e hélio de alta pureza, já que as impurezas
do gás de arraste (1) lesionam a coluna, (2) d i m i n u e m o desem-
p e n h o de alguns detectores e (3) afetam a quantificação de
maneira adversa na análise de traços. Nas colunas empacotadas,
o gás de arraste usado c o m mais freqüência é o nitrogênio, que
é utilizado n o s detectores por ionização de chama (FID), de
captura de elétron (ECD) o u de condutividade térmica (TCD).
O hélio também é usado n o s FIDs e T C D s e as misturas de
nitro gênio-argônio-metano são usadas no E C D . O s gases de
arraste devem ser puros e secos, s e n d o que a tubulação usada
para conectar a fonte de gás ao G C deve estar livre de contami-
nação. O s leitos de peneiras moleculares e os retentores especia-
lizados e m linha têm sido utilizados para remover o u reduzir o
c o n t e ú d o da mistura, hidrocarboneto ou oxigênio, d o gás de
arraste. 5
Injetor
A função de u m injetor é introduzir u m a alíquota da amostra a
ser analisada dentro da coluna; isso inicia o processo cTomato-
122 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
gráfico e tem que ser feito c o m u m a interrupção mínima d o fluxo
gasoso para dentro da coluna. N a maioria dos métodos clínicos
de G C , as amostras são dissolvidas e m líquidos não-aquosos e
introduzidas na coluna por meio de u m injetar alinhado. Nas
colunas empacotadas utiliza-se uma microsseringa de vidro para
injetar uma alíquota de 1 a 10 pL da amosfra dissolvida através
de u m septo que serve c o m o interface entre o injetor e o sistema
cromatográfico. Na prática, a agulha da seringa é inserida através
do septo injetor e dentro de uma região aquecida. Depois, os
analitos voláteis e o solvente são "vaporizados" e varridos para
dentro da coluna pelo gás de arraste. Para garantir a volatilização
rápida e completa d o soluto, a temperatura do injetor é mantida
e m 3 0 ° C a 5 0 ° C acima da temperatura da coluna.
O s problemas c o m u n s na análise da G C incluem vazamentos
do septo e adsorção dos c o m p o n e n t e s da amostra dentro d o septo
durante a injeção. A l é m disso, c o m o o septo está aquecido,
formam-se, com freqüência, produtos da decomposição, que ter-
m i n a m por "sangrar" para dentro da coluna. Isso resulta e m picos
falsos, chamados picos-"fantasmas", que aparecem no cromato-
grama. O sangue n o septo é maior em temperaturas mais elevadas
na porta de injeção. Para minimizar esse problema, utiliza-se u m
septo revestido de teflon e c o m baixo sangramento. A superfície
interna d o septo é c o nt i nuamente limpa pelo gás de arraste, que
é ventilado antes de passar para dentro da coluna. Essa aborda-
gem é especialmente eficaz e a maioria dos injetores disponíveis
no mercado está equipada c o m características de limpeza contí-
nua. O septo é u m c o m p o n e n t e consumível e deve ser substituído
pelo m e n o s a cada 100 injeções.
Em decorrência da baixa capacidade de amostra e das taxas
de vazão gasosa utilizadas na coluna capilar, são usadas as técnicas
de injeção com e sem fracionamento para introduzir as amostras
nas colunas. N o m o d o fracionado, apenas uma pequena porção
da amostra vaporizada adentra a coluna, e n q u a n t o que n o m o d o
sem fracionamento a maior parte da amostra adentra a coluna.
Operacionalmente, o m o d o de vazão fracionado é utilizado para
amostras que contêm concentrações relativamente elevadas do(s)
analito(s)-alvo; o m o d o sem fracionamento é utilizado para amos-
tras que c o n t e n h a m concentrações relativamente baixas do(s)
analiro{s)-alvo.
Estão disponíveis portas de injeção c o m temperatura progra-
mável, s e n d o utilizadas em ambos os modos, fracionado e não-
fracionado. A amostra é injetada n u m a temperatura ligeiramente
mais alta do que o p o n t o de ebulição d o solvente. A maior parte
dos componentes da amostra condensa n o vidro ou na lã de sílica
fundida n o material inserido n o injetor enquanto o solvente é
removido. Então, o injetor é rapidamente aquecido em taxas de
até 100"C/min. O aquecimento rápido vaporiza os analitos que
fluem, então, para dentro da coluna. O aquecimento muito
rápido é vantajoso a partir do m o m e n t o em que os componentes
termicamente instáveis são expostos s o m e n t e a temperaturas ele-
vadas por um período de t e m p o curto. A separação da remoção
do solvente e a vaporização do analito permitem a injeção de
volumes de amostra de até centenas de microlitros. Isto melhora
a detecção do analito q u a n d o a matriz de amostra não é o fator
hmitante.
Controle de Temperatura
Operacionalmente, tanto as colunas empacotadas quanto as capi-
lares requerem u m controle cuidadoso da temperatura da coluna,
do injetor e do detector. O controle da temperatura da coluna é
obtido colocando-se a coluna n u m forno o u aquecendo-a através
de aquecimento resistivo. As temperaturas d o injetOT e d o detec-
tor são controladas n o r m a l m e n t e através d o aquecimento resis-
tivo. D e p e n d e n d o da aplicação, a temperatura da coluna é
mantida n u m nível constante preestabelecido duTante a execução
da cromatografia (operação isotérmica) ou alterada e m função d o
Lempo (operação c o m temperatura programada o u c o m gradiente
de temperatura).
N a prática, o aquecimento de coluna c o m temperatura pro-
gramada é usado na maior parte das aplicações clínicas. C o m a
programação da temperatura, os solutos com menores pontos de
ebulição eluem primeiro, seguidos pelos que têm pontos de ebu-
lição mais elevados. C o n s e q ü e n t e m e n t e , uma mistura de solutos
complexa c o m u m amplo espectro de p o n t o s de ebulição é sepa-
rada e m picos cromatográficos nítidos e distintos n u m tempo
m e n o r d o que a operação isotérmica. A temperatura é progra-
mada e controlada por u m computador e seu software resi-
dente.
Detectores
Vários detectores sensíveis são usados n o s cromatógrafos a gás.
Entre eles encontram-se as unidades universais que detectam a
maioria dos analitos e os dispositivos extremamente seletivos, que
detectam apenas analitos específicos (Tabela 7-1). C o m o exemplo
temos os FIDs, os seletivos termo iónicos (TSDs), os ECDs, a
fotoionização (PIDs) e os T C D s . Muitos outros dispositivos têm
sido utilizados c o m o detectores de G C e tornou-se uma prática
c o m u m colocar dois ou mais detectores e m série para melhorar
a especificidade e a sensibilidade analíticas. 6 Tipos diferentes de
espectrómetros de massa t a m b é m são usados c o m o detectores
nos cromatógrafos a gás (Capítulo 8).
Detector de Ionização de Chama. O FID é o detector mais
c o m u m e n t e utilizado em análise clínica (Figura 7-11). Entre as
suas vantagens estão a (1) simplicidade, a (2) confiabilidade, a (3)
versatilidade, a (4) sensibilidade e a (5) facilidade de operação.
Durante a operação) o efluente da coluna é misturado c o m
hidrogênio e ar e os c o m p o n e n t e s em eluição são queimados por
u m a chama. Cerca de 1 molécula em 10.000 produz u m cátion
orgânico e libera u m elétron que é detectado por u m eletrodo
coletor posicionado acima da chama. A magnitude d o sinal
gerado está relacionada com a massa de material carbônico que
chega ao detector. Este sinal é usado para a detecção e quantifi-
cação dos solutos e m eluição.
Detector Seletivo Termoiônico. O T S D , também c o n h e c i d o
c o m o detector de niirogêmo-fósforo (NPDJ, é uma variação do FID
na qual um leito alcalino é eletricamente aquecido na área acima
do jato. A presença dos átomos alcalinos na chama aumentará
em cerca de 15 vezes o sinal dos compostos que c o n t ê m nitrogê-
nio, e em cerca de 3 0 0 vezes os sinais dos compostos que c o n t ê m
fósforo.
Detector de Fotoionização. O PID também é uma variação d o
FID. N o PID, entretanto, a energia para a ionização é fornecida
por uma lâmpada U V intensa e m vez de uma chama. O PID tem
u m limite de detecção menor d o que o FID porque produz u m
sinal mais estável (produz m e n o s "ruído" basal).
Detector de Condutividade Térmica. O T C D baseia-se no prin-
cípio de que a adição de um c o m p o s t o a um gás altera a condu-
tância térmica deste gás. Ele é usado, com freqüência, na G C
capilar. O principio de operação do E C D baseia-se na reação
entre os compostos eletronegativos, tais c o m o o flúor, o cloro, o
bromo e o iodo, e os elétrons térmicos. C o m o nem todos os
c o m p o n e n t e s c o n t ê m esses grupos funcionais, a derivação com
reagentes c o n t e n d o misturas policloradas ou polifluoradas é uti-
lizada com freqüência na E C D .
Computador/Controlador
O s computadores proporcionam o controle d o sistema e o pro-
cessamento dos dados, tanto para os cromatógrafos a gás quanto
 Cromatografia CAPÍTULO 7 123

TABELA 7 - 1 Exemplos de Detectores Usados nos Cromatógrafos a Gás

Tipo de Detector Princípio de Operação Seleliuidade Limite de Detecção Comentários

Condutância térmica (TCD)
Ionização de chama (FID)
Seletivo termoiânico
(TSD; NPD)
Captura de elétron (ECD)
Espectrômetm de massa
(MS)
Fotoionizaçáo (PID)
Condutividade eletrolitica
(Hall)
Fotcmétrico a chama (FPD)
Intra vermelho com
transformação de Fourier
(FTIR)
Mede a variação da condutividade térmica Universal < 400 pg propano/mL He
no gás de arraste duruante a eluição
dos compostos
CHNO + calor ^ CHNCT + er; elétrons Hidrocarboneto 10 a 100 pg CHO
coletados para a detecção
Um leito alcalino ioniza seletivamente N, P 0,4 a 10 pg N
os compostos que contêm N ou P 0,1 a 1,0 pg P
e" + R + N2 -> Re" + N2 Re" + N2 + e"; Grupos eletronegaíívos Compostos contendo
elétrons em excesso coletados; 0,05 a 1,0 pg Cl"
concentração inversamente relacionada
e - + ABC -> A*+ BC; monitora a proporção Universal (ajustável) 1 ng na varredura Proporciona confirmação
massa/carga através da varredura ou 10 pg na SIM estrutural; as proporções
da monitoração de um único ion (SIM) de ions são constantes
na SIM
CHNO + fótcn ^ CHNO* + er; Hidrocarboneto 1 a 10 pg CHO Pode ser uma melhoria
detecta elétrons para FID
Detector de reação pós-coluna para a Compostos contendo 0,1 a 1,0 pg Ci"
detecção seletiva dos compostos halogênio, S e N 2,0 pg S
contendo tialogênio, S ou N 4,0 pg N
Hidrocarbonetos contendo P e S emitem Compostos contendo P e S 0,9 pg CHP
luz quando queimados nnma chama 20 pg CHS
do tipo FID; a luz emitida é detectada
Luz de comprimento de onda infravermelho Universal (ajustável) 1 ng forte absorvedor Varrido em busca de
absorvida pelo composto de interesse de infravermelho informação estrutural
ou absorvância medida
para a quantificação

NPD, Detector de nitrogêno-fósfcno.

p a r a os c r o m a t ó g r a f o s l í q u i d o s (Figura 7-12). C o m o u m contro- b i t ú r i c o s n u m a f o r m a solúvel n u m solvente orgânico, tal c o m o

l a d o r d o processo, o c o m p u t a d o r regula vários p a r â m e t r o s , tais
c o m o (1) a c o m p o s i ç ã o e a taxa d e vazão da fase móvel, (2) a
pressão n a p a r t e de trás da c o l u n a , (3) as t e m p e r a t u r a s d a c o l u n a
e d o detector, (4) a i n j e ç ã o de a m o s t r a , (5) a seleção e a o p e r a ç ã o
d o d e t e c t o r e (6) as várias e t a p a s de t e m p o r i z a ç ã o q u e c o m a n d a m
a o p e r a ç ã o d o sistema. Para o p r o c e s s a m e n t o d o s d a d o s , o com-
p u t a d o r m o n i t o r a os sinais gerados pelos detectores d o sistema
e c o m a n d a a aquisição e o a r m a z e n a m e n t o d o s d a d o s e m inter-
valos de t e m p o específicos. A área, o u altura, d e cada p i c o cro-
matográfico é d e t e r m i n a d a a partir d o s d a d o s a r m a z e n a d o s e
u s a d a p a r a calcular a c o n c e n t r a ç ã o d o analito r e p r e s e n t a d o p o r
cada pico. O s a l g o r i t m o s disponíveis p a r a esse cálculo i n c l u e m
os b a s e a d o s e m curvas de calibração ou e m fatores d e conversão
a partir da calibração i n t e r n a o u externa. Se for desejado, é pre-
p a r a d o e impresso u m relatório c o m p l e t o p a r a cada corrida cro-
matográfica. O p c i o n a l m e n t e , os d a d o s são a r m a z e n a d o s p a r a
serem r e c u p e r a d o s e r e p r o c e s s a d o s c o m diferentes p a r â m e t r o s de
integração.
Considerações Práticas
Várias técnicas a f e t a m a aplicação prática d a G C n o l a b o r a t ó r i o
clínico, i n c l u i n d o as utilizadas para extrair e derivar a m o s t r a s
para análise.
Extração da Amostra
Para a análise p o r G C , a e x t r a ç ã o d o analito a p a r t i r d a amostra
é f r e q ü e n t e m e n t e necessária. Por exemplo, para extrair barbitú-
ricos d o soro, este é p r i m e i r o acidificado p a r a converter os bar-
o d i c l o r o m e t a n o . E n t ã o , u m v o l u m e deste solvente é vigorosa-
m e n t e c h a c o a l h a d o c o m o soro acidificado. Q u a n d o as c a m a d a s
a q u o s a e orgânica se s e p a r a m , a m a i o r p a r t e d o s b a r b i t ú r i c o s está
p r e s e n t e n a fase orgânica e m u i t a s interferências, c o m o as prote-
ínas, p e r m a n e c e m n a fase aquosa. A extração d o solvente t a m b é m
é usada c o m f r e q ü ê n c i a a f i m d e a u m e n t a r a c o n c e n t r a ç ã o de
u m analito antes da análise cromatográfica.
Derivação da Amostra
M u i t o s c o m p o s t o s c l i n i c a m e n t e relevantes são não-voláteis e, p o r
isso, são difíceis de separar pela G C . P o r é m , a m o d i f i c a ç ã o ou
derivação q u í m i c a de tais c o m p o s t o s a u m e n t a a sua volatilidade
p a r a a análise p o r G C . As reações q u í m i c a s utilizadas para f o r m a r
esses derivados não-polares i n c l u e m (1) acilação, (2) sililação, (3)
a esterificação e a (4) oximação. A l é m de a u m e n t a r a volatilidade
d o soluto, a derivação t a m b é m é usada para a u m e n t a r a especi-
ficidade e a sensibilidade d e d e t e r m i n a d o s ensaios. Por exemplo,
o u s o de u m r e a g e n t e quiral p a r a derivar a a n f e t a m i n a m e l h o r a
a especificidade e p e r m i t e a s e p a r a ç ã o d o s i s ô m e r o s D e L n u m a
c o l u n a d e G C c o m u m . A m e l h o r a n a detecção t a m b é m é alcan-
çada através d a p r e p a r a ç ã o d e derivados d o p e n t a f l u o r o p r o p i l
para uso com o E C D .
Cromatografia Líquida
A separação p o r L C baseia-se n a distribuição d o s solutos e n t r e
u m a fase móvel líquida e u m a fase estacionária. 1 Q u a n d o partí-
culas d e d i â m e t r o p e q u e n o são u s a d a s c o m o a p o i o da fase esta-
cionária, a técnica é a H P L C . C o m o são necessárias pressões
124 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

relativamente elevadas para bombear líquidos através das colunas

de HPLC, a técnica t a m b é m foi classificada c o m o cromatografia
líquida, de alta pressão. N o laboratório clínico, a H P L C é a forma
de LC mais utilizada.

Instrumentação
U m cromatógrafò líquido básico (Figura 7-10) consiste dos seguin-
tes elementos: 8
1. U m a coluna cromatográfica para separar os solutos
2. U m reservatório de solvente para aumentar a fase móvel
E n t r a d a d e ar 3. U m a o u mais bombas para forçar a fase móvel liquida através
d o sistema
4- U m injetor para introduzir u m a alíquota de amostra na
P o s i ç ã o final d a
coluna
coluna capilar
5. Detector(es) para captar os analitos separados conforme
Jato eluam da coluna
6. U m computador que controla o sistema e processa os
Entrada dados
de H,
Colunas Cromatcgráficas
Tanto as colunas empacotadas quanto as capilares são usadas nos
cromatógrafos líquidos. O s avanços na tecnologia da coluna
aumentaram a seletividade, a estabilidade e a capacidade de
reprodução das colunas analíticas da LC e os materiais usados
para tamponar e revestir a superfície interna dessas colunas. 10
Dimensões dâ Coluna. A tecnologia moderna da coluna pro-
duziu-as em diferentes dimensões c o m a tendência c a m i n h a n d o
para as colunas com IDs e volumes internos pequenos. Para o
uso n o laboratório clínico, a maior parce das colunas de H P L C
é fabricada a partir de tubos feitos de aço inoxidável 316 que
possuem IDs variando de 0,1 m m a 5 m m e comprimentos de
Gás composto
5 0 m m a 2 5 0 m m (Tabela 7-2), A l é m disso, estão sendo desen-
volvidas colunas (chamadas "nanobore") que possuem IDs de 25
a 100 pm. A s colunas tubulares abertas também estão disponí-
veis, tendo u m I D menor d o que 25 pm. Geralmente, as colunas
c o m IDs menores (1) são mais eficientes, (2) possuem limites de
detecção menores e (3) requerem volumes de fase móvel menores.
Por exemplo, uma coluna c o m ID de 2 m m requer cerca de cinco
Figura 7-11 D i a g r a m a e s q u e m á t i c o d e u m FID e q u i p a d o c o m gás vezes menos solvente do que uma coluna com ID de 4,7 m m
c o m p o s t o . F/D, Detector d e ionização de c h a m a . ( M o d i f i c a d o d e Hyver (Tabela 7-2). Os encaixes no final da coluna que possuem zero
KJ: H i g h r e s o l u t i o n gas chromatography, 3rd ed. Palo Alto, Calif: de volume morto e f u n d e m para reter as partículas de suporte
Hewlett Packard, 1989.) são usados para conectar a coluna ao injetor n o interior da ter-
minação, e o detector n o exterior da terminação.
A s colunas capilares usadas na LC são construídas revestindo-
1 Controle do se a parede interna de u m tubo de sílica fundida c o m u m a
Injelor 1 processador Temperaturas película fina da fase líquida. Essas colunas variam de 0,1 a 1,0
•
m m de diâmetro, e de 10 a 5 0 c m de comprimento.
Detecção

Medição Taxas
Detectores
• de vazão
Cálculo
•
TABELA 7 - 2 Tipos de Coluna Utilizados na HPLC
Equipamento Programa de tempo Funções de
Terminologia de ID da Coluna Volume Útima
auxiliar temporização
Gráfico Coluna (mm) de Vazão
Padrão 4,6 1,25 mL/min
4,0 1,0 mL/min
Cavidade estreita 3,0 0,6 mL7min
Relatório da 2,0 200 pL/min
análise Microcavidade/capilar 1,0 50 (iL/min
0,5 12 (.iL/min
0,3 4 luL/min
Figura 7 - 1 2 F u n ç õ e s dos c o m p u t a d o r e s n o s c r o m a t ó g r a f o s a gás e
líquido. HPLC, Cromatografia liquida de alta e/i ciência; ID, diâmetro interna.

Para i m p e d i r q u e u m a c o l u n a analítica adsorva irreversivel-
m e n t e as p r o t e í n a s c o n t i d a s n a alíquota d e amostra, c o m u m a
r e d u ç ã o s u b s e q ü e n t e t a n t o na resolução q u a n t o na vida útil da
coluna, coloca-se u m a c o l u n a de p r o t e ç ã o e n t r e o injetor e a
c o l u n a analítica. U m a c o l u n a d e p r o t e ç ã o é e m p a c o t a d a c o m a
m e s m a fase estacionária, ou similar, da m e s m a f o r m a q u e a
c o l u n a analítica. Ela coleta m a t é r i a p a r t i c u l a d a e q u a i s q u e r c o m -
p o n e n t e s f o r t e m e n t e retidos d a a m o s t r a e, p o r t a n t o , preserva a
vida útil da c o l u n a analítica.
Empacotamentos de Partículas na Coluna. A s partículas empa-
cotadas nas colunas t ê m d i â m e t r o s q u e variam e n t r e 1,8 e 10 p m .
E m geral, q u a n t o m e n o r o d i â m e t r o da partícula, mais eficiente
é a c o l u n a . C o m o a pressão o p e r a c i o n a l traseira d e u m a c o l u n a
d e L C é i n v e r s a m e n t e p r o p o r c i o n a l ao q u a d r a d o d o d i â m e t r o d a
partícula, são necessárias pressões relativamente altas p a r a
b o m b e a r líquidos através das c o l u n a s de H P L C . C o n s e q ü e n t e -
m e n t e , as colunas d e H P L C mais curtas são usadas c o m f r e q ü ê n -
cia a f i m d e evitar a n e c e s s i d a d e de o p e r a ç ã o e m pressões trasei-
ras proibitivas. Tais c o l u n a s t a m b é m são úteis n a s técnicas d e
e s p e c t r o m e t r i a d e m a s s a - H P L C (HPLC-MS) pOT ocasião d o s
baixos v o l u m e s de solvente necessários para p r o d u z i r separações
a d e q u a d a s ( C a p í t u l o 8). O s e m p a c o t a m e n t o s de f o r m a t o irregu-
lar ou esférico q u e p r o p o r c i o n a m pressões traseiras m e n o r e s
t a m b é m estão disponíveis.
O s tipos de e m p a c o t a m e n t o p a r t i c u l a d o i n c l u e m os m a t e r i a i s
ligados, p o l i m é r i c o s , quirais e de acesso restrito.
E m p a c o t a m e n t o s d e Fase L i g a d a . Nesse tipo de e m p a c o t a -
m e n t o , a fase estacionária é q u i m i c a m e n t e ligada à superfície d a s
partículas de sílica através d e u m éster d e sílica ou de u m a liga
p o l i m é r i c a d e silicone. O s e m p a c o t a m e n t o s d e fase ligada (1) são
m e c â n i c a e q u i m i c a m e n t e estáveis, (2) p o s s u e m vida útil longa e
(3) p r o p o r c i o n a m d e s e m p e n h o c r o m a t o g r á f i c o excelente. O s
e m p a c o t a m e n t o s d e fase ligada estão disponíveis para a c r o m a t o -
grafia de t r o c a i ô n i c a e p a r a as de fase n o r m a l e reversa. N a
H P L C d e fase n o r m a l , os g r u p o s f u n c i o n a i s da fase e s t a c i o n á r i a
são p o l a r e s e m r e l a ç ã o aos da fase móvel, c o n s i s t i n d o , n o r m a l -
m e n t e , e m solventes não-polares, tal c o m o o h e x a n o . São exem-
p l o s d e g r u p o s f u n c i o n a i s p o l a r e s de H P L C d e fase n o r m a l o
silanol, a m i n o e nitrila. A H P L C d e fase reversa r e q u e r u m a
fase e s t a c i o n á r i a não-polar. O e m p a c o t a m e n t o d e fase Teversa
mais p o p u l a r é o tipo C18, n o qual as m o l é c u l a s d e octadecil-
s i l a n o são ligadas a partículas d e sílica. U m a c o l u n a c o m e m p a -
c o t a m e n t o d e o c t a d e c i l é c h a m a d a , f r e q ü e n t e m e n t e , coluna
O D S ( O D S , o c t a d e c i l sílica - octadecyl sílica). As características
d e r e t e n ç ã o e seletividade da c o l u n a da fase reversa são a l t e r a d a s
p e l o a c o p l a m e n t o de o u t r o s g r u p o s à sílica, tais c o m o octila,
fenila ou c i a n o p r o p i l a .
E m p a c o t a m e n t o s P o l i m é r i c o s . O c a r b o n o grafitado ou os
copolímeros m i s t u r a d o s são utilizados c o m o e m p a c o t a m e n t o poli-
mérico (p. ex., poliestireno-divinil-benzeno) o u s u b s e q ü e n t e m e n t e
derivados c o m a troca iônica o u c o m os grupos f u n c i o n a i s C 4 ,
C 8 ou C 1 8 . As colunas p r e e n c h i d a s c o m esses e m p a c o t a m e n t o s
a p r e s e n t a m níveis de d e s e m p e n h o comparáveis aos das c o l u n a s
c o m base de sílica e são estáveis c o m o p H entre 2 e 13.
E m p a c o t a m e n t o s Q u i r a i s . O s e m p a c o t a m e n t o s quirais são
utilizados para separar os e n a n t i ô m e r o s , q u e são e s p e l h a m e n t o s
d o m e s m o c o m p o s t o . N o l a b o r a t ó r i o clínico, esse tipo d e e m p a -
c o t a m e n t o é u s a d o para s e p a r a r e q u a n t i f i c a r os e n a n t i ô m e r o s
medicamentosos.
E m p a c o t a m e n t o s d e Acesso R e s t r i t o . C o m esse t i p o d e
e m p a c o t a m e n t o as superfícies externas das partículas de a p o i o
são protegidas p o r u m a rede hidrofílica. O s solutos m e n o r e s ,
c o m o os m e d i c a m e n t o s , passam através da rede pare d e n t r o d o s
poros, q u e são revestidos c o m fase estacionária h i d r o f ó b i c a . A s
Cromatografia CAPÍTULO 7 125
grandes moléculas de p r o t e í n a têm o acesso n e g a d o ao n ú c l e o
i n t e r n o e p a s s a m através da coluna. As c o l u n a s p r e e n c h i d a s c o m
e m p a c o t a m e n t o d e acesso restrito viabilizam a injeção direta d e
amostras biológicas c o m altas c o n c e n t r a ç õ e s d e proteína, q u e
u l t r a p a s s a m a p r e p a r a ç ã o da a m o s t r a e m e l h o r a m a precisão
analítica.
A l é m dos e m p a c o t a m e n t o s descritos a n t e r i o r m e n t e , os empa-
c o t a m e n t o s de partículas estão c o m e r c i a l m e n t e disponíveis c o m
(1) características d e fase reversa e n o r m a l , (2) c o m p a t i b i l i d a d e
c o m altas t e m p e r a t u r a s (até 100°C) o u (3) t a m a n h o s g r a n d e s de
p o r o (p. ex., 3 0 0 A).
Empacotamentos de Coluna Monolítica Particulada. Uma coluna
m o n o l í t i c a é aquela disposta c o m o u m a fase c o n t í n u a h o m o g ê -
n e a ( " e x a t a m e n t e c o m o o c o n c r e t o n u m a forma"), 1 0 ao invés de
e m p a c o t a d a c o m partículas individuais. Existem as c o l u n a s basea-
das e m sílica assim c o m o as baseadas e m p o l í m e r o . Essas d u a s
colunas p o s s u e m t a n t o p o r o s g r a n d e s (com a p r o x i m a d a m e n t e 2
p m de diâmetro), que criam g r a n d e d e n s i d a d e de poros, q u a n t o
p o r o s p e q u e n o s (com a p r o x i m a d a m e n t e 13 n m d e diâmetro), q u e
criam u m a área de superfície i n t e r n a grande. O p e r a c i o n a l m e n t e ,
ter a m b o s os tipos de p o r o é v a n t a j o s o p o r q u e a área d e superfí-
cie elevada p r o p o r c i o n a b o a separação e a alta p o r o s i d a d e mini-
miza a pressão traseira, viabilizando assim altas taxas d e vazão.
C o m isso, o t e m p o de análise é b a s t a n t e reduzido. Tais c o l u n a s
são envolvidas e m t u b u l a ç õ e s c o m p o l i t e t r a f l u o r o e t i l e n o i n e r t e
(PTFE) e a r m a z e n a d a s e m t u b o s de aço inoxidável. A t u b u l a ç ã o
i n e r t e elimina os v o l u m e s n u l o s n a i n t e r f a c e e n t r e o t u b o de aço
inoxidável e o b a s t ã o m o n o l í t i c o , m e l h o r a n d o a resolução. D u a s
v a n t a g e n s adicionais dessas c o l u n a s são a de q u e p o d e m ser
usadas c o m gradientes de vazão da fase móvel (p. ex., taxa de
vazão crescente n o final da separação) e q u e diversas c o l u n a s são
pareadas n u m a série para a u m e n t a r a resolução c o m u m p e q u e n o
a u m e n t o na pressão traseira. T a m b é m estão disponíveis as c o l u n a s
capilares monolíticas.
Reservatório de Solvente
O s solventes utilizados c o m o fase m ó v e l estão c o n t i d o s nesses
reservatórios. E m suas f o r m a s simples, os reservatórios são garra-
fas ou frascos d e vidro n o s quais são inseridas "linhas de alimen-
tação" para a b o m b a . Para r e m o v e r partículas d o s solventes, são
colocados filtros a l i n h a d o s nas concavidades das linhas d e ali-
m e n t a ç ã o . O s sofisticados sistemas d e m a n e j o da fase m ó v e l
c o m e r c i a l m e n t e disponíveis c o n t ê m garrafas especialmente pro-
jetadas c o m f u n d o s cónicos i n t e r n o s q u e viabilizam o u s o d e
p e q u e n o s volumes d e solvente. Estes sistemas de m a n e j o t a m b é m
a p r e s e n t a m três o u q u a t r o t a m p a s d e válvula q u e p e r m i t e m a
filtração, o a r m a z e n a m e n t o e a liberação de solventes, e u m a
torneira para a retirada d e gás a v á c u o .
Bomba
São usadas b o m b a s d e pressão c o n s t a n t e e d e d e s l o c a m e n t o
c o n s t a n t e nas c r o m a t o g r a f i a s líquidas, c o m estas ú l t i m a s s e n d o
usadas de m a n e i r a mais a m p l a D u r a n t e a sua operação, a b o m b a
d e d e s l o c a m e n t o c o n s t a n t e retira (aspira) a fase móvel d o reser-
v a t ó r i o d e solvente e libera u m a vazão c o n s t a n t e r e p r o d u t í v e l da
m e s m a através d o sistema c r o m a t o g r á f i c o .
U m a b o m b a alternada de dois pistões é u m tipo d e desloca-
m e n t o c o n s t a n t e q u e usa u m disco assimétrico p a r a guiar estes
pistões para d e n t r o e para fora de d u a s câmaras d e b o m b e a m e n t o
(Figura 7-13). A ação a l t e r n a d a d a b o m b a , e n t r e t a n t o , cria "pul-
sações de b o m b a " q u e r e s u l t a m de alterações n a taxa d e vazão.
As alterações afetam os sinais de saída de alguns detectores,
a u m e n t a n d o , c o n s e q u e n t e m e n t e , o r u í d o basal q u e i n f l u e n c i a o
limite d e detecção d o sistema. A m a i o r i a das b o m b a s a l t e r n a d a s
126 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

z C T H ) Do r e s e r v a t ó r i o Do r e s e r v a t ó r i o n o"n~»y

Válvula d e
controle d e
entrada
-O .#1 A
,0 S*.
<3 nn 1 «»

a o o aeTI
# #
t>• sZ.o 6 0«o •„ o «>o
> oo £ .*
O "o ®<>'_c •o °
n OO
Isolamento

Válvula d e c o n t r o l e
de saída •

to
va o»OPara a coluna P a r a a c o l u n a O o-. 0 £

Figura 7 - 1 3 V i s ã o em corte de u m a b o m b a alternada de dois pistões (Extraído de W a l k e r J Q , Jackson M T

]r, M a y n a r d JB. C h r o m a t o g r a p h i c systems: M a i n c e n a n c e and t r o u b l e s h o o t i n g , 2 n d ed. N e w York: Acadernic
Press, 1977 )

L 1 I l
Tempo
Figura 7 - 1 4 E x e m p l o s de eluição isocrática e g r a d i e n t e n a L C .
LC, C r o m a t o g r a f i a líquida.
usa a m o r t e c e d o r e s d e p u l s o mecânicos ou eletrônicos e / o u
cabeças múltiplas q u e o p e r a m fora de fase para liberar u m a fase
c o n t i n u a m e n t e móvel. O u t r a técnica utiliza u m t e m p o de reabas-
t e c i m e n t o mais r á p i d o d o q u e o t e m p o de distribuição. As
b o m b a s a l t e r n a d a s o p e r a m a até 10.000 libras p o r polegada qua-
d r a d a (psi) e geram taxas d e vazão de 0,01 m L / m i n a 2 0 m L / m i n
ou mais, d e p e n d e n d o d o t a m a n h o da cabeça e da c o n f i g u r a ç ã o
da b o m b a .
A b o m b a da H P L C é o p e r a d a n u m m o d o isocrático ou gra-
d i e n t e (Figura 7-14). N o m o d o isocrático, a compos i ção da fase
m ó v e l p e r m a n e c e c o n s t a n t e através da corrida c r o m a t o g r á f i c a .
Esse m o d o é u s a d o , n o r m a l m e n t e , nas preparações simples e p a r a
a separação d a q u e l e s c o m p o s t o s c o m estruturas e / o u t e m p o s de
r e t e n ç ã o similares. U m a fase móvel isocrática é u m solvente
ú n i c o (p. ex., m e t a n o l ) ou u m a m i s t u r a p r e p a r a d a d e diversos
solventes (p ex., m e t a n o l , acetonitrila e água) liberada a p a r t i r
de u m reservatório de solvente individual. A l t e r n a t i v a m e n t e ,
u m a fase móvel muItisso(vente é m e d i d a e p r o p o r c i o n a d a a p a r t i r
d e d o i s o u mais reservatórios. A m a i o r i a das separações d e H P L C
é executada s o b c o n d i ç õ e s isocráticas.
A eluição e m g r a d i e n t e é u s a d a para separações mais c o m p l e -
xas. 2 Messe m o d o , a c o m p o s i ç ã o d a fase móvel é alterada d u r a n t e
a c o r r i d a d e f o r m a p a u l a t i n a o u c o n t í n u a . São usadas m u i t a s
técnicas diferentes para gerar perfis de gradiente. N u m a técnica
são usadas d u a s o u mais b o m b a s e m paralela. Vários perfis de
g r a d i e n t e são gerados pela p r o g r a m a ç ã o da saida de cada b o m b a .
A l t e r n a t i v a m e n t e , a fase móvel é a l i m e n t a d a para o l a d o i n t e r n o
de u m a única b o m b a . Por exemplo, até q u a t r o reservatórios d e
solvente p o d e m ser c o n e c t a d o s à válvula i n t e r n a d e verificação
de u m a ú n i c a b o m b a via válvulas de dosagem. E n t ã o , varia-se a
c o m p o s i ç ã o da fase móvel através da p r o g r a m a ç ã o d o t e m p o
d u r a n t e o q u a l o solvente é liberado através de cada u m a das
l válvulas de dosagem.
Injetor
Para iniciar u m a separação de LC, p r i m e i r o introduz-se u m a
a l í q u o t a da a m o s t r a (p. ex., 0,2 a 5 pL) n a c o l u n a através de u m
injetor. O t i p o mais utilizado d e injetor é o d e alça fixa (Figura
7-15). N a posição d e e n c h i m e n t o , u m a alíquota da a m o s t r a é
i n t r o d u z i d a s o b pressão atmosférica n u m a alça de aço inoxidável.
N o m o d o de injeção, a alça da a m o s t r a é girada n o f l u x o c o r r e n t e
da fase móvel f a z e n d o c o m q u e a a m o s t r a f l u a p a r a d e n t r o da
c o l u n a cromatográfica. Esses injetores são (1) precisos, (2) f u n -
c i o n a m e m pressões elevadas e (3) têm sido p r o g r a m a d o s para
s e r e m utilizados e m sistemas a u t o m a t i z a d o s .
A p a r e l h o s de a u t o - a m o s t r a g e m d i g i t a l m e n t e c o n t r o l a d o s e
q u e i n c o r p o r a m u m injetor e m alça estão disponíveis comercial-
m e n t e . Esses dispositivos sofisticados são precisos e p o d e m ser
p r o g r a m a d o s para a o p e r a ç ã o c o n t í n u a e a u t o m a t i z a d a A l é m
disso, a alça da a m o s t r a é lavada d e m a n e i r a a u t o m á t i c a , c o m a
fase móvel entre as a m o s t r a g e n s para i m p e d i r a m o v i m e n t a ç ã o
 Cromatografia CAPÍTULO 7 127

t— Alça d a —»
/ amostra \

Entrada do eluente E n t r a d a —»
do •'
eluente

Coluna cromatográfica

Alça d e e n c h i m e n t o Injeção da amostra

da amostra

Figura 7 - 1 5 Visão em corte de u m injetor de amostra em alça c o m u m e n t e usado.

TABELA 7 - 3 E x e m p l o s de D e t e c t o r e s U t i l i z a d o s nos Cromatógraíos Líquidos de A l t a Eficiência

Tipo de Intervalo de Limite de

Detector Principio de Operação Aplicação Detecção Comentários
Fotômetro UV (comprimento Mede a absorvância da luz UV Seletivo <1 ng 0 analito deve abson/er a luz UV ou ser
de onda fixo) derivado
Fotômetro UV (comprimento Mede a absorvância da luz UV Seletivo <1 ng 0 detector é "ajustado" para um
de onda variável) comprimento de onda específico
Série de díodos Mede a absorvância de luz Seletivo <1 ng 0 detector proporciona o espectro completo
Fluorímetro Mede a fluorescência Muito seletiva pg a n g 0 analito deve fluorescer ou ser derivado
Refratômetro Mede a variação no índice de retração Universal 1 ug
Eietroquímico Mede, eletroquimicamente, o analito Seletivo pg a n g 0 detector é útil para as
oxidado/reduzido catecolaminas

UV, ultrãviolétd

d a a m o s t r a . A c a p a c i d a d e d e injetar múltiplas alíquotas a partir
de u m ú n i c o frasco d e a m o s t r a , o u de a d i c i o n a r reagentes a partir
d e frascos designados para derivar analitos i m e d i a t a m e n t e a n t e s
d a injeção, é característica a d i c i o n a l d e m u i t o s aparelhos d e auto-
amostragem.
Detectares
FoTam desenvolvidos m u i t o s detectores p a r a u s o c o m c r o m a t ó -
graíos l í q u i d o s (Tabela 7-3). O s exemplos i n c l u e m o (1) f o t o m é -
trico, (2) e s p e c t r o f o t o m é t r i c o , (3) f l u o r i m é t r i c o e (4) eletroquí-
mico. U m c o m p o n e n t e - c h a v e e i n t e g r a n t e de tais detectores é a
célula d e vazão (Figura 7-16), através d a qual passa o p r o d u t o
e l u í d o p r o v e n i e n t e da c o l u n a c r o m a t o g r á f i c a . O s analitos dissol-
vidos são e n t ã o d e t e c t a d o s e é g e r a d o u m sinal eletrônico. (Os
e s p e c t r ó m e t r o s de massa, c o m o os detectores da LC, são apresen-
tados n o C a p í t u l o 8.)
Fotômetros e Espectrofotômetros, O s f o t ô m e t r o s de U V e de luz
visível m e d e m a energia r a d i a n t e absorvida pelos compostos con-
f o r m e eles e l u e m da c o l u n a cromatográfica (Capítulo 4). Estes
detectores o p e r a m nas regiões de energia r a d i a n t e de 190 a 4 0 0
n m e de 4 0 0 a 700 n m , respectivamente. O s dispositivos são
versáteis e d e t e c t a m m u i t o s solutos p o r q u e a maioria dos compos-
tos orgânicos absorve n a região de UV, c o m u n s p o u c o s absor-
v e n d o até m e s m o a região visível d o espectro eletromagnético.
O s f o t ô m e t r o s o p e r a m c o m o detectores de c o m p r i m e n t o de
o n d a fixo o u variável. A m a i o r i a d o s f o t ô m e t r o s U V de compri-
m e n t o de o n d a fixo usa a l i n h a de r e s s o n â n c i a i n t e n s a de 2 5 4
n m p r o d u z i d a p o r u m a l â m p a d a d e arco de m e r c ú r i o . Esse t i p o
d e detector é e x t r e m a m e n t e sensível e o p e r a a 0 , 0 0 5 u n i d a d e s de
absorvância e m escala c o m p l e t a (AUES). Para prover u m a flexi-
b i l i d a d e m a i o r aos detectores d e c o m p r i m e n t o de o n d a fixo, são
utilizadas o u t r a s l i n h a s d e ressonância m e n o s intensas d a l â m p a d a
de m e r c ú r i o A l t e r n a t i v a m e n t e , u m f ó s f o r o é c o l o c a d o e n t r e a
l â m p a d a e a célula de vazão e a f l u o r e s c ê n c i a e m i t i d a r e s u l t a n t e
d a excitação c o m 254 n m é u s a d a c o m o f o n t e de luz. Esta ú l t i m a
a b o r d a g e m é utilizada n o s f o t ô m e t r o s d e c o m p r i m e n t o d e o n d a
d u p l o q u e o p e r a m e m dois c o m p r i m e n t o s de o n d a fixos (p. ex.,
254 n m e 2 8 0 n m ) . As l i n h a s d e ressonância i n t e n s a s de 214 n m
e 2 2 9 n m de u m a l â m p a d a de arco de zinco ou c á d m i o , respec-
t i v a m e n t e , t a m b é m são u s a d a s p a r a a detecção e m c o m p r i m e n t o s
d e o n d a m e n o r e s , o n d e mais c o m p o n e n t e s a b s o r v e m .
O s e g u n d o tipo de f o t ô m e t r o é o d e t e c t o r de c o m p r i m e n t o
de o n d a variável. Ele o p e r a n u m c o m p r i m e n t o de o n d a selecio-
n a d o a p a r t i r d e u m d e t e r m i n a d o i n t e r v a l o de c o m p r i m e n t o s de
128 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
Entrada da Saída da
amostra amostra
Lâmpada UV
Fotocélula
dual
Célufa
d e fluxo
Entrada de Saída de
referência referência
Figura 7-16 E s q u e m a ópcico d e u m f o t õ m e t r o simples e d e u m a
célula d e f l u x o . UV, Ultravioleta.
o n d a . O detector é " s i n t o n i z a d o " p a r a o p e r a r n a absorvância
m á x i m a para u m d e t e r m i n a d o a n a l i t o ou c o n j u n t o de analitos,
o q u e a u m e n t a a aplicabilidade e a seletividade d o detector
(Figura 7-2). U m a o u t r a v a n t a g e m desse detector é a sua capaci-
d a d e d e o p e r a r e m c o m p r i m e n t o s de o n d a mais baixos (p. ex.,
190 n m ) . C o m o mais c o m p o s t o s (p. ex., colesterol) absorvem e m
c o m p r i m e n t o s de o n d a m e n o r e s , essa c a p a c i d a d e a u m e n t a a
versatilidade d o detector. N o s c o m p r i m e n t o s d e o n d a m e n o r e s ,
p o r é m , m u i t o s solventes a b s o r v e m a luz U V e são inúteis c o m o
fase móvel. Felizmente, a acetonitrila e o m e t a n o l , dois solventes
a m p l a m e n t e utilizados n a c r o m a t o g r a f i a de fase reversa, têm
absorção de U V m í n i m a a 2 0 0 n m .
C o n j u n t o s de d i o d o t a m b é m são utilizados c o m o detectores
de H P L C p o r q u e r a p i d a m e n t e p r o d u z e m d a d o s espectrais p o r
t o d o o intervalo de c o m p r i m e n t o d e o n d a cie 190 a 6 0 0 n m e m
cerca de 10 milissegundos. D u r a n t e a o p e r a ç ã o , o detector de
c o n j u n t o de d i o d o passa a luz p o l i c r o m á t i c a através d a célula d e
vazão d o detector. A luz t r a n s m i t i d a é dispersa p o r u m a grade de
diíração e direcionada, e n t ã o , p a t a u m c o n j u n t o d e f o t o d i o d o s ,
o n d e é m e d i d a a i n t e n s i d a d e da luz e m c o m p r i m e n t o s de o n d a
variados. Tais detectores t ê m sido úteis n a i d e n t i f i c a ç ã o de drogas
na u r i n a e n o soro.
Fluorimetros. O s f l u o r í m e t r o s são utilizados n o s cromatógra-
fos l í q u i d o s para detectar os c o m p o s t o s f l u o r e s c e n t e s c o n f o r m e
e l u e m d a c o l u n a A l é m disso, os reatores pré e pós-coluna são
utilizados para rotular q u i m i c a m e n t e u m c o m p o s t o c o m u m a
marca f l u o r e s c e n t e para a detecção posterior. Por exemplo, os
a m i n o á c i d o s ou o u t r a s a m i n a s p r i m á r i a s são rotulados, f r e q ü e n -
t e m e n t e , c o m marcas de dansil o u f l u o r e s c a m i n a e seguidos pela
separação H P L C e pela d e t e c ç ã o f l u o r i m é t r i c a . A m a i o r i a d o s
f l u o r í m e t r o s utilizados c o m os c r o m a t ó g r a f o s líquidos tem u m
p r o j e t o relativamente simples e são e x t r e m a m e n t e seletivos e
sensíveis para c o m p o s t o s q u e e m i t e m fluorescência d e n t r o d o
intervalo de c o m p r i m e n t o de o n d a o p e r a c i o n a l d o detector. A s
l â m p a d a s de arco de d e u t é r i o e d e x e n ô n i o , ou os ktsers, t ê m sido
utilizados c o m o f o n t e s d e luz nesses detectores.
Detectores Eletroquímicos. N o s detectores q u í m i c o s ampero-
métricos ( C a p í t u l o 5), u m analito eletroativo a d e n t r a a célula de
vazão, o n d e é o x i d a d o o u r e d u z i d o n u m a superfície de e l e t r o d o
sob potencial c o n s t a n t e . O s c o m p o s t o s eletroativos de interesse
clínico, c o n v e n i e n t e m e n t e analisados p o r H P L C c o m detecção
eletroquímica, i n c l u e m as catecolaminas u r i n á r i a s ( C a p í t u l o 26).
A l é m disso, "etiquetas" q u i m i c a m e n t e eletroativas (p. ex., b r o m o )
são a d i c i o n a d a s aos c o m p o s t o s c o m o os ácidos graxos insatura-
dos ou p r o s t a g l a n d m a s
O s detectores coulométricos t a m b é m são utilizados. Q u a n d o
postos e m série, tais detectores são u s a d o s para detectar e quanti-
ficar os c o m p o s t o s co-eluentes q u e diferem e m seus potenciais de
meia o n d a (o potencial n o m á x i m o d e m e i o sinal) e m pelo m e n o s
60 mV. Esses detectores são e x t r e m a m e n t e seletivos e sensíveis,
c o m intervalos d e resposta razoavelmente grandes. São utilizados
n o laboratório clínico para a análise de m e t a n e f r i n a s , ácido vanil-
m a n d é l i c o , ácido homovanílico e ácido acético 5-hidroxindol n a
urina b u m a n a s e m grandes preparações de amostra.
Computador
D a m e s m a f o r m a q u e n o s c r o m a t ó g r a f o s a gás, a i n c o r p o r a ç ã o
da i n f o r m á t i c a n a i n s t r u m e n t a ç ã o d a H P L C resultou e m sistemas
c o m d e s e m p e n h o s analíticos m e l h o r a d o s (Figura 7-12). Nestes
sistemas, u m c o m p u t a d o r p r o p o r c i o n a t a n t o a f u n ç ã o d e con-
trole d o sistema q u a n t o a de p r o c e s s a m e n t o dos dados. Para
maiores d e t a l h e s o leitor d e v e T á c o n s u l t a r a discussão a n t e r i o r
s o b r e o u s o d e c o m p u t a d o r e s n o s c r o m a t ó g r a f o s a gás.
Cons/cferaçâes Práticas
Várias técnicas afetam a aplicação prática da H P L C n o l a b o r a n >
rio clínico, i n c l u i n d o as utilizadas p a r a p r e p a r a r amostras e fases
móveis.
Preparação da Amostra
A p r e p a r a ç ã o d a amostra é u m a etapa i m p o r t a n t e n a análise
c r o m a t o g r á f i c a p o r H P L C e inclui p r o c e d i m e n t o s para a concen-
tração, p u r i f i c a ç ã o e derivação da a m o s t r a .
Concentração e/ou Purificação da Amostra. Freqüentemente é
necessário c o n c e n t r a r ou p u r i f i c a r u m analito n u m a a m o s t r a
a n t e s d a separação e da q u a n t i f i c a ç ã o p o r H P L C . Diversas técni-
cas cie extração de líquido e de fase sólida (SPE) são usadas c o m
esse p r o p ó s i t o . A ú l t i m a t o i n o u - s e m u i t o p o p u l a r p o r q u e cartu-
chos de extração da fase sólida o u as placas n o f o r m a t o S P E de
9 6 p o ç o s s i m p l i f i c a r a m b a s t a n t e a p r e p a r a ç ã o da a m o s t r a .
Existem, hoje, dispositivos para a extração a u t o m á t i c a e para
a p r e p a r a ç ã o d a amostra. Eles consistem, p r i n c i p a l m e n t e , e m
braços e m e c a n i s m o s robóticos p a r a a liberação a l t a m e n t e precisa
d e v o l u m e s de solvente. D e p e n d e n d o d o i n s t r u m e n t o , as amostras
p o d e m ser p r e p a r a d a s e analisadas i n d i v i d u a l m e n t e o u e m lotes.
Derivação Ü3 Amostra. Alguns analitos p r e c i s a m ser derivados
q u i m i c a m e n t e a n t e s o u depois da separação c r o m a t o g r á f i c a p a r a
a u m e n t a r sua c a p a c i d a d e de s e r e m detectados. Por exemplo, n o s
analisadores a u t o m a t i z a d o s d e a m i n o á c i d o s , os a m i n o á c i d o s
eluídos reagem c o m n i n i d r i n a n u m r e a t o r pós-coluna ( C a p í t u l o
18). E n t ã o , as espécies c r o m o g ê n i c a s resultantes são detectadas
com u m fotõmetro. Outros exemplos incluem a marcação de
a m i n o á c i d o s ou outras a m i n a s p r i m á r i a s c o m "etiquetas" d e
dansil ou fluorescência n u m r e a t o r p r é ou pós-coluna, seguida
pela detecção f l u o r o m é t r i c a .
Preparação da Fase Móvei. A o se p r e p a r a r a fase móvel, os gases
dissolvidos n o solvente devem ser r e m o v i d o s o u s u p r i m i d o s e o
 Cromatografia CAPÍTULO 7 129

solvente t a m b é m deve ficar livre d e matéria p a r t i c u l a d a . Q u a n d o m e n t a l . Existe software para a i d e n t i f i c a ç ã o d e c o m p o s t o s através

a fase móvel for c o m p o s t a p o r dois ou mais solventes, os m e s m o s
deverão ser m i s t u r a d o s d e f o r m a a d e q u a d a .
R e t i r a d a do Gás d o Solvente. U m problema c o m u m na L C
é a evolução de b o l h a s de gás dissolvido q u e crescem c o n f o r m e
a fase m ó v e l passa d o l a d o d e alta pressão (coluna) para o l a d o
d a pressão a m b i e n t e (pós-coluna) d o sistema c r o m a t o g r á f i c o .
Essas b o l h a s devem ser r e m o v i d a s ou s u p r i m i d a s p o r q u e criam
u m sinal eletrônico instável (sinal basal ruidoso) q u a n d o passam
através de u m detector. O p e r a c i o n a l m e n t e , (1) a retirada d o gás
a vácuo, (2) a e l i m i n a ç ã o pelo hélio, (3) a pressão traseira pós-
d e t e c t o r ou (4) a retirada d o gás p o r m e m b r a n a a v á c u o são
técnicas usadas para evitar esse p r o b l e m a .
Clareza d o S o l v e n t e . As fases móveis devem ser p r e p a r a d a s a
partir d o s solventes d o grau d e H P L C livres d e m a t é r i a particu-
lada. A m a i o r i a dos solventes d e H P L C comerciais é pré-filtrada.
E n t r e t a n t o , se n ã o o f o r e m , eles devem ser filtrados através d e
u m filtro de 0,5 p m .
M i s t u r a d o S o l v e n t e . D u r a n t e a o p e r a ç ã o de gradiente, os
solventes da H P L C q u e c o n s t i t u e m a fase m ó v e l são m i s t u r a d o s
mais c o m u m e n t e c o m u m m i s t u r a d o r estático ou d i n â m i c o . O s
m i s t u r a d o r e s estáticos c o n t a m c o m a d i n â m i c a de f l u x o l a m i n a r ,
e n q u a n t o os m i s t u r a d o r e s d i n â m i c o s u s a m agitadores magnéti-
cos. A viscosidade d o solvente afeta as características d a mistura;
a m i s t u r a i n a d e q u a d a é d e t e c t a d a p o r m u i t o s detectores U V e
p o d e ser expressa c o m o u m sinal basal instável.
da pesquisa e m bibliotecas de espectro U V b a s e a d a n o s valores
corrigidos de R,.11
C o m as colunas capilares da G C e d a LC, é possível introdu-
zir, s i m u l t a n e a m e n t e , os c o m p o n e n t e s d e u m a i n j e ç ã o ú n i c a nas
d u a s colunas feitas de fases estacionárias diferent es . As colunas
são c o n e c t a d a s para separar os detectores de tipos iguais ou
diferentes. A igualdade e n t r e as p r o p r i e d a d e s de r e t e n ç ã o d e u m
ú n i c o analito e o c o m p o s t o d e referência e m duas c o l u n a s de
fases diferentes a u m e n t a a c h a n c e da identificação correta desse
analito. A identificação de a n a l i t o mais confiável, p o r é m , é pro-
p o r c i o n a d a por u m d e t e c t o r q u e a p r e s e n t a i n f o r m a ç ã o estrutu-
ral, assim c o m o o e s p e c t r ô m e t r o de massa ( C a p í t u l o 8).
Quantificação do Analito
O s sinais eletrônicos gerados pelo(s) detector(es) t a m b é m são
u s a d o s p a r a p r o d u z i r i n f o r m a ç ã o q u a n t i t a t i v a . T ê m sido usadas

Segurança CD

As p r e c a u ç õ e s n o r m a i s n o l a b o r a t ó r i o devem ser praticadas £

d u r a n t e a o p e r a ç ã o de H P L C . O e f l u e n t e da c o l u n a deve ser
c o l e t a d o n u m recipiente a d e q u a d o e a r m a z e n a d o de m o d o apro-
p r i a d o a n t e s d o descarte. A liberação explosiva d a pressão n u m
sistema H P L C n ã o é u m a a m e a ç a i m p o r t a n t e ; os líquidos são
6 8 0 2 1 6 3
a p e n a s ligeiramente c o m p r i m i d o s e, c o m isso, a c u m u l a m p o u c a Tempo (minutos)
energia.

Concentração
ANÁLISES QUALITATIVA E QUANTITATIVA
A c r o m a t o g r a f i a é b a s i c a m e n t e u m a técnica de separação Entre-
t a n t o , é utilizada t a n t o para análises qualitativa [identificar o(s) Figura 7-17 U s o d e calibradores e x t e r n o s na p r o d u ç ã o d e u m
anahto(s) de interesse] q u a n t o para a quantitativa. gráfico de calibração. (Extraído d e Krull I, Swarta M . Q u a n t i t a t i o n i n
m e t h o d validation. L G G C . 1998;16:1084-90.)
Identificação do Analito
O t e m p o de retenção, o v o l u m e ou a distância percorrida n u m a
placa são usados, c o m freqüência, para a identificação, compa-
r a n d o s e esse resultado com o de u m c o m p o s t o de referência. A
aparência d o pico, b a n d a ou p o n t o de u m soluto n u m m e s m o
m o m e n t o que o d o c o m p o s t o d e referência é consistente c o m os
dois c o m p o s t o s s e n d o o m e s m o . A aparência simultânea n ã o prova
a identidade, já que é possível que outros c o m p o s t o s t e n h a m o
m e s m o t e m p o de retenção c o m o o c o m p o s t o de referência.
N a c r o m a t o g r a f i a p l a n a r os c o m p o s t o s de referência são cro-
m a t o g r a f a d o s s i m u l t a n e a m e n t e c o m a amos t ra d e s c o n h e c i d a . A
identificação p o r tentativa é feita pela c o m p a r a ç ã o e n t r e as dis-
tâncias de m i g r a ç ã o e as características de detecção dos compos-
tos d e referência e as d o s analitos d e s c o n h e c i d o s . Se o R/ (veja a
e q u a ç ã o 3) d o analito d e s c o n h e c i d o e o R, d o c o m p o s t o d e refe-
rência f o r e m diferentes, dever-se-á considerar q u e os c o m p o s t o s
t a m b é m serão diferentes. Se f o r e m iguais, presumir-se-á que os
8 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8
c o m p o s t o s serão idênticos. E n t r e t a n t o , c o m o mais de u m com-
T e m p o (minutos)
p o s t o p o d e ter o m e s m o R ( n u m d e t e r m i n a d o sistema c r o m a t o -
gráfico, a identificação p r e s u m i d a precisa ser c o n f i r m a d a p o r Figura 7 - 1 8 U s o d e calibradores i n t e r n o s na p r o d u ç ã o d e u m
o u t r a s técnicas, tal c o m o o u s o de (1) reagentes específicos e m gráfico de calibração (sendo o pico 1 o p a d r ã o i n t e r n o ) (Extraído de
spray, (2) f o r m a ç ã o de c o m p l e x o s c o m a n t i c o r p o s ou (3) isola- Krull I, Swartz M . Q u a n t i t a t i o n i n m e t h o d validation. L C - G C .
m e n t o d o c o m p o s t o seguido pela análise q u í m i c a e / o u instru- 1998;16:1084-90)
130 PARTE II Instrumentação e T é c n i c a s Analíticas
técnicas d e calibração i n t e r n a s e externas. C o m a calibracao
externa, as s o l u ç õ e s d e referência q u e c o n t e n h a m q u a n t i d a d e s
de analitos s ã o processadas de u m m o d o i d ê n t i c o ao das amostras
q u e c o n t ê m o a n a l i t o (Figura 7-17). U m a curva d e calibração d e
altura d o p i c o , área d o p i c o o u d e n s i d a d e d e p o n t o s vctsms c o n -
c e n t r a ç ã o d o calibrador é c o n s t r u í d a e utilizada para calcular a
c o n c e n t r a ç ã o dn a n a l i t o nas amostras. C o m a calibração interna,
t a m b é m c h a m a d a padronização interna, são preparadas s o l u ç õ e s
d e referência de c o n c e n t r a ç õ e s de a n a l i t o c o n h e c i d a s e é adicio-
nada a cada u m a delas e a cada a m o s t r a u m a q u a n t i d a d e cons-
tante d e u m c o m p o s t o d i f e r e n t e , o u padrão i n t e r n o (Figura 7-18).
Traçando-se u m a c u r v a da p r o p o r ç ã o entre a altura d o p i c o (ou
área) o u a d e n s i d a d e de p o n t o s d o analito e m relação à altura do
p i c o ( o u área) e a d e n s i d a d e d e p o n t o s d o padrão i n t e r n o versus
a c o n c e n t r a ç ã o d o analito, é c o n s t r u í d a u m a curva d e calibração
q u e corrige as perdas sistemáticas. E n t ã o , essa curva é usada para
calcular a c o n c e n t r a ç ã o d o a n a l i t o na amostra através d e inter-
polação.
REFERÊNCIAS
1. Clarke W, Hage D. Clinicai applications of affinicy chromatography. In:
Aboul-Enein HY, ed. Sepaiation techniques in clinicai chemistry. New
York: Mareei Dekker, 2003:321-60.
2. Dolan JW, Snyder LR, Gradienc elution chromatography. In: Meyers
RA, ed. Encyclopedia of analytical chemistry. Chichester: John Wiley &
Sons, 2000=11342-60.
3. DorseyJG. Liquid chromatography: introduction. In: Meyers RA, ed.
Encyclopedia of analytical chemistry. Chichester: John Wiley & Sons,
2000:11231-3.
4- DorseyJG. Column theory and resolution in liquid chromatography. In:
Meyers RA, ed. Encyclopedia of analytical chemistry. Chichester: John
Wiley & Sons, 2000.1133442.
5. Eiceman GA. Instrumentation of gas chromatography in clinicai
chemistry. In: Meyers RA, ed. Encyclopedia of analytical chemistry.
Chichester: John Wiley Si Sons, 2000:10671-9.
6. Eiceman GA, Gardea-Torresdey J, Overton E, Carney K, Dorman F. Gas
chromatography. Anal Chem 2002;74-22771-80.
7. Jain R, Shcrma J. Planar chromatography in clinicai chemistry. In
Meyers RA, ed. Encyclopedia of analytical chemistry. Chichester: John
Wiley St Sons, 2000:1583-603.
8. LaCourse WR. Column liquid chromatography: equipment &
instrumentation. Anal Chem 2002;74:2813-32.
9. Lough WJ. Reveised phase liquid chromatography. In: Meyers RA, ed.
Encyclopedia of analytical chemistry. Chichester; John Wiley & Sons,
2000:11442-50,
10. Majors R. Advances in HPLC column packing design. LC-GC- Column
Technology Supplement. June 2004:8-11.
11. Sherma J. Planar chromatography. Anal Chem 2002;74:2653-62.
C
APÍ
TUL
O 8
Espectrometria de Massas*
Thomas M. Armesley, Ph.D., Alan L. Rockwood, Ph.D.,
e Nicholas E. Sherman, Ph.D.

OBJETIVOS í o n Molecular: O íon não fragmentado da molécula original.

1. Discutir o princípio da análise por espectrometria de massas. Ionização por Eletrospray. U m a técnica c o m u m e n t e empregada
2. Descrever porque o espectro metro de massas é considerado um o n d e a amostra é ionizada sob pressão atmosférica antes de
sua introdução n o analisador de massas.
detector universal.
M A L D I : Acrônimo para l o n i z a ç ã o / D e s s o r ç ã o a Laser Assistida
3. Determinar os cinco componentes de um espectrômetro de massas
por Matriz.
e relacionar a finalidade de cada componente.
M o n i t o r a m e n t o d o I o n S e l e c i o n a d o (SIM): U m a técnica de
4. Comparar e confrontar a ionização de elétrons, química e por
espectrometria de massas (MS) na qual apenas os íons
eletrospray.
especificados de interesse são monitorados.
5. Relacionar os três tipos de feixes dos espectrómetros de massas, e
P i c o Básico: O íon e m maior abundância n o espectro de
determinar os princípios e usos de cada tipo.
massas; é atribuído u m valor relativo de 100%.
6. Discutir os espectrómetros de massas de captura (trapping), Proteômica: Identificação e quantificação de proteínas e suas
incluindo três tipos e os princípios e usos de cada tipo. modificações põs-translacionais em u m dado sistema o u
7. Comparar a espectrometria de massas em tandem com a sistemas.
espectrometria de massas com único estágio, Razão entre Massa e Carga (m/z): A medida obtida pela
8. Descrever as similaridades e diferenças entre MALDI e SELDI. divisão do n ú m e r o de massa de u m íon pela sua carga.
9. Descrever as aplicações clínicas da cromatografia gasosa- SELDI: A c r ô n i m o de Dessorção/Ionização a Laser Realçado de
espectrometria de massas, cromatografia líquida-espectrometria de Superfície.
massas, espectrometria de massas MALDI-TOF, e espectrometria de
massas-ICP.

A
10. Descrever o papel da espectrometria de massas no campo da
e s p e c t r o m e t r i a de m a s s a (MS) é u m a t é c n i c a analítica
proteômica.
qualitativa e q u a n t i t a t i v a m u i t o p o d e r o s a q u e é
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES empregada para m e d i r u m a grande variação de anali-
tos clinicamente relevantes. Quando a MS é associada tanto à cro-
Análise d e Massas: O processo pelo qual uma mistura de
matografia de gás quanto à líquida, as análises resultantes apresentam
espécies iónicas é identificada segundo a relação entre a
capacidade analítica expandida c o m aplicações clínicas diversas.
massa e a carga (m/z) (íons).
A l é m disso, devido à sua capacidade de identificar e quantificar
Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massas (GC-MS):
proteínas, a MS, é uma ferramenta analítica fundamental, empre-
U m processo analítico que emprega um cromatógrafo
gada n o campo emergente da proteômica. O capítulo inicia c o m
gasoso associado a u m espectrômetro de massas.
uma discussão sobre os conceitos básicos e definições da MS,
Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas (LC-MS):
seguida pelas discussões sobre os instrumentos de M S e suas
U m processo analítico que usa u m cromatógrafo líquido
aplicações clínicas.
associado a u m espectrômetro de massas.
Cromatograma I ô n i c o Total (TlC)i A soma de todos os íons
CONCEITOS BÁSICOS E DEFINIÇÕES
produzidos exibidos em f u n ç ã o de tempo.
U m espectrômetro d e massas é u m instrumento analítico que,
Espectro de Massa: U m gráfico da abundância relativa de cada
em primeiro lugar, realiza a ionização de uma molécula-alvo sepa-
íon traçado e m função da sua relação entre a massa e a
rando e medindo, então, a massa da molécula ou seus fragmen-
carga (m/z).
tos. A análise de massas é o processo pelo qual uma mistura de
Espectrometria de Massa c o m D i l u i ç ã o de Isótopo (IDMS):
espécies iónicas é identificada segundo a razão entre a massa e a
U m a técnica analítica usada para quantificar u m com p osto
carga (m/z) (íons). 17 A análise é igualmente qualitativa e quanti-
relativo a uma espécie isotópica de concentração conhecida
tativa; é extremamente útil na determinação da composição ele-
ou fixada.
mentar e es ti u tuia dos compostos inorgânicos c orgânicos.
Espectrometria de Massas (MS): U m a técnica analítica que usa
U m espectro de massa é representado pela abundância rela-
u m espectrômetro de massas para identificar e quantificar
tiva de cada í o n traçado c o m o função de sua razão m/z (Figura
substâncias n u m a amostra.
8-1). Em geral, cada ion apresenta uma única carga (s: = 1); assim,
Espectrômetro de Massas: U m instrumento o n d e as moléculas
a relação m/z é igual à massa. O í o n não-fragmencado da molé-
ionizadas são separadas e medidas conforme sua razão entre
cula original é chamado de í o n molecular. A o íon mais abun-
massa e carga.
dante n o espectro de massa é atribuído u m valor relativo de 100%
e que é chamado de pico básico. O emprego da abundância
relativa de cada fragmento iônico minimiza a variabilidade depen-
dente d o aparelho, s e n d o então possível comparar o espectro de
*Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições prévias de Larry D. massas com os espectros obtidos n o s outros aparelhos. C o m o a
Bowers, nas quais se baseiam partes deste capítulo. fragmentação dos íons e m ligações específicas depende de sua

131
132 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

100 r

204' TIC Spectra Lib

Cromatógrafo Sim
EiP Maích

80

4r 60
\ I /
Fonte de ions Computador

u 40
160
118
\
\
20 42 91 Analisador(es) de m a s s a Sistema de vácuo
/ 65 I

LA
60
\
80 100 120
!
140 160
|
180
r
200
Massa/carga
Detector
100 r

308

Figura fi-2 D i a g r a m a em b l o c o dos c o m p o n e n t e s d e u m sistema d e

80
c r o m a cografia-especcrômetro de massa. O analisador d e massa e o
detector estão sempTe sob vácuo. A fonte de íons p o d e estar sob v á c u o
ou s o b c o n d i ç õ e s de pressão p r ó x i m a ã atmosférica, d e p e n d e n d o d o
^ 60
m o d o d e ionização O sistema d e c o m p u t a d o r é u m a p a r t e integral da
ra
o aquisição de d a d o s e d o r e s u l t a d o .
c
<ra
•n 40
_a
<

20 além de ser u m d e t e c t o r universal, o e s p e c t r ô m e t r o de massas é

118
195 262 t a m b é m u m d e t e c t o r a l t a m e n t e específico. A m b o s os r e s u l t a d o s
l

A
44 I 236
159
I I
I .I «I / . i' i A
50 100 150 200 250
Massa/carga
B
Figura 8-1 E s p e c t r o d e massa dos derivados da d-metan£eta mi na :
(A) p e n t a f l u o r o p r o p i o n i l e (B) carberoxiexaflu o r o b u t ir il.
natureza química, é possível d e t e r m i n a r a e s t r u t u r a de u m analito
a partir d e seu espectro de massa. Bibliotecas c o m p u t a d o r i z a d a s
dos espectros estão disponíveis p a r a a j u d a r n a identificação do(s)
analito(s).
C o m a interface de u m c r o m a t ó g r a f o l í q u i d o o u gasoso, o
e s p e c t r ô m e t r o de massas f u n c i o n a c o m o u m detector p o t e n t e ,
f o r n e c e n d o i n f o r m a ç õ e s e m t e m p o real sobre os analitos, indivi-
d u a l m e n t e , n a m e d i d a e m q u e são eluídos d e u m a c o l u n a d e
cromatografia, D e p e n d e n d o das características o p e r a c i o n a i s d o
e s p e c t r ô m e t r o de massas e da largura d o p i c o d o analito, diversas
v a r r e d u r a s da massa espectral são adquiridas, caracteristicamente
através d o pico. A s o m a de t o d o s os íons p r o d u z i d o s é exibida
como uma função d o tempo para produzir um c r o m a t o g r a m a
i ô n i c o total (TIC). O e s p e c t r ô m e t r o de massas é c o n s i d e r a d o u m
"detector universal" p o r q u e todos os c o m p o s t o s a p r e s e n t a m
massa e, t e o r i c a m e n t e , p o d e m ser detectados. T a m b é m é possível
p r o g r a m a r o sistema d e d a d o s a f i m d e exibir apenas í o n s pré-
selecionados a d q u i r i d o s d u r a n t e a v a r r e d u r a espectral d e massas
O r e s u l t a d o e x i b i d o é c h a m a d o d e perjil iônico extraído. Assim,
/
e x i b e m o aspecto de u m c r o m a t o g r a m a c o m i n t e n s i d a d e d e sinal
traçado e m f u n ç ã o d o t e m p o . O s t e m p o s d e r e t e n ç ã o são e n t ã o
300 m e d i d o s e as alturas de pico, o u áreas de pico, são integradas
p a r a u s o n a análise quantitativa.
Q u a n d o apenas u n s p o u c o s analitos são de interesse para
análise q u a n t i t a t i v a e seu espectro de massa é c o n h e c i d o , o espec-
t r ô m e t r o de massas é p r o g r a m a d o para m o n i t o r a r apenas os íons
de interesse. Esta técnica de detecção seletiva é c o n h e c i d a c o m o
m o n i t o r a m e n t o d o í o n s e l e c i o n a d o (SIM). C o m o o S I M se
c o n c e n t r a n u m n ú m e r o l i m i t a d o d e íons, mais sinais são coleta-
d o s para cada massa selecionada. Isto a u m e n t a a relação e n t r e o
sinal e o r u í d o d o analito e eleva o limite i n f e r i o r d e detecção.
E m geral, u m c o m p o s t o d e s c o n h e c i d o é c o n s i d e r a d o i d e n t i f i c a d o
se as a b u n d ã n c i a s relativas de três ou q u a t r o íons se e n c o n t r a m
e m a c o r d o d e n t r o de + 2 0 % d a q u e l a s de u m c o m p o s t o de refe-
rência.
O s e s p e c t r ó m e t r o s d e massas t a m b é m são u s a d o s p a r a distin-
guir e quantificar, s i m u l t a n e a m e n t e , u m c o m p o s t o c o m u m a
a b u n d â n c i a n o r m a l d o i s ó t o p o a partir d e u m a n á l o g o e n r i q u e -
cido c o m u m isótopo estável (p. ex., 2 H e m relação a ] H , 1 3 C e m
relação a I 2 C, I5 N e m relação a I4 N, o u l s O e m relação a I 6 0 ) ,
Para análise, u m c o m p o s t o m a r c a d o c o m u m isótopo estável é
u s a d o c o m o p a d r ã o i n t e r n o p o r q u e se c o m p o r t a d e m a n e i r a
q u a s e idêntica ao c o m p o s t o nativo d u r a n t e a p r e p a r a ç ã o da
a m o s t r a e na análise c r o m a t o g r á f i c a . A capacidade d e q u a n t i f i c a r
u m c o m p o s t o e m relação a u m a espécie de isótopos c o m c o n c e n -
tração c o n h e c i d a o u fixa é c o n h e c i d a c o m o anáhse de diluição de
isótopos, e a técnica de e s p e c t r o m e t r i a d e massas é d e s i g n a d a
e s p e c t r o m e t r i a d e massas c o m d i l u i ç ã o d e i s ó t o p o s ( I D M S ) . A
técnica I D M S foi utilizada p a r a desenvolver m é t o d o s definitivos
p a r a diversos analitos c l i n i c a m e n t e i m p o r t a n t e s .

INSTRUMENTOS
U m e s p e c t r ô m e t r o d e massas consiste n u m a f o n t e de íons,
sistema d e vácuo, analisador d e massa, d e t e c t o r e c o m p u t a d o r
(Figura 8-2).
Fonte de íoris
T o d a s as técnicas de M S r e q u e r e m u m a etapa de ionização o n d e
u m íon é p r o d u z i d o a partir d e u m á t o m o n e u t r o ou de u m a
molécula. Diversas a b o r d a g e n s f o r a m empregadas para f o r m a r
íons, canto e m c o n d i ç õ e s de altu vácuo 1:01110 de pressões quase
atmosféricas. A ionização p o r i m p a c t o de elétrons (EI) e a ioniza-
ção química (Cl) são técnicas d e ionização usadas q u a n d o h á
e n t r a d a de moléculas n a fase gasosa n o analisador de massas d o
c r o m a t ó g r a f o gasoso. Q u a n d o u m c r o m a t ó g r a f o líquido de alta
eficiência está e m interface c o m u m e s p e c t r ô m e t r o de massas
(HPLC-MS), u s a m o s as seguintes f o n t e s de ionização: (1) ioniza-
ção p o r ektrospray (ESI), 3 (Z) ionização c o m spray sônico (SSI), (3)
ionização q u í m i c a c o m pressão atmosférica (APCI) e (4) fotoioni-
zação c o m pressão atmosférica (APPI). O u t r a s técnicas d e ioniza-
ção i n c l u e m (1) p l a s m a c o m a c o p l a m e n t o indutivo (ICP), (2)
i o n i z a ç ã o / d e s s o r c ã o a laser assistida p o r matriz (MALDI), 1 ^ (3)
i o n i z a ç ã o / d e s s o r c ã o a fosev assistida por matriz c o m pressão atmos-
férica (AP-MALDI), e (4) b o m b a r d e i o a t ô m i c o r á p i d o (FAB).
Ionização por Impacto de Elétrons
N a EI, as moléculas n a fase gasosa são b o m b a r d e a d a s c o m elé-
trons e m i t i d o s a p a r t i r de u m f i l a m e n t o a q u e c i d o , e atraídas p a r a
u m e l e t r o d o coletor (Figura 8-3). Este processo deve ocorrer sob
v á c u o p a r a i m p e d i r a o x i d a ç ã o d o f i l a m e n t o . U m a diferença e m
potencial de 70 eV gera e l é t r o n s c o m energia suficiente para,
n u m a p r ó x i m a colisão, c o m a m a i o r i a das moléculas orgânicas,
p r o d u z i r u m c á t i o n radicai para a EI, c o n s i s t i n d o igualmente n u m
Amostra de
fase gasosa
i q u í m i c a c o m íon eletronegativo a p r e s e n t a limites de detecção
Porta d e entrada
Filamento Eletrodo
(cátodo)
~\
zL
/repulsur
ima
N
ai ltjrii/3çãu !
Camara I J
•"^Extração
/ gás coaxial n e b u l i z a d o r a j u d a a dirigir as gotículas carregadas n o
Focxv
Aceleração da
voltagem
I'
Feixe d e (ons
•Saida da fenda
( r e g i ã o d e v ô o livre)
Figura 8 - 3 Impacto dc e l é t r o n s sobre a f o n t e d e íons O s ímãs
p e q u e n o s são u s a d o s p a r a colimar u m feixe d e n s o d e elétrons, q u e é
extraído d e u m f i l a m e n t o a q u e c i d o c o l o c a d o n u m p o t e n c i a , negativo. O
feixe de elétrons é p o s i c i o n a d o na f r e n t e d e u m e l e t r o d o repulsor, q u e
se e n c o n t r a n u m p o t e n c i a l l i g e i r a m e n t e positivo e m c o m p a r a ç ã o c o m a
f o n t e d e íons. O e l e t r o d o r e p u l s o r envia q u a l q u e r f r a g m e n t o d e íon
c o m carga positiva p a r a a a b e r t u r a n a f r e n t e da f o n t e d e íons. As placas
de aceleração exercem u m a f o r t e a t r a ç ã o sobre os f r a g m e n t o s de íons
c o m carga positiva.
Espectrometria de Massas CAPÍTULO 8 133
íon e n u m radical. 17 N a m a i o r i a d o s casos este íon radical, sub-
s e q ü e n t e m e n t e , s o f r e u m r e a r r a n j o u n i m o l e c u l a r para p r o d u z i r
u m cátion e u m radical:
AB + *-> A + +B'
D e a c o r d o c o m sua estabilidade química, as p r o p o r ç õ e s rela-
tivas d o íon m o l e c u l a r e d o s íons f r a g m e n t a d o s são razoavel-
m e n t e reproduzíveis. O s í o n s positivos são r e p e l i d o s u u reinuvi-
d o s da câmara d e ionização p o r m e i o d e u m c a m p o elétrico. O s
cátions são c o n c e n t r a d o s e l e t r o s t a t i c a m e n t e e i n t r o d u z i d o s n o
a n a l i s a d o r d e massas.
Ionização Química
A C l é u m a técnica de ionização "suave" o n d e u m p r ó t o n é
t r a n s f e r i d o para, ou retirado d e u m analito de fase gasosa p o r
m e i o de u m a m o l é c u l a gasosa reagente. O s gases reagentes típicos
são: (1) m e t a n o , (2) a m ó n i a , (3) i s o b u t a n o , e (4) água. O gás
reagente é dirigido p a r a u m a f o n t e d e ionização q u í m i c a (Cl)
especial, de m o d o que a pressão da f o n t e é elevada para cerca de
0,1 totr. U m feixe de elétrons ioniza o gás reagente e p r o d u z
espécies reativas, f r e q u e n t e m e n t e c o m o resultado de reações das
m o l é c u l a s de íons, c o m o C H + , n o caso d o m e t a n o . As colisões
e n t r e o gás reagente reativo e o analito p r o v o c a m a t r a n s f e r ê n c i a
d e p r ó t o n s . C o m o a m o l é c u l a p r o t o n a d a n ã o é a l t a m e n t e exci-
t a d a n e s t e processo, a f r a g m e n t a ç ã o e n c o n t r a d a é r e l a t i v a m e n t e
p e q u e n a . Isto é v a n t a j o s o para a d e t e r m i n a ç ã o da massa molecu-
lar d o analito e para sua q u a n t i f i c a ç ã o . A C l c o m c a p t u r a d e íons
eletronegativos se t o r n o u p o p u l a r n a q u a n t i f i c a ç ã o de drogas
c o m o as benzodiazepinas. A f o r m a ç ã o de íons negativos ocorre
q u a n d o elétrons a q u e c i d o s são c a p t u r a d o s p o r u m s u b s t i t u t o
eletronegativo c o m o o cloro o u f l ú o r n o analito. Assim, o n ú m e r o
d e c o m p o s t o s q u e s o f r e ionização negativa é p e q u e n o e h á
r e d u ç ã o d o sinal (ruído) de f u n d o . Q u a n d o aplicável, a ionização
m u i t o favoráveis.
Ionização por Eletrospray
A i o n i z a ç ã o p o r eletrospray (ESI) é u m a técnica o n d e u m a
a m o s t r a é ionizada sob pressão a t m o s f é r i c a a n t e s da sua i n t r o d u -
ção n o analisador de massas. 1 9 A amostra, t i p i c a m e n t e u m
e f l u e n t e H P L C , atravessa u m capilar estreito de m e t a l ou de sílica
f u n d i d a n o qual se aplicou u m a v o l t a g e m d e 3 a 5 k V (Figuia
8-4, A). As forças eletrostáticas n o l í q u i d o r e s u l t a m na expulsão
das gotículas e l e t r i c a m e n t e carregadas da p o n t a d o capilar. U m
s e n t i d o de u m e l e t r o d o c o n t a d o r . As gotículas e v a p o r a m q u a n d o
p a s s a m pela região de pressão atmosférica, e x p e l i n d o gotículas
m e n o r e s . O p r ó t o n o u a m ó n i a , a d u z i d o s d a molécula, q u e p o d e m
estar associados c o m m o l é c u l a s solventes são "dessolvatados"
p a r a f o r m a r í o n s "nus", q u e e n t ã o atravessam a b e r t u r a s n u m
c o n e de a m o s t r a g e m e u m ou mais cones de extração (sltiminérs)
antes de e n t r a i n o analisador de massa.
U m a característica ú n i c a da ESI é a p r o d u ç ã o de m ú l t i p l o s
íons c o m carga, e s p e c i a l m e n t e a partir de p e p t í d i o s e p r o t e í n a s .
E c o m u m observar a p r o x i m a d a m e n t e u m a carga para cada 10
r e s í d u o s de a m i n o á c i d o s n u m a p r o t e í n a . Por exemplo, c o m o u m a
m o l é c u l a com massa 2 0 . 0 0 0 p o d e p r o d u z i r 20 cargas, p o d e ser
d e t e c t a d a em m/z 1.000 ( 2 0 . 0 0 0 / 2 0 ) n u m a m e n o r resolução e
n u m analisador mais b a r a t o . Isto e x p a n d e m u i t o a faixa d e massas
acessível a tal i n s t r u m e n t o .
D e v e m o s n o t a r q u e a Figura 8-4, A, s e n d o u m a ilustração
simplificada, m o s t r a a s o n d a s e n d o dirigida para o c o n e d e amos-
134 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
Gás 5 kV
nebullzador v
Amostra
da solução
/+ +"\
Gás
nabulizador
Amostra da
solução
CHgOH CH3OH;
M 5 kV M M
Figura 8 - 4 Representação esquemática de fontes de ionização com ekirospray (A) e química com pressão
atmosférica (B). Observe os pontos diferentes onde ocorre a ionização, como descrito no texto.
tragem d o detector de massas. Para aumentar a performance e
minimizar a contaminação d o detector de massas, as configura-
ções modernas dos aparelhos anularam a sonda e / o u o detector
de massas telativo ao c o n e de amostragem.
A l é m da ESI, existem outras técnicas baseadas na ionização
por spray. Estas técnicas diferem da ESI porque se baseiam, pri-
mariamente, em processos físicos diferentes da alça voltagem para
gerar o spray. Por exemplo, a SSI emprega u m gás nebulizador
supersônico e o termospray usa o aquecimento rápido e a vapori-
zação parcial para gerar u m sfira^.
Ionização Química com Pressão Atmosférica (APCI)
A A P C I é similar à ESI. Por exemplo, ocorre sob pressão atmos-
férica, envolve nebulização e dessolvatação, e utiliza a mesma
amostra e cones de extração que a ESI. A principal diferença
encontra-se n o m o d o de ionização (Figura 8-4, B). N a APCI não
se aplica voltagem alguma n o capilar de entrada. Em vez disso,
Utiliza-se u m injetor de descarga corona para emitir uma n u v e m
de elétrons que ioniza os compostos depois de uma série de
reações iónicas moleculares, de m o d o similar à Cl, mas com
moléculas solventes c o m o a água e o metanol f u n c i o n a n d o c o m o
moléculas reagentes em lugar da amónia ou d o metano c o m o na
CL O s produtos destas reações secundárias p o d e m conter agru-
pamentos de moléculas de solventes e analito de m o d o que se
empregam, igualmente, u m tubo de transferência aquecido o u
um fluxo contracnTrenre de u m determinado gás, por exemplo,
o nitrogênio, para desagrupar os íons. C o m o ocorre na ESI existe
uma fragmentação relativamente pequena e a APCI é usada para
análise quantitativa ou para MS em tandem.
Fotoionização com Pressão Atmosférica
A APPI fornece uma abordagem complementar à ESI o u à APCI
e é considerada mais universal na escala de polaridade. Difere da
Cortina g a s o s a
/ Dotoctor d e
\ massa
• ' + * + (M + H)~
:,+ + , g:
•* J + 1
(M * H)
>
Descarga coruri<j Cortina g a s o s a
5 kV
/ Detoclor
\ do massa
B
(M+H) +
CH 3 OH 2
CHgOH
APCI, primariamente, sob dois aspectos. Em primeiro lugar,
substitui o injetor de descarga corona por uma lâmpada de ultra-
violeta ( U V ) (tipicamente uma lâmpada de descarga de criptõnio
de 10 eV) para gerar íons na fase gasosa por meio da fotoioniza-
ção, Em segundo lugar, geralmente inclui u m gás reagente adi-
cional facilmente ionizado c o m o o tolueno. C o m o ocorre com a
APCI e C l , depois que os íons primários são produzidos (p. ex.,
a partir d o tolueno), eles sofrem u m a série de reações iónicas
moleculares que eventualmente resultam na ionização das molé-
culas du analito.
Plasma de Acoplamento Indutivo
O ICP é u m método de ionização sob pressão atmosférica.
C o n t u d o , ao contrário da maioria dos métodos de ionização sob
pressão atmosférica, que são "suaves" e produzem pouca fragmen-
tação, o ICP é a ionização "dura" extrema, levando, caracteristi-
camente, a uma atomização completa da amostra durante a ioni-
zação. C o n s e q ü e n t e m e n t e , seu uso primário é para a análise
elementar. N o laboratório clínico é particularmente útil na
análise de traços de metal e de metal pesado nos tecidos ou
líquidos do corpo. O ICP é extremamente sensível (p. ex., partes
por trilhão) e é capaz de faixas dinâmicas extremamente elevadas.
A amostra é tipicamente preparada pela digestão ácida e o líquido
digerido c introduzido na fonte de toas poi meio de u m nebuli-
zador alimentado por uma bomba peristáltica. A amostra nebu-
lizada é transmitida para o plasma quente gerado sob pressão
atmosférica pela potência do acoplamento indutivo n o plasma
com o uso de u m gerador de radiofreqüência (R.F) c o m alta
potência. U m pequeno orifício o b t é m amostras d o plasma e os
íons são transmitidos para o analisador de massas, por meio de
uma série de estágios de b o m b e a m e n t o diferencial. O ICP-MS é
relativamente livre da maioria das interferências. N o entanto,
algumas interferências, c o m o p e q u e n o s poliatômicos formados

n a l â m p a d a p o r m e i o d a s reações moleculares iónicas, c a u s a m
p r o b l e m a s . Por exemplo, A r O T interfere c o m o ferro e m m/z 56.
U m a solução para este p r o b l e m a é a reação d i n â m i c a celular, q u e
consiste n u m gás d e pressão m o d e r a d a c o l o c a d o a n t e s d o anali-
sador de m/z- U m gás reagente, c o m o o N H 3 , é dirigido para a
reação celular o n d e reage c o m interferências poliatôtnicas e as
r e m o v e a n t e s d a sua i n t r o d u ç ã o n o analisador de massa.
Dessorção/Ionização da Matriz Assistida por Laser
(MALDI)
M A L D I foi descrita, o r i g i n a l m e n t e , e m 1987. 7 C o m o usada atu-
a l m e n t e , o analito é dissolvido n u m a solução da matri^ q u e é u m
c o m p o s t o d e baixo peso m o l e c u l a r capaz d e absorver UV. Esta
solução é colocada n u m alvo que, e n t ã o , é i n t r o d u z i d o n o espec-
t r ô m e t r o d e massas. A razão e n t r e a matriz e o analito situa-se,
g e r a l m e n t e , e n t r e 1.000 e 1. C o m a e v a p o r a ç ã o d o s solventes
voláteis, o c o m p o s t o m a t r i z se cristaliza e i n c o r p o r a as moléculas
analito. A Figura 8-5 ilustra o u s o de u m laser U V p a r a vaporizar
p e q u e n a s q u a n t i d a d e s de matriz e analito n u m a n u v e m de í o n s
dirigida p a r a o a n a l i s a d o r de massa. A M A L D I g e r a l m e n t e é
associada a u m a n a l i s a d o r d e massas c o m t e m p o d e v ô o ( T O F )
p o r q u e p r o d u z p a c o t e s i ó n i c o s de sinal p u l s a d o discretos.
Dessorção/lonização a Laser Realçada por
Superfície
A d e s s o r ç ã o / i o n i z a ç ã o a laser realçada p o r superfície (SELDI) 6
associa a p u r i f i c a ç ã o p o r a f i n i d a d e e M A L D I n o alvo. A situação
mais c o m u m envolve a p r o d u ç ã o de u m alvo d e superfície
M A L D I , m o d i f i c a d o p o r algum t i p o d e p r o p r i e d a d e de captura
p o r a f i n i d a d e ( h i d r o f ó b i c a , iônica, c r o m a t o g r a f i a d e a f i n i d a d e d e
m e t a l imobilizado [IMAC], D N A , a n t i c o r p o s etc.). A amostra em
q u e s t ã o , f r e q ü e n t e m e n t e n u m a m i s t u r a c o m p l e x a tal c o m o o
EriIrada da luz UV üo laser , '
Eslfíg o
da
amostra
\ Classes Gerais de Espectrómetros
^4
\/ V
Dentro do
. .v . analisador
- / / \ íons d a rnalnz e neutros do massa
V \
Matriz c r i s t a l i z a d a c o m
analito incluído
Figura 8 - 5 Visão genérica d o p r o c e s s o d e dessorção da ionização da
matriz assistida p o r laser. A m a t r i z co-ciistalizada e moléculas de analitos
são irradiadas c o m u m laser U V . O laser vaporiza a matriz, p r o d u z i n d o
u m a n u v e m d e íons da matriz, ions analitos e n e u t r o s . O s i o n s da fase
gasosa são dirigidos p a r a u m a n a l i s a d o r d e massa.
Espectrometria de Massas CAPÍTULO 8 135
soro, é exposta a u m a ou mais destas superfícies d e a f i n i d a d e e
c o m as quais alguns analitos v ã o se ligar p r e f e r e n c i a l m e n t e . A
superfície é lavada para r e m o v e r o m á x i m o de ligações inespecí-
ficas possível, e acrescenta-se u m a matriz para a u m e n t a r a dessor-
ção e / o u ionização. O alvo, e n t ã o , é analisado, g e r a l m e n t e c o m
u m analisador d e massas T O F . A i n t e r a ç ã o p o d e ser m u i t o espe-
cífica, c o m o u m a n t i c o r p o , e p u r i f i c a r e s s e n c i a l m e n t e u m a pro-
teína, ou p o d e ser específica p a r a u m a classe d e c o m p o s t o s , p o r
exemplo, espécies fosforiladas o u glicosiladas. S u a p r i n c i p a l van-
tagem é a p e q u e n a perda de amostra e n q u a n t o a purificação e
análise o c o r r e m n a m e s m a superfície.
Bombardeio Rápido de Átomos (FAB)
O FAB é u s a d o para p r o d u z i r íons a partir de p o l í m e r o s d e alto
peso molecular. P r o d u z í o n s q u a n d o u m feixe de á t o m o s d e alta
velocidade colide c o m a s u p e r f í c i e d e u m l í q u i d o não-volátil
(geralmente glicerol) c o n t e n d o o(s) analito(s). Acredita-se q u e a
pTotonização o c o r r e q u a n d o os analitos n a superfície das gotícu-
las vaporizadas passam para o e s t a d o gasoso. O FAB foi ampla-
m e n t e s u p l a n t a d o pela ESI e pela M A L D I .
Sistema de Vácuo
C o m exceção de alguns e s p e c t r ó m e t r o s d e massas d o tipo c a p t u r a
d e í o n s (icm trap) a separação dos íons n u m analisador de massas
r e q u e r q u e estes n ã o c o l i d a m c o m n e n h u m a o u t r a m o l é c u l a
d u r a n t e a interação c o m os c a m p o s m a g n é t i c o s ou elétricos. Para
t a n t o é necessário o uso d e u m v á c u o d e IO"3 até 10~9 torr,
d e p e n d e n d o d o t i p o d e a n a l i s a d o r de massas Para atingir tal
nível de v á c u o , u m e s p e c t r ô m e t r o de massas e m p r e g a t a n t o u m
v á c u o m e c â n i c o c o m o u m a b o m b a de alto v á c u o eficiente.
D u r a n t e a operação, a b o m b a de v á c u o m e c â n i c a remove o ar d o
sistema até u m a pressão e m q u e a b o m b a de alto v á c u o seja,
e n t ã o , eficaz. U m a b o m b a d e d i f u s ã o é a b o m b a d e alto v á c u o
de m e n o r custo e m a i o r c o n f i a b i l i d a d e . As b o m b a s t u r b o m o l e -
culares e c r i o b o m b a s t a m b é m são usadas n o s analisadores de
massas, s e n d o q u e o u s o das b o m b a s t u r b o m o l e c u l a r e s está cada
vez mais d i f u n d i d o . As b o m b a s d e alto v á c u o r e q u e r e m m a n u -
t e n ç ã o d e r o t i n a para u m a ó t i m a operação.
Analisadores de Massas, Detectores de íons e
Espectrómetros de Massa e m Tandem
O s e s p e c t r ó m e t r o s de massas m e d e m m/z e n ã o a massa molecu-
lar. Isto r e p r e s e n t a u m i m p a c t o f u n d a m e n t a l sobre os p r i n c í p i o s
físicos d e f u n c i o n a m e n t o dos e s p e c t r ó m e t r o s de massas e i n f l u e n -
cia t o d o s os aspectos d o p r o j e t o d e i n s t r u m e n t a ç ã o , o p e r a ç ã o e
i n t e r p r e t a ç ã o d o s resultados.
de Massas
O s e s p e c t r ó m e t r o s de massas são classificados de u m m o d o geral
c o m o (1) i n s t r u m e n t o s d o tipo feixe ou (2) i n s t r u m e n t o s d o tipo
c a p t u r a de íons (trapfjmg). N u m i n s t r u m e n t o d o t i p o feixe, os íons
se m o v e m pelo i n s t r u m e n t o e a t i n g e m o detector, o n d e são
d e t e c t a d o s d e f o r m a destrutiva. O processo inteiro, a p a r t i r d o
m o m e n t o e m q u e o í o n p e n e t r a n o analisador até o m o m e n t o
em q u e é d e t e c t a d o , g e r a l m e n t e leva de m i c r o s s e g u n d o s a milis-
s e g u n d o s . N u m analisador d o t i p o d e captura de íons, eles são
m a n t i d o s n u m a região e s p a c i a l m e n t e c o n f i n a d a p o r m e i o d e
u m a c o m b i n a ç ã o d e c a m p o s magnéticos, e / o u eletros tá ticos e / o u
de R F elétrica. O s c a m p o s de c a p t u r a de íons são m a n i p u l a d o s
d e m a n e i r a q u e p e r m i t a m a realizaçao d e m e d i ç õ e s m/z- O s
t e m p o s d e c a p t u r a v a r i a m de u m a f r a ç ã o de s e g u n d o até m i n u t o s ,
e m b o r a a maioria das aplicações clínicas se e n c o n t r e n a extremi-
d a d e f i n a l desta faixa.
136 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
Figura 8 - 6 Diagrama de um filtro de massa quadrupolo, incluindo
a porção RF das voltagens aplicadas nos bastões quadrupolares.
Aparelhos do Tipo Feixe
O s espectrómetros de massas do tipo feixe incluem aparelhos (1)
quadrupolo, (2) setoi magnético, e (.3) T O E E conveniente cate-
gorizar os aparelhos do tipo feixe e m duas categorias amplas:
aqueles que produzem u m espectro de massas por meio da var-
redura da faixa m/z n u m período de tempo {quadrupolo e setor
magnético), e aqueles que adquirem imagens instantâneas suces-
sivas do espectro das massas (TOF). Esta categorização não é
definitiva porque alguns aparelhos p o d e m ser adaptados para
operações c o m ou sem varredura. N o entanto, a categorização é
útil porque abrange a maioria dos instrumentos atualmente dis-
poníveis, e porque os aparelhos c o m e sem varredura são adap-
táveis para diferentes empregos mais eficientes.
Quãdnjpolo. O s espectrómetros de massas quadrupolos são, às
vezes, c o n he c ido s c o m o filtros de massas quadrupolos (QMFs).
Analiticamente são, n o m o m e n t o , mais empregados c o m o espec-
trómetros de massas porque substituíram os espectrómetros de
setor magnético c o m o instrumento-padrão. Embora estes instru-
m e n t o s sejam inferiores aos de setor magnético e m termos de (1)
sensibilidade, (2) maior capacidade de massa, (3) resolução, e (4)
exatidão de massa, os quadrupolos oferecem uma combinação
atrativa e prática de características, inclusive: (1) facilidade de
uso, (2) flexibilidade, 0 ) d e s e m p e n h o adequado para a maioria
das aplicações, (4) custo relativamente baixo, (5) sem exigências
cruciais de localização, e (6) sistemas de software altamente desen-
volvidos.
U m espectrômetro de massas quadrupolo consiste e m quatro
bastões paralelos, condutores elétricos dispostos em quadrado
(Figura 8-6). O s quatro bastões forniam u m canal comprido
através d o qual o feixe de íons passa. O feixe penetra perto d o
eixo, n u m a extremidade d o quadrado, atravessando-o n u m a
direção geralmente em paralelo ao eixo e saindo na outra extre-
midade do quadrado. O feixe de íons que penetra n o quadrupolo
pode conter íons c o m diversos valores de m/z, mas apenas os
íons situados dentro de uma faixa m/z muito estreita (caracteris-
ticamente Am/z < 1) são transportados com sucesso através do
aparelho para atingir o detector. O s íons fora desta faixa estreita
são ejetados radialmente. A faixa A m/z representa uma banda de
Figura 8-7 Voltagens D C aplicadas no grupo quadrupolar de
bastões.
passagem, análoga à largura de banda de u m filtro de interferên-
cia em ótica, motivo pelo qual os espectrómetros de massas
quadrupolos são freqüentemente chamados de "filtros de massas"
em vez de "espectrómetros de massas".
O s espectrómetros de massas quadrupolos se baseiam n u m a
superposição de potenciais RF e corrente direta ( D C ) aplicados
aos bastões quadrupolos. Considerando, e m primeiro lugar, o
c o m p o n e n t e D C , as voltagens D C são aplicadas nos eletrodos
n u m padrão quadrupolar. Por exemplo, u m potencial D C posi-
tivo é aplicado nos eletrodos 1 e 3, c o m o indicado na Figura 8-7,
e u m potencial D C negativo equivalente é aplicado n o s eletrodos
2 e 4. O s potenciais D C são relativamente pequenos, da ordem
de poucos volts. Superpostos aos potenciais D C encontram-se os
potenciais RF, também aplicados de m o d o quadrupolar. O s
potenciais RF variam até a faixa de quilovolt, e a freqüência é da
ordem de 1 MHz. A freqüência é fixada de forma típica, apesar
de uma operação c o m freqüência variável ser possível.
O aparelho pode ser operado igualmente n o m o d o de monito-
ramento de íons seíeriormdos (SIM), c o m o n o m o d o de varredura. N o
m o d o SIM, as voltagens RF e D C são fixas. Conseqüentemente,
o centro da passagem de banda e a sua largura são fixas. Por
exemplo, o espectrômetro de massas pode ser calibrado para a
passagem de íons com m/z 363 ± 0,5. A m b o s os centros m/z e
Am/z, são calibrados pela escolha adequada da D C e da RF.
A combinação dos limites m/z inferiores e superiores estabe-
lece uma passagem de banda (Am/z) e, finalmente, uma resolu-
ção [(iti/í)/(Atn/^]. Geralmente os instrumentos quadrupolares
são limitados a uma resolução de diversos milhares, que é sufi-
ciente para atingir a resolução isotópica de íons de carga indivi-
dual de m/z cão elevada quanto diversos milhares. N o entanto,
avanços técnicos permitiram que os espectrómetros de massas
quadrupolos conseguissem resoluções que ultrapassam 10.000.
O s benefícios da alta resolução incluem a redução das interferên-
cias. A l é m disso, uma resolução elevada associada a uma eletrô-
nica de alta precisão permitiu a medida de "massas exatas" (isto
é, uma precisão de massa muito elevada) usando instrumentos
quadrupolares. As medidas de massa exatas são úteis na confir-
mação de u m a fórmula química. Em virtude de seu menor custo
e simplicidade relativa e m comparação com os instrumentos de
setor magnético, os QMFs geralmente apresentam interface com
as cromatografias gasosa e líquida.

Setor Magnético. O s espectrómetros de massas de setcr mag-
nético raramente são usados n o laboratório clínico, por isso não
vão ser descritos com detalhe agora. Paia uma boa introdução à
tecnologia do setor magnético, o leitor deve consultar a edição
anterior deste livro.* Estes espectrómetros de massas clássicos são
de fácil compreensão, versáteis, confiáveis, altamente sensíveis, e
no seu m o d o de operação c o m "dupla focalização", capazes de
uma resolução m/z e precisão de massa muito elevadas C o n t u d o ,
São caracteristicamente caros, grandes e pesados. A l é m disso,
freqüentemente seu uso é difícil. C o n s e q u e n t e m e n t e , outros ins-
trumentos substituíram de forma ampla os espectrómetros de
massas d e setor magnético. C o n t u d o , existem dois p e q u e n o s
espectrómetros de massas de setor magnético com dupla focali-
zação de bancada potencialmente úteis para o químico clínico.
Tempo de VÔO. A espectrometria de massas T O F (TOF-MS) é
uma técnica sem varredura o n d e u m espectro de massas com-
pleto é adquirido c o m o u m a imagem instantânea, em vez de
uma varredura através de u m série seqüencial de valores m/z
durante a apresentação da amostra. A espectrometria de massas
T O F é m u i t o popular e apresenta diversas vantagens, inclusive
(I) uma faixa quase ilimitada m/z, (2) elevada velocidade de
aquisição, (3) alta exatidão de massa, (4) resolução moderada-
m e n t e elevada, (5) alta sensitividade, e (6) custo razoável.
T a m b é m são bem adaptados às forças de ionização pulsadas, que
é uma vantagem e m algumas aplicações, particularmente c o m
M A L D I e técnicas relacionadas.
Os espectrómetros de massas T O F modernos produzem
medidas exatas de massa, caracteristicamente com exatidão em
baixas partes por milhão (ppm). Isto possibilita que as medidas
T O F c o n f i r m e m a fórmula molecular de u m composto. Ao con-
trário dos instrumentos de setor magnético que também são
capazes de medidas de massa exatas, as medidas exatas obtidas com
T O F são práticas nos experimentos de cromatografia de rotina e
são, portanto, potencialmente úteis para o químico clínico.
O s espectrómetros de massas T O F são conceitualmente
simples d e compreender porque se baseiam n o fato de que u m
íon mais leve se move mais depressa d o que u m í o n mais pesado,
desde que apresentem a mesma energia cinética. U m a TOF-MS
lembra u m cachimbo longo. O s ions são criados o u injetados na
extremidade final do cachimbo e, então, acelerados com um
potencial de diversos quilovolts. Eles se m o v e m pelo tubo de vôo
e atingem o detector na extremidade final do tubo de vôo. O
tempo decorrido para atravessar o tubo é c o n h e c i d o c o m o t e m p o
de vôo, q u e está relacionado à m/z do íon.
O t e m p o de v ô o para u m íon com massa m e energia cinética
E atravessar uma distância L n u m a região livre de campos elétri-
cos é d a d o por:
m |
U m cálculo da amostra para um i o n c o m peso molecular de
200 k D a (3,32 X 10~ M kg) c o m uma energia cinética de 10 keV
(1,60 X 10~15 J), se m o v e n d o através de u m percurso de 1 m,
produz u m tempo de vôo de 10,18 microssegundos, e u m íon
com peso molecular de 201 leva apenas cerca de 25 nanossegun-
*Annesley T, Rockwood AL, Sherman NE. Mass spectrometry. ]n: Burtis CA,
Ashwood ER, Bruns DE, eds. Tietz textbook of clinicai chemistry and molecu-
lar diagnostica, 4l1, ed. St Louis: Saunders, 2006:165-90.
Espectrometria de Massas CAPÍTULO 8 137
dos a mais. Para capturar c o m exatidão tais sinais transitórios, o
sistema de registro de dados deve funcionar n u m a escala de
t e m p o de ~ 1 nanossegundo. O s avanços n o processamento ele-
trônico do sinal tornaram esta técnica prática e com custo rela-
tivamente modesto, o que foi um fator importante no a u m e n t o
da popularidade da TOF-MS.
A T O F é uma técnica basicamente pulsada e se associa pron-
tamente a métodos de ionização pulsada, sendo a M A L D I o
exemplo mais comum. A MALDI-TOF apresenta seu maior
impacto na área da identificação de proteínas e peptídios e atual-
m e n t e é pouco utilizada para análise quantitativa devido à varia-
ção nas amplitudes de sinal, que dificultam a quantificação.
U m a outra área e m que a T O F - M S se distingue é na análise
de alta massa porque sua faixa de massas é quase ilimitada. N o
MALDI-TOF, por exemplo, a detecção de proteínas c o m pesos
moleculares acima de 1 0 0 . 0 0 0 não é i n c o m u m . A T O F também
é empregada com fontes de ions ESI e EI. Por razões técnicas, os
aparelhos ESI-TOF e EI-TOF diferem consideravelmente dos apa-
relhos MALDI-TOF, de m o d o que os aparelhos T O F têm, geral-
mente, uma única finalidade, pois fontes de íons não são inter-
cambiáveis entre os diferentes tipos de aparelhos TOF. Espera-se
que a capacidade de análise de massa elevada aumente de impor-
tância com o uso cada vez mais freqüente de m é t o d o s de diag-
nóstico baseados na proteômica pelos laboratórios clínicos.
Espectrómetros com Captura de Massa
A o contrário dos aparelhos em feixe, estes espectrómetros de
massas se baseiam na captura ou trafjfimg de íons para capturar e
conter durante u m período de tempo prolongado numa pequena
região do espaço. Os tempos de captura variam desde uma fração
de segundo até minutos. Diferente dos instrumentos do tipo feixe,
a divisão entre os aparelhos de varredura e sem varredura tem
menor significado para os instrumentos com captura de íons. A
principal diferença prática entre os instrumentos c o m e sem var-
redura está relacionada c o m o pico de inclinação, c o m o foi discu-
tido na seção sobre TOF. E m termos de produção de espectros
de inclinação os aparelhos de captura são mais parecidos com os
instrumentos sem varredura, c o m o os T O F (sem inclinação), do
que c o m os instrumentos c o m varredura. Isto ocorre porque a
amostra é capturada n u m instante e analisada, então, n o laser.
C o m o a amostra é capturada em u m instante, não existe inclina-
ção dos espectros, independente da realização de análise de m/z
com u m procedimento c o m ou sem varredura.
As classes de captura d e íons ou ions traps incluem (1) ions
traps quadrupolos (QIT), que se baseiam nos campos de RF para
possibilitar a captura dos íons; (2) ions trafs lineares, que são
muito próximos d o QIT n o s seus princípios de operação; e, (3)
espectrómetros de massas por ressonância iônica ciclotrônica
(ICR), baseados n u m a c o m b i n a ç ã o de campos magnéticos e ele-
trostáticos para a captura.
Ions Traps Quadrupolos. O s QITs são utilizados, primaria-
mente, c o m o detectores G C o u HLPC. Eles são (1) relativamente
compactos, (2) de baixo custo, (3) versáteis, (4) excelentes para
estudos exploratórios, e (5) úteis para a caracterização estrutural
e para a identificação de amostras.
A operação do Q I T se baseia n o m e s m o princípio físico que
o espectrômetro de massas quadrupolos descrito anteriormente.
A m b o s os instrumentos empregam a capacidade dos campos RF
para confinar os íons. N o entanto, o campo RF de u m ion trap é
projetado de m o d o a capturar ions e m três dimensões e m vez de
permitir a travessia dos íons, c o m o n u m QMF, que confina os
íons apenas em duas dimensões.
U m diagrama de u m espectrômetro de massas de ion trap
encontra-se na Figura 8-8. A área de captura é muito pequena,
138 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
Tampa da extremidade
do eletrodo (entrada
d e elétrons)
Superfícies Anel d e
eletrodos
z
I captura de íons RF que se baseia e m u m Q M F linear modificado.
Tampa da extremi-
d a d e do eletrodo
(sairia d e íons)
Figura 8 - 8 D i a g r a m a d o q u a d m p o l o c o m c a p t u r a de ions {ions (rap).
m e d i n d o apenas poucos centímetros de comprimento. A captura
de íons por si só seria pouco mais que uma singularidade da física
se não fosse o fato de que os íons dentro da área p o d e m ser
manipulados, de m o d o a se dissociar em fragmentos característi-
cos, e ejetados de m o d o a gerar u m espectro de massas.
Apesar dos QITs e Q M F s terem sido descritos aproximada-
mence ao m e s m o tempo, o Q M F inicialmente foi mais popular
c o m o aparelho analítico. Posteriormente, duas descobertas impor-
tantes mudaram o uso d o QIT. Em primeiro lugar, descobriu-se
que a inclusão na área de captura o u trctp de uma pressão mais
elevada (IO -3 torr) de gás com baixo peso molecular melhorava a
resolução da massa e reduzia os limites de detecção. Em segundo
lugar, o desenvolvimento de uma ejeção seletiva de massas ou uma
função de varredura de instabilidade de massa, melhorava a var-
redura QIT. N o caso de ausência de voltagem D C e uma baixa
voltagem RF, os íons de todas m/z são armazenados n o campo
QIT. C o m o aumento da voltagem RF, os ions com m/z crescente
se tornam axialmente instáveis e saem, seqüencialmente, do QIT
de acordo com seu m/z• O s íons que deixam o QIT através de
uma tampa da extremidade são detectados por meio de u m mul-
tiplicador externo de elétrons. U m a melhora adicional na sensi-
bilidade do QIT foi a aplicação de u m comprimento de onda c o m
modulação axial nos eletrodos da tampa da extremidade. A volta-
gem oscilante a u m e n t o u a eficiência da ejeção de íon a partir da
área de captura e melhorou a resolução da massa.
A l é m d o m o d o de operação c o m voltagem oscilante, o QIT
é capaz de operar em outros m o d o s . Por exemplo, o Q I T também
é operado n u m m o d o de armazenamento seletivo de massas que
envolve a seleção de condições RF e D C de m o d o que apenas
íons de uma massa sejam armazenados n o Q I T em qualquer
momento.
A capacidade de aplicar comprimentos de ondas personaliza-
dos ao Q I T o torna u m dos mais versáteis dos espectrómetros de
massas, rivalizado apenas pelo espectrômetro de massa ICR. Isto
é mais fortemente evidenciado na espectrometria de massas e m
tandem ( M S / M S e técnicas relacionadas), q u e vai ser discutida
em separado. Devemos observaT aqui, n o entanto, que os experi-
mentos com múltiplos estágios M S / M S ( M S / M S / M S . . . , ou MS")
são prontamente realizados n o s instrumentos c o m iom traps.
A capacidade de armazenar íons também implica outras van-
tagens distintas. U s a n d o a abordagem de varredura c o m ejeção
seletiva de massa, a resolução de massa n o Q I T é inversamente
proporcional à taxa de varredura. C o m a redução da taxa de
varredura, foi obtida uma resolução de massa similar à obtida
c o m os aparelhos de setor. Por exemplo, esta técnica foi usada
para determinar o estado da carga de íons proteicos c o m carga
múltipla gerada na ESI.
A QIT também compartilha algumas vantagens com a TOF-MS.
E m particular, a espectrometTia de massas c o m captura de íons
é muito sensível. A l é m do mais, a amostragem é dissociada da
varredura de m o d o fazendo c o m que não exista pico de inclina-
ção de massa espectral na GC -M S e na HPLC-MS.
Ion Trap Lineãr. O Ion trap linear é u m instrumento com
Em lugar de ser u m aparelho de passagem c o m o u m Q M F linear
normal, os campos eletrostáticos são aplicados nas extremidades
para prevenir que os íons deixem o aparelho. Assim, uma vez
retidos os ions são manipulados em muitas maneiras usadas e m
u m QIT. U m a vantagem do quadrupolo linear trap geralmente é
apresentar uma faixa dinâmica superior a u m QIT. O s espectró-
metros de massas do tipo triplo quadrupolo comerciais estão
s e n d o oferecidos c o m o terceiro quádruplo modificado para fun-
cionar c o m o u m trap linear.
Ressonância lônica Ciclotrônica. A ICR-MS se distingue pelas
medidas de acurácia de alta resolução e de alta massa. As medidas
obtidas c o m resoluções superiores a 1 milhão não são i n c o m u n s
e é possível uma exatidão de massa sub-ppm. A ICR é uma
técnica de captura e compartilha muitas das vantagens dos ins-
trumentos de captura RF; con tu d o, existem ainda outras manei-
ras de manipular íons e m uma ICR-MS do que n u m QIT, e
medidas M S n são facilmente obtidas c o m u m a ICR-MS.
U m a ICR M S se baseia n o princípio de que os íons imersos
n u m campo magnético sofrem u m movimento circular (movi-
m e n t o ciclotrônico). U m a ICR-MS típica usa u m campo magné-
tico supercondutor elevado (3 a 12 tesla). Dentro deste campo e
dentro de u m alto vácuo está mon tad a u m a "câmara" formada,
caracteristicamente, por seis eletrodos de metal dispostos c o m o
as faces de u m cubo. O s íons estão suspensos dentro da câmara
e sofrem movimentação ciclotrônica, que impede que os íons se
percam radialmente (a direção radial é definida e m perpendicu-
lar às linhas d o campo magnético). U m potencial baixo ( - 1 V)
é aplicado na tampa da extremidade para manter os íons axial-
mente dentro da armadilha. A combinação de campos elétricos
e magnéticos mantém os íons c o n f i n a d o s dentro da célula.
U m a Transformada de Fourier (FT) é usada para extrair u m
espectro de massa a partir d o sinal bruto. D e v i d o ao uso fre-
qüente da FT na ICR, a técnica freqüentemente é chamada de
FT-ICR ou FTMS. O s instrumentos FT-ICR são os mais versáteis
de todos os espectrómetros de massas e são capazes de muitos
tipos de medidas, inclusive diversos tipos de experimentos M S /
MS.
Espectrómetros de Massas em Tandem ou
Seqüenciais
A espectrometria de massas e m tandem, ou espectrometria de
massas/espectrometria de massas ( M S / M S ) se tornou uma
técnica importante n o s laboratórios clínicos e é usada para
análise quantitativa das amostras de rotina. N o entanto, também
é excelente para caracterização estrutural e identificação de com-
postos e, conseqüentemente, é útil para estudos exploratórios,

m e s m o q u a n d o u m teste f i n a l p o d e ser b a s e a d o n u m a tecnologia
diferente, c o m o o i m u n o e n s a i o . A característica mais i m p o r t a n t e
desta técnica é sua seletividade m u i t o elevada. Q u a n d o associada
à m a i o r seletividade de u m a H P L C , a i n t e r f e r ê n c i a n u m e s t u d o
b e m p r o j e t a d o c o m M S / M S (e e s p e c i a l m e n t e n u m teste H L P O
M S / M S ) são m u i t o baixas. E m v i r t u d e de sua baixa taxa de
interferências, baixo custo de cons umí vei s ( c o m o o c o r r e c o m a
m a i o r i a d o s m é t o d o s MS) e elevadas taxas d e r i t m o de transfe-
rência de a m o s t r a , cada vez m a i s l a b o r a t ó r i o s clínicos estão com-
p r a n d o e u s a n d o e s p e c t r ó m e t r o s de massas e m tandem.
O p r i n c í p i o físico dos e s p e c t r ó m e t r o s de massas e m tandem é
mais b e m c o m p r e e n d i d o se c o n s i d e r a r m o s os aparelhos d o tipo
feixe, t a n t o u m e s p e c t r ô m e t r o d e massas de setor m a g n é t i c o c o m o
u m e s p e c t r ô m e t r o de massa q u a d r u p o l o . D o i s e s p e c t r ó m e t r o s de
massa estão dispostos s e q ü e n c i a l m e n t e c o m u m a "câmara d e
colisão" colocada e n t r e os dois aparelhos. O p r i m e i r o a p a r e l h o é
u s a d o para selecionar íons de u m m/z e m particular, c h a m a d o
t a n t o de "íon precursor" c o m o " í o n pai". O íon precursor é diri-
gido para a câmara de colisão, o n d e os íons colidem c o m molé-
culas d e gás n o f u n d o , e se q u e b r a m em íons m e n o r e s , c h a m a d o s
"íons-produto" ou "íons filhos". O s e g u n d o e s p e c t r ô m e t r o de
massas a d q u i r e o espectro de massas dos íons-produto.
Existem diversas f u n ç õ e s d e varredura possíveis c o m os espec-
trómetros d e massas e m tandem. U m a "varredura d o í o n - p r o d u t o "
envolve a calibragem d o p r i m e i r o espectrômetro de massas, M S I ,
a f i m de selecionar u m m/z d e t e r m i n a d o e realizar a varredura d o
espectro de massa completo d o íon-produto. Esta varredura é fre-
q ü e n t e m e n t e usada para caracterização estrutural. U m a v a r r e d u r a
d o "íon precursor" reverte este r e l a c i o n a m e n t o c o m o s e g u n d o
espectrômetro de massas, MS2, a fim de selecionar u m íon-produto,
e M S I é varrido através d o espectro. O s picos n a varredura do íon
precursor são indicativos de quais destes íons p r o d u z e m u m íon-
p r o d u t o específico, u m a capacidade que f r e q ü e n t e m e n t e é usada
paTa analisar classes específicas de compostos. A chave para a
elevada seletividade da M S / M S é q u e caracteriza u m c o m p o s t o
s e g u n d o duas p r o p r i e d a d e s físicas, massa d o íon precursor e massa
d o íon-produto, e m vez de u m a ú n i c a p r o p r i e d a d e . Se for associada
a u m a separação cromatográfica, o t e m p o de retenção será e n t ã o
acrescentado à caracterização, e os analitos serão caracterizados p o r
três p r o p r i e d a d e s físicas. Esta seletividade elevada elimina a maioria
das interferências potenciais.
C o m o a c o n t e c e c o m os e s p e c t r ó m e t r o s d e massas de estágio
ú n i c o , os e s p e c t r ó m e t r o s de massa e m tandem são grosseiramente
caracterizados c o m o i n s t r u m e n t o s d o tipo feixe e d e captura. O
i n s t r u m e n t o d o tipo de feixe mais p o p u l a r é o triplo q u a d r u p o l o .
Neste instrumento, o primeiro quadrupolo ( Q l ) funciona como
M S I , e o terceiro q u a d r u p o l o (Q3) f u n c i o n a c o m o M S 2 . E n t r e
estes dois q u a d r u p o l o s encontra-se o u t r o q u a d r u p o l o , Q 2 , q u e
f u n c i o n a c o m o a câmara d e colisão.
O u t r a evolução tecnológica n a e s p e c t r o m e t r i a de massas e m
tandem é a c o m b i n a ç ã o de dois e s p e c t r ó m e t r o s de massas T O F ,
T O F / T O F Estes aparelhos são m u i t o sensíveis e a p r e s e n t a m
excelente r k m o d e transferência para M A L D I - M S / M S , s e n d o
e s p e c i a l m e n t e a p r o p r i a d o s p a r a a pesquisa e m p r o t e ô m i c a . N o
e n t a n t o , estes i n s t r u m e n t o s são incapazes de realizar v a r r e d u r a s
verdadeiras d e í o n p r e c u r s o r o u v a r r e d u r a s c o m p e r d a s n e u t r a s
constantes.
O s c h a m a d o s e s p e c t r ó m e t r o s d e massas h í b r i d a s i n c l u e m
u m a c o m b i n a ç ã o de dois tipos diferentes de e s p e c t r ó m e t r o s de
massas n u m a disposição tandem. U m a a b o r d a g e m p o p u l a r é a
c o m b i n a ç ã o de u m q u a d r u p o l o p a r a M S I e u m T O F para M S 2 .
C o m o o c o r r e c o m os i n s t r u m e n t o s T O F / T O F , estes i n s t r u m e n -
tos são a t u a l m e n t e u s a d o s , p r i n c i p a l m e n t e , p a r a pesquisa de
p r o t e ô m i c a , mas p o d e m , e v e n t u a l m e n t e , e n c o n t r a r aplicações
Espectrometria de Massas CAPÍTULO 8 139
e m l a b o r a t ó r i o clínico. N o e n t a n t o , estes a p a r e l h o s n ã o são
capazes d e realizar v a r r e d u r a s verdadeiras de íon p r e c u r s o r o u
v a r r e d u r a s com p e r d a s n e u t r a s c o n s t a n t e s .
Detectares
C o m exceção de u m ICR-MS, quase t o d o s os espectrómetros de
massa usam multiplicadores de elétrons para detecção de íons. As
classes de multiplicadores d e elétrons c o m p r e e n d e m (1) multipli-
cadores d e d m o d o discretos, (2) multiplicadores de elétrons d i n o d o
c o n t í n u o (CDEMs), t a m b é m c h a m a d o s dc multiplicadores d e
canal cle elétrons, (CEMs) e (3) multiplicadores de elétron de placa
microcanal (MCP), t a m b é m c o n h e c i d o s c o m o multiplicadores d e
elétrons de placa multicanal. E m b o r a sejam diferentes e m seus
detalhes, todos três f u n c i o n a m p o r m e i o de u m processo de mul-
tiplicação similar, c h a m a d o , às vezes, de processo e m avalanche ou
em cascata, q u e se repete p o r m e i o de u m a cadeia de d i n o d o s ,
n u m e r a d o s e n t r e 12 e 24 n a maioria dos projetos. O processo d e
multiplicação produz, tipicamente, u m g a n h o de IO4 até 10h, o n d e
a geração de u m elétron n o p r i m e i r o d i n o d o p r o d u z u m pulso de
IO4 até 10 a elétrons n o final da cascata. A duração d o pulso é m u i t o
curta, geralmente inferior a 10 n a n o s s e g u n d o s .
U m detector adicional u s a d o n o s e s p e c t r ó m e t r o s de massas
é o c o p o de Faraday.
Computador e Programa
N o s e s p e c t r ó m e t r o s de massa m o d e r n o s , o sinal b r u t o p r o d u z i d o
pelo i n s t r u m e n t o é digitalizado e o sinal digital é registrado e
p r o c e s s a d o p o r c o m p u t a d o r e s e seu p r o g r a m a residente. E m
d e c o r r ê n c i a da (1) c a p a c i d a d e d e resolução de massa, (2) d a
f u n ç ã o d e v a r r e d u r a , (3) d a c a p a c i d a d e d e m u d a r a u t o m a t i c a -
m e n t e d o m o d o d e ionização positivo p a r a o negativo, e (4) d a
velocidade c o m q u e diversos sinais m/z são m o n i t o r a d o s , os
i n s t r u m e n t o s m o d e r n o s para a M S g e r a m q u a n t i d a d e s e n o r m e s
d e d a d o s b r u t o s . A l é m disso, o u s o da M S e m diversas aplicações
r e q u e r q u e os f a b r i c a n t e s f o r n e ç a m c o m p u t a d o r e s e p r o g r a m a s
sofisticados.
Por exemplo, n o s l a b o r a t ó r i o s de toxicologia, u m a f u n ç ã o
i m p o r t a n t e d o sistema de d a d o s é a pesquisa da biblioteca pro-
c u r a n d o a j u d a r n a i d e n t i f i c a ç ã o d o c o m p o s t o . Existem diversas
bibliotecas comerciais, i n c l u i n d o a (1) Wiley Registry of Mass
Spectral Data, (2) a U.S. N a t i o n a l I n s t i t u t e of S t a n d a r d s a n d
T e c h n o l o g y (NIST) Mass Spectral D a t a b a s e , e (3) Pfleger, M a u r e r ,
W e b e r d r u g libraries. A l é m disso, diversos l a b o r a t ó r i o s g e r a m
suas p r ó p r i a s bibliotecas. A q u a l i d a d e e a q u a n t i d a d e de espec-
tros disponíveis, o a l g o r i t m o de busca, e se espectros c o n d e n s a -
d o s ou c o m p l e t o s são pesquisados são fatores i m p o r t a n t e s n a
correlação d o s espectros. Existem diversos algoritmos de pesquisa
disponíveis n a s bibliotecas, s e n d o o mais p o p u l a r o da correlação
b a s e a d a em p r o b a b i l i d a d e s e a a b o r d a g e m d a correlação d o
p r o d u t o s e m e a d o m o d i f i c a d o pelo N I S T . A m b a s as a b o r d a g e n s
f o r n e c e m u m a avaliação da q u a l i d a d e d a correlação e n t r e os
espectros o b s e r v a d o s e os espectros da biblioteca
APLICAÇÕES CLÍNICAS
A associação dos espectrómetros de massas c o m cromatógrafos
gasosos ou líquidos ( G C - M S e LC-MS) resultou e m i n s t r u m e n t o s
analíticos versáteis com a capacidade de resolução dos cromatógra-
fos, e com a especificidade sofisticada e baixos limites de detecção
de u m espectrômetro de massas. Tais i n s t r u m e n t o s são f e r r a m e n t a s
analíticas poderosas utilizadas e m laboratórios clínicos para iden-
tificar e quantificar analitos orgânicos. Por exemplo, f o r n e c e m
informações estruturais e quantitativas sobre analitos individuais
n a m e d i d a e m que são eluídos d e u m a coluna cromatográfica.
140 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

Estas técnicas associadas são m u i t o sensíveis e só há necessidade Cromatografia Líquida Acoplada à

de q u a n t i d a d e s e m n a n o g r a m a s o u picogramas para análise.
O s espectro m e eros de massas M A L D I - T O F e SELDI, e as
técnicas de ionização I C P t a m b é m a u m e n t a r a m a capacidade
analítica d o s e s p e c t r ó m e t r o s de massas. O s e s p e c t r ó m e t r o s de
massa M A L D I - T O F e S E L D I estão s e n d o usados, p r i n c i p a l m e n t e ,
p a r a detecção e n ã o p a r a a análise de r o t i n a das amostras d o
paciente. U m a aplicação i m p o r t a n t e da M S é seu uso c o m o fer-
r a m e n t a analítica p r i m á r i a para descobertas n o c a m p o e m expan-
são e c r e s c i m e n t o r á p i d o , q u e é a p r o t e ô m i c a .
Cromatografia Gasosa Acoplada à
Espectrometria de M a s s a s (GC-MS)
A G O M S é usada n a análise de c o m p o s t o s biológicos h á diversas
décadas. Por exemplo, é u s a d a p e l o N I S T c o m o u m m é t o d o
definitivo de qualificar materiais d e referência p a d r ã o e atribuir
valores certificados a m u i t o s analitos clínicos ( C a p í t u l o 2). U m a
das aplicações mais c o m u n s d a G C - M S encontra-se na detecção
de drogas p a r a f i n s clínicos o u forenses. M u i t a s drogas apresen-
t a m pesos moleculares r e l a t i v a m e n t e baixos e p r o p r i e d a d e s não-
polares e / o u voláteis, q u e t o r n a m estes c o m p o s t o s particular-
m e n t e a d e q u a d o s p a r a análise pela G C . A ionização por i m p a c t o
de elétrons c o m detecção de massas p o r m e i o de v a r r e d u r a com-
pleta é a a b o r d a g e m mais u s a d a p a r a u m a detecção a b r a n g e n t e
de drogas. A i d e n t i f i c a ç ã o de c o m p o s t o s d e s c o n h e c i d o s é reali-
zada c o m a c o m p a r a ç ã o de t o d o o seu espectro de massa c o m
u m a biblioteca o u base d e d a d o s especial. Diversas agências fede-
rais ou estaduais o b r i g a m q u e apenas a G C - M S seja u s a d a para
c o n f i r m a r a p r e s e n ç a de drogas e m amostras s u p o s t a m e n t e con-
sideradas positivas n a s análises i m u n o i s to químicas.
A G C - M S a p r e s e n t a diversas aplicações além da detecção de
drogas. Diversos c o m p o s t o s x e n o b i ó t i c o s são p r o n t a m e n t e anali-
sados pela G C - M S . Foi descrita a sua aplicação n a pesquisa de
esteróides anabólicos, pesticidas, p o l u e n t e s e erros inatos d o
metabolismo."
U m a limitação i m p o r t a n t e da G C - M S é a necessidade de q u e
os c o m p o s t o s s e j a m voláteis o b a s t a n t e p a r a p e r m i t i r a transfe-
rência da fase sólida para o gás c a r r e a d o r móvel e, desta m a n e i r a ,
ser e l u í d o da c o l u n a analítica para o detector. E m b o r a m u i t o s
c o m p o s t o s biológicos sejam passíveis de separação cromatográfica
c o m a C G , u m n ú m e r o m a i o r ainda de c o m p o s t o s é m u i t o polar
o u seu t a m a n h o é g r a n d e d e m a i s para ser analisado p o r esta
técnica.
E s p e c t r o # 1 O B C [BP = 2 1 3 9 . 0 , 2 3 5 8 8 ]
100
901
a) 80
n 70 13XS.V;
TJ
in 60
jÜ 50 eTCjCttS
- 401 t:ri
£ 30 !• >» icui
5° 20 9 5 - » Ü'J
X.JJJL
2154.990
10 lfc88.66B l |1824."7SI35 ' 23^2.02 46!
' í í J È %—
CD
C\J CO
to CM in co
CO LTl cn
M a s s a (m/z)
Figura 8 - 9 U m e x e m p l o de u m espectro M A L D I - T O F e x i b i n d o
p e p t i d i o s gerados n u m digerido tríptico d e u m p o n t o central a p a u i r de
u m gel SDS-PAGE, 2-D.
Espectrometria de Massas (LC-MS)
E m c o m p a r a ç ã o c o m a c r o m a t o g r a f i a gasosa, a i n t e r f a c e dos
c r o m a t ó g r a f o s líquidos c o m os e s p e c t r ó m e t r o s de massa é mais
difícil p o r q u e os analitos estão diluídos n u m l í q u i d o e n ã o n o
gás. Isto causa dificuldades para o sistema de b o m b e a m e n t o a
v á c u o d o e s p e c t r ô m e t r o de massas. C o m o foi d i s c u t i d o anterior-
m e n t e , diversas técnicas d e i n t e r f a c e f o r a m desenvolvidas paTa
associação e n t r e u m c r o m a t ó g r a f o l í q u i d o e u m e s p e c t r ô m e t r o
de massas, p e r m i t i n d o a aplicação bem-sucedida de H P L C - M S e
H P L C - M S / M S para u m a g r a n d e v a r i e d a d e de c o m p o s t o s . E m
teoria, d e s d e q u e o c o m p o s t o esteja d i l u í d o n u m l í q u i d o , é pos-
sível introduzi-lo n u m sistema H P L C - M S . Assim, analitos polares
e n ã o polares, e c o m p o s t o s c o m g r a n d e peso molecular, c o m o as
p r o t e í n a s , são analisados p o r m e i o desta técnica.
U m a área i m p o r t a n t e e m q u e a H P L C - M S / M S é clinica-
m e n t e usada é a d e t e c ç ã o e a c o n f i r m a ç ã o de alterações genéticas
e d o s erros inatos d o m e t a b o l i s m o . 4 A capacid ade d e analisar
c o m p o s t o s m ú l t i p l o s n u m a ú n i c a corrida analítica faz desta
técnica u m a f e r r a m e n t a eficaz p a r a detecção. Por e x e m p l o , a M S
c o m eletTospTãy (eletronebulização) e m tandem se t o r n o u o m é t o d o
de referência r e c o n h e c i d o , n a análise da c a r n i t i n a e acilcarnitina
p a r a identificar acidemias orgânicas e defeitos d e oxidação de
ácidos graxos. T a m b é m é u m a f e r r a m e n t a excelente n a análise de
a m i n o á c i d o s , usada p a r a diagnosticar diversos erros inatos d o
m e t a b o l i s m o . N o caso da análise d e c a r n i t i n a e d e a m i n o á c i d o s ,
estes c o m p o s t o s variam na sua p o l a r i d a d e , o q u e causa p r o b l e m a s
c o m a consistência d o s fatores d e resposta. Para resolver esta
q u e s t ã o , alguns p r o c e d i m e n t o s e m p r e g a m u m a derivação butil-
éster d o g r u p o carboxila para forçar u m caráter c a t i ô n i c o sobre
os a m i n o á c i d o s e produzir, desta m a n e i r a , deficiências d e ioniza-
ção s e m e l h a n t e s para estes c o m p o s t o s . F o r a m descritos testes
p a r a acilcarnitinas e a m i n o á c i d o s q u e n ã o r e q u e r e m derivação. 5 , 2 0
O u t r o s c o m p o s t o s c l i n i c a m e n t e relevantes passíveis d e análise
pela H P L C - M S i n c l u e m i m u n o s s u p r e s s o r e s , anti-retrovirais,
a m i n a s biogênicas, ácido m e t i m a l ô n i c o e diversos h o r m ô n i o s
esteróides. 1,2,10,14
Espectrometria de M a s s a s MALDI-TOF
A M A L D I - T O F foi usada para analisar u m g r a n d e n ú m e r o d e
classes diferentes d e c o m p o s t o s . Seu uso se e n q u a d r a e m u m a
das três g r a n d e s categorias a seguir: (1) detecção de u m c o m p o s t o
ou mais, e m particular, (2) identificação d e proteína(s) (Figura
8-9), o u (3) i d e n t i f i c a ç ã o de u m o r g a n i s m o . O s requisitos para a
i d e n t i f i c a ç ã o de u m a p e q u e n a m o l é c u l a p e l o M A L D I são: (1) a
m o l é c u l a deve co-cristalizar c o m a matriz, s e m reagir; (2) ser capaz
de ser r e m o v i d a da matriz e; (3) f o r m a r u m íon ou u m a d u t o
capaz d e ser d e t e c t a d o . A p e s a r d e a M A L D I ser simples e r á p i d a ,
o u t r a s técnicas de M S e n ã o M S f r e q ü e n t e m e n t e são t ã o boas ou
até m e s m o m e l h o r e s para a análise d e p e q u e n a s moléculas, espe-
c i a l m e n t e se o interesse residir n a análise quantitativa.
M A L D I - T O F t a m b é m foi u s a d a n a identificação d e organis-
m o s , c o m o bactérias. Foi descrito u m m é t o d o q u e t e n t a identi-
ficar bactérias p o r m e i o de u m m a p a de identificação {fingerprin-
ting) de p r o t e í n a s extraídas s o b c o n d i ç õ e s mais suaves. 1 * A base
2380.0219
,2332.024® desta técnica é q u e bactérias diferentes d e v e m expressar p r o t e í n a s
-- ^ —
ú n i c a s na faixa d e massa entre 2 a 2 0 k D a , p e r m i t i n d o sua clas-
sificação de acordo c o m o seu /mgerfirmtíng de massa protéica. O s
principais p r o b l e m a s 1 8 são: a ausência d e u m a i n f o r m a ç ã o real
m
<M
da massa protéica p a r a várias bactérias e a falta de investigação
das diferentes cepas da m e s m a bactéria. O s m a p a s d e identifica-
ção das massas das proteínas devem ser catalogados p a r a cada
bactéria e d e t e r m i n a d o s de m o d o a ser c o m p l e t a m e n t e r e p r o d u -
zíveis para u m d e t e r m i n a d o m é t o d o de extração. A l é m d o mais,

há n e c e s s i d a d e d e m a i s e s c u d o s sobre as m u d a n ç a s n o nível das
proteínas entre d i f e r e n t e s cepas o u i s o l a d o s s u p o s t a m e n t e da
m e s m a bactéria.
Espectrometria d e M a s s a s SELDI
A S E L D I - M S foi usada na análise d e marcadores b i o l ó g i c o s de
d o e n ç a s . A p r e missa básica é q u e o d i a g n ó s t i c o d o e s t a d o pato-
lógico p o d e ser feito p e l a m o n i t o r a ç ã o à distância d o sítio real
da d o e n ç a — na m a i o r i a das vezes n o soro, urina o u n o líqu i d o
cerebrospinal. A s p r o t e í n a s são purificadas por a f i n i d a d e a partir
do f l u i d o b i o l ó g i c o , e o s m a r c a d o r e s são i d e n t i f i c a d o s c o m b a s e
n u m a g r a n d e diferença de a b u n d â n c i a entre o c o n t r o l e e a
d o e n ç a . Estes m a r c a d o r e s n e m m e s m o s ã o i d e n t i f i c a d o s n o s está-
dios iniciais d o teste. O p o d e r da t e c n o l o g i a é a c a p a c i d a d e d e
identificação rápida d e m ú l t i p l o s m a r c a d o r e s b i o l ó g i c o s e m
potencial q u e p o d e m ser u s a d o s e m c o n j u n t o , c o m o u m a ferra-
m e n t a de d i a g n ó s t i c o — a l t a m e n t e preferível a m u i t o s d o s testes
isolados para marcadores b i o l ó g i c o s e m u s o a t u a l m e n t e .
Espectrometria d e M a s s a s ICP
3 ICP-MS é usada n a d e t e r m i n a ç ã o d e traços de e l e m e n t o s e m
diversos tipos de amostras. N o e n t a n t o , sabe-se que a toxicidade de
j m e l e m e n t o p o d e d e p e n d e i d o estado orgânico o u inorgânico e m
que o e l e m e n t o está presente. N e s t e s casos, é mais importante se
assegurar das concentrações das espécies tóxicas do q u e da c o n c e n -
Tação total d o e l e m e n t o . Para estender a utilidade desta técnica, os
sistemas de C G e H P L C a t u a l m e n t e estão s e n d o associados c o m
iCP-MS para separar espécies elementares individuais antes da
málise pelo ICP-MS. 1 2 C o m o ocorre c o m qualquer m é t o d o analí-
:ico, o ICP-MS é passível de sofrer interferências. U m exemplo
:ípico é que o A r O + apresenta u m m/x de 56 q u e interfere c o m o
Drincípio i s ó t o p o d o Fe'. D u a s s o l u ç õ e s para este tipo de problema
ião: (1) espectrómetros de massas de alta resolução que resolvem as
pequenas (subdalton) diferenças de massa entre os analiros-alvo e
is interferências; o u (2) a reação celular dinâmica, que remove
quimicamente o c o m p o s t o que provoca a interferência.
Proteômica
\los ú l t i m o s 2 0 a n o s , v i m o s u m e n o r m e progresso e m g e n ô m i c a
:om centenas de genomas completos o u quase completos.
C o n t u d o , esta i n f o r m a ç ã o m u i t a s vezes n ã o f o r n e c e u u m a ampla
: o m p r e e n s ã o da f u n ç ã o celular — p r i n c i p a l m e n t e e m vista da
n i r í a d e de m u d a n ç a s q u e o c o r r e m c o m as proteínas produzidas
i partir d o g e n o m a d u r a n t e t o d o o ciclo d e vida de u m a célula.
\ía m e t a d e da d é c a d a de 1 9 9 0 , a M S v e i o para a vanguarda das
écnicas analíticas usadas n o e s t u d o das proteínas, q u a n d o o
e r m o p r o t e ô m i c a foi criado. A p e s a r de a d e f i n i ç ã o ainda ser
questionada, a p r o t e ô m i c a , n o s e u s e n t i d o m a i s a m p l o , abrange
d c o n h e c i m e n t o de (1) estrutura, (2) f u n ç ã o e (3) expressão de
o d a s as proteínas n o s c o n t e x t o s b i o q u í m i c o s o u b i o l ó g i c o s de
o d o s o s o r g a n i s m o s . 8 N u m s e n t i d o mais básico e prático, a
proteômica se refere à i d e n t i f i c a ç ã o e q u a n t i f i c a ç ã o das proteínas
: suas m o d i f i c a ç õ e s p ó s - t r a d u c i o n a i s n u m d e t e r m i n a d o sistema
o u sistemas). Esta é u m a tarefa d e s a f i a d o r a p o r q u e cada g e n e
ipresenta, e m potencial, 100 o u mais i s o f o r m a s q u i m i c a m e n t e
listintas de proteínas. A l é m d i s s o , m u i t a s outras m o l é c u l a s
metais, l i p í d i o s etc.) i n t e r a g e m de m o d o n ã o c o v a l e n t e c o m
uroteínas. C o n s e q ü e n t e m e n t e , n u m g e n o m a c o m o o h u m a n o ,
) o d e haver u m r e p e r t ó r i o de m i l h õ e s d e "proteínas" q u e preci-
a m ser identificadas e q u a n t i f i c a d a s .
Espectrometria d e M a s s a s C A P Í T U L O 8 141
A t u a l m e n t e , a M S é u s a d a c o m o Totina para realizar diversas
tarefas e m p r o t e ô m i c a . A tarefa mais básica é a i d e n t i f i c a ç ã o d a
p roteín a. A a b o r d a g e m típica é c o n h e c i d a c o m o m é t o d o "bottom-
up", o n d e as proteínas são separadas — t a n t o pela eletroforese e m
gel q u a n t o por m é t o d o s b a s e a d o s e m s o l u ç ã o — e e n t ã o d i g e r i d o s .
O s f r a g m e n t o s resultantes são a n a l i s a d o s e utilizados para iden-
tificar a(s) proteína(s) presenre(s). Este p r o c e s s o é d e m o r a d o e
apresenta diversos imprevistos. C a d a vez mais m u i t a p e s q u i s a é
dirigida à análise d e misturas de proteínas. A p e s a r d e s o l u c i o n a r
m u i t o s d o s p r o b l e m a s a s s o c i a d o s à análise das p r o t e í n a s isoladas
por gel, esta t é c n i c a sofre u m a g r a n d e d e s v a n t a g e m — a c o m p l e -
xidade. Atualmente, n e m a instrumentação n e m o programa de
análise s ã o a v a n ç a d o s o s u f i c i e n t e para identificar f a c i l m e n t e
todas as proteínas n u m a mistura r e a l m e n t e c o m p l e x a . C o m o
resultado, c o l o c o u - s e m u i t a ênfase n o s m é t o d o s de separação d e
proteínas e / o u p e p t í d i o s . M u i t o s g r u p o s i n t r o d u z i r a m m é t o d o s
para começaT a lidar c o m este nível d e c o m p l e x i d a d e . As aborda-
gens mais populares são: (1) f r a c i o n a m e n t o subcelular, (2) cro-
matografia m u l t i d i m e n s i o n a l , e (3) marcação p o r a f i n i d a d e e / o u
purificação. C o m a associação destas abordagens, diversos milha-
res de e s p é c i e s d e p r o t e í n a s foram i d e n t i f i c a d o s . O b v i a m e n t e
estes n ú m e r o s são m e l h o r e s d o q u e o s m é t o d o s "battom-ufi" d o s
géis, mas a i n d a estão l o n g e d o q u e é necessário para u m a prote-
ômica completa.
A s d u a s ú l t i m a s áreas q u e p r e c i s a m ser a b o r d a d a s são: a
q u a n t i f i c a ç ã o e o s e q ü e n c i a m e n t o de novo e / o u m o d i f i c a ç õ e s
pós-tTaducionais. E m p r i m e i r o lugat, a maioria das p r o t e í n a s
i d e n t i f i c a d a s deve ser q u a n t i f i c a d a e m relação a m u d a n ç a s n o
e s t a d o o u tipo celular. A q u a n t i f i c a ç ã o n a M S para esta finali-
d a d e é relativa e requer u m a c o m p a r a ç ã o entre u m a c o n d i ç ã o
padrão e u m a alterada. A s técnicas atuais nesta área a i n d a e s t ã o
na fase d e d e s e n v o l v i m e n t o , mas g e r a l m e n t e e n v o l v e m a marca-
ção t a n t o de u m s u b g r u p o de p e p t í d i o s ( i s ó t o p o - c o d i f i c a d o c o m
marcação de a f i n i d a d e ) q u a n t o de t o d o s o s p e p t í d i o s ( m a r c a ç ã o
metabólica). A p e s a r de haver alguns p r o b l e m a s c o m a marcação,
o m a i o r deles — c o m o o d e i d e n t i f i c a ç ã o — e n v o l v e a c o m p l e x i -
d a d e absoluta da amostra a ser analisada. O s e g u n d o p r o b l e m a
é i g u a l m e n t e d i s t i n t o e r e l a c i o n a d o . A s m o d i f i c a ç õ e s pós-tradu-
c i o n a i s são, c l a r a m e n t e , o principal m e c a n i s m o de c o n t r o l e n a s
células. A espectrometria de massas é ímpar c o m o u m a t é c n i c a
q u e t a n t o identifica q u a n t o localiza e x a t a m e n t e u m a m o d i f i c a -
ção. C o n t u d o , o programa para a u t o m a t i z a ç ã o deste p r o c e s s o
ainda é m u i t o precário n a c a p a c i d a d e d e coletar o s dados. O q u e
falta é u m programa para o s e q ü e n c i a m e n t o de novo q u e inter-
prete u m espectro d e massa c o m p o u c a o u n e n h u m a i n t e r v e n ç ã o
d o usuário, e s p e c i a l m e n t e na área d e m o d i f i c a ç õ e s pós-traducio-
nais. A t u a l m e n t e , a m a i o r i a d o s espectros m o d i f i c a d o s é inter-
pretada de f o r m a m a n u a l por especialistas a l t a m e n t e t r e i n a d o s
e m e s p e c t r o m e t r i a de massas, a c r e s c e n t a n d o dias o u até m e s m o
s e m a n a s de t e m p o para a análise por amostra. Estes d o i s proble-
mas, a l é m da c o m p l e x i d a d e da amostra, precisam ser resolvidos
antes que a p r o t e ô m i c a evolua para u m c a m p o m a d u r o .
T o d a s estas q u e s t õ e s são abordadas e m diversos trabalhos,
t o d o s os meses, n a s p u b l i c a ç õ e s d e s d e a Vroteomia até a Clinicai
Chemistry. A p e s a r d e u m a listagem e x t e n s a ser impossível, e x i s t e m
diversas revisões o u referências de o p i n i ã o q u e r e p r e s e n t a m
p o n t o s d e b o m p a d r ã o para e x p l o r a ç ã o d o m u n d o da p r o t e ô -
mica, e m rápida mudança. 1 1 , 1 3 , 1 6 A p r o t e ô m i c a , c o m o é praticada
a t u a l m e n t e , n ã o é algo a ser u s a d o para a análise d e rotina de
amostTas de p a c i e n t e s , mas é d e interesse e m l o n g o t e r m o para
d e s c o b e r t a s q u e sejam p o t e n c i a l m e n t e capazes de produzir,
algumas das quais p o d e n d o f i n a l m e n t e vir a ser e m p r e g a d a s n o
laboratório clínico.
142 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
REFERÊNCIAS
1. Ceglarek U, Lembcke J, FiedieT GM, Werner M, Wirzigmann H, Hauss
JP, Thiery ]. Rapicl simultaneous quantification of immunosuppressants
iri transplant patients by turbulent flow chromatography combined with
tandem mass spectrometry. Clin Chim Acta 2004;346T81-90.
2. Colombo S, Bcguin A, Biollaz J, Bnclin T, Rochat B, Decosterd LA.
Intracellular measurements of antí-HIV drugs indinavir, amprenavir,
saquinavir, ti to ri avir, nelfinavir, lopinavir, atazanavir, efavirenz and
nevirapine in penpheral blood mononucleai cclls by liquid
chiomatography coupled to tandem mass speccromecry. ] Chiomatogr B
Analyt Technol Biomed Life Sei 2005;819:259-76
3. Fenn ]B, Electrospray wings foi molecular elephants {Nobel Lecture).
Angew Chem Int Ed Engl 2003 Aug 25;42:3871-94.
4- Garg TJ, Dasouki M Expanded newbom screening of inherited
metabolic disorders by tandem mass spectrometry: clinicai and
iaboratory aspects Clin Biochem 2006;39.315-32.
5 Ghoshal AK, Guo T, Soukhova N, Soldin SJ. Rapid measuremenr of
plasma acylcatnitines by liquid chromatography-f andem mass
spectrometry with o ut deriva tizarion. Clin Chim Acta 2005;358:
104-12
6 Issaq H, Veenstra T, Conrads T, Felschow D The SELDI-TOF approach
to proteomics Protein profiling and biomarker identification Biochem
Biophys Res C o m m u n 2002;292:587-92.
7. Karas M, Bachmann D, Bahr U, Hillenkamp E Matrtx-assisted
ultraviolet laser desorption of non-volatile compounds. Int ] Mass
Spectrom Ion Processes I987;78-53-68
8. Kenyon GL, DeMaiini DM, Fuchs E, Galas D], Kirsch JF, et al.
Defining the mandate of proteomics in the post-genomics era: workshop
report, Mol Celi Proteomics 2002;1:763-80,
9. Kuhara T. Gas chromatographic-mass spectrometric urinary metabolome
analysis to study mucations of inborn errors of metabolism Mass
Spectrom Rev 2005;24:814-27.
10. Kushnir MM, Urry FM, Frank EL, Roberts WL. Analysis of
catecholamines in urine by positive-ion electrospray tandem mass
spectrometry, Clin Chem 2002;48:323-31.
11. Lin D, Tabb DL, Yates ]R III. Large-scale protein identification using
mass spectrometry. Biochim Biophys Acta 2003;1646:1-10.
12. Mandai BK, Ogra Y, Suzuki KT. Specianon of arsenic in human nail and
hair from arsenic-affected area by HPLC-inductively coupled árgon plasma
mass spectrometry Toxicol Appl Pharmacol 2003,189. 73-83.
13. Romijn EP, Krijgsveld ], Heck AIR. Recent liquid chromarographic-
(tandem) mass spectrometric applications in proteomics. J Chromatogr
A 2003;1000:589-608
14 Schmedes A, Brandslund I. Analysis of methylmalonic acid in plasma by
liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem
2006,52:754-7.
15. Tanaka K. The origin of macromolecule ionizarion by laser rrtadiation
(Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl Aug 25, 2003;42 3860-70
16. Tao WA, Aebersold R. Advances in quantitative proteomics via stable
isotope tagging and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol
2003,14.110-18.
17 Todd JFT. Recommendations for nomenclatura and symbolism for mass
spectroscopy IUPAC recommendations 1991. Pure & Appl Chem
1991;63:1541-66.
18. Wang Z, Dunlop K, Long SR, Li L. Mass spectrometric methods for
generation of protein mass database used for bactéria! identification
Anal Chem 2002;74:3174-82.
19. Whitehouse CM, Dreyer RN, Yamashita M, Fenn JB. Electrospray
interface for liquid chromatographs and mass spectrometers. Anal Chem
1985;57:675-9.
20. Zoppa M, Gallo L, Zachello F, Giordano G. Meehod for the
quantification of underivatized amino acids on dcy blood spots from
newbom screening by HPLOESI-MS/MS, ] Chromatogt B
2006;831:267-73
CAPÍTULO 9

Princípios da Enzimologia Clínica*

Renze Bais, Ph.D., A.R.C.P.A., e Mauro Panteghini, M.D.

OBJETIVOS Centro Ativo: A parte da enzima ou de outra proteína na qual

1. Definir enzima e descrever como estas são classificadas de acordo
com suas estruturas ou ações sobre os seus substratos.
2. Definir os seguintes termos:
Sítio ativo
Apoenzima
Holoenzima
Co-fator
Coenzima
Ativador
Cinéticas de primeira ordem e de ordem zero
Km
inibição enzimática (competitiva, não-competitiva, incompetitiva)
3. Descrever as equações de Michaeiis-Menten e de Lineweaver-Burk
e relacioná-las à cinética enzimática pela definição de velocidade
de reação, Vmw e Km.
4. Desenhar e rotular uma curva de Michaeiis-Menten e um gráfico de
Lineweaver-Burk.
5. Listar os fatores que afetam a velocidade de uma reação
enzimática e como os mesmos atingem a cinética enzimática.
6. Citar a forma pela qual cada tipo de inibição afeta a cinética
enzimática e ilustrar como cada um dos três tipos afeta a
velocidade da reação enzimática usando um gráfico de
Lineweaver-Burk.
7. Listar os fatores fisiológicos que afetam os níveis de enzimas do
sangue,
8. Comparar os métodos disponíveis para a análise de enzimas
clinicamente significantes e descrever como a velocidade de uma
reação catalisada por enzima se relaciona com a quantidade de
atividade enzimática presente em um sistema.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
Apoenzima: A parte protéica de uma enzima sem o co-fator
necessário para a catálise.
Ativador: Uma molécula efetora que aumenta a atividade
catalítica de uma enzima quando esca se liga a um sítio
específico.
Atividade Catalítica: A propriedade de um catalisador que é
medida pela velocidade de conversão catalisada de uma
reação química específica produzida em um sistema de
ensaio específico.
Catalisador: U m a substância que aumenta a velocidade de uma
reação química, mas não é consumida ou modificada por
ela. U m a enzima é um biocatalisador.
*Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições originais do DT.
Donald "W. Moss e de nosso amigo e colega Dr. A. Ralph Henderson (já
falecido), nas quais se baseiam partes deste capítulo.
ocorre a ligação inicial entre o substrato e a enzima para
formar o complexo enzima-substrato intermediário.
Coenzima: Uma substância difusível, termolábíl, de baixo peso
molecular que, quando combinada a uma proteína inativa
denominada apoenzima, forma um composto ativo ou uma
enzima completa denominada holoenzima.
Constante de Michaeiis-Menten (K m ): Definida,
operacionalmente, como a concentração de substrato que
permite que uma reação enzimática proceda com a metade
de sua velocidade máxima.
Desnaturação: Alteração parcial ou total da estrutura de uma
proteína, sem mudança da estrutura covalente, pela ação de
certos procedimentos físicos (aquecimento, agitação) ou de
agentes químicos. A desnaturação é reversível ou
irreversível.
Energia de Ativação: Em enzimologia, é a energia necessária
para uma molécula formar um complexo ativado. Em uma
reação catalisada por enzima, isso corresponde à formação
do complexo enzima-substrato ativado.
Enzima: U m a molécula protéica que catalisa reações químicas
sem ser alterada ou destruída.
Enzimas Imobilizadas: Enzimas solúveis ligadas a uma matriz
insolúvel, orgânica ou inorgânica, ou encapsuladas em uma
membrana para aumentar sua estabilidade e possibilitar seu
uso repetido ou contínuo.
Gráfico de Líneweaver-Burk: Gráfico do recíproco da
velocidade de uma reação catalisada por enzima (ordenada;
eixo y) versus o recíproco da concentração de substrato
(abscissa, eixo x).
Holoenzima: Composto funcional formado pela combinação
de uma apoenzima e sua coenzima apropriada.
Inibidor: U m inibidor é uma substância que diminui a
velocidade de uma reação química; o processo é
denominado inibição.
Isoenzima; U m a enzima de um grupo de enzimas relacionadas
que catalisam a mesma reação, mas que têm diferentes
estruturas moleculares e são caracterizadas por diversas
propriedades físicas, bioquímicas e imunológicas.
Katal: A quantidade de atividade enzimática que converte u m
rnol de substrato por segundo sob condições específicas de
reação.
Monitoramento Contínuo: Uma forma de reação na qual esta
é monitorada continuamente e os dados são apresentados
no m o d o analógico ou digital.
Produto: Substância produzida pela conversão catalisada por
enzima de um substrato.
Reação de Ordem Zero: Reação na qual a velocidade de reação
é independente da concentração de reagente.
Reação de Primeira Ordem: Uma reação na qual a velocidade
de reação é proporcional à concentração de reagente.
Reação de T e m p o Fixo: U m a forma de reação de dois pontos
na qual as medidas são feitas em tempos específicos. Esta

143
 144 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

forma é preferida para ensaios nos quais a velocidade de
reação é de primeira ordem quanto à concentração inicial
de substrato.
Substrato: U m reagente em uma reação catalisada.
U n i d a d e Internacional: A quantidade de enzima que catalisa a
conversão de u m micromol de substrato por m i n u t o sob
condições específicas d o m é t o d o de ensaio.
interesse clínico, identificadas pelos n o m e s triviais, abreviados e
sistemáticos, e pelos seus códigos numéricos.
A l é m disso, uma prática c o m u m e conveniente é usar abre-
viaturas c o m letras maiúsculas para os n o m e s de certas enzimas,
tais c o m o ALT, para alanina aminotransferase, AST, para aspar-
tato aminotransferase, LD, para lactato desidrogenase, c CK,
para creatinoquinase (Tabela 9-1),

PRINCÍPIOS BÁSICOS
Esta seção se inicia c o m a discussão da nomenclatura de enzimas
e prossegue c o m discussões de enzimas c o m o proteínas e catali-
sadores.
Nomenclatura de Enzimas
Historicamente, enzimas individuais foram identificadas u s a n d o
se o n o m e d o substrato o u grupo sobre o qual a enzima age,
adicionando-se, então, o sufixo -ase. A l é m disso, algumas enzimas
receberam n o m e s empíricos, c o m o tripsina, diastase, ptialina,
pepsina e emulsina. Subseqüentemente, a C o m i s s ã o de Enzimas
(EC) da U n i ã o Internacional de Bioquímica (IUB) desenvolveu
u m princípio racional e piálicu para a identificação de enzimas
(http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/).'
C o m o sistema IUB, u m n o m e trivial e um sistemático são
dados para cada enzima. O n o m e sistemático descreve a natureza
da reação catalisada e está associado a uma designação única em
código numérico. O n o m e trivial ou prático, que p o d e ser idên-
tico ao n o m e sistemático, mas freqüentemente é u m a simplifica-
ção dele, é adequado para o uso diário. A designação numérica
única para cada enzima consiste e m quatro números, separados
por pontos. O número tem c o m o prefixo as letras EC, d e n o t a n d o
Enzyme Commisiion- Todas as enzimas são atribuídas a u m a de seis
classes, caracterizadas pelo tipo de reação que catalisam: (1) oxi-
dorredutases, (2) transferases, (3) hidrolases, (4) liases, (5) isome-
rases e (6) Iigases. A Tabela 9-1 lista enzimas selecionadas de
Enzimas c o m o Proteínas
Estrutura Básica
Todas as moléculas de enzimas possuem as estruturas primária,
secundária e terciária características de proteínas (Capítulo 18).
Além disso, a maioria das enzimas t a m b é m exibe um nível qua-
ternário de estrutura. Para muitas enzimas, suas atividades catalí-
tica e biológica requerem duas ou mais cadeias polipeptídicas
dobradas (subunidades) associadas c o m o propósito de formar
uma molécula funcional. O arranjo destas subunidades define a
estrutura quaternária. As subunidades p o d e m ser cópias da mesma
cadeia polipeptídica (homomultímeros [p- ex., c o m o a isoenzima
MM da creatinoquinase, ou a isoenzima H 4 da lactato desidroge-
nase]) o u p o d e m ser polipeptídios distintos (heteTomultímeros).
A atividade catalítica de uma molécula enzimática depende,
geralmente, da integridade de sua estrutura. Qualquer rompi-
mento da estrutura é a c o m p a n h a d o pela perda da atividade, u m
processo c o n h e c i d o c o m o desnaturação. Se o processo de desna-
turação é m í n i m o , ele p o d e ser revertido c o m a recuperação da
atividade enzimática pela retirada d o agente desnaturante. Entre-
tanto, c o n d i ç õ e s desnarurantes prolongadas o u intensas resultam
na perda irreversível de atividade. As condições desnaturantes
incluem: (1) temperaturas elevadas, (2) extremos de p H e (3)
ad içao de compostos químicos. A inativaçao da maioria das
enzimas por calor ocorre a uma velocidade apreciável à tempera-
tura ambiente e, na maioria dos casos, é quase instantânea acima
de 6 0 ° C . As polimerases são u m a exceção e mantêm a atividade
em temperaturas tão altas quanto 90° C . Temperaturas baixas são,
portanto, usadas paTa preservar a atividade enzimática, especial-

r
TABELA 9 - 1 N ú m e r o s da C o m i s s ã o d e E n z i m a s (EC), N o m e s Sistemáticos e Triviais, J u n t a m e n t e c o m as Abreviações
F r e q ü e n t e m e n t e A d o t a d a s das E n z i m a s d e M a i o r I m p o r t â n c i a D i a g n o s t i c a

Número EC Nome Sistemática Nome Trivial Abreviação

1.1.1.27 L-lactato: NAD+ oxidorredutase Lactato desidrogenase LD
1.1,1.49 D-gliccse-6-füsfato; NADP+ oxidorredutase Gliccse-6-fosfato desidrogenase GBPD
1,4.1.3 L-glutamatcr NAD(P)+ oxidorredutase (desaminadora) Glutamato desidrogenase GLD
2.3.2.2 (5-glutamil)-peptidio: aminoácido 5-glutamiltransferase y-GI utam iltransferase GGT
2.6.1.1 L-aspartato: 2-oxoglutarato aminotransferase Aspartato aminotransferase (transa minase) AST
2.6.1.2 L-alanina: 2-oxoglutarato aminotransferase Alanina aminotransferase (transaminase) ALT
2.7.3.2 ATP: creatina W-fosfotransferase Creatinoquinase CK
3.1.1.3 Triacilglicerol acil-hidrolase Lipase LIP
3.1.1.7 Acetilcolina acetil-hidrolase Acetilcolinesterase, colinesterase verdadeira, —

colinesterase 1
3.1.1.8 Acilcolina acil-hidrolase Pseudocolinesterase, hutiril colinesterase, CHE
colinesterase II (colinesterase sérica)
3.1.3.1 Ortolosfórico-mono Éster fosfo-hidrolase (ótimo alcalino) Fosfatase alcalina ALP
3.1.3.2 Ortolosfóricü-monoáster losfo-hldrolase (ótimo ácido) Fosfatase ácida ACP
3.1.3.5 5'-ritioruclea1ídeo fcsío-hidrolase 5'-Mucleotidase NTP
3.2.1.1 1,4-ot-D-glucano glucano-fiidrolase Amilase AMY
3.4.21.1 Químiotripsina CHY
3.4.21.4 Tripsina TRY
3.4.21.36 Elastase-1 E1
 Princípios da Enzimologia Clínica
m e n t e e m soluções a q u o s a s c o m o o soro. E x t r e m o s de p H
t a m b é m c a u s a m o d e s e n r o l a m e n t o das e s t r u t u r a s m o l e c u l a r e s
das enzimas e, exceto para p o u c a s exceções, d e v e m ser evitados
n a p r e s e r v a ç ã o d e a m o s t r a s enzimáticas. A a d i ç ã o de c o m p o s t o s
q u i m i c o s , c o m o a uréia e c o m p o s t o s r e l a c i o n a d o s , r o m p e as
p o n t e s de h i d r o g ê n i o e as interações h i d r o f ó b i c a s , d e f o r m a q u e
a exposição d e enzimas a soluções c o n c e n t r a d a s desses reagentes
resulta e m inativação.
Isoenzimas e Outras Formas Múltiplas de Enzimas
I s o e n z i m a s são formas múltiplas de u m a enzima q u e p o s s u e m a
c a p a c i d a d e de catalisar a reação característica da e n z i m a , m a s
d i f e r e m e m e s t r u t u r a u m a vez q u e são codificadas p o r genes
e s t r u t u r a i s distintos.* Essas variantes enzimáticas p o d e m o c o r r e r
d e n t r o de u m ú n i c o órgão, ou m e s m o d e n t r o d e u m ú n i c o tipo
celular. Elas f r e q ü e n t e m e n t e t ê m diferenças quantificáveis signi-
ficativas n a atividade catalítica. E n t r e t a n t o , t o d a s as f o r m a s de
u m a e n z i m a e m p a r t i c u l a r p o s s u e m a c a p a c i d a d e d e catalisar sua
reação característica.
Origens Genéticas de Variantes Enzimáticas
As isoenzimas verdadeiras são o c a s i o n a d a s pela existência de mais
de u m locus gênico q u e codifica a e s t r u t u r a d a p r o t e í n a enzimá-
tica. M u i t a s enzimas h u m a n a s (talvez m a i s d o q u e u m terço) são
c o n h e c i d a s p o r serem d e t e r m i n a d a s p o r mais d o q u e u m locus
gênico estrutural. O s genes e m d i f e r e n t e s loci s o f r e r a m modifica-
ções d u r a n t e o curso da evolução d e tal f o r m a q u e as p r o t e í n a s
enzimáticas codificadas p o r eles n ã o t ê m e s t r u t u r a s idênticas.
O s m ú l t i p l o s genes q u e d e t e r m i n a m u m g r u p o p a r t i c u l a r de
isoenzimas n ã o estão n e c e s s a r i a m e n t e ligados de f o r m a í n t i m a
e m u m cromossomo-, eles estão f r e q u e n t e m e n t e localizados e m
c r o m o s s o m o s diferentes. Por exemplo, a m b o s os genes e s t r u t u r a i s
q u e c o d i f i c a m as amilases salivar e p a n c r e á t i c a estão localizados
n o c r o m o s s o m o 1, e n q u a n t o os genes q u e c o d i f i c a m as m a l a t o
d e s i d r o g e n a s e s m i t o c o n d r i a l e citoplasmática estão localizados
n o s c r o m o s s o m o s 7 e 2, r e s p e c t i v a m e n t e . E n t r e as enzimas de
i m p o r t â n c i a clínica q u e existem c o m o isoenzimas, e m v i r t u d e da
p r e s e n ç a d e m ú l t i p l o s loci genicos, estão a lactato desidrogenase,
a c r e a t i n o q u i n a s e , a a - a m i l a s e e algumas f o r m a s d e fosfatase
alcalina.
O u t r a categoria de f o r m a s m o l e c u l a r e s m ú l t i p l a s surge
q u a n d o as enzimas são olígoméricas e c o n s i s t e m e m m o l é c u l a s
c o m p o s t a s de s u b u n i d a d e s . A associação de d i f e r e n t e s tipos de
s u b u n i d a d e s e m diversas c o m b i n a ç õ e s gera u m a v a r i e d a d e de
m o l é c u l a s de enzimas ativas. Q u a n d o as s u b u n i d a d e s são deriva-
das de genes e s t r u t u r a i s distintos, d e m ú l t i p l o s loci o u d e múlti-
plos alelos, as moléculas h í b r i d a s e n t ã o f o r m a d a s são c h a m a d a s
lioen^imcís híbridas. A c a p a c i d a d e d e f o r m a r isoenzimas h í b r i d a s é
u m a evidência de similaridades e s t r u t u r a i s consideráveis e n t r e as
d i f e r e n t e s s u b u n i d a d e s . As isoenzimas h í b r i d a s são t a m b é m for-
m a d a s m vitra e in vivo, em células nas q u a i s os d i f e r e n t e s tipos
de s u b u n i d a d e s c o n s t i t u i n t e s estão presentes n o m e s m o compar-
t i m e n t o subcelular.
O n ú m e r o de d i f e r e n t e s isoenzimas híbridas q u e são f o r m a -
das a p a r t i r d e dois pTotômeros n ã o - i d ê n t i c o s d e p e n d e d o n ú m e r o
d e s u b u n i d a d e s n a molécula enzimática c o m p l e t a . Para u m a
e n z i m a d i m é r i c a , é f o r m a d o u m d í m e r o misto (isoenzima híbrida).
Se a e n z i m a é u m t e t r â m e r o , três enzimas heteropoliméTicas
p o d e m ser f o r m a d a s . E x e m p l o s de isoenzimas h i b r i d a s são os
*A IUB recomenda que o termo "isoenzima" seja restrito a formas que se
originam de genes que codificam as estruturas das proteínas enzimáticas em
questão.
CAPÍTULO 9 145
d í m e r o s M B mistos de c r e a t i n o q u i n a s e (CK-MB) e as três isoen-
zimas híbridas, LD-2, LD-3 e LD-4, da lactato d e s i d r o g e n a s e .
Causas Nao-genéticas de Formas Múltiplas de Enzimas
M u i t o s tipos d i f e r e n t e s de m o d i f i c a ç õ e s p ó s - t r a d u c i o n a i s de
m o l é c u l a s enzimáticas geram m ú l t i p l a s f o r m a s q u e são c o m u -
m e n t e c o n h e c i d a s c o m o isoformas (Figura 9-1). T e m sido mos-
t r a d o q u e vários desses processos c a u s a m a h e t e r o g e n e i d a d e d e
várias enzimas, n a matéria viva ou c o m o r e s u l t a d o d e m u d a n ç a s
o c o r r i d a s d u r a n t e extração o u a r m a z e n a m e n t o .
Sabe-se q u e as m o d i f i c a ç õ e s dos r e s í d u o s n a s cadeias polipep-
tídicas de m o l é c u l a s enzimáticas o c o r r e m nas células vivas p a r a
gerar m ú l t i p l a s f o r m a s Por e x e m p l o , a r e m o ç ã o d e g r u p o s a m i d a
é responsável p o r p a r t e d a h e t e r o g e n e i d a d e d a amilase e d a ani-
drase c a r b ô n i c a (cada u m a destas enzimas t a m b é m existe c o m o
isoenzima verdadeira). A m o d i f i c a ç ã o t a m b é m o c o r r e c o m o resul-
t a d o d e p r o c e d i m e n t o s d e extração. M u i t a s enzimas dos eritróci-
tos, inclusive a d e n o s i n a d e s a m i n a s e , fosfatase ácida e a l g u m a s
f o r m a s d e fosfoglicomutase, c o n t ê m g r u p o s sulfidrila q u e são
susceptíveis à oxidação, r e s u l t a n d o e m m o l é c u l a s enzimáticas
variantes c o m carga m o l e c u l a r alterada.
M u d a n ç a s q u e a f e t a m os c o m p o n e n t e s não-protéicos das
moléculas enzimáticas t a m b é m p o d e m c o n t r i b u i r p a r a a hetero-
g e n e i d a d e m o l e c u l a r . Por e x e m p l o , m u i t a s enzimas são glicopro-
teinas, e variações n a s cadeias laterais d e c a r b o i d r a t o s são u m a
causa c o m u m de falta de h o m o g e n e i d a d e nas p r e p a r a ç õ e s dessas
enzimas. A l g u m a s p o r ç õ e s de c a r b o i d r a t o , e s p e c i a l m e n t e ácido
N - a c e t i l n e u r a m í n i c o (ácido siálico), são f o r t e m e n t e ionizadas e,
c o n s e q ü e n t e m e n t e , têm u m p r o f u n d o efeito sobre algumas pro-
p r i e d a d e s das m o l é c u l a s d e enzimas. Por exemplo, a r e m o ç ã o de
g r u p o s d e ácido siálico t e r m i n a i s da fosfatase alcalina h u m a n a
h e p á t i c a e / o u óssea c o m n e u r a m i n i d a s e reduz m u i t o a heteroge-
n e i d a d e eletroforética d a e n z i m a .
A agregação de m o l é c u l a s enzimáticas u m a s c o m as o u t r a s ou
c o m p r o t e í n a s não-enzimáticas p o d e originar f o r m a s m ú l t i p l a s
q u e são separadas p o r técnicas q u e d e p e n d e m d e diferenças dos
t a m a n h o s moleculares. Por e x e m p l o , q u a t r o c o m p o n e n t e s d e
colinesteiase c a t a l i t i c a m e n t e ativos c o m pesos m o l e c u l a r e s q u e
v a r i a m d e cerca d e 8 0 . 0 0 0 a 3 4 0 . 0 0 0 D a são e n c o n t r a d o s n a
m a i o r i a d o s soros, c o m o c o m p o n e n t e mais p e s a d o , C 4 , contri-
b u i n d o p a r a a m a i o r p a r t e d a atividade enzimática.
Distribuição de Isoenzimas e Outras Formas Múltiplas de Enzimas
A d i s t r i b u i ç ã o d e isoenzimas n ã o é u n i f o r m e p o r t o d o o c o r p o ,
e variações e n o r m e s n a a t i v i d a d e d e d i f e r e n t e s isoenzimas são
e n c o n t r a d a s n o s níveis de órgão, celular e subcelular. D i f e r e n ç a s
tecido-específicas t a m b é m são e n c o n t r a d a s n a s d i s t r i b u i ç õ e s de
algumas f o r m a s m ú l t i p l a s de enzimas q u e n ã o são causadas pela
existência de m ú l t i p l o s loci g ê m e o s .
Mudanças na Distribuição de Isoenzimas durante o
Desenvolvimento e Doenças
O s loci gênicos m ú l t i p l o s e suas isoenzimas r e s u l t a n t e s f o r n e c e m
u m m e i o para a a d a p t a ç ã o d e p a d r õ e s m e t a b ó l i c o s às necessi-
dades de m u d a n ç a de d i f e r e n t e s órgãos e tecidos n o c u r s o d o
d e s e n v o l v i m e n t o n o r m a l ou e m resposta a m u d a n ç a s a m b i e n t a i s .
Sabe-se q u e c o n d i ç õ e s patológicas t a m b é m estão associadas a
alterações das atividades d e isoenzimas específicas.
O s p a d r õ e s de vários g r u p o s d e isoenzimas m u d a m d u r a n t e
o d e s e n v o l v i m e n t o n o r m a l e m tecidos de m u i t a s espécies. Por
exemplo, as m u d a n ç a s nas p r o p o r ç õ e s relativas de várias isoenzi-
mas são n o t a d a s d u r a n t e o d e s e n v o l v i m e n t o e m b r i o n á r i o d o
m ú s c u l o esquelético. As p r o p o r ç õ e s das isoenzimas q u e m i g r a m
m a i s e m direção ao c á t o d o n a eletroforese, t a n t o de L D q u a n t o
146 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
Figura 9-1 Modificações não-genéticas q u e podem gerar múltiplas formas de enzimas (isoformas). (De Moss
DW- Isoenzymes. London, C h a p m a n Sj_ Hall, 1982, com a gentil permissão de Springer Science and Business
Media.)
d e C K , a u m e n t a m progressivamente neste tecido, até aproxima-
d a m e n t e o sexto mês d e vida intra-uterina, q u a n d o o p a d r ã o se
assemelha à q u e l e d o m ú s c u l o d i f e r e n c i a d o . M u d a n ç a s q u a n t i t a -
tivas m e n o r e s n a distribuição d e isoenzimas p o d e m c o n t i n u a r até
o n a s c i m e n t o e o início da v i d a pós-natal.
O fígado t a m b é m mostra m u d a n ç a s características nos padrões
de várias isoenzimas d u r a n t e a embriogênese. N o início d o desen-
volvimento fetal, três isoenzimas da aldolase, A, B e C, j u n t a m e n t e
com os vários tetrâmeros híbridos, têm sido detectados e m extratos
hepáticos E n t r e t a n t o , ao n a s c i m e n t o — c o m o n o fígado a d u l t o — a
aldolase B é a isoenzima p r e d o m i n a n t e . M u d a n ç a s notáveis n a
distribuição das isoenzimas d e álcool desidrogenase t a m b é m
ocorrem n o fígado h u m a n o d u r a n t e o desenvolvimento pré-natal.
As m u d a n ç a s n o s p a d r õ e s de isoenzimas d u r a n t e o desenvol-
v i m e n t o r e s u l t a m de m u d a n ç a s n a s atividades relativas dos íoci
gênicos d e n t r o de u m t i p o p a r t i c u l a r d e células e m desenvolvi-
m e n t o (p. ex , células musculares). O u t r a s alterações n o b a l a n ç o
de isoenzimas n o o r g a n i s m o c o m o u m t o d o p o d e m derivar de
m u d a n ç a s n o n ú m e r o ou n a atividade d e células q u e c o n t e n h a m
g r a n d e s q u a n t i d a d e s d e u m a isoenzima característica. U m
exemplo é o a u m e n t o d o n ú m e r o e da atividade d o s osteoblastos,
q u e são responsáveis pela mineralização d o esqueleto e n t r e o
início d o p e r í o d o pós-natal e o início d a terceira década de vida.
O excesso d e fosfatase alcalina (ALP) d o s osteoblastos ativos e n t r a
n a circulação, o n d e sua p r e s e n ç a é r e c o n h e c i d a p o r suas proprie-
dades características, e eleva a atividade de A L P sérica total de
pessoas jovens acima da d o s a d u l t o s c o m esqueleto m a d u r o . U m a
A L P d o f í g a d o t a m b é m c o n t r i b u i p a r a a atividade total dessa
e n z i m a n o p l a s m a n o r m a l , e a q u a n t i d a d e desta i s o e n z i m a n o
p l a s m a m o s t r a u m a u m e n t o p e q u e n o e progressivo c o m o avançar
da idade.
C e r t a s doenças, tais c o m o as distrofias m u s c u l a r e s progressi-
vas, p a r e c e m u m a falha d o s tecidos afetados e m a m a d u r e c e r
n o r m a l m e n t e o u e m m a n t e r u m e s t a d o n o r m a l . As células can-
cerosas m o s t r a m u m a p e r d a progressiva d a e s t r u t u r a e d o meta-
b o l i s m o das células saudáveis das quais elas se o r i g i n a m . Por-
t a n t o , o p a d r ã o de isoenzimas d e tecido m a d u r o e d i f e r e n c i a d o
p o d e ser p e r d i d o o u m o d i f i c a d o se a d i f e r e n c i a ç ã o n o r m a l for
i n t e r r o m p i d a ou m u d a d a , e m u i t o s exemplos de m u d a n ç a s d e
isoenzimas associadas a tais processos t ê m sido descritos.
Observa-se t a m b é m q u e as distribuições das isoenzimas d e
aldolase, L D e C K n o s m ú s c u l o s de pacientes c o m di s t t of i a
m u s c u l a r progressiva são similares àquelas d o s estágios iniciais d o
d e s e n v o l v i m e n t o d o m ú s c u l o fetal. As a n o r m a l i d a d e s das isoen-
zimas n o m ú s c u l o c o m d í s t r o f i a t ê m sido i n t e r p r e t a d a s c o m o
u m a falha e m atingir ou m a n t e r u m grau n o r m a l d e diferencia-
ção. O s p a d r õ e s de isoenzimas n o s tecidos e m r e g e n e r a ç ã o
t a m b é m p o d e m m o s t r a r a l g u m a t e n d ê n c i a a se assemelhar às
distribuições fetais. O r e a p a r e c i m e n t o dos p a d r õ e s fetais da dis-
tribuição de isoenzimas t a m b é m é u m a característica da transfor-
m a ç ã o m a l i g n a e m m u i t o s tecidos. Esse f e n ô m e n o foi p r i m e i r a -
m e n t e e s t u d a d o de f o r m a extensiva n o caso das isoenzimas d e
L D . O s t u m o r e s malignos, e m geral, m o s t r a m u m a m u d a n ç a
significativa n o b a l a n ç o d e isoenzimas e m direção às f o r m a s q u e
m i g r a m mais p a r a o c á t o d o n a eletroforese, LD-4 e LD-5. O
declínio n a atividade das i s o e n z i m a s LD-1 e LD-2 resulta e m
p a d r õ e s q u e l e m b r a m aqueles q u e o c o r r e m n o s tecidos e m b r i o -
nários. O s t u m o r e s d e p r ó s t a t a , cérvix, m a m a , cérebro, estômago,
c ó l o n , reto, b r ô n q u i o e l i n f o n o d o s estão e n t r e aqueles q u e
m o s t r a m esta t r a n s f o r m a ç ã o . Por o u t r o lado, gliomas b e n i g n o s
m o s t r a m , c o m p a r a t i v a m e n t e , u m a u m e n t o relativo d e isoenzimas
aniônicas.
 Princípios da Enzimoiogia Clínica
Diferenças de Propriedades entre as Múltiplas Formas de
Enzimas
As diferenças estruturais entre as múltiplas formas de u m a enzima
dão origem a maiores ou m e n o r e s diferenças das propriedades
físico-químicas, tais como (1) mobilidade eletro for ética, (2) resis-
tência à inativaçao e (3) solubilidade, ou das características cata-
líticas, como a velocidade de reação com substratos análogos ou
resposta a inibidores. O s m é t o d o s de análise de isoenzimas têm,
p o r t a n t o , sido desenhados d e forma a investigar u m a ampla
variedade de propriedades catalíticas e estruturais das moléculas
enzimáticas. 6
Técnicas de biologia molecular, c o m o clonagem e seqüencia-
m e n t o de genes, têm revolucionado a investigação das estruturas
primáiias de isoenzimas. As diferenças das estruturas p n m á r i a s
entre isoenzimas, sejam derivadas de íoci gêmeos múltiplos ou de
diferentes alelos, são agora conhecidas para várias enzimas. A l é m
disso, muitas perguntas têm sido respondidas sobre se múltiplas
formas de enzimas r e p r e s e n t a m isoenzimas verdadeiras (genetica-
m e n t e determinadas) ou se o t i g i n a m de modificações pós-tradu-
cionais.
As isoenzimas resultantes da existência de bei gênicos múlti-
plos n o r m a l m e n t e diferem q u a n t i t a t i v a m e n t e e m suas proprieda-
des catalíticas. Essas diferenças p o d e m ser manifestadas em carac-
terísticas c o m o (1) atividade molecular, (2) valores de Kra para o(s)
substrato(s), (3) sensibilidade a vários inibidores e (4) velocidades
relativas de atividade c o m análogos de substratos. Por outro lado,
múltiplas formas enzimáticas q u e se originam de modificações
póS'traducionais, tais c o m o agregação, n o r m a l m e n t e têm proprie-
dades catalíticas similares.
As isoenzimas mwhiíoci n o r m a l m e n t e t a m b é m diferem n a
especificidade antigênica, e m b o r a essas diferenças possam ser
m e n o s p r o n u n c i a d a s entre isoenzimas que surgiram, de forma
relativa, recentemente na história evolutiva e são i n t i m a m e n t e
relacionadas e m estrutura. Reação imunológica cruzada t a m b é m
n ã o é i n c o m u m entre isoenzimas multiíoci. As múltiplas formas
enzimáticas resultantes de modificações pós-síntese freqüente-
m e n t e apresentam d e t e r m i n a n t e s antigênicos c o m u n s . A capaci-
dade de detectar diferenças e n t r e moléculas de isoenzimas anti-
genicamente similares d e p e n d e do grau de especificidade do
a n t i c o r p o monoclonal.
Diferenças n a resistência à desnaturação são c o m u m e n t e
encontradas entre isoenzimas verdadeiras, sejam elas p r o d u t o s
de múltiplos bei ou de múltiplos alelos. O u t r a s formas múltiplas
de enzimas f r e q ü e n t e m e n t e n ã o diferem ou diferem apenas
m u i t o p o u c o a esse respeito. A diferença mais c o m u m e n t e explo-
rada entre isoenzimas é a diferença de carga molecular líquida
que resulta das composições alteradas de aminoácidos das molé-
culas. Esta diferença forma a base de suas separações por eletro-
forese de zona, cromatografia d e troca iônica ou focalização íso-
elétrica.
Enzimas c o m o Catalisadores
U m catalisador é u m a substância que a u m e n t a a velocidade de
u m a reação química em particular, sem que seja c o n s u m i d a ou
p e r m a n e n t e m e n t e alterada. Enzimas são catalisadores protéicos
de origem biológica. Praticamente todas as reações químicas que
ocorrem na matéria viva são catalisadas p o r enzimas específicas.
POTtanto, a vida p o r si só é considerada c o m o u m a série integrada
de reações enzimáticas e algumas doenças c o m o o desarranjo do
p a d r ã o n o r m a l de metabolismo.
Eficiência
Biologicamente, u m d e t e r m i n a d o n ú m e r o de moléculas enzimá-
ticas converte u m n ú m e r o e n o r m e de moléculas de substrato a
CAPÍTULO 9 147
p r o d u t o s d e n t r o de u m curto p e r í o d o de tempo. Portanto, o
aparecimento de q u a n t i d a d e s a u m e n t a d a s de enzimas na cor-
rente sanguínea é facilmente detectado, embora a q u a n t i d a d e de
proteína enzimática liberada de células danificadas seja p e q u e n a
q u a n d o comparada com o nível total de proteínas não-enzimáti-
cas n o sangue. Dessa forma, u m a enzima e m particular é reco-
nhecida por seu efeito característico sobre u m a certa reação
química i n d e p e n d e n t e m e n t e de u m grande excesso de outras
proteínas.
Especificidade e Centro Ativo2
A interação entre a enzima e seu substrato envolve a c o m b i n a ç ã o
de u m a molécula de enzima com u m a molécula de substrato (ou
duas, n o caso de reações bissubstrato), A reação envolve a ligaçao
da molécula de substrato a u m a região especializada da molécula
da enzima, seu c e n t r o ativo. O s vários grupos que são importan-
tes na ligação do substrato estão juntos n o centro ativo, e é lá
q u e ocorre o processo de ativação e transformação do substrato.
A composição e o arranjo espacial d o centro ativo t a m b é m cons-
t i t u e m a base para a especificidade de u m a enzima.
O sítio ativo variará entre as enzimas, mas, em geral:
1. O sítio ativo de u m a enzima é relativamente p e q u e n o se
c o m p a r a d o ao v o l u m e total da molécula enzimática, pois sua
estrutura p o d e envolver m e n o s de 5 % do total de aminoáci-
dos da molécula.
2. O s sítios ativos das enzimas são estruturas tridimensionais
f o r m a d a s c o m o resultado da estrutura terciária global da pro-
teína. Isto resulta dos aminoácidos e co-fatores n o sítio ativo
de u m a enzima, sendo espacialmente estruturados e m u m a
relação exata e tridimensional c o m respeito u m ao outro e à
estrutura da molécula de substrato.
3. N o r m a l m e n t e , a atração entre as moléculas da enzima e as
moléculas de seu substrato é u m a ligação não-covalente. As
forças físicas usadas nesse tipo de ligação incluem (1) p o n t e s
de hidrogênio, (2) interações eletrostáticas e hidrofóbicas e
(3) forças de van der Waals.
4. O s sítios ativos das enzimas c o m u m e n t e ocorrem e m fendas
e frestas na proteína. Isto exclui a massa de solvente e reduz
a atividade catalítica da enzima.
5. A especificidade da ligação d o substrato é u m a f u n ç ã o do
arranjo espacial exato de átomos n o sítio ativo da enzima que
c o m p l e m e n t a a estrutura da molécula de substrato.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
As enzimas a t u a m através da f o r m a ç ã o de u m complexo enzima-
substrato (ES), n o qual u m a molécula de substrato está ligada ao
centro ativo da molécula enzimática. O processo de ligação trans-
forma a molécula de substrato em seu estado ativado. A energia
de ativação ocorre sem a adição d e energia externa de f o r m a que
a barreira de energia para a reação é d i m i n u í d a e a conversão a
p r o d u t o s é acelerada. O complexo ES se desfaz para gerar os
p r o d u t o s da reação (P) e a enzima livre (E):
E + S <; ^ E S ^ P + E /i\
~ .i /
Todas as reações catalisadas por enzimas são, em teoria, reversí-
veis. E n t r e t a n t o , n a prática, sabe-se que a reação é n o r m a l m e n t e
mais rápida e m u m a direção do q u e e m outra, de tal forma que
u m equilíbrio é alcançado q u a n d o o p r o d u t o da reação direta ou
inversa p r e d o m i n a , algumas vezes tão a c e n t u a d a m e n t e q u e a
reação é praticamente irreversível.
Se o p r o d u t o da reação e m u m a direção é removido assim
q u e é f o r m a d o , o equilíbrio d o primeiro processo enzimático será
148 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

deslocado de maneira que a reaçan procederá naquela direção

até sua finalização. As seqüências de reações nas quais o produto
de uma reação catalisada enzimaticamente se torna o substrato
da próxima enzima são características de processos biológicos.
Analiticamente, várias reações enzimáticas p o d e m estar ligadas
para fornecer u m m e i o de medida da atividade da primeira
enzima o u a concentração do substrato inicial da cadeia.
Q u a n d o uma reação secundária catalisada por u m a enzima,
conhecida c o m o u m a reação indicadora, é usada para determinar
a atividade de uma enzima diferente, a reação primária catalisada
pela enzima a ser determinada precisa ser a etapa limitante da
velocidade. As condições são escolhidas para garantir que a velo-
cidade da reação catalisada pela enzima indicadora seja direta-
m e n t e proporcional à velocidade de formação de produto na
primeira reação.

Fatores que Determinam a Velocidade das

8 16 24 32
R e a ç õ e s Catalisadas por Enzimas
O s fatores que afetam a velocidade de reações catalisadas por C o n c e n t r a ç ã o d e s u b s t r a t o e m mol/L x 1 0 ^

enzimas incluem concentrações de enzima e de substrato, pH,

temperatura e presença de inibidores, ativadores, coenzimas e
grupos prostéticos.
Concentração Enzimática
N a reação enzimática representada na equação (1), assume-se que
a reação de equilíbrio entre enzima e substrato é muito rápida,
q u a n d o comparada à quebra de ES em enzima livre e produtos.
Por outro lado, a velocidade global da reação sob condições
constantes é considerada, portanto, proporcional à concentração
d o complexo ES. Desde que u m excesso de moléculas de subs-
trato livre seja mantido, a adição de mais moléculas de enzima
ao sistema de reação aumenta a concentração d o complexo ES e
a velocidade glohal de reação. Esre a u m e n t o é responsável pela
velocidade de reação ser proporcional à concentração de enzima
presente no sistema e é a base para a determinação quantitativa
de enzimas através da medida de velocidades de reação. A s con-
dições de reação são selecionadas para garantir que a velocidade
de reação observada seja proporcional à concentração de enzima
e m uma faixa tão ampla quanto possível.
Concentração de Substrato
A l é m de descrever a dependência da velocidade de reação sobre
a concentração de enzima sob condições em que o excesso de
substrato esteja presente, a formação de u m complexo ES também
explica a relação hiperbólica entre a velocidade de reação e a
concentração de substrato (Figura 9-2). Tais curvas são denomi-
nadas gráficos de Michaeiis-Menten.
Reações de um Único Substrato
Se a concentração enzimática é mantida constante e a concentra-
ção de substrato é variada, a velocidade de reação é quase direta-
m e n t e proporcional à concentração de substrato e m valores
baixos deste último. Sob essas condições, a velocidade da reação
é proporcional e d e p e n d e n t e da concentração de substrato, uma
situação d e n o m i n a d a reação de primeira o r d e m . E m baixas con-
centrações de substrato, s o m e n t e uma fração de enzima está
associada ao substrato, e a velocidade observada reflete a baixa
concentração d o complexo ES. Em altas concentrações de subs-
trato, a velocidade de reação é conhecida c o m o reação d e o r d e m
zero e é independente da concentração de substrato. C o m uma
reação de ordem zero, toda a enzima está ligada ao substrato, e
u m a velocidade de reação muito maior é obtida. A l é m disso,
c o m o toda a enzima está presente na forma do complexo, não é
possível n e n h u m aumento posterior da concentracão do com-
Figura 9 - 2 Curva de Michaeiis-Menten relacionando 3 velocidade
(taxa) de uma reação enzimaticamente catalisada com a concentração de
substrato. O valor de é dado pela concentração de substrato na qual
se o b t é m a metade da velocidade máxima.
plexo e n e n h u m incremento posterior da velocidade de reação.
A velocidade máxima possível para a reação foi alcançada.
U m a curva de Michaeiis-Menten típica é descrita pela
equação*
Vm,[Sl
(2)
K„+[S]
onde é a velocidade que o valor observado da velocidade (u)
atinge e m altos valores de substrato ([S]). Ele aumenta c o m o
a u m e n t o da concentração de enzima. A constante d e Michaeiis-
M e n t e n (Km) é a concentração de substrato na qual v - V m a i / 2 ,
e é u m a constante para u m a determinada enzima que atue sob
determinadas condições. Se u m equilíbrio é estabelecido entre
enzima e substrato, JCm é a constante de equilíbrio dessa reação.
Entretanto, o símbolo K s (constante do substrato) é usado caso
se deseje este significado, e é reservada para o valor de [S]
determinado, experimentalmente, no qual a reação procede à
metade de sua velocidade máxima (<; = V m 3 J 2 ) .
Embora não seja errado estabelecer u m experimento para
determinar a variação de ti com [S], o valor exato de Vmax não é
facilmente determinado a partir de curvas hiperbólicas. A l é m
disso, muitas enzimas se desviam d o c o m p o r t a m e n t o ideal e m
altas concentrações de substrato e, de fato, p o d e m ser inibidas
pelo excesso de substrato, por isso o valor calculado de V msv não
p o d e ser obtido na prática. N o passado, era c o m u m transformar
a equação de Michaeiis-Menten (2) em uma das várias formas
recíprocas, e l/v era graficamente representado contra 1/[S] o u
[S]/v graficamente representado contra [S].
"Uma derivação desta equação é encontrada em Bais R, Panteghini M. Princi-
pies of clinicai eniymology. In: Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. Tietz
textbook of clinicai chemistry and molecular diagnostica, 4rl ed. St Louis:
Saunders, 2006:191-263.

í K_
+•
V [S] V s u b s t r a t o i n i b e a atividade d e u m a o u t r a e n z i m a necessária em
\ «•»
Essa e q u a ç ã o , q u a n d o r e p r e s e n t a d a p o r gráficos, geia u m a
l i n h a reta q u e intercepta e m 1 / V ^ , n a o r d e n a d a , e
abscissa. O gráfico n o q u a l as r e p r e s e n t a ç õ e s são feitas é c o n h e -
cido c o m o g r á f i c o de L i n e w e a v e r - B u r k (Figura 9-3).
A g o r a é prática de r o t i n a d e t e r m i n a r as c o n s t a n t e s cinéticas,
c o m o K,n e V max , usando-se u m p a c o t e de software. H á u m g r a n d e
n ú m e r o d e tais pacotes disponíveis, que variam d e rotinas espe-
cializadas para simulações cinéticas ou p a r a ajuste de d a d o s a
pacotes m a t e m á t i c o s , estatísticos o u gráficos gerais ( h t t p : / / m e d .
u m i c h . e d u / b i o c h e m / e n z r e s o u r c e s / s o f t w a r e . t t m ) . A l g u n s desses
pacotes são gratuitos ( d o m í n i o público, f e r r a m e n t a s compartilha-
das ou licença grátis) o u estão c o m e r c i a l m e n t e disponíveis. U m
exemplo d o p r i m e i r o é o p a c o t e de f e r r a m e n t a s c o m p a r t i l h a d a s
E N C O R A 1.2, disponível de R.J.W. Slats e c o l a b o r a d o r e s da
D e l f t Universify of T e c h n o l o g y ( h t t p : / / w w w . b t . t u d e l f t . n l / ) .
D y n a F i t é u m e x e m p l o d e u m a r o t i n a disponível c o m e r c i a l m e n t e
( h t t p : / / w w w . b i o k i n . c o m / d y n a f i t ) q u e realiza a regressão não-
linear p o r m í n i m o s - q u a d r a d o s d e cinética q u í m i c a , cinética enzi-
mática ou d a d o s de ligação e n t r e Iigantes e receptores.
Q u a n d o se está m o n t a n d o m é t o d o s de ensaios enzimáticos,
é necessário (1) explorar a relação e n t r e velocidade d e reação e
c o n c e n t r a ç ã o de substrato e m u m a g r a n d e faixa d e concentra-
ções, (2) d e t e r m m a T Km e (3) d e t e c t a r q u a l q u e r i n i b i ç ã o em altas
c o n c e n t r a ç õ e s de substrato. A s cinéticas d e o r d e m zero são m a n -
tidas se o s u b s t r a t o estiver p r e s e n t e e m g r a n d e excesso com con-
centrações de p e l o m e n o s 10 e p r e f e r e n c i a l m e n t e 100 vezes a d o
valor d e K m . Q u a n d o [S] = 10 x Km, v é a p r o x i m a d a m e n t e 9 1 %
da teórica. O s valores d e K,„ p a r a a m a i o r i a das enzimas são
d a o r d e m d e IO' 5 a 10"_í m o I / L ; p o r t a n t o , as c o n c e n t r a ç õ e s
d e substrato são n o r m a l m e n t e escolhidas na faixa de 0,001 a
0,07 -
0,06
0,05
0.04 Interceptação na =• — = 0,0345
w
ordanada rcnx
6 = — - — = 29
0.03 ,rax
0,0345
0.02
0,01
Intercepção 1 p r o d u t o d e u m a reação catalisada e n z i m a t i c a m e n t e se t o r n a o
na abscissa - 0 , 8 x 10 4 , e Km = 1,25 x lO^ 4
i
—T— T m u i t o s estágios, são características d e processos m e t a b ó l i c o s
-0,8 -0.4 0.4 0,8 1,2
— xitr^
[S\
Figura 9 - 3 Transformação de Lineweaver-Burk da curva da Figura 9-
2, com l / u representado n a ordenada (eixo y) e 1/[S] ria abscissa (eixo
x). As intercepcções indicadas permitem o cálculo de Vma). e K,r. As
u n i d a d e s de v e [S] são aquelas dadas na Figura 9-2.
Princípios da Enzimologia Clínica CAPÍTULO 9 149
0,10 m o l / L . O c a s i o n a l m e n t e , q u a n d o o s u b s t r a t o t e m solubili-
d a d e l i m i t a d a ou q u a n d o a c o n c e n t r a ç ã o d e u m d e t e r m i n a d o
(3)
u m sistema de reações acopladas, as c o n c e n t r a ç õ e s ideais de
s u b s t r a t o n ã o p o d e m ser usadas.
na
Reações ds Dois Substratos
E m b o r a a discussão inicial t e n h a se c o n c e n t r a d o n o efeito de
m u d a n ç a s n a c o n c e n t r a ç ã o d e u m ú n i c o s u b s t r a t o n a velocidade
d e reação, a m a i o r i a das reações enzimáticas é d o seguinte tipo:
Substrato 1 + Substrato 2 li P r o d u t o 1 + P r o d u t o
(4)
SI S2 PI P2
E n t r e as reações bissubstrato i m p o r t a n t e s n a enzimologia clínica
estão as reações catalisadas p o r desidrogenases ou p o r a m i n o -
transferases — nas quais o s e g u n d o s u b s t r a t o é u m a coenzima
específica, tal c o m o a n i c o t i n a m i d a a d e n m a d i n u c l e o t í d e o redu-
zida ( N A D H ) o u a N A D fosfato r e d u z i d a ( N A D P H ) . As concen-
trações de a m b o s os substratos a f e t a m as velocidades das reações
de dois substratos. O s valores d e e V m a x para cada substrato
são o b t i d o s a p a n i r de e x p e r i m e n t o s n o s quais a c o n c e n t r a ç ã o
d o p r i m e i r o s u b s t r a t o é m a n t i d a e m níveis saturantes, e n q u a n t o
a c o n c e n t r a ç ã o d o s e g u n d o s u b s t r a t o varia, e vice-versa.
N a prática, a escolha das c o n c e n t r a ç õ e s de s u b s t r a t o é limi-
tada p o r considerações c o m o (1) a solubilidade dos substratos.
(2) a viscosidade e a absorvância inicial alta das soluções concen-
tradas e (3) os custos relativos dos reagentes. A l é m disso, a seleção
de c o n c e n t r a ç õ e s apropriadas de s u b s t r a t o é s o m e n t e u m dos
fatores a serem c o n s i d e r a d o s n a f o r m u l a ç ã o de u m sistema ideal
de ensaio para a m e d i ç ã o da atividade enzimática específica.
Escolhas críticas precisam t a m b é m ser feitas c o m respeito a
o u t r o s fatores f r e q ü e n t e m e n t e i n t e r d e p e n d e n t e s q u e a f e t a m a
velocidade de reação, tais c o m o as c o n c e n t r a ç õ e s de ativadores e
o tipo e o p H d o sistema t a m p ã o A a b o r d a g e m empírica tradi-
cional para a otimização tem sido s u b s t i t u í d a p o i técnicas mais
novas de co-otimização simplex e m e t o d o l o g i a d e superfície-res-
posta. 9 C o m o exemplo, esta técnica t e m sido usada r e c e n t e m e n t e
para d e t e r m i n a r as condições ideais para o m é t o d o de análise de
amilase, r e c o m e n d a d o pela F e d e r a ç ã o I n t e r n a c i o n a l d e Q u í m i c a
Clínica e M e d i c i n a Laboratorial ( I F C C ) . 5
Reações Enzimáticas Consecutivas
C o m o d i s c u t i d o a n t e r i o r m e n t e , sabe-se q u e u m a reação enzimá-
tica n o r m a l m e n t e é mais r á p i d a e m u m a direção d o q u e e m
o u t r a , o q u e faz c o m q u e a reação seja p r a t i c a m e n t e irreversível
Se o p r o d u t o d a reação em u m a direção for r e m o v i d o logo após
sua f o r m a ç ã o , o e q u i l í b r i o d o p r i m e i r o processo enzimático será
d e s l o c a d o d e m a n e i r a que a reação possa c o n t i n u a r n a q u e l a
direção até sua finalização. As s e q ü ê n c i a s de reação nas q u a i s o
s u b s t r a t o d e u m a o u t r a enzima, f r e q ü e n t e m e n t e através de
A n a l i t i c a m e n t e , várias reações enzimáticas p o d e m estar ligadas a
f i m de f o r n e c e r u m m e i o d e m e d i r a atividade da p r i m e i r a
e n z i m a o u a c o n c e n t r a ç ã o d o s u b s t r a t o inicial da cadeia.
Q u a n d o u m ensaio d e e n z i m a ligada, c o n h e c i d o c o m o reação
indicadora, é u s a d o para d e t e r m i n a r a atividade d e u m a e n z i m a
diferente, é essencial q u e a reação p r i n c i p a l seja a e t a p a l i m i t a n t e
da velocidade. Por exemplo, n a d e t e r m i n a ç ã o da atividade da
a s p a r t a t o a m i n o t r a n s f e r a s e , a reação i n d i c a d o r a é a r e d u ç ã o do
150 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
2-oxoglutarato formado na reação de aminotransferase, a malato
pela malato desidrogenase e N A D H . A atividade da enzima indi-
cadora precisa sei suficiente para garantir a remoção pratica-
mente instantânea do produto da primeira reação, a fim de evitar
reversão significativa da primeira reação. A enzima medida nor-
malmente está agindo sob condições de saturação em relação a
seu substrato; entretanto, a concentração do substrato da enzima
indicadora (isto é, o produto da primeira reação) permanece na
região da curva de Michaeiis-Menten na qual v é diretamente
proporcional à [S]. Portanto, a velocidade da reação catalisada
pela enzima indicadora é diretamente proporcional à velocidade
de formação de produto na primeira reação.
Durante u m período de retardamento, que ocorre após o
início da primeira reação, a concentração de seu produto atinge
um estado de equilíbrio (steady state). C o m o a velocidade da
segunda reação depende da atividade da enzima indicadora e da
concentração de seu substrato (o produto da reação principal), a
duração do período de retardamento é reduzida pelo aumento
da concentração da enzima indicadora, diminuindo, assim, a
concentração do produto da primeira reação no estado de equi-
líbrio.
pH
A velocidade das reações catalisadas por enzimas é uma função
típica do pH. Por exemplo, muitas das enzimas no plasma san-
guíneo exibem atividade máxima in vitro na faixa de pH de 7 a
8. Entretanto, tem-se observado atividade em valores de pH tão
baixos quanto 1,5 (pepsina), e tão altos quanto 10,5 (ALP). O pH
ideal para uma determinada reação direta pode ser diferente do
pH ideal observado para a reação inversa correspondente. A
forma da curva de dependência do pH é resultado de um número
de efeitos separados, incluindo a ionização do substrato e o grau
de dissociação de certas cadeias laterais de aminoácidos-chave na
molécula protéica, tanto n o centro ativo quanto em qualquer
outro lugar da molécula. O pH e o ambiente iônico também
terão efeito na conformação tridimensional da proteína e, por-
tanto, sobre a atividade enzimática em tal grau que as enzimas
possam ser irreversivelmente desnaturadas em valores extremos
de pH.
Os efeitos pronunciados do pH sobre as reações enzimáticas
reforçam a necessidade de se controlar esta variável por meio de
soluções-tampão adequadas. Os ensaios enzimáticos devem ser
realizados no pH correspondente à atividade máxima porque a
curva de pH-atividade tem sua inclinação mínima próximo a esse
pH, e uma pequena variação no pH causará uma mudança
mínima na atividade enzimática. O sistema-tampão deve ser capaz
de contrabalançar o efeito de adição da amostra (p. ex., o soro,
por si só, é u m tampão poderoso) no sistema de ensaio, e os
efeitos de ácidos e bases formados durante a reação (p. ex., for-
mação de ácidos graxos pela ação da lípase). C o m o os tampões
têm sua capacidade tamponante máxima próxima a seus valores
de pKn (-log da constante de ionização Ka), sempTe que possível
um sistema-tampão deverá ser escolhido com o valor de pK,
dentro de 1 unidade do pH desejado para o ensaio. A interação
entre os íons do tampão e outros componentes do sistema de
ensaio (p. ex., íons metálicos ativadores) pode fazer com que
certos tampões não sejam considerados.
Temperatura
A velocidade de uma reação enzimática é proporcional à sua
temperatura de reação. Para a maioria das reações enzimáticas, os
valores de Q 1 0 (as velocidades de reação relativas em duas tempe-
raturas diferindo de 10°C) variam de 1,7 a 2,5. N o entanto, um
aumento da velocidade da reação catalisada não é o único efeito
do aumento de temperatura na reação enzimática. Na teoria, a
velocidade inicial de reação medida aumentará instantaneamente
com a elevação da temperatura. Na prática, entretanto, um tempo
finito é necessário para permitir que os componentes da mistura
de reação, inclusive a solução de enzima, atinjam a temperatura
de equilíbrio, e para permitir a formação de uma quantidade
mensurável de produto. Durante esse período de tempo a enzima
está sofrendo inativação térmica e desnaturação, um processo que
tem um coeficiente de temperatura muito grande para a maioria
das enzimas e, portanto, toma-se praticamente instantâneo em
temperaturas entre 60°C e 70°C. Os efeitos que contrabalançam
a velocidade aumentada da reação catalisada e a inativação enzi-
mática mais rápida, à medida que a temperatura aumenta, são
responsáveis pela existência de uma temperatura ótima aparente
para a atividade enzimática (Figura 9-4).
C o m o citado anteriormente, em algumas temperaturas críti-
cas, uma enzima sofrerá inativação térmica influenciada por
vários fatores. Estes incluem (1) a presença de substrato e sua
concentração, (2) o pH e (3) o tipo e a força iônica do tampão.
O armazenamento de amostras de soro em temperaturas baixas
é necessário para minimizar a perda de atividade enzimática
enquanto se aguarda a análise. Entretanto, enzimas individuais
variam em suas características de estabilidade, e as condições de
armazenamento adequadas variam de forma correspondente. A
amilase, por exemplo, é estável à temperatura ambiente (22°C a
25°C) por 24 horas, enquanto a fosfatase ácida é muitíssimo
instável, até mesmo quando refrigerada, a menos que seja mantida
em pH abaixo de 6,0. A ALP exibe uma propriedade não usual:
a tendência da atividade de preparações parcialmente purificadas
e congeladas da enzima aumentar após descongelamento em um
período de 24 horas ou mais. Esse efeito é compartilhado por
preparações liofilizadas e reconstituídas da enzima e afeta seu uso
para fins de garantia de qualidade. Poucas enzimas são inativadas
nas temperaturas de refrigeradores; um exemplo clinicamente
importante é a isoenzima do tipo hepático da lactato desidroge-
nase, LD-5, que parece ser menos estável em temperaturas mais
baixas. Como resultado, soros para as determinações de LD
devem ser mantidos à temperatura ambiente e não-refrigerados.
Historicamente, a escolha da temperatura do ensaio de enzimas
de importância clínica tem sido assunto de debate extensivo. Atu-
T e m p e r a t u r a (°C)
Figura 9-4 Diagrama esquemático mostrando o efeito da
temperatura sobre as velocidades de reações catalisadas não-enzimátíca e
enzimaticamente.
 Princípios da Enzimologia Clínica
a l m e n t e , a escolha da t e m p e r a t u r a d e r e a ç ã o d e i x o u de ser u m
p o n t o d e d e b a t e , u m a vez q u e a m a i o r i a , se n ã o t o d o s os sistemas
analíticos o p e r a m a 37 °C. A l é m disso, os m é t o d o s d e r e f e r ê n c i a
p a r a diversas e n z i m a s c l i n i c a m e n t e relevantes já f o r a m d e t e r m i n a -
d o s a 37 C C. 1 0 1 5 N a prática, o c o n t r o l e preciso da t e m p e r a t u r a
d e n t r o d e ± 0 , 1 ° C d u r a n t e a r e a ç ã o e n z i m á t i c a é essencial.
Inibidores e Ativadores
A s v e l o c i d a d e s d a s r e a ç õ e s e n z i m á t i c a s são a f e t a d a s p o r o u t r a s
s u b s t â n c i a s a l é m d a e n z i m a o u d o s u b s t r a t o . Estes m o d i f i c a d o r e s
p o d e m ser i n i b i d o r e s , q u a n d o s u a s p r e s e n ç a s r e d u z e m a veloci-
d a d e d e r e a ç ã o , o u a t i v a d o t e s , q u a n d o elas a u m e n t a m a veloci-
d a d e d e r e a ç ã o . A t i v a d o r e s e i n i b i d o r e s g e r a l m e n t e são m o l é c u l a s
p e q u e n a s ( c o m p a r a d a s à e n z i m a ) , o u a t é m e s m o í o n s . Eles v a r i a m
e m e s p e c i f i c i d a d e d e s d e , m o d i f i c a d o r e s , q u e e x e r c e m e f e i t o s simi-
lares s o b r e u m a g r a n d e v a r i e d a d e d e r e a ç õ e s e n z i m á t i c a s d i f e r e n -
tes, p o r u m l a d o , até s u b s t â n c i a s q u e a f e t a m s o m e n t e u m a ú n i c a
r e a ç ã o . O s r e a g e n t e s , tais c o m o os á c i d o s foTtes o u â n i o n s e
cátions multivalentes, que d e s n a t u r a m ou precipitam proteínas,
d e s t r o e m a a t i v i d a d e e n z i m á t i c a e, p o r t a n t o , p o d e m ser c o n s i d e -
rados c o m o exemplos extremos de inibidores enzimáticos não-
e s p e c í f i c o s . Esses efeitos g e r a l m e n t e n ã o são i n c l u í d o s e m discus-
sões s o b r e i n i b i ç ã o e n z i m á t i c a , e m b o r a eles t e n h a m i m p l i c a ç õ e s
p r á t i c a s óbvias n o t r a t a m e n t o e a r m a z e n a m e n t o d e a m o s t r a s n a s
q u a i s a a t i v i d a d e e n z i m á t i c a será m e d i d a . A a t i v i d a d e de a l g u m a s
e n z i m a s d e p e n d e d a p r e s e n ç a d e g r u p o s q u í m i c o s específicos, tais
c o m o os g r u p o s s u l f i d r i l a r e d u z i d o s (—SH), n o c e n t r o ativo. Rea-
g e n t e s q u e a l t e r a m esses g r u p o s (p. ex., o x i d a n t e s d e g r u p o s S H )
a g e m , p o r t a n t o , c o m o i n i b i d o r e s gerais d e tais e n z i m a s .
A l g u n s f e n ô m e n o s d e a t i v a ç ã o o u i n i b i ç ã o e n z i m á t i c a são
causados por interação entre o modificador e u m c o m p o n e n t e
n ã o - e n z i m á t i c o d o s i s t e m a d e r e a ç ã o , tal c o m o o s u b s t r a t o (p. ex.,
a c o m b i n a ç ã o d e Mg 2 " c o m o a d e n o s i n a t r í f o s f a t o (ATP) p a r a
f o r m a r MgATP, o substrato necessário para a reação de CK). N a
m a i o r i a d o s casos, e n t r e t a n t o , o m o d i f i c a d o r c o m b i n a c o m a
própria enzima de forma análoga à combinação da enzima com
o substrato.
Inibição da Atividade Enzimática
O s i n i b i d o r e s são classificados c o m o reversíveis o u irreversíveis.
Inibição Reversível. I n i b i ç ã o reversível significa q u e a a t i v i d a d e
da enzima é restaurada completamente q u a n d o o inibidor é
f i s i c a m e n t e r e m o v i d o d o s i s t e m a . Esse t i p o d e i n i b i ç ã o é caracte-
r i z a d o p e l a e x i s t ê n c i a d e u m e q u i l í b r i o e n t r e a e n z i m a (E) e o
i n i b i d o r (i) :
E+I< 1B1 (5)
A c o n s t a n t e d e e q u i l í b r i o da r e a ç ã o , K, (a constante de inibição), é
u m a m e d i d a da a f i n i d a d e d o i n i b i d o r pela e n z i m a , da m e s m a
f o r m a q u e K m g e r a l m e n t e r e f l e t e a a f i n i d a d e da e n z i m a p o r seu
substrato.
U m inibidor competitivo é geralmente u m análogo estrutural
d o s u b s t r a t o e se liga à e n z i m a n o sítio d e ligação d e s t e s u b s t r a t o ,
m a s c o m o n ã o é i d ê n t i c o ao m e s m o , a q u e b r a e m p r o d u t o n ã o
ocorre. Q u a n d o o processo de inibição é c o m p l e t a m e n t e compe-
titivo, a e n z i m a se c o m b i n a c o m o s u b s t r a t o o u c o m o i n i b i d o r ,
m a s n ã o c o m os d o i s s i m u l t a n e a m e n t e . E m b a i x a s c o n c e n t r a ç õ e s
d e s u b s t r a t o , a ligação d o s u b s t r a t o é r e d u z i d a p o r q u e a l g u m a s
moléculas de enzima estão c o m b i n a d a s c o m o inibidor. Assim, a
c o n c e n t r a ç ã o d e E S e, p o r t a n t o , a v e l o c i d a d e d e r e a ç ã o g l o b a l
e s t ã o r e d u z i d a s , e K m está a p a r e n t e m e n t e a u m e n t a d a . E m altas
CAPÍTULO 9 151
[5], e n t r e t a n t o , t o d a s as m o l é c u l a s d e e n z i m a s c o m b i n a m p a r a
f o r m a r ES, d e f o r m a q u e V m a x n ã o é a f e t a d a p e l o i n i b i d o r . Essas
características da i n i b i ç ã o c o m p e t i t i v a são d e m o n s t r a d a s n o
g r á f i c o d e L i n e w e a v e r - B u r k ( F i g u r a 9-5).
A i n i b i ç ã o c o m p e t i t i v a r e s u l t a da c o m p e t i ç ã o e n t r e m o l é c u l a s
d e s u b s t r a t o p o r u m ú n i c o sítio d e ligação. N a s r e a ç õ e s c o m d o i s
s u b s t r a t o s , altas c o n c e n t r a ç õ e s d o s e g u n d o s u b s t r a t o p o d e m c o m -
p e t i r c o m a ligação d o p r i m e i r o . A i n i b i ç ã o c o m p e t i t i v a t a m b é m
c o n t r i b u i p a r a a r e d u ç ã o da v e l o c i d a d e d e u m a r e a ç ã o e n z i m á t i c a
c o m o t e m p o e a não linearidade das curvas de progresso d e
reação.
U m i n i b i d o r n ã o - c o m p e t i t i v o e m geral é e s t r u t u r a l m e n t e dife-
r e n t e d o s u b s t r a t o . A s s u m e - s e q u e ele se liga a u m sítio da m o l é -
c u l a d e e n z i m a d i f e r e n t e d o sítio d e ligação d o s u b s t r a t o ; p o r t a n t o ,
n ã o existe c o m p e t i ç ã o e n t r e i n i b i d o r e s u b s t r a t o , e u m c o m p l e x o
t e r n á r i o e n z i m a - s u b s t r a t o - i n i b i d o r (ESI) é f o r m a d o . A ligação d o
i n i b i d o r à e n z i m a n ã o altera a a f i n i d a d e da e n z i m a p o r s e u subs-
t r a t o (isto é, a p e r m a n e c e i n a l t e r a d a ) , m a s o c o m p l e x o ESI n ã o
é q u e b r a d o p a r a gerar p r o d u t o s . C o m o o s u b s t r a t o n ã o c o m p e t e
c o m o i n i b i d o i p e l o s sítios d e ligação na m o l é c u l a d e e n z i m a , u m
a u m e n t o n a c o n c e n t r a ç ã o d e s u b s t r a t o n ã o s u p e r a o efeito d e u m
i n i b i d o r n ã o - c o m p e t i t i v o . P o r t a n t o , V m a x é r e d u z i d a na p r e s e n ç a
d e t a l i n i b i d o r , e n q u a n t o Km n ã o é alterada, c o m o d e m o n s t r a o
g r á f i c o d e Lineweaver-Burk ( F i g u r a 9-5).
E m u m t i p o d e i n i b i ç ã o reversível e s p e c i a l m e n t e r a r o , c o n h e -
c i d o c o m o inibição incompetitiua, são o b t i d a s l i n h a s p a r a l e l a s
q u a n d o se c o m p a r a as r e p r e s e n t a ç õ e s gráficas d e í/v c o n t r a 1 / [ S ]
c o m e s e m i n i b i d o r (Figura 9-5); isto é, t a n t o K m q u a n t o Vm!Dt
estão diminuídas A inibição incompetitiva é ocasionada pela
c o m b i n a ç ã o do inibidor com o complexo ES e é mais c o m u m
[S]
Figura 9 - 5 Efeitos de diferentes tipos de inibição n o gráfico duplo-
recíproco de l / v contra 1/[S]. Assumiu-se que cada u m dos inibidores
reduz a atividade da enzima da m e s m a forma, representada pela variação
e m l/v de a para b na c o n c e n t r a ç ã o de substrato c. A linha O é o
gráfico da enzima sem o inibidor, C com u m inibidor competitivo, N C
c o m u m inibidor não-competitivo e U C com u m m i b i d o r incompcutivo.
( D e Moss DW. M e a s u r e m e n t of enrymes. In: Hearse DJ, de Leiris J, eds.
Enzymes in cardiology: diagnosis a n d research Chichester- J o h n Wiley
Sons Limited, 1979. Reimpresso com permissão de J o h n Wiley &
Sons, Limited).
152 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
n a s reações de dois substratos, nas quais u m complexo t e r n á r i o
ESI se f o r m a após o p r i m e i r o s u b s t r a t o ter se c o m b i n a d o à
enzima.
Inibição Irreversível. O s inibidores irreversíveis t o m a m a molé-
cula da enzima inativa pela m o d i f i c a ç ã o covalente e p e r m a n e n t e
d e u m g r u p o f u n c i o n a l necessário à catálise. Seu efeito é progres-
sivo com o t e m p o , t o r n a n d o - s e c o m p l e t o se a q u a n t i d a d e de
i n i b i d o r p r e s e n t e exceder a q u a n t i d a d e total de enzima. A velo-
c i d a d e d e reação e n t r e e n z i m a e i n i b i d o r é expressa c o m o a f r a ç ã o
d a atividade enzimática q u e é i n i b i d a e u m t e m p o fixo p o r u m a
d e t e r m i n a d a c o n c e n t r a ç ã o d e i n i b i d o r . A c o n s t a n t e de veloci-
d a d e d a reação d o i n i b i d o r c o m a enzima é u m a m e d i d a d a efi-
ciência d o inibidor.
U m a categoria f i s i o l o g i c a m e n t e i m p o r t a n t e d e inibição enzi-
m á t i c a irreversível é p r o d u z i d a pelas antienzimas, exemplificadas
p o r v á n o s tipos de i n i b i d o r e s de tripsina. Estes são proteínas q u e
se ligam à tripsina d e m a n e i r a irreversível, a n u l a n d o sua atividade
proteolítica. U m desses i n i b i d o r e s está p r e s e n t e n a tração c^-glo-
b u l i n a das p r o t e í n a s séricas; o u t r o s são e n c o n t r a d o s n o feijão de
soja e n o feijão de lima. I n i b i d o r e s d e proteólise similares presen-
tes n o plasma e v i t a m o a c ú m u l o d e t r o m b i n a e m excesso e de
o u t r a s enzimas d e coagulação, m a n t e n d o , assim, o processo de
coagulação sob controle.
Inibição por Anticorpos. A c o m b i n a ç ã o de moléculas de enzimas
c o m a n t i c o r p o s específicos f r e q ü e n t e m e n t e n ã o t e m efeito sobre
a atividade catalítica, q u e é m a n t i d a pelo c o m p l e x o enzíma-anti-
c o r p o . E n t r e t a n t o , e m alguns casos, a reação da enzima c o m o
a n t i c o r p o reduz, ou até m e s m o cessa a atividade enzimática. A
explicação mais provável p a r a esse t i p o de i n i b i ç ã o é que a molé-
cula d e a n t i c o r p o restringe o acesso das moléculas de s u b s t r a t o
ao c e n t r o ativo p o r i m p e d i m e n t o estérico o u , e m casos extremos,
m a s c a r a c o m p l e t a m e n t e o sítio d e ligação d o substrato. Entre-
t a n t o , parece q u e alguns e x e m p l o s de inibição enzimática pela
c o m b i n a ç ã o c o m a n t i c o r p o s são causados p o r u m a m u d a n ç a
c o n f o r m a c i o n a l i n d u z i d a n a molécula de e n z i m a .
Ativação Enzimática
O s ativadores a u m e n t a m as velocidades das reações enzimatica-
m e n t e catalisadas p o r u m a v a r i e d a d e d e m e c a n i s m o s de ativação.
Por exemplo, m u i t a s e n z i m a s c o n t ê m íons metálicos c o m o p a r t e
integral de suas estruturas. A f u n ç ã o d o m e t a l p o d e ser a de
estabilizar as estruturas terciária e q u a t e r n á r i a das proteínas. A
r e m o ç ã o d e íons metálicos divalentes p o r t r a t a m e n t o com u m a
solução de c o n c e n t r a ç ã o a d e q u a d a de ácido e t i l e n o d i a m i n o t e t r a '
cético (EDTA) é a c o m p a n h a d a p o r m u d a n ç a s c o n f o r m a c i o n a i s
c o m a inativação da enzima. Esta f r e q ü e n t e m e n t e é reativada p o r
diálise c o n t r a u m a solução d o í o n metálico a p r o p r i a d o , o u sim-
p l e s m e n t e pela adição d o í o n à m i s t u r a de reação
Q u a n d o o íon ativador é u m a p a r t e essencial da molécula da
e n z i m a f u n c i o n a l , seja c o m o u m e l e m e n t o p u r a m e n t e e s t r u t u r a l
o u c o m o u m a f u n ç ã o catalítica adicional, ele n o r m a l m e n t e está
i n c o r p o r a d o de m a n e i r a m u i t o f i r m e à m o l é c u l a da e n z i m a .
P o r t a n t o , g e r a l m e n t e n ã o é necessário a d i c i o n a r o ativador às
misturas de reação e o excesso d o i o n p o d e , até m e s m o , ter u m
efeito inibidor. E n t r e t a n t o , e m alguns casos, o ion ativador está
ligado s o m e n t e fraca ou t r a n s i t o r i a m e n t e à e n z i m a (ou ao seu
substrato) d u r a n t e a catálise. A s amostras de enzimas p o d e m ,
p o r t a n t o , ser deficientes n o í o n , de f o r m a q u e sua adição a u m e n t a
a velocidade de reação o u , d e fato, p o d e ser essencial p a r a q u e a
reação ocorra. Por exemplo, todas as enzimas d e t rans ferência de
fosfato (quinases), tais c o m o a c r e a t i n o q u i n a s e , r e q u e r e m a pre-
sença d e íons Mg 1+ . O u t r o s c á t i o n s ativadores c o m u n s são M n í + ,
Fe 2+ , Ca z + , Zn 3+ e K \ Mais r a r a m e n t e , os ã n i o n s p o d e m a t u a r
c o m o ativadores. U m e x e m p l o é a amilase, q u e f u n c i o n a e m sua
velocidade m á x i m a s o m e n t e se Cl" o u o u t r o s ã n i o n s m o n o v a l e n -
tes — tais c o m o Br" ou NO}~, — estiverem presentes. A l g u m a s
enzimas r e q u e r e m a presença f o r ç a d a de dois íons ativadores. K+
e Mg 2 * sãu essenciais para a atividade d e p i r u v a t o q u i n a s e , e Mg" +
e Zn' + são necessários para a atividade de ALP.
Coenzimas e Grupos Prostéticos
As c o e n z i m a s são n o r m a l m e n t e moléculas mais c o m p l e x a s d o
q u e os ativadores, e m b o r a s e j a m moléculas m e n o r e s d o q u e as
próprias p r o t e í n a s enzimáticas. A l g u n s c o m p o s t o s , tais c o m o os
d i n u c l e o t í d e o s N A D e N A D P , são classificados c o m o coenzimas
e são substratos específicos e m reações de dois substratos. Seus
efeitos n a velocidade de reação seguem o p a d r ã o de Michaeiis-
M e n t e n de d e p e n d ê n c i a da c o n c e n t r a ç ã o d e substrato. A s estru-
turas destas d u a s coenzimas são idênticas, exceto pela p r e s e n ç a
d e u m g r u p o fosfato adicional n o N A D P ; c o n t u d o , desidrogena-
ses individuais, para as quais essas coenzimas são substratos, são
p r e d o m i n a n t e m e n t e , ou m e s m o a b s o l u t a m e n t e específicas para
u m a ou o u t r a f o r m a .
C o e n z i m a s , c o m o N A D e N A D P , são ligadas a p e n a s m o m e n -
t a n e a m e n t e à e n z i m a d u r a n t e o curso d a reação, c o m o é o caso
d o s substratos e m geral. P o r t a n t o , n e n h u m a reação o c o r r e a
m e n o s q u e a c o e n z i m a a p r o p r i a d a esteja p r e s e n t e n a solução.
D i f e r e n t e m e n t e dessas coenzimas t o t a l m e n t e solúveis, algumas
coenzimas são mais o u m e n o s ligadas de f o r m a p e r m a n e n t e às
moléculas de enzima, nas quais elas fazem p a r t e d o c e n t r o ativo
e s o f r e m ciclos d e m u d a n ç a s q u í m i c a s d u r a n t e a reação.
A h o l o e n z i m a ativa resulta d a c o m b i n a ç ã o da a p o e n z i m a
inativa c o m o grupo prostético. U m exemplo de g r u p o p r o s t é t i c o é
o piridoxal fosfato (P-5'-P), u m c o m p o n e n t e da A S T e da ALT. O
g r u p o prostético P-5'-P sofre u m ciclo d e conversão da p o r ç ã o
piridoxal à p i r i d o x a m i n a e é c o n v e r t i d o de volta d u r a n t e a trans-
ferência de u m g r u p o a m i n a d e u m a m i n o á c i d o p a r a u m oxiá-
cido. G r u p o s prostéticos, tais c o m o ativadores com u m a f u n ç ã o
estrutural, n ã o têm q u e ser a d i c i o n a d o s para q u e se o b t e n h a a
atividade catalítica c o m p l e t a da enzima, a m e n o s q u e o trata-
m e n t o prévio t e n h a causado a p e r d a d o g r u p o prostético d e
algumas m o l é c u l a s enzimáticas. E n t r e t a n t o , a m o s t r a s d e soro
n o r m a l e patológico c o n t ê m q u a n t i d a d e s apreciáveis d e apo-ami-
notransferases, q u e são convertidas às h o l o e n z i m a s ativas após
u m p e r í o d o a d e q u a d o de i n c u b a ç ã o c o m P-5'-P.
ENZIMOLOGIA ANALÍTICA
O s l a b o r a t ó r i o s clínicos estão p r e o c u p a d o s c o m a m e d i ç ã o d a
atividade o u da massa protéica d e enzimas n o soro o u plasma.
Essas enzimas são p r e d o m i n a n t e m e n t e intracelulares e n o r m a l -
m e n t e estão presentes n o soro s o m e n t e e m baixas c o n c e n t r a ç õ e s .
M e d i n d o - s e as m u d a n ç a s nas c o n c e n t r a ç õ e s dessas enzimas e m
doenças, é possível inferir a localização e a n a t u r e z a das m u d a n ç a s
patológicas n o s tecidos do c o r p o .
Medidas de Velocidades de Reação
A velocidade de u m a reação catalisada p o r e n z i m a é d i r e t a m e n t e
p r o p o r c i o n a l à q u a n t i d a d e de enzima ativa p r e s e n t e n o sistema.
Conseqüentemente, a d e t e r m i n a ç ã o da velocidade d e reação s o b
condições definidas e controladas fornece um m é t o d o muito
sensível e específico para a q u a n t i f i c a ç ã o de enzimas e m a m o s t r a s
c o m o o soro.
A d e t e r m i n a ç ã o da velocidade d e reação envolve a m e d i d a
cinética d o total de variação p r o d u z i d a e m u m d e t e r m i n a d o
intervalo d e t e m p o . O s m é t o d o s d e reação d e t e m p o f i x o e de
m o n i t o r a m e n t o c o n t í n u o são u s a d o s p a r a m e d i r velocidades de
reação. N o m é t o d o d e t e m p o fixo, o total d a variação p r o d u z i d a
pela e n z i m a é m e d i d o após a p a r a d a da reação ao final de u m
 Princípios da Enzimologia Clínica
intervalo de tempo fixado. N o método de monitoramento con-
tínuo, o progresso da reação é monitorado continuamente.
Analiticamente, a atividade enzimática é determinada pela
medida do decréscimo de concentração do substrato ou pelo
aumento de concentração dos produtos. Prefere-se a medida de
formação de produto porque a determinação do aumento da
concentração de uma substância acima de um nível inicialmente
igual a zero ou abaixo disso é analiticamente mais confiável do
que a medida do declínio de um nível inicialmente alto.
No momento em que a enzima e o substrato são misturados,
a velocidade da reação é zero. A velocidade, então, aumenta
rapidamente a um valor máximo que permanece constante por
um período de tempo (Figura 9-6). Durante o período de veloci-
dade de reação constante, a velocidade depende somente da
concentração de enzima e é completamente independente da
concentração de substrato. Diz-se que a reação segue a cinética
de ordem zero porque sua velocidade é proporcional ao poder
zero da concentração de substrato. N o fim, entretanto, quanto
mais substrato é consumido, a velocidade de reação declina e
entra na fase de dependência de primeira ordem da concentração
de substrato. Outros fatores que contribuem para o declínio da
velocidade de reação incluem (1) acúmulo de produtos que
podem ser inibitórios, (2) a importância crescente da reação
T e m p o (s)
F i g u r a 9 - 6 Variações nas concentrações de substrato e velocidade de
reação durante um ensaio da atividade de lactato desidrogenase a 37°C
em tampão fosfato, com piiuvato e N A D H como substratos. A reação é
acompanhada pela observação da diminuição da absOTvância a 340 nm
à medida que o N A D H é oxidado a NAD + . A velocidade de reação
aumenta rapidamente a um valor máximo, a partir do qual declina
apenas levemente até que metade do N A D H tenha sido consumida.
Durante essa fase da reação, a velocidade é essencialmente zero com
relação à concentração de substrato. N o ponto no qual a velocidade cai
abaixo de ceTca de 90% do seu valor máximo, a concentração de
N A D H é aproximadamente 10 x K A Km para o N A D H é da ordem
de 5 x IO"6 mo l/L, enquanto para o piruvato ela é 9 x IO'3 mol/L.
Portanto, utiliza-se uma concentração inicial de piruvato
aproximadamente 10 vezes a de N A D H . (As concentrações são por litro
de mistura de reação). (De Moss DW. Mesurement of enzymes. In:
Hearse DJ, de Leiris J, eds. Enzymes in cardiology: diagnosis and
research. Chichester: John Wiley & Sons Limited, 1979. Reimpresso
com permissão de John Wiley & Sons, Limited.)
CAPÍTULO 9 153
inversa e (3) a desnaturação da enzima. Embora seja possível
comparar as velocidades de reação produzidas por diferentes
quantidades de uma enzima sob condições de primeira ordem, é
mais fácil padronizar tais comparações quando a concentração
da enzima é a única variável que influencia a velocidade de
reação. Portanto, as enzimas são normalmente medidas sob con-
dições que são inicialmente saturantes com respeito à concentra-
ção de substrato. A velocidade de reação durante a fase de ordem
zero é determinada pela medida de produto formado durante um
período fixo de incubação, onde a velocidade permanece cons-
tante (Figura 9-7). A medida das velocidades de reação em qual-
quer parte da curva A dá resultados idênticos à verdadeira "velo-
cidade inicial". Entretanto, a curva B desvia da linearidade em
todo o seu curso, e a velocidade decai com o tempo. A partir da
curva C, resultados corretos são obtidos somente se a velocidade
for medida ao longo do segmento II. Resultados incorretos são
obtidos se a velocidade for medida durante a fase de retarda-
mento (I) ou durante a fase III.
A seleção cuidadosa das condições de reação, tais como as
concentrações de substratos e co-fatores, melhora as curvas de
progresso de reação, eliminando as fases de retardamento e pro-
longando o período de linearidade, de tal forma que os métodos
de análise de tempo fixo são viáveis. As melhorias das técnicas
óticas, que levam a medidas de formação de produto mais con-
fiáveis e sensíveis, também permitiram que a duração da incuba-
ção fosse diminuída quando comparada aos ensaios mais antigos.
Isso resultou em um aumento correspondente no intervalo sobre
c qual a atividade enzimática é medida. Contudo, existe um
limite superior de atividade em todos os métodos de tempo fixo,
acima do qual as curvas de progresso não serão mais lineares.
Neste caso, a quantidade de variação medida no intervalo de
tempo fixo não representa mais as condições de velocidade de
ordem zero verdadeira.
A velocidade de reação inicial teoricamente aumenta sem
limite com o aumento da concentração da enzima, contanto que
nenhum outro fator, tal como concentração de substrato, se
torne limitante. Na prática, a velocidade de reação se torna tão
Tápida em atividades enzimáticas altas que é impossível medir a
velocidade inicial da reação, mesmo com métodos de monitora-
mento contínuo. Portanto, existe um limite superior de atividade
que é aceito sem modificação do procedimento de ensaio mesmo
nos métodos de monitoramento contínuo, mas esse limite nor-
malmente é muito mais alto do que o adequado aos métodos de
tempo fixo correspondentes. Algumas amostras requerem, por-
tanto, tratamento especial. Além disso, o monitoramento contí-
nuo permite a identificação da porção de ordem zero apropriada
da curva de progresso para cada amostra e a identificação de
amostras que necessitam de tratamento especial. Os métodos de
monitoramento contínuo, portanto, possuem uma vantagem
decisiva no ensaio enzimático e devem ser usados sempre que
possível. É também possível medir a atividade enzimática pela
determinação do tempo necessário a fim de consumir toda uma
quantidade fixa de substrato, mas os métodos semelhantes a este
têm sido, na sua grande maioria, descontinuados.
Unidades para Expressar a
Atividade Enzimática
Quando as enzimas são medidas por suas atividades catalíticas,
os resultados de tais determinações são expressos em termos da
concentração do número de unidades de atividade presente em
um volume ou massa conveniente de amostra. A unidade de
atividade é a medida da velocidade na qual a reação procede. Em
enzimologia clinica, a atividade de uma enzima geralmente é
expressa em termos de alguma unidade conveniente de volume,
154 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

Tempo em unidades

F i g u r a 9 - 7 Formas de gráficos mostrando a variação na velocidade da reação enzimática como u m a função d o

tempo. Em A, a velocidade é constante durante toda a corrida, e as velocidades calculadas em I, II e III serão
idênticas à velocidade inicial. Em B, a velocidade diminui continuamente; as velocidades calculadas em I, II e III
serão diferentes e menores do que a velocidade inicial real. Em C, u m a medida em II será representativa da
velocidade máxima, mas em 1 (período de retardamento) e III (depleção de substrato) ela será m e n o r do que em II.

tal c o m o atividade p o r 100 m L ou p o r litro de soro o u p o r 1,0 de ensaio, ele é m e d i d o f o t o m e t r i c a m e n t e , e n q u a n t o ela p r o c e d e .

m l de eritrócitos e m p a c o t a d o s . C o m o a velocidade d a reação
d e p e n d e de p a r â m e t r o s e x p e r i m e n t a i s , tais c o m o (1) p H , (2) tipo
d e t a m p ã o , (3) t e m p e r a t u r a , (4) natureza d o substrato, (5) força
iônica, (6) c o n c e n t r a ç ã o de ativadores e (7) o u t r a s variáveis, estes
precisam ser especificados n a d e f i n i ç ã o d a u n i d a d e .
Para p a d r o n i z a r c o m o as atividades enzimáticas são expressas,
a E C da I U B p r o p ô s q u e a u n i d a d e d e atividade enzimática fosse
d e f i n i d a c o m o a q u a n t i d a d e de enzima q u e catalisa a reação de
1 (imol de s u b s t r a t o p o r m i n u t o , e q u e essa u n i d a d e fosse d e n o -
m i n a d a u n i d a d e internacional (U). A c o n c e n t r a ç ã o catalítica
deve ser expressa e m t e r m o s d e U / L ou k U / L , a q u e l e q u e forne-
cer o valor n u m é r i c o mais c o n v e n i e n t e . Neste capítulo, o s í m b o l o
U é u s a d o p a r a d e n o t a r a u n i d a d e i n t e r n a c i o n a l . N a q u e l e s exem-
plos n o s quais existe a l g u m a incerteza sobre a n a t u r e z a exata d o
s u b s t r a t o ou q u a n d o h á d i f i c u l d a d e e m calcular o n ú m e r o de
m i c r o m o l e s r e a g i n d o ( c o m o c o m m a c r o m o l é c u l a s , tais c o m o
a m i d o , p r o t e í n a e lipídios complexos), a u n i d a d e deve ser expressa
c o n f o r m e o g r u p o o u r e s í d u o q u í m i c o m e d i d o a p ó s a reação (p.
ex., u n i d a d e s d e glicose ou u n i d a d e s de a m i n o á c i d o s forma-
dos).
A u n i d a d e derivada d o SI para a atividade catalítica é o k a t a l .
Ele é d e f i n i d o c o m o m o l e s p o r s e g u n d o . T a n t o a U n i ã o I n t e r n a -
cional de Q u í m i c a P u r a e A p l i c a d a (International Union of Pure
and Applied Chemistry) q u a n t o a I U B r e c o m e n d a m agora q u e a
atividade enzimática seja expressa e m moles p o r s e g u n d o , e q u e
a c o n c e n t r a ç ã o enzimática seja expressa e m t e r m o s de katals p o r
litro (kat/L). 4 Assim, 1 U = IO"6 m o l / 6 0 s = 16,7 x 10~9 m o l / s ,
ou 1,0 n k a t / L = 0 , 0 6 U / L .
Medidas de Substratos
A quantidade de substrato transformada em produtos durante
u m a reação e n z i m a t i c a m e n t e catalisada é m e d i d a por u m a varie-
d a d e de técnicas analíticas, tais c o m o e s p e c t r o f o t o m e t r i a , fluori-
metria ou q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a ( C a p í t u l o 4). Por exemplo, se
u m a reação enzimática for a c o m p a n h a d a p o r u m a m u d a n ç a nas
características de absorvância de algum c o m p o n e n t e d o sistema
A s reações "auto-indicadoras" desse tipo são p a r t i c u l a r m e n t e
valiosas p o r q u e p e r m i t e m o m o n i t o r a m e n t o c o n t í n u o . Exemplos
i m p o r t a n t e s d e reações a u t o - i n d i c a d o r a s são a d e t e r m i n a ç ã o da
atividade de d e s i d r o g e n a s e pelo m o n i t o r a m e n t o da variação da
absorvância a 3 3 9 (340) n m das c o e n z i m a s N A D H ou N A D P H
d u r a n t e a oxidação o u r e d u ç ã o . O u t r o e x e m p l o é a m e d i d a da
atividade de A L P pela geração d o íon í>nitrofenolato a m a r e l o a
partir d o s u b s t r a t o p-nitrofenil f o s f a t o e m solução alcalina. Estes
ensaios são tão versáteis q u e reações acopladas são f r e q ü e n t e -
m e n t e usadas p a r a f o r n e c e r u m a variação ótica observável acom-
p a n h a n d o u m a reação p r i n c i p a l n a qual tal variação n ã o está
presente.
Otimização, Padronização e
Garantia de Qualidade
Para m e d i r a atividade enzimática c o m c o n f i a n ç a , t o d o s os fatores
q u e afetam a velocidade d e reação — o u t r o s além d a c o n c e n t r a ç ã o
de e n z i m a ativa — d e v e m ser o t i m i z a d o s e r i g i d a m e n t e controla-
dos. A l é m disso, c o m o a v e l o c i d a d e de reação está n o seu m á x i m o
ou p r ó x i m o dele s o b c o n d i ç õ e s ideais, é o b t i d o u m sinal analítico
maior, q u e é mais a c u r a d o e p r e c i s a m e n t e m e d i d o d o q u e u m
sinal m e n o r o b t i d o sob c o n d i ç õ e s subideais. M u i t o esforço, por-
t a n t o , t e m sido feito para se d e t e r m i n a r as c o n d i ç õ e s ideais para
as m e d i d a s das atividades d e enzimas de i m p o r t â n c i a clínica.
Otimização
A otimização das c o n d i ç õ e s d e reação p a r a ensaios enzimáticos
t e m , t r a d i c i o n a l m e n t e , envolvido a variação d e u m ú n i c o f a t o r e
o e s t u d o de seu efeito sobre a v e l o c i d a d e de reação. E n t ã o , repete-
se o e x p e r i m e n t o c o m u m s e g u n d o fator, e assim p o r diante, até
q u e os efeitos de todas as variáveis t e n h a m sido testados. U m a
c o m b i n a ç ã o ideal d e variáveis é selecionada de a c o r d o c o m esses
e x p e r i m e n t o s , e a validade das c o n d i ç õ e s escolhidas é verificada.
Essa a b o r d a g e m e m p í r i c a t r a d i c i o n a l tem s i d o s u b s t i t u í d a por
técnicas mais novas de co-otimização simples e m e t o d o l o g i a de
superfície d e resposta. 9
 Princípios da Enzimologia Clínica
Padronização
O s esforços atuais paia a padronização de enzimas estão concen-
trados n o desenvolvimento de u m sistema que forneça a possibi-
lidade de comparação de resultados de testes, independente-
m e n t e do m é t o d o de medida. Para atingir este objetivo tem sido
proposto u m "sistema de referência" baseado nos conceitos de
confiabilidade metrológica e de hierarquia de m é t o d o s analíti-
cos. 3 U m p r o c e dime nt o de referência e materiais de referência
certificados são a base da cadeia de confiabilidade metTológica
(Figura 9-8). C o m o parte dessa hierarquia, têm sido desenvolvi-
dos procedimentos de referência a 37°C para as enzimas mais
c o m u n s , e u m grupo de laboratórios de referência realiza as
medidas e m u m nível metrológico apropriadamente alto.10'15
O s procedimentos de referência ajustam padrões de precisão
e exatidão contra os quais são avaliados os d e s e m p e n h o s relativos
d o s m é t o d o s planejados para o uso de rotina. O procedimen to
de referência é usado para determinar u m valor certificado para
o material de referência. Esse material certificado é, então, usado
pelos fabricantes para determinar valores para os calibradores
comerciais, resultando em confiabilidade do valor obtido n o
laboratório.
Para um sistema de referência ser capaz de padronizar os
resultados de diferentes ensaios de uma determinada atividade
emimática, algumas condições precisam ser satisfeitas. 8 Primeiro,
o procedimento de referência usado para determinar o valoT d o
material de referência e o(s) método(s) de rotina a ser(em)
calibrado(s) deve ter especificidades idênticas para a enzima e m
análise e suas isoenzimas ou isoformas específicas. Segundo, as
propriedades do material calibrador devem ser as mesmas o u
m u i t o similares às da enzima em análise e m sua matriz natural,
geralmente o soro.
Figura 9 - 8 O sistema de referência proposro para medição de
ensima mostrando a confiabilidade do resultado do laboratório
conforme o procedimento de medida de referencia. (De Panteghini M,
Ceriotti F, Schumann G, Siekmann L. Establishing a reference sysrem
in clinicai enzymology. Clin Chem Lab Med 2001;39:795-800.
Reimpresso com permissão de Walter de Gr li v ter.)
CAPÍTULO 9 155
Garantia de Qualidade
A aplicação sistemática de u m programa de garantia de qualidade
(QA) é essencial q u a n d o se m e d e enzimas para garantir que a
eficiência analítica satisfatória dos ensaios enzimáticos seja
mantida n o dia-a-dia. Preparações liofilizadas e líquidas, con-
tendo várias enzimas, estão disponíveis a partir de fontes comer-
ciais e são usadas para fins de Q A . N o passado, /iooÍs (misturas)
de soro preparados n o laboratório eram usados amplamente para
fins de QA; seu uso tem sido bastante d e s c o n t i n u a d o por razões
de biossegurança. Preparações liofilizadas e líquidas, c o n t e n d o
várias enzimas, estão disponíveis a parrir de fontes comerciais, e
elas têm uma função útil e m Q A . E m geral a reprodutibilidade
de resultados de ensaios enzimáticos no dia-a-dia tem u m coefi-
ciente de variação de ± 5% a 10%.
Medida da Concentração de
Massa Enzimática
Vários imunoensaios para se medir massa de enzimas e isoenzi-
mas humanas, em vez da atividade catalítica, têm sido descritos.
Para desenvolver tais ensaios, proteínas enzimáticas purificadas
precisam ser preparadas para (1) atuarem c o m o calibradores, (2)
serem marcadas e (3) serem usadas para produzir o anticorpo
específico para a enzima. Esses m é t o d o s identificam todas as
moléculas c o m os determinantes antigênicos necessários para o
reconhecimento pelo anticorpo, de tal forma que moléculas de
enzima inativas, que estão imunologicamente inalteradas, são
medidas juntamente c o m as moléculas ativas. Tem sido obser-
vado que isto é importante para a determinação de algumas
enzimas digestivas, tais c o m o a tripsina, q u a n d o precursores ina-
tivos e inibidores da atividade catalítica estão presentes n o
plasma. N a maioria dos casos, n o entanto, n ã o ocorre degradação
o u variações da enzima ativa n o sangue de forma que a equiva-
lência clínica dos diferentes procedimentos de medida é obtida.
Na prática, entretanto, os i m u n o e n s a i o s não têm sido ampla-
m e n t e usados para a determinação das atividades enzimáticas
totais para fins diagnósticos, porque esses ensaios geralmente não
p o d e m competir e m velocidade, precisão e custo c o m a medida
automatizada da atividade catalítica total. A l é m disso, várias ati-
vidades enzimáticas n o soro são causadas por misturas de isoen-
zimas imunologicamente distintas, de tal forma que u m ensaio
que utiliza u m único tipo de anticorpo n o r m a l m e n t e determina
s o m e n t e uma das formas enzimáticas. N o entanto, essa desvan-
tagem na determinação da atividade enzimática total torna-se
uma vantagem considerável na medida das isoformas e isoenzi-
mas específicas, e os m é t o d o s imunológicos têm assumido grande
importância na análise de isoenzimas para fins diagnósticos
(Capitulo 19).
Enzimas c o m o R e a g e n t e s Analíticos
As enzimas são usadas c o m o reagentes analíticos para a medida
de vários metabólitos e substratos e, e m imunoensaios, para
detectar e quantificar reações imunológicas.
Medidas de Metabólitos
O uso de enzimas c o m o reagentes analíticos para medir metabó-
litos freqüentemente oferece a vantagem de grande especificidade
para a substância a ser quantificada. Essa alta especificidade
n o r m a l m e n t e remove a necessidade dos estágios de separação o u
purificação preliminares, de tal forma que a análise é realizada
diretamente em misturas complexas c o m o o soro. Uricase (urato
oxidase), urease e glicose oxidase são exemplos de enzimas alta-
mente específicas usadas em ensaios clínicos importantes, tais
c o m o as medidas de ácido úrico, uréia e glicose em fluidos bio-
lógicos. Entretanto, alta especificidade n e m sempre é atingida na
156 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

prática, e o c o n h e c i m e n t o das especificidades pelos substratos Portanto, a constante de velocidade de primeira ordem, k, é igual
das enzimas reagentes é, portanto, essencial para permitir que
possíveis interferências n o ensaio possam ser antecipadas e cor-
rigidas. As reações acopladas são freqüentemente usadas para
O s métodos nos quais alguma propriedade relacionada à
criar u m sistema analítico enzimático para a determinação de um
concentração de substrato (tais c o m o absorvância, fluorescência,
c o m p o s to e m particular. Por exemplo, a glicose é determinada,
quimioluminescência etc.) é medida em dois tempos fixos durante
usando-se a reação da hexoquinase. A hexoquinase converte
o curso da reação são c o n h e c i d o s c o m o métodos cinéticos de dois
outros açúcares além da glicose a seus ésteres 6-fosfato. Entre-
pontos. Eles são, teoricamente, os mais precisos para a determina-
tanto, a reação indicadora para monitorar essa mudança é cata-
ção enzimática de substratos. Entretanto, esses m é t o d o s são tec-
lisada pela glicose 6-fosfato desidrogenase, uma enzima que é
nicamente mais exigentes do que os m é t o d o s de equilíbrio, e
altamente específica para seu substrato; assim, o processo global
todos os fatores que afetam a velocidade de reação, tais c o m o
é altamente específico para a glicose.
p H , temperatura e quantidade de enzima, precisam ser mantidos
constantes de u m ensaio para o outro, assim c o m o o m o m e n t o
Métodos de Equilíbrio
das duas medidas. Essas condições são prontamente alcançadas
Na maioria dos ensaios usados para determinar enzimaticamente
em analisadores automatizados. U m a solução de referência do
a quantidade de uma substância, é permitido que a reação con-
analito (substrato) deve ser usada para a calibração. Para garantir
tinue até sua finalização de forma que t o d o o substrato tenha
condições de reação de primeira ordem, a concentração de subs-
sido convertido em u m produto mensurável. Esses m é t o d o s são
trato deve ser baixa q u a n d o comparada c o m a K,n (isto é, na
d e n o m i n a d o s end £oint (ponto final) ou, mais corretamente,
ordem de m e n o s do que 0 , 2 x I O . Prefere-se, portanto, as
m é t o d o s de equilíbrio, u m a vez que a reação cessa q u a n d o o equi-
enzimas c o m altos valores de para análises cinéticas para dar
líbrio é alcançado. As reações nas quais o p o n t o de equilíbrio
uma faixa mais ampla de uso da concentração de substrato.
corresponde praticamente à conversão completa do substrato são
obviamente preferíveis para esse tipo de análise. N o entanto,
equilíbrios desfavoráveis são freqüentemente deslocados da
Imunoensaio
Em u m i m u n o e n s a i o enzimático, é permitido que anticorpos ou
direção desejada por reações enzimáticas ou não-enzimáticas adi-
antígenos marcados c o m enzimas reajam primeiramente com o
cionais que convertem ou "aprisionam' 1 u m produto da primeira
ligante e, então, u m substrato enzimático é subseqüentemente
reação.
adicionado. ALP, peroxidase de rábano, glicose 6-fosfato desidro-
A medida que a concentração de substrato cai a baixos níveis
genase e p-galactosidase têm sido usadas c o m o marcadores enzi-
e m direção ao final da reação, a ÍC, da enzima tornasse impor-
máticos. U m a modificação dessa metodologia é o ensaio de imu-
tante na determinação da velocidade de reação. Enzimas com
noabsorção enzimática (ELISA), n o qual u m dos c o m p o n e n t e s
altas afinidades por seus substratos (valores baixos de ÍCJ são,
da reação está ligado a u m a superfície de fase sólida. Nessa
portanto, mais adequadas para análises de equilíbrio. O s métodos
técnica, uma alíquota da amostra é colocada para interagir com
de equilíbrio são muito insensíveis às pequenas variações das
o anticorpo na fase sólida. A p ó s lavagem, u m segundo anticorpo
condições de reação. N ã o é necessário ter exatamente a mesma
marcado c o m enzima é adicionado para formar u m complexo
quantidade de enzima em cada mistura de reação o u manteT o
Ab-Ag-Ab-enzima. O excesso de anticorpo marcado com enzima
p H o u a temperatura absolutamente constantes, desde que as
livre é, então, lavado e o substrato é adicionado; a conversão do
variações não sejam tão grandes que a reação não seja completada
substrato é proporcional à quantidade de antígeno. N o s imuno-
dentro d o tempo fixado permitido.
ensaios, a especificidade da enzima não é importante, mas sim
sua sensibilidade.
Métodos Cinéticos
As reações de primeira ordem o u de pseudoprimeira ordem são
Aplicações Analíticas d a s Enzimas
as reações mais importantes para a determinação cinética da
concentração de substrato. Para qualquer reação de primeira
Imobilizadas
A s enzimas imobilizadas, reutilizáveis, têm sido usadas e m alguns
ordem, a concentração de substrato [S] em u m determinado
sistemas de ensaio. Nestes ensaios, as enzimas imobilizadas têm
t e m p o í após o início da reação é dada por
sido quimicamente ligadas a adsorventes, tais c o m o (1) celulose
microcristalina, (2) dietilaminoetil celulose (DEAE), (3) carboxi-
[S] - [S0] x e (6)
metil celulose e (4) agarose. O s grupos diazo, triazina e azida são
usados para aderir a proteína enzimática à matriz insolúvel, for-
o n d e [S0] é a concentração de substrato inicial, ê é a base d o
m a n d o partículas e m contato c o m a solução de substrato, ou
logaritmo natural, e k é a constante da velocidade.
uma superfície e m contato c o m a solução de substrato, tal c o m o
A variação da concentração de substrato e m u m intervalo de
uma membrana ou u m revestimento na superfície interna de u m
t e m p o fixo é diretamente proporcional à sua concentração inicial,
vaso c o n t e n d o a solução de substrato. Dentre as enzimas dispo-
uma propriedade geral das reações de primeira ordem.
níveis nesta forma imobilizada estão (1) urease, (2) hexoquinase,
Para uma reação enzimática, as cinéticas de primeira ordem
(3) a-amilase, (4) glicose oxidase, (5) tripsina e (6) leucina ami-
ocorrem quando [S] é pequena q u a n d o comparada a K„,. Assim
nopeptidase. A estabilidade ao calor e a outras formas de inati-
vação é consideravelmente aumentada comparada com enzimas
e m solução. As enzimas proteolíticas imobilizadas não estão sujei-
» = 4»t<[S] (7) tas à autodigestão. Entretanto, algumas propriedades da enzima,
*v m tais c o m o sua ÍCn o u seu p H ideal, p o d e m ser alteradas.
As enzimas incorporadas e m membranas formam parte de
OU eletrodos enzimáticos (Capítulo 5). A superfície de um eletrodo
sensível a íons é revestida c o m uma camada de gel poroso no
« = k[S] (8) qual uma enzima foi polimerizada. Q u a n d o o eletrodo é imerso
 Princípios da Enzimologia Clínica C A P Í T U L O 9 157

e m u m a solução d o substrato apropriado, a ação da enzima 6. Moss DW. Isoenzyme analysis. London: The Chemical Society,
p r o d u z í o n s p a r a os q u a i s o e l e t r o d o é sensível. 1979.
7. Nomenclature Committee, I.E. 1978. Recommendations of the
Medida de isoenzimas e isoformas Nomenclature Committee of IUB on the Nomenclature and
Classification of Enzymes. New York; Academic Press, 1979.
Diversas técnicas analíticas t ê m sido usadas para m e d i r isoenzimas
8. Panteghini M, Ceriotti F, Schumann G, Siekmann L. Establishing a
o u i s o f o r m a s . Elas i n c l u e m e l e t r o f o r e s e { C a p í t u l o 6), f o c a l i z a ç ã o
reference system in clinicai enzymology. Clin Chem Lab Med
isoelétrica, c r o m a t o g r a f i a ( C a p í t u l o 7), i n a t i v a ç ã o q u í m i c a e dife-
2001;39-795-800.
r e n ç a s n a s p r o p r i e d a d e s catalíticas, m a s o s m é t o d o s d e r o t i n a m a i s
9. Raurela GS, Snee RD, Millet WK. Response-surface co-optimization of
c o m u n s a g o r a se b a s e i a m e m e n s a i o s i m u n o q u í m i c o s .
reaction condirions in clinicai chemical methods. Clin Chem
O s métodos imunoquímicos de análise de isoenzimas são parti-
1979;25.1954-64.
c u l a r m e n t e aplicáveis a i s o e n z i m a s d e r i v a d a s d e m ú l t i p l o s íoci
10 Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Clerc-Renaud P, Ferrem CA,
g ê n i c o s p o r q u e essas são, e m geral, m a i s d i s t m g u í v e i s a n t i g e m c a -
Férard G, et al. IFCC primary reference procedures for the
mente. Entretanto, o maior p o d e r discriminatório dos anticorpos
measu remem of catalytic activity concentrations of enzymes at
m o n o c l o n a i s t e m t r a z i d o d e f o r m a p o t e n c i a l t o d a s as m ú l t i p l a s
37 ' C . Part 2 Reference procedure for the measurement of catalytic
f o r m a s d e u m a enzima para o alcance da análise i m u n o q u í r m c a .
concentration of creatine kinasc Clin Chem Lab Med
A l g u n s d e s s e s m é t o d o s f a z e m u s o d a a t i v i d a d e c a t a l í t i c a d a s iso-
2002 ; 40(6):63542.
e n z i m a s . P o r e x e m p l o , a a t i v i d a d e r e s i d u a l p o d e ser m e d i d a a p ó s
11. Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Clerc-Renaud P, Ferrero CA, Férard
a r e a ç ã o c o m o a n t i - s o r o . Esses m é t o d o s n ã o d e p e n d e m da ativi-
G, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of
d a d e c a t a l í t i c a d a i s o e n z i m a q u e está s e n d o d e t e r m i n a d a . E n t r e -
catalytic activity concentrations of enzymes at 37 "C. Part 3. Reference
tanto, c o m o desenvolvimento de sistemas de i m u n o e n s a i o s
procedure for the measurement of catalytic concentration of lactate
a u t o m a t i z a d o s , os m é t o d o s d e r o t i n a m a i s c o m u n s p a r a se d o s a r
dehydrogenase Clin Chem Lab Med 2002;40:643-8
i s o e n z i m a s , tais c o m o C K - M B , s ã o E L I S A s d e f a s e s ó l i d a . 12 Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Férard G, Ferrero CA, Franck PFH,
A e s c o l h a e a a p l i c a ç ã o d e v á r i o s m é t o d o s d e a n á l i s e d e iso-
et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of
e n z i m a s n a e n z i m o l o g i a c l i n i c a s ã o d i s c u t i d a s n o C a p í t u l o 19 e m catalytic activity concentrations of enzymes at 37 "C. Part 4- Reference
relação a sistemas de isoenzimas específicos. procedure for the measurement of catalytic concentration of alanine
aminotransferase Clin Chem Lab Med 2002 ; 40-719-24
13. Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Férard G, Ferrero CA, Franck FFH,
R EFERÊ N CIAS
et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of
1- C o m m i s s i o n o n B i o c h e m ic a l N o m e n c l a t u r e I. N o m e n c l a t u r e of catalytic activity concentrations of enzymes at 37"C, Part 5. Reference
m u l t i p l e f o r m s of enzymes. J Biol C h e m 1977;252:5939-41
procedure for the measurement of catalytic concentration of asparta:e
2. Copeland RA Enzymes a practical introduction to strucrure, aminotransferase. Clin Chem Lab Med 2002;40.725-33.
mechanism, and data analysis Basel: V C H Publíshers, 1996.
14. Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Clerc-Renaud P, Férard G,
3. IS018153:2003. In vitro diagnostic medicai devices—Measurement of
Ferrero CA, et al. IFCC primary reference procedures for the
quantities in samples of biological origin—Metrological traceability of
measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37*C.
values for catalytic concentrations of enzymes assigned to calibrators and
Part 6. Reference procedure for the measurement of catalytic
control materiais. ISO, Geneva, Switzerland.
concerniation of gamma-glutamyltransferase. Clin Chem Lab Med
4. IUPAC Commission on Quantities and Units and IFCC Expert Panei
2002;40:734-8.
on Quantities and Units: Approved Recommendations (1978).
15. Schumann G, Aoki R, Ferrero CA, Ehlets G, Férard G, Gella FJ, et al.
Quantities and units in clinicai chemistry. Clin Chim Acta
IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic
1979;96 157F-83F.
5 Lorenz K. A p p r o v e d r e c o t n m e n d a t i o n o n I F C C m e t b o d s ferr t h e
activity concentrations of enzymes at 37 "C. Part 8. Reference procedure
m e a s u T e m e n t of catalytic c o n c e n t r a t i o n s of enzymes. PaTt 9 I F C C
for the measurement of catalytic concentration of Ot-amylase. Clin Chem
m e t h o d for amylasc. C l i n C h e m Lab M e d 1998;36:185-203.
Lab Med 2006;44: in press.
C A P Í T U L O I O

Princípios das Técnicas

Imunoquímicas*
L.J. Kricka, D. Phil., F.A.C.B., C.Chem., F.R.S.C., F.R.C.Path.

OBJETIVOS Anti-soro Policlonal: Anti-soro produzido em u m animal

1. Definir os seguintes termos:
hospedeiro n o r m a l e m resposta à administração de u m
Anticorpo imunógeno.
Avidez: Força total de ligação d e u m anticorpo a u m antígeno;
Antígeno
inclui a soma das afinidades das ligações de todos os sítios
Hapteno
de c o m b i n a ç ã o individuais n o anticorpo.
Imunoensaio
Bacteriófago: Q u a l q u e r vírus q u e infecta u m a bactéria.
Imunógeno
Ensaio de I m u n o a b s o r v â n c i a Ligado à E n z i m a (ELISA): U m
Monoclonal
i m u n o e n s a i o d o tipo s a n d u í c h e de enzima em q u e u m dos
Policlonal
c o m p o n e n t e s da reação está ligado à superfície de u m a fase
2. Esquematizar e classificar os componentes de uma molécula de sólida para facilitar a separação dos reagentes marcados
anticorpo IgG. ligados ou livres.
3. Descrever os tipos de interações que ocorrem entre um antígeno e H a p t e n o : U m d e t e r m i n a n t e q u i m i c a m e n t e d e f i n i d o que,
um anticorpo. q u a n d o c o n j u g a d o a u m carreador imunogênico, estimula a
4. Comparar as reações de precipitação às reações de aglutinação. síntese de anticorpos específicos para o h a p t e n o .
5. Descrever e apresentar a utilidade clínica de cada um dos itens a I m u n o e n s a i o : Ensaio baseado n a reação de u m antígeno com
seguir: u m anticorpo específico para este antígeno.
Difusão em gel I m u n ó g e n o : U m a substância capaz de induzir u m a resposta
Imunoeletroforese imune.
Imunofixação Marcador: Q u a l q u e r substância c o m p r o p r i e d a d e mensurável
Western blotting de se ligar a u m antígeno, anticorpo ou substâncias ligantes
Calibração (como avidina, biotina ou proteína A).
6. Listar os marcadores usados nos imunoensaios isotópicos e T é c n i c a de I s m u n o e n s a i o E n z i m á t i c o de Multiplicação
não-isotópicos.
(EMIT): U m i m u n o e n s a i o de não-separação baseado n a
marcação enzimática.
7. Comparar imunoensaios competitivos aos não-competitivos e
W e s t e r n Blotting: Ensaio baseado em u m a m e m b r a n a n o qual
imunoensaios heterogêneos aos homogêneos.
as proteínas são separadas por eletroforese seguida da
8. Descrever:
transferência para u m a m e m b r a n a e detecção com
I m u n o e n s a i o enzimático
a n t i c o r p o marcado.
Ensaio de imunoabsorvância ligado à enzima
Imunoensaio multiplicado por enzima
9. Descrever ensaio de imunofluorescência e imunoensaio de

A
fluorescência polarizada. s reações i m u n o q u í m i c a s f o r m a m a base para os ensaios
10. Citar o princípio da imunocitoquímíca. clínicos sensíveis e específicos c o n h e c i d o s c o m o i m u n o -
11. Citar a utilidade clínica dos imunoensaios em um laboratório clínico. ensaios. I , z , 7 , 1 ° E m u m i m u n o e n s a i o típico, u m a n t i c o r p o
é utilizado c o m o reagente para d e t e c t a r o analito (antígeno) de
interesse. A especificidade a p u r a d a e a alta a f i n i d a d e dos anti-
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES corpos p o r a n t í g e n o s específicos, j u n t a m e n t e c o m a h a b i l i d a d e
A f i n i d a d e : Energia de interação de u m ú n i c o sítio de i n c o m p a r á v e l dos a n t i c o r p o s para fazer ligações cruzadas com
c o m b i n a ç ã o de u m a n t i c o r p o com o seu epítopo os antígenos, p e r m i t e m a i d e n t i f i c a ç ã o e a q u a n t i f i c a ç ã o de
c o r r e s p o n d e n t e n o antígeno. substâncias específicas p o r u m a v a r i e d a d e de m é t o d o s . Vários
A n t i c o r p o : Molécula da classe das i m u n o g l o b u l i n a s (Ig) (p ex , destes ensaios, a t u a l m e n t e , são agora a u t o m a t i z a d o s . O s prin-
IgA, IgG ou IgM) q u e se liga, especificamente, a u m cípios dos m é t o d o s mais c o m u m e n t e utilizados no l a b o r a t ó r i o
antígeno ou h a p t e n o . são discutidos n e s t e capítulo.
A n t i c o r p o M o n o c l o n a l : P r o d u t o de u m ú n i c o clone ou
linhagem de plasmócitos. CONCEITOS BÁSICOS E DEFINIÇÕES
A n t í g e n o : Q u a l q u e r material capaz de reagir com u m O s a n t i c o r p o s são imunoglobulinas que se ligam, especifica-
a n t i c o r p o sem, necessariamente, ser capaz de induzir a m e n t e , a u m a grande variedade de antígenos naturais e sintéticos
formação de anticorpo. c o m o proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos, lipídios e outras
moléculas. Analiticamente, a i m u n o g l o b u l i n a G (IgG) é o rea-
gente i m u n o q u í m i c o de uso mais f r e q ü e n t e . Ela é u m a glicopro-
* 0 autor agradecidamente reconhece as contribuições originais do Dr. Gregory teína (peso molecular [MW] 158.000 Da) composta de duas
Buffone nas quais se baseiam partes desce capítulo. cadeias duplas, cada grupo é c o m p o s t o por u m a cadeia pesada

159
160 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
x X
o 5
o o
ü o
Fragmento Fc
Cbh —
Cadeia
Fagmento Fab
Sítios de ligação
ao antigeno
Figura 10-1 Diagrama esquemático da molécula de anticorpo IgG (imunoglobulina G) mostrando
carboidrato (Cbh), pontes dissulfeto (SS) e os principais fragmentos produzidos por tratamento com enzimas
proteolíticas (F[ab'JZl Fc, Fab, Fd).
(y) e uma leve (X, ou k), ligadas por pontes dissulfeto (Figura 10-1).
As pontes dissulfeto intercadeias mantêm as cadeias duplas
unidas e criam uma molécula simétrica. A seqüência de amino-
ácidos variável na região aminoterminal de cada cadeia determina
a especificidade antigênica de u m anticorpo em particular. Cada
seqüência única de aminoácidos é u m produto de uma única
linhagem de plasmócitos ou clone, e cada linhagem de plasmó-
citos produz anticorpos com especificidades únicas. U m antigê-
nico complexo é capaz de induzir uma variedade de anticorpos
com diferentes especificidades, derivados de diferentes linhagens
celulares. U m anticorpo desenvolvido desta forma é denominado
poíicíonal e exibe diversas especificidades em sua reatividade com
o imunógeno. Cada região única do antigeno molecular que se
liga a u m anticorpo complementai é denominada epítopa (deter-
minante antigênico).
U m i m u n ó g e n o é uma proteína ou uma substância acoplada
a u m carreador, geralmente uma proteína. Quando o imunógeno
é introduzido em u m hospedeiro estranho, ele induz a formação
de u m anticorpo. U m hapteno é u m determinante quimica-
mente definido que, sozinho, não estimula a resposta imune. N o
entanro, quando conjugado a u m carreador imunogênico, a
molécula conjugada estimula a síntese de u m anticorpo especí-
fico para o hapteno. Algumas propriedades gerais necessárias
para a imunogenicidade incluem o seguinte:
1. Áreas de estabilidade estrutural na molécula
2. Randomicidade da estrutura
3. Peso molecular m í n i m o de 4.000 a 5.000 Da
4. Capacidade para ser metabolizado (critério necessário, mas
não suficiente para algumas classes de antígenos)
—Cbh
Clivagem por pepsina
Clivagem por papaína
Fragmento
F(ab')2
Região
'variável
5. Acessibilidade de uma configuração imunogênica particular
para o mecanismo de formação de anticorpos
6. Característica de ser estruturalmente estranho ao organismo
A força ou energia da interação entre o anticorpo e o antigeno
é descrita por dois termos. A afinidade refere-se à grandeza ter-
modinâmica que define a energia de interação de u m único sítio
de combinaçao do anticorpo e seu epítopo correspondente no
antigeno. A avidez refere-se à força total de ligação do anticorpo
ao antigeno e i n c l u i a soma das afinidades das ligações de todos
ns sítios de combinação individuais no anticorpo. Portanto, a
afinidade é uma propriedade da substância ligada (antigeno) e a
avidez é uma propriedade do ligante (anticorpo).
O anti-soro policlonal é produzido em u m animal normal
hospedeiro em resposta à administração de u m imunógeno. E m
contraste, u m anticorpo m o n o c l o n a l é o produto de u m único
clone ou linhagem de plasmócitos, e não uma mistura heterogê-
nea de anticorpos produzidos por vários clones celulares em res-
posta à imunização. Os anticorpos monoclonais atualmente são
empregados amplamente como reagentes em técnicas de imuno-
ensaio.3 O método usual de produção de anticorpos monoclonais
envolve a fusão de linfócitos sensibilizados de baços ou linfonodos
de camundongos imunizados com uma linhagem celular de
mieloma m u r i n o de uma cultura de tecidos (uma linhagem de
linfócitos B imortalizados). A s linhagens celulares de mieloma
m u r i n o mais comumente utilizados são deficientes para a enzima
hipoxantina guanina fosforribosiltransferase (HGPRT) e, por-
tanto, não sintetizam bases putirias a partir de timidina e hipo-
xantina na presença de aminopterina. Após a fusão, as células são
colocadas em u m meio de seleção contendo hipoxantina, aminop-
 Princípios das Técnicas Imunoquímicas CAPÍTULO 10 161

terina e t i m i d m a (meio H A T ) para crescer seletivamente as linha-
gens celulares híbridas fusionadas. As células híbridas fusionadas
irão sobreviver no meio H A T porque combinam a imortalidade
das células do mieloraa ao material genético das células esplénicas
necessário paia a síntese da HGPRT. As colônias que surgem a
partir das células fusionadas são examinadas quanto à produção
de anticorpos, e as linhagens celulares secretoras de anticorpos da
especificidade desejada são clonadas em subculturas. Assim, uma
linhagem clonal única é então isolada para pioduzir u m anticorpo
com especificidade para u m único epítopo antigênico e com uma
única energia de ligação ou afinidade.
Os anticorpos monoclonais apresentam uma vantagem ana-
lítica, pois dois anticorpos de especificidades diferentes podem
ser usados em u m único ensaio. Por exemplo, u m anticorpo de
fase sólida específico para u m único epítopo e outro anticorpo
marcado — específico para u m epítopo diferente — reagem com
o antígeno em uma única incubação. Esta combinação elimina
(1) a adição seqüencial em duas etapas do antígeno e do anti-
corpo marcado à fase sólida, (2) uma etapa de incubação e (3)
uma etapa de lavagem, que pode ser necessária quando se utili-
zam anticorpos policlonais que se ligam a ambos os sítios. N o
entanto, a incomparável capacidade do anticorpo monoclonal
para reagir com u m único epítopo em u m antígeno multivalente
resulta na incapacidade da maioria dos anticorpos monoclonais
para fazer ligação cruzadas e precipitar antígenos macromolecu-
lares. Portanto, anticorpos monoclonais não são utilizados em
todos os imunoensaios nos laboratórios clínicos, especialmente
naqueles que utilizam os métodos tradicionais de precipitação.
A tecnologia de phage-display é urna abordagem m vitro dife-
rente para a produção de anticorpos que mimetiza o sistema
imune. 11 Neste processo, os genes codificadores dos domínios
variáveis das cadeias pesada e leve da imunoglobulina, isolados
de linfócitos, são amplificados pela reação em cadeia da polime-
rase (Capítulo 17) e introduzidos em u m vetor bacteriófago fila-
mentoso para formar bibliotecas combinatórias de genes V H e V[_.
Bacteriófagos individuais apresentam cópias de u m anticorpo
específico em suas superfícies e, então, a biblioteca de fagos é
analisada para procurar anticorpos de especificidade definida
através da utilização de u m antígeno imobilizado ("panning"). Esta
técnica mimetiza a seleção imune e isola os anticorpos com
muitas especificidades de ligação diferentes. C o m este processo
foram formadas grandes bibliotecas que apresentam mais de IO12
anticorpos.
LIGAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
Nesta seção serão discutidos vários fatores que afetam a ligação
dos antígenos aos anticorpos
Forças de Ligação
Várias forças agem em cooperação para produzir a ligação antí-
geno-anticorpo. As três principais forças contribuidoras são 0 )
interações eletrostáticas dipolo-dipolo tipo van der Waals-
L o n d o n , (2) interações hidrofóbicas e (3) ligação coulômbica
iônica (primariamente entre os grupamentos C O O " e N H / n o
antígeno e no anticorpo).
Mecanismo de Reação
A ligação de u m antígeno a u m anticorpo não é estática, mas é
uma reação de equilíbrio que acontece em três fases, A reação
inicial (fase 1) de u m antígeno multivalente (Ag,.) com u m anti-
corpo (Ab) bivalente ocorre m u i t o rapidamente em comparação
ao crescimento subseqüente dos complexos (fase 2) e é descrita
pela seguinte equação:
-•'U + A b < " >A g n A b ^ = = ^ A g a A b i , (i)
t_L k-2
onde ícj > » k2, n é o número de epítopos por molécula, e a e b
são os números de moléculas de antígeno e anticorpo por com-
plexo. A fase 3 da reação envolve a precipitação do complexo
após o mesmo atingir u m tamanho crítico. A velocidade destas
reações depende da concentração de eletrólitos, p H e tempera-
tura, bem como dos tipos de antígeno e anticorpo e da afinidade
de ligação do anticorpo.

o
O
o
VfY K Ã Excesso de anticorpo
Todos os sitios aníigênicos
estão recobertas por anticorpos
Y y y e a formação de rede é
inibida.
Complexos solúveis

Zona de equivalência
(Proporção ideal)
Este estado ocorre quando estão
o o
VYY presentes 2 ou 3 moléculas de
o o
% anticorpo para cada molécula
de antígeno; produz a formação
máxima de rede e, portanto, a
Complexos insolúveis
precipitação máxima.

Excesso de antigeno
O O, Todos os sítios dos anticorpos

O o yV & estão saturadas pelos antígenos.

Trios (2 antígenos + 1 anticorpo)
são o tamanho máximo alcançado
pelas partículas. Nenhum
Antígeno Anticorpo Complexos solúveis
precipitado é formado.

Figura 1 0 - 2 Diagrama esquemático para a reação de precipitação. A, Excesso de anticorpo, B, Zona de

equivalência. C, Excesso de antígeno.
162 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
Reação de Precipitação
Se o número de sítios de combinação do anticorpo [Ab] é signi-
ficativamente maior do que o número de sítios dc ligação do
antigeno [Ag], estes sítios de ligação no antigeno são então rapi-
damente saturados pelo anticorpo, antes de ocorrer a ligação
cruzada, resultando na formação de pequenos complexos antí-
geno-anticorpo compostos de A g A b (Figura 10-2, A). Para o caso
no qual o anticorpo está moderadamente em excesso ([Ab] >
[Ag]), a probabilidade de ligação cruzada do A g pelo A b é maior
e, por isso, a formação de complexos grandes é favorecida (Figura
10-2, B). N o caso em que o [Ag] está em grande excesso, a forma-
ção de grandes complexos é menos provável e teoricamente o
tamanho m í n i m o dos complexos é Ag^Ab (Figura 10-2, C).
Este modelo descreve os resultados observados quando os
antígenos e anticorpos são misturados em várias razões de con-
centração. A curva mostrada na Figura 10-3 é u m diagrama
esquemático da cUTva de precipitação clássica. Embora a concen-
tração de anticorpo total seja constante, a concentração de anti-
corpo livre, [Ab]f, e de antigeno livre, [Ag] h varia para qualquer
razão A g / A b determinada. U m a baixa razão A g / A b existe na
seção A da Figura 10-3 (zona de excesso de anticorpo). Sob estas
condições, [Ab] f existe em solução, mas [Ag] f não. A medida que
o antigeno total aumenta, o tamanho dos imunocomplexos
aumenta até a equivalência (Figura 10-3, seção B) em que exista
pouco ou n e n h u m |Ab]f ou [Ag] f . Esta é a zona de equivalência
e é a razão de combinação ideal para a ligação cruzada no sistema
particular sob análise. Quando a razão A g / A b aumenta (Figura
10-3, seção C), o tamanho dos imunocomplexos d i m i n u i e [Ag]f
aumenta (zona de excesso de antigeno).
Fatores Químicos
Os fatores químicos que influenciam a ligação antigeno/anticorpo
incluem espéc:es iónicas, força iõnica e moléculas poliméricas.
Efeitos das Espécies de íons e Força tônica
Os sais catiônicos promovem a inibição da ligação do anticorpo
a u m hapteno catiônico. A ordem de inibição por vários cátions
B
Parâmetro
[Antigeno]
Figura 10-3 Diagrama esquemático da curva de precipitação
ilustrando as diferentes zonas de concentração de antigeno. A, Excesso
de anticorpo. B, Equivalência. C, Excesso de antigeno. O parâmetro
medido pode ser a quantidade de proteína precipitada, dispersão de luz
ou outro parâmetro mensurável. A concentração de anticorpo é
mantida constante neste exemplo.
é Cs" > Rb + > NH4* > 10 > Na J > Li*. Esta OTdem corresponde à
diminuição do raio iônico e aumento do raio de hidratação. Para
os hapieno;) aiiiònicus e sais aniônicos, a ordem de inibição da
ligação é CNS~> N 0 3 " > I~ > Br" > C l " > F~, novamente na ordem
de diminuição do raio iônico e aumento do raio de hidratação.
Efeito do Polímero
A adição de u m polímero linear à mistura de antigeno e anticorpo
causa u m aumento significativo na taxa de crescimento do imuno-
complexo e aumenta sua precipitação, especialmente com anti-
corpo de baixa avidez. Várias espécies de polímeros, como (1)
dextran (um polímero D-glucose de alto peso molecular), (2) álcool
polivinil e (3) polietileno glicol 6.000 (PEG ou Carbowax) são
empregadas nos métodos imunoquímicos. As características mais
desejáveis do polímero são (1) alto peso molecular, (2) alto grau de
linearidade (ramificação mínima) e (3) alta solubilidade em água.
PEG 6.000 apresenta estas características e é particularmente útil
nos métodos imunoquímicos nas concentrações de 3 a 5 g / d L .
MÉTODOS QUALITATIVOS
As técnicas imunoquímicas utilizadas com propósitos qualitati-
vos incluem (1) difusão passiva em gel, (2) imunoeletroforese
(1EP) e (3) Western blotting.
Difusão Passiva em Gel
Vários métodos imunoquímicos qualitativos e quantitativos uti-
lizam meios semi-sólidos, como ágar ou agarose. Esta prática
estabiliza o processo de difusão com relação à mistura causada
pela vibração ou convecção e permite a visualização de bandas
de precipitação para avaliação quantitativa e qualitativa da reação.
A razão antígeno-anticorpo, concentração de sal e intensificação
por polímero possui a mesma influência na reação antígeno-
anticorpo em géis assim como nas reações em solução.
Se a matriz não interage com as espécies moleculares sob
investigação, a difusão passiva dos Teagentes na matriz semi-sólida
é descrita pela equação de Fick
dQ
=-D (2)
dt dx
onde:
dQ = Quantidade de substância em difusão que passa pela
área A durante o tempo
dt = Variação do tempo
dC/dx = Gradiente de concentração
D = Coeficiente de difusão
O coeficiente de difusão, D, é uma função direta da tempe-
ratura; também é inversamente proporcional ao volume molecu-
lar hidratado das espécies em difusão. A razão dQ/dt é uma
função de dC/dx, o gradiente de concentração. A quantidade de
espécies e m difusão transferida da o r i g e m ao p o n t o distante
(através da distância de migração) depende do tempo em que se
permite ocorrer a difusão.
A concentração inicial de antigeno e anticorpo é crítica. Cada
molécula n o sistema atinge u m único gradiente de concentração
com o tempo. Q u a n d o as fronteiras de difusão do antigeno e do
anticorpo se sobrepõem, a reação começa, mas a formação de
uma l i n h a de precipitação não ocorre até u m excesso moderado
de anticorpo set atingido. U m a banda de precipitação pode se
formar e ser dissolvida várias vezes à medida que chegam antíge-
 Princípios das Técnicas Imunoquímicas CAPÍTULO 10 163

nos ao local, até que o e q u i l í b r i o seja estabelecido e a posição da ficos para os antígenos de interesse (Figura 10-6). 5 N a prática, a
b a n d a de precipitação seja estabilizada. C R I E é mais sensível e p r o d u z u m a m a i o r resolução q u e aquela
A difusão simples e d u p l a são as duas abordagens básicas possível c o m a I E R U m exemplo da aplicação clínica da C R I E é
utilizadas para aplicações qualitativas de difusão passiva. N a apresentado na Figura 10-7.
difusão simples, u m gradiente de concentração é estabelecido N a contra-imunoeletroforese ( C I E ) , duas linhas paralelas de
para u m ú n i c o reagente. Esta abordagem é d e n o m i n a d a imunodi- poços são feitas n o ágar. U m a f i l e i r a é p r e e n c h i d a c o m solução
fusão simples e geralmente depende da difusão de u m antígeno n o de antígeno e a f i l e i r a oposta é p r e e n c h i d a c o m solução de anti-
ágar i m p r e g n a d o c o m a n t i c o r p o . U m a técnica q u a n t i t a t i v a corpo (Figura 10-8) U m a v o l t a g e m é aplicada ao gel fazendo c o m
baseada neste p r i n c í p i o é chamada de imunodifusão radial ( R I D ) .
A segunda abordagem é a chamada difusão dupla, e m que o
gradiente de concentração é estabelecido t a n t o para o antígeno 0
q u a n t o para o a n t i c o r p o (Figura 1 0 4 ) . Esta abordagem é conhe-
cida c o m o técnica de Ouckterlony. N a prática, ela p e r m i t e a com-
paração direta de dois o u mais materiais de teste e fornece u m
m é t o d o simples e d i r e t o u t i l i z a d o para d e t e r m i n a r se os antígenos
nos espécimes testados são idênticos, reagem de f o r m a cruzada
o u são não-idênticos.

Imunoeletroforese
A I E P (imunoeletroforese) é u m a técnica i m u n o q u í m i c a utilizada
para separar e identificar as várias espécies de proteínas contidas
e m u m a solução c o m u m , c o m o o soro o u l i q u i d o r a q u i d i a n o
( C a p í t u l o 6). Esta técnica é extensivamente usada n o estudo de
misturas de antígenos e na avaliação das gamopatias humanas. As
proteínas d o soro são separadas de acordo c o m sua m o b i l i d a d e
eletroforética (Figura 10-5). A p ó s a eletroforese, u m anti-soro
c o n t r a a proteína de interesse é colocado e m u m p o ç o paralelo e
adjacente à amostra. A difusão simultânea d o antígeno a p a r t i r
da amostra separada e d o a n t i c o r p o a p a r t i r do poço resulta n a
formação de arcos de precipitação c o m formas e posições caracte-
rísticas das proteínas i n d i v i d u a i s separadas na amostra.
O
N o l a b o r a t ó r i o clínico, este m é t o d o é aplicado para avaliar as Figura 10-5 Configuração para imunoeletroforese. Os poços de
proteínas de m i e l o m a h u m a n o . N o e n t a n t o , o m é t o d o está sendo
amostras são feitos n o ágar/agarose, as amostras são aplicadas e a
g r a d u a l m e n t e substituído pela eletroforese de i m u n o f b t a ç ã o , par-
eletroforese é realizada para separar as proteínas da amostra. O anti-soro
t i c u l a r m e n t e n o estudo de antígenos proteicos e seus p r o d u t o s
é aplicado nos sulcos e o gel é incubado em uma câmara Úmida a 4°C
fracionados, e na avaliação de m i e l o m a .
por 24 a 72 horas A raia x representa o formato das zonas de proteína
A imunoeletroforese cruzada ( C R I E , t a m b é m c o n h e c i d a
após a eletroforese; as raias j e ? mostram a reação das proteínas 5 e 1
c o m o imunoeletroforese bidimensional) é a variação da I E P e m que
com os seus anti-soros específicos nos sulcos c e i O anti-soro contra as
a eletroforese t a m b é m é utilizada e m u m a segunda d i m e n s ã o para
proteínas I a é está presente n o sulco b.
d i r i g i r o antígeno d e n t r o de u m gel c o n t e n d o a n t i c o r p o s especí-

©
Ag Ag'

A GêI contendo
anliçorpo

Ab Sojimda
dimensão

í
m
O Primeira
dimensão

Figura 10-4 Imunodifusão dupla em duas dimensões pela técnica
Cuchterlony A, Reação de identidade R, Reação de não-identidade.
C, Reação de identidade parcial. D , Esquema para a formação de
esporão. Ag, Antígeno; Ab, anticorpo
© 0
Figura 10-6 [munoeletroforese cruzada bidimensional (CRIE).
A, Configuração para a primeira dimensão da CRIE. O segmento d o
gel marcado pelas linhas pontilhadas é recortado e colocado na segunda
placa. B , U m gel superior c o n t e n d o anticorpo é adicionado. A
eletroforese agora é realizada a 90° em relação à corrida da primeira
dimensão.
164 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

TRIPSINA que o antigeno e o anticorpo migrem u m em direção ao outro

• apresenta uma melhor resolução. A l é m disso, as proteínas com
© Origem © mobilidades eletroforéticas semelhantes ou idênticas são mais
Figura 10-7 Padrão da imunoeletroforese cruzada (CRIE) obtido
com duas concentrações diferentes de tTipsina adicionada ao soro
normal. A primeira dimensão foi realizada da esquerda para a direita, e
a segunda dimensão de baixo para cima. Dois géis separados são
mostrados, com a maior concentração de tripsina embaixo. O anticorpo
contra a r a n ti tripsina estava presente no gel da segunda dimensão. O
padrão resultante mostra duas espécies distintas de a ran ti tripsina. o
inibidor de protease livre (direita) e o complexo protease-antiprotease
(esquerda). Este exemplo ilustra a capacidade da CRIE para avaliar
mudanças na estrutura especifica da proteína
em uma velocidade mais rápida. U m a linha de precipitação é
formada onde eles se encontram. Esta informação qualitativa é
utilizada pata identificar o antigeno e é fornecida dentro de 1 a
2 horas. A C I E é aplicada na detecção de antígenos bacterianos
n o sangue, urina e líquido cerebrospinal.
A imunofixação (IF) ganhou ampla aceitação como u m
método i m u n o q u í m i c o utilizado para identificar proteínas. C o m
esta técnica, primeiro a eletrofotese é realizada em gel de agarose
pata separar as proteínas na mistura. Subsequentemente, o anti-
soro espalhado diretamente sobre o gel faz com que a(s) proteína(s)
de interesse precipite(m). O imunoprecipitado é preso dentro da
matriz de gel e todas as proteinas não precipitadas são então
removidas por lavagem do gel. E m seguida o gel é corado para
identificação das proteínas. Na prática, entretanto, a C R I E é mais
sensível que a IF, em termos de limite de detecção, e também
bem distinguidas por CRIE, pois na IF elas se apresentam como
uma única banda. A IF atualmente é utilizada de forma ampla
na avaliação de proteínas de mieloma e sua utilidade está ilus-
trada na Figura 10-9.
Western Blotting
As técnicas discutidas previamente utilizam u m exame direto da
imunoprecipitação da(s) proteína(s) no gel. N o entanto, certos
meios, como a poliacrilamida, não são úteis para a imunopreci-
pitação direta ou nem sempre existe uma concentração de anti-
geno suficiente para produzir u m imunoprecipitado que é retido
n o gel durante os procedimentos subseqüentes. A técnica de

©
Eletroendosmose

I
Ill
Paço com
anticorpo

i
Zona de formação
de precipitado

Poço com <u

amostra
(antigeno)

Migração
eietroforética I

O Figura 10-9 Imunofixação de u m soro contendo uma paraprotema

Figura 10-8 Contra-imunoeletroforese mostrando reaçao positiva
entre anti-Haemop/uíus influenzae E (poço superior) e uma amostra de
liquido cerebrospinal (CSF) contendo H. influenzae B (poço inferior).
kappa K de IgM. Raia 1, eletroforese do soro corado para proteína; raia
2, anti-IgG, específico para o fragmento Fc, raia 3, anti-IgA, específico
para a cadeia a; raia 4, anti-IgM, especifico para a cadeia a; raia 5,
anticadeia leve K; raia 6, anti cadeia leve X. (Cortesia de Katberine Bayer,
Filadélfia.)
 Princípios das Técnicas Imunoquímicas
Western b l o t t i n g é usada nestas circunstâncias. Ela envolve uma
etapa de eletroforese, seguida pela transferência das proteínas
separadas para uma membrana de nitrocelulose ou náilon colo-
cada sobre o gel por u m processo chamado de etectrobíotting. U m a
vez fixadas à membrana, as proteínas são detectadas por sondas
de anticorpos marcados com moléculas como isótopos radioati-
vos ou enzimas. Utilizando estas sondas, os limites de detecção
são de 10 a 100 vezes menores que os valores obtidos pela imu-
noprecipitação direta e coloração das proteínas. Esta técnica é
análoga ao Southern b l o t t i n g (eletroforese de D N A seguida de
transferência para uma membrana) e N o r t h e r n blotting (eletro-
forese de R N A seguida de transferência para uma membrana).
A Figura 10-10 mostra u m exemplo da análise por Western
b l o t t i n g aplicado à detecção de anticorpos contra o vírus da
imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Q u a n d o aplicados aos
ensaios de antígenos, detectam-se concentrações de antígenos tão
gpífió
I 1
—ypiGO
H Imunoensaio de Imunodifusão Radial
pftü pGG
pS5— ^5
pt> •
9P*1 •
p32
p24 M • p:'4
plb m padrão da área do anel ou diâmetro versus concentração.
Forle Fraco
Figura 10-10 Análise por Western blotting de amostras de soro
fortemente positiva e fracamente positiva para anticorpo HIV-1.
Proteínas nucleares (GAG, antígenos grupo-especifico) pl8, p24 e p55;
polimerase (POL) p32, p51 e p65; e proteínas do envelope (ENV) gp41,
gpl20 e gpléO (Cortesia de Bio-Rad Laboratories Diagnostics Group,
Hercules, Calif.)
Padrões Duplicatas das amostras de pacientes
Figura 10-11 Imunoeletroforese em foguete da albumina sérica humana. As amostras dos pacientes foram
aplicadas em duplicatas. Os padrões foram colocados nas extremidades opostas da placa
CAPÍTULO 10 165
baixas quanto 500 n g / m L , ou 2,5 ng por banda no gel. O limite
de detecção da técnica é d i m i n u í d o para aproximadamente 100
pg na detecção quimioluminescente do anticorpo marcado com
enzima e na detecção de emissão de lu2 pela utilização de filme
de raios X ou fotográfico. 11
U m a técnica mais simples, que elimina a etapa de separação
eletroforética, é conhecida como dot biottmg. U m a amostra da
proteína a ser analisada é aplicada à superfície da membrana
como u m pequeno "ponto". Após a secagem da amostra, a mem-
brana então é exposta a um anticorpo marcado específico para
o antígeno em teste contido na mistura de proteínas aplicada à
membrana. E m seguida a membrana é lavada e o anticorpo
marcado que se ligou à proteína na membrana é detectado com
u m sistema de detecção fotométrica ou quimioluminescente.
MÉTODOS QUANTITATIVOS
As técnicas imunoquímicas são utilizadas para desenvolver
métodos quantitativos e incluem (1) difusão radial e eletroimu-
noensaios, (2) ensaios turbidimêtricos e nefelométricos, e (3)
ensaios imunoquímicos marcados.
Imunodifusão Radial e Eletroimunoensaio
A R I D (imunodifusão radial) e o eletroimunoensaio são comu-
mente utilizados em mensurações imunoquímicas quantitativas.
A R I D é u m método de difusão passiva em que u m gradiente de
concentração é estabelecido para u m único reagente, geralmente
pata o antígeno. O anticorpo é uniformemente disperso na
matriz de gel A difusão do antígeno de u m poço para o gel é
permitida até que exista u m excesso de anticorpo e, assim, ocorra
a imunoprecipitação; u m anel bem definido de precipitação em
volta do poço indica a presença de antígeno. O diâmetro do anel
continua aumentando até que se alcance o equilíbrio. Os padrões
são aplicados de forma simultânea à amostra para gerar a curva-
Eletroimunoensaio
O eletroimunoensaio (conhecido como técnica de "foguete") é
u m tipo de imunoensaio onde u m único gradiente de concentra-
ção é estabelecido para o antígeno. U m a voltagem é aplicada para
dirigir o antígeno do poço de aplicação para dentro de uma
suspensão homogênea de anticorpo no gel (Figura 10-11). Este
processo produz uma migração unidírecional do antígeno e
resulta em u m limite menor de detecção. A altura da linha de
precipitação resultante em forma de foguete é proporcional à
concentração de antígeno. A quantificação é feita pelo uso de
padrões na mesma placa j u n t o às amostras desconhecidas. Sub-
seqüentemente, a estimativa das concentrações das amostras des-
Padrões
166 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

conhecidas é obtida a partir da altura dos foguetes. A curva-

padrão é linear somente para u m curto intervalo de concentração
e, conseqüentemente, as amostras devem ser diluídas ou concen-
tradas, quando necessário.
Ensaios Turbidimétrico e Nefelométrico
A turbidimetria e a nefelometria são técnicas convenientes utili-
zadas para medir a velocidade de formação de imunocomplexos
in uitro. Os princípios instrumentais para estes métodos são des-
critos no Capítulo 4 Alguns estudos demonstraram que a reação
entre anrígeno e anticorpo começa em milissegundos e continua
por horas. O desempenho de ambos os tipos de ensaios tem
melhorado significativamente através do aumento da velocidade
da reação pela adição de polimeros lineares hidrossolúveis.
Os métodos imunoquímicos, turbidimétrico e nefelométrico,
utilizando protocolos de velocidade e de pseudo-equilibrio, foram
descritos para proteínas, antigenos e haptenos. Nos ensaios de
velocidade, as medidas geralmente são realizadas nos primeiros
minutos da reação porque a maior variação ( d l / d t ) na intensi-
dade da luz dispersa (Is) é obtida durante este intervalo de tempo.
Para os ensaios de pseudo-equilibrio, é necessário aguardar de 30
a 60 minutos para que a d L / d t seja menor em relação ao tempo
requerido para fazer as medidas necessárias. (Nota: Estes ensaios
são chamados de pseudo-equilibrio e não de equilíbrio porque o
verdadeiro equilíbrio não é atingido dentro do tempo permitido
para estes ensaios.)
Os métodos nefelométricos em geral são mais sensíveis que
os métodos turbidi métricos e apresentam l i m i t e de detecção
menor, de aproximadamente 1 a 10 m g / L para uma proteína
sérica. Limites menores de detecção são obtidos em líquidos
como o cefalorraquidiano e a urina por causa das baixas concen-
trações de lipídios e proteínas, que resultam em uma razão sinal-
ruído maior. A l é m disso, para proteínas de baixo peso molecular
como a mioglobina ( M W 17.800 Da), os limites de detecção são
diminuídos pela utilização de u m procedimento acentuado poT
látex, baseado em esferas de látex revestidas com anticorpos.
Os ensaios nefelométricos e turbidimérricos também são apli-
cados na dosagem de drogas (haptenos) com o uso de técnicas de
inibição. Para fazer o reagente, a droga de interesse é acoplada a
uma molécula carreadora, como a albumina sérica bovina. O
hapteno ligado à albumina compete com o hapteno hvre (droga
introduzida na amostra) pelo anticorpo anti-hapteno. Na presença
de hapteno livre, a formação de imunocomplexos é reduzida
porque mais sítios dos anticorpos são saturados e, então, a disper-
são da luz é diminuída. A diminuição da dispersão da luz é relativa
à concentração de hapteno livre. Ambos os métodos, cinético e
de pseudo-equilibrio, foram descritos. Na ausência de hapteno
livre, o hapteno ligado à albumina reage com os sítios disponíveis
n o anticorpo anti-hapteno para formar imunocomplexos de
ligação cruzada com alta capacidade de dispersão da luz.
Ensaios Imunoquímicos com Marcadores
Os métodos previamente discutidos baseiam-se na análise da
formação de imunocomplexos como u m índice de reação antí-
geno-anticorpo. C o m o demonstrado anteriormente por equação
(1), a reação total ocorre em fases sequenciais e somente na fase
final ocorre a formação de imunocomplexos. N o entanto, a
ligação micial do anticorpo ao antigeno é realizada com antige-
nos e anticorpos que apresentam marcadores para desenvolver
vários ensaios imunoquímicos sensíveis e específicos. A reação
que descreve esta ligação inicial e a constante cinética para a
reação completa são mostradas nas equações (3a) e (3b), respec-
A b + A g i—. 1 AbAg (3a)
*w|
[AbAg]
K = (3b)
[Ab][Ag]
onde:
k] = Constante de velocidade para a reação de associação
k i = Constante de velocidade para a reação de dissossiação
K = Constante de equilíbrio para a reação completa
C o m o previsto a partir da lei de ação da massa, as concentra-
ções de A b , A g e A b : A g são dependentes da magnitude de k j e
k~]. Para o anti-soro policlonal, a avidez média das populações de
anticorpo determina K, e a magnitude de k b em comparação a
k~ h determina o limite máximo de detecção alcançável com uma
determinada população de anticorpo.
Tipos de Marcadores
Na década seguinte aos desenvolvimentos pioneiros de Yalow e
Berson, 12 todos os imunoensaios utilizavam marcadores radioati-
vos em ensaios competitivos. Desde a introdução de imunoen-
saios enzimáticos, na década de 1970, foram desenvolvidos ensaios
sofisticados com marcadores não-isotópicos (Tabela 10-1).'
Princípios Metodológicos
Para capitalizar a especificidade apurada e aumentar a sensibili-
dade dos ensaios imunoquímicos, vários princípios metodológi-
cos foram aplicados no desenvolvimento destes métodos. Isto
i n c l u i tipos de reações competitivas e não-competitivas e diferen-
tes esquemas de processos para realizar os ensaios.
Tipos de Reação Competitivas versus Não-competitivas
C o m o mostrado na Figura 10-12, os dois principais tipos de
reação utilizados em ensaios imunoquímicos são denominados
TABELA 10-1 M a r c a d o r e s U t i l i z a d o s e m Imunciensaíoa
N ã o - i s o tópicos
Quimioluminescente Éster de acridina, éster sulfonil acridina, isoluminol
Co-íator Trifosfatc de adenosina, dinuclectídeo flavina
adenina
Enzima Fosfalase alcalina, luciíerase de bactéria marinha,
p-galactcsidase, luciferase de vaga-lume, glicose
oxidase, glicose-6-fosfata desidrogenase,
peroxidase de raiz forte, lisozima. malato
desidrogenase, microperoxidase, urease, xaniiria
oxidase
Fluorófcro Quelato de európio, fluoresceína, licoeriirina,
quelato de lérbio
Radical livre Nitróxido
Inibidor Metolrexato
Metal Sal de ouro, sal de selinio, sal de prata
Partícula Bactericfago, eritrócito, esferas de látex,
lipossomo, quantum dot
Substância Conversão ascendente da nanopartícula contendo
fosforescente lantanídio
Polinucleotídeo DMA

tivamente. Substrato Galado piranosídeo umbeliferona

 Princípios das Técnicas Imunoquímicas
Competitivo (reagente limitado)
Simultâneo
Ab + Ag + A g - L Ab:Ag + Ab:Ag-L
(livre) (ligado)
Seqüencial
ki
Etapa 1 Ab + Ag Ab:Ag + Ab
k-i
Etapa 2 Ab:Ag + Ab + A g - L Ab:Ag + A b : A g - L + Ag-L
Não-campetitivo (excesso de reagente, dois sítios, sanduíche)
+ A b L
gg-Ab ^ >^-Ab:Ag " >gg-Ab:Ag:Ab-l
Figura 10-12 Desenho experimental do imunoensaio.
Ab, anticorpo; Ag, antígeno; L, marcador; fej, constante d e velocidade
de associação; k_i, constante de velocidade de dissociação.
competitivo (ensaio c o m reagente l i m i t a d o ) e nâo-competitivo (ensaio
c o m reagente em excesso, dois sítios o u sanduíche).
Imunoensaios Competitivos. E m u m ensaio i m u n o q u i m i c o com-
p e t i t i v o , todos os reagentes são simultânea o u seqüencialmente
misturados juntos. N a abordagem simultânea, o antígeno marcado
(Ag*) e o antígeno não marcado (Ag) c o m p e t e m pela ligação c o m
o a n t i c o r p o . A avidez d o a n t i c o r p o pelos antígenos, marcado c
não marcado, deve ser a mesma neste sistema. Sob estas condi-
ções, a p r o b a b i l i d a d e de o a n t i c o r p o se ligar ao antígeno marcado
é inversamente p r o p o r c i o n a l à concentração de antígeno não
marcado; p o r t a n t o , conseqüentemente, o marcador ligado é inver-
samente p r o p o r c i o n a l à concentração de antígeno não marcado.
E m u m ensaio c o m p e t i t i v o seqüencial, o a n t í g e n o não
marcado é m i s t u r a d o ao a n t i c o r p o em excesso, p e r m i t i n d o sua
ligação até que se atinja o e q u i l í b r i o (Figura 10-12, etapa 1). O
antígeno marcado é então a d i c i o n a d o sequencialmente (Figura
10-12, etapa 2), p o s s i b i l i t a n d o assim o e q u i l í b r i o . A p ó s a separa-
ção, o marcador ligado é m e d i d o e u t i l i z a d o para calcular a
concentração de antígeno não m a r c a d o . U t i l i z a n d o este m é t o d o
de duas etapas, u m a fração m a i o r de antígeno n ã o marcado é
ligada p e l o a n t i c o r p o em comparação a esta mesma fração n o
ensaio s i m u l t â n e o , especialmente q u a n d o se u t i l i z a m baixas con-
centrações de antígeno. C o n s e q ü e n t e m e n t e , o l i m i t e de detecção
d o i m u n o e n s a i o seqüencial ê 2 a 4 vezes m e n o r e m relação ao
ensaio s i m u l t â n e o , d a d o k] » k_). O a p r i m o r a m e n t o n o l i m i t e
de detecção é resultado do a u m e n t o da ligação A g A b (e, por-
t a n t o , e m u m a d i m i n u i ç ã o da ligação de A g * ) , q u e é favorecida
pela adição seqüencial de A g e A g * . Se k] > k_], a dissociação de
A g A b torna-se mais provável, r e s u l t a n d o em m a i o r competição
entre A g * e A g . U m a curva de ligação i m u n o q u í m i c a típica é
apresentada na Figura 10-13.
Imunoensaios Não-competitivos. E m u m i m u n o e n s a i o não-
c o m p e t i t i v o típico, o a n t i c o r p o de " c a p t u r a " é p r i m e i r o adsor-
v i d o passivamente o u ligado covalentemente à superfície de u m a
fase sólida. E m seguida, permite-se que o antígeno da amostra
reaja e seja capturado pelo a n t i c o r p o da fase sólida. O u t r a s pro-
teínas são retiradas p o r lavagem e u m a n t i c o r p o marcado (conju-
gado) é a d i c i o n a d o . Este reage c o m o antígeno ligado p o r m e i o
de u m segundo e p í t o p o d i s t i n t o . O excesso de a n t i c o r p o marcado
não l i g a d o é r e m o v i d o p o r lavagens adicionais. E m seguida, o
marcador ligado é m e d i d o e sua concentração o u atividade é
d i r e t a m e n t e p r o p o r c i o n a l à concentração de antígeno
N o s ensaios não-competitivos, os anticorpos, p o l i o u m o n o -
clonais, são utilizados t a n t o c o m o a n t i c o r p o s de captura c o m o
CAPÍTULO 10 167
Figura 10-13 Diagrama esquemático da curva dose-resposta para
um imunoensaio típico. A porção analiticamente útil da curva é
triangulada pelos pontos a e b
conjugados. A incubação s i m u l t â n e a da amostra c o m os anticor-
pos, c o n j u g a d o e de captura, se t o r n a possível q u a n d o são u t i l i -
zados a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s , c o m especificidade para epítopos
distintos, s i m p l i f i c a n d o assim o p r o t o c o l o do ensaio.
Os i m u n o e n s a i o s não-competitivos são realizados de f o r m a
simultânea o u seqüencial. Todavia, na f o r m a simultânea, u m a
alta concentração d o a n a l i t o satura os a n t i c o r p o s de captura e
conjugado. Sob estas condições, o analito, presente e m altas
concentrações, reage s i m u l t a n e a m e n t e c o m os a n t i c o r p o s de
captura e conjugado, r e d u z i n d o o n ú m e r o de complexos f o r m a -
dos e p r o d u z i n d o u m r e s u l t a d o falsamente baixo. Assim, a curva-
padrão do ensaio apresenta u m "efeito de gancho" n o q u a l a
resposta do ensaio desaparece de m o d o r e p e n t i n o em altas con-
centrações d o analito. Este efeito ocorre nos ensaios para analitos
cujos limites das concentrações patológicas n o r m a i s são m u i t o
amplos. Por exemplo, ensaios para g o n a d o t r o f i n a c o r i õ n i c a ( C G )
e a - f e t o p r o t e í n a (AFP) são p a r t i c u l a r m e n t e propensos a este pro-
blema. As diluições das amostras geralmente são reanalisadas
para verificar este t i p o de i n t e r f e r ê n c i a analítica. N a prática, o
efeito de gancho é e l i m i n a d o se for a d o t a d o o f o r m a t o de ensaio
seqüencial, e se as concentrações dos a n t i c o r p o s de captura e
conjugados f o r e m s u f i c i e n t e m e n t e altas para c o b r i r as concentra-
ções do analito em t o d a variação analítica do ensaio.
Ensaios imunoquímicos Heterogêneos versus Homogêneos
Os ensaios i m u n o q u í m i c o s que requerem a separação de marca-
dores livres e ligados são chamados de heterogêneos. Os ensaios
homogéneos não precisam de separação.
EnSâiOS Heterogêneos. Os ensaios heterogêneos assumem, de
f o r m a i m p l í c i t a , q u e k] e várias técnicas de separação física
( Q u a d r o 10-1) são utilizadas para separar o antígeno marcado
livre (Ag*) do antígeno marcado fígado ( A g * : A b ) .
A precipitação do antígeno m a r c a d o ligado ( A g * : A b ) a p a r t i r
da m i s t u r a de reação é alcançada t a n t o q u í m i c a q u a n t o i m u n o -
logicamente. Q u i m i c a m e n t e , adiciona-se u m composto q u í m i c o
capaz de precipitar proteínas, c o m o o ( N H ^ S O ^ I m u n o l o g i c a -
m e n t e , adiciona-se u m segundo a n t i c o r p o " p r e c i p i t a n t e " . N a
adsorção em fase l í q u i d a , partículas de carvão ativado o u carvão
168 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

QUADRO 10-1 Métodos de Separação Utilizados nos TABELA 10-2 Limites de Detecção para Marcadores
Imunoensaios Isotópicos ou Não-isotópicos e m Imunoensaios

ADSOHÇÃO Limite de
Carvão, llorisil, talco Detecção em
Zeptomoles*
PRECIPITAÇÃO Marcador (10 21 moles) Método
Polímero de precipitação: polietileno glicol Fosfatase alcalina 50.000 Fotometria
Solvente ou sal de precipitação: etanol, dioxano, (NH^SOj,
300 Fluorescência com
Proteína A cu precipitação por dois anticorpos (secundário)
resolusão de tempo
100 Fluorescência
ANTICORPOS DE FASE SÓLIDA
10 Cascata enzimática
Anticorpos ou outras proteínas de ligação (p. ex., proteína A, biotina-avidina e
1 Quimioiuminescência
biotina-estreptavidina) adsorvidos ou ligados cova lente mente a u m a matriz
p-D-galactosidase 5.000 Quimioiuminescência
insolúvel (p. ex., esferas de plástico, superfície interna de tubos plásticos ou
1.000 Fluorescência
micropoços e esferas magnéticas)
Quelato de európio 10.000 Fluorescência resolvida

DIVERSOS no tempo

Eletroforese Glicose-6-fosfato 1.000 Quimioiuminescência

Filtração em gel desidrogenase

3
Troca Jónica H 1.000.000 Cintilação
Separação radial Peroxidase de raiz forte 2.000.000 Fotometria
1 Quimioiuminescência
125|
1.000 Cintilação

revestido c o m d e x t r a n são d i r e t a m e n t e adicionadas à m i s t u r a da Tris(bipiridíl) rutênio (II] 20 1 Eletroquimioluminescência

reação p a i a adsorver o antigeno livre. A s partículas de carvão
c o m antigeno a d s o r v i d o são então removidas após sua sedimen-
tação o u por centrifugação.
A adsorção e m fase sólida é u m a técnica de separação ampla-
m e n t e utilizada. C o m este m é t o d o , a ligação e a competição dos
antígenos marcados o u n ã o marcados pelos sítios de ligação d o
a n t i c o r p o o c o r r e m n a superfície de u m suporte sólido. N a super-
fície deste s u p o r t e , o a n t i c o r p o de captura é a d e r i d o p o r adsorção
física o u p o r ligação covalente. V á r i o s tipos diferentes de s u p o r t e
sólido são utilizados, i n c l u i n d o a superfície i n t e r n a de t u b o s
plásticos o u poços de placas de m i c r o t i t u l a c ã o e a superfície
exrerna de materiais insolúveis, c o m o celulose o u esferas o u
partículas de látex magnéticas.
Ensãios Homogêneos. Os ensaios hom ogêneos n ã o necessitam
de separação dos antígenos o u anticorpos marcados livres e
ligados. 8 Neste t i p o de ensaio, a atividade d o m a r c a d o r a d e r i d o
ao antigeno é d i r e t a m e n t e m o d u l a d a pela ligação d o a n t i c o r p o .
A m a g n i t u d e da m o d u l a ç ã o é p r o p o r c i o n a l à concentração de
antigeno ou a n t i c o r p o a ser m e d i d a . C o n s e q ü e n t e m e n t e , é neces-
sário somente i n c u b a r a amostra c o n t e n d o o antigeno a n a l i t o
c o m o antigeno marcado e a n t i c o r p o e, e m seguida, a atividade
d o m a r c a d o r é m e d i d a d i r e t a m e n t e " n o l u g a r " , t o r n a n d o estes
ensaios tecnicamente mais rápidos e mais fáceis.
Padronização dos Imunoensaios
A padronização de u m i m u n o e n s a i o envolve u m a série de ensaios
c o m padrões de valores conhecidos e a construção de u m a l i n h a
reta o u curva, a p a r t i r dos dados resultantes) para associar o sinal
à concentração das séries analisadas. Esta curva dose-resposta é
então utilizada para d e t e r m i n a r a concentração dos espécimes
desconhecidos. A ligação dos p o n t o s sucessivos da curva-padrão
geralmente é d e t e r m i n a d a pelas médias de u m a equação mate-
m á t i c a a p r o p r i a d a . V á r i o s m é t o d o s para a construção de curvas
são empregados ( C a p í t u l o 13). M é t o d o s de interpolação p e r m i -
t e m a ligação dos p o n t o s sucessivos p o r linhas retas ( i n t e r p o l a ç ã o
linear) o u linhas curvas ( i n t e r p o l a ç ã o curvilínea). N a ú l t i m a , u m
p o l i n ó m i o c ú b i c o (y = a + bx + cx 2 + dx^) associa a resposta (y) à
concentração d o p a d r ã o (x). A m e l h o r p l o t a g e m é o b t i d a p o r
m e i o de u m a série de recálculos (iterações) que suavizam as
junções entre as curvas, ligando os p o n t o s sucessivos n a curva.
* U m leptomole •= J 0 J atomoles o u 106 finto moles.
^Comunicação pessoal.
A equação resultante é chamada de f u n ç ã o spline. M é t o d o s empí-
ricos de elaboração de curvas u t i l i z a m diferentes m o d e l o s mate-
máticos, i n c l u i n d o h i p e r b ó l i c o , p o l i n ó m i o e log-logístico e suas
variantes (p. ex., log-logística de q u a t r o parâmetros) para calcular
a curva para ajustar os dados da padronização.
Deve-se considerar que a incerteza da f o r m a da c u r v a entre
os sucessivos padrões e a imprecisão na m e d i d a de cada padrão
é u m a f o n t e de erro e m todos os m é t o d o s para elaboração da
curva. A imprecisão p o d e não ser constante e m t o d o o i n t e r v a l o
de concentração representado pelos padrões e, neste caso, a res-
posta variável é chamada de heterocedástica.
Limites da Detecção Anaucica
Os l i m i t e s de detecção analítica de i m u n o e n s a i o s competitivos
são d e t e r m i n a d o s , p r i n c i p a l m e n t e , pela a f i n i d a d e d o a n t i c o r p o .
Cálculos i n d i c a m que o m e n o r l i m i t e de detecção de 10 f m o l / L
(isto é, 6 0 0 . 0 0 0 moléculas de a n a l i t o e m u m v o l u m e de amostra
t í p i c o de 100 p L ) é possível e m u m ensaio c o m p e t i t i v o u t i l i z a n d o
u m a n t i c o r p o c o m a f i n i d a d e de I0 13 m o l / L .
Para os i m u n o e n s a i o s não-competitivos, a capacidade dos
detectores para m e d i r o m a r c a d o r d e t e r m i n a o l i m i t e de detecção
d o e x p e r i m e n t o . A Tabela 10-2 ilustra os l i m i t e s de detecção para
os i m u n o e n s a i o s não-competitivos u t i l i z a n d o marcadores isotópi-
cos e não-isotópicos. U m marcador radioativo, c o m o 125 I, apre-
senta ba ixa atividade especifica (7,5 m i l h õ e s de marcadores sao
necessários para a detecção de 1 desintegração/segundo) q u a n d o
c o m p a r a d o a marcadores enzimáticos, q u i m i o l u m i n e s c e n t e s e
fluorescentes. Os marcadores enzimáticos f o r n e c e m u m a a m p l i -
ficação (cada marcador e n z i m á t i c o p r o d u z vários p r o d u t o s mole-
culares detectáveis) e o l i m i t e de detecção para u m a enzima é
m e l h o r a d o se a detecção f o t o m é t r i c a c o n v e n c i o n a l f o r substitu-
ída pela detecção q u i m i o l u m i n e s c e n t e o u b i o l u m i n e s c e n t e . A
c o m b i n a ç ã o da amplificação c o m a reação de detecção ultra-sen-
sível t o r n a os i m u n o e n s a i o s enzimáticos q u i m i o l u m i n e s c e n t e s
 Princípios das Técnicas Imunoquímicas
não-competitivos u m dos tipos de i m u n o e n s a i o s mais sensíveis.
Os marcadores fluorescentes t a m b é m apresentam alta atividade
específica; u m ú n i c o f l u o r ó f o r o de alto r e n d i m e n t o q u â n t i c o é
capaz de p r o d u z i r 100 m i l h õ e s de f ó t o n s / s e g u n d o . N a prática,
vários fatores d i m i n u e m o l i m i t e de detecção de u m i m u n o e n -
saio. Estes i n c l u e m (1) sinal de f u n d o do detector, 1,2) reagentes
do ensaio e (3) ligação inespecífica do reagente marcado.
Os marcadores secundários, c o m o a b i o t i n a , t a m b é m são
usados para p r o d u z i r amplificação em u m i m u n o e n s a i o . A ligação
constante de complexos b i o t i n a - a v i d i n a é extremamente alta (IO 15
m o l / L ) . Esta alta ligação p e r m i t e o d e l i n e a m e n t o de sistemas de
imunoensaios mais sensíveis que os sistemas de anticorpos
simples. O sistema biotina-avidina utiliza o p r i m e i r o a n t i c o r p o
m a r c a d o c o m b i o t i n a . A b i o t i n a é aderida ao a n t i c o r p o em u m a
p r o p o r ç ã o relativamente alta sem a perda da í m u n o r r e a t i v i d a d e
do a n t i c o r p o . A adição de u m marcador c o n j u g a d o c o m avidina
f o r m a u m complexo A g A b - b i o t i n a : a v i d i n a - m a r c a d o r . U m a
amplificação a d i c i o n a l é o b t i d a pela ligação b i o t i n a : a v i d i n a :
b i o t i n a p o r q u e a taxa de ligação de b i o t i n a : a v i d i n a é 4 : 1 (p- ex.,
A g : A b - b i o t i n a : a v i d i n a : [ 3 marcadores b i o t i n a ] ) . Se o marcador é
u m a enzima, várias moléculas de enzima n o complexo c o m p l e t o
p r o p o r c i o n a m u m grande a u m e n t o na atividade enzimática, j u n -
tamente c o m a pequena q u a n t i d a d e de antígeno a ser determi-
nada, de u m m o d o correspondente, o ensaio c o m o antígeno é
mais sensível. O u t r a s estratégias para d i m i n u i r os limites de
detecção analítica dos i m u n o e n s a i o s i n c l u e m o uso de conjuga-
dos estreptavidina-tireoglobulina, e complexos macromoleculares
de t i r e o g l o b u l i n a s c o m marcações m ú l t i p l a s e estreptavidina-tireo-
g l o b u l i n a . Nestes reagentes, a t i r e o g l o b u l i n a age c o m o u m carre-
i
Q U A D R O 1 0 - 2 I Exemplos de Outras Imunoensaios Não-isotópicos
IMUNOENSAIOS BIOLUMINESCENTES
Apoaequorina nativa ou recombinante (da água-viva bicluminescente Aequorea)
utilizada como marcador. Ela é ativada por uma reação com celenlerazira, e a emissão
de luz a 469 nm é desencadeada pela reação com íons de cálcio (cloreto de cálcio)
IMUNOENSAIO DE TRANSFERÊNCIA DE EXCITAÇÃO DE FLUORESCÊNCIA
Ensaio competitivo homogêneo no qual um antígeno marcado com fluoróforo (doadoij
compete com um antígeno na amostra pelos sítios de ligação em um anticorpo
marcado com um corante fluorescente (aceptor). A fluorescência do doador é extin-
guida quando o mesmo se liga ao anticorpo marcado com o aceptor
IMUN0-PCR
imunoensaio heterogêneo no qual um fragmento de DNA de fila simples CL dupla
é utilizado como um marcador para um anticorpo em um ensaio sanduíche. 0
DNA marcado ligado é amplificado utilizando-se a reação em cadeia da polime-
rase (PCR). 0 produto da amplificação de DNA é separado por eletroforese em
gel, corado com brometo de etídio e quantificado por análise densitométrica
IMUNOENSAIO DE CANALIZAÇÃO DE OXIGÊNIO LUMINESCENTE (L0CI)
Imunoensaio sanduíche homogêneo no qual um antígeno se liga a uma partícula
preenchida com corante sensibilizador recoberta por anticorpos (diâmetro de 250
nm) e a uma partícula revestida por anticorpo (diâmetro de 250 nm) preenchida
com uma mistura de precursores de um composto quimioluminescente e de um
fluoróforo. A irradiação produz oxigênio singlete na superfície da partícula com
corante sensibilizador Este se difunde para a outra partícula que está mais
próxima e ligada através da reação imunoquímica entre o antígeno e os anticor-
pos rias partículas ("canais"). 0 oxigênio singlete reage com o precursor do
composto quimioluminescente na partícula para formar um dioxano quimiolumi-
nescente, que então se decompõe para emitir luz por meio de um mecanismo
sensibilizado pelo fluoróforo. Nenhum sinal é obtido das partículas carregadas
com precursores do fluoróforo que não estão ligados a um antígeno por meio de
uma reação imunológica
CAPÍTULO 10 169
ador para m ú l t i p l o s marcadores (p. ex., Eu + 1 e fatores de ampli-
ficação de vários milhares são alcançados).
Exemplos de Imunoensaios Marcados
Exemplos específicos de diferentes tipos de i m u n o e n s a i o s marca-
dos são discutidos na seção seguinte. O u t r o s estão descritos n o
Q u a d r o 10-2.
Radioimunoensaio
Os r a d i o i m u n o e n s a i u s (RIAs) f o r a m desenvolvidos na década de
1960 e utilizavam c o m o marcadores os isótopos radioativos de
i o d i n a , U 5 l e 131 I, e t r í t i o ( J H ) . n C o m b i n a ç õ e s dos marcadores (p.
ex., ^ C o e 125 I) t a m b é m eram utilizados para ensaios simultâneos
(p. ex., v i t a m i n a B I Z e folato). Na prática, a competição entre os
antígenos o u anticorpos radiomarcados o u não marcados, e m
u m a reação antígeno-anticorpo, analiticamente é utilizada para
d e t e r m i n a r a concentração de antígeno o u a n t i c o r p o não marcado.
Esta técnica t e m c o m o vantagem a especificidade da interação
antígeno-anticorpo e da capacidade de se m e d i r quantidades
m u i t o pequenas de elementos radioativos. Os R I A s são utilizados
para d e t e r m i n a r a concentração de anticorpos o u qualquer antí-
geno c o n t r a o qual tenha sido p r o d u z i d o u m a n t i c o r p o específico.
Q u a n d o utilizado para m e d i r a concentração de u m antígeno, o
R I A requer que o antígeno esteja disponível na f o r m a p u r a e
marcado c o m isótopo radioativo. U m desenho e x p e r i m e n t a l alter-
nativo utiliza a n t i c o r p o marcado (p ex., ensaio i m u n o r r a d i o m é -
trico [ I R M A ] ) e não requer antígeno p u r i f i c a d o p o r q u e o antígeno
não precisa ser marcado. Isto t a m b é m e l i m i n a potenciais proble-
mas que possam ser causados pela lodinação de antígenos instá-
IMUNOENSAIO COM SUBSTÂNCIA FOSFORESCENTE
é Imunoensaio heterogêneo em que uma nanopartícula fosforescente conversora
é utilizada como marcador. A nanopartícula (200 a 400 nm de diâmetro) é um
oxissulfeto de lantanídeo cristalino. Ele absorve dois ou mais fótons de luz
iníravermelha (980 nm) e produz emissão de luz em um comprimento de onda
mais curto (deslocamento anti-Sfokes). A fosforescência não é influenciada pelas
condições da reação (p. ex., temperatura ou tampão) e não ocorre conversão de
sinal dos componentes biológicos da amostra (baixo ruído de fundo), 0 ensaio
múltiplo é possível porque diferentes tipos de partículas produzem diferentes
comprimentos de ondas de fosforescência (p. ex., as partículas de oxissulfeto de
ítrio/érbio são verdes [550 nm] e as partículas de oxissulfeto ítrio/túlio são azuis
[475 nm])
IMUNOENSAIO COM QUANTUM DOT
imunoensaio heterogêneo em que uma partícula de material semicondutor de
dimensão nanométrica (menor que 10 nm) é utilizada como marcador. Um
quantum dot á um nanocristal altamente fluorescente composto por CdSe, CdS,
ZnSe, InP ou InAs ou uma camada de ZnS ou CdS sobre, por exemplo, um núcleo
CdSe, 0 ensaio múltiplo é possível com estes marcadores porque as propriedades
de emissão podem ser moduladas pelas alterações no tamanho e na composição
do nanocristal (p. ex., CdS emite luz azul, InP emite luz vermelha)
IMUNOENSAIO DE DIFUSÃO DA LUZ EM FASE SÓLIDA
Esferas de índio são revestidas por vidro para medir a ligação do anticorpo a um
antígeno. A ligação dos anticorpos aos antígenos aumenta a espessura da camada
dielétrica, que produz um grau maior de difusão que as áreas onde somente um
antígeno está ligado. A quantificação é realizada por densitometria
IMUNOENSAIO DE EFEITO DE SUPERFÍCIE
Um anticorpo é imobilizado na superfície de um guia de ondas (lâminas de
quartzo, vidro ou plástico, ou um prisma revestido por ouro ou prata), e a ligação
do antígeno é medida diretamente pela reflexão interna total da fluorescência,
ressonância de superfície de plasmônio ou reflexão total atenuada
170 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

veis. Os anticorpos são proteínas mais estáveis e são facilmente

marcados sem que se danifique a função da proteína H
Os R I As de não separação também foram desenvolvidos com
base na modulação dos marcadores trítio ou n , I por micropartí- fY II
culas carregadas com u m cintilante. 6 Estes ensaios de proximi- íí
nh 2 O
dade de cintilação encontraram aplicação rotineira em ensaios
de detecção de alta amplitude utilizados para o descobrimento H 2 0 : + p-iodofenol
de drogas. M a r c a d o r c o m peroxidase Luz
Embora seja popular, o emprego dos RLAs nos laboratórios de raiz f o r t e
clínicos d i m i n u i u principalmente por causa das preocupações
com a manipulação segura e a utilização e descarte dos reagentes O—O CH3
radioativos. I O

Imunoensaio Enzimático
O imunoensaio enzimático (EIA) utiliza as propriedades catalíti-
/-V/
\J
cas das enzimas para detectar e quantificar as reações imunológi- orou
cas. As enzimas mais comumente empregadas como marcadores (AMPPD)
nos ELAs são a fosfatase alcalina (ALP), a peroxidase de raiz forte M a r c a d o r c o m fosfatase Luz
(HRP), a glicose-6-desidrogenase (G6D) e a |3-galactosidase. alcalina
Vários sistemas de detecção são utilizados para monitorar os
EIAs. Os ensaios que produzem compostos que são monitorados NADP

fotometricamente são empregados de forma ampla e foram auto-

matizados. Os EIAs que utilizam substratos fluorogênicos ou M a r c a d o r c o m fosfatase

quimioluminogênicos também são populares porque sua medição

é inerentemente sensível. As reações enzimáticas em cascata
também são aplicadas à detecção de marcadores enzimáticos no
E I A . O princípio de u m ensaio em cascata para a A L P está ilus-
trado na Figura 10-14. A vantagem deste tipo de ensaio é que ele
combina a propriedade de amplificação de duas enzimas — o
marcador A L P e a álcool desidrogenase no reagente — produ-
zindo u m ensaio extremamente sensível (Tabela 10-2)
Exemplos de E I A incluem ensaio de imunoabsorvância ligado
à enzima (ELISA), técnica de imunoensaio enzimático de mul-
tiplicação ( E M I T ) e imunoensaio de doador enzimático clonado
(CEDIA).
Ensaio de Imunoabsorvância Ligado à Enzima. O ELISA é uma
técnica de E I A heterogêneo. Neste tipo de ensaio, um dos com-
ponentes da reação é aderido à superfície de uma fase sólida,
como u m poço de microtitulacão. Esta aderência é uma adsorção
inespecífica ou uma ligação química ou imunoquímíca e facilita
a separação dos reagentes marcados ligados ou livres. Tipica-
mente, é adicionado com o ELISA uma alíquota da amostra ou
do padrão contendo o antigeno a ser medido, permitindo a
ligação deste ao anticorpo na fase sólida. Após lavar a fase sólida,
u m anticorpo marcado com enzima diferente do anticorpo ligado
é, então, adicionado formando-se u m "complexo sanduíche",
com Ab-ligado à fase sólidaAgAb-enzima. O anticorpo em
excesso (não ligado) é retirado por meio de lavagem e adiciona-se
u m substrato enzimático. O marcador enzimático, então, catalisa
a conversão do substrato em produto(s) e a quantidade deste é
proporcional à quantidade de antigeno na amostra. Os anticor-
pos na amostra também são quantificados pela utilização de u m
procedimento ELISA no qual o antigeno, e não o anticorpo, é
ligado à fase sólida e o segundo reagente é u m anticorpo especí-
fico marcado com enzima para o anticorpo do analito. Por
exemplo, em placas de microtitulacão, os ELISAs são extensiva-
mente utilizados para a detecção de anticorpos para vírus e para-
sitas n o soro ou no sangue total. A l é m disso, conjugados enzimá-
ticos acoplados a substratos que produzem produtos visíveis são
utilizados para desenvolver ensaios semelhantes ao ELISA com
resultados que são visualmente interpretados. Estes tipos de
ensaios são m u i t o úteis para aplicações em (1) triagens, (2) pronto
atendimento e (3) testes em domicilio.
c
CtLCHnOH NAD Formãzan
AIcoo! desidrogenase Di aforas e
y / V
CHICHO NADH " " INT
Figura 10-14 Ensaios ultra-sensíveis para os marcadores peroxidase
de raiz forte e fosfatase alcalina. A, Ensaio quimioluminescente para o
marcador peroxidase de raiz forte empregando luminol. B, Ensaio
quimioluminescente para um marcador com fosfatase alcalina
empregando AMPPD (fosfato dissódio 3-(4-metoxispiro[l,2-dioxetano-
3,2'-mciclo[3.3.1.1]-decano]4-il)fenil). C, Ensaio fotométrico para o
marcador fosfatase alcalina utilizando uma reação de detecção em
cascata. ÍNT, violeta de p-iodonitrotecrazólio.
Técnica de Imunoensaio Enzimático de Multiplicação. E M I T é
u m E I A homogêneo (Figura 10-15).8 Esta técnica é de realização
simples porque não necessita de uma etapa de separação e é
utilizada no desenvolvimento de uma ampla variedade de expe-
rimentos com drogas, hormônios e metabólitos. Os ensaios do
tipo E M I T são facilmente automatizados e estão incluídos no
repertório da maioria dos analisadores automatizados clínicos e
de imunoensaios.
N a técnica E M I T , o anticorpo contra o analito, droga, hor-
m ô n i o ou metabólito é adicionado à amostra do paciente junta-
mente com o substrato. Assim ocorre a ligação do anticorpo ao
analito. U m a alíquota da enzima conjugada ao analito, droga,
h o r m ô n i o ou metabólito é então adicionada como segundo rea-
gente. O conjugado enzima-analito liga-se com o excesso de anti-
corpo antianalito formando u m complexo antígeno-anticorpo.
Esta ligação do anticorpo antianalito com o conjugado enzima-
analito afeta a enzima e altera sua atividade. A variação relativa
na atividade da enzima é proporcional à concentração do analito
na amostra do paciente. A concentração do analito é calculada
a partir da curva-padrão preparada através da análise dos padrões
que contenham quantidades conhecidas de analito.
 Princípios das Técnicas Imunoquímicas CAPÍTULO 10 171

Imunoensaio de Doador Enzimático Cionado. C E D I A é u m
segundo t i p o de E I A h o m o g ê n e o {Figura 10-15). Este é o pri-
m e i r o E I A desenhado e desenvolvido p o r técnicas de engenharia
genética.' C o m esta técnica, fragmentos inativos de p-gala c t o si-
das e (o d o a d o r enzimático e o aceptor) são preparados p o r m a n i -
pulação do gene Z d o operori lac de Esckerichia coli. Estes dois
fragmentos reagrupam-se espontaneamente para f o r m a r a enzima
ativa, m e s m o que o d o a d o r enzimático esteja aderido a u m antí-
geno. N o e n t a n t o , a ligação d o a n t i c o r p o ao c o n j u g a d o antígeno-
d o a d o r enzimático i n i b e o reagrupamento, b l o q u e a n d o então a
f o r m a ç ã o da enzima ativa. A s s i m , a competição entre o antígeno
e o c o n j u g a d o antígeno-doador enz i m áti c o p o r u m a q u a n t i d a d e
f i x a de a n t i c o r p o na presença de u m aceptor enz i m áti c o m o d u l a
a atividade enzimática m e d i d a . A l t a s concentrações de antígeno
p r o d u z e m a m e n o r i n i b i ç ã o da atividade enzimática; baixas con-
centrações, causam a m a i o r p r o d u ç ã o .
Fluoroimunoensaio
O f l u o r o i m u n o e n s a i o ( F I A ) utiliza u m a m o l é c u l a fluorescente
c o m o u m marcador i n d i c a d o r para detectar e q u a n t i f i c a r as
reações imunológicas. Exemplos de f l u o r ó f o r o s empregados
c o m o marcadores n o F I A e suas propriedades estão listados na
Tabela 10-3. U m p r o b l e m a i n i c i a l era a fluorescência de f u n d o
da amostra que l i m i t a v a a u t i l i d a d e do F I A . Este p r o b l e m a f o i
c o n t o r n a d o pela utilização de técnicas de imunoensaios c o m
resoluções de t e m p o que u t i l i z a m elementos quelantes da série
CEDIA
-fAjj
Ab + EA + ED-A,-' A t r A g + {EA-ED- \ o. >4
Enzima ativa
Sem Ag
A b A g - E D + EA
Ausência Ár atividade
enzimática
EMIT
¥
A«-Enzima + A b A b iAg + Ag-Enzima
1 Enzima ativa
terra raras (lantanídeo) ( C a p i t u l o 4). Estas técnicas são baseadas
n o f a t o de as emissões fluorescentes dos quelatos de l a n t a n í d e o
(p. ex., e u r ó p i o , t é r b i o e samáno) apresentarem vida longa (> 1
(is) em comparação à fluorescência de f u n d o típica e n c o n t r a d a
nas amostras biológicas. N o F I A c o m resolução de tempo, u m
m a r c a d o r de quelato de e u r ó p i o é excitado p o r u m pulso de
excitação l u m i n o s o (0,5 (is), e a emissão de fluorescência de vida
longa d o m a r c a d o r é m e d i d a após u m atraso (400 a 800 |Js); nesse
t e m p o q u a l q u e r sinal de f u n d o de vida c u r t a já decaiu.
O i m u n o e n s a i o de fluorescência polarizada ( F P I A ) é u m t i p o
de F I A h o m o g ê n e o a m p l a m e n t e utilizado (Figura 10-16). C o m
esta técnica, a polarização da fluorescência a p a r t i r de u m conju-
gado fluorosceína-antígeno é d e t e r m i n a d a pela velocidade de
rotação d u r a n t e o t e m p o de vida do estado excitado em solução.
U m p e q u e n o c o n j u g a d o antígeno-fluorosceina de rotação rápida
apresenta u m baixo grau de polarização; n o e n t a n t o , a ligação a
u m a grande m o l é c u l a de a n t i c o r p o d i m i n u i a velocidade de
rotação e a u m e n t a o grau de polarização. Assim, a ligação ao
a n t i c o r p o m o d u l a a polarização. A alteração na polarização é
então m e d i d a e relacionada à concentração de antígeno.
O u t r o t i p o de F I A de não separação utiliza u m sistema de
m u l t i c a m a d a para e l i m i n a r a necessidade de separação das frações
ligadas e livres. O dispositivo consiste de duas camadas de agarose
separadas p o r u m a camada opaca de ó x i d o de ferro. A amostra é
adicionada à camada superior (10 Jim) e se d i f u n d e através da
camada de ó x i d o de ferro (10 |j,m) para a camada sinalizadora
delgada (1 |J.m), que c o n t é m complexos anticorpo-antigeno-roda-
m i n a . O conjugado antígeno-rodamina é deslocado da camada
sinalizadora pelo antígeno na amostra e se d i f u n d e para a camada
superior. O conjugado antígeno-rodamina ligado residual na
camada sinalizadora é m e d i d o por f l u o r o m e t r i a f r o n t a l de super-
fície. O conjugado livre deslocado não c o n t r i b u i para o sinal
p o r q u e o mesmo é protegido da excitação de luz da fluorescência
pela camada de ó x i d o de ferro. V á r i o s outros tipos de FIAs h o m o -
gêneos f o r a m desenvolvidos e estão listados n o Q u a d r o 10-2.
imunoensaio QuimioluminGscentG
Q u i m i o l u m m e s c ê n c i a é a emissão de luz p r o d u z i d a d u r a n t e u m a
reação q u í m i c a ( C a p í t u l o 4). E m u m i m u n o e n s a i o q u i m i o l u m i -
nescente, u m a m o l é c u l a q u i m i o l u m i n e s c e n t e é utilizada c o m o

Quantidade
Ab: Ag-Enzima variável de Ag
Ausénciíí de atividade enzimática Ag-F + Ab Ab:Ag-F + Ab:Ag + Ag-F

F i g u r a 1 0 - 1 5 Imunoensaios homogêneos com as técnicas de Alta polarização Baixa polarização

(rotação lenia) (rotação rápida)
imunoensaio de doador enzimárico cionado (CEDIA) e técnica de
imunoensaio multiplicado por enzima (EMIT). EA, aceptor
enzimático; ED, doador enzimático; SD, micToparticula cintilante; Figura 10-16 Fluoroimunoensaio de polarização homogênea.
Ab, andcorpo; Ag, antígeno. F, Fluoresceína; Ab, anticorpo; Ag, antígeno.

T A B E L A 10 3 Propriedades dos Marcadores Fluorescentes

Rendimento Quântico Tempo de

Fluoróforo Excitação (nm) Emissão (nm) de Fluorescência 4 Vida (ns)

Isotiociariato de lluorosceina 492 520 0,0-0,85 4,5

Európio (p-naftoil irifluoroaceíona) 340 590,613 - 500.000
Luciíerina amarela VS 430 540 - -

Ficobiliproieína 550-620 580-660 0,5-0,98 -

Isotiocianata de rcdamina B 550 565 0,0-0,7 3,0

Umbelrferona 380 450 - -

*í?entíimenío quântico de fluorescênciasFração de moléculas que emite um fólon.

172 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
marcador indicador para detectar e quantificar as reações imu-
nológicas. O isoluminol e os ésteres de acridina são exemplos de
marcadores quimioluminescentes, A oxidação do isoluminol
pelo peróxido de hidrogênio na presença de uma catalisador (p.
ex-, microperoxidase) produz uma emissão de luz a 425 n m de
vida relativamente longa. A oxidação do éster de acridina pelo
peróxido de hidrogênio alcalino na presença de u m detergente
(p. ex.p T r i t o n X-100) produz u m flash de luz rápido a 429 nm.
Os ésteres de acridina são marcadores de atividade altamente
específica (sendo o limite de detecção pata o marcador de 800
zeptomoles) que podem ser utilizados para marcar tanto anticor-
pos quanto hapteno,1? (Figura 10-17, A).
Imunoensaio de Eletroquimiolunninescência
E m u m imunoensaio de eletroquimioluminescência, uma molé-
cuia eletroquimioluminescente, como o rutênio, é utilizada
como marcador indicador em imunoensaios competitivos ou
sanduíche. Nestes ensaios, o r u t ê n i o (II) tris(bipiridil) (Figura
10-17, B) é submetido a u m a reação eletroquimioluminescente
(620 n m ) c o m t r i p r o p i l a m i n a em uma superfície de eletrodo.
C o m este marcador, vários ensaios foram desenvolvidos em u m
f l u x o celular, c o m esferas magnéticas como fase sólida. As
esferas são capturadas na superfície de eletrodo e o marcador
não ligado é lavado da célula c o m tampão de lavagem. O mar-
cador ligado à esfera é submetido a uma reação eletroquimio-
luminescente, e a emissão de luz é medida por u m tubo foto-
m u l t i p l i c a d o r adjacente.
©©
0
A ^ \ / V ^ K --i'
r r V
B ^ \ / Y
H
T1 X'H-,
Figura 10-17 Marcadores lu min esc entes. A, Ester de acridina,
marcador quimioluminescente. (De Law S-], Miller T, Piran U, et ai.
Novel poly-substituted aryl acridinium esters and their use in
immunoassay. ] Biolum Chemilum 1989;4:88-98 ) B, Ester de rutênio
(II) tris(bipiridil) NHS (N-hidroxisuccinimida), marcador
eletroquimioluminescente.
Imunoensaio Simplificado
A integração dos avanços técnicos realizados na imunologia mole-
cular com aqueles realizados nas ciências do material e processa-
mento resultou no desenvolvimento de vários imunoensaios "sim-
plificados" para uso no consultório médico ou em domicílio
(Capítulo 12). Os esforços iniciais foram direcionados para os
testes de gravidez e fertilidade, e foram baseados na aglutinação e
inibição de aglutinação utilizando hemácias marcadas ou partícu-
las de látex em uma lâmina. Subseqüentemente, imunoensaios
sanduíches foram adaptados para aplicações semelhantes Por
exemplo, como listado na bula, o teste de gravidez I C O N I I
(Beckman Coulter, Fullerton, Calif.) é um ensaio operacional-
mente simples e sensível para a gonadotrofina coriônica humana
que detecta C G em concentrações menores que 10 m U I / m L no
soro e 20 m U I / m L na urina. C o m o mostrado na Figura 10-18, o
teste I C O N I I é u m dispositivo E I A sanduíche que utiliza anti-
corpo monoclonal m u r i n o imobilizado na superfície de uma
membrana microporosa de náilon localizada n o topo de u m forro
absorvente. O forro funciona como uma bomba capilar para
transferir o líquido da membrana. Para realizar a análise, uma
alíquota de urina é adicionada à superfície da membrana; a C G
é removida à medida que o líquido é transferido, resultando na
remoção da C G da amostra pela sua ligação ao anticorpo de
captura na membrana. Em seguida, u m anticorpo monoclonal
m u r i n o anti-CG adequado, conjugado com ALP, é adicionado e
permite-se sua transferência para o forro absorvente. A solução de
lavagem é então adicionada, seguida por u m substrato indoxil-
fosfato. O conjugado ligado converte esse substrato em u m corante
índigo insolúvel, que aparece como u m ponto azul discreto. A
segunda geração do teste I C O N inclui duas zonas adicionais de
Amostra, conjugado, solução de
lavagem, substrato
Produto colorido
Substrato
insolúvel
V*
Aík Phos
AB
** Fluxo
CG
Figura 10-18 Sistema do imunoensaio ICON ilustrando a
membrana com o anticorpo imobilizado (a), membrana de separação
fbj; recipiente (c), e forro absorvente (d). CG, gonadotrofina coriônica
humana^ AB, anticoTpo monoclonal paTa CG; Âlk Phos, fosfatase
alcalina.
 Princípios das Técnicas Imunoquímicas
controle. U m a zona com anti-ALP imobilizado age como u m
controle do procedimento; este se liga ao conjugado A L P e
também aparece como um p o n t o azul. A outra zona contém u m
anticorpo m o n o c l o n a l m u r i n o irrelevante imobilizado; este
detecta a presença de anticorpos heterófilos nas amostras, parti'
cularmente anticorpos humanos anticamundongo. Isto mimetiza
o antígeno e liga os anticorpos murinos conjugados e de captura,
fornecendo então o que parece ser u m resultado positivo.
Outros sistemas de pronto atendimento ( P O C T ) requerem
somente a adição da amostra, simplificando o protocolo do
ensaio e m i n i m i z a n d o possíveis falhas resultantes de erro do
operador. O TestPack Plus ( U n i p a t h Limited, Bedford, Reino
U n i d o ) é u m teste de gravidez que consiste em uma única etapa
e que ilustra os princípios gerais dos novos dispositivos. O mesmo
utiliza partículas de selênio coloidal (diâmetro de 160 nm) mar-
cadas com anticorpo monoclonal anti-a-CG, que apresenta cor
vermelha e fácil visualização. A amostra (urina) é aplicada ao
poço da amostra e penetra em u m forro de fibra de vidro con-
tendo o conjugado. Qualquer C G na amostra de urina combina
com o anticorpo marcado com selênio, e a mistura migra ao
longo de uma tira de nitrocelulose para uma região onde uma
linha de anticorpo policlonal anti-CG e uma l i n h a ortogonal de
complexo anti-(3-CG.CG estão imobilizados. O complexo captura
o anti-a-CG marcado com selênio que não reagiu, formando o
sinal menos, visível na janela de observação. Se a C G estiver
presente na amostra de urina, então os complexos anti-a-CG
marcado com selênio:CG ligar-se-ão ao anti-CG policlonal imo-
bilizado e u m sinal mais será formado, denotando u m resultado
positivo. O restante da mistura de reação migTa para o final da
tira e reage com o indicador de p H , vermelho de quinaldina, em
uma janela " f i m de teste" para sinalizar que o f l u x o no sistema
f u n c i o n o u corretamente. Variações deste tipo de dispositivo uti-
lizam esferas recobertas com anticorpo, carregadas com corante
azul, e possuem janelas separadas para os controles positivo,
negativo e de procedimento (p. ex., Clearview; U n i p a t h , Bedford,
Reino U n i d o ) .
imunoensaios para Análise Simultânea de Multianalitos
Os tipos de imunoensaios para análise simultânea de multiana-
litos, nos quais dois o u mais analitos são detectados em u m único
ensaio, estão se t o r n a n d o cada vez populares, tanto nos i m u n o -
ensaios de rotina quanto na pesquisa proteômica. Duas estraté-
gias diferentes foram desenvolvidas com base em suas zonas de
reação discreta (arranjos planos o u conjuntos de microesferas) o u
combinações de diferentes marcadores. 9
Por exemplo, n o sistema Triage P O C T paTa triagem de abuso
de drogas (BioSite Diagnostics, San Diego, Calif.), sete drogas são
analisadas simultaneamente, através do uso de zonas de testes
discretas em u m pequeno pedaço de membrana de náilon. Cada
zona de reste é composta por anticorpos contra uma droga espe-
cífica imobilizada na superfície da membrana. Esta zona captura
o conjugado droga-sal de ouro livres da amostra que contém a
mistura da reação do conjugado anticorpo-antidroga sal de ouro-
droga e aparece como uma banda púrpura. U m a variante desta
estratégia utiliza pequenos pedaços de vidro ou plástico sobre os
quais são marcados arranjos de anticorpos de captura ou antí-
geno para diferentes testes (p. ex., arranjo de antígenos para teste
de anticorpo anti nuclear [ A N A ] ) Outra estratégia utiliza combi-
nações de microesferas distinguíveis (p. ex., cada uma com u m
sinal de fluorescência único) em que cada tipo de esfera é reco-
berto com u m anticorpo de captura o u antígeno diferente. O
conjunto de esferas é misturado à amostra e aos reagentes de
detecção de fluorescência. A medição das fluorescências identi-
fica as diferentes esferas (por meio do seu sinal de fluorescência)
CAPÍTULO 10 173
e o sinal decorrente da captura do analito. A vantagem desta
abordagem é a simplificação do trabalho porque todos estes testes
são realizados simultaneamente na mesma lâmina ou no mesmo
tubo, n o caso, de ensaios baseados e m microesferas.
Combinações de marcadores distinguíveis, tais como os que-
latos de európio (613 n m , tempo de vida da emissão de 730 (is)
e de samário (643 n m , tempo de vida da eirissão de 50 |is),
também fornecem a base para imunoensaios quantitativos simul-
tâneos. Estes dois quelatos apresentam diferentes emissões
máximas de fluorescência e tempos diferentes de decaimento da
fluorescência e, portanto, são facilmente distinguidos a partir da
medição a 613 n m , com tempo de atraso de 0,4 ms (európio) e
643 n m , com tempo de atraso de 0,05 jis (samário). O ensaio para
o antígeno prostático especifico livre e ligado e para mioglobulina
e amdrase carbônica I I I são dois exemplos da utilidade clínica de
testes combinados neste formato de ensaio simultâneo.
Microarranjos de Proteínas
Arranjos de centenas ou milhares de pontos de dimensões micro-
métricas, com antígenos ou anticorpos imobilizados na superfície
de u m chip de vidro o u plástico, estão emergindo como u m a
ferramenta importante nos estudos genõmicos e na avaliação das
interações proteína-proteína. 9 Este formato facilita os imunoen-
saios para análise simultânea de multianalitos utilizando, por
exemplo, conjugados marcados com enzimas ou fluoróforos. Os
arranjos são feitos pela impressão o u marcação de gotas de 1 n L
de soluções protéicas em u m a superfície plana, como u m a lâmina
de v i d r o para microscopia. Em u m ensaio sanduíche típico, o
arranjo na superfície da lâmina é incubado com a amostra e, em
seguida, com o conjugado. O conjugado ligado é detectado uti-
lizando-se quimioluminescencia ou fluoresceína por meio de u m
escaneador. O padrão do sinal fornece informações sobre a pre-
sença e a quantidade de analitos individuais na amostra, ou a
reatividade de u m único analito com u m a série de proteínas
dispostas na superfície da lâmina.
Interferências
U m problema em particular reconhecido nos imunoensaios san-
duíches é a interferência causada por anticorpos humanos circu-
lantes que reagem com imunoglobulinas de animais, particular-
mente os anticorpos humanos anticamundongo ( H A M A ) . Este
tipo de anticorpo causa interferência positiva ou negativa nos
ensaios sanduíche baseados em anticorpo com dois sítios que
utilizam anticorpo m o n o c l o n a l m u r i n o de captura como rea-
gente. O H A M A causa interferência falso-positiva por formar
uma ponte entre o anticorpo de captura antiimunoglobulina
m u r i n o e o conjugado de i m u n o g l o b u l i n a m u r i n o , mimetizando,
assim, u m analito específico. Considera-se que u m resultado
falso-negativo seja causado pelos H A M A s que reagem c o m u m
dos reagentes do ensaio (anticorpo imobilizado ou conjugado) e
prevenindo a formação do sanduíche com o analito específico.
Os H A M A s freqüentemente estão presentes no sangue de
pacientes que receberam anticorpo m o n o c l o n a l m u r i n o utilizado
como agente terapêutico o u para exames por imagem. Eles
também ocorrem por causa da exposição aos antígenos murinos
(p. ex., como resultado do manuseio de camundongos). O soro
m u r i n o não i m u n e geralmente é incluído nos imunoensaios
baseados em anticorpo monoclonal m u r i n o para formaT comple-
xos com o H A M A . N o entanto, apesar desta precaução, ainda
encontra-se a reatividade gerando resultados falso-positivos ou
negativos. A presença de H A M A s e outros anticorpos antiani-
mais não é disfarçada pelos experimentos de diluição porque as
amostras que contêm anticorpos antianimais não geram resulta-
dos proporcionais. A reanálise da amostra após a incubação com
174 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
urna proteína o u soro a n i m a l (p. ex., I g G de c a m u n d o n g o o u
soro m u r i n o para H A M A s ) t a m b é m c o n f i r m a u m a interferên-
cia.
OUTRAS TÉCNICAS IMUNQQUÍMICAS
O u t r o s m é t o d o s analíticos de interesse c l í n i c o que empregam
a n t i c o r p o s i n c l u e m os ensaios c i t o q u í m i c o s e de aglutinação.
Imunocitoquímica
A n t i c o r p o s reagentes marcados são utilizados c o m o sondas especí-
ficas para antígenos protéicos o u peptídicos para examinar células
i n d i v i d u a i s q u a n t o à capacidade sintética, e para marcadores espe-
cíficos para identificação de várias linhagens celulares. A i m u n o -
q u í m i c a expandiu r a p i d a m e n t e p o r m e i o de métodos imunoenzi-
máticos, como os ensaios marcados c o m H R P (imunoperoxidase).
A utilização de marcadores enzimáticos p r o p o r c i o n a várias vanta-
gens e m relação ao uso de marcadores fluorescentes, E m p r i m e i r o
lugar, eles p e r m i t e m o uso de tecidos fixados (embebidos o u não
em parafina) que fornecem u m a preservação excelente da m o r f o -
logia celular e e l i m i n a o p r o b l e m a de autofluorescência do tecido.
E m segundo lugar, as colorações c o m imunoperoxidase são perma-
nentes e é necessário apenas u m m i c r o s c ó p i o de lu2 c o m u m para
identificar as marcações. O s métodos c o m imunoperoxidase
t a m b é m são aplicáveis na microscopia eletrônica.
Ensaios Imunoquímicos de Aglutinação
A aglutinação é a " f o r m a ç ã o de g r u m o s " e m suspensão de células
que expressam antígenos, m i c r o r g a n i s m o s o u partículas na pre-
sença de a n t i c o r p o s específicos, t a m b é m conhecidos c o m o agiu-
tininas. Os ensaios baseados na aglutinação são utilizados há
vários anos para a medição q u a l i t a t i v a e q u a n t i t a t i v a de antígenos
e anticorpos. A formação de g r u m o s visíveis das partículas, c o m o
células e partículas de látex, é utilizada para i n d i c a r a reação
p r i m á r i a entre antigeno e a n t i c o r p o . O m é t o d o de aglutinação
requer (1) partículas estáveis e u n i f o r m e s , (2) antigeno p u r o e (3)
a n t i c o r p o específico. Os a n t i c o r p o s I g M apresentam m a i o r pro-
b a b i l i d a d e de p r o d u z i r aglutinação c o m p l e t a d o que os anticor-
pos I g G p o r causa do t a m a n h o e da valência da m o l é c u l a de I g M .
P o r t a n t o , q u a n d o apenas a n t i c o r p o s I g G estão envolvidos, p o d e
ser necessária a utilização de acentuador q u í m i c o o u de u m
m é t o d o antiglobulina-aglutinação. C o m o em todas as reações
i m u n o q u í m i c a s na q u a l a agregação é m e d i d a n o f i n a l da reação,
a razão a n t í g e n o / a n t i c o r p o é crítica. As concentrações extremas
de a n t i g e n o o u a n t i c o r p o i n i b e m a agregação.
A hemaglutinação descreve u m a reação de aglutinação na
q u a l o antigeno está localizado e m u m e r i t r ó c i t o . Os eritrócitos
não são apenas bons carreadores passivos de antigeno, mas
t a m b é m são f a c i l m e n t e revestidos c o m proteínas estranhas, sendo
de fácil obtenção e estoque. Os testes diretos e m eritrócitos para
g r u p a m e n t o sanguíneo, R h e o u t r o s tipos antigênicos são ampla-
m e n t e empregados nos bancos de sangue. Os anti-soros específi-
cos, c o m o a n t i - A , a n t i - C e anti-Kell, são utilizados para detectar
estes antígenos na superfície d o e r i t r ó c i t o . N a hemaglutinação
i n d i r e t a o u passiva, os eritrócitos são utilizados c o m o partículas
carreadoras de antígenos estranhos (ou de a n t i c o r p o , em alguns
testes); esta técnica apresenta aplicações amplas. O u t r o s tipos de
materiais disponíveis sob a f o r m a de partículas finas, c o m o o
látex, t a m b é m são utilizados c o m o carreadores de antígenos,
p o r é m , estes materiais são mais difíceis de revestir, p a d r o n i z a r e
armazenar. E m u m a variação correlacionada c o m esta técnica,
c o n h e c i d a c o m o inibição dá hemaglutinação, determina-se a capa-
cidade dos antígenos, haptenos o u outras substâncias, para i n i b i r
especificamente a h e m a g l u t i n a ç ã o de células sensibilizadas (reves-
tidas) pelos anticorpos.
E m geral, os métodos de aglutinação são bastante sensíveis,
mas não são tão q u a n t i t a t i v o s c o m o o u t r o s m é t o d o s i m u n o q u í -
micos discutidos a n t e r i o r m e n t e . Os i m u n o e n s a i o s não-isotópi-
cos, especialmente os EIAs, são tão convenientes q u a n t o as
reações de aglutinação e, p o r esta razão, estão s u b s t i t u i n d o os
métodos de aglutinação em vários laboratórios.
REFERÊNCIAS
1. Diamandis EP, Christopoulos TK. Immunoassay. San Diego
Academíc Press, 1996.
2. Gosling JP. Immunoassays- A practical approach. Oxford: Oxford
Press, 2000.
3. Kohler G, Milstein C. C o n t i n u o u s cultures of fused cells secreting
antibody of predefmed specificity. N ature 1975;256:495-7.
4- Kricka LJ. Chemilummescenc and biolum mescent tcchniques. Clin
C h e m 1991-37 1472-81
5. Laurell CB. Antigen-antibody crossed electrophoresis. Anal
Biochem 1965-10:358-61.
6. Picardo M, Hughes KT. Scintillation proximity assays. In: Devlin jP
High throughput screening. New York: Mareei Dekket, 1997:307-16.
7. Pnce CP, Newman D], eds Principies and practice of immunoassay,
2nd ed. New York: Stockton Press, 1997.
8 Rubenstein KE, Schneider RS, Ullman EF. "Homogeneous" enzyme
immunoassay: new immunochemical technique. Biochem Biophys
Res C o m m u n 1972;47:846-51.
9. Schena M. Protein microarrays. Sudbury, MA: Jones and Bartlett,
2005.
10 Wild D, ed. T h e immunoassay handbook, 3rd ed. San Diego:
Elsevier, 2005
11. W i n te i G. Synthetic h u m a n antibodies and a strategy for protein
engineering. FEBS Lett 1998;430:92-4.
12. Yalow RS, Berson SA. Aísay of plasma insulin in h u m a n subjeets by
immunological methods Nature 1959;184:1648-69.
 /
CAPÍTULO 1 1
Automação em LaboratóriG
de Análises Clínicas*
James C. Boyd, M.D., e Charles D. Hawker, Ph.D., M.B.A., F.A.C.B
OBJETIVOS
1. Distinguir as abordagens para automação em análises em lote, de
acesso aleatório, independente, seqüencial, multicanal e via única,
centrífugo e de fluxo contínuo.
2. Listar as operações comumente automatizadas de uma análise
clínica e descrever cada operação individualmente.
3. Descrever uma estação de trabalho laboratorial automatizada e
integrada.
4. Definir o que é teste laboratorial remoto (point-of-care testing) e
fornecer exemplos de analisadores de testagem laboratorial remeta.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A l í q u o t a : U m a porção da q u a n t i d a d e t o t a l de u m a amostra
(n); u m processo paia d i v i d i r u m a solução em alíquotas (v).
A n á l i s e de Acesso A l e a t ó r i o : U m t i p o de análise n o q u a l
q u a l q u e r amostra, pelo c o m a n d o d o sistema processador, é
analisada p o r q u a l q u e r processo d i s p o n í v e l em seqüência
o u não a outras amostras e sem preocupação c o m suas
ordens iniciais.
A n á l i s e de F l u x o C o n t í n u o : U m t i p o de análise n o q u a l cada
amostra d o lote passa pelo m e s m o f l u x o c o n t í n u o na
mesma velocidade e é s u b m e t i d a às mesmas reações
analíticas.
A n á l i s e e m L o t e : U m t i p o de análise n o q u a l m u i t a s amostras
são processadas na mesma sessão o u " c u r s o " analítico.
A n á l i s e I n d e p e n d e n t e : U m t i p o de análise n o q u a l cada
amostra e m u m l o t e possui os espaços físicos e q u í m i c o s
separados de q u a l q u e r o u t r a amostra.
A n á l i s e M u l t i c a n a l : U m t i p o de análise n o q u a l cada amostra
é s u b m e t i d a a m ú l t i p l o s processos analíticos para q u e vários
resultados de testes sejam o b t i d o s de u m a única amostra;
t a m b é m c o n h e c i d a c o m o análise multiteste.
A n á l i s e Paralela: U m t i p o de análise n o q u a l todas as amostras
são submetidas a u m a série de processos analíticos ao
m e s m o t e m p o , de f o r m a paralela.
A n á l i s e p o r V i a Ú n i c a : U m t i p o de análise n o q u a l cada
amostra é s u b m e t i d a a u m processo ú n i c o para q u e apenas
sejam p r o d u z i d o s os resultados para u m ú n i c o a n a l i t o .
T a m b é m c o n h e c i d a c o m o análise de teste único.
A n á l i s e S e q ü e n c i a l : U m t i p o de análise e m q u e cada amostra
e m u m l o t e entra n o processo analítico u m a após a o u t r a e
cada r e s u l t a d o o u c o n j u n t o de resultados emerge na mesma
o r d e m q u e as amostras e n t r a r a m .
A u t o m a ç ã o : O processo p e l o q u a l u m i n s t r u m e n t o analítico
realiza m u i t o s testes c o m o e n v o l v i m e n t o m í n i m o de u m
*Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições prévias de Ernest
Maclin e D.S. Young, nas quais se Laseiam partes deste capítulo.
analista; t a m b é m d e f i n i d a c o m o operação c o n t r o l a d a de
u m aparato, processo o u sistema p o r dispositivo mecânico
o u eletrônico sem i n t e r v e n ç ã o h u m a n a .
Configuração do Analisador: O formato no qual os
i n s t r u m e n t o s analíticos estão configurados; d i s p o n í v e l e m
sistemas aberto e fechado. N o sistema aberto, o o p e r a d o r
de l a b o r a t ó r i o m o d i f i c a os parâmetros da análise e c o m p r a
reagentes de vários fornecedores. N o sistema fechado, a
m a i o r i a dos parâmetros é d e t e r m i n a d a pelo fabricante que
t a m b é m fornece os reagentes e m u m recipiente especial.
C o n t a m i n a ç ã o C r u z a d a (Carry-Over)-. O t r a n s p o r t e de u m a
q u a n t i d a d e de analito o u de reagente que parte da reação
de u m a amostra para a seguinte e a c o n t a m i n a .
L a b o r a t ó r i o C e n t r a l : U m t i p o de l a b o r a t ó r i o centralizado para
o q u a l as amostras são enviadas para análise.
T a x a de P r o d u ç ã o de A m o s t r a : A velocidade na q u a l u m
sistema analítico processa as amostras.
Testagem C e n t r a l i z a d a : U m m o d o de testagem n o q u a l as
amostras são transportadas para u m a u n i d a d e central, o u
" n ú c l e o " , para análise.
Testagem L a b o r a t o r i a l R e m o t a ( P O C T ) : U m sistema de
testagem e m que a análise é realizada n o local o n d e a
assistência médica é f o r n e c i d a ; t a m b é m c o n h e c i d o c o m o
teste à cabeceira, próximo ao paciente, descentralizado e fora do
laboratório.
O
t e r m o a u t o m a ç ã o f o i aplicado na q u í m i c a clínica para
descrever o processo pelo q u a l u m i n s t r u m e n t o analítico
realiza m u i t o s testes c o m o m í n i m o de e n v o l v i m e n t o p o r
parte de u m analista. A d i s p o n i b i l i d a d e de i n s t r u m e n t o s automa-
tizados p e r m i t e que os l a b o r a t ó r i o s processem m a i o r n ú m e r o de
testes sem a u m e n t o comparável de f u n c i o n á r i o s . A evolução da
automação n o l a b o r a t ó r i o c l í n i c o chegou ao patamar da automa-
ção na i n d ú s t r i a m a n u f a t u r e ira, p r o g r e d i n d o da automação fixa,
e m q u e u m i n s t r u m e n t o realiza sozinho u m a tarefa repetitiva,
para a automação programável, q u e p e r m i t e que u m i n s t r u m e n t o
desempenhe várias tarefas diferentes. A automação inteligente
t a m b é m f o i acrescentada e m alguns i n s t r u m e n t o s o u sistemas,
p e r m i t i n d o que eles se a u t o m o n i t o r e m e que r e s p o n d a m de
f o r m a a p r o p r i a d a às condições variáveis.
U m b e n e f í c i o da a u t o m a ç ã o é a redução na v a r i a b i l i d a d e dos
resultados e nos erros das análises via eliminação das tarefas que
são repetitivas e m o n ó t o n a s para a m a i o r i a dos i n d i v í d u o s . O
aperfeiçoamento da r e p r o d u t i b i l i d a d e o b t i d o c o m a automação
l e v o u a u m a m e l h o r a significativa na qualidade dos testes labora-
toriais.
M u i t o s l a b o r a t ó r i o s p e q u e n o s agora se c o n s o l i d a r a m e m enti-
dades maiores e mais eficientes e m resposta às tendências do
mercado n o q u e diz respeito à redução de custos. O i m p u l s o para
automatizar esses megalaboratórios a b r i u novas portas na auto-
176 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

mação l a b o r a t o r i a l . A automação não é mais simplesmente usada u n i f o r m e m e n t e o a u m e n t o de t r a b a l h o e, c o m isso, a u m e n t a r a

para auxiliar o técnico l a b o r a t o r i s t a na realização do teste, mas
ela agora i n c l u i (1) processamento e transporte de amostras, (2)
injeção de amostras em analisadores automáticos e (3) avaliação
dos resultados dos testes realizados. A c r e d i t a m o s que a automa-
ção dessas funções adicionais seja crucial para a prosperidade
f u t u r a d o l a b o r a t ó r i o clínico. 1 , 3
Este c a p í t u l o discute os p r i n c í p i o s que se aplicam à automa-
ção das etapas i n d i v i d u a i s d o processo analítico — t a n t o nos
analisadores i n d i v i d u a i s q u a n t o na integração da automação em
t o d o o l a b o r a t ó r i o clínico.
CONCEITOS BÁSICOS
O s analisadores automatizados geralmente i n c o r p o r a m versões
mecanizadas das técnicas e p r o c e d i m e n t o s manuais básicos
usados em l a b o r a t ó r i o . P o r é m , a i n s t r u m e n t a ç ã o m o d e r n a oferece
u m a grande variedade de configurações. A configuração mais
c o m u m é o analisador de acesso aleatório. N a análise de acesso
a l e a t ó r i o o u r a n d ô m i c o , as análises são realizadas seqüencial-
m e n t e e m u m a coleção de amostras, c o m cada amostra analisada
para u m a seleção diferente de testes. Os testes feitos nos analisa-
dores de acesso aleatório são selecionados c o m o uso de diferen-
tes frascos de (1) reagentes l í q u i d o s , (2) pacotes de reagente o u
(3) tabletes de reagente, d e p e n d e n d o do analisador. Essa aborda-
gem p e r m i t e a mensuração de u m a grande q u a n t i d a d e variável e
de analitos em cada amostra. Os perfis o u grupos de testes são
d e f i n i d o s para a amostra n o m o m e n t o em que os testes a serem
realizados e n t r a m n o analisador (1) por m e i o de u m p a i n e l ele-
t r ô n i c o (na m a i o r i a dos sistemas), (2) p o r instrução de u m sistema
de i n f o r m a ç ã o d o l a b o r a t ó r i o em c o n j u n t o c o m u m código de
barras n o t u b o da amostra, o u (3) p o r seleção d o o p e r a d o r dos
pacotes de reagentes apropriados.
H i s t o r i c a m e n t e , outras configurações de analisadores usadas
i n c l u e m (1) f l u x o c o n t í n u o , (2) m o d u l a i e (3) analisadores cen-
trífugos. Os analisadores de f l u x o c o n t í n u o f o r a m os p r i m e i r o s
a serem analisados e usados e m laboratórios de análises clínicas.
I n i c i a l m e n t e , esses analisadores f o r a m usados em u m a configu-
ração para análise p o r v i a ú n i c a e realizavam u m a análise seqüen-
cial de cada amostra Subseqüentemente, as versões de análise
m u l t i c a n a l f o r a m desenvolvidas o n d e a análise de cada amostra
era feita em cada u m dos canais e m paralelo. Os resultados de
testes não solicitados n o m e n u de teste eram descartados depois
da análise completa. A i n f l e x i b i l i d a d e n o m e n u dos testes que
p o d i a m ser realizados nesses analisadores e v e n t u a l m e n t e levou à
sua substituição n o m e r c a d o p o r configurações mais versáteis.
O s analisadores m o d u l a r e s f o r a m desenvolvidos p o r fabrican-
eficiência o p e r a c i o n a l (Tabela 11-1) A adição de u m m ó d u l o
quase sempre é usada para a u m e n t a r a taxa de p r o d u ç ã o da
a m o s t r a do analisador c o m o m e d i d a n o n ú m e r o de resultados
d o teste p r o d u z i d o p o r hora. O s m ó d u l o s t a m b é m p o d e m adi-
c i o n a r f u n c i o n a l i d a d e a u m analisador, c o m o na adição de u m
m ó d u l o de eletrodo íon-seletivo para mensuTação de eletrólitos.
Nos analisadores de acesso aleatório, os m ó d u l o s adicionais
p o d e m fornecer u m m e n u mais a m p l o de testes disponíveis.
Os analisadores centrífugos usam pipetas distintas para
colocar em seqüência alíquotas de amostras e reagentes nas
câmaras distintas de u m rocor, e as amostras são subseqüente-
m e n t e analisadas em paralelo (análise paralela) T a l analisador
p o d e ser operado n o m o d o de q u í m i c a ú n i c a / a m o s t r a m ú l t i p l a
o u de amostra ú n i c a / q u í m i c a m ú l t i p l a .
AUTOMAÇÃO DO PROCESSO ANALÍTICO
As seguintes etapas i n d i v i d u a i s necessárias para c o m p l e t a r u m a
análise são referidas em c o n j u n t o c o m o operações de unidade
( Q u a d r o 11-1). Essas operações são descritas i n d i v i d u a l m e n t e
nesta seção, c o m exemplos que d e m o n s t r a m c o m o elas f o r a m
automatizadas em termos de desempenho analítico e operacio-
nal. N a m a i o r i a dos sistemas automatizados essas etapas n o r m a l -
m e n t e são realizadas seqüencialmente, mas e m alguns instrumen-
tos elas p o d e m ocorrer em paralelo.
I
Q U A D R O 1 1 - 1 | Operações de Unidade no Processo Analítico
- Identificação tia amostra
• Preparação da amostra
• Distribuição da amostra
• Aspiração e carregamento da amostra
• Processamento da amostra
• Injeção de amostra e transporte interno
• Manejo e armazenamento de reagente
• Distribuição de reagente
• Fase de reação química
• Abordagens de mensuração

tes para fornecer mais escalabilidade, o u seja, para m a n i p u l a r • Processamento de sinal, manejo de dados e controle tio processo

TABELA 11-1 Exemplos de Sistemas Modulares com Parâmetros-chave

Nome do Variação da Produção, Elementos-chave Montagem

Sistema Módulos Resultados por Hora Comuns do Módulo Comentários
SYNCHRON CX7 Analisadores 825 Sampleador e computador Na fábrica Combina o CX3 e o CX4
MODULAR Moduladores 170-10.000 Rotas para estantes, estação Na fábrica Módulos analíticos comuns e
D, P, E de carregamento e computador e no campo múltiplos podem ser usadas
WorkCell Analisadores 1.650 químicos e 240 Triltio e computador Na fábrica Combina o 1.650 e o Centaur
imunoquímicos
LX4201 Analisadores 2.830 Computador Na fábrica Combina dois analisadores LX20
AU54G0 Series Analisadores 3.200-6.600 Rotas de transferência de Na fábrica Combina atê 3 módulos de
estantes (racKj e computador analisadores e 2 módulos ISE
 Automação em Laboratório de Análises Clínicas
QUADRO 11-2 Tecnologias Usadas para Identificação
Automática e Coleta de Dados
Código de barras
Reconhecimento óptico de caracteres
Reconhecimento de fita magnética e de caracteres de tinta magnética
Identificação de voz
Identificação de radiofreqüência
Monitores sensíveis ao toque
Canetas ópticas
Placas de impressão da mão
Leitores de marcas ópticas
Cartões inteligentes
Identificação de Amostras
E m geral o elo de identificação (identificador) entre paciente
e amostra é feito à cabeceira do paciente e a manutenção dessa
conexão durante (1) o transporte da amostra ao laboratório,
(2) a subseqüente análise da amostra, e (3) a preparação do
relatório é essencial. Várias tecnologias estão disponíveis para
identificação automática e coleta de dados (Quadro 11-2). N a
prática, a identificação automática i n c l u i apenas tecnologias
que detectam eletronicamente u m a característica única ou u m a
série de dados característicos associados ao objeto físico. Por
exemplo, identificadores como (1) n ú m e r o de série, (2) n ú m e r o
do lote, (3) cor, (4) fabricante, (5) n ú m e r o do paciente e (6)
número da Previdência Social (Social Securit^) são usados para
identificar u m objeto ou paciente via banco de processamento
de dad os eletrônico. E m laboratório clínico, etiquetar c o m
código de barras tornou-se a tecnologia de escolha devido à
identificação automática. O uso desses códigos reduziu os erros
de identificação.
Rotulagem
E m muitos sistemas de informação laboratorial, a entrada ele-
trônica de u m pedido de teste no laboratório ou no posto de
enfermagem para u m paciente exclusivamente identificado cria
u m r ó t u l o para a amostra com u m n ú m e r o seqüencial exclusivo
do laboratório. U m registro é estabelecido e permanece incom-
pleto até que o resultado (ou grupo de resultados) entre n o
computador e seja comparado com o n ú m e r o seqüencial. O
rótulo exclusivo é fixado n o tubo de coleta da amostra quando
o sangue é extraído. O alinhamento adequado do r ó t u l o no tubo
de coleta é essencial para o processamento subseqüente da
amostra, quando rótulos com código de barras são usados. A
chegada da amostra n o laboratório é registrada manualmente o u
pelo procedimento computadorizado íogin. E m outros sistemas,
a amostra é rotulada à cabeceira do paciente, j u n t o à identifica-
ção do paciente e às informações adicionais, e entra no labora-
tório c o m o pedido médico. Lá a amostra recebe u m número
seqüencial como parte do procedimento login, que pode (ou não)
ser realizado por computador.
Após o registro, iniciam-se os processos de manejo técnico
das amostras. Para os processos que requerem a Temoção física
do soro do tubo original, novos rótulos contendo as informações
essenciais do r ó t u l o original devem ser colados em qualquer
tubo adicional. Alguns analisadores automatizados retiram
amostra diretamente do tubo coletor original enquanto, simul-
taneamente, lêem o número seqüencial da etiqueta com código
de barras no tubo. Caso seja necessário, rótulos secundários c o m
código de barras podem ser gerados na hora do registro de
CAPÍTULO 11 177
entrada o u em alguns analisadores por impressora embutida que
esteja ligada quando o analisador for programado.
Muitos métodos são usados para se obter rotulagem secun-
dária quando não há disponibilidade de rótulos com código de
barras. Pode-se escrever u m número n o frasco de coleta ou colar
u m r ó t u l o codificado no tubo original o u no frasco da amostra.
Os números do r ó t u l o p o d e m precisar de correlação com uma
lista de tarefas o u de cargas manual o u gerada por computador.
A lista de carga geralmente registra os números seqüenciais com
as posições físicas dos frascos o u tubos na zona de carregamento
do analisador. Essa zona de carregamento pode ser (1) uma
bandeja giratória, (2) u m a correia mecânica ou (3) u m rnck
(estante) ou grupo de racks pelos quais as amostras são distribu-
ídas em uma ordem predeterminada para a estação de aspiração
da amostra do analisador.
Nos analisadores que não associam a identidade da amostra
e a aspiração da mesma automaticamente, a seqüência dos resul-
tados produzidos deve ser manualmente associada à seqüência
de entrada das amostras. Alguns analisadores i m p r i m e m ou
transmitem para o computador p r i n c i p a l cada resultado ou
grupo de resultados de uma amostra, seja pela posição da amostra
na zona de carregamento, o u pelo n ú m e r o de acesso programado
para aquela posição.
Codificação de Barras
U m dos principais avanços na automação da identificação de
amostras em laboratórios de análises clínicas é a incorporação
da tecnologia de codificação de haTras nos sistemas analíticos.
Na prárica, u m r ó t u l o codificado com barras (quase sempre
gerado pelo sistema de informação do laboratório e contendo o
número de acesso da amostra) é colocado no recipiente da
amostra e " l i d o " , subseqüentemente, por u m o u mais leitores de
código de barras colocados em posições estratégicas na seqüência
analítica. A informação suplementar e identificadora resultante
é então transferida e processada pelo programa do sistema.
Iniciar a identificação por código de barras à cabeceira de u m
paciente garante u m a integridade maior da identidade da
amostra em u m analisador. Os sistemas para transferir a infor-
mação sobre a identidade do paciente para os tubos de sangue
à cabeceira do paciente foram introduzidos em alguns hospitais
e várias empresas estão agora oferecendo esses sistemas.
Identificação positiva e inequívoca de cada amostra é obtida
em analisadores com código de barras em menos de 2 segundos.
As vantagens do uso de rótulos codificados incluem;
1. Eliminar listas de tarefas para o sistema.
2. Evitar erros cometidos na colocação dos tubos no analisador
ou durante a amostragem.
3. Analisar as amostras em uma seqüência definida.
4. Evitar possível mistura de tubos quando o soro precisa ser
transferido para u m recipiente secundário.
Exemplos de código de barras usados em analisadores quí-
micos são ilustrados na Figura 11-1.
U m sistema de codificação de barras é composto por uma
impressora de código de barras e u m leitor de código de barras
o u scanner. Sistemas de impressão de códigos de barras e bidi-
mensionais estão disponíveis. U m código de barras unidimen-
sional é u m grupo de barras retangulares e de espaços organiza-
dos em padrão predeterminada, que seguem regras não-ambí-
guas para representar os elementos dos dados denominados
caracteres. U m código de barras é transferido e fixado em u m
objeto por u m "rótulo de código de barras" que contenha o
código de barras e, opcionalmente, outra informação confiável
não-codificada. Simbologia é o termo usado para descrever as
regras que especificam o m o d o como os dados são codificados
178 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
HEITHflN L0UISE C
AF-115475 F 79 BD:D7/D2/12
HEITHAN LGUISE C
AF-11B475 F 79
514CS6 06/17/91 CL 514D9S OS/17/31
• •
111 IEJIGC PM 111 111 lGiGD PM 11»
LDH ISO CK ISO LDH ISO CK ISO
HEITMflN LQUISE C
HEITHflN LOLISE C
PF-118475 F 79
AF-110475 F 75 BE:•7/DB/1E
514CI9G QE/17/91 CL 51409S osy 17/31
111 IQIQC PM 111 111 1G:GG PM 111
LDH ISG CK ISO LDH 150 CK ISO
Figura 11-1 Exemplo de códigos de barras usados em analisadores
químicos que contenham a mesma informação. A, Código 39. B,
Código] 2 / 5 C, Código 128B D, Codabar. (Cortesia de Computer
Transceiver Systems, Inc.)
em barras e espaços. A largura das barras e dos espaços e o
n ú m e r o de cada u m deles são determinados p o r uma especifica-
ção para essa simbologia. Combinações diferentes de barras e
espaços representam caracteres diferentes. Q u a n d o u m scanner de
código de barras é passado sobre o código, o raio de luz do scanner
é absorvido pelas barras escuras e não são refletidos; o raio de
luz é refletido pelos espaços em claro. U m detector de fotocélula
no scanner recebe a luz refletida e converte essa luz em u m sinal
elétrico que é então digitalizado. U m código de barras unidimen-
sional é "verticalmente redundante", pois a mesma informação
é repetida verticalmente — as alturas das barras podem ser trun-
cadas sem perda alguma de informação. Na prática, a redundân-
cia vertical permite que u m símbolo com defeitos de impressão,
como manchas e vazios, seja lido.
Erros de Identificação
H á muitas oportunidades para se cometer erros com as amostras
e com os resultados. Os riscos começam à cabeceira do paciente
e a u m e n t a m a cada etapa d o p r o c e s s a m e n t o , e n t r e a coleta e a
análise da amostra pelo instrumento. O risco fica m u i t o maior
quando a transcrição manual é usada no processamento, na
rotulagem e rerrotulagem, e na criação de listas de carregamento.
U m n ú m e r o de acesso incorreto, n o qual os dígitos são transpos-
tos, ou uma lista de carregamento com números de acesso trans-
postos podem fazer com que os resultados sejam atribuídos ao
paciente errado. U m outro erro pode acontecer quando as amos-
tras precisam ser inseridas em certas posições na zona de carga.
A leitura humana errada, tanto do rótulo da amostra quanto da
lista de carregamento, pode causar a colocação de amostras,
calibradores ou controles em lugar errado. A leitura automática
do código de barras reduz a taxa de erro de 1 (um) em 300
caracteres (para entrada humana) para 1 (um) em 1 (um) milhão
de caracteres
Preparação da Amostra
A coagulação do sangue em tubos de coleta de amostra, sua
subseqüente configuração e a transferência do soro para tubos
recipientes precisam de u m tempo limitado para se completar.
Q u a n d o realizado manualmente, esse processo resulta em atraso
na preparação de uma amostra para análise. Para eliminar os
problemas associados à preparação da amostra, estão sendo
desenvolvidos sistemas para automatizar esse processo.
ED:D7/QE/1E
Uso de Sangue Total para Análise
CL Q u a n d o o sangue total é usado em u m sistema de análise, o
tempo de preparação da amostra é eliminado. Os eletrodos íons-
seletivos automatizados ou semi-automatizados, que medem a
atividade do íon no sangue total em vez da concentração de íon,
foram incorporados em sistemas automatizados para fornecer
certos resultados de testes alguns minutos após a extração de uma
amostra. Essa abordagem é agora comumente usada para análises
60:07/02/12
de eletrólitos e de alguns outros analitos comuns. O u t r a aborda-
CL gem envolve a aplicação manual o u automatizada de sangue total
em filmes de reagente seco e a observação visual ou instrumental
de uma mudança quantitativa (Capítulo 12).
Automação da Preparação da Amostra
Vários fabricantes desenvolveram sistemas de preparação total-
mente automatizados. (Esses sistemas serão descritos mais adiante
neste capítulo.)
Entrega da Amostra
Vários métodos são usados para entrega de amostras em labora-
tórios, i n c l u i n d o (1) serviço de portador, (2) sistemas de tubos
pneumáticos, (3) veículos de t r i l h o elétrico e (4) robôs móveis.
Serviço de Portador
Historicamente, os portadores são usados para transportar amos-
tras dos locais de coleta para os laboratórios e entre estes. Embota
fidedigno de forma geral, o serviço de portadores cria certos
problemas. A entrega é u m processo quantitativo e os portadores
normalmente servem apenas u m determinado ponto de retirada
em tempos específicos. Planejamentos para coleta imediata são
possíveis, mas acrescentam custos ao processo analítico e atrasam
os relatos dos resultados. A l é m disso, a perda ou quebra de uma
amostra ocorre quando se lida manualmente com as mesmas.
Sistemas de Tubos Pneumáticos
Os sistemas de tubos pneumáticos fornecem o transporte rápido
de amostra e são confiáveis quando instalados como serviços de
ponta a ponta. N o entanto, quando mecanismos de troca são
introduzidos para permitir que os carregadores (contêineres em
forma de bala usados para carregar amostras) sejam enviados a
vários locais, sabe-se que problemas mecânicos ocorrem e causam
erro de rota nos carregadores. A l é m disso, atenção cuidadosa ao
formato do sistema de tubo pneumático é necessária para evitar
a hemólise da amostra. Evitar acelerações e desacelerações súbitas
e usar material de embalagem apropriado dentro dos carregado-
res minimizarão a hemólise.
Veículos de Trilho Elétrico
Os veículos de t r i l h o elétrico possuem uma capacidade maior de
transporte do que os sistemas de tubos pneumáticos e não dani-
ficam as amostras por forças de aceleração e / o u desaceleração.
Alguns sistemas mantêm o carregador na posição vertical com o
uso de argola de suspensão (um dispositivo que permite a u m
corpo inclinar-se livremente em qualquer direção ou suspenso
pata que permaneça nivelado quando seu apoio estiver incli-
nado). Isso faz com que o carregador se mova tanto vertical
quanto horizontalmente sobre u m t r i l h o elétrico instalado. Os
recipientes contêm gelo seco ou pacotes de gel congelados com
as amostras caso seja desejado. Eles são especialmente úteis para
o transporte rápido de amostras entre andares ou locais do labo-
ratório que estejam a alguma distância u m do outro, utilizando
todo o espaço do teto acima do laboratório. A principal desvan-
tagem é o custo do t r i l h o em movimento e das estações de car-
regamento e descarregamento se o laboratório estiver expandindo
 Automação em Laboratório de Análises Clínicas
ou se movendo; além disso, as estações podem ser maiores que
as estações do tubo pneumático. Se a estação não estiver locali-
zada diretamente no laboratório central (testagem centralizada;
laboratório central) poderá ser necessário pessoal adicional para
descarregar os carrinhos e transportar as amostras até o destino
final, e o sistema de trilho elétrico pode não atingir o objetivo
desejado de transporte rápido de amostra.
Robôs Móveis
Os robôs móveis têm sido usados com sucesso para o transporte
de amostras dentro e fora do laboratório central.' 6 Eles são
facilmente adaptados para transportar recipientes de amostras
de várias formas e tamanhos, além de serem reprogramáveis
quando há mudanças na geometria do laboratório. A l é m disso,
em laboratórios de m u i t o movimento, a entrega de amostras nos
bancos do laboratório por u m robô móvel pode ser mais fre-
qüente que por humanos e mostrou ser custo-efetiva. Robôs
móveis de vários fabricantes foram instalados em laboratórios de
análises clínicas. Os modelos econômicos seguem uma linha n o
chão, enquanto outros possuem sistemas de orientação mais
sofisticados. Suas limitações incluem a necessidade de agrupar
as amostras (análise de lote) para maior eficiência e, na maioria
dos casos, elas precisam de pessoal para depositar e remover as
amostras do robô móvel em cada local de parada.
Carregamento e Aspiração de Amostra
Na maioria das situações, a amostra para análise automática é o
soro. M u i t o s analisadores testam o soro diretamente dos primei-
ros tubos de coleta de vários tamanhos. C o m tais analisadores,
os tubos de coleta mais usados contêm u m material separador
que forma uma barreira entre o sobrenadante e as células (Capi-
tulo 3).
Muitos analisadores também testam em recipientes ou tubos
de soro transferido dos tubos originais. Os formatos dos reci-
pientes de testagem são especiais para cada analisador. Cada
recipiente deve ser desenhado a f i m de minimizar o volume
m o r t o — o excesso de soro que deve existir em u m recipiente
para permitir a aspiração de todo o volume necessário para o
ensaio. Os recipientes devem ser feitos de material inerte para
que não interajam com os analitos que estão sendo medidos.
Eles também devem ser descartáveis para que haja redução dos
custos e seus formatos devem, mesmo sem tampa, minimizar a
evaporação.
As amostras podem sofrer outras formas de degradação além
da evaporação. As amostras que contêm constituintes termolá-
beis podem sofrer degradação desses analitos se mantidos em
temperatura ambiente. Outros constituintes, como bilirrubina,
são fotolábeis. A termolabilidade é reduzida quando as amostras
e os calibradores são mantidos em uma zona de carregamento
refrigerada. A fotodegradação é reduzida com o uso de recipien-
tes semi-opacos e a colocação de coberturas plásticas de cor fume
ou laranja sobre os recipientes de amostra.
A zona de carga de u m analisador é a área na qual as amos-
tras são mantidas no instrumento antes de serem analisadas. A
área que comporta o material pode ser uma bandeja circular,
uma estante ou série de estantes em forma de cassete ou n u m a
cadeia de recipientes em forma de serpentina na qual tubos
individuais são inseridos. Q u a n d o as amostras não são identifi-
cadas automaticamente, elas devem ser colocadas no dispositivo
de testagem na seqüência correta como especificado por uma
lista de carga. O mecanismo de amostragem determina o volume
exato da amostra que deve ser removido.
Para a maioria dos analisadores, os recipientes para a próxima
amostragem devem ser preparados em uma bandeja separada
CAPÍTULO 11 179
enquanto u m processamento já está em progresso. Esse processo
permite que a operação da máquina e as ações humanas ocorram
paralelamente para que ocorra máxima eficiência. E m alguns
analisadores, as amostras podem ser adicionadas continuamente
pelo operador à medida que se t o r n a m disponíveis. U m a carac-
terística desejável em qualquer analisador automatizado é a capa-
cidade de inserir novas amostras na frente de amostras já posi-
cionadas na zona de carga. Essa característica permite a análise
oportuna de uma amostra com alta prioridade médica quando
ele chega ao laboratório clínico. Q u a n d o a identificação de uma
amostra é lida de forma automática, o operador consegue repo-
sicionar facilmente as amostras na zona de caTga. Q u a n d o a
identificação da amostra está ligada à lista de carga, entretanto,
a inserção ou reposição das amostras deve ser acompanhada pela
revisão da lista de carga.
A transmissão de doenças infecciosas pelo equipamento
automatizado é uma preocupação nos laboratórios de análises
clinicas. O principal método de transmissão por equipamento é
através de respingos de soro ou sangue durante a aquisição de
amostras das sondas de amostra que se movem rapidamente. O
uso de sensores de nível que restringem a penetração das sondas
de amostragem nas amostras e fornecem u m controle mais suave
do movimento reduz m u i t o os respingos.
Devido ao potencial para contaminação quando os tampões
dos principais recipientes são abertos ou destampados para
decantar o soro em recipientes de amostra, várias empresas
desenvolveram sistemas de amostragem com recipientes fecha-
dos para uso em seus analisadores químicos e hematológicos
automatizados. Nesses sistemas, a sonda de amostra passa por
uma agulha oca que penetra pTimeiro n o anteparo de borracha
do recipiente principal. Essa configuração evita o dano ou a
obsnução da sonda de amostra enquanto permite que u m sensor
de nível (usado para reduzir a contaminação cruzada e detectar
pouca amostra) permaneça atLvo. Depois que a sonda de amostra
é retirada, a agulha oca externa também é retirada para que o
anteparo volte a se vedar e a amostra não escape. A amostragem
em recipientes fechados é amplamente usada em analisadores
hematológicos.
Processamento de Amostra
A automação de procedimentos analíticos deve ter a capacidade
de remover as proteínas e outros interferentes de algumas amos-
tras e de separar as frações livre e ligada de imunoensaios hete-
rogêneos .
Remoção de Proteínas e Outros Interferentes
A remoção de proteínas e de outros interferentes das amostras
é, às vezes, necessária para garantir a especificidade de u m
método analítico. Diálise, cromatografia e filtração são usadas
com esse propósito. 2
Separações em Sistemas de Imunoensaio
A automação de procedimentos de imunoensaio requer a sepa-
ração das frações livre e ligada de imunoensaios heterogêneos.
Várias abordagens têm sido usadas.
Para automatizar essa etapa de separação, vários analisadores
de imunoensaio automatizados utilizam anticorpos ou proteínas
ligados em u m sistema de fase sólida. Nessa abordagem, a ligação
de anticorpos e antígenos ocorre em superfície sólida na qual os
anticorpos ou outras proteínas reativas foTam absorvidos ou
quimicamente ligados. Tipos diferentes de fases sólidas são
usados, incluindo (1) contas, (2) tubos revestidos, (3) lâminas de
microtitulação, (4) micropartículas magnéticas e não-magnéticas
e (5) matrizes fibrosas. Detalhes adicionais sobre os sistemas
180 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
automatizados que usam várias fases sólidas são encontrados nos
livros de Chan, 4 de Price e Newman. 1 5
Introdução da Amostra e Transporte Interno
O método usado para introduzir a amostra n o analisador e seu
subseqüente transporte n o mesmo é a principal diferença entre
os sistemas de fluxo contínuo e descontínuo. Nos sistemas de
fluxo contínuo a amostra é aspirada pela sonda de amostragem
dentro de u m f l u x o líquido, pela qual é transportada para as
estações analíticas no instrumento. Na análise independente a
amostra é aspirada pela sonda de amostragem e então liberada,
quase sempre com reagente, pelo mesmo orifício dentro de u m
recipiente de reação ou outro recipiente. A contaminação cruzada
é u m problema em potencial em ambos os sistemas.
Analisadores de Fluxo Contínuo
A Technicon Instruments C o r p . f o i a pioneira n o uso de bombas
peiistálticas e de tubulações plásticas para movimentar amostras
e reagentes em análise de f l u x o contínuo. A bomba peristáltica
ainda é usada em alguns analisadores com eletrodos ions-seleti-
vos. As bombas peristálticas prendem "uma alíquota" de f l u i d o
entre dois cilindros que ocluem a tubulação. A medida que os
cilindros rolam sobre a tubulação, o fluído preso é empurrado
para frente e, conforme o cilindro dianteiro se levanta da tubu-
lação, é acrescentado ao f l u i d o à sua frente. Para garantir a pro-
porcionalidade entre os calibradores, controles e amostras, a
bomba deve atuar uniformemente sobre o tubo da amostra e a
velocidade do cilindro deve permanecer constante. Embora a
tubulação de p o l i v i n i l deforme com o tempo, as mudanças na
velocidade do f l u x o em relação ao tempo do processamento são
mínimas. A curto prazo, pequenas mudanças na proporcionali-
dade entre os calibradores e os elementos desconhecidos são
corrigidas por calibração a cada 20 minutos, aproximadamente.
Sistema de Processamento Independente
Pipetas de deslocamento positivo de líquido são usadas para testar
amostras na maioria dos sistemas automatizados independentes
nos quais as amostras, calibradores e controles são liberados por
uma única pipeta para a próxima etapa no processo analítico.
U m a pipeta de deslocamento positivo pode ser projetada para
u m dos dois modos operacionais: (1) para liberar apenas a amostra
aspirada dentro do receptáculo de reação ou, (2) para liberar a
amostra junto com o diluente Ambos os sistemas usam uma
seringa de plástico ou de vidro com u m êmbolo cuja ponta é
normalmente de Teflon.
As pipetas podem ser caracterizadas como de volume fixo,
variável ou selecionável (Capitulo 2). As pipetas de volume selecio-
nável permitem a seleção de u m número limitado de volumes
predeterminados. Em geral as pipetas com volume selecionável são
utilizadas em sistemas que permitam muitas aplicações diferentes,
enquanto as pipetas de volume fixo são normalmente utilizadas
para amostras e reagentes em instrumentos dedicados ao desempe-
nho de uma pequena variedade de testes.
Contaminação Cruzada (Carry-Over)
A contaminação cruzada é definida como o transporte de uma
quantidade de analito ou reagente de uma reação para a Teação
subseqüente. C o m o isso afeta erroneamente os resultados analí-
ticos da reação subsequente, a contaminação cruzada deverá ser
minimizada- A maioria dos fabricantes de sistemas de fluxo inde-
pendente reduz a contaminação cruzada, estabelecendo uma
razão adequada de lavagem/amostra e incorporando estações de
lavagens para sonda de amostragem. A razão lavagem/amostra
pode chegar a 4:1 para l i m i t a r a contaminação cruzada a menos
de 1%, embora os avanços recentes no controle da velocidade
dos materiais e do dispensador permitam razões mais baixas. A
escolha apropriada do material da sonda de amostragem, da
geometria e das condições da superfície minimiza a imprecisão.
A contaminação cruzada f o i reduzida em alguns sistemas
através da lavagem das superfícies interna e externa da sonda de
amostragem com grandes quantidades de diluentes. O lado
externo da sonda de amostragem é limpo em alguns instrumen-
tos para evitar a transferência de uma porção da amostra anterior
para o p r ó x i m o recipiente de amostra. Nos sistemas de f l u x o
independente com recipientes de reação descartáveis e cubetas
de medição, a contaminação cruzada é causada pelo sistema de
pipetagem. E m instrumentos com cubetas reaproveitáveis ou
células de fluxo, a contaminação cruzada pode ocorrer em cada
ponto nos quais as amostras passam de m o d o seqüencial. Pontei-
ras descartáveis de sondas de amostragem eliminam a contami-
nação de uma amostra por outra n o interior da sonda e a conta-
minação cruzada de uma amostra para outro no próximo reci-
piente. C o m o uma nova ponteira é usada para cada pipetagem,
a contaminação cruzada é completamente eliminada.
Na prática, a redução da contaminação cruzada é uma exi-
gência mais rigorosa para os analisadores automatizados que rea-
lizam imunoensaios, já que alguns analitos possuem maior varia-
ção de concentrações nas amostras. Por exemplo, as concentra-
ções de gonadotrofina co rio nica variam de 1 a 106. Alguns siste-
mas usam etapas extras como lavagens adicionais ou u m disposi-
tivo adicional de lavagem para reduzir a contaminação cruzada
para limites aceitáveis. C o m o as etapas extras reduzem a produ-
ção total, as funções de lavagem adicionais são iniciadas (por
seleção do operador) apenas para análises com grande faixa ana-
lítica.
Manuseio e Armazenamento de Reagente
Muitos sistemas automatizados usam reagentes armazenados em
recipientes de plástico ou de vidro. Para os analisadores nos quais
u m inventário de trabalho é m a n t i d o n o sistema, os volumes de
reagentes armazenados dependem do número de testes a serem
realizados sem a intervenção de u m operador. Sempre que pos-
sível, os fabricantes usam reagentes únicos para os procedimentos
de teste, embora dois ou mais reagentes possam ser necessários
para alguns testes. Alguns analisadores usam reagentes em forma
de tabletes secos; outros usam fitas ou lâminas impregnadas com
reagente, e outros dependem inteiramente de eletrodos para
reagir a amostras.
Para muitos analisadores nos quais as amostras não são pro-
cessadas continuamente, os reagentes são armazenados em refri-
geradores e introduzidos nos instrumentos, quando necessário.
Nos sistemas maiores, as seções dos compartimentos de armaze-
namento de reagentes são mantidas em uma temperatura de 4°C
a 10°C. Armazenamento refrigerado para reagentes também é
fornecido na maioria dos sistemas de imunoensaio. Muitos dos
reagentes fornecidos em forma líquida pelos fabricantes desses
sistemas permanecem estáveis por 2 a 12 meses.
Alguns sistemas usam reagentes ou anticorpos que foram
imobilizados em uma câmara de reação ou serpentina a f i m de
permitir seu uso repetido em uma reação química. Outros siste-
mas usam enzimas imobilizadas sobre membranas acopladas a
eletrodos sensores. Os produtos de reação são então medidos
pelo aparelho sensor. Apenas uma solução-tampão é necessária
como diluente ou lavagem e, assim, a membrana tem validade
prolongada por vários meses. Alguns podem ser reciclados por
até 7.500 testes, o que reduz o custo de cada teste.
 Automação em Laboratório de Análises Clínicas
Identificação de Reagente
Os rótulos nos recipientes de reagentes contêm informações
c o m o (1) identificação d o reagente, (2) v o l u m e d o c o n t e ú d o ou
número de testes para os quais o conteúdo será usado, (3) prazo
de validade e (4) número do lote. M u i t o s recipientes de reagente
agora contêm código de barras com algumas dessas informações,
possibilitando ao fabricante recuperar qualquer informação per-
tinente, quando necessário.
Outras vantagens para o uso de código de barras incluem (1)
facilidade no controle de inventário, (2) capacidade de inserir
recipientes de reagente em seqüência randômica, e (3) capaci-
dade de distribuição automática de u m determinado volume de
reagente líquido. A l é m disso, quando u m código de barras está
conectado a u m sistema sensor de nível na sonda de reagente,
ele avisa o operador se há quantidade suficiente de reagente para
completar uma carga de trabalho.
Em sistemas de imunoensaio, u m código de barras em u m
recipiente de reagente contém informação importante sobre cali-
bradores (múltiplos), como a definição do algoritmo de uma
curva e os valores das constantes da curva definidos na hora da
fabricação do reagente. Os materiais calibradores fornecidos nos
próprios tubos com código de barras na hora da fabricação
garantem que as funções de calibração sejam devidamente inte-
gradas na análise
Sistemas Abertos versus Fechados
Os analisadores automatizados também são classificados como
"abertos" ou "fechados". E m u m analisador aberto, o operador
consegue mudar os parâmetros relacionados com uma análise e
pTeparar reagentes "em casa", ou utilizar reagentes de vários
fornecedores. Tais analisadores normalmente possuem flexibili-
dade considerável e se adaptam prontamente a novos métodos
e analitos.
U m analisador de sistema fechado precisa que o reagente
venha em u m recipiente ou formato específico fornecido pelo
fabricante. Em geral, os reagentes líquidos para sistemas abertos
são mais baratos que os componentes patenteados exigidos pelos
analisadores fechados. Porém, os sistemas fechados possuem
uma vantagem embutida n o custo, pois a reconstituição ou
preparação dos reagentes para uso não requer o tempo de u m
laboratorista. A variabilidade na reconstituição de reagentes
secos foi superada pelo uso de reagentes líquidos prontos ou pelo
fornecimento de líquidos pré-medidos. A estabilidade dos rea-
gentes para alguns sistemas abertos está agora se aproximando
de maior estabilidade característica de muitos sistemas fechados.
A maioria dos sistemas de imunoensaio é fechada, assim como
o é a maioria dos sistemas desenvolvidos para aplicações em teste
laboratorial remoto.
Distribuição de Reagente
Os reagentes líquidos são adquiridos e distribuídos para câmaras
de mistura e de reação por meio de bombas (através de tubos) ou
por dispositivos de seringa de deslocamento positivo. Em alguns
analisadores automatizados de alta produção, os reagentes e diluen-
tes são extraídos de recipientes volumosos por tubos, e a amostra
do recipiente de amostra é extraída por sonda aspiradora.
Dispositivos em forma de seringa, tanto para reagente quanto
para distribuição de amostra, são comuns em muitos sistemas
automatizados. Esses dispositivos são normalmente de desloca-
mento positivo, e o volume de reagentes que eles distribuem é
programável. Nos analisadores em que mais de u m reagente é
adquirido e distribuído pela mesma seringa, a lavagem ou enxágüe
da sonda é essencial para evitar a transferência de reagente.
CAPÍTULO 11 181
Fase de Reação Química
As amostras e os reagentes interagem na fase de reação química.
O s fatores q u e são i m p o r t a n t e s nessa fase i n c l u e m ( 1 ) r e c i p i e n t e
n o qual a reação ocorre, (2) tempo da reação ou reações, (4)
mistura e transporte dos reagentes e (5) condição térmica dos
fluidos. C o m o discutido anteriormente, a separação das frações
ligadas e não-ligadas é uma quinta questão para alguns sistemas
de imunoensaio.
Tipo de Recipiente e Cubeta de Reação
E m u m sistema de fluxo contínuo, cada amostra passa pelo
mesmo curso contínuo na mesma velocidade e é submetido às
mesmas reações analíticas que qualquer outra amostra. E m tais
sistemas a reação ocorre no tubo, que serve tanto como reci-
piente de f l u x o como cubeta.
Nos sistemas independentes, cada amostra em u m lote possui
o próprio espaço físico e químico, separado de qualquer outra
amostra. Os analisadores independentes usam recipientes indi-
viduais de reação (descartáveis ou reutilizáveis) transportados
pelo sistema depois que a amostra e o reagente foram distribuí-
dos, ou usam uma câmara de reação estacionária. E m alguns
sistemas de f l u x o independente, os recipientes de reação são
reutilizados; em outros, eles são descartados após cada uso. O
uso de cubetas descartáveis simplificou a automação e eliminou
a contaminação cruzada nas cubetas e a manutenção das células
de fluxo. O aprimoramento da tecnologia de fabricação e dos
plásticos (especialmente acrílico e cloreto de polivinil) possibili-
tou a confecção de cubetas descartáveis.
Os recipientes de reação são reutilizáveis em muitos instru-
mentos. O prazo de validade para esses recipientes e cubetas
depende de suas composições (p. ex., 1 mês para plástico e 2
anos para os vasos de vidro tradicionais). Os vasos de pirex
normalmente não são substituídos, exceto quando fisicamente
danificados.
A seqüência n o r m a l de lavagem de u m recipiente/cubeta de
reação requer a aspiração da mistura de reação da cubeta em
uma estação de lavagem in sim. U m a solução de lavagem deter-
gente, alcalina ou ácida é dispensada e aspirada repetidamente
da cubeta e, posteriormente, é enxaguada várias vezes com água
deionizada e seca com ar a vácuo ou pressurizado.
Os sistemas de reagente seco que usam SÍÍCÍÉ.S com filmes de
multicamadas ou tiras de tecido impregnadas não precisam dis-
tribuir ou misturar os reagentes líquidos. N o entanto, esses
instrumentos ainda precisam de u m mecanismo que mantenha
uma temperatura estável e forneça o posicionamento preciso da
unidade de reação para mensurações ópticas.
Cronometragem das Reações
O tempo permitido para que uma reação ocorra depende de
vários fatores. E m alguns analisadores o tempo de reação depende
da velocidade do transporte da mistura de reação pelo sistema
para a estação de mensuração, dos eventos cronometrados da
adição do reagente (ou da ativação) relativos à mensuração, ou
de ambos. Nos analisadores de acesso aleatório, as amostras e os
reagentes são adicionados em uma cubeta em uma sequência
programada e os sinais detectores são medidos em intervalos
para acompanhar o curso de cada reação. Normalmente, o
período de tempo para uma reação nesses sistemas está restrito
a u m valor máximo definido pelo fabricante, mas pode ser pro-
gramado para ser mais curto.
Mistura de Reagentes
Várias técnicas são usadas para misturar os reagentes. E m u m
sistema de fluxo independente, essas técnicas incluem:
182 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

1. Aplicação em jorro 1. U m a fonte óptica

2. Agitação magnética
3. Deslocamento lateral vigoroso
4. Pá em rotação
5. Uso de energia ultra-íônica
Os analisadores de fluxo contínuo contam com a ação girató-
ria do curso em u m cilindro de mistura. Para os sistemas de rea-
gentes secos torna-se óbvia a necessidade de mistura porque o soro
interage completamente com os químicos secos à medida que f l u i
pela matriz da unidade de reação. C o n t u d o , independente da
técnica usada, misturar é u m processo difícil de automatizar.
Condicionamento Térmica
A regulação térmica requer o estabelecimento de u m ambiente
com temperatura controlada em contato p r ó x i m o com o reci-
piente de reação e da transferência de calor do ambiente para a
mistura de reação. Banhos de ar, banhos de água e contato com
placas aquecidas têm sido usados para regulagem térmica em
analisadores comerciais.
Abordagens de Mensuração
Os analisadores químicos automatizados tradicionalmente con-
tavam com fotômetros e espectrómetros para medir a absorvância
da reação produzida na fase de reação química. As abordagens
alternativas que agora estão sendo incorporadas nos analisadores
incluem fotômetros de reflectância, fluorímetros e luminôme-
tros. Os sistemas de imunoensaio têm usado esquemas de reação
que produzem fluorescência, quimioiuminescência e eletroqui-
mioluminescência para melhorar a sensibilidade. Eletrodos íons-
seletivos e outras técnicas eletroquímicas também são ampla-
mente utilizados.
Fo tometria/Espectrofotometría
A mensuração da absorvância requer os três componentes básicos
a seguir (Capítulo 4):
2. U m meio de isolamento de espectro
3. U m detector
Fonte Óptica
As fontes de energia radiante usadas nos sistemas automatizados
incluem lâmpadas de tungsténio, quartzo halogenado, deutério,
mercúrio, xenônio e lasers. Na lâmpada de quartzo halogenado,
o vapor de halogênio de baixa pressão (p. ex., iodo ou bromo) é
envolvido em u m envelope de sílica f u n d i d o n o qual u m fila-
mento de tungsténio serve como fonte de luz incandescente. O
espectro produzido compreende comprimentos de ondas de apro-
ximadamente 300 a 700 nm.
Isolamento de Espectro
Nos sistemas automatizados, o isolamento de espectro comu-
mente é obtido com filtros de interferência. Os filtros de inter-
ferência típicos possuem máximos de transmitância de 3 0 % a
80%, e larguras das faixas de 5 a 15 n m (Capítulo 4). E m vários
analisadores de multitestes, os filtros são montados em u m disco
de filtros, e o filtro apropriado é movido para o lugar sob o
comando do computador do sistema. Monocromadores com
grades móveis e fendas fornecem uma escolha contínua de com-
primento de ondas. Eles fornecem grande flexibilidade e são
especialmente adequados para o desenvolvimento de novas aná-
lises. Porém, como relativamente poucos comprimentos de ondas
são necessários para análises em analisadores de rotina, muitos
fabricantes usam uma grade estacionária, regulada holografica-
mente, acoplada a u m conjunto de fbtodiodos estacionários para
isolar o espectro. Esses dois elementos também são associados a
guias de luz de fibra óptica para transferir a passagem da energia
da luz pelas cubetas para locais convenientes à mecanização. O
uso desses elementos passivos melhora a confiabilidade de u m
sistema porque não há necessidade de peças para isolar o espectro
(Figura 11-2).

Extensão do caminho Primeiro espelho

Espelho torôide de 5m da cubeta Lentes colimador
Vé. • \

lâmpada
de flash
da xenônio

340 nm
Segundo
espelho
colimador

700 nm
10 arranjos de diodo

Figura 11-2 O uso de arranjo de diodo no monocromador S Y N C H R O N C X 7 reduz a necessidade de peças

móveis. Para simplificar, apenas três traçados dos comprimentos das ondas dos raios são mostrados. (Cortesia de
Beclcman Coulter Inc; www.beckmancoulter.com.)
 Automação em Laboratório de Análises Clinicas
Detectores Fotométricos
Fotodiodos são usados em muitos sistemas automatizados, seja
como componentes individuais o u múltiplos na forma de u m
arranjo. Tubos fotomultiplicadores são necessários em muitos
sistemas de imunoensaios para fornecer u m sinal alto para o
nível de ruído e u m detector rápido de tempo de resposta para
medidas fluorescentes e quimioluminescentes.
O alinhamento apropriado das cubetas com a(s) trajetória(s)
da luz é importante nos analisadores tanto manuais quanto
automatizados. A l é m disso, a energia perdida e as reflexões
internas devem ser mantidas em níveis aceitáveis. Se a trajetória
da luz não estiver perpendicular à cubeta, poderá haver impre-
cisão, especialmente em análises cinéticas.
Fotometria de Reftectância
N a fotometria de reflectância é medida a luz refletida dispersa.
A luz refletida vem da iluminação, com luz dispersa, de uma
mistura de reação em u m suporte, ou da difusão da luz por uma
mistura de reação em u m suporte iluminado. A intensidade da
luz refletida do suporte de reagente é comparada àquela refletida
de uma superfície de referência. C o m o a intensidade da luz
refletida é não-linear à concentração do analito, os algoritmos
matemáticos são comumente usados para linearizar a relação de
reflectância para concentração. 2
Fluorimetria
Fluorescência é a emissão de radiação eletromagnética por uma
amostra que absorveu radiação excitante de uma fonte externa.
A intensidade da luz emitida (fluorescente) é diretamente pro-
porcional à concentração da amostra excitada (Capítulo 4).
A fluorimetria é amplamente usada para imunoensaio auto-
matizado. Ela é aproximadamente 1.000 vezes mais sensível que
a comparável espectrometria de absorvância, mas a interferência
de f u n d o ocasionada pela fluorescência do soro nativo é u m sério
problema. Essa interferência é minimizada com (1) o desenho
cuidadoso dos filtros usados para isolamento de espectro, (2) a
seleção de u m fluoróforo com u m espectro de emissão diferente
daqueles dos componentes de interferência, o u (3) o uso de
fluorimetria com resolução por fase o u tempo (Capítulo 4).
Diferentes configurações ópticas são representadas em equi-
pamentos de diferentes fabricantes. A medida da fluorescência
em ângulo reto é u m a das abordagens comuns, com a luz emitida
passando pelo filtro de interferência de emissão até u m tubo
fotomultiplicador. Na polarização de fluorescência, a fonte de
luz está na forma de luz polarizada. A mensuração então é feita
pela mudança do ângulo da luz polarizada emitida por uma
molécula fluorescente (Capítulos 4 e 10).
Turbidimetria e Nefelometria
T u r b i d i m e t r i a e nefelometria são técnicas ópticas aplicáveis espe-
cialmente em métodos que medem a formação de precipitados
em reações entre antígenos e anticorpos (formação de imutio-
complexos) (Capítulo 10). Essas técnicas são usadas para medir
proteínas plasmáticas e monitorar droga terapêutica.
Quimioluminescência e Bioluminescência
A quimioluminescência e a bioluminescência diferem da fluori-
metria no que diz respeito à origem da excitação, que é causada
poT u m a reação química o u eletroquímica, e não por fotolumi-
nescência (Capítulo 4). As aplicações de quimioluminescência e
bioluminescência aumentaram de m o d o significativo com o
desenvolvimento da instrumentação automatizada e de vários
novos sistemas de reagentes. Devido a seus limites de detecção
na faixa attamol (10' 1H mol) a zeptomol (10' 21 mol), as reações da
CAPÍTULO 11 183
quimioluminescência e da bioluminescência têm sido ampla-
mente usadas como rótulos indicadores no desenvolvimento de
imunoensaios.
Eletroquímica
Vários métodos de eletroquímica foram incorporados nos siste-
mas automatizados. A abordagem eletroquímica mais usada
envolve eletrodos íons-seletivos. Esses eletrodos substituíram a
fotometria de chama na determinação de sódio e potássio. Os
detectores eletroquímicos também são usados para a medida de
outros eletrólitos e para aplicações indiretas na análise de vários
outros constituintes séricos (Capítulo 5). A relação entre a ativi-
dade e concentração de íons nas amostras deve ser estabelecida
com soluções calibradoras, e tais eletrodos precisam ser calibra-
dos com freqüência para compensar as alterações da resposta ao
eletrodo.
Bombas peristálticas são usadas para conduzir a amostra até
as câmaras que contêm amostras fixas e eletrodos de referência.
Os eletrodos devem permanecer em contato com a amostra
durante 7 a 45 segundos para alcançar condições de estado
estável. O modelo mais c o m u m é fornecer eletrodos para analisar
três analitos, geralmente sódio, potássio e cloreto. C o m o as amos-
tras e calibradores normalmente passam por u m grupo de eletro-
dos , os resultados para todos os analitos são transmitidos paia a
maioria dos sistemas. A capacidade do eletrodo íon-seletivo
QUADRO 11-3 Funções de Processamento de Dadas e de
Sinal Realizadas pelos Computadores de
Analisadores Automatizados
AQUISIÇÃO E CÁLCULO DE DADOS
Aquisição de sinal de resposta e cálculo da média de sinal
Subtração de resposta em branco
Correção de resposta de incógnita para interferências (p, ex., correções do tipo
Allen)
Regressão linear para determinar a inclinação
( A A / A í ) da taxa de reações; (AA/ACj da relação absorvância/concentração;
( A f f A Q de qualquer parâmetro de resposta para a concentração
Estatística (média, SD, CV) sabre a paciente ou valores de controle
Transformação matemática das relações não-lineares para contraparte linear
Transformação matemática dos resultados para unidades de transmissão alter-
nativa
M0NIT0HAMENT0
Teste de adequação de dados aos critérios de linearidade para curvas de
calibração ou taxa de reações
Teste do resultado do paciente contra os critérios de intervalo de referência
Teste do resultado do controle contra os critérios de um controle de qualidade-
padrao de desempenho
Teste de mudança na média dos resultados do paciente contra critérios de
qualidade para detectar desvio de teste
EXIBIÇÃO
Exibe as amostras que estão sendo analisadas, os pedidos de testes para cada
amostra e os tempos esperados para a conclusão
Acumula o grupo de resultados do paciente
Coteja os resultados para os dados impressos orientados para o paciente
Fornece mensagens de alerta para avisar o operador sobre o mau funciona-
mento do instrumento, a necessidade de manutenção ou a situação clínica
habitual
Fornece diagramas de controle de qualidade para revisão do operador
Fornece lluxograma de resolução de problemas para auxiliar o operador
SD, desviopadiSo; C V , coeficiente de variação.
184 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
t a m b é m foi i n c o r p o r a d a e m analisadores automatizados de m é d i o
e grande portes c o m o m ó d u l o s integrados de três o u quatro parâ-
metros, a u m e n t a n d o de m o d o significativo o r e n d i m e n t o desse
sistema, já que vários resultados são produzidos em paralelo.
Processamento do Sinal, Verificação de
Dados e Controle do Processo
A integração e a interface dos computadores nos analisadores
automatizados e nos sistemas analíticos t i v e r a m grande i m p a c t o
na aquisição e n o processamento de dados analíticos. Os sinais
analógicos dos deteccores são convertidos r o t i n e i r a e r a p i d a m e n t e
(IO 3 a IO"5) para formas digitais p o r conversores que c o n v e r t e m
sinais analógicos p a i a digitais. O c o m p u t a d o r e o p r o g r a m a resi-
dente então processam os dados digitais em i n f o r m a ç ã o signifi-
cativa e ú t i l . O processamento de dados p e r m i t i u a automação
de p r o c e d i m e n t o s c o m o imunoensaios não-isótopos e espectro-
m e t r i a de reflectância p o r q u e os algoritmos d o c o m p u t a d o r
t r a n s f o r m a m , p r o n t a m e n t e , respostas tradicionais complexas e
não-lineares em curvas de calibração linear. Várias funções reali-
zadas p o r computadores interligados e m analisadores automati-
zados estão listadas n o Q u a d r o 11-3. A s funções adicionais são
as seguintes:
1. Os computadores c o m a n d a m e ajustam a operação eletrome-
cânica d o analisador, assegurando assim que todas as funções
sejam realizadas u n i f o r m e m e n t e , de m o d o repetitivo e na
seqüência correta. O c o n t r o l e pelo c o m p u t a d o r das caracte-
rísticas operacionais d o e q u i p a m e n t o automatizado, do
cálculo dos resultados e da m o n i t o r a ç ã o da operação contri-
b u i para o a u m e n t o da r e p r o d u t i b i l i d a d e dos resultados.
2. O s c o m p u t a d o r e s a d q u i r e m , c o n s u l t a m , processam e armaze-
n a m os dados operacionais dos analisadores. Os c o m p u t a d o -
res integrados m o n i t o r a m as funções dos i n s t r u m e n t o s para
a execução correta e reagem à f u n ç ã o i m p r ó p r i a , registrando
o local e a natureza do m a u f u n c i o n a m e n t o .
3. Os c o m p u t a d o r e s p o s s i b i l i t a m interações na comunicação
entre o analisador e o operador. A s mensagens c o m p u t a d o r i -
zadas sobre o diagnóstico para o usuário descrevendo o local
e o t i p o de p r o b l e m a p o s s i b i l i t a m a rápida identificação dos
problemas e sua p r o n t a correção. A s apresentações gráficas
f o rn ec em orientação detalhada e interativa sobre resolução
de problemas para os operadores de i n s t r u m e n t o s , e demons-
tração visual d o status de cada amostra e dos dados de con-
trole de q u a l i d a d e associados. A p r o d u ç ã o de dados é sinali-
zada p o r comparação c o m os critérios presentes e apresentada
para avaliação d o operador. Tal i n f o r m a ç ã o p o d e especificar
que a l i n e a r i d a d e de u m a reação f o i excedida, que a reação
não é linear, que ocorreu exaustão do substrato, que a absor-
vância de u m reagente está m u i t o alta o u m u i t o baixa, o u que
o desvio da l i n h a de base está excessivo. Os operadores p o d e m
reprogramar certas funções do analisador (p. ex., o i n t e r v a l o
de t e m p o pata u m a reação cinética e o p o n t o d e t e r m i n a d o
da temperatura de reação); i n t r o d u z i r certos valores, c o m o
concentrações de calibradores; apresentar i n f o r m a ç ã o arma-
zenada e m f o r m a b r u t a o u processada e d e f i n i r o f o r m a t o da
i n f o r m a ç ã o impressa p o r m e i o de simples interação c o m o
p r o g r a m a do c o m p u t a d o r .
4. Os computadores integrados e m sistemas analíticos c o m u n i -
cam-se c o m unidades c o m p u t a c i o n a i s centrais. N o passado,
as interfaces usaram conexões seriais RS-232 para p e r m i t i r a
conexão interativa entre os sistemas do c o m p u t a d o r n o
m o d e r n o analisador de l a b o r a t ó r i o e o Laboratory I n f o r m a -
t i o n System (LIS). M a i s recentemente, os fabricantes de ins-
t r u m e n t o s v ê m desenvolvendo interfaces E t h e r n e t para cone-
xões de rede c o m T C P / I P (Transmission Controi Protocol/lnter-
net Protocai).
5. A s estações de t r a b a l h o são usadas para m o n i t o r a r e integrar
as funções de u m o u mais analisadores. N o r m a l m e n t e a
estação de t r a b a l h o (1) serve c o m o p o n t o de interação c o m
o o p e r a d o r de i n s t r u m e n t o , (2) aceita pedidos de testes, (3)
m o n i t o r a o processo de testagem, (4) auxilia na análise de
qualidade d o processo e (5) fornece meios para revisão e
verificação dos testes. N o r m a l m e n t e a estação de t r a b a l h o
t e m interface direta c o m o c o m p u t a d o r p r i n c i p a l (LIS), acei-
t a n d o pedidos de testes e fazendo l e v a n t a m e n t o dos resulta-
dos dos mesmos. A m a i o r i a das estações de t r a b a l h o possui
meios para (1) apresentar gráficos Levy-Jennings de c o n t r o l e
de qualidade, (2) m o n i t o r a r o processo de cada p e d i d o de
teste e (3) resolver problemas dos analisadores. Elas t a m b é m
p o d e m fornecer meios para auxiliar na revisão de resultados
de testes realizados. A l g u m a s estações de t r a b a l h o possuem
p r o g r a m a de c o m p u t a d o r baseado e m regras, o que p e r m i t e
ao operador programar as regras para a autoverificação dos
resultados dos testes.
AUTOMAÇÃO INTEGRADA PARA O
LABORATÓRIO CLÍNICO
H o u v e u m progresso significativo na integração das etapas i n d i -
viduais do processo analítico nos sistemas analíticos. Conseqüen-
temente, sistemas analíticos avançados de vários fornecedores
estão agora disponíveis para a automação (1) q u í m i c a , (2) hema-
tológica, (3) de i m u n o e n s a i o , (4) de coagulação, (5) de m i c r o b i o -
logia e (6) de testes de ácido nucléico, o que fornece u m a opera-
ção eficiente e de custo-benefício c o m a m í n i m a participação do
operador. A l é m disso, os laboratórios de análises clínicas t a m b é m
estão a u t o m a t i z a n d o suas operações pré e pós-analíticas.
A l g u n s fabricantes desenvolveram sistemas de automação
i n d e p e n d e n t e que interagem d i r e t a m e n t e e que (1) classificam,
(2) c e n t r i f u g a m , (3) destampam, (4) f r a c i o n a m e (5) r o t u l a m
tubos. E m b o r a precisem d o t r a n s p o r t e m a n u a l dos t u b o s para as
áreas analíticas, esses sistemas possuem etapas automatizadas n o
processamento da amostra. Os sistemas de automação m a i s avan-
çados f o r n e c e m opções c o m o (1) aparato mecânico para trans-
p o r t a r amostras, (2) interfaces de testagem direta c o m os analisa-
dores de m a i o r v o l u m e do l a b o r a t ó r i o e (3) a r m a z e n a m e n t o
refrigerada e sistemas de recuperação.
A automação e m larga escala do laboratório i n c l u i u m a área
automatizada de processamento de amostra onde estas são (1)
identificadas, (2) rotuladas, (3) programadas para análise, (4) cen-
trifugadas e (5) classificadas. Depois que as amostras são proces-
sadas, os dispositivos mecânicos transportam-nas para as devidas
estações de trabalho n o laboratório o n d e são analisados sem
intervenção h u m a n a . O programa de sistema (software) baseado
em normas (1) auxilia na revisão dos resultados laboratoriais,
l i b e r a n d o automaticamente os resultados que não têm problemas
associados; e (2) identifica qualquer resultado p r o b l e m á t i c o para
chamar a atenção dos laboratoristas treinados. Depois da análise,
todas as amostras são catalogadas e armazenadas em u m local de
armazenamento central, disponíveis para recuperação automati-
zada caso seja necessário. C o m o discutido a n t e r i o r m e n t e , os
aspectos mais i m p o r t a n t e s dos projetos de automação e m larga
escala são as abordagens usadas para processar e transpoTtaT as
amostras e a integração geral dos componentes automatizados em
u m f u n c i o n a m e n t o totalmente suave.
Estações de Trabalho
A tarefa de integrar a automação d o l a b o r a t ó r i o começa c o m a
estação de trabalho. E m geral, u m a estação de t r a b a l h o n o labo-
 Automação em Laboratório de Análises Clínicas
ratório clínico tem tarefas definidas e contém instrumentos labo-
ratoriais apropriados para realizar essas tarefas normalmente.
U m a estação de trabalho no laboratório moderno é quase
sempre definida em termos do analisador automatizado que está
sendo usado. Os atuais sistemas e instrumentos para laboratório
são altamente desenvolvidos para operações independentes e se
encaixam n o conceito de estação de trabalho. A movimentação
das amostras para dentro e fora da estação de trabalho é feita
por transporte manual, e as atividades do operador de instru-
mento são bem diferentes daquelas em outras estações de traba-
lho. E m u m instrumento típico, o operador segue a seqüência
recomendada pelo fabricante sobre calibração, controle de qua-
lidade e atividades de manutenção diária, usando as funções do
painel f r o n t a l do instrumento para introduzir as amostras para
análise. Se o analisador tiver uma interface bidirecional com u m
LIS (Capítulo 5) e capacidade para ler códigos de barras, a infor-
mação sobre quais análises investigar em cada amostra será
obtida a p a n i r do LIS e o operador de instrumento apenas
carregará as amostras rotuladas com código de barras na área de
entrada de amostra. Os diagnósticos fornecidos pela maioria dos
analisadores modernos dão ao analisador "inteligência" sufi-
ciente para permitir ao operador "ausentar-se" do instrumento
por breves períodos, confiante em sua capacidade de realizar
uma operação fidedigna. O operador, entretanto, precisa acom-
panhar periodicamente (1) a operação do instrumento, (2) o
reabastecimento de reagentes, (3) a avaliação das mensagens
diagnosticas do instrumento e (4) a introdução de novas amos-
tras na bandeja de abastecimento destas.
Grupos de Instrumentos
Para redução de custos, os fabricantes de instrumentos têm
desenvolvido abordagens que permitirão a u m ú n i c o técnico
controlar e monitorar simultaneamente as funções de vários
aparelhos. Inicialmente, tais estações de trabalho foram configu-
radas com grupos de instrumentos idênticos, como analisadores
químicos, i m u n o q u i m i c o s ou hematológicos. Grupos de instru-
mentos mais avançados p o d e m incorporar analisadores quími-
cos e de imunoensaio do mesmo fornecedor, e u m a possível
extensão desse conceito é o desenvolvimento de grupos de ins-
trumentos diferentes que combinem disciplinas laboratoriais
tradicionais. U r n exemplo pode ser u m grupo de analisadores
químicos e hematológicos.
U m grupo de analisadores possui seu próprio m ó d u l o de
controle central (um PC) com u m programa que auxilia o labo-
A, Cartesiano. B, Cilíndrico C, Articulado (polar) ou com juntas. (Modificado do Journal of the International
Federation of Clinicai Chemistty, 1992;4 175.)
CAPÍTULO 11 185
ratorista a monitorar as funções de cada analisador e auxilia
também na revisão dos resultados laboratoriais gerados pelo
grupo. O acesso às funções do painel frontal de cada analisador
é fornecido pela interface entre o analisador e o m ó d u l o de
controle central. Desse m o d o , o laboratorista transfere as amos-
tras em cada instrumento n o grupo e depois monitora a opera-
ção do instrumento subseqüente e revisa os resultados na estação
de trabalho central. A o incorporar as atividades de várias esta-
ções de trabalho, n o rma lme n te para a maioria dos laboratórios
atuais, em uma única estação de trabalho, essa abordagem
promete poupar potencial humano n o laboratório.
Células de Trabalho
Outra extensão do conceito de grupo de instrumento é adicionar
preparação e manejo robóticos de amostra. U m sistema robótico
é usado para desempenhar várias etapas na preparação da
amostra, como verificar se a mesma está adequada e será centri-
fugada, transportar e armazenar estas amostras. O sistema robó-
tico é responsável pela introdução de amostras no analisador
apropriado, p e r m i t i n d o que o laboratorista assuma, principal-
mente, o papel de m o n i t o r . U m a interface entre o m ó d u l o de
controle central e o controlador do robô (ou a combinação
dessas funções em u m único computador) permite que as ativi-
dades de u m grupo robótico sejam totalmente coordenadas.
Transporte Automatizado de Amostra
Abordagens diferentes f o r a m desenvolvidas para o transporte e
a manipulação de amostras dentro do laboratório.
Esteiras Rolantes
Esteiras rolantes são usadas no laboratório para transportar
amostras de uma estação de trabalho para outra. Esteiras rolan-
tes industriais comuns são usadas com sucesso quando apenas
o transporte é necessário. Porém, quando estão integradas a
outros sistemas robóticos para automatizar funções pré e / o u
pós-analíticas, essa tecnologia encontra dificuldade para lidar
com a grande variedade de recipientes de amostra encontrada
n o laboratório clínico. Para aumentar a variedade de tipos de
recipientes de amostra que são transportados em u m sistema de
esteira rolante, estas amostras são colocadas em transportadores
especialmente desenhados para se encaixarem na l i n h a da esteira
rolante. As vezes conhecidos como "estantes" o u "racícs" (depen-
dendo do que transportam: amostras individuais ou grupos de
186 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
amostras), os transportadores possuem receptáculos para tubos
de vários tamanhos, geralmente variando de 13 X 75 m m a 16 X
100 m m — c a m i n h o s q u e estão d e a c o r d o c o m o C l i n i c a i a n d
Laboratory Standards Institute (CLSI) Protótipo A U L O O l - A . 6
A transferência de amostras da esteira rolante para a estação
de trabalho do laboratório foi implantada de várias maneiras. Por
exemplo, muitos fabricantes equiparam seus instrumentos de
laboratório com dispositivos para obter amostras dos sistemas de
esteira rolante. Na prática, a automação do sistema requer u m
dispositivo que pare o tubo no local exato exigido pelo analisador
e que verifique e transfira a identificação do código de barras do
tubo para o analisador. Em outro exemplo, u m sistema robótico
especializado é necessário para remover o tubo e colocá-lo na
estante ou carrossel do analisador.
Braços Robóticos
Os braços robóticos conseguem realizar análises clínicas alta-
mente complexas. 16 Três tipos de mecanismos estão disponíveis
comercialmente: cartesiano, cilíndrico e articulado {Figura 11-3).
Devido à sua flexibilidade operacional, os robôs possibilitam a
configuração rápida de sistemas para novos e variados protocolos.
Essa capacidade (1) aprimora a versatilidade e a segurança, (2)
melhora a precisão e a produtividade e (3) reduz erros em decor-
rência da combinação inadequada da identidade da amostra por
humanos.
Atualmente o sistema cartesiano é a forma mais c o m u m de
robótica utilizada em laboratórios. Esses sistemas são construídos
dentro de estações de pipetas programáveis e fornecem rotinas
flexíveis de pipetagem adequadas a vários protocolos.
Processamento de Amostra Automatizado
Embora as operações manuais desempenhadas em uma área de
processamento de amostra pareçam simples, essas operações
F i g u r a 11-4 A célula de trabalho Tecan Genesis FE500™ faz a
pré-classificaç^o, inspeciona o volume da amostra, centrifuga,
destampa, divide em alíquotas e envia as amostras classificadas em
estantes específicas paia diferentes analisadores com uma produção
de até 500 tubos primários e secundários por hora. (Cortesia de
Tecan Trading AG, Suíça, www.tecan.com.)
possuem uma complexidade considerável. Por conseqüência, o
processamento de amostras tem sido uma das áreas mais difíceis
de automatizar. Várias tentativas foram feitas usando abordagens
tanto integradas quanto modulares que seTão discutidas mais
adiante. Cada amostra que passa por uma área de processamento
precisa passar por uma série de operações, começando com (1)
recebimento da amostra; (2) inspeção para verificar a adequação
da rotulagem, o tipo de recipiente, a temperatura e a quantidade
de amostra; (3) identificar a amostra no LIS; (4) rotulá-la com
u m número de acesso; e (5) separar as amostras urgentes e está-
ticas das amostras de rotina A l é m disso, as amostras precisam
ser classificadas para centrifugação, aliquocação ou, caso contrá-
rio, preparadas para a estação de laboratório apropriada.
Sistemas de Processamento de Amostras
Independentes
U m exemplo de sistema de processamento de amostra indepen-
dente é mostrado na Figura 11-4. Sistemas similares colocam as
amostras processadas em estantes (mcíts) que precisam ser trans-
portadas manualmente para as áreas de teste, com algumas exce-
ções. Alguns são quase do tamanho de u m analisador automati-
zado e outros podem ser um pouco maiores. Eles podem ser uma
boa escolha para os laboratórios (1) com cargas de trabalho
diárias de 500 a 2.500 amostras, (2) com limitações de espaço,
ou (3) que desejam fazer melhorias e facilidade de uso com dife-
rentes analisadores de diferentes fornecedores. Alguns laborató-
rios podem optar pelo uso de múltiplos de u m sistema de pro-
cessamento de amostra independente para automatizar o pro-
cesso de arquivamento e de análise de amostra.
Esses sistemas irão (1) receber as amostras, (2) classificar, (3)
destampar, (4) aliquotar e (5) rotular recipiente com alíquotas da
amostra com código de barras — todas as tarefas de interface com
o LIS do laboratório. Alguns sistemas até incluem centrifugação
automatizada. Vários dos sistemas fazem a classificação de estan-
tes específicas de instrumentos para analisadores de diferentes
fornecedores. A l é m da classificação para determinados analisado-
res ou seções de laboratório, alguns usuários aplicam esses siste-
mas para aliquotar e selecionar referência ou para "dispensar"
teste, poupando u m tempo considerável na localização de amos-
tras originais após o teste em seus próprios laboratórios.
Figura 11-5 Sistema Beckman Coulter Power Processor. Essa é a
fotografia de um sistema instalado em um grande laboratório de
hospital. O desenho deste sistema inclui módulos para analisadores e
para processamento pré-analítico. (Cortesia de Beckman Coulter Inc;
www.beckmancoulteT.com.)
 Automação em Laboratório de Análises Clínicas
Sistemas de Automação Integrada e Modular
V á r i o s fabricantes oferecem sistemas de automação integrada o u
m o d u l a r para processamento de amostras que i n c l u e m f u n c i o -
nalidade adicional. A l é m das funções p r e v i a m e n t e descritas,
esses sistemas n o r m a l m e n t e acrescentam (1) transportadores
mecânicos, (2) interface entre analisadores automatizados, (3)
c o n t r o l e mais sofisticado d o processo e, e m alguns casos, (4) u m
sistema de armazenamento e recuperação de amostra. T o d o s
esses sistemas apresentam design m o d u l a r , p e r m i t i n d o ao cliente
escolher quais características/módulos devem ser incluídos.
A l g u n s dos sistemas usam design aberto, o q u e p e r m i t e a inter-
face entre analisadores de vários fornecedores, e n q u a n t o o u t r o s
sistemas apresentam-no fechado e só possuem interface c o m o
analisador d o p r ó p r i o fabricante o u c o m u m n ú m e r o l i m i t a d o
de analisadores Deve-se n o t a r q u e os sistemas fechados n o r m a l -
m e n t e n ã o possuem u m p r o g r a m a (software) para c o n t r o l e de
p r o c e d i m e n t o i n d e p e n d e n t e dos i n s t r u m e n t o s o u sistema, por-
t a n t o , o c o n t r o l e d o processo de automação está i n t e g r a d o ao
t r a b a l h o c o m os analisadores d o fornecedor. U m exemplo de
sistema de automação integrada é m o s t r a d o na Figura 11-5.
Para se o b t e r o m á x i m o de eficácia de u m sistema de auto-
mação, o p r o g r a m a (software) de c o n t r o l e d o p r o c e d i m e n t o deve
conseguir ler a identificação ( I D ) d o c ó d i g o de barras da amostra
e obter i n f o r m a ç ã o do L I S d o l a b o r a t ó r i o sobre o t i p o de amostra
e os testes pedidos, p o d e n d o d e t e r m i n a r os processamentos
requeridos para a amostra e a trajetória o u curso de ação exato
para cada amostra. Ele deve ser capaz de (1) calcular o n ú m e r o
de alíquotas e o v o l u m e a p r o p r i a d o para cada u m a de acordo
c o m os testes exigidos, (2) d i r e c i o n a r as amostras para os anali-
sadores, (3) retampar as amostras e (4) reter as amostras para
revocação (recaü) automática. O p r o g r a m a deve m o n i t o r a r os
analisadores n o c o n t r o l e da p r o d u ç ã o e t o m a r decisões automa-
t i c a m e n t e se u m teste não estiver disponível. A checagem da
integridade da amostra deve ser a u t o m á t i c a ; decisões baseadas
e m n o r m a s e critérios devem m o n i t o r a r a q u a l i d a d e da amostra
e t o m a r essas decisões. F i n a l m e n t e , a m a i o r i a dos softwares de
c o n t r o l e deve i n c l u h (1) "autoverificação", o que é a validação
dos resultados d o analisador c o m tomadas de decisões baseadas
nas regras que sinalizam as exceções para a revisão d o laborato-
rista e (2) "auto-recuperação" de amostras para repetição, refle-
xão e d i l u i ç ã o da mesma.
E m b o r a a m a i o r i a desses sistemas esteja restrita a l i d a r c o m
tipos específicos de recipientes de amostra, eles são capazes de
processar grande parte da caTga de t r a b a l h o diária de u m grande
l a b o r a t ó r i o clínico. Apesar de alguns l a b o r a t ó r i o s c o m cargas dc
t r a b a l h o consideradas baixas (600 a 8 0 0 tubos de amostra) jus-
t i f i c a r e m o uso desses sistemas pela falta de assistência técnica,
estes n o r m a l m e n t e são desenvolvidos para laboratórios c o m
cargas de trabalho de 1.000 a 10.000 amostras p o r dia. A l é m d o
p r o g r a m a de c o n t r o l e d o processo e da capacidade de interface
c o m o L I S d o l a b o r a t ó r i o , cada u m desses sistemas i n c o r p o r a
alguns o u todos dos seguintes c o m p o n e n t e s :
1. Are a de entrada (input) de amostra: u m a área de retenção o n d e
amostras c o m código de barras são introduzidas n o sistema.
2. Estações de leitura de código de barras: leitores de código de
barras m ú l t i p l o s são colocados e m locais decisivos n o sistema
de processamento para rastrear as amostras e fornecer infor-
mação de suas trajetórias para as estações n o sistema de
processamento.
3. Sistema de transporte, segmentos de u m a l i n h a na esteira
r o l a n t e q u e conduz as amostras até locais apropriados.
4. U m classificador de alto nível para classificar e encammhar
amostras: u m dispositivo que separa as amostras pelo t i p o
( c o m o p o r altura d o tubo) o u pelo código d o p e d i d o e as
CAPÍTULO 11 187
transfere para o sistema de t r a n s p o r t e o u para u m sistema
que utiliza esteiras (racícs). U m classificador de alto nível é
quase sempre usado para separar as amostras que precisem
de centrifugação das que n ã o precisam, o u para e n c a m i n h a r
amostras para trajetos t o t a l m e n t e diferentes dentro do
sistema de automação total. 11
5. Centrifugação automatizada: uma área d o processador de
amostras que desvia da centrifuga as amostras na esteira
r o l a n t e que necessitam de centrifugação. As amostras são
a u t o m a t i c a m e n t e balanceadas, centrifugadas (temperatura
a m b i e n t e o u refrigerada) e depois removidas da centrífuga e
colocadas de v o l t a ao sistema de transporte.
6. Detecção do nível e avaliação da adequação da amostra (mtegri-
dade da amostra): u m a área o n d e sensores são usados para
avaliar o v o l u m e de amostra e m cada r e c i p i e n t e e t a m b é m
para verificar a presença de hemólise, l i p e m i a ou icterícia.
7. Estação de destampamento: u m a área o u dispositivo n o sistema
a u t o m a t i z a d o o n d e tampas o u tampões de amostra são auto-
m a t i c a m e n t e removidos e descartados e m cesto de l i x o .
8. Estação de retampamento: u m a área o u dispositivo n o sistema
a u t o m a t i z a d o o n d e tubos de amostra são a u t o m a t i c a m e n t e
retampados c o m novos tampões o u cobertos c o m fecha-
mento hermético.
9. Dispositivo de ahquotagem: aspira alíquotas de t a m a n h o s apro-
priados de cada recipiente de amostra o r i g i n a l e os transfere
para novos recipientes para classificação e transporte para as
m ú l t i p l a s estações de trabalho analíticas.
10. Interface, com analisador automatizado: u m a conexão física
direta c o m u m analisador que p e r m i t e a aspiração d i r e t a da
amostra c o n t i d a n o recipiente aberto pela sonda de amostra-
g e m d o analisador, e n q u a n t o o recipiente ainda está n o
t r a n s p o r t a d o r , o u p e r m i t e que o recipiente d o t r a n s p o r t a d o r
seja levantado e colocado n o analisador p o r braços r o b ó t i -
cos. A l g u n s sistemas de automação possuem interface apenas
com suas p r ó p r i a s marcas de analisadores o u c o m um
n ú m e r o l i m i t a d o de sistemas, e n q u a n t o outros usam u m
desenho d e n o m i n a d o aberto que se adapta aos padrões d o
C L S I e p e r m i t e interfaces c o m u m a variedade de analisado-
res automatizados.
11. Classificador: u m classificador a u t o m a t i z a d o para selecionar
as amostras que n ã o irão para u m analisador que t e n h a
interface c o m o t r a n s p o r t a d o r o u para u m a estação de tra-
b a l h o . Tal dispositivo n o r m a l m e n t e faz a classificação entre
30 e 100 grupos diferentes e m estantes ou transportadores.
E m alguns sistemas, as estantes são específicas para d e t e r m i -
nados analisadores apenas p o r conveniência,
12. Estações de retirada: áreas de armazenagem t e m p o r á r i a para
amostras antes e depois da análise. A estação de retirada
p o d e ser igual ao classificador descrito a n t e r i o r m e n t e o n d e
as amostras são classificadas para entrega m a n u a l . Porém, ela
t a m b é m p o d e servir c o m o área de retenção (curral) para
amostras que aguardam a autoverificação de resultados
q u a n d o é necessário repetir u m teste.
13. Sistema de armazenagem e recuperação: essa u n i d a d e t e m a
mesma f u n ç ã o que a estação de retirada o u curral — reter
amostras após análise caso seja necessário repetir u m teste,
mas c o m u m a grande diferença; essas unidades são n o r m a l -
m e n t e refrigeradas e c o m p o r t a m m u i t o mais amostras (3 a
15 .000) que a estação de retirada o u curral. D e p e n d e n d o das
cargas diárias de trabalho, o l a b o r a t ó r i o p o d e reter o equiva-
as lente a 1 semana de amostras para repetir o u fazer testes
adicionais. Os recipientes de amostra são carregados e recu-
perados c o m auxílio de u m r o b ô .
188 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
\ _ X Linha de
Anadsador
Figura 11-6 A testagem direta a partir de um trilho transportador
em configuração de aro elimina a necessidade de separar o equipamento
para classificar as amostras, mas pode limitar o ritmo do movimento da
amostra no trilho para uma velocidade de testagem mais lenta na
estação de trabalho. {De Boyd JC, Felder RA, Savory j. Robotics and
the changing face of the clinicai laboratory. Clin Chem 1996,42:1901 -
10.)
Figura 11-7 Fazer a classificação de amostras laboratoriais, antes da
introdução em sistemas de transporte de amostra automatizado,
simplifica o desenho e a construção de um transportador. (De Boyd JC,
Felder RA, Savory J. Robotics and the changing face of the clinicai
laboratory. Clin Chem 1996;42:1901-10.)
Classificação de Amostra Automatizada
Várias abordagens paia classificar amostras de modo automático
foram usadas, incluindo (1) esteira rolante, (2) classificador auto-
matizado usando es cantes e (3) classificadores independentes.
Escolher a abordagem correta é u m determinante m u i t o impor-
tante do esquema geral de automação em qualquer laboratório.
Integração com um Sistema Transportador
Três tipos de sistemas de classificação de transportador foram
usados. U m tipo usa u m aro contínuo n o qual todas as amostras
seguem o aro e passam por cada estação de trabalho o u analisa-
dor. As amostras ou são testadas diretamente pelo instrumento
analítico ainda n o transportador, ou u m robô anexado à estação
de trabalho remove as amostras selecionadas do transportador
para análise (Figura 11-6). A vantagem dessa abordagem é não
sei necessário aliquotar as amostras já que elas passam por todas
as estações de trabalho nas quais os testes são realizados. C o n t u d o ,
o aro contínuo também tem algumas desvantagens, pois a taxa
de produção de amostras é quase sempre limitada pelo analisador
de testes, mais lento no aro. As exceções incluem sistemas que
usam trilhos de desvio que permitem às amostras desviar de
estações para chegarem aos seus destinos corretos. Deve-se notar
também que, se as amostras foram removidas de seus recipientes
na l i n h a de testagem, u m sistema de enfileiramento de recipien-
tes vazios é necessário para devolver os tubos ao transportador.
químíca
P'OWrS«ldrX Unha de
LÍH ;-*riusli>i hematologia
ProoMi*nanto3
nâo-autcmatlzBdos
Figura 11 - 8 O uso de um sistema transportador para classificar
amostras de modo dinâmico durante o transporte destas elimina a
necessidade de equipamento separado para classificá-las, mas requer um
sistema transportador mais sofisticado com muitas estações e portões de
leitura de código de banas pata direcionar as amostras para estações de
trabalho apropriadas. (De Boyd JC, Felder RA, Savory J. Robotics and
the changing face of the clinicai laboratory. Clin Chem 1996;42:1901-
10)
E m uma segunda abordagem, alguns sistemas de transporta-
dores de processamento automatizado classificam as amostras em
grupos de acordo com seus destinos n o laboratório, como para
testes químicos ou hematológicos, Depois da classificação, as
amostras separadas são direcionadas para a linha transportadora
exclusiva (Figura 11-7). Esse método segue a abordagem usada na
maioria das áreas de processamento de amostras manual. A
extensão do transporte de amostra via transportador depende das
atividades a serem incluídas. Por exemplo, esses desenhos p o d e m
incluir uma centrífuga e u n i dispositivo de aliquotagem, analisa-
dores de interação química e imunoquímica, u m classificador
adicional, uma estação cie retirada, e até mesmo uma armazena-
gem refrigerada e uma estação de recuperação no f i m da linha
de química. A linha de hematologia pode levar diretamente a
analisadores hematológicos e de coagulação e a uma máquina de
preparação de slide automatizada.
N a terceira abordagem, o classificador é integrado ao sistema
transportador e as amostras são classificadas enquanto são trans-
portadas (Figura 11-8). As vantagens dessa abordagem são que
u m classificador de amostra exclusivo não é necessário n o sistema
de processamento de amostra e que, com o transporte de amostra
apropriado, a necessidade de alíquotas de amostra pode ser
evitada.
Classificação Automatizada em Estantes
Alguns classificadores são projetados para classificar amostras em
estantes para transferência para determinadas seções do labora-
tório o u paia analisadores, c o m o descrito anteriormente. Esses
sistemas classificam as alíquotas e os tubos originais nas estantes
para transporte manual para analisadores ou seções do laborató-
rio. E m alguns casos, as estantes podem ser específicas para u m
determinado analisador, eliminando o manuseio adicional de
tubos.
Armazenagem e Recuperação de Amostras
Automatizadas
A capacidade automatizada de armazenar e recuperar amostras,
quando necessário, é u m aspecto importante dos sistemas de
liberação de amostras automatizadas. Alguns dos sistemas inte-
grados ]á descritos oferecem módulos de armazenagem e recupe-
ração de amostras como opções em seus sistemas. Esses módulos
robóticos armazenam amostras refrigeradas em locais específicos
 Automação em Laboratório de Análises Clinicas CAPÍTULO 11 189

Sistema de Sistema de
QUADRO 11-4 Etapas para a Mapeamento do Fluxo de
automação internação
<—
Trabalho em Laboratório Clínico da laboratório do laboratório

Descarregamento de recipientes de transporte
Pré-classificação
Preservação de temperatura
Entrada de pedido
Gerenciamento de documento (requisições etc.)
Rotulagem
Classificação
Centrifugação
Rotulagem de tubos de alíquotas
Distribuição de alíquotas
Mais classificação
Entrega em seções do laboratório
Mais classificação
Preparação de listas de trabalho
Destampamento
Rotulagem de tubos específicos de u m analisador para amostras
Distribuição c u pipetagem de amostras específicas de um analisador
Carregamento de tubos em analisadores
Realização de testes (etapas como extração, centrifugação, precipitação, dilui-
ção etc,, não são especificamente listadas)
Descarregamento de analisadores
Refàmpamento
Manipulações de dados (cálculos)
Revisão e verificação de resultado
Relatório de resultados
Distribuição de amostras para sistema de armazenagem e arquivamento
Armazenagem oculta de amostras
Testagem reflexiva
Repetição de testagem, diluição, caso necessário
Testagem adicional a pedido do médico
Recuperação de amostra para repetição do ensaio ou realização de teste
adicional
Descarte de amostras vencidas
que são registradas em u m banco de dados mantido pelo sistema
de liberação dessas amostras. Q u a n d o u m usuário solícita a
recuperação de uma determinada amostra, o robô recebe
comando paia lecupeiá-la do local arquivado apLOpiiado e enca-
minhá-la para a estação solicitada utilizando o sistema de trans-
porte. Alguns grandes laboratórios de referência adotaram siste-
mas de grande armazenagem comumente usados em outras
indústrias em suas unidades laboratoriais.
CONSIDERAÇÕES PRÁTICAS
Nesta seção são discutidas as considerações práticas que influen-
ciam nas decisões em laboratório sobre a automação de parte ou
de todas as suas operações.
Avaliação das Necessidades
Qualquer consideração sobre automação total ou modular de
laboratório deve iniciar com uma avaliação das necessidades.10
Essa avaliação começa com o mapeamento do f l u x o de trabalho
atual n o laboratório, desde a chegada de amostras de pacientes
até a realização da testes e relatórios de resultados. O Quadro
11-4 lista as etapas de u m fluxo de trabalho em potencial que
devem ser mapeadas. O mapeamento dos fluxos de dados e de
material (amostra) está diretamente relacionado com o fluxo de
procedimentos e auxiliará o laboratório na determinação das
etapas que (1) são obstruídoras, (2) desperdiçam mão-de-obra e
(3) são propensas a erros.13 O mapeamento do fluxo de trabalho
A A A
1
V V W V
Inslrumento de Inslrumento de Instrumento Inslrumento
transporte
procedimento analíbco analítico
Figura 11-9 M o d e l o de controle funcional do p r o t ó t i p o CLS1/
NCCLS AUT003-A. As linhas sólidas e as setas mostram o fluxo de
informação lógica apoiado pelo protótipo As linhas pontilhadas e as
setas são os fluxos de informação lógica permitidos, mas não apoiados
pelo protótipo. (Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS.
Automação de laboratório: comunicações com sistemas automatizados
de laboratório clinico, instrumentos, dispositivos e sistemas de
informação. CLSI protótipo aprovado AUT003-A. Wayne, PA: Clinicai
and Laboratory Standards Insticute, 2000. Figura reproduzida com
permissão do CLSI.)
permite ao laboratório identificar melhor quais etapas podem
ser consideradas paTa automação.
Alguns laboratoristas utilizam até 80% de dados empíricos
como base para tomada de decisões sobre automação. Os labo-
ratórios de análises clínicas possuem muitos testes, recipientes
de amostras e situações excepcionais para avaliar. N o entanto,
se 80% das situações e dos recipientes de amostras puderem ser
padronizados e automatizados, o laboratório conseguirá uma
redução substancial nos custos e mão-de-obra, o que deve ser
suficiente para justificar o investimento em automação, planeja-
mento e avaliação do tempo envolvido
U m a vez mapeado o f l u x o de trabalho e identificadas as
necessidades, as soluções alternativas são então consideradas.
Vendedores são convidados para fazer apresentações e acompa-
nhar visitas da equipe gerencial a outros laboratórios onde o
fornecedor possua instalações bem-sucedidas. Nesse estágio é
importante colocar em foco as necessidades identificadas pelo
mapeamento do f l u x o de trabalho e não permitir que o vende-
dor tente vender equipamentos que não sejam necessários.
Problemas de Integração
Construir u m laboratório altamente integrado gera muitos pro-
blemas em potencial. C o m o é improvável que u m laboratório
use apenas o equipamento de u m único fabricante, a integração
de instrumentos em dispositivos robóticos de fabricantes dife-
rentes normalmente é necessária. Devem ser tomadas decisões
sobre qual veículo será o controlador mestre e qual fornecedor
desenvolverá o programa de computador (software) que fornecerá
o controle geral do esquema de automação. A l é m disso, os
indivíduos ou empresas que serão responsáveis pela configura-
ção da automação e pela geometria e cronograma da produção
do laboratório deverão ser convocados e treinados. Embora os
esquemas de automação industrial tenham sido desenvolvidos
para resolver muitos desses problemas, a experiência com essas
abordagens ainda é insuficiente no ambiente de laboratórios de
análises clínicas.
O leitor deve se referir ao protótipo A U T 0 0 3 - A do CLSI,
que é descrito na seção a seguir, e em particular ao M o d e l o de
Controle Funcional (Seção 4.2), que descreve as relações entre
o LIS, LAS e vários outros dispositivos. 7 Nesse modelo, e em
todas as séries de protótipos de automação CLSI, o termo LAS
190 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
representa o sistema de c o m p u t a d o r que c o n t r o l a a automação
d o sistema, e não o hardware de automação. C o m frequência é o
L A S que possui o requisito d o p r o g r a m a (software) de c o n t r o l e
d o processo para m a n t e r a automação. O m o d e l o de c o n t r o l e
f u n c i o n a l , m o s t r a d o na Figura 11-9, m a n t é m i n s t r u m e n t o s ana-
líticos que p o d e m ser fisicamente i n c o r p o r a d o s ao sistema de
automação e analisadores que não p o d e m ser i n c o r p o r a d o s , mas
que a m d a possuem interface c o m o LIS. O m o d e l o não concede
d o m i n â n c i a ao L I S o u L A S , mas p e r m i t e o f l u x o de i n f o r m a ç ã o
essencial em q u a l q u e r das duas direções buscando o uso mais
eficiente dos p o n t o s fortes de cada sistema.
Dispositivo de Integração
U m objetivo n o des env ol v i m ento de u m l a b o r a t ó r i o integrado é
ligar os i n s t r u m e n t o s e os dispositivos d o l a b o r a t ó r i o a u m
sistema a u t o m a t i z a d o paia m a x i m i z a i o n ú m e r o de funções auto-
matizadas. A i n t r o d u ç ã o automática de amostra requer o desen-
v o l v i m e n t o de interfaces mecânicas entre cada analisador e dis-
positivos, c o m o esteiras rolantes, robôs móveis o u braços robóti-
cos. Atualizações para interfaces eletrônicas de i n s t r u m e n t o s para
l a b o r a t ó r i o são necessárias para p e r m i t i r o c o n t r o l e das funções
d o painel f r o n t a l p o r u m c o m p u t a d o r remoto, a notificação da
i n f o r m a ç ã o sobre o estado d o i n s t r u m e n t o , e a coordenação da
d i s t t i b u i ç ã o de amostras entre os i n s t r u m e n t o s . A m a i o r i a das
interfaces de L I S c o m analisadores de l a b o r a t ó r i o fornece apenas
a capacidade de baix ar n ú m e r o s de acesso e pedidos de teste de
cada amostra, e de carregar (upload) os resultados gerados pelo
analisador.
Controladores e Programa do Processo
Os controladores de p r o c e d i m e n t o for nec em integração compu-
tadorizada de m u i t a s tarefas através de decisões que o c o r r e m na
atividade diária de u m l a b o r a t ó r i o C o n s e q ü e n t e m e n t e , u m pro-
grama de c o n t r o l e d o processo é necessário para coordenar todas
as atividades do l a b o r a t ó r i o . Para integrar todos os dispositivos
n o l a b o r a t ó r i o , é preciso estabelecer comunicações c o m u m dis-
positivo c o n t r o l a d o r mestre. A l é m disso, a comunicação é neces-
sária entre o c o m p u t a d o r L I S , o c o m p u t a d o r L A S (que fornece
c o n t r o l e do processo), os analisadores d o l a b o r a t ó r i o , os trans-
portadores de amostra e os dispositivos de manipulação de
amostra, c o m o centrífugas, aliquotadores, destampadores etc. A
distribuição de tarefas deve ser cuidadosamente especificada n o
desenvolvimento dessa rede de comunicações.
OUTRAS ÁREAS DE AUTOMAÇÃO
A l é m dos dispositivos descritos a n t e r i o r m e n t e , u m a variedade de
i n s t r u m e n t o s e p r o c e d i m e n t o s foi automatizada e i n c o r p o r a d a à
r o t i n a de l a b o r a t ó r i o s de análises clínicas. Eles i n c l u e m (1) ana-
lisadores de u r i n a , (2) contadores de células, (3) analisadores de
ácido nucléico, (4) sistemas de placa de m i c r o t i t u l a c ã o , (5) esta-
ções de pipetagem automatizadas e (6) analisadores para testagem
l a b o r a t o r i a l remoca.
Analisadores de Urina
M u i t o s dos mesmos p r i n c í p i o s analíticos são usados para quan-
tificação dos c o n s t i t u i n t e s d o soro e da u r i n a . E mais difícil,
entretanto, automatizar a testagem de u r i n a em v i r t u d e da grande
variedade das concentrações dos constituintes da u r i n a . Essa
variedade requer u m l i m i t e baixo de detecção para m e d i r con-
centrações baixas, e linearidade para p e r m i t i r mensurações de
concentrações altas sem diluição. Essa requisição, j u n t o à
d e m a n d a relativamente baixa para testes de u r i n a comparada
c o m a d e m a n d a para testes de soro, restringiu o desenvolvimento
de analisadores projetados especialmente para constituintes uri-
nários. N o entanto, análises selecionadas de u r i n a sao realizadas
nos analisadores disponíveis em algumas instituições. 9
Contadores de Células
Analisadores que realizam u m a contagem completa de sangue
f o r a m automatizados c o m o uso do " p r i n c í p i o de C o u l t e r " , o
q u a l se baseia em (1) c o n d u t i v i d a d e de célula, (2) luz dispersa e
(3) c i t o m e t r i a de f l u x o . Células sanguíneas i n d i v i d u a i s são anali-
sadas c o m aplicação de u m a o u mais dessas técnicas. O p r i n c í p i o
de C o u l t e r baseia-se nas mudanças na impedância elétrica pro-
duzidas p o r partículas não-condutivas suspensas em u m e l e t r ó l i t o
q u a n d o estas passam através de u m a pequena abertura entre os
eletrodos. N a zona sensível da abertura, o v o l u m e de eletrólitos
deslocados pela partícula (célula) é m e d i d o c o m o u m a m u d a n ç a
na v o l t a g e m p r o p o r c i o n a l ao v o l u m e da partícula. C o m o con-
trole cuidadoso da q u a n t i d a d e de e l e t r ó l i t o que passa pela aber-
t u r a , vários milhares de partículas são contadas p o r segundo e
medidas i n d i v i d u a l m e n t e . Células vermelhas, células brancas e
plaquetas são identificadas p o r seus tamanhos. A l t e r n a r a cor-
rente na faixa de r a d i o f r e q ü ê n c i a piovoca curto-circuito na
camada de l i p í d i o b i p o l a r da m e m b r a n a da célula, p e r m i t i n d o
que a energia penetre na mesma. C o m essa técnica obtêm-se
informações sobre a estrutura intracelular, i n c l u i n d o composição
q u í m i c a e v o l u m e nuclear.
A c i t o m e t r i a de f l u x o n o r m a l m e n t e utiliza células tingidas
c o m corante (solução de supravital eosina a 5 % em soro fisioló-
gico), o n d e as células mortas são coradas, o u sondas fluorescen-
tes que, e m suspensão, atravessara, i n d i v i d u a l m e n t e , u m a fonte
de luz de u m laser. (Células não-tingidas t a m b é m são medidas )
A luz dispersa e a luz e m i t i d a são coletadas através de detectores
de dispersão de luz f r o n t a l e lateral. A i n f o r m a ç ã o o b t i d a p o r
mensuração de luz dispersa q u a n d o a célula é atingida p e l o raio
laser é então usada para estimar (1) a f o r m a da célula, (2) o
t a m a n h o , (3) a granulosidade celular, (4) a l o b u l a r í d a d e nucleaT
e (5) a estrutura da superfície da célula. A l g u n s contadores de
células classificam as células brancas usando o p r i n c í p i o de
C o u l t e r — a c o n d u t i v i d a d e da célula e a dispersão de luz das
células não-tingidas para diferenciar os tipos de células. O u t r o s
contadores de células usam m ú l t i p l o s canais de c i t o m e t r i a de
f l u x o o u u m a c o m b i n a ç ã o de c i t o m e t r i a de f l u x o , c o n d u t i v i d a d e
da célula e dispersão de luz.
Analisadores de Ácido Nucléico
A automação de análise de ácido nucléico se desenvolveu rapida-
m e n t e c o m o consequência ao Projeto G e n o m a H u m a n o . 1 2 V á r i o s
fabricantes desenvolveram automação para auxiliar n o isola-
m e n t o e análise de ácidos nucléicos usando vários esquemas de
amplificação e seqüenciamento desse ácido. M u i t a s dessas técni-
cas f o r a m miniaturizadas usando tecnologia de chip.5M As aboi-
dagens baseadas e m chip p r o m e t e m reduzir o t e m p o de análise e
o c o n s u m o de reagentes, d i m i n u i n d o os custos a s s o c i a d o s à
r o b ó t i c a e à necessidade de aparato l a b o r a t o r i a l para as aborda-
gens em macroescala.
Sistemas de Placa de Microtitulação
Os sistemas de placa de m i c r o t i t u l a c ã o são c o m u m e n t e usados
em imunoensaios e em análises de ácido nucléico. C o m o são
usadas em testes imunoadsorventes associados à enzima ( E L I S A ) ,
as placas de m i c r o t i t u l a ç ã o n o r m a l m e n t e são feitas de poliesti-
r e n o e possuem 48 o u 96 cavidades revestidas c o m a n t i c o r p o
específico para o antigeno de interesse. A p ó s a incubação d o soro
na cavidade da placa de m i c r o t i t u l a ç ã o , a cavidade é lavada para
remover antigeno solto, e u m segundo a n t i c o r p o c o m i n d i c a d o r
c o n j u g a d o é a d i c i o n a d o . D e p o i s de u m segundo p e r í o d o de
 Automação em Laboratório de Análises Clínicas
incubação, a cavidade é lavada para remover o conjugado solto.
U m produto de coloração é desenvolvido com a adição de subs-
trato de enzima e a reação termina em u m tempo determinado.
C o m o desenvolvimento de estações de pipetagem automatiza-
das, as etapas de manejamento de l i q u i d o necessárias em análises
com placa de micra titulação foram totalmente automatizadas
para tornar essas análises u m a tecnologia viável para a realização
de grandes quantidades de imunoensaios. As estações de pipe-
tagem automatizadas possuem u m robô cartesiano com uma
pipeta fixada n o final da sonda que se move em u m espaço
retangular. A sonda é capaz de se mover em eixos de X, Y e Z.
Os líquidos podem ser aspirados e depositados em qualquer
local do espaço retangular.
Estações de Pipetagem Automatizadas
As estações de pipetagem podem ser usadas para automatizar u m
procedimento analítico para o qual u m analisador automatizado
não existe ou seu custo não pode ser justificado. A maioria dos
robôs de pipetagem é (1) relativamente fácil de programar, (2)
raramente falha, e (3) consegue distribuir alíquotas de líquidos
com extrema precisão. Os robôs de pipetagem de canais múltiplos
permitem o processamento paralelo de amoscras com 8 a 12
sondas de canal para lidar com as placas de microtitulação.
Analisadores para Teste Laboratorial Remoto
O teste laboratorial r e m o t o ( P O C T ) é u m componente analí-
tico que está crescendo rapidamente, 8 sendo também conhecido
como teste " p r ó x i m o ao paciente", "descentralizado" e "portátil"
(Capítulo 12).
REFERÊNCIAS
1. Boyd J. Tech. Sight. Robocic laboiacory automation. Science. 2002 Jan
18;295{5554):517-8.
2. Boyd JC, Hawker CD. Automation in the clinicai laboratory. In: Burtis
CA, Ashwood ER, Biuns DE, eds. Tietz textbook of clinicai chemistry
and molecular diagnostics, 4th ed Philadelphia: Saunders, 2006:265-97-
3. Boyd JC, Felder RA. Preanalytical automation in the clinicai laboratory.
In: Ward-Cook KM, Lehmann CA, Schoeff LE, Williams RH, eds.
CAPÍTULO 11 191
Clinicai diagnostic technology: the tocai testing process. Volume 1. The
preanalytical phase. Washington, DC: AACC Press, 2002:107-29.
4. Chan DW. Immunoassay automation: an updated guide to systems. San
Diego. Academic Press, 1995.
5. Cheng J, For ti na P, Surrey S, Kricka LJ, Wilding P. Microchip-based
devices for molecular diagnosis of genetic diseases. Molecular Diagnosis
1996;1:183-200.
6. Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Laboratory
automation: Specimen container/specimen carrier. CLS1/NCCLS
Approved standard AUTOOl-A. Wayne, PA: Clinicai and Laboratory
Standards Insrimte, 2000.
7. Clinicai and Laboratory Standards Insticute/NCCLS Laboratory
automation: Communications wich automaced clinicai laboratory
systems, instruments, devices, and information systems. CLSI/NCCLS
Approved standard AUT003-A. Wayne, PA: Clinicai and Laboratory
Standards Insriture, 2000.
8. Giuliano KK, Giant ME. Blood analysis at the point of caie: issues in
applicacion for use in critkally ilt patients. AACN Clin Issues. 2002
May, 13:204-20.
9. Guder WG, Ceriotti F, Bonini P. Urínalysis—challenges by new medicai
needs and advanced technologies. Clin Chem Lab Med 1998;36:907.
10. Hawker CD, Garr SB, Hamilton LT, Penrose JR, Ashwood ER, Weiss
RL. Automated transport and sorting sysrem in a large reference
laboratory: Part 1: Evaluation of needs and alteinatives and
development of a plan. Clin Chem 2002;48:1751-60.
11. Hawker CD, Roberts WL, Gatr SB, Hamilton LT, Penrose JR, et al.
Automated cransport and sorting system in a large reference laboratory.
Pare 2: Implementation of the system and performance measures over
three years. Clin Chem 2002;48:1761-67.
12. JaklevicJM, Garner HR, Miller GA. Instrumentation for the genome
project. Annu Rev Biomed Eng 1999;1:649-78.
13. Middleton S, Mountain P. Process cantiol and on-line optirrmation. In.
Kosi GJi ed. Handbook of clinicai automation, robotícs, and
optimization. New York: John Wiley & Sons, 1996:515-40.
14 Paegel BM, Blasej RG, Mathies RA. Microfluidic devices for DNA
sequencing: sample preparation and electrophoretic analysis. Curr Opin
Biotechnol 2003;14:42-50.
15. Price CP, Newman D], eds. Principies and practice of iminunoassafy,
2nd ed. New York: Stockton Press, 1997
16. Sasaki M, Kageoka T, Oguia K, Kataoka H, Ueta T, et al. Total
laboratory automation in Japan: past, present, and the future. Clin
Chim Acta 1998;278:217-27.
CAPÍTULO 1 2
| Testagem Laboratorial Remota
Christopher P. Price, Ph.D., F.R.C.Path., e Andrew St. John, Ph.D., M.A.A.C.B.
OBJETIVOS
1. Definir testagem laboratorial remota e outros termos usados para
descrever o mesmo processo.
2. Descrever as requisições analíticas e as considerações tecnológicas
para testagem laboratorial remota:
• Desenho
• Interface do operador
• Sistemas de identificação de código de barras
• Distribuição de amostra
• Célula de reação
• Sensores
• Sistemas de comunicação e controle
• Armazenamento e gerenciamento de dados
• Fabricação de dispositivos para testagem laboratorial remota
3. Descrever exemplos de dispositivos:
Dispositivos in vitro:
• Tira qualitativa ou dispositivos de cartucho e/ou tira de use
único (p. ex., bastões de imersão, bastões complexos e tira
immunostrip)
• Cartucho qualitativo ou testes de tiras de uso único com
dispositivo de monitoração (p. ex., mensuração de glicose e
outras aplicações)
Dispositivos in vivo, ex vivo ou minimamente invasivos
4. Descrever a relação entre informática e testagem laboratorial remota:
• Descrição da conectividade-padrãc
• Benefícios da conectividade da testagem laboratorial remota
5. Descrever a abordagem para a implementação e o gerenciamento
da testagem laboratorial remota:
• Estabelecer a necessidade
• Organizar uma comissão organizadora da testagem laboratorial
remota
• Política e responsabilidade da testagem laboratorial remota
• Procura e avaliação de equipamento
• Treinamento e certificação de operadores
• Controle de qualidade, garantia de qualidade e auditoria
• Manutenção e controle de inventário
• Documentação
• Acreditação e regulamento
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A c r e d i t a ç ã o : U m a técnica de a u d i t o r i a usada para avaliar a
qualidade de u m processo v e r i f i c a n d o se os padrões
operacionais d e f i n i d o s estão sendo seguidos, neste caso, n o
d e s e m p e n h o da testagem l a b o r a t o r i a l r e m o t a .
A n a l i t o : A substância a ser analisada o u medida. T a m b é m
denominado mensurando.
A u d i t o r i a : O exame de u m processo para verificar sua
acuidade, que neste caso p o d e ser o uso da testagem
l a b o r a t o r i a l r e m o t a para garantir que o resultado correto
esteja sendo p r o d u z i d o e / o u que o resultado d o paciente
esperado esteja sendo apresentado.
Bastão de I m e r s ã o : U m i n s t r u m e n t o simples c o m superfície
absorvente c o n t e n d o reagentes nos quais a amostra é
b o r r i f a d a o u o bastão é imerso na amostra. Isso p e r m i t e a
m o n i t o r a ç ã o da reação da amostra c o m os reagentes.
C o n e c t i v i d a d e : A p r o p r i e d a d e (p. ex., software e kard wire o u
conexão sem fio) de u m dispositivo q u e p e r m i t e que ele
seja conectado a u m sistema de i n f o r m a ç ã o (p. ex., u m
sistema de i n f o r m a ç ã o de l a b o r a t ó r i o ) c o m os p r i n c i p a i s
objetivos de t r a n s m i t i r os dados d o paciente do dispositivo
para o registro d o paciente e de m o n i t o r a r o desempenho
d o dispositivo.
D i s p o s i t i v o s M i n i m a m e n t e Invasivos: Dispositivos para m e d i r
os constituintes dos f l u i d o s do c o r p o sem a necessidade de
u m a v e n i p u n t u r a , c o m o n o caso de iontoforese paTa extrair
l í q u i d o extracelular para a superfície da pele pata
mensuração de glicose.
F l u í d i c o : Processo pelo q u a l o l í q u i d o se move d e n t r o de u m
espaço c o n f i n a d o , c o m o n o caso de u m t u d o estreito o u
m a t r i z porosa. T a l processo i n c l u i tensão de superfície,
difusão e o uso de bombas.
G e r e n c i a m e n t o de Q u a l i d a d e : Técnicas usadas para garantir a
m e l h o r qualidade n o desempenho. As técnicas i n c l u e m
t r e i n a m e n t o e certificação dos operadores, c o n t r o l e de
qualidade, garantia de q u a l i d a d e e a u d i t o r i a .
I n f o r m á t i c a : Estrutura, criação, gerenciamento, armazenagem,
recuperação, disseminação e transferência de i n f o r m a ç ã o .
T a m b é m usada para descrever o estudo da aplicação de
i n f o r m a ç ã o d e n t r o de organizações.
I n t e r f a c e de O p e r a d o r : A parte de u m dispositivo que o
operador precisa usar para que o dispositivo f u n c i o n e (p.
ex., l i g a i u m leitor, inserir identificação de amostra de
paciente o u calibrar o dispositivo).
Sensor: U m dispositivo que recebe e responde a u m sinal o u
estímulo. H á m u i t o s exemplos na v i d a i n c l u i n d o os
receptores da língua, da orelha etc. U m a enzima é usada
c o m o u m sensor conectado ao t r a n s d u t o r na construção de
u m biossensor.
Testagem L a b o r a t o r i a l R e m o t a ( P O C T ) : U m m e i o de testagem
n o q u a l a análise é realizada n o l o c a l o n d e o c u i d a d o
m é d i c o é dispensado j u n t o ao paciente.
T i r a i m m u n o s t r i p : U m a m a t r i z porosa que c o n t é m u m a região
na q u a l u m reagente de a n t i c o r p o r o t u l a d o é seco na matri2
e o u t r a na q u a l u m a n t i c o r p o é q u i m i c a m e n t e ligado.
Q u a n d o u m a amostra é a d i c i o n a d a à p r i m e i r a região, o
analito de interesse se liga ao a n t i c o r p o , agora em solução,
e se move ao l o n g o da tira, ligando-se ao segundo
a n t i c o r p o . A presença desse p r i m e i r o a n t i c o r p o r e t i d o na
segunda região i n d i c a que o antigeno c o n t r a o qual os
a n t i c o r p o s f o r a m estimulados está presente na amostra.
T r a n s d u t o r : U m a substância ou dispositivo q u e converte
entrada de energia em u m a f o r m a , e m p r o d u ç ã o de energia
de o u t r a f o r m a . São exemplos o cristal piezoeléctrico, o
m i c r o f o n e e a célula fotoelétrica. A c o m b i n a ç ã o de u m
sensor e u m t r a n s d u t o r deve levar a u m p r o d u t o que p o d e
ser " l i d e " por h u m a n o s .
194 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

A testagem l a b o r a t o r i a l r e m o t a ( P O C T ) é u m m e i o de
testagem n o q u a l a análise é reali2ada n o local o n d e o
c u i d a d o m é d i c o dado ao paciente. O u t r o s termos usados
para descrevei a P O C T i n c l u e m testagem (1) "à cabeceira") (2)
" p r ó x i m a ao paciente", (3) " n o c o n s u l t ó r i o m é d i c o " , (4) "extra-
l a b o r a t ó r i o " , (5) "descentralizada", (6) "fora do local", (7) "suple-
m e n t a r " , (8) " e m local a l t e r n a t i v o " e (9) " p o r t á t i l " . A P O C T é
realizada em várias localizações ( Q u a d r o 12-1). 9 ' u Suas principais
vantagens são (1) redução d o t e m p o do processo de testagem
( T A T ) , (2) redução d o risco de desconexão entre o processo de
testagem e a t o m a d a de decisão clínica (Figura 12-1), e (3) res ul-
tados de saúde m e l h o r a d o s ( Q u a d r o 12-2)
As seções a seguir descreverão a tecnologia disponível para a
P O C T e os fatores organizacionais que são i m p o r t a n t e s q u a n d o
u m a P O C T é instalada e m u m a u n i d a d e de saúde.
CONSIDERAÇÕES ANALÍTICAS E
TECNOLÓGICAS
A m i n i a t u r i z a ç ã o há m u i t o t e m sido u m a tendência na instru-
mentação diagnostica clínica e resultou na evolução de disposi-
tivos de P O C T pata m e d i r eletrólitos, gases sanguíneos e outros
Q U A D R O 12-1 Ambientes Onde a Testagem Laboratorial
Remota Pode Ser Empregada
TRATAMENTO PRIMÁRIO
Residência
Farmácia da comunidade
Centros de saúde (clínica geral, cuidados primários)
Clínica em local de trabalho
Consultório médico e clínica da comunidade
Centro de diagnóstico e treinamento
Veículo de auxílio paramédico (ambulância, helicóptero, avião)
TRATAMENTOS SECUNDÁRIO E TERCIÁRIO
Sala de emergência
Unidades de admissão
Ambulatório de diagnóstico e centro de tratamento
Sala de operação
Unidade de tratamento intensivo
Enfermaria
Clínica ambulatorial
analitos. 4 Ela t a m b é m resultou n o desenvolvimento de reagentes
secos, estáveis em dispositivos de dose ú n i c a descartáveis. E m b o r a
a p r o d u ç ã o dos testes para esses dispositivos seja baixa, o t e m p o
necessário para pToduzir resultados normalmente é c u r t o . A l é m
disso, esses dispositivos são quase sempre pequenos o bastante
para serem portáteis, m e l h o r a n d o ainda mais a possibilidade de
"oferecer testes ao paciente".
O s tópicos discutidos nesta seção i n c l u e m (1) requisitos do
i n s t r u m e n t o , (2) desenho d o i n s m i m e n r o e da i n t e r f a c e d o
o p e r a d o r , (3) exemplos de dispositivos de P O C T e (4) o papel
da i n f o r m á t i c a . Os leitores que quiserem i n f o r m a ç ã o a d i c i o n a l
p o d e m encontrá-la em textos mais abrangentes 6 8 1 0 1 1 o u c o m os
vendedores de dispositivos de P O C T .
Requisitos
A s características e requisitos dos dispositivos de P O C T estão
listados n o Q u a d r o 12-3.
Desenho
H á u m a grande variedade de dispositivos sendo usada para
P O C T (Tabela 12-1). Essa a m p l a tecnologia abrange u m a gama
de analitos, e m u i t o s dos dispositivos usam os mesmos princí-
pios analíticos que aqueles encontrados e m analisadores de labo-
r a t ó r i o convencional. Os p r i n c i p a i s componentes n o desenho
Q U A D R O 1 2 - 2 | Vantagens da Testagem Laboratorial Remota
Redução do tempo do processo de tEstagem (TAT) dos resultados do
teste
Controle melhorado do paciente
Redução do trabalho administrativo associado à requisição de teste
Redução na demora resultante de coleta e requisições para a amostra
Redução do tempo resultante com o transporte de amostra para o
laboratório
Redução do tempo resultante com log in (registro) de amostra
Redução do tempo resultante da entrada de amostra em instalação de
testagem complexa
Q U A D R O 12-3 Características/Requisições de um
Analisador de Testagem Laboratorial Remota

Primeiros resultados em um minuto ou menos

paciente Instrumentos portáteis com cartuchos de reagente para consumo

• it •
Capacidade de realizar análise direta de amostra em sangue total e urina
# interpre- pedido
(amostras não-processadas)
tação
médico Procedimentos de operação simples que não precisam de operadores
R treinados
transmissão E A flebotomia
Cardápio de teste flexível
: S M Resultados quantitativos ccm acuidade e precisão comparáveis àquelas do
U O laboratório central
relatório transporte
L S Calibração e controle de qualidade automáticos/integrados

T Armazenamento com temperatura ambiente para reagentes

T
Resultados fornecidos em cópia impressa, armazenados e disponíveis para
A R transmissão
validade D A registro
Instrumento de baixo custo
O
Serviço de intercâmbio
controle de Preservação automática de registro regulador
análise preparo
"qualidade"'
Modificado de Moclin E, WC. Pcint-ofcare leíiing tecnclogy.
]. Clin LíjanJ Assay 1995;18:21-33.
Figura 12-1 U m a representação esquemática das principais etapas Protocolo de. operação de um ou dots passos
em u m pedido, entrega e uso de u m resultado de teste diagnóstico.
 Testagem Laboratorial Remota CAPÍTULO 12 195

TABELA 12-1 Classificação dos T i p o s de I n s t r u m e n t o s ou Dispositivos de Testagem Laboratorial R e m o t a

Tipo de Tecnologia Princípio Analítico Analitos

Testes qualitativos cu semiqualitativos Reflexão da luz Química da urina e sangue

de cartucho ou tira de uso único Imunoanálises de fluxo-lateral ou íiuxo Agentes de doença infecciosa, marcadores cardíacos, hCG
Testes quantitativos de cartucho/tira Reflexão da luz Glicose
de uso único com dispositivo de leitura Eletroquímica Glicose
Reflexão da luz Quimica do sangue
Movimento óptico de luz dispersa Coagulação
Imunoanálises de fluxo-lateral, fluxo ou Marcadores cardíacos, drogas, CRP, alergia
de fase sólida e testes de fertilidade
Imunolurbidimetria HbA1c, albumina urinária
Espectrofotometria Quimica do sangue
Eletroquímica pH, gases sanguíneos, eletrólitos, melabolitos
Dispositivos quantitativos de Eletroquímica pH, gases sanguíneos, eletrólitos, metabólitos
cartucho/bancada de uso múltiplo Fluorescência pH, gases sanguíneos, eletrólitos, metabólitos
Espectrofotometria de múltiplos comprimentos de onda Espécies de hemoglobina, bilirrubina
Fluorescência com resolução temporal Marcadores cardíacos, drogas, CRP
Impedância elétrica Hemograma completo

de u m a P O C T i n c l u e m (1) a interface do operador, sistemas de Analito

identificação de código de barras, (3) dispositivos de distribuição

"T
de amostra, (4) célula de reação, (5) sensores, (6) sistemas de
c o n t r o l e e c o m u n i c a ç ã o e (8) requisições do fabricante.
Sistema
Analito
Biorreativo
Interface do Operador
A interface do o p e r a d o r o u usuária c o m u m dispositivo de
P O C T deve (1) exigir interação m í n i m a d o operador, (2) orien-
tar o usuário d u r a n t e a operação e (3) tolerar pequenos eTros do
rL ^ A n a l i t o ^ J1 JT. jransc|Utor
I
Transdutor
operador. U m n ú m e r o m í n i m o de etapas deve i n c l u i r a identi-
ficação (1) do operador, (2) do paciente e (3) do teste a ser
m e d i d o . Os avanços na tecnologia de i n f o r m a ç ã o e na eletrônica
de c o n s u m o tiveram grande i m p a c t o nessa área. O u t r a s formas
<c
de interface do usuário i n c l u e m (1) teclados, (2) leitores de c
</5
código de barras e, (3) possivelmente, u m a impressora. E m
alguns dispositivos, o vídeo é o ú n i c o m e i o de mostrar o resul-
tado, e em outros ele pode integrar u m a tela de t o q u e que é Figura 12-2 Diagrama moscranda os principais tipos da tecnologia
usada para c o n t r o l a r o dispositivo. de sensores usados em inscrumemos de P O C T .

Sistemas de Identificação de Código de Barras

M u i t o s dispositivos de P O C T i n t e g r a m sistemas de leitura de
código de barras c o m vários objetivos; d e n t r e eles (1) i d e n t i f i c a r
o pacote de testes do sistema, (2) integrar os dados da calibração
de fábrica e {3), e m alguns casos, p r o g r a m a r o i n s t r u m e n t o para
processar u m teste e m p a r t i c u l a r o u g r u p o de testes. A l g u n s
dispositivos de P O C T usam fitas magnéticas c o m o m e i o para
armazenar i n f o r m a ç ã o similar, c o m o dados de calibração especí-
ficos de lote. O u t t a função de i m p o r t â n c i a crescente em u m
leitor de código de barras é i d e n t i f i c a r t a n t o o o p e r a d o r q u a n t o
a amostra do paciente n o sistema. Isso p e r m i t e rastreaT a pessoa
que realizou o teste e associar os resultados ao paciente certo.
Distribuição de Amostra
O acesso e a d i s t r i b u i ç ã o da amostra n o c o m p o n e n t e da tira,
cassete o u cartucho t a m b é m são interações i m p o r t a n t e s do
usuário c o m o dispositivo e, em alguns casos, a remoção da
amostra t a m b é m p o d e precisar da intervenção d o usuário. D e
f o r m a ideal, após a adição da amostra, não deve haver necessi-
dade de interação a d i c i o n a l p o r parte do operador. 1
Célula de Reação
A configuração do local o n d e a reação analítica ocorre varia de
u m a simples a l m o f a d a porosa a u m a célula o u superfície de u m a
câmara. C o n t u d o , para s i m p l i f i c a r a interface do usuário, é
quase sempre necessário c o n f i g u r a r a c o m p l e x i d a d e da câmara
de reação. Os avanços e m sistema f l u í d i c o e em técnicas de
fabricação são f u n d a m e n t a i s para o desenvolvimento de dispo-
sitivos de P O C T . 5
Sensores
M u i t o d o foco sobre os dispositivos de P O C T t e m a ver c o m o
avanço n o desenho de sensores. 13 V á r i o s desenhos de sensores
são ilustrados na Figura 12-2. O quimiossensor m o s t r a d o na
p r i m e i r a c o l u n a da Figura 12-2 é u m exemplo o n d e o analito
t e m u m a p r o p r i e d a d e intrínseca, c o m o a fluorescência, que pos-
sibilita sua detecção sem u m elemento de r e c o n h e c i m e n t o . O
quimiossensor m o s t r a d o na segunda c o l u n a é u m desenho
m u i t o mais c o m u m e é usado e m m u i t o s dispositivos de P O C T .
O elemento de transdução pode ser u m i n d i c a d o r q u í m i c o o u
196 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas

molécula de ligação que reconhece o analito a ser medido e
produz u m sinal normalmente elétrico ou óptico. U m biossensor
é mostrado na terceira coluna e se distingue de u m quimiossen-
sor por ter u m componente biológico ou bioquímico como ele-
mento de reconhecimento. As enzimas são os elementos biológi-
cos usados mais comuns, seguidas por anticorpos; a transdução
normalmente é feita via sinal óptico ou elétrico.
Sistemas de Controle e Comunicação
Mesmo no menor dispositivo há u m subsistema que coordena
todos os outros sistemas, garantindo que todos os processos neces-
sários para a realização de uma análise ocorram na ordem correta.
As operações que exigem controle incluem (1) inserção ou
remoção de tira, cartucho ou cassete; (2) controle de temperatura;
(3) injeção ou aspiração de amostra; (4) detecção de amostra; (5)
mistura; (6) cronometragem do processo de detecção e (7) remoção
de resíduos. O movimento do f l u i d o é quase sempre obtido por
meio mecânico através de bombas ou centrifugação, e por meio
das propriedades fluídicas, como a tensão superficial que, com
freqüência, é u m elemento crítico no desenho de testes simples
com tiras e de sistemas microfabricados. 5
Gerenciamento e Armazenamento de Dados
O gerenciamento de dados i n c l u i os dados da curva de calibra-
ção, dos limites de controle de qualidade (QC) e dos resultados
dos pacientes, E m alguns sistemas a transferência e o gerencia-
mento de dados ocorrem quando o medidor ou leitor está conec-
tado a u m pequeno dispositivo de bancada denominado estação
de ancoração (iocking station). Esses e outros dispositivos incluem
protocolos de comunicação que permitem a transferência de
dados para outros sistemas de gerenciamento/
Fabricação de Dispositivos de POCT
C o m o muitos métodos de P O C T são usados apenas uma vez e
depois descartados, a capacidade de reprodução de fábrica é uma
exigência importante para que o desempenho consistente alcance
uma grande quantidade de dispositivos ou tiras O processo de
fabricação inclui etapas executadas para garantir a reprodutibili-
dade dos dispositivos e para que estes permaneçam estáveis durante
o transporte e o armazenamento pelo tempo determinado.
Bastões de Imersão. Bastões de imersão são dispositivos com
almofada única, relativamente simples na construção, compostos
p o r uma almofada de material p o r o s o , como celulose, que pri-
meiro é impregnada com reagente e depois seca.16
Bastões Complexos. As almofadas mais complexas são compos-
tas por várias camadas, a mais importante delas é uma membrana
semipermeável que evita que as células vermelhas entrem na
matriz. C o m esses dispositivos, u m fator crítico para o operador
é a necessidade de cobrir toda a almofada com a amostra. A l é m
disso, como as reações muitas vezes não têm u m acompanha-
mento até sua conclusão, é necessário cronometrar o tempo entre
a aplicação da amostra na almofada e a comparação da cor resul-
tante com u m quadro de cores. O desenvolvimento desses dispo-
sitivos de haste única inclui a colocação de duas almofadas. Eles
são usados para mensuração de (1) concentrações diferentes de
u m mesmo analitoj como hemoglobina e glicose;10,16 (2) albumina
e creatinina (semiquantitativa) para obter uma razão albumina-
creatinina; 10 e (3) até 10 analitos diferentes de urina usando
tecnologia de reflexão da luz.10 U m dispositivo cromatográfico
também f o i desenvolvido para mensuração quancitativa de coles-
terol, que não requer o uso de n e n h u m instrumento. 1 0 A Tabela
12-2 lista alguns desses testes realizados por hastes de imersão
únicas ou múltiplas e a química usada para análise.
Tiras Immunostríps. São sensores biológicos nos quais o agente
de reconhecimento é u m anticorpo que se liga ao analito. A
detecção do evento de ligação ou o transdutor de sinal é normal-
mente por u m mecanismo óptico, espectrofotometria de reflexão
da luz ou fluorescência. Os imunossensores geralmente usam
tecnologias de fase sólida junto com (1) flow-through, (2) fluxo-
lateral ou (3) processos de imunocromatografia. N o formato de
fluxo-através, uma imunoanálise heterogenia ocorre em uma
célula de matriz porosa que age como a fase sólida. N o fluxo-
lateralj o estágio de separação ocorre à medida que a amostra
passa ao longo da matriz porosa.
TABELA 12-2 E x e m p l o s de Testes c o m H a s t e Ú n i c a
ou Múltipla

Teste Amostra Química

Exemplos de Dispositivos de POCT
Os dispositivos de P O C T são classificados como m vitro, in vivo, Acetominofeno Sangue lotai Acil desidrogenase
ex vivo ou minimamente invasivo. Alanina aminotransferase Sangue total Alamina/glutamato
Albumina Sangue total, urina Ligação por tintura
Colesterol Sangue total Colesterol oxidase
Dispositivos In Vitro
Creaíinina Sangue total, urina Impregnação de cobre
A diversidade da tecnologia de P O C T e a variedade de analitos
Glicose Sangue total Glicose oxidase
dificultam a concepção de uma classificaçao simples que evite
Lactato Sangue total Lactato desidrogenase
qualquer superposição entre as várias tecnologias. Para identificar
Acido úrico Sangue total Uricase
as tecnologias decisivas ou novas de POCT, a discussão a seguir
Álcool Urina Álcool desidrogenase
classifica os dispositivos de acordo com o tamanho e a comple- Bilirrubina Urina 2,4-dicloroanilina
xidade; (1) cartucho e / o u testes com tiras de uso único, (2) car- Hemoglobina Urina Atividade da peroxidase
tucho quantitativo e / o u testes com tiras de uso único e disposi- Leucócito-este rase Urina Hidrólise de aminoéster
tivo de monitoração e (3) cartuchos e sistemas de bancada de uso de pirrol
múltiplo. Cetonas Urina Reação de nitroprussido
de sódio
Cartucho ou Tira Qualitativa e/ou Dispositivos com Nitrito Urina Reação de ácido
Tira de Uso Único p-arsanílico

Muitos dispositivos se encaixam nessa categoria, incluindo (1) pH Urina Princípio de indicador

testes de urina com almofada única (bastões de imersão) que é duplo

Proteína Urina Indicadores de erros
lida de modo visual; (2) bastões mais complexos que usam refle-
protéicos
xão da luz para mensuração, e (3) cassetes ou cartuchos fabricados
Gravidade específica Urina Mudança no pH poliácido
que integram técnicas como imunocromatografia e são usados
Urobilinogênio Urina Reação de Ehrlich
como imunossensores.

h-Zona de aplicaçao
,150 jtL de sangua
t"
Imunorreação:
formação dos
complexos de ligação
Figura 12-3 Diagrama esquemático dc uma imunoanálise de fluxo lateral para troponina T. (Cortesia de
Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha.)
U m formato típico de imunoanálise é u m dispositivo de
flow-through que possui u m anticorpo covalente mente integrado
à superfície de u m a matriz porosa. Q u a n d o a amostra do paciente
é adicionada à matriz, o analito de interesse se liga ao anticorpo.
A adição de u m segundo anticorpo rotulado forma u m sanduí-
che e captura o rótulo na posição do p r i m e i r o anticorpo. 10 Se o
rótulo for de partículas de hidrossol de ouro ou de látex tingido,
o r ó t u l o será diretamente visto ou quantificado pela espectrofo-
tometria de reflexão da luz em u m leitor separado. O u t r a carac-
terística importante desse tipo de tecnologia é a integração de
u m m o n i t o r automático de qualidade que indica positivo quando
todos os reagentes foram armazenados e o dispositivo f u n c i o n o u
corretamente. Em todos esses formatos diferentes, o fluxo uni-
forme e previsível da amostra através o u ao longo da matriz
sólida é u m determinante valioso da capacidade de reprodução
dessa técnica. Logo, a escolha da matriz e de como ela interage
com a amostra é m u i t o importante, e os avanços na compreen-
são da tecnologia da fase sólida e da química da superfície
c o n t r i b u í r a m m u i t o para o desenvolvimento de imunossenso-
res.10 U m exemplo dessa tecnologia está na Figura 12-3. Neste
dispositivo a amostra de sangue é adicionada e f l u i primeiro
através de uma lã de fibra de vidro que separa o plasma do
sangue total. Simultaneamente, dois anticorpos monoclonais
anti-humanos t r o p o n i n a cardíaca T (cTnT), u m conjugado para
biotina e outro rotulado com partículas de ouro, ligados à tro-
ponina T na amostra, O complexo t r o p o n i n a / a n t i c o r p o , então,
f l u i na direção lateral ao longo da tira de teste de nitrato de
celulose, até alcançar a zona de captura, que contém estieptavi-
dina ligada a uma fase sólida. A biotma n o complexo t r o p o n i n a /
anticorpo se liga à estreptavidina e imobiliza o complexo. O
complexo então é visto como uma faixa roxa devido às partículas
de ouro colocadas em u m dos anticorpos O anticorpo rotulado
com ouro que não reagiu se move mais para baixo da tira, onde
é capnirado p o i uma zona que contém peptídio sintético com-
posto por epítopos de c T n T humana e visto como uma faixa
colorida similar, mas separada. A presença dessa segunda faixa
serve como u m indicador de qualidade importante porque
indica que a amostra f l u i u ao longo da tira de teste e que o
dispositivo f u n c i o n o u corretamente.
Testagem Laboratorial Remota CAPÍTULO 12 197
Z Í X I H <]«
X
Ligação dos Ligaçao de
complexos anticorpos marcados
com ouro
Filme de aplicaçao/fino reação -
Molécula-alvo
Reagente de captura
Revestimento óptico
Suporte óptico
Figura 1 2 - 4 Diagrama esquemático dos princípios de uma
imunoanálise óptica (OIA) usando detecção de filme fino. (Cortesia de
Inverness Medical-BioStar Inc.)
U m a abordagem alternativa usa reflexão de luz e amplifica-
ção de filmes finos nas chamadas imunoanálises ópticas. A pre-
sença de u m antigeno de doença infecciosa, como o Streptococcus
A , é detectada através da ligação a u m anticorpo que reveste a
superfície do teste. Apenas a luz refletida através do f i l m e de
anticorpo produz u m f u n d o dourado que muda para roxo
quando a espessura do filme é aumentada devido à presença de
u m antígeno (Figura 12-4). Os testes incluem controles automá-
ticos e fornecem resultados comparáveis àqueles fornecidos por
análises microbiológicas convencionais, mas bem mais rápido.
Cartucho Quantitativo de Uso Único e Testes de Tira com
Dispositivo de Monitoração
A disponibilidade de detectores pequenos e compactos é u m
resultado dos avanços na eletrônica moderna e na miniaturiza-
ção. U m a parte integral de muitos desses instrumentos é u m a
câmara com dispositivo de carga acoplado (COO), que é u m
detector de luz multicanal similar a u m tubo fotomultiplicador
198 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
em u m espectrofotômetro, mas detecta sinais bem mais baixos
em baixos níveis de luz Por exemplo, a Roche Cardiac Reader
contém u m C C D que quantifica tiras separadas de imunoanálise
de fluxo-lateral para mensuração de troponina T, mioglobina e
D - D i m e r (D-Dímero). A maioria dos dispositivos incluídos nessa
categoria é usada para medir glicose. Além disso, muitos outros
analitos de interesse clínico são medidos com tais dispositivos.
Mensuração de Glicose. Clinicamente, a P O C T é mais fre-
qüentemente usada para medir a glicose. Esses dispositivos são
biossensores porque todos eles usam a mesma enzima como
agente de reconhecimento, seja glicose oxidase (GO), hexoqui-
nase (HK) ou glicose desidrogenase ( G D H ) , com detecção foto-
métrica (reflexão da luz) ou eletroquímica.
Em geral, todas as tiras modernas de glicose são uma forma
da tecnologia denominada filme espesso na qual o filme é com-
posto por várias camadas, cada uma com uma função especifica.
Q u a n d o o sangue é adicionado à trra, tanto água quanto glicose
passam pelo filme ou camada analítica; para alguns sistemas
fotométricos, os eritrócitos devem ser excluídos. Os processos são
alcançados pelo que se chama separação de camada que contém
vários componentes, i n c l u i n d o membranas de lã de fibra de
vidro e fórmulas especiais de látex. Em sistemas fotométricos,
u m a camada espalhada é importante para a distribuição rápida
e homogênea da amostra, enquanto as tiras eletroquímicas usam
sistemas de enchimento capilar. A camada de apoio normal-
mente é u m plástico f i n o que, no caso de tiras baseadas na
reflexão da luz, também pode ter propriedades refletivas. Proprie-
dades da reflexão da luz adicional foram obtidas com a inclusão
de substâncias como óxido de titânio, bátio, sulfato e óxido de
zinco.
C o m sistemas que medem a reflexão da luz, a relação entre
esta e a concentração de glicose é desdita pela equação de
Kubelka-Munk:
onde C é a concentração do analito, K é o coeficiente de absor-
çãO) S é o coeficiente de dispersão e R é a porcentagem de refle-
xão da luz. Na prática, as tiras de glicose são produzidas em
grandes lotes e, após u m controle de qualidade rigoroso, cada
lote recebe u m código que é armazenado em uma fita magnética
do lado inferior de cada tira. Esse código descreve o desempenho
de cada lote, i n c l u i n d o a relação da calibração entre o sinal
fotométrico ou eletroquímico e a concentração de glicose. Uma
tira que não requer codificação também já foi desenvolvida.
Desde sua introdução, houve uma inovação permanente no
desenvolvimento de medidores de glicose para tornar os disposi-
Figura 12-5 Vista esquemática de
cassete de mensuração para o OPTI Sensor de Na+
Medicai Cricical Care Analízer. (Cortesia
de OPTI Medicai, Roswell, Geórgia.)
Sensor de K+
Cl, Ca++ ou
sensor de glicose
tivos menores e mais fáceis de usar com menos risco de erro,
reduzindo a interferência de outros compostos e efeitos. Esses
efeitos incluem (1) outras substâncias de redução, (2) baixa tensão
de oxigênio na amostra e (3) hematócritos em excesso. U m a etapa
imporrante nesse desenvolvimento foi o uso de ferroceno e seus
derivados como mediadores imobilizados na construção de uma
tira de glicose eletroquímica. Ela é composta por u m eletrodo de
referência A g - A g C l e u m eletrodo ativo à base de carbono,
ambos fabricados usando tecnologia de impressão de tela com o
ferroceno ou seus derivados contidos na tinta de impressão. A
amostra é colocada na janela de observação da amostra e a
camada hidrófila serve para direcionar a amostra sobre a camada
de reagente. A conversão da glicose é acompanhada pela reação
do ferroceno e pela liberação de elétrons. A introdução da tec-
nologia eletroquímica facilitou a produção de medidores menores,
tiras sem esfregaço, com menos necessidade de limpar os instru-
mentos ópticos e resultados mais rápidos. Algumas dessas carac-
terísticas estão agora disponíveis com medidores de glicose foto-
métricos.
Outras Aplicações. Vários dispositivos de P O C T com base em
imunossensores foram desenvolvidos e são capazes de medir u m
grupo de analitos, como (1) marcadores cardíacos, (2) testes de
alergia, (3) testes de fertilidade, (4) drogas de abuso. Nesses dis-
positivos, uma mistura de anticorpos é imobilizada na origem, e
anticorpos complementares para vários analitos são imobilizados
nas várias posições ao longo da tira porosa. N o caso de drogas
de abuso, os dispositivos são desenhados de forma que as respos-
tas positivas só sejam obtidas quando a concentração estiver
acima de u m valor de corte pré-calibrado 10
E m contraste com a tecnologia de filme espesso descrita
anteriormente, os sensores de uso único também foram construí-
dos usando tecnologia de filme fino, o exemplo comercial mais
c o m u m é o analisador í-STAT. Ele é u m dispositivo de mão para
gás sanguíneo que mede (1) eletrólitos, (2) glicose, (3) creatinina,
(4) certos parâmetros de coagulação, e (5) marcadores cardíacos.
Nos sensores de filme fino, os eletrodos são discos construídos
com filmes de óxido de metal f i n o usando técnica de microfabri-
cação. Os resultados são cartuchos de uso único contendo u m
arranjo de sensores eletroquímicos que opera em c o n j u n t o com
o analisador de mão. C o m o a camada do sensor é m u i t o fina, o
sangue permeia essa camada rapidamente e o cartucho do sensor
usado imediatamente após é desempacotado. Isso é u m avanço
sobre alguns sensores de filme espesso que exigem equilíbrio ou
tempo para umedecer antes de serem usados para medir amostra
de sangue.
Os dispositivos de uso único para gás sanguíneo e outras
mensurações estão disponíveis através de sensores ópticos ou
optodos (Capítulos 4 e 5). U m exemplo desse tipo de tecnologia
é mostrado na Figura 12-5. Dentre as vantagens dos sistemas
ópticos comparados com os transdutores eletroquímicos inclui-
Sensor de PC0 2
Sensor de P0 2 /tHb/S0 2
de pH
antiderrapante
para os dedos
Adaptador para amostras
de seringa (removível
para amostras capilares)

se o fato de n ã o precisarem de calibração para c o r r i g i r o desvio
d o e l e t r o d o e, p o r t a n t o , os sensores são calibrados na h o r a da
fabricação.
H á vários dispositivos de uso ú n i c o para P O C T s q u a n t i t a t i -
vas que usam desenho de cassete o u c a r t u c h o e não tiras de
fluxo-lateral. U m de tais dispositivos separa o plasma das células
vermelhas e depois o plasma reage c o m almofadas de reagentes
secos para glicose, colesterol o u triglicerídeos, m e d i n d o a absor-
vância em u m p e q u e n o focômetro. V á r i o s sistemas baseados em
cassete f o r a m desenvolvidos para mensuração da h e m o g l o b i n a .
E m u m sistema c o m o esse, a lise das células vermelhas ocorre
em u m a m i n i p r o v e t a , a h e m o g l o b i n a é convertida para metemo-
g l o b m a que é m e d i d a e m 570 n m ; a turbidez é corrigida p o r
u m a mensuração a d i c i o n a l em 8 8 0 n m .
O u t r o t i p o de desenho de c a r t u c h o usa i m u n o a n á l i s e de luz
dispersa para m e d i r h e m o g l o b i n a glicosada, j u n t o à análise foto-
m é t r i c a para h e m o g l o b i n a total. O cartucho tem u m a estrutura
relativamente complexa que c o n t é m partículas de látex revesti-
das de antígeno, a n t i c o r p o s para H b A l c e lise de reagentes que
são misturados após adição da amostra (Figura 12-6) A mensu-
ração ocorre q u a n d o o c a r t u c h o é colocado e m u m l e i t o r c o m
temperatura controlada, e o d e s e m p e n h o analítico é suficiente
para o m o n i t o r a m e n t o q u a n t i t a t i v o do c o n t r o l e glicêmico. O
t a m a n h o do dispositivo p e r m i t e que ele seja usado em clínicas
o n d e t a m b é m se]a usado para a mensuração de a l b u m i n a uriná-
ria e creatinina.
Dispositivos de P O C T para m o n i t o r a r terapia anticoagu-
lante t a m b é m f o r a m desenvolvidos para uso em clínicas o u p o r
pacientes e m casa. A n t e r i o r m e n t e , os p r i m e i r o s sistemas usavam
magnetos para detectar redução n o f l u x o da amostra o u movi-
m e n t o resultante do processo de coagulação, mas isso exigia
c r o n o m e t r a g e m cuidadosa e u m a grande amostra de sangue.
U m a tecnologia alternativa b o m b e i a u m a q u a n t i d a d e d e f i n i d a
da amostra para frente e para trás, através de u m a abertura
estreita. Sensores ópticos m o n i t o r a m a velocidade c o m que a
amostra se move e, à m e d i d a q u e o coágulo se f o r m a , a veloci-
dade d i m i n u i e, q u a n d o u m d e t e r m i n a d o nível é alcançado, o
i n s t r u m e n t o i n d i c a o t e m p o . O u t r a abordagem t a m b é m usa
m a g n e t i s m o em f o r m a de partículas paramagnéticas de ó x i d o de
Puxador (puxe
para liberar o
tampão da bandeja)
- Maçaneta para
Prendedor remover cartucho
capilar Bandeja de
solução-tampâo
Absorvente vedada com
(captura todo folha de metal
(600 |jL)
o liquido ao
final do leste) Aglutinador
Anticorpo
conjugado
1 mL de amostra
a látex
de sangue
Janela de
Oxidante leitura óptica
F i g u r a 1 2 - 6 U m diagrama esquemático de Siemens Medicai
Solutions Diagnostics D C A 2000® H b A l c immunoassay cartridge.
(Usado com permissão de Siemens Medicai Solutions Diagnostics.
D C A 2000 é uma marca registrada de Siemens Medicai Solutions
Diagnostics )
Testagem Laboratorial Remota CAPÍTULO 12 199
ferro incluídas na amostra e induzidas ao m o v i m e n t o p o r u m
campo magnético oscilante Q u a n d o u m coágulo é f o r m a d o , o
m o v i m e n t o das partículas é r e s t r i n g i d o ; isso é detectado p o r u m
sensor i n f r a v e r m e l h o e o t e m p o levado para alcançar esse estado
é u m a indicação do t e m p o de coagulação.
Tecnologia de detecção p o r g r â n u l o t a m b é m f o i usada para
m e d i r (1) t e m p o de p r o t r o m b í n a (PT), (2) t e m p o parcial de ati-
vação da t r o m b o p l a s t i n a ( A P 1 1) e (3) t e m p o de coagulação
ativada ( A C T ) . Nessa abordagem, o i n s t r u m e n t o c o n t é m u m a
f o n t e de luz i n f r a v e r m e l h a q u e d i r e c i o n a u m r a i o de luz coerente
para d e n t r o da amostra que se e n c o n t r a oscilante. O m o v i m e n t o
das células vermelhas n o sangue resulta na refração da luz para
p r o d u z i r u m a i n t e r f e r ê n c i a o u " p a d r ã o " de grânulos que é regis-
t r a d o pelo fotodetector. Esse "padrão'' m u d a q u a n d o o f l u x o
capilar reduz a velocidade à m e d i d a que a amostra coagula. O
t e m p o de o c o r r ê n c i a desse processo é a m e d i d a do t e m p o de
coagulação.
Deve-se n o t a r que os t a m a n h o s de alguns desses sistemas
baseados e m cartuchos de uso ú n i c o são comparáveis a certos
sistemas de bancada. A l é m disso, alguns dos dispositivos de uso
m ú l t i p l o possuem centrifugação onboard. O u t r o s analisadores
pequenos são usados fora do l a b o r a t ó r i o , mas precisam de cen-
trifugação p r e l i m i n a r da amostra.
Sistemas de Cartucho e de Bancada de Uso Múltiplo
M u i t o s dos dispositivos de P O C T nessa categoria são usados
para testagens essenciais e m locais c o m o (1) u n i d a d e de terapia
intensiva, (2) sala de cirurgia e (3) sala de emergência ( Q u a d r o
12-1). A l g u n s desses dispositivos usam sensores de f i l m e f i n o o u
eletrodos em tiras para m e d i r glicose, lactato e uréia usando a
mesma tecnologia descrita a n t e r i o r m e n t e , mas d i f e r e m p o r q u e
seus sensores são desenhados para serem reutilizáveis. Eles são
fabricados c o m filmes espessos de pasta e t i n t a , usando técnicas
de impressão na tela para p r o d u z i r sensores i n d i v i d u a i s o u m ú l -
tiplos. A l é m de m e d i r m e t a b ó l i t o s , esses sensores t a m b é m são
usados para m e d i r gases sanguíneos e eletrólitos. Os sensores
possuem reagentes e calibradores d e n t r o de u m ú n i c o cartucho
o u pacote, que é colocado n o c o r p o de u m analisador p o r t á t i l
para testagem essencial, de t a m a n h o p e q u e n o a m é d i o . Cada
pacote c o n t é m reagentes suficientes para m e d i r u m certo n ú m e r o
de amostras d u r a n t e u m certo t e m p o ; depois disso, ele é relati-
v a m e n t e simples de repor.
O u t r o s elementos i m p o r t a n t e s para dispositivos i n c l u e m os
sistemas de calibração de l í q u i d o s que usam u m a c o m b i n a ç ã o
de soluções de base aquosa e mensurações de c o n d u t â n c i a para
calibrar o p H e os eletrodos de P C 0 2 , c o m o oxigênio sendo
calibrado c o m u m a solução livre de oxigênio e ar d o aposenco.
A l é m disso, os pacotes c o m Q C automatizados são integrados
nesses analisadores, g a r a n t i n d o que as amostras c o m Q C sejam
analisadas e m intervalos regulares. Eles c o n t ê m pacotes ou
frascos de m a t e r i a l c o m Q C e m b u t i d o s n o i n s t r u m e n t o e testa-
dos em intervalos p r e d e t e r m i n a d o s c o m u m programa de com-
p u t a d o r onboard i n t e r p r e t a n d o os resultados e gerando mensa-
gens de alerta, caso seja necessário. Tais dispositivos t a m b é m t ê m
capacidade para ser m o n i t o r a d o r e m o t a m e n t e e p r o g r a m a d o
para responder a problemas localizados a longa distância d o
l a b o r a t ó r i o central.
I n s t r u m e n t o s de P O C T para cuidados essenciais t a m b é m
estão disponíveis para m e d i r várias espécies de h e m o g l o b i n a e
realizar determinações de C O - o x i m e t r i a . Esta ú l t i m a depende de
espectro f o t o m e t r i a de m ú l t i p l o s c o m p r i m e n t o s de onda, o n d e a
absorção de luz pelo sangue h e m o h s a d o é m e d i d a em 60 o u mais
c o m p r i m e n t o s de o n d a para d e t e r m i n a r a concentração das
200 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
cinco espécies de h e m o g l o b i n a . U m fabricante recentemente
a m p l i o u a espectrofotornetria de m ú l t i p l o s c o m p r i m e n t o s de
o n d a para m e d i r b i l i r r u b i n a d i r e t a m e n t e em sangue total.
Os dispositivos de bancada t a m b é m estão disponíveis para
realizar contagens de sangue completas (CBCs) usando princí-
pios analíticos similares àqueles usados em dispositivos baseados
e m l a b o r a t ó r i o . A l é m disso, uma tecnologia de c a r t u c h o de uso
ú n i c o está sendo desenvolvida c o m capacidade para oferecer
diferenciação t o t a l de células brancas. Mensurações de i m u n o a -
nálise agora t a m b é m estão disponíveis e m dispositivo compacto
para uso em clínicas e locais semelhantes. Tal dispositivo usa
reagentes secos e fluorescência com resolução t e m p o r a l para
detecção. Os resultados são p r o d u z i d o s em menos de 20 m i n u t o s ,
e o cardápio i n c l u i proteína C-reativa (CRP), g o n a d o t r o f i n a coriô-
nica h u m a n a ( h C G ) e marcadores cardíacos. 10
Dispositivos In Vivo, Ex Vivo ou Minimamente Invasivos
E m b o r a a m a i o r i a dos dispositivos de P O C T seja usada pata
aplicações in uitro, há u m g r u p o m e n o r classificado c o m o in vivo,
ex vivo o u m i n i m a m e n t e invasivo (Tabela 12-3). A s aplicações in
vivo o u de m o n i t o r a ç ã o c o n t í n u a são aquelas nas quais o dispo-
sitivo sensor é inserido na corrente sanguínea. D u r a n t e m u i t o s
anos essa aplicação f o i c o n f i n a d a a gases sanguíneos usando
tecnologia óptica, mas as aplicações eletroquímicas t a m b é m
f o r a m desenvolvidas t a n t o para gases q u a n t o para glicose. Os
sensores eletroquímicos t a m b é m são usados em aplicação ex vivo
para os mesmos parâmetros, a diferença está nos sensores que
são externos ao corpo, mas e m u m c i r c u i t o fechado de sangue
que deixa o c o r p o e r e t o r n a ao dispositivo sensor. A p r i n c i p a l
aplicação para os dispositivos m i n i m a m e n t e invasivos é, princi-
p a l m e n t e , a glicose, caso do dispositivo G l u c o W a t c h Biographer,
mas os dispositivos para mensuração transcutânea de b i l i r r u b i n a
agora t a m b é m estão disponíveis, embora sejam adequados apenas
para triagem.
Informática e POCT
A m a i o r i a dos dispositivos analíticos usada e m laboratórios de
análises clínicas está d i r e t a m e n t e ligada o u conectada por u m a
interface eletrônica ao sistema de i n f o r m a ç ã o d o l a b o r a t ó r i o
(LIS). Nessa progressão, m u i t a s funções de i n f o r m á t i c a diferentes
são usadas, i n c l u i n d o a transferência eletrônica de dados de u m
analisador para o LIS e depois para o registro m é d i c o e l e t r ô n i c o
d o paciente. Isso dá aos profissionais de saúde acesso r á p i d o ,
preciso e a p r o p r i a d o à i n f o r m a ç ã o e h i s t ó r i a médica d o
paciente.
Esforços consideráveis t ê m sido feitos para i n c o r p o r a r esses
processos de i n f o r m á t i c a e m dispositivos de P O C T . C o n t u d o ,
TABELA 12-3
Tipos de Tecnologia de Testagem
Laboratorial Remota Ex Vivo. In Viiro e
Não-invasiva
Tipo de Princípio
tecnologia Analítico Analitos
In vivo Fluorescência óptica pH, gases no sangue
Eletroquímica Glicose subcutânea
Ex vivo Fluorescência óptica pH, gases no sangue
Eletroquímica pH, gases no sangue,
elelrólitos, glicose
Não-invasíva EletroquímicaViontoforese Glicose transcutânea
Espectrofotornetria de Bilirrubina
múltiplos comprimentos
de arda
esses processos p r o v a r a m ser e x t r e m a m e n t e difíceis e os p r i m e i r o s
dispositivos de P O C T não possuem hardware e software que adqui-
r a m e armazenem dados e os t r a n s f i r a para u m LIS. Por isso, os
dados analíticos quase sempre n ã o e r a m capturados n o registro
m é d i c o d o paciente o u precisavam ser m a n u a l m e n t e inseridos
n o L I S c o m grande risco de erro na transcrição. Desse m o d o ,
i n f o r m a ç ã o clínica i m p o r t a n t e era perdida e testes dispendiosos
precisavam ser refeitos. Os dispositivos de P O C T mais novos
a b o r d a r a m esse p r o b l e m a i n c o r p o r a n d o o pré-requisito tamiwciTÊ
e sofware em seus desenhos, mas conectá-los aos sistemas de
gerenciamento de i n f o r m a ç ã o p r o v o u ser p r o b l e m á t i c o , pois cada
dispositivo t i n h a sua p r ó p r i a interface.
Para abordar o p r o b l e m a da falta de c o n e c t i v i d a d e em ins-
t r u m e n t o s de P O C T , u m g r u p o de mais de 30 empresas envolvi-
das na i n d ú s t r i a de P O C T c r i o u o C o n n e c t i v i t y I n d u s t r y C o n -
s o r t i u m ( C I C ) que desenvolveu u m c o n j u n t o de padrões de
c o m u n i c a ç ã o — "ligar e usar" — para P O C T . ' A adesão a esses
padrões de conectividade garante que os dispositivos de P O C T
p r e e n c h a m os requisitos essenciais do usuário, c o m o (1) bidire-
cionalidade, (2) a t r i b u t o s em c o m u m de conexão do dispositivo,
(3) operacionalidade comercial d o software, (4) segurança e (5)
Q C e / o u estai de acordo c o m o regulamento.
Descrição dos Padrões de Conectividade
Os padrões de conectividade d o C I C são simplesmente represen-
tados c o m o as duas interfaces entre os dispositivos de P O C T e
os sistemas de i n f o r m a ç ã o (Figura 12-7). O dispositivo de inter-
face passa os resultados do paciente e a i n f o r m a ç ã o sobre o Q C
entre o i n s t r u m e n t o de P O C T e os dispositivos, c o m o estações de
ancoração, concentradores, servidores de terminais e gerenciado-
res de dados d o l a b o r a t ó r i o r e m o t o . Este deve estar conectado a
vários sistemas de i n f o r m a ç ã o pela interface do registro de obser-
vação o u pela interface dos dados eletrônicos, para transmissão
de p e d i d o de i n f o r m a ç ã o e resultados de pacientes.
Benefícios da Conectividade da POCT
A t u a l m e n t e , u m dos benefícios mais i m p o r t a n t e s da conectivi-
dade é que ela facilita a caprura da P O C T do paciente e a trans-
ferência de dados relacionados c o m a qualidade em registros médicos
permanentes. A l é m disso, as inovações na área de qualidade da
P O C T t a m b é m serão assistidas, sendo capaz de conectar facil-
mente os dispositivos a redes e àqueles que são responsáveis pelo
dispositivo. V á r i o s fabricantes de dispositivos de P O C T agora
f o r n e c e m programas de c o m p u t a d o r que p e r m i t e m aos laborató-
rios centrais m o n i t o r a r seus i n s t r u m e n t o s em locais remotos. E m
c o n j u n t o c o m a t e c n o l o g i a de rede, o so/tuwre de c o n t r o l e r e m o t o
n ã o só p e r m i t e m o n i t o r a r o desempenho do dispositivo, mas
t a m b é m p e r m i t e aos responsáveis pelo i n s t r u m e n t o executar
alguns p r o c e d i m e n t o s de serviço o u mesmo desligar t o t a l m e n t e
o i n s t r u m e n t o , se necessário.
CONSIDERAÇÕES SOBRE IMPLEMENTAÇÃO
E GERENCIAMENTO
A implementação, o gerenciamento e a m a n u t e n ç ã o de u m
serviço de P O C T em u m a instituição de saúde requerem plane-
j a m e n t o necessário, supervisão e c o n t r o l e de i n v e n t á r i o e a garan-
tia de c o n f i a b i l i d a d e dos resultados via t r e i n a m e n t o a d e q u a d o e
Q C . C o n s e q ü e n t e m e n t e , vários fatores devem ser considerados
( Q u a d r o 12-4).
Estabelecimento da Necessidade
A s s i m c o m o acontece c o m a testagem l a b o r a t o r i a l em geral, a
decisão de i m p l a n t a r u m serviço de P O C T requer (1) estabeleci-
 T e s t a g e m Laboratorial R e m o t a C A P Í T U L O 1 2 2 0 1

2 Interfaces - 3 Especificações

Interface d e Interface (EDI) d e

dispositivo registro d e o b s e r v a ç ã o

Dispositiva Revisor de Receptor

observação observante

DML

L i i
1
DAP
3
w

Dispositivas, Gerenciadores de dados LIS, C D R ,

estações de d e POCT, pontos de acesso, outro CIS
ancoração concentradores

DML - dispositivo d e c a m a d a d e m e n s a g e m ORI = Interface d e registro d e o b s e r v a ç ã o

DAP = dispositivo e ponto d e a c e s s o

Figura 12-7 Diagrama esquemático das interfaces entres dispositivos de P O C T e sistemas d e informação.
( M o d i f i c a d o d e Clinicai a n d L a h o r a t o r y S t a n d a r d s I n s t i t u t e / N C C L S . Point-of-care conectivity: a p p i o v e d
S t a n d a r d C L S T ( a n t e r i o r m e n t e N C L L S , 2 0 0 6 ) . A p p r o v e d s t a n d a r d P O C T 1 - A 2 . W a y n e , PA: C l i n i c a i a n d
L a b o r a t o r y S t a n d a r d s Institute, 2001.)

QUADRO 12-4 Fatores que Precisam Ser Consideradas na QUADRO 12-5 Avaliação da Necessidade de um Serviço de
Implementação, Gerenciamento e T e s t a g e m Laboratorial R e m o t a
Manutenção do Serviço de POCT
Que testes são necessários?
Estabelecer a necessidade Qual é o TAT necessário?
Organizar e implementar uma comissão organizadora Que pergunta clínica está sendo feita quando se solicita esse teste?
Estabelecer uma política e um termo de responsabilidade para POCT Que decisão clínica tende a ser tomada ao receber o resultado?
Procurar equipamento e estimar preço Que atitude tende a ser tomada ao receber o resultado?
Treinar e certificar os operadores Que resultado deve ser esperado da atitude tomada?
Estabelecer QC, garantia de qualidade e política de auditoria Por que o laboratório não consegue oferecer o serviço exigido?
Garantir a documentação
A POCT fornecerá a precisão necessária dc resultado?
Estabelecer um modelo para acreditação e regulamentação da política de
Há pessoal disponível para realizar o teste?
POCT
Há instalações adequadas para realizar D teste e armazenar o equipamento e
reagentes?
Você aceita a política de POCT da organização?
Hã benefícios operacionais para essa estratégia de POCT?
m e n t o d a n e c e s s i d a d e , (2) c o n s i d e r a ç ã o s o b r e o s b e n e f í c i o s clí-
Há benefícios econômicos para essa estratégia de POCT?
n i c o s , o p e r a c i o n a i s e e c o n ô m i c o s e (3) a v a l i a ç ã o d o s c u s t o s e d a s
Será que uma mudança na prática será exigida para oferecer esses benefícios?
m u d a n ç a s n o processa clínico envolvido.
É possível oferecer essas mudanças na prática que podem ser exigidas?
L e r as p e r g u n t a s l i s t a d a s n o Q u a d r o 12-5 é útil p a r a e s t a b e -
lecer os r e q u e r i m e n t o s p a r a u m serviço d e P O C T . 1 2 R e s p o n d ê - l a s
a j u d a r á a i d e n t i f i c a i o t e s t e , e m si, m a s t a m b é m d e v e r á e x p l i c a r
QUADRO 12-6 Q u e s t õ e s d e Interesse Q u a n d o s e Faz u m a
poT q u e o s e r v i ç o a t u a l n ã o e s t á s u p r i n d o as n e c e s s i d a d e s d o Avaliação d o R i s c o para Considerar a
paciente o u d o médico. Implementação de um Serviço de POCT
Uma estimativa d o risco t a m b é m deve ser feita c o m o foco
principal sobre os procedimentos e processos que devem ser Solidez do serviço de POCT
realizados para garantir a manutenção de um serviço de alta Qualidade dos testes produzidos
qualidade. Questões de interesse que precisam ser abordadas Competência do operador do dispositivo
q u a n d o se faz tal e s t i m a t i v a e s t ã o listadas n o Q u a d r o 12-6. Efetividade do processo para transmissão dos resultados ao cuidador
Competência do cuidador para interpretar os resultados fornecidos

Organização e Implementação de uma Procedimentos no local para garantir que um registro preciso dos resultados

Comissão Organizadora de POCT seja mantido

Identificação das mudanças na prática que devem ser feitas para oferecer os
A o organizar e i m p l e m e n t a r u m serviço de P O C T , é i m p o r t a n t e
benefícios identificados
c o n s u l t a r t o d o s os e n v o l v i d o s n a o f e r t a d e tal serviço. Para isso
Como o pessoal será retreinado, caso seja apropriado
é bom estabelecer uma comissão organizadora. Essa comissão
Como as mudanças, na prática, serão implementadas
fica e n t ã o e n c a r r e g a d a d e g e r e n c i a r t o d o o p r o c e s s o p a i a oferecer
202 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
u m serviço de P O C T de alta qualidade. A comissão deve ser
composta por representantes daqueles que usam o serviço e por
aqueles que oferecem o serviço, j u n t o a u m representante da
equipe de gerenciamento da organização. Os usuários incluem
(1) médicos, (2) médicos assistentes, (3) enfermeiros, (4) auxiliares
de enfermagem e (5) outros cuidadores, talvez até u m paciente.
O grupo dos cuidadores deve incluir pelo menos u m represen-
tante do laboratório e daqueles envolvidos no uso de outros
equipamentos de terapia e diagnóstico próximos ao paciente.
N o r m a l m e n t e u m profissional do laboratório será o presidente
da comissão porque é o laboratório que fornecerá a alternativa
necessária se houver erro no serviço. Além disso, os profissionais
do laboratório terão treinamento e conhecimento sobre as ques-
tões analíticas que poderão surgir. Recomenda-se também que a
comissão preste contas ao médico diretor. A comissão deve desig-
nar membros que serão responsáveis pela supervisão do treina-
mento e da acreditação de todos os operadores de P O C T e
t a m b é m pelo controle e garantia de qualidade. O trabalho da
comissão deve ser orientado pela política sobre P O C T da orga-
nia«,0ü. u
Política e Responsabilidade da POCT
Implantar u m serviço de P O C T requer uma política que estabe-
leça todos os procedimentos necessários para garantir o forneci-
m e n t o de u m serviço de alta qualidade junto à responsabilidade
de todos os profissionais associados ao POCT. Essa política p o d e
ser (1) parte do sistema de controle de qualidade total da orga-
nização, (2) parte de sua política de gerenciamento e (3) necessá-
ria para propósitos de acreditação. 9 Os elementos de uma política
de P O C T estão listados no Q u a d r o 12-7.
QUADRO 12-7 Elementos da Política de Testagem
Laboratorial Remota
Catálogo de informação — tempo de revisão
Aprovado por
Distribuição original
Políticas relacionadas
Informação adicional
Substituições de política
Introdução — histórico
Definição
Acreditação de serviços
Auditoria de serviços
Serviços laboratoriais na organização — local
Logística
Política de testagem diagnostica
Gerenciamento de POCT — comissão e responsabilidade
Diretores
Membros da comissão
Termos de referência
Responsabilidades
Reuniões
Procura de equipamento e consumíveis — critérios para procura
Processo de pesquisa
Procedimentos operacionais-padrão
Treinamento e certificação de pessoal — treinamento
Certificação
Outra certificação
Controle e garantia de qualidade — procedimentos
• Documentação e revisão
Procedimentos de saúde e segurança
Bibliografia
Procura e Avaliação de Equipamento
Depois de estabelecer a necessidade, a comissão organizadora e
a política, o próximo passo no processo é procurar o equipa-
mento. Isso envolve identificar primeiro o equipamento que
tenha o pré-requisito analítico e a capacidade para cumprir as
exigências clínicas de u m serviço de POCT. C o m o discutido n o
Capítulo 13 e no protocolo de CLS1, 2 as características do desem-
p e n h o desses dispositivos são então obtidas e comparadas. Além
disso, as exigências operacionais feitas ao operador também pre-
cisam ser identificadas, e o potencial para erro do operador
determinado. Comprovação independente dessas características
analíticas e operacionais é obtida (1) do fabricante, (2) de avalia-
ções publicadas feitas por agências governamentais, e (3) relatos
em literatura revisada pelos pares. Ao revisar os dados de desem-
penho, deve ser dedicada atenção especial à precisão da mensura-
ção, incluindo a concordância entre os resultados produzidos pelo
dispositivo de P O C T e o m é t o d o laboratorial de rotina porque os
pacientes p o d e m ser tratados com o uso de ambos os sistemas
analíticos. Essa concordância pode ser difícil de avaliar e talvez
seja necessário buscar endosso de usuários atuais dos sistemas e,
possivelmente, realizar alguma forma de estudo interno.
U m a estimativa econômica d o equipamento, deve ser feita
incluindo custo de consumíveis e serviço. Provavelmente, será
um exercício comparativo entre os vários sistemas de laboratório
remoto em consideração. Qualquer comparação de custos com
o serviço de laboratório estará apenas enfatizando o custo por
teste, o que não resultará em avaliação precisa do custo-utilidade
do sistema. Porém, nesse ponto é útil ter uma boa avaliação dos
custos relativos com pessoal associados aos diferentes sistemas,
porque essas características tendem a ser fundamentais no pro-
cesso de tomada de decisão. E provável que o sistema escolhido
seja operado por pessoal que já esteja desempenhando u m a gama
de funções envolvendo o cuidado aos pacientes e, portanto, o
tempo exigido para operar o dispositivo p o d e ser crítico.
Depois que os dados de comparação foram obtidos, classifi-
cados e interpretados, o dispositivo de P O C T é selecionado.
Recomenda-se então que o profissional de laboratório faça uma
curta avaliação do equipamento para adquirir familiaridade com
o sistema. Essa avaliação ajudará a determinar o conteúdo da
rotina de treinamento que será elaborado em seguida e, caso
necessário, a identificar e solucionar os problemas. Tal avaliação
deve documentar a concordância entre os resultados gerados com
os dispositivos e aqueles fornecidos pelo laboratório. Todas essas
informações devem ser registradas em u m diário associado ao
equipamento. Além disso, a organização pode querer idealizar
algum critério de segurança, dar ao dispositivo alguma forma de
código local e registrar o código no registro do equipamento.
Treinamento e Certificação
A confiança de (1) médico, (2) cuidador e (3) paciente nos resul-
tados gerados pelo dispositivo de P O C T depende do desempe-
n h o e da solidez do i n s t r u m e n t o e da competência do operador.
Muitas das agências envolvidas na regulamentação de serviço de
saúde agora exigem que todos os profissionais associados ao
fornecimento de resultados diagnósticos demonstrem sua com-
petência por meio de processo de regulamentação, e isso se aplica
igualmente aos profissionais de P O C T . Normalmente, os profis-
sionais de saúde envolvidos com P O C T não receberam treina-
mento no uso dos dispositivos analíticos como parte da formação
profissional, mas p o d e m ter sido solicitados a operar vários ins-
trumentos complexos do equipamento.
Os elementos de u m programa de treinamento estão listados
no Q u a d r o 12-8. Na prática, tal programa é estruturado para
suprir as necessidades d o indivíduo e da organização. Ele p o d e
 Testagem Laboratorial Remota
QUADRO 12-8 Principais Elementos do Programa de
Testagem Laboratorial Remota
Entender o contexto do teste — contexto tisiopatológico
• Exigência clínica para o teste
• Atitude iomada com base no resultado
• Natureza do teste e método usado
Preparação necessária do paciente — relevância de variação diurna
• Relevância da terapia com droga
Requisição de amostra e coleta de amostra
Preparação do dispositivo analítico — máquina e/ou consumíveis
Desempenho do teste
Desempenho do controle de qualidade
Documentação do resultado do teste e do resultado do controle de qualidade
Comunicação do resultado do teste à equipe apropriada
Interpretação do resultado e das tontes do dispositivo
Questões de saúde e segurança (p. ex., descarte de amostra e dispositivo de
teste, limpeza da máquina e da área de teste)
mcluir apresentação formal a grupos ou a uma pessoa por vez,
aprendizado autodirecionado com o uso de material reconhe-
ci do, ou aprendizado com auxílio de computador. Por exemplo,
vários dos modelos atuais de gás sanguíneo e de eletrólito
possuem módulos de treinamento auxiliados por computador.
Seja qual for a estratégia de treinamento usada, é importante
documentar que o indivíduo completou satisfatoriamente o trei-
n a m e n t o e que ele foi testado e julgado competente com uma
combinação de perguntas relacionadas com a compreensão e
com demonstração prática das habilidades adquiridas. Essas
habilidades são adquiridas com a realização de testes em uma
série de materiais de Q C e com a repetição da testagem de
amostras que foram recentemente analisadas (testagem paralela).
Finalmente, o operador deve ser observado durante todo o pro-
cedimento envolvido na P O C T em pelo menos três ocasiões
A competência a longo prazo é mantida com a prática regular
das habilidades e com a continuação dos estudos. E importante
inserir essas características em qualquer programa de treina-
mento e educação. A revisão habitual do desempenho nos pro-
gramas de controle e garantia de qualidade fornecerá meios para
supervisionar a competência dos operadores. C o n t u d o , isso n e m
sempre é suficiente, especialmente q u a n d o os operadores estão
trabalhando em turnos irregulares ou não podem ser convoca-
dos para realizar u m a POCT. Nesse último caso, pode sei neces-
sário fazer arranjos específicos para que os operadores possam
realizar os testes com material de Q C . O registro de erro do
computador também p o d e alertar q u a n d o surgirem problemas.
Porém, é importante incentivar uma abordagem aberta de ava-
liação da competência para que os próprios operadores busquem
ajuda q u a n d o acharem que problemas estão ocorrendo. Tal abor-
dagem aberta deve ser apoiada com auditoria e reuniões para
rever o desempenho onde os problemas são ventilados e os
desenvolvimentos discutidos. A avaliação periódica da compe-
tência deve ser incorporada em u m programa formal paTa certi-
ficação de que será uma exigência da maioria dos programas de
acreditação. 12
Controle de Qualidade, Garantia de Qualidade
e Auditoria
Os programas de controle e garantia de qualidade fornecem u m
meio formal de monitorar a qualidade de um serviço (Capítulo
16). O programa d e Q C interno é uma visão a curto prazo e,
CAPÍTULO 1 2 203
normalmente, compara o desempenho atual àquele da última
vez em que a análise foi realizada. A garantia de qualidade
externa é u m processo a longo prazo e aborda outras questões
em t o r n o da qualidade do resultado. Essa garantia de qualidade
compara o desempenho da testagem de diferentes locais e / o u
de diferentes partes do equipamento ou métodos. 10 A auditoria
é u m a forma mais retrospectiva de análise do desempenho e,
além disso, tem u m a visão bolística de todo o processo. C o n t u d o ,
a base para garantir uma boa qualidade continua sendo u m
treinamento bem-sucedido e u m esquema de certificação.
Classicamente, o Q C interno quantitativo envolve a análise
da amostra para a qual a concentração de analito é conhecida e
a média e a variação dos resultados cotadas para o m é t o d o
usado. Há vários desafios na abordagem clássica da P O C T . As
primeiras preocupações são com a freqüência da testagem — urna
amostra de Q C deve ser analisada toda vez que (1) u m a amostra
é analisada, (2) u m novo operador usa o sistema, (3) u m novo
n ú m e r o de lote de reagentes é usado, ou (4) o sistema é cali-
brado? Não há consenso sobre a abordagem correta e o usuário,
provavelmente, deve se guiar pela reprodutibilidade e pelo
desempenho analítico geral do sistema A abordagem usada
t a m b é m é influenciada pelas circunstâncias locais, como o
n ú m e r o e a competência dos operadores, junto com a freqüência
com que o sistema é usado. Para um analisador de bancada e / o u
de multiteste, pelo menos uma amostra de Q C deve ser feita no
m í n i m o uma vez por t u r n o — três vezes por dia. Alguns analisa-
dores de cuidados essenciais são programados para realizar uma
checagem do Q C em intervalos determinados pelos responsáveis
pelo dispositivo.
Para os dispositivos de P O C T de uso único, a estratégia
descrita anteriormente não monitora completamente a quali-
dade do sistema de teste. Por exemplo, q u a n d o o material de
Q C convencional é analisado em u m sistema de P O C T de teste
ou de uso únicos, apenas aquela unidade de testagem é monito-
rada. Logo, é impossível testar todas as unidades com material
de controle porque, por definição, estes são sistemas de teste
único e não é possível analisar o material de controle e a amostra
do pacientes com a unidade única. Nessas circunstâncias, há
uma dependência maior sobre a reprodutibilidade de fábrica dos
dispositivos para garantir u m serviço de boa qualidade. U m a
n o r m a do CLSI de 2002 estabelece procedimentos de controle
de qualidade para teste de uso único sob o p o n t o de vista do
fabricante e d o usuário.''
N o caso do usuário, alguns p o d e m querer continuar com a
estratégia de testagem de Q C semelhante àquela para dispositi-
vos de multiuso; isto é, analisar pelo menos uma amostra de Q C
durante cada jornada de trabalho. Se a testagem for infreqüente,
então outra abordagem seria analisar u m a amostra de Q C
sempre que houver uma m u d a n ç a n o sistema de testagem, como
u m lote diferente de materiais para testagem ou u m operador
diferente. H á outras abordagens também, mas muitas não testam
todo o processo. Por exemplo, o uso de uma almofada de refle-
xão da luz substituta, como u m a amostra de Q C , irá testar
apenas o desempenho do medidor de reflexão da luz, mas não
testará o processo de adição de amostra etc. Do mesmo modo,
algumas formas eletrônicas de Q C interno também não testam
a técnica de amostragem, mas simplesmente a funcionalidade do
cassete e da estação de ancoração. 10
A garantia de qualidade externa ou testagem d e proficiência
é uma abordagem sistemática para monitoração do Q C na qual
amostras padronizadas são analisadas por u m ou mais laborató-
rios para determinar a capacidade de cada participante. Nessa
abordagem, o operador desconhece a concentração do analito e,
portanto, ela é considerada próxima da "situação real de testa-
204 PARTE II Instrumentação e Técnicas Analíticas
gem". Os resultados são transmitidos para uma autoridade central,
que então prepara u m relatório e envia u m a cópia para cada
laboratório participante. O relatório identificará a séiic de resul-
tados obtidos para todo o grupo de pardcipantes e poderá ser
classificado de acordo com os diferentes métodos usados pelos
participantes no esquema. O esquema pode incorporar os labora-
tórios e os usuários de P O C T , o que permite comparar os resul-
tados com os métodos baseados n o laboratório. Na prática, a
garantia de qualidade externa ou testagem de proficiência é usada
na P O C T para determinar e d o c u m e n t a r o desempenho a longo
prazo e a concordância dos resultados entre o serviço de P O C T
e o laboratório central da organização. Também é possível efetuar
u m esquema de garantia de qualidade externa dentro de u m
hospital ou estabelecimento organizacional; tal esquema normal-
m e n t e é dirigido por profissionais qualificados d o laboratório, o
que permite comparar os resultados que estão sendo relatados
pelo laboratório e por outros locais de P O C T dentro da mesma
organização. Isso é importante quando os pacientes são tratados
em vários departamentos — ou q u a n d o as máquinas quebram e
as amostras são levadas para outros locais de testagem. Q u a n d o
u m desempenho fraco é identificado em u m desses esquemas, é
importante registrar o problema e depois fornecei e registrar a
solução. C o m o parte desse exercício pode ser necessário rever
algumas anotações sobre o paciente para garantir que resultados
incorretos não tenham sido relatados e ações clínicas inapropria-
das tomadas. Além disso, se a solução destacar u m aspecto vulne-
rável do processo em geral ou de um operador em particular,
então u m processo de retremamento deverá ser instituído.
Manutenção e Controle de Inventário
O estabelecimento e a m a n u t e n ç ã o de um serviço de P O C T
exigem u m suprimento p e r m a n e n t e de dispositivos e u m pro-
grama formal para mantê-lo. Os pontos-chave nesse processo são
(1) manter as condições de armazenamento recomendadas, (2)
estar ciente do prazo de validade dos consumíveis, e (3) garantir
que os estoques sejam liberados a tempo para que qualquer pre-
paração analítica seja adequada (p. ex., descongelamento).
Q u a n d o vários locais estão u s a n d o os mesmos materiais, então
u m sistema de controle de compra, de provisão e de inventário
deve ser instaurado. Isso evitará a compra em grandes quantida-
des e que sistemas individuais sejam abastecidos por engano com
lotes diferentes de consumíveis.
A complexidade na m a n u t e n ç ã o de dispositivos reutilizáveis
varia de sistema paia sistema, mas orientações claras dos fabri-
cantes estão disponíveis e devem ser seguidas de forma rigorosa.
As questões que n o r m a l m e n t e exigem total vigilância incluem
prazo de validade, biocontaminação, segurança com eletricidade,
m a n u t e n ç ã o de instrumentos ópticos e uso inadvertido de con-
sumíveis inapropriados.
Documentação
A documentação de todos os aspectos de u m serviço de P O C T
continua sendo u m a das principais questões devido ao fato de
que o armazenamento de dados em sistemas de laboratório e
hospital é quase sempre limitado e inconsistente. Logo, é extre-
m a m e n t e importante manter, n o mínimo, u m registro pTeciso (1)
d o teste solicitado, (2) d o resultado e (3) da ação praticada.
Algumas dessas questões sobre documentação estão agora sendo
resolvidas com o advento d o registro eletrônico do paciente, da
solicitação eletrônica e de u m a melhor conectividade da instru-
mentação de P O C T com os sistemas de informação e com o
registro do paciente. A documentação deve abranger os procedi-
mentos operacionais-padrão para os sistemas de P O C T e os regis-
tros de treinamento e certificação dos operadores, além do con-
trole e da garantia de qualidade internos juntos ao sistema de
registro de erros e qualquer ação corretiva praticada.
Acreditação e Regulamentação da POCT
As características da organização e d o gerenciamento da P O C T
descritos anteriormente são iguais àquelas para a acreditação de
quaisquer serviços diagnósticos. 1 A acreditação da P O C T deve
fazer parte da acreditação geral dos serviços médicos d o labora-
tório ou mesmo parte da acreditação do serviço clínico em geral,
como acontece em muitos países, incluindo os Estados U n i d o s
e o Reino U n i d o há vários anos. Assim, as Emendas sobre Melho-
ria em Laboratório Clínico (CLIA) da legislação de 1988, nos
Estados Unidos, estipulam que todas as P O C T s devem seguir
certos padrões. 14 ' 15 Nos Estados Unidos, os Centers for Medicare
a n d Medicaid Services, o Joint Commission on Acreditation of
Healthcare Organizations e o College of American Pathologists
são responsáveis pela inspeção dos locais e cada u m compromete-
se a assegurar a conformidade com os regulamentos de testagem
para POCT. 6
REFERÊNCIAS
1. Bornett D. Accredi tation and point-of-care testing. Aim Clin Biochem
2000;37:241-3.
2. Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS Evaluation of
precísion performance of clinicai chemistry devices, 2rid ed. CLSI/
NCCLS Document EP5-A2 Wayne, PA Clinicai and Laboratory
Standards Institute, 2004
3. Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS, Point-of-care
connectivity CLSI/NCCL3 Document POCT1-A2. Wayne, PA Clinicai
and Laboratory Standards Institute, 2006.
4 Clinicai and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Quality
management for unit-use testing. CLSI/NCCLS Document
EP18-A. Wayne, PA: Clinicai and Laboratory Standards Institute,
2002.
5. Khandurina J, Guttman A Bioanalysis in microfluidlc devices.
J CliTomatoET A 2002;943' 159-83.
6. Kost GJ, ed. Principies and practice of point-of-care testmg.
Philadelphia Lippincott Williams & Wilkins, 2002:ppó54.
7. National Academy of Engiiieering and Institute of Medicine. Reid PP,
CompTon "WD, Grossman JH, Fanjiang G, eds Building a better
delivery system. Washington, DC: National Academies Press, 2005:
pp262.
8. Nichols JH, ed. NACB Laboratory medicine practice guidelines:
Evidence-based practice for point-of-caTe testing. Washington, DC:
AACC Press, 2006; 1:187. (http://www.aacc.org/AACC/rn.erabers/nacb/
LMPG)
9. Price C P Point of care resting. BMj 2001;322:1285-88
10. Price CP, St John A, Hicks JM, eds. Point-of-care testing, 2nd ed
Washington, D C AACC Press, 2004 pp488.
11 Price CP, St John A. Point-of-care testmg. In. Burtis CA, Ashwood ER,
Rruns DE, eds. Tietz textbook of clinicai chemistry and molecular
diagnostics, 4th ed. St Louis: Saunders, 2006-299-320
12. Price CP, St John A. Point-of-care testing for managers and polícymakers
Washington, DC: AACC Press, 2006 1-122.
13. Turner APF: In- Karube I, "Wilson GS, eds. Biosensors: fundamentais
and applications. Oxford: Oxford University Press, 1987:1-770.
14. US Department of Health and Human Services. Medicare, Medicaid
and CLIA progTams. regulacions implementing the Clinicai Laboratory
Improvement Amendments of 1988 (CLIA). Final rule. Federal Register
1992;57:7002-186.
15. US Department of Health and Human Services. Medicare, Medicaid
and CLIA progTams: regulations implementing the Clinicai Laboratory
Improvement Amendments of 1988 (CLIA) and Clinicai Laboratory Act
program fee collection Federal Register 1993;58:5215-37.
OPERAÇÕES LABORATORIAIS P A R T E III

CAPÍTULO 1 3

Seleção e Avaliação
Analítica de Métodos -
Por Técnicas Estatísticas
Kristian Linnet, M.D., D.M.Sc., e James C. Boyd, M.D.*

OBJETIVOS E r r o A l e a t ó r i o : EITO q u e resulta de variações imprevisíveis

1. Discutir a necessidade de método de seleção e a avaliação no con- i n f l u e n c i a d o pela q u a n t i d a d e de medidas. Esses efeitos
texto de um laboratório clínico. aleatórios originam variações em observações repetidas do
2. Definir e indicar fórmulas para o seguinte:
determinando.
E r r o Sistemático: U m c o m p o n e n t e de erro que, n o decorrer
Média
de u m a série de análises d o m e s m o d e t e r m i n a n d o ,
Mediana
p e r m a n e c e c o n s t a n t e o u varia de u m a forma previsível.
Desvio-padrão
Incerteza: U m parâmetro associado ao resultado de u m a
Coeficiente de correlação
medição que caracteriza a dispersão de valores q u e
Análise de regressão
p o d e r i a m ser razoavelmente atribuídos ao d e t e r m i n a n d o
Distribuição gaussiana
ou, mais r e s u m i d a m e n t e : a incerteza é u m p a r â m e t r o que
3. Determinar as considerações que devem ser examinadas na seleção
caracteriza o intervalo de valores d e n t r o do q u a l se espera
de um novo método analítico. q u e a q u a n t i d a d e a ser m e d i d a esteja contida.
4. Definir desempenho-padrão e metas analíticas. I n t e r v a l o de Med i ção : Intervalo fechado de valores possíveis
5. Definir o seguinte: permitidos para u m p r o c e d i m e n t o de m e d i ç ã o e delimitado
Viés pelos limites inferior e superior de determinação. Para esse
Limite de detecção intervalo, o erro total das medições está d e n t r o de limites
intervalo de medição analítica específicos d o m é t o d o . T a m b é m designado faixa de medição
Erro aleatório analítica.
Ene sistemático L i m i t e d e D e t e c ç ã o : A m e n o r q u a n t i d a d e de analito que p o d e
6. Delinear as tarefas envolvidas na avaliação de um método, incluindo ser detectada n u m a amostra, mas n ã o q u a n t i f i c a d a c o m o
medidas estatísticas que devem ser realizadas. u m valor exato. T a m b é m designado de limite inferior de
7. Construir um gráfico de diferença, dados os resultados de uma com- detecção, concentração m í n i m a detectável (ou dose o u
paração de métodos experimentais. valor).
M a t e r i a l de R e f e r ê n c i a (RM): U m material o u substância com
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES u m a o u mais propriedades suficientemente b e m
A n a l i t o : C o m p o s t o que é m e d i d o . estabelecidas a serem utilizadas n a calibração de u m
CLIA'88: U m a c r ô n i m o p a i a Clinicai Laboratary Improvement m é t o d o o u para atribuir valores a materiais.
Amendments de 1988. M a t e r i a l de R e f e r ê n c i a C e r t i f i c a d o (CRM): U m material de
D e t e r m i n a n d o : A " q u a n t i d a d e " q u e é r e a l m e n t e m e d i d a (p. referência e m que u m o u mais valores de p r o p r i e d a d e s são
ex., a concentração de analito). Por exemplo, se o analito é certificados p o r u m p r o c e d i m e n t o t e c n i c a m e n t e válido,
glicose, o d e t e r m i n a n d o é a concentração de glicose. Para a c o m p a n h a d o o u rastreável por u m certificado o u o u t r a
u m a enzima, o d e t e r m i n a n d o p o d e ser a atividade d o c u m e n t a ç ã o emitida por u m a e n t i d a d e certificadora.
enzimática ou a concentração de massa da enzima. Matriz: Todos os c o m p o n e n t e s de u m sistema de material, c o m
exceção do analito.
P r o c e d i m e n t o d e M e d i ç ã o d e R e f e r ê n c i a : P r o c e d i m e n t o de
m e d i ç ã o exaustivamente investigado e com d e m o n s t r a ç ã o
' O s autores agradecidamente reconhecem as contribuições prévias de David que fornece valores de incerteza de medição compatível
D. Koch, Theodcie Peters e Robert O. Krtngle, nas quais se baseiam partes com o objetivo de utilização, especialmente na avaliação da
deste capítulo. veracidade de outros p r o c e d i m e n t o s de medição para a
206 PARTE III O p e r a ç õ e s Laboratoriais

m e s m a q u a n t i d a d e e n a caracterização de materiais de A avaliação de m é t o d o n o l a b o r a t ó r i o clínico é f o r t e m e n t e

referência.
P r o c e d i m e n t o de Referência Primário: U m procedimento
t o t a l m e n t e c o m p r e e n d i d o , c o m elevadíssima q u a l i d a d e
analítica e o r ç a m e n t o d e incerteza total d a d o e m u n i d a d e s
SI.
Q u a n t i d a d e : A q u a n t i d a d e de substância (p. ex., a
c o n c e n t r a ç ã o d a substância).
Rastreabilidade: A propriedade do resultado de u m a medida
ou d o valor d e u m p a d r ã o s e g u n d o a q u a l esses p o d e m ser
relacionados c o m referências estabelecidas, g e r a l m e n t e
p a d i õ e s n a c i o n a i s o u i n t e r n a c i o n a i s , p o r u m a cadeia
i n i n t e r r u p t a d e c o m p a r a ç õ e s , t o d a s p o s s u i n d o incertezas
indicadas. Isto é a lcançado p e l o e s t a b e l e c i m e n t o d e u m a
cadeia de calibrações q u e leva a p a d r õ e s n a c i o n a i s o u
i n t e r n a c i o n a i s p r i m á r i o s , de m a n e i r a ideal (por coerência a
l o n g o prazo), e m u n i d a d e s d e m e d i d a s d o Système
International (SI).
S e l e c t i v i d a d e / E s p e c i f i c i d a d e : O grau e m q u e u m m é t o d o
r e s p o n d e , exclusivamente, a u m analito d e f i n i d o .
Viés: D i f e r e n ç a e n t r e a m é d i a ( e s t r i t a m e n t e a expectativa) de
r e s u l t a d o s d o teste e u m valor de referência aceito. Viés é
u m a m e d i d a d e veracidade.
i n f l u e n c i a d a p o r o r i e n t a ç õ e s (p. ex., Clinica! and Laboratory Stón-
dard Institute [CLSI; a n t e r i o r m e n t e N C C L S , www.clsi.org]) e a
International Organization for Standardization (ISO, w w w . i s o . o r g ) .
A l é m disso, atingir requisitos p a r a l i c e n c i a m e n t o d o l a b o r a t ó r i o
tornou-se u m e l e m e n t o i m p o r t a n t e n o processo d e avaliação e
seleção d e m é t o d o . Este c a p í t u l o a p r e s e n t a u m a visão geral de
c o n s i d e r a ç õ e s d o processo de seleção de m é t o d o , seguida p o r
seções s o b r e estatística básica e m é t o d o s d e avaliação e compara-
ç ã o d e m é t o d o s . U m a lista das abreviaturas utilizadas n e s t e capí-
t u l o é a p r e s e n t a d a n o Q u a d r o 13-1.
SELEÇÃO DE MÉTODO
A seleção a d e q u a d a de m é t o d o envolve consideração d a utilidade
m é d i c a , análise d e d e s e m p e n h o e critérios práticos.
Critérios Médicos
A seleção d e m é t o d o s a p r o p r i a d o s para ensaios d e l a b o r a t ó r i o
clínico é u m a parte vital na prestação d e assistência d e q u a l i d a d e
ao paciente, e avanços na assistência ao m e s m o são f r e q ü e n t e -
m e n t e baseados e m testes laboratoriais novos o u otimizados.
A averiguação da necessidade clínica para u m teste laborato-
rial é o p r i m e i r o passo para selecionar u m m é t o d o c a n d i d a t o
(Figura 13-1). Parâmetros-chave, tais c o m o o t e m p o a d e q u a d o e,
n e c e s s a r i a m e n t e , a utilidade clínica de u m ensaio, m u i t a s vezes

A
p o d e m SÊT o b t i d o s p o r discussões entre laboratoristas e m é d i c o s .
i n t r o d u ç ã o d e m é t o d o s novos ou revisados é c o m u m n o
A o i n t r o d u z i r novos ensaios de diagnóstico, estimativas confiá-
l a b o r a t ó r i o clínico (Figura 13-1) U m m é t o d o n o v o ou
veis d e s e n s i b i l i d a d e e e s p e c i f i c i d a d e clinicas d e v e m ser o b t i d a s
revisado deve ser c u i d a d o s a m e n t e s e l e c i o n a d o e o desem-
da literatura ou p o r c o n d u ç ã o d e u m e s t u d o clínico. Para a n a l í t o s
p e n h o e x a u s t i v a m e n t e avaliado n o l a b o r a t ó r i o antes de ser
estabelecidos, u m c e n á r i o c o m u m é a substituição d e u m m é t o d o
adotado na rotina. O estabelecimento de u m método novo
mais antigo e laborioso p o r u m m é t o d o n o v o e a u t o m a t i z a d o ,
t a m b é m p o d e envolver u m a avaliação de características d o anali-
q u e é mais e c o n ô m i c o p a r a utilização diária.
sador a u t o m a t i z a d o o n d e o m é t o d o será i m p l e m e n t a d o .

Critério de Desempenho Analítico

N a avaliação de características de d e s e m p e n h o de u m m é t o d o
Abordagem de introdução de novo método c a n d i d a t o , precisão, acurácia (veracidade), intervalo analítico,
limite de detecção e especificidade analítica são de i m p o r t â n c i a
Estabele- p r i m o r d i a l . A s seções sobre avaliação e c o m p a r a ç ã o d e m é t o d o s
cimento d e
necessidades neste capítulo c o n t ê m u m e s b o ç o desses conceitos e as respectivas
avaliações. O s p a r â m e t r o s de d e s e m p e n h o e s t i m a d o s para u m
m é t o d o p o d e m , e n t ã o , ser r e l a c i o n a d o s c o m as m e t a s de quali-
Seleção de
rrélado
d a d e q u e g a r a n t e m utilização m é d i c a aceitável dos r e s u l t a d o s d o s
testes (ver seção sobre M e t a s Analíticas). Sob o p o n t o de vista
p r á t i c o , a resistência d o m é t o d o d e r o t i n a é i m p o r t a n t e .
Delimilação
de meias de
Q u a n d o u m n o v o a n a l i s a d o r clínico é incluído n o processo
qualidade d e avaliaçao global, diversos p a r â m e t r o s i n s t r u m e n t a i s t a m b é m
\
r 7 >
)
A
j Avsllsçao
\ d e mélodo de mélodo
V Q U A D R O 1 3 - 1 J Abreviações

Mantiíenção Cl intervalo de confiança

Implemenlação
prevenliva CV Coeficiente de variação ( - SD/JT, onde x é a concentração)
CV% = CV x 10G%

Submissão Análise CVfl Coeficiente de variação analítica

Prálicas de canlrole
d e a mos Ira de rotina CVRB Coeficiente de variação de viés aleatório
d e qualidade
ISO International Organization for Standardization
GLR Análise de regressão dos mínimos quadrados ordinários

( Relatório d e \
resultados J
SD
SEM
SDfl
Desvio-padrão
Erro-padrão da média (= SD/VN)
Desvio-padrão analítico
Figura 13-1 Diagra ma de fluxo que ilustra o processo de SDRb Desvio-padrão de viés aleatório

introdução de u m novo m é t o d o na rotina. O diagrama destaca as xm Média

Xm„ Média ponderada
principais etapas d o m é t o d o de seleção, m é t o d o de avaliação e controle
WLR Análise de regressão ponderada dos mínimos quadrados
de qualidade.
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas
exigem avaliação, incluindo precisão de pipetagem, contamina'
ções entre tipologia e entre reagentes, imprecisão do detector, o
tempo para o primeiro resultado relatável, a estabilidade de rea-
gente n o interior do instrumentOj velocidade de transferência de
dados, freqüência média de falhas d o instrumento e de reparo.
Informações sobre esses parâmetros deverão estar disponíveis n o
manual do instrumento.
Outros Critérios
Diversas categorias de métodos candidatos p o d e m ser considera-
das. Novos métodos descritos na literatura científica p o d e m
exigir desenvolvimento "interno". Kits comerciais, por O U Í T O
lado, estão prontos para execução no laboratório, freqüente-
mente em um sistema analítico "fechado" de u m instrumento
destinado a esse fim. Ao revisar métodos potenciais, deve ser
dada atenção ao seguinte:
1. O principio do ensaio, com referências originais.
2 . 0 protocolo detalhado para efetuar o ensaio.
3. A composição de reagentes e materiais de referência, as quan-
tidades fornecidas e os requisitos para o armazenamento (p.
ex., restrições de espaço, temperatura, luz e umidade) aplicá-
veis antes e depois da abertura da embalagem original.
4 A estabilidade dos reagentes e materiais de referência (p. ex.,
a vida de prateleira).
5.Tempo do laboratorista e habilidades requeridas.
6. Possíveis riscos e precauções de segurança adequadas, de
acordo com as normas pertinentes e a legislação.
7. O tipo, a quantidade e a eliminação dos resíduos gerados.
8. Necessidades da amostra (isto é, as condições de coleta,
volume adequado, a necessidade de anticoagulantes e conser-
vantes, e condições de armazenagem necessárias).
9 . 0 intervalo de referência do método, incluindo informações
sobre a forma como foi derivado, valores típicos obtidos na
saúde e na doença, bem como a necessidade de determinação
de u m intervalo de referência para a própria instituição (ver
Capítulo 14 para obter detalhes sobre como gerar u m inter-
valo de referência).
10. Requisitos e limitações do instrumento.
11. Custo-benefício.
12. Plataformas de computador com interface para o sistema de
informática do laboratório.
13. A disponibilidade de suporte técnico, suprimentos e serviço
Outras questões devem ser consideradas. Existe espaço suficiente,
energia elétrica, refrigeração e canalização para u m novo instru-
mento? A projeção de trabalho é compatível com a capacidade
de um instrumento novo? O repertório de teste de u m novo
instrumento é suficiente? Q u a l é o m é t o d o e a freqüência de
calibração? Os recursos h u m a n o s d o laboratório são suficientes
ou será exigida formação adicional? Quais são as opções apropria-
das para os procedimentos de controle de qualidade e testes de
aptidão? Qual é o custo estimado de realização d e u m ensaio
utilizando o método proposto, incluindo os custos de calibração,
amostras para controle de qualidade e o tempo de trabalho dos
técnicos?
ESTATÍSTICA BASiCA
Nesta seção, conceitos e técnicas estatísticas fundamentais são
introduzidos no contexto de investigações analíticas típicas. Os
conceitos básicos de populações, amostras, parâmetros, estatística
e distribuições de probabilidade são definidos e ilustrados. Duas
distribuições de probabilidades importantes, a gaussiana e a t de
Student, são introduzidas e discutidas.
CAPÍTULO 13 207
„ 0,30- 30
tr
y
c
> 0.20 20
<D
"<D
ra
u 0,10
c 10
«D
rr
í»
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
GGT (U/L)
Figura 13-2 Distribuição de freqüência de valores de 100 y-
glutamiltransferase (GGT).
Distribuição de Freqüência
U m dispositivo gráfico para exibir u m grande c o n j u n t o de dados
é a distribuição de freqüência, também designada histograma. A
Figura 13-2 mostra uma distribuição de freqüência apresentando
os resultados de medidas de y-glutamiltransferase (GGT) sérica
de 100 homens, aparentemente saudáveis, com idades entre 20
e 29 anos. A distribuição de freqüência é construída mediante a
divisão da escala de medição em células de largura idêntica,
c o n t a n d o os números, n,, de valores que se situam dentro de cada
célula e desenhando u m retângulo acima de cada célula cuja área
(e altura, porque as larguras das células são todas iguais) é pro-
porcional a TI,. Neste exemplo, as células selecionadas foram 5 a
9, 10 a 14, 15 a 19, 20 a 24, 25 a 29, e assim por diante, com 60
a 64 sendo a última célula. O eixo das ordenadas da distribuição
de freqüência fornece o n ú m e r o de valores dentro de cada célula.
Q u a n d o esse n ú m e r o é dividido pelo n ú m e r o total de valores no
c o n j u n t o de dados, a freqüência relativa de cada célula é
obtida.
Muitas vezes a posição de u m valor dentro de u m a distribui-
ção de valores é clinicamente útil. A abordagem nâo-pardmétrica
pode ser utilizada para determinar diretamente o perceniil de u m
determinado objeto. Tendo classificado N objetos de acordo com
os respectivos valores, o percentil n, Percn, pode ser estimado
como o valor (N[n/100] + 0,5) das observações ordenadas. Em
caso d e valor não-inteiro, a interpolação é realizada entre valores
vizinhos.
População e Amostra
O objetivo do rrabalho analítico é obter informações e tirar
conclusões sobre u m a ou mais características de valores de popu-
lações. No exemplo da GGT, o interesse está na localização e na
amplitude de valores de G G T em uma população de homens
saudáveis, com idades entre 20 e 29 anos. Assim, u m conceito
de população é o c o n j u n t o completo de todas as observações que
poderiam ocorrer como resultado de realização de u m procedi-
m e n t o particular, sob condições específicas.
A maioria de populações de interesse em química clinica é
infinita em t a m a n h o e, por isso, é impossível de sei plenamente
estudada. Geralmente u m subgrupo de observações é retirado da
população como base para formar conclusões acerca de caracte-
rísticas da população. O grupo de observações que tenha, efeti-
vamente, sido selecionado entre a população é designado amostra.
Por exemplo, os valores 100 de G G T são uma amostra de uma
respectiva população. N o entanto, uma amostra p o d e ser utili-
zada para estudar as características da população apenas se tiver
208 PARTE III Operações Laboratoriais
sido devidamente selecionada. Por exemplo, se o investigador
estiver interessado na população de valores de G G T dentre diver-
sos lotes de materiais e de u m determinado período, a amostra
deve ser selecionada pata ser representativa desses fatores, bem
como fatores de idade, sexo e saúde. Conseqüentemente, é neces-
sária a especificação exata de população(ões) de interesse antes
de se desenvolver u m plano para a obtenção da(s) amostra(s).
Probabilidade e Distribuições de
Probabilidade
Considere novamente a distribuição de freqüência na Figura 13-2.
E m adição à localização e amplitude de valores de GGT, outras
informações úteis são facilmente extraídas dessa distribuição de
freqüência. Por exemplo, 9 6 % (96 de 100) das determinações são
menores que 55 U / L , e 91% (91 de 100) são iguais ou superiores
a 10, mas inferiores a 50 U / L . U m a vez que o intervalo de célula
é de 5 U / L nesse exemplo, afirmações como essas p o d e m ser
feitas apenas na proximidade de 5 U / L . U m a amostra maior
permitiria u m menor intervalo de células e uma afirmação mais
refinada. Para uma amostra suficientemente grande, o intervalo
de célula p o d e ser tão reduzido que a distribuição de freqüência
pode se aproximar de uma cuTva contínua e suave como aquela
mostrada na Figura 13-3. D e fato, se a amostra é suficientemente
grande, podemos considerar que essa é uma representação
próxima da verdadeira distribuição de freqüência âa população. Em
geral, a forma funcional da curva de distribuição de freqüência
de uma população de uma variável x é denotada por ffr).
A distribuição de freqüência de população nos permite fazer
afirmações sobre a probabilidade de u m valor de G G T selecio-
n a d o aleatoriamente de u m a população de h o m e n s saudáveis,
com idades entre 20 e 29 anos. Por exemplo, a probabilidade Pr(x
> JXJ de que o valor de G G T x para u m h o m e m saudável com
idade entre 20 e 29 anos, aleatoriamente selecionado, é maior
que u m valor é igual à área da distribuição de frequência da
população situada à direita de xa. Se xa = 58, então, a partir da
Figura 13-3, PrOc > 58) = 0,05. Do m e s m o modo, a probabilidade
Pr(xa < x < xb) que x seja maior que x0, mas m e n o r que xbl é igual
à área da distribuição de freqüência da população situada entre
xa e xb. Por exemplo, se xa = 9 e xh = 58, então, a partir da Figura
13-3, Pr (9 < x < 58) = 0,90. Em função de a distribuição de
freqüência de população fornecer todas as informações sobre a
probabilidade de um m e m b r o da população aleatoriamente sele-
cionado, essa é designada distribuição de probabilidade de popu-
lação. Embora a distribuição de probabilidade verdadeira n u n c a
seja conhecida na prática com exatidão, ela p o d e ser aproximada
pela observação de u m grande n ú m e r o de amostras.
0.3
jc 0,2
£ SD =
<E
D
0,1 X
u
% / . . APS
•T - f r
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
G G T (U/L)
Figura 13-3 Distribuição de freqüência de valores de
y-glutamiltransferase (GGT) na população.
Parâmetros: Medidas Descritivas de uma
População
Qualquer população de valores p o d e ser descrita pela medida das
respectivas características. U m parâmetro é uma constante que
descreve alguma característica particular de u m a população.
Embora a maioria de populações de interesse em trabalho analí-
tico seja infinita em tamanho, para as definições seguintes vamos
considerar o t a m a n h o de população finito, com t a m a n h o N,
onde N é muito amplo.
U m a importante característica de u m a população é a localiza-
ção central. O parâmetro mais c o m u m e n t e utilizado para descre-
ver a localização de uma população de valores N é a média da
população (p):
/* = I»,
N
U m parâmetro alternativo que indica a tendência central de uma
população é a mediana, que é definida como percentil 50, Percho.
Outra característica importante de uma população é a disper-
são de valores em torno da média da população. U m parâmetro
muito útil para descrever essa dispersão de uma população com
valores N é a variância da população a" (sigma ao quadrado):
çji _ $
N
O desvio-padrão da população cr, a raiz quadrada positiva da
variância da população, é um parâmetro freqüentemente utili-
zado para descrever a dispersão da população, nas mesmas uni-
dades (p. ex., mg/dL) de valores da população.
Estatística: Medidas Descritivas de Amostra
Tal como referido anteriormente, os químicos clínicos normal-
mente têm em mãos apenas u m a amostra de observações da
população de interesse. U m a estatística é u m valor calculado a
partir de observações de uma amostra para descrever u m a carac-
terística particular dessa amostra. A média de amostra ^ é a
média aritmética de uma amostra, que é u m a estimativa de p. De
m o d o igual, o desvio-padrão da amostra (SD) é uma estimativa
de p; e coeficiente de variação (CV) é a Tazão entre o SD e a
média, multiplicada por 100%. As equações utilizadas para cal-
cular x,„, SD e CV, respectivamente, são as seguintes:
1jxl
N
I 2 (iKj
IPC, —
I ~ x
,,,)* N
N-l N-l
SD
C V = — x 100%
onde, x, é uma medida individual e N é o n ú m e r o de medições
da amostra.
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Eslalíticas
0,6
— 99,72% -
0,5 — SSj/Mft» -
68,26% >
0,4
: if
: / \
0,3
g
I w
I o.
y V
p-;jG \i-.i<7 ji-c p p i cr u t2cr u+Scr
Figura 13-4 Distribuição gaussiana d e probabilidade,
1 / u - m
PU)
O^Itz 2(7'"'
Amostragem Aleatória
U m a seleção aleatória de u m a população é aquela em que cada
m e m b r o da população tem a mesma chance de ser selecionado.
U m a amostra aleatória é aquela em que cada m e m b r o da amostra
é passível de ser selecionado aleatoriamente a partir da população
de interesse. Embora grande parte da análise e interpretação
estatística dependa da suposição de u m a população fixa, a coleta
real de dados f r e q ü e n t e m e n t e não satisfaz essa suposição. Em
particular, para os dados gerados seqüencialmente, é possível que
observações adjacentes t e n d a m a ser mais semelhantes que
aquelas separadas n o tempo. U m a amostra originária de tais
observações não pode ser considerada amostra selecionada alea-
toriamente de u m a população fixa. Felizmente, com freqüência
p o d e m ser tomadas precauções na concepção de uma investiga-
ção para validar aproximadamente a amostragem aleatória.
Distribuição de Probabilidade Gaussiaria
A distribuição de probabilidade gaussiana, ilustrada na Figura
13-4, é de f u n d a m e n t a l importância em estatística por várias
razões. C o m o m e n c i o n a d o anteriormente, u m determinado
valor analítico x não costuma ser igual ao valor verdadeiro p da
amostra que está sendo medida. Em vez disso, associado a esse
valor x específico haverá u m erro de medição particular S = x - p,
que é o resultado da contribuição de muitas fontes de erro. Esses
erros de medições tendem a seguir u m a distribuição de probabi-
lidade como aquela mostrada na Figura 13-4, o n d e os erros são
simetricamente distribuídos, com os pequenos erros ocorrendo
com mais freqüência que os maiores e com valor estimado de 0.
Esse fato importante é conhecido como efeito de limite central
para distribuições de erros: se u m erro de medição £ é a soma de
várias fontes independentes de erro, £j £3,... £t, vários dos quais
são contribuintes majoritários, a distribuição de probabilidade
de erro de medição £ tenderá a ser gaussiana q u a n d o o n ú m e r o
de fontes de erro tornar-se grande.
O u t r a razão para a importância da distribuição de probabili-
dade gaussiana é que muiros dos procedimentos estatísticos
baseiam-se em u m pressuposto de distribuição gaussiana de
valores; essa abordagem é c o m u m e n t e referida como paramé-
trica. Além disso, esses procedimentos em geral não são signifi-
cantemente invalidados por partirem dessa pressuposição. Final-
mente, a grandeza da incerteza associada à estatística de amostra
p o d e ser averiguada com base n o fato de que muitas análises
CAPÍTULO 13 209
/
V = 03
\
\
\ \ ,V = 10
V
//
•7/
/
\V
tf %
Figura 13-5 Distribuição d e p r o b a b i l i d a d e t para v = 1; 10 e
estatísticas de grandes amostras apresentam distribuição de pro-
babilidade gaussiana.
A distribuição de probabilidade gaussiana é completamente
caracterizada pela média u e variância a 2 . A notação N (p,c 3 ) é
freqüentemente utilizada para a distribuição de u m a variável
gaussiana com média p e variância a 2 . Determinações de proba-
bilidade de u m a variável x que segue u m a distribuição N (p,cí2)
geralmente são realizadas considerando a variável z>
x -pi
z=
que é designada variável gaussiana padrão. A variável z tem uma
distribuição de probabilidade gaussiana com (i = 0 e o 2 = 1, ou seja,
z é N(0,1). A probabilidade de que x esteja dentro de 2 o de p [isto
é, Pr( U - p | < 2a) =] é 0,9544. A maioria dos programas de pla-
nilha pode calcular probabilidades para todos os valores de z-
Distribuição de Probabilidade t de Student
Para determinar probabilidades associadas a uma distribuição
gaussiana é necessário conhecer o desvio-padrão da população a .
Na prática, a é freqüentemente desconhecido, por isso não
podemos calcular z- N o entanto, se u m a amostra aleatória pode
ser retirada de u m a população gaussiana, podemos calcular o SD
da amostra, substituir c por SD e calcular o valor t
x- }1
t-
~SD~
Sob essas condições, a variável r tem u m a distribuição de proba-
bilidade chamada de distnkuiçáo t de Student. A distribuição t é,
na verdade, u m a família de distribuições, d e p e n d e n d o dos graus
de liberdade v,, para o desvio-padrão de amostra. Diversas distri-
buições t dessa família são mostradas na Figura 13-5. Q u a n d o o
t a m a n h o da amostra e os graus de liberdade para SD são infini-
tos, não há incerteza n o SD e, por isso, a distribuição t é idêntica
à distribuição gaussiana padrão. N o entanto, q u a n d o o t a m a n h o
da amostra é pequeno, a incerteza em SD leva a u m a u m e n t o de
dispersão da distribuição £ e extremidades mais acentuadas
q u a n d o comparadas com a distribuição gaussiana padrão, con-
forme ilustrado na Figura 13-5. A maioria dos programas de
planilhas pode calcular probabilidades para todos os valores de
1, se fornecidos os graus de liberdade para SD.
S u p o n h a que a distribuição de valores de glicose sérica de
jejum para h o m e n s saudáveis seja gaussiana e tenha u m a média
de 90 m g / d L . S u p o n h a também que a seja desconhecido e que
210 PARTE III O p e r a ç õ e s Laboratoriais
u m a amostra aleatória de 20 h o m e n s saudáveis leve a u m S D de
a m o s t r a = 10,0 m g / d L . E n t ã o , p a r a e n c o n t r a r a p r o b a b i l i d a d e de
Pr(x > 105), p r o c e d e m o s c o m o se segue:
1. ta = {*„ - p ) / S D = (105 - 9 0 ) / 1 0 = 1,5
2. Pr (t > t j = Pr (í > 1,5) = 0,08, a p r o x i m a d a m e n t e , a p a r t i r de
distribuição c o m 19 graus d e l i b e r d a d e
3. Pr(x > 105) = 0 , 0 8
A distribuição t de S t u d e n t é c o m u m e n t e utilizada e m testes de
significância, tais c o m o a c o m p a r a ç ã o das médias de amostra, ou
t e s t a n d o se u m a curva de regressão difere significativamente de 1,
Descrições desses testes p o d e m ser e n c o n t r a d a s e m livros didáticos
e n o Tietz textbaok of c l i n i c a i chemútry, 3 rd edirian, p á g i n a s 274-87.
CONCEITOS BÁSICOS RELACIONADOS COM
MÉTODOS ANALÍTICOS
Esta seção d e f i n e os conceitos básicos utilizados neste capítulo:
calibração, veracidade (acurácia), precisão, linearidade, limite de
detecção e outros.
Calibração
A f u n ç ã o calibração è a relação e n t r e o sinal d o i n s t r u m e n t o (5)
e a c o n c e n t r a ç ã o d o analito (x), o u seja,
y =f(x)
O inverso dessa f u n ç ã o , t a m b é m d e s i g n a d o f u n ç ã o de m e d i ç ã o ,
resulta n a c o n c e n t r a ç ã o a p a r t i r da resposta:
x=f\y)
Essa relação é estabelecida pela m e d i ç ã o de amostras c o m q u a n -
t i d a d e s c o n h e c i d a s (a q u a n t i d a d e ) d o analito (calibradores).
Pode-se distinguir entre soluções q u i m i c a s c o m pureza-padrão e
amostras c o m q u a n t i d a d e s c o n h e c i d a s d e analitos presentes e m
u m a m a t r i z típica a ser m e d i d a (p. ex., soro h u m a n o ) . A p r i m e i r a
situação se aplica n o r m a l m e n t e a u m p r o c e d i m e n t o d e m e d i ç ã o
d e r e f e r ê n c i a , q u e n ã o é i n f l u e n c i a d a pelos efeitos de matriz, e
o s c g u n d u caso n o r m a l m e n t e c o r r e s p o n d e a u m m é t o d o de
c a m p o que, m u i t a s vezes, é i n f l u e n c i a d o p o r c o m p o n e n t e s d e
matriz e, p o r isso, deve ser calibrado, preferivelmente, u t i l i z a n d o
a respectiva matriz. F u n ç õ e s d e calibração p o d e m ser lineares ou
n ã o e, n o caso de i m u n o e n s a i o s , m u i t a s vezes p o d e m ter u m a
f o r m a especial (p. ex., m o d e l a d o pela curva logística de q u a t r o
parâmetros). N o caso d e f u n ç õ e s d e calibração não-lineares, a
análise de regressão não-linear é aplicada para estimar a relação,
ou a t r a n s f o r m a ç ã o iogit é realizada p a r a produzir u m a f o T m a
linear. U m a a b o r d a g e m alternativa utiliza u m m o d e l o livre para
estimar u m a curva spline alisada, q u e m u i t a s vezes é realizada p a r a
i m u n o e n s a i o s . A ú n i c a exigência é q u e deve haver u m a relação
u n i f o r m e entre o sinal e a c o n c e n t r a ç ã o d o analito q u e s o b r e p õ e
o intervalo d e m e d i ç ã o analítica. C a s o contrário, há possibili-
d a d e d e o c o r r e r erros (p. ex., o efeito g a n c h o e m i m u n o e n s a i o s
não-comperitivo5) provocados p o r u m a d i m i n u i ç ã o de sinal de
resposta e m c o n c e n t r a ç õ e s m u i t o elevadas.
A precisão d o m é t o d o analítico d e p e n d e da estabilidade de
resposta d o i n s t r u m e n t o para u m a d e t e r m i n a d a q u a n t i d a d e de
analito. E m p r i n c í p i o , u m a dispersão aleatória de sinal d e u m
instrumento, em u m a determinada concentração, transforma a
dispersão e m escala de m e d i ç ã o , c o m o já d e m o n s t r a d o esquema-
t i c a m e n t e (Figura 13-6). Aspectos d e t a l h a d o s d e estatística d e
calibração são b a s t a n t e complexos, mas algumas relações de apro-
x i m a ç ã o são revisadas aqui. Se a f u n ç ã o de calibração é linear e
a imprecisão da resposta d o sinal é a m e s m a ao longo d o intervalo
de m e d i ç ã o analítica, o desvio-padrão analítico (SDA) d o m é t o d o
X
Figura 1 3 - 6 Relação entre concentração (jc) e a recosta de sinal (5)
para uma curva de calibração linear. A dispersão em resposta de sinal
(oy) é projetada no eixo i, originando a imprecisão de ensaio ( o j .
t e n d e a ser c o n s t a n t e ao longo d o intervalo de m e d i ç ã o analítica
(Figura 13-6). Se a imprecisão a u m e n t a p r o p o r c i o n a l m e n t e ao
nível de resposta d o sinal, o S D analítico d o m é t o d o t e n d e a
a u m e n t a T p r o p o r c i o n a l m e n t e ao nível de c o n c e n t r a ç ã o (*), o q u e
significa q u e a imprecisão relativa, CV, é c o n s t a n t e ao l o n g o d o
intervalo d e m e d i ç ã o analítica, s u p o n d o - s e q u e a interseção da
l i n h a d e calibração seja zero.
E m i n s t r u m e n t o s de q u í m i c a clínica m o d e r n o s e automatiza-
dos, a relação entre a c o n c e n t r a ç ã o d o analito e o sinal f r e q ü e n -
t e m e n t e é m u i t o estável e a f r e q ü ê n c i a de calibração é baixa (p.
ex., e m intervalos de alguns meses). N a análise cromatográfica
tradicional (p. ex., cromatografia líquida d e alta eficiência [HPLC]),
p o r o u t r o lado, é h a b i t u a l calibrar cada série analítica (corrida), o
q u e significa q u e a calibiação é realizada d i a r i a m e n t e .
Veracidade e Exatidão
A veracidade d e m e d i d a s é d e f i n i d a c o m o o grau d e p r o x i m i d a d e
e n t r e o valor m é d i o o b t i d o a p a r t i r de u m a g r a n d e série de resul-
tados d e m e d i d a s e u m valor verdadeiro. 5 A diferença entre o
valor m é d i o (estritamente, a expectativa m a t e m á t i c a ) e o valor
v e r d a d e i r o é o viés, q u e é expresso n u m e r i c a m e n t e e, poT isso, é
i n v e r s a m e n t e r e l a c i o n a d o c o m a veracidade. A veracidade e m si
é u m t e r m o qualitativo q u e p o d e ser expressa c o m o , p o r exemplo,
baixa, m é d i a o u alta. S o b o p o n t o de vista teórico, o valor verda-
deiro exato n ã o é obtenível, mas, ao c o n t r á r i o , u m "valor d e
referência aceitável", q u e p o d e ser d e t e r m i n a d o na prática, é
c o n s i d e r a d o o valor "verdadeiro". 5 A veracidade p o d e ser avaliada
p o r c o m p a r a ç ã o d e m e d i ç õ e s poT u m m é t o d o (de c a m p o ) deter-
m i n a d o e u m m é t o d o d e referência. Essa avaliação p o d e ser
e f e t u a d a p o r m e d i d a s paralelas d e u m c o n j u n t o de amostras d e
pacientes ou p o r m e d i ç õ e s de m a t e r i a i s d e r e f e r ê n c i a (veT rastrea-
b i l i d a d e e incerteza). A I S O i n t r o d u z i u a expressão v e r a c i d a d e
c o m o u m s u b s t i t u t o d o t e r m o "exatidão", q u e recebeu signifi-
cado ligeiramente diferente. Exatidão é o grau de p r o x i m i d a d e
entre o resultado de u m a medição e a verdadeira concentração
d o analito. A exatidão é, p o r t a n t o , i n f l u e n c i a d a p o r a m b o s , o
viés e a imprecisão e, dessa f o r m a , reflete o erro total. Exatidão,
q u e p o r si só é u m t e r m o qualitativo, é i n v e r s a m e n t e r e l a c i o n a d a
c o m a "incerteza" de m e d i ç ã o , q u e p o d e ser q u a n t i f i c a d a , c o m o
descrita a d i a n t e (Tabela 13-1).
C o m relação à veracidade, os conceitos d e recuperação, oscila-
ção e contaminação t a m b é m p o d e m ser considerados. A recupera-
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas CAPÍTULO 13 211

TABELA 13-1 ' Visão Geral dos Termos Qualitativos e TABELA 13-2 | Fatores C o r r e s p o n d e n t e s a Limites C l 95%
1
Medidas Quantitativas Relacionadas com o para um SD (o número de graus de liberdade
I D e s e m p e n h o de M é t o d o •í N - 1 )
Conceito Qualitativo Medida Quantitativa Cl 95%-
N Inferior Superior
Veracidade Wés
0 grau de concordância entre o Uma medida do erro sistemático 20 0,760 ' ,460
valor médio e o "valor 30 0,797 " ,346
verdadeiro" 40 0,819 1,283
Precisão Imprecisão (SD) 50 0,835 1,243
Repetibilidade fintramedida) Uma medida de dispersão de 60 0,848 1,217
Precisão intermediária (longo erros aleatórios 70 0,857 1,198
prazo) BO 0,865 1,183
Reprodutibilidade 30 0,872 1,171
(interlaboratorial) 100 0,878 1,161
Exatidão Erro de medição 150 0,898 1,128
0 grau de concordância entre uma Compreende influências sistemáticas 200 0,911 1,109
única medida com o "valor e aleatórias 250 0,919 1,096
verdadeiro" 300 0,926 1,087

cão é a fração ou a u m e n t o de percentual de concentração q u e é
medida em relação ao valoT adicionado. Experimentos de recu-
peração são geralmente realizados em análises de drogas. Podemos
distinguir entre recuperação de extração, o que f r e q ü e n t e m e n t e é
interpretado como a fração do composto que é obtido de u m
processo de extração, e a recuperação medida pelo procedimento
analítico inteiro, em que a adição de u m padrão interno com-
pensa as perdas do procedimento de extração. A recuperação de
quase 100% é u m a condição indispensável para u m grau de
veracidade elevado, mas isso n ã o garante resultados imparciais,
devido à possível inespecificidade contra componentes da matriz
n ã o ser detectada pelo experimento de recuperação. A oscilação
é causada por instabilidade de reagente ou desgaste de instru-
m e n t o ao longo d o tempo, de m o d o que a calibração torna-se
tendenciosa. A contaminação também deve ser próxima de zero
para garantir resultados imparciais.
2
^ T ® in Escorrida ^ intercorri da
Em estudos laboratoriais de variação analítica, são as estimativas
de imprecisão que são obtidas. Q u a n t o maior o n ú m e i o de obser-
vações, mais corretas são as estimativas. C o m u m e n t e o n ú m e r o
20 é tido como u m n ú m e r o razoável de observações (p. ex., suge-
rido pela orientação d o CLSI sobre o tema). Para estimar tanto a
imprecisão intracorrida q u a n t o a total, u m a abordagem c o m u m
é medir amostras de controle em duplicata em u m a série de cor-
ridas. Por exemplo, pode-se medir u m controle em duplicata para
mais de 20 corridas, nesse caso 20 observações estão presentes n o
que diz respeito a ambos os componentes. Pode-se notar aqui que
a dispersão de médias (xm) das duplicatas é dada como
^ MI: ^ ^ & miemorrida
A partir dos 20 c o n j u n t o s de duplicatas, p o d e m o s derivar o S D
intracorrida utilizando a fórmula de atalho:

Precisão SD2 irirrac01-rtda= Sdj2/(2 x 20)

A precisão p o d e ser definida como o grau de concordância entre
os resultados independentes de medidas obtidas sob condições
estipuladas. 5 O gra^ de precisão é n o r m a l m e n t e expresso com
base em medidas estatísticas de imprecisão, como o S D ou CV,
q u e é, então, inversamente relacionado com a precisão. Impreci-
são de medições é exclusivamente relacionada com o e r r o alea-
tório de medições e não tem qualquer relação com a veracidade
das medições.
A precisão é especificada como a seguir: 5
Repetibilidade: grau de concordância entre os resultados de medi-
ções sucessivas efetuadas nas mesmas condições (isto é, cor-
r e s p o n d e n d o à precisão intracorrida).
Reprodutibilidade: grau de concordância entre os resultados de
medições realizadas sob condições de medições variadas (p.
ex., tempo, operadores, calibradores, lotes de reagentes).
Duas especificações de reprodutibilidade são f r e q ü e n t e m e n t e
utilizadas: precisão intercorrida ou total n o laboratório, em
geral denominada precisão intermédia e precisão interlaborato-
rial (p. ex., como foi observado nos esquemas de avaliação e
qualidade externas [EQAS]) (Tabela 13-1).
O desvio-padrão total (o T ) pode ser dividido em componentes
intra e intercorridas utilizando os princípios dos componentes
de análises de variância (variância é o quadrado de SD):
onde, d, refere-se à diferença entre o c o n j u n t o i° de duplicatas.
Ao estimar SDs, o conceito graus de liberdade (df) é utilizado.
Em u m a situação simples, o n ú m e r o de graus de liberdade iguala-
se a N - 1 Para N duplicatas, o n ú m e r o de graus de liberdade é
N (2 - 1) = N. Assim, ambos os componentes de variância são
derivados dessa forma. A vantagem dessa abordagem é que a
estimativa intracorrida baseia-se em várias corridas, fazendo com
que u m a estimativa média seja obtida, em vez de apenas u m a
estimativa de u m a corrida particular, se todas as 20 observações
tiverem sido obtidas na mesma corrida. O m é t o d o descrito é u m
exemplo simples de análise de componente de variância.
N ã o há nada definitivo sobre o n ú m e r o 20 selecionado. Geral-
mente a estimativa de imprecisão melhora com o aumento do
número de observações disponíveis. Na Tabela 13-2 fatores corres-
pondentes a intervalos de confiança (CIs) de 9 5 % são dados em
função do t a m a n h o de amostra para simples estimativa de SD de
acordo com a distribuição X 2. Esses fatores fornecem orientações
sobre a validade de estimativas de SDs para precisão. Suponha que
tenhamos estimado a imprecisão de SD de 5,0 com base de N =
20 observações. Da Tabela 13-2 obtemos os percentis 2,5 e 97,5:
5,0 x0,76 c o < 5 , 0 x 1 , 4 6
212 PARTE III Operações Laboratoriais

Perfil de Precisão
A precisão g e r a l m e n t e d e p e n d e da c o n c e n t r a ç ã o d o analito a ser
c o n s i d e r a d o . A a p r e s e n t a ç ã o de precisão e m f u n ç ã o da concen-
tração d o analito é o perfil de precisão, o q u e é n o r m a l m e n t e
r e p r e s e n t a d o e m t e r m o s de S D o u C V c o m o u m a f u n ç ã o de
CV
c o n c e n t r a ç ã o d o analito (Figura 13-7, A - Q . A l g u n s exemplos
típicos p o d e m ser considerados. Primeiro, o S D p o d e ser cons-
t a n t e (isto é, i n d e p e n d e n t e da concentração), assim c o m o m u i t a s
vezes o é para analitos c o m faixa l i m i t a d a d e valores (p. ex., ele-
crólitos). Q u a n d o o S D é c o n s t a n t e , o C V varia i n v e r s a m e n t e à
c o n c e n t r a ç ã o (isto é, é alto na p a r t e inferior da faixa alta, e baixo SD
n a p o r ç ã o alta d o intervalo). Para analitos c o m faixas mais exten-
sas (p. ex., h o r m ô n i o s ) , o S D f r e q ü e n t e m e n t e a u m e n t a à m e d i d a
q u e a c o n c e n t r a ç ã o d o analito t a m b é m a u m e n t a . Se existe u m a Concentração d e analito
relação p r o p o r c i o n a l , o C V è c o n s t a n t e . Isso p o d e , f r e q ü e n t e -
m e n t e , se aplicar a u m a g r a n d e p a r t e da faixa de m e d i ç ã o analí-
tica. N a realidade, essa relação é a n t e c i p a d a p o r u m erro de
m e d i ç ã o r e s u l t a n t e da imprecisão d e v o l u m e d i s p e n s a d o . M u i t a s
vezes, existe u m a relação mais complexa. N ã o raro, o S D é rela-
tivamente c o n s t a n t e na p o r ç ã o inferior da faixa, de m a n e i r a q u e SD .'
o C V a u m e n t a n a área p r ó x i m a ao limite de detecção. E m con- B
centrações intermediárias, o C V p o d e ser r e l a t i v a m e n t e cons-
t a n t e e talvez d e c l i n e u m p o u c o e m c o n c e n t r a ç õ e s crescentes.
/
Linearidade
Linearidade refere-se à relação entre os valores m e d i d o s e espera- CV
dos d e n t r o d o intervalo d e m e d i ç ã o analítica. A linearidade p o d e
ser c o n s i d e r a d a e m relação às concentrações real ou a p a r e n t e d o
Concentração d e analilu
analito. Neste ú l t i m o caso, u m a diluição seriada d e u m a a m o s t r a
p o d e ser estudada. Isso é m u i t a s vezes realizado p o r i m u n o e n s a i o s , l
cada caso é investigado para d e t e r m i n a r se a c o n c e n t r a ç ã o m e d i d a I
l
d i m i n u i c o n f o r m e o esperado, d e acordo c o m o fator d e diluição.
l
A diluição geralmente é Tealizada c o m a matriz d e amostra apro-
priada (p. ex., soro h u m a n o individual o u agrupado). '
A avaliação da l i n e a r i d a d e p o d e ser realizada de diversas ' SD /
m a n e i r a s . U m a simples, m a s subjetiva, é avaliar v i s u a l m e n t e se a i
relação e n t r e a c o n c e n t r a ç ã o m e d i d a e e s p e r a d a é linear o u n ã o . 1 /
U m a avaliação mais f o r m a l p o d e ser realizada c o m base e m testes 1
\
estatísticos. Vários p r i n c í p i o s p o d e m ser aplicados aqui. Q u a n d o V /
m e d i ç õ e s repetidas estão disponíveis e m c a d a c o n c e n t r a ç ã o , a \ /
\ CV
variação aleatória e n t r e as m e d i ç õ e s e variação e m t o r n o de u m a
l i n h a de regressão estimada p o d e ser estatisticamente avaliada
(pelo teste F). Essa a b o r d a g e m t e m sido criticada, pois relaciona
apenas a m a g n i t u d e d o s e r r o s aleatório e sistemático, sem con- Concentração de analito
siderar os desvios absolutos d e l i n e a r i d a d e . Q u a n d o significativa
não-linearidade é e n c o n t r a d a , essa p o d e ser útil para explorar
Figura 13-7 Relações entre a concentração do analito e SD/CV. A,
O SD é constante, assim a C V varia inversamente à concentração do
alternativas não-lineares p a r a regressão linear (isto é, p o l i n ó m i o s
analito. B, A C V é constante em virtude da relação proporcional entre
d e graus mais elevados). 2
concentração e SD. C, Ilustra uma situação mista com SD constante em
O u t r a a b o r d a g e m c o m u m e n t e aplicada p a r a d e t e c t a r a não-
faixa baixa e uma relação proporcional com o restante do intervalo de
l i n e a r i d a d e é avaliar os resíduos d e u m a l i n h a d e regressão esti-
medição analítica.
m a d a e testar se os desvios positivos e negativos estão distribuídos
a l e a t o r i a m e n t e . Isso p o d e ser realizado p o r corridas teste (veja a
seção Análise de Regressão). U m a c o n s i d e r a ç ã o adicional p a r a
avaliar curvas d e diluição q u e deve ser levada e m c o n t a é se u m a as m e d i ç õ e s estão d e n t r o das tolerâncias declaradas pela impre-
l i n h a d e regressão estimada passa ou n ã o p o r zero. A l é m disso, cisão e viés d o m é t o d o . 5 N a prática, o limite s u p e r i o r é f r e q ü e n -
os testes de l i n e a r i d a d e estão relacionados c o m a avaliação de t e m e n t e d e f i n i d o p e l o limite d e l i n e a r i d a d e d e resposta d o ins-
veracidade s o b r e o intervalo de m e d i ç ã o analítica. A presença de
t r u m e n t o , e o limite i n f e r i o r c o r r e s p o n d e ao limite de quantifi-
l i n e a r i d a d e é u m a c o n d i ç ã o indispensável para u m elevado grau cação mais baixo ( L o Q - ver adiante). N o r m a l m e n t e presume-se
d e veracidade. U m a o r i e n t a ç ã o d o C L S I sugere p r o c e d i m e n t o ( s ) q u e as especificações d o m é t o d o se aplicam e m t o d a a faixa d e
de avaliação da linearidade. 2 m e d i ç ã o analítica. N o e n t a n t o , p o d e haver t a m b é m situações e m
q u e diferentes especificações sejam aplicadas aos diferentes inter-
Intervalo de Medição Analítica valos de m e d i ç ã o analítica. E preciso, a i n d a , estar c o n s c i e n t e se
U m intervalo d e m e d i ç ã o analítica ( i n t e r v a l o d e m e d i ç ã o , faixa S D ou C V é especificado d e n t r o d e certos limites d o intervalo
relatável) é o intervalo d e c o n c e n t r a ç ã o d o analito s o b r e o q u a l d e m e d i ç ã o analítica (ver perfil d e precisão).
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas CAPÍTULO 13 213

Limite de Detecção* 0,5

O l i m i t e d e d e t e c ç ã o (LoD) é c l i n i c a m e n t e i m p o r t a n t e para
m u i t o s analitos, e s p e c i a l m e n t e p a r a os h o r m ô n i o s . A p r i m e i r a
0,4 Distribuição de valores de branco
geração d e ensaios d e h o r m ô n i o s q u a s e s e m p r e a p r e s e n t a alto
L o D , t o r n a n d o os r e s u l t a d o s baixos c l i n i c a m e n t e inúteis. O hor-
LoB
m ô n i o e s t i m u l a n t e d a tiróide (TSH) é u m b o m exemplo. C o n - Distribuição de valores d e amostra
(D 0 , 3
f o r m e os m é t o d o s d e análise f o r a m s e n d o aperfeiçoados, bai-
x a n d o o L o D , baixos resultados d e T S H p u d e r a m ser distingui-
A «
5
ai / \
d o s d o limite i n f e r i o r d o i n t e r v a l o de referência, t o r n a n d o o teste g 0,2 / BhLJ
Cl
útil p a r a o d i a g n ó s t i c o de h i p e r t i r e o i d i s m o .
\
Conceitos 0,1
C o n v e n c i o n a l m e n t e , o L o D t e m sido d e f i n i d o c o m o o m e n o r
valor q u e excede, d e f o r m a significativa, as m e d i ç õ e s d o b r a n c o . Aliei
0,0
Assim, o limite foi e s t i m a d o c o m base e m m e d i ç õ e s repetidas d o 1 2 3 4
b r a n c o e relatadas c o m o a m é d i a mais 2 ou 3 S D s d e m e d i d a s Concentração observada
d o b r a n c o . Existem alguns p r o b l e m a s c o m essa a b o r d a g e m con-
vencional. 1 5 P r i m e i r o , a distribuição d o s valores d o b r a n c o fre- 0,5-
q ü e n t e m e n t e é assimétrica, t o r n a n d o a aplicação de estatística
p a r a m é t r i c a i n a d e q u a d a (Figura 13-8, A). E m s e g u n d o lugar,
m e d i ç õ e s repetidas d e u m a a m o s t r a c o m u m a c o n c e n t r a ç ã o ver- 0.4
LoB LoD
dadeira, e x a t a m e n t e igual a o limite estatístico de significância
para m e d i d a s d o b r a n c o , r e s u l t a r ã o e m u m a distribuição c o m
|0,3
5 0 % d o s valores inferiores e 5 0 % e x c e d e n d o o limite e m viTtude "O
d o erro de m e d i ç ã o aleatório (Figura 13-8, A). A p e n a s se a con- B c
c e n t r a ç ã o v e r d a d e i r a da a m o s t r a for s u p e r i o r ao limite de signi- 9
O 0,2
ficância poder-se-á ter certeza d e q u e o valor da m e d i d a excederá
o limite c o m u m a p r o b a b i l i d a d e s u p e r i o r a 5 0 % (Figura 13-8j B).
E m s e n t i d o estatístico, deve-se levar e m c o n t a n ã o apenas a pro- 0,1
b a b i l i d a d e de q u e n ã o h a j a analito p r e s e n t e q u a n d o o ensaio
detecta u m sinal ( u m erro T i p o I), mas t a m b é m a p r o b a b i l i d a d e /
- f t e t o Alfrt
d e n ã o se detectar a p r e s e n ç a d o analito q u e r e a l m e n t e está 0.0
0 2 4 6 8 10
presente (um erro T i p o II).
T e n d o u m a d i s t r i b u i ç ã o assimétrica dos valores d o b r a n c o e Concentração observada
aplicando-se u m nível d e significância (alfa, a ) d e 5 % (Figura
Figura 13-8 Perfil de distribuição de valores de branco, que é
13-8, A), o p r o c e d i m e n t o m a i s direto p a r a a estimativa d o limite
truncado em zero e a distribuição de valores de amostra. A, Quando a
d e significância é a aplicação d e u m p r i n c í p i o n ã o - p a r a m é t r i c o
concentração verdadeira da amostra se iguala ao LoB, 50% das medidas
b a s e a d o e m valores o r d e n a d o s p a r a a estimativa d o percentil 95. 12
excedem LoB. B, Em concentração verdadeira de amostra igual a LoD,
T e n d o classificado N valores d e a c o r d o c o m o t a m a n h o , o per-
(100% - P) (aqui 95%) das medidas excedem IxiB
centil 9 5 é d e t e r m i n a d o ; Perc 9 5 é o valor ( N [ 9 5 / 1 0 0 ] + 0,5) da
observação o r d e n a d a . E m caso d e valoT não-inteiro, a interpola-
ção é realizada e n t r e valores vizinhos (ver exemplo). O percentil
limite da distribuição d o b r a n c o , q u e c o r t a o p e r c e n t u a l a n a çao d e a m o s t r a é gaussiana e, n e s t e caso, o percentil 5 d a distri-
e x t r e m i d a d e s u p e r i o r da distribuição, será d e s i g n a d o a seguir b u i ç ã o p o d e ser calculado a p a r t i r da m é d i a e de S D c o m o
c o m o limite de b r a n c o (LoB):

—1,65 SDq
L o B = Perc 100-a

o n d e , xra5 e S D s são a m é d i a e o desvio-padrão de m e d i ç õ e s d e

Para resolver o nível d e erro T i p o II, h á q u e se c o n s i d e r a r a a m o s t r a , respectivamente, e 1,65 é o valor d e x q u e t e m u m a
c o n c e n t r a ç ã o m í n i m a d e a m o s t r a q u e resulta e m valores d e con- p r o b a b i l i d a d e c u m u l a t i v a d e 9 5 % (Pr[x < 1,65 SDs]) = 0,95).
c e n t r a ç ã o q u e e x c e d e m o LoB c o m u m a p r o b a b i l i d a d e específica. Globalmente, temos
Se o nível d e erro T i p o II é f i x a d o e m 5 % , 9 5 % das medições
d e v e m exceder o L o B (Figura 13-8, B). N o r m a l m e n t e a distribui-
L o D = LoB + 1,65 S D C

*Os estudantes devem estar conscientes de que a definição de LoD está em

evolução. A maioria dos laboratoristas dos Estados Unidos considera que o LoD
seja equivalente ao LoB. Em nossa opinião, a palavra "limite" é uma escolha
ruim para o "LoD", que foi definido anteriormente. O conceito descrito aqui
poderia ser mais bem designado como "menor concentração detectável de forma
confiável", mas temos dúvidas de que a sigla LCRD irá substituir LoD num
futuro próximo - os editores.
N o caso d e a distribuição d e a m o s t r a n ã o ser gaussiana, o per-
centil 5 da distribuição d e a m o s t r a p o d e r á ser e s t i m a d o n ã o
p a r a m e t r i c a m e n t e da m e s m a f o r m a q u e o LoB. N o e n t a n t o , a
estimativa p a r a m é t r i c a é mais eficaz e deve ser utilizada s e m p r e
q u e possível.
214 PARTE III Operações Laboratoriais
Características do Branco e da Amostra
A amostra de branco(s) deve ser o mais semelhante possível a
amostras normais de pacientes (p. ex., para ensaio de uma droga
pode ser soro ou plasma livre da droga, e não apenas uma
solução-tampão). Para garantir que as medições sejam represen-
tativas, a compilação de medidas de certo n ú m e r o de amostras
de branco pode ser preferível (p. ex., u m c o n j u n t o de 5 a 10 ou
mais amostras de branco de soro). Para compostos endógenos,
podem-se utilizar amostras livres do componente a ser dosado (p.
ex., precipitação com auxílio de u m anticorpo) pela degradação
enzimática ou por adsorção em carvão.
N o que diz respeito à(s) amostra(s) com baixa concentração
de analito, prefere-se u m c o n j u n t o de soros de pacientes con-
tendo o analito (p. ex., uma droga) em vez de amostra sérica única
derivada da mistura de várias amostras. Para compostos endóge-
nos, de m o d o ideal u m c o n j u n t o de amostras com faixa baixa de
concentração pode ser utilizado. U m a estimativa de SD, pode,
então, ser obtida a partir de medições repetidas do c o n j u n t o de
amostras (p. ex., 10 medidas de cada uma das 10 amostras [ver o
exemplo apresentado mais adiante neste capítulo]). As medições
devem ser realizadas em dias diferentes para que o SD reflita a
variação analítica total.
Relatórios de Resultados
Em u m laboratório o LoB p o d e ser utilizado para decidir se a
apresentação de resultados deve ser relatada aos pacientes como
"detectada" ou "não-detectada". Não detectado (isto é, um resul-
tado abaixo do LoB) significa que a concentração verdadeira é
inferior ao LoD com 100 - P por cento de garantia, o n d e p é o
nível de erro do T i p o II, que freqüentemente é fixado em 5%.
Assim, u m resultado inferior ao LoB deverá ser relatado como
"inferior ao LoD" e não como "inferior ao LoB" ou "zero". U m
resultado superior ao LoB (isto é, "detectado") significa que a
concentração verdadeira excede a zero com 100 - a por cento de
garantia (onde a é o nível de erro do Tipo I) e o resultado deveria
ser relatado como "superior a zero" ou "detectado". Resultados
iguais ou superiores ao L o Q (ver adiante) são relatados como
resultados quantitativos.
Um Exemplo de Estimativa de LoD de um Ensaio
Consideramos aqui u m ensaio h o r m o n a l hipotético, para o qual
o fabricante ou u m laboratório de pesquisa pretende estimar o
LoD, Os valores de a = P = 5% são escolhidos. Supõe-se que o
fabricante tenha disponíveis 10 amostras de pacientes o n d e o
h o r m ô n i o esteja ausente em função de doença ou supressão
farmacológica. Dez medidas de cada amostra de branco são rea-
lizadas em 10 dias diferentes para garantir que a variação total
do ensaio seja refletida. Apenas valores não-negativos são forne-
cidos pelo ensaio e 100 medições não-simétricas de branco com
relação à média são distribuídas (Figura 13-9) Assim, o LoB é
estimado não-parametricamente como o percentil 95 da distri-
buição de medição. O percentil 95 corresponde a 95,5 da obser-
vação ordenada (=100 x [95/100] + 0,5). As observações 95 a e
96" têm os valores 0,0539 e 0,0548 U / L , respectivamente. A
interpolação linear entre essas observações resulra em LoB esti-
mado de 0,0544 U / L (=0,0539 + 0,5 x [0,0548 - 0,05391).
Amostras com baixas concentrações são obtidas de pacientes.
Aqui estamos s u p o n d o que uma amostra é obtida a partir de
cada 10 pacientes e que cada amostra é ensaiada 10 vezes (Figura
13-9). U m a estimativa de mistura de SDs foi calculada 12 (neste
caso, a raiz quadrada da média das variâncias) e é igual a 0,0299
U / L . Uma estimativa do LoD é então obtida:
L o D = LoB + 1 . 6 5 S D s = 0 . 0 5 4 4 + 1 . 6 5 x 0.0299 = 0.104 U /L.
0,5
LoB LoD
0,4
Ü 0,3-
\
"o \
<03
\ /
X
/ \
0,1 /
/
0,0
0,00 0 , 0 2 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0 , 1 4 0,16 0,18
Concentração observada
Figura 13-9 Distribuições registradas de valores de 100 brancos e
100 amostras paia o exemplo de h o r m ô n i o hipotético. O LoB estimado
(= percentil 95 de distribuição de valores de branco) e o LoD estimado
estão indicados. Os SDs foram obtidos a partir da distribuiçfio de
valores de amostra (na verdade, como uma estimativa de mistura de 10
medidas, que aqui estão combinadas).
Sensibilidade Analítica
O limite de detecção de u m método não deve ser c o n f u n d i d o
com a suposta sensibilidade analítica. Sensibilidade analítica é a
capacidade de u m método analítico avaliar as pequenas variações
de concentração do analito. Isso é muitas vezes expresso, como
a inclinação da curva de calibração. 5 N o entanto, além da incli-
nação da função de calibração, a variação aleatória da função de
calibração também deve ser considerada. Na verdade, a sensibili-
dade analítica depende da relação entre o SD da função de cali-
bração e o declínio. C o m o mencionado anteriormente, quanto
m e n o r a variação aleatória de resposta do instrumento e mais
intensa a inclinação, maior a capacidade de distinguir pequenas
diferenças entre as concentrações do analito. Na realidade, a sen-
sibilidade analítica depende da precisão do método.
Limite de Quantificação
A incerteza relativa de medições em ou apenas que excedam o
L o D pode ser grande e muitas vezes u m resultado quantitativo
n ã o é relatado. O limite inferior para a comunicação de resultados
quantitativos, o LoQ, refere-se ao erro total a ser considerado
aceitável para u m ensaio. A partir de u m perfil de precisão para
a análise e uma avaliação de viés na faixa baixa, L o Q p o d e ser
determinado em relação às especificações do método. Por exemplo,
u m laboratório pode especificar que o erro total (p. ex., expresso
aqui com viés + 2 SD) de u m ensaio é inferior a 4 5 % (correspon-
d e n d o a u m viés de 15% e u m C V de 15%) da concentração de
medição. Neste caso o L o Q é o m e n o r valor de ensaio o n d e essa
especificação é cumprida. L o Q constitui o limite inferior da faixa
atribuível a resultados de u m ensaio quantitativo.
Especificidade Analítica e de Interferência
A especificidade analítica é a capacidade de u m procedimento
determinar, exclusivamente, a concentração de u m analito alvo
na presença de substâncias ou fatores potencialmente interferen-
tes na matriz da amostra (p. ex., hiperlipemia, hemólise, bilirru-
bina, anticoagulantes, anticorpos e produtos de degradação). Por
exemplo, n o contexto de ensaio de uma droga, a especificidade
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas
TABELA 13-3 Hierarquia de P r o c e d i m e n t o para Estabelecer
Especificações de Qualidade Analítica para
M é t o d o s Laboratoriais
I Avaliação do efeito de desempenho analítico sabre resultados clínicos
em cenários clínicos específicos
II Avaliação do efeito de desempenho analítico sobre decisões clínicas
em geral:
A. Dados baseados em componentes com variação biológica
B. Dados baseados em análise de opiniões de médicos
III Recomendações profissionais publicadas:
A. De corpos de especialistas nacionais e internacionais
B. De grupos de especialistas locais ou individuais
IV Metas de desempenho estabelecidas por:
A. Organismos reguladores (p. ex., CLIA)
B, Organizadores de esquemas EQA
V Metas baseadas no estado real da arte:
A. Dados de EGA/esquema de testes de aptidão
B. Dados de publicações recentes sobre a metodologia
é de relevância em relação a metabólitos da droga. A interferên-
cia de hiperlipemia, hemólise e biliirubina geralmente é depen-
dente da concentração e pode ser quantificada como u m a f u n ç ã o
da concentração de compostos interferentes. C o m relação aos
imunoensaios, a interferência de proteínas (geralmente anticor-
pos heterofílicos) deve ser reconhecida.
METAS ANALÍTICAS
O estabelecimento de metas para a qualidade analítica pode ser
baseado em vários princípios. Em u m a conferência sobre o
assunto, foi sugerida u m a hierarquia consensual 1 4 (Tabela 13-3).
O nível superior da hierarquia especifica metas com base em
resultados clínicos de determinações clínicas específicas, que é
u m princípio lógico.
N o entanto, metas analíticas relacionadas com a variação
biológica têm atraído considerável interesse. 7 Inicialmente, a
imprecisão era o foco e foi sugerido que o SD analítico (CTA)
deveria ser inferior a metade da variação biológica intra-indivi-
dual, o intra . B . A justificativa para essa relação á o princípio de
adição de variâncias. Se u m material estiver sendo submetido à
monitoração de u m analito, a variação aleatória de medição para
medição consiste em ambos os componentes de variação bioló-
gica e analítica. O SD total para a variação aleatória d u r a n t e a
monitoração é d e t e r m i n a d o pela relação
1 _2 . 2
° T = & tnrra-B ^ A
o n d e o c o m p o n e n t e biológico inclui a variação pré-analítica. Se
CA é igual ou inferior à metade do valor de o iri[ra , Bj a T apenas
excede a intia , B p o r menos de 12%. Assittij se essa relação se man-
tiver verdadeira, a imprecisão analítica apenas acrescentará ruído
aleatório limitado em u m a situação de a c o m p a n h a m e n t o .
Além de imprecisão, metas para viés t a m b é m devem ser con-
sideradas. O viés admissível p o d e ser relacionado com a largura
do intervalo de referência, que é determinado pela combinação
de variações biológicas intra e intermateriais, em adição à varia-
ção analítica. C o m base em considerações relativas à porcenta-
gem incluída em u m intervalo na presença de viés analítico, foi
sugerido que
Viés < 0,25 (a 2 i n m . f i + a2intE1,B),0.5
, ao procedimento sugerido, deve-se estar consciente das limitações
onde, üínt€r,B é o componente S D biológico intermateriais.
CAPÍTULO 13 215
Outros princípios amplamente utilizados consistem em rela-
cionar metas a limites fixados pelas entidades reguladoras (p. ex.,
Clinicai LaboTatary Improvimenis Avaenàments [ C L I A '88]), o u enti-
dades profissionais (p. ex., a meta de tendência de 3 % para o
colesterol sérico [originalmente definido 5%]) estabelecidas pelo
The National Cholesterol Educarion Program. A Tabela 13-4 fornece
u m a visão geral de metas para alguns analitos importantes. As
metas são dadas em unidades de concentração que utilizam níveis
de decisão ou concentrações críticas 0 0 , (p- ex., limites de refe-
rência ou intervalos terapêuticos). Foi sugerido que o C V analí-
tico de u m método não deve exceder u m quarto dos limites de
CLIA, a fim de incluir a possibilidade de d e s e m p e n h o instável
do método e a utilização de procedimentos de controle de qua-
lidade eficaz em termos de custos.
Métodos Qualitativos
Métodos qualitativoSj que atualmente estão g a n h a n d o cada vez
mais utilidade na forma de teste laboratorial remoto (POCT), são
concebidos para distinguir entre resultados abaixo ou acima de
u m valor de corte pTedefinido. Observe que o p o n t o de corte
não deve ser c o n f u n d i d o c o m o limite de detecção. Esses testes
são avaliados, principalmente, com base na capacidade de classi-
ficar corretamente os resultados c o m relação ao valor de corte.
A probabilidade de classificar u m resultado como positivo
(superior ao valor de corte), n o caso em que o valor verdadeiro
ultrapasse o valor de corte, é designada como sensibilidade
clínica. Classificar u m resultado como negativo (abaixo d o valor
de corte), n o caso de o valor verdadeiro ser inferior ao valor de
corte, recebe o n o m e de especificidade clínica. Determinações da
sensibilidade e especificidade clínicas baseiam-se na comparação
de resultados do ensaio c o m u m padrão-ouro. O padrão-ouro
pode ser u m teste i n d e p e n d e n t e q u e mede o mesmo analito, mas
t a m b é m pode ser u m diagnóstico clínico determinado por
métodos clínicos definitivos (p. ex., testes radiográficos, continua-
ção ou análise de resultados). A sensibilidade e a especificidade
clínicas p o d e m ser dadas c o m o u m a fração ou como u m a por-
centagem após multiplicação por 100. Erros-padrão de estimati-
vas são obtidos a partir de distribuição binomial.
U m a abordagem para a determinação de desempenho regis-
trado de teste, em termos de sensibilidade e especificidade clíni-
cas, é determinar a concentração verdadeira d o analito utilizando
u m método de referência i n d e p e n d e n t e . Q u a n t o mais próxima
estiver a concentração d o p o n t o de corte, maiores freqüências de
erro serão esperadas. N a verdade, o p o n t o de corte é definido de
tal forma que para as amostras com concentração verdadeira,
exatamente igual ao p o n t o d e corte, 5 0 % dos resultados serão
positivos e 5 0 % serão negativos. As concentrações acima e abaixo
d o ponto de corte em que resultados repetidos são 9 5 % positivos
ou 9 5 % negativos, respectivamente, foi designado o "intervalo
95%" para o p o n t o de corte para aquele método (observe que
este não é u m Cl; Figura 13-10).4 Assim, em u m a avaliação qua-
litativa de u m teste, é importante especificar a composição de
amostras em detalhes. D e acordo com orientação recente do
CLSI sobre o tema, recomenda-se preparar amostras com u m a
concentração igual à concentração do ponto de corte e com
concentrações 2 0 % abaixo e acima d o ponto. 4 Vinte réplicas de
medidas são então realizadas em cada concentração e as porcen-
tagens de resultados positivos e negativos são registradas. C o m
base nessas medidas, pode-se avaliar se o "intervalo 9 5 % " para o
p o n t o de corte está dentro o u fora desse intervalo. C o m relação
associadas a medições repetidas de misturas de amostra. As medi-
ções individuais de amostras de pacientes c o m concentrações
216 PARTE III O p e r a ç õ e s Laboratoriais

TABELA 13-4 Metas Analíticas

METAS-LIMITE
D E S S E M FENHO M E T A S DE PRECISÃO FIXADAS ( E R R O M Á X I M O
ACEITÁVEL, ( S D MÁXIMO] TOTAL)
Analito Nível de DeGisão, xc CLIA'86 xB versus CL1A/4 Fraser4 CLIA ' 8 8

ROTINA QUÍMICA
Alanina aminotransfnrase 1 5 0 U/L 20% 2.5 6,1 10
Albumina 3,5 g/dL 10% 0,09 0,06 0,35
Fosfatase alcalina 150 Ü/L 30% 11 4,8 45
Amilase 100 U/L 30% 7,5 4,8 30
Aspartato aminotransferaso 1 30 U/L 20% 1,5 1,8 6,0
Bicarbonato 20 m m o l / L 0,46*
30 mmol/L 0,69*
Biliirubína, total 1 1,0 mg/dL 0,4 0,10 0,13 0,40
20 mg/dL 20% 1,0 2,6 4,0
Gás do sangue, PC02 35 m m Hg 5 m m Hg 1,3 0,84 5,0
50 m m Hg 5 m m Hg 1,3 1,2 5,0
Gás do sangue, PQ2 3 0 m m Hg 3 SD s 0,75 SD 5 3 SD 5
BO m m Hg 3 SD 0,75 SD 3 SD
195 m m Hg 3 SD 0,75 SD 3 SD
Gás do sangue, pH 7,35 0,04 0,01 0,01" 0,04
7,45 0,04 0,01 0,01" 0,04
Cálcio, total 1 7,0 mg/dL 1,0 0,25 0,07 1,0
10.8 mg/dL 1,0 0,25 0,11 1,0
13,0 m g / d L 1,0 0,25 0,13 1 0
Cloreto 1 90 mmol/L 5,0% 1,1 0,54 4,5
110 mmol/L 5,0% 1,4 0,66 5,5
Colesterol, total 1 200 mg/dL 10% 5,0 6,0 20
Colesterol, lipoproteína de alta densidade 35 mg/dL 30% 2,6 1,3 10,5
65 mg/dL 30% 4,9 2,3 19,5
Creatinoquinase 1 200 L / L 30% 15 23 60
Creatinoquinase, isoenzima M B 13 pg/L 3 SD 0,75 SD 1,2 3 SD
Creatinina 1,0 mg/dL 0,30 0,08 0,02 0,30
3,0 mg/dL 15% 0,11 0,07 0,45
Glicose 1
50 m g / d L 6,0 1,5 1,7 6,0
126 mg/dL 10% 3,15 4,2 12,6
200 mg/dL 10% 5,0 6,6 20
Ferro 150 ug/dL 20% 7,5 20 30
Lactato desidrogenase 300 U/L 20% 15 13 60
Lactato desidrogenase isoenzimas 100 U/L 30% 7,5 3,8 30
Magnésio 2,0 mg/dL 25% 0,13 0,04 0,50
Fosfato, inorgânico 4,5 mg/dL 0,19
Potássio 1 3,0 mmol/L 0,50 0,13 0,07 0,50
6,0 mmol/L 0,50 0,13 0,14 0,50
Proteína, total 1 7,0 g/dL 10% 0,18 0,10 0,70
Sódio 1 130 mmol/L 4,0 1.0 0,52 4,0
150 m m o l / L 4,0 1,0 0,60 4,0
Triglicerídeos 160 mg/dL 25% 1 17 40
Nitrogênio da uréia 1 27,0 mg/dL 9% 0,6 1,7 2,4
Acido úrico 6.0 m g / d L 17% 0,25 0,26 1,02

CLJA, Clinicai Ldboratorj Improviments Admendments

*Meta calculada a partir da metade da variação biológica intra-índividual, dados fornecidos par Fraser na ref. 7 ou como demarcado.
'Jvíêtodo de Referência/matenal credenciado pelo blauonal Referente System for Clinicai Laboratories
*Fraser CG. Bioiogicai variation m clinicai chemhtry An updãte- Coliated data, 1988-1991. Arch Paüuil Lab Med 1992; 116.916 23
s
Limites dos SDs sãa Wseddos em dados de. um grupo tle esjbeciaíistds do programa de Teste de Aptidão utilizado.
"Fraser CG. Generatioíi and application of arudy tical goals iji I abara tory medicine. A mui li deli' Instituto SuJictiote âi Sanita l991;27369-76 .

especificadas sao preferíveis p a r a q u e se o b t e n h a u m a c o m p r e e n - c o n j u n t o de a m o s t r a s d e p a c i e n t e s d e v e m ser realizadas. Para

são v e r d a d e i r a dos possíveis efeitos d e matriz. evitar diferenças artificiais i n d u z i d a s pela matriz, a m o s t r a s frescas
d e pacientes são o m a t e r i a l d e p r e f e r ê n c i a . U m a d i s t r i b u i ç ã o de
COMPARAÇÃO DE MÉTODO _ valores q u a s e u n i f o r m e sobre a faixa d e m e d i ç ã o analítica t a m b é m
C o m p a r a ç ã o das m e d i ç õ e s p o r dois m é t o d o s é u m a tarefa fre- é preferível. E m u m l a b o r a t ó r i o c o m u m , a c o m p a r a ç ã o d o s dois
q u e n t e e m l a b o r a t ó r i o s . D e p r e f e r ê n c i a , m e d i d a s paralelas d e u m m é t o d o s de c a m p o será a situação q u e ocorrerá c o m m a i s fre-
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Eslalíticas
Freqüência cumulativa
9 5 %
5 0 %
/ ^•Alvol
5 %
-2 1 O
Corte
Figura 1 3 - 1 0 Distribuição de freqüência cumulativa de resultados
positivos. O eixo x indica concentrações padronizadas para zero no
ponto de corte (50% de resultados positivos), com unidade SD.
qüência. M e n o s comumente, a comparação de u m m é t o d o de
campo com u m método de referência é realizada. Ao comparar
dois métodos d e campo, o enfoque é sobre as diferenças obser-
vadas. Nessa situação, não é possível estabelecer que u m c o n j u n t o
de medições é o correto e, então, considerar o desvio d o outro
c o n j u n t o de medições a partir de concentrações presumidamente
corretas. Em vez disso, a questão é saber se o novo m é t o d o pode
substituir u m existente sem uma mudança geral na medição de
concentração. Para resolver essa questão, a dispersão das diferen-
ças observadas entre os pares de medições pelos métodos pode
ser avaliada. Paia efetuar u m a análise formal e objetiva de dados,
u m procedimei to estatístico com representação gráfica deve ser
aplicado. As abordagens comumente utilizadas são (1) u m gráfico
de diferença (viés), que mostra as diferenças em f u n ç ã o da con-
centração média de medições (gráfico de Bland-Altman); e (2)
uma análise de regressão. Na seqüência, u m modelo de erro geral
é apresentado e aproximações estatísticas são demonstradas.
Modelo de Erro Básico
A ocorrência d e erros de medida está relacionada com característi-
cas de desempenho do ensaio, primariamente com viés, imprecisão
e especificidade, como definida anteriormente. A influência global
desses fatores pode ser incorporada em u m modelo de erro.
Valor Verdadeiro e Valor-a Ivo
Levando-se em conta que u m m é t o d o analítico mede as concen-
trações de analito c o m alguma incerteza, é necessário distinguir
o valor medido (x,) e o valor-alvo (X/y^) de u m a amostra subme-
tida à análise por u m determinado método.
Este último é o resultado m é d i o que obteríamos se u m a certa
amostra fosse medida u m n ú m e r o infinito de vezes. O valor
medido, provavelmente, se afasta do valor-alvo por alguma quan-
tidade "aleatória" pequena (E). Para u m a determinada amostra
medida por u m método analítico, temos
x, = X A + £f
Se o método é u m método de referência sem viés e inespecífico,
o valor-alvo se iguala ao valor verdadeiro:
CAPÍTULO 13 217
*-Alvc, = X v
Dado u m método de campo, algum viés ou não-especificidade
p o d e m estar presentes e os valores verdadeiro e alvo provavel-
m e n t e irão diferir entre si. Por exemplo, se medimos creatinina
por u m m é t o d o cromogênico, que co-determina alguns outros
componentes com a creatinina n o soro, provavelmente obtere-
mos u m valor-alvo maior do que q u a n d o utilizamos espectrome-
tria de massa por diluição isotópica específica (1D-MS) como
método de referência (isto é, o valor-alvo d o m é t o d o cromogênico
ultrapassa o valor verdadeiro determinado por medições repetiti-
vas com métodos de referência). Assin^ temos a relação
^-Vcrdfldeiroi VieS,
U m a vez que os montantes de substâncias co-determinados p o d e m
variar de amostra para amostra, o viés provavelmente será um
pouco diferente de amostra para amostra. Para u m conjunto repre-
sentativo de amostras de pacientes, podemos descrever os vieses
associados a amostras individuais pela tendência central (média
ou mediana) e pela dispersão (Figura 13-11). Assim, o viés pode
ser dividido em u m a quantidade média, o viés médio e u m a parte
aleatória, viés aleatório. Para uma amostra individual, temos
^AIvoi ~ ^ -Verdadeiro!; + Viés Médio + Viés Aleatório,
Por exemplo, o método cromogênico de creatinina pode deter-
minar, em média, valores de creatinina 15% mais elevados, o que
constitui, assim, o viés médio. Para amostras individuais, o viés
particular pode ser ligeiramente superior ou inferior a 15%,
d e p e n d e n d o do c o n t e ú d o cromogênico real.
Viés Médio e Viés Aleatório
Levando os vieses médio e aleatório em conta, por u m método
de campo, obtemos a seguinte expressão para u m a medida indi-
vidual de uma determinada amostra:
=
Xaw +
= XvftdatitirDí + Viés Médio + Viés Aleatório; + ef
Para esse tipo de medição individual o erro total é o desvio
de x, d o valor verdadeiro,
Erro total de x, - Viés Médio + Viés Aleatório, + e,
Assim, o etro total é composto de u m viés médio, u m com-
ponente de interferência aleatória relacionado com a matriz e,
finalmente, u m elemento d e erro de medição aleatória. Este
último c o m p o n e n t e pode ser avaliado a partir de medições repe-
tidas de uma determinada amostra pelo m é t o d o em questão e
pode ser expresso como u m SD (isto é, o SD analítico como
descrito anteriormente [inter ou intracorridasj). A estimativa de
outros elementos requer medidas paralelas entre o método em
questão e u m m é t o d o de TefeTência, conforme explicado em
detalhes posteriormente.
A exposição acima define o erro total em termos um pouco
mais amplos do que muitas vezes ele é visto. U m a expressão
tradicional de erro total é
Erro total = Viés + 2 SD A
que muitas vezes é interpretado como o viés m é d i o mais 2 SD A .
Caso seja t o m a d a u m a perspectiva estatística monocaudal, a
expressão será modificada para Viés + 1,65 SD A , indicando que
5 % dos resultados estão localizados fora d o limite. A interpreta-
218 PARTE III Operações Laboratoriais

"A Erros Grosseiros ou de Transcrição

O u t r o m o t i v o para oudiets em e s t u d o s de c o m p a r a ç ã o d e m é t o d o s
/
Distribuição de /\ / e n a prática diária são os erras grosseiros o u de transcrição. N o

medições da
mesma amostra
1
l
/ 1
passado, esse t i p o d e erro g e r a l m e n t e era associado à transferên-
cia m a n u a l d e resultados. H o j e e m dia, este tipo de erro n o r m a l -
m e n t e está r e l a c i o n a d o cora erros c o m p u t a c i o n a i s originários d e
interfaces e n t r e sistemas. Erros e m f o r m u l á r i o s d e p e d i d o s d e
/ e x a m e o u erros relacionados c o m m a n i p u l a ç ã o de f o r m u l á r i o s
/
\
/ de p e d i d o s p a r e c e m ser relativamente f r e q ü e n t e s (em e s t u d o s
\
V
sistemáticos f o r a m observados d e 1% a 5 % desses erros). N a fase
pós-analítica, i n t e r p r e t a ç ã o i n a d e q u a d a p o d e r á o c o r r e r (p. ex.,
relativo a intervalos de referência errôneos).
Distribuição de
desvios de valores-alvo
a partir de valor verdadeira
\
'
\
Modelo de Dados de Comparação de Método
para uma população de amostras A q u i c o n s i d e r a m o s n o s s o m o d e l o de erro e m relação à situação
V
de c o m p a r a ç ã o d e m é t o d o s . Para u m a d e t e r m i n a d a a m o s t r a

/
de pacientes /

/'
/ m e d i d a p o r dois m é t o d o s analíticos, 1 e 2, temos:
/

/
s '
*1.I =X1AIvoí + e l ; = Xverdadeiroi + V i é s M é d i o l + Viés A l e a t ó r i o l , +
ei,
Viés médio +
x2, =X2aívo, + E2,- = ^-VERDADE;ROÍ Viés M é d i o 2 + Viés Aleatório2, +
'*• "W e2j

A partir desse m o d e l o geral, p o d e r e m o s estudar algumas situa-

o
ções típicas. P r i m e i r o , a c o m p a r a ç ã o de u m m é t o d o de c a m p o a
Figura 13-11 Esquema de modelo de erro básico para medições u m m é t o d o de referência será tratada. Seg i n d o , a situação q u e
o c o r r e c o m m a i o r f r e q ü ê n c i a - a c o m p a r a ç ã o de dois m é t o d o s
por um método de campo.
Parte superior. A distribuição de medições repetidas da mesma amostra, de c a m p o - é c o n s i d e r a d a .
representando uma distribuição gaussiana em corno do valor-alvo (linha
vertical) da amostra, com uma dispersão correspondente ao desvio-padrão Comparação de um Método de Campo com um
analítico, OA- Método de Referência
Parte média-. Esboço esquemático de desvios de valor-alvo dos respectivos P o d e m o s c o m e ç a r s u p o n d o q u e o m é t o d o 1 é u m m é t o d o de
valores verdadeiros para uma população de amostras de pacientes. A dis- referência. Nesse caso, os c o m p o n e n t e s de viés p o r d e f i n i ç ã o
tribuição de uma forma arbitrária é demonstrada. A linha vertical indica d e s a p a r e c e m e t e m o s a seguinte situação:
a média de distribuição.
+
Parte inferior. A distância entTe zero e a média dos desvios de valor-alvo a xl; El; ^Verdadeiroi + El;
partir de valores verdadeiros representa o viés médio do método. x2, = X2AIvü1 + e2, = XyeidMklTOI + V i é s M é d i o 2 + Viés A l e a t ó r i o 2 j
+ E2;

A s diferenças e m p a r e l h a d a s tornam-se

4
{xl{ - xlj) = V i é s M é d i o 2 + Viés Aleatório2i (E2, - e l f )

T e m o s , assim, u m a expressão constituída poT u m t e r m o cons-

cão de viés c o m o s e n d o i d ê n t i c a ao viés m é d i o p o d e levar a u m
erro total s u b e s t i m a d o .
A interferência aleatória r e l a c i o n a d a c o m a matriz p o d e
a s s u m i r várias f o r m a s . Essa p o d e ser u m c o m p o n e n t e de erro
aleatório adicional q u e o c o r r e r e g u l a r m e n t e (p. ex., c o m o foi
o b s e r v a d o pelo p r i n c í p i o de Jaffé para a m e d i ç ã o de creatinina),
erro este q u e p o d e ser q u a n t i f i c a d o sob a f o r m a de u m S D ou
CV. O p r o c e d i m e n t o m a i s direto é executar u m escudo compa-
rativo b a s e a d o e m c o n j u n t o d e a m o s t r a s de pacientes, o n d e u m
d o s m é t o d o s é u m m é t o d o d e referência, c o n f o r m e explicado
mais à f r e n t e .
O u t r a f o r m a d e i n t e r f e r ê n c i a aleatória relacionada c o m a
matriz são erros grosseiros q u e o c o r r e m mais r a r a m e n t e , n o r m a l -
m e n t e vistos n o c o n t e x t o d e i m u n o e n s a i o s e q u e dizem respeito
a interações inesperadas c o m a n t i c o r p o s . Esse t i p o de erro nor-
m a l m e n t e irá se m o s t r a r c o m o u m p o n t o d i s c r e p a n t e (outher) e m
e s t u d o s de c o m p a r a ç ã o de m é t o d o s . U m a f o n t e b e m c o n h e c i d a
é a ocorrência de a n t i c o r p o s heterofílicos. Dessa forma, outliers
d e v e m ser c o n s i d e r a d o s c u i d a d o s a m e n t e , e n ã o apenas descarta-
dos d e u m p r o c e d i m e n t o de análise de d a d o s .
t a n t e (o viés m é d i o d o m é t o d o 2) e dois t e r m o s aleatórios. O
t e r m o viés aleatório é d i s t r i b u í d o e m t o r n o d o viés m é d i o , de
a c o r d o c o m u m a distribuição i n d e f i n i d a . O s e g u n d o t e r m o alea-
t ó r i o é u m a diferença e n t r e os dois erros de m e d i ç ã o aleatórios
q u e são i n d e p e n d e n t e s e, c o m u m e n t e , d e distribuição gaussiana.
S o b essas premissas, as diferenças e n t r e os erros de m e d i ç ã o
aleatórios t a m b é m são aleatórias e gaussianas. N o e n t a n t o , lem-
b r a m o s ao leitor q u e o S D para m é t o d o s analíticos quase s e m p r e
d e p e n d e d o nível d e c o n c e n t r a ç ã o , c o m o m e n c i o n a d o anterior-
m e n t e . Para analitos c o m u m a vasta faixa de m e d i ç ã o analítica
(p. ex., alguns h o r m ô n i o s ) , t a n t o as interferências aleatórias rela-
c i o n a d a s c o m a matriz, c o m o o S D analítico, p r o v a v e l m e n t e são
d e p e n d e n t e s d a c o n c e n t r a ç ã o d e m e d i d a , m u i r a s vezes de m a n e i r a
a p r o x i m a d a m e n t e p r o p o r c i o n a l . Nesse caso p o d e ser mais útil
avaliar as diferenças relativas - (x2j - xl;)/[(x2{ + xl)/2] - e, con-
s e q ü e n t e m e n t e , expressar m é d i a , viés aleatório e erro analítico
c o m o p r o p o r ç õ e s . U m a alternativa é a p a r t i ç ã o d o intervalo d e
m e d i ç ã o analítico total e m s e g m e n t o s (p. ex., três partes) e con-
siderar viés m é d i o , viés aleatório e erro analítico e m s e p a r a d o ,
e m cada u m desses segmentos. P r e f e r e n c i a l m e n t e , os s e g m e n t o s
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas
p o d e m ser divididos relacionando-se concentrações consideradas
importantes para tomadas de decisões (p. ex., em Telação aos
limites de intervalo de referência ou concentrações relacionadas
com tratamento, ou ambos).
Comparação entre Dois Métodos de Campo
Na comparação entre dois métodos de campo, as diferenças
emparelhadas tornam-se
(x2, - xl;) = (ViésMédio2 - Viés Médio 1) + (Viés Aleatório2,
- Viés Aleatóriol,) + (e2, - el,)
Novamente, a expressão consiste em u m termo constante, a dife-
rença entre os dois vieses médios e dois termos aleatórios. O
primeiro termo aleatório é uma diferença entre dois componentes
de viés aleatório que p o d e m ou não ser independentes. Se os dois
métodos de campo são baseados no mesmo principio de medição,
os termos de viés aleatório possivelmente são correlacionados. Por
exemplo, dois métodos cromogênicos para creatinina, possivel-
mente, estão sujeitos à interferência dos mesmos compostos cro-
mogênicos presentes em uma determinada amostra sérica. Por
outro lado, u m m é t o d o cromogênico e u m enzimático para crea-
tinina estão sujeitos à interferência de diferentes tipos de compos-
tos e os termos de viés aleatório p o d e m ser relativamente inde-
pendentes. No termo 82,-81,, as mesmas relações descritas ante-
riormente são aplicáveis. Pode-se notar que a fórmula geral para
as diferenças expressas é a mesma para as duas situações. Assim,
os mesmos princípios estatísticos gerais são aplicáveis. Nas seções
seguintes, iremos considerar a distribuição de diferenças sob diver-
sas circunstâncias e também as relações de medidas entre os
métodos 1 e 2, com base na análise de regressão.
Planejando um Estudo Comparativo de
Métodos
Ao elaborar u m m é t o d o de estudo comparativo, os métodos ana-
líticos a serem estudados devem ser estabelecidos em laboratório,
de acordo com proU colos escritos e estáveis em u m trabalho de
rotina. Os reagentes são comumente fornecidos como kits analíti-
cos, prontos para utilização, às vezes concebidos para u m instru-
mento analítico particular (sistema aberto ou fechado). Os técni-
cos encarregados do estudo devem ser treinados para executar tais
procedimentos e operar a instrumentação associada. Além disso,
é importante que u m sistema interno de controle de qualidade
esteja implementado a fim de garantir que os métodos em estudos
comparativos sejam executados sob condições idênticas.
Na fase de planejamento de estudo comparativo de métodos,
vários pontos requerem atenção, incluindo o n ú m e r o de amos-
tras necessárias, a distribuição de concentrações de analito (pre-
ferencialmente uniforme sobre o intervalo de medição analítica),
b e m como a representatividade das amostras. Para abordar esse
último ponto, amostras de categorias relevantes de pacientes
deveriam ser incluídas a fim de que possíveis fenômenos de
interferências possam ser descobertos. Aspectos práticos relacio-
nados com o armazenamento e tratamento de amostras (reci-
piente etc.) e possíveis artefatos induzidos pela armazenagem (p.
ex., congelamento de amostras) e a adição de anticoagulantes
devem ser considerados. A comparação de medições deve ser
realizada, preferencialmente, d u r a n t e vários dias (p. ex., pelo
menos 5 dias), de m o d o que a comparação dos métodos não se
torne dependente do desempenho dos métodos em uma corrida
em particular. Finalmente, os aspectos éticos (p. ex., a concordân-
cia de pacientes cujas amostras serão utilizadas ou amostras sem
identificação, remanescentes de testes clínicos anteriores) devem
ser considerados em relação à legislação vigente.
CAPÍTULO 13 219
A o considerar o protocolo de comparação, a orientação EP-
9A2 do CLSI: Metfiod comparison and bias estima ti cm using patient
sãmples sugere que, q u a n d o u m novo método é introduzido n o
laboratório como u m substituto para outro já estabelecido na
rotina, deve-se medir, por cada método, 40 amostras em duplica-
tas. 3 Além disso, propõe-se que o fabricante do sistema analítico
tenha feito u m estudo comparativo baseado em, pelo menos, 100
amostras medidas em duplicata para cada método.
Embora essas orientações gerais sobre o t a m a n h o de amostras
sejam úteis, outros aspectos são importantes. O poder estatístico
pode ser considerado como base para estabelecer u m t a m a n h o
adequado de amostra, tal como apresentado no âmbito de análise
de regressão. 11 Adicionalmente, a probabilidade de detecção de
interferências que ocorram raramente como outhers deve ser con-
siderada para estabelecer o t a m a n h o apropriado de amostra.
Finalmente, com relação à avaliação de métodos automatizados,
uma atenção especial deve ser dada à seqüência de amostras para
avaliar oscilação, contaminação e não-linearidade.
Gráfico de Diferença (de Bland-Altman)
O procedimento foi originalmente introduzido por Bland e
Altman para comparação de medições em medicina clínica, mas
o procedimento também foi adotado na química clínica. 1 O
gráfico de Bland-Altman geralmente é entendido como represen-
tação de diferenças contra a média de resultados dos métodos.
Assim, o gráfico de diferença nessa versão fornece informação
sobre a relação entre diferenças e concentração, o que é útil para
avaliar se existem problemas em certos intervalos (p. ex., extre-
midade alta da faixa) causados pela não-linearidade de u m dos
métodos. Também pode ser de interesse observar se as diferenças
tendem a aumentar proporcionalmente à concentração ou se são
independentes da mesma. O modelo de erro básico descrito
anteriormente aplica-se, também, ao gráfico de diferença.
A versão básica do gráfico de diferença consiste em traçar as
diferenças contra a média das medidas. Se u m c o n j u n t o de
medidas está sem o erro de medida aleatório, p o d e representar
as diferenças contra esse valor. A Figura 13-12 mostra o gráfico
de u m exemplo consistindo de N = 65 amostras medidas p o r dois
métodos de ensaio de droga. O intervalo ± 2 SD das diferenças
quase sempre delineado em t o r n o da diferença média (isto é,
correspondente à média e aos percentis 2,5 e 97,5).
U m viés médio constante sobre o intervalo de medição ana-
lítica distancia a concentração média de zero. A presença de
interferências aleatórias relacionadas com a matriz a u m e n t a a
amplitude de distribuição. Se o viés médio depende da concen-
tração ou da dispersão, varia de acordo com a concentração ou
ambos, as relações tornam-se mais complexas e o intervalo médio
± 2 S D das diferenças p o d e não ser adequado como intervalo
9 5 % ao longo de toda a faixa de medição analítica.
N o gráfico de Bland-Altman traçado para comparação de
dados de ensaio de draga, existe uma tendência em direção ao
a u m e n t o de dispersão com o a u m e n t o de concentração, o que é
u m reflexo do a u m e n t o de erro aleatório com o nível de concen-
tração. Assim, a representação gráfica de diferenças relativas,
contra a concentração média é relevante (Figura 13-13). Agora
existe uma dispersão mais homogênea de valores concordantes
com os limites estimados para a dispersão (isto é, a diferença
média relativa ± to.o:5,<N-1) SD RelDif ).
Gráfico de Diferença (de Btand-Altman) com
Limites Especificados
Em muitas situações em que a implementação de m é t o d o de
campo está sendo considerada, pode-se almejar, primariamente,
verificar se as diferenças em relação ao m é t o d o em utilização estão
220 PARTE III Operações Laboratoriais

5 0 0 i
Limites Inferiores (95% Cl Monocaudal) de
Porcentagens Observadas (%) de Resultados
Localizados dentro 'de Limites Especificados
2 5 0 para D ife r e nç as Emparelhadas que Estão e m
Concordância c o m a Hipótese de pelo m e n o s
&$«Po° 03 95% das Diferenças se Encontrarem dentro
O o- ° 1 o
O VC.' CKTHT;— dos Limites
? 0
CM O" * 8
X Oo N Proporções Observadas
0
V° o ° o
20 85

- 2 5 0
30 87
40 90
50 90
60 90
- 5 0 0 70 30
Q 1 . 0 0 0 2 . 0 0 0 3 . 0 0 0 BO 91
90 91
(x1+x2)/2 100 91
150 92
Figura 13-12 Gráfico de diferenças de Bland-Altman para exemplo 200 93
de comparação de droga. As diferenças são traçadas contra a 250 93
concentração média. A diferença média (42 nmol/L) com ± 2 SD de 300 93
diferenças é mostrado (linhas tracejadas). 400 93
500 93
1.000 94

0 , 5

estudo mostra que a meta foi alcançada, pois o limite inferior

ç\l para a aceitação é de 90%. É evidente que u m n ú m e r o razoável
rí de observações deve ser obtido para que a avaliação tenha u m
X ° 9> &o o ~ ' o
+ 0 poder aceitável.
o r ~9j o -
0,0 r
O ' * Ao considerar limites adequados para u m estudo compara-
-n% v o* tivo, t a m b é m deve-se estar consciente dos componentes de erro
° <3 Oo do método de comparação. S u p o n h a que u m a imprecisão corres-
X 0 O Oo
I
CM p o n d e n t e a u m CV A de 5 % seja permitida para o novo m é t o d o
>(
e u m viés de até ±3% e m relação ao método de comparação seja
razoável. Se o CV A do m é t o d o de comparação é de 4%, os limites
para as diferenças tornam-se: ±[3% + 2(5 2 4 42)0,5] (isto é, ±15,8%
[supondo u m intervalo de 95%]). Aqui ignoramos a possibilidade
- 0 , 5
de interferências aleatórias relacionadas com a matriz.
1.000 2.000 3.000
(x1 +x2)l2 Análise de Regressão
A análise de regressão é c o m u m e n t e aplicada c o n f r o n t a n d o
Figura 13-13 Gráfico de diferenças relativas de Bland-Altman para resultados de comparações de métodos analíticos. Em geral
exemplo de comparação de droga. As diferenças são traçadas contra a realiza-se u m experimento o n d e se coleta u m a série de valores
concentração média. A diferença relativa média (0,042) com + 2 SD de emparelhados para comparar u m novo m é t o d o com u m m é t o d o
diferença relativa é demonstrada (iinfias tracejados). estabelecido. Essa série d e observações emparelhadas (xl„ x2) é
então utilizada para determinar a natureza e a intensidade da
relação entre os testes. A análise de regressão tem a vantagem
de permitir que a relação entre os valores-alvo para os dois
localizadas dentro de determinados limites especificados, em vez métodos em comparação seja estudada ao longo de t o d o o inter-
de distribuição de diferenças estimadas. Por exemplo, podem-se valo de medição analítica. Se a diferença sistemática entre
estabelecer limites correspondentes a ±15% como clinicamente valores-alvo (isto é, a diferença de viés médio entre os dois
aceitáveis e a aspiração que a maioria (p. ex., 9 5 % das diferenças) métodos ou o erro sistemático) estiver relacionada com a con-
esteja localizada dentro desse intervalo. centração do analito, tal relação poderá n ã o ser claramente
Pela contagem, pode ser determinado se a proporção espe- demonstrada q u a n d o da utilização dos gráficos de diferença
rada de resultados está dentro dos limites (isto é, 95%). Podem m e n c i o n a d o s anteriormente. Na análise de regressão linear,
ser aceitas porcentagens que não desviam, significativamente, do presume-se que a diferença sistemática entre os valores-alvo p o d e
porcentual suposto em determinado t a m a n b o de amostra deri- ser modelada como u m a diferença sistemática constante (desvio
vado de distribuição binomial (Tabela 13-5). Por exemplo, se 50 de interseção de zero) c o m b i n a d a com u m a diferença sistemática
medições emparelhadas forem realizadas em u m estudo compa- proporcional (desvio de inclinação da unidade) (Figura 13-14).
rativo de métodos, e caso seja observado que 46 dos resultados A interseção quase sempre p o d e representar alguma média de
(92%) estão dentro dos limites especificados (p. ex., ±15%), o diferença induzida pela matriz e a diferença proporcional pode
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas
X2C ,,
/
Ac = X 2 - - X l 0 = cx0 I
Figura 13-14 Ilustração de diferença sistemática A. entre dois
métodos e m u m determinado nível X l c d e acoido c o m a linha de
regressão. A diferença é o resultado entre uma diferença sistemática
constante (desvio de interseção a partir de zero) e uma diferença
sistemática proporcional (desvio de inclinação a partir da unidade). A
linha pnntill-Lada representa a diagonal X 2 = X I .
ser resultante de discrepância relacionada com a calibração dos
métodos. Em situações com SD s de erros aleatórios constantes,
procedimentos de regressão n ã o p o n d e r a d o s são utilizados (isto
é, m í n i m o s quadrados ordinários [OLR] e análise de regressão
de Deming). Para os casos com SDs que são proporcionais ao
nível de medição, os procedimentos de regressão p o n d e r a d o s
correspondentes são adequados.
Modelos de Erro em Análise de Regressão
C o n f o r m e descrito anteriormente, distinguimos entre o valor
medido (x,) e o valor-alvo (XAK™) de u m a amostra submetida à
análise pot u m determinado método. Em análise de regressão
linear, assumimos que u m a relação linear
X 2 A W =
CTN + J B X 1 ' A I „ I
onde, XVAM e X2'A|TOi correspondem aos valores-alvo sem o viés
aleatório; ou seja, temos as relações
=
XIaIVOÍ Xr^hoi + Viés Aleatóriol,
X2Alvoi = + Viés Aleatório2i
Este modelo geralmente é útil q u a n d o a diferença sistemática
entre X1'AITOÍ e X2'A]voi d e p e n d e da concentração medida
X2' A]voi - X I V , , = Oo + (P - D X 1 V ,
A diferença sistemática é, portanto, composta de u m a parte fixa
e u m a parte proporcional.
Em virtude de interferências aleatórias relacionados com
matriz e erro analítico, os pares de medidas individuais de valores
CAPÍTULO 13 221
x2
>
\
Jí1
Figura 13-15 Esqu e m a da relação entre os valores x l e x2 medidos
por dois métodos sujeitos a erros aleatórios com S D constantes ao longo
do intervalo de medição analítica. E presumida uma relação linear entre
os valores-alvo X2\| v o i ). O s valores x l , e x2, estão distribuídos de
forma gaussiana em torno de XI3AI™ e X 2 \ i ^ „ respectivamente, c o m o
demonstrado de m o d o esquematizado. <521 ÍOyJ está demarcado.
{xlj, x2|) serão dispersos em corno da linha que expressa a relação
entre e X 2 ' A ] v o i . A Figura 13-15 descreve, esquematica-
mente, como a distribuição aleatória de valores xl e x2 ocorre ao
redor da linha de regressão. Temos:
xl, = X I AJvoi + ei, = XrAivoi 4 Viés Aleatóriol,+ e l ;
X2Í = X2Alvoi + B2Í = X Z ' ^ , + Viés Aleatório2,+ E 2 ;
O s componentes de erro aleatório p o d e m ser expressos como SD s
e, em geral, nós podemos assumir que os componentes viés ale-
atório e analítico são independentes para cada analito, resul-
t a n d o nas relações
— < 7 r b i + (7' A I
O , , - CT RB2 I (TA Z
Os componentes de viés aleatório para os métodos 1 e 2 não
necessariamente são independentes. Eles t a m b é m p o d e m não ser
de distribuição gaussiana, o que é menos provável n o que diz
respeito aos componentes analíticos. Assim, ao aplicar u m pro-
cedimento de regressão, os pressupostos explicitamente necessá-
rios devem ser considerados. E m situações sem componentes de
viés aleatório, de qualquer significado, as relações são simplifica-
das para
'AL
AI
Nessa situação, pode-se assumir, normalmente, que as distribui-
ções de etros são gaussianas e dados de SDs p o d e m ser conheci-
dos a partir do controle de qualidade.
O u t r o problema metodológico relacionado com dispersão de
erro é saber se os componentes de erro aleatório são constantes
ou alteram com a concentração d o analito, c o m o considerado
anteriormente nas seções sobre gráficos de diferença. Em casos
com intervalo considerável (p. ex., u m a década ou mais), esse
222 PARTE Ml Operações Laboratoriais

V
x2 x2
7
\
V
y
rl xl

Figura 13-16 E s q u e m a da relação entre os valores xl e x2 m e d i d o s Figura 13-17 O m o d e l o p r e s u m i d o em O L R ordinária. O s valores

por dois m é t o d o s sujeitos a erros aleatórios proporcionais. Admite-se
q u e a relação entre os valores-alvo seja linear. Os valores x l ; e x2-, estão
distribuídos de f o r m a gaussiana em t o r n o de X I ' A]V0I e
respectivamente, c o m a u m e n t o de dispersão e m altas concentrações,
c o m o m o s t r a d o n o esquema.
xl estão distribuídos de f o r m a gaussiana e m t o r n o da linha com SD
constante ao longo do intervalo de medição analítica. Assume-se q u e os
valores xl n ã o apresentam erro aleatório. (CT„) é m o s t r a d o .

f e n ô m e n o t a m b é m deve ser levado em conta ao aplicar análise

de regressão. A Figura 13-16 mostra, esquematicamente, c o m o as
dispersões p o d e m aumentar, proporcionalmente, c o n f o r m e a
concentração.

Análise de Regressão de Deming e Análise de

Regressão Ordinária dos Mínimos Quadrados (SDs
Constantes)
Para estimar a relação entre os valores-alvo com precisão (isto é,
a 0 pata a 0 e b para (3), u m procedimento de regressão que leva
em conta erros em xl e x2 é preferível (isto é, abordagem de
D e m i n g [Figura 13-15]). N o e n t a n t o , o procedimento de regres-
são mais utilizado e m estudos de comparação de métodos, OLR,
n ã o leva em conta erros de xl, mas baseia-se n o pressuposto de
que apenas as medições de x2 estão sujeitas aos erros aleatórios
(Figura 13-17). N o p r o c e d i m e n t o de Deming, a soma dos quadra-
dos das distâncias de c o n j u n t o s de valores medidos (xl,, x2,) para
a linha de regressão é minimizada em u m ângulo d e t e r m i n a d o
pelo quociente entre os SD 5 para as variações aleatórias xl e x2.
Pode-se comprovar, teoricamente, que em virtude de as distribui- Figura 13-18 Em O L R , a soma dos q u a d r a d o s dos desvios a partir
ções de erros serem gaussianas, esse p r o c e d i m e n t o de estimativa da linha é minimizada na direção vertical. N a análise de regressão de
é o mais eficiente. N a Figura 13-18, o caso simétrico é ilustrado D e m i n g , a s o m a dos q u a d r a d o s dos desvios é m i n i m i z a d a e m u m
com u m a inclinação de regressão de 1 e SDs iguais para as varia- ângulo com a linha d e p e n d e n d o da razão de erro aleatório. Aqui, o caso
ções aleatórias xl e x2, caso em que a soma dos quadrados das simétrico é a p r e s e n t a d o com desvios ortogonais. (Reproduzidas com a
distâncias é minimizada, ortogonalmente, com relação à linha. autorização do L i n n e t K. Tfie performance of Demmg regression analysis ín
E m OLR, a soma dos quadrados das distâncias é minimizada na case of a misspecified analytical error -ratio. CIm Chem 1998;44' 1024-31
direção vertical com relação à linha (Figura 13-18). [Figura 1].)
Pode ser provado, teoricamente, que negligenciar o erro alea-
tório em xl induz a u m a estimativa viesada de declividade des-
cendente
do modelo de erro inadequado. A Figura 13-19 mostra o viés
P' =
P[tf2xrAiw/(o2xi'A]TO
+
cr*])] = P / [ l +
(ct^/oVaiJ2] como f u n ç ã o da proporção entre S D de erro aleatório e SD de
dispersão de valor-alvo X I ' . Para u m a razão até 0,1, o viés é infe-
onde, Oxi'Alvo É o S D dos valores-alvo X I ' . i 0 A m a g n i t u d e de viés rior a 1%. Para razão igual a 0,33, o viés eleva-se a 10% e, em
d e p e n d e da relação entre o SD para o erro aleatório em xl e o seguida, a u m e n t a ainda mais. C o m o exemplo, u m estudo com-
SD de valores-alvo !X1'. E m situações com ampla faixa de valores- parativo típico para dois métodos de determinação de níveis
alvo X l ' , esse viés p o d e ser desprezível e O L R p o d e ser utilizado séricos de sódio p o d e ser associado a u m viés de inclinação des-
para estimativa de inclinação e interseção, apesar do pressuposto c e n d e n t e de cerca de 10% (Figura 13-20).
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas CAPÍTULO 13 223

Valor de inclinaçao esperado Procedimentos Computacionais para OLR e

1,0
Regressão de Deming
Assumindo a ausência de erros em jcl e u m a distribuição gaus-
\ siana de erro x2 com SD consEante em toda a faixa de medição
\ analítica, OLR é o melhor p r o c e d i m e n t o de estimativa, como
0,8 V
comprovado por Gauss n o século XVIII. Se forem assumidos
erros em ambos, xl e x2, a abordagem de D e m i n g será o m é t o d o
O
•a X de escolha. 10 Deve-se ter em mente que para esses procedimentos
paramétricos apenas as distribuições de erro devem ser gaussianas
o \ ou normais. O princípio dos mínimos quadrados não presume
0,6
que a normalidade seja aplicada, mas é ótimo sob condições de
Declive médio estimado por OLR • normalidade e os erros nominais d o Tipo I para testes estatísticos
associados a declive e à interseção permanecem verdadeiros sob
essa suposição. Os procedimentos são geralmente robustos para
0,4 desvios de normalidade) mas são sensíveis a outliers por causa da
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 elevação ao quadrado. Finalmente, a distribuição de valores-alvo
xl e xl não necessita ser gaussiana. U m a distribuição uniforme
ao longo d o intervalo de medição analítica quase sempre é van-
tajosa) mas a distribuição pode, em princípio, assumir qualquer
F i g u r a 1 3 - 1 9 Relações entre o valor verdadeiro de inclinação forma. Para ambos os procedimentos, poderemos avaliar o SD
(esperado) e o declive médio estimado pOT OLR. O viés de estimativa de da dispersão na direção venical em t o r n o da linha (comumente
inclinação por OLR aumenta negativamente com o a u m e n t o das razoes d e n o t a d o SDV,X e aqui designado SD 2] ). Temos
entre SDs para erros aleatórios em x l e os SDs da distribuição de valor-
alvo XI. SDj_l - [E(x2, - X2 alvoestirrui<io)V(N 2)1|0,5

U m a discussão mais aprofundada sobre a interpretação do SD 2 i

será abordada a seguir.
160 -
Para calcular a inclinação na análise de regressão de Deming, é
necessária a razão entre os SDs de erros aleatórios xl e x2, Isto é,

150
^<*ÍB1^ÍI)/(<4b2 + <Z)
o
| 140 Os SD A s p o d e m ser estimados a partir de conjuntos de medições,
em duplicata como
CM
X

130 SDi^d/lWíX^-xl,,) 2

120
12G 130 140 150
x1 mmol/L
Figura 13-20 Comparação simulada de dois métodos de sódio. A
linha sólida indica a linha estimada média por OLR, e a linha
pontilhada é a linha de identidade. Embora não haja diferença
sistemática entre os dois métodos, a linha OLR média afasta-se da linha
de identidade que corresponde a u m viés de inclinação descendente de
cerca de 10%.
N o exemplo apresentado anteriormente, a razão entre SD
analítico e SD de distribuição de valor-alvo é elevada em função
da rigorosa regulação fisiológica de concentrações de eletrólitos,
que significa que a variação biológica é limitada. A maioria dos
outros tipos de analitos exibe distribuições mais amplas e a razão
entre erro e distribuição de valor-alvo é menor. Por exemplo, para
analitos com distribuição superior a u m a década e u m erro ana-
lítico correspondente a u m C V de 5%, n o meio do intervalo de
medição analítica, o viés de inclinacão O L R eleva-se para cerca
de - í % .
2
SDAjHl/ZNmA,-^!,)
160
ou, esses p o d e m estar disponíveis a partir de dados de controle
de qualidade.
Se u m valor específico para não está disponível e os dois
métodos de campo que estão sendo comparados possivelmente
estão associados a níveis de erro aleatório com a mesma ordem
de grandeza, A. p o d e ser ajustado para 1. O procedimento de
Deming em geral é relativamente insensível a especificações
erradas de valores de X.
Fórmulas para calcular inclinação (p), interseção (a n ) e os
respectivos erros-padrão estão disponíveis a partir de outras
fontes 10,11 e não serão repetidas aqui. Os pacotes de aplicativos
de informática c o m u m e n t e disponíveis para realizar análises por
ambos as métodos serão revisados a seguir.
Avaliação de Erro Aleatório em Torno de uma
Linha de Regressão Estimada
Supõe-se que a inclinação e a interseção forneçam u m a estimativa
de diferença sistemática ou erro entre dois métodos analíticos ao
longo do intervalo de medição analítica. Adicionalmente, u m a
estimativa do erro aleatório é importante. C o m o m e n c i o n a d o
anteriormente, é c o m u m considerar a dispersão em torno da
linha na direção vertical, que é quantificada como SDV.,. (aqui
224 PARTE 111 Operações Laboratoriais
denotado SDZ1). O SÜ21, originalmente, foi introduzido no con-
texto de OLR, mas também pode ser considerado com relação à
análise de regressão de Deming.
Interpretando SDy.x (SD21) com Erros Aleatórios
apenas em x2
N o modelo assumido em O L R temos apenas erros aleatórios
associados às medições x2 (Figura 13-17). Essa situação ocorre
raramente na prárica, mas pode ocorrer (p. ex., quando u m con-
junto de materiais de referência disponível foi determinado repe-
titivamente por u m m é t o d o de referência), então, na prática não
há erro de medição aleatório presente. Nesse caso, a dispersão
em t o r n o da linha apenas reflete o erro aleatório de medições
xl. Se não houver interferências aleatórias relacionadas com a
matriz, o erro aleatório será igual à imprecisão analítica e
teremos
°21 = W
A2
Se interferências aleatórias relacionadas com a matriz estiverem
presentes, teremos
_2 2
21 — ^AZ +<5
RB2
onde, é o SD de efeitos aleatórios relacionados com a matriz,
aqui suposto ser de distribuição normal e independente da
imprecisão do método.
Interpretando SDy.x (SD21) com Erros Aleatórios
em Ambos x1 e x2
N o que se refere à SD 2 i, temos aqui, sem interferências aleatórias
relacionadas com a amostra
_2 _ n2 _2 , _2
< >2i — P O a i f u A 2
Assim, reflete tanto o erro aleatório em xl (com re-escala-
mento) como em xl. Freqüentemente P é próximo da unidade
e, nesse caso, cT^2 torna-se aproximadamente a soma dos quadra-
dos individuais de SDs. Essa relação vale para ambas as análises
de Deming e OLR. Freqüentemente o O L R é aplicado em situações
associadas a erro de medição aleatória tanto em xl quanto em xl
e, nessas situações, o 2 i reflete os erros de ambos.
A presença de interferências aleatórias relacionadas com
amostra em xl e x2 resulta na seguinte expressão:
<*21 = t P Z ° A l + + [P Z °RB1 + O
Assim, o valor CTji é influenciado pelo valor da inclinação, os
componentes de erro analítico c A ] e gA2 (agrupados no primeiro
colchete) e a R B 1 e c R B 2 (agrupados no segundo colchete). Em
muitos casos a inclinação é próxima à unidade, caso em que
temos a simples adição de componentes. C o m o mencionado
anteriormente, as interferências aleatórias associadas à matriz
p o d e m não ser independentes. Nesse caso, a simples adição de
componentes não é correta porque o termo de covariância deve
ser incluído. N o entanto, em u m caso real, podemos estimar o
efeito combinado correspondente ao termo entre colchetes.
Informações sobre os componentes analíticos geralmente são
disponíveis, quer a partir de duplicatas de c o n j u n t o de medidas
ou de dados de controle de qualidade. Baseado nessa informação,
o termo viés aleatório combinado no segundo colchete pode ser
obtido subtraindo-se os componentes analíticos de c ^ . De u m
m o d o geral pode-se julgar se o erro aleatório total é aceitável ou
não. A diferença sistemática pode ser ajustada com relativa faci-
lidade por uma re-escala de u m dos conjuntos de medições. No
entanto, se o erro aleatório é muito grande, tal re-escalamento
não irá garantir a equivalência de medidas n o que diz respeito às
amostras individuais. Assim, é importante avaliaT tanto a dife-
rença sistemática e o erro aleatório ao decidir sc u m novo método
pode substituir u m OUÍTO já existente. Em u m a situação mais ou
menos simétrica, com uma declive próxima a unidade e dois
métodos de campo com especificidade e precisão presumida-
mente iguais, o erro aleatório total expresso como SD 2Í pode ser
subdividido em componentes de erros associados a cada teste,
dividindo pela raiz quadrada de dois. Pode-se, então, avaliar os
níveis de erro aleatório com relação às metas estabelecidas.
Avaliação de Outliers
O principio de minimizar a soma do quadrado das distâncias da
linha torna os procedimentos de regressão descritos sensíveis à
presença de outliers e a avaliação da ocorrência dos mesmos deve
ser realizada de forma rotineira. A distância de um suposto outiier
à linha é registrada em unidades SD e a exclusão do mesmo é~__
realizada q u a n d o a distância excede u m limite predeterminado
(p. ex., 3 ou 4 unidades SD). N o caso de OLR, a unidade SD
equivale a SD 2 i e a distância vertical é considerada. PaTa a análise
de regressão de Deming, a unidade é o SD de desvio dos pontos
com relação à linha, em um ângulo determinado pela razão de
erro de variância X. U m gráfico desses desvios, u m suposto gráfico
de resíduos, ilustra de forma conveniente a ocorrência de
outliers.I0,n A Figura 13-21, (A) ilustra u m exemplo de análise de
regressão de Deming, com ocorrência de u m outlier e o gráfico
de resíduos associado (B), que mostra claramente o padrão de
outliers. Nesse exemplo, o gráfico de resíduos foi padronizado para
unidade SD. Utilizando esse exemplo u m limite de outlier de 4
unidades SD, o outlieT foi rejeitada e uma reavaliação foi realizada.
Nesse exemplo, a rejeição do outlier m u d o u a inclinação de 1,14
para 1,03. No que se refere aos outliers, essas medidas não apenas
devem ser automaticamente rejeitadas, mas também a razão da
presença desses deve ser examinada.
Coeficiente de Correlação
Além de descrever os componentes de erro aleatório relacionados
com a análise de regressão, alguns comentários sobre o coeficiente
de correlação podem ser adequados. O coeficiente de correlação
ordinário p, também designado coeficiente de correlação momento-
produto de Pearson, é estimado como r a partir da soma dos
quadrados dos desvios para valores xl e xl, como segue:
5
T = pAmf'
Onde:
f>=2Xx l j - x l J G c 2 , - x 2 J
u = IX* l t — jcl m ) 2 q = E(jc2f — x 2 m ) 2
e
x l m = I x l / h l x2m = &2,yN
O l h a n d o para o modelo teórico, p está relacionado com a razão
entre os SD s da distribuição de valores-alvo (cr^i-ai™ e cr^ivo) e o s
componentes independentes de erro aleatório total associados
e a,?)
P = °xiw™ +
a2,,)(a2l2a|m + a 2 J ] 0 , 5
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas CAPÍTULO 13 225

30 intervalo é de 1 a 6. O S D de erro aleatório é p r e s u m i d a m e n t e cons-

tante e, nos dois casos, é fixado em 0,15 para ambos x l e xl, corres-
p o n d e n d o a u m C V de 5 % em nível 3. Dados os c o n j u n t o s de 5C
medições emparelhadas, o coeficiente de correlação é 0,93 n o casc
(A), e 0,99 n o caso (B). Além disso, u m único p o n t o situado fora dc
restante de observações exerce u m a forte influência (Figura 13-22, C),
20 E m C, 49 das observações são distribuídas d e n t r o d o intervalo 1 a 3,
com u m único p o n t o situado fora dos outros em torno do valor 6.
sendo que os outros fatores são iguais. O coeficiente de correlaçãc
C\L aqui tem u m valor intermediário de 0,97. Assim, u m único ponte
situado fora d o resto tem u m a forte influência (designado ponte
influente). Repare que n ã o se trata de u m p o n t o periférico, apenaí
10 - u m p o n t o aberrante com relação ao intervalo.
Embora seja a medida relevante para erro aleatório nos estudoí
comparativos de métodos, p ainda é a m p l a m e n t e utilizado comc
suposição de medida entre os dois métodos. C o n v é m notar que um£
diferença sistemática n ã o é expressa por p; assim, embora o coefi
ciente de correlação seja m u i t o elevado, p o d e haver u m viés conside
rável entre as medições dos dois métodos.

10 í>0 30 Análise de Regressão em Caso de Erros Aleatórios

Jí1 Proporcionais
C o m o discutido em relação ao perfil de precisão, para analitos cotr
intervalos amplos (p. ex., u m a ou várias décadas) o SD A raramente t
5 -
constante. A o contrário, u m a relação proporcional p o d e ser aplicada
Isso t a m b é m p o d e ser verdade paTa os c o m p o n e n t e s de viés aleatório
Nessa situação os procedimentos de regressão descritos anteriormente
ainda p o d e m ser utilizados, mas esses n ã o são ideais p o r q u e os erros
padrão de inclinação e interseção tornam-se maiores que aqueles o n d í
é aplicada u m a forma p o n d e r a d a de análise de regressão. As aborda-
w
o gens ideais são formas ponderadas de análise que levam em conta E
"D
ra relação entre o erro aleatório e a concentração do analito. 1011 Dad c
N
'c o Qn u m a relação proporcional, u m procedimento p o n d e r a d o atribui pesoí
o nOfl _ . CD
(pO(J3Ü maiores às observações em faixas inferiores, essas faixas de observa
~n ° O O
tc O O ções são mais precisas d o que aquelas que representam altas concen
CL
OT trações, que estão sujeitas a erros aleatórios maiores. Mais especifica
rd mente, as ponderações são aplicadas aos cálculos que são inversa
Z)
•g
"w m e n t e proporcionais ao q u a d r a d o de S D (variâncias), q u e expressa c
0 erro aleatório. Na forma p o n d e r a d a da análise de regressão doí
C£
m í n i m o s quadrados (WLR), as distâncias {xl, e x2,) com relação £
linha n o sentido vertical são inversamente ponderadas de acordo c o n
o q u a d r a d o do valor SD A em d e t e r m i n a d o nível de concentraçãc
B -5 (Figura 13-23). Abordagens computacionais para a realização de WLB
10 20 30 estão disponíveis em outra publicação 1 0 e não serão repetidas aqui.
O m é t o d o de D e m i n g também pode ser realizado de forma p o n
(x1+x2)/2
derada (p. ex., assumindo-se SD s proporcionais). Na modificação p o n
derada do procedimento de Deming, distâncias a partir de (xl, e x2'„
Figura 13-21 A, Gráfico de dispersão com linha de regressão de
com relação à linha são inversamente ponderadas de acordo com c
D e m i n g (linha sólida), com u m outlier (ponto cheio). A l i n h a reta
q u a d r a d o de SD em u m a determinada concentração (Figura 13-24)
p o n t i l h a d a é a diagonal e a linha curva tracejada demarca a região de
Os procedimentos de regressão são utilizados de forma mais conve
confiança 9 5 % . B, Gráficos residuais padronizados com indicação de
niente q u a n d o realizados com aplicativos de computador específicos,
outlier.

Os c o m p o n e n t e s de erro aleatório total incluem t a n t o impreci-
sões q u a n t o interferências aleatórias relacionadas com a amostra
(isto é, a 2 ,! = <52a1 + c^RBj e g2i2 = g2a2 + a 2 R B 2 ). Assim, p é u m
indicador relativo da quantia de dispersão em t o r n o da linha de
regressão. Se o intervalo de valores é curto, p t e n d e a ser baixo,
e vice-versa, por u m longo intervalo de valores. Por exemplo,
considere exemplos simulados em q u e os erros aleatórios xl e x 2
são os mesmos, mas a amplitude de distribuição de valores-alvo
diferem (Figura 13-22, A-B). E m (A) os valores-alvo são distribuí-
dos u n i f o r m e m e n t e ao longo d o intervalo de 1 a 3, e em (B) o
Testes de Linearidade
A divisão de erro sistemático em u m c o m p o n e n t e constante e urr
proporcional d e p e n d e d o pressuposto de linearidade, que deve sei
testado. U m teste conveniente é corridas-teste, que, pressupõe-se
avalia se os desvios negativos e positivos dos p o n t o s com relação i
linha são distribuídos aleatoriamente ao longo de um intervalo de
medição analítica. O termo corrida refere-se aqui a u m a seqüência df
desvios com o m e s m o sinal. Considere, por exemplo, a situação, corr
u m a tendência descendente de valores xl na extremidade superior dt
intervalo de medição analítica (Figura 13-25, A). Os desvios padroni
zados acima e abaixo da linha (isto é, os resíduos) tenderão, então, í
ser negativos nessa área, em vez de serem distribuídos aleatoriamente
226 PARTE III Operações Laboratoriais

Figura 13-23 Distâncias entre pontos e a linha na direção vertical

em WLR, assumindo SDs proporcionais para erros aleatórios em xl e
nenhum erro aleatório em xl. (De Linnet K. Ne cessar} sample size for
metkod compariscn SÍUJÍÍÊS hased on REGTÈSSÍON ANAÍJSIÍ. Clin Ctam
1999;45:882-94.)

*1

Figura 13-24 Distâncias de pontos e a linha de regressão

ponderada de Deming assumindo erros aleatórios proporcionais em x l e
Figura 1 3 - 2 2 Gráficos de dispersão ilustrando o efeito do intervalo sobre
xl. O caso simétrico é ilustrado c o m erros aleatórios iguais e um declive
o valor do coeficiente de correlação p A, Os valores-alvo estão distribuídos
de uma unidade produzindo projeções ortogonais sobre a linha. (De
uniformemente ao longo do intervalo de 1 a 3 com erros aleatórios de x l e
Linnet K. NecejMry sample size for methad ccmparison stutiies baseA cm
x2 correspondendo a um SD de 5% do valor-alvo em 3 (erro de S D
regressiOTi tmafysis. Clin Cftóm 1999;45:882-94 )
constantes). B, O intervalo i estendido para I a é com os mesmos níveis de
erros aleatórios. O coeficiente de correlação é igual a 0,93 em A, e 0,99 em
R Em C, o efeito de um único ponto aberrante i mostrado. Quarenta e nove
dos valores-alvo são distribuídos ao longo do intervalo 1 a 3, com um único
ponto em 6. O coeficiente de correlacão é 0,97.
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas CAPÍTULO 1 3 227

acima e abaixo da linha 1 0 (Figura 13-25, B). D a d o u m n ú m e r o
suficiente de pontos, tal sequência tornar-se-á estatisticamente
significativa em coiridas-teste.
Análise de Regressão Não-paramétrica
(Passing-Bablok)
A inclinação e a interseção p o d e m ser estimadas por u m proce-
dimento não-paiamétrico, que é robusto para outíiers e não exige
pressupostos de distribuições gaussianas de erro. 13 Observe, no
entanto, que os procedimentos de regressão paramétricos não
presumem distribuições gaussianas de valores-alvo, mas apenas
distribuições de erro. Assim, a principal vantagem do procedi-
mento não-paramétrico é o d e s e m p e n h o robusto na presença de
owílirn. O método leva em conta erros de xl e *2, mas o método
pressupõe que a razão entre erros aleatórios está relacionada com
o inclinacão de maneira fixa:
SD 3 proporcionais. O método não é tão eficiente quanto os
procedimentos paramétricos correspondentes (isto é, procedi-
mentos de Deming e de Deming ponderado). 1 0 Inclinação e
interseção com Cls são fornecidas j u n t a m e n t e com coeficiente
de correlação de classificação de Spearman. U m aplicativo de
computador é necessário para o procedimento.
Princípio de Computação
O procedimento consiste em calcular todos os conjuntos de
inclinações possíveis a partir do c o n j u n t o de valores N (xl, x2):
Sf] = (x2, - x2j)/(xli - xl) para 1 < i < j < N
A inclinação é, em princípio, obtida como u m deslocado de
mediana
=
i Sth - U/2 + k) para n ímpar

X =(SD 2 R B 1 + S D ^ ) / ( S D 2 R B 2 + S D L ) = l ^ 2 b = exp((log{S(ll/2 • Kj) + log(S W 2 + j + íq))/2)

para n par (média geométrica)
Caso contrário, uma estimativa enviesada de inclinação é
obtida. 10,13 O procedimento p o d e ser aplicado tanto em situações onde TI é o n ú m e r o total de valores StJ e K é o n ú m e r o de valores
de erros aleatórios com SD s constantes, quanto em casos com S, abaixo de -1. A interseção a 0 é obtida como a mediana de
todos (xli - ÍBcli).
Cls para inclinação e interseção são derivados conforme já
250 n descrito. 1 ' N e n h u m erro-padrão é obtido nesse procedimento
p u r a m e n t e não-paramétrico. Se o C l para o declive não inclui 1,
200 - ar o desvio é estatisticamente significativo e análogo à interseção.
<A o
Interpretação de Diferenças Sistemáticas entre
Métodos Obtidos com Base em Análise de
Regressão
100 A diferença sistemática entre dois métodos é identificada se a
interseção estimada diferir, de m o d o significativo, de zero ou o
declive desviar também significativamente de 1. Isto é decidido
50 com base nos testes t

0 t - (fl 0 - 0 ) / S E ( ü 0 )
0 25 50 75 100 125 15G t = (b-l)/SE(b)
x1
SE(ao) e SE(b) são erros-padrão da interseção estimada a 0 e o
40 declive b, respectivamente. Para O L R e WLR, os erros-padrão são
o calculados a partir de fórmulas apresentadas em outra publica-
•a
ca ção.10 Essas fórmulas t a m b é m se aplicam, aproximadamente, aos
N
n 20
"c procedimentos de D e m i n g e D e m i n g p o n d e r a d o . U m procedi-
O
L_
•a m e n t o exato é a aplicação de u m princípio de reamostragem
S. o 0 ^ C- -
computadorizado designado procedimento Jackknife, que, na
prática, pode ser realizado utilizando-se u m aplicativo apro-
"cn priado. 11
Cl o 0
Í -20 Cí Tendo estimado a 0 e b, temos a estimativa da diferença siste-
f/3
(1)
ce mática entre os métodos, Dc, em uma concentração selecionada
1
XIaIvoc
-40
Dc X2 XI Atvoc ^0 (b-l)Xl Alvoc
25 50 75 100 125 150
(xl +x2)l2 X2'AiV[)[esic é o valor-alvo estimado de 9Í2' alvo em Xl' c . Observe
que Dc refere-se à diferença sistemático (isto é, a diferença entre
Figura 1 3 - 2 5 Superior, Gráfico da dispersão mostrando um exemplo os valores-alvo) e, por isso, não é u m erro total, incluindo erros
de não-linearidade na forma de valores xl de desvios descendentes na de medição aleatórios.
parte superior do intervalo. Inferior, Gráficos de resíduos mostrando o O erro-padrão da diferença sistemática estimada Deltac deve
efeito da não-linearidade. Na extremidade superior do intervalo de ser considerado. A fórmula se aplica a O L R
medição analítica, uma seqüência (corrida) de resíduos negativos está
presente desde x = 150 até 200. SEÍDeítaJ = SD 2 1 [1/N + (Xl'Mvoc - xj2/u 10,5
228 PARTE III Operações Laboratoriais

Para W L R temos a fórmula análoga

SE(DeÍMc) = kall/Zw, + ( X l * ^ - x J 2 / u J 0 ' 5 3.000 o

o //
o n d e k?i = |?.(v2i - (X2' A i r o ( = J 2 /t«/(N -2)] 0,5 . As fórmulas anterio-
res para O L R e W L R se aplicam, aproximadamente, às regressões
de Deming e Deming ponderada, respectivamente. U m procedi- ^ 2.000 J
• J f
m e n t o exato consiste em aplicar o procedimento Jackknife utili-
zando u m programa de computador. 1 1 Ao avaliar o erro-padrão CM
em toda a faixa de medição analítica, uma região de confiança V
1.000
para a linha estimada pode ser mostrada. Fica claro pela estrutura

/
das fórmulas que a região de confiança é mais estreita n o centro
do intervalo (xm ou x^J. Se a comparação de métodos é realizada
para avaliar a capacidade de acompanhar a execução, a correção
de u m a diferença sistemática significativa Deltae será freqüente-
1.000 2.000 3.000
m e n t e realizada por recalibração (*2rec = (xl -ra0)/fc>)).A incerteza-
padrão associada é o erro-padrão de Deltac. Ainda que a interse- x1 (nmol/L)
ção e a inclinação não sejam significativamente diferentes de zero
e um, respectivamente, a expressão combinada Deltac p o d e ser 5 i
significativamente diferente de zero. Isso pode ocorrer em situa-
ções o n d e inclinação e interseção estejam no mesmo sentido
(Figura 13-14). o
"O
ta o o o
N
Exemplo de Aplicação de Análise de Regressão "E
o o
(Análise de Deming Ponderada) cc oo
Q- o
A aplicação de análise de D e m i n g ponderada p o d e ser ilustrada -e$r O CK^O> O
W?
pelo exemplo de comparação de ensaios droga (medições N = 65 "râ „o
o % Oo
(xl, x2). C o n f o r m e descrito anteriormente, neste exemplo o erro oo
aleatório das diferenças a u m e n t a com a concentração, sugerindo <U
CU
que a forma ponderada da análise de Deming está correta. A
Figura 13-26 mostra (A) a linha de regressão estimada com inter-
valos de confiança de 9 5 % e (B), u m gráfico de resíduos. A dis-
persão quase homogênea n o gráfico de resíduos apóia o modelo -5
de erro aleatório proporcional presumido e o pressuposto de 1.000 2.000 3.000
linearidade. A estimativa de inclinação (1,014) não é significati-
B (x1+x2)/2
vamente diferente de 1 (Cl 95%: 0,97 a 1,06) e a interseção não
é significativamente diferente de zero (Cl 95%: -6,7 a 47,4)
(Tabela 13-6). Corridas teste de linearidade não contradizem a Figura 13-26 U m exemplo de análise de regressão de Deming
ponderada paca comparação de ensaios de droga. A, A linha sólida é a
suposição de linearidade. A quantidade de erro aleatório é deter-
estimativa da linha de regressão ponderada de Deming, as curvas
minada em forma de fator de proporcionalidade SD^i igual a 0,11
tracejadas indicam a região de confiança 95%, e a linha pontilhada é a
ou 11%. N o presente exemplo, com inclinação próxima à u n i d a d e
linha de identidade. B E um gráfico de resíduos padronizados para
e dois métodos de campo com erros aleatórios pressupostos de
unidade de SD. A dispersão homogênea sustenta o modelo do erro
aproximadamente a mesma magnitude, dividimos o erro aleató-
proporcional assumido e a pressuposição de linearidade.
rio pela raiz quadrada de dois e obtemos CV T i = C V ^ = 7,8%.
Dados de controle de qualidade de laboratório têm fornecido
C V A S de 6,1% e 7,2% para os métodos 1 e 2, respectivamente.
Assim, neste exemplo, o erro aleatório pode ser, em grande parte,
atribuído ao erro analítico. O princípio do ensaio se aplica a
ambos os métodos de H P L C , que geralmente é um princípio TABELA 13-6 Resultados de Análises de Regressão de
específico de medição, e efeitos de viés aleatório consideráveis D e m i n g Ponderada para a Comparação de
não são esperados neste caso. Se u m ou ambos os métodos Exemplo de Ensaios de Drogas Medidas
fossem imunoensaios, a situação poderia ter sido diferente. de N = 6 5 (xl, x2)
Na tabela o valor estimado de diferenças sistemáticas nos
Estimativa SE Cl 95%
limites de intervalo terapêutico (300 e 2.000 n m o l / L ) são exibidos
(24,6 e 48,9 n m o l / L , reciprocamente). Isso corresponde a valores Inclinação (6) 1,014 0,022 0,97 a 1,06
percentuais de 8,2% e 2,4%, respectivamente. Os erros-padrão Interseção ( a j 20,3 13,5 - 6,7 a 4 7 4
estimados pelo procedimento Jackknife resultam em C l 95%, Coeficiente de correlação 0,98
como mostrado na tabela. E m concentração baixa, a diferença é ponderada
significativa (Cl 95%: 5,7 a 44 n m o l / L não inclui zero), que não Fator de proporcionalidade SD21 0,11
é o caso em nível elevado (CT 95%: - 1 9 a 117 nmol/L). Embora Corridas-teste para n.s.
as estimativas de interseção e inclinação, em separado, não sejam linearidade
Deltac = X i - X em 24,6 9,5 5,72 a 43,6
significativamente diferentes de valores hipotéticos nulos de zero
JÇ. = 300
e 1, de forma respectiva, a diferença combinada de Deltac é signi-
Deltac = X2 - X, em 48,9 34,2 - 1 9 , 3 a 117
ficativa em baixas concentrações neste exemplo. Se a diferença for
X = 2.000
considerada de importância médica e ambos os métodos estive-
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas
rem sendo utilizados simultaneamente n o laboratório, u m a reca-
libração de u m dos métodos deverá ser considerada.
Discussão de Aplicação de Análise de
Regressão
A maioria das avaliações de m é t o d o publicadas falha ao aplicar
u m a análise de regressão rigorosa. Esta seção considera tanto a
utilização de OLR, em vez de regressão de Deming, quanto a
utilização de análise não-ponderada para o estabelecimento de
erros aleatórios proporcionais.
O L R é o procedimento de análise de regressão mais utilizado
em estudos de comparação de métodos. Assim, é i m p o r t a n t e
considerar o significado da não-consideração de eTros de medição
xl, conforme descrito a n t e r i o r m e n t e (Figuras 13-18 e 13-19). O
problema de viés relativo a declive é mais significativo q u a n d o se
trata de faixas de medição estreitas (p. ex., q u a n d o se compara
medidas de eletrólitos). Foi r e c o m e n d a d o que OLR pode ser
aplicado q u a n d o o coeficiente de correlação for superior a 0,975
ou 0,99.^ O coeficiente de correlação, c o n t u d o , cambem d e p e n d e
do erro aleatório xl, que não tem qualquer influência sobre a
questão d o viés. O viés de escimativa de inclinação tem c o m o
conseqüência para a análise estatística o a u m e n t o de erro do Tipo
I (isto é, a hipótese nula é rejeitada com demasiada freqüência).
D e p e n d e n d o do intervalo de concentrações de teste considerado
e da quantidade de erro aleatório associado a xl, esse a u m e n t o
pode ser várias vezes superior ao nível n o m i n a l de 5%. Se o
intervalo de valores-alvo X I ' é amplo (p. ex., correspondendo a
várias décadas), o problema é negligenciável.
Em estudos atuais de comparação de métodos é frequente a
aplicação de formas não-ponderadas de análise (isto é, O L R e
procedimento de Deming), embora os SD s variem com a concen-
tração medida, como ocorre com u m a relação proporcional
(constante CV A ). Assim, é de interesse considerar o que acontece
nessas situações. 10
Basicamente, O L R fornece estimativas imparciais de inclina-
ção e interseção, s e x l n ã o apresenta erro aleatório, independen-
temente d o SD dc erro aleatório x2 ser constante ou variar com
a concentração medida. Da mesma forma, o procedimento de
D e m i n g fornece estimativas imparciais de inclinação e interseção
q u a r do SD varia, desde que a razão entre esses seja constante em
toda a faixa de medição analítica. Esse aspecto é i m p o r t a n t e e
significa que, em geral, as estimativas de inclinação e interseção
são confiáveis nessa situação, q u e f r e q ü e n t e m e n t e é encontrada.
N o entanto, outros aspectos devem ser considerados: a confiabi-
lidade da análise estatística associada e a eficiência dos procedi-
mentos de estimativa não-ponderada. A presença de u m SD A
proporcional para medições de x2 tende, independentemente, a
aumentar o erro do tipo 1 para o teste de desvio de inclinação
utilizando o procedimento OLR, pois o erro-padrão de inclina-
ção é subestimado. O f e n ô m e n o é mais p r o n u n c i a d o para distri-
buições de valor-alvo assimétrico, onde o erro d o Tipo I pode
aumentar de três a quatro vezes, passando a 15% a 20%, compa-
rado-se ao nível n o m i n a l de 5%. 1 0 Para distribuições de valor-alvo
uniformes e gaussianas, o a u m e n t o chega até 7,5% e 10%, res-
pectivamente. Finalmente, a precisão de estimativas de inclinação
e interseção é inferior àquela de W L R em caso de u m SD A pro-
porcional para medições xl. Para u m a razão de intervalo de 10
a estimativa de inclinação, com certa precisão, necessita de 2,3
vezes mais observações, q u a n d o comparada com o procedimento
W L R . Para a interseção, o fator é 3,9."
O principal problema associado à aplicação da análise de
Deming não-ponderada, em caso de SD A s proporcionais consiste
n o nível sub ideal da abordagem não-ponderada. Para distribui-
ções uniformes com razões de intervalos de 2 a 100, são necessá-
CAPÍTULO 13 229
rias 1,2 a 3,7 vezes mais amostras para obter a mesma precisão
de estimativa de inclinação não-ponderada, comparada com a
abordagem ponderada. Dessa maneira, quanto maior a razão de
intervalo, mais ineficaz é o m é t o d o não-ponderado.
ACOMPANHAMENTO DE RESULTADOS
SERIADOS
U m aspecto importante na química clínica constitui n o
a c o m p a n h a m e n t o de doença ou tratamento (p. ex., marcadores
tumorais, em caso de câncer, ou concentrações de drogas n o caso
de controle terapêutico de medicamento). Para avaliar as altera-
ções de maneira racional, os diversos componentes de imprecisão
devem ser considerados. , d Variações biológicas intramaterial
(SDJMA.B), pré-analíticas (SDPA) e analíticas (SD a ) devem ser iden-
tificadas. Assumindo-se que a variação pré-analítica já esteja
incluída n a variação de SD intramaterial, u m SD total (SD T ) pode
ser estimado:
SD 2 T = SD 2 , nm , B + S D 2 a
O limite de mudanças estatisticamente significativas, assim, é
kV2 S D t , o n d e k d e p e n d e d o nível de probabilidade desejado.
C o n s i d e r a n d o u m nível bicaudal d e 5 % , k é 1,96. O fator mono-
caudal correspondente é 1,65. Se u m nível de probabilidade
superior é desejado, k deve ser a u m e n t a d o .
RASTREABILIDADE E MEDIÇÃO DE
INCERTEZA
C o n f o r m e descrito anteriormente, nas seções sobre modelo de
erro, resultados laboratoriais são suscetíveis a erros sistemáticos
e aleatórios de vários tipos. A obtenção de concordância de
medições entre laboratórios, ou por longo período em determi-
n a d o laboratório, muitas vezes pode sei problemática.
Rastreabilidade
Para garantir concordância razoável entre as medições de métodos
de campo, o conceito de rastreabilidade entra em foco. A rastrea-
bilidade é baseada n u m a cadeia ininterrupta de comparações de
medições, conduzindo a u m valor de referência conhecido (Figura
13-27). Tietz propôs u m a abordagem hierárquica para rastrear
valores de medições de rotina de métodos de referência e defini-
tivos em química clínica, e essa abordagem foi adaptada pela ISO
(p. ex., ver as orientações ISO 15193 e 15194). Para analitos b e m
estabelecidos, existe uma hierarquia de métodos com u m proce-
d i m e n t o de referência primário n o topo, procedimentos de referên-
cia secur\dários em u m nível intermediário e, finalmente, métodos
de rotina, na parte inferior. 15 U m procedimento de referência
primário é u m procedimento inteiramente compreendido, da
mais alta qualidade analítica e com a estimativa total de incerteza
dada em unidades SI. 5 Os resultados obtidos pelo método de
referência primário são alcançados sem que sejam comparados
com u m calibrador de referência d o analito a ser medido. O
procedimento de referência primário é utilizado para atribuir
valores aos calibradores primários. Posteriormente, o calibrador pri-
mário é aplicado na calibração de procedimentos de referência
secundários. Procedimentos de referência secundários são utiliza-
dos para medir a concentração do analito em calibradores secundá-
rios, que n o r m a l m e n t e têm matriz semelhante àquela da amostra
que está sendo medida por procedimentos de rotina (p. ex., soro
h u m a n o ) . Calibradores secundários geralmenre possuem elevada
qualidade analítica e são certificados. Lltilizando-se o cortisol
como exemplo, o procedimento de medição primário pode con-
sistir em pesagem de cortisol e em u m a análise química de
impurezas. U m calibrador primário é, então, u m a preparação de
230 PARTE III Operações Laboratoriais
Atribuição de valor
Cal.: calibração
Figura 13-27 Hierarquia de calibração de u m m é t o d o primário
para u m m é t o d o de rotina. A incerteza a u m e n t a de cima para baixo.
cortísol com fração de massa estabelecida (pureza) (p. ex., 0,998
e C l de 9 5 % ± 0,001). O procedimento de medição de referência
secundária é u m método de diluição isotópica que utiliza espec-
trometria de massa associada à cromatografia a gás. Após o cali-
brador secundário, temos u m procedimento de medição utili-
zado em preparação comercial de reagentes, calibradores e kits
analíticos para utilização rotineira em laboratórios de química
clínica. O procedimento de medição selecionado é calibrado com
u m calibrador primário ou secundário e é utilizado para a
medição de quantidade n o calibrador de trabalho do fabricante.
Esse último é utilizado para calibrar o procedimento de medição
regular da companhia, que é u m método validado n o que di2
respeito à especificidade analítica. O procedimento de medição
regular é aplicado para a quantificação do produto calibrador, que
é o calibrador para o método de rotma. A incerteza de procedi-
mentos de medição a u m e n t a a partir do topo em direção à
base.
Apenas u m a minoria (25 a 30) de analitos de química clinica
é rastreável por unidades SI (p. ex., eletrólitos), alguns metabóli-
tos (glicose, creatinina e ácido úrico), esteróides e alguns hormô-
nios da tiróide. Para h o r m ô n i o s proteicos, a existência de hete-
rogeneidade ou micro-heterogeneidade complica a questão de
rastreabil idade.
Conceito de Incerteza
Para avaliar erros associados a resultados laboratoriais de uma
forma sistemática, o conceito incerteza foi introduzido em labora-
tório médico. 6 De acordo com ÍSO Guide to the Expresswn of
Uncertainty in Measurement ("GUM"), a incerteza é formalmente
definida como "um parâmetro associado ao resultado de uma
medição, que caracteriza a dispersão de valores que poderiam ser
os de m o d o lógico atribuídos ao determinando".' Na prática, isto
significa que a incerteza é dada como u m intervalo em torno de
u m resultado laboratorial relatado que especifica o local do valor
verdadeiro com u m a determinada probabilidade (p. ex., 95%).
Em geral, a incerteza de resultado, que é rastreável para uma
referência particular, é a incerteza daquela referência juntamente
com a incerteza global da cadeia de rastreabilidade. 6 Informações
atualizadas sobre aspectos da rastreabilidade encontram-se dispo-
niveis na internet na página do Joínt Commitíee on Traceability in
Laboratory Medicine (wu)W.bipm.org/en/committees/ic/ictlm/, Acces-
sed January, 2007).
Incerteza-padrão (us1)
O conceito incerteza é voltado para o usuátio final (médico) do
resultado, que está preocupado com o erro total possível e que não
está particularmente interessado se os erros são sistemáticos ou
aleatórios. No esboço do conceito de incerteza assume-se que qual-
quer componente de erro sistemático conhecido de u m método
de medição tenha sido corrigido, e a incerteza especificada inclui
a incerteza associada à correção de erro(s) sistemático(s). 6
Na teoria da incerteza, uma distinção entre as incertezas Tipo
A e B é realizada. As incertezas do Tipo A são estimativas basea-
das em freqüências de SDs (p. ex., u m SD de imprecisão). As
incertezas do Tipo B são componentes de incerteza para os quais
SDs baseados em freqüências não estão disponíveis. Ao contrá-
rio, a incerteza é estimada por outras abordagens ou pelo parecer
dos peritos. Finalmente, a incerteza total é derivada de uma
combinação de todas as fontes de incerteza. Nesse contexto, é
prático operar com incertezas-padrão (tO, que são equivalentes aos
SDs. A incerteza correspondente a u m determinado nível de
probabilidade é derivada da multiplicação de u m a incerteza-
padrão por u m fator de cobertura (k). Por exemplo, a multiplicação
por u m fator de cobertura de dois produz u m grau de probabili-
dade de « 9 5 % , resultando em distribuição gaussiana. Ao consi-
derar a incerteza total de u m resultado analítico obtido por u m
método de rotina, a variação pré-analítica, a imprecisão do
método, interferências aleatórias relacionados com matriz e
incertezas associadas à calibração e correções de vieses (rastreabi-
lidade) devem ser levados em conta. Expressando os componen-
tes de incerteza como incertezas-padrão, temos a relação geral;
.. —L.2 _1_
2 2
_!_ 2
l05
' PAst ^Aa Hg st ^TracstJ
o n d e os componentes individuais referem-se a incertezas pré-
analítica, analitica, do viés aleatório relacionadas com matriz e
rastreabilidade.
A incerteza pode ser avaliada de várias formas e, muitas vezes,
uma combinação de procedimentos é necessária, Em principio a
incerteza p o d e ser julgada diretamente por comparação entre
medições, ou indiretamente, a partir de uma análise individual de
fontes de erro, de acordo com a lei de propagação de erro ("esti-
mativa de eiro"). A comparação de medição pode consistir em
um estudo comparativo de métodos, com u m m é t o d o de referên-
cia baseado em amostras de pacientes, de acordo com os princí-
 Seleção e Avaliação Analítica de Métodos — Por Técnicas Estatíticas CAPÍTULO 1 3 231

pios a n t e r i o r m e n t e enunciados ou p o r medição de materiais de Trata -se de uma relação complexa q u e n o r m a l m e n t e será difícil
referência de matriz certificados. de avaliar na prática. Em muitas situações, n o e n t a n t o , os fatores
contribuintes são independentes, simplificando assim o cenário.
Exemplo de Avaliação Direta da Incerteza Baseado Abaixo, alguns exemplos simples de expressões combinadas são
em Medições de um Material de Referência mostrados. As regras são apresentadas sob a f o r m a de SDs com-
Certificado binados ou coeficientes de variação (CVs) u m a vez que os com-
S u p o n h a que u m m a t e r i a l d e referência certificado (CRM) p o n e n t e s de entrada são independentes.
esteja disponível com u m valor d e t e r m i n a d o 10,0 m m o l / L e u m a
incerteza-padrão de 0,2 m m o l / L . Dez medições repetidas e m q=x +y SD(ÍJ) = [ S D ( X ) 2 + SDCJ) 2 ] 0 , 5
corridas i n d e p e n d e n t e s f o r n e c e m u m valor médio de 10,3 m m o l /
L com S D de 0,5 m m o l / L . O erro-padrão da média é, então, q=x-y SDiq)=[SD(x)2 + SD(y)2r
0 , 5 / V 10 - 0,16 m m o l / L . A m é d i a n ã o é significativamente dife-
rente do valor atribuído (t = (10,3 - 10,0)/(0,2 2 + 0,16 2 ) 0,5 = 1,17). q =ax S D ( Q ) = A S D ( x ) e C V ( < j ) = C V (x)
A incerteza-padrão total n o que diz respeito à rastreabilidade é,
então, "Tiacsi = [0>162 + 0,2 2 ] 0,5 = 0 , 2 6 m m o l / L . Se o viés tiver sido q=xp CV(q) =p°'5CV(x)
significativo, deve ser considerada u m a correção do m é t o d o e a
incerteza-padrão seria a m e s m a e m u m nível determinado. Assim, q=xy C M 4 ) = [ C V ( X ) 2 + CV(^) 2 ] 0 ' 5
as medições d o C R M f o r n e c e m uma estimativa de incerteza
associada à rastreabilidade. O s outros c o m p o n e n t e s devem SÊT q -x /y CW{q) = [ C V W 2 + C V ( ? ) 2 ] 0 ' 5
estimados separadamente. N o q u e diz respeito à imprecisão de
método, a imprecisão a longo prazo (p. ex., observada a partir de
Por exemplo, as fórmulas mostradas p o d e m ser utilizadas para
medições de controle de qualidade) deveria ser utilizada em vez
calcular a incerteza c o m b i n a d a de u m a solução calibradora, a
d o SD a curto prazo observado para o C R M . A q u i s u p o m o s que
partir das incertezas de compostos d e referência, pesagem e etapas
o S D a de longo prazo é de 0,8 m m o l / L . D a d o s sobre variação
de diluição.
pré-analírica p o d e m ser obtidos p o r amostragem de u m a séTie de
Algumas relações entre a S D e distribuições não-gaussianas
pacientes, em duplicata ou p o r j u l g a m e n t o (incerteza d o Tipo B)
t a m b é m p o d e m ser de relevância para os cálculos de incerteza
de dados da literatura o u dados sobre analitos semelhantes. Pre-
(Tabela 13-7). Assim, se a incerteza de u m valor de C R M é d a d a
s u m i m o s aqui que SD PA equivale à m e t a d e d o SD analítico (isto
com alguma percentagem, isso pode ser e n t e n d i d o c o m o referên-
é, 0,4 m m o l / L ) . Finalmente, n ã o possuímos informações sobre
cia à distribuição de probabilidade retangular. C o m relação à
eventual c o m p o n e n t e de viés aleatória que possamos escolher
calibração de frascos, a distribuição triangular f r e q ü e n t e m e n t e é
para ignorar n o presente exemplo. A incerteza-padrão de resulta-
utilizada.
dos torna-se, então

"x = 1 " PA a + uí + w t _ c J 0 , 5 = [0,4 Z + 0,8^ + 0 , 2 6 ^210.5

] ORIENTAÇÕES, EXIGÊNCIAS REGULADORAS
— 0,93 ( m m o l / L )
Neste caso, os c o m p o n e n t e s principais de incertezas é a impreci-
são a longo prazo n o laboratório.
Avaliação Indireta da Incerteza peia Quantificação
dos Componentes de Fonte de Erro Individuais
C o m base n u m m o d e l o quantitativo d e t a l h a d o de p r o c e d i m e n t o
analítico, a abordagem-padrão avalia as incertezas associadas aos
parâmetros de entrada individuais e c o m b i n a esses c o n f o r m e a
lei de propagação de incertezas. 6 A relação entre a incerteza-
p a d r ã o c o m b i n a d a u c (j) de u m valor y e a incerteza de parâmetros
independentes jq, x2.. *n dos quais essa d e p e n d e é
0,5
H c b ( x l , x 2 , . . )] = [ S c , 3 t í ( x i ) 3 ]
o n d e q é u m coeficiente de sensibilidade (o diferencial parcial de
y com relação a x,). Esses coeficientes de sensibilidade indicam
c o m o o valor de y varia e m f u n ç ã o de m u d a n ç a s nos parâmetros
de entrada x,. Se as variáveis n ã o são independentes, a relação
torna-se
0.5
u c b ( * i . * f c - - •)] = [ £ c M * ; ) 2 + [ S = 1 c l u ( « ( , x k ) 1 ]
E LICENCIAMENTO
Várias orientações e exigências normativas são de relevância c o m
relação aos m é t o d o s analíticos utilizados n a química clinica.
Exemplos de orientações d o CLSI são citados e m subseções indi-
viduais e e m vários d o c u m e n t o s ISO. Aqui, algumas orientações
gerais serão brevemente mencionadas.
ISO 15189 Medicai Laboratories Particular Requirementsfor Quality
and. Oompetence é u m p a d r ã o universal para a gestão de qualidade
e m laboratórios médicos, q u e especifica requisitos em t e r m o s
gerais, aplicáveis a todas as áreas. 9 A p a d r o n i z a ç ã o p r e t e n d e
f o r m a r a base para a certificação d e laboratórios médicos. E m
adição às condições gerais de l a b o r a t ó r i o c o m relação ao con-
trole de qualidade, a padronização sobre a c o m p e t ê n c i a médica,
interpretação de resultados de testes, seleção de testes, interva-
los de referência, aspectos éticos e segurança. U m anexo é
relacionado com a gestão da q u a l i d a d e de sistemas de c o m p u -
t a d o r de laboratório.
T A B E L A 1 3 - 7 I Relações entre Desvio-padrão e
Intervalo para D i v e r s o s T i p o s de
Distribuições

Distribuição Distribuição
o n d e u(xj, xk) é a covariância entre x, e xi, e c, e a são os coefi- Distribuição Gaussiana Retangular Triangular
cientes de sensibilidade. A covariância está relacionada com o
SD = Metade da largura SD = Metatte da SD = Metade
coeficiente de correlação por
de intervalo 95%/t o g 7 5 (v) largura/V3 da largura/V6
~ metade da largura de
intervalo 95%/2
232 PARTE III Operações Laboratoriais
N o que diz respeito às exigências normativas, os regulamentos
d o CLIA nos Estados U n i d o s têm exercido u m a grande influên-
cia sobre considerações na qualidade em química clínica (Tabela
13-4). Sob a perspectiva d o fabricante, os requisitos da Food and
Drug Adminiscration (FDA) para a validação de novos ensaios são
de primordial importância nos Estados U n i d o s . Na Europa, a
diretiva IVD (Directive 98/79 of tfie Europeãn Cornmunity on ln-Vitro
Diagnostics) é uma regulamentação legislativa européia dirigida a
diagnósticos resultantes de manipulação m vitro. A diretiva exige
que o fabricante tenha u m sistema de gestão de qualidade e que
os p r o d u t o s sejam validados por laboratórios competentes. Exige-
se q u e a rastreabilidade dos valores atribuídos aos calibradores
ou materiais de controle, ou de ambos, deva ser validada por
procedimentos de medição de referência disponíveis e / o u mate-
riais disponíveis da mais elevada qualidade,
PACOTES DE PROGRAMAS DE
COMPUTADORES
G e r a l m e n t e as análises estatísticas de huje sãu realizadas em
planilhas ou por programas de estatística. N o que diz respeito a
este último, grandes pacotes de programas gerais ou programas
mais simples, mais ou menos especializados, são aplicáveis à área
de química clínica. U m a grande diversidade de pacotes gerais está
n o mercado (p. ex., SPSS, SAS, Stata, Systat e StatGraphics).
Entre os programas de médio p o r t e pode-se m e n c i o n a r Gra-
phPad (www.graphpad.com) e SigmaStat. O Excel (Microsoft)
t a m b é m c o n t é m várias rotinas de estatística. O s programas gerais
p o d e m prescindir de procedimentos de interesse da química
clínica (p. ex., procedimentos de D e m i n g e de Passing-Bablok).
Entre os programas mais ou menos especializados para química
clínica, pode-se m e n c i o n a r Analyze-it (www.analyze-it.com),
M e d C a l c (www.medcalc.be)j EP-avaluator (D. Rhoads Assoe.,
www dgrhoads com) e u m programa distribuído por u m dos
autores (KL), CBstat (www.cbstat.com). O ú l t i m o programa
inclui rotinas automáticas para estimativa de limite de detecção
e avaliação de linearidade, de acordo com recentes diretrizes de
CLSI (NCCLS) e rotinas para formas ponderadas de análise de
regressão.
REFERÊNCIAS
1 Bland JM, A l t m a n D G . Statistical m e t h o d s for assessing agreement
between two m e t h o d s of clinicai measurement. Lnncet 1986;i:307 10
2 Clinicai a n d Laboratoiy Standards I n s t i t u t e / N C C L S . Evaluation of the
linearity of quantitative me a s ure me nt procedures: a statistical approach,
Approved guideline. C L S 1 / N C C L S D o c u m e n t EP6-A. Wayne, PA:
Clinicai and Laboratory Standards Institute, 2003.
3. Clinicai and Laboratory Standards Instituce/NCCLS. M e t h o d
comparison a n d bias estimation using patient samplcs; Approved
guideline, 2 n d ed. C L S I / N C C L S D o c u m e n t EP9-A2. Wayne, PA:
Clinicai and Laboratory Standards Institute, 2002.
4- Clinicai a n d Laboiacory Standards I n s t i t u t e / N C C L S User protocol for
evaluation of qualitative test performance; Approved guideline C L S I /
N C C L S D o c u m e n t EP 12 A. Wayne, PA: Clinicai and Laboratory
Standards Institute, 2002.
5. Dyblcaet R. Vocabulary for use in measurement procedures a n d
description of reference materiais in laboratory medicine. Eui J Clin
C h e m Clin Biochem 1997;35:141-73.
6. Ellison SLR, Rosslein VI, Williams A, eds. Eurachem/Cicac guide, C G
4: quantifying uncertainty in analytical measurement, 2 n d ed.
E U R A C H E M / C I T A C , 2000: 4, 5, 9, 17 (see www.
m e a s u t e m e n t u n c e T r a i n t y . o r g / m u / Q U A M 2 0 0 0 - l . p d f , accessed January
25, 2007).
7 Fraser C G . Biological variation- F r o m principies to practice.
Washington, D C : A A C C Press, 2001:504, 133-41.
8. Harris EK, Boyd ] C . Statistical bases of reference values in laboratory
medicine. New YOTIC. Mareei Dekker, 1995:238-50.
9 International Organization for Standardization (ISO) Medicai
laboratories—Pai ticular requirements for qualicy a n d competence
(15189). Geneva: ISO, 2003.
10. Linnet K. Evaluation of regression procedures for m e t h o d s comparison
studjes. Clin C h e m 1993;39:424-32.
11. Linnet K. Necessary sample size for method comparison studies based
o n regression analysis. Clin C h e m 1999;45:882-94-
12. Linnet K, Kondratovich M. Partly nonparametric approach for
determining the limit of detection. Clin C h e m 2004;50:732-40.
13. Passing H, Bablok W. A new biometrical procedure for testing rhe
equality of measurements f r o m two different analyrical methods. J Clin
C h e m Clin Biochem 1983;21:709-20.
14. Petersen PH, Fraser C G , Kallner A, Kenny D, eds Strategies to set
global analytical qnality specifications in laboratory medicine. Scand ]
Clin Lab Invest 1999;59(7M75-585.
15. T h i e n p o n t LM, Van Uytfanghe K, Rodriguez C D Metrological
tiaceability of calibration in the estimation and use of c o m m o n medicai
decision-making criteria. Clin C h e m Lab Med 2004:42-842-50.
CAPÍTULO 1 4

Estabelecimento e Uso de
Valores de Referência
Helge Erik Solberg, M.D., Ph.D.

OBJETIVOS se encaixem e m p a d r õ e s q u e caracterizem o u t r a s d o e n ç a s alter-

1. Definir os seguintes termos: nativas (diagnóstico p o r exclusão).
A interpretação dos dados d o laboratório médico é u m
Valor de referência
exemplo de decisão feita p o r c o m p a r a ç ã o . São necessários, por-
Valor de referência com base no indivíduo
t a n t o , valores de referência p a r a t o d o s os testes realizados e m labo-
Valor de referência com base na população
r a t ó r i o clínico n ã o a p e n a s de i n d i v í d u o s saudáveis, m a s t a m b é m
Critério de seleção
d e pacientes c o m d o e n ç a s relevantes. 6,13,14 I d e a l m e n t e , os valores
Amostra aleatória
observados deveriam ser c o m p a r a d o s c o m diversas coleções d e
Prevalência
valores de referência: valores d e pessoas saudáveis, d e u m a p o p u -
2. Comparar os critérios de seleção e exclusão e fornecer exemplos de lação não-diferenciada de u m hospital, d e pessoas c o m a d o e n ç a
cada um. típica, de i n d i v í d u o s a m b u l a t o r i a i s e valores prévios dos p r ó p r i o s
3. Determinar os intervalos de referência usando mensurações i n d i v í d u o s testados .â U m r e s u l t a d o laboratorial de u m p a c i e n t e
paramétricas e não-paramétricas. a p e n a s n ã o é c l i n i c a m e n t e útil se n ã o h o u v e r u m a c o m p a r a ç ã o
4. Definir a p r o p r i a d a d o s d a d o s . O e s t a b e l e c i m e n t o e o uso desses valores
sensibilidade clinica, d e referência são os t ó p i c o s deste capítulo.
especificidade clinica e
valor preditivo ESTABELECIMENTO DE VALORES DE
dos testes laboratoriais e como calculá-los.
REFERÊNCIA
5. Demonstrar, usando uma fórmula, como o valor preditivo de um C e r t a s c o n d i ç õ e s são necessárias para se c o m p a r a r os resultados
teste laboratorial é afetado pela prevalência. laboratoriais de u m p a c i e n t e c o m valores de referência possíveis
e válidos:
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES 1. T o d o s os g r u p o s de indivíduos-referência d e v e m ser clara-
A n á l i s e M u l t i v a r i a d a : C o n s i d e r a ç ã o de mais d e u m teste m e n t e definidos.
simultaneamente. 2. O paciente e x a m i n a d o deve assemelhar-se s u f i c i e n t e m e n t e
E s p e c i f i c i d a d e (Clínica): P r o p o r ç ã o d e i n d i v í d u o s s e m d o e n ç a c o m os indivíduos-referência (em t o d o s os grupos seleciona-
q u e a p r e s e n t a m resultados negativos. dos para c o m p a r a ç ã o ) e m t o d o s os aspectos q u e n ã o aqueles
I n d i v í d u o - r e f e r ê n c i a : I n d i v í d u o s e l e c i o n a d o c o m o base d e s o b investigação.
c o m p a r a ç ã o c o m i n d i v í d u o s sob investigação clínica, 3 A s c o n d i ç õ e s sob as q u a i s as a m o s t r a s são o b t i d a s e processa-
m e d i a n t e u s o de critério d e f i n i d o . das para a análise d e v e m ser c o n h e c i d a s .
P a r a m é t r i c o : U m a a b o r d a g e m estatística para análise de valores 4. Todas as q u a n t i d a d e s c o m p a r a d a s devem ser d o m e s m o tipo.
de referência q u e r e q u e r e m hipóteses d e distribuições 5 T o d o s os r e s u l t a d o s laboratoriais devem ser p r o d u z i d o s c o m
específicas; a a b o r d a g e m não-paramêtnca, p o r o u t r o lado, o u s o de m é t o d o s a d e q u a d a m e n t e p a d r o n i z a d o s s o b sufi-
n ã o faz n e n h u m a s u p o s i ç ã o a respeito da distribuição. ciente c o n t r o l e d e q u a l i d a d e analítico (ver C a p í t u l o 16).
P a r t i ç ã o : Processo p e l o qual u m g r u p o d e referência é 6. O s estágios na p a t o g ê n e s e das d o e n ç a s de objetivo diagnós-
s u b d i v i d i d o para reduzir a variação biológica e m cada tico devem ser m e n c i o n a d o s .
grupo. 7. Sensibilidade e especificidade diagnostica, prevalência e custos
S e n s i b i l i d a d e (Clínica): P r o p o r ç ã o de i n d i v í d u o s c o m d o e n ç a laboratoriais devem ser c o n h e c i d o s para t o d o s os testes labo-
q u e a p r e s e n t a m resultados positivos. ratoriais usados.
Valor d e R e f e r ê n c i a : Valor o b t i d o p o r observação ou
m e n s u r a ç ã o d e u m tipo particular d e q u a n t i d a d e a respeito
d e u m indivíduo-referência. Definição
O t e r m o valores normais era f r e q ü e n t e m e n t e u s a d o n o passado.
Surgiu u m a c o n f u s ã o , p o i s a palavra normal possui diversas cono-
tações m u i t o diferentes. C o n s e q ü e n t e m e n t e , esse t e r m o é agora

O
s d a d o s coletados d u r a n t e a consulta médica, o e x a m e
clínico e as investigações s u p l e m e n t a r e s precisam ser
i n t e r p r e t a d o s p o r c o m p a r a ç ã o c o m d a d o s d e referência.
Se a c o n d i ç ã o d o p a c i e n t e parece ser característica de u m a d o e n ç a
e m particular, assemelha-se a u m a d o e n ç a particular, o m é d i c o
p o d e basear o diagnóstico n a observação (diagnóstico positivo).
Esse diagnóstico é feito observando-se s i n t o m a s e sinais q u e n ã o
c o n s i d e r a d o obsoleto e n ã o deve mais ser u s a d o . E m vez disso, a
Federação I n t e r n a c i o n a l d e Q u í m i c a C l í n i c a e M e d i c i n a Labora-
torial ( I F C C ) 6 r e c o m e n d a o u s o d o t e r m o valores de referência e
t e r m o s relacionados, c o m o referência individual, limite de referência,
mtervalo de referência e valores observados. O s valores d e r e f e r ê n c i a
são r e s u l t a d o d e u m certo t i p o d e q u a n t i d a d e o b t i d a de u m ú n i c o
i n d i v í d u o o u g r u p o de i n d i v í d u o s c o r r e s p o n d e n t e a u m a descri-
234 PARTE III Operações Laboratoriais
ção declarada que precisa ser divulgada e viabilizada paia uso de
outros.
E conveniente uma breve descrição de qualidades associadas
ao termo valores de referência, como valores de referência associados
à saúde {próximo ao que se e n t e n d e pelo termo obsoleto valores
normais). Outros exemplos de palavras qualificadoras são (1)
paciente diabético, (2) paciente diabético hospitalizado e (3) paciente
diabético ambulatória!. Essas pequenas descrições evitam o engano
c o m u m de que os valores de referência estão associados apenas
a saúde.
Existe mais u m a distinção entre valores de referência com
base no indivíduo e com base na população. Os valores de referên-
cia com base no indivíduo são valores prévios, de um mesmo indi-
víduo, obtidos q u a n d o este estava em u m estado definido de
saúde. Os valares ãe referência com base na população são aqueles
obtidos de u m grupo de indivíduos-referência sistematicamente
definido e são usualmente os tipos de valores referidos q u a n d o
o termo valores de referência é usado sem palavras qualificadoras.
Seleção de Indivíduos-Referência
U m c o n j u n t o de critérios de seleção determina quais indivíduos
devem ser incluídos no grupo de indivíduos-referência. Esses
critérios de seleção incluem declarações descrevendo a fonte da
população, as especificações de critérios de saúde ou as doenças
de interesse. 6,H A seleção dos indivíduos-referência se faz com
base essencialmente na aplicação dos critérios definidos para um
grupo de candidatos examinados. As características requeridas
dos valores de referência determinam quais critérios devem ser
usados no processo de seleção. O Q u a d r o 14-1 lista os critérios
importantes para serem usados na produção de valores de refe-
rência associados à saúde.
Idealmente, o grupo de indivíduos-referência deve ser uma
amostra aleatória de todos os indivíduos na população de origem,
que preencham completamente os critérios de seleção. C o n t u d o ,
é impossível obter u m esquema de amostragem estritamente alea-
tório na maioria das situações por uma diversidade de razões
práticas. Isso poderia implicar o exame e a aplicação dos critérios
de seleção para uma população inteira (milhares ou milhões de
indivíduos), e a seleção aleatória de uma parcela de indivíduos
QUADRO 14-1 Exemplas de Critérios de Exclusão para
Valares de Referência Associados à Saúde*
DOENÇAS
Fatores de Risco
Obesidade
Hipertensão
Riscos advindos da ocupação ou do ambiente
Riscos determinados geneticamente
Ingestão de Agentes Farmacologicamente Ativos
Tratamento medicamentoso para doença ou acometimento
Contraceptivas orais
Abuso de dragas
Álcool
Tabaco
Estados Fisiológicos Específicos
Gestação
Estresse
Exercício excessivo
"O qufldio apenas lista algumas classes principais de critáríos e r!<Tw ser suplementado
com outros critérios relevantes com hase nasfontesconhecidas de variação tio lógica.
entre aqueles aceitos. Portanto, é necessário usar a melhor
amostra referência obtida após todas as considerações práticas
terem sido levadas em conta Os dados deveriam então ser usados
e interpretados com o devido cuidado por causa dos possíveis
vieses introduzidos pela não-aleatoriedade do processo de seleção
da amosrra
Muitas vezes os valores de referência são separados por sexo,
grupos de idade e outros critérios necessários. Assim, definir o
critério de partição para a subclassificação de uma parte dos
individuos-referência selecionados em grupos mais homogêneos
também p o d e ser necessário (Quadro 14-2).6,14 Os métodos esta-
tísticos p o d e m determinar se a partição é necessária. (Isso é dis-
cutido em u m a seção subseqüente nesse capítulo.) O n ú m e r o de
critérios de partição geralmente deve ser m a n t i d o o m e n o r pos-
sível para se obter amostras de t a m a n h o suficiente para a deriva-
ção de estimativas estatísticas válidas.
A idade e o sexo são os critérios mais freqüentemente usados
para o subagrupamento, pois diversas análises variam significan-
temente entre diferentes idades e gênero (ver Capítulo 3). A
idade p o d e ser categorÍ2ada em intervalos iguais (p. ex., por
décadas) ou intervalos que são limitados pelos períodos da vida
nos quais se observam grandes variações. Além disso, muitas
vezes é conveniente o uso de grupos qualitativos de idade (p. ex.,
(1) pós-natal, (2) primeira infância, (3) infância, (4) pré-púbere,
(5) púbere, (6) adulto, (7) pré-menopausa, (8) menopausa ou (9)
geriátrico). O peso e a altura t a m b é m têm sido usados como
critérios para a categorização de crianças.
Coleta de Amostras
A padronização pré-analítica da (1) preparação dos individues
antes da coleta da amostra, (2) a coleta da amostra propriamente
dita e (3) a manipulação da amostra antes da análise pode ser
eliminar ou minimizar vieses ou variações advindos desses fatores.
Esses passos podem reduzir o "ruído" biológico que de outro
m o d o poderia dissimular "sinais" biológicos importantes da
doença, risco ou efeito do tratamento.
As magnitudes das fontes pré-analíticas de variação são clara-
mente di&tiiitas para diferentes análises. Portanto, poderia se
supor que p o d e m ser considerados apenas aqueles fatores que
QUADRO 14-2 Exemplos de Critérios de Partição para
Possível Subagrupamento dos Grupos de
Referência
IDADE (NÃO NECESSARIAMENTE CATEGORIZADA POR INTERVALOS IGUAIS)
SEXO
FATORES GENÉTICOS
Origem étnica
Grupos sanguíneos (ABO]
Sistema de histocompatibilidade (HLA)
Geres
FATORES FISIOLÓGICOS
Estágio do ciclo menstrual
Estágio da gestação
Condição física
OUTROS FATORES
Socioeconómico
Ambiental
Cranobiológico
HLA, antígenos dos leucócitos humanos.
 Estabelecimento e Uso de Valores de Referência
c a u s a m v a r i a ç ã o i n d e s e j a d a p a r a a q u a n t i d a d e biológica p a t a a
q u a l se p r e t e n d e p r o d u z i r valores d e referência. A p o s t u r a d o
c o r p o d u r a n t e a coleta d a a m o s t r a , p o r exemplo, é a l t a m e n t e
relevante p a r a o e s t a b e l e c i m e n t o d o s valores d e referência e m
análises d e amostras não-difimdíveis, c o m o a a l b u m i n a n o soro,
mas irrelevante para aqueles difundiveis, c o m o o sódio sérico.
C o m o alternativa para isso, m u i t o s c o n s t i t u i n t e s são analisa-
dos n a s m e s m a s amostras clínicas. P o t t a n t o , p r o j e t a r sistemas
especiais para cada t i p o de q u a n t i d a d e é impraticável. Por essa
razão, t ê m s i d o r e c o m e n d a d o s p r o c e d i m e n t o s p a d r o n i z a d o s
para a coleta de a m o s t r a s de sangue p o r v e n o p u n t u r a e p u n ç ã o
d a pele. 2 , 3
A ingestão de m e d i c a m e n t o s antes d a coleta causa u m pro-
b l e m a especial, Pode-se fazer u m a d i s t i n ç ã o e n t r e as m e d i c a ç õ e s
indispensáveis e dispensáveis. A ú l t i m a categoria de m e d i c a m e n -
tos s e m p r e deve ser evitada p o r pelo m e n o s 2 dias antes d a coleta
da a m o s t r a . O u s o de m e d i c a m e n t o s indispensáveis, c o m o
pílulas contraceptivas ou m e d i c a ç ã o essencial, p o d e ser u m cri-
tério de exclusão o u p a r t i ç ã o .
Procedimentos Analíticos e Controle de
Qualidade
O s c o m p o n e n t e s essenciais necessários p a r a a d e f i n i ç ã o d e u m
g r u p o de valores de referência são especificações a respeito d o
(1) m é t o d o de análise, i n c l u i n d o i n f o r m a ç ã o sobre e q u i p a m e n t o ,
reagentes, calibradores, t i p o de d a d o s b r u t o s e m é t o d o para
cálculo; d o (2) c o n t r o l e de q u a l i d a d e (ver C a p í t u l o 16); e d o (3)
critério d e c o n f i a n ç a (ver C a p í t u l o 13). A s especificações devem
ser c u i d a d o s a m e n t e descritas d e m o d o q u e o u t r o p e s q u i s a d o r
seja capaz de r e p r o d u z i r o e s t u d o e avaliar a c o m p a r a b i l i d a d e
d o s valores de referência c o m os valores o b t i d o s pelos m é t o d o s
utilizados para a p r o d u ç ã o d o s valores d o s pacientes n o labora-
t ó r i o d e r o t i n a . Deve-se usar u m m e s m o m é t o d o analítico para
assegurar a c o m p a r a b i l i d a d e e n t r e os valores d e referência e os
observados.
Tratamento Estatístico dos Valores de
Referência
A p ó s a realização d a análise das a m o s t r a s d e referência, os valores
de referência são s u b m e t i d o s ao t r a t a m e n t o estatístico. Esse
t r a t a m e n t o inclui (1) p a r t i ç ã o dos valores de referência e m
g r u p o s a p r o p r i a d o s , (2) i n s p e ç ã o d a d i s t r i b u i ç ã o de cada g r u p o ,
(3) i d e n t i f i c a ç ã o d o s valores discrepantes {outliers) e (4) determi-
n a ç ã o d o s limites de referência.
Partição dos Valores de Referência
O s s u b c o n j u n t o s d e indivíduos-referência e d e seus valores d e
r e f e r ê n c i a c o r r e s p o n d e n t e s p o d e m ser s e p a r a d o s d e a c o r d o c o m
sexo, i d a d e e outras características ( Q u a d r o 14-2). A p a r t i ç ã o
t a m b é m é c o n h e c i d a c o m o estratificação, categorização o u suhagru.-
pamento, e seus r e s u l t a d o s são c h a m a d o s d e partes, extratos, cate-
gorias, classes ou subgrupos. O objetivo d a p a r t i ç ã o é reduzir, se
possível e necessário, a variação e n t r e os i n d i v í d u o s para m i n i -
mizar o " r u í d o " biológico. A m e n o s q u e a variação e n t r e classes
resulte e m intervalos d e referência mais estreitos e específicos.
Diversos critérios estatísticos p a r a a p a r t i ç ã o t ê m sido sugeridos." 1
Pode-se fazer, p o r exemplo, teste de d i f e r e n ç a de m é d i a s ou
desvios-padrão das distribuições. E n t r e t a n t o , tem-se m o s t r a d o
q u e d i f e r e n ç a s de localização ou variação p o d e m ser estatistica-
m e n t e significantes e a i n d a m u i t o p e q u e n a s p a r a justificar a
s u b s t i t u i ç ã o de u m ú n i c o i n t e r v a l o de referência total c o m diver-
sos intervalos classe-específicos. Harris e Boyd"1 e Lathi e co-
autores 7 descreveram o u t r o s critérios p a r a a p a r t i ç ã o e m é t o d o s
estatísticos para esse p r o p ó s i t o .
CAPÍTULO 14 235
Freqüência FraqüènriR cumulativa
0.15- 1,0-
B
0,10-
0,5-
0.05
^
•
n ,
• ^
j
1,0 2,0 3,0 1.0 2,0 3,0
Triglicerídeo, soro (mmol/L)
Figura 14-1 Distribuições hipotética e observada de 500 valores de
triglicerideos n o soro (em m m o l / L ) . A, As banas verticais do histograma
mostram o número de observações n o intervalo, dividido pelo número
total d e observações. A curva é a probabilidade de distribuição estimada
da população, assumindo-se a amostragem aleatória e u m a distribuição
gaussiana em escala logarítmica B, A razão acumulada (barras) e
probabilidade cumulativa de distribuição estimada (curva). Os dados
f o r a m gerados p o r c o m p u t a d o r para esta ilustração.
N a s seções seguintes, assume-se q u e exista u m a distribuição
h o m o g ê n e a das referências — o u a distribuição c o m p l e t a e m
s u b g r u p o s (se a p a r t i ç ã o for desnecessária) ou u m a distribuição
e m subclasses após a partição,
inspeção da Distribuição
E aconselhável dispor g r a f i c a m e n t e a distribuição das referências
e s u b s e q ü e n t e m e n t e inspecioná-la. U m h i s t o g r a m a , c o m o mos-
t r a d o n a Figura 14-1, A, é p r e p a r a d o m a n u a l m e n t e o u p o r u m
p r o g r a m a d e c o m p u t a d o r . O e x a m e d o h i s t o g r a m a é u m a salva-
g u a r d a c o n t r a a aplicação ou a i n t e r p r e t a ç ã o e r r ô n e a d o s m é t o d o s
estatísticos e p o d e f o r n e c e r i n f o r m a ç õ e s i m p o r t a n t e s a respeito
d o s d a d o s . E m u m e x a m e d e d i s t r i b u i ç ã o devem ser considera-
das as seguintes características:
1. Valores a l t a m e n t e d i s c r e p a n t e s (outliers) p o d e m r e p r e s e n t a r
valores e r r ô n e o s
2. A s distribuições b i m o d a i s o u p o l i m o d a i s p o s s u e m mais de
u m pico e p o d e m i n d i c a r q u e a d i s t r i b u i ç ã o n ã o é h o m o g ê -
n e a e m razão d a m i s t u r a de d u a s ou mais distribuições. Se
a distribuição n ã o for h o m o g ê n e a , o critério u s a d o para
selecionar os indivíduos-referência deve ser reavaliado, o u
deve-se separar os valores d e a c o r d o c o m idade, sexo ou
t e n t a d o s o u t r o s fatores relevantes.
3. A f o r m a d a distribuição p o d e ser assimétrica (inclinada) ou
m a i s ou m e n o s a g u d a d o q u e a d i s t r i b u i ç ã o gaussiana simé-
trica e e m f o r m a de s i n o (curtose — "grau de a c h a t a m e n t o "
— não-gaussiana). 11,13 ' 14
4 A inspeção visual t a m b é m p o d e f o r n e c e r estimativas iniciais
d a localização dos limites de r e f e r ê n c i a q u e são úteis q u a n d o
se verifica a validação d a c o m p u t a ç ã o d o s d a d o s .
Identifícação e Manipulação dos Outliers
U m outlier é u m valor e r r a d o q u e desvia significativamente dos
p r ó p r i o s valores d e referência. A i n s p e ç ã o visual d o h i s t o g r a m a
é u m m é t o d o confiável p a r a a i d e n t i f i c a ç ã o cie possíveis outliers.
C o n t u d o , o i n s p e t o r precisa m a n t e r e m m e n t e q u e valores pró-
x i m o s ao p o n t o mais d i s t a n t e da c a u d a longa d e u m a distribui-
ção i n c l i n a d a p o d e m ser f a c i l m e n t e c o n f u n d i d o s c o m outliers. Se
236 PARTE III Operações Laboratoriais
a distribuição for positivamente inclinada, a inspeção do histo-
grama, exibindo-se o logaritmo dos valores, p o d e ajudar na iden-
tificação dos outliers. Alguns outliers também p o d e m ser identifi-
cados por testes estatísticos, 5,614 mas não há u m m é t o d o único
para detectar os outliers em todas as situações que estes p o d e m
ocorrer. A seguir, são listados os dois principais problemas mais
f r e q ü e n t e m e n t e encontrados-
1. Muitos testes assumem que o tipo da verdadeira distribuição
é conhecido antes de o teste ser usado. Alguns testes reque-
r e m especificamente q u e a distribuição seja normal (gaus-
siana). C o n t u d o , as distribuições biológicas são m u i t o fre-
q ü e n t e m e n t e não-gaussianas e seus tipos raramente são
conhecidos em p r o f u n d i d a d e . O teste de amplitude, descrito
nas recomendações da IFCC, 6 é relativamente robusto e
envolve a identificação de u m valor extremo como outlier se
a diferença entre os dois maiores valores (ou menores) na
distribuição exceder u m terço da amplitude de todos os
valores
2. Diversos testes para outliers assumem que os dados contêm
apenas u m único outlier. Assim, o teste de amplitude geral-
m e n t e falha na presença de vários outliers.
U m m é t o d o desenvolvido em 2005 parece fornecer u m a
solução promissora para ambos os problemas antes menciona-
dos. 15 O algoritmo opera e m dois passos: (1) transforma matema-
ticamente os dados originais para aproximar a u m a distribuição
n o r m a l e (2) estabelece a detecção de limites com base na parte
central da distribuição transformada.
Os valores desviados identificados como possíveis outliers n ã o
devem ser descartados automaticamente. Os valores devem ser
incluídos ou excluídos de f o r m a racional. Os registros dos valores
suspeitos devem ser verificados e quaisquer erros, corrigidos. Em
alguns casos, os valores desviados devem ser rejeitados por não
encontrarem causas não-passíveis de correção, como condições
previamente desconhecidas que qualificam os indivíduos para a
exclusão d o grupo de Lndividuos-referência.
Determinação dos Limites de Referência
Na prática clínica, u m valor observado de u m paciente geral-
m e n t e é comparado com o intervalo de referência correspon-
dente, o qual é limitado por u m par de limites de referência. Esse
intervalo, o qual pode ser d e f i n i d o de diferentes maneiras, é u m a
condensação útil da informação carregada pelo grupo total de
valores de referência.
Os termos limites de referência e limitei de decisão clinica n ã o
devem ser confundidos. O s limites de referência descrevem a
distribuição de referências e fornecem informação sobre a varia-
ção observada dos valores n o grupo selecionado de indivíduos-
referência. Portanto, a comparação de novos valores com esses
limites fornece apenas informação sobre a similaridade ao dado
grupo de valores de referência. Em contrapartida, os limites de
decisão clínica fornecem u m a separação ótima entre as categorias
clínicas. Esses limites de decisão clínica têm base nos valores de
referência de diversos grupos de indivíduos (p. ex., indivíduos
saudáveis e pacientes com doenças relevantes) e, dessa forma, são
usados com o propósito d e diagnóstico diferencial.
O termo amplitude de referência é utilizado algumas vezes para
o t e r m o intervalo de referência, mas esse uso deve seT desencora-
jado, pois o termo estatístico amplitude denota a diferença (um
valor único!) entre os valores máximo e m í n i m o em u m a distri-
buição.
As categorias de intervalos de referência incluem (1) intervalo
de tolerância, (2) intervalo de predição e (3) intervalo interper-
centil. 6 A escolha entre esses três pode ser importante para definir
certos problemas estatísticos sistematicamente definidos, mas, na
Figura 14-2 Intervalo de referência central de 9 5 % com percentil
de 2,5 e 97,5 e seus intervalos de confiança de 0,90 das 5 0 0
concentrações séncas de rriglicerídeos (ver Figura 14-1), c o m a
d e t e r m i n a d o pelo m é t o d o paramétrico (ver texto relacionado). As curvas
são as probabilidades de distribuição estimadas.
prática, suas diferenças numéricas são ínfimas q u a n d o baseadas
em pelo menos 100 valores de referência.
O intervalo interpercentil é (1) simples de se estimar, (2) mais
c o m u m e n t e utilizado e (3) r e c o m e n d a d o pela IFCC. Ê É definido
como u m intervalo limitado por dois percentis de distribuição
de referência. U m percentil denota u m valor que divide a distri-
buição de referência de m o d o que uma porcentagem específica
desses valores tenha magnitudes menores o u iguais ao valor limi-
tante. Por exemplo, se 2,32 m m o l / L (205,3 m g / d L ) for o percen-
til 97,5 de triglicerídeos séTicos, 97,5% da concentração dos
valores são iguais ou menores q u e esse valor.
A definição d o intervalo de referência com u m intervalo
central de 9 5 % limitado pelos percentis 2,5 e 97,5 é u m a arbi-
trariedade, mas u m a convenção c o m u m (Figura 14-2); isto é,
2,5% dos valores são cortados em ambas as caudas da distribui-
ção de referências. 6 O u t r o t a m a n h o ou u m a localização assimé-
trica d o intervalo de referência pode ser mais apropriado em
casos particulares.
A precisão de um percentil como estimativa de u m valor de
população depende d o t a m a n h o do subgrupo e é m e n o s preciso
q u a n d o o n ú m e r o de observações é baixo. Se assumirmos a
realização de u m a amostragem aleatória, é possível determinar o
intervalo de confiança d o percentil (isto é, os limites dentro dos
quais o verdadeiro percentil está localizado com u m grau de
confiança específico) (Figura 14-2). O intervalo de confiança 0,90
do percentil 97,5 (limite de referência superior) para os triglice-
rídeos séricos pode, por exemplo, ser de 2,22 a 2,62 m m o l / L
(196,5-231,8 m g / d L ) . Poderia se esperar o verdadeiro percentil
nesse intervalo com u m a confiança de 0,90 se todas as concen-
trações de triglicerídeos séricos da população fossem mensuradas.
O t a m a n h o m í n i m o requerido da amostra, na teoria, para a
estimativa de percentis 2,5 e 97,5 é de 40 valores, mas pelo menos
120 valoTes de referência são necessários paTa se obterem estima-
tivas confiáveis.
O intervalo interpercentil tem sido determinado tanto por
métodos estatísticos paramétricos como não-paramétricos. O
m é t o d o p a r a m é t r i c o para a determinação de percentis e de seus
intervalos de confiança assume u m certo tipo de distribuição e
isso se faz com base n a estimativa de parâmetros da população,
como a média e o desvio-padrão (DP). Por exemplo, u m m é t o d o
paramétrico é usado q u a n d o se acredita que a verdadeira distri-
buição seja gaussiana e os limites de referência (percentis) sejam
 Estabelecimento e Uso de Valores de Referência CAPÍTULO 14 237

determinados c o m o os valores localizados dois D P abaixo e 3. Determine os pereentis e n c o n t r a n d o os valores de referência

acima da média. Em sua maioria, os métodos paramétricos são,
de fato, baseados na distribuição gaussiana. Se a distribuição de
referência tiver outra forma, p o d e m ser usadas funções matemá-
ticas que transformam os dados para u m a forma mais apToxi-
m a d a da gaussiana. O método não-paramétrico não assume nada
a respeito do tipo de distribuição e não usa estimativas de parâ-
metros de distribuição. Os pereentis são determinados simples-
m e n t e pelo corte de u m a porcentagem necessária de valores em
cada cauda d o subgrupo da distribuição de referência.
Q u a n d o os resultados obtidos por esses dois métodos são
comparados, as estimativas dos pereentis quase sempre são muito
semelhantes. Geralmente se prefere u m método não-paramétrico
simples e confiável, especialmente em versão auto-suficiente
("Íjootsíraf)"), do que o m é t o d o paramétrico.
Método Não-paraméírico
Existem diversos métodos não-paramétricos disponíveis, 14 mas os
baseados em dados ordenados são simples e confiáveis e permi-
tem a estimativa não-paramétrica dos intervalos de confiança dos
pereentis. 4,6,12 ' 14
Os passos em u m procedimento não-paramétrico são os
seguintes:
1. D i s p o n h a os n valores de referência em ordem crescente de
magnitude e ordene os valores. O valor m í n i m o tem n ú m e r o
1 na classificação, o próximo valor tem n ú m e r o 2 e assim
por diante até o valor máximo, classificação n ú m e r o n, ser
atingido. Devem-se atribuir números de classificação conse-
cutivos para dois ou mais valores idênticos (empate de
dados). A disposição e classificação p o d e m ser feitas facil-
m e n t e com u m programa de planilha como o EXCEL.
2. C o m p u t e os números classificados dos pereentis 2,5 e 97,5
como 0,025(n + 1) e 0,975(n + 1), respectivamente.
originais que correspondem aos números classificados com-
putados, desde que os números classificados sejam inteiros.
D o contrário, é necessária a interpolação entre os dois
valores limitantes.
4. Finalmente, determine o intervalo de confiança de cada
percentil por meio do uso da distribuição binomial. A Tabela
14-1 facilita esse passo para o intervalo de confiança de 0,90
de pereentis 2,5 e 97,5. O s números classificados limitantes
para cada percentil podem ser localizados na tabela.
A Tabela 14-2 mostra u m exemplo de determinação não-
paramétrica de pereentis usando os valores de triglicerídeos
séricos exibidos na Figura 14-1.
Estimativa auto-suficiente (Soofsfrap)
O método autosuficiente 411c descrito aqui é u m a extensão do método
não-paramétrico. Contudo, o princípio autoíuficiente pode ser
empregado em qualquer método de estimativa, paramétrico ou não-
paramétrico. O método consiste nos seguintes passos:
1. Sorteie, com reposição, amostras aleatórias de t a m a n h o n a
partir do subgrupo de n valores de referência. Pode-se sortear
"com reposição" se cada valor aleatoriamente selecionado d o
subgrupo é m a n t i d o n o subgrupo, de m o d o que possa par-
ticipar na seleção aleatória do próximo valoT. O n ú m e r o de
Teamostragens deve ser alto (500 é u m n ú m e r o razoável de
repetições).
2. Para cada reamostragem estime os limites de referência supe-
rior e inferior (pereentis) por procedimento não-paramétrico
baseado em classificação previamente descrita. (Omita o
passo 4, estimativa dos intervalos de confiança.) G u a r d e as
duas estimativas para cada repetição.
3. Após completar todas as repetições, use a média das reamos-
tragens estimadas de cada u m dos dois limites de referência
como estimativa final.

TABELA 14-1 Intervalos de C o n f i a n ç a Não-paramétricos dos Limites de Referência*

POSIÇÃO DOS NÚMEROS POSIÇÃO DOS NÚMEROS

Tamanho da Amostra Inferior Superior Tamanho da Amostra Inferior Superior
119-132 1 7 566-574 8 22
133-160 1 8 575-598 9 22
161-187 1 9 599-624 9 23
1B8-189 2 9 625-631 10 23
190-218 2 10 632-665 10 24
219-248 2 11 666-674 10 25
249-249 2 12 675-698 11 25
250-279 3 12 699-724 11 26
280-307 3 13 725-732 12 26
308-309 4 13 733-765 12 27
310-340 4 14 766 773 12 28
341-363 4 15 774-799 13 28
364-372 5 15 800-822 13 29
373-403 5 16 823-833 14 29
404-417 5 17 834-867 14 30
418-435 6 17 868-871 14 31
436-468 6 18 872-901 15 31
469-470 6 19 902-919 15 32
471-500 7 19 920-935 16 32
501-522 7 20 936-967 16 33
523-533 8 20 968-970 17 33
534-565 8 21 971-1.000 17 34

* A tateia mostra a posição dos números do intervalo de confiança de 0,90 d o percentil 2,5 para amostras com 119 a 1.000 valores. Paia obter a posição
correspondente dos números do percentil 97,5, subtraia os números de (TI 1), onde n É o tamanho da amostra.
De IFCC.
238 PARTE III Operações Laboratoriais

TABELA 14-2 Determinação Não-paramétrica do Intervalo de Referência*

VALORES SORTEADOS E POSICIONADOS DE TRIGLICERÍDEOS SÉRICOS NA CAUDA ESQUERDA DA DISTRIBUIÇÃO:
Valores: 0,41 0,43 0,45 0,46 0,47 0,49 D,51 0,55 0,55 0,55
Posição: 1 2 3 4 5 6 7 8 £ 10
Valores: 0,56 0,58 0,58 0,61 0,62 0,62 0,64 0,64 0,65 0,65
Posição: 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

VALORES SORTEADOS E POSICIONADOS DE TRIGLICERÍDEOS SÉRICOS NA CAUDA DIREITA DA DISTRIBUIÇÃO:

Valores: 2,21 2,22 2,26 2,27 2,27 2,28 2,30 2,31 2,34 2,35
Posição: 481 402 483 484 485 48G 487 408 489 490
Valores: 2,40 2,50 2,55 2,62 2,63 2,65 2,72 2,78 2,90 2,91
Posição: 491 492 493 494 495 496 4â7 498 499 500

CÁLCULO DA POSIÇÃO DOS NÚMEROS DOS PERCENTIS:

Inferior: 0,025 (500 + 1) = 12,5
Superior: 0,975 (500 + 1) - 488,5

ENCONTRO DOS VALORES ORIGINAIS CORRESPONDENTES À POSIÇÃO DESSES NÚMEROS:

Limite de referência inferior {perGentil 2,5) Q.56
Limite de referência superior (percentil 97,5): 2,32 (por interpolação)

POSIÇÃO DOS NÚMEROS E VALORES DO LIMITE DE CONFIANÇA DE 0 , 9 0 DO LIMITE DE REFERÊNCIA INFERIOR:

Posição dos números (ver Tabela 14-1): 7 e 19
Limites de contiança: 0,51 e 0,65

POSIÇÃO DOS NÚMEROS E VALORES DO LIMITE DE CONFIANÇA DE 0 , 9 0 DO LIMITE DE REFERÊNCIA SUPERIOR:

Posição dos números (ver Tabela 14-1): 500 + 1 - 19 = 482
5C0 + 1 - 7 = 494
Limites de contiança: 2,22 e 2,62

RESUMO:
Limite de referência inferior: 0,58 [0,51-0,65] mmol/L
Limite de referência superior: 2,32 [2,22-2,62] mmol/L

I *A tabela mostra um exemplo usando as 500 concentrações de triglicerídeos séricos dispostas na Figura 14-1. Veja o texto para a descrição d o m é t o d o
não-paramé tricô. A unidade de todas as concentrações na tabela é de m m o l / L

Se a distribuição de referência não for significativamente

4. Determine o intervalo de confiança de 0,90 de cada limite diferente da distribuição gaussiana, os percentis 2,5 e 97,5 serão
de referência da distribuição das estimativas do percentil. estimados pelos valores aproximadamente dois DP em cada lado
Entre os métodos disponíveis para a estimativa dos limites de da média, ou mais precisamente
referência, prefere-se o m é t o d o auto-suficiente porque reproduz
estimativas confiáveis de ambos os percentis e seus intervalos de Percentil 2,5 = x - 1,96 x D P
confiança. E necessário u m computador para processar u m
grande n ú m e r o de repetições auto-suficientes. 12 Percentil 97,5 = x + 1,96 x D P

Método Paramétrico O intervalo de confiança de 0,90 de cada percentil é estimado

O método paramétrico 4 ' 6,13,14 é muito mais complicado que o
não-paramétricô e geralmente requer o uso de u m programa
estatístico de computador q u a n d o são processadas amostras
grandes. 12 O método paramétrico para estimar percentis assume
que a verdadeira distribuição é gaussiana. U m a fase crítica no
método paramétrico, portanto, é testar o nível de ajuste da dis-
tribuição de referência a u m a hipótese de distribuição gaussiana.
U m teste simples é o exame da distribuição cumulativa (Figura
14-1, B) q u a n d o traçado sobre u m papel de probabilidade gaus-
siana, a qual caracteriza u m eixo vertical não linear com base na
distribuição gaussiana. Se a distribuição for gaussiana, o traçado
deverá ser quase u m a linha reta. C o n t u d o , a avaliação visual dos
desvios da uma linha reta é muito difícil, devido à não-lineari-
dade das distâncias verticais n o gráfico. Muitos programas esta-
tísticos de computador possuem bons testes de ajuste (p. ex.,
testes com base em coeficientes de inclinação e curtose, o teste
de Kolmogorov-Smirnov, ou o teste de Anderson-Darling). 6,12,14
pelos dois limites seguintes:
Limite de confianca inferior = limite de percentil 2,81 X —j=
vn
SD
Limite de confianca superior = limite de percentil + 2 , o l x —
vn
Se a distribuição de referência não for gaussiana, a transfor-
mação matemática dos dados pode ajustar a forma para aproxi-
mar a distribuição gaussiana. U m a observação freqüente de inte-
resse é que os valores transformados logaritmicamente de uma
distribuição com a cauda direita longa (positivamente inclinada)
se aproximam muito da distribuição gaussiana. Essa informação
 Estabelecimento e Uso de Valores de Referência
é a base para o uso c o m u m das transformações logarítmicas e de
raiz quadrada q u a n d o os limites de referência são estimados
como descrito n a seção seguinte. Se essas duas funções falharem
em transformar os dados em uma distribuição próxima da gaus-
siana, mais transformações gerais podem ser usadas. Essas funções
são descritas em outra literatura relevante. 4,6,n ' 14
Para aplicar o procedimento paramétrico, são percorridos os
seguintes passos:
1. Transformar os dados com u m a funçãodogarítmica y = log(x)
ou pelo uso de raiz quadrada: J ~ •. (Pode-se usar ou
logaritmos naturais, ln(x), ou logaritmos comuns de Briggs,
logioW.) Então, teste o ajuste à distribuição gaussiana pelo
uso dos métodos descritos anteriormente. Se ambas as trans-
formações falharem, deverão ser usadas mais funções gerais,
as quais são n o r m a l m e n t e mais complicadas, ou o método
não-paramétrico simples descrito anteriormente.
2. C o m p u t e , então, a média 0 ) e o desvio-padrão (DP,,) dos
dados transformados
3. A seguir, estime os pereentis e seus intervalos de confianca
na escala transformada com as fórmulas já apresentadas, com
y para x e DP, para DP.
4. Finalmente, reconverta os pereentis e seus intervalos de con-
fiança para a escala dos dados originais pelo uso de f u n ç ã o
inversa — antilogaritmos ou elevação ao quadrado, respecti-
vamente.
Por exemplo, a média e o D P dos valores de triglicerídeos
séricos da Figura 14-1 após a transformação logarítmica (logarit-
mos naturais) são J = 0,172 e DP 5 = 0,357. O percentil 2,5 é
0,172 - 19,6 x 0,357 = - 0 , 5 2 8
Percentil 2,5 = e" 0 ' 528 = 0,59
O limite de referência inferior dos triglicerídeos séricos é,
portanto, 0,59 m m o l / L (52,2 mg/dL). O intervalo de confiança
de 0,90 desse percentil é
- 0 , 5 2 8 - 2,81 x 0,357 A/5ÕÕ = - 0 , 5 7 3
Limite de confiança inferior = e"0,573 = 0,56
- 0 , 5 2 8 + 2,81 x 0,357 /V5ÕÕ = - 0 , 4 8 3
Limite de confiança superior = e~0,483 = 0,62;
isto é, 0,56 a 0,62 m m o l / L (49,5-54,9 mg/dL). O percentil 97,5
(e seu intervalo de confiança de 0,90) é encontrado pelo mesmo
método como sendo 2,39 (2,29 a 2,50) m m o l / L [211,5 (202,7-
221,2) mg/dL]. Os leitores p o d e m verificar esses resultados
como u m exercício de aprendizado.
A comparação com a Tabela 14-2 demonstra que os métodos
não-paramétricos e os paramétricos resultam em estimativas de
limites de referência (pereentis) muito semelhantes. Os interva-
los de confiança paramétricos, contudo, são u m pouco mais
estreitos do que os não-paramétricos.
USO DE VALORES DE REFERÊNCIA
A interpretação dos dados clínicos laboratoriais requer a com-
paração dos valores d o paciente com os valores de referência.
Apresentação de um Valor Observado com
Relação aos Valores de Referência
U m valor observado (valor d o paciente) pode ser comparado
com os valores de referência. Essa comparação é freqüentemente
CAPÍTULO 14 239
semelhante ao teste de hipótese, mas raramente é testado esta-
tisticamente n o sentido restrito. E aconselhável considerar os
valores de referência como u m critério para u m a avaliação m e n o s
formal do que o teste de hipótese.
O clínico ou o serviço de saúde deveria ter mais informações
sobre os valores de referência necessários para a interpretação. 6
Os intervalos de referência para todos os testes laboratoriais
p o d e m ser apresentados ao médico ou ao serviço de saúde em
u m folheto, j u n t o com informações sobre (1) os métodos de
análise, (2) sua imprecisão e (3) a descrição dos valores de refe-
rência. U m a apresentação conveniente d o valor observado e d o
intervalo de referência n o m e s m o relatório pode ser útil para o
clínico ocupado ou serviço de saúde. Por exemplo, os intervalos
de referência p o d e m ser pré-impressos n o formato dos relatórios,
ou o sistema de computador p o d e selecionar os intervalos de
referência apropriados, específicos de idade e sexo, de u m b a n c o
de dados e imprimir em seguida ao resultado d o reste nu em
forma de gráfico.
U m valor observado pode ser classificado como baixo,
normal ou alto (três classes), d e p e n d e n d o de sua localização com
relação ao intervalo de referência. Nos relatórios, uma prática
conveniente é destacar resultados não-usuais (p. ex., mediante
uso de letras B ou A, para baixo e alto, respectivamente).
O u t r o método popular de classificação é a expressão d o valor
observado em u m a medida de distância estatística. Por exemplo,
a bem conhecida unidade DP, ou a de desvio n o r m a l equiva-
lente, é u m tipo de medida e é calculada pela diferença entre o
valor observado e a média dos valores de referência dividida por
seu DP. 6 Essa medida, contudo, n ã o será confiável se a distribui-
ção dos valores for inclinada.
Regiões de Referência Multivariadas com
Base na População
As seções anteriores deste capitulo discutiram os valores de
referência com base na população univariada e quantidades
derivadas destas. C o n t u d o , esses valores não se ajustam à situa-
ção clínica c o m u m na qual os valores observados de diversos
testes laboratoriais estão disponíveis para interpretação e tomada
de decisão. Por exemplo, na média, 10 testes laboratoriais indi-
viduais são requisitados em cada amostra recebida n o laborató-
TÍo. Cada valot observado é comparado com os valores ou inter-
valos de referência correspondentes (isto é, realização de compa-
rações unkmiadas múltiplas), ou o grupo de valores observado é
considerado como u m a única observação multivariada e inter-
pretado como tal por uma comparação muitwanada. Apenas o
último método, conhecido como análise multivariada, evita
uma fração muito alta de resultados falso-positivos (ver as subse-
ções seguintes).
Conceito Multivariada
U m a observação univariada, como u m único resultado laborato-
rial, pode ser representada graficamente como u m ponto sobre
u m a linha que representa c eixo ou escala de valores. Os resulta-
dos obtidos pelos dois testes laboratoriais realizados na mesma
amostra (uma observação bivariada) podem ser dispostos como
u m ponto em u m plano definido por dois eixos perpendiculares.
Três resultados levam a uma observação trivariada e a u m ponto
n o espaço definido por três eixos perpendiculares. Q u a n d o
existem mais de três observações, a mente h u m a n a não é capaz
de visualizar u m a observação multivariada (mais do que três
dimensões). Não obstante, é possível considerar a observação
multivariada como u m ponto em u m hiperespaço multidimensio-
nal com tantos eixos mutuamente perpendiculares quanto resul-
tados de diferentes testes. (Nesse contexto, o prefixo hiper- significa
240 PARTE III Operações Laboratoriais
Figura 14-3 Regi ao de referência bivariada (elipse), comparada com
a região definida por dois intervalos de referência univariados (pkno).
Nesse exemplo, as duas distribuições de referência univariadas ao longo
dos eixos (análise dos resultados d o teste 1) e (teste 2) são
gaussianas. A interpretação correta dos dois padrões, a e b, é possivel
apenas pela comparação com a região de referência bivariada (elipse).
"mais do que três dimensões".) Essas observações multivariadas são
também conhecidas como padrões ou perfis. U m a distribuição mui-
tivariada, portanto, é representada por um agrupamento de pontos
em u m plano, em u m espaço ou em u m hiperespaço, dependendo
da dimensional idade da observação. Diversos métodos estatísticos
têm base em métodos multivariados e alguns destes são extensões
diretas de métodos univariados. 8
Região de Referência Multivariada
E possível definir u m a região de referência multivariada com base
na junção da distribuição dos valores de leferência para dois ou
mais testes laboratoriais. Essa região multivariada não é u m a áiea
de ângulo reto ou um biperplann, rnas assemelha-se a uma elipse
n o plano (Figura 14-3) ou u m corpo elipsóide ou hipercorpo
q u a n d o existem mais de duas dimensões. Essa região de referên-
cia pode ser u m a extensão direta d o intervalo de 9 5 % univariado
a u m a situação multivariada; isso pode ser agrupado para próximo
de 9 5 % dos pontos centrais dos dados de referência multivaria-
dos. 1 Nesse caso, apenas 5 % de resultados falso-positivos pode-
riam ser esperados, i n d e p e n d e n t e m e n t e da dimensionalidade,
O uso de regiões de referência multivariadas geralmente
requer o auxílio do computador. O programa de computador
seleciona u m grupo dos resultados obtidos por diversos testes
laboratoriais realizados na mesma amostra e calcula u m índice.
A interpretação da observação multivariada com relação aos
valores de referência envolve, então, a comparação do índice com
u m valor critico estimado de u m grupo correspondente de valores
de referência. 1
Valores de Referência com Base no Indivíduo
A Figura 14-4 ilustra o problema inerente associado aos valores
de referência com base na população. A figura mostra duas dis-
tribuições de referência hipotéticas. U m a representa a distribui-
ção de referência c o m u m com base em amostras únicas obtidas
de u m grupo de diversos individuos-refetência diferentes. Apre-
senta u m a média verdadeira (hipotética) p e u m DP de a . A outra
Indivíduo
Grupo (p'o)
li, |i x
F i g u r a 1 4 - 4 A relação entre as distribuições de referência com base
na população e n o indivíduo e intervalos de referência. O exemplo é
hipotético e as duas distribuições são, por simplicidade, gaussianas. As
médias e os desvios-padrão hipotéticos são ]i e G (para a população) e [i
e a, (individuo i); x, análise do resultado. (Modificado de Harris EK.
Effects o n intra- and inter individual variation on the appropriate use of
normal ranges. Clin Chem 1974;20:1536.)
distribuição tem base em diversas amostras coletadas por u m
período de t e m p o em u m único indivíduo, o i-ésimo indivíduo.
Essa média hipotética é p , e o DP,
Se u m valor observado estiver localizado fora da dependência
dos percentis 2,5 e 97,5, o intervalo de referência pessoal ou com
base n o indivíduo, a causa p o d e ser a alteração n o estado bioquí-
mico, sugerindo a presença de doença. A Figura 14-4 demonstra
que esse valor observado ainda pode estar dentro d o intervalo
com base na população. A sensibilidade do último intervalo a
alterações n o estado bioquímico do indivíduo d e p e n d e conse-
q ü e n t e m e n t e da localização da média ps do indivíduo Telativa à
média c o m u m p e às magnitudes relativas dos DP Os e O corres-
pondentes. U m a média pi próxima à p e u m p e q u e n o Oj em
relação ao (7pode ocultar totalmente as alterações do individuo
dentro d o intervalo de referência com base na população.
Existem as duas seguintes soluções possíveis para o problema
da insensibilidade clínica dos intervalos de referência com base
na população:
1. Podem ser feitas tentativas de reduzir a variação nos valores
de referência pela partição em subclasses mais homogêneas,
como discutido anteriormente.
2. Os valores prévios do indivíduo, obtidos em u m estado de
saúde b e m definido, p o d e m se usados como a referência para
qualquer valor f u t u r o . ^ A aplicação dos valores com base
n o indivíduo torna-se mais viável como "exame médico" por
testes de laboratório, e o armazenamento de resultados em
c o m p u t a d o r fica disponível para grandes segmentos da popu-
lação geTal.
Transferibilidade dos Valores de Referência
A determinação de valores de referência confiáveis para cada teste
n o acervo de dados do laboratório é u m a tarefa f u n d a m e n t a l que
f r e q ü e n t e m e n t e está muito além das capacidades d o laboratório
individual. Portanto, o uso de valores de referência que são
gerados em outro laboratório p o d e ser conveniente. Essa tarefa
será possível se forem satisfeitas as seguintes condições: 9
1. A população examinada por ambos os laboratórios deve ser
descrita e combinada adequadamente.
2. O s subgrupos dos dados do laboratório de ambos lugares
devem ser comparados entre si para verificar vieses que
possam surgir dos fatores analíticos.
 Estabelecimento e Uso de Valores de Referência CAPÍTULO 14 241

Saudáveis Doentes
TABELA 1 4 - 3 | Valor Preditivo de um Teste Aplicado a
Populações Saudáveis e Doentes
População NB de Pacientes com NQ de Pacientes com
Resultado de Teste Resultado de Teste
Positivo Negativo
Totais
N° de pacientes
com doença VP FN
VP+FN
Ne de pacientes
sem doença FF lM
FP + l/A/ VP+ FP FN+ VN
Valor do teste
Totais

VP, verdadeiro-positivos (número de pacientes doestes corretamente Figura 14-5 Distribuições s i m u l a d a s d e p o p u l a ç õ e s saudáveis e
classificados pelo teste); FP, falso-positivos {número de pacientes Modoentes d o e n t e s . O b s e r v e q u e n o limiar d e decisão m o s t r a d o , a p r o b a b i l i d a d e
erroneamente classificados peta teste]- FN, falso-negativos (número de pacientes
d e u m sujeito c o m d o e n ç a (a) é m u i t o m e n o r d o q u e a p r o b a b i l i d a d e
doentes erroneamente dassifiçados pelo teste); VN, vetdadeiio-negativos
d e u m sujeito saudável (b). VP, verdadeiro-positivos; VN, verdadeiro-
(número de pacientes não-doenEes corretamente classificados pelo teste).
negativos; FP, falso-positivos; FN, falso-negativos.
Sensibilidade Clínica
= positividade na dowr rs. egressa em porcentagem
VP "
= 100 X
VP + FN
negativos. A movimentação do limite de decisão a u m valor
Especificidade Clínica
m e n o r aumenta a sensibilidade clínica — mas à custa de dimi-
= ausência de uma doença patticolai, expressa em porcentagem nuir a especificidade clinica. Assim, a detecção aumentada de
V V verdadeiro-positivos foi negociada para u m a u m e n t o n o n ú m e r o
= 100 x
fFP+VN) de resultados falso-positivos. Esse dilema ocorre na maioria dos
testes realizados na medicina.
V a l o r p r e d i t i v o d o teste p o s i t i v o ( V P )
D a d o u m resultado positivo, em quantos casos u m paciente
= porcentagem dos pacienta com Tesultados positivos qué são doentes
VP realmente tem a doença? O valor preditivo do teste positivo
^100x- responde a essa questão. O valor preditivo de u m teste combina
( V P + FP)
a prevalência da doença com os testes de sensibilidade e especi-
= (prevalência X sensibilidade)/[(prevalência X sensibilidade]
ficidade. A prevalência é a porção da população (ou daqueles a
+ (1 — prevalêricia)(l — especificidade)]
serem testados) com a doença. O valor preditivo do teste positivo
Valeu preditivo do teste negativo (VP") é o n ú m e r o de resultados verdadeiro-positivos dividido pelo
— porcentagem de pacientes com resultados negativos que não são doentes n ú m e r o de resultados positivos (resultados verdadeiro-positivos
VN
= 10Qx - - e falso-positivos combinados). O n ú m e r o de resultados verda-
ÍVN+FN)
deiro-positivos e falso-negativos é u m a função da prevalência na
população e da sensibilidade e especificidade do teste em questão.
O valor preditivo de u m teste negativo segue de maneira seme-
lhante, mas é usado menos freqüentemente. Isso responde a
questão "Dado u m resultado negativo, qual é a probabilidade de
o paciente realmente não ter a doença?" As fórmulas que p o d e m
ser usadas para o valor preditivo de u m teste positivo e para o
3. As performances analíticas de ambos os laboratórios devem
valor preditivo de u m teste negativo são encontradas na Tabela
ser concordantes.
14-3, para combinar a sensibilidade e especificidade do teste com
4- A preparação do indivíduo antes da coleta da amostra e a
a prevalência.
coleta da amostra propriamente dita deve seguir u m esquema
padronizado em ambos os laboratórios.

Sensibilidade e Especificidade Clínica REFERÊNCIAS

Conhecer a sensibilidade e especificidade do teste pode ajudar na
interpretação apropriada q u a n d o u m clínico ou um serviço de
saúde usa u m teste de laboratório para auxiliar no estabelecimento
do diagnóstico (como oposto uma tendência ou avaliação efetiva
do tratamento). A sensibilidade clínica de um ensaio é a fração
daqueles indivíduos com u m a doença específica que o ensaio
afirma corretamente. A especificidade clínica é a fração daqueles
indivíduos sem a doença que o ensaio afirma corretamente. A
Tabela 14-3 lista as definições e as fórmulas pertinentes.
Alterar a decisão-1 imite de u m ensaio afeta tanto a sensibili-
dade como a especificidade clínica. Considere a situação em que
o grupo de doentes tem valores maiores que o grupo de não-
doentes (Figura 14-5). Os valores acima do limite de decisão são
classificados como positivos; aqueles n o limite ou abaixo são
1. Boyd ]C, Lacher DA. T h e multivanate reference range: an alternative
inter preta tio n of multi-test profiles. Clin C h e m 1982;28:259-65.
2. Clinicai and Laboratory Standards Institute. Procedures for the
collection of diagnnstic blood specimens by venipuncture: CLSI
Approved Standard H3-A5, 5th ed. Wayne, PA: Clinicai and
Laboratory Standards Institute, 2003.
3. Clinica] and Laboratory Standards Institute Procedures and devices for
the collection of capillary blood specimens: CLSI Approved Standard
H4-A5, 5th ed. Wayne, PA. Clinicai and Laboratory Standards
Institute, 2004-
4. Harris EK, Boyd J C Statistical bases of reference values in laboratory
medicine. New York: Mareei Dekker, 1995.
5. H o r n PS, Feng L, Li Y, Pesce A]. Effect of ourliers and nonhealthy
individuais on reference interval estimation Clin C h e m 2001;47:2137-45.
242 PARTE III Operações Laboratoriais
6. International Fedeiation of Clinicai Chemistry, Expert Panei on Theory
of Reference Values Approved lecommendation on the theory of
tevererice va Ines. Párt 1. The roncept of reference values. J Clin Chem
Clin Biochem 1987,25:337-42. Pare 2. Selection of individuais for the
production of reference values. ] Clin Chem Clin Biochem 1987;25-639-
44. Pan 3. Preparation of individuais and collection of specimens foi
the ptoduefion of reference values. J Clin Chem Clin Biochem
1988;26:593-8. Part 4. Conttol of analytical variation in the production,
transfer, and application of reference values Eur J Clin Chem Clin
Biochem 1991;29:531-5 Part 5. Statistical treatment of collected
reference values: determination of reference limits. ] Chn Chem Clin
Biochem 1987;25:645-56. Pan 6 Presentation of observed values related
to reference values. J Clin Chem Clin Biochem 1987;25:657-62.
7. Lahti A, Petersen PH, Boyd JC, Rusiad F, Laake P, Solberg HE.
Partitioning of n onga us s ia n-d i s tr i b u ted biochemical reference data into
subgToups. Clin Chem 2004;50:891-900.
8. Morrison DF. Multivariate statistical methods, 4th ed, Belmont, CA.
Broolis-Cnle, 2005
9. Ru s ta d P, Felding P, eds. Transnational biological reference inter vais.
Proceduies and examples from rhe Nordic Reference Interval Project
2000- Scand J Clin Lab Invest 2004;64:265-441.
10. Shulc EK, Willard KE, Rich SS, Connelly DP, Critchfield GC.
Imptoved reference-interval estimation. Clin Chem 1985;31:1974-8.
11. Snedecor GW, Cochran WG. Statistical methods, 8th ed. Ames, Iowa;
Iowa State Uníveisity Press, 1989.
12. Solberg HE. The 1FCC recommendation on estimation of reference
intervala The RefVal progtam. Clin Chem Lab Med 2004;42.
710-4.
13. Solberg HE Establishment and use of reference values In: Burtis CA,
Ashwood ER, Bruns DE, eds. TietE textbook of clinicai chemistry and
molecular diagnostics, 4ih ed. St Louis: Saunders, 2006:425-48.
14 Solberg HE, Grasbeck R. Reference values Adv Clin Chem 1989;27-
1-79.
15. Solberg HE, Lahti A Detection of outbers in reference distributions:
performance of Horn s algorithm. Clin Chem 2005;51:2326-32.
CAPÍTULO 1 5
Informatica no Laboratório
de Análises Clínicas*
Brian R. Jackson, M.D., M.S., e James H. Harrison, Jr.. M.D.. Ph.D.
OBJETIVOS
1. Descrever os componentes de um sistema de computador, incluindo
hardware e software.
2. Descrever os pontos-chave na aquisição e implementação de um
sistema da informática laboratorial.
3. Explicar o papel dos padrões de informação, incluindo HL7, LQINC e
SNOMED.
4. Listar as principais categorias de risco de segurança em um sistema de
informação de saúde, junto com estratégias atenuantes.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
Go-live: O m o m e n t o e m q u e u m software (programa de
c o m p u t a d o r ) ou u m hardware (dispositivos q u e c o m p õ e m
u m c o m p u t a d o r , inclusive a u n i d a d e central de
p r o c e s s a m e n t o , a m e m ó r i a e os dispositivos d e e n t r a d a e
saída) é instalado p o r c o m p l e t o e testado, e inicia-se o u s o
de r o t i n a
H I P A A : A c c o u n t a b i l i t y Act, c o m suas r e g u l a m e n t a ç õ e s
associadas a respeito da segurança e privacidade da
i n f o r m a ç ã o de saúde.
I n t e r f a c e : N o a m b i e n t e laboratorial, esse t e r m o g e r a l m e n t e se
refere ao m e c a n i s m o d e t r a n s m i s s ã o de d a d o s d e u m
sistema de c o m p u t a d o r p a r a o u t r o , i n c l u i n d o f o r m a t o s
específicos d e dados.
I n t e r n e t : U m a r e d e m u n d i a l de c o m p u t a d o r e s disponível p a r a
u s o público.
M a l w a r e : U m t e r m o g e n é r i c o para software malicioso,
i n c l u i n d o , mas n ã o l i m i t a d o , aos vírus d e c o m p u t a d o r e s .
M e l h o r d a C a t e g o r i a : U m t e r m o u s a d o p a r a descrever u m
p r o d u t o que é c o n s i d e r a d o o m e l h o r e m u m a categoria
particular de p r o d u t o s . Isso implica a escolha de u m
c o m p l e m e n t o d e p r o d u t o s excelentes de múltiplos
v e n d e d o r e s e m vez de se a d q uirir t o d o o p o r t f ó l i o de u m
único vendedor.
N e t w o r k : U m m e c a n i s m o p a r a c o n e x ã o de c o m p u t a d o r e s para
c o m p a r t i l h a m e n t o de d a d o s . As redes de c o m u n i c a ç ã o
i n c l u e m conexões sem f i o (wireíess) e c o n e x ã o física, j u n t o
c o m hardware e software p a r a os d a d o s de r o t i n a .
R e g i s t r o C l í n i c o E l e t r ô n i c o ( E H R ) : U m registro m é d i c o e m
c o m p u t a d o r . U m E H R p o d e incluir d a d o s hospitalares,
d a d o s de a t e n d i m e n t o a m b u l a t o r i a l e m e s m o d a d o s d o
paciente.
Sistema de G e r e n c i a m e n t o de Dados (DBMS): U m programa
de c o m p u t a d o r para criar e m a n t e r g r a n d e s coleções de
informação.
* 0 autor agradecidamente reconhece a contribuição prévia de Kent A. Spack-
man, na qual se baseiam partes deste capítulo.
S i s t e m a d e I n f o r m a ç ã o H o s p i t a l a r (H1S): U m sistema de
f u n ç õ e s c o m p u t a d o r i z a d a s q u e gerencia o a t e n d i m e n t o
do paciente dentro d o hospital.
S i s t e m a d e I n f o r m a ç ã o L a b o r a t o r i a l (LIS): U m sistema d e
f u n ç õ e s c o m p u t a d o r i z a d a s para o g e r e n c i a m e n t o das
operações laboratoriais e c o m u n i c a ç ã o d a s resultados de
testes laboratoriais.
S i s t e m a O p e r a c i o n a l (OS): U m p r o g r a m a de c o m p u t a d o r
mestre que controla as f u n ç õ e s básicas d o c o m p u t a d o r ,
i n c l u i n d o dispositivos terminais d e imagens, resposta ao
teclado e ao mouse (dispositivo a p o n t a d o r ) ,
g e r e n c i a m e n t o de arquivos e c o n t r o l e de programas.
T e c n o l o g i a d a I n f o r m a ç ã o (IT): U m a s s u n t o a m p l o n o que
diz respeito a tecnologia e o u t r o s aspectos d o
g e r e n c i a m e n t o e p r o c e s s a m e n t o de i n f o r m a ç õ e s . O s
profissionais da c o m p u t a ç ã o são m u i t a s vezes c h a m a d o s
de especialistas em I I , e a divisão de u m a e m p r e s a o u
u n i v e r s i d a d e que lida c o m a tecnologia d e softwares é
g e r a l m e n t e c h a m a d a d e d e p a r t a m e n t o d e IT.
W o r l d W i d e W e b : U m a rede d e servidores n a I n t e r n e t que
p e r m i t e aos u s u á r i o s d e c o m p u t a d o r navegarem e n t r e
d o c u m e n t o s u s a n d o i n t e r f a c e s gráficas e ligações
h i p e r t e x t o (linícs).
A
i n f o r m á t i c a m é d i c a a b r a n g e o (1) projeto, (2) gerencia-
m e n t o e (3) e s t u d o d e sistemas q u e a r m a z e n e m e
c o m u n i q u e m i n f o r m a ç õ e s médicas. A informática do
laboratório de análises clínicas é u m r a m o desse c a m p o q u e se
c o n c e n t r a n a c o m u n i c a ç ã o e n o g e r e n c i a m e n t o de i n f o r m a -
ções relacionadas aos testes laboratoriais e sua i n t e r p r e t a ç ã o .
A i n f o r m á t i c a é crucial p a r a o p e r a ç õ e s d o l a b o r a t ó r i o , pois a
p r i n c i p a l tarefa d o s laboratórios d e análises clínicas é a criação
e c o m u n i c a ç ã o da i n f o r m a ç ã o p a r a o diagnóstico d o p a c i e n t e
e m o n i t o r a m e n t o da terapia. O objetivo d a i n f o r m á t i c a dos
l a b o r a t ó r i o s de análises clínicas inclui (1) s u p o r t e às decisões
de o r d e m correta dos p e d i d o s de testes pelos clínicos, (2)
c o m u n i c a ç ã o precisa e a r m a z e n a m e n t o d e p e d i d o s e resulta-
dos d e testes, (3) g e r e n c i a m e n t o de i n f o r m a ç õ e s i m p o r t a n t e s
p a r a a p e r f o r m a n c e laboratorial de alta q u a l i d a d e e (4) assegu-
rar a correta i n t e r p r e t a ç ã o d o s testes. A l g u n s desses processos
se e s t e n d e m além d o l a b o r a t ó r i o de análises clínicas e, assim,
a i n f o r m á t i c a d o laboratório está envolvida t a n t o n o s processos
i n t e r n o s c o m o externos d o l a b o r a t ó r i o , q u e envolvem a infor-
m a ç ã o laboratorial. Este capítulo a p r e s e n t a u m a i n t r o d u ç ã o
ao p r o j e t o , aquisição e aplicação d e sistemas de i n f o r m a ç ã o
c o m base e m c o m p u t a d o r e s n o s l a b o r a t ó r i o s d e análises clíni-
cas, pois os c o m p u t a d o r e s digitais e as r e d e s d e c o m p u t a d o r e s
f o r n e c e m a t u a l m e n t e a e s t r u t u r a p r i n c i p a l p a i a armazena-
m e n t o e c o m u n i c a ç ã o d e i n f o r m a ç ã o laboratorial—e p o r q u e
sua i m p o r t â n c i a irá c o n t i n u a r a crescer n o f u t u r o .
244 PARTE III Operações Laboratoriais

QUADRO 15-1 Um Resumo da História dos Computadores

Década de 1940 Primeiros computadores

Década de 1960 Computadores centrais e cartões perfurados
Década de 1970 Minicomputadores, terminais "buiros", tempo compartilhado
Década de 1980 Computadores pessoais
Década ds 1990 Servidores clientes, Internet, wimless (conexão sem fio)
Década de 2000 internet, clusters (agrupamento de computadores)

FUNDAMENTOS DE COMPUTAÇÃO
Esta seção fornece u m a introdução aos conceitos de informática,
incluindo (1) definições e história dos computadores digitais, (2)
representação dos dados digitais, (3) descrição de hardware e sof-
tware e (4) descrição de u m a rede de computadores.

Definições e História 0,01 1 100 10.000 1.000.000

Inicialmente, o termo "computador" se referia a uma pessoa que
realizava cálculos numéricos. 1 0 Esse termo é agora mundialmente
usado para definir u m a máquina digital para manipulação de
dados digitais de acordo com uma lista de instruções conhecida
como u m programa. 10 O E N I A C (Electrical Numerical Integrator
and Calculator) e o Colossus foram os primeiros computadores
digitais do m u n d o . O Q u a d r o 15-1 apresenta u m resumo da
história dos computadores digitais.
Representação de Dados Digitais
Os números armazenados, processados e comunicados por com-
putadores 10 são representados de forma binária (base 2, com valores
de 0 nu 1), pois o binário— correspondente a ligado e desligado^é
a extensão ao processo em sistemas eletrônicos. Esses valores 0 e
1 são referidos como "bits" {binar} digit) e são os blocos de constru-
ção para números maiores. U m a lista de 8 bits representa 256
valores, de 0 a 255, assim como uma lista de 3 dígitos em base 10
representa 1.000 valores, de 0 a 999. Os bits não são particular-
mente úteis por si só, exceto por representar valores verdadeiros
ou falsos. C o n t u d o , u m número de parâmetros que são úteis no
m u n d o real é representado adequadamente com 256 valores,
então u m grupo de 8 bits torna-se a unidade padrão dos dados de
computador e é referida como u m (binary term). Os volumes
de dados de computador (tamanho dos arquivos de dados, capaci-
dade de armazenamento etc.) são tipicamente mensurados em
bytes, usando o prefixo kiío- (milhares de bytes), mesa- (milhões) e
gig£í- (bilhões). Por convenção, em algumas áreas da computação,
esses prefixos se referem à base 10 (kilo = 1.000), enquanto em
outros se referem ao equivalente binário mais próximo (kilo =
1.024). Na prática, essa distinção não é importante.
Os sistemas que representam dados de forma binária são
referidos como sistemas digitais, O s dados digitais p o d e m ser
copiados com alta fidelidade entre localizações no computador
muitas vezes e n q u a n t o são processados. Ao contrário, muitos
dados no m u n d o real apresentam valores contínuos (tempera-
tura, cor, freqüência de som etc.) Esses tipos de valores são
referidos como anaiogícos e sua representação no ambiente dos
computadores digitais requer sua conversão para a forma digital
(ianalógico-para-digital, ou conversão A/D). Os valores convertidos
digitalmente são geralmente aproximações dos valores analógicos
iniciais e a aproximação é melhorada pelo a u m e n t o do n ú m e r o
de bytes que representam os dados analógicos n o consumo do
a u m e n t o crescente do total de arquivos de dados.
Os computadores digitais representam dados não-numéricos
usando números que são definidos como correspondentes, por
exemplo, símbolos (para texto) ou cores e intensidades de cor (para
Capacidade de armazenamento (Megabytes)
Figura 15-1 Taxa de transferência de dados em megabytes/segundo
uctsws capacidade de a r m a z e n a m e n t o para os dispositivos de
armazenamento e memória selecionados.
imagens). Para comunicar corretamente esses tipos de dados
entre computadores, as definições numéricas e sua organização
no c o n j u n t o de dados (seu formato) precisam ser "entendidas"
por cada computador. As definições compartilhadas e geralmente
definições entendidas, ou padrões,3 permitem que os computado-
res sejam usados como dispositivos de comunicação e são impor-
tantes para a maioria dos benefícios que os computadores forne-
cem hoje em dia. Muitas organizações de agrupamento-padrão
operam em todos os níveis do projeto de sistemas de c o m p u t a d o r
e comunicação.
Hardware de Computador
Na versão mais simples, u m computador consiste em uma u n i d a d e
de processamento central (CPU), memória para armazenamento de
dados e dispositivos para comunicação de dados para dentro e
fora do computador (dispositivos de entrada/saída). A C P U e parte
da memória são circuitos integrados. U m circuito integrado é u m
c o n j u n t o altamente miniaturizado de transistores interconectados
e outros componentes eletrônicos montados como uma unidade
única sobre uma pastilha (wafer) de silicone. Os circuitos integra-
dos são freqüentemente chamados de "cftips".
A C P U é designada a executar operações matemáticas e lógicas
sobre dados binários. As C P U s modernas contêm muitos milhões
de transistores. Os aperfeiçoamentos técnicos constantes n o
desenvolvimento das C P U s têm melhorado o desempenho e dimi-
n u í d o o preço dos hardwares de computadores, Os dados que
aguardam pelo processamento da C P U ou que foram recente-
mente processados são armazenados em chips especializados cha-
mados de memória de acesso aleatório, ou RAM (random access
memor}). A RAM permite acesso muito rápido a qualquer u m
desses dados (por isso o n o m e de "acesso aleatório") e requer força
contínua para manter seu estado. Os computadores modernos
têm tipicamente milhões a bilhões de bytes (megabytes a gigabytes)
de RAM. Exemplos de diversos dispositivos de armazenamento e
suas taxas de transferência são mostrados da Figura 15-1.
Os dados a serem preservados entre os processamentos são
copiados da RAM para a memória de duração mais longa. Essa
memória de longa duração é geralmente fornecida por u m disco
 Informática no Laboratório de Análises Clinicas
rígido (hn.rd disc drive). U m disco rígido consiste em u m ou mais
discus de inetal com coberturas de óxido metálico que são mag-
netizadas de m o d o reversível em padrões que representam os
valores de bit de 0 ou 1. Os disco rígidos têm feito grandes passos
na velocidade e capacidade e também são colaboradores importan-
tes para a diminuição do preço e razão de desempenho dos har-
dwares de computadores- A capacidade típica dos discos rígidos é
da extensão de gigabytes (bilhões de bytes). T ê m sido criados siste-
mas de armazenamento maiores pela ligação dos discos rígidos
juntos em matrizes de disco (disc arrays). Embora os discos rígidos
tenham velocidade impressionante, são muito mais lentos para o
acesso de dados do que a R A M e, portanto, os dados são normal-
mente processados em alta velocidade pela RAM e periodicamente
copiados para u m disco para preservação.
Os computadores pessoais também oferecem diversas formas
de memorieis portáteis. Os disquetes são feitos de u m plástico fino
e têm capacidade e velocidade de transferência muito mais baixas
do que os discos rígidos. Os disquetes têm sido largamente
suplantados pelos discos compactos (CDs), os quais têm capaci-
dades maiores e representam os dados com padrões detectados
por Liser em u m filme de metal ou tinta engastada em plástico.
Pequenos carrões de memória t a m b é m estão disponíveis e têm
capacidade e transferência de dados muito mais elevada.
O C P U , RAM e outros chips são m o n t a d o s em u m grande
circuito chamado de "placa-mãe", a qual fornece vias de comuni-
cação entre os chips e outros componentes do computador. A
placa-mãe também fornece conectores para os periféricos (veja a
seguir) e redes e pode incluir encaixes para circuitos de placas
especializados e menores chamados "cartões". Os cartões podem
ser usados, por exemplo, para conectar u m equipamento não-
padrão a u m computador ou para gerar capacidades especializa-
das, como dispositivos gráficos de alta velocidade.
A entrada/saida ( l / O ) é geralmente fornecida por u m teclado,
dispositivo apontador (tipicamente u m mouse ou mouse esfera—
trackball), monitor de vídeo e impressora. Se u m computador
estiver conectado a u m a rede, I / O t a m b é m ocorre via comuni-
cações em rede como em computadores maiores. As placas-mães
modernas implementam conexões de barramento-padrão para
esse e outros dispositivos externos (periféricos), como impressoras,
digitalizadores (scanners) etc. U m a conexão de b a r r a m e n t o é
projetada para supoTtaT múltiplos dispositivos em u m circuito,
usando um ambiente de comunicações compartilhadas; os exem-
plos incluem o barramento serial universal (USB) e o barramento
serial de alto desempenho (Firewne—IEEE 1394).
U s a n d o esses componentes, diversos tipos de computadores
têm sido montados, incluindo (1) computadores centrais (main-
frames), (2) computadores de mesa (desktops), (3) portáteis e (4)
assistentes digitais portáteis ("computadores de mão"). Além
disso, pequenos e delicados computadores chamados de sistemas
embutidos são freqüentemente incorporados nos dispositivos,
como instrumentos, eletrodomésticos e automóveis. Os grandes
computadores são projetados primordialmente para suportar
múltiplos usuários de rede confiáveis. Os servidores de empresa
(p. ex., Figura 15-2, CIS/EHR—clinicai information system
[CIS]/eletronic health record [EHR]) diferem dos microcompu-
tadores principalmente em (1) robustez na construção, (2) n ú m e r o
de processadores, (3) capacidade de memória e (4) redundância
de componentes internos. O s computadores centrais (ou macro com-
putadores) (Figura 15-2, c o m p u t a d o r central hospitalar) são pro-
jetados para suportar muitos usuários com pouco ou n e n h u m
tempo ocioso ("dou/ntime") para manutenção. Ma prática, é possí-
vel substituir quase que qualqueT componente (incluindo CPUs
individuais ou RAM) em u m c o m p u t a d o r central sem perda de
dados e n q u a n t o o computador continua a operar. Os servidores
CAPÍTULO 15 245
e macrocomputadores comi'mente usam sistemas externos de
matrizes de disco (Figura 15-2, LIS) em vez de discos TÍgidos
internos. Os grandes aglomerados de processadores de computador
paralelos, muitas vezes chamados de "supercomputadores", são
compostos de cemenas de microcomputadores com intercone-
xões de alta velocidade e são usados para modelos matemáticos
de computadores complexos, como clima, fluxo de líquidos e ar
e aplicações genômicas e proteômicas. E m b o r a cada um desses
tipos de sistemas contenha os elementos básicos de u m compu-
tador discutidos acima, cada u m t a m b é m oferece características
únicas ao seu propósito.
Software de Computador
O hardware d o computador processa a informação de acordo com
u m g T U p o de instruções, ou programa.13 Os programas são infor-
mação e, portanto, não tangíveis fisicamente; por isso, são cha-
mados de "software" (parte lógica d o computador) em contraste
a hardware (parte física d o computador).
Os computadores rodam primeiramente um programa de
controle chamado de sistema operacional (OS) que (1) coordena
as atividades do computador, (2) gerencia seus dispositivos inter-
nos e periféricos e (3) fornece u m ambiente paia o funciona-
m e n t o de outros programas. O O S define as características de
operacionalidade d o computador, ou "personalidade". Os Win-
dows XP e Vista, Linux e Macintosh OSX são OS, de microcom-
putadores m u n d i a l m e n t e conhecidos e muitos outros OS 5 são
usados para outros tipos de computadores. A combinação d o
hardware com o O S define u m tipo particular de computador e
é freqüentemente referida como u m a plataforma, pois fornece
u m a base para outros programas.
Os periféricos, dispositivos I / O etc. requerem programas cha-
mados de controladores de dispositivos (device driveis) ou simples-
mente controladores (drivers), para interpretar suas comunicações
e permitir que façam interface com o OS. A introdução de bar-
ramentos de comunicação-padrão, como o USB, tem simplifi-
cado o gerenciamento dos drivers, e foram incluídos drivers para
muitos tipos de dispositivos na distribuição dos OS. U m hardware
não usual ou para u m propósito especial pode ainda requerer a
instalação e o teste de u m driver de software especializado.
Os programas que suportam u m a tarefa particular para u m
usuário de computador, como a edição de texto, a análise de
planilha, o envio e recebimento de correspondência eletrônica
(e-mail), etc., são referidos como programas de aplicativos o u apenas
aplicativos. Os aplicativos f u n c i o n a m n o ambiente que o O S
fornece e p o d e m tirar vantagens dos serviços d o OS, como u m
estilo particular de disposição gráfica, ou capacidades de impres-
são e de trabalho em rede.
Os programadores de computador tipicamente criam o sof-
tware escrevendo uma representação textual das instruções de u m
programa, chamada de código fonte, u s a n d o u m ou muitos progra-
mas de linguagens.13 O código fonte pode ser completamente con-
vertido a instruções binárias (também chamadas de compilação ou
linguagem de máquina) e copiadas para o computador n o qual o
programa será executado C o m o alternativa, o código fonte (ou
u m a representação compacta dele) pode ser executado direta-
m e n t e usando u m interpretador que converte a fonte em lingua-
gem de computador em u m processo passo-a-passo. O código
compilado geralmente rnda mais rápido que u m código interpre-
tado, mas os interpretadores permitem u m desenvolvimento
mais rápido d o código, são mais flexíveis e geralmente fornecem
u m a capacidade melhor de executar u m programa em múltiplas
plataformas. A abordagem ótima para u m a taTefa particular
d e p e n d e dos seus objetivos e necessidades.
O software que interage com os usuários de c o m p u t a d o r o faz
através de u m a interface de uso que geralmente é disposta em
u m a tela. Os tipos mais amplamente utilizados de interfaces de
uso para microcomputadores são as interfaces de comanda por linha
246 PARTE III Operações Laboratoriais

Dispositivos portáteis

Radiologia sem PACS

CIS/EHR (Picture Archiving and Communication
Computador central Entrada de pedido Estaçao de trabalho
System)
do hospital (HIS) Relatório de resultados POC ("point-of-care")
10/ Farmácia
Admissão/descarte/
Outras sistemas de departamentos
transferência Finanças

A internet

IfUbríautí IIL7

7
Roteador
lie nuüc — —

Firewat!

L ii:: :il: irio r «tal èfiuiil &•

Hut> de rftdft
Usuário
rio LIS

Usuário
dn LIS
Garencisdur Matnz de Oisoo LIS
cs equipamentos

Usuário
do LIS

Ánüliaadoi dc luúurulOrio

Agrupamento de equipamentos laboratoriais

LAN laboratorial

Figura 15-2 D i a g r a m a simplificado d e u m a r e d e d e hospital o u l a b o r a t ó r i o (veja detalhes n o texto).

(Unix, Linux, Disc O p e r a t i n g System [DOS]) e as interfaces gráfi- dispositivos d e a p o n t a m e n t o p a r a interagir c o m os e l e m e n t o s da

cas para usuários ( W i n d o w s , M a c i n t o s h e G n o m e e K D E n o
Linux). As interfaces d e c o m a n d o de l i n h a f o r n e c e m u m a orien-
tação para a e n t r a d a d e texto e r e s p o n d e aos c o m a n d o s teclados
e e n t r a d a d e d a d o s . As interfaces gráficas para usuários (GUI S )
f o r n e c e m u m disposição (lajout) e m tela cheia para a interação
c o m o usuário, b o t õ e s e m e n u s l i s t a n d o ações alternativas e
interface. S e u p r o j e t o sugere o u s o correto das interações e evita
a necessidade de m e m o r i z a r c o m a n d o s , mas t a m b é m p o d e ser
i n c ô m o d o a n ã o ser q u e c o n s t r u í d o h a b i l m e n t e . Dessa f o r m a , a
escolha de u m a i n t e r f a c e para u m t r a b a l h o e m particular precisa
d e consideração c u i d a d o s a sobre a natureza da tarefa e as neces-
sidades d o u s u á r i o d o c o m p u t a d o r .
 Informática no Laboratório de Análises Clínicas
Rede de Computador
As redes de computador são compostas de conjuntos de computa-
dores que compartilham conexões por fios ou por freqüência de
rádio e transmissão de informação uns com os outros usando pro-
tocolos-padrão ou especificações da forma, conteúdo e métodos de
transmissão de dados. Os protocolos de comunicação entre com-
putadores são divididos naqueles projetados para o uso por
computadores em redes individuais geograficamente compactas
conhecidas como redes de áreas locais (LANs—Figura 15-2, parte
inferior) e aqueles para a conexão das redes de áreas locais juntas
através longas distâncias (WANs — redes de área alargada ou redes
de longa distância).
As LAN, comumente usam o padrão "Ettarner", o qual define
métodos para a transmissão de informação entre múltiplos com-
putadores através de u m fio compartilhado ou grupos de freqüên-
cias de rádio. Essas redes geralmente são como uma estrela que
libera ramos dos computadores a u m concentrador (hub) central
(Figura 15-2, par te central). Em edificações com múltiplos andares,
geralmente são colocados u m ou dois hubs em cada andar com
conexões na "espinha dorsal" que corre verticalmente entre os
andares. As estações sem fio (freqüência de rádio) funcionam de
modo semelhante aos fiubs com fios. C o m o hardware apropriado,
a Ethernet suporta a velocidade de transferência da rede, ou largura
da banda (baruíu/idtíi), em mais de 100 megabits por segundo.
As LAN, são conectadas a uma rede nacional de espinhas
dorsais através de roteadores (Figura 15-2, parte central) que geren-
ciam a transferência de informação. A combinação dessas LAN S
e das redes de espinhas dorsais constituem a I n t e r n e t (World
W i d e Web), uma rede global de redes. Hoje, a maioria dos dados
transferidos dentro e entre as LAN S usa u m grupo de protocolos
desenvolvido para a Internet chamado de T C P / I P (Transmission
Control Protocol/Internet Protocol). O T C P / I P define como
grandes arquivos de dados são quebrados em múltiplos "pacotes"
(rajadas) de informação por u m computador que envia, como
esses pacotes são endereçados e como são verificados em relação
a erros e reconstituídos aos arquivos originais pelo computador
que os recebe. O T C P / I P também define como os computadores
são identificados na Internet (por endereços de ÍP numéricos) e
como os roteadores lêem pacotes de endereços e direcionam os
pacotes paTa seus destinatários. Os roteadores monitoram conti-
n u a m e n t e as velocidades de transmissão entre si e outros rotea-
dores e m a n d a m pacotes em direção a roteadores que estão
menos congestionados. Dessa forma, a comunicabilidade dos
roteadores na Internet tem a habilidade de desviar um roteador
com falha ou u m problema regional, e os pacotes de u m único
grande arquivo de dados não necessita seguir o mesmo c a m i n h o
para o seu destino.
Os pacotes de dados transmitidos pela Internet não são auto-
maticamente criptografados e n q u a n t o armazenados e direciona-
dos entre os roteadores e, portanto, seus conteúdos estão sujeitos
a cópia ou observação. Os pacotes também têm sido construídos
com conteúdos e endereços de origem falsos. Dessa forma os
pacotes que entram em uma LAN vindos da Internet deveriam
ser visualizados como potencial falsificação, U m software de rede
privada virtual (VPN) resolve esse problema incorporando infor-
mação de autenticação nos pacotes e criptografando os conteú-
dos dos pacotes antes de estes entrarem na Internet. Assim, os
VPN, permitem a comunicação segura através da Internet pela
transmissão de pacotes criptografados verificáveis entre localiza-
ções confiáveis.
Aplicativos de Rede
As redes de computador suportam programas aplicativos que
permitem que muitos indivíduos interajam simultaneamente
CAPÍTULO 15 247
com u m c o n j u n t o unificado de dados, enquanto trabalham em
múltiplas localizações. Isso se dá usando computadores de arma-
zenamento de dados em rede, ou servidor. Os usuários p o d e m
executaT um programa (interface inicia! ou cliente) em seus compu-
tadores que forneça a interface de uso e muito do poder de
processamento do aplicativo, e transfira os dados pela rede até o
servidor (ou retaguarda). Essa arquitetura cliente-servidar padrão tem
sido considerada escalonável a grandes números de usuários a
baixo custo, pois tira vantagem do poder de processamento dos
computadores dos próprios usuários.
Por essas razões parcialmente relacionadas à necessidade de
instalar e sustentar software cliente complexo em muitas máqui-
nas de usuários, esses sistemas cliente-servidor originais começa-
ram a perder aprovação em comparação com sistemas que usam
u m software cliente simples e de fácil m a n u t e n ç ã o (muitas vezes
chamado de cliente magro) com mais sistemas de retaguarda capa-
citados. Os navegadores de rede são c o m u m e n t e usados como
clientes magros, e os sistemas como PubMed, Google e Amazon
exemplificam a abordagem do cliente magro. Os sistemas de
cliente magro são freqüentemente construídos usando a arquite-
tura de três camadas que inclui um software "mediador" c o m p o n e n t e
j u n t o com o servidor de dados de retaguarda. O mediador geren-
cia as comunicações entre os clientes e os servidor de dados e
fornece u m processamento adicional para suportar as necessida-
des dos clientes.
Sistema de Gerenciamento de Banco de Dados
Os bancos de dados são coleções organizadas de informação; 12
sistemas de gerenciamento de bancos de dados (DBMSJ são
programas de computador projetados para criar e manter essas
coleções de informações. U m DBMS tipicamente (1) permite que
os dados sejam estruturados em modos lógicos de uso, (2) indexa os
dados pata que sejam pesquisados rapidamente e atualizados
simultaneamente através de acesso local ou em rede (3) permite
que vários usuários recuperem e atualizem dados simultaneamente
através de acesso local ou conectado à rede e (4) evita que os usu-
ários escrevam simultaneamente os mesmos elementos de dados.
Além disso, alguns bancos de dados suportam verificação interna
da consistência dos dados, protocolam todas as interações dos
usuários (trilha de auditoria), fazem cópia reserva enquanto ativos
e restabelecem os bancos de dados ao estado consistente anterior
n o caso de atualizações problemáticas ou errôneas.
O tipo de DBMS mais amplamente usado no presente são
sistemas de gerenciamento de base de dados relacional. Os bancos
de dados relacionais implementam uma estrutura multitabela
semelhante a múltiplas planilhas. Os registros de dados são repre-
sentados como listas nas tabelas, e os registros de diferentes
tabelas são ligados (relacionados) entre cada tabela através de
elementos de dados compartilhados. O banco de dados relacio-
nal suporta uma linguagem de programação-padrão para a des-
crição do banco de dados, consulta e atualização, chamada de
QUADRO 1 5 - 2 Funções de Suporte de um Sistema de
Informação Laboratorial
Entrada do registro do paciente e informação demográfica
Pedido de exame
Rastreamento da amostra
Entrada automática e manual de resultados de exames
Verificação da execução do teste
Controle de qualidade
Diagrama/distribuição das resultados
Acompanhamento de inventário e relatório de gerenciamento
248 PARTE III Operações Laboratoriais
Linguagem de Consulta Estruturada, ou SQL. Esses bancos de
dados são muito flexíveis e são particularmente úteis para a
consulta de dados de uma variedade de perspectivas.
SISTEMAS DE INFORMAÇÃO LABORATORIAL
O sistema de informação laboratorial (LIS) é uma classe de sof-
tware que recebe, processa e armazena a informação gerada pelo
fluxo de trabalho do laboratório. Esses sistemas são aplicativos
de bancos de dados em larga escala que estão p r o f u n d a m e n t e
incrustados nas operações laboratoriais, automatizando o fluxo
de quase toda a informação relacionada ao laboratório. 3 C o m o
indicado n o Q u a d r o 15-2, os LISs suportam u m n ú m e r o de
funções laboratoriais. Originalmente, os LISs eram sistemas autô-
nomos que forneciam a entrada do pedido do exame e a dispo-
sição do relatório e impressão para o ambiente clínico geral. C o m
o a u m e n t o do registro clínico eletrônico (EHR), contudo, tornou-
se c o m u m a interface do LIS com o E H R para receber os registros
do paciente e pedidos de exames eletronicamente e, assim, retor-
nar os resultados dos exames para o E H R para exibição." Os LISs
são destinados para laboratórios de análises clínicas, em vez de
laboratório de pesquisa e, assim, têm suporte limitado especifi-
camente para análise de dados ou protocolos de pesquisa. Essas
últimas funções são mais c o m u m e n t e encontradas em sistemas
de informação orientados para investigação, c o m u m e n t e referi-
dos como sistema de gerenciamento de informação laboratorial
(LJMSs).
O desenvolvimento da entrada do pedido e dos sistemas
externos de exposição dos resultados para o laboratório gera u m
desafio para a informática de laboratórios de análises clínicas, o
qual está comprometido com a otimização do fluxo de informa-
ção da escolha inicial do pedido médico até a interpretação dos
resultados. Os detalhes do projeto desses sistemas externos
muitas vezes criam problemas nos pedidos e interpretação de
exames que não são reconhecidos até o laboratório rever o
sistema. 1 Para evitar esse tipo de problema, o laboratório deve ter
conhecimento de todos os sistemas usados para pedido e visua-
lização de resultados e devem revê-los antes de colocá-los por
inteiro no uso de rotina. Ultimamente, esses sistemas são apro-
priados para o laboratório que tem a responsabilidade principal
de assegurar a exibição precisa e clara dos resultados laboratoriais
e todos os sistemas sendo usados por essa c o m u n i d a d e clínica.
Comunicações e Interfaces do LIS
O LIS opera tipicamente em u m ambiente de empresa médica
que inclui muitos sistemas de informação conectados funcio-
n a n d o sobre o hardware, incluindo (1) computadores centrais, (2)
servidores de empresa e (3) computadores deskwp/lnptop (Figura
15-2). As conexões entre os sistemas de informação e as conexões
a aparelhos são conhecidas como interfaces. Os LIS, p o d e m fazer
interface com sistemas por (1) registro hospitalar, (2) entrada de
pedido médico, (3) relatório de resultados, (4) faturamento, (5)
laboratório de referência, (6) pesquisa de repositores de dados e
(7) outras funções. As interfaces dos sistemas geralmente têm
base no padrão de comunicação HL7 (Health Levei 7, www.hl7
org), o qual define as "mensagens" eletrônicas de texto para
transmissão de informação do paciente. 5 O HL7 permite alguma
flexibilidade na implementação dessas mensagens e, assim, a
criação de uma interface HL7 requer planejamento e programa-
ção local. Novos padrões da organização HL7 definem mais com-
pletamente essas mensagens e p o d e m reduzir a variabilidade e o
custo das interfaces HL7 n o futuro.
As interfaces HL7 entre os principais sistemas são freqüente-
mente coordenadas por u m computador especializado chamado
"motor de interface" (centro da parte superior da Figura 15-2). A
informação sobre os pacientes e pedidos médicos é passada do
Sistema de I n f o r m a ç ã o Hospitalar (HIS) e sistema de informa-
ção clínica ou E H R ( C I S / E H R ) através do motor de interface
para o LIS. Muitos hospitais usam dispositivos portáteis para
exames ao leito (point-ofcarc [POC] teíting) (Capítulo 12) que são
"aportados" a u m c o m p u t a d o r de estação de trabalho conectado
à rede do hospital (Figura 15-2, parte superior) e p o d e m também
passar resultados e dados de controle de qualidade por meio da
rede para o LIS. Os resultados laboratoriais e os dados de fatu-
ramento p o d e m ser retornados do LIS através do motor de inter-
face HL7 para o C I S / E H R e HIS para exposição para os clínicos
e processamento financeiro.
O diagrama da LAN do laboratório na metade inferior da
Figura 15-2 retrata u m hub de rede conectando o LIS (1) ao motor
de interface, (2) ao usuário dos computadores internos do labo-
ratório (cliente) e (3) à aparelhagem do laboratório. O processa-
m e n t o de amostras e os métodos manuais de exames laboratoriais
requerem técnicos para entrar diretamente e rever os dados em
computadores desktop o u terminais, como mostrado à direita na
Figura 15-2. Os equipamentos automatizados p o d e m comunicar-
se diretamente com o LIS através da rede ou conexões delicadas
(Figura 15-2, parte inferior, à direita), recebendo a informação do
pedido e transmitindo resultados (equipamentos de interface
bidirecional), ou apenas transmitindo resultados (equipamentos
de interface unidirecionai). As interfaces dos equipamentos podem
seguir ou o padrão H L 7 descrito anteriormente ou o padrão
ASTM. O padrão A S T M (American Society for Testing and
Materials, agora conhecida simplesmente por ASTM Internacio-
nal), publicou o primeiro padrão de comunicação amplamente
utilizado para interface de equipamentos de laboratório com os
LISa e permanece em uso até hoje. Podem ser usados mais com-
putadores gerenciadores de equipamentos (Figura 15-2, parte inferior,
à esquerda) paTa controlar os conjuntos de analisadores automá-
ticos e sistemas robóticos de manipulação das amostras e pode
gerar o processamento especializado da amostra com base em
regras e a autoverificaçâo dos resultados
A rede do laboratório pode também se conectar à Internet
através de u m roteador (Figura 15-2, centrai à esquerda) As cone-
xões com à Internet, com proteção apropriada, são c o m u m e n t e
usadas para (1) comunicação, (2) acesso a informações de refe-
rência e (3) troca de pedidos e resultados de exames com os sis-
temas de LIS em laboratórios de referência e outros afiliados O
acesso à Internet é tipicamente restrito pelo uso de u m programa
firewall (Figura 15-2, ver t a m b é m a discussão sobre segurança a
seguir), e as comunicações na Internet p o d e m ser também pro-
tegidas pela criação d e uma rede privada virtual (VPN) para
partes externas.
Código 5306-6 do LOINC
Componente |Propriedade| Tempo | Sistema | Escala | Método
Rickettsía sp AB Título | PT | Soro | QN | FC
r
Q
LU
2 78178004 anticorpos conjra rickattsia
O
118590008 título
Ui
123029007 coleta única
11 9364003 amostra de soro —
•O 30766002 quantitativo
•a
O
69207009 fixação do complemento
Figura 1 5 - 3 Partes dos nomes LOINC com códigos do SNOMED.
 informática no Laboratório de Análises Clínicas
Sistemas-padrão de Codificação da
Informação
A informação armazenada n o laboratório, e outras bases de dados
médicas, e transmitidas em mensagens HL7 é geralmente expressa
usando códigos em vez de n o m e s ou descrições textuais. Os siste-
mas médicos de codificação representam conceitos de serviços de
saúde como cadeias de caracteres alfanuméricos pré-definidas.
Esses códigos apTesentam vantagens sobre as descrições em texto
por processamento automatizado, pois não são ambíguas, são
definidas sistematicamente e são independentes de linguagem. Os
códigos p o d e m ser localmente desenvolvidos, c o m o códigos de
exames definidos pelo laboratório, ou p o d e m ser retirados de
sistemas de padrões de codificação nacionais ou internacionais.
Por serem globalmente definidos, os códigos-padrão não necessi-
tam de tradução ("mapeamento") para outro esquema de códigos
se os dados são compartilhados para fora d o ambiente local. Os
sistemas-padrão de codificação clínica usados c o m u m e n t e incluem
os CID-9 e C/D-IO (Classificação Internacional de Doenças, Orga-
nização M u n d i a l de Saúde) para codificar os diagnósticos e C P T
(Current Procedural Terminology, Sociedade Americana de Medi-
cina), para codificação dos procedimentos médicos para fatura-
mento. LOINC e SNOMED são dois sistemas médicos de codifi-
cação particularmente pertinentes paia laboratório e patologia.
Nomes e Códigos para Identificação de
Observações Clínicas (LOINC)
O L O I N C começou c o m o u m padrão para especificar n o m e s de
exames lahoratoriais (LOÍNC Laboratorial) e então se ramificou
em outros testes diagnósticos, como radiologia e exames físicos
(LOINC Clínico).' O L O I N C é desenvolvido e m a n t i d o n o Insti-
tuto de Regenstrief em Indianapolis (www.regenstrief.org/
loinc/). Tem o potencial de simplificar o desenvolvimento da
interface e comunicações envolvidas nos exames laboratoriais,
pela especificação de u m c o n j u n t o padronizado de n o m e s de
exames. U m n o m e L O I N C tem seis componentes: (1) compo-
n e n t e / a n a l i t o , (2) tipo de propriedade (p. ex., massa), (3) aspecto
d o tempo (p. ex., coleta de 24 horas), (4) tipo de amostra/sistema,
(5) tipo de escala (p. ex., semiquantitativa) e (6) tipo de método
(Figura 15-3). O uso do L O I N C a u m e n t a provavelmente ã medida
q u e a troca de dados entre sistemas de serviços de saúde diferen-
tes se torna mais c o m u m .
Nomenclatura Sistematizada de Medicina
(SNOMED)
O S N O M E D (www.snomed.org) foi desenvolvido originalmente
pelo Colégio Americano de Patologistas (CAP). 9 O C A P tem,
desde então, feito u m a parceria com um grupo paralelo do Reino
U n i d o para produzir o S N O M E D Internacional. O S N O M E D
tem evoluído de suas raízes em anatomia patológica para tornar-
se o S N O M E D C T ( S N O M E D Termos Clínicos), u m a terminolo-
gia padronizada extremamente poderosa que cobre toda a medi-
cina clínica. U m a vez que os métodos sejam desenvolvidos para
permitir a codificação eficiente de descrições clínicas na medi-
QUADRO 1 5 - 3 P a s s o s na Aquisição de um Sistema de
Informação Laboratorial
Análise de requisitos
Solicitação de propostas
Demonstração de produto pelo vendedor
Implementação
Teste
Go-live
CAPÍTULO 15 249
cina, o S N O M E D promete permitir a análise de dados através
de u m a ampla gama de sistemas de informação clínica.
Aquisição do LIS
A aquisição e a implementação do LIS é u m e n o r m e empreendi-
mento. Envolve a redefinição de grandes quantidades de dados
e Tetreinamento de todo o pessoal e p o d e precisar de grandes
mudanças n o fluxo de trabalho. U m laboratório pode esperar
uma perturbação significativa d u r a n t e 12 a 24 meses n o r m a l m e n t e
necessários para a transição. A experiência em outras indústrias
tem mostrado que aproximadamente u m quarto desse projeto de
sistema de informação tem mais ou m e n o s sucesso, u m quarto
falha completamente, e a metade restante é atrasada, superfatu-
rada e / o u n ã o atende a d e q u a d a m e n t e às necessidades. Por essas
razões, a maioria dos laboratórios troca seu LIS apenas a cada 10
ou 20 anos. As razões típicas para a substituição de u m LIS
incluem:
• O vendedor está deixando de dar suporte ao LIS atual.
• O LIS atual é tão antigo que impede seriamente a efici-
ência do laboratório.
• O laboratório é adquirido por, ou se f u n d e com outro
laboratório com u m LIS diferente.
• A instituição deseja harmonizar o LIS com outros siste-
mas de informação.
C o m qualquer dessas razões, o risco e o nível de comprome-
timento necessários para a substituição d o LIS exigem q u e este
seja organizado e cuidadosamente planejado u s a n d o bons softwa-
res e boas práticas de desenvolvimento de sistema. 14 Os passos na
aquisição de u m LIS estão listados no Q u a d r o 15-3.
Análise dos Requisitos
O primeiro passo em qualquer projeto de tecnologia da infor-
m a ç ã o (IT) é uma cuidadosa análise dos requisitos. Para u m LIS,
devem-se, pelo menos, listar e identificar os seguintes:
• Drivers e critérios de sucesso d o prujeto-chave. Todos os
patrocinadores e participantes d o projeto devem ter os
mesmos objetivos em m e n t e .
• Restrições e requisitos únicos de u m laboratório particu-
lar. C a d a laboratório é diferente, e u m sistema bem adap-
tado a um laboratório p o d e ser completamente inapro-
priado pata outro. N o mínimo, as restrições deveriam
incluir os (1) tipos de exames realizados, (2) volumes de
amostras e (3) natureza do negócio e ambiente clínico. O
fluxo único de trabalho e as restrições semelhantes deve-
riam ser criticamente examinados, pois p o d e m refletir
práticas históricas em vez de restrições verdadeiras.
« Áreas nas quais o LIS atual é deficiente e tem requerido
soluções provisórias. Evitar, entretanto, atenção despro-
porcional a essas áreas em detrimento de outras.
• Características aceitáveis d o vendedor. Os pequenos ven-
dedores p o d e m ter a flexibilidade de customizar caracte-
rísticas, mas a m a n u t e n ç ã o d o sistema por u m a década
ou mais requer que o vendedor permaneça financeira-
mente viável e m a n t e n h a u m suporte de alta qualidade
por esse período. Ainda, é i m p o r t a n t e identificar o nível
d o risco d o vendedor que a organização está disposta a
aceitar.
• Custo aceitável. U m LIS movimenta facilmente cerca de
milhões de dólares apenas para a licença do software, e os
custos da implementação, treinamento e produtividade
reduzida temporariamente dos empregados muitas vezes
excedem os custos com a licença.
A organização deve decidir se irá pagar u m m e l h o r da cate-
goria ou uma estratégia de sistema integrado. A abordagem do
250 PARTE 111 Operações Laboratoriais
melhor da categoria permite que seções particulares do laborató-
rio escolham os componentes do sistema que têm a melhor
funcionalidade para aquela seção e pode resultar em um LIS
composto de m ó d u l o s de diferentes vendedores. Por exemplo, os
sistemas de hanco de sangue e anatomia patológica são freqüen-
temente considerados aquisições do melhor da categoria. A des-
vantagem é que o laboratório ou o departamento de IT p o d e
precisar de peritos para manter múltiplos sistemas. Além disso,
os dados em u m sistema podem ser difíceis de se transferir ou
não disponíveis para outros sistemas. Na prática, é possível aliar
a maioria dos sistemas a esforço e dinheiro, mas é difícil afirmar a
funcionalidade final de cada interface. A alternativa ao melhor
da categoria é apoiar-se em u m único vendedor de LIS que cubra
tudo. Infelizmente, muito poucos sistemas cobrem realmente
todo o espectro das funções de u m laboratório de análises clíni-
cas, e mesmo esses p o d e m n ã o cobrir adequadamente todas as
necessidades das seções do laboratório.
Solicitação de Proposta
U m a vez definidos os requisitos, o próximo passo é identificar
os potenciais vendedores e sistemas. Os laboratórios muitas vezes
distribuem os requisitos aos vendedores na forma de uma solici-
tação de proposta (RFP). U m a RFP deve incluir questões e requi-
sitos que são redigidas de m o d o a promover respostas o mais
claras possível. Os vendedores irão tentar apresentar seus siste-
mas da melhor maneira e p o d e m ter respostas ambíguas em áreas
o n d e seu sistema é pouco competente. E preciso ser muito espe-
cífico quanto a cada característica ou função desejada, e se está
incluída na oferta de custo. Deve-se perguntar diretamente se a
solução do vendedor inclui atualmente essa característica e / o u
função. Se faltar a m a característica, deve-se perguntar se há
planos de, no futuro, essa característica ser disponibilizada e a
data de sua liberação, ou deve-se fazer uma requisição de uma
oferta de desenvolvimento customizado. E preciso deixar o ven-
dedor saber abertamente que a empresa planeja incluir suas
respostas ao RFP como u m adendo ao eventual contrato. No
m o m e n t o do desenvolvimento do RFP, é b o m colocar em prática
o plano de como as respostas ao RFP serão revisadas, incluindo
quem estará envolvido na tomada de decisão, qual será seu papel e
como o processo de decisão irá progredir. Q u a n d o o RFP estiver
sendo completado, é razoável o uso da publicidade da informação
para estreitar a lista de vendedores para seis ou menos.
D e m o n s t r a ç ã o do Produto pelo Vendedor
Após receber e avaliar as respostas ao RFP, u m laboratório deve
convidar os vendedores de destaque para demonstrações. As
demonstrações são muito úteis para a revisão das características
do sistema para ter u m a primeira impressão do sistema e ques-
tionar os vendedores. As estratégias seguintes ajudarão os labo-
ratórios a tirar o melhor benefício das demonstrações:
• Reduzir a u m n ú m e r o pequeno os vendedores de desta-
que, idealmente dois, para evitar confusão e sobrecarga
de informação.
QUADRO 15-4 Áreas a Serem Consideradas Quando da
Implementação úe um LIS
Gerenciamento de risco
Garantia de qualidade
Teste
Treinamento
Comunicação
Serviços profissionais
Go-live
• Construir u m roteiro b e m específico para os vendedores
seguirem para que façam apresentações razoavelmente
comparáveis.
• Agendar todos os vendedores para apresentar dentro de
u m curto intervalo de t e m p o (ou mesmo no mesmo dia)
para que as comparações tenham base na informação
recente.
N a maioria dos casos, u m vendedor irá oferecer voluntaria-
mente uma lista de contatos de instalações existentes, geralmente
aquelas que têm experiências favoráveis. E preciso considerar o
pedido de uma lista completa das implementações e do vendedor
e contatar alguns lugares a mais da lista preferida.
Alguns laboratórios contratam consultores externos para
ajudá-los com o processo de decisão. Na prática, consultores adi-
cionam valioso investimento ao processo, particularmente se
tiverem experiência com múltiplos vendedores de produtos e labo-
ratórios. O papel do consultor na tomada de decisão deve ser
claro, e a maioria dos laboratórios deve usar consultores como
conselheiros em vez de delegar a tomada de decisão.
A negociação do contrato está além do objetivo deste capí-
tulo, mas vale a pena incluir diversos pontos. Os problemas
surgem em qualquer implementação de u m sistema maior e o
contrato é essencial como u m recurso de proteção. Durante a
avaliação do vendedor e as ligações para clientes de referência,
devem ser identificadas as áreas de potencial risco n o contrato.
Deve-se ter atenção também aos tópicos que são omitidos ou que
são ligeiramente encobertos n o contrato padronizado do vende-
dor. Por exemplo, os detalhes sobre os serviços profissionais
p o d e m estar faltando no contrato padronizado, embora repre-
sente tipicamente uma grande porção do total do custo da insta-
lação.
Implementação
Existem disponíveis muitos manuais excelentes e cursos de trei-
n a m e n t o s sobre gerenciamento de projeto de software. Diversas
áreas importantes estão listadas no Q u a d r o 15-4 e discutidas a
seguir.
Gerenciamento de Riscos
E i m p o r t a n t e identificar os principais riscos do projeto, e eventos
que possam desviar ou atrasar o projeto, e desenvolver estratégias
de minimizaçao e / o u contingência. Os planos de gerenciamento
de riscos devem ser revisados regularmente.
Garantia de Qualidade
U m objetivo chave é identificar os problemas o mais cedo possível
no processo. Estima-se que u m defeito descoberto tardiamente no
desenvolvimento de u m software custe 50 a 200 vezes mais que u m
problema descoberto logo no início. 6 O mesmo princípio se aplica
à implementação do software.
Teste
O teste é essencial, mas já que se espera que mesmo os testes mais
minuciosos detectem apenas cerca de metade dos defeitos, o teste
não é, em u m primeiro m o m e n t o , tão eficaz. O teste irá, tipica-
mente, incluir tanto os testes de unidade, os quais asseguram que
os módulos individuais estão f u n c i o n a n d o adequadamente, e os
testes de integração, nos quais se assegura que os m ó d u l o s intera-
gem apropriadamente entre si.
Treinamento
Muitas organizações falham em orçar adequadamente o treina-
m e n t o . A maioria do pessoal de laboratório necessitará reapren-
der grande parte das tarefas de seu trabalho, pois u m LIS é
 Informática no Laboratório de Análises Clínicas
QUADRO 1 5 - 5 Processos que Irão Contribuir para o
S u c e s s o no Desenvolvimento do Software
Uma minuciosa análise de requisitos Ü O projeto devem estar completos
artes no início da codificação
0 código deve ser submetido a um segundo programador para ser testado
0 teste deve cobrir uma ampla gama de cenários e dados, incluindo valores
absurdos
0 teste precisa ser terminado antes da aceitação do primeiro lançamento do
programa e precisa ser repetido em seguida a cada subseqüente
modificação (teste de regressão)
A documentação completa deve incluir as especificações originais,
modificações e validação de dados
p r o f u n d a m e n t e incrustado n o fluxo de trabalho do laboratório.
O s laboratórios devem orçar não apenas as instruções, mas
t a m b é m horas extras que o pessoal d o laboratório precisará tra-
balhar além de sua jornada regular e treinamento. Deve-se con-
siderar a designação de u m supervisor para cada seção e eleger
q u e m vai receber treinamento extra e atuar como u m perito local
para os outros funcionários.
Comunicação
O s laboratórios devem esperar grande dose de incerteza e ansie-
dade por parte dos usuários d o sistema até a implementação estar
completa. A pronta comunicação dos (1) prazos, (2) planos, (3)
mudanças d e planos, (4) problemas etc. dão suporte moral. U m a
linha aberta de feedback daqueles envolvidos n o projeto de imple-
mentação ajudará a detectar problemas o mais facilmente possí-
vel. Os clientes externos, incluindo outros laboratórios e médicos
locais, deverão estar cientes d o projeto, d o período da instalação
de programas para uso de rotina e de quaisquer m u d a n ç a s que
o afetarão.
Serviços Profissionais
A maioria dos vendedores oferece serviços de consultoria que
p o d e m ajudar na implementação, pois dão a o p o r t u n i d a d e de
ganhar experiência e conhecimento sobre o novo sistema. O con-
trato inicial deve especificar razão, termos e condições dos serviços
profissionais com o cliente, mantendo o direito de aprovar o pessoal
do vendedor e rejeitar indivíduos se necessário.
Go-live
O go-live é o m o m e n t o em que o sistema de software ou hardware
é completamente instalado e testado e inicia-se o uso de rotina.
Na prática, é u m estimulante se for u m marco amedrontador. Se
houver sucesso, será u m feito impressionante para o laboratório.
Se não, p o d e suceder u m desastre. As considerações-chave paTa
garantir u m inicio com sucesso incluem (1) agendar o go-live para
u m período d e m e n o r movimento, p. ex., u m fim de semana; (2)
recrutar pessoal extra para suportar a perda de produtividade
devida à não-familiaridade com o novo sistema; e (3) ter u m a
cópia do plano n o local e especificar as circunstâncias sob as
quais terá q u e se recuar na implementação e retornar ao antigo
sistema.
Desenvolvimento do Software
O s laboratórios desenvolvem software com propósitos especiais,
abrangendo pequenos esforços internos para tarefas específicas
até projetos contratados para melhorar a funcionalidade d o LIS.
O desenvolvimento do software compartilha muito dos princípios
e riscos da aquisição e implementação do LIS. Diversos princí-
CAPÍTULO 15 251
pios listados n o Q u a d r o 15-5 a u m e n t a r ã o a probabilidade de
sucesso. 6
SEGURANÇA DO SISTEMA DE INFORMAÇÃO
Q u a n d o o gerenciamento eletrônico dos dados do serviço de
saúde se torna indispensável para o atendimento clínico, os
dados e a segurança d o sistema se tornam progressivamente
importantes. Os sistema de informação dos serviços de saúde
geram grandes benefícios, mas a qualidade do a t e n d i m e n t o é
seriamente comprometida se os sistemas forem perturbados ou
ficarem indisponíveis A divulgação inapropriada dos dados do
serviço de saúde resulta em (1) penalidades legais, (2) alteração
na vida dos pacientes e (3) perda da confiança do paciente. A
decisão de gerenciar eletronicamente os dados requer u m com-
p r o m e t i m e n t o correspondente contra danos n o sistema, assim
como perda, corrupção e uso incorreto dos dados.
Responsabilidade d o s Usuários
A maioria das divulgações inapropriadas de informação de saúde
ocorre através de ações intencionais ou não intencionais de usuá-
rios. Alguns indivíduos p o d e m tentar enganar os funcionários
para conseguir informações não autorizadas ou acesso a médicos.
Esse tipo de ataque, conhecido como "engenharia social", é geral-
m e n t e muito mais fácil d o que tentar violar as salvaguardas da
segurança técnica. Para evitar esses problemas, os usuários do
sistema devem ser treinados regularmente quanto às suas obriga-
ções com o uso apropriado da informação médica. Os usuários
também deverão ser treinados para reconhecer requisições sus-
peitas de informação de terceiros. A senha ou outra informação
de acesso nunca deve ser compartilhada ou requisitada por outros
usuários Todos os usuários devem entender que os LISs criam
u m a trilha de auditoria, u m registro de ações dentro do sistema
identificado pelo usuário, que é periodicamente revisado.
Segurança do Sistema
O objetivo da segurança d o sistema é evitar que indivíduos ou
softwares não autorizados p e r t u r b e m ou d a n i f i q u e m o sistema.
Os sistemas p o d e m ser colocados em localizações protegidas
e seguras que t e n h a m baixo risco de fogo, alagamento etc. O
acesso físico ao sistema deve ser limitado ao pessoal treinado e
autorizado. Os softwares padrões de defesa devem ser instalados
contra aiaques de rede, incluindo invasores (crackers), ataques de
negação de serviço (denial-os-sewice [DoS]) e várias formas de
malware..l]
Crackers são indivíduos que t e n t a m ganhar acesso não auto-
rizado nos sistemas de c o m p u t a d o r usando u m a variedade de
ferramentas de software e engenharia social. Existem disponíveis
numerosas ferramentas, incluindo (1) teste completo de senhas
com base em dicionário de senhas, (2) sondagem das fraquezas
d o sistema e (3) testes para desconfiguração. Se o cracker consegue
acesso parcial ao sistema através de u m a senha de usuários por
engenharia social, existem técnicas disponíveis para tentar expan-
dir as permissões de acesso para níveis mais altos, particular-
m e n t e para sistemas que não são corretamente configurados.
Os ataques DoS p o d e m ocorrer q u a n d o u m ou mais compu-
tadores comprometidos na Internet, geralmente controlados por
u m cracker, são alvos de u m alto volume de comunicações em
rede para u m único endereço, sobrecarregando, assim, aquele
computador e sua rede local. C o m o alternativa, se os computa-
dores dentro de uma rede local estiverem comprometidos, u m
ataque DoS poderia ser iniciado localmente. Esses ataques ilus-
tram a necessidade de uniformizar a segurança nos computadores
em rede, e não apenas nos sistemas críticos individuais, como
u m LIS.
252 PARTE III Operações Laboratoriais
Malware é u m n o m e genérico pata muitos tipos de softwares
maliciosos, incluindo wrus, vermes (worms), cavalos de tróia, registra-
dores de digitaçâo (key loggers) e outros. Estritamente falando, os
vírus atacam a si mesmos e a outros softwares no computador e
rodam q u a n d o aquele software é ativado. Os «jorms geram seu
próprio mecanismo d e comunicação e viajam de computador
para computador de m o d o independente. Os cavalos de tróia
aparecem como softwares inócuos ou interessantes, mas realizam
ações indesejadas q u a n d o executados. Os registradores de digita-
ção são programas ocultos que capturam e transmitem toda a
digitação do usuário, permitindo que os crackers capturem a
identificação da usuário e senhas. O Malware pode ser recebido
diretamente, ser transmitido em u m e-mail ou anexo de conversa
on-íinej ou ser baixado automaticamente de sítios de rede mali-
ciosos.
A melhor proteção contra esses ataques é a combinação de
boas práticas de computação e u m software e / o u hardware de
segurança. As boas práticas incluem (1) não abrir mensagens de
e-maiís desconhecidos, (2) não abrir anexos não solicitados de e<
maíls ou conversas eletrônicas, (3) evitar sítios não confiáveis e
(4) configurar o software de Internet, como clientes de e-mail e
pesquisadores de rede, a não baixar e abrir arquivas automatica-
mente. Os pacotes de filtragem âos firewalls (Figura 15-2), servidores,
intermediários (proxy) e softwares firewall são muitas vezes usados em
combinação para impedir que u m software inapropriado entre
pela rede. Os softwares de detecção de intrusão também monito-
ram as redes e alertam sobre atividades suspeitas de crackers ou
malwares.
O malware tem se tornado u m problema sério e prevalente,
particularmente para computadores que executam o Microsoft
Windows, que uma indústria desenvolveu para testar e denunciar
a vulnerabilidade a malware do software e cria programas que
bloqueiam e removem os malwares. Os vendedores de computador
atualizam continuamente seus sistemas e liberam correções
(fiatcKes), ou pequenos arquivos com código de computador cor-
rigido, que conserta as vulnerabilidades identificadas. Diversos
estudos informais têm mostrado que u m computador com o
Microsoft Windows n ã o corrigido conectado à Internet irá se
infectar com malware dentro de poucos segundos a minutos,
sendo de crucial importância aplicar as correções ao sistema tão
logo seja apropriado (pode-se requerer u m teste local por profis-
sionais de IT) e mais computadores devem executar softwares "anti-
vírus". Embora os /irewalls façam uma mensuração da proteção
por manter a maioria dos malwares fora da rede local, é sempre
possível que uma nova forma de malware possa passar pelo firewall,
ou o malware pode ser introduzido após o firewall, por exemplo,
por u m laptop adicionado à rede. Em uma população de compu-
tadores Windows em u m laboratório, o efeito disso poderia ser
u m impacto muito grave nas operações laboratoriais.
Dados de Segurança e Privacidade
Ter dados médicos em sistemas eletrônicos é crucial para a qua-
lidade do atendimento e isso precisa ser protegido de perdas e
corrupção. Além disso, as informações médicas precisam ser tra-
tadas confidencialmente e divulgadas apenas para aqueles que
são parte do processo de atendimento médico. As regulamenta-
ções federais associadas ao H I P A A (Health Insurance Portability
and Accountability Act) determinam que as organizações de ser-
viços de saúde usem boas práticas específicas e salvaguardas para
proteger a segurança e privacidade dos dados que identifiquem
o paciente. 0 Essas regulamentações definem também (1) os direi-
tos dos pacientes com relação aos seus dados, (2) usos apropria-
dos dos dados pelas organizações de serviço de saúde e seus
parceiros de negócios e (3) penalidades para o uso inapropriado.
Em geral, os dados podem ser usados para o atendimento do
paciente e melhora da qualidade por profissionais de saúde auto-
rizados. O uso de dados para pesquisa pode ser aprovado por
uma comissão de revisão institucional que fiscaliza a pesquisa com
h u m a n o s e geralmente pedirá o consentimento do paciente, a
menos que todas as informações de identificação sejam removi-
das dos dados. 4
O primeiro passo na proteção da integridade e confidencia-
lidade dos dados é a restrição do acesso aos dados somente a
usuários treinados e autorizados. A maioria dos sistemas atuais
conta com senhas. Para serem efetivas, as senhas não p o d e m ser
compartilhadas com outros e devem ser construídas para que
crackers e outros não a descubram (p. ex.j devem conter caracteres
alfanuméricos). Existe u m breve guia para boas senhas disponível
em National Institutes of Health - www.alw.nih.gov/Security/
Docs/passwd.html).
O u t r o s métodos de autenticação têm sido usados na tentativa
de evitar as limitações das senhas. Pequenos sinais de autenticação
(tokens), como os "cartões inteligentes", carregam informações crip-
tografadas que identificam o proprietário ou dispõem números
em u m padrão único de troca conhecido pelo sistema em que se
entra, junto com a senha. Esses dispositivos diminuem a chance
de se obter uma informação útil para acesso através visualização
do usuário, registro de sua digitação ou captura de suas comuni-
cações de rede. A autenticação biométrica está também em ativo
desenvolvimento) e, no futuro, os usuários poderão ser identifica-
dos por (1) impressão digital ou de mão, (2) padrões de veias, (3)
vasos da retina, (4) padrão da íris ou (5) mapeamento facial.
Mesmo com u m ótimo controle de acesso e segurança de
sisrema, falhas no software ou hardware ou desastres naturais p o d e m
danificar u m sistema e os dados nele contidos. Assim, é essencial
copiar (backup) regularmente os dados para uma localização segura.
A maioria dos LIS., implementa u m backup rotativo para cartuchos
de fita. C o m o parte da rotatividade, algumas das fitas são tiradas
para que se u m desastre afetar o locai, não danifique também todos
os backups. Os sistemas altamente importantes podem também
criar u m hotbackup ("backup a quente"), um sistema duplicado
continuamente atualizado, fora da sede. Espera-se que os sistemas
cruciais como os LISs tenham planos de cobertura de desastres que se
antecipem à possibilidade de falha de qualquer ou de todos os
componentes do sistema em uma varie dade de cenários, e forneça
procedimentos "do um ti me" (nos momentos em que o sistema está
ocioso) e procedimentos de restauração dos serviços.
Retenção de Dados
Os resultados dos exames e outras informações técnicas devem
ser retidos pelo laboratório de acordo com requerimentos regu-
latórios aplicáveis. Q u a n d o os sistemas de informação são altera-
dos ou aprimorados, é importante confirmar se os dados arqui-
vados dentro do intervalo de t e m p o requerido permanecem
acessíveis.
REFERÊNCIAS
1. As cio n M, ed. Laboratoty errors & patient safety 2006. Vol 3, Issuc 3.
2. Barros CE, Nigam MK, Fridsma DB, Gadd CS. Piedicting the impact of
a new information system on workflow using a discrere event
simuíation. Medinfo 2004;11:706-10.
3. Cowan DF, ed. Infonnatics for the clinicai laboiarnry: a practical guide.
New York: Springer Vedag, 2003.
4. G u n n PP, Fremont AM, Bottrell M, Shugarman LR, Galegher J, Bikson
T. The Health Insurance Portability and Accountability Acc Privacy
Rule: A practical guide for researchers. Med Care 2004;42:321-7.
 Informática no Laboratório de Análises Clínicas
5. Klein G O . Standard ization of health iníormatics—results and challenges.
Methods Inf Med 2002;41:261-70.
6. McConnell S. Software project survival guide. Redmond, Washington,
DC: Microsoft Press, 1998.
7 McDonald CJ, Huff SM, Suico JG, Hill G, Leavelle D, et ai. LOINC, a
universal standard for identifying laboratory observations: a 5-year
update Clin Chem 2003,49:624-33.
8. Moskop JC, Marco CA, Larkin GL, Geiderman JM, Derse AR. From
Hippocrates ro HIPAA: Privacy and confidentiality in emergency
medicine—Part I: Conceptual, moral, and legal foundations A n n Emerg
Med 2005;45.53-9.
9 Wang AY, Sable JH, Spackman KA. The S N O M E D clinicai terms
development piocess; refinement and analysis of content. Proc AM1A
Symp 2002:845-9.
CAPÍTULO 15 253
10. Wikipedia. Computer. http.//en.wikipedia.org/wiki/Computei
(accessed January 2007)-
11. Wikipedia. Computei insecmity http://en.wikipedia.org/wiki/
Computer_msecurity (accessed January 2007).
12. Wikipedia Database. http://en.wikipedia.org/wiki/Database {accessed
January 2007).
13. Wikipedia- Programming Ianguage h t t p / / e n wikipedia.org/wiki/
Programminglanguage (accessed January 2007).
14. Wikipedia. Software development process. http://en.wikipedia.org/
wikí/SoitwaTe_development_process (accessed January 2007).
CAPÍTULO 1 6
George G. Klee, M.D., Ph.D., e James O. Westgard, Ph.D.
OBJETIVOS
1. Definir qualidade, gestão da qualidade total, controle de processo
dos Seis Sigma e produção magra.
2. Listar os exemplos de variáveis pré-analfticas, analíticas e pós-
analíticas que afetam as resultados de testes laboratoriais e
determinam como cada um é controlado.
3. Comparar o controle interno de qualidade com a avaliação externa
de qualidade
4. Definir materiais de controle e estabelecer sua utilização no
laboratório clínico; definir controle de qualidade.
5. Explicar a necessidade de mapas de controle no laboratório clínico
e descrever como introduzir dados em um mapa de controle.
6. Listar e explicar as regras de Westgard para a interpretação de
dados de controle laboratoriais.
7. Aplicar as regras de Westgard aos dados efetivos de controle e
determinar que ações devem ser tomadas para corrigir valores de
controle fora do limite.
8. Definir testes de proficiência.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
Avaliação d a Q u a l i d a d e E x t e r n a : U m p r o g r a m a de q u a l i d a d e
n o qual as a m o s t r a s são s u b m e t i d a s a l a b o r a t ó r i o s p a r a
análise e os r e s u l t a d o s de u m l a b o r a t ó r i o i ndi vi dual são
c o m p a r a d o s aos resultados d o g r u p o de laboratórios
participantes.
C o n t r o l e d e P r o c e s s o d o Seis S i g m a : M e t a de d e s e m p e n h o da
q u a l i d a d e q u e r e q u e r 6 sigma o u 6 desvios-padrão de
variação d o processo p a r a se ajustar aos limites de
tolerância d o processo.
D e t e c ç ã o d e E r r o s : U m d e s e m p e n h o característico de u m
p r o c e d i m e n t o d e Q C q u e descreve o q u ã o f r e q ü e n t e m e n t e
u m a série analítica é r e j e i t a d a q u a n d o os r e s u l t a d o s c o n t ê m
erros além da i m p r e c i s ã o i n e r e n t e ao m é t o d o .
G e s t ã o d a Q u a l i d a d e T o t a l ( T Q M ) : Filosofia e a b o r d a g e m de
gestão q u e focaliza os processos e sua m e l h o r i a c o m o o
m e i o p a i a satisfazer as necessidades e exigências d o cliente.
G r á f i c o d e C o n t r o l e d e Levey-Jenníngs: U m a exposição gráfica
simples na q u a l os valores observados são c o n f r o n t a d o s
c o m u m a série de valores aceitáveis, c o m o i n d i c a d o n o
gráfico pelas l i n h a s d e limites de c o n t r o l e s u p e r i o r e
inferior, os quais são c o m u m e n t e extraídos da m é d i a , m a i s
o u m e n o s 3 desvios-padrão.
I S O 9 0 0 0 : U m a série de p a d r õ e s i n t e r n a c i o n a i s p a r a a gestão
da q u a l i d a d e p r o d u z i d o s pela O r g a n i z a ç ã o I n t e r n a c i o n a l
para Padronização.
L i m i t e s de C o n t r o l e : L i n h a s sobre u m gráfico d e c o n t r o l e
utilizadas para avaliar o e s t a d o d e c o n t r o l e de u m m é t o d o ;
c o m u m e n t e calculadas c o m o a m é d i a d o material de
c o n t r o l e mais o u m e n o s u m certo m ú l t i p l o d o desvio-
p a d r ã o o b s e r v a d o p a r a aquele material de c o n t r o l e .
P r o c e d i m e n t o de C o n t r o l e ( P r o c e d i m e n t o d e Q C ) : O
p r o t o c o l o e os materiais necessários p a r a u m analista avaliar
Gestão da Qualidade
se u m m é t o d o está f u n c i o n a n d o a d e q u a d a m e n t e e se os
r e s u l t a d o s dos testes d o p a c i e n t e p o d e m ser relatados. É
descrito p e l o n ú m e r o d e m e d i d a s de controle e pelos
critérios d e decisão (regras d e controle) utilizados p a r a
julgar a aceitabilidade dos r e s u l t a d o s .
P r o c e s s o d e T e s t e C o m p l e t o : D e f i n i ç ã o a m p l a d o p r o c e s s o de
testes laboratoriais, q u e inclui as etapas pré-analítica,
analítica e pós-analítica.
P r o d u ç ã o M a g r a : U m processo d e q u a l i d a d e q u e se c o n c e n t r a
n a criação d e mais valor pela e l i m i n a ç ã o de atividades
c o n s i d e r a d a s desperdício.
Q C Estatístico: Aqueles aspectos d o c o n t r o l e d e q u a l i d a d e n o s
quais estatísticas são aplicadas, e m contraste c o m o objetivo
m a i s a m p l o da garantia d e q u a l i d a d e , q u e inclui m u i t o s
o u t r o s p r o c e d i m e n t o s , c o m o a m a n u t e n ç ã o preventiva,
avaliações da f u n ç ã o d o i n s t r u m e n t o e testes d e validação
do d esempenho.
Q u a l i d a d e : C o n f o r m i d a d e às exigências d o s usuários o u
clientes e a satisfação de suas necessidades e expectativas.
R e g r a s d e C o n t r o l e : U m critério d e decisão utilizado p a r a
i n t e r p r e t a r os d a d o s d o c o n t r o l e d e q u a l i d a d e ( Q C ) e fazer
u m j u l g a m e n t o sobre o estado d e c o n t r o l e (ou seja, l 3 s
r e p r e s e n t a n d o u m a regra de c o n t r o l e o n d e u m a série é
julgada f o r a d e c o n t r o l e se u m a m e d i d a d e c o n t r o l e exceder
a m é d i a mais o u m e n o s 3 desvios-padrão).
R e g r a s M ú l t i p l a s d e W e s t g a r d : P r o c e d i m e n t o q u e utiliza u m a
série de regras d e c o n t r o l e p a r a testar as m e d i d a s d e
controle: u m a regra 1^ é u s a d a c o m o u m aviso, seguida p o r
l 3 s j 2 2s , R ^ , 4is e 10j usadas c o m o regras d e rejeição.
R e j e i ç õ e s Falsas: D e s e m p e n h o característico d e u m
p r o c e d i m e n t o de Q C q u e descreve o q u ã o f r e q ü e n t e m e n t e
u m a série analítica é rejeitada q u a n d o n e n h u m erro ocorre,
exceto pela imprecisão i n e r e n t e ao m é t o d o .
T e s t e s d e P r o f i c i ê n c i a (PT): O processo p e l o qual a m o s t r a s
s i m u l a d a s de pacientes o b t i d a s a p a r t i r d e u m a f o n t e
c o m u m são analisadas p o r laboratórios, s e n d o os r e s u l t a d o s
deste p r o c e d i m e n t o avaliados p a r a se d e t e r m i n a r a
" q u a l i d a d e " d o d e s e m p e n h o dos laboratórios.
O
s p r i n c í p i o s da gestão, garantia e c o n t r o l e d e q u a l i d a d e
se t o r n a r a m a base pela qual os l a b o r a t ó r i o s clínicos são
a d m i n i s t r a d o s e o p e r a d o s . Este capítulo c o m e ç a c o m
u m a discussão sobre os f u n d a m e n t o s da gestão da q u a l i d a d e total
e segue c o m as descrições de (1) gestão da q u a l i d a d e total d o s
l a b o r a t ó r i o s clínicos, (2) c o n t r o l e das variáveis pré-analíticas, (3)
c o n t r o l e das variáveis analíticas, (4) avaliação d a q u a l i d a d e
e x t e r n a e p r o g r a m a s de testes d e p r o f i c i ê n c i a e (5) u s o c o m b i n a d o
d e c o n t r o l e s mutáveis mais m é d i a s f l u t u a n t e s d o s valores de
p a c i e n t e s para a m o n i t o r a ç ã o d o c o n t r o l e d e q u a l i d a d e . O capí-
t u l o é c o n c l u í d o c o m discussões sobre as novas iniciativas de
q u a l i d a d e , i n c l u i n d o os p r i n c í p i o s e métricas d o s Seis Sigma, a
p r o d u ç ã o e n x u t a e os p a d r õ e s I S O 9 0 0 0 .
256 PARTE 111 Operações Laboratoriais
FUNDAMENTOS DA GESTÃO DA QUALIDADE
TOTAL
Os sistemas de qualidade nas organizações de assistência à saúde
c o n t i n u a m a se desenvolver com numerosas fontes de informação
disponíveis na Internet. 8 As pressões públicas e privadas para
conter os gastos são agora acompanhadas por pressões pela
melhoria da qualidade (QI). As pressões aparentemente contra-
ditórias pela redução d o custo e pela QI exigem que estas orga-
nizações de assistência à saúde adotem sistemas para gerenciar a
qualidade. Q u a n d o confrontadas com estas mesmas pressões,
outras organizações implementaram u m processo d e n o m i n a d o
gestão da qualidade total (TQM). Este processo é também refe-
rido como (1) controle da qualidade total (QC), (2) liderança da
qualidade total, (3) melhoria contínua da qualidade, (4) ciência da
gestão da qualidade, ou mais como (5) gestão da qualidade organiza-
cional Isso fornece tanto u m a filosofia de gestão para o desenvol-
vimento organizacional q u a n t o u m processo de gestão para a
melhoria da qualidade em todos os aspectos do trabalho. Muitas
organizações de assistência à saúde adotaram os conceitos e prin-
cípios da T Q M .
Conceitos
Neste capítulo, a qualidade é definida como a conformidade às
exigências dos usuários ou clientes e a satisfação de suas necessi-
dades e expectativas. Os ptincípios universais da T Q M são (1)
foco n o cliente, (2) compromisso com a gestão, (3) treinamento,
(4) capacidade e controle do processo e (5) medição utilizando
ferramentas de melhoria da qualidade. 2 1 O foco nos usuários e
clientes é importante, particularmente em organizações de servi-
ços, como as de assistência à saúde. Os usuários dos laboratórios
de assistência à saúde geralmente são as enfermeiras e os médicos;
seus clientes são os pacientes e outros grupos responsáveis pelo
pagamento.
Os custos devem ser compreendidos n o contexto da quali-
dade. Se a qualidade significa conformidade às necessidades,
então os "custos de qualidade" devem ser compreendidos em
termos de "custos de conformidade" e "custos de não-conformi-
dade", como ilustrado na Figura 16-1. Em termos organizacio-
nais, os custos de conformidade são divididos em custos de
prevenção e custos de avaliação. Os custos de não-confcrmidade
consistem em custos de insucessos internos e externos. Para u m
Custos da
qualidade
Cuslos de Custos de não-
conformidade conformidade
Custos
\ Custos de
Custos de Custos de
prevenção avaliação de falhas
internas
Exemplos: Exemplos: Exemplos:
Treinamento Inspeção Refugo
Calibração Controle Retrabalho
Manutenção de qualidade Séries Pedidos repetidos
repetidas
Figura 16-1 O custo da qualidade em termos de custos de
c o n f o r m i d a d e e custos de n ã o - c o n f o r m i d a d e às exigências dos clientes.
(De Westgard J O , Barry PL. Cost-effective quality c o n t r o l : m a n a g i n g t h e
quality a n d p i o d u c t i v i t y of analytical processes. W a s h i n g t o n , D C ;
A A C C Press, 1997.)
processo de teste laboratorial, a calibração é u m bom exemplo de
custo incorrido para prevenir problemas. Da mesma forma, (1)
o controle de qualidade é um custo para a avaliação do desem-
penho, (2) u m a série repetida é u m custo de insucesso interno
para u m desempenho analítico insatisfatório e (3) pedidos repe-
tidos de testes - devido à baixa qualidade pré-analítica ou analí-
tica - constituem u m custa de insucesso externo.
Essa compreensão da qualidade e do custo leva a u m a nova
perspectiva do relacionamento entre estes dois conceitos. A
melhoria na qualidade leva a reduções n o custo. Por exemplo,
com u m a melhor qualidade analítica, u m laboratório elimina
séries repetidas e pedidos repetidos de testes. Esse trabalho de
repetição é desperdício. Se a qualidade melhora, o desperdício é
reduzido, o que por sua vez reduz o custo. O pai deste conceito
f u n d a m e n t a l foi o recentemente falecido W. Edwatds Deming,
que desenvolveu e promulgou internacionalmente a noção de
que a melhoria da qualidade reduz o desperdício e leva a u m a
produtividade melhorada, o que por sua vez reduz custos e
fornece u m a vantagem competitiva. 7
Metodologia
A melhoria na qualidade ocorre q u a n d o problemas são elimina-
dos permanentemente. A experiência organizacional demonstra
que 8 5 % de todos os problemas são problemas de processo,
e n q u a n t o os 15% restantes são problemas que requerem u m a
melhoria na ação e desempenho de empregados individualmente.
Portanto, os problemas de qualidade são primariamente proble-
mas de gestão, porque apenas a gestão t e m o poder de m u d a r os
processos de trabalho.
Essa ênfase nos processos de trabalho leva a u m a nova visão
da organização como u m sistema de processos (Figura 16-2).^ Por
exemplo, várias disciplinas terão diferentes visões sobre os pro-
cessos de trabalho de uma organização de assistência à saúde
(Quadro 16-1). O sistema global para a organização de assistência
à saúde envolve a interação de todos esses processos e outros. 8
Dada a importância primária desses processos para a organi-
zação, a T Q M visualiza a organização como uma estrutura de
suporte, em vez de u m a estrutura de comando. Os processos mais
imediatos exigidos para a prestação de serviços são aqueles empre-
gados da linha de frente. O papel d o gestor sênior é dar suporte
Clientes ou
usuários s x ^
istema \ f \ ^
jProcesso^ | P r o c e s s o ^ | Processo^[Processoj
• n TTI r
J
Y [•mn í n
LJ [.
Itil /
Trabalhadores
de linha
n J
J L. L
Gerentes
t ? t j T j TJ
falhas de seção
externas
Exemplos: Diretores de
¥ + ¥ í
Reclamações departamento
Serviço
Administrador
da organização
Figura 16-2 V i s ã o da gestão da q u a l i d a d e total d e u m a organização
c o m o u m sistema de processos.
 Gestão da Qualidade CAPÍTULO 16 257

QUADRO 16-1 Diferentes Visões dos Processos de Trabalho

de uma Organização de Assistência à Saúde
como Função de Cada Posição na Organização

MÉDICO/PROMOTOR DE SAÚDE
• Exame do paciente
• Testes do paciente
• Diagnostico do paciente
• Tratamento do paciente

ADMINISTRADOR DE SAÚDE
• Processos para admissão dos paGientes
• Conduzindo os serviços dos pacientes
• Liberação dos pacientes
• Faturamento dos custos de serviço

DIRETOR DO LABORATÓRIO
• Processos de aquisição de amostras
• Processamento das amostras
• Análise das amostras
• Relatório dos resultados dos testes

ANALISTA DO LABORATÓRIO
Figura 16-3 E s t r u t u r a da gestão da q u a l i d a d e total para a gestão da
• Aquisição das amostras
• Análise das amostras q u a l i d a d e em u m l a b o r a t ó r i o d e assistência à saúde. ( D e W e s t g a r d J O ,
• Realização do controle de qualidade B u r n e t t RW, Bowers G N . Quality m a n a g e m e n t science m clinicai
• Liberação dos resultados de testes do paciente c h e m i s t r y ' a d y n a m i c f r a m e w o i k f o r c o n t i n u a m imp-rovement of
quality. C l i n C h e m 1990;36:1712-6.)

aos empregados de linha e empoderá-los para identificar e resol-

ver os problemas em seu próprio processo de trabalho.
A importância da delegação de poder de decisão é facilmente
compreendida se u m problema envolve processos de dois diferen-
tes departamentos. Por exemplo, se u m problema envolve uma
ligação entre o processo A e o processo B (Figura 16-2), a estru-
tura de gestão tradicional exige que o problema seja transferido
dos trabalhadores d e linha para u m gerente ou supervisor de
seção, u m diretor de departamento e u m administrador da orga-
nização. O administrador trabalha então com u m n ú m e r o igual
de intermediários do outro departamento. O envolvimento
direto dos trabalhadores de linha e seus gerentes deve fornecer
uma resolução mais imediata do problema
Todavia, resolver tais problemas exige u m processo criteriosa-
mente estruturado para garantir que as causas básicas sejam iden-
tificadas e as soluções propostas, verificadas. O processo de
melhoria da qualidade "projeto por projeto" de Juran fornece
diretrizes detalhadas que têm sido amplamente adotadas e inte-
gradas à metodologia de solução de problemas das equipes
atuais. 12 C o n f o r m e listado n o Q u a d r o 16-2, o esboço da metodo-
logia distingue etapas a serem seguidas para tal processo de QI.
IMPLEMENTANDO A TQM
Os princípios e conceitos da T Q M têm sido formalizados em u m
processo de gestão da qualidade (Figura 16-3). A estrutura tradi-
cional para a gestão da qualidade em u m laboratório de assistên-
cia à saúde enfatiza o estabelecimento de (1) processos laborato-
riais de qualidade (QLPs), (2) Q C , (3) avaliação da qualidade
(QA) e (4) sistemas de qualidade (QSs). 4 Os QLPs incluem pro-
cessos analíticos e políticas, práticas e procedimentos gerais que
definem como todos os aspectos do trabalho são realizados. O
Q C enfatiza procedimentos de controle (procedimentos de QC)
estatísticos, mas t a m b é m inclui procedimentos de avaliação não-
estatísticos, como as verificações de linearidade, avaliação de
reagentes e de padrões e monitores de temperatura. A QA, como
QUADRO 1 6 - 2 Elementos de uma Abordagem "Projeto por
Projeto" para Melhoria da Qualidade
Definição criteriosa do problema
Estabelecimento das medições base para o desempenho do processo
Identificação das causas essenciais do problema
Identificação de uma solução para o problema
Verificação de que a solução realmente funGiona
"Padronização" ou generalização da solução para implementação de rotina de
um processo melhorado
Determinação das medições em andamento para monitoração e controle do
processo
atualmente aplicada, relaciona-se principalmente com medidas
mais amplas e monitores de desempenho laboratorial, tais como
(1) tempo de resposta, (2) identificação de amostras, (3) identifi-
cação do paciente e (4) utilidade do teste. Observe que avaliação
ãa qualidade é o termo apropriado para essas atividades, ao con-
trário de garantia da qualidade, que tem sido incorretamente usada
para descrever essas atividades. A medida do d e s e m p e n h o não
melhora por si mesma o desempenho e f r e q ü e n t e m e n t e não
detecta problemas a tempo de evitar efeitos danosos. A Q A exige
que tanto as causas dos problemas sejam identificadas através da
Q I quanto eliminadas através do planejamento da qualidade
(QP), ou que o Q C detecte os problemas cedo o suficiente para
evitar suas conseqüências.
Para fornecer uma estrutura completamente desenvolvida
para a gestão da qualidade, os componentes da Q I e Q P devem
ser estabelecidos. A QI fornece u m processo estruturado de
solução de problemas para ajudar a identificar a causa básica de
u m problema e a solução para este problema. O Q P é necessário
para (1) padronizar a solução, (2) estabelecer medidas para a
258 PARTE III Operações Laboratoriais

QUADRO 1 6 - 3 j Princípios Básicos de um Sistema de Qualidade TABELA 16-1 Processos de Testes Laboratoriais e seus
Erros Potenciais
Documentos e registros
Organização
Processo * * Enos Potenciais ^ ; * . , . . . • ; -> - ; -
Pessoal Pedido de teste Teste inadequado
Equipamento Escrita à mão não legível
Aquisição e inventário Identificação errada do paciente
Controle do processo Exigências especiais não identificadas
Gestão da informação Custo ou pedido atrasado
Gestão de ocorrências Aquisição da Tubo ou recipiente incorreto
Avaliação: externa e interna amostra Identificação incorreta do paciente
Melhoria do processo Volume inadequado
Serviço ao cliente Amostra inválida (p. ex., hemolisada ou muito diluída)
Adaptado ie: Jn.siiiufo d& Padrões Glínícos e Laboratoriais, A qwüity sustem jnoil ílr Coletada no momento errado
jtfaiith. aiíe, 2nd ed. Documento HS0Í-A2 GLSI. Wctym, PA: /nstituro de °ic ír>>?r Condições de transporte Inadequadas
Ciáiicos e Lab&ratmais, 2004. Medição analítica Instrumento nãe calibrado corretamente
Amostra confundida
Volume da amostra incorreto
Substância interferente presente
Problema de precisão do instrumento
monitoração do desempenho, (3) assegurar que o desempenho
Relatório dos testes Identificação errada do paciente
atingido satisfaça os requisitos de qualidade e (4) documentar o
Relatório não apresentado em mapa
novo QLP. O novo processo é então implementado através do QLP,
Relatório não legível
medido e monitorado através do Q C e da QA, melhorado através
Relatório atrasado
da QI e replanejado através do QP. Estes cinco componentes, que Erro de transcrição
trabalham juntos em u m ciclo de feedback, ilustram como a Qi Interpretação Substâncias interferentes não reconhecidas
continua é efetuada e a garantia de qualidade é construída em dos testes Especificidade do teste não compreendida
processos laboratoriais. Limitações de precisão não reconhecidas
A estrutura dos "cinco Qs" (Figura 16-3) também define Sensitividade analítica não apropriada
como a qualidade é objetivamente gerenciada com o "método Valores prévios não disponíveis para comparação
científico", ou o ciclo PFCA (planejar, fazer, controlar, agir). O
Q P fornece a etapa do planejamento, o QLP estabelece processos
padronizados da forma pela qual as ações são realizadas, o Q C e
a Q A fornecem medições para avaliações do quão b e m as ações
são realizadas e a QI fornece u m mecanismo através d o qual se que as amostras apresentadas sejam analisadas (Capítulo 3). Por-
atua sobre essas medições. A metodologia naturalmente aplicada tanto, o processo de teste completo deve ser gerenciado apropria-
a experimentos científicos t a m b é m deve ser a base para decisões damente nas fases pré-analítica, analítica e pós-analitica.
objetivas de gestão. As muitas etapas ou subprocessos que ocorrem a partir do
A objetividade, todavia, d e p e n d e da existência de requisitos pedido inicial de u m teste pelo médico até o m o m e n t o da inter-
quantitativos de qualidade para a avaliação d o d e s e m p e n h o nos pretação final d o resultado d o teste são obtidos através d o desem-
processos existentes e o planejamento d o desempenho nos novos p e n h o de u m a "análise de sistemas". A Tabela 16-1 lista as etapas
processos. O s laboratórios devem definir suas metas e objetivos ou subprocessos para u m laboratório clínico típico e os poten-
de serviço e estabelecer requisitos clínicos analíticos de quali- ciais erros associados a eles. Apesar de tal análise identificar os
dade para o teste do processo. Sem tais metas de qualidade, processos críticos para u m laboratório típico, cada situação labo-
n e n h u m a forma objetiva existe para (1) determinar se u m a qua- ratorial é diferente, p o d e n d o estar presentes processos e fontes
lidade aceitável está sendo alcançada, (2) identificar processos de erro adicionais. Assim, cada laboratório deve executar u m a
que necessitam de melhoria, ou (3) planejar ou projetar novos análise de sistemas de seu próprio sistema de testes laboratoriais
processos que assegurem a obtenção de u m nível especificado de para identificar aquelas áreas nas quais os erros p o d e m ocorrer.
qualidade. U m a vez que os processos t e n h a m sido documentados,
A T Q M t a m b é m é considerada u m sistema de qualidade que aqueles mais suscetíveis a erros devem ser identificados e receber
é implementado para assegurar qualidade. Por exemplo, u m a maior atenção. Muitas vezes os processos que levam ao maior
n ú m e r o de reclamações, tais como amostras perdidas ou resulta-
d o c u m e n t o do Clinicai and Laboratory Standards ínstitutes
(CLSI) descreve u m sistema de gestão da qualidade (QS) como dos atrasados, são julgados mais importantes. Todavia, outras
etapas, tais como a adequação da seleção do teste e a aceitabili-
u m "conjunto de elementos-chave de qualidade que devem ser
adequados para que as operações de trabalho de u m a organização dade de u m a amostra, p o d e m ser mais importantes para se alcan-
f u n c i o n e m , de forma a alcançar os objetivos estabelecidos de çar u m a assistência médica ótima. Diretrizes descrevendo proce-
qualidade da organização.'" 5 O s princípios básicos de u m Q S dimentos para a manipulação da amostra estão disponíveis em
estão listados n o Q u a d r o 16-3. Estes representam a necessária organizações como o CLSI; organizações de credenciamento, tais
infra-estrutura exigida por u m laboratório para fornecer serviços como a Academia Americana de Patologistas, Centros para o
laboratoriais de qualidade. Detalhes de como implementar u m Controle e Prevenção de Doenças e agências reguladoras estatais,
Q S são fornecidos n o d o c u m e n t o d o CLSI. 4 também são úteis. 3,4,8

CONTROLE DAS VARIÁVEIS PRÉ-ANALÍTICAS

O PROCESSO DE TESTE COMPLETO O estabelecimento de métodos efetivos para a monitoração e
Relatórios de testes exatos e adequados são responsabilidade do controle das variáveis pré-analíticas é difícil, pois muitas das
laboratório. Todavia, muitos problemas surgem antes e depois variáveis estão fora das áreas laboratoriais tradicionais (Capítulo
 Gestão da Qualidade CAPÍTULO 16 259

QUADRO 16-4 | Variáveis no Processo Pré-analítico q u a n d o os resultados são verificados duas vezes. A informatização
reduz este tipo de erro de transcrição, pois os sistemas computa-
Uso do leste e diretrizes práticas dorizados possuem rotinas de detecção de erros programadas n o
Identificação da paciente terminal de funções de entrada. Essas rotinas p o d e m incluir (1)
Tempo de resposta verificação dos dígitos, (2) verificações de limites, (3) verificações
Registros laboratoriais de correlação de testes e (4) checagens de verificação com os
Erros de transcrição arquivos-mestre d o hospital.
Preparo do paciente
Coleta da amostra Preparação do Paciente
Transporte da amostra
Os testes laboratoriais são afetados por muitos fatores do paciente,
Separação da amostra e distribuição das alíquotas
tais c o m o a ingesta recente de alimento, álcool ou medicamentos,
fumo, atividade física, estresse, sono e postura durante a coleta
da amostra, e outras variáveis {Capítulo 3). A preparação apro-
priada d o paciente é essencial para se obterem resultados signifi-
3). A monitoração das variáveis pré-analíticas exige um esforço
cativos nos testes. O laboratório deve definir as instruções e
coordenado de muitos indivíduos e departamentos hospitalares,
procedimentos para a preparação d o paciente e obtenção da
devendo cada u m deles reconhecer a importância desses esforços
amostra.
na manutenção dc u m serviço de alta qualidade. A realização de
tal monitoração pode requerer suporte externo ao laboratório,
particularmente da comissão de práticas clínicas da instituição
Coleta da Amostra
As técnicas utilizadas para se obter u m a amostra afetam os testes
ou de alguma autoridade similar. U m a lista de variáveis impor-
laboratoriais {Capítulo 3). Recipientes inadequados e conservan-
tantes a se considerai estão listadas n o Q u a d r o 16-4, e são dis-
tes incorretos t a m b é m afetam os resultados dos testes, tornando-
cutidas a seguir.
os inadequados. U m a forma para monitorar e controlar este
aspecto do processamento laboratorial é designar u m a equipe
Aplicação d o s Testes e Diretrizes Práticas
laboratorial especialmente treinada para a coleta da amostra.
Tradicionalmente, a aplicação dos testes laboratoriais tem sido
monitorada ou controlada em algum grau, mas a ênfase atual n o
custo da assistência médica e a regulação governamental da assis-
Transporte da Amostra
A estabilidade das amostras durante o transporte desde o paciente
tência médica p o d e m aumentar a importância deste fator.
até o laboratório é f u n d a m e n t a l para alguns testes executados
localmente e para a maioria dos testes enviados para centros
Identificação do Paciente
regionais e laboratórios comerciais. Para controlar o transporte
A correta identificação de pacientes e amostras é uma grande
da amostra, o aspecto essencial é a possibilidade de se rejeitarem
preocupação para os laboratórios. A freqüência mais elevada de
amostras que chegam ao laboratório em u m a condição obvia-
eiras ocorre com a utilização de etiquetas escritas à mão e formu-
m e n t e insatisfatória (tais como u m a amostra descongelada que
lários de pedido. A utilização da tecnologia de código de barras
deveria ter permanecido congelada).
para a identificação d o paciente minimizou esta fonte potencial
de erros (Capítulo 11).
Separação d a s Amostras e Distribuição d a s
Tempo de Resposta (TAT) Alíquotas
A separação das amostras de sangue e a distribuição das alíquotas
O tempo decorrido desde que um teste foi pedido até que o
são funções usualmente executadas sob o controle direto do
resultado d o teste seja relatado é conhecido como o tempo de
l a b o r a t ó r i o . A s v a r i á v e i s p r i n c i p a i s s ã o a s (1) c e n t r í f u g a s , (2)
resposta para o teste. Fedidos de testes, amostras e relatórios
recipientes e (3) pessoal. As centrífugas devem ser monitoradas
atrasados e perdidos contribuem para TATs inaceitáveis. Por-
através de verificações da velocidade, temporizador e tempera-
tanto, na prática, é necessário registrar os tempos efetivos da (1)
tura. Tubos de coleta, pipetas, tampas e tubos com alíquotas são
coleta da amostra, (2) recebimento no laboratório e (3) relatório
fontes de cálcio e de contaminação por traços de metal; cada
dos resultados dos testes.
n ú m e r o de lote dos materiais deve ser testado quanto à contami-
nação pot cálcio e possivelmente por outros elementos.
Registros Laboratoriais
Q u a n d o tubos com alíquotas de soro chegam ao laboratório, um
formulário de pedido/relatório geralmente acompanha as amos*
CONTROLE DAS VARIÁVEIS ANALÍTICAS
tras. O n o m e do paciente, n ú m e r o de identificação e os testes
As variáveis analíticas devem ser controladas criteriosamente para
solicitados n o formulário devem ser comparados às informações
assegurar medições exatas por métodos analíticos. Métodos ana-
no rótulo do tubo da amostra para assegurar que eles são os
líticos confiáveis são obtidos através de u m processo criterioso de
mesmos. Além disso, a amostra deve ser inspecionada para se
(1) seleção, (2) avaliação, (3) implementação, (4) m a n u t e n ç ã o e (5)
confirmar a adequação do volume e a ausência de problemas que
controle (Capítulo 13). U m serviço laboratorial eficiente e inin-
possam interferir n o ensaio, tais como lipidemia ou hemólise. As
terrupto requer muitos procedimentos planejados para se evitar a
amostras devem então ser armazenadas apropriadamente, e as
ocorrência de problemas. Diferentes laboratórios experimentaram
informações de identificação e tempo de chegada, registrados em
diversos problemas com os mesmos métodos analíticos, pois
u m arquivo-mestre.
níveis diferentes de esforço foram alocadas para a assistência,
m a n u t e n ç ã o e suporte daqueles métodos.
Erros de Transcrição Certas variáveis devem ser monitoradas em u m a base labora-
Em laboratórios nos quais a identificação e rotina eletrônicas não torial ampla, pois elas afetam muitos métodos laboratoriais (Capí-
tenham sido implementadas, existe u m risco substancial de erro tulo 2). Além disso, certas variáveis afetam especificamente
de transcrição a partir da entrada m a n u a l dos dados, mesmo métodos analíticos individuais e estes necessitam do desenvolvi-
260 PARTE III Operações Laboratoriais
QUADRO 1 6 - 5 Esboço de um Documento de Procedimento do CLSI
Um documento 5 do CLSI descreve as seguintes seções a serem incluídas em um
procedimento laboratorial:
A. Título: Um iflulo estabelece claramente a finalidade do documento, devendo
ser conciso
B. Finalidade ou princípio: O documento deve começar por uma seção que
simplesmente estabeleça a sua finalidade. Per exemplo, a seção de
"Finalidade" de um processo poderia ser descrita como: "Este processo
descrevo como (aqui, o nome do processo, [p. ex., aquisição da amostra.])
ocorre neste laboratório. A seção de "Finalidade" de um procedimento
poderia ser descrita como: "Este procedimento íomece instruções para a
coleta de amostras digitais para a análise da glicose." As expressões "Este
praeesso descreve como..." e "Este procedimento fornece instruções
para..." podem ser padronizadas no modelo e, portanto, incluídas em cada
processo e documento de procedimento
Informações concernentes à teoria, implicações clínicas do exame ou
metodologia do exame, ou quadro histórico, podem ser incluídas no início
de um documento de procedimento para fornecer uma estrutura
educacional, clínica e científica para o leitor e usuário. Todavia, em
íunção de essas informações poderem ser técnicas e enfadonhas, elas
também podem ser posicionadas no final de um documento de
procedimento
C. Instruções óo procedimento: C foco primário de um procedimento é
fornecer informações sobre "como fazer" uma tarefa particular de
Adaptado do Insncwis de Padrões Clínicos e Laboratoriais. Laboratory documente: Deüelapment and Contro l, 2rid eâ. Documento do CLSI GP-Q2-A5. Wd;ynás PA: Instituto de Padrões
Ciínicoí e Laboratoriais, ZOO6.
QUADRO 1 6 - 6 | Esboço para um Manual de Procedimentos
A. Tabela de Sumários
B. Descrições dos Processos (opcionais, mas altamente recomendadas)
C. Procedimentos
D. Formulários Associados
Adaptado do Instiiitto de Padrões Clínicos e Laboratoriais- Lühomtory documente:
Development and Contro!, 2nd ed. Documento do CLSÍ GP-02-A5. W/i-jne, PA:
J?Liriti;/;: de Pddrães Oniícj; íl Laboratoriais, 2006.
m e n t o de procedimentos para lidar especificamente com as carac-
terísticas dos métodos.
Documentação d o s Protocolos Analíticos
O CLSI 5 define processo como u m c o n j u n t o de atividades inter-
relacionadas ou interativas que transformam entradas em saídas
{ISO 9OOO/http://www.iso.org). Na prática, u m processo pode
ser d o c u m e n t a d o como u m mapa de fluxo ou tabela que descreve
operações dentro do laboratório. U m d o c u m e n t o de procedi-
mentos fornece passo-a-passo as instruções que u m indivíduo
precisa seguir para completar com sucesso uma atividade no
processo. Tal procedimento é crítico se u m método fornecer os
mesmos resultados q u a n d o utilizado por diferentes analistas n o
decorrer de u m longo período de tempo. O Q u a d r o 16-5 delineia
as informações que estão contidas em u m d o c u m e n t o de proce-
dimentos. Diretrizes mais detalhadas são fornecidas pelo CLSI. 5
As matérias necessárias em u m manual laboratorial estão listadas
n o Q u a d r o 16-6. Tal m a n u a l deve ser revisto anualmente e revi-
sado sempre que alterações ocorrerem. Além disso, manter pro-
cedimentos obsoletos em uma pasta de arquivos (cópia em papel
ou eletrônica) é uma boa prática.
uma forma gradual. Por exemplo, as etapas envolvidas na execução de uma
medição da glicose sanguínea
D. Documentos relacionados: Se utilizada, esta seção fornece uma listagem de
outros procedimentos que foram mencionadas neste procedimento
E. Referências: Os procedimentos precisam citar a fonte das informações,
quando aplicável
F. Apêndices ou anexos: Exemplos de formulários completos, etiquetas ou
rótulos devem ser incluídos como apêndices ou anexos nos documentas
dos procedimentos. Informações adicionais contidas em uma tabela ou lista
podem ser mais bem apresentadas em um apêndice ou anexo, em vez de
no corpo do procedimento
G. Autorfes): 0(s) autcr(es] do documento deve(m) ser registrado(s). G
laboratório tem a opção de incluir as informações dos autores diretamente
no documento ou em outro documento que esteja relacionado ao
documento específico
H. Assinaturas de aprovação: As evidências de que o documento foi aprovado
pela(s) pessoa(s) apropriadas é uma exigência das agências reguladoras e
de credenciamento, e de padrões internacionais. G laboratório tem a opção
de incluir as informações das assinaturas de aprovação diretamente no
documento ou em outro documento que esteja relacionado ao documento
específico
Monitoração da Competência Técnica
O treinamento apropriado do pessoal do laboratório para se esta-
belecer uma uniformidade na técnica é importante, assim como
o cronograma de serviços suficientes de rotina para a manutenção
de técnicas adequadas. U m a lista escrita de objetivos que deli-
neiam as tarefas e conhecimento essenciais é u m instrumento útil
no treinamento do pessoal em novos métodos analíticos. Os
objetivos asseguram instruções sistemáticas que cobrem os pontos
críticos. Antes que as análises para o uso clínico sejam executadas,
a competência técnica do pessoal deve ser verificada e séries prá-
ticas, realizadas. A monitoração periódica da competência pode
ser difícil, mas relatórios e resultados incidentais a partir de veri-
ficações de Q C externas e internas ajudarão a identificar proble-
mas específicos; esses problemas devem ser discutidos diretamente
com o pessoal envolvido. Programas de educação continuada e
em serviço ajudam a manter e melhorar a competência. Confe-
rências com empregados também ajudam a descobrir problemas
não-técnicos que possam afetar a qualidade do trabalho.
Controle Estatístico d o s Métodos Analíticos
O desempenho dos métodos analíticos é tipicamente monito-
rado através da análise de amostras com concentrações conheci-
das e comparação subseqüente dos valores observados com os
valores conhecidos. O s valores conhecidos são geralmente repre-
sentados por u m intervalo de valoTes aceitáveis ou por limites
superiores e inferiores para o controle (limites d e controle).
Q u a n d o os valores observados se enquadram nos limites de
controle, o analista se assegura de que o m é t o d o analítico está
f u n c i o n a n d o adequadamente. Q u a n d o os valores observados se
enquadram fora dos limites de controle, o analista fica alertado
para a possibilidade de problemas na determinação analítica.
Várias fontes de informação sobre a aplicação do Q C estatístico
no laboratório clínico estão disponíveis. 10,18

Materiais de Controle
As amostras que são analisadas para fins de Q C são conhecidas
como materiais de controle. Elas precisam estar disponíveis (1) em
uma forma estável, (2) em alíquotas ou frascos e (3) para análise
ao longo de u m período extenso de tempo. Além disso, deve
existir apenas uma variação mínima de frasco para frasco, de tal
forma que as diferenças entre as medições repetidas sejam atri-
buídas ao m é t o d o analítico isoladamente. O material de controle
deve possuir preferencialmente a mesma matriz que as amostras
do teste de interesse; por exemplo, uma matriz protéica p o d e ser
melhor q u a n d o o soro for o material do teste a ser analisado pelo
m é t o d o analítico. Materiais de fontes h u m a n a s geralmente são
preferíveis, mas, devido à disponibilidade limitada e às conside-
rações sobre o d a n o biológico, os materiais oriundos de animais
oferecem uma certa vantagem em segurança e estão mais pron-
tamente disponíveis. A concentração do material analisado deve
estar nos intervalos de referência esperados e anormais, corres-
p o n d e n d o às concentrações q u e sejam críticas na interpretação
clínica dos resultados do teste.
Na prática, os laboratórios adquirem materiais de controle de
uma dentre várias empresas q u e produzem os soros de controle
ou "produtos de controle". Esses produtos geralmente são forne-
cidos em formas liofilizadas ou congeladas a seco que são recons-
tituídas pela adição de água ou de u m a solução diluente especí-
fica. Também estão disponíveis materiais com matri7es apresen-
tando urina, líquido espinal e sangue total. Materiais de controle
líquidos também estão disponíveis e possuem a vantagem da
eliminação de erros causados pela reconstituição. Todavia, as
matrizes desses materiais líquidos contêm outros materiais que
constituem uma fonte potencial de erros com alguns métodos e
instrumentos analíticos.
Além da matriz do produto, vários outros fatores devem ser
considerados na seleção dos materiais de controle comerciais. A
estabilidade é importante, pois o laboratório frequentemente
adquire o suprimento por u m ano de um lote ou série de fabricação.
Diferentes séries (ou números de lote) do mesmo material possuem
diferentes concentrações, o que exige novas estimativas do desvio-
médio e padrão (SD). O tamanho das alíquotas ou frascos deve ser
adequado para os métodos analíticos a serem monitorados. Frascos
de tamanho maior são geralmente menos caros (em uma base por
milímetro), mas os materiais não-utilizados podem eliminar econo-
mias potenciais. Dois ou três materiais diferentes devem ser selecio-
nados para fornecer concentrações que monitorem o desempenho
em diferentes níveis de decisão clínica.
Os produtos de controle são adquiridos como materiais testa-
dos ou não-testados. Os materiais testados acompanham uma lista
de valores para as concentrações esperadas daquele material. Essa
lista freqüentemente inclui tanto o desvio-médio quanto o SD para
vários métodos analíticos comuns e preferencialmente para u m
método de referência utilizado para medir um material analisado
particular. Devido ao trabalho necessário para determinar estes
valores, os materiais testados são mais caros. Apesar de os valores
de teste fixados serem úteis na seleção dos materiais desejados, a
determinação do desvio-médio e do SD no laboratório do usuário
é recomendável, pois esse processo melhora as características de
desempenho dos procedimentos de controle estatístico.
Princípios Gerais dos Gráficos de Controle
U m método c o m u m utilizado para comparar os valores observa-
dos para os materiais de controle com seus valores conhecidos é
a utilização dos gráficos de controle. Os gráficos de controle são
apresentações gráficas simples nas quais os valores observados são
plotados versus o m o m e n t o q u a n d o as observações são feitas. Os
valores conhecidos são representados por uma variação aceitável
Gestão da Qualidade CAPÍTULO 16 261
de valores, conforme indicado n o gráfico pelas linhas para os
limites de controle superiores e inferiores. Q u a n d o os pontos
marcados caem dentro dos limites de controle, esta ocorrência é
geralmente interpretada como que o m é t o d o está f u n c i o n a n d o
adequadamente. Q u a n d o os pontos caem fora dos limites de
controle, problemas p o d e m estar se desenvolvendo.
Os limites de controle são usualmente calculados a partir do
desvio-médio (x) e SD (s) obtidos a partir das medições repetidas das
amostras conhecidas por u m método analítico particular que deva
ser controlado. O desvio-médio e SD são calculados a partir das
seguintes equações:
T_Sx,
ri
(«ix-XW
n(n-l)
onde x, é uma observação individual de controle e n é o número
de observações no período de tempo que está sendo monitorado.
A estimativa inicial deve estar baseada em medições obtidas ao
longo de u m período de pelo menos 1 mês quando o método está
funcionando adequadamente. Na prática, esta estimativa inicial
pode não ser inteiramente precisa devido ao baixo número de
pontos de dados e possíveis informações estranhas nos dados. As
estimativas são revistas quando mais dados tiverem sido acumula-
das pelo registro de n e pelas somas de ^ e (xL2), e pela subseqüente
utilização dos totais cumulativos nas equações prévias para fornecer
as médias e SDs cumulativos. Os efeitos dos dados estranhos são
minimizados pela eliminação dos valores que excederem a média em
mais de ±3,1 a 3,8 s's (onde o fator exato depende do número total
de pontos de dados: 3,14 para n = 30; 3,22, n = 40; 3,33, n = 60;
3,41, n = 80; 3,47, n = 100; 3,66, n = 200; 3,83, n = 400).
A distribuição dos erros do m é t o d o analítico é considerada
uma distribuição simétrica e curva de Gauss. Os limites de con-
trole são dispostos para incluir a maioria dos valores de controle,
usualmente 9 5 % a 99,7%, que correspondem à média ± 2 ou 3
SDs (s). Por ser a observância de u m valor no final da distribuição
uma ocorrência relativamente rara (apenas 1 entre 20 m o m e n t o s
para limites de 2 s, 3 entre 1.000 para limites de 3 s), tal obser-
vação é duvidosa e sugere que algo possa ter acontecido ao
m é t o d o analítico. Tal ocorrência poderia ter causado u m deslo-
camento na média (um problema de exatidão), o que poderia
resultar em uma probabilidade mais elevada de exceder os limites,
ou ela poderia ter causado u m a u m e n t o n o SD (um problema
de precisão), que poderia a u m e n t a r a distribuição e t a m b é m
resultar em uma probabilidade mais elevada de exceder os limites
de controle da aceitabilidade.
A Figura 16-4, A, ilustra como as distribuições dos valores de
controle aparecem em três diferentes situações: (a) desempenho
estável no qual uma observação ocasional excede os limites de
controle; (b) ocorrência d e u m erro sistemático que desloca a
média da distribuição e causa u m a expectativa ou probabilidade
maior de que os valores de controle possam ser observados fora
de u m dos limites de controle; e (c) ocorrência de u m a u m e n t o
n o erro ou imprecisão aleatória, o que aumenta a distribuição e
causa u m a probabilidade b e m maior de que u m valor de controle
possa ser observado fora de quaisquer dos limites de controle.
Na prática, os gráficos de controle são utilizados para compa-
rar os valores de controle observados com os limites de controle
e fornecer uma apresentação visual que é inspecionada e revista
262 PARTE III Operações Laboratoriais
a) Desempenho b) Problema de c) Problema de
estável exatidão; desloca- precisão; aumento
mento na média no desvio-padrão
Limite de controle \ momento. O n ú m e r o total de observações de controle disponí-
1
Limite de controle
| refere à regra de controle na qual uma observação excede à média
•8
& Freqüência das observações
£
Tempo
Figura 16-4 Base conceituai dos gráficos d e controle. A ,
Distribuições de f r e q ü ê n c i a das observações d e c o n t r o l e para diferentes
c o n d i ç õ e s d e errns. B t A p r e s e n t a ç ã o d o s valores d e controle
r e p r e s e n t a n d o aquelas distribuições nas quais a c o n c e n t r a ç ã o é
m a r c a d a versus o t e m p o em u m m a p a d e controle.
rapidamente. Nestes mapas, a concentração ou valor observado
é marcado n o eixo y versus tempo de observação no eixo x. Comu-
mente, os dados de 1 mês são marcados no mapa, geralmente
apenas u m ou dois pontos por dia, mas o eixo do tempo deve
ser adequado para o m é t o d o que está sendo monitorado. U m
exemplo do gráfico de controle de Levey-Jennings é mostrado
na Figura 16-4, 6, o n d e os valores de controle representam as três
situações na Figura 16^4, A, com 10 valores por situação (para
u m total de 30 valores). Se o m é t o d o analítico estiver funcio-
n a n d o adequadamente, os valores de controle caem predominan-
temente dentro dos limites de controle. Q u a n d o existe u m pro-
blema de exatidão, os valores de controle são deslocados para u m
lado e vários valores em u m a linha p o d e m cair fora de u m dos
limites. Q u a n d o existe u m problema de precisão, os valores de
controle f l u t u a m muito mais amplamente e podem exceder
ambos os limites de controle superiores e inferiores.
A interpretação dos dados de controle é guiada por certos
critérios de decisão ou regras de controle, que definem q u a n d o
u m a série analítica é julgada "em controle" (aceitável) ou "fora
de controle" (inaceitável). O termo "série analítica" é utilizado
nesta discussão para se referir àquele segmento de dados para os
quais uma decisão sobre a aceitabilidade deve ser tomada. Este é
o grupo dos resultados do paciente que precisa ser relatado, com
base nos resultados de controle disponíveis para inspeção naquele
veis para inspeção q u a n d o u m a decisão precisa ser tomada sobre
a aceitabilidade de uma série analítica é designada como N. Por
exemplo, q u a n d o uma observação de controle precede e uma se
segue a u m grupo de 10 amostras de pacientes cujos resultados
devem ser relatados, existem duas observações de controle
naquela série analítica. As regras de controle são símbolos dados
como A l , ou n L , o n d e A é a abreviação para uma estatística, n é
o n ú m e r o de observações de controle e L se refere aos limites de
controle. Por exemplo, l 3s se refere à regra de controle na qual
uma observação excedendo os limites médios de controle + 3 s
é o critério para a rejeição da série analítica. Similarmente, l 2s se
±2s.
Características de Desempenho de um
Procedimento de Controle
O s diferentes procedimentos de controle discutidos anterior-
mente possuem diferentes capacidades de desempenho, depen-
d e n d o das regras de controle e da quantidade de observações de
controle escolhidas. Por exemplo, u m mapa de controle de Levey-
Jennings com os limites de controle dispostos como a média ± 2
s possui uma elevada taxa de rejeições q u a n d o o método está
realmente f u n c i o n a n d o de forma satisfatória ("falsos alarmes").
A utilização dos limites de controle de 3 s reduz os falsos alarmes
a 1% ou menos; todavia, os alarmes verdadeiros ou a detecção
de erros também passam por uma redução.
A seleção das regras de controle e das quantidades de medi-
ções de controle deve estar relacionada às metas de qualidade
estabelecidas pelo laboratório.' 5 Na prática, é necessário o conhe-
cimento das características de desempenho dos procedimentos
de controle para selecionar as regras de controle que detectam
problemas laboratoriais relevantes, sem causar alarmes falsos em
demasia. Analistas experientes frequentemente utilizam uma
série de regras ou julgamentos informais para reduzir a quanti-
dade de alarmes falsos, sem conhecer seus efeitos na detecção de
problemas reais ou alarmes verdadeiros. Alguma avaliação quan-
titativa destas duas características - alarmes falsos e alarmes ver-
dadeiros - deve existir sempre que as capacidades de novos pro-
cedimentos de controle forem avaliadas ou procedimentos de
controle fixados forem revistos.
E importante o reconhecimento da seriedade do problema
da falsa rejeição e sua relação com os limites de controle esco lhi-
dos para o mapa de Levey-Jennings. Estas falsas rejeições são de
fato uma propriedade inerente ao procedimento de controle. Elas
ocorrem em função dos limites de controle que tenham sido
selecionados, e não devido a problemas com o m é t o d o analítico.
Portanto, a utilização dos limites de controle de 2 s geralmente
não é recomendada. C o m a utilização dos limites de controle de
3 5, o problema da falsa rejeição é eliminado, mas a detecção de
erros infelizmente também é reduzida.
Mapa das Regras Múltiplas de Westgarg
O procedimento das "regras múltiplas" desenvolvido por West-
gard e colegas 19 utiliza várias regras de controle para interpretar
os dados de controle. A probabilidade de falsas rejeições é mantida
baixa por meio da seleção apenas daquelas regras com baixas
probabilidades individuais de falsa rejeição (0,01 ou menos). A
probabilidade de detecção de erros é melhorada através da seleção
 Gestão da Qualidade CAPÍTULO 16 263

daquelas regras que são particularmente sensíveis aos erros alea- Maleital (te oonlrvlu d» atevada concunlroçâo

tórios e sistemáticos. O procedimento das Regras Múltiplas de

f
Westgard requer um mapa com as linhas para os limites de con- 16b
trole desenhadas na média ± 1 s, 2 s e 3 s. 1 160

MÂW\ aÍ-
As seguintes regras de controle são utilizadas:

--tFA
$ ®
"8 p
155
• lj, U m a observação de controle excedendo à média + 2 s —

._y_x_L__!.\í;_ _vj.il
\L..
utilizada apenas como uma regra de "advertência" que inicia 150

. • ii
o teste dos dados de controle pelas demais regras de con- Í3 ° 145
-g "O
trole 8 * * * .
140
• l 3s U m a observação de controle excedendo à média + 3 s — •si
primariamente sensível ao erro aleatório 135
• 2 D u a s observações de controle consecutivas excedendo à I I I I I I 1 I I I

mesma média + 2 s ou à média - limite de 2 5 — sensível ao 5 6 8 11 1314 17 25 27 29

Número das séries
erro sistemático
• R^is U m a observação excedendo à média + 2 s e outra exce-
dendo à média - 2 s — sensível ao erro aleatório 112
• 4i, Q u a t r o observações consecutivas excedendo à média + 1 108

s ou à média - I s — sensível ao erro sistemático
• 10„ 10 observações de controle consecutivas caindo de u m
lado da média (acima ou abaixo, com n e n h u m outro requisito
sobre o t a m a n h o dos desvios) — sensível ao erro sistemático
A utilização do procedimento das regras múltiplas é similar
à utilização de u m mapa de Levey-Jennings, mas a interpretação
dos dados é mais estruturada. Para se utilizar o procedimento das
regras múltiplas são usadas as seguintes etapas:
1. As amostras do material de controle são analisadas pelo
método analítico a ser controlado em pelo menos 20 dias
diferentes. São recomendados dois materiais diferentes com
concentrações adequadas. A média e o SD são calculados para
os resultados de cada material de controle sendo utilizado.
2. Utilizando-se u m software, u m gráfico de controle é constru-
ído para cada u m dos materiais de controle utilizados. A
concentração observada ou o valor de controle é marcado no
eixo 9, fixando-se a variação das concentrações para incluir a
média ± 4 s. As linhas horizontais são desenhadas para a
média, a média ± 1 s, a média ± 2 s e a média + 3 s. Na prática,
são úteis diferentes cores para estas linhas, talvez verde,
amarelo e vermelho para os limites de 1 s, 2 s e 3 s, respecti-
vamente. O eixo x é graduado paia o tempo, dia ou n ú m e r o
de série e indicado adequadamente.
3. Duas amostras de controle são introduzidas em cada séTie
analítica para cada u m a das duas concentrações (quando
tiverem sido selecionados dois materiais diferentes). Os
valores de controle são registrados e marcados pata cada uma
no seu respectivo mapa de controle.
4. Q u a n d o ambas as observações de controle caírem dentro dos
limites de 2 s, a série analítica é aceita e os resultados do
paciente relatados. Q u a n d o uma das observações de controle
exceder u m limite de 2 s, os resultados do paciente são retidos
e regras adicionais aplicadas. Por exemplo, os dados de con-
trole são inspecionados utilizando-se as regras l 3s , 2*. R#a e
10*. Q u a n d o quaisquer das regras indicar que a série está fora
do controle, a série analítica é rejeitada e os resultados do
paciente não são relatados. Q u a n d o todas as Tegras indicarem
que a série está n o controle, a série analítica é aceita e os
resultados do paciente relatados.
5. Q u a n d o uma série estiver fora do controle, o tipo de erro é
determinado com base na regra de controle que tenha sido
violada. Isso envolve procurar as fontes para aquele tipo de
erro. O problema é então corrigido e a análise da série inteira
é repetida, incluindo as amostras de controle e do paciente.
U m exemplo da aplicação do procedimento das regras múlti-
plas é mostrado na Figura 16-5, o n d e o gráfico superior ilustra
u m material de controle de elevada concentração e o gráfico
AÍAjlSA /•
104
f 1
Y-U-U A1Y /L.7
F - V - - Y - - - - - w
X I I _L _L
5 6 8 11 1314 17 25 27 29
Número das séries
Material de controla de baixa concentração
Figura 16-5 M a p a d e c o n t r o l e das regras m ú l t i p l a s de Westgard,
c o m os limites d e c o n t r o l e d e s e n h a d o s na m é d i a ± l s , 2 s c 3 s . A
c o n c e n t r a ç ã o é p l o t a d a n o eixo y versus o t e m p o ( n ú m e r o das séries) n o
eixo x. A , M a p a para m a t e r i a l d e c o n t r o l e d e elevada c o n c e n t r a ç ã o . B ,
M a p a p a r a material d e c o n t r o l e d e baixa c o n c e n t r a ç ã o , s, Desvio-padrão.
(De "Westgard J O , Barry PL, H u n t MR, G r o t h T. A multi-rule S h e w h a r t
c h a r t for quality control in clinicai chemistry. C l i n C h e m 19fil;27;493-
501.)
inferior u m material de baixa concentração. E importante que a
regra seja aplicada d e n t r o de apenas uma série, de tal forma
que erros sistemáticos entre as séries não sejam interpretados
equivocadamente como erros aleatórios. Todavia, a regra pode
ser aplicada "através" dos materiais, significando que uma das
observações está n o material de baixa concentração e a outra no
material de alta concentração, enquanto eles estejam dentro da
mesma série. Alternativamente, observe que as regras 22s, 4]s e
10* são aplicadas através das séries e materiais. Esta aplicação
aumenta efetivamente o n e melhora as capacidades do procedi-
mento.
Identificação das Fontes de Erros Analíticos
Os procedimentos de controle estatístico fornecem u m meio de
alertar o analista para os problemas que fazem com que a quali-
dade do desempenho analítico seja m e n o r que as metas estabe-
lecidas para o laboratório. Todavia, esses procedimentos de con-
trole não identificam as fontes dos erros analíticos nem solucio-
nam os problemas de controle. O analista deve responder ao sinal
fora de controle para corrigir o problema e evitar futuras ocor-
rências.
As diretrizes de Q C do CLSI 6 enfatizam a importância da cor-
reção do problema, de forma oposta à repetição de rotina dos
controles, que, de fato, são apenas testes repetidos até que os con-
troles estejam dentro da variação aceitável. Q u a n d o os procedimen-
tos de controle são selecionados adequadamente, tomando-se como
base a qualidade requerida para o teste e a imprecisão e inexatidão
264 PARTE III Operações Laboratoriais
QUADRO 16-7 Erros Sistemáticos Geralmente
Relacionados a Problemas de Calibração
Materiais de calibração impuras
Preparo inadequado das soluções de calibração
Pontos estabelecidos e valeres fixados errôneos
Soluções de calibração instáveis
Soluções contaminadas
Técnicas de calibração inadequadas
Funções de calibração não-lineares cu instáveis
Formulários de amostra inadequados
Formulários de reagentes instáveis
observadas para o método, as falsas rejeições devem ser minimiza-
das. Instrumentos práticos para a seleção dos procedimentos ade-
quados de Q C têm sido descritos na literatura. 18 Q u a n d o alertado
para u m problema de controle, o analista deve primeiro conduzir
uma inspeção do (1) método analítico, (2) equipamento, (3) reagen-
tes e (4) amostras para assegurar que o teste está funcionando cor-
retamente. U m a inspeção pode parecer uma técnica qualitativa e
sensorial, mas é u m instrumento muito poderoso quando execu-
tada com listas de verificação desenvolvidas para métodos analíticos
específicos. Esta inspeção deve incluir uma revisão dos registros,
documentando alterações que ocorrem com o instrumento e rea-
gentes. Verificações concisas da função do instrumento são freqüen-
temente executadas para verificar o desempenho adequado do
sistema e separar as fontes de erros químicas das instrumentais. U m
analista experiente freqüentemente identifica o problema execu-
tando este tipo de inspeção, enquanto analistas inexperientes são
auxiliados por listas de verificação formais.
O tipo de erro fornece por si só u m indício sobre a fonte do
erro. Por exemplo, os erros sistemáticos freqüentemente relacio-
nados a problemas de calibração estão listados no Q u a d r o 16-7.
Os erros aleatórios são mais provavelmente devidos a (1) falta de
reprodutibilidade na pipetagem de amostras e reagentes, (2) dis-
solução de tabletes de reagentes e mistura da amostra e reagentes,
e (3) falta de estabilidade da temperatura das soluções, regulação
do tempo e de sensores fotométricos e outros sensores. Os métodos
analíticos individuais p o d e m não estar sujeitos a todas essas pos-
síveis fontes de erros; em vez disso, podem existir apenas poucas
fontes plausíveis para u m tipo particular de erro. Analistas expe-
rientes freqüentemente sabem quais são essas fontes comuns para
os seus métodos analíticos particulares e rapidamente identificam
as fontes, uma vez que o tipo de erro seja conhecido.
U m a indicação do tipo de erro é a regra de controle que é
violada. As diferentes regras de controle possuem diferentes sen-
sitividades para detectar erros aleatórios e sistemáticos. Por
exemplo, as regras l 3s e FL, t e n d e m a responder ao erro aleatório;
as regras 22s, 4is e 10x, aos erros sistemáticos. Procedimentos de
controle que utilizem amostras do paciente em vez de materiais
de controle estáveis ajudam a identificar fontes pré-analíticas de
erros, tais como manipulação e processamento da amostra. Pro-
cedimentos externos de avaliação da qualidade p o d e m fornecer
informações mais abrangentes sobre os erros sistemáticos que as
disponíveis a partir dos procedimentos internos. As informações
a partir de todos esses procedimentos são complementares e,
q u a n d o utilizadas em combinação, fornecem uma avaliação mais
completa dos tipos de erros e suas possíveis fontes.
Uso Combinado dos Controles de Líquidos e
Médias Móveis dos Valores do Paciente para a
Monitoração do Controle de Qualidade
As distribuições dos valores medidos dos testes têm sido utilizadas
para complementar os tradicionais controles de líquidos na moni-
toração da inclinação analítica. Essas medições da amostra do
paciente geralmente possuem variâncias muito maiores que os
controles de líquidos, pois elas contêm fontes biológicas, fisiopa-
tológicas e pré-analíticas d e variação, além da variação analítica.
Todavia, se algumas dessas fontes de variação forem controladas,
então as técnicas de média p o d e m ser utilizadas para gerar parâ-
metros de conduta que possuam variações da mesma ordem de
magnitude dos controles de líquidos. As informações demográfi-
cas sobre pacientes específicos, tais como idade, sexo e área de
serviço do provedor de saúde têm sido usadas pata normalizar os
valores dos testes, resultando em variações menores das médias
dos grupos para os parâmetros de monitoração. Q u a n t o maior o
t a m a n h o da janela usada para a média dos valores do paciente,
menor a variância. O coeficiente de variação (CV) da média do
grupo diminui aproximadamente de forma proporcional à raiz
quadrada do n ú m e r o de amostras. Várias técnicas estatísticas têm
sido usadas para calcular a média dos valores dos pacientes, tais
como a média móvel ajustada exponencialmente. Em geral, há
u m equilíbrio entre a variância diminuída versus o tempo aumen-
tado para a detecção de erros q u a n d o números maiores dos
valores do paciente são usados nestas médias móveis. Para a maior
parte dos testes químicos, tamanhos de janela usando-se valores
de amostra de 50 a 100 são freqüentemente necessários. 13 U m a
vantagem das distribuições dos valores dos testes sobre os contro-
les de líquidos é a inclusão da variação pré-analitica causada pela
coleta, transporte e armazenamento da amostra. Isso permite que
os parâmetros derivados dos valores do paciente detectem altera-
ções nestas variáveis além das alterações nos testes analíticos.
A Figura 16-6 ilustra u m algoritmo para a combinação de
controles de líquidos com u m controle derivado dos valores do
paciente. Os mesmos sistemas de avaliação de regras múltiplas
usados para os controles de líquidos têm sido utilizados para
conduzir a estatística do Q C derivado dos valores do paciente.
Pontos estabelecidos e valores de limiar são fixados para esse
parâmetro derivado, para otimizar a capacidade de detecção de
erros para o erro sistemático. Observe que os algoritmos de média
usados para gerar esses parâmetros derivados calculam a média
de erros aleatórios, de tal forma que esses parâmetros derivados
não são úteis para a detecção de erros aleatórios. C o m o ilustrado
na figura, esse protocolo de controle combinado é mais exato
q u a n d o tanto o controle de líquidos q u a n d o o controle derivado
do paciente se movimentam na mesma direção (ambos altos ou
ambos baixos). Q u a n d o os controles se movimentam discordan-
temente, é necessária u m a investigação adicional para definir se
o problema está relacionado à (1) instabilidade dos controles de
líquidos, (2) alterações nas características do paciente (tais como
muitos pacientes doentes observados ao mesmo tempo), (3) alte-
rações pré-analíticas dos testes, ou (4) outras causas.
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE EXTERNA E
PROGRAMAS DE TESTES DE PROFICIÊNCIA
Todos os procedimentos de controle descritos previamente foca-
lizaram a monitoração d e u m único laboratório. Esses procedi-
mentos constituem o que é freqüentemente d e n o m i n a d o Q C
interno para distingui-los dos procedimentos usados para compa-
rar os desempenhos de diferentes laboratórios, sendo estes
conhecidos como QA externa. Os dois procedimentos são com-
plementares: o Q C interno é necessário para a monitoração
diária da precisão e exatidão do m é t o d o analítico, e a Q A externa
é importante na m a n u t e n ç ã o da exatidão a longo prazo dos
métodos analíticos.
A participação em u m programa externo de testes de proficiên-
cia é necessária para todos os laboratórios dos EUA que executam
testes classificados como moderados e de alta complexidade. Muitos

Figura 16-6 Protocolo para a combinação dos controles líquidos com o controle derivado dos valores de u m paciente.
pontos de atendimento executam alguns desses testes, devendo
também se inscrever em programas de testes de proficiência. O s
fornecedores atualmente aprovados dos programas de testes de
proficiência distribuem kits de até cinco amostras para análise
três vezes ao ano pelo laboratório. O laboratório relata seus
resultados ao fornecedor, que então os torna disponíveis para as
agências reguladoras.
A s p e c t o s d o s Programas d e Avaliação da
Qualidade Externa
Vários programas de Q A externa disponíveis ao laboratório
clínico são patrocinados por sociedades profissionais e fabrican-
tes de materiais de controle. A operação básica desses programas
envolve todos os laboratórios participantes, analisando o mesmo
lote de material de controle, usualmente com frequência diária
como parte das atividades d o Q C interno. Os resultados são
tabulados mensalmente e enviados ao grupo patrocinador para
análise dos dados. Relatórios resumidos são preparados pelo
patrocinador do programa e distribuídos para todos os laborató-
rios participantes. Esse tipo de relatório não tem sido disponibi-
lizado em tempo real, sendo usado apenas para revisões mensais
e para atividades periódicas de solução de problemas. C o n t u d o ,
com os avanços nas telecomunicações e a acessibilidade e versa-
tilidade da Internet onipresente, o Q C externo em tempo real
está disponível.
Os relatórios gerados a partir dos programas de Q A externa
freqüentemente incluem u m a análise abrangente dos dados,
resumos estatísticos e gráficos. A média global dos laboratórios no
programa ou a média dos valores de todos os laboratórios é tida
como "verdadeira" ou de valor correto, sendo usada para a com-
paração com a média do laboratório individual. Os diferentes
Gestão da Qualidade CAPÍTULO 16 265
programas fazem isso de diferentes formas. Por exemplo, o teste t
é utilizado para testar a significância estatística de qualquer dife-
rença entre a média observada de u m laboratório individual e a
média do gTupo. Q u a n d o a diferença é significativa, o laboratório
é alertado de que seus resultados estão tendenciosos em compa-
ração com os resultados da maioria dos outros laboratórios. U m a
outra abordagem é dividir a diferença pelo SD global do grupo e
então expressar a diferença em termos de n ú m e r o d e SDs.
Resultado Laboratorial - Média do G r u p o
SDI =
Desvio-padrão Global do G r u p o
O n d e SDI é o intervalo ou índice do desvio-padrão e o SD gíofcal
do grupo é o SD para o grupo ou u m subconjunto selecionado do
grupo. Diferenças maiores que 2 indicam que determinado labo-
ratório não está de acordo com o restante dos laboratórios do
programa. Esses cálculos reduzem todos os resultados dos testes
aos mesmos valores, o que torna possível a interpretação dos
dados a partir de diferentes materiais analisados, sem referência
à média e s exatos para cada método analítico.
Algumas informações adicionais sobre a natureza do erro
sistemático são obtidas q u a n d o dois diferentes materiais de con-
trole são analisados por cada laboratório. A média observada do
laboratório para o material A é plotada n o eixo y versus sua média
observada para o material B no eixo x. Os testes gráficos são
d e n o m in a d o s gráficos de Youden. Idealmente, o p o n t o para u m
laboratório deve cair no centro da curva. Pontos de dados caindo
a partir do centro, mas na linha de 45°, sugerem u m erro analí-
tico proporcional. Pontos de dados caindo a partir do centro,
mas não na linha de 45°, sugerem ou u m erro q u e é constante
266 PARTE III Operações Laboratoriais
paia ambos os materiais ou u m que ocorre com apenas u m
material.
O relatório também p o d e incluir gráficos de Levey-Jennings
dos dados, mas por não estar tal informação disponível em tempo
real, ela n ã o serve efetivamente para fins de Q C interno. Gráficos
de controle em branco m o n t a d o s para cada material analisado e
cada material de controle p o u p a m do laboratório o tempo neces-
sário para preparar esses mapas manualmente.
Papel d o s Testes de Proficiência no
Credenciamento
O s testes de proficiência (PT) são o processo n o qual amostras
simuladas do paciente, feitas a partir de u m reservatório comum,
são analisadas por u m laboratório. Os resultados deste procedi-
m e n t o são avaliados paia se determinar a "qualidade" do desem-
p e n h o do laboratório. Existe controvérsia quanto à validade
desse processo de avaliação laboratorial, mas o governo e as
agências licenciadas o usam como u m m é t o d o objetivo para o
credenciamento do laboratório. Relatos da mídia destacando
problemas de qualidade dos laboratórios resultaram na tramita-
ção de levisões pelo Congresso dos EUA sobre o Clinicai Labo-
ra tory Improvement Act de 1967 (CL1A '67) e as Clinicai Labo-
ratory Improvement A m e n d m e n t s de 1988 (CL1A '88). U m a das
revisões prevê o P T c o m o parte principal do processo de creden-
ciamento do laboratório. As regras de implementação para esta
legislação têm evoluído, com a norma legislativa final sendo
publicada em 24 de janeiro de 2003." Diretrizes interpretativas
adicionais foram publicadas pelos Centros de Serviços de Assis-
tência e Socorro Médico (CMS), em janeiro de 2004, na forma
do Manual de Operações do Estado. O apêndice C desse docu-
m e n t o se refere especificamente às diretrizes para os laboratórios
e serviços de testes laboratoriais. 1
A CLIA '88 exige que todos os laboratórios dos EUA se
registrem n o governo e identifiquem os testes que executam. Os
testes são classificados como "gratuitos" ou "não-gratuitos". Os
testes gratuitos são aqueles que qualquer laboratório pode execu-
tar, contanto que siga as instruções dos fabricantes. N ã o há
outros requisitos para a gestão da qualidade desses testes. Os
laboratórios que executam testes "não-gratuitos" estão sujeitos
aos regulamentos completos d o CLIA, devendo ser inspeciona-
dos periodicamente pelo governo ou por certas organizações
profissionais consideradas detentoras de padrões pelo menos tão
rigorosos quanto os requisitos do CLIA, Duas de tais organiza-
ções são a Academia Americana de Patologistas (CAP) e a Comis-
são Mista de Credenciamento de Organizações de Assistência à
Saúde (JCAHO). As regras de implementação do CLIA e as
diretrizes interpretativas delineiam os critérios para u m desempe-
n h o aceitável na inspeção e credenciamento do laboratório.
Os requisitos do CLIA englobam várias classes extensas: (1)
Stibparte J. Administração de Recursos; (2) Subparte K. Sistemas
de Qualidade; (3) Subparte M. Pessoal; e (4) Subparte Q. Inspe-
ção. A regra final tratou principalmente de alterações na subpaTte
do QS, 1 ' com uma particular atenção aos sistemas pré-analíticos,
analíticos e pós-analíticos. Ela enfatiza de forma acentuada que
se tenha u m Q S para m o n i t o r a r processos pré-analíticos e pós-
analíticos, porém o maior impacto da regra final é na Q A analí-
tica e no Q S analítico. 20
A CLIA "88 propôs critérios que agrupam os testes laborato-
riais nas categorias "especial" e "subespecial" e especificam os
testes representativos a serem monitorados em cada categoria.
Para ter êxito em uma dada categoria, u m laboratório deve pro-
duzir resultados corretos em quatro de cinco amostras para cada
u m dos materiais analisados naquela categoria e alcançar u m
total de pelo menos 8 0 % para três desafios consecutivos. Se mais
de dois resultados incorretos forem produzidos para qualquer
material analisado, o laboratório é considerado "em experiência".
Se um laboratório tiver dois ou mais resultados incorretos para
qualquer material analisado ou u m escore total m e n o r que 8 0 %
em duas de três inspeções, ele é classificado como "suspenso" e
deve cessar os testes de todos os materiais analisados naquela
categoria determinada até que seja reintegrado.
LJma nova exigência dos regulamentos definitivos do CLIA
é que os laboratórios devem realizar estudos de validação dos
métodos em todos os novos testes introduzidos após 24 de abril
de 2003. Antes disso, os laboratórios que implementassem novos
métodos e sistemas analíticos que tivessem sido esclarecidos pela
Food and Drug Adminístration (FDA) podiam simplesmente
seguir as instruções dos fabricantes e considerar que as alegações
de desempenho dos fabricantes eram válidas. C o m a publicação
da regra definitiva, o d e s e m p e n h o de todos os novos testes deve
ser validado em cada laboratório para documentar a relatável: (1)
variação, (2) precisão, (3) exatidão, e (4) intervalos de referência.
Para alguns métodos, p o d e ser t a m b é m necessário determinar o
limite de detecção e testar possíveis interferências.
U m a outra alteração principal na regra definitiva foi a elimi-
nação de uma cláusula precoce que teria exigido que a FDA
revisasse as instruções d e Q C de um fabricante. Isso foi uma
cláusula-chave para permitir q u e os laboratórios simplesmente
seguissem as instruções de u m fabricante. Todavia, com a elimi-
nação de tal cláusula, os laboratórios possuem agora mais respon-
sabilidade para o estabelecimento de sistemas de Q C efetivos que
(1) monitorarão o processo analítico como u m todo, (2) levarão
em consideração as especificações de desempenho do método,
(3) detectarão erros imediatos e (4) monitorarão a precisão e a
exatidão a longo prazo.
A m u d a n ç a mais controversa na regra definitiva é a introdu-
ção de "procedimentos equivalentes de Q C " . O CLIA estabelece
u m nível m í n i m o de Q C que deve ser executado por todos os
laboratórios. Tipicamente, isso requer dois níveis de controles a
seiem analisados a cada 24 horas ou, para alguns testes, um nível
de controle a ser analisado a cada 8 horas. As novas diretrizes
para o " Q C equivalente" p o d e m permitir aos laboratórios reduzir
o Q C diário para semanal ou até u m Q C mensal paTa sistemas
analíticos que tenham controles de procedimento integrados. A
cláusula está obviamente visando testes de p o n t o de assistência
(POCT) ou testes próximos ao paciente (NPT), nos quais o
pessoal carece das habilidades para executar u m Q C e, portanto,
confia em verificações com instrumentos, mais notadamente veri-
ficações eletrônicas ou Q C eletrônico. Apesar dos argumentos
sobre a inadequação do Q C eletrônico, ele se tornou ampla-
mente aceito nos P O C T e nos tratamentos NPT. Embora haja
pelo menos u m exemplo de sistema analítico com tecnologia de
Q C melhorada que exige pouco ou n e n h u m Q C externo, 20 a
maioria dos sistemas analíticos ainda tem de demonstrar u m
desempenho que justifique u m a redução do Q C diário a apenas
u m Q C semanal ou mensal.
Os programas de PT estão longe de serem monitores ideais
do desempenho laboratorial. E m u m estudo de problemas de
inspeções de P T na Clínica Mayo, mais da metade dos erros nas
inspeções estava relacionada diretamente a deficiências nas ins-
peções (p. ex., amostras inválidas e critérios de avaliação inade-
quados), e apenas 2 8 % p u d e r a m ser relacionados a problemas
analíticos específicos. 14
NOVAS INICIATIVAS DE QUALIDADE
Várias novas iniciativas de qualidade têm sido desenvolvidas e
implementadas para assegurar que os laboratórios incorporem os
princípios da gestão da qualidade e Q A em suas operações diárias.
 Gestão da Qualidade CAPÍTULO 16 267

Isso inclui a implementação d o processo dos Seis Sigma, produ-
ção enxuta e dos padrões I S O 9000. Além disso, a Joint C o m -
mittee foi Tiaceabilily in Laboratory Medicine (JCTLM) tem sido
organizada para fornecer u m a direção na equivalência internacio-
n a l m e n t e reconhecida e aceita das medições n a medicina labora-
torial e u m a determinabilidade para padrões de medição apro-
priados.
O P r o c e s s o d o s Seis Sigma
O c o n t r o l e de processo dos Seis Sigma é u m a evolução n a gestão
da qualidade que está s e n d o a m p l a m e n t e implementada nos
negócios e organização do n o v o milênio. 11 A métrica dos Seis
Sigma está sendo adotada c o m o a m e d i d a universal de qualidade
a ser aplicada a seus processos e aos processos de seus fornecedo-
res. O s princípios dos Seis Sigma são determináveis na aborda-
gem da Motorola à T Q M n o início dos anos de 1990 e à m e t a
de d e s e m p e n h o de que " 6 sigma ou 6 desvios-padrâo de variação do
processo devem se ajustar dentro dos /imitei de tolerância para o pro-
cesso"; por isso, o n o m e Seis Sigma ( h t t p : / / m u . m o t o r o l a . c o n i / ) .
O Seis Sigma fornece u m a estrucura mais quantitativa para a
avaliação do d e s e m p e n h o do processo e evidências mais objetivas
para a melhoria do processo. A meta para o d e s e m p e n h o do
processo é ilustrada na Figura 16-7, que mostra u m a distribuição
de erros de u m p r o c e d i m e n t o d e medição que se ajusta de forma
aceitável dentro das especificações de tolerância ou requisitos de
qualidade para essa medição. Q u a l q u e r processo p o d e ser ava-
liado em termos de u m a métrica sigma que descreva quantos
sigma cabem d e n t r o dos limites de tolerância. Para processos nos
quais resultados insatisfatórios são contados c o m o erros ou defei-
Figura 16-7 A meta dos Seis Sigma "especificação da tolerância"
para o d e s e m p e n h o do processo representa a exigência da qualidade.
tos, os defeitos são expressos c o m o defeitos p o r milhão (DPM),
então convertidos para uma métrica sigma utilizando u m a tabela
p a d r ã o disponível nos livros-texto do Seis Sigma. 11 Neste
m o m e n t o , q u a n d o os resultados da assistência à saúde e a redução
dos erros médicos são de grande interesse, o Seis Sigma fornece
u m a metodologia geral para descrever o resultado d o processo n a
escala sigma.
Para ilustrar essa avaliação, considere o problema com u m a
certa marca de p n e u s e m u m a certa marca de veículos utilitários
esportivos (SUV) nos Estados Unidos. Utilizando-se dados dispo-
níveis ao público, houve 200 acidentes e m veículos equipados
com esses pneus, levando a u m a rechamada de 6.000.000 de
pneus. A taxa de defeito é então estimada em 333 S D M
(2000/6,000.000), ou 0,033%, q u e corresponde a u m sigma de
4,9, utilizando u m a tabela de conversão de S D M para sigma, U m a
taxa de defeito de 0 , 0 3 3 % seria considerada excelente em qual-
quer organização de assistência à saúde, o n d e taxas de erro de 1%
a 5 % são f r e q ü e n t e m e n t e consideradas aceitáveis. 2 U m a taxa de
erro de 5,0% corresponde ao d e s e m p e n h o 3,15 sigma e u m a taxa
de erro de 1,0% corresponde a 3,85 sigma. O Seis Sigma mostra
que a meta deve ser de taxas de erro de 0,1% (4,6 sigma) a 0,01%
(5,2 sigma) e, enfim, de 0,001% (5,8 sigma). A métrica sigma de
6,0 a 3,0 representa a variação d o "melhor caso" pata o "pior
caso". Métodos com o d e s e m p e n h o dos Seis Sigma são conside-
rados "classe mundial"; métodos com o d e s e m p e n h o sigma m e n o r
q u e 3 n ã o são considerados aceitáveis para a produção.
Utilizando os dados sigma discutidos acima, é possível consi-
derar a q u a n t i d a d e de Q C necessária para os processos de
medição que possuem diferentes métricas de d e s e m p e n h o . Por
exemplo, u m "gráfico de f u n ç ã o de capacidade" é m o s t r a d o na
Figura 16-8, que descreve a probabilidade de rejeição de u m a série
analítica n o eixo y uersws o t a m a n h o do erro sistemático que deve
ser detectado n o eixo x. As linhas verticais íngremes correspon-
d e m aos métodos q u e possuem d e s e m p e n h o de 3, 4, 5 e 6 sigma
(esquerda para direita). As diferentes linhas ou curvas de capaci-
dade c o r r e sp o n d e m às regras de controle e à q u a n t i d a d e de
medições de controle dadas n a legenda à direita (do topo para a
base). Esses diferentes p r o c e d i m e n t o s de Q C possuem diferentes
sensitividades ou capacidades para detectai erros analíticos. As
metas práticas são de alcançar u m a probabilidade de detecção de
erros de 0,90 (p. ex., u m a chance de 9 0 % de detectar o erro
sistemático de t a m a n h o crítico, e n q u a n t o se m a n t é m a probabi-
lidade de rejeição falsa em 0,05 o u m e n o s [p. ex., u m a chance
de 5 % ou m e n o s de alarmes falsos]). Isso é fácil de alcançar em
processos c o m d e s e m p e n h o de 5 a 6 sigma; são necessários u m a

N R

-x'
1,0
* 1 3S/2oí32S/R4&/3I S/6X
0,9
-•
/
/ '' / 6 1
// // 13S^2S/1W41S'

/ / /
/
>
0,8

/ /
* 4 '7"
0,7 k / / Y
12.5S
i

Ü,G •v // 4 1

/i // / / •7
Figura 1 6 - 8 Rekç ão do desempenho do / / /
t 12.5S
processo na escala sigma com as características de 0,5
t
/ / /} 2 1
d e s e m p e n h o de procedimentos laboratoriais de
0.4 9
f
// / // 13s/22s^4s
2 1
Q C c o m u m e n t e utilizados A probabilidade de //
// /
/
'
/ / .'/ 13S

/V '// /
rejeição é marcada n o eixo y versus a magnitude d o 0,3 >

2 1
erro sistemático no eixo x e a escala sigma n o eixo
0.2 / / 13.5S
x. As regras de controle e o n ú m e r o de medições
' V 2 1
de controle são dadas n a legenda à direita, em
q u e as 8 linhas, de cima para baixo, correspondem
0,1
^ : 23s
1 1
0,0
ás curvas do gráfico, de cima para baixo. 0. l,n 2.0 3,0 4,0
268 PARTE III Operações Laboratoriais
seleção mais criteriosa e esforços aumentados de Q C para pro-
cessos de 4 a 5 sigma; e torna-se m u i t o difícil e caro para proces-
sos com menos de 4 sigma.
Produção Magra
A produção magra é u m processo de qualidade que está concen-
trado na criação de mais valor pela eliminação de atividades que
são consideradas desperdício. Por exemplo, qualquer atividade
ou processo ineficiente que consuma recursos ou adicione custos
ou tempo sem criar valor é revista ou eliminada. Na prática, ela
enfoca as melhorias a "nível de sistema" (de forma oposta às
"melhorias de pontos").
Devido a seu sucesso no a u m e n t o dos meios de eficiência, a
abordagem magra mostrou-se útil onde quer que haja u m con-
junto definido de atividades f u n c i o n a n d o para produzir u m
p r o d u t o ou serviço. Por exemplo, uma "equipe magra" no Hos-
pital Saint Mary, u m hospital da Clínica Mayo, em Rochester,
Minn., utilizou a produção magra para melhorar a eficiência de
seu sistema de pedidos de papéis para o trabalho laboratorial em
sua unidade de terapia intensiva. 15 C o m o a meta da produção
magra é o a u m e n t o da eficiência e do processo dos Seis Sigma a
melhoria da qualidade, eles têm sido combinados e integrados
n o gerenciamento de várias organizações, incluindo recursos de
assistência à saúde e laboratórios clínicos. 9
ISO 9000
A Organização Internacional para Padronização (ISO), em
Genebra, Suíça (http://www.iso.ch), desenvolveu e promulgou os
padrões I S O 9000. É u m conjunto de quatro padrões (ISO 9001-
9004) aprovados para assegurar a gestão da qualidade e a Q A em
organizações industriais e de serviços. 16 Eles foram primeiramente
publicados em 1987 e são usados em todo o m u n d o , por mais de
80 países.
Os padrões I S O 9000 representam um consenso internacio-
nal sobre os aspectos essenciais de u m QS para assegurar o fun-
cionamento efetivo de qualquer negócio, seja u m fornecedor
F i g u r a 1 6 - 9 Estrutura de u m sistema de medição com base na
exatidão, mostrando as relações entre os métodos e os materiais de
referência.
industrial ou de serviços ou outro tipo de organização, no setor
público ou privado. A certificação I S O é efetuada por organiza-
ções credenciadoras conhecidas como registradoras. As registrado-
ras revisam o manual d e qualidade da organização e auditam o
processo para assegurar que o sistema d o c u m e n t a d o no manual
esteja em ordem e seja efetivo. Muitas companhias maiores de
diagnóstico receberam a certificação ISO 9000, e, em 1996, os
Laboratórios Clínicos da Excel Bestview de Mississauga, Ontário,
Canadá, tornaram-se o primeiro laboratório clínico n o m u n d o a
receber a certificação I S O 9002.
Comissão Mista para Determinabilidade na
Medicina Laboratorial
Muitas organizações têm se envolvido n o desenvolvimento de
uma base de exatidão determinável para materiais analisados de
interesse clínico (Figura 16-9). U m a diretriz nos esforços atuais
para desenvolver tal base é a Diretiva Européia 9 8 / 7 9 / E C em
dispositivos diagnósticos clínicos invitro (www.ce-mark.com/ivd.
pdf), que exige que "A determinabilidade dos valores especifica-
dos para os calibradores e / o u materiais de controle deve ser
assegurada através de procedimentos de referência disponíveis
para a medição e / o u materiais de referência disponíveis de natu-
reza superior.
Em 2002, a JCTLM foi criada para atender à exigência de
uma plataforma em todo o m u n d o para promover e dar direção
na equivalência internacionalmente reconhecida e aceita das
medições na medicina laboratorial e na determinabilidade sob
padrões de medida adequados (www.bipm.org/en/committees/
jc/jctlm/). Os três principais participantes na JCTLM são o
Bureau Internacional d e Pesos e Medidas (BIPM), a Federação
Internacional de Química Clínica e Medicina Laboratorial
(IFCC) e a Cooperação Internacional de Credenciamento de
Laboratórios.
A JCTLM criou dois grupos de trabalho: (1) JCTLM WG-1,
Materiais de Referência e Procedimentos de Referência e (2)
JCTLM WG-II, Redes d e Laboratórios de Referência. Eles são
responsáveis por fornecer suporte prático para as organizações de
diagnóstico in vitro (IVD) de todo o m u n d o n o estabelecimento
da determinabilidade metrológica de valores especificados para
calibradores e / o u mateiiais de controle, tal como requerido pela
futura Diretiva Européia sobre Diagnóstico In vitw e por regula-
mentos comparáveis em outros países.
REFERÊNCIAS
1. Appendix C of state operations manual. Regulations and interpretive
guidelines for labotatoties and laboratory services. (http.//www cms.gov.
cl ia/appendx.asp)
2 Blumenthal D The errors of our ways. Clin Chem 1997:43 1305
http://www.clinchem.org/cgi/content/full/43/8/1305).
3. CAP Standards for accreditacion of medicai laboratories. Skokie, IL:
College of Ameiican Pathologists (www.cap.org).
4 Clinicai and Laboratory Standards Institute. A quality system model for
healrh care, 2nd ed CLSI Document HS01-A2. Wayne, PA: Clinicai
and Laboratory Standards Institute, Z004-
5. Clinicai and Laboratory Standards Institute. Laboratory documents:
Development and contrai, 5th ed CLSI Document GP-02-A5. Wayne,
PA: Clinicai and Laboiarory Standards Inscitute, 2006.
6. Clinicai and Laboratory Standards Institute. Statistical quality control
for quantitacive measurements: Principies and defmitions, 3rd ed. CLSI
Document C24-A3. Wayne, PA: Clinicai and Laboratory Standards
Institute, 2C06.
7. Deming WE. Out of the crisis. Cambridge, Mass: Massachusetts
Institute of Technology Center for Advanced Study, 1987
 Gestão da Qualidade CAPÍTULO 16 269

8. DeWoskin RS. Information resources on quality available on the
Internet. Qual Assur 2003;10.29-65.
9. George ML. Lean síx sigma: Comhining si-v sigma qualitv wtth lean
production. New York: McGraw-Hill, 2002.
10. Harris EK, Boyd JC. Statistical bases of reference values in laboratory
medicine. New York: Mareei Dekker, 1995.
11. Harry M, Schioeder R. Sbc sigma: The breakthrough management
strategy revolucionizing che world's top Corporation. New York:
Currency, 20C0.
12. Juran JM, Endres A. Quality improvement for services. Wilton, Conn,
Juran Institute, 1986.
13. Klee GG. Use of patient test values to enhance the quality control of
PSA assays. Clin Chem 2003;49;A94.
14. Klee GG, Forsman RW. A users dassification of problems identified by
proficiency testing surveys. Arch Pathol Lab Med 1988; 112:371-3.
15. Lusky K Trimming tlie fat from lab processes. CAP Today, May 2006.
16. Rabbitt JT, Bergh PA. The Mmiguide to ISO 9000. New York: Quality
Resources Press, 1995.
17. U S C e n t e r s for M e d t c a r e & M e d i c a i d S e r v i c e s ( C M S ) M e d i c a r e ,
Medicaid, and CLIA programs: laboratory requirements relating co
quality syseems and cettain personnel qualificadons. Final Rule. Fed Reg
Jan 24 2003; 16.3640-714-
18. Westgard JO, Barry PL. Cost-effective quality control: managing the
quality and productivity of analytical processes. Washington, DC,
AACC Press, 1997.
19. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Grotb T. A multi-rule Shewhart chart
for quality control in clinicai chemistry. Clin Chem 1 9 8 1 j 2 7 : 4 9 3 - 5 0 1 .
20. Westgard JO, Ehrmeyer SS, Darcy TP. CLIA final rules for quality
systems: Quality assessment íssues and answers. Madison, WI; Westgard
QC, Inc., 2004.
21. Westgard JO, Fallon KD, Mansouii S Validation of iQM active process
control technology. Point of Care 2003;2:1-7.
ANALITOS P A R T E IV

CAPÍTULO 1 7

Ácidos Nucléicos*
Yuk Ming Dennis Lo, M.A. (Cantab), D.M. (Oxon), D.Phil. (Oxon),
F.R.C.P. (Edin), M.R.C.P. (Lond), F.R.C.Path.,
Rossa W.K. Chiu, M.B.B.S., Ph.D., F.H.K.A.M. (Pathology), F.R.C.P.A.,
Carl T. Wíttwer, M.D., Ph.D., e Noriko Kusukawa, Ph.D.

OBJETIVOS 18. Discutir os marcadores usados para detecção de seqüências de

1. Definir o código genético e descrever o dogma central.
2. Discutir as diferenças entre DNA e RNA, incluindo as estruturas
física e química, função fisiológica e utilidade no teste de
diagnóstico clínico.
3. Comparar e contrastar a composição química das purinas e das
pirimidinas.
4. Descrever a estrutura de um cromossomo eucariótico.
5. Descrever a estrutura física e^a composição química da cromatina e
sua aparência durante os estágios do ciclo celular.
6. Diferenciar centrômeros e telômeros e descrever a função de cada
um deles.
7. Listar os processos envolvidos em replicação do DNA, transcrição e
tradução do mRNA.
8. Descrever a função fisiológica das DNA e RNA polimerases.
9. Descrever a importância da epigenética, particularmente a
metilação do DNA, na função gênica.
10. Comparar e identificar esses tipos de alteração; inserção, deleção,
rearranjo, expansão de repetição.
11. Contrastar repetições curtas em tandem (em seqüência) e número
variável de repetições em tandem, e discutir sua utilidade clínica
em um laboratório de diagnóstico molecular.
12. Caracterizar polimorfismo de um único nucleotídeo e descrever
métodos de detecção de SNP (Polimorfismo de um Único
Nucleotídeo).
13. Comparar e contrastar genomas bacterianos e genomas virais.
14. Definir as funções dessas enzimas na tecnologia de ácidos
nucléicos: endonuclease de restrição, ligase, polimerases e
transcriptase reversa.
15. Desenhar a reação em cadeia da polimerase.
16. Descrever amplicon e discutir como a contaminação por ampliccns
é controlada em um laboratório de diagnóstico molecular.
17. Comparar e contrastar técnicas de amplificação de sinal e técnicas
de amplificação de alvo.
*Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições prévias de Elizabeth
R. Unger, Ph.D., M.D. e Margaret A. Piper, Ph.D., M.P.H., nas quais se baseiam
partes deste capitulo.
ácidos nucléicos após a hibritiização.
19. Descrever c princípio da eletroforese de ácido nucléico; descrever a
função e a metodologia da eletroforese na discriminação de ácidos
nucléicos.
20. Descrever o uso de RFLPs (Polimorfismo de Comprimento de
Fragmentos de Restrição) na avaliação do DNA isolado.
21. Comparar e contrastar as utilizações e os aspectos técnicos das
técnicas de Northern blotting e Southern blottirig.
22. Descrever o princípio dos ensaios de hibridização.
23. Descrever o princípio da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) em
tempo real; discutir a diferença entre PCR em tempo real e PCR.
24. Discutir como são realizadas as detecções de sondas e produtos na
PCR em tempo real.
25. Discutir a utilidade clínica da análise da curva de desnaturação em
um laboratório de diagnóstico molecular.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A c i d o N u c l é i c o : U m p o l í m e r o feito d e m o n ô m e r o s de
n u c l e o t i d e o s ( u m a parte d e açúcar, u m ácido fosfórico e
u m a base p u r í n i c a ou pirimidínica); são exemplos o ácido
desoxirribonucléico ( D N A ) e o ácido r i b o n u c l é i c o (RNA).
A l e l o : U m a cópia d e u m gene; alelos p o d e m c o n t e r variações
na s e q ü ê n c i a ( m u d a n ç a s n a s e q ü ê n c i a de pares de bases)
q u e a l t e r a m sua expressão o u as características f u n c i o n a i s
da p r o t e í n a c o r r e s p o n d e n t e .
A l t e r a ç ã o : U m a variação ou m u d a n ç a n a s e q ü ê n c i a d o D N A .
Ela p o d e ser b e n i g n a ou causar d o e n ç a .
A m p l i c o n : O p r o d u t o de u m a reação d e amplificaçao, tais
c o m o reação e m cadeia da p o l i m e r a s e (PCR).
A m p l i f i c a ç ã o d e Sinal: U m m é t o d o q u e a u m e n t a o sinal
resultante de u m a i n t e r a ç ã o m o l e c u l a r q u e n ã o envolva
amplificação d o DNA-alvo.
A m p l i f i c a ç ã o d o Alvo: Q u a l q u e r m é t o d o para a u m e n t a r a
q u a n t i d a d e d o ácido nucléico-alvo, ou seja, o ácido nucléico
de interesse.
A r r a n j o (Microarranjo, Chip de D N A , Chip de Genes):
Lâminas d e vidro ou plástico, ou esferas, nas quais as
s o n d a s d e D N A f o r a m ligadas c o m o p r o p ó s i t o de se
e s t u d a r D N A ou R N A e m u m a amostra.
A u t o s s o m o : U m c r o m o s s o m o não-sexual; existem 22 pares de
autossomos no genoma h u m a n o .
272 PARTE IV Analitos
Base (do D N A ou R N A ) : As purinas e pirimidinas em u m a
molécula de ácido nucléico.
C e n t r õ m e r o : U m a constrição p i i m á n a em u m cromossomo; os
cenctômeTos desempenham uma função importante no
controle do movimento dos cromossomos entre células-
filhas durante a divisão celular.
Código Genético: A lista completa de códons de três
nucleotídeos (tripíei) e os aminoácidos ou ações que eles
"codificam"
C ó d o n : U m a seqüência de três nucleotídeos que "codifica" u m
aminoácido durante a tradução ou codifica o fim de uma
cadeia peptídica ("códon de parada" — "stop codon"); existem
64 códons possíveis de três nucleotídeos no D N A nuclear.
C r o m a t i n a : D N A nuclear e suas proteínas estruturais
associadas; a cromatina é arranjada e organizada em u m
padrão hierárquico n o qual o grau de sua condensação
aumenta com os níveis mais altos de organização estrutural.
C r o m o s s o m o : U m a estrutura altamente ordenada de u m a
única molécula de D N A dupla-fita, compactada muitas
vezes com a ajuda de proteínas.
Deleção! U m a seqüência de D N A que é perdida em uma
amostra em comparação a uma outra. As deleções p o d e m
ser tão pequenas que p o d e m conter apenas u m
nucleotídeo.
D N A (Ácido Desoxirribonucléico): U m a substância biológica
que carrega informação genética e é u m polímero de
nucleotídeos dupla-fita.
D N A Mitocondrial: O D N A circular dentro da organela
mitocondrial que codifica polipeptídios envolvidos na via
de fosforilação oxidativa; esse D N A é particularmente
transmitido através de gerações por herança materna.
d N T P s : Desoxiriibonucleotídeo5 trifosfatos (geralmente dATP,
dCTP, d G T P e dTTP), os blocos de construção do D N A .
Eletroforese: Separação de moléculas por seus movimentos
causados por u m campo elétrico, freqüentemente através de
uma matriz de gel. Poliacrilamida e agarose são matrizes
c o m u m e n t e usadas para separar D N A e R N A sujeitos a u m
campo elétrico.
Endonuclease: Uma enzima que hidrolisa u m a ligação
fosfodiéster interna, corcando u m ácido nucléico em duas
ou mais partes.
Endonucleases de Restrição: As endonucleases, geralmente de
bactérias, cortarão, cada uma delas, somente seqüências
específicas de ácido nucléico.
Epigenética: Processos que alteram a f u n ç ã o gênica por outros
mecanismos além daqueles que dependem de mudança da
seqüência de DNA; esses processos incluem metilação de
D N A j imprintmg genômico, modificação de histona e
remodelagem de cromatina.
E u c r o m a t i n a : Regiões genômicas que são ricas em genes; são
coradas com menos intensidade e organizadas de forma
menos compacta (durante a intérfase) do que a
hetero cromatina.
Exon: A região codificadora de u m gene que pode ser expressa
como proteina logo após a tradução.
Exonuclease-. U m a atividade enzimática que remove
nucleotídeos terminais de u m polinucleotídeo.
Eenótipo: Características observáveis de u m organismo,
determinadas pela interação de genes e ambiente; a função
expressa ou o p r o d u t o biológico de u m gene.
Fluorescência: Emissão de luz de u m comprimento de onda
mais longo depois de excitação com luz.
G e n e : U m a unidade básica da hereditariedade; uma unidade
de D N A que determina a produção de u m RNA.
G e n o m a : O c o n j u n t o completo de cromossomos; o n ú m e r o
total de informação hereditária; o genoma h u m a n o contém
duas cópias, d e n o m i n a d a s alelos, de cada u m dos genes
autossômicos.
G e n ó t i p o : A constituição genética de u m indivíduo, incluindo
seqüências de DNA. que p o d e m não afetar a aparência
exterior (fenótípo); o "genótipo" freqüentemente é usado
para se referir ao par específico de alelos que u m indivíduo
possui em uma certa localização do genoma.
H a p l ó t i p o : A associação de alelos específicos em múltiplas
localizações (íori) em u m a fita do cromossomo.
H e t e r o c r o m a t í n a : Regiões genômicas que são pobres eni genes
ou cobertas por genes transcncionalmente silenciosos,
sendo mais densamente empacotadas durante a intérfase do
que a eucromatina.
Hibridização: A ligação (anelamento ou pareamento) de duas
fitas (complementares) de D N A por pareamento de bases.
Histona: Uma proteína estrutural envolvida na organização
tridimensional dos cromossomos e na regulação da função
do D N A nuclear.
Inserção: U m a seqüência extra de D N A que está presente em
uma amostra em comparação com uma seqüência de
referência.
I n t e r gênica: Seqüência de D N A entre genes.
I n t r o n : A região não-codificadora de u m gene que não será
traduzida em proteína.
Ligase: U m a enzima q u e liga, covalente mente, duas fitas de
DNA.
Marcador: U m a molécula que está associada a u m analito e
que o torna mais fácil de ser observado.
Metilação de D N A : A adição de u m grupo metil à posição
correspondente ao quinto carbono dos resíduos de citosina
nos dinucleotídeos C p G ; esse processo epigenético está
envolvido em crescimento e desenvolvimento de organismos.
Métodos de Amplificação: Técnicas para amplificar a
quantidade do alvo, do sinal ou da sonda, de forma que as
alterações de seqüência possam ser prontamente
observadas.
Métodos de Detecção: Técnicas para identificar seqüências de
ácido nucléico, geralmente após purificação e amplificação.
Minisseqüenciamento: Uma técnica para identificar a
seqüência de bases próxima a u m oligonucleotídeo
iniciador (frimer); também chamada extensão de base única
do primer ou extensão de u m único nucleotídeo (SNE).
Missense (de Sentido Trocado): U m a substituição de
nucleotídeo que codifica u m aminoácido diferente. Essas
alterações de seqüência são c o m u m e n t e denominadas
"mutações" missense (de sentido trocado), mas elas p o d e m
ser benignas e não causar qualquer doença.
Mutação: U m a alteração de seqüência ou, em alguns
contextos, uma alteração de seqüência que causa doença.
Nonserwe, M u t a ç ã o Nonse7ise (Mutação sem Sentido): U m a
alteração de seqüência que converte um códon que
determina u m aminoácido em u m códon de parada
("sto£"), t e r m i n a n d o prematuramente a proteína.
N o r t h e r n Bloí: U m m é t o d o para detectar seqüências
específicas de R N A com sondas marcadas após elas terem
sido separadas por eletroforese.
Nuclease: U m a enzima que degrada o ácido nucléico.
Nucleossomo: U m a u n i d a d e de cromatina que consiste em
partículas centrais de nucleossomo (146 pares de bases do
D N A dupla-fita) e u m D N A de ligação (íinícer) enrolado ao
redor de u m c o n j u n t o de oito (octàmero) proteínas
histonas.

Nucleotídeo: U m a unidade monomérica que consiste em uma
parte de açúcar, u m ácido fosfórico e uma base purínica ou
pirimidínica; a ligação dos m o n ô m e r o s de nucleotideos
forma os polímeros de D N A e R N A .
Oligonucleotídeo: U m pequeno polímero de ácido nucléico de
fita simples.
Par de Bases: U m nucleotideo de purina e u m de pirimidina
ligados por pontes de hidrogênio; n o pareamento de bases
do D N A , a adenina se liga à timina e a guanina parei a com
citosina; no pareamento de bases do RNA, a adenina se
liga à uracila em lugar da timina.
P C R e m T e m p o Real (Real-time P C R ) : Métodos para
observar o progresso da produção de ácido nucléico
(amplificação) pelo menos uma vez a cada ciclo.
P i r i m i d i n a : Uma base c o n t e n d o u m anel de carbono e
nitrogênio; citosina, timina e uracila são pirimidinas.
Polimerases: Enzimas envolvidas na replicação e transcticão do
DNA.
P o l i m o r f i s m o de C o m p r i m e n t o de Fragmentos de Restrição
(RFLP): Uma alteração na seqüência do D N A que m u d a o
t a m a n h o dos fragmentos de D N A produzidos por digestão
do D N A com endonuclease de restrição.
P o l i m o r f i s m o de u m Ú n i c o Nucleotídeo (SNP): U m a variante
de u m único nucleotídeo (isto é, com uma base alterada) de
uma molécula de D N A que ocorre na população com uma
freqüência de pelo menos 1%.
Primer (Iniciador): U m oligonucleotídeo que serve para iniciar
a adição de dNTPs, catalisada por enzima, por ligação
(anelamento ou pareamento) a uma parte do ácido nucléico
que está sendo copiado (amplificado).
P r o m o t o r : U m a região reguladora do DNA; os promotores
estão envolvidos no controle da taxa e do m o m e n t o da
transcrição.
P s e u d o g e n e : U m elemento genético que não resulta em u m
produto gênico funcional (tal como u m R N A ou u m a
proteína).
P u r i n a : Uma base contendo dois anéis de carbono e
nitrogênio; adenina e guanina são purinas.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR): U m método m vitvo
de amplificação exponencial do D N A .
Replicação: A reprodução d o D N A das células-mães para as
células-filhas durante a divisão celular, copia das seqüências
de DNA.
R N A (Acido Ribonucléico): U m a substância biológica similar
ao D N A exceto por ser, principalmente, de fita simples,
concer ribose como a parte de açúcar, ter u m grupo
hidroxila extra e conter uracila em lugar de timina; existem
diferentes tipos funcionais de RNA, incluindo R N A
mensageiro (mRNA), R N A ribossômico (rRNA) e RNA de
transferência (tRNA).
Seqüência: A ordem dos pares de bases ou das bases em uma
molécula de D N A ou RNA; uma porção de u m a molécula
de D N A com uma seqüência específica.
Seqüenciamento: Qualquer método para determinar a
identidade e a ordem exata das bases em uma molécula de
D N A ou uma porção dela.
Sonda: U m ácido nucléico usado para identificar u m alvo por
hibridização.
Southern Blot: U m m é t o d o para detectar variantes da
seqüência de D N A que envolve digestão do D N A , com
uma ou mais enzimas de restrição, e separação dos
fragmentos de D N A resultantes por eletroforese. Após
separação, o D N A é transferido (por "bioíting" -
transferência por absorção) do gel de eletroforese para u m
Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 273
suporte sólido (tal como papel) e os fragmentos de interesse
são identificados por hibridização com uma sonda marcada.
Southern Mots detectam variantes de seqüência que
produzem uma alteração na distância entre sítios de
restrição e, portanto, produzem uma alteração dos
tamanhos dos fragmentos. Southmi Mots p o d e m detectar
alterações pequenas no D N A , alterações estas que afetam
os sítios que as enzimas de restrição cortam, p o d e n d o
também detectar inserções e deleções grandes e alguns
rearranjos de seqüências de D N A .
T e l ô m e r o : A seqüência de D N A na extremidade de um
cromossomo; os telômeTos c o n t é m seqüências de
nucleotídeo repetitivas que protegem as extremidades
dos c r o m o s s o m o s da r e c o m b i n a ç ã o com outros
cromossomos.
T r a d u ç ã o : O processo através do qual uma seqüência do
R N A mensageiro (mRNA) direciona a formação de u m
peptídio com a seqüência de aminoácidos desejada; a
tradução t a m b é m envolve os R N As de transferência
(tRNAs), que reconhecem os códons tnplet no m R N A e
carregam o aminoácido correspondente; a tradução ocorre
nos ribossomos e necessita de enzimas e outros fatores.
Transcrição: Processo de transferência de informação da
seqüência de regiões génicas do D N A para u m a mensagem
de RNA; fazer u m a "cópia" de R N A do D N A .
Transcriptase Reversa: U m a polimerase que catalisa a síntese
de D N A a partir de u m molde de RNA; a enzima que faz
uma "cópia" de D N A do RNA; contrasta com a transcrição.
O
diagnóstico molecular representa uma das áreas que se
desenvolvem mais rapidamente em medicina laborato-
rial. Os avanços nesse campo têm sido possiveis por causa
d e nosso melhor entendimento de biologia molecular e genética
e de suas relações com as doenças humanas, e do desenvolvimento
d e tecnologias poderosas de análise de ácidos nucléicos.
ESSENCIAL
Genes são as unidades básicas de herança correspondentes a
segmentos definidos de D N A (ácido desoxirribonucléico) que
codificam produtos proteicos ou de R N A (ácido ribonucléico)
com funções biológicas. O D N A é uma substância biológica que
carrega informação genética e é u m polímero de nucleotideos ou
bases. A informação genética é reproduzida de células-mães para
células-filhas durante a divisão celular pelo processo de replicação
de D N A . Q u a n d o os genes são expressos ("Íigíidos"), a seqüência
de D N A é transcrita em RNA. As moléculas de R N A são polí-
meros de ribonucleotídeos e existem em muitas formas funcio-
nais, tais como R N A ribossômico (rRNA), R N A de transferência
(tRNA) e R N A mensageiro (mRNA). O mRNA é o produto de
u m a seqüência nucleotídica transcrita e, em seguida, traduzida
em uma proteína, que é u m polímero de aminoácidos. Cada
aminoácido é codificado por um código de trinca de nucleoti-
deos, d e n o m i n a d o códon. O código genético h u m a n o inclui 64
códons, que codificam os 21 aminoácidos e três códons de
parada. Os códons do m R N A são lidos pelas regiões de anticó-
d o n das moléculas de tRNA, que são pequenos R N As que trazem
o aminoácido correspondente para a cadeia polipeptídica cres-
cente. A cadeia polipeptídica é sintetizada por ribossomos, que
são complexos rnacromoleculares contendo TRNA. Recentemente,
outras moléculas dc R N A que n ã o codificam u m produto pro-
teico têm sido identificadas. Esses RNAs, chamados RNAs não-
codificadores, têm funções biológicas especializadas. U m exemplo
274 PARTE IV Analitos

de R N A não-codificador é o microRNA. Tem sido mostrado que
alguns microRNAs inibem a produção de proteínas especificas.
A maioria das células h u m a n a s contém dois conjuntos com-
pletos do g e n o m a h u m a n o , que é organizado e empacotado em
23 pares de cromossomos U m c r o m o s s o m o é uma estrutura
altamente ordenada de uma única molécula de D N A com carac-
terísticas estruturais especializadas, especificamente u m centrõ-
m e r o e dois telômeros. Cada individuo herda u m c o n j u n t o do
genoma h u m a n o de seu pai e u m c o n j u n t o de sua mãe. Portanto,
o genoma h u m a n o contém duas cópias, denominadas alelos, de
cada gene autossômico. Embora uma seqüência gênica codifique
u m a proteína específica com funções definidas, os alelos dos
genes podem apresentar variações de seqüência que, por sua vez,
determinam as variações das características funcionais da proteína
entre os indivíduos. As seqüências nucleotídicas primárias dos
dois alelos do gene formam o genótipo, enquanto a função
expressa ou o efeito biológico do produto gênico é d e n o m i n a d o
fenótípo. Assim, pode-se estudar u m a doença h u m a n a ou u m
traço no nível genético por meio da determinação da seqüência
aléhca de u m gene (isto é, genotipagem), ou no nível de proteína,
através das avaliações da f u n ç ã o protéica (isto é, fenotipagem).
Exemplos de fenotipagem incluem a investigação de concentra-
ções ou atividades de enzima, grupos sangüíneos A B O e mobili-
dade eletrofotética de variantes da hemoglobina. A escolha da
genotipagem ou fenotipagem para fazer u m diagnóstico depende
da aplicação diagnostica específica,
ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO DOS ÁCIDOS
NUCLÉICOS
Existe uma relação íntima entre estrutura e função do ácido
nucléico. A função fisiológica do ácido nucléico é facilitada por
sua estrutura "estrategicamente projetada".
C o m p o s i ç õ e s Moleculares e Estruturas de
DNA e RNA
U m a única molécula de D N A é u m polímero que consiste em
um suporte de composição constante e grupos laterais arranjados
em uma seqüência variável (Figuras 17-1 e 17-2). O polímero é
sintetizado a partir de m o n ô m e r o s de nucleotídeos compostos pelo
açúcar desoxirribose, p o t u m resíduo fosfato e por uma base
purínica ou pirimidínica (Figura 17-1). As p u r i n a s são adenina
(A) e guanina (C) e contêm dois anéis de carbono e nitrogênio
(Figura 17-1). As p i r i m i d i n a s são citosina (C) e timina (T) e
contêm u m anel de carbono e nitrogênio (Figura 17-1). Os quatro
nucleotídeos que são os blocos de construção do D N A são abre-
viados dATP (desoxiadenosina-trifosfato), d G T P (desoxiguano-
sina-trifosfato), d C T P (desoxicitidina-trifosfato e d T T P (desoxiti-
mídina-trifosfato), respectivamente. Os nucleotídeos são unidos
por ligações fosfodiéster que ligam o grupo 5'-fosfato de um ao
grupo 3'-hidroxíla do próximo (Figura 17-1). Não existem ligações
3'-3' ou 5 -5'; assim, as partes de açúcar e fosfato compõem as
porções não-específicas da molécula (Figura 17-2). A seqüência
das bases varia de molécula para molécula e identifica de forma
única cada u m dos polímeros de D N A , que, como discutido
posteriormente, determina a identidade e a função do produtos
proteicos ou de R N A que o D N A codifica.
Embora as purinas e as pirimidinas sejam de composições e
tamanhos diferentes, q u a n d o em orientação apropriada, a
adenina forma pontes de hidrogênio com a timina, e a guanma
forma pontes de hidrogênio com a citosina a fim de criar estru-
turas planas ("planares") de dimensões similares (Figura 17-2). As
pontes de hidrogênio entTe as duas bases levam à formação de
u m par de bases. Isso, j u n t o ao fato de que a porção das bases
de cada nucleotídeo é hidrofóbica, contribui para a estrutura
secundária energeticamente favorável do D N A : u m a dupla-hélice,
voltada para a direita, a estrutura de "Watson e Crick" (Figura
17-2). Os pares de bases planares se empilham no interior da
hélice, 10 bases por volta, e n q u a n t o o suporte de açúcar-fosfato
hidrofílico forma ligações não-covalentes com moléculas de água
ao seu redor. Para que os dois polímeros de D N A formem pontes
de hidrogênio adequadas entre as bases, dois requerimentos
devem ser preenchidos: os polimeros devem estar em direções
opostas (antiparalelos), c o m o definido pelos grupos hidroxila
livres em cada extremidade (3'-5' w 5'-3'), e as seqüências de cada
molécula devem ser de tal forma que pontes de hidrogênio A:T
e G : C sejam sempre formadas pelo processo de pareamento de
bases. As duas fitas de D N A que atendem a esses requerimentos
são chamadas complementares. Devido ao pareamento de bases e
à conformação dupla-hélice, o D N A dupla-fita (dsDNA) é u m a
molécula excepcionalmente estável.
O RNA é quimicamente muito similar ao D N A , mas difere
em aspectos importantes, A u n i d a d e de açúcar é a ribose com
u m grupo hidroxila adicionado à posição 2', e a pirimidina meti-
lada uracila (U) (Figura 17-1) substitui a timina. O R N A existe

PIRIMIDINAS PURINAS
li V ©
o * V)
H3C O—H- N Base
m
*\'H 11
H- •// \'-H" k '' - "N Figura 17-1 A , Bases purínicas e pirimidinicas e a
Vl—/ \—N Cjdci formação de pares de bases complementares. As linhas
e ,o o II
Cadeia Desoxirribose tracejadas i n d i c a m a formação de pontes de hidrogênio.
O* \ > XrLbose**) (*No R N A , a timina é substituída p o r uracila, que difere
Timina (uracila*) Adenina
• > H AK/E Base da t i m m a s o m e n t e pela ausência do grupo metil.) B,

H xr nx
H \ f
B U m a cadeia de D N A fica simples As unidades de
nucleotídeo repetitivas estão unidas por ligações
N-—H—-0 M fosfodiéster que ligam o carbono 5' de u m açúcar ao
/ W * carbono 3' d o próximo. Cada m o n ô m e r o de nucleotídeo
II-- N-—H—.xj\
/ \\Y- o* \> consiste em u m a parte de açúcar, u m resíduo fosfato e
/= '/ n
Cadeia
N -1 ' 1
1 O. H 'Base u m a base. (**No R N A , o açúcar é ribose, que tem u m
/ A
0- — H - N Ligação g r u p a m e n t o 2'-hidroxil adicionado à desoxirribose.)
Cadeia
H fosfodiéster (Modificado de Piper MA, U n g e r ER. Nucleic acid
prubes: a primer for pathologists. Chicago, A S C P Press,
Citosina Guanina HO H
198^.1
 Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 275

5' em várias formas funcionais, mas geralmente como um polímero

de fita simples, que é muito m e n o r do que o D N A e tem uma
estrutura tridimensional irregular. Pesquisas recentes têm reve-
lado q u e as conformações do R N A não são estruturas aleatórias
e que o mecanismo de d o b r a m e n t o das moléculas de R N A é
complexo. 2 O dobramento produz u m a estrutura secundária que
p o d e ser descrita em u m desenho bidimensional. A estrutura
Suporte açúcar secundária adotada por uma molécula de R N A é, em u m nível
' -fosfato mais elevado, relacionada com sua seqüência de nucleotideos. A
estrutura secundária de seqüências de R N A específicas pode ser
cão reprodutível quanto a estrutura secundária de uma proteína.
Sabe-se, agora, que moléculas de R N A podem, ainda, interagir
para formar estruturas terciárias complexas (tridimensionais,
como uma escultura). A formação dessas estruturas envolve
outras interações químicas dentro da molécula de R N A e é inti-
m a m e n t e relacionada com novas funções do RNA, tais c o m o a
atividade catalítica das ribozimas. 2

Estrutura do C r o m o s s o m o
As moléculas de D N A são extremamente longas e, na célula
eucariótica, são mantidas em estruturas tridimensionais ordena-
das e compactas. Cada célula h u m a n a diplóide (isto é, células
com dois conjuntos de cromossomos) contém dois conjuntos
completos do genoma h u m a n o , com cada cópia consistindo em,
aproximadamente, 3,2 bilhões de pares de bases. Essa quantidade
e n o r m e de material genético é organizada em 23 pares de cro-
mossomos, com u m m e m b r o de cada par sendo de origem
materna e o outro de origem paterna. Os dois cromossomos de
cada par são similares (homólogos) e, exceto para os cromosso-
mos sexuais (X e Y), contêm os mesmos genes arranjados na
mesma seqüência. Cada cromossomo é uma estrutura altamente
ordenada de uma única molécula de dsDNA, compactada, muitas
vezes, com a ajuda de proteínas que se ligam ao D N A (Figura
17-3). Os cromossomos estão em seu estado mais compacto e
aparecem como estruturas similares a u m dedo durante a divisão
celular (especificamente n o estágio chamado metáfase). A cons-
trição primária, o centrômero, t a m b é m é observada em cada
cromossomo (Figura 17-3). As extremidades dos cromossomos
são d e n o m i n a d a s telômeros (Figura 17-3). Tanto centromeros
q u a n t o Lelômeros têm funções especializadas que serão discutidas
posteriormente. Os cromossomos não-sexuais, os autossomos, do
genoma h u m a n o são numerados na ordem de t a m a n h o decres-
cente. O arranjo cromossômico d o D N A h u m a n o não apenas
permite o empacotamento do e n o r m e genoma h u m a n o nas
dimensões físicas limitadas do núcleo celular, conforme aborda-
gem posterior, como t a m b é m essa organização estrutural está
i n t i m a m e n t e relacionada com o controle da transcrição, da repli-
cação, da recombinação e do reparo do DNA. 5
O D N A nuclear, juntamente com suas proteínas estruturais
associadas, incluindo proteínas histonas e não-histonas, é conhe-
cido c o m o cromatina. Esta é arranjada e organizada em u m
c; > Timina padrão hierárquico no qual o grau de condensação aumenta com
Guanina níveis maiores de organização estrutural. As unidades básicas da
cromatma são os nucleossomos Estes são feitos de D N A nuclear
- E Ciiosina
empacotado ao redor de proteínas. Eles estão presentes ao longo
de todo o comprimento de cada cromossomo (Figura 17-3).^ C a d a
u n i d a d e de nucleossomo consiste em uma partícula central de
Figura 1 7 - 2 DNA dupla-hélice, com o suporte açúcar-fosfato e o
nucleossomo e 20 a 80 pares de bases de D N A de ligação, que
pareamento das bases na parte central f o r m a n d o estruturas planares.
estão presentes entre nucleossomos adjacentes. A partícula central
(De Jorde CB, Carey JC, Bamskead MJ et al, eds. Medicai genetks, 3id
do nucleossomo envolve 146 pares de bases de d s D N A fortemente
ed. St Louis. Mosby, 2006.)
enrolados ao redor de u m conjunto de oito proteínas histonas
(um octâmero), duas de cada u m a de quatro proteínas histonas,
denominadas H 2 A , H2B, H 3 e H4. Os segmentos de D N A de
ligação estão associados à histona de ligação H l . Os nucleossomos
276 PARTE IV Analitos

DNA dupla-hélice

Nucleossomos

Crom atina

Uma volta d e
Telômeros cromatina c o n t é m
aproximadamente
100.000 bp
d e DNA

Certrâmero'

Cromátide

F i g u r a 1 7 - 3 Organização estrutural do D N A cromossômico humano. O D N A dupla-fita é enrolado ao redor

de histonas para formar os nucleossomos. O D N A nuclear, juntamente com suas proteínas estruturais associadas,
é chamado de cromatina. A cromatina, em seu estado mais compacto, forma os cromossomos. A constrição
primária de um cromossomo è a centrômero, e as extremidades do cromossomo são os telômeros. (De Jorde CB,
Carey JC, Bamshead MJ et al, eds. Medicai genetics, 3rd. ed. St. Louis: Mosby, 2006.)

são, em seguida, e m p a c o t a d o s e m níveis sucessivos d e complexi-
d a d e e, ao final, p o d e m ser visualizados c o m o c r o m o s s o m o s dis-
cretos d u r a n t e a divisão celular (Figura 17-3). A i n t e g r i d a d e d a
estrutura d o n u c l e o s s o m o é i m p o r t a n t e para a m a n u t e n ç ã o dos
a r r a n j o s de mais alto grau d a c r o m a t i n a .
A c o n d e n s a ç ã o d a c r o m a t i n a é u m processo d i n â m i c o q u e
m u d a d e f o r m a c o o r d e n a d a e m associação ao ciclo celular (isto
é, d u r a n t e u m a série o r d e n a d a d e m u d a n ç a s q u e levam ao cres-
c i m e n t o celular e à divisão de células para p r o d u z i r d u a s células-
filhas). E m geral, a c r o m a t i n a é m u i t o m e n o s c o n d e n s a d a d u r a n t e
a i n t é r f a s e d o ciclo celular, p e r í o d o n o q u a l o D N A é replicado.
N o e n t a n t o , o grau de c o n d e n s a ç ã o da c r o m a t i n a d u r a n t e a
intérfase varia e n t r e regiões d o g e n o m a . A s regiões g e n ô m i c a s
q u e são ricas e m genes são, e m geral, organizadas d e f o r m a m e n o s
c o m p a c t a e são d e n o m i n a d a s e u c r o m a t i n a . As regiões q u e são
p o b r e s e m genes o u q u e se e s t e n d e m s o b r e genes transcricional-
m e n t e silenciosos (isto é, g e n e s q u e n ã o estão s e n d o transcritos)
são e m p a c o t a d a s d e f o m i a m a i s d e n s a e são c h a m a d a s h e t e r o c r o -
m a t i n a . N o s s o e n t e n d i m e n t o a respeito d a f u n ç ã o biológica d a
h e t e r o c r o m a t í n a e d o s m e c a n i s m o s q u e g o v e r n a m sua f o r m a ç ã o
e m o n t a g e m t e m m e l h o r a d o n o s ú l t i m o s anos. A heterocToma-
t i n a é i m p o r t a n t e para a m a n u t e n ç ã o das e s t r u t u r a s especializa-
das d e c r o m a t i n a , a i n a t i v a ç ã o d o c r o m o s s o m o X nas fêmeas, a
m a n u t e n ç ã o d a e s t a b i l i d a d e d o g e n o m a poT estabilização das
s e q u ê n c i a s repetitivas d e D N A , e a regulação d a expressão gênica. 3
O s c r o m o s s o m o s e u c a r i ó t i c o s c o n t ê m duas regiões especializadas
d e h e t e r o c r o r n a t i n a , e m p a r t i c u l a r o centrômero, localizado
p r ó x i m o ao m e i o d e cada c r o m o s s o m o , e os íêIotii£tos, localizados
n a s e x t r e m i d a d e s . O p r i m e i r o d e s e m p e n h a u m a f u n ç ã o impor-
t a n t e d i r e c i o n a n d o o m o v i m e n t o dos c r o m o s s o m o s e n t r e as
células-filhas d u r a n t e a divisão celular, e n q u a n t o os ú l t i m o s
c o n t ê m s e q ü ê n c i a s n u c l e o t í d i c a s repetitivas q u e p r o t e g e m as
e x t r e m i d a d e s d o s c r o m o s s o m o s de r e c o m b i n a ç ã o c o m o u t r o s
c r o m o s s o m o s . O n ú m e r o d e repetições t e l o m é r i c a s e m células
somáticas d i m i n u i c o m a i d a d e , m a s é m a n t i d o n a s células ger-
m i n a t i v a s e nas células t u m o r a i s pela e n z i m a telomerase. C o n s i -
dera-se, n o s ú l t i m o s anos, q u e t e l ô m e r o s e telomerase desempe-
n h a m f u n ç õ e s i m p o r t a n t e s n a patologia de d o e n ç a s h u m a n a s . '
A l é m d o s blocos c e n t r o m é r i c o s ou teloméricos g r a n d e s da hete-
r o c r o r n a t i n a , d o m í n i o s m e n o r e s da h e t e r o c r o r n a t i n a estão disper-
sos ao l o n g o d o g e n o m a e e s t ã o associados ao c o n t r o l e da expres-
são gênica. A m o n t a g e m d a h e t e r o c r o r n a t i n a se inicia n o nível
mais básico d a organização d e c r o m a t i n a , os n u c l e o s s o m o s , e
envolve metilação d o D N A , m o d i f i c a ç õ e s de h i s t o n a , R N A s não-
c o d i f i c a d o r e s e p r o t e í n a s d e ligação seqúência-específica ao
D N A . ' As implicações f u n c i o n a i s d a organização e s t r u t u r a l d a
c r o m a t i n a t a m b é m serão d i s c u t i d a s p o s t e r i o r m e n t e .
Genoma Mitocondrial
O g e n o m a m i t o c o n d r i a l é o u t r o c o m p o n e n t e genét i co impor-
t a n t e das células eucarióticas. O g e n o m a m i t o c o n d r i a l h u m a n o
é u m p e d a ç o de D N A circular e t e m 16.500 bases (16,5 kb) d e
c o m p r i m e n t o . O D N A m i t o c o n d r i a l é t r a n s m i t i d o e n t r e gera-
ções p o r h e r a n ç a m a t e r n a , c o m a m i t o c ô n d r i a v i n d o d o s ovóci-
tos, e n ã o (geralmente) d o s e s p e r m a t o z ó i d e s . M ú l t i p l a s cópias d o
D N A m i t o c o n d r i a l estão p r e s e n t e s d e n t r o d e cada m i t o c ô n d r i a
e cada u m a das células c o n t é m u m n ú m e r o variável d e m i t o c ô n -
d n a s , d e p e n d e n d o d o r e q u e r i m e n t o energético do tipo específico
d e célula. P o r t a n t o , certos t i p o s celulares p o d e m c o n t e r até vários
m i l h a r e s d e cópias de D N A m i t o c o n d r i a l . Essa m a i o r a b u n d â n -
cia, c o m p a r a d a ao d o D N A nuclear, t o r n a o D N A m i t o c o n d r i a l
a t r a e n t e para certas aplicações d e teste n a s quais a a m o s t r a de
D N A é l i m i t a d a (isto é, investigações de cenas d e crimes, detecção
d e p a t ó g e n o e paleontologia). O D N A m i t o c o n d r i a l é dupla-fita
Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 277
n a m a i o r p a r t e d e seu c o m p r i m e n t o , exceto n a região de c o n t r o l e
d e replicação e transcrição (a alça D). D i f e r e n t e m e n t e d o g e n o m a
nuclear, o g e n o m a m i t o c o n d r i a l n ã o é e m p a c o t a d o nas u n i d a d e s
n u c l e o s s o m a i s . E m vez disso, ele tem u m a organização e s t r u t u r a l
única, q u e os p e s q u i s a d o r e s a p e n a s c o m e ç a r a m a desvendar. Ele
codifica 13 p o l i p e p t í d i o s , t o d o s envolvidos n a via da fosforilação
oxidativa, dois r R N A s e todos os 22 t R N A s necessárias para a
síntese m i t o c o n d r i a l d e proteínas. Várias o u t r a s p r o t e í n a s
t a m b é m são necessárias para a f u n ç ã o m i t o c o n d r i a l n o r m a l e são
codificadas p o r genes nucleares.
FISIOLOGIA E REGULAÇÃO FUNCIONAL DO
ÁCIDO NUCLÉICO
O s ácidos nucléicos c o n s t i t u e m o d e p ó s i t o d e i n f o r m a ç ã o here-
ditária e f o r n e c e m os m e i o s d e traduzir essa i n f o r m a ç ã o n a
m a q u i n a r i a celular d a vida. Expressão gênica se refere ao processo
de transformar o projeto genético em produtos funcionais que
p a r t i c i p a m de vários processos biológicos d e u m a célula. O pro-
cesso de expressão gênica é g o v e r n a d o pelo d o g m a central. O
dogma central d e t e r m i n a q u e a i n f o r m a ç ã o biológica seja transfe-
r i d a d o D N A p a r a o R N A e p a r a a p r o t e í n a (Figura 17-4). A
r e p r o d u ç ã o d o c o n t e ú d o d e D N A das células-mães para as células-
filhas d u r a n t e a divisão celulaT é d e n o m i n a d a r e p l i c a ç ã o . U m
g e n e é expresso através d a t r a n s c r i ç ã o d e sua s e q ü ê n c i a d e D N A
e m R N A . U m p o l i p e p t í d i o é, e n t ã o , sintetizado através da t r a d u -
ç ã o d a s e q ü ê n c i a d e bases d o R N A n a s e q ü ê n c i a c o r r e s p o n d e n t e
de aminoácidos.
Replicação
C a d a vez q u e u m a célula se divide, o c o n t e ú d o de t o d o o D N A
dessa célula deve ser f i e l m e n t e d u p l i c a d o , d e f o r m a q u e o con-
j u n t o total de i n f o r m a ç ã o h e r e d i t á r i a (o genoma humano) seja
m a n t i d o e m cada célula-filha. Esse processo é c h a m a d o replicação.
E m v i r t u d e das leis de p a r e a m e n t o d e bases (isto é, a d e n i n a
pareia s o m e n t e c o m t i m i n a , e g u a n i n a s o m e n t e c o m citosina), a
s e q ü ê n c i a de u m a única fita d e D N A dita a s e q ü ê n c i a d e sua fita
c o m p l e m e n t a r . N a replicação, as d u a s fitas p a r e n t a i s d e u m a
m o l é c u l a de d s D N A servem, cada u m a delas, c o m o m o l d e p a r a
a síntese de u m a fita-filha (Figura 17-5). O processo é c h a m a d o
semiconservativo p o r q u e as m o l é c u l a s d e d s D N A d u p l i c a d a s pro-
duzidas dessa m a n e i r a são, cada u m a delas, c o m p o s t a s d e u m a
Replicação
DNA
DNA
I
Transcrição
mRNA
i
Tradução
proteína
FigUfa 17-4 O dogma central.
278 PARTE IV Analitos
DNA parental
dupla-fita Fita contínua
5'1
Fitas-
filhas
3'
Direção do d e s e n o v e -
lamento da hélice
Fita descontínua J
Forquilha de replicaçao
Figura 1 7 - 5 Replicação do DNA. O DNA dupfa-fita é separado
na forquilha de replicação. A fita contínua è sintetizada
continuamente, enquanto a fita descontinua é sintetizada
descontinuamente, mas ligada, posteriormente, pela DNA ligase.
fita p a r e n t a l (conservada) e u m a fita-filha. Para q u e a replicação
ocorra, a hélice dupla-fita original deve ser s e p a r a d a . A replicação
se inicia e m m ú l t i p l o s sítios (origens d e replicação) d u r a n t e esse
processo, mas cada o r i g e m d e replicação é u s a d a a p e n a s u m a vez
d u r a n t e u m ú n i c o ciclo celular.
As fitas-filhas são sintetizadas pela D N A polimerase III, u m a
enzima que lê o m o l d e parental e liga nucleotídeos à fita-filha
crescente de a c o r d o c o m as leis de p a r e a m e n t o de bases d o d s D N A .
A D N A polimerase III c omeça a síntese na forquilha de replicação
(Figura 17-5), o p o n t o de separação das fitas, c o m u m primer de
R N A p e q u e n o q u e é p a r e a d o c o m o m o l d e parental. E m seguida,
esse primer é excisado e s u b s t i t u í d o p o r D N A pela enzima d e reparo
d o D N A , D N A polimerase I. C o m o a D N A polimerase III sintetiza
D N A apenas n a direção 5'-3', u m a fita-filha, a fita c o n t í n u a , é
sintetizada c o n t i n u a m e n t e , e n q u a n t o a outra, a fita d e s c o n t í n u a ,
deve ser sintetizada de m o d o d e s c o n t í n u o (isto é, em s e g m e n t o s
p e q u e n o s IFigura 17-5]). O s f r a g m e n t o s da fita d e s c o n t í n u a são,
então, ligados pela enzima D N A ligase,
Transcrição
A i n f o r m a ç ã o d o D N A é organizada e m u n i d a d e s que especifi-
cam a p r o d u ç ã o d e m o l é c u l a s de p r o t e í n a s e d e R N A necessárias
paTa a f u n ç ã o celular. Essas u n i d a d e s , c h a m a d a s genes, i n c l u e m
as regiões c o d i f i c a d o r a s q u e d e t e r m i n a m as s e q ü ê n c i a s d e ami-
n o á c i d o s d e u m a p r o t e í n a ; e as regiões reguladoras, c h a m a d a s
p r o m o t o r e s , c o n t r o l a m a taxa e o m o m e n t o de p r o d u ç ã o dessa
p r o t e í n a (Figura 17-6). A região c o d i f i c a n t e de u m gene é dividida
e m s e g m e n t o s d e n o m i n a d o s éxons, intercalados c o m regiões não-
c o d i f i c a d o r a s d e n o m i n a d a s i n t r o n s (Figura 17-6). O n ú m e r o e o
t a m a n h o d o s i n t r o n s e éxons são variáveis e n t r e os genes. A
p r o d u ç ã o das p r o t e í n a s é m e d i a d a p o r moléculas de R N A que
c a r r e g a m a i n f o r m a ç ã o p a r a p r o t e í n a s específicas a p a r t i r d o
D N A d o n ú c l e o para o citoplasma, o n d e as p r o t e í n a s são sinte-
tizadas. Essas m o l é c u l a s são os m R N A s . O processo d e transfe-
rência d e i n f o r m a ç ã o d a s e q ü ê n c i a d e D N A para R N A é c h a m a d o
transcrição.
C o m o a replicação, a transcrição r e q u e r separação das fitas
d o D N A d ú p l e x e usa u m a p o l i m e r a s e para copiar a f i t a - m o l d e
de D N A . Para a transcrição, a p o l i m e r a s e é a R N A p o l i m e r a s e
II, q u e se liga a s e q ü ê n c i a s d o p r o m o t o r . O s p r o m o t o r e s o c o r r e m
DNA início da transcrição Exons
3'
5'
Promotor
I
Transcrição
...
Introns
Pré-mRNA
mRNA
maduro I
•AAAAA
Processa-
mento do
mRNA
Figura 1 7 - 6 Transcrição do DNA e processamento do mRNA. Um
gene que codifica uma proteína contém uma região promotora com um
número variável de introns e éxons. A transcrição começa no sítio de
inicio de transcrição. O pré-mRNA é processado por capeamento
(capping), poliadenilação e js£>Iicing de introns, tornando-se um mRNA
maduro.
a a p r o x i m a d a m e n t e 100 bases "acima" ("ufistream") (isto é, n a
e x t r e m i d a d e 5') d o sício d e início d a transcrição, n o qual a pri-
m e i r a u n i d a d e de r i b o n u c l e o t í d e o é p a r e a d a c o m o m o l d e . ( N o
R N A , a t i m i n a é s u b s t i t u í d a p o r uracila, q u e pareia c o m a d e n i n a . )
O s p r o m o t o r e s são g e r a l m e n t e TICOS e m t i m i n a e a d e n i n a e m
p a d r õ e s d e r e p e t i ç ã o e t ê m sido d e n o m i n a d o s T A T A boxes. O
início de transcrição r e q u e r m u i t o s co-fatores d e p r o t e í n a para se
ligar à R N A p o l i m e r a s e a f i m d e f o r m a r o c o m p l e x o d e iniciação
ativo. O u t r a s regiões d o D N A , c o n h e c i d a s c o m o a c e n t u a d o r e s
(enfumcErj), p o d e m interagir c o m o c o m p l e x o de iniciação c o m a
f u n ç ã o d e e s t i m u l a r o u r e p r i m i r a transcrição. A regulação d a
transcrição é o m e c a n i s m o p r i m á r i o q u e as células u s a m para
c o n t r o l a r a expressão gênica.
O f i m d a transcrição (ou " t e r m i n a ç ã o d e cadeia") o c o r r e e m
resposta a s e q ü ê n c i a s específicas. O transcrito d e R N A rapida-
m e n t e se desliga d o m o l d e d e D N A . O p r o d u t o f i n a l é u m a
s e q ü ê n c i a c o m p l e m e n t a r d e r i b o n u c l e o t i d e o s , c h a m a d o pré-
m R N A , q u e c o n t é m a i n f o r m a ç ã o necessária para a síntese pro-
téica (Figura 17-6). M o d i f i c a ç õ e s adicionais são necessárias, entre-
t a n t o , a n t e s q u e o m R N A possa ser e x p o r t a d o ao citoplasma,
o n d e o c o r r e a síntese de p r o t e í n a . A e x t r e m i d a d e 5' d a m o l é c u l a
de p r é - m R N A é m o d i f i c a d a pela adição d e resíduos de 7-metil
g u a n o s i n a a f i m d e f o r m a r u m a estrutura c h a m a d a cap (Figura
17-6). A e x t r e m i d a d e 3' é m o d i f i c a d a pela a d i ç ã o de múltiplas
bases d e a d e n i n a , c h a m a d a d e c a u d a poli A (Figura 17-6). T a n t o
o cap q u a n t o a c a u d a são necessários p a r a a t r a d u ç ã o d o m R N A
e m p r o t e í n a , e eles p r o t e g e m a molécula de m R N A d e degrada-
ção p o r exonucleases. A excisão o u splicing dos i n t r o n s não-codi-
ficadores é executada poT u m c o m p l e x o m o l e c u l a r d e n o m i n a d o
spliceossomo. Esses c o m p l e x o s são c o m p o s t o s d e múltiplas par-
tículas de r i b o n u c l e o p r o t e í n a nuclear p e q u e n a ( s n R N P s ) . O s
spliceossomos m e d e i a m a clivagem e a ligação d o R N A a s e q ü ê n -
cias d e r e c o n h e c i m e n t o específicas, c h a m a d a s s e q ü ê n c i a s d o
d o a d o r e d o aceptor de splicing. A p ó s a r e m o ç ã o dos introns, os
éxons são justapostos u m a o o u t r o , f o r m a n d o u m a m o l é c u l a de
m R N A m a d u r o (Figura 17-6) q u e é t r a n s p o r t a d o para o cito-
plasma, o n d e o c o r r e a t r a d u ç ã o e m p r o t e í n a .
Tradução
A tradução é o processo através d o qual a s e q ü ê n c i a de m R N A
d i r e c i o n a a s e q ü ê n c i a de a m i n o á c i d o s d u r a n t e a síntese de pro-
 Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 279

teína. Vinte e u m aminoácidos estão envolvidos na síntese pro-
téica e cada u m é especificado por uma seqüência de três nucleo-
tideos, como urn códon.
C o m o existem 64 possiveis códons, a maioria dos aminoáci-
dos é especificada por mais de u m códon. Além disso, dois
códons n ã o codificam aminoácidos, mas o sinal de terminação
de síntese protéica (códons de parada — stop codons) e u m códon,
U G A , que codifica uma parada ou o aminoácido selenocisteína,
d e p e n d e n d o das seqüências adjacentes das proteínas de ligação
ao RNA. A lista completa das seqüências de códon forma o código
genético, que é mostrado na Tabela 17-1 A tradução ocorre nos
ribossomos, que são complexos de ribonucleoproteínas que fun-
cionam como fábricas de síntese protéica, U m ribossomo se liga
ao sítio de iniciação no m R N A para formar u m complexo de
iniciação. D u r a n t e a síntese, os códons são "lidos" pelo tRNA,
pequenas moléculas de R N A que têm uma seqüência comple-
mentar a u m códon de aminoácido (anticódon) e são ligadas à
molécula de aminoácido especificada pelo códon. A medida que
a síntese procede, o anticódon de tRNA apropriado pareia com
o próximo c ó d o n no m R N A . U m a enzima do ribossomo catalisa,
então, a formação de uma ligação peptídica entre o aminoácido
ligado ao tRNA e a cadeia de proteína crescente. O t R N A ante-
rior é liberado e o próximo t R N A é adicionado. O ribossomo se
move ao longo d o m R N A até que se atinja u m códon de parada
e a síntese termine. O ribossomo e o produto piotéico são, então,
dissociados do m R N A . Mais de u m ribossomo p o d e se mover ao
longo da molécula de m R N A ao mesmo tempo, f o r m a n d o um
polissomo (ou polirribossomo),
alteram a função gênica ou sua interpretação por mecanismos
diferentes daqueles que dependem da alteração de seqüência d e
D N A . A epigenética praticamente tem se desenvolvido de forma
a incluir o estudo de metilação d o D N A , impnnting genômico,
modificação de histona, remodelagem de cromatina e outros. A
maioria desses processos acrescenta u m a ourra dimensão para o
controle de expressão gênica.
A metilação do D N A se refere à adição de u m grupo metil
ao carbono da quinta posição dos resíduos de citosina em dinu-
cleotídeos C p G . Aproximadamente 8 0 % de todos os dinucleotí-
deos C p G do genoma h u m a n o são mediados e estes incluem,
principalmente, dínucleotídeos C p G isolados e em grupos, deno-
minados ilhas C p G , nos elementos de repetição do D N A não-
p r o m o t o r (Figura 17-7).4 Esses padrões de metilação são reprodu-
zidos durante a replicação do D N A por manutenção de D N A
metiltransferases (DNTM1), de forma que o padrão de metilação
é h e r d a d o pelas células-filhas na divisão celular. Além disso, a
metilação do D N A está envolvida no crescimento e no desenvol-
vimento de organismos. Após a fertilização do embrião, o genoma
se torna desmetilado (exceto os loci marcados [ímprinted]; ver
discussão mais adiante, neste parágrafo) para preparar a via do
estabelecimento de padrões relacionados, em termos de desen-
volvimento, de metilação cie nouo d o D N A pelas D N A metiltrans-
ferases ( D N M T 3 a e DNMT3b). Impnniing genômico e compen-
sação da dosagem gênica de genes ligados ao X em fêmeas,

Genética e Epigenética
Os fenômenos de genética e epigenética estão intimamente rela-
cionados. E m geral, os eventos genéticos estão associados à infor-
mação de seqüência do D N A e, portanto, incluem as conseqüên-
Figura 17-7 Padrão d e metilação d e D N A n o r m a l n o g e n o m a
cias da transmissão de uma seqüência particular de D N A (p. ex.,
h u m a n o . O s sírios de d í n u c l e o t í d e o s C p G são i n d i c a d o s p o r círculos.
a herança de mutações ou polimorfismos de DNA) ou da aqui-
As ilhas d e C p G em associação aos p r o m o t o r e s d e g e n e g e r a l m e n t e são
sição de variações da seqüência de D N A (p. ex., o acúmulo de
não-metiladas, e n q u a n t o d í n u c l e o t í d e o s C p G isolados são metilados.
mutações somáticas no envelhecimento ou no desenvolvimento
C í r c u l o s abertos: não-rnerilados; CÍTCUIOS cheios: m e d i a d o .
de câncer). Por o u t r o lado, a epigenética engloba processos que

T A B E L A 1 7 - 1 I Código Genético (Tradução do m R N A em Aminoácidos durante a Síntese de Proteína)

P O S I Ç Ã O DO N U C I F O T I D E O NO C Ó D O N

Terceiro

Primeiros Segundo U G A G

U U Fenilalariiria Fenilalanina Leucina Leucina

C Serina Serina Serina Serina
A Tiros i na Tirosina Parada Parada
G Cisteína Cisteína Selenocisteína* Triptofano

C U Leucina Leucina Leucina Leucina

C Prolina Prolina Prolina Prolina
A Histidína Histidína Glutamina Glutamina
G Arginina Arginina Arginina Arginina

A U Isoleucioa Isoleucina Isoleucina Metionina

c Treonina Treonina Treonina Treonina
A Asparagina Asparagina Usina Usina
G Serina Serina Arginina Arginina

G Ü Valína Vali na Valina Valina

C Alanina Alanina Alanina Alanina
A Ácido aspártico Ácido aspártico Ácido glutâmico Ácido glutâmico
G Glicina Glicina Glicina Glicina
*0 códon UGA pode codificar selenocisteína ou parada.
280 PARTE IV Analiíos
d e n o m i n a d a inativação d o X ou lionização, são t a m b é m media-
dos por metilação do D N A . Im£>rmtmg genõmico é um f e n ô m e n o
epigenético através d o qual a f u n ç ã o genética de alelos específicos
é determinada pelo fato de o alelo ser herdado d o pai ou da mãe.
O locus do fator de crescimento h u m a n o similar à insulina-2 H 1 9
(IGF2-H19) n o cromossomo 15 é u m exemplo de u m íocus
marcado através do qual a herança dissõmica d o alelo paterno
ou materno resulta em conseqüências clínicas significativamente
diferentes, denominadas síndromes de Prader-Willi e Angelman,
respectivamente. A metilação diferencial do locus marcado n o
m o m e n t o do desenvolvimento da célula germinativa permite o
reconhecimento da origem parental dos alelos marcados pelos
processos celulares.
Além de afetar o crescimento e o desenvolvimento, a metila-
ção do D N A é u m f e n ô m e n o epigenético bem reconhecido que
medeia o silenciamento de genes. 4 C o m exceção das ilhas C p G
dentro dos elementos de repetição d o D N A , outras ilhas C p G ,
particularmente aquelas encontradas em regiões promotoras de
genes ativos, não são metiladas n o estado homeostático (Figura
17-7). Se, ao contrário, as ilhas C p G n o promotoT se tornassem
hipermetiladas, os genes tornar-se-iam transcricionalmente silen-
ciados. A hipermetilação anormal dos promotores de genes, em
particular qualquer dos genes supressores de tumor e de genes
envolvidos n o reparo do D N A , é um f e n ô m e n o bem conhecido
n o desenvolvimento de tumor. Tem sido mostrado que a metila-
ção dos promotores gênicos compromete a associação dos fatores
de transcrição sensíveis à metilação, impedindo, portanto, a ati-
vação gênica.
C o m o já discutido, as histonas são u m a parte integrante dos
nucleossomos, a u n i d a d e estrutural de repetição básica da croma-
tina. As proteínas histonas p o d e m ser modificadas pós-traducio-
nalmente pot meio de processos que incluem acetilação, metila-
ção, fosforilação e ubiquitinação. 3 A acetilação de certas hsinas
das histonas H 3 e H 4 por histona acetiltransferases diminui a
interação histona-DNA e melhora a acessibilidade d o D N A à
ativação transcricional. Ao contrário, a desacetilação de histonas
por histona desacetilases promove a formação de nucleossomos
compactos, levando à repressão da transcrição. A desacetilação
de histonas é u m componente-chave na montagem da heterocro-
matina, a cromatina transcricionalmente inativa. 3
Além das modificações de histona, os nucleossomos p o d e m
ser remodelados por processos dependentes de ATP, incluindo o
deslizamento do octâmero, o enovelamento do D N A e a substi-
tuição de histonas. 5 O deslizamento d o octâmero permite o repo-
sicionamento dos octâmeros de histonas nos segmentos de D N A
adjacentes. A volta d o D N A se refere ao mecanismo através do
qual o segmento de D N A , originalmente empacotado ao redor
do nucleossomo, pode ser desenovelado. A substituição de his-
tonas permite a substituição de subunidades do octâmero com
histonas variantes. C o n s e q ü e n t e m e n t e , os nucleossomos são
estruturas dinâmicas que p o d e m ser remodeladas de acordo com
as demandas transcricionais da célula. Resumindo, a função
gênica é mediada por u m a rede inter-relacionada de mecanismos
epigenéticos. A interdependência entre o controle da função ou
expressão gênica e a organização estrutural da cromatina pode
ser estimada a partir dos duplos efeitos estrutural e funcional da
metilação de C p G , modificação de histona, formação de hetero-
cromatina e remodelagem de nucleossomos e cromatina
VARIAÇÃO DE SEQÜÊNCIA DOS ÁCIDOS
NUCLÉICOS
Qualquer m u d a n ç a da seqüência (comparada com a seqüência
de referência) é chamada u m a seqüência variante ou alteração.
Se a seqüência variante ou alteração estiver presente a u m a fre-
qüência de pelo menos 1%, ela será u m poíimor/ismo. As variações
de seqüência mais comuns são as mudanças de u m a única base,
também chamadas p o l i m o r f i s m o s de u m ú n i c o nucleotídeo
(SNPs). Milhões de SNPs têm sido descritos, e muitos outros
novos c o n t i n u a m a ser relatados. Alguns deles são comuns, com
freqüências alélicas de 0,1 a 0,5 (isto é, presente em 10 a 50 das
100 cópias estudadas), apesar de outras mudanças de base única
serem muito raras. As alterações de seqüência que são conhecidas
por causar doenças são chamadas mutações. A maioria das muta-
ções SNP é missense e causa u m a substituição de aminoácido,
e n q u a n t o em u m n ú m e r o significativamente menor são as muta-
ções nomense que resultam em u m códon de parada e terminação
prematura de cadeia polipeptídica.
Freqüentemente as variantes de seqüência são herdadas juntos
em u m bloco contíguo, ou haplótipo. As associações a doenças
p o d e m depender não de qualquer mutação em particular, mas d o
efeito global de vários alelos ligados que definem o haplótipo. Por
exemplo, a função de u m a enzima depende do haplótipo que
determina a seqüência de aminoácidos na proteína. Os haplótipos
p o d e m ser definidos por muitos íoci polimórficos.
Algumas vezes os genes, ou m e s m o os cromossomos, estão
presentes em mais de duas cópias. Se as cópias extras dos genes
perdem sua função, elas são conhecidas por pseudogenes. E
importante distinguir pseudogenes de genes funcionais, visto que
as variações de seqüência em pseudogenes raramente têm impor-
tância clínica. Alguns genes muito importantes estão presentes
em muitas cópias, fazendo com que a expressão global da proteína
não seja afetada se u m a mutação inesperada ocorrer em u m a
cópia. A maioria dos genes, entretanto, está presente em apenas
duas cópias e a dosagem gênica normal é dois. Q u a n d o esses
genes, tais como HER-2-neu, estão presentes em mais de duas
cópias funcionais, diz-se que os genes estão amplificados. C o m o
consequência, mais transcritos de m R N A e proteínas geralmente
são feitos, resultando em anormalidades celulares e possível pro-
gressão ao câncer.
Variação Humana
Se o D N A de dois indivíduos quaisquer é comparado, existe, em
média, u m a diferença a cada 1.250 bases (isto é, aproximada-
m e n t e 9 9 , 9 % da seqüência são idênticos entre cópias do genoma
escolhidas aleatoriamente). Muitas seqüências variantes, altera-
ções e polimorfismos d o genoma não afetam a saúde h u m a n a e
são benignas ou silenciosas. Embora um SNP tenha sido identifi-
cado a cada 100 a 300 bases, muitos desses não são encontrados
freqüentemente na população. A grande maioria dos SNPs (97%)
ocorre em regiões não-codificadoras; somente 3 % dos SNPs estão
associados aos éxons.
Aproximadamente 70% das mutações h u m a n a s são SNPs e
a maioria dessas é de mutações misseroe ou nonsense. Apenas 9 %
das mutações que causam doenças são SNPs que afetam sítios de
sfjlidng e resultam em concatenação alterada da seqüência codi-
ficadora. Finalmente, menos de 1% das mutações conhecidas
que causam doenças são SNPs que afetam a eficiência reguladora
da transcrição por alterar as regiões do p r o m o t o r / a c e n t u a d o r em
introns ou a estabilidade d o transcrito de RNA.
A maioria das mutações h u m a n a s remanescentes (23%) cons-
titui pequenas inserções ou deleções. U m a inserção se refere à
presença de bases extras, e n q u a n t o a deleção envolve a ausência
de certas bases em comparação com a seqüência de referência.
Mutações de inserção e deleção f r e q ü e n t e m e n t e resultam em
u m a m u d a n ç a d o quadro de leitura dos códons, resultando em
seqüência de aminoácidos alterada após a mutação — c o m u m e n t e
acompanhada por terminação de cadeia devido a u m códon
non.s£TLse.

Apenas 7% das mutações h u m a n a s são alterações de seqüên-
cia mais complexas. Essas incluem duplicações ou deleções de
éxons ou genes inteiros, translocações cromossómicas, expansões
de repetição (p. ex., expansões de repetição de trinucleotídeos),
reananjos gênicos (p. ex,, reatranjos gênicos em células B e T) e
loci polimórficos complexos relacionados com saúde e com doença
(p ex , antígeno leucocitário h u m a n o [HLA]).
Variação Bacteriana
Os genomas bacterianos são consideravelmente menos comple-
xos do que o genoma h u m a n o ou outros genomas eucarióticos.
Bactérias comuns têm apenas u m cromossomo, geralmente u m
D N A dupla-hélice circular de 4 a 5 milhões de pares de bases,
cerca de 1.000 vezes menos quantidade de D N A do que em uma
célula humana. Cerca de 9 0 % do D N A em bactérias codifica
proteínas. N ã o existem introns, mas existem múltiplas regiões
intergênicas pequenas de seqüências repetitivas que estão disper-
sas ao longo do genoma. A bactéria comum Escherichia coh
contém aproximadamente 4-300 genes.
Além do cromossomo circular grande, que carrega os genes
essenciais, as bactérias também carregam genes adicionais em
circulos menores de D N A dupla-fita, conhecidos como plasmí-
deos. Estes variam em t a m a n h o de 1.000 a mais de 1 milhão de
pares de bases. Os plasmídeos são importantes n o diagnóstico
molecular porque f r e q ü e n t e m e n t e codificam fatores patogênicos
e resistência a antibiótico.
O c o n j u n t o bacteriano de D N A p o d e ser alterado por (1)
ganho ou perda de plasmídeos; (2) alterações de uma única base,
pequenas inserções e deleções, como nos genomas eucarióticos,
e (3) rearranjos de segmentos maiores, incluindo inversões, dele-
ções e duplicações. Alguns genes, tais como os de R N A ribossõ-
mico, estão presentes em muitas cópias e p o d e m ser usados para
identificar diferentes espécies de bactérias. Além disso, as seqüên-
cias repetitivas intergênicas p o d e m servir como alvos múltiplos
para sondas de oligonuclsotídeos, permitindo a geração de perfis
únicos ou impressões digitais (/mgerprints) de D N A para espécies
individuais de bactéria.
Variação Virai
Os genomas virais são consideravelmente menos complexos do
que os genomas bacterianos. Vírus comuns que infectam seres
humanos variam em t a m a n h o de cerca de 5,000 a 250.000 bases,
ou 20 a 1.000 vezes menos quantidade de ácido nucléico do que
em E. coíi. C o m o os vírus usam a maquinaria celular do hospe-
deiro, eles não precisam de muitos genes. Vírus pequenos p o d e m
codificar apenas alguns genes, mas os vírus maiores podem codi-
ficar centenas de genes. O genoma virai consiste em D N A ou
RNA, e o ácido nucléico pode ser de fita simples ou dupla-fita,
linear ou circular, com u m ou múltiplos fragmentos e / o u cópias
por partícula virai. C o m o em bactéria, não existem introns. De
fato, em alguns vírus, os éxons se sobrepõem com diferentes
quadros de leitura que codificam produtos distintos a partir das
mesmas seqüências de ácidos nucléicos. Regiões não-codificadoras
estão geralmente presentes nas extremidades dos genomas linea-
res. Segmentos de repetição são encontrados com freqüência
como repetições terminais ou internas e p o d e m estar invertidos.
Alterações de seqüência em vírus são comuns. Áreas de alta
variação de seqüência p o d e m estar intercaladas entre domínios
conservados Freqüências maiores de variação podem estar corre-
lacionadas com a fidelidade mais baixa da polimerase, o que pode
permitir escapar do reconhecimento de anticorpos e de drogas
antivirais. Mutações comuns em virus incluem as mutações de
ponto, inserções e deleções A diversidade de seqüência dentro
Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 281
de uma espécie virai pode ser tao grande que as seqüências-con-
senso para tipagem molecular são difíceis de serem encontradas.
ENZIMAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
Enzimas de ácidos nucléicos são ferramentas importantes para o
diagnóstico molecular. Enzimas comuns que atuam em ácidos
nucléicos incluem aquelas que sintetizam polímeros longos e as
que degradam ácidos nucléicos em fragmentos menores. Essas
enzimas são fundamentais para a replicação do D N A e transcrição
do R N A , e devem estar presentes em todas as células que repli-
cam. Além das enzimas de funções gerais, u m a variedade de
enzimas únicas, encontradas em bactéria e vírus, atua em seqüên-
cias específicas de ácidos nucléicos. Muitas dessas enzimas têm
sido purificadas e sintetizadas in uítro, algumas vezes "engenheira-
das" com alterações que melhoram seu desempenho ou sua esta-
bilidade. Nossa capacidade de manipular ácidos nucléicos in uifrro
com essas enzimas tem possibilitado a biologia molecular moderna.
As e m imas são também extensivamente utilizadas n o diagnóstico
de ácido nucléico, incluindo preparação de amostras, marcação
de sondas, geração de sinal e amplificação de alvos e sondas.
As nucleases são enzimas que hidrolisam uma ou mais liga-
ções fosfodiéster dos polímeros de ácidos nucléicos. As nucleases
p o d e m requerer uma extremidade hidroxila livre (exonucleases),
com especificidade para o terminal 3' ou o 5', ou p o d e m atuar
somente em ligações internas (endonucleases). Por exemplo,
algumas técnicas que utilizam sondas são baseadas na atividade
5'-exonuclease que cliva ácidos nucléicos entre dois marcadores
fluorescentes. As nucleases p o d e m ser específicas para D N A ou
R N A e p o d e m atuar apenas em polímeros de fita simples ou
dupla-fita. Por exemplo, a DNAse I digere D N A dupla-fita
(dsDNA) e de nuclease S I atua somente em D N A de fita simples
(ssDNA). A DNAse I pode ser usada especificamente para degra-
dar D N A em misturas de ácidos nucléicos q u a n d o se tem inte-
resse apenas em RNA. As RNAses são enzimas muito estáveis
que constituem contaminantes comuns de laboratório.
As endonculeases de restrição são encontradas em bactérias;
essas encimas impedem a replicação de D N A estranho. Sua ação
é seqüência-específica, requerendo seqüências de reconhecimento
de geralmente 4 a 10 nucleotídeos na molécula de D N A dupla-
fita. Em cada local onde essa seqüência é encontrada, a enzima
corta ambas as fitas de forma reprodutível, resultando em cortes
que resultam em extremidades coesivas ou cegas. Por exemplo,
EcoRI é uma enzima de restrição de E. coíi que reconhece a seqüên-
cia de seis bases G A A T T C e corta entre o G e o A de ambas as
fitas, produzindo u m corte com extremidades coesivas:
5' ... G / A A T T C ... 3'
3' ... C T T A A / G ... 5'
Note que os cortes de "extremidades cegas" seriam produzidos se
a enzima hidrolisasse a ligação entre A e T. As enzimas de restri-
ção são usadas nos laboratórios para digerir fitas grandes de D N A
em fragmentos menores e para preparar D N A de diferentes
origens para serem ligados nos procedimentos de clonagem.
As ligases catalisam a formação de ligações fosfodiéster entre
duas cadeias de ácido nucléico. As D N A ligases não são seqüência-
especificas e requerem a presença de u m molde complementar.
Ao contrário, as R N A ligases usadas em processamento de m R N A
não requerem u m molde, mas são sensíveis à sequência.
As polimerases catalisam a síntese de polímeros de ácidos
nucléicos complementares usando u m a fira parental como molde.
In vitro, essas enzimas p o d e m estender u m primer de oligonucleo-
tídeo que é anelado a uma fita-molde. A extensão requer que a
3 ' O H da extremidade que se estende esteja livre, e que nucleotí-
282 PARTE IV Analitos

deos trifosfatos (NTPs) estejam presentes. A extensão pára se o
molde ou os NTPs se esgotam ou se n e n h u m grupo 3 ' O H está
disponível no terminal que se estende. Polimerases termoestáveis,
tal como a Thermus aquaticus (Taq) D N A polimerase, são reagen-
tes essenciais para a automatização de muitos procedimentos de
amplificação de ácidos nucléicos
A transcriptase reversa catalisa a síntese de D N A a partir de
u m molde de R N A ou D N A . A enzima é encontrada em retro-
vírus, tais como o vírus da imunodeficiência h u m a n a 1 (H1V-1)
(e em hepadnavirus). Os retrovírus têm genomas de RNA, e a
atividade de transcriptase reversa é necessária como parte de sua
replicação No laboratório, a transcriptase reversa é usada para
fazer cópias de D N A complementar (cDNA) de R N A em amos-
trás e p o d e m ser usadas para clonagem, preparação de sonda e
análises de ácidos nucléicos.
TÉCNICASJ)E AMPLIFICAÇÃO
O laboratório de diagnóstico molecular depende de técnicas de
amplificação para estudar pequenas quantidades de ácidos
nucléicos que são de interesse nas amostras clínicas. O genoma
h u m a n o é tão grande que é difícil detectar pequenas alterações
em uma pequena parte do genoma. Técnicas que a u m e n t a m a
quantidade do alvo d e ácido nucléico ou o sinal de detecção de
uma única seqüência de interesse são designadas como m é t o d o s
de amplificação. N a amplificação do alvo, a região do ácido
nucléico que envolve a área de interesse é copiada, muitas vezes,
por métodos in fitro. Areas fora do alvo não são amplificadas. Na
amplificação de sinal, a quantidade do alvo permanece a mesma,
mas o sinal é então a u m e n t a d o por u m dos vários métodos,
incluindo hibridização sequencial das estruturas de ácido
nucléico ramificadoras e ação enzimática contínua sobre o subs-
trato que p o d e ser reciclado. Técnicas de amplificação podem,
freqüentemente, atingir uma amplificação de mais de u m milhão
de veses em menos de uma hora.
Reação e m Cadeia da Polimerase
A reação e m cadeia da polimerase (PCR)1LI é o mais bem conhe-
cido e o mais amplamente empregado dos métodos de amplifica-
ção de alvo. Por causa da disponibilidade comercial de D N A
polimerases termoestáveis, kits e instrumentação, esse m é t o d o é
amplamente utilizado tanto em pesquisa q u a n t o em laboratórios
clínicos.
A PCR requer uma D N A polimerase termoestável, desoxirn-
bonucleotídeos de cada uma das bases (coletivamente designados
com dNTPs), a seqüência-alvo e u m par de oligonucleotídeos
(denominados primers) complementares às fitas opostas que flan-
queiam a seqüência a ser detectada. Na primeira etapa, os dúplb
ces-alvo são desnaturados em fitas simples por calor (Figura 17-8).
Q u a n d o a mistura é resfriada, os primers fornecidos em grande
excesso (geralmente mais de u m milhão de vezes a concentração
do alvo inicial) se anelam de forma específica às seqüências com-
plementares do alvo. U m a vez q u e os fmmers estejam anelados, a
ação da polimerase sintetiza duas fitas de D N A adicionais con-
t e n d o os primers nas extremidades 5'. Os fmmers são posicionados
próximos o bastante de forma que a polimerase estenda cada u m a
das fitas distante o suficiente para incluir o sítio de inicio do
o u t r o primer. Geralmente a temperatura ideal para a polimeriza-
ção é u m valor intermediário entre as temperaturas de desnatu-
ração e de anelamento. O segundo ciclo t a m b é m se inicia com
a desnaturação, mas agora existem duas vezes mais fitas (o D N A
genômico original e os produtos de extensão do primeiro ciclo)
disponíveis para o anelamento do primer e subsequente extensão.
A variação de temperatura continua (tipicamente) encre três
valores: uma temperatura alta o suficiente para desnaturar a

• NA genômico a Produtos longos a Produtos pequenos

produtos longos produtos pequenos a produtos
pequenos
Desnaturação
94°C
V

Anelamento
55°C

Extensão
72°C V.
- _ - l

Figura 17-8 Diagrama esquemático da reação em cadeia da polimerase (PCR) Ciclos repetitivos de
desnaturação, anelamento e extensão são determinados por variação seqüencial da temperatura de reação. Dois
primers (indicados como segmentos pequenos) pareiam com as fitas-molde opostas (linhas longas em vermelho e
preto) para definir a região a ser amplificada A extensão ocorre a partir das extremidades 3' (indicadas pelas
pontas de setas pela metade). Em cada ciclo, o D N A genômico é desnaturado e pareado com primer?, que se
estendem em direções opostas através da mesma região, produzindo produtos longos de comprimento
indefinido. Os produtos longos gerados por extensão de u m dos primers pareiam a outro primer durante o ciclo
seguinte, produzindo produtos pequenos de tamanho definido. Qualquer produto pequeno presente t a m b é m
produz mais produtos pequenos. Após n ciclos, até 2 n de novas cópias da região amplificada estão presentes [n
produtos longos e (2 n — n) produtos pequenos] mais uma (original) cópia genômica. U m a abordagem similar
pode ser usada para amplificar os alvos de R N A por transcrição reversa inicial do molde de PvNA para produzir
o molde de D N A .

1.2
0,8 -
O b r o m e t o de etídio p o d e ser suficiente. Q u a n d o se deseja u m a
X acurácia m a i o r , u m dos primers p o d e ser marcado c o m fluores-
<£
0 0,4 -
03
•a
01
ffl
a.
'O
O p a r t i c u l a r m e n t e vantajosos n o l a b o r a t ó r i o clínico. A d i c i o n a r
0,0 -
16 20 2/|
Tempo (minutos)
1 1 1 1 1 o u depois que essa reação tenha sido completada ( m e d i d a do
32 40 48
Ciclos de PCR
Amplificação do DNA
Figura 17-9 Curvas exponencial e logística do D N A amplificado
por PCR. Assume-se u m tempo de duplicação de 30 segundos para a
PCR. O u seja, dada a equação N t = Noe", em que N t é a quantidade de
D M A no tempo t e N 0 é a quantidade inicial de D N A , r é 1,386 m i n 1
para PCR. U m a capacidade de carga de 1011 cópias de produto de PCR
por M.L f o i usada, assumindo que a reação é limitada pelo primar em 1 / 3
da concentração da sua concentração (inicialmente a 0,5 |uM o u 3 x
IO11 pares de moléculas de fmmer por (iL). Iniciando com apenas uma
cópia-alvo, leva somente 23 minutos (46 ciclos) para amplificar o alvo
até a saturação. (Modificado com permissão do editor de W i t t w e r CT,
Kusukawa N. Real-time PCR. In: Persing D H , Tenover FC, Versalovic ],
Tang Y W , UngeT ER, Relman D A , W h i t e T ] , eds. Molecular
microbiology: diagnostic principies and practice, Washington, D C A S M
Press, 2004:71-84. © 2004 A S M Press.)
sequência-alvo, u m a temperatura baixa q u e p e r m i t a o anela-
m e n t o dos primers c o m o alvo, e u m a terceira temperatura ideal
para a extensão pela polimerase.
O ciclo repetitivo de temperaturas resulta no a c ú m u l o expo-
n e n c i a l de u m p r o d u t o p e q u e n o (que consiste nos primers e em
toda a seqüência entre eles). Se a eficiência de cada ciclo é ideal,
o n ú m e r o de seqüências-alvo d o b r a a cada ciclo (eficiência = 2,0).
A eficiência da P C R depende dos primers e das condições de
ciclagem de temperatura, j u n t a m e n t e c o m a presença o u a ausên-
cia de i n i b i d o r e s da polimerase. Os p r o d u t o s amplificados se
a c u m u l a m e x p o n e n c i a l m e n t e nos ciclos iniciais da P C R . E m
a l g u m p o n t o , entr etanto, a eficiência de amplificação cai e, even-
t u a l m e n t e , a q u a n t i d a d e de p r o d u t o atinge u m p l a t ô (Figura
17-9) devido ou à exaustão dos c o m p o n e n t e s o u à competição
entre a n e l a m e n t o dos primers e d o p r o d u t o (isto é, as fitas simples
de p r o d u t o estão e m concentrações tão altas que elas se anelam
umas c o m as outras e m vez de se anelarem c o m os primers). E m
u m a reação de P C R típica, u s a n d o 0,5 p m de cada primer, a
concentração de D N A m á x i m a atingível é cerca de 100 bilhões
de c ó p i a s / [ i L .
C o m a adição de u m a etapa de transcriptase r e v e r s a i n i c i a l
para f o r m a r c D N A de R N A na amostra, os alvos de R N A t a m b é m
p o d e m ser amplificados c o m sucesso e m cópias de D N A . A s
etapas de transcrição reversa e amplificação do D N A geralmente
Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 283
são catalisadas p o r duas poíimerases diferentes, mas algumas
enzimas termoestáveis t ê m t a n t o a atividade de D N A polimerase
q u a n t o a de transcriptase reversa, de f o r m a que ambas as etapas
p o d e m ser realizadas ao m e s m o t e m p o c o m a mesma enzima.
A p ó s a amplificação, os p r o d u t o s p o d e m sei detectados p o i
vários m é t o d o s A simples eletroforese e m gel c o m coloração c o m
cência, de f o r m a que após a P C R os fragmentos possam ser
avaliados em u m aparelho de seqüenciamento âe D N A . A l t e r n a t i -
vamente, algumas formas de ensaio de h i b r i d i z a ç ã o p o d e m sei
usadas para verificar o u analisar o p r o d u t o a m p l i f i c a d o . M é t o d o s
automatizados são sempre atraentes e os de t u b o fechado são
u m a sonda o u u m corante fluorescente antes da amplificação
p e r m i t e aos termocicladores equipados c o m detecção óptica ana-
lisar a reação à m e d i d a que ela p r o g r i d e ( P C R e m t e m p o real)
p o n t o final), sem q u e se precise processar a amostra em u m a
etapa de análise separada.
É n a t u r a l pensar sobre a P C R em termos de três eventos —
desnaturação do alvo dupla-fita, a n e l a m e n t o do alvo c o m os
f r i m m , e extensão da fita de D N A a p a r t i r do primer — o c o r r e n d o
em três temperaturas, cada u m a r e q u e r e n d o u m certo p e r í o d o
de tempo. D e fato, é c o m u m realizar a P C R m a n t e n d o a m i s t u r a
reacional em três temperaturas diferentes (p. ex., desnaturação a
9 4 ° C , a n e l a m e n t o a 5 5 ° C e extensão a 7 2 ° C ) . Os p r i m e i r o s
aparelhos focavam o c o n t r o l e preciso de t e m p e r a t u r a do b l o c o
de a q u e c i m e n t o n o e q u i l í b r i o , n ã o n o c o n t r o l e d i n â m i c o da
t e m p e r a t u r a da amostra. C o m o resultado, as temperaturas da
amostra não eram b e m definidas d u r a n t e as transições e tempos
de ciclo longos se t o r n a r a m o p a d r ã o para assegurar q u e a amostra
atingisse as temperaturas desejadas. A r e p r o d u t i b i l i d a d e entre
aparelhos e fabricantes era r u i m e a P C R requeria de 2 a 4 horas
para completar as amplificações típicas de 3 0 ciclos.
Os aparelhos m o d e r n o s de P C R f o c a m transições rápidas
entre temperaturas c o m o m í n i m o de pausa o u n e n h u m a pausa
(platôs de temperatura), seguindo u m p a r a d i g m a mais acurado
para a amplificação p o r P C R (Figura 17-10). Desnaturação, ane-
l a m e n t o e extensão são reações m u i t o rápidas. O uso de " p i c o s "
de temperatura na desnaturação e n o anelamento, em vez de
platôs estendidos de temperatura, p e r m i t e u m a ciclagem rápida.
O t e m p o real necessário para a P C R depende d o t a m a n h o do
p r o d u t o , mas q u a n d o ele é m e n o r que 5 0 0 b p , 3 0 ciclos reque-
r e m somente 15 a 3 0 m i n u t o s . A l é m disso, a amplificação rápida
m e l h o r a a especificidade. A Figura 17-11 mostra a amplificação
p o r P C R de u m p r o d u t o de 5 3 6 b p a m p l i f i c a d o e m velocidades
de ciclagem diferentes. C o m a ciclagem lenta convencional, são
gerados m u i t o s p r o d u t o s mespecíficos ( p e r f i l de ciclagem A ) .
Esses p r o d u t o s desaparecem q u a n d o o t e m p o de ciclagem é redu-
zido (perfis B, C e D ) . D e fato, o r e n d i m e n t o da amplificação e
a especificidade do p r o d u t o são ó t i m o s q u a n d o os tempos de
desnaturação e a n e l a m e n t o são m í n i m o s . O t e m p o de extensão
necessário para cada ciclo depende do t a m a n h o d o p r o d u t o de
P C R . Estes p o d e m ser tão pequenos q u a n t o 40 b p , até cerca de
40 kb. Para a m p l i f i c a r p r o d u t o s maiores que 5 k b , misturas de
poíimerases q u e i n c l u e m alguma atividade 3'-exonuclease para
editar os nucleotídeos m a l pareados geralmente são usadas. E m
lugar de temperaturas de a n e l a m e n t o e extensão separadas,
ambos os processos p o d e m ser realizados na mesma temperatura,
r e s u l t a n d o e m ciclagem de duas temperaturas e m vez de apenas
três. E m b o r a isso s i m p l i f i q u e a necessidade de i n s t r u m e n t a ç ã o e
programação, l i m i t a a escolha de fmmers e requer u m t e m p o de
extensão mais l o n g o em temperaturas subideais.
284 PARTE IV Analitos

DNA fita simples

Desnaturação

05- 85"
o
ÇC
75-
2
dJ 7 -V
a V -
.d) 65- • 3

Anelamenta do prímer
B V
\ /
ie 12 24
Tempo (segundos) DNA
du ala fita

Figura 17-10 D e m o nsU ação vis uni da emética da PCR. As três fases da PCR (desnaturação, anela mento e
extensão) ocorrem quando a temperatura é continuamente mudada (painel A). Próximo ao f i m da variação de
temperatura, a reação contém produtos de PCR fita simples e dupla-fita. Q u a n d o amostras de diferentes pontos
do ciclo são obtidas (por resfriamento rápido da mistura em água gelada, painel B) e analisadas, a transição do
D N A fita simples desnaturado ao D N A dupla-fita se revela como continua (painel C). A progressão da reação de
extensão pode ser seguida por bandas adicionais que aparecem entre os D N A s fita simples e dupla-fita (pontos
de tempo 5 a 7). (Modificado com permissão de W i t t w e r CT, H e r r m a n n M G . Rapid thermal cycling and PCR
kinetics. In: M Innis, D Gelfand, J Sninsky, eds. PCR applicadons, San Diego: Academic Press, 1999:211-229.
Copyright Elsevier, 1999.)

Q u a n d o a P C R é realizada sob ótimas condições, u m a ú n i c a sair do t u b o . M é t o d o s que realizam amplificação, detecção e

cópia do alvo pode ser detectada. N a prática, entretanto, a pro-
b a b i l i d a d e estatística de se detectar essa única cópia e m u m a
solução de m o l d e d i l u í d a na P C R deve ser considerada. A distri-
b u i ç ã o de Poisson indica q u e se, e m média, u m a cópia d o alvo
está presente p o r t u b o , 3 7 % dos tubos não terão alvo, 3 7 % terão
u m alvo e o restante terá mais de u m . Se existe u m a média de
duas cópias p o r t u b o , a p r o x i m a d a m e n t e 14% dos tubos não terão
m o l d e e fornecerão u m resultado falso-negativo. Cerca de cinco
cópias em m é d i a são necessárias para que 9 9 % dos tubos i n c l u a m
pelo menos u m a cópia. Essa l i m i t a ç ã o de análise de cópia baixa
se m a n t é m verdadeira para q u a l q u e r técnica de amplificação.
Usar soluções diluídas de m o l d e na P C R p o d e ser vantajoso.
Por exemplo, PCR digital é u m a técnica q u e depende dos sinais
de liga/desliga resultante da presença o u ausência de m o l d e em
cada u m dos m u i t o s c o m p a r t i m e n t o s da reação. E m vez de tubos
convencionais, esses c o m p a r t i m e n t o s p o d e m ser d i m i n u t a s gotí-
culas aquosas e m u m a emulsão de água e m óleo, o u polônias
(colônias de P C R ) e m u m f i l m e f i n o de gel de acrilamida. 7
C o m o a P C R p o d e detectar u m a única m o l é c u l a de seqüên-
cia-alvo, u m a pequena q u a n t i d a d e de c o n t a m i n a ç ã o e m u m a
amostra facilmente pode p r o d u z i r u m resultado falso-positivo. O
m a i o r p o t e n c i a l de c o n t a m i n a ç ã o v e m d o p r o d u t o da reação de
amplificação d e n o m i n a d o a m p l i c o n (usado em lugar de produto
de PCR). A p ó s a amplificação, cada m i s t u r a reacional pode conter
o equivalente a 100 bilhões de c ó p i a s / p L do a m p l i c o n . Portanto,
d i m i n u t a s gotículas de aerossol c o n t ê m mais alvo d o que o neces-
sário para u m s boa amplificação. O a m p l i c o n p o d e c o n t a m i n a r
reagentes, pipetas e v idr ar i a. E f á c i l t r a n s f o r m a r u m l a b o r a t ó r i o
em u m fiasco do D r . Seuss.14 Para evitar a c o n t a m i n a ç ã o p o r
a m p l i c o n , áreas fisicamente separadas para pré e pós-amplifica-
ção, pipetas c o m deslocamento positivo para m i n i m i z a r a conta-
m i n a ç ã o p o r aerossol e reagentes pré-aliquotados são freqüente-
m e n t e utilizados. O m o d o mais eficiente é não deixar o p r o d u t o
caracterização em t u b o fechado e l i m i n a m o risco de c o n t a m i n a -
ção p o r p r o d u t o . M e s m o c o m esses cuidados, u m c o n t r o l e nega-
t i v o o u b r a n c o (todos os reagentes menos o D N A - a l v o ) é u m dos
controles mais i m p o r t a n t e s da P C R .
A P C R é u m processo flexível e não requer ácido nucléico
altamente p u r i f i c a d o . N a prática, entretanto, as amostras clínicas
p o d e m c o n t e r quantidades imprevisíveis de impurezas que p o d e m
i n i b i r a atividade da polimerase. Para garantir u m a amplificação
confiável, algumas formas de p u r i f i c a ç ã o de ácido nucléico são
f r e q ü e n t e m e n t e usadas. A natureza idiossincrática dos i n i b i d o r e s
de P C R d e n t r o das amostras clínicas requer a prova de que a
amostra ( o u preparação do ácido nucléico p u r i f i c a d o a paTtiT
dela) p e r m i t i r á a amplificação. TJma seqüência de ácido nucléico-
c o n t r o l e , geralmente diferente d o alvo, p o d e ser adicionada à
amostra ( o u extraída da amostra). Falha e m a m p l i f i c a r esse con-
trole i n d i c a que purificação subseqüente da amostra é necessária
para remover i n i b i d o r e s da reação.
A P C R c o n v e n c i o n a l usa prímers que estão presentes em quan-
tidades iguais, g a r a n t i n d o , assim, que a m a i o r i a dos p r o d u t o s seja
a m p l i c o n dupla-fita. A PCíí assimétrica usa concentrações diferen-
tes dos dois primers para gerar mais u m a fita d o q u e outra. Por
exemplo, o uso do primer A a 0,5 p M e d o primer B a 0,005 p M
produz, p r i n c i p a l m e n t e , D N A f i t a simples estendida do prímer
mais abundante. Isso é ú t i l para fins de s e q ü e n c i a m e n t o o u para
fazer sondas de f i t a simples. O r e n d i m e n t o d o p r o d u t o , n o
e n t a n t o , p o d e ser baixo. C o m razões menos extremas (p. ex.,
primei A a 0,5 p,M e primer B a 0,2 p M ) , o r e n d i m e n t o é, na
m a i o r i a das vezes, preservado, c o m u m a fita sendo p r o d u z i d a em
excesso suficiente paTa torná-la mais d i s p o n í v e l à hibridização
c o m sonda.
U m o u t r o m é t o d o variante c h a m a d o PCR aleloespecífica
p e r m i t e a amplificação preferencial de u m alelo genético e m
relação ao o u t r o . A extremidade 3' de u m prímer é p o s i c i o n a d a

o
< N e m sempre é necessário amplificar a seqüència-alvo. E m vez de
cr
i—
c/)
O usam ácidos nucléicos para ampliar a detecção de sinal. O m é t o d o
s de D N A de cadeia ramificada ( b D N A ) é u m a dessas técnicas de
<
< uso c o m u m . A estratégia de b D N A hibridiza o ácido nucléico-alvo
é
D c o m m ú l t i p l a s sondas de captura afixadas em u m poço de u m a
D série de sondas "extensoras", "pré-amplificadoras" e amplificado-
o:
LU
Q_
s
LU
K TÉCNICAS DE DETECÇÃO
TEMPG (minutos)
Figura 17-11 PCR rápida melhora a especificidade do produto. As
amostras foram ciciadas 30 vezes através dos perfis A , B, C e D . M e l h o r
espedfícidade de amplificação de u m fragmento de P-globiria de 534 bp
é vista c o m ciclos mais rápidos ( C e D). (Reimpresso com permissão de
Eaton Associates.)
n o sítio p o l i m ó r f i c o e será p r o n t a m e n t e estendida apenas se ela
for t o t a l m e n t e c o m p l e m e n t a r ao alvo. Essa estratégia é usada para
d i s t i n g u i r u m gene de seus pseudogenes e para a genotipagem de
S N Ps. A P C R ale lo-es peei fica é t a m b é m u m m é t o d o c o m u m para
determinar haplótipos.
Métodos de Amplificação Baseados na
Transcrição
Os m é t o d o s de amplificação baseados na transcrição f o r a m
criados após a replicação dos retrovírus. Esses métodos são conhe-
cidos p o r vários nomes, i n c l u i n d o ensaios de amplificação
baseada na seqüência d o ácido n u c l é i c o ( N A S B A ) , de amplifica-
ção mediada p o r transcrição ( T M A ) e de replicação de seqüência
auto-sustentada (3SR). Eles a m p l i f i c a m seus alvos sem ciclagem
de temperatura (isotermicamente) e usam as atividades coletivas
de transcriptase reversa, RNase H e R N A polimerase. O m é t o d o
p o d e ser aplicado a alvos de R N A de f i t a simples o u de D N A
dupla-fita. U m a transcriptase Teversa é usada para sintetizar u m a
f i t a de c D N A a p a r t i r do m o l d e de R N A c o m u m primer que t e m
u m a seqüência p r o m o t o r a de R N A polimerase c o m o u m a cauda
Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 285
5'. A fica de R N A d o d u p l e x R N A / D N A é, então, digerida c o m
RNase H seguido pela síntese de D N A dupla-fita c o m u m primer
oposto. A seqüência p r o m o t o r a d o D N A dupla-fita transcreve,
então, m ú l t i p l a s cópias de R N A f i t a simples pela R N A p o l i m e -
rase) c o m p l e t a n d o o ciclo. C o m o na P C R , todos os reagentes
p o d e m ser i n c l u í d o s em u m a m i s t u r a e a amplificação é expo-
n e n c i a l c o m a conclusão em m e n o s de u m a h o r a . O m é t o d o é
p a r t i c u l a r m e n t e vantajoso q u a n d o o alvo é o R N A (p. ex., H I V
e vírus da hepatite C ( H C V ) na análise de ácido nucléico de
b a n c o de sangue).
Amplificação de Sinal de Cadeia Ramificada
aumentar a concentração do alvo, técnicas de amplificação de sinal
placa de microtitulaçâo. E m seguida é feita a hibridização c o m u m a
ras. A ú l t i m a sonda amplificadora altamente ramificada i n c l u i
múltiplas cópias de enzimas geradoras de sinal que atuam em u m
substrato q u i m i o l u m i n e s c e n t e para produzir luz.
O diagnóstico m o l e c u l a r depende t a n t o de m é t o d o s de detecção
genéricos q u a n t o específicos de ácidos nucléicos. As técnicas
genéricas m e d e m a q u a n t i d a d e total de ácido nucléico, e n q u a n t o
as técnicas específicas m e d e m u m a seqüência particular, freqüen-
temente pelo uso de sondas de ácido nucléico.
Para m e d i r o u visualizar a q u a n t i d a d e t o t a l de ácido n u c l é i c o ,
duas abordagens são c o m u m e n t e usadas: absorvância de ultravio-
leta e coloração c o m corantes fluorescentes A s moléculas de
ácido nucléico absorvem luz u l t r a v i o l e t a a 2 6 0 n m , u m a proprie-
dade que é c o m u m e n t e usada para m e d i r o c o n t e ú d o de ácido
nucléico de u m a solução. Se u m a preparação de D N A d u p l a - f i t a
é p u r a , u m a solução de 5 0 m g / L t e m u m a absorvância de 1,0 a
2 6 0 n m A pureza de u m a solução de ácido nucléico p o d e ser
estimada p o r sua razão de absorvância a 2 6 0 e 2 8 0 n m (razão
260:280). A o c o n t r á r i o dos ácidos nucléicos, as proteínas t ê m o
m á x i m o de absorção a 280 n m . U m a preparação p u r a de ácido
nucléico geralmente t e m u m razão 2 6 0 : 2 8 0 de 1,7 a 2,0.
E m b o r a as medidas de absorvância sejam simples e precisas,
elas não são sensíveis. Os corantes fluorescentes que se ligam ao
ácido nucléico são 1.000 a 10.000 vezes mais sensíveis do que as
medidas de absorvância. O exemplo mais b e m c o n h e c i d o de u m
corante de ácido nucléico é o b r o m e t o de etídeo, u m corante
intercalante de D N A dupla-fita, p o s i t i v a m e n t e carregado. Os
corantes de cianina, tais c o m o S Y B R G r e e n I, são t a m b é m coran-
tes populares dos ácidos nucléicos p o r q u e eles não f l u o r e s c e m a
menos que estejam ligadas a ácidos nucléicos, f o r n e c e n d o , assim,
u m background m u i t o baixo. C o m a óptica apropriada, moléculas
únicas de D N A p o d e m ser visualizadas c o m corantes de ácidos
nucléicos baseados em cianina. 8 O s corantes de ácido nucléico
p o d e m detectar D N A em géis o u em solução (tal c o m o na P C R
e m t e m p o real).
A absorvância de ultravioleta e os corantes fluorescentes não
detectam, especificamente, diferentes seqüências de ácidos
nucléicos (isto é, eles não são seqüência-específicos). A especifi-
cidade das análises de ácido n u c l é i c o é f o r n e c i d a p o r hibridização
das fitas complementares, geralmente entre u m a fita-alvo na
amostra e u m a sonda f o r n e c i d a pelo ensaio. Os marcadores de
detecção p o d e m estar covalentemente ligados o u i n c o r p o r a d o s
nas sondas de ácido n u c l é i c o . A s p r i m e i r a s sondas usadas na
286 PARTE IV Analitos
detecção de ácido nucléico e r a m marcadas radioativa mente. As
sondas radioativas, raramente usadas nos dias de hoje em ensaios
clínicos, t ê m sido substituídas p o r indicadores q u i m i o l u m i n e s -
centes, c o l o r i m é t r i c o s o u fluorescentes. M u i t o s marcadores f l u o -
rescentes estão disponíveis, p e r m i t i n d o a m u l t i p l i c i d a d e de cores
para aplicações em s e q ü e n c i a m e n t o de D N A , análise de t a m a n h o
de f r a g m e n t o , arranjos de D N A e P C R e m t e m p o real (todos
revisados p o s t e r i o r m e n t e neste capítulo). Técnicas i n c l u i n d o
polarização de fluorescência, transferência de energia p o r resso-
n â n c i a de fluorescência ( F R E T ) e supressão de fluorescência
(fluorescence L{uenching) p o d e m forneceT especificidade de detecção
adicional. A polarização de fluorescência p o d e ser usada para
d i s t i n g u i r marcador livre do ligado, caso a rotação m o l e c u l a r da
sonda se altere c o m a ligação. A rotação molecular depende,
p r i n c i p a l m e n t e , d o t a m a n h o da molécula, de f o r m a que a ligação d a m e n t e através do p o l í m e r o d o que as maiores (Figura 17-12).
de u m a sonda pequena a u m alvo grande resulta em u m a u m e n t o
de polarização que p o d e ser m e d i d o . As técnicas de F R E T depen-
d e m da distância entre dois marcadores fluorescentes espectral-
m e n t e distintos. O s dois marcadores o u são aproximados através
da hibridização, o u t e r m i n a m ainda mais afastados, através de
clivagem h i d r o l i t i c a de u m a sonda d u p l a m e n t e marcada. Final-
m e n t e , a supressão o u o a u m e n t o de fluorescência p o d e ocorrer
c o m a hibridização de u m o l i g o n u c l e o t i d e o fluorescente c o m seu
alvo. O efeito depende do corante fluorescente específico e a
supressão inerente de resíduos G n o alvo e / o u na sonda. A l t e r -
nativamente, u m a parte da supressão (íjuencfimg) p o d e ser pTopo-
sitalmente i n c o r p o r a d a n a sonda.
TÉCNICAS DE DISCRIMINAÇÃO
U m a variedade de técnicas é usada paia d i s c r i m i n a r diferentes
ácidos nucléicos. A separação p o r t a m a n h o através de u m a m a t r i z
de gel em presença de u m c a m p o elétrico (eletroforese) talvez seja
MW (pb)
5,000-
4,000 -
3,000-
2,000-
1,500-
1,250-
1,000-
750"
500 -
Figura 17-12 Uma fotografia de vários fragmentos de D N A após
eletroforese em gel de agarose ( 1 % w / v , gel de agarose SeaKem LE)
mostrando a separação das moléculas de D N A dupla-fita por tamanho.
( A fotografia é cortesia de Lonza Rockland, Inc., Rockland, Me.)
a mais c o m u m . Sondas de oligonucleotídeos complementares são
f r e q ü e n t e m e n t e i n c o r p o r a d a s nos ensaios moleculares para dis-
c r i m i n a r diferentes seqüências p o r hibridização. F i n a l m e n t e , a
P C R e m t e m p o real e a análise de desnaturação estão e m e r g i n d o
c o m o técnicas de t u b o fechado, simples, que se e n q u a d r a m b e m
às necessidades do l a b o r a t ó r i o clínico.
Eletroforese
T a n t o o D N A q u a n t o o R N A são carregados negativamente e
migrarão e m direção ao eletrodo positivamente carregado. A
separação de diferentes ácidos nucléicos ocorTe q u a n d o se p e r m i t e
que as misturas m i g r e m através de u m a m a t r i z de p o l í m e r o sob
u m campo elétrico. A separação se baseia, p r i n c i p a l m e n t e , no
peso molecular, c o m as moléculas menores m i g r a n d o mais rapi-
Q u a n d o moléculas grandes (> 5 0 kb) t ê m de ser separadas,
empregam-se campos elétricos pulsados para ajudar a movê-las
através da matriz do p o l í m e r o . A separação t a m b é m ocorre c o m
base na c o n f o r m a ç ã o física o u f o r m a da molécula. Por exemplo,
moléculas de fitas simples p o d e m se enovelar em estruturas
secundárias, e moléculas dupla-fita p o d e m f o r m a r estruturas
heterodúplices, nícked (apenas u m a f i t a clivada) e circulares super-
hélices. A separação baseada na f o r m a p o d e fornecer informações
úteis, mas pode, t a m b é m , c o n f u n d i r a análise baseada em
t a m a n h o . Por exemplo, c o m o o R N A geralmente t e m u m alto
grau de estrutura secundária, a eletroforese de R N A geralmente
é realizada sob condições desnaturantes para destruir essas estru-
turas. A eletroforese de D N A é realizada sob condições não-des-
naturantes, ou desnaturantes d e p e n d e n d o da aplicação.
Agarose e fioiiacritaniida são os dois tipos de p o l í m e r o s c o m u -
m e n t e usados e m eletroforese. U m gel de agarose p o d e separar
fragmentos de ácido nucléico tão pequenos q u a n t o 20 bp, até
mais de 10 M b (10.000 kb), i n c l u i n d o cromossomos de leveduras,
fungos e parasitos. E n t r e t a n t o , a resolução de separações em
agarose é geralmente l i m i t a d a a u m a diferença de t a m a n h o de
2 % a 5 % . Os p o l í m e r o s de poliacTilamida são adequados à sepa-
ração de alta resolução (até cerca de 0 , 1 % de diferenças de
t a m a n h o ) de moléculas pequenas (até cerca de 2 kb), e são usados
no seqüenciamento de D N A .
A eletroforese é usada e m m u i t o s métodos de discriminação
de ácidos nucléicos. A análise direta dos p r o d u t o s de P C R p o r
eletroforese pode ter valor diagnóstico (p. ex., a presença de u m a
bactéria, u m vírus o u u m f u n g o em uma amostra). M u i t a s alte-
rações n o D N A h u m a n o são inserções de seqüências, deleções,
rearranjos e mudanças n o n ú m e r o de seqüências de repetição.
Se essas alterações se e n c o n t r a m d e n t r o de u m f r a g m e n t o que
p o d e ser f i e l m e n t e a m p l i f i c a d o p o r P C R , então essas variações
de t a m a n h o t a m b é m p o d e m ser d i r e t a m e n t e detectadas p o r ele-
troforese. M e s m o q u a n d o a variação não altera o t a m a n h o do
p r o d u t o de P C R (p. ex., SNPs), as enzimas de restrição p o d e m
ser f r e q ü e n t e m e n t e utilizadas para revelar p o l i m o r f i s m o s de
c o m p r i m e n t o de f r a g m e n t o s de restrição (RFLPs). N a P C R /
RFLP, os p r o d u t o s de P C R são digeridos c o m u m a o u mais
enzimas de restrição e analisados p o r eletroforese. Por exemplo,
se u m a amostra t e m u m a mutação q u e destrói u m sítio de reco-
n h e c i m e n t o da enzima, esta p o d e ser d i s t i n g u i d a de u m a amostTa
que não t e m a m u t a ç ã o . T a l ensaio p r o d u z i r á u m f r a g m e n t a de
P C R não-cortado q u a n d o a mutação estiver presente, e dois
fragmentos menores q u a n d o a m u t a ç ã o estiver ausente (Figura
17-13). Se a mutação estiver presente e m heterozigose ( u m a cópia
de D N A n o r m a l e u m a m u t a n t e ) , então u m f r a g m e n t o longo e
dois menores serão observados.
E m c o m b i n a ç ã o c o m a eletroforese, a ligação de sonda de
o l i g o n u c l e o t i d e o p o d e ser usada para analisar, s i m u l t a n e a m e n t e ,

Sítio de clivagem da
endonuelease de restrição
Primer de PCR
Gene normal
Primer de PCR
Gene mutado
Nenhuma clivagem
Resultado da Eletroforese
Normal Mutante Heterozigoio
M W (bp)
300
200 -
100 -
Figura 17-13 Exemplo de PCR-RFLP. U m fragmento de D N A
amplificado p o r PCR carrega u m sítio (unia seqüência única geralmente
com quatro o u mais bases) que é reconhecido e clivado por uma
endonuelease de restrição. Se uma mutação está presente, esse sítio é
alterado e não é mais reconhecido pela enzima. A eletroforese revela
que o fragmento de uma amostra normal foi de fato cortado pela
enzima, gerando dois fragmentos menores que o tamanho original,
enquanto o fragmento de u m mutante homozigoto não foi cortado e o
tamanho original do amplicon é preservado. E m u m mutante
heterozigoto, tanto o fragmento original quanto os fragmentos menores
são visíveis.
m u i t o s loa genéticos diferentes. E m cada locus, duas sondas de
oligonucleotídeos são hibridizadas a seqüências adjacentes d o
D N A - a l v o , e a D N A ligase liga de f o r m a covalente as duas sondas
somente se ambas estiverem p e r f e i t a m e n t e hibridizadas ao alvo.
Se as sondas diferentes são projetadas para terem mobilidades
eletroforéticas diferentes, m u i t o s ioci p o d e m ser detectados em
u m a c o r r i d a eletroforética. Para genotipagem de m ú l t i p l o s SNPs,
as sondas de cada alelo são incluídas e a ligação é realizada após
amplificação p o r P C R m u l t i p l e x . A ligação t a m b é m pode ser
usada para estimar o n ú m e r o relativo de cópias de m u i t o s loci
diferentes, p o r exemplo, rastreamento de deleções o u duplicações
de m ú l t i p l o s éxons d e n t r o de u m gene. Neste caso, a ligação é
realizada antes da P C R c o m sondas que i n c l u e m seqüências
c o m u n s que servem c o m o primers de P C R em u m a amplificação
multiplex com sonda dependente de ligação*3 ( M P L À ) . E m ambos os
casos, os p r o d u t o s de ligação são separados em géis de poliacri-
l a m i d a de alta resolução e m presença de padrões de t a m a n h o
marcados, s i m i l a r ao seqüenciamento.
N o seqüenciamento de D N A , a seqüência exata de ácido
nucléico de u n i fragmento de D N A é d e t e r m i n a d a c o m taxas de
erros de a p r o x i m a d a m e n t e 0 , 1 % (uma base i d e n t i f i c a d a errada
e m 1.000). F r e q ü e n t e m e n t e a seqüência é analisada em ambas as
fitas (senso e anti-senso), o que fornece u m a acurácia ainda
maior. Alterações de bases que resultam em u m código de ami-
n o á c i d o alterado, códons de parada, deleções o u inserções p o d e m
ser identificadas. A estratégia de seqüenciamento mais c o m u m
usa P C R n a p r i m e i r a etapa para a m p l i f i c a r a região de interesse,
Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 287
Amplicon de PCR
Desnaturar fitas
• Hibridizar com primer específico
primer
-TCATTCACCCTGGAC....
Adicionar DNA polimerase, mistura de
nucleotídeos (dNTP) e didesaxinucleotí-
deos terminadores marcados (ddA,
d d G , d d T e ddC)
Extensão de primer e terminação
primer - > A G T A A G T G G G A C C T G.
—T C A T T C A Ç Ç Ç T G G A C.
r
ddA
ddG
c
La.
C_ ddT
ddC
Figura 17-14 Reação de terminação de cadeia (Sanger). U m
amplicon de PCR é desnaturado c, então, hibridizado a u m primer
oligonucleotideo especifico- A medida que a D N A polimerase estende o
primer por incorporação de bases (dNTPs) complementares ao molde,
ocasionalmente ela incorpora u m análogo de base terminador (ddA,
ddG, d d T ou ddC) que interrompe a extensão seguinte. O resultado é
uma mistura de produtos estendidos c o m tamanhos variados Cada base
ter m i n adora pode ser marcada com u m dos quatro diferentes
marcadores fluorescentes (mostrados como diferentes símbolos no
diagrama). Alternativamente, o primer pode carregar quatro diferentes
marcadores fluorescentes nas reações individuais de terminação de
cadeia (contendo somente u m ddNTP) realizadas em tubos separados.
O procedimento original incorporava u m d N T P radioativo durante a
extensão, permitindo a detecção monocromática dos fragmentos
truncados que eram analisados por eletroforese em quatro pistas
separadas, cada uma para uma das bases terminador as (Figura 17-15).
seguida de u m a variação da reação de t e r m i n a ç ã o de cadeia
desenvolvida p o r F. Sanger, n o f i n a l dos anos 1970." Essa reação
( t a m b é m d e n o m i n a d a reação de Sanger) gera fragmentos que são
t e r m i n a d o s em diversos c o m p r i m e n t o s pela i n c o r p o r a ç ã o de u m
dos quatro didesoxinucleotídeos, análogos de bases, d u r a n t e a
extensão a p a r t i r de u m primer de seqüenciamento (Figura 17-14).
O m é t o d o mais c o m u m para gerar esses fragmentos completos é
o seqüenciamento em ciclo, r e p e t i n d o as etapas de a n e l a m e n t o ,
extensão e t e r m i n a ç ã o de cadeia e desnaturação p o r ciclagem de
temperatura, similar à P C R . Os fragmentos gerados são marcados
c o m u m corante fluorescente (pelo uso de primers marcados o u
didesoxinucleotídeos terminadores marcados), separados, então,
p o r eletroforese em gel de p o l i a c r i l a m i d a desnaturante o u capilar,
e identificados p o r detecção de fluorescência à m e d i d a que os
fragmentos passam pelo detector (Figura 17-15). O seqüencia-
288 PARTE IV Analitos

Homozigoto (referência)
A G T A A G T

<3 I- O
•O T3
"O T3

1
Homozigoto (mutante)
A G T A A G C G G G A C
G
T
C
c
A
G
G
G
T Heterozigoto (mutante)
G A G 7 A A G Y G G A C
A ia a a
A aa•
T
G
A

Seqüenciamento
Seqüenciamento com quatro Leitura do seqüenciamento automático
com uma cor cores

Figura 17-15 Esquema d o s e q ü e n c i a m e n t o de D N A . Os p r o d u t o s de extensão gerados pela reação de

t e r m i n a ç ã o de cadeia (Sanger) são separados usando q u a t r o pistas (se s o m e n t e u m m a r c a d o r é usado), o u usando
u m a pista (se corantes de tons diferentes são usados para cada u m a das reações c o m terminadores). A estratégia
c o m q u a t r o cores é adequada à detecção a u t o m a t i z a d a da fluorescência resultante (mostrada p e l o i c o n e de o l h o )
t a n t o para eletroforese e m gel q u a n t o para eletroforese capilar. A direção da migração d o f r a g m e n t o é d o t o p o
para a base. A seqüência é lida da base para o t o p o dos géis, e da esquerda para a d i r e i t a d a seqüência
automática. São mostrados os exemplos de u m a amostra de referência ( h o m o z i g o t o T n c sítio p o l i m ó r f i c o ) , u m a
a m o s t T a m u t a n t e ( h o m o z i g o t o C ) e u m a amostra m u t a n t e heterozigota ( T e C).

mento de D N A no laboratório clinico é mais comumente usado
na análise de doenças infecciosas, tais como genotipagem de H I V
quanto à resistência a drogas e de H C V para estabelecer prognós-
tico e tratamento apropriados.
O minisseqüenciamento, também conhecido como extensão
de primer de uma única base o u extensão de u m único nucleotí-
deo (SNE), identifica a seqüência de bases p r ó x i m a a u m primet
de oligonucleotideo. Q u a n d o hibridizado ao p r o d u t o de PCR
fita simples, a extensão enzimática do primer em presença de
terminadores de didesoxinucleotídeos marcados identifica a base
incorporada. Os ensaios de SNE podem ser do tipo multiplex
em seqüenciadores automáticos de D N A , variando-se os compri-
mentos dos primers de forma que o SNP seja resolvido pelo
t a m a n h o em uma corrida eletroforétíca. Os ensaios de extensão
também p o d e m ser detectados por detecção colorimétrica em
placas de microtitulação, sistemas de detecção de captura do
p r o d u t o em microarranjos de D N A , ensaios de hibridização em
esfera detectados por cítometria de fluxo, polarização de fluores-
cência baseada em solução e espectrometria de massa.
Avanços técnicos recentes permitem o seqüenciamento de
u m genoma bacteriano inteiro em uma única operação. A ampli-
ficação paralela intensa em folônias (colônias de PCR) microscó-
picas o u gotículas de emulsão 6 é seguida por reações de extensão
que são observadas com fluorescência ou jjirosse^üenciíimÉTitci. O
pirosseqüenciamento, o u o seqüenciamento por síntese, não
requer eletroforese. E m vez disso, os dNTPs são adicionados, u m
de cada vez, a u m molde iniciado e as adições bem-sucedidas são
monitoradas por luminescência.
Q u a n d o uma alteração de D N A cobre uma região grande que
não é facilmente amplificada por PCR, a análise por Southern
blot pode ser usada para detectar a alteração. N o Southzm bfotting
a amostra de D N A original (em lugar de u m fragmento amplifi-
cado) é digerida por uma endonuclease de restrição, separada por
eletroforese em agarose, e transferida para u m suporte sólido
seguida por visualização seletiva dos fragmentos por hibridização
com sondas marcadas. A análise de Southern blot revela polimor-
fismos na seqüência de D N A baseada no perfil RFLP tornado
visível pelas sondas. Ela também pode detectar alterações estru-
turais grandes, tais como deleções, duplicações, inserções e rear-
ranjos. O Southern fclotting é trabalhoso e muito mais demorado
do que a PCR. Norcfiern biotting é uma técnica análoga que usa
R N A em lugar de D N A .
Hibridização
A hibridização de ácidas nucléicos fita simples para formar híbri-
dos dupla-fita específicos fornece u m nível m u i t o alto de discri-
minação. O processo requer (1) que a sonda e os ácidos nucléicos-
alvo sejam misturados sob condições que permitam o pareamento
específico de bases complementares e (2) que exista u m método
 Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 289

para detectar quaisquer ácidos nucléicos dupla-fita resultantes.
U m a s o n d a é u m ácido nucléico cuja i d e n t i d a d e é conhecida, e
alvo o u amostra é u m ácido n u c l é i c o cuja i d e n t i d a d e o u abundân-
cia é revelada pela hibridização. E m u m ensaio de hibridização,
a sonda é análoga e m sua f u n ç ã o e i m p o r t â n c i a ao a n t i c o i p o em
u m i m u n o e n s a i o . C o m o anticorpos nos imunoensaios, as sondas
p o d e m ser não marcadas o u marcadas c o m u m a das i n ú m e r a s
moléculas reveladoras, d e p e n d e n d o da técnica usada para detec-
tar a hibridização. As sondas p o d e m ser clonadas ( r e c o m b i n a n -
tes), geiadas p o r P C R , o u sintetizadas (oligonucleotídeos). Elas
p o d e m ser D N A o u R N A , e f i t a simples o u dupla-fita.
As reações de hibridização p o d e m ser divididas em duas
grandes categorias: fase sólida, n a qual a sonda o u o alvo é preso
a u m suporte sólido e n q u a n t o o o u t r o está em solução, e h i b i i d i -
zações em fase liquida, na q u a l ambos estão em solução. U m tanto
surpreendente é o fato de os ácidos nucléicos ligados à matriz
sólida p o d e r e m ainda se ligar a ácidos nucléicos complementares.
Os ensaios e m fase sólida são úteis p o r q u e amostras m ú l t i p l a s
p o d e m ser processadas juntas, f a c i l i t a n d o o controle, a lavagem e
os p r o c e d i m e n t o s de separação. A hibridização e m suporte sólido
é, n o entanto, menos eficiente d o que a hibridização em solução,
e as cinéticas são mais lentas e mais difíceis de se predizer. A m b o s
os ensaios, em fase sólida e em fase l í q u i d a , são usados rotineira-
m e n t e em l a b o r a t ó r i o clínico. Os ensaios e m fase sólida i n c l u e m
dot fclots, sondas alinhadas, arranjos, hibridização in si tu para amos-
tras de tecido, e Southern e Northern blotiing.
Os ensaios de h i b r i d i z a ç ã o e m m e m b r a n a s são conhecidos
c o m o dot híots o u line probes, d e p e n d e n d o da geometria das
manchas i n d i v i d u a i s . A m e m b r a n a é i n c u b a d a c o m ácido n u c l é i c o
c o m p l e m e n t a r a u m a t e m p e r a t u r a constante, seguido p o r u m a
o u mais lavagens para d i s c r i m i n a r o ácido nucléico h i b r i d i z a d o
do n ã o - h i b r i d i z a d o . O m é t o d o p e r m i t e que m ú l t i p l a s hibridiza-
ções de sonda-alvo sejam realizadas s i m u l t a n e a m e n t e sob c o n d i -
cões idênticas. Os resultados de u m ensaio de dot blot o u de line

Excitaçaa
Teste Refeiência Laser 2
Laser 1

Transcrição
reversa

Marcar com
corantes
fluorescentes

V - Monocromo

H Vermelho
G Verde
Y Amarelo
Cor
^ £ * 5 l = H s 5j ! i I s s| í ; i ü

Hibridizar com
o microarranjc
J
Combinado

T
Análise por
computador

Figura 17-16 Experimento de microananjo com duas cores U m ananjo de clones de D N A afixado em uma
lâmina de vidro. Os R N As mensageiros nas amostras-teste e referência são convertidos em c D N A difetencialmente
marcados por transcrição reversa e incorporação de dois corantes fluorescentes diferentes. As duas amostras são
hibndizadas juntas n o arranjo. O arranjo é lavado e a imagem é capturada duas vezes, cada uma com u m Use? de u m
comprimento de onda que excita u m dos corantes, mas não o outro. As imagens monocromáticas são, então,
convertidas a duas cores (verde para a amostra-teste [G] e vermelho para a referência [R]), e as imagens são combinadas.
Se a quantidade de c D N A é a mesma em cada uma das duas amostras, então a mancha composta será mostrada como
amarelo [Y]. Se uma está em maior abundância, então aquela cor será preservada. Regulações positiva (wf>regMÍ£ttioTi) ou
negativa (íiownTegulation) da expressão gêmea são, então, analisadas por programa de computador.
290 PARTE IV Analitos
prabe geralmente são qualitativos: caso a hibridização tenha ocor-
rido, u m sinal é gerado na mancha especificada e uma interpre-
tação simples de sim ou não é dada.
Os microarranjos (também chamados arranjos de D N A ou
chips de D N A ) com milhares de manchas de hibridização peque-
nas foram introduzidos em meados dos anos 1990.11 Os micro-
arranjos requerem equipamentos de detecção especializados,
programa de computador e informática para analisar os dados.
Eles são construídos em superfícies sólidas (geralmente em vidro,
mas algumas vezes em outros suportes, tais como blocos de gel
ou superfícies cobertas com ouro) por síntese in situ de oligo-
nucleotídeos ou por posicionamento físico das sondas com a
ajuda de equipamento de arranjo robótico ou de impressão ele-
trônica. Por causa de sua expressiva capacidade paralela, os micro-
arranjos têm atraído enorme interesse entre os pesquisadores que
querem monitorar o genoma inteiro para (1) identificação de
polimorfismos e mutações de seqüência e (2) quantificação de
expressão gênica. U m exemplo de u m microarranjo de duas cotes
para expressão gênica é mostrado na Figura 17-16. Estudar a
expressão gênica em tumores pode levar à descoberta de novos
marcadores de diagnóstico o u prognóstico e de novos alvos tera-
pêuticos. A promessa dos microarranjos é acompanhada por
desafios, incluindo a necessidade de requerimentos estritos de
controles e de bom desenho experimental.
Seguindo o advento dos microarranjos de alta densidade, os
arranjos de densidade menor foram introduzidos, sendo capazes
de processar ainda mais reações de hibridização do que os forma-
tos clássicos de dot blot ou de line probe.
Algumas vezes chamadas arranjos de densidade média, essas
ferramentas estão emergindo no laboratório clínico para doenças
genéticas, oncologia e farmarogenética para analisar amostras
quanto a múltiplas mutações. Muitas companhias estão envolvidas
no fornecimento de sistemas de microarranjo e de arranjo de
densidade média, e a indústria está mudando rapidamente. Os
arranjos não precisam estar presos a uma superfície bidimensional,
desde que seus "endereços" possam ser decodificados. Por exemplo,
microesferas podem ser codificadas por intensidade de fluorescên-
cia era dois canais diferentes, e n q u a n t o a fluorescência em um
Detecção
Quantificação
10 20 30 70
Ciclos
Amplificação
10
Tempo (minutos)
terceiro canal monitora a hibridização. Todos os canais podem ser
lidos simultaneamente utilizando-se u m citômetro de fluxo.
A hibridização in situ é u m cipo especializado de ensaio de
suporte sólido no qual tecidos morfologicamente intactos, células
ou cromossomos afixados a uma lâmina de vidro fornecem a
matriz para a hibridização. O processo é análogo à ímunoistoquí-
mica, exceto pelos ácidos nucléicos serem usados como sondas
em lugar de anticorpos. A força do método conta com a ligação
entre a avaliação morfológica e a detecção de seqüências especí-
ficas de ácido nucléico. Quando sondas fluorescentes são aplica-
das a esfregaços de cromossomos metafásicos ou núcleo interfá-
sico, a técnica é chamada hibridização in situ fluorescente ou
FISH. A detecção de aberrações numéricas ou translocações de
cromossomos pode ser rapidamente atingida. F I S H também
pode estar combinada com imunoistoquímica, de forma que a
informação a respeito tanto de quantidade de expressão de pro-
teína quanto de dosagem gênica pode seT obtida na mesma
lâmina.
PCR em Tempo Real
N a PCR em tempo real, os dados são coletados durante a ampli-
ficação do ácido nucléico e não em u m único ponto final (Figura
17-17). A hibridização em solução é combinada com amplifica-
ção, detecção e quantificação, todas no mesmo tubo. Esses
ensaios em tubo fechado e em tempo real não requerem quais-
quer adições, lavagens ou etapas de separação. A técnica usa
moléculas reveladoras fluorescentes e instrumentação, que regis-
tra a fluorescência durante a ciclagem térmica. Os dados obtidos
fornecem informação sobre identidade, quantidade e seqüência
da amostra de ácido nucléico. Os corantes ou sondas fluorescen-
tes capazes de sinalizar a quantidade relativa de D N A são adicio-
nados à mistura de PCR antes da amplificação. O mesmo tubo
de reação é usado pata amplificação e monitoramento de fluo-
rescência, e não existem transferências de amostra, adições de
reagente ou etapas de separação em gel, eliminando, assim, o
risco de contaminação de produto nas reações subseqüentes.
C o m o ü processo é simples e rápido, a PCR em tempo real está
• Identificação Figura 17-17 Monitoramento em
do Produto tempo real durante a amplificação e a
• Identificação análise da desnaturação. O painel inferior
do Alelo mostra u m perfil de temperatura de um
ciclo rápido Hpico que é seguido por uma
rampa da temperatura para análise de
desnaturação. Quando a fluorescência é
monitorada durante a amplificação, uma
ao 90
Temperatura , °C) vez a cada ciclo (iiíitas pontilhadas), ela
fornece informação sobre a presença o u
ausência de seqüências-alvo específicas,
permitindo a quantificação do alvo.
Análise de desnaturação Q u a n d o a fluorescência é continuamente
monitorada através da fase de desnaturação
{área sombreada), ela pode fornecer
informação que verifique a identificação do
alvo ou estabeleça o genótipo. (Modificado
com permissão do editor de W i t t w e r CT,
Kusukawa N . Real-time PCR. In: Persing
D H , Tenover FC, Versalovic ], Tang Y W ,
Unger ER, Relman D A , W h i t e TJ, eds.
Molecular microbiology: diagnosric
30 principies and practice, Washington, D C :
15
A S M Press, 2004:71-84.)
 Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 291

substituindo muitas técnicas convencionais no laboratório
clínico.
A PCR em tempo real usa corantes fluorescentes como SYBR
Green I, que cora o D N A dupla-fita produzido durante a ampli-
ficação, ou sondas marcadas com fluorescência, que hibridizam
com produto fita simples. Se o DNA-alvo estiver presente, a
fluorescência aumentará. O momento, durante a PCR, no qual
se começa a ver u m sinal depende da quantidade inicial do D N A -
alvo, e isso fornece u m método sistemático de quantificação.
A l é m disso, quando a fluorescência é monitorada continua-
mente, à medida que a temperatura é elevada uma curva de
desnaturação pode ser gerada. Freqüentemente a primeira deri-
vada dessa curva de desnaturação é plotada para ajudar visual-
mente uma pessoa a determinar a posição da temperatura de
desnaturação A análise de desnaturação pode ser usada para
verificar a identidade do produto amplificado e para detectar
variantes de seqüência tão baixas quanto às de uma única base.
PCR em tempo real e análise de desnaturação podem ser consi-
deradas como ensaios de hibridização "dinâmicos", nos quais a
formação ou a dissociação do duplex sonda-alvo (ou produto
duplex) é monitorada em tempo real.
O uso de sondas fluorescentes na PCR fornece u m nível a
mais de especificidade do processo. Sondas fluorescentes que
hibridizam com produtos de P C R durante a amplificação alteram
a fluorescência por dois possíveis mecanismos: (1) uma ligação
covalente entre dois corantes é quebrada por hidrólise, ou (2) a
alteração de fluorescência segue a hibridização reversível da
sonda com o alvo. De acordo com essa diferença, quando uma
ligação covalente irreversível está envolvida as sondas são chama-
das .sondas de hidrólise. Q u a n d o as sondas m u d a m de forma rever-
sível, a fluorescência na formação do duplex, elas são chamadas
sondas de hibridização. U m a diferença importante entre dois tipos
de sonda é que a análise de desnaturação é possível com sondas
de hibridização, mas não com sondas que tenham sido hidroli-
sadas. Quando a fluorescência é monitorada uma vez a cada ciclo
em presença de SYBR Green I, observa-se a curva em forma de
S esperada (Figura 17-18). N o entanto, com as sondas de hidró-
lise, a fluorescência é cumulativa e continua a aumentar mesmo
após a quantidade de p r o d u t o atingir u m platô. Por outro lado,
reações monitoradas com sondas de hibridização podem mostrar
u m decréscimo na fluorescência em u m número alto de ciclos.
Apesar dessas diferenças, todos esses métodos podem ser usados
para detecção e quantificação. A detecção multiplex (múltiplas) é
possível com sondas que são marcadas com corantes de tonalida-
des diferentes ou com sondas que tenham temperaturas de des-
naturação distintas.
U m sinal fluorescente que aumenta durante a PCR e segue
uma das formas de curva esperadas sugere que o alvo específico
está presente e foi amplificado. A o contrário, u m sinal que per-
manece nos níveis iniciais mesmo após 40 a mais de .50 ciclos de
PCR sugeTe que o alvo está ausente e que nenhuma amplificação
ocorreu. A análise de desnaturação pode ser usada para verificar
a amplificação do produto esperado pela temperatura de desna-
turação (Tm) de uma sonda ou do produto se o sinal fluorescente
for reversível. Exemplos no laboratório clínico incluem multipli-
cidade de sondas para detectar a presença de mais de u m orga-
nismo infeccioso ou para discriminar u m molde de controle
interno do alvo.
A PCR em tempo real oferece uma abordagem conveniente
e sistemática de quantificação por m o n i t o r a i a quantidade de
p r o d u t o a cada ciclo. U m a de suas vantagens é sua grande faixa
dinâmica. A Figura 17-19 mostra u m a faixa estendida de calibra-
dores externos em uma PCR em tempo real típica. A medida que
a concentração inicial do molde aumenta, as curvas m u d a m para

Especificidade = Primer Especificidade = Seqüência Interna

Corante do dsDNA Hidrólise da Sonda Hibridização da Sonda

A fluorescência aumenta O sinal do fluoróforo é liberado A fluorescência aumenta por
quando o corante se liga ao de seu quencher (supressor) transferência de energia de
produto de DNA dupla-fita per hidrólise da sonda ressonância, quando as sondas
hibridizam com o produto

Monitora-
mento de
Cada Ciclo
de PCR

Ciclo Ciclo Ciclo

do Produto
;*\Tr i üü S u m i a
Monitora- \\> «

mento
Contínuo \
da PCR u x \

Temperatura (°C) Temperatura (°C) Temperatura (°C)

Figura 17-18 M o n i t o r a m e n t o em tempo real. A linha superior mostra os dados coletados uma vez a cada
ciclo de PCR, e a linha inferior mostra os dados coletados continuamente (cinco vezes por segundo) durante
todos os ciclos de PCR. Três diferentes sistema identificadores são mostrados (Modificado com permissão do
editor de Wittwer CT, Kusukawa N. Real-time PCR, In: Persing DH, Tenover FC, Versalovic ], Tang YW, IJnger
ER, Relman D A , W h i t e TJ, eds. Molecular microbiology: diagnostic principies and practice, Washington, D C :
A S M Press, 2004:71-84.)
292 PARTE IV Analitos

1.2"
A— ioio
o— 10®
1.0-
-o— 10 a
U •
o— 107
2 0.8 f
O -1— 10*
C

» 105
w 0.6

//
$ • - 10 4
b
9 Mn -»— 103
i s ~
• - 10 2
JN 7 i t 1
0 2 A— 10 1
' l 7 r •/ J f • / y — 1
A • p J" > y j f jA
n i i f l f V r f í Y i i I n í t t i » « t f í i t T • ** — o

Figura 17-19 Quantificação por PCR em tempo real. São

mostradas as curvas em tempo real típicas das reações de
amplificação de concentrações variáveis de alvo inicial (painel
A), e o log da concentração inicial plotada contra o número de
ciclos no qual o sinal aumenta acima do valor basal (painel B).
(Modificado com permissão do editor de Wíttwer CT,
Kusukawa Kl. Real-timc PCR. In: Persing D H , Tenover FC,
VeTsalovic J, Tang YW, Unger ER, Relman D A , W h i t e TJ, eds.
10 20 30 40 Molecular microbiology: diagnostic principies and praccice,
Ciclo Washington, D C : A S M Press, 2004:71-84 )

Resultado da
N° Necessário
Curva de
Sondas Marcadores Modelo Desnaturação

A
í
Dois Dais -G-
y /v
s
Sondas Adjacentes

A Figura 17-20 Quatro formas de genotipagem de SNP por

Um
t f \ análise de desnaturação. O tradicional modelo de hibridização
Um -G— /A'. de sonda (linha supetior) usa u m par de sondas, uma marcada
-c— ya i i V

S o n d a Única
/ \ com um f l u o r ó f o r o aceptor (círculo A) e a outra com u m
fluoróforo doador (círculo D). O modelo de hibridização de
sonda única (segunde linha) não usa a segunda sonda. O
modelo de desnaturação do amplicon (terceira linha) usa um
Corante corante de ligação ao D N A dupla-fita saturante. Os dois
/ Ã \
ri homozigotos, embora próximos em T m , podem ser
• / \ \

Nenhum Nenhum diferenciados com instrumentos de alta resolução, e o

•V hetro zigoto tem uma transição de temperatura baixa adicional
Desnaturação
do Amplicon causada por heteiodúylices. O modelo de sonda não-marcada
(linha in/erior), similar á desnaturação do amplicon, não requer
u m marcador fluorescente covalentemente ligado e requer u m
Corante A, corante de ligação ao D N A saturante. Entretanto, como uma
sonda é usada, as curvas de desnaturação resultantes são mais
Um Nenhum — facilmente separadas do que com a desnaturação do amplicon.
O homozioto do alelo G (ImJia tracejada na coluna mais ã
v \ direita), o homozigoco do alelo A (linha pontiEfwXíia) e o

Sonda N ã o - m a r c a d a heterozigoto G A (linria sdliáa).


os ciclos anteriores. O grau da m u d a n ç a depende da eficiência
da P C R . O ciclo em que a fluorescência a u m e n t a acima dos
níveis iniciais se correlaciona inversamente c o m o íog da c o n c e n '
tração de m o l d e inicial. Esse " c i c l o " é, de fato, u m ciclo vníual
q u e i n c l u i u m c o m p o n e n t e parcial d e t e r m i n a d o p o r interpola-
ção, que p o d e ser calculado p o r vários métodos. Talvez o uso
c l í n i c o mais p o p u l a r da P C R em t e m p o real seja na avaliação de
carga virai, p a r t i c u l a r m e n t e de H I V e H C V . A necessidade clínica
de quantificação é b e m estabelecida e os m é t o d o s em t e m p o real
f o r n e c e m respostas rápidas e precisas. E n t r e t a n t o , outros sistemas
de amplificação, p a r t i c u l a r m e n t e os m é t o d o s baseados e m trans-
crição e D N A r a m i f i c a d o , são t a m b é m aceitos nesse campo alta-
m e n t e c o m p e t i t i v o . O u t r a s aplicações quantitativas de P C R em
t e m p o real i n c l u e m a quantificação de m R N A s (após transcrição
reversa), e m estudos de expressão gênica e avaliação de dosagem
gênica, na genética e oncologia.
Análise de Desnaturação
N ã o apenas amplificação, detecção e quantificação p o d e m ser
realizadas p o r hibridização h o m o g ê n e a , mas informações de
genotipagem detalhadas t a m b é m p o d e m ser obtidas. A genotipa-
gem é mais b e m realizada n o m e s m o t u b o p o r m o n i t o r a m e n t o
da desnaturação dos dúplices h i b i i d i z a d o s d u r a n t e o aqueci-
m e n t o c o n t r o l a d o , p r o d u z i n d o u m a curva de desnaturação
p r ó p r i a d o duplex. Tal característica m o n i t o r a a ligação do d ú p l e x
e m u m a faixa de temperaturas, ao c o n t r á r i o da análise em u m a
ú n i c a t e m p e r a t u r a das técnicas convencionais de hibridização,
tais c o m o dot falots o u m i c r o arranjos. As vantagens das curvas de
desnaturação completas t a m b é m se a p l i c a m q u a n d o se conside-
r a m somente técnicas homogêneas. Por exemplo, os métodos em
t e m p o real que d e p e n d e m da h i d r ó l i s e para geração de sinal e / o u
aqueles que a d q u i r e m dados s o m e n t e e m u m a temperatura geral-
m e n t e resultam e m mais erros de genotipagem. A amplificação
em t e m p o real e a análise de desnaturação caracteiizam u m a
c o m b i n a ç ã o poderosa de técnicas que r e q u e r e m apenas c o n t r o l e
de t e m p e r a t u r a e amostragem de fluorescência. M u i t a s outras
técnicas de genotipagem r e q u e r e m separação complexa e / o u
e q u i p a m e n t o de detecção após a P C R . A P C R e m t e m p o i e a l
c o m análise de curva de desnaturação p e r m i t e detecção, quanti-
ficação e genotipagem em m e n o s de 3 0 m i n u t o s (Figura 17-17)
sem processamento secundário o u e q u i p a m e n t o adicional.
Q u a n d o a fluorescência é m o n i t o r a d a c o n t i n u a m e n t e d e n t r o
de cada ciclo de P C R , as características de hibridização dos pro-
dutos de P C R e sondas p o d e m ser observadas (Figura 17-18,
painéis inferiores). C o m S Y B R G r e e n I , as características de
desnaturação do D N A a m p l i f i c a d o p o d e m i d e n t i f i c a r o p r o d u t o .
N e n h u m a i n f o r m a ç ã o de hibridização é o b t i d a c o m sondas de
h i d r ó l i s e , embora a desnaturação de sondas de hibridização seja
i m e d i a t a m e n t e visível. A desnaturação da sonda ocorre e m u m a
temperatura característica que p o d e ser explorada para c o n f i r m a r
a i d e n t i d a d e do alvo e analisar alterações de sequência sob a
sonda. Para análise de r o t i n a n o l a b o r a t ó r i o clínico, u m a única
curva de desnaturação geralmente é realizada ao f i n a l da P C R e m
vez de m o n i t o r a r a hibridização ao l o n g o de t o d o o processo.
A genotipagem p o r análise de curva de desnaturação p o d e
ser o b t i d a p o t u m a v a r i e d a d e d e m é t o d o s c o m s o n d a e c o r a n t e .
A l i n h a superior da Figura 17-20 mostra o desenho de pares de
sonda de hibridização tradicionais e os Tesultados de amostras
homozigotas selvagens, m u t a n t e s e heterozigotas, que são b e m
discriminadas umas das outras. O m e s m o resultado p o d e ser
o b t i d o usando-se u m a única sonda de hibridização na q u a l o
sinal fluorescente é d i f e r e n c i a l m e n t e s u p r i m i d o na hibridização
(segunda linha). A terceira l i n h a mostra ura desenho n o q u a l
n e n h u m a sonda é usada e o sinal é f o r n e c i d o p o r u m corante de
Ácidos Nucléicos CAPÍTULO 17 293
ligação ao D N A saturante. O p e r f i l de desnaturação do p r o d u t o
de P C R é usado para a genotipagem e p o d e ser o b t i d o em apenas
1 a 5 m i n u t o s . Aparelhos de desnaturação de alta resolução são
melhores para essas " g e n o t i p a g e m de a m p l i c o n " . F i n a l m e n t e , a
ú l t i m a l i n h a m o s t r a u m desenho c o m u m a sonda não-matcada
e u m corante de ligação ao D N A saturante. Os dois ú l t i m o s
m é t o d o s são vantajosos pelo fato de os oligonucleotídeos marca-
dos c o m fluorescência não serem necessários. A análise de des-
naturação c o m corantes saturantes t a m b é m p o d e ser usada para
detectar heterodúplices (variação de seqüência d e n t r o de u m
a m p l i c o n ) n o rastreamento de mutação. 9 A vantagem d o rastrea-
m e n t o de m u t a ç ã o p o r desnaturação é que n e n h u m a separação
é necessária, sendo a análise realizada n o m e s m o t u b o de P C R .
RESUMO
Existem m u i t o s métodos de análise de ácidos nucléicos e o
m é t o d o escolhido depende de diversos fatoies, i n c l u i n d o exigên-
cias de cempo para realização e de r e n d i m e n t o . A necessidade da
pesquisa genômica de grande v o l u m e é diferente daquela de u m
l a b o r a t ó r i o de referência clínica, u m a clínica médica o u os labo-
ratórios S T A T do f u t u r o . A análise de ácidos nucléicos é u m
campo que se desenvolve r a p i d a m e n t e na m e d i c i n a laboratorial,
i m p u l s i o n a d a pela promessa de c o n f e r i r u m grande r e t o r n o . O
t r a t a m e n t o c o m drogas p o d e ser ajustado para cada i n d i v í d u o
pelos testes moleculares apropriados? Os biochtps de diagnóstico
p o d e m ser comparados c o m a revolução m i c r o e l e t r ó n i c a , conti-
n u a n d o a fornecer mais i n f o r m a ç ã o a u m custo menor? O
seqüenciamento d o genoma c o m p l e t o para a análise de predis-
posição i n d i v i d u a l toinar-se-á u m a realidade? Técnicas simples,
poderosas e c o m custo-benefício c o n t i n u a r ã o a expandir nosso
e n t e n d i m e n t o sobre a complexidade dos ácidos nucléicos e sua
f u n ç ã o central na vida. Os detalhes técnicos de muitas das técni-
cas i n t r o d u z i d a s aqui p o d e m ser encontrados e m outras fontes
bibliográficas. 1 5
REFERÊNCIAS
I. Blasco M A . Telomeres and h u m a n disease; ageing, cancei and beyond.
N a t R e v G e n e t 2005,6 611-22.
2. C o n n GL, Draper DE. R N A scructure C u t r O p i n Stiuct Biol
1998;8.278-85.
3. Grewa.1 SI, Moazed D Hecerochromatin and epigenetic control of gene
expression. Science 2003;301:798-802.
4 Jones PA, Baylin SB. The fundamental role of epigenetic events i n
câncer. N a l Rev Genet 2002;3:415-28.
5 Khorasanizndeh S T h e nucleosome: í r o m genomíc organization to
genomíc regulation. Celi 2004; 116:259-72
6. Margulies M , Egholm M , A l t m a n W E , Attiya S, Bader JS, Bemben LA,
et al. Genome sequencing i n microfabricated high-density picolitre
xeacturs. Narure 2005,437.376-80.
7 M i t r a R D , Butty V L , Shendure J, W i l l i a m s B R , H o u s m a n D E , Church
G M . Digital genocyping and haplocyping w i t h polymerase colomes. Proc
N a t l Acad Sei U S A 2003;100:5926-31.
8. Perlcins TT, Quake SR, Smith D E , C h u S. Relaxation of a single
D N A m o l e m l e observed by optical microscopy. Science 1994.264
822-6.
9. Reed G H , W i t t w e r C T Sensitivity and specificity of single-nucleotide
polymorpbism scanning by high-resolution melting analysls. C l í n C h e m
2004 ; 50-1748-54
10 Sarki RK, G e l f a n d D H , Stoffel S, Scharf SJ, H i g u c h i R, H o r n GT, et al,
PtimeT-directed enzymatic amplification o f D N A w i t h a thermostable
D N A polymerase. Science 1988;239.487-91.
I I . Sanger F, N t c k l e n S, Coulson A R , D N A sequencing w i t h chain-
terminating inhibitors. Proc N a t l Acad Sei U S A 1977,74.5463-7-
294 PARTE IV Analilos
12. Schena M , Shalon D , Davis KW, Brown PO. Quantitative monitoring o f
gene expression pattems w i t h a complementaiy D N A microarray.
Science 1995;270-46^70
13. Schouten ]P, McElgunn C], Waaijer R, Zwijnenburg D , Diepvens F, Pais
G. Relative quantifica tion of 40 nucleic acid sequences by multiplex
ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res 2002;30:e57.
14- Seuss D . The cat i n the hat comes back! New York: Random House,
1958.
15 Wittwer CT, Kusukawa N Nucleic acid cechniques. In: Bruris D,
Ashwood E. Burtis C, eds. Fundamentals of molecular diagnostics.
Sr Louis: Saunders, 2007.46-79
CAPÍTULO 1 8
Aminoácidos e Proteínas*
OB-ETIVOS
1. Descrever a estrutura química básica de um aminoácido.
2. Explicar a formação (polimerização) de um peptídio a partir de
aminoácidos.
3- Descrever a principal fonte de aminoácidos.
4. Descrever o ciclo metabólico dos aminoácidos
5. Definir os seguintes termos:
• Proteína
• Globulina
• Imunoglobulina
• Reação de fase aguda
• Paraproteína
• Proteína do complemento
6. Descrever a bioquímica, a função e a importância clínica dos
aminoácidos e das proteínas.
7. Descrever os quatro estágios da estrutura de uma proteína.
8. Comparar proteínas "fibrosas" e proteínas "globulares" e dar
exemplos de cada uma delas.
9. Listar as principais proteínas plasmáticas e imunogiobulinas.
10. Listar as técnicas que são utilizadas para avaliar aminoácidos e
proteínas em fluidos corporais e descrever os princípios dessas
técnicas.
11. Descrever o principio da imunofixação e os padrões de migração
das proteínas plasmáticas.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A m i n o á c i d o : U m c o m p o s t o o r g â n i c o que c o n t é m ambos os
grupamentos f u n c i o n a i s a m i n o ( - N H 2 ) e carboxila
(-COOH).
A m i n o á c i d o s Essenciais: A m i n o á c i d o s q u e não p o d e m ser
sintetizados pela m a i o r i a dos mamíferos e, p o r t a n t o , são
considerados constituintes essenciais da dieta para a
m a n u t e n ç ã o da saúde o u crescimento.
C o m p l e m e n t o : U m sistema f u n c i o n a l m e n t e associado,
c o m p r e e n d e n d o pelo m e n o s 20 proteínas séricas distintas,
que ajuda a destruir células estranhas identificadas pelo
sistema i m u n e .
G r u p o P r o s t é t i c o : U m a estrutura não-polipeptídica que está
f o r t e m e n t e ligada à p r o t e í n a e é necessária à atividade de
uma enzima o u o u t r a p r o t e i n a .
I m u n o d e f i c i ê n c i a : D e f i c i ê n c i a o u incapacidade de certas partes
d o sistema i m u n e para f u n c i o n a r , o que t o m a u m
i n d i v í d u o suscetível a certas doenças que ele o u ela, de
f o r m a geral, n ã o d e s e n v o l v e r ! a .
I m u n o g i o b u l i n a s : U m a classe de proteínas, t a m b é m são
conhecidas c o m o anticorpos, sintetizadas pelas células B do
sistema i m u n e e m resposta a u m a n t i g e n o específico,
c o n t e n d o u m a região q u e se liga a esse antigeno (sítio de
O autor agradecidamente reconhece as contribuições prévias de RobeTt H.
Christenson Hassan M.E. A^iazy, Lawrence M. Silverman e Elizabeth M.
Rohlfs, nas quais se baseiam partes deste capítulo
A. Myron Johnson, M.D.
ligação ao antigeno); existem cinco classes de
i m u n o g l o b u l i n a ( I g A , I g D , IgE, I g G e I g M ) .
Ligação P e p t í d i c a : Ligação amida f o r m a d a entre o g r u p a m e n t o
carboxila de u m a m i n o á c i d o e o g r u p a m e n t o a m i n a de u m
outro aminoácido.
O l i g o p e p t í d i o : U m a cadeia relativamente c u r t a de a m i n o á c i d o s
(três a cinco resíduos).
P a r a p r o t e í n a : U m a proteína plasmática a n o r m a l que aparece
em grandes quantidades c o m o resultado de u m a c o n d i ç ã o
patológica; t a m b é m conhecida c o m o u m a proteína do
mieíoma ( M C ) .
P o l i p e p t í d í o : U m a cadeia de a m i n o á c i d o s q u e c o n t é m
a p r o x i m a d a m e n t e 6 a 30 resíduos.
P r o t e í n a : Q u a l q u e r u m dos grupos de compostos orgânicos
complexos que c o n t e n h a m c a r b o n o , h i d r o g ê n i o , oxigênio,
n i t r o g ê n i o e, geralmente, enxofre (o elemento característico
é o n i t r o g ê n i o ) e estão a m p l a m e n t e d i s t r i b u í d o s em plantas
e animais.
P r o t e í n a de Bence-Jones: U m a p r o t e í n a plasmática o u u r i n á r i a
a n o r m a l que consiste em cadeias leves de i m u n o g l o b u l i n a
m o n o c l o n a l , e x c r e t a d a em algumas doenças neoplásicas e
caracterizada p o r suas propriedades m c o m u n s de
solubilidade, já que precipita sob a q u e c i m e n t o a 5 0 ° C a
6 0 ° C e redissolve a 9 0 ° C a 100°C.
P r o t e í n a C o n j u g a d a : U m a proteína q u e c o n t é m u m o u mais
grupos prostéticos.
P r o t e i n a G l o b u l a r : U m a proteína c o m u m a m o r f o l o g i a
compacta que é solúvel em água o u soluções salinas,
P r o t e í n a s Plasmáticas: Proteínas presentes n o sangue,
i n c l u i n d o proteínas transportadoras, f i b r i n o g ê n i o e o u t r o s
fatores de coagulação, componentes do c o m p l e m e n t o ,
i m u n o g i o b u l i n a s , i n i b i d o r e s de enzimas e m u i t o s outros; a
m a i o r i a é e n c o n t r a d a em o u t r o s f l u i d o s corporais, mas e m
concentrações menores.
Reação de Fase A g u d a : Resposta d o c o r p o a u m a lesão o u
i n f l a m a ç ã o , i n c l u i n d o febre, leucocitose e alterações de
proteínas.
A
minoácidos, peptídios e proteína d e s e m p e n h a m funções
cruciais e m praticamente t o d o s os processos biológicos,
c o m os a m i n o á c i d o s sendo as unidades estruturais básicas
das proteínas. 2 , 3 M u i t a s mutações genéticas r e s u l t a m na i n c o r p o -
ração, nas proteínas, de a m i n o á c i d o s que p o d e m alterar as taxas
de síntese, a secreção o u o m e t a b o l i s m o das proteínas e suas
funções. A l é m disso, existe u m grande n ú m e r o de a n o r m a l i d a d e s
herdadas d o m e t a b o l i s m o de a m i n o á c i d o s ( C a p í t u l o 44).
Este capítulo i n c l u i discussões de (1) a m i n o á c i d o s , (2) proteí-
nas e (3) técnicas analíticas usadas para analisar proteínas.
AM INOÁCI DOS
A m i n o á c i d o s são as unidades estruturais básicas das proteínas.
Suas medições nos f l u i d o s fisiológicos f o r n e c e m informações
i m p o r t a n t e s para o diagnóstico de m u i t a s condições patológicas
e herdadas.
296 PARTE IV Analitos

Bioquímica Básica Influência dos Grupos R

Os a m i n o á c i d o s são compostos orgânicos que c o n t ê m t a n t o u m Os grupos R dos diferentes a m i n o á c i d o s são responsáveis p o r
g r u p a m e n t o a m i n a ( - N H 2 ) c o m o u m g r u p a m e n t o carboxila suas propriedades especiais. Por exemplo, alguns grupos R são
( - C O O H ) . Aqueles que aparecem nas proteínas são chamados apoiares e, p o r t a n t o , h i d r o f ó b i c o s ; outros são polares e h i d r o f í l i -
ra-aminoácidos e t ê m a f ó r m u l a empírica R C H ( N H j ) C O O H . cos (Tabela 18-1). O u t r o s ainda se t o r n a m carregados, negativa
H % - ° " (os a m i n o á c i d o s ácidos) o u positivamente (os a m i n o á c i d o s
básicos). Os grupos R p o d e m ser lineares (p. ex., valina) o u cícli-
cos (p. ex., p r o l i n a ) , pequenos (p. ex., glicina) o u volumosos (p.
Vl-C—H ex., t r i p t o f a n o ) . A densidade eletrônica p o d e ser baixa, c o m o nas
^ À \ cadeias alifáticas; o u alta, c o m o nos anéis aromáticos. Essa diver-
sidade na q u í m i c a e na estrutura dos grupos R possibilita vários
Á t o m o de carbono a
tipos de interação entre esses grupos, u m fato de grande i m p o r -
A Tabela I 8 T lista os a m i n o á c i d o s i m p o r t a n t e s para a q u í m i c a tância para a determinação da estrutura protéica.
de proteínas. O s 22 a m i n o á c i d o s listados na seção I são utilizados A l g u n s aminoácidos t ê m grupos R c o m substituintes carrega-
para c o n s t r u i r o grande n ú m e r o de peptídios e proteínas biolo- dos o u ionizáveis. Esses substituintes t ê m seus p r ó p r i o s pKs. E m
gicamente ativos que existem na natureza. B i o q u í m i c a mente, as u m p H de a p r o x i m a d a m e n t e 7, o segundo g r u p o carboxila d o
propriedades ácido-básicas características dos a m i n o á c i d o s , t a n t o ácido glutâmico ( G l u ) e do ácido aspártico (Asp) está completa-
q u a n t o a natureza diveisa de seus g r u p a m e n t o s R e suas intera- m e n t e ionizado e carregado negativamente. Nesse p H fisiológico,
ções, c o n f e r e m aos peptídios e às proteínas sua versatilidade e m a m a i o r i a dos aminoácidos básicos está p o s i t i v a m e n t e carregadai
termos de estrutura e f u n ç ã o . e n t r e t a n t o , menos de 10% das histidinas estão p o s i t i v a m e n t e
carregadas. E m p H ~ 6 , a glicina, c o m pK^ de 2,34 e p K 2 de 9,60,
Propriedades Ácido-Bâsicas t e m u m a carga l í q u i d a p r ó x i m a de zero, i l u s t r a n d o o c o m p o r t a -
As propriedades ácido-básicas dos a m i n o á c i d o s d e p e n d e m dos m e n t o ácido-base d o g r u p o de a m i n o á c i d o s c o m grupos R q u e
g r u p a m e n t o s a m i n a e carboxila ligados ao c a r b o n o Ot, e dos não t ê m substituintes ionizáveis. A s diferenças de s o l u b i l i d a d e e
g r u p a m e n t o s básicos, ácidos o u o u t r o s g r u p a m e n t o s f u n c i o n a i s propriedades ácido-básicas dos a m i n o á c i d o s f o r n e c e m a base de
representados pelo R , N a faixa de p H fisiológico de 7,37 a 7,47, sua separação p o r (1) eletroforese, (2) cromatografia de partição,
o g r u p a m e n t o carboxila de u m a m i n o á c i d o está dissociado e o o u (3) cromatografia de troca i ô n i c a (Capítulos 6 e 7). As dife-
g r u p a m e n t o a m i n a está p r o t o n a d o , c o m o se segue: renças entre a natureza q u í m i c a dos grupos R p e r m i t e m , em
alguns casos, a identificação o u a medição de a m i n o á c i d o s espe-
H cíficos p o r reações fotométricas.
H SVr/-
l H ©
nh 3
rÍ-cC i - b - coo
Ligação Peptídica
U m a ligação p e p t í d i c a é formada q u a n d o o g r u p a m e n t o a - a m i n o
À %
de u m a m i n o á c i d o é covalentemente ligado ao a-carboxila de u m
segundo a m i n o á c i d o , c o m o se segue:
Esse t i p o de m o l é c u l a ionizada, c o m a coexistência de cargas
negativas e positivas, é c h a m a d o ion dipolar o u anfólito. E m baixo H H O, ,°H
N"" HjQ
p H , u m a m i n o á c i d o está em sua f o r m a catíônica, c o m ambos os H H-íN
g r u p a m e n t o s a m i n a e carboxila p r o t o n a d o s ( - b T I - ^ e - C O O H ) . Ri— + / Rj"—•'
A m e d i d a q u e o p H a u m e n t a , o g r u p a m e n t o carboxila perde seu
p r ó r o n e a f o r m a de a n f ó l i t o aparece em t o r n o de p H 6. C o m o
h ^ k
Primeiro Segundo
a u m e n t o posterior do p H , a a m i n a - N + H 3 t a m b é m é desproto- Dipeptídio
aminoácido aminoácido
nada, r e s u l t a n d o na f o r m a a n i ô n i c a da molécula. Esse processo
para u m a m i n o á c i d o m o n o a m i n a e m o n o c a r b o x í l i c o se dá c o m o A ligação peptídica é descrita pela estrutura na área circun-
se segue: dada. Por exemplo, a glicina e a a l a n i n a reagem para f o r m a r dois
dipeptídios diferentes, glicil-alanina nu alanil-glicina. N o glicil-
C á t i o n em p H < pi Anfólito e m p H = pi  n í o n em p H > PI alanina, a alanina é d e n o m i n a d a resíduo C-terminal do p e p t í d i o ;
<±> fcü
NH 3 O NH3 O NH, o a glicina é o resíduo N-íerminal p o r q u e seu g r u p a m e n t o a m i n a está
OtP OH livre. N o alanil'glicina, as denominações são invertidas. As desig-
R—h~ê R—b -ê r—h—ê
nações C- e N - t e r m i n a l se aplicam, t a m b é m , aos p o l i p e p t í d i o s e
Í V)H li 0: H ^
às proteínas.
HiO + 2H20

As constantes de dissociação (razão entre a n f ó l i t o e cátion)
e K ; (razão entre a n f ó l i t o e â n i o n ) geralmente são expressas loga-
r i t m i c a m e n t e c o m o p K i e p K 2 , o n d e p K = - l o g K , de f o r m a
análoga à notação de p H . U m p K é o p H n o qual quantidades
iguais das formas pTotonada (associada) e desprotonada (disso-
ciada) estão presentes. O p o n t o isoelétrico, p i , é o p H n o q u a l as
moléculas existem na f o r m a de a n f ó l i t o e têm u m a carga l i q u i d a
igual a zero. O p o n t o isoelétrico de u m a m i n o á c i d o n e u t r o é
calculado a p a r t i r dos pKs de seus grupamentos a m i n a e carboxila
( p i = V^tpK] + pK}]). O conceito de a n f ó l i t o e suas características
de dissociação t a m b é m se aplicam a proteínas p o r q u e a m a i o r i a
delas é carregada negativamente e m p H fisiológico.
Metabolismo
E m u m i n d i v í d u o saudável, a f o n t e p r i n c i p a l de aminoácidos
para a síntese de p r o t e í n a endógena é f o r n e c i d a pela ingestão de
proteínas da dieta. E m b o r a a m a i o r i a dos a m i n o á c i d o s seja sin-
tetizada i n vivo, a m a i o r i a dos mamíferos não é capaz de sintetizar
8 a 10 dos 2 2 a m i n o á c i d o s c o m u n s . Estes são considerados
constituintes "essenciais" ( a m i n o á c i d o s essenciais) da dieta para
m a n u t e n ç ã o da saúde e do crescimento, o u ambos. 9 A s enzimas
proteolíticas n o trato gastrointestinal a t u a m nas proteínas ingeri-
das l i b e r a n d o a m i n o á c i d o s , q u e são, então, absorvidos d o j e j u n o
para o s a n g u e e, subseqüentemente, tornam-se parte da m i s t u r a
de aminoácidos do c o r p o . O fígado e outros tecidos se u t i l i z a m
dessa m i s t u r a para a síntese de proteínas plasmáticas e intracelu-
 Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 297

T A B E L A 18-1 Aminoácidos
MW
Nome e Abreviatura m Estrutura em pH 6 - 7 Comentários

I. AMINOÁCIDOS ENCONTRADOS NA MAIORIA DAS PROTEÍNAS

Aminoácidos Hidrofóbicos; Grupos R Apoiares
Alanina 89,09 H o Substrato da ALT; o menos hidrofóbicc do grupo
Ala HqC—c—cf
I \B
KH, cr
©

Leucina 131,17 H3C H O Grupo R de cadeia ramificada; essencial; cetogênico;

Leu \VH—CH2-C- C metabolismo defeituoso na doença da urina de
NH3 "o° xarope de bardo
©

lsoleucina
lie
131,17
H3 C—CH2-ch—C—C
I I V ©
J Essencial; parcialmente cetogênico; ver Leucina, acima

CH-s NH, O
$

Valína 117,17 H3C H O Essencial; parcialmente cetogênico; ver Leucina, acima

Val CH-lz—cf
H
3C/ NH3 "O3
O

Prallna 115,13 p Importante constituinte das proteínas do tecido

Pro
Qr* \P
Gonjuntivo {p. ex., colágeno e elastina); alguns
hidroxilados a Hyp durante a síntese do colágeno;
desestabiliza as a-hélices e as estruturas 3;
contém um grupo a-imina

Metionina 149,21 H o Essencial; importante na transferência de grupos

Met HjC—s—CH 2 -CH 2 -C—é metil; fornece enxofre para outros compostos
| V 0 que contêm enxofre
NH-, O
(]>
H
Fenilalanina 165,19 / = \ o Essencial; níveis elevados na fenilcetonúria
Phe
0"°*L'v
Triptofano 204,22 Essencial; metabólitos encontrados em tumor
Trp carcinóide; contém um anel indolico; precursor
de serotonina e melatonina
ÍJ.Hj ^

Aminoácidos Hidrofílicos; Grupos Polares Não-carregados

Glicina 75,07 H 0 aminoácido mais simples; oticamente inativo;
„ i êV 0
0

Gly inserido neste grupo porque seu grupo R (um

MH 3 ° único H) é incapaz de afetar a polaridade do resto
da molécula; usado na biossíntese de purinas e
porfirinas; usado in vitro como tampão

Serina 105,09 Constituinte do centro ativo de muitas enzimas; o

Ser HO—CH,- grupo hidroxila pode ser fcstorilado
V©
NH. O
íL

Treonina 119,12 HO H O Essencial

Thr Yh—h—é
UjC NH3 0 Q
vi)
H
°
Cisteíria 121,16 Grupo sulfidrila funcional na atividade de muitas
Cys HS—CHj—n—</ enzimas; é responsável pelas pontes dissulfeto de
peptídios e proteínas; cistina é dicisteína,
Íh,
Cys-S-S-Cys; hcmocisteína tem um carbono a mais
do que cisteína e forma homocistina
(di-homocisteína)

Continua
298 PARTE IV Analitos

TABELA 18-1 Aminoácidos - C o n t .

MW
Nome e Abreviatura (Da) Estrutura em pH 6 - 7 Comentários

Selenocisteína 168,05 ? ° Forma ativa do selênio; encontrada em muitas

Secys HSe—CHj-C—ê enzimas envolvidas em reações de oxidorredução

©
Tirosina 181.1S H o Geralmente não-essencial; irtermediário na síntese
Tyr de catecclaminas, tiroxina e melanina; grupo
HO
' \ 0 tenólico funcional; reage com o reagente de Folin
NH 3
© no exame quantitativo de proteínas

Glutamina 146,15 Forma de armazenamento de amónia nos tecidos;

H2N H O
Gin tornece o nitrogênio amida usado na biossíntese de
c—ch2-CH2— — ê
purinas e pirimidinas
0 0
nh3
©

Asparagina 132,12 H Forma de armazenamento de amónia nos tecidos

Asn C—CH ,-i: -ê
&H.
<9

Hidroxiprolina 131,13 HO . o Constituinte do colágeno — a única proteína humana

Hyp / que contém quantidades apreciáveis; excreção na
NI I- X
0G urina é usada como um indicador da metabolismo
© * da matriz óssea; contém um grupo a-imina

Aminoácidos Dicarboxilicos; Grupos R Ácidos

Ácido aspártico 133,10 O H o Co substrato juntamente com Glu da AST; usado na
Asp ch2-c—ê biossíntese de pirimidinas
e
O JJH3 O 0
©
0
Ácido glutâmico 147,13 °v V Co-substrato juntamente com Ala da ALT e com
Glu V - C i h - C H «-í:- ê Asp da AST
0 / ' I
O nh3 O
©

Aminoácidos Básicos; Grupos R Básicos

Lisina 146,19 H O Essencial; NH2 terminal denominado e-amino
Lys h3n—ch,-ch2-ch2-ch2-c—ê
® i i e
NH 3 O
©

Arginina 174,20 H O Envolvido na síntese de uréia; o grupo básico é um

Arg t - N H - C H 2 - C H r C H 2 C—ê grupo guanidina
H,/ AH
N h ,, \ > e
© $

Histidina 155,16 H O 0 grupo imidazol da histidina é o grupo-tampão

©
His HN mais importante na faixa de pH fisiológico
" ' i T v 0e
NHj
©

II. AMINOÁCIDOS DIFERENTES

Tiroxina 776,93 Hormônio da tireóide
T<
HO ;> - o

Continua
 Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 299

S-1 Aminoádd<\s - Crmr.

MW
Nome e Abraviatura (Da) Estrutura em pH 6-7 Comentários

Triiodotiranina 651,01 1 I Homiônlo da tireóide; mais ativo da que T4

T, " O
n o — a — o — v . ) H&r-C—ê .
% // ^

fl-Alánina 89,09 Constituinte da vitamina ãoidn pantotênico

[i-Ata H-iK—CH 2 -CH2—i

Dikjroxjfenilaianina 197.1B 110 Intermediário na sintcso tie Ccrteoolainina

DOW 0
V
J u tf>

Acido y-amlnobutirlco 103,12 Mctabólito do Gfci; um neuno transmissor

SABA* H-iN CH-.-CH->—CHj-cf' .
Ü)

Omitina 132,1 G H o Intnrmwfiãrio rw síntese da uréia

0m* U,N CH-, CHt-CH*—C—C ^
H VP

Citadina 175,19 H i intermediário na síntese da meia

\ V /
Cltr" £- Ml-C:Hr-Ui-ji—tH 2 —C—(
6
1sH3 V

Fosfosserina 185,08 Na cascina c nm ouiras fo&íoproUHiias

V0 V o
1 tf
Hú—p—o r.iij-c.'—v
lp Ih, o"

Acida pirrolidina carboxílico 129,12 .--V, O Forma cíclica do GI11, raro; usado para term na/
cadeias peptidicas, como no AAmrmlnal das
cadeias L das -,-globulinas
H

Taurina 126,14 o Formas conjugadas com 0$ ácidos biliarcs; inibem a

G c?
'O—S—CH3-CH2-NH: transmissão de impulsos norvosns
&

Ácido f>-aminDÍsobutírica 103,12 " o Piesente na urina: urn metabólito das pirimidinas
® I //
j
p-AIB* MSN—CHJ-C—C
U v»
A1.1, ALuLiU U&LLtaiiiii.i3ux.'. AST, itauurUUxj UjiLaauúiW:*:.
',\l:rtviulHT.i litiL •mix níii íiiV.il.

lares. O fígado e os r i n s t a m b é m estão ativamente envolvidos na transportadores ligados à m e m b r a n a e da concentração i atraiu-

interconversão de a m i n o á c i d o s p o r transaminação e em sua
degradação p o r desaminação (Figura 18-1). A desaminação
p r o d u z íons a m ó n i o , q u e são c o n s u m i d o s r a p i d a m e n t e na síntese
de uréia, A uréia, p o r sua vez, é excretada pelos rins.
Os a m i n o á c i d o s n o sangue são f i l t r a d o s através das m e m b r a -
nas glomerulares, mas n o r m a l m e n t e são reabsorvidas nos t ú b u l o s
renais p o r sistemas de t r a n s p o r t e saturáveis. O m e c a n i s m o de
reabsorção é u m sistema de t r a n s p o r t e ativo dependente dos
m i n a i de Na + .
Q u a n d o os mecanismos de t r a n s p o r t e se t o r n a m saturados
o u são defeituosos, os a m i n o á c i d o s escapam pela u r i n a , resul-
t a n d o e m u m a c o n d i ç ã o conhecida c o m o a m i n o a c i d ú r i a . Três
tipos de a m i n o a c i d ú r i a f o r a m identificados:
1. A a m i n o a c i d ú r i a de t r a n s b o r d a m e n t o ocorre q u a n d o a con-
centração plasmática de u m o u mais a m i n o á c i d o s excede o
l i m i t e renal (capacidade de reabsorção).
300 PARTE IV Analitos
Aminotransferases
Aminoácidos + a-cetoglutarato
Biossíntese de proteínas do
V Pinjvatn
ligado e do plasma, purinas,
pirimidinas, porfirinas, hormô-
nios e outras proteínas
Corpos cetônicos
Síntese de
ácidos graxos
COj + HjO
Figura 18-1 U r a esquema generalizado do metabolismo de aminoácidos n o fígado.
2. A a m i n o a c i d ú r i a renal ocorre q u a n d o as concentrações plas-
máticas são n o r m a i s , mas o sistema de reabsorção t u b u l a r
renal tem u m defeito c o n g ê n i t o o u a d q u i r i d o .
3. A a m i n o a c i d ú r i a sem l i m i t e ocorre q u a n d o quantidades
excessivas de u m a m i n o á c i d o , originadas de u m b l o q u e i o
m e t a b ó l i c o h e r d a d o , estão presentes na u r i n a , mas as concen-
trações plasmáticas são essencialmente n o r m a i s , p o r q u e t o d o
a m i n o á c i d o é excretado. N o t e que as a m i n o a c i d ú r i a s sem
l i m i t e , tais c o m o a h o m o c i s t i n ú r i a , não são causadas p o r
defeitos renais congênitos o u adquiridos, mas são provocadas
u n i c a m e n t e p o r saturação do sistema de reabsorção t u b u l a r
renal n o r m a l .
As concentrações plasmáticas de a m i n o á c i d o s v a r i a m d u r a n t e
o dia em cerca de 3 0 % ; os valores são mais altos n o m e i o da tarde
e mais baixos n o i n i c i o da m a n h ã . Essa variação d i u r n a é parti-
c u l a r m e n t e i m p o r t a n t e q u a n d o se analisam amostras para a
detecção de estados heterozigóticos do m e t a b o l i s m o defeituoso.
As concentrações plasmáticas de a m i n o á c i d o s são altas
d u r a n t e os p r i m e i r o s dias de vida, especialmente em neonatos
p r e m a t u r o s , mas t e n d e m a ser baixas e m bebês c o m b a i x o peso
ao n a s c i m e n t o pelas suas idades gestacionais, sendo a causa a má
n u t r i ç ã o ocasionada p o r i n s u f i c i ê n c i a placentária. Os valores
maternos são baixos na p r i m e i r a metade da gravidez.
A excreção de a m i n o á c i d o n a u r i n a varia c o m a idade (Figura
18-2). Os bebês prematuros, especialmente d u r a n t e a p r i m e i r a
semana de v i d a , d e m o n s t r a m u m a a m i n o a c i d ú r i a renal fisioló-
gica generalizada; m e s m o e m recém-nascidos a t e r m o , a aminoa-
c i d ú r i a é mais m a r c a n t e do q u e e m adultos. N a u r i n a de adultos
n o r m a i s , a g l i c i n a geralmente é a fração p r e d o m i n a n t e . O l i m i t e
renal para m u i t a s substâncias é reduzido d u r a n t e a gravidez, e os
aminoácidos, tais c o m o h i s t i d i n a , f e n i l a l a n m a , l i s m a e tirosina,
c o m u m e n t e estão presentes na u r i n a .
A selenocisteína (Secys) é u m a m i n o á c i d o de destaque espe-
cial. 4 E s t r u t u r a l m e n t e , a selenocisteína é u m análogo da cisteína
q u e c o n t é m selênio, reconhecida c o m o o 2 P a m i n o á c i d o codifi-
/ \
Cetoácidos + glutamato NH
Y \ 1
Glicose
Uréia
{excretada
pelo rim)
Acetil-CoA
Ciclo do ácido
trícarboxllíco;
fosforilação s
O,
oxidativa
ATP
cado pelo D N A . É (1) a f o r m a b i o l o g i c a m e n t e ativa d o selênio,
(2) f o r t e m e n t e regulada e (3) e n c o n t r a d a nos reinos de procario-
tos e eucarlotos e m sítios ativos de enzimas envolvidas e m reações
de oxidorredução. M u i t o s estudos experimentais t ê m demons-
trado q u e a selenocisteína é u m a m i n o á c i d o utilizado na síntese
de proteínas mediada p o r r i b o s s o m o . O c ó d o n de t r i n c a de bases
d o R N A mensageiro ( r n R N A ) para Secys é U G A , considerado,
o r i g i n a l m e n t e , c o m o u m c ó d o n de parada, mas atualmente reco-
n h e c i d o p o r desempenhar duas funções, d e p e n d e n d o das seqüên-
cias adjacentes do D N A , D o z e selenoproteinas de m a m í f e r o s
f o r a m caracterizadas, e cada u m a delas c o n t é m selenocisteína
i n c o r p o r a d a e m resposta ao c ó d o n U G A específico.
Implicações Clínicas
As a m i n o a c i d ú r i a s p o d e m ser p r i m á r i a s o u secundárias. A doença
p r i m á r i a é provocada p o r u m defeito enzimático h e r d a d o ,
t a m b é m c h a m a d o de erro mato do metabolismo. O defeito está
localizado na via pela q u a l u m a m i n o á c i d o específico é metabo-
lizado o u n o sistema de t r a n s p o r t e t u b u l a r r e n a l específico p e l o
q u a l o a m i n o á c i d o é reabsorvido. A a m i n o a c i d ú r i a secundária é
devida à (1) doença de u m órgão, t a l c o m o o fígado, que é u m
local ativo d o m e t a b o l i s m o de a m i n o á c i d o s , (2) disfunção t u b u l a r
renal generalizada, o u (3) m á n u t r i ç ã o relacionada c o m a prote-
ína-energia. Erros inatos do m e t a b o l i s m o específicos são discuti-
dos c o m mais detalhe n o C a p í t u l o 44.
Análise de Aminoácidos
M u i t o s p r o c e d i m e n t o s encontram-se disponíveis para m e d i r ami-
noácidos e m amostras biológicas. Para diagnosticar patologias, os
três grupos de testes seguintes para análise de a m i n o á c i d o s são
importantes:
1. Testes de rastreamento, i n c l u i n d o a cromatografia em camada
f i n a ( T L C ) , testes c o l o r i m é t r i c o s da u r i n a e o teste m i c r o b i o -
lógico de G u t h r i e
 Aminoácidos e Proteínas ÍAPÍTULO 18 301

Figura 18-í Cromarogramas de T L C bidimensional de urina, mostrando a variação na excreção de

aminoácidos com a idade. A, Neonato. B, Bebê. C, Adulto. 1, Alanina; 2, serina; 3, glicina; 4, glutamina; 5,
histidina; tí, lisina/ornitina.

2. Testes q u a n t i t a t i v o s para m o n i t o r a r o t r a t a m e n t o o u confir- de plasma hepariniaadn em lugar de soro e outros anticoagulan-

mar u m diagnóstico inicial.
3. Testes específicos que i d e n t i f i c a m u m a m i n o á c i d o o u metabó-
l i t o desconhecido.
Requisitos de Amostras
Para diagnosticar precisamente uma a m i n o a c i d ú r i a herdada,
deve-se t o m a r c u i d a d o para se o b t e r amostTas válidas e represen-
tativas. Por exemplo, i n d i v í d u o s devem seguir u m a d i e t a n o r m a l
p o i 2 a 3 dias antes da coleta. As amostras de sangue e u r i n a
devem ser coletadas s i m u l t a n e a m e n t e . Dá-se preferência ao uso
tes. O plasma deve ser desproteinizado se a análise i n c l u i r os
aminoácidos que c o n t ê m enxofre. C o m o algumas drogas admi-
nistradas à mãe antes do p a r t o o u ao bebê i n t e r f e r e m nas amos-
tras, todas as medicações devem ser registradas.
Testes de Rastreamento
U m a variedade de métodos é utilizada para pesquisar aminoáci-
dos nos f l u i d o s corporais. Eles i n c l u e m T L C , ensaio f o t o m é t r i c o
e o tesce de G u t h r i e .
302 PARTE IV Analitos
TLC
A análise de aminoácidos por T L C é realizada em três etapas: (1)
preparação das amostras, (2) separação cromatográfica e (3) iden-
tificação dos aminoácidos separados. Para a análise de aminoáci-
dos nos fluidos corporais e tecidos, o pré-tratamento da amostra
é frequentemente necessário para remoção de proteínas, lipídios,
sais inorgânicos, ou outras substâncias que interferem na resolu-
ção cromatográfica.
A quantidade de aminoácidos visível em u m cromatograma
é influenciada não apenas pelo processo da doença, mas também
pelo volume de líquido aplicado ao cromatograma. Portanto, o
volume da amostra é calibrado tendo como referência seu conteúdo
de nitrogênio total ou a quantidade de creatinina em u m volume
especificado da amostra.
Na prática, a celulose continua a ser a fase estacionária de
escolha pata a T L C , porque os procedimentos que a utilizam
fornecem resolução cromatográfica superior e reduzem o tempo
necessário para o desenvolvimento do sistema de solvente (Capí-
tulo 7). Os procedimentos que utilizam papel, entretanto, são
m u i t o úteis quando amostras de sangue ou urina são coletadas
em discos de papel de filtro.
U m grande número de solventes tem sido proposto para a
separação de misturas de aminoácidos. A T L C unidimensional é
mais aceita por causa de sua simplicidade, dos compostos múlti-
plos de referência e pelo fato de as amostras correrem facilmente
em uma única placa. Na T L C bidimensional, após a primeira
migração, o cromatograma é girado a 90° e, então, transferido
para u m outro sistema de solventes, para uma segunda migração.
Quando se utiliza uma combinação de reagentes de coloração
seletiva com o sistema de solventes bidimensional, é possível
identificar mais de 75 compostos de interesse bioquímico.
M u i t o s corantes são utilizados para visualizar os aminoácidos
separados por T L C . O reagente mais amplamente usado para as
avaliações qualitativa e quantitativa de aminoácidos é a nini-
drina. A maioria dos aminoácidos reage com a n i n i d r i n a em
temperatura ambiente, formando uma cor azul que se torna roxa
sob aquecimento.
tf J- .?
oh Y /?
i ir jC * $
' —«
— *• r i a
h c
°2 ó são discutidos mais detalhadamente em uma edição anterior
Ninidrina Aminoácido Hidrindantina
O O
4 Teste de Guthrie
ÇXX- * CXX
<\ ll
Ò
•O K U
Ninidrina Hidrindantina
A prolina e a hidroxiprolina, entretanto, produzem compos-
tos amarelos que são menos adequados para a observação visual;
conseqüentemente, corantes adicionais como a isatina (indol-2,3-
diona) são freqüentemente usados. A isatina converte a prolina
e a hidroxiprolina em compostos azuis que são detectáveis contra
u m f u n d o amarelo. A adição de bases orgânicas, tais como a
colidma, a soluções de n i n i d r i n a também produz um corante
policromático, o que facilita a identificação dos diferentes ami-
noácidos.
Cromatografia em Camada Fina Unidimensional. O princípio da
T L C unidimensional está descrito no Capítulo 7. Embora se
prefira a T L C bidimensional para a urina, a T L C unidimensional
do plasma e da urina detectará a maioria das aminoacidopatias
e, geralmente, é a adequada para o rastreamento. C o m essa
técnica, as amostras, as soluções de referência e os controles são
aplicados às placas de camada fina pré-cobertas com celulose. O
desenvolvimento é realizado em u m sistema solvente-vapor apro-
priado, seguido de secagem e coloração do cromatograma. A
solução de referência é uma mistura de aminoácidos de concen-
tração conhecida. Quando várias alíquotas da mesma amostra
correm em uma única placa e cada uma delas é, então, corada
com corantes específicos distintos, freqüentemente é possível
identificar muitos aminoácidos diferentes.
Cromatografia em Camada Fina Bidimensional. A T L C bidimen-
sional é usada para identificar os aminoácidos livres n o sangue,
na urina, no líquido cerebrospinal (CSF) e em outros fluidos
biológicos e tecidos. C o m essa técnica, primeiramente a proteína
é precipitada com etanol absoluto, seguida por extração com
clorofórmio para remoção da uréia e outtas substâncias orgânicas
e inorgânicas. Os aminoácidos na fase aquosa são, então, separa-
dos por T L C em placas pré-cobertas com celulose. Dois sistemas
de solventes são usados; o primeiro contém amónia para aumen-
tar a mobilidade dos aminoácidos com cadeias laterais básicas, e
o segundo contém ácido fórmico para aumentar a mobilidade
dos aminoácidos com cadeias laterais ácidas.
Na prática, uma alíquota da amostra é aplicada em uma
extremidade da placa de camada fina de celulose e, após a sepa-
ração dos aminoácidos em uma direção, a placa é girada em u m
ângulo reto e os aminoácidos são posteriormente separados por
u m segundo solvente. Após o desenvolvimento, os aminoácidos
são visualizados com ninidrina-colidina Então, a distância migrada
por cada aminoácido e a frente do solvente são medidas a partir
do ponto de aplicação. As distâncias são usadas para calcular u m
Ry com a seguinte equação:
distância do ponto de aplicação ao centro da mancha
distância do ponto de aplicação à frente do solvente
A provável identificação é feita por comparação dos valores
de Rf e as cores características dos aminoácidos desconhecidos
com os valores da misturas de referência dos aminoácidos genuí-
nos cromatografados ao mesmo tempo.
Testes Fotométricos de Rastreamento da Urina
Vários testes qualitativos são usados para o rastreamento, para a
oh +pR_t
avaliação ao acaso, ou informações complementares. Esses testes
deste livro. 1
Aldeído
0 0
Vi
o nó
I
O teste de Guthrie é u m exame microbiológico semiquantitativo.
Os esporos de bactéria, geralmente Bariííui íubtifa, são incorpo-
rados em u m meio de ágar ao qual f o i adicionado u m i n i b i d o r
Produto colorido de crescimento específico para o aminoácido a ser avaliado. O
i n i b i d o r geralmente tem uma estrutura molecular similar à do
aminoácido de interesse. Na prática, sangue ou urina do paciente
é colocado sobre u m pedaço de papel de filtro macio, e u m
círculo padronizado é "pressionado" sobre o papel e transferido
para a superfície do ágar. A placa da ágar é, então, incubada e
posteriormente observada com relação ao crescimento bacte-
riano. Na presença de concentrações elevadas do aminoácido de
interesse, o efeito do i n i b i d o r de crescimento é reduzido ou
superado, e zonas de crescimento bacteriano são observadas. O
sistema de teste é construído para mostrar crescimento somente
quando a concentração do aminoácido de interesse excede seu
limite de referência superior.
Testes Quantitativos
Os aminoácidos são medidos quantitativamente nos líquidos
corporais com uma variedade de técnicas i n c l u i n d o (1) eletrofo-

tese capilar (CE), (2) cromatografia gasosa (GC), (3) cromatogra-
fia líquida de alta eficiência (HPLC), (4) cromatografia liquida
de troca iônica e (MS-MS) espectrometria de massa seqüencial.
Eletroforese Capilar
E m CE, as técnicas clássicas de eletroforese são realizadas em
tubos capilares de 20 a 200 cm de comprimento (Capítulo 7) de
sílica fundida e de calibre pequeno (10 a 100 (J.m). Q u a n d o
acoplados a detectores sensíveis, a CE é capaz de medir quanti-
dades fentomolares de aminoácidos.
Cromatografia Gasosa
As vantagens de G C incluem o tamanho pequeno da amostra e
a rapidez, mas u m a limitação importante é a volatilidade relati-
vamente baixa de aminoácidos em temperaturas convencional-
mente usadas nessa técnica. Entretanto, é possível derivar quimi-
camente esses aminoácidos para aumentar sua volatilidade e
melhorar suas características cromatográficas e de detecção.
Cromatografia Líquida de Alta Performance
Por causa de sua alta resolução e do tempo de análise relativa-
mente curto, a H P L C é amplamente usadà para medir aminoá-
cidos em amostras biológicas. A principal vantagem da H P L C
sobre a G C é que as temperaturas relativamente altas necessárias
pata a volatilização das amostras em G C não são necessárias nessa
técnica. Portanto, a possibilidade de decomposição de aminoáci-
dos em temperaturas elevadas é evitada.
Somente poucos aminoácidos são detectados por espectrofotô-
metros de ultravioleta (UV) ou luz visível, fluorímetros, ou detec-
tores eletroquímicos que são rotineiramente utilizados com os
analisadores de HPLC. Conseqüentemente, os aminoácidos são
comumente derivados para análise por H P L C . As derivações pós-
coluna com ninidrina ou reagentes fluorogênicos, tais como
o-ftaldialdeido ou fluorescamina, têm sido empregados com sucesso
para fms de detecção. As técnicas de derivação pré-coluna usando
(1) o-ftaldialdeído, (2) dansil, (3) fenil isotiocianato o u (4) derivados
de 9-fluorenilmetil cíoToformato têm sido utilizadas n a H P L C de
fase reversa. Métodos sensíveis q u e acoplam detecção eletroquí-
mica e derivação química também têm sido desenvolvidos.
Cromatografia Líquida de Troca Iônica
A cromatografia líquida de troca iônica tem sido amplamente
empregada para separar e quantificar aminoácidos em uma varie-
dade de amostras. Após a separação, os aminoácidos eluídos são
misturados com n i n i d r i n a ou algum outro indicador em u m
reator pós-coluna. As espécies coloridas resultantes são, então,
detectadas com u m espectrofotô metro, u m fluorímetro o u outros
aparelhos de detecção acoplados. Os aminoácidos são identifica-
dos através da comparação dos tempos de retenção dos compo-
nentes da amostra com os dos compostos de referência. A quan-
tificação é feita comparando-se as áreas ou as alturas do pico da
amostra com as de conjuntos de calibradores ou, alternativa-
mente, usando se uma técnica de padronização interna. A detec-
ção fluorimétrica com fluorescamina e o-ftaldialdeído tem dimi-
nuído os limites de detecção, e colunas mais curtas e mais finas
empacotadas com partículas menores operando a taxas de fluxo
mais elevadas têm d i m i n u í d o o tempo necessário para análise.
Espectrometria de Massa Seqüencial
M S / M S se aplica à análise rápida de analitos específicos em
líquidos biológicos complexos (Capítulo 8). A MS-MS tem sido
utilizada para rastrear neonatos com relação a doenças associadas
ao metabolismo de aminoácido, como fenilcetonúria (PKU),
doença da urina de xarope de bordo ( M S U D ) , tirosinemia, hiper-
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 303
metioninemias e homocistinúria. 8 Comparada com os métodos
mais antigos, a MS-MS (1) é uma técnica mais sensível, (2) oferece
maior acurácia e precisão e (3) tem especificidade e sensibilidade
clínicas mais elevadas. Conseqüentemente, gera menos resulta-
dos falso-negativos e falso-positivos.
Testes de Aminoácidos Específicos
A l é m das técnicas analíticas gerais discutidas anteriormente,
existe uma variedade de testes simples específicos para os diferen-
tes aminoácidos. Esses testes são usados n o diagnóstico de doenças
específicas.
PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
O corpo h u m a n o contém milhares de proteínas diferentes.5,11,12
Muitas são elementos estruturais de células ou tecidos organiza-
dos; outras são solúveis nos líquidos intra e extracelulares.
Bioquímica Básica
As proteínas são polímeros de aminoácidos ligados covalente-
mente através de ligações peptídicas. Cadeias m u i t o curtas de
aminoácidos ligados são denominadas dipeptídios, tripeptídíos,
tetrapeptídios o u pentapeptídios. Cadeias maiores que cinco Tesí-
duos em comprimento são chamadas oligopeptídios. Cadeias
maiores (6 a 30 resíduos) são designadas polipeptídios. Q u a n d o
o número de aminoácidos ligados excede 40 (massa molecular ~5
kDa), a cadeia assume propriedades físicas associadas a proteínas.
Os diferentes grupos R encontrados nos aminoácidos fornecem
aos peptídios e proteínas estruturas e funções diversas.
Estrutura
As proteínas são classificadas como fibrosas (principalmente
estruturais) ou globulares. Algumas proteínas fibrosas como (1)
fíbrinogênio, (2) troponina, (3) colágeno e (4) miosina são de
interesse clínico. A maioria das proteínas de interesse clinico,
contudo, é de proteínas globulares solúveis, tais como (1) hemo-
globina, (2) enzimas, (3) hormônios peptídios e (4) proteínas
plasmáticas. A curvatura e o dobramento complexos das cadeias
polipeptídicas resultam de inúmeras interações dos grupos R de
seus aminoácidos estruturais. Proteínas globulares são compac-
tas e têm pouco ou n e n h u m espaço para água no interior da
molécula, onde se encontra a maioria dos grupos R hidrofóbicos.
Grande parte dos grupos R polares está localizada na superfície
da proteína, onde exercem uma influência importante (1) solu-
bilidade, (2) comportamento ácido-básico e (3) mobilidade ele-
troforética da proteína.
A maioria das proteínas globulares retém suas atividades bio-
lógicas somente dentro de faixas estreitas de temperatura e p H .
Períodos de exposição a altas temperaturas ou extremos de p H
fazem com que as moléculas de proteínas "desnaturem" e percam
suas solubilidades e atividades biológicas. Por exemplo, muitas
enzimas perdem suas funções catalíticas após desnaturarem (Capí-
tulo 9).
As proteínas globulares têm quatro classificações de estru-
tura:
1. Estrutura primária se refere à identidade e à ordem específica
de resíduos de aminoácidos na cadeia polipeptídica. Essa
seqüência, que depende exclusivamente das ligações covalen-
tes (peptídicas), é predeterminada pelo D N A codificador.
2. Estrutura secundária é u m arranjo regularmente repetido no
espaço da estrutura primária que se estende ao longo de uma
dimensão. As estruturas secundárias de muitas proteínas glo-
bulares têm extensões de a-hélice, folha p-pregueada e eno-
velamentos aleatórios (random coih), todos dependentes de
304 PARTE IV Analitos
i n ú m e r a s pontes de h i d r o g ê n i o e, ocasionalmente, de pontes
dissulfeto covalentes.
3. E s t r u t u r a terciária envolve o d o b r a m e n t o i n t r a m o l e c u l a r da
cadeia p o l i p e p t í d i c a em u m a estrutura t r i d i m e n s i o n a l com-
pacta c o m u m a forma específica.
4. E s t r u t u r a quaternária se refere à associação de várias cadeias
polipeptídicas o u subunidades e m uma u n i d a d e agregada
"oligoméiica" maior.
M u i t a s proteínas c o n t ê m c o m p o n e n t e s que não são aminoácidos
conhecidos c o m o grupos prostéticos. Tais proteínas freqüente-
m e n t e são designadas c o m o proteínas conjugadas e são classifi-
cadas de acordo c o m a natureza de seus grupos prostéticos c o m o
(1) metaloproteínas, (2) l i p o p r o t e í n a s , (3) ghcoproteínas, (4)
m u c o p r o t e í n a s e (5) fosfoproteínas. T a n t o as glicoproteínas
q u a n t o as m u c o p r o t e i n a s t ê m grupos prostéticos glirídicos cova-
l e n t e m e n t e ligados. A q u a n t i d a d e de carboidrato varia de 5 % a
1 5 % nas glicoproteínas, e d e 1 5 % a 7 5 % n a s mucoproteínas. As
proteínas conjugadas livres de seus grupos prostéticos são conhe-
cidas c o m o apoproteínas.
Propriedades
M u i t a s propriedades das proteínas são usadas para a sua separa-
ção, identificação e análise. D e n t r e elas encontram-se as cinco
propriedades a seguir:
1. Ta?"tiiínfio molecular-, A m a i o r i a das proteínas consiste em
macro moléculas de alto peso molecular. D e v i d o aos tama-
n h o s e às diferentes massas moleculares das proteínas, é pos-
sível separá-las de moléculas menores p o r (1) diálise, (2) ultra-
filtração, (3) cromatografia de filtração e m gel e (4) ultracen-
trifugação e m gradiente de densidade.
2. Solubilidade diferencial: A s o l u b i l i d a d e das proteínas é afetada
p o r (1) p H , (2) força iônica, (3) temperatura e (4) constante
dielétrica do solvente. Q u a n d o esses parâmetros v a r i a m , as
diferentes proteínas tornam-se mais o u menos solúveis. Por
exemplo, c o m variações na força iônica de u m a solução, as
proteínas se t o r n a m mais solúveis (".wítmg-in") o u m e n o s solú-
veis ("salting-out").
3. Carga elétrica-. O efeito d o p H i n t r o d u z i n d o , a u m e n t a n d o o u
alterando as cargas superficiais de u m a proteína cria várias
espécies de cargas diferentes que m i g r a m a diferentes taxas em
u m campo elétrico. A separação p o r eletroforese e a focalização
isoelétrica são baseadas nesse c o m p o r t a m e n t o . A cromatogra-
fia de troca iônica é baseada nas interações eletrostáticas de
proteínas carregadas c o m u m m e i o sólido c o m carga oposta.
4. Adsorção em materiais inertes finamente diuídidos: Esses materiais
oferecem grandes áreas superficiais paia as interações c o m pro-
teínas. Essas interações p o d e m ser (1) hidrofóbicas, (2) absorti-
vas, (3) iónicas o u (4) moleculares (pontes de hidrogênio)
5. Ligações específicas a anticorpos, coenzirrMs ou receptores de hormô-
nios: A p r o p r i e d a d e ú n i c a de u m a proteína de reconhecer e
se ligar a u m composto c o m p l e m e n t a r c o m alta especificidade
é a base dos ensaios i m u n o q u í m i c o s ( C a p í t u l o 10). As proteí-
nas t a m b é m p o d e m ser separadas por cromatografia de afini-
dade, na q u a l u m ligante associado a u m m e i o sólido fornece
alta seletividade.
Funções
As proteínas e x i b e m inúmeras funções biológicas. Por exemplo,
(1) as enzimas são proteínas que catalisam reações b i o q u í m i c a s
essenciais ao m e t a b o l i s m o ; (2) h o r m ô n i o s protéicos, p o l i p e p t í d i -
cos e oligopeptídicos regulam o m e t a b o l i s m o ; e (3) a n t i c o r p o s e
componentes do sistema de c o m p l e m e n t o protegem contra infec-
ções.10 A l é m disso, proteínas plasmáticas m a n t ê m a pressão osmó-
tica d o plasma. Elas t r a n s p o r t a m h o r m ô n i o s , v i t a m i n a s , metais
e drogas servindo, f r e q ü e n t e m e n t e , c o m o reservatórios para sua
liberação e uso. A s a p o l i p o p r o t e í n a s s o l u b i l i z a m l i p í d i o s ; a hemo-
g l o b i n a t r a n s p o r t a oxigênio; e os fatores de coagulação protéicos
afetam a hemostasia.
Centenas de proteinas diferentes estão presentes n o plasma
sanguíneo e são conhecidas, coletivamente, c o m o proteínas plas-
máticas. A m a i o r i a é sintetizada n o fígado e se move para a
corrente sanguínea através dos sinusóides hepáticos e das veias
centrais do fígado ( C a p í t u l o 36). As proteínas plasmáticas circu-
l a m n o sangue e entre o m e s m o e os espaços extracelulares dos
tecidos. Seu m o v i m e n t o extravascular ocorre não apenas p o r
difusão passiva, mas t a m b é m p o r mecanismos de transporte
ativo, pinocítose e exocitose através e a p a r t i r das células. A
m a i o r i a das proteínas plasmáticas é catabolizada n o fígado. Para
algumas proteínas o s i n a l que marca para a degradação parece
ser a perda de parte de o u t o d o o c o n t e ú d o de ácido siálico.
U m a alteração c o m u m , relevante para o l a b o r a t ó r i o clínico,
nas concentrações de proteinas e m doenças resulta da resposta
o u reação de fase aguda (APR), u m a resposta i n específica a
i n f l a m a ç ã o (infecções, doenças auto-imunes etc.) o u lesão teci-
d u a l (trauma, cirurgia, i n f a r t o d o m i o c á r d i o o u tumores). As
proteínas afetadas são conhecidas c o m o proteínas de fase aguda
(APPs). Proteínas c o m o (1) a r a n t i t r i p s i n a , (2) a r g l i c o p r o t e í n a
ácida, (3) h a p t o g l o b i n a , (4) c e r u l o p l a s m i n a , (5) C 4 , (6) C 3 e (?)
proteínas C-reativa (CPR), apresentam concentrações aumenta-
das em resposta a u m a A P R e são conhecidas c o m o A P Ps positivas.
Outras, i n c l u i n d o (1) t r a n s t i r r e t i n a , (2) a l b u m i n a e (3) transfer-
r i n a , d i m i n u e m e são designadas A P P j negativas. As alterações nas
concentrações de proteínas plasmáticas são desencadeadas p o r
citocinas liberadas n o local da i n j ú r i a . As concentrações plasmá-
ticas de cada proteína A P R m u d a m a diferentes taxas após o d a n o
i n i c i a l (Figura 18-3). N a prática, essas mudanças são úteis para a
dctccção dc inflamação, e medidas seqüenciais de p r o t e í n a s , tais
c o m o CRP, são úteis n o m o n i t o r a m e n t o do progresso da infla-
mação o u sua resposta ao t r a t a m e n t o .
N a Tabela 18-2 encontram-se listadas as propriedades das
p r i n c i p a i s proteínas plasmáticas. As proteínas estão listadas na
o r d e m de suas m o b i l i d a d e s eletroforéticas em géis de agarose e m
p H 8,6. Seus intervalos de referência t e m p o r á r i o s para adultos
estão listados na Tabela 18-83. Esses intervalos se baseiam na
calibração usando E R M - D A 4 7 0 ( M a t e r i a l de Referência E u r o p e u ,
C l í n i c o [ D ] Proteínas IA]).
Tipos de Proteínas Plasmáticas
A discussão a seguir é l i m i t a d a a várias das mais i m p o r t a n t e s
proteínas plasmáticas.
Albumina
A a l b u m i n a é u m a proteína g l o b u l a r pequena c o m uma massa
m o l e c u l a r de 66,3 k D a . E a p r o t e í n a mais a b u n d a n t e encontrada
n o plasma a p a r t i r do m e i o da gestação até a m o r t e , sendo res-
ponsável p o r a p r o x i m a d a m e n t e metade da massa correspondente
às proteínas plasmáticas. Por causa de sua alta concentração
plasmática e de seu t a m a n h o relativamente pequeno, a a l b u m i n a
t a m b é m é o p r i n c i p a l c o m p o n e n t e proteico da m a i o r i a dos l í q u i -
dos corporais extravasculares, i n c l u i n d o (1) CSF, (2) l í q u i d o
intersticial, (3) u r i n a e (4) l í q u i d o a m n i ó t i c o . A p r o x i m a d a m e n t e
6 0 % d o t o t a l da a l b u m i n a do c o r p o se e n c o n t r a n o espaço extra-
vascular. Ela não t e m cadeias laterais de c a r b o i d r a t o , mas é alta-
m e n t e solúvel em água devido à sua elevada carga l í q u i d a nega-
tiva em p H fisiológico.
Bioquímica e Função
A a l b u m i n a é sintetizada, p r i n c i p a l m e n t e , pelas células parenqui-
mais hepáticas. A capacidade sintética d o fígado é enorme. Por
exemplo, na s í n d r o m e nefrótica, a taxa de síntese p o d e ser 3 0 0 %
 Figura 18-3 Aumento; relativos de reagentes de fase aguda após um insulto agudo de curta duração. As
concentrações são expressas como múltiplas do limite superior do intervalo de referência. A linha tracejada
representa o limite de referência superior. CRP, proteina O reativa; AAT, a r antittipsina; C3, fator 3 do
complemento.

TABELA 18-2 | Propriedades de Proteínas Plasmáticas Selecionadas

Região Método de
Eletroforética Proteína Meia-vida P1 MW (D n Itens) Análise Preterido Comentários

Proteína de ligação 12 h 21.000 IN, IT, RID Transporta retinol

ao retinol (RBP) (vitamina A); complexada
com TTR
Translirretina (TTR) 48 h 4,7 54.980 IN, IT, RID Transporta hormônios
tireodianos, RBP
Albumina 15-19 dias 4-5,8 66.300 IN, IT, RID tira Uma proteína de transporte
reagente geral; mantém a pressão
osmótica do plasma
cti an-An1itripsina (AAT) 4 dias 4,8 51.000 IN, IT Inibidor de protease,
especialmente elastase
a,-Glicoprote[na ácida 5 dias 2,7-4 40,000 IN, IT, RID Função obscura; liga drogas
{AAG, orosomucúide) catiônicas e hormônios
a-rFetoproteína (AFP) 69.000 RIA, EIA, polarização Proteína fetal principal;
de fluorescência análogo de albumina
a2 Haptoglobina {Hp, HAP) 2 dias 4,1* 85.000-840.000 IN, IT Liga-se á hemoglobina;
reduzida por hemólise
a 2 - Macroglobulina 5 dias 5,4 720.000 IN, IT, RID Inibidor de enzima
(AMG) proieolítica geral
Ceruloplasmina (CER) 4,5 dias 4,4 132.000 IN, IT, RID, enzimática Oxidante-antloxidante
(especialmente para
ferro)
Pi Transferriria (Tl, 7 dias 5,7 79.600 IN, IT, RID Transporta ferro
siderofilina)
C4 206.000 IN, IT, RID Fator do complemento
Ps C3 180.000 IN, IT, RID Fator do complemento
PrMicroglobulina 11.800 RIA, EIA Usada para testar a
(BMG) função tubular renal;
elevada na linfocitose ou
quebra de linfócitos
y IflG 24 dias 6-7,3 144.000-150.000 IN, IT, imunotixação Anticorpo
igA 6 dias ~ 160.000 IN, IT, imunotixação Anticorpo
igM 5 dias 900.000 Netelometria, Anticorpo
imunotixação
Proteína C-reativa 6,2 -115.000 RID, RIA, IN, ÍT, Defesa não-específica contra
(CRP) imunoensaio da agentes infecciosos;
enzima homogênea remoção de restos
celulares

EIA, Enzima imunoensaio; IN, imunonefelomecna; IT, imunomibídimetiia; RIA, radioim uno ensaio; RID, i mu no difusão radial.
*Para o fenótipo Hp 1-1.
306 PARTE IV Analitos

TABELA 18-3 Intervalos de Referência Consenso Analbuminemia. Indivíduos com essa deficiência genética rara
T e m p o r á r i o s p a r a 14 P r o t e í n a s P l a s m á t i c a s d o
têm concentrações de albumina plasmática menores que 0,5 g / L ,
podendo ser moderadas no caso de edema. As manifestações
Soro H u m a n o R e f e r e n t e a E R M - D A 4 7 0 *
clínicas mais importantes estão relacionadas com o transporte
Proteína g/L mg/dL anormal de lipídios.
arGliccproteína ácida 0,5-1,2 50-120 Inflamação. As inflamações aguda e crônica são as causas mais
Albumina 35-52 3.500-5.200 comuns de hipoalbuminemia, resultante de (1) hemodiluição, (2)
ctrAniitripsina 0,9-2,0 90-200 perda para o espaço extravascular, (3) consumo elevado pelas
C3* 0,9-1,3t 90-1 aot células e (4) síntese reduzida.
C4 0,1-0,4 10-40 Doença Hepática. As concentrações reduzidas de albumina pre-
Ceruloplasmina 0,2-0,6 20-60 sentes na maioria dos casos de doença hepatocelular resultam de
Proteína C-reativa < 0,005 <0,5 (1) concentrações elevadas de imunoglobulina, (2) perda para o
Haptcglobina 0,3-2,0 30-200 espaço extravascular e (3) inibição direta da síntese por toxinas e
IgA 0,7-4,0 70-400 álcool. O fígado é capaz de sintetizar quantidades aumentadas de
igG 7-16 700-1.600
albumina até que o dano ou a perda parenquimal hepática sejam
igM 0,4-2,3 40-230
graves, com a perda de aproximadamente 95% da função.
Transtirretira (pré-albumina) 0,2-0,4 20-40
Perda Urinária. O glomérulo renal atua como uma peneira
a 2 -Macrcglobulina 1,3-3,0 130-300
molecular, excretando qualquer substância a uma taxa inversa-
Transferrina 2,0-3,6 200-360
mente proporcional ao seu raio molecular. C o m o a albumina é
De Dati Fj Schumann G, Thomas L, et al. Consensus of a group of relativamente pequena e globular, quantidades significativas são
Professional societies and diagnostic companies on giiidelmes for ínterim
filtradas para a urina glomerular. EntretantOi a maior parte da
reference ranges for 14 proteins in setum based on the standardhation
albumina é reabsorvida pelas células tubulares proximais. A urina
against the I F C C / B C R / C A P reference material (CRM 470). Eor ] Clin
n o r m a l excretada contém até 20 mg de albumina por grama de
C h e m Clin Biochem 1996; 34:517-20.
Estes valores se aplicam apenas para adultos entre 20 e 60 anos de idade. creatinina. Excreção acima desse valor sugere (1) filtração glome-
*ERM-DA470 (Material de Referência Europeu, Clinico [D] Proteínas [A]) era rular aumentada, (2) dano tubular ou hematúria ou (3) uma
inicialmente conhecido como Material de Referência Certificado 470 (CRM 470). combinação desses dois fatores.
1
Os valores são levemente mais baixos em amostras frescas (analisado menos Filtração elevada também ocorre em caso de exercício físico
de 8 h após a coleta).
e febre; portanto, a albumina urinária deve seT analisada sob
condições controladas e repetida se existir dúvida clínica com
relação à causa das concentrações aumentadas. Excreção mode-
radamente elevada (20 a 300 m g / L ) , ou microalbuminúria,
parece predizer o desenvolvimento futuro de doença renal clínica
ou mais da sua taxa normal. A taxa de síntese da albumina é em indivíduos com hipertensão o u diabetes meííitus. Exceto para
controlada, piincipaímente, pela pressão osmótica coloidal a analbuminemia hereditária, as menores concentrações de albu-
(COP), e também pelo consumo de proteínas. A l é m disso, a m i n a plasmática estão presentes em indivíduos com síndrome
síntese é d i m i n u í d a por citocmas inflamatórias. O catabolismo nefrótica ativa, associada à perda acentuadamente aumentada da
ocorre, principalmente, por pinocitose em todos os tecidos, com maioria das proteínas de tamanhos pequeno e médio para a urina
reutilização dos aminoácidos livres resultantes para a síntese de glomerular.
proteínas celulares. A meia-vida normal da albumina n o plasma Perda Gastrointestinal. Doença inflamatória do trato intestinal
é de 15 a 19 dias. está associada à perda gastrointestinal (GI) elevada de albumina.
A principal função da albumina é a manutenção da C O P Esse aumento geralmente é de pouco interesse a menos que a
tanto nos espaços vasculares como nos extravasculares. A albu- perda seja excessiva'ou persista. Enteropatia com perda protéica
mina também se liga a e transporta u m grande número de com- crônica pode resultar em perda similar àquela observada na sín-
postos, incluindo (1) ácidos graxos livres, (2) fosfolipídios, (3) íons drome nefrótica.
metálicos, (4) aminoácidos, (5) drogas, (6) hormônios e (7) bilir- Má Nutrição de Energia e Proteína. As concentrações de albu-
rubina. mina têm sido usadas para ajudar a detectar e monitorar o estado
A albumina é codificada por u m gene localizado no braço nutricional protéico. N o entanto, concentrações baixas geral-
longo do cromossomo 4, intimamente ligado aos genes da mente não se correlacionam com o grau de má nutrição, sendo
a-fetoproteína e da globulma de ligação à vitamina D, que com- mais freqüentemente provocadas pela APR.
partilham grande homologia de seqüência com a albumina. Mais Edema e Ascite. As concentrações plasmáticas de albumina
de 80 variantes genéticas têm sido descritas. Todas são herdadas são diminuídas em presença de edema e ascites. Entretanto,
em u m padrão autossômico codominante, com expressão, em edema e ascites geralmente são decorrentes de permeabilidade
heterozigotos, de ambos os produtos gênicos. Muitos isotipos vascular aumentada, em vez de hipoalbuminemia per se. As con-
t ê m migração eletroforética alterada, resultando na chamada centrações de albumina nesses fluidos variam de m u i t o baixas a
bisalbummemia. C o n t u d o , drogas e metabólitos ligados também mais altas do que as do plasma.
podem alterar a migração eletroforética da albumina. Poucas
variantes têm afinidades de ligação anormais para a tiroxina (T4). Considerações Laboratoriais
Indivíduos afetados são eutireóideo, mas têm soro total e con- A maioria dos laboratórios clínicos analisa a albumina por
centrações de T 4 livre anormais. métodos automatizados de ligação a corantes, usando os corantes
verde de bromocresol (BCG) ou p ú r p u r a de bromocresol (BCP).
Importância Clínica Esses corantes têm maior afinidade por albumina, portanto, a
Concentrações elevadas de albumina estão presentes somente na taxa inicial de ligação geralmente é medida e relacionada com a
desidratação aguda e não têm importância clínica. Concentra- concentração de albumina na amostra. O uso do soro é recomen'
ções reduzidas são vistas em inúmeras condicões clínicas. dado porque essas análises superestimam a albumina em pre-

seriça de fibrinogênio e lieparina A l é m disso, essas análises
tendem a ser inexatas se o padrão de proteína sérica global for
anormal. Nesses casos, a quantificação imunoquímica é recomen-
dada. Outros ligantes, incluindo drogas e metabólitos, ligam-se à
albumina, mas geralmente não afetam de forma significativa as
análises de ligação a corante de soro ou plasma a menos que suas
concentrações sejam extremamente altas. Os métodos imunoquí-
micos usados para soro são também usados para analisar concen-
trações m u i t o baixas de albumina em urina não-diluída, sendo
m u i t o rápidos e precisos. Os intervalos de referência estão lista-
dos na Tabela 18-3.
ai-Glicoproteína Ácida
A a r g l i c o p r o t e í n a ácida (AAG), também conhecida como oroso-
•mucóide, contém u m alto porcentual de carboidrato com u m
grande número de resíduos de ácido siálico. Portanto, tem uma
carga líquida negativa m u i t o alta e é m u i t o solúvel em água. Ela
é o principal constituinte da fração seromucóide do plasma, u m
grupo de proteínas precipitadas por HCIO^ e outros ácidos
fortes.
Bioquímica e Função
A A A G é classificada como u m a das lipocalinas — proteínas que
ligam substâncias lipofílicas. Cada molécula de A A G contém 181
aminoácidos e uma massa molecular total de 40 kDa, da qual
aproximadamente 45% são carboidratos, incluindo 11% a 12%
de ácido siálico. Ela é sintetizada, principalmente, pelas células
parenquimais hepáticas, e o catabolismo resulta na remoção da
proteína sem ácido siálico pelos receptores hepáticos de asialogli-
coproteína.
Embora sua verdadeira função fisiológica seja desconhecida,
A A G se liga a e inativa hormônios básicos e lipofílicos, i n c l u i n d o
progesterona e o antagonista de progesterona R U 486. A A G
também se liga a e reduz a biodisponibilidade de muitas drogas,
i n c l u i n d o (1) propranolol, (2) quinidina, (3) clorpromazina, (4)
cocaína e (5) benzodiazepinas. Se as concentrações de A A G são
elevadas, pode ser necessário aumentar as dosagens da droga para
compensar essa ligação aumentada.
importância Clínica
As concentrações de A A G aumentam na APR, especialmente na
doença inflamatória gastrointestinal (Gl) e nas neoplasias malig-
nas. As concentrações são aumentadas pelos corticosteróides e
algumas drogas antiinflamatórias não-esteróides (NSAIDs). Estró-
genos (p. ex., da gravidez ou contracepção oral) d i m i n u e m a
síntese de AAG. 3 '' As concentrações também são baixas nas sín-
dromes de perda protéica, tais como a síndrome nefrótica. Diver-
sas variantes genéticas de A A G são conhecidas; entretanto, elas
não são clinicamente importantes.
TABELA 18-4 Outros Inibidores de Protease
Inibidor Peso Molecular (kDA)
«rAntiquimiotripsina 68
a 2 -Antiplasmina 70
Antitrombina III1 65
Inibidor de C l 1 104
Inibidor de inter-a-tripsina 160
* Vdríos inibidores se ligam e inatkiam o antigeno específico tia próstata (PSA), incluindo a rAn ti rrip j ina, a-M ücroglo&u linfl e a2-Antipiíismin£i.
Os complexos de aj-íiníiqnimionipjín/i geralmente são os que /rrcdomí riam no soro ou no plasma, fwtmeímente por causa cio desaparecimento rápido dos outros. Os níveis de P
complexada são aumentados na maioria dos {wcienrei com câncer de próstata, quando comparados com indivíduos normais ou com os que apresentam fiipertrofia. prostática benigna
fDeficiências quantitativas e qualitativas (funcional) relatadas.
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 307
Considerações Laboratoriais
Embora A A G seja uma das proteínas de mais alta concentração
na região da (Xx-globulina na eletroforese de soro de rotina, ela
não cora bem com corantes de proteína por causa de seu alto
conteúdo de C H O . Ela pode ser visualizada pelo uso de ácido
periódico de Schiff ou outros corantes de carboidrato. A A G é
quantificada por todos os métodos imunoquímicos, i n c l u i n d o
turbidimetria e nefelometria. Os intervalos de referência estão
listados na Tabela 18-3.
a i-Antitripsina
A cij-antitripsina (AAT) é uma serpina (inibidor da serina protei-
nase) que inativa as serinas proteases, especialmente aquelas estru-
turalmente relacionadas com tripsina. Outras serpinas incluem (1)
a^-antiquimiotripsina, (2) a 2 -antiplasmina, (3) antitrombina 111 e
(4) inibidor de C l (Tabela 18-4).
Bioquímica e Função
A A T é sintetizada, principalmente, pelas células parenquimais
hepáticas. O catabolismo também ocorre em células parenqui-
mais hepáticas por duas vias. E m uma, os complexos AAT-protease
são removidos por receptores do complexo serpina-enzima. Em
outra, a A A T sem ácido siálico é removida por receptores de
asialoglicopToteína hepáticos.
Em termos molares, a A A T é o inibidor de proteinase de mais
alta concentração no plasma. Fisiologicamente, é o i n i b i d o r mais
importante da elastase leucocitária, liberada no processo de fago-
citose pelos leucócitos p o l i m o r f o nucleares. Essa enzima também
reage com a elastina na árvore traqueobrônquica e no endotélio
vascular. O tamanho relativamente pequeno da A A T e a facili-
dade de difusão para esses tecidos são importantes na prevenção
da perda do recolhimento elástico. A elastase não-inibida na
árvore brônquica em virtude do excesso de elastase ou de uma
deficiência em A A T pode resultar em perda do recolhimento
elástico e desenvolvimento do enfisema.
Pelo menos 75 variantes genéticas de A A T são conhecidas,
sendo que muitas delas estão associadas a baixas concentrações
séricas. O fenótipo selvagem c o m u m é Pi M M ; os fenótipos
associados à deficiência mais comuns e de importância clínica
são Pi ZZ e SZ. Outros fenótipos incluem Pi M Z e Pi SS. Os
indivíduos nulos raros não têm A A T .
Importância Clínica
As concentrações de A A T são elevadas pela A P R e pelos estróge-
nos (de gravidez, contracepção oral). Secundariamente, as con-
centrações de A A T são baixas em indivíduos com (1) síndrome
do desconforto respiratório neonatal, (2) pancreatite grave e (3)
doenças associadas à perda protéica. Concentrações diminuídas
de A A T provocadas por deficiência genética, ou primária, estão
Proteases Fisiológicas Inibidas Doenças Associadas à Deficiência
Catepsina G; quinase de mastócitas; Cirrose hepática; asma; enfisema
antígeno especííico da próstata *
Plasmína Hemorragia (aumenta a lise de coágulo)
Trombina Tromboembolismo
C1r, C1s Angioedema hereditário
Desconhecida Nenhuma conhecida
308 PARTE IV Analitos
associadas a u m risco m u i t o alto de desenvolvimento de enfisema
pulmonar basilar (ao contrário da doença apical presente em
outras formas de enfisema). O início da doença geralmente
ocorre m u i t o mais cedo do que pata a maioria das outras formas
de enfisema, com as alterações se iniciando n o f i n a l da segunda
até a quarta décadas de vida em 90% dos indivíduos Pi ZZ. O
processo é aumentado pela poluição do ar e fumaça de cigarro.
A deficiência de A A T também está associada a doenças do
fígado, incluindo colestase neonatal, cirrose e carcinoma hepato-
celular. A colestase neonatal, ou "hepatite", é vista mais comu-
mente entre 3 e 8 semanas de vida e geralmente regride após
poucas semanas. Os duetos biliares intra e extra-hepáticos podem
ser pequenos, provavelmente por causa do fluxo biliar d i m i n u í d o .
Diferenciar essa doença da atresia biliar é importante porque a
mortalidade é alta nos bebês Pi ZZ submetidos a cirurgias impor-
tantes. A l é m disso, os indivíduos com deficiência em A A T apre-
sentam u m risco significativamente maior de desenvolver câncer
primário de fígado.
U m a variante, Pi Mpittsburghi tem uma substituição de aminoá-
cido met —> arg que resulta em maior atividade contra enzimas
de coagulação, incluindo trombina e calicreína. Os heterozigotos
para essa variante têm uma doença hemorrágica ocasionada por
seus efeitos anticoagulantes.
Considerações Laboratoriais
A A A T é o principal constituinte da banda de a r g l o b u l i n a na
eletroforese de soro da rotina clínica. A A A G e a ra-lipoproteína
também estão incluídas na banda de a r g l o b u l m a , mas não coram
bem com corantes de peptídios por causa do seu conteúdo
elevado de C H O e lipídio, respectivamente. Algumas variantes
genéticas de A A T podem ser detectáveis pelo exame visual do
padrão eletroforético devido à mobilidade alterada o u à concen-
tração diminuída, Existem de cinco a oito bandas de A A T na
eletroforese em gel ácido ou focalização isoelétrica (pis de apro-
ximadamente 4,2 a 4,9, dependendo do fenótipo genético).
Geralmente a A A T é quantificada por métodos imunoturbi-
dimétricos e imunonefelométricos. C o m o ela constitui cerca de
90% dos inibidores séricos da atividade de tripsina ou de elastase
contra substratos pequenos, tais como benzoil-DL-arginina-p-
nitroanilida, também tem sido semiquantificada pela capacidade
inibidora do soro para essas enzimas; entretanto, esse exame não
é específico para A A T . Os intervalos de referência estão listados
na Tabela 18-3.
a1 -Fetoproteína
A drfetoproteína (AFP) é uma das primeiras a-globulinas a apa-
recer n o soro de mamíferos durante o desenvolvimento do embrião
e é a proteína sérica dominante n o início da fase embrionária. A
AFP reaparece no soro de adultos durante certas patologias.
Bioquímica e Função
A AFP é u m análogo de albumina, contendo aproximadamente
4 % de carboidrato, com uma massa molecular de aproximada-
mente 70 kDa. E uma proteína importante no soro fetal, sinteti-
zada principalmente pelo saco vitelino fetal e fígado. A AFP é
visível entre a albumina e A A T na eletroforese do soro fetal ou
do neonato.
Importância Clínica
AFP elevada no líquido amniótico ou no soro materno indica a
possibilidade de u m tubo neural aberto ou u m defeito da parede
abdominal do feto. A concentração de AFP também é aumentada
em condições de (1) gestação múltipla, (2) morte fetal, (3) hemor-
ragias fetomaternas e (4) estimativa incorreta da idade gestacional
(Capítulo 43). A l é m disso, a concentração da AFP sérica é aumen-
tada em presença de muitas formas de carcinomas hepatocelulares
e de células germinativas em crianças e adultos (Capítulo 20).
As concentrações n o soro materno estão diminuídas em
mulheres grávidas de fetos com trissomia do 18 ou do 21. As
deficiências genéticas raras da AFP não parecem trazer qualquer
conseqüência clínica.
a2-Macroglob ulina
A a 2 -macroglobulina ( A M G ) é u m importante inibidor de protei-
nase do plasma. Diferentemente da A A T e da maioria dos outros
inibidores de proteínase, ela é uma molécula m u i t o grande (massa
molecular ~725 kDa) e não se difunde do espaço plasmático para
os líquidos extracelulares em quantidades significativas.
Bioquímica e Função
A A M G inibe muitas classes diferentes de proteinases, incluindo
aquelas com serina, cisteína e íons metálicos em seus sítios proteo-
líticos. Ela não é uma A P R em seres humanos. A A M G é sinteti-
zada, principalmente, pelas células parenquimais hepáticas.
Importância Clínica
Concentrações aumentadas de A M G ocorrem com os efeitos de
estrógenos. Por exemplo, mulheres em idade fértil exibem con-
centrações maiores do que homens da mesma idade. As concen-
trações em bebês e crianças são duas a três vezes as concentrações
de adultos, talvez como u m mecanismo de proteção contra a
exposição elevada a proteases intestinais na primeira infância e
proteases bacterianas e leucocitárias durante as segunda e terceira
infâncias. Concentrações significativamente aumentadas podem
estar presentes em indivíduos com síndrome nefrótica por causa
da perda renal de proteínas de baixa massa molecular e síntese
hepática elevada de todas as proteínas para compensar a resul-
tante concentração sérica baixa de proteínas. Concentrações
diminuídas de A M G estão presentes em indivíduos com pancrea-
tite aguda grave e antes do tratamento de indivíduos com carci-
n o m a avançado de próstata. Embora existam variantes genéticas
de A M G , elas não têm importância clínica conhecida.
Considerações Laboratoriais
Juntas, a A M G e a haptoglobina (Hp) constituem a maioria da
zona de a 2 ' g l ° b u l i n a na eletroforese de soro da rotina clínica. N o
período neonatal e' na hemólise in vivo, a A M G sozinha é o
principal constituinte dessa zona. Os intervalos de referência
estão listados na Tabela 18-3.
\\2-Microglobulina
A p 2 ' m i c r ° g l ° b u l i n a ( B M G ) é uma proteína de baixa massa mole-
cular (11,8 kDa) encontrada nas superfícies celulares de todas as
células nucleadas.
Bioquímica e Função
A B M G é a cadeia leve ou a cadeia (3 dos antígenos leucocitários
humanos (HLAs) e consiste em uma única cadeia polipeptídica
com uma ponte dissulfeto intracadeia e n e n h u m carboidrato.
Alguma B M G é derramada no plasma, particularmente pelos
linfócitos e células tumorais. O tamanho pequeno da molécula
permite que a B M G passe através da membrana glomerular, mas
normalmente menos de 1% da B M G filtrada é excretada na
urina. O restante da B M G é reabsorvido e catabolizado nos
túbulos proximais dos rins.
Importância Clínica
Altas concentrações plasmáticas de B M G ocorrem em indivíduos
com insuficiência renal, inflamação e neoplasias, especialmente

aqueles associados aos linfócitos B. O principal valor clínico da
análise de B M G é testar a função tubular renal em casos de
exposição duvidosa a metais pesados e, particularmente, em
transplantados renais, nos quais a rejeição do enxerto se mani-
festa como função tubular diminuída. C o m o a B M G é sensível
a p H ácido, outras proteínas, como Cti-microglobulina ( A j M ) e
cistatina. C, podem ser mais úteis na urina. (Alternativamente, as
amostras de urina podem ser alcalinizadas.) Análises seqüenciais
de B M G sérica ou plasmática também são úteis para monitorar
tumores de células B.
Ceruloplasmina
A ceruloplasmina (Cp) é uma o^-globulina que contém aproxi-
madamente 95% do cobre sérico total, o que confere a ela uma
cor azulada. Quando as concentrações de C p são significativa-
mente elevadas (p. ex., durante a gravidez) ou os pigmentos
amarelos normais do plasma estão reduzidos, como é visto na
artrite reumatóide ativa, o plasma pode ter u m t o m esverdeado.
Bioquímica e Função
A C p é sintetizada principalmente pelas células parenquimais
hepáticas. O cobre é adicionado à cadeia peptídica por uma
ATPase intracelular. Ele é essencial para o dobramento normal
da cadeia polipeptidica. A apoCp é sintetizada mesmo em ausên-
cia de cobre ou de ATPase, mas a maioria é degradada no meio
intracelular, sendo liberadas apenas quantidades moderadas na
circulação.
A função fisiológica principal da C p envolve reações de
redução e oxidação (redox) n o plasma. Ela funciona como oxi-
dante o u antioxidante, dependendo de fatores, tais como a pre-
sença de íons férricos livres e sítios de ligação da ferritina (Figura
18-4). A Cp é de importância vital na regulação do estado iônico
do ferro, oxidando, em particular, Fez+ a FeJ* e, portanto, permi-
tindo a incorporação do ferro na transferrina sem a formação de
produtos tóxicos de ferro. A albumina e a transcupreína são,
provavelmente, as proteínas de transporte de cobre mais impor-
tantes.
Importância Clínica
As concentrações de C p aumentam como resultado de uma APR.
A CP, entretanto, é uma A P R fraca de reação tardia. As concen-
trações são significativamente aumentadas por estrógenos, como
ocorre na gravidez ou na contracepção oral.
Indivíduos com deficiência genética primária de Cp apresen-
tam u m quadro clínico similar ao apresentado por aqueles com
hemocromatose hereditária, por causa da incapacidade de incor-
porar ferro na transferrina. Esses indivíduos têm cobre tecidual
normal, mas reserva de ferro tecidual aumentada e ferro sérico
diminuído.
As concentrações plasmáticas de Cp baixas secundárias cau-
sadas p o r falta de incorporação de Cu 2 + na molécula durante a
síntese são m u i t o mais comuns do que a deficiência primária. A
deficiência secundária pode ser ocasionada por (1) insuficiência
de cobre na dieta (incluindo má absorção), (2) incapacidade de
transportar C u 2 ' do epitélio G I para a circulação (como na
doença de Menkes) ou (3) incapacidade de inserir C u 2 ' na molé-
cula de C P em formação (como na doença de W i l s o n ) . As con-
centrações também podem ser baixas nas perdas de sangue ou
nas síndromes de perda protéica renal ou gastrointestinal (GI).
Deficiência alimentar, secundária à deficiência nutricional de
cobre, está associada a (1) neutropema, (2) trombocitopenia, (3)
ferro sérico baixo e (4) anemia hipocrômica, normocítica ou
microcítica, que não responde à terapia com ferro.
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 309
Atividade ferroxidase de Cp
H,0 Oi
(ou — srç , (ou — SS—)
CpCu©@ CpCu©
Ferro ferroso Ferro ferroso
(da Ferritina (para a
celular) transferrina
plasmática)
Figura 18-4 Função p r o p o s t a da c o b r e - c e i u l o p l a s m i n a (CpCu 1 *)
c o m o u m receptor de p r ó t o n ( í o n h i d r o g ê n i o ) d o ferro ferroso celular. A
oxidação resultante de Fe 24 para o estado f é r r i c o p e r m i t e sua ligação e
seu transporte pela t r a n s f e r r i n a plasmática. C p C u * è o x i d a d a
(regenerada a C p C u 2 * ) p o r reações c o m o oxigênio, grupos t i o l oxidados,
o u outras substâncias oxidantes. ( M o d i f i c a d o de J o h n s o n A M .
C e r u l o p l a s m i n . I n : R i t c h i e RF, Navolotskais O , ed. S e r u m p r o t e i n s i n
c l i n i c a i m e d i c i n e . V o l . 1: L a b o r a t o r y section. S c a r b o r o u g h , M a i n e :
F o u n d a t i o n for B l o o d Research, 1996:13.01-13.03.)
A doença de Wilson, o u degeneração hepato lenticular, difere
da deficiência alimentar pelo fato de o cobre total do organismo
estar aumentado de forma significativa e depositado nos tecidos,
incluindo as células parenquimais hepáticas, o cérebro e a periferia
da íris (resultando nos anéis de Kayser-Fleischer característicos). Os
sintomas nos indivíduos com doença de W i l s o n geralmente se
iniciam na segunda ou terceira década de vida, mas podem se
manifestar mais cedo ou mais tarde. Mutações que destroem com-
pletamente a função do gene podem estar associadas à crise da
doença hepática precocemente, já aos 3 anos de idade.
A l é m da deficiência genética rara de C p mencionada anterior-
mente, existem diversas variantes genéricas, sendo que nenhuma
delas tem importância clínica conhecida.
Considerações Laboratoriais
Por causa de sua instabilidade, a C p pode perder alguns ou todos
os seus cobres espontaneamente ou por oxidação durante o arma-
zenamento do soro in vino. A l é m disso, a fragmentação da cadeia
peptídica por enzimas no soro e nos leucócitos normais pode
resultar em reatividade alterada com anticorpos. Essa instabili-
dade pode criar problemas com calibradores, materiais de con-
trole de qualidade e com as amostras dos pacientes. Dependendo
do grau de degradação e d o método de análise, as concentrações
reais podem aumentar ou d i m i n u i r . O soro ou o plasma das
amostras de pacientes deve ser separado tão logo seja possível,
após a coleta, e analisado imediatamente ou armazenado sob
condições apropriadas (até 3 dias a 4°C; armazenamento por
períodos mais longos a - 7 0 ° C ) .
A Cp é analisada i m u n o q u í m i c a ou funcionalmente (ativi-
dade cobre oxidase). Os últimos ensaios medem somente a CP
nativa contendo cobre, enquanto os primeiros medem tanto a
molécula intacta quanto, em vários graus, a apoCp e os fragmen-
tos proteoliticos. Os intervalos de referência estão listados na
Tabela 18-3.
Proteína C-Reativa
U m a substância presente nos soros de indivíduos gravemente
doentes que é capaz de se ligar ao polissacarídeo C da parede
310 PARTE IV Analitos
celular de Stre^tococcMs pneumonias foi primeiramente descrita em
1930. E m 1941 foi demonstrado se tratar de uma proteína e
recebeu o n o m e de CRP. Ela é uma das primeiras APRs a se tornar
elevada em doenças inflamatórias e também a exibir os aumentos
mais dramáticos de concentração. Ela consiste em cinco subuni-
dades idênticas e é sintetizada, principalmente, pelo fígado.
Bioquímica e Função
Na presença de Ca 2+ , a proteína CRP se liga não apenas a polis-
sacarídeos presentes em muitas bactérias, fungos e protozoários
parasitas, mas também a (1) fosforilcolina, (2) fosfatidilcolinas,
tais como lecitina, e (3) poliânions, tais como ácidos nucléicos.
Na ausência de Ca 2 ", a C R p se liga a policátions, tais como as
histonas. U m a vez complexada, a CRP ativa a via do comple-
mento clássica que se inicia em C l q . A CRP complexada, por-
tanto, é capas de iniciar (1) opsonização, (2) fagocitose e (3) Iise
dos organismos invasores, tais como bactérias e virus. Ela faz isso
de maneira similar à observada em complexos anticorpo-antí-
geno. A CRP t a m b é m é capaz de reconhecer substâncias autóge-
nas potencialmente tóxicas liberadas de tecidos danificados, de
se ligar a elas e, então, detoxificá-las ou eliminá-las do sangue. A
própria C R P é catabolizada após opsonização.
Importância Clínica
Há m u i t o tempo a CRP foi reconhecida como uma das APPs
mais sensíveis. As concentrações no plasma geralmente aumen-
tam dramaticamente após (1) ínfarto do m i o c á r d i o / (2) estresse,
(3) trauma, (4) infecção, (5) inflamação, (6) cirurgia ou (7) proli-
feração neoplásica. O aumento começa dentro de 6 a 12 horas
após o início de qualquer uma dessas doenças, e a concentração
pode atingir 2.000 vezes o valor normal. A determinação de CRP
é clinicamente ú t i l para (1) rastreamento de doença orgânica, (2)
avaliação da atividade de doença inflamatória, (3) detecção de
infecções mtercorrentes n o lúpus eritematoso sistêmico (SLE), na
leucemia, ou após cirurgia (aumento secundário da concentração
plasmática), e (4) tratamento de septicemia neonatal e meningite,
quando as coletas de amostra para investigações bacteriológicas
podem ser difíceis. As concentrações circulantes de CRP podem
constituir u m fator de risco independente, embora fraco, para
doença cardiovascular (Capítulo 23). Concentrações aumentadas
associadas à doença cardiovascular m u i t o provavelmente são
devidas à, em vez de serem a causa de, inflamação vascular.
Sangue do cordão umbilical normalmente tem concentrações
baixas de CRP (1 a 35 |j.g/dL), mas com infecção intra-uterina,
as concentrações podem atingir 26.000 \lg/dL. As concentrações
na primeira infância normalmente aumentam por uns poucos
dias após o parto normal, cai a concentrações muitos baixas e,
então, aumentam gradualmente por diversas semanas, até as con-
centrações de adulto.
Considerações Laboratoriais
C o m o a CRP normalmente está presente no plasma em baixas
concentrações, são necessários métodos imunoquímicos altamente
sensíveis para sua quantificação (Capítulo 23). Os ensaios atuais
incluem (1) ímunoturbidimetria com partículas aumentadas ou
nefelometria, (2) imunofluorescência e (3) imunoquimiolumines-
cência. A CRP migra na eletroforese em acetato de celulose ou em
gel de agarose em qualquer posição da região y lenta à região (3
média, dependendo do conteúdo de íon cálcio do tampão. Os
intervalos de referência estão listados na Tabela 18-3.
Haptoglobina
A H p é uma a?-glicoproteína que se liga, irreversivelmente, à
hemoglobina (Hb) livre. Ela é sintetizada pelo fígado e é com-
posta por quatro cadeias peptídicas ligadas por pontes dissulfeto
em dois pares, uma configuração (a(3)2 similar à da H b . Cada
monômero H p 1 se liga a até dois dímeros a(3 de H b , ou ao
equivalente de uma molécula de H b intacta; a cadeia p de H p se
liga às cadeias a de H b .
Bioquímica e Função
Durante a hemólise extracelular, a H b é liberada dos eritrócitos
e os dímeros de H b livres se ligam quase imediatamente à H p .
Os complexos H p - H b são grandes o suficiente para evitar ou
reduzir consideravelmente a perda renal de H b e seu ferro. Os
complexos são removidos m u i t o rapidamente pelas células de
Kuppfer hepáticas, onde as proteínas são degradadas em ferro e
aminoácidos, que são, então, reutilizados. A l é m disso, os com-
plexos H p - H b podem ser importantes para o controle dos pro-
cessos inflamatórios locais. Por exemplo, o complexo H p - H b é
uma peroxidase potente capaz de hidrolisar peróxidos liberados
durante a fagocitose pelos leucócitos polimorfonucleares nos
sítios de inflamação. A H p é também u m agente bacteriostático
natural para bactérias que requerem ferro, tais como Eschenchia
coíi, evitando o ujçi do ferro da H b por esses organismos.
Existem variantes genéticas de ambas as cadeias a e J3; o
polimorfismo comumente reconhecido envolve as primeiras. A
cadeia cl2 é quase duas vezes maior que a cadeia a i (142 versus 83
aminoácidos), o que resulta na formação de polímeros de H p
com massa molecular m u i t o elevada.
Importância Clínica
As concentrações de H p são aumentadas por hormônios corti-
costeróides e muitos N S A I D s . A Hp, assim como a Cp, é uma
APP fraca e de reação tardia. As concentrações de H p sao eleva-
das nas síndromes de perda protéica seletiva, tais como a sín-
drome nefrótica, em indivíduos com fenótipos H p 2-1 ou 2-2.
Obstrução biliar na ausência de doença hepatocelular grave está
associada a alterações lipídicas importantes e concentrações
aumentadas de H p .
A depleção de H p geralmente é o indicador laboratorial mais
sensível de hemólise, seguida pela depleção de hemopexina (ou
a presença de complexos de hemopexina-heme) e pela presença
de metemalbuminemia, hemoglobinúria, ou ambas. Sob circuns-
tâncias normais, aproximadamente 1% dos eritrócitos circulantes
é removido da circulação ou destruído n o espaço intravascular a
cada dia. U m aumento para somente 2% de destruição por dia
esgotará completamente a H p plasmática na ausência de u m
estímulo de produção, tais como inflamação aguda ou terapia
com corticosteróide.
Os estrógenos d i m i n u e m a síntese de H p . A maioria das
formas de doença hepatocelular aguda ou crônica, i n c l u i n d o
hepatite virai aguda e cirrose com icterícia, está associada a con-
centrações diminuídas de H p devido ao metabolismo alterado de
estrógeno e à lise de hemácias secundária a alterações de lipídios
de membrana. A ausência genética (ahaptoglobinemia) e hipo-
haptoglobmemia têm sido descritas em muitas populações, espe-
cialmente em indivíduos de origem africana. N o entanto, muitos
dos relatos se originaram de populações com altas taxas de
doenças hemolíticas. A HpO verdadeira (deficiência total) é rara
na maioria, se não em todas as populações. A hipohaptoglobine-
mia genética, associada a concentrações m u i t o baixas de Hp, é
mais comumente observada. E m indivíduos H p 1-1 as síndromes
de perda protéica seletiva (p. ex., síndrome nefrótica) geralmente
estão associadas a baixas concentrações.
Considerações Laboratoriais
A A A G deve ser analisada em associação à H p porque os outros
fatores mencionados anteriormente — com exceção das síndro-

mes de perda protéica — influenciam nas concentrações de ambas
as proteínas em paralelo. Tradicionalmente, a H p foi medida
analisando a atividade de peroxidase após a mistura do soro com
u m excesso de hemoglobina livre, a chamada capacidade de
ligação da hemoglobina (BC). E m média, [Hp] = [Hp BC] x 1,5;
aproximadamente 1 mg de hemoglobina está ligada por 1,5 mg
de H p , dependendo do fenótipo.
Os métodos imunoquímicos são agora os testes preferidos
para aplicações clínicas por serem rápidos e facilmente automa-
tizados. Por causa das diferenças dos tamanhos moleculares e das
taxas de difusão correspondentes, as técnicas de difusão em gel,
tais como imunodifusão radial (RID), requerem correção para os
fenótipos e são, portanto, demoradas e inconvenientes. Imuno-
ensaios em solução, tais como nefelometria e turbidimetria, são
também levemente influenciados pelo tamanho, mas as diferen-
ças são relativamente insignificantes. Os intervalos de referência
estão listados na Tabela 18-3.
Transferrina
Transferrina ( T R F / T í ) , ou siderofilina, é a principal proteína
plasmática de transporte de ferro (Capitulo 28). Embora ela se
ligue reversivelmente e transporte uma série de cátions divalen-
tes, somente a ligação de ferro e cobre tem importância clinica
conhecida. A T R F é responsável pela maioria da capacidade total
de ligação ao ferro (TIBC) do plasma; uma molécula se liga a dois
íons férricos se a C p estiver presente para atuar como uma ferro-
xidase (Figura 18-4). O complexo TRF-Fe ,+ transporta, então,
ferro para as células para incorporação nos citocromos, H b e
mioglobina, e para os locais de reserva, tais como fígado e sistema
reticuloendotelial. Praticamente todos os tipos celulares têm
receptores de superfície para TRF.
Bioquímica e Função
A T R F é sintetizada, principalmente, no fígado e migra na região
P na eletroforese de soro da rotina clínica. As concentrações
plasmáticas são reguladas quase sempre pela disponibilidade do
ferro, aumentando com a deficiência de ferro e d i m i n u i n d o com
o tratamento bem-sucedido. C o m o ocorre com a albumina, cerca
de metade da T R F se encontra fora do compartimento vascular
nos líquidos extracelulares, i n c l u i n d o linfa e CSF.
Importância Clínica
A avaliação das concentrações plasmáticas de T R F é ú t i l para o
diagnóstico diferencial da anemia e para o monitoramento do
tratamento da anemia ferropriva. Em casos de deficiência de
ferro, a concentração de T R F se encontra elevada, mas a proteína
está menos saturada com ferro. Quando a anemia é causada por
falha na incorporação de ferro nos eritrócitos e não por uma
deficiência de ferro, a concentração de T R F pode ser n o r m a l ou
baixa, mas a proteína é m u i t o saturada com ferro. Nos estados
de sobrecarga de ferro, tais como na hemocromatose hereditária,
a concentração de T R F é normal, mas a saturação (normalmente
.30% a 38%) está aumentada. Altas concentrações de T R F são
observadas na gravidez e durante a administração de estrógeno.
A T R F é uma APP negativa e concentrações baixas estão
presentes na inflamação ou em tumores malignos. M á nutrição
de energia e proteína (PEM) pode estar associada a concentrações
baixas, mas P E M é menos freqüente do que a doença inflamató-
ria em países desenvolvidos. Perda protéica, como acontece na
síndrome nefrótica ou nas enteropatias com perda protéica,
também causam baixas concentrações. Na atransferrinemia con-
gênita, uma concentração m u i t o baixa de T R F é acompanhada
por sobrecarga de ferro e anemia hipocrômica grave resistente à
terapia com ferro.
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 311
Pelo menos 22 variantes genéticas de T R F foram identifica-
das; diversas estão associadas à mobilidade ele tro for ética alterada,
o que pode ser confundido com paraproteína (ver imunoglobu-
linas). A atransferrinemia congênita, discutida anteriormente, é
m u i t o rara.
Considerações Laboratoriais
Por causa da conveniência das medidas simultâneas de ferro
sérico e T I B C e o desejo de se conhecer o porcentual de saturação
de TRF, algumas vezes ele é indiretamente estimado a partir do
valor de T I B C pela seguinte equação:
T R F ( m g / d L ) = 0,70 x T I B C ( | i g / d L )
ou
T I B C = 1,43 x T f
A transferrina é quantificada com maior precisão por métodos
imunoquímicos, i n c l u i n d o i m u n o t u r b i d i m e t r i a e imunonefelo-
metria. C o n f o r m e citado anteriormente, ela migra na região pi
na eletroforese de soro de rotina, mas as variantes genéticas
podem causar problemas na interpretação desses padrões. Os
intervalos de referência estão listados na Tabela 18-3.
Transtirretina (Pré-albumina) e Proteína de Ligação
ao Retinoi
A transtirretina (pré-albumina) e a proteína de ligação ao retinoi
(RBP) são proteínas de transporte que migram juntas como u m
complexo molecular 1:1. A transtirretina foi originalmente deno-
minada pré-albumina de ligação à tiroxina devido à sua mobili-
dade eletroforética, anodal com relação à albumina; ela foi reno-
meada em 1981 para melhor caracterizar sua ligação e o trans-
porte de ambos os hormônios da tireóide (tiroxina e triiodotiro-
nina) e da RBP.
Bioquímica e Função
A transtirretina (TTR) é uma proteína não-glicosilada (massa
molecular 34,98 kDa), composta por quatro subunidades idênti-
cas ligadas não-covalen tem ente para formar u m espaço central
que contém os sítios de ligação a T 3 e T 4 . Ela se liga a e transporta
aproximadamente 10% de ambos os hormônios, T3 com afini-
dade mais alta do que T 4 . (A globulina de ligação à tiroxina
transporta certa de 70% e a albumina se liga ao "excesso" com
baixa afinidade.) Por causa da cooperatividade negativa, a ligação
de T T R à primeira molécula de h o r m ô n i o d i m i n u i a afinidade
de ligação da segunda, de forma que somente u m sítio está nor-
malmente ocupado. A T T R é sintetizada no fígado, em uma
menor extensão, no plexo coróide do CNS. Sua síntese é estimu-
lada por hormônios glicocorticosteróides, andrógenos e muitos
NSAIDs, incluindo aspirina.
A RBP é uma proteína transportadora monomérica pequena
(21 kDa) de todos os trans-retinol, a forma alcoólica e fisiologica-
mente ativa da vitamina A . Ela é sintetizada n o fígado. O zinco
é necessário para a síntese, e o r e t m o l é necessário para o seu
transporte pelo aparelho de Golgi. Q u a n d o circula no plasma, a
RBP está em u m complexo 1.1 com a transtirretina, o que impede
que a RBP seja filtrada pelos glomérulos renais e estabilize a
ligação do retinoi, reduzindo sua liberação para as células que
não sejam alvo. A obtenção de retinoi pelas células-alvo é seguida
pela dissociação do complexo transtirretina-RBP e a retirada de
apoRBP (RBP sem o retinoi) da circulação pelos rins. Ela é reab-
sorvida pelas células do túbulo proximal renal e por células
catabolizadas; os aminoácidos são, então, reutilizados.
312 PARTE IV Analitos
Importância Clínica
Se o consumo de vitamina A é adequado e a função renal é
normal, as concentrações de T T R e RBP tendem a aumentai e
a d i m i n u i r simultaneamente. A RBP sérica aumenta na doença
renal crônica, i n c l u i n d o a nefropatia diabética. As concentrações
de ambas as proteínas se encontram aumentadas no tratamento
com cor ticos terói de ou N S A I D e na doença de Hodgkin.
Concentrações reduzidas de RBP são observadas principal-
mente na (1) doença hepática, (2) má nutrição protéica e (3) APR.
A deficiência de zinco é caracterizada pelas concentrações séricas
baixas tanto de RBP quanto de vitamina A.
As concentrações de transtfrretina são freqüentemente usadas
como u m indicador do estado protéico por causa de (1) sua meia-
vida relativamente curta, (2) u m conteúdo elevado de triptofano,
(3) uma alta relação entre aminoácidos essenciais e não-essenciais
e (4) mistura de tamanho pequeno. Entretanto, ela é uma A P R
negativa. As concentrações caem na inflamação e em tumores
malignos, e na cirrose do fígado e nas doenças com perda protéica
do intestino ou dos rins. Portanto, u m reagente de fase aguda
sensível, tal como a CRP, deve sempre ser analisado juntamente
com a T T R se as concentrações forem usadas para estimar o
estado nutricional. A história e o exame físico também são aspec-
tos importantes de tais avaliações.
U m a variedade de variantes genéticas de T T R foi descrita,
algumas das quais estando associadas à ligação de T 3 e T4 aumen-
tada (hipertiroxinemia eutireóide familiar) ou diminuída. Diver-
sas variantes estão associadas à deposição extracelular de fibrilas
amilóides em vários tecidos. Essas amiloidoses hereditárias autos-
sômicas dominantes incluem cardiomiopatia amiloidótica, poli-
neuropatia amiloidótica familiar e amiloidose sistêmica senil.
Considerações Laboratoriais
A T T R migra de forma ano dal com relação à albumina na
eletroforese de soro de rotina. A presença de uma banda de T T R
é considerada u m marcador de eletroforese de boa qualidade. N o
entanto, as concentrações são apenas aproximadamente semi-
quantificadas a partir da intensidade da banda. A RBP se dissocia
durante a eletroforese e tem uma migração anodal com relação
à transferrina, mas a banda geralmente é m u i t o fraca para ser
vista. As proteínas também têm sido quantificadas por métodos
imunoquímicos cle rotina. Os intervalos de referência estão lista-
dos na Tabela 18-3.
Proteínas do Complemento
O sistema complemento consiste em pelo menos 20 proteínas
do sangue e dos fluidos teciduais. Elas interagem (1) seqüencial-
mente com os complexos antígeno-anticorpo (Ag-Ab), (2) entre
si e (3) com membranas celulares de uma forma complexa, porém
flexível para destruir vírus e bactérias e, em algumas doenças, até
mesmo as células do próprio hospedeiro (Figura 18-5). As proteí-
nas do complemento estão divididas em cinco grupos de acordo
com a função:
1. A via clássica, que inclui C l , C4, C 2 e C3 (em ordem de
ativação)
2. A via alternativa, que inclui C3, os fatores B e D , e a proper-
dina
3. O complexo de ataque à membrana, que inclui C5 a C9
4. Inibidores e inativadores das vias mencionadas anterior-
mente, i n c l u i n d o o i n i b i d o r de C l , os fatores H e I, e a
proteína de ligação a C4 (C4bp)
5. Receptores celulares dos componentes ativados ou ligados à
célula.
A v i a clássica é ativada, principalmente, por complexos Ab-Ag
ou pela formação de complexos de bactérias ou outros ligantes
com a CRP, enquanto a via alternativa é ativada por lipopolissa-
carídeos bacterianos, proteases celulares e veneno de cobra. A
ativação da via clássica através de C3 também ativa a via alterna-
tiva que, então, amplifica a produção de moléculas efetoras.
Outros mecanismos também p o d e m ativar o sistema comple-
mento, i n c l u i n d o a ação de proteases liberadas por leucócitos e
outras células inflamatórias. A etapa c o m u m envolvida é a ativa-
ção de C3 a C3b.
Durante a ativação, muitos componentes do complemento
são clivados enzimaticamente em dois fragmentos — em geral (1)
u m fragmento maior que se liga a diversas superfícies, tais como
membranas bacterianas, mais (2) u m fragmento pequeno que
pode se tornar ativo na quimiotaxia e na permeabilidade vascular.
Os fragmentos maiores são designados p o i u m b minúsculo e os
menores por u m a minúsculo. Os fragmentos maiores geral-
mente contêm u m sítio de ligação para as membranas celulares
e os complexos imunológicos, mais, em muitos casos, u m sítio
enzimático que ativa, então, o(s) próximo(s) componente(s). Por-
tanto, o fragmento ativo, ligado à célula, de C3 é C3b, enquanto
o peptídio C3a (potente an afila toxina) é liberado no líquido ao
redor. Os fragmentos inativados são denominados pela letra i (p.
ex., C3bi). *
A ativação seqüencial da via clássica ou da via alternativa,
com ou sem ativação completa do complexo de ataque à mem-
brana, produz moléculas efetoras que iniciam a inflamação e
facilitam a eliminação de antígenos por lise (p. ex., bactérias) ou
fagocitose (p. ex., complexos imunológicos). Portanto, o sistema
complemento é u m dos principais mediadores da inflamação.
Edema e estase secundários permitem a passagem de outros
anticorpos, complementos e fagóeitos para dentro do espaço
extravascular, o que contribui para matar e remover agentes infec-
ciosos e complexos imunológicos.
Bioquímica e Função
Os componentes do complemento são sintetizados principal-
mente pelo fígado, embora se acredite que pequenas quantidades
sejam sintetizadas por monócitos e outros tipos celulares. Sua
principal função fisiológica é destruir ou remover agentes infec-
varne;a IfiA.I
ües
Figura " Resumo das cascatas d o c o m p l e m e n t o . A t i v a ç ã o através
da via clássica é mostrada à esquerda e através da via alternativa à
direita. A c o n t í n u a inativação p o r h i d r ó l i s e , de C 3 a C 3 i , é mostrada na
p a r t e s u p e r i o r central. A ativação direta de C 3 p o r n e u t r ó f i l o s e
proteases plasmáticas t a m b é m p o d e ocorrer. Os mecanismos de concrole
estão sombreados. (Cortesia de J W W h i c h e r , c o m modificações.)

ciosos, tais como bactérias e vírus. A maioria dos componentes
do complemento apresenta p o l i m o r f i s m o genético.
Importância Clínica
A importância clínica do sistema complemento é demonstrada
pelas associações a doenças presentes em deficiências herdadas
ou secundárias de diversos componentes. Várias proteínas do
complemento, em especial C3 e C4, estão bastante aumentadas
após uma APR; entretanto, elas são APPs fracas e de reação
tardia. A concentrações de C3 e C 4 também são elevadas na
obstrução biliar. C l , inibidor de C l , C3, proativador de C 3
(fator B) e C 4 são os componentes mais freqüentemente avalia-
dos com finalidades clínicas, porque suas concentrações são
importantes em doenças relativamente comuns e os ensaios estão
prontamente disponíveis.
Tanto as variantes genéticas quanto as deficiências de aproxi-
madamente todos os componentes do complemento foram des-
critas. As deficiências, em particular, p o d e m estar associadas a
doenças. Por exemplo, a deficiência genética cle C 2 e C 4 está
coiriu mente relacionada com (1) doenças auto-ímunes, do com-
plexo imunológico, tais como SLE, (2) polimiosite e (3) glome-
rulonefrite. A o contrário, a deficiência de C3 (ou sua inibição)
está associada à infecção, geralmente grave, causada particular-
mente por bactérias encapsuladas. A deficiência de qualquer u m
dos componentes do complexo de membrana (C5 a C9) pode
estar associada a infecções graves recorrentes, persistentes e / o u
por neisséria. A deficiência do i n i b i d o r de C l resulta em angio-
edema hereditário (HAE), com atividade contínua de C l e, por-
tanto, de C 2 e C4. O H A E é caracterizado por crises recorrentes
de edema subcutâneo, laríngeo, brônquico e GI, o que pode
representar risco de vida. Concentrações diminuídas de C 4 têm
sido usadas para rastrear a doença; se as concentrações do inibi-
dor de C l são normais em indivíduos com sintomas clínicos e
C 4 d i m i n u í d o , as análises funcionais devem ser realizadas.
Reduções secundárias das concentrações de qualquer compo-
nente p o d e m ocorrer como resultado da tuberculose. Os exem-
plos clássicos disso são depleção de C 4 em H A E e de C 3 e C 4
na glomerulonefnte pós-estreptocócica grave, sendo que no
ú l t i m o caso está associada, também, à produção reduzida pelo
fígado. E m doenças como SLE e outras doenças associadas à
formação de complexos imunológicos, a diferenciação entre a
deficiência genética e a secundária pode requerer estudos de
família, fenotipagem, análise de D N A , ou combinações desses.
Imunoglobulinas
As imunoglobulinas, ou anticorpos humorais, reconhecem antí-
genos estranhos e iniciam os mecanismos que os removem ou
destroem. A capacidade de reconhecer a enorme variedade de
antígenos é efetuada através de u m grau i n comum de heteroge-
neidade estrutural. Por exemplo, uma única bactéria tem inúme-
ros antígenos de superfície; cada u m deles tem muitos determi-
nantes ou epítopos, e cada epítopo estimula a produção de anti-
corpos para aquele determinante. Isso resulta na notável hetero-
geneidade das imunoglobulinas, ilustrada pelas bandas difusas
vistas na eletroforese.
Bioquímica Básica e Função
Todas as moléculas de imunoglobulina são compostas por u m a
ou mais unidades básicas, consistindo em duas cadeias pesadas
(H) idênticas e duas cadeias leves (L) idênticas (Figura 10-1, Capí-
tulo 10). Cada uma das quatro cadeias tem uma região variável
e uma constante, com a região variável envolvida n o reconheci-
mento e ligação ao antígeno. As seqüências de aminoácido das
regiões variáveis na extremidade N - t e r m i n a l das quatro cadeias
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 313
determinam a especificidade antigênica das moléculas específicas
de anticorpo produzidas por uma única célula plasmática o u p o i
u m "clone" de células plasmáticas idênticas. Os dois sítios de
ligação ao antígeno (Fab) estão na extremidade de cada par de
cadeias leve e pesada idênticas. O restante da molécula, a parte
"constante", é o mesmo para toda molécula de imunoglobulina
de uma determinada subclasse e carrega os sítios efetores.
Embora a maioria das proteínas plasmáticas seja sintetizada
no fígado, as imunoglobulinas são sintetizadas pelas células plas-
máticas, a progénie de céíulas-tronco para linfócito B na medula
óssea. Os linfócitos B mais maduros, encontrados principalmente
em lmfonodos e sangue, desenvolvem imunoglobulinas recepto-
ras na suas membranas de superfície. A o encontrar o antígeno,
esses linfócitos B se proliferam e se desenvolvem dentro das
células plasmáticas. Estas, então, secretam no sangue anticorpos
específicos capazes de ligar o antígeno adicional.
Inicialmente, os linfócitos B têm receptores de superfície de
IgM e secretam I g M como a primeira o u a "principal" resposta a
u m antígeno. As cadeias pesadas das moléculas de receptores de
superfície de I g M são, então, modificadas in súw a cadeias pesadas
IgG ou IgA, mas as regiões variáveis permanecem inalteradas. A
medida que as células se transformam dentro das células plasmá-
ticas, uma segunda exposição ao mesmo antígeno causa uma
resposta maior, secundária ou anamnéstica de secreção de IgG.
A I g M continua, contudo, a ser sintetizada contra os antígenos
confinados ao sangue, tais como antígenos de superfície dos
eritrócitos e parasitas tropicais.
Os sítios efetores que interagem com células (p. ex., IgE com
mastócitos) e complemento estão na região constante (Fc) das
cadeias pesadas. Variações da região Fc resultam em classes e
subclasses dentro das quais as imunoglobulinas estão agrupadas:
IgM, IgG (quatro subclasses), IgA (duas subclasses), IgD e IgE.
Suas respectivas cadeias pesadas são chamadas (_i, y, a , 5, e. A
região de dobradiça (hinge) entre as porções Fc e Fab, que é sus-
cetível à clivagem proteolítica, controla a interação entre as partes
Eab e Fc. A região flexível contém u m a o u mais metades de cis-
tinas, que fornecem as pontes dissulfeto mtercadeias. As variações
estruturais entre as classes de i m u n o g l o b u l i n a também resultam
em diferenças de função.
Cadeias leves, que são produzidas independente e ligeira-
mente em excesso, são de dois tipos — K e X — e as regiões cons-
tantes delas têm estruturas diferentes. Elas aparecem em todas as
imunoglobulinas na proporção KrX. = 2:1; as duas metades de
uma determinada molécula sempre têm o mesmo tipo. Existem
quatro subclasses de cadeias X. Os genes de cadeia pesada estão
localizados no cromossomo 14; as cadeias leves K são codificadas
por u m gene no cromossomo 2, enquanto o gene da cadeia X
está no cromossomo 22.
Tipos de imunoglobulinas
As porções constantes das cadeias pesadas (Fc) contêm os sítios
que interagem com células e com o complemento .Variações no
fragmento Fc são responsáveis pelas classes e subclasses nas quais
as imunoglobulinas estão agrupadas-. IgM, IgG, com quatro sub-
classes, IgA, com duas subclasses, I g D e IgE.
Imunoglobulina G
A imunoglobulina G (IgG) é a principal imunoglobulina produ-
zida pelas células plasmáticas, compondo 70% a 75% do total de
imunoglobulinas. Desse total, 65% são extravasculares; o restante
se encontra n o plasma. Os anticorpos IgG são produzidos em
resposta à maioria das bactérias e vírus. Eles se ligam a proteínas
estranhas, solúveis e pequenas e se agregam a elas, tais como
toxinas bacterianas. A IgG consiste em duas cadeias pesadas e duas
314 PARTE IV Analitos
leves. Sua massa molecular é de 144 a 150 kDa, incluindo menos
de 3 % de carboidrato. N a eletroforese em acetato de celulose ou
em gel de agarose, a IgG migra, em geral, nas regiões y e |3 lenta,
como resultado da heterogeneidade das moléculas IgG
A IgG tem quatro subclasses, I g G ^ IgGí, IgG3 e lgG 4 , que
diferem principalmente em suas regiões de dobradiça (Junge). E m
IgG 3 , a dobradiça é estendida por até 15 metades de cistinas,
permitindo uma ligação eficiente a C l q . Tanto IgG] quanto IgG 3
se ligam a receptores de Fc em células faguciláiias, ativam monó-
citos ídller (células K) e atravessam a placenta por u m processo de
transporte ativo dependente da ligação de Fc. A IgG! é a princi-
pal IgG a atravessar a placenta e a proteger neonatos durante os
primeiros 3 meses de vida pós-termo. A meia-vida de IgGj, como
as de IgG 2 e IgG 4 , é de cerca de 22 dias, m u i t o mais longa do
que a de IgG3 (7 dias).
Imunoglobulina M
A I g M é a imunoglobulina mais primitiva e menos especializada.
Ela é a única i m u n o g l o b u l i n a sintetizada normalmente pela
maioria dos neonatos. Em soro de adultos, é a terceira imuno-
globulina mais abundante, sendo responsável por 5 % a 10% do
total de imunogiobulinas circulantes. C o m o receptor de mem-
brana, a I g M é uma molécula monomérica, mas a maioria da I g M
sérica é u m pentâmero; cada monômero é similar à molécula de
IgG, exceto pelo fato de que a I g M pentamérica também contém
u m glicopeptídio pequeno, a cadeia ], que é importante para a
polimerização Neoplasias das células plasmáticas podem secretar
I g M monomérica além de, ou em vez de, pentâmeros. A massa
molecular elevada de I g M (970 kDa; - 1 0 % de carboidratos)
impede sua rápida passagem para os espaços extravasculares. A
I g M não é transportada através da placenta e, p o r t a n t o , não
está envolvida em doenças hemolíticas dos neonatos. Ela é u m
ativador de complemento eficiente, sendo as cadeias Fc espaça-
das a uma distância correta para parear com os sítios de ligação
de C l q .
Imunoglobulina A
Aproximadamente 10% a 15% da imunoglobulina sérica é IgA,
que contém 10% de carboidrato, tem u m peso molecular de 160k
Da, e uma meia-vida de 6 dias. Em sua forma monomérica, sua
estrutura é similar à de IgG, mas 10% a 15% de IgA no soro são
diméricas, particularmente IgA 2 , que é mais resistente à destrui-
ção por algumas bactérias patogênicas do que I g A ^ Na eletrofo-
rese, a IgA migra na região (B-y, anodal à maioria das IgGs.
U m a forma possivelmente mais importante de IgA é a
chamada IgA secretora, encontrada em (1) lágrimas, (2) suor, (3)
saliva, (4) leite, (5) colostro, (6) secreção gastrointestinal e (7)
secreção brônquica. A IgA secretora tem massa molecular de 380
k D a e consiste em duas moléculas de IgA, u m componente secre-
tor (massa molecular de 70 kDa) e uma cadeia ) (15,6 kDa). Ela
é sintetizada, principalmente, pelas células plasmáticas nas mem-
branas mucosas do intestino e do brônquio e nos duetos da
mama lactante. O componente secretor faz a IgA secretora mais
resistente a enzimas, p e r m i t i n d o que ela proteja a mucosa contra
bactérias e virus. Sua presença no colostro e leite provavelmente
c o n t r i b u i para a proteção dos neonatos contra infecções intesti-
nais. A IgA ativa o complemento pela via alternativa (Figura 18-5),
mas a função exata de IgA no soro não está esclarecida.
Imunoglobulina D
A I g D é responsável por menos que 1% das imunogiobulinas
séricas. Ela é monomérica, contém cerca de 12% de carboidrato,
e tem uma massa molecular de 184 kDa. Sua estrutura é similar
à de IgG. C o m o a I g M , a I g D é u m receptor de superfície para
o antigeno em linfócitos B, mas sua função primária é desco-
nhecida.
Imunoglobulina E
A IgE é tão rápida e firmemente ligada a mastócitos que somente
quantidades traço estão normalmente presentes no soro. A IgE
contém 15% de carboidrato e tem uma massa molecular de 188
kDa. Sua estrutura é similar à de IgG. A IgE se liga a mastócitos
por meio de sítios de ligação em sua região Fc. Q u a n d o o anti-
geno (alergênico) faz ligação cruzada de duas das moléculas IgE
ligadas, o mastócito é estimulado a liberar histamina e outras
ammas vasoativas que são responsáveis pela permeabilidade vas-
cular e pela contração do músculo liso, ocorrendo em reações
alérgicas como (1) rinite, (2) asma (3) urticária e (4) eczema.
Importância Clínica
N o r m a l m e n t e o soro contém uma mistura policlonal e heterogê-
nea de anticorpos, que representa "idiotipos" múltiplos (produ-
tos de muitos clones diferentes de células plasmáticas). Cada u m
desses produz u m único tipo de molécula de imunoglobulina. A
proliferação benigna ou maligna de u m desses clones produz uma
concentração elevada de u m único idiotipo (um anticorpo m o n o
clonal), que pode aparecer como uma banda estreita e fina na
eletroforese de proteínas. U m a segunda banda, mais fraca, de
cadeias leves livres também pode ser visível. Se uns poucos clones
proliferam, podem existir várias bandas finas (p. ex., as bandas
oligoclonais vistas na eletroforese de CSF em [1] doenças desmie-
linizantes, tais como esclerose múltipla, [2] soro após transplante
de medula óssea bem-sucedido, o u [3] resposta inicial a organis-
mos como o Streptococcus pneumonias). As doenças podem, por-
tanto, estar associadas a uma redução ou a u m aumento das
imunogiobulinas policlonais normais, ou a u m aumento em u m
ou mais idiotipos monoclonais.
Deficiência de Imunoglobulina
A defesa i m u n e depende de quatro sistemas complexos e intera-
tivos: (1) imunidade celular (Imfócitos T), (2) anticorpos humo-
rais (imunogiobulinas), (3) sistema fagocítico e (4) sistema com-
plemento. Os dois últimos sistemas não são específicos pelo fato
de eles não terem memória imunológica para o antigeno. Somente
o segundo e o quarto sistemas são compostos por proteínas plas-
máticas. Estados de i m u n o d e f i c i ê n c i a caracterizados por infec-
ções recorrentes podem ser resultado de u m defeito em qualquer
u m desses sistemas ou qualquer combinação deles.
U m a redução óbvia ou ausência da banda y na eletroforese
indica deficiência de anticorpos IgG. A deficiência em I g G pode
sei secundária à perda protéica ou à falha adquirida da síntese,
mas pode ser causada por uma doença genética primária. O
diagnóstico de u m estado de deficiência é clinicamente impor-
tante porque é possível se fazer a terapia de substituição com IgG.
A presença de uma banda y aparentemente normal na eletrofo-
rese de proteínas não descarta a deficiência de imunoglobulina.
Algumas deficiências primárias envolvem apenas uma ou duas
classes ou subclasses de imunoglobulina; se a concentração total
de imunoglobulina não é m u i t o reduzida, pode não se suspeitar
da deficiência (p. ex., IgA ou u m a subclasse de IgG) a partir do
padrão eletioforético. A l é m disso, alguns pacientes têm concen-
trações típicas de imunoglobulina, mas os anticorpos não reagem
normalmente a antígenos relacionados.
Os bebês têm imunodeficiência fisiológica de IgG transitória,
com o valor mais baixo aos 3 meses de idade. A deficiência
fisiológica prolongada ou grave pode estar associada a taxas
aumentadas de infecção, especialmente por bactérias encapsula-
das. As concentrações de IgG materna, transferida através da

placenta, aumentam rapidamente n o feto durante a ú l t i m a
metade da gestação, mas caem rapidamente após o nascimento
(Figura 18-6). Os neonatos que estão particularmente sob risco
incluem (1) bebês prematuros, que começam com menos IgG
materna c (2) bebes noa quais o início da síntese de IgG c tran-
sitoriamente atrasado. As determinações de IgG são inestimáveis
nesses casos porque as concentrações podem se tornar perigosa-
mente baixas se o tratamento do bebê não for iniciado. O
aumento das concentrações de I g M e da I g A salivar normal com
6 semanas de idade sugere u m prognóstico favorável. O contato
do neonato com antígenos ambientais normalmente faz com que
os linfócitos B comecem a se multiplicar e as concentrações de
I g M comecem a aumentar, seguido, semanas a meses depois,
pelas IgA e IgG
Hiperimunoglobulinemia Policlonal
Os aumentos policlonais das imunoglobulinas séricas são a res-
posta normal a infecções. A resposta de IgG predomina nas res-
postas auto-imunes; IgA nas infecções de pele, de intestino, respi-
ratória e renal; e I g M nas infecções virais primárias e por parasitas
sanguíneos, como malária. As infecções bacterianas crônicas podem
causar u m aumento nas concentrações séricas de todas as imuno-
globulinas. Em tais casos, as estimativas das diferentes imunoglo-
bulinas raramente fornecem mais informações do que a eletrofo-
rese de proteínas. N o entanto, elas são valiosas para o diagnóstico
diferencial de doenças hepáticas e de infecções intra-uterinas. E m
(1) ciiTose biliar primária, a concentração de I g M é m u i t o aumen-
tada; (2) hepatite crônica ativa, a IgG e, algumas vezes, a I g M estão
aumentadas; e (3) cirrose porto!, a IgA e, algumas vezes, a IgG estão
elevadas E m infecções intra-uterinas, a produção de I g M pelo feto
aumenta e a concentração de I g M no sangue do cordão umbilical
é elevada. As estimativas de IgE são usadas n o tratamento de asma
e outras condições alérgicas, especialmente em crianças.
Imunoglobulinas Monoclonais (Paraproteínas)
U m único clone de células plasmáticas produz moléculas de
imunoglobulina com estrutura idêntica. Se o tamanho do clone
aumenta muito, a concentração dessa proteína específica no soro
do paciente pode produzir uma banda estreita e bastante discreta
na eletroforese. Essas imunoglobulinas monoclonais, denomina-
das paraproteínas, podem ser (1) polímeros, (2) monômeros, ou
Adquirida Transplacetariamente Produção Endógena
100 \ \
2 3 4 5 6 7 8 9
Idade Fetal (Meses)
Nascimento Idade (Anos)
Figura 18-6 Concentrações de i m u n o g l o b u l i n a sérica antes do nascimento e n o p r i m e i r o ano de vida
expressas c o m o u m porcentual das concentrações de adulto.
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 315
(3) fragmentos de moléculas de imunoglobulinas. Caso sejam
fragmentos, estes são normalmente de cadeias leves (proteínas de
Bence Jones) ou, raramente, de cadeias pesadas ou metades de
moléculas. A m b o s os monômeros e os fragmentos podem poli-
merizar. Cerca de 60% das paraproteínas estão associados a
tumores de células plasmáticas (mieloma m ú l t i p l o ou plasmoci-
toma solitário) e aproximadamente 15% são causados por super-
produção de linfócitos B, principalmente nos linfonodos — (1)
linfomas, (2) leucemia linfocítica crônica, (3) macroglobulinemia
de Waldenstrõm, ou (4) doença de cadeia pesada. Até 25% das
paraproteínas são benignas e muitas nunca são descobertas.
U m a paraproteína deve ser identificada no sangue ou na
urina, ou em ambos; suas cadeias pesada e leve devem ser tipadas;
e as concentrações das IgG, IgA e I g M policlonais devem ser
determinadas. Essas determinações ajudam a confirmar se a banda
n o padrão eletroforético é, de fato, uma paraproteína, ajuda na
avaliação do prognóstico, e mostra se as imunoglobulinas policlo-
nais são baixas a ponto de deixar u m paciente vulnerável a infec-
ções. O prognóstico é baseado (1) na classe da paraproteína encon-
trada, (2) na sua concentração n o momento do diagnóstico e (3)
na taxa em que sua concentração aumenta. A concentração no
momento do diagnóstico geralmente se correlaciona com o grau
atual do processo da doença. A taxa do aumento na concentração
é u m indicativo da taxa de crescimento da neoplasia.
Paraproteínas de baixa concentração podem ser clinicamente
benignas, com radiografias de esqueleto e medula óssea normais.
Entretanto, os seguintes achados sugerem que a condição pode,
eventualmente, se tornar maligna: (1) a concentração de IgG é
maior do que 2 g / d L ; (2) a concentração de IgA ou IgM é maior
do que I g / d L ; (3) descoberta de uma paraproteína IgD ou IgE
em qualquer concentração; (4) fragmentos de imunoglobulina
estão presentes na urina ou n o soro, geralmente a proteína de
Bence Jones; (5) a concentração da paraproteína aumenta pro-
gressivamente; (6) as concentrações de imunoglobulina policlo-
nal d i m i n u e m m u i t o . Se esses critérios não estão presentes, a
condição provavelmente é benigna ou é uma "gamopatia mono-
clonal de significado desconhecido" ( M G U S ) . Esses pacientes
devem ser monitorados por pelo menos cinco anos por causa da
possibilidade de conversão à malignidade.
Mieloma Múltiplo. Mieloma múltiplo é uma neoplasia maligna,
geralmente de u m único clone de células plasmáticas, embora às
IgM lyG IgA
100 S \ \
80
ê
Ü 60
£ 40
5 20
—
I 1 i i—i 1—I
2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9
Idade Fetal (Meses)
Nascimento Idade (Anos)
B
316 PARTE IV Analitos
vezes dois ou mais clones possam estar envolvidos. As células
plasmáticas, na maioria das vezes, proliferam de forma difusa por
toda a medula óssea, mas ocasionalmente elas f o r m a m u m t u m o r
solitário denominado plasmocitoma. Lesões osteolíticas são produ-
zidas, e as outras células da medula óssea são reduzidas desenvol-
vendo trombocitopenia, anemia e leucopenia. A o mesmo tempo,
o desenvolvimento de clones normais de células plasmáticas é
inibido; conseqüentemente, a síntese de outras imunogiobulinas
é reduzida e se observa uma síndrome de infecções recorrentes.
A incidência de mieloma m ú l t i p l o é baixa em indivíduos com
idade menor do que 60 anos, mas aumenta rapidamente com a
idade. Pacientes podem ter sintomas locais de uma lesão óssea,
tais como dor ou fraturas, mas mais freqüentemente têm sinto-
mas inespecíficos, tais como (1) perda de peso, (2) anemia, (3)
hemorragia, (4) infecções repetidas ou (5) insuficiência renal.
U m a concentração sérica n o r m a l de fosfatase alcalina em u m
paciente com lesões ósseas destrutivas é u m achado laboratorial
altamente sugestivo. Características básicas do diagnóstico da
doença são a descoberta de células plasmáticas neoplásicas em
u m aspirado de medula óssea, a demonstração radiológica de
lesões osteolíticas e a identificação de uma paraproteína no soro
ou na urina. Todos os pacientes que podem desenvolver a doença
devem ser rastreados com relação a paraproteínas; menos de 1%
dos portadores da doença não têm paraproteínas detectáveis. A
Tabela 18-5 lista as paraproteínas que podem estar associadas a
mieloma m ú l t i p l o e algumas de suas características.
Tumores Linfóides. Tumores Imfóides, tais como linfomas o u
leucemias linfocíticas crônicas, originam-se de estágios iniciais do
desenvolvimento de línfócitos B. E m geral, cerca de 1 em 5 deles
produzem paraproteínas, comumente da classe IgM.
Macroglobulinemia d6 Waidenstrõm. Se ficar provado que uma
paraproteína é IgM, o diagnóstico provavelmente é maerogiofcuíí-
nemia de Waidenstrõm, e não mieloma múltiplo. Os clones da
macroglobulinemia de Waidenstrõm se originam dos linfócitos
B mais maduros e, invariavelmente, produzem IgM; de fato, é a
presença dessa proteína de massa molecular m u i t o alta que
produz o sintoma importante da doença — u m aumento na vis-
cosidade do sangue. A proteinúria de Bence Jones ocorre em
80% desses casos, mas a condição é m u i t o menos maligna do que
o mieloma m ú l t i p l o . Os linfonodos e o baço se encontram
aumentados, mas a infiltração linfóide cresce de forma lenta, e
os sintomas são comumente tratáveis por transfusão de hemo-
componentes ou plasmaférese.
TABELA 18-5 Imunogiobulinas Monoclonais (Paraproteínas) no Mieloma Múltiplo
Paraproteína Idade da
Plasmática Incidência* (%) Ocorrência* (Média)
IgG 50 65
IgA 25 65
Somente Bence 20 56
Jones (cadeias
leves livres)
IgD 2 57
IgM 1 -
IgE 0,1 - A maioria
Biclona! 1 -
Não-detectada <1 - 0
* Aproximado.
Doença de Cadeia Pesada. As formas pouco comuns de IgG,
I g A ou cadeias leves raramente polimerizam e causam uma sín-
drome similar com alta viscosidade sanguínea. As doenças de
cadeia pesada, na qual a paraproteína consiste em apenas uma
cadeia pesada, geralmente incompleta, são doenças raras associa-
das à infiltração linfóide. A mais c o m u m delas é a doença de cadeia
a , na qual o intestino é infiltrado e pode-se observar uma má
absorção grave.
Doença Amilóide e Crioglobulinemia. Ambas as doenças são
algumas vezes caracterizadas por paraproteínas. U m a crioglobu-
lina é uma proteína sérica que precipita em temperaturas mais
baixas do que a temperatura n o r m a l do corpo. A maioria das
crioglobulinas é formada por complexos de imunoglobulina poli-
clonal, mas aproximadamente a metade é monoclonal, geral-
mente IgM. Para avaliação da crioglobulina, uma temperatura de
37 ° C deve ser mantida na coleta de sangue e na separação e no
armazenamento do soro, a f i m de evitar que a crioglobulina
precipite. A doença amilóide é caracterizada por depósitos de
complexos de proteína fibrilar insolúvel em vários tecidos; com
coloração especial, os depósitos são facilmente visualizados em
cortes de biópsia. Alguns dos depósitos contêm fragmentos de
cadeias leves, especialmente da região variável. Os depósitos ami-
lóides também podem ocorrer em mieloma múltiplo.
Proteína em Outros Líquidos Corpóreos
A l é m do plasma, as proteínas de interesse clinico são encontradas
em diversos outros líquidos corpóreos e tecidos, i n c l u i n d o (1)
urina, (2) CSF, (3) líquido amniótico, (4) saliva e (5) fezes.
Proteínas Urinárias
Proteinúria é definida como a presença de proteínas em excesso
na urina, como é visto (1) em muitos tipos de doença renal
(Capítulo 34), (2) após exercício intenso e (3) na desidratação.
Bioquímica e Função
A membrana basal glomerular ( G B M ) do r i m atua como u m
ultrafiltro para as proteínas plasmáticas. O grau pelo qual as
proteínas passam através da membrana é função (1) do tamanho
molecular, (2) da carga iônica líquida e (3) da concentração plas-
mática das proteínas.' E m geral, o transporte das moléculas pro-
téicas através da membrana glomerular é inversamente relacio-
Incidência da Proteinúria
de Bence Jones {%) Comentários
60 Pacientes mais suscetíveis à imunodeficiência; as
paraproteínas atingem os níveis mais altos
70 Tendência à li ipe real cernia e amíloidese
100 Freqüentemente doença renal; lesces ósseas;
amiloidose; prognóstico ruim
100 90% tipo Jl; freqüentemente possui lesão
extra-óssea, amiloidose e falha renal; 50% têm
linfonodos, ligado e baço aumentados;
prognóstico ruim
100 Podem ou não ter síndrome de hiperviscosidade
-
- -
Normalmente redução das imunogiobulinas normais

n a d o c o m o t a m a n h o e c o m a carga negativa l í q u i d a . N o r m a l -
m e n t e as proteínas de massa m o l e c u l a r alta, tais c o m o I g M
(massa molecular • 9 0 0 k D a ) , estão presentes n o f i l t r a d o glome-
r u l a r somente em quantidades-traço. Q u a n t i d a d e s relativamente
pequenas, mas significativas, de a l b u m i n a (massa m o l e c u l a r de
66 k D a ) são passadas para o f i l t r a d o c o m o resultado de sua alta
concentração plasmática e massa m o l e c u l a r relativamente baixa.
As proteínas c o m massas moleculares de 15 a 40 k D a são filtradas
mais p r o n t a m e n t e , mas em m e n o r q u a n t i d a d e p o r causa de suas
concentrações plasmáticas baixas.
A q u a n t i d a d e de u m a d e t e r m i n a d a proteína na u r i n a excre-
tada t a m b é m depende da extensão de sua reabsorção pelos
t ú b u l o s renais, que t a m b é m é inversamente relacionada c o m o
t a m a n h o molecular. Proteínas pequenas, tais coma B M G e a r
m i c r o g l o b u l i n a ( A ] M ) , são reabsorvidas quase por c o m p l e t o se a
função t u b u l a r estiver n o r m a l . S o m e n t e u m a pequena quanti-
dade de proteína está presente na u r i n a n o r m a l excretada (20 a
150 m g / d i a ) , e a m a i o r i a é a l b u m i n a . O restante é quase inteira-
m e n t e o u r o m u c ó i d e da p r o t e í n a de T a m m - H o r s f a l l , provavel-
m e n t e secretado pelos t ú b u l o s distais. A p e r m e a b i l i d a d e aumen-
tada da G B M é p r i m e i r a m e n t e sinalizada pelas quantidades ele-
vadas de a l b u m i n a na u r i n a . A perda da seletividade n o r m a l
("peneiração") é d e m o n s t r a d a pelo aparecimento de proteínas
c o m massa m o l e c u l a r cada vez m a i o r na u r i n a . A reabsorção
t u b u l a r d i m i n u í d a , o u d i m i n u i n d o , é sugerida pelas concentra-
ções crescentes de proteínas de massa m o l e c u l a r baixa na u r i n a .
Importância Clínica
A l é m d o sangramento pós-renal, a proteinúria ocorre c o m (1)
p e r m e a b i l i d a d e g l o m e r u l a r a u m e n t a d a (proteinúria glomerular), na
q u a l a proteína u r i n á r i a é p r i n c i p a l m e n t e a a l b u m i n a , (2) reab-
sorção t u b u l a r defeituosa (proteinúria tubular), na q u a l as proteí-
nas urinárias são p r i n c i p a l m e n t e as de baixo peso molecular, (3)
concentração a u m e n t a d a no plasma de u m a proteína de b a i x o
peso m o l e c u l a r a n o r m a l , tais c o m o as cadeias leves de i m u n o g l o -
b u l i n a (proteinúria de sobrecarga), e (4) secreção a n o r m a l de p r o t e í n a
n o t r a t o u r i n á r i o {proteinúria pós^enal). A s duas ú l t i m a s são as
menos c o m u n s .
Proteinúria Glomerutaí, Esse é o t i p o mais c o m u m e mais grave
de p r o t e i n ú r i a . Os pacientes são r o t i n e i r a m e n t e rastreados c o m
relação a essa doença por u m teste simples da a l b u m i n a usando
t i r a de papel. Se o resultado d o teste for negativo, a p r o t e i n ú r i a
glomerular clinicamente significativa será excluída; se o resultado
do teste for positivo, investigação posterior, como u m a avaliação
q u a n t i t a t i v a da excreção de proteína, estará indicada. C o m o a
m a i o r i a da proteína excretada é a a l b u m i n a , a p r o t e i n ú r i a glome-
rular é freqüentemente classificada c o m o albuminúria. U m a u m e n t o
na permeabilidade g l o m e r u l a r ocorre e m inúmeras condições
caracterizadas p o r lesão difusa dos TÍns. N o diabetes mellitus, a
permeabilidade vascular a u m e n t a e a a l b u m i n ú r i a aparece q u a n d o
a regulação metabólica é r u i m , pelo menos em parte, p o r causa
da glicosilação e da perda das cargas negativas nas membranas.
A proteinúria funcional o u benigna é u m a f o r m a de p r o t e i n ú r i a
g l o m e r u l a r que provavelmente é causada p o r mudanças de f l u x o
sanguíneo através dos glomérulos. Ela é observada c o m (1) exer-
cício, (2) febre, (3) exposição ao f r i o , (4) insuficiência cardíaca
congestiva, (5) hipertensão e (6) arteriosclerose. As taxas de excre-
ção protéica são menores q u e 1 g / d i a . A proteinúria ortostática o u
postural, associada à posição ereta, é t a m b é m u m a f o r m a de pro-
t e i n ú r i a f u n c i o n a l , mas a excreção p o d e exceder 1 g / d i a . Dife-
r e n t e m e n t e , a p r o t e i n ú r i a ortostática complica a avaliação de
pacientes assintomáticos. Se t r a n s i t ó r i a , provavelmente é benigna;
mas se crônica o u não i n t e i r a m e n t e relacionada c o m a postura,
as taxas de excreção de p r o t e í n a devem ser checadas em interva-
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 317
los de seis meses, preferencialmente p o r u m teste q u a n t i t a t i v o . A
persistência de p r o t e i n ú r i a sugere doença renal básica. N a gravi-
dez n o r m a l , a excreção de proteinas pode a u m e n t a r para 2 0 0 a
3 0 0 m g / d i a sem perigo. Esse p e q u e n o a u m e n t o contrasta c o m a
p r o t e i n ú r i a da pré-eclâmpsia, u m a p r o t e i n ú r i a g l o m e r u l a r de até
3 g / d i a , e c o m as proteínurias de insuficiência renal latente o u
de infecção d o t r a t o u r i n á r i o .
U m a realidade clínica a d i c i o n a l , a microalbuminúria, é reco-
n h e c i d a c o m o sendo de grande v a l o r p r e d i t i v o da n e f r o p a t i a
i m i n e n t e e m pacientes diabéticos do t i p o I.
Proteinúria Tubular. A p r o t e i n ú r i a t u b u l a r é caracterizada pelo
aparecimento de proteínas de b a i x o peso m o l e c u l a r na u r i n a
c o m o resultado da reabsorção d i m i n u í d a pelos t ú b u l o s proxi-
mais. Pode ocorrer sozinha, mas é mais c o m u m e n t e associada à
p r o t e i n ú r i a glomerular. Q u a n d o a p r o t e i n ú r i a t u b u l a r ocorre
sozinha, a excreção de a l b u m i n a é apenas ligeiramente aumen-
tada, mas f r e q ü e n t e m e n t e não o bastante para dar u m a reação
positiva na tira de papel. Testes mais específicos são necessários
para detectar a p r o t e i n ú r i a t u b u l a r simples o u para identificá-la
e m presença de p r o t e i n ú r i a g l o m e r u l a r . A eletroforese em agarose
da u r i n a de pacientes em s o f r i m e n t o resulta e m u m padrão
característico — bandas a e |3 i m p o r t a n t e s , u m a banda de albu-
m i n a relativamente fraca, e algumas vezes u m a banda pós-y. Ele-
troforese em gel de p o l i a c r i l a m i d a e d o d e c i l sulfato de sódio
(SDS-PAGE) é ainda mais ú t i l , especialmente na detecção de
p r o t e i n ú r i a t u b u l a r e m presença de p r o t e i n ú r i a glomerular,
p o r q u e ela separa as proteínas p e l o t a m a n h o molecular. As pro-
teínas n o r m a l m e n t e excretadas n a p r o t e i n ú r i a t u b u l a r i n c l u e m
(1) B M G - 11,8 k D a , (2) lisozima - 14,5 k D a , (3) R B P - 21 k D a ,
(4) A : M — 27 k D a , (5) A A G — 4 0 k D a e (6) diversos h o r m ô n i o s
p o l i p e p t í d i c o s e enzimas. U m a m a n e i r a simples de rastrear a
p r o t e i n ú r i a t u b u l a r é q u a n t i f i c a r a B M G o u a lisozima. A razão
de desaparecimento proteína-creatinina para a proteína marca-
d o r a t a m b é m é u m i n d i c a d o r ú t i l de excreção (p. ex., a razão para
a lisozima é a u m e n t a d a 100 vezes na s í n d r o m e de Fanconi) e é
s u f i c i e n t e m e n t e confiável para a m a i o r i a dos fins diagnósticos e
prognósticos.
A proteinúria tubular aguda p o d e ocorrer c o m (1) queimaduras,
(2) pancreatite aguda, (3) e n v e n e n a m e n t o p o r metal pesado o u
(4) administração de drogas genotóxicas e pode, p o s t e r i o r m e n t e ,
ser c o m p l e t a m e n t e resolvida. A proteinúria tubular crônica é geral-
m e n t e irreversível. Sua etiologia p o d e ser hereditária, c o m o na
s í n d r o m e de Fanconi; o u a d q u i r i d a , c o m o na p i e l o n e f r i t e crônica
o u n u m a doença sistêmicaj t a l c o m o cirrose o u sarcoidose.
Drogas, tais c o m o fenacetina, e toxinas, c o m o c á d m i o , t a m b é m
causam d a n o t u b u l a r , que p o d e ser grave. E m alguns casos a
p r o t e i n ú r i a t u b u l a r leve p o d e ser o ú n i c o sinal de d a n o renal
progressivo. Testes para a p r o t e i n ú r i a t u b u l a r estão sendo utiliza-
dos agora para m o n i t o r a r (1) rejeição de transplante renal, (2)
e n v e n e n a m e n t o p o r c á d m i o e a m i n o g l i c o s í d e o , e (3) p i e l o n e f r i t e
crônica. A B M G é u m a p r o t e í n a marcadora favorita para a pro-
teinúria tubular.
Proteinúria de Sobrecarga. A p r o t e i n ú r i a de sobrecarga i n c l u i
(1) h e m n g l o b i n ú r i a , (2) m i o g l o b i n ú r i a e (3) p r o t e i n ú r i a de Bence
Jones (concentrações plasmáticas elevadas de paraproteínas de
cadeia leve de i m u n o g l o b u l i n a , c o m o visto n o m i e l o m a m ú l t i -
plo). A detecção de cadeias leves depende das análises eletroforé-
tica e i m u n o q u í m i c a . A p r o t e i n ú r i a de sobrecarga de hemoglo-
b i n a o u m i o g l o b i n a é detectada p o r testes i m u n o q u í m i c o s o u
funcionais.
Proteinúria Pós-renal. A pToteinúria pós-renal se refere à pro-
teína q u e se o r i g i n a do trato u r i n á r i o abaixo dos r i n s e geralmente
é provocada p o r i n f l a m a ç ã o o u m a l i g n i d a d e . Ela é diagnosticada
p o r avaliação microscópica do s e d i m e n t o u r i n á r i o para células
31B PARTE IV Analitos
inflamatórias e malignas. A presença de eritrócitos ou leucócitos
em u m sedimento urinário centrifugado é uma prova valiosa de
que sua origem é dos rins, e náo extra-renal.
Considerações Laboratoriais
A detecção qualitativa da proteína em excesso na urma é mais
comumente realizada usando-se testes de tira de papel, muitos
deles sendo métodos baseados em corantes. C o m o todas as técni-
cas de ligação a corante, os métodos com tira de papel são mais
sensíveis para a albumina do que para outras proteínas plasmáticas.
Eles são, portanto, testes de rastreamento excelentes para a protei-
núria glomerular, mas insatisfatórios para a detecção de proteinúria
tubular ou proteinúria de sobrecarga do tipo Bence Jones.
O ensaio quantitativo para a proteina total ou para as diferentes
proteínas geralmente é realizado em coletas por u m período de
tempo. Períodos de 4. 8 e 12 horas podem ser apropriados para
monitorar u m transplantado renal ou u m paciente cujas perdas
renais agudas de albumina estão sendo compensadas com trata-
mento de reposição bem controlado. Na maioria dos casos, entre-
tantOj prefere-se uma coleta de 24 horas, tanto para a análise
quantitativa total quanto para uma proteína específica e para a
separação eletroforética.
O intervalo de referência para a proteína urinária é 1 a 14
m g / d L . A taxa de excreção em descanso é 50 a 80 m g / d i a , mas
muitos laboratórios indicam o valor de referência como menor
que 100 rng/dia (menos que 150 m g / d i a na gravidez). A concen-
tração pode atingir 300 m g / d L na urina de indivíduos saudáveis
após exercício.
Proteínas do Líquido Cerebrospinal
O CSF para a análise laboratorial normalmente é obtido da
região lombar.
Bioquímica e Função
O CSF é secretado pelo plexo coróide, ao redor dos vasos
cerebrais, e ao longo das paredes dos ventrículos cerebrais. Ele (1)
preenche os ventrículos e as cisternas, (2) banha a medula espinal
e (3) é reabsorvido para o sangue através das vilosidades da arac-
nóide. A reposição do CSF é rápida, sendo trocada totalmente
cerca de quatro vezes por dia. Mais de 80% do conteúdo proteico
do CSF se origina do plasma por ultrafiltração e pinocitose. O
restante é de síntese intratecal. A concentração mais baixa de
proteína total e a menor proporção de moléculas protéicas maiores
estão no f l u i d o ventricular. A medida que o CSF desce para a
espinha lombar (local a partir do qual as amostras são normal-
mente coletadas), a concentração de proteína aumenta.
C o m o o CSF é principalmente u m ultrafiltrado do plasma,
normalmente há predominância de proteínas plasmáticas de
massa molecular relativamente baixa, tais como (1) pré-albumma,
(2) albumina e (3) transferrina. N e n h u m a proteína com massa
molecular maior do que a da IgG está presente em concentração
suficiente para ser visualizada por eletroforese. O padrão eletro-
forético de CSF normal após concentração do f l u i d o tem duas
características que se destacam — uma banda proeminente de
pré-albumina e duas bandas de transferrina. A segunda banda
eletroforética de transferrina é a proteína t (tau), uma forma de
transferrina que é produzida ou transformada mtratecalmente e,
por comparação com a transferrina plasmática, é deficiente n o
teor de ácido siálico.
importância Clínica
A barreira sangue-CSF é u m conceito e não uma estrutura ana-
tômica. A barreira é definida pelos muitos fatores complexos que
governam a distribuição de compostos, além de água, dióxido de
carbono e oxigênio, entre o sangue e o líquido extracelular do
cérebro e suas estruturas acessórias. Neste capítulo, o termo bar-
reira sangue-CSF é usado como u m sinônimo para o endotélio
capilar de vasos do sistema nervoso central (CNS). A análise de
proteína total e de proteínas específicas do CSF é usada, princi-
palmente, para detectar permeabilidade aumentada da barreira
sangue-CSF para as proteínas plasmáticas ou síntese mtratecal
aumentada de imunogiobulinas.
Permeabilidade Aumentada. A permeabilidade da barreira
sangue-CSF para as proteínas plasmáticas é aumentada por
pressão intracraniana elevada resultante de (1) u m t u m o r n o
cérebro, (2) hemorragia intracerebral ou (3) lesão traumática.
A l é m disso, a permeabilidade aumentada é vista em inflamação
associada a (1) meningite bacteriana ou virai, (2) encefalite ou (3)
poliomielite. Os aumentos mais notáveis de proteína total de
CSF são observados em meningite bacteriana. A proteína de CSF
lombar se encontra aumentada quando a circulação de CSF é
mecanicamente obstruída acima do local da punção (como por
u m t u m o r na medula espinal) e as proteínas plasmáticas se equi-
libram através das paredes dos capilares meníngeos para dentro
do CSF estagnado. O efeito de qualquer uma dessas condições
é que as proporções de proteínas específicas no CSF se asseme-
l h a m cada vez mais às do soro. Neonatos prematuros e a termo
têm maior permeabilidade e, como resultado, concentrações con-
sideravelmente maiores de proteína total do CSF (até 130 m g /
dL) do que os adultos saudáveis.
SíntSSS Intratecal. A demonstração de síntese intratecal aumen-
tada de imunogiobulinas, particularmente IgG, é de grande impor-
tância para o diagnóstico de doenças desmielinizantes do CSF,
especialmente esclerose múltipla. Na esclerose múltipla, a dete-
rioração incompleta das bainhas de mielina dos axónios no C N S
afeta, profundamente, a condução de impulsos nervosos. A causa
da desmielinização não é conhecida, e os locais das lesões são
imprevisíveis; os sintomas resultantes variam enormemente. Os
linfócitos B que infiltram as lesões sintetizam IgG e, ocasional-
mente, outras imunogiobulinas. C o m o os axônios do C N S estão
em contato í n t i m o com o CSF, as imunogiobulinas produzidas
na lesão aparecem no CSF.
Considerações Laboratoriais
Diversas técnicas analíticas são usadas para avaliar a permeabili-
dade aumentada da barreira sangue-CSF para as proteínas plas-
máticas e detectar a síntese intratecal de imunogiobulinas.
O intervalo de referência para a albumina no CSF lombar
pelo R I D é 17,7 a 25,1 m g / d L . N o CSF normal, IgA, IgD e I g M
são, cada uma, menores do que 0,2 m g / d L . Os intervalos de
referência para IgG são associados à idade; suas médias aumentam
de 3,5 m g / d L , no grupo de 15 a 20 anos de idade, para 5,8 m g /
dL, em adultos com 60 anos ou mais. O intervalo de referência
usual para IgG do CSF em adultos é de 0,8 a 4,2 m g / d L .
Proteínas do Líquido Amniótico, Saliva, Fezes e
Cavidades Peritoneai e Pleural
O líquido amniótico é analisado com relação à AFP e outros
analitos no rastreamento pré-natal de defeitos fetais. A saliva é
examinada com relação à IgA, na avaliação de possíveis deficiên-
cias imunológicas, e à B M G , na síndrome de Sjõgren. Análise de
A A T nas fezes é usada algumas vezes no diagnóstico de entero-
patia exsudativa ou outras formas de perda proteica gastrointes-
tinal; ao contrário de outras proteínas plasmáticas, a A A T é
resistente à quebra por enzimas proteolíticas n o intestino. Os
valores de A A T nas fezes maiores que 54 m g / L indicam perda
aumentada.

Os acúmulos patológicos de l i q u i d o nas cavidades peritoneais
e pleurais, o u e m qualquer o u t r o lugar, v a r i a m g r a n d e m e n t e n o
c o n t e ú d o proteico. Por exemplo, eles p o d e m ser (1) u k r a f i l t r a d o s
c o m concentrações baixas de proteínas e quantidades m u i t o
pequenas de proteinas de massa m o l e c u l a r elevada o u (2) l í q u i d o s
serosos c o m altas concentrações de proteínas e quantidades sig-
nificativas de proteínas grandes, tais c o m o i m u n o g l o b u l i n a s .
Esses l í q u i d o s são d i v i d i d o s a r b i t r a r i a m e n t e de acordo c o m suas
concentrações protéicas em transudatos, c o m proteína t o t a l m e n o r
que 3 g / d L , e exsudatos, c o m concentrações de p r o t e í n a t o t a l
m a i o r que 3 g / d L Os transudatos geralmente r e f l e t e m alterações
na p e r m e a b i l i d a d e das membranas filtrantes, e n q u a n t o os exsu-
datos n o r m a l m e n t e resultam de infecção o u m a l i g n i d a d e ; os
ú l t i m o s p o d e m conter u m grande n ú m e r o de leucócitos o u células
malignas.
Proteína Amilóide
A m i l ó i d e ( d o grego "semelhante ao a m i d o " , p o r causa da colora-
ção c o m i o d o e outros corantes) se refere a depósitos patológicos
extracelulares associados a u m g r u p o de doenças coletivamente
d e n o m i n a d a s amiioidoses. Os depósitos exèrcem pressão sobre
órgãos vitais e, eventualmente, causam a m o r t e . T o d o s os tipos
de a m i l ó i d e se l i g a m ao v e r m e l h o congo, q u e emite u m a fluores-
cência verde-clara sob luz polarizada. C l i n i c a m e n t e , as a m i l o i d o -
ses são classificadas e agrupadas c o m o (1) a m i l o i d o s e p r i m á r i a ,
(2) a m i l o i d o s e associada ao m i e l o m a m ú l t i p l o , (3) a m i l o i d o s e
secundária associada a doenças i n f l a m a t ó r i a s ou infecciosas, (4)
a m i l o i d o s e associada à idade ( a m i l o i d o s e senil) e (5) a m i l o i d o s e
familiar.
Os grupos u m e dois são caracterizados p o r plasmocitose na
m e d u l a óssea e p r o d u ç ã o e m excesso de células plasmáticas de
cadeias leves m o n o c l o n a i s a n t i g e n i c a m e n t e idênticas, e são cole-
tivamente conhecidos c o m amiloidose AL.
A a m i l o i d o s e secundária está associada a depósitos de ami-
l ó i d e A ( A A ) e é chamada amihidose A A . As proteínas A A são
fragmentos a m i n o t e r m i n a i s da proteína a m i l ó i d e A sérica ( S A A ;
220-23.5 k D a ) que circula c o m o u m complexo c o m l i p o p r o t e í n a s
de alta densidade ( H D L ) . A S A A é uma proteína de fase aguda,
a u m e n t a n d o r a p i d a m e n t e e m infecções o u i n f l a m a ç ã o não-infec-
ciosa. A a m i l o i d o s e A A está f r e q ü e n t e m e n t e associada a doenças
i n f l a m a t ó r i a s não-infecciosas crônicas. Estas i n c l u e m (1) artrite
r e u m a t ó i d e ( i n c i d ê n c i a até 2 0 % ) , (2) outras doenças i n f l a m a t ó -
rias de articulação, (3) infecções granulomatosas e supurativas
crônicas, tais c o m o tuberculose e ostelomielite, e (4) tumores
não-linfóides, tais c o m o carcinomas renal e gástrico e l i n f o m a de
H o d g k i n . O s depósitos da p r o t e í n a A A são e n c o n t r a d o s mais
f r e q u e n t e m e n t e nos rins, n o fígado e n o baço, e geralmente
resultam e m s í n d r o m e n e f r ó t i c a e hepatoesplenomegalia.
A p r o t e í n a a m i l ó i d e senil é e n c o n t r a d a mais c o m u m e n t e n o
coração ( a m i l ó i d e cardíaco senil), mas t a m b é m n o pâncreas e n o
cérebro ( d e n o m i n a d a placa amilóide). Parecem existir diferentes
mecanismos patogenéticos para as três localizações de depósitos.
Os depósitos de a m i l ó i d e n o d u l a r o u i n f i l t r a t i v o t a m b é m p o d e m
estar presentes na pele, nos p u l m õ e s , na traquéia e n o s órgãos
e n d ó c r i n o s , tais c o m o o pâncreas ( n o diabetes mellitus de longa
duração) o u a tireóide ( n o c a r c i n o m a medular). Essas formas são
c o m u m e n t e assintomáticas, exceto a f o r m a cardíaca.
As a m i l o i doses familiares são p r i n c i p a l m e n t e neurológicas,
mas t a m b é m p o d e m envolver os rins e os vasos sanguíneos.
Várias f o r m a s têm m o n ô m e r o s de t r a n s t i r r e t i n a a n o r m a l o u frag-
m e n t o s q u e c o m p a r t i l h a m d e t e r m i n a n t e s antigênicos c o m essa
proteína.
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 319
ANÁLISE DE PROTEÍNAS
Os m é t o d o s para as diferentes proteínas f o r a m discutidos ante-
r i o r m e n t e , nas seções i n t i t u l a d a s Considerações Laboratoriais.
Nesta seção, técnicas (1) i m u n o q u í m i c a s , (2) eletroforéticas, (3)
espectrofotométricas e (4) de espectrometria de massa são discu-
tidas em geral. Elas são discutidas mais d e t a l h a d a m e n t e n o Capí-
t u l o 4 e nos C a p í t u l o s 6-10.
Métodos Imunoquímicos Quantitativos
A m a i o r i a dos métodos i m u n o q u í m i c o s se aplica à m e d i d a de
qualquer u m a das proteínas discutidas neste capítulo. Por causa
de sua rapidez e sua facilidade, os métodos nefelométricos e tur-
b i d i m é t r i c o s são mais a m p l a m e n t e usados em aplicações clínicas.
Essas técnicas são realizadas p o r m e d i d a da q u a n t i d a d e de com-
plexo A g A b f o r m a d o (métodos de e q u i l í b r i o ) o u pela m e d i d a da
taxa de formação do complexo (métodos cinéticos). Essas medidas
são feitas p o r m e i o de técnicas t u r b i d i m é t r i c a s e nefelométricas.
Amostras de soros lipêmicos não devem ser analisadas p o r esses
métodos p o r causa do extremo espalhamento de luz pelas partí-
culas lipídicas contidas neles Tais amostras devem ser centrifuga-
das e m u m a centrífuga de alta velocidade para separar os l í q u i d o s
e obter soros claros antes da análise. Os tubos de ensaio c o n t e n d o
as amostras, os controles e o calibrador, devem permanecer cober-
tos d u r a n t e o teste para evitar c o n t a m i n a ç ã o p o r poeira e partícu-
las de sujeira e para m i n i m i z a r a evaporação. As cubetas devem
permanecer cobertas t a m b é m d u r a n t e o ensaio e q u a n d o f o r e m
armazenadas. Partículas de poeira e outros corpos particulados na
m i s t u r a reacional resultam em sinais de espalhamento de luz
estranhos e levam a resultados equivocados.
Técnicas Eletroforéticas
A eletroforese é usada em l a b o r a t ó r i o s clínicos para estudar e
m e d i r o c o n t e ú d o protéico de f l u i d o s biológicos, i n c l u i n d o soro, 6
u r i n a e CSF. Técnicas eletroforéticas c o m u n s para soro i n c l u e m
o uso de acetato de celulose, de gel de agarose o u de eletroforese
capilar. Procedimentos especiais i n c l u e m Weste-rn Motting, imuno-
fixação e eletroforese bidimensional (2-D) ( C a p í t u l o 6). M é t o d o s ele-
troforéticos similares t a m b é m são usados para avaliar proteínas
da u r i n a e d o C S E
Eletroforese de Proteínas Séricas6
O soro é mais c o m u m e n t e u t i l i z a d o do que o plasma para a
eletroforese de r o t i n a de proteínas d o sangue para evitar a b a n d a
do f i b r i n o g ê n i o em u m a região para a q u a l as i m u n o g l o b u l i n a s
m o n o c l o n a i s f r e q ü e n t e m e n t e m i g r a m . N o e n t a n t o , alguns ana-
listas preferem usar o plasma para s e m i q u a n t i f i c a r a q u a n t i d a d e
de f i b r i n o g ê n i o presente c o m o evidência de i n f l a m a ç ã o aguda o u
f i b r i n ó l i s e i n vivo.
A Figura 18-7 ilustra as separações típicas p o r eletroforese de
p r o t e í n a sérica (SPE) e m condições n o r m a i s e patológicas. N a
prática, a m a i o r i a das eletroforeses de proteínas séricas é realizada
u s a n d o sistemas comerciais q u e i n t e g r a m aparelho, m a t e r i a l e
reagentes de u m ú n i c o f o r n e c e d o r . Os tampões-padrão têm força
i ô n i c a baixa ( ~ 0 , 0 5 ) e p H ( ~ 8 , 6 ) . A amostra usual é de 3 a 5 p L ,
aplicada c o m u m dispositivo m e c â n i c o para se obter u m a faixa
regular da amostra ao l o n g o de u m a trajetória d o m e i o . Os parâ-
metros típicos para a c o r r i d a são 1,5 m A p o r 2 c m de largura d o
acetato de celulose, o u 10 m A p o r 1 c m de largura do gel de
agarose, e u m t e m p o de c o r r i d a de 40 a 6 0 m i n u t o s , p r o d u z i n d o
u m a distância de migração de 5 a 6 c m para a a l b u m i n a . M u d a n -
ças em certas bandas estão c l a r a m e n t e associadas a doenças espe-
cíficas, o que t o r n a a eletroforese de proteínas séricas u m m é t o d o
de rastreamento valioso.
320 PARTE IV Analitos

Normal (Adulto) Normal (Pediátrico) Doença Renal Crônica

Padrão Proteína Concentração Padrão Proteína Concentração Padrão Proteína Concentração
(mg/dL) (mg/dL) (mg/dL)
TP 6.800-8.300 TP 6.900 TP 2 . 3 0 0 4-
Alb 3.500-5.000 B B Alb 4.390 Alb 1.110 4
AAT 100-200 AAT 240 AAT 260*
AAG 50-150 AAG 59 AAG 72*
Hp 30-215 Hp 65 Hp 101
AMG 125-140 • • ' • AMG 490 AMG 180
TRF 200-350 TRF 300 TRF 81
1
C3 70-150 '• C3 127 C3 71 *
C4 10-40 C4 27 C4 14*
IgA 40-390 IgA 180 IgA 67*
IgM 25-210 IgM 140 IgM 47*
IgG 525-1.650 IgG 870 IgG 200 A
CRP <2 CRP <1 CRP <1

Gamopatia Monoclonal IgG Gamopatia Monoclonal IgA

(Benigna) (Mieloma Múltiplo) Síndrome Nefrótica
Padrão Proteína Concentração Padrão Proteína Concentração Padrão Proteína Concentração
(mg/dL) (mg/dL) (mg/dL)
TP 6.900 / TP 9.100T - - TP 2.9001
Alb 4.380* Alb 2.170T Alb 6804.
AAT 200 AAT 250 AAT 160*
AAG 50 AAG 63 AAG 35*
Hp 75 Hp « M m Hp 370*
AMG 220 AMG 170 AMG 460 T
TRF 270 TRF 150 TRF 101T
C3 122 C3 90 C3 125*
C4 24 C4 20 C4 22*
IgA 70* IgA 5.800T IgA 250*
IgM 170* IgM 244- IgM 93*
IgG 1.330/ IgG 2004- IgG 4404-
CRP <1 CRP <1 CRP <1

Inflamação (Aguda) Lúpus Eritematoso Sistêmico Artrite Reumatóide (Adulto)

Padrão Proteína Concentração Padrão Proteína Concentração Padrão Proteína Concentração
(mg/dL) (mg/dL) (mg/dL)
TP 5.700* TP 7.800 • • TP 6.300
Alb 2.4701 Alb 3.390* Alb 2.840*
AAT 4001 AAT 230 AAT 400T
AAG 170T AAG 43 AAG 150Í
Hp 340 T Hp 111* Hp 2901
AMG 210 AMG 240 AMG 148
TRF 714- TRF 310 TRF 220*
C3 120/ C3 94* C3 90/
C4 17-" C4 12* C4 13^
IgA 270 igA 650T igA 260/

M
IgM 137 IgM 170 IgM 880
IgG 1.440 IgG 2.4801' IgG 930^
CRP 9,8 t CRP 7,8T CRP 6,1 T

Deficiência de Ferro Doença Hepática Crônica Hemólise Crônica e Deficiência de Ferro

Padrão Proteína Concentração Padrão Proteína Concentração Padrão Proteína Concentração
(mg/dL) (mg/dL) (mg/dL)
TP 6800 TP 6.300* TP 6.300
Alb 4770 Alb 2.2404- Alb 4.010
AAT 280 AAT 97* AAT 190
AAG 44 AAG 19* AAG 43
Hp 101 Hp <1* Hp <14.
AMG 220 AMG 290 AMG 400
mÊm
TRF 5301 TRF 1294- - - -
TRF 3901
C3 136 C3 53* C3 134
C4 22 C4 4* C4 14
IgA 150 IgA 4801 IgA 180
IgM 82 IgM 620/
4}
IgM 170
IgG 880 igG 2.370t IgG 700
CRP <11 CRP <1

Figura 1S-7 Padrões eletroforéticos típicos de urna c o n d i ç ã o n o r m a l e de algumas condições patológicas (gel
de agarose). Setas para cima e para baixo i n d i c a m , respectivamente, a u m e n t o e redução de u m i n t e r v a l o de
referência. Setas inclinadas para d i r e i t a o u para a esquerda i n d i c a m , respectivamente, variação d o n o r m a l para
u m a u m e n t o o u para u m a T e d u ç ã o d o i n t e r v a l o de referência. O asterisco indica o f e n ó t i p o H p 2-2.

Colorações
O azul brilhante de Coomassie (CBB), que é mais sensível do
que o A m i d o Black ou o Ponceau S, é amplamente usado para
corar as proteínas separadas. As concentrações de muitas proteí-
nas são m u i t o baixas para serem visualizadas como bandas
coradas distintas, ou são ofuscadas por proteínas de concentra-
ções maiores que migram próximas a elas (p. ex., C p mascarada
por H p e A M G ) . A l é m disso, algumas proteínas coram m u i t o
pouco porque contêm proporções elevadas de lipídios (lipopro-
teínas) ou carboidratos. A densitometria é utilizada para a quan-
tificação grosseira de bandas individuais e para a representação
gráfica de padrões eletroforéticos corados, mas é preferível a
análise visual por u m observador treinado.
Corantes especiais para lipídios são necessários para visualizar
lipoproteínas que migram em bandas de mobilidade variável da
região a [ rápida (a.]-lipopToteína), da região ot2 ou pré-p (lipoproteínas
de densidade muito baixa) e da região p! (p-lipoproteína), ou que
permanecem na origem (quilomícrons; ver também Capítulo 23).
Como mencionado anteriormente, a visualização da ai-glicoproteína
ácida requer corante para as cadeias laterais de carboidrato.
Imunofixação
A imunofixação (IFE) está gradativamente substituindo a imuno-
eletroforese (IEP) para a detecção de paraproteínas ou de compo-
nentes M por causa de sua velocidade e facilidade de interpreta-
ção. Embora esses dois procedimentos d i f i r a m em alguns deta-
lhes, seus princípios são similares.
Nas gamopatias monoclonais, os padrões de IFE geralmente
produzem uma banda de precipitina claramente definida e dis-
tinta com anti-soro contra uma cadeia pesada e uma cadeia leve.
Essas bandas são compatíveis com a localização da imunoglobu-
lina específica do padrão de referência (Figura 18-8). U m a segunda
banda, mais fraca, de cadeias leves livres também pode estar
presente.
Os padrões de IFE devem ser sempre confirmados pela quan-
tificação das imunoglobulinas (IgG, IgA, IgM) na amostra. Eleva-
ções de imunoglobulinas específicas devem corresponder a bandas
coradas mais intensamente com relação ao padrão de IFE, mas se
uma proteína monoclonal está presente, o resultado da análise
pode ser apenas uma aproximação por causa do antígeno em
excesso. As imunoglobulinas não afetadas freqüentemente são de
concentração muito baixa. Para determinar as diluições apropria-
das da amostra a serem usadas para as diversas imunoglobulinas,
é ú t i l fazer a quantificação antes de se realizar a IFE.
Separação Eletroforética de Proteínas Urinárias
O procedimento de eletroforese da urina em gel de agarose ou
acetato de celulose é idêntico ao do soro, exceto pelo faro de a
urina dever ser concentrada a aproximadamente 3 g / d L de pro-
teína antes da aplicação, a menos que métodos de coloração mais
sensíveis sejam utilizados (p. ex., colorações com ouro e / o u
prata). A eletroforese da urina é comumente usada para detectar
a presença de cadeias leves de imunoglobulina (proteína de Bence
Jones) ou outras proteínas de massa molecular baixa, típicas da
proteinúria tubular. Comparação entre uma separação de urina
e uma separação correspondente do soro também pode indicar
o grau de seletividade da proteinúria glomerular. U m ponto
importante pata lembrar é que a urina normal pode conter
"degraus" de cadeia leve, o que pode se confundir com a proteína
de Bence Jones.
Separação Eletroforética de Proteínas do Líquido
Cerebrospinal
C o m concentração suficiente de CSF, é possível utilizar os
mesmos procedimentos eletroforéticos usados para o soro, mas
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 321
técnicas de alta resolução são fortemente recomendadas. O uso
de coloração com prata e / o u IFE aumenta a sensibilidade e
permite a análise de CSF não-concentrado. A l é m disso, com IFE,
as bandas de IgG são identificadas com certeza. A Figura 18-9
ilustra u m padrão de eletroforese e subseqüente IFE, demons-
trando a presença de bandas oligoclonais.
Quantificação de Proteína Total em Líquidos
Corpóreos
Diversos métodos químicos e instrumentais são usados para
medir o conteúdo de proteína total em fluidos biológicos, tais
como soro, urina e CSF. C o m esses métodos, as seguintes hipó-
teses são feitas:
1. Todas as moléculas de proteína são cadeias polipeptídicas
puras, contendo em média 16% por peso de nitrogênio.
2. Cada uma das centenas de proteínas individuais reage quimi-
camente como qualquer outra proteína.
Claramente a primeira hipótese não é verdadeira, e a segunda
nem sempre é verdadeira. N o entanto, essas hipóteses simplifica-
doras tornam a medida da proteína total u m procedimento
prático, ainda que empírico.
Medida de Proteína Total em Amostras de Soro
Os métodos específicos usados para medir o conteúdo de proteína
total de amostras de soro incluem os métodos (1) do biureto, (2)
fotométricos diretos, (3) de ligação com corante, (4) de Folin-
Ciocalteu (Lowry), (5) de Kjeldahl, (6) refratométricos, (7) turbi-
dimétricos e (8) nefelométricos. Diferentes materiais são usados
para calibrar esses métodos.
Método do Biureto
O método do biureto depende da presença de ligações peptídicas
em todas as proteínas. Essas ligações peptídicas reagem com íons
C u ' " em soluções alcalinas, formando u m p r o d u t o colorido, cuja
absorvância é medida espectrofotometricamente a 540 n m . O
Teagente biureto contém tartarato de sódio e potássio para formar
u m complexo com íons cúpricos e manter sua solubilidade em
solução alcalina. O iodo é incluído como antioxidante. A inten-
sidade da COT produzida é proporcional ao número de ligações
peptídicas que estão reagindo e, portanto, à quantidade de pro-
teína presente no sistema reacional. Aminoácidos e dipeptídios
não reagem, mas tripeptídios, oligopeptídios e polipeptídios
reagem e produzem produtos de cor rosa a violeta averme-
lhado.
A maioria dos métodos do biureto detecta entre 1 e 15 mg de
proteína na alíquota analisada, uma quantidade presente em 15 a
200 p L de u m soro contendo proteínas a 7 j ^ d L . Inúmeras versões
do método do biureto têm sido desenvolvidas e empregadas.
Soro ou plasma podem ser usados em u m teste do biureto, mas
prefere-se soro. U m a amostra em jejum não é necessária, mas pode
ser desejável para d i m i n u i r o risco de lipemia. Amostras hemolisa-
das não devem ser analisadas. As amostras bem fechadas de soro
são estáveis, por uma semana ou mais, à temperatura ambiente, e
por u m mês a 2°C a 4°C. Amostras que foram congeladas e des-
congeladas devem ser bem misturadas antes da análise.
Métodos Fotométricos Diretos
A absorção de luz U V em 200 a 225 n m e 270 a 290 n m tem
sido u s a d a para medir o conteúdo proteico de amostras biológi-
cas. A absorção de luz U V a 280 n m depende, principalmente,
dos anéis aromáticos de tirosina e triptofano em p H 8. Acurácia
e especificidade são prejudicadas por uma distribuição irregular
desses aminoácidos entre as diferentes proteínas em uma mistura
e da presença, nos líquidos corpóreos, de tirosina e triptofano
322 PARTE IV Analitos

A © C ©
&

Mi

•0
• » m • m m

SPE IgO IgA IgM 3K IgO IgA IgM

B © D ©
S s ç 8 9 s c

()

IgO IgA IgM lg IgO IgA IgM

Figura 18-8 C o m p a r a ç ã o entre i m u n o f i x a ç ã o (I FE) e i m u ri o eletroforese (IEP) de dois pacientes c o m

gamopatias m o n o c l o n a i s . A , A m o s t r a de paciente c o m u m a p r o t e i n a m o n o c l o n a l I g G (kappa, K) c o n f o r m e
i d e n t i f i c a d o p o r I F E . A seta i n d i c a a posição da p r o t e í n a m o n o c l o n a l . A p ó s a eletroforese, cada trajetória, exceto
SPE, reage c o m seu anti-soro respectivo e, então, todas as pistas são coradas para visualização das bandas das
respectivas proteínas. (SPE: eletroforese de proteínas séricas q u i m i c a m e n t e predeterminadas; I g G , I g A , I g M , K e
A i n d i c a m o anti-soro u t i l i z a d o e m cada Trajetória.) B , M e s m a amostra de A , com.as proteínas identificadas p o r
IEP. A seta i n d i c a a posição da p r o t e i n a m o n o c l o n a l . Os soros d o c o n t r o l e n o r m a l (C) e d o paciente (S) estão
alternados. A p ó s a eletroforese, o anti-soro é a d i c i o n a d o a cada canal c o n f o r m e i n d i c a d o pelas etiquetas de I g
(anti-soro I g polivalente), I g G , I g A , I g M , k e A. Os anti-soros reagem c o m as proteínas separadas nas amostras,
f o r m a n d o p r e c i p i t a d o s na f o r m a de arcos. Os arcos de I g G e K são mais curtos e densos do que os d o c o n t r o l e
n o r m a l , m o s t r a n d o a presença da p r o t e í n a m o n o c l o n a l I g G (K). AS concentrações de I g A , I g M e cadeias leves A
são t a m b é m reduzidas. C, A m o s t r a de paciente c o m u m a p r o t e í n a m o n o c l o n a l I g A (lambda, A.) i d e n t i f i c a d a pela
técnica IFE, c o n f o r m e descrito em A . D , A mesma amostra de C , c o m proteínas identificadas p o r IEP, c o m o
descnto e m B. Os arcos de I g A e A a n o r m a i s da amostra d o paciente i n d i c a m u m a concentração elevada de u m a
p r o t e í n a m o n o c l o n a l I g A (A). Todas as separações f o r a m realizadas u s a n d o o sistema B e c k m a n C o u k e r Paragori.

livres, ácido úrico e bilirrubina, que cambém absorvem luz
próximo a 280 n m . As ligações peptídicas são responsáveis, prin-
cipalmente, pela absorção de U V (70% a A205); absorção especí-
fica por proteína em 200 a 225 n m é 10 a 30 vezes maior do que
em 280 n m . A interferência de tirosina e triptofano livres é sig-
nificativa nesses comprimentos de onda curtos. Entretanto, uma
diluição 1:1.000 ou 1:2.000 do soro com NaCl, 0,15 m o l / L ,
permite escapar dessa interferência. O método tem sido usado
para CSF após remoção de moléculas interferentes pequenas por
filtração em gel.
Métodos de Ligação ao Corante
Os métodos de ligação ao corante são baseados na capacidade de
as proteínas se ligarem a corantes, tais como A m i d o black 10B e
C B B . As afinidades e capacidades de ligação desiguais das proteí-
nas pelos corantes são uma limitação de todas essas aplicações
que são ainda mais complicadas pela incapacidade de se definir
u m material consistente para uso como calibrador. O método de
ligação ao corante de maior interesse atual, em particular para
análise de proteína total em CSF e urina, usa CBB G-250. C B B
se liga a grupos amina protonados de resíduos de aminoácidos

A B C D
Figura 18-9 Padrões elecroforéticos d o l i q u i d o c e r e b r o s p i n a l (CSF)
corados c o m Paragon violeta após pré-concentração em centrífuga. A , C S F
4 0 vezes c o n c e n t r a d o . B , Soro coletado 6 horas após a coleta de CSF. C,
I m u n o f i x a ç ã o da i m u n o g l o b u l i n a G (IgG) d o c o n c e n t r a d o de C S F p u r o .
D , I m u n o f i x a ç ã o de LgG de u m a d i l u i ç ã o 1:3 d o c o n c e n t r a d o de C S F .
da cadeia pohpeptídica, e o m á x i m o de absorvância das espécies
ligadas do corante d i m i n u i a 465 n m e aumenta a 5 9 5 n m . O
método é simples, rápido e linear até 150 m g / d L .
Método de Folin-Ciocalteu (Lowry)
A maioria das proteínas contém tirosina ou triptofano, o u ambos,
mas cada proteína contém u m a proporção única deles. A albu-
mina, por exemplo, t e m apenas 0 , 2 % de triptofano por peso,
enquanto o conteúdo de t r i p t o f a n o de globulinas varia entre 2 %
e 3%. Esses aminoácidos, livres o u em cadeia polipeptidica dese-
novelada, reduzem o ácido fosfotúngstico-fosfomolíbdico (rea-
gente de Folin-Ciocalteu) e produzem u m a cor azul. Essa proprie-
dade é mais ú t i l para o teste de u m a proteína pura c o m compo-
sição e reatividade relativa conhecidas (p. ex., fibrinogênio) do
que para o teste de uma mistura de proteínas com concentrações
e reatividades diferentes.
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 323
Método Kjeldahl
N o método Kjeldahl, a amostra é primeiramente digerida com
ácido para converter o n i t r o g ê n i o da proteína em íon a m ó n i o . A
concentração de nitrogênio da amónia é, então, avaliada por
titulação ou nesslerização, é feita uma correção do nitrogênio
o r i u n d o de compostos não-protéicos t a m b é m presentes no soroj
e o valor do nitrogênio da a m ó n i a é m u l t i p l i c a d o por u m fator
cie 6,25 ( 1 0 0 % / 1 6 % ) para expressar o nitrogênio proteico como
proteína total. O método é caracterizado e reprodutível, mas
demorado, inconveniente e impraticável para o uso de rotina. A
determinação pelo método K j e l d a h l , no entanto, ainda perma-
nece como u m meio pelo qual se caracterizam-se e validam-se
materiais de referência para uso com o teste do biureto.
Refratometria
A refratometria é u m a alternativa rápida para a análise química
de proteína total do soro q u a n d o uma rápida estimativa é solici-
tada. Alguns laboratórios consideram-na uma maneira conve-
niente de determinar o conteúdo de proteína total antes que o
SPE seja realizado. E m concentrações de proteína inferiores a 3,5
g / d L , os resultados refratométricos provavelmente são impreci-
sos. E m uma concentração m a i o r que 11,0 g / d L , obtém-se u m
resultado válido pela diluição do soro com partes iguais de água,
seguido da leitura da amostra diluída. U m coeficiente de variação
( C V ) de rotina menor que 2,0% é uma previsão aceitável.
Métodos Turbidimétricos e Nefelométricos
A precipitação de proteína para os ensaios turbidimétricos o u
nefelométricos é alcançada com o ácido sulfossalicílico sozinho,
c o m ácido sulfossalicílio em combinação com sulfato de sódio,
o u ácido tricloroacético ( T C A ) , o u c o m o T C A sozinho. Os
métodos de precipitação para o ensaio de proteína total depen-
d e m da formação de u m b o m precipitado de partículas protéi-
cas insolúveis, u n i f o r m e s , que espalham a luz incidente em
suspensão.
Calibração de Métodos de Proteína Total
A albumina bovina o u h u m a n a é usada rotineiramente para
calibrar os métodos do biureto. A albumina é disponível e m alta
pureza, contém apenas aminoácidos, seu conteúdo de nitrogênio
é uma fração constante de sua massa molecular, e o n ú m e r o de
ligações peptídicas por molécula é conhecido.
A calibração dos métodos de precipitação e de ligação ao
corante geralmente é realizada usando-se uma diluição disponível
de u m soro, ou de uma mistura de soros, com uma razão albu-
m i n a / g l o b u l i n a normal. O soro deve ser obtido de u m o u mais
indivíduos saudáveis e analisados quanto à proteína total com
u m biureto calibrado ou o m é t o d o Kjeldahl. Para os métodos de
precipitação, as albuminas séricas bovina o u h u m a n a não devem
ser utilizadas como calibradores com ácido sulfossalicílico porque
essas proteínas puras fornecem cerca de 2,5 vezes a turbidez das
globulinas séricas; entretanto, o uso de a l b u m i n a pura é possível
como calibrador para a precipitação c o m T C A .
Intervalos de Referência
A concentração da proteína t o t a l do soro o b t i d o de u m adulto
saudável em m o v i m e n t o é de 6,3 a 8,3 g / d L , e a de u m adulto
em descanso é de 6,0 a 7,8 g / d L . Os intervalos de referência para
neonatos, crianças pequenas e adultos com mais de 60 anos são
ligeiramente menores. As duas causas gerais de uma mudança na
concentração da proteína total do soro são uma alteração do
v o l u m e de água do plasma e u m a alteração na concentração de
uma o u mais proteínas específicas do mesmo. A d i m i n u i ç ã o do
v o l u m e da água do plasma (hemoconcentração) é chamada hiper-
324 PARTE IV Analitos
proteinemia relativa; concentrações de todas as proteínas plasmá-
ticas se e n c o n t r a m aumentadas em u m mesmo grau se o processo
é agudo. A hiper proteinemia é observada em casos de desidrata-
ção devido ao consumo inadequado de água o u perda excessiva
desta, tais como nos casos graves de v ô m i t o e diarréia, na doença
de A d d i s o n , ou na acidose diabética. A hemodiluição (aumento
do volume de água do plasma) se reflete como h i p o p r o t e i n e m i a
relativa: novamente, as concentrações de todas as proteínas plas-
máticas individuais d i m i n u e m em u m mesmo grau se a perda é
aguda. A hemodiluição ocorre c o m as síndromes de intoxicação
p o i água ou de retenção de sal, durante infusões intravenosas
grandes, e fisiologicamente q u a n d o u m i n d i v í d u o assume uma
posição reclinada.
Determinação de Proteína Total na Urina
M u i t o s métodos têm sido usados para m e d i r proteínas urinárias.
0 m é t o d o do b i u r e t o aplicado à proteína precipitada c o m ácido
ou a u m concentrado o b t i d o p o r filtração em m e m b r a n a t e m a
vantagem de ser igualmente sensível para cada uma das proteínas
da mistura. M u i t o s laboratórios, entretanto, acham essa aborda-
gem m u i t o demorada para o uso de r o t i n a e preferem os métodos
t u r b i d i m é t r i c o s e de ligação a corante porque são rápidos e
simples. Dos métodos de ligação a corante, o vermelho de piro-
galol, Ponceau S e C B B são os mais utilizados. Os métodos
t u r b i d i m é t r i c o s e de ligação a corante têm cuivas de calibração
não-lineares e reagem diferentemente com as proteínas. A maio-
ria subestima as proteínas de massa molecular baixa, na protei-
n ú r i a tubular, e as cadeias leves de i m u n o g l o b u l i n a , na protei-
núria de sobrecarga.
Para quantificar as proteínas urinárias, geralmente se usa
u m a coleta por u m período de tempo. Os períodos de cólera de
4, 8 e 12 horas t ê m sido usados para m o n i t o r a r os transplanta-
dos renais o u u m paciente cujas perdas renais agudas de albu-
m i n a estejam sendo compensadas c o m tratamento de reposição
b e m controlado. N a maioria dos casos, no entanto, escolhe-se
u m tempo de coleta de 24 horas, tanto para o ensaio quantita-
tivo de proteína específica o u total, quanto para a separação
eletroforética. U m a abordagem alternativa é m e d i r as razões
p r o t e í n a / c r e a t i n i n a de amostras aleatórias.
Os testes em tira de papel freqüentemente são usados para
m e d i r semiquantitativamente a proteína em excesso na urina.
C o m esses testes, a porção reativa do papel é coberta c o m u m
indicador t a m p o n a d o que desenvolve a cor em presença de
proteína. Os limites de detecção são de aproximadamente
7 m g / d L C o m o todas as técnicas de ligação a corante, os métodos
de tira de papel são mais sensíveis à a l b u m i n a do que a outras
proteínas plasmáticas. Eles são, p o r t a n t o , testes de rastreamento
excelentes para a proteinúria glomerular, mas insatisfatórios para
a detecção de p r o t e i n ú r i a tubular o u de sobrecarga. E m b o r a a
maioria dos testes meça proteína em excesso de 10 m g / d L , os
testes são apenas semiquantitativos e seu uso deve ser l i m i t a d o
ao rastreamento e a estimativas aproximadas requeridas antes
que a amostra seja concentrada para a eletroforese ou d i l u í d a
para o ensaio quantitativo. U m a amostra da p r i m e i r a u r i n a do
dia é preferível porque ela tende a ser concentrada e não afetada
pelos fatores posturais.
O intervalo de referência para a proteína total u r i n á r i a é de
1 a 14 m g / d L . A taxa de excreção em descanso é de 5 0 a 80
m g / d i a , mas m u i t o s laboratórios i n d i c a m o valor de referência
como m e n o r que 100 m g / d i a (< 150 m g / d i a na gravidez). A
concentração p o d e atingir 300 m g / d L na u r i n a de i n d i v í d u o s
saudáveis após exercício.
Determinação de Proteína Total no Líquido
Cerebrospinal
As baixas concentrações de proteína n o CSF l i m i t a m os métodos
que são usados para m e d i r seu conteúdo de proteína total. Os
métodos turbidimétricos e as versões dos métodos de ligação ao
corance C B B são comumenre usados para esse f i m . A desvanta-
gem mais grave dos métodos t u r b i d i m é t r i c o s é a necessidade de
0,2 a 0,5 m L de amostra. Os métodos do C B B são sensíveis o
bastante para uso com amostras tão pequenas quanto 25 p.L, mas
eles subestimam as globulinas. C o m o a a l b u m i n a é a proteína
predominante do CSF, essa sub estimativa pode não ser grave o
bastante para i m p e d i r o uso de u m m é t o d o do C B B .
Determinação de Proteínas Específicas no Líquido
Cerebrospinal
A a l b u m i n a e a IgG são medidas n o CSF utilizando-se (1) nefelo-
metria, (2) i m u n o t u r b i d i m e t r i a , (3) eletroimunodifusão e (4) R I D .
A ausência aparente de I g G pode ser ocasionada por sua degra-
dação por protemases na amostra. O radioimunoensaio (RIA) ou
outros métodos altamente sensíveis são necessários para determi-
nar proteínas específicas presentes em concentrações muitos
baixas (p. ex., IgM). O intervalo de referência para concentrações
de albumina n o CSF lombar pelo R I D é de 17,7 a 25,1 m g / d L .
Cada u m a das IgA, I g D e I g M , medidas por R I A , n o r m a l m e n t e
é menor que 0,2 m g / d L . Os intervalos de referência para I g G são
associados à idade; suas médias aumentam de 3,5 m g / d L , n o
grupo de 15 a 20 anos de idade, para 5,8, em adultos com 60
anos ou mais. O intervalo de referência usual para IgG no CSF
de adultos é de 0,8 a 4,2 m g / d L ; para a proteína total é de 15 a
45 m g / d L . As concentrações de proteína total são consideravel-
mente maiores em neonatos e, em adultos idosos saudáveis, con-
centrações até 60 m g / d L são consideradas normais.
Espectrometria de Massa
A M S é usada para avaliar a massa molecular e a seqüência pri-
mária de aminoácidos de peptídios e proteínas. Os avanços téc-
nicos da M S resultaram n o desenvolvimento de técnicas de ioni-
zação por dessorção a laser assistida por matriz ( M A L D 1 ) , e ioni-
zação por eletrospray (ES), que p e r m i t e m o seqüenciamento e a
determinação de massa de quantidades na o r d e m de p i c o m o l de
proteínas c o m massas maiores que 100 k D a (Capítulo 8). U m
espectrômetro de massa por t e m p o de vôo é usado para detectar
pequenas quantidades de íons que são produzidos pelo M A L D I .
Nesse tipo de espectrômetro, os íons são acelerados em u m
campo elétrico e movimentam-se em direção a u m detector. A
massa do íon é calculada a p a r t i r do tempo que ele leva para
atingir o detector. Para medir as massas das proteínas em uma
mistura, uma quantidade pequena de amostra (0,5 a 2,0 fiL) é
seca na extremidade da sonda, que, então, é introduzida n o
espectrômetro para análise. C o m essa técnica, as proteínas loca-
lizadas nas superfícies das células são ionizadas e analisadas sele-
tivamente.
C o m a ionização ES, uma névoa fina de partículas altamente
carregadas é produzida q u a n d o u m l í q u i d o f l u i de u m tubo
capilar para dentro de u m forte campo elétrico (3 a 6 IcV). N a
prática, as fontes de ionização ES freqüentemente são acopladas
diretamente a H P L C de fase reversa o u colunas de capilaridade.
A possibilidade de se acoplar u m cromatógrafo l í q u i d o com uma
fonte de ionização ES e u m espectrômetro de massa permite a
remoção em tempo real de sais e contaminantes e a análise de
misturas complexas. E m b o r a seja diferente de M A L D I , ES apre-
senta sensibilidade e aplicação similares para a análise de proteí-
nas grandes.

M S - M S é u m t i p o de M S aplicável ao s e q ü e n c i a m e n t o r á p i d o
de peptídios c o n t i d o s e m u m a mistura biológica complexa. E m u m
e s p e c r r ô m e t r o d e massa s e q ü e n c i a l , d o i s o u m a i s a n a l i s a d o r e s d e
m a s s a são c o n e c t a d o s e m s e q ü ê n c i a . N o p r i m e i r o analisador, o
c o m p o s t o - a l v o é s e l e t i v a m e n t e i o n i z a d o e seus í o n s c a r a c t e r í s t i c o s
são s e p a r a d o s d o s o u t r o s p r e s e n t e s n a m i s t u r a . O s í o n s p r i m á r i o s
s e l e c i o n a d o s c o l i d e m , e n t ã o , c o m m o l é c u l a s d e u m gás n e u t r o p a r a
p r o d u z i r f r a g m e n t o s q u e são s e p a r a d o s e i d e n t i f i c a d o s n o s e g u n d o
e s p e c t r ô m e t r o . O uso de dois espectrómetros de massa e m seqüên-
cia p e r m i t e a análise seletiva e especifica de m u i t o s c o m p o s t o s de
d i v e r s a s classes e s t r u t u r a i s . A n e c e s s i d a d e d e u m a e t a p a c r o m a t o -
gráfica é e l i m i n a d a p o r q u e a separação e a análise o c o r r e m s i m u l -
taneamente no e s p e c t r ô m e t r o de massa s e q ü e n c i a l . C o m p a r a d o
c o m os m é t o d o s m a i s a n t i g o s , M S - M S oferece m a i o r s e n s i b i l i d a d e
analítica, acurácia, rapidez e a possibilidade de analisar p e p t í d i o s
que contêm u m N-terminal bloqueado.
REFERÊNCIAS
1. Chrístenson RH, Azzazy ME. Amino acids. In: Burtis CA, Ashwaad ER, eds,
Tietz lextbook of clinicai chemistry, 3rd ed. Philadejphia: WB Saunders,
1999:444-76.
2. Cynober LA, ed. Amino acid metabolism in health and nutritional disease.
Boca Raton, Fia: CRC Press, 1995.
3. Davies JS. Amina acids, peplides, and proteins. vai 25. Baca Ratan, Fia: CRC
Press, 1994.
Aminoácidos e Proteínas CAPÍTULO 18 325
3a. Ganrot PO. Varialion of the concenlrations of some plasma proteins in
normal adults, in pregnant women and in newborns. Scand J Clin Lab Invest
1972;124:83-8.
4. GladyshevVN, Hatfield DL. Selenocysteine-containing proteins in mammals. J
Biomed Sei 1993;6:151-60.
5. Johnson AM. Amino acids, peprtides, and proteins. In: Burtis CA, Ashwood ER,
Bruns DE, eds. Tietz textbook of clinicai cbemistry and molecular diagnostics,
4th ed. Philadelphia: WB Saunders,
2005:533-96.
6. Keren DF. Higb-resolution eiectrophoresis and immunofixation: techniques
and interpretation, 2nd ed. Newton, Mass: Butterworth-Heinemann, 1994.
7. Lagrand WK, Visser CA, Hermens WT, Niessen HW, Verheugt FW.
et al. C-reactive protein as a cardiovascular risk lactar: more than an
epiphenomenon? Circulation 1999;100:96-102.
a, Miner SES, Evrovski J, Cole DEC. The clinicai chemistry and molecular
biclogy of homocysteine metabolism: an update. Clin Biochem 1997;30:189-
201.
9. Massey KA, Blakeslee CH, Pitkow HS. A review of physiolcgical and metabolic
effeets of essential amino acids. Amino Acids 1998;14:271-300.
10. Morgan BP. Complement: methods and pratocols. Totowa, NJ: Humana Press,
2000.
11. Ritchie R, ed. Serum proteins in clinicai medicine. Voi I. Labcratory section.
Scarborougb, Maine: Foundation for Blood Research, 1996.
12. Ritchie R, ed. Serum proteins in clinicai medicine. Vol II. Clinicai section.
Scarborough, Maine: Foundation for Blood Research, 1999.
13. Whicher J, Ritchie RF, Johnson AM, Baudner S, Bienvenu J, et al. New
international relerence preparation for proteins in human serum (RPPHS). Clin
Chem 1994;40:934-8.
C A P Í T U L O 1 9
Mauro Panteghini, M.D., e Renze Bais, Ph.D., A.R.C.P.A.
OBJETIVOS
1. Listar os fatores que afetam as atividades enzimáticas no sangue.
2. Relatar as ações fisiológicas, a distribuição tecidual, o significado
clínico e os métodos analíticos para as seguintes enzimas:
transaminases
creatinoquinase
lactato desidrogenase
fosfatases
y-g lutam i Itran sfe rase
5'-nucleotidase
colinesterases
amilase
lípase
tripsina
3. Listar os métodos de análise de isoenzimas e descrever os padrões
de migração das isoenzimas da creatinoquinase e da lactato
desidrogenase após a eletroforese.
4. Descrever duas enzimas clinicamente relevantes adicionais e relatar
sua significância.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
5'-Nucleotidase: Fosfatase que age somente em nucleosideos-5'-
fosfatos, tais c o m o adenosina-5'-monofosfato ( A M P ) ,
l i b e r a n d o fosfato i n o r g â n i c o .
A l f a - a m i l a s e ; E n z i m a que catalisa a endo-hidrólise das ligações
glícosídicas 1,4-alfa n o a m i d o , glicogênio e polissacarídeos
relacionados e oligossacarídeos que c o n t ê m três o u mais
u n i d a d e s de D-glicose ligadas p o r ligações 1,4-alfa.
A m i n o t r a n s f e r a s e s : Subclasse de enzimas da classe transferase
que catalisa a transferência de u m g r u p o a m i n o de u m
d o a d o r (geralmente u m a m i n o á c i d o ) para u m aceptor
(geralmente u m 2-cetoácido). A m a i o r i a dessas enzimas é de
proteínas dependentes de p i r i d o x i l fosfato. A a l a n i n a e a
aspartato aminotransferase são exemplos que t ê m u t i l i d a d e
clínica significante.
Colinesterase: E n z i m a da classe hidrolase que catalisa a
clivagem do g r u p o acil de vários ésteres de c o l i n a , inclusive
acetilcolina e alguns compostos relacionados.
C r e a t i n o q u i n a s e ( C K ) : E n z i m a d i m é r i c a que catalisa a
f o r m a ç ã o de A T P a p a r t i r de A D P e creatina fosfato n o
m ú s c u l o . T e m q u a t r o formas: C K - M M , C K - M B , C K - B B e
C K mitocondrial.
EIastase-1: Serina protease d o pâncreas. U m a
carboxiendopeptidase que catalisa a h i d r ó l i s e de elastina
nativa c o m a f i n i d a d e especial pelo g r u p o carboxila de A l a ,
Val e Leu.
" O s autores a g r a d e c i d a m e n t e r e c o n h e c e m as contribuições prévias d o Dr. D o n a l d
W Moss e d e n o s s o caro colega Dr. A . R a l p h H e n d e r s o n (falecido), n a s quais se
Laseiam partes deste c a p í m l o
Enzimas*
E n z i m a C o n v e r s o r a d e A n g i o t e n s i n a (ECA): E n z i m a q u e cliva
o decapeptídio angiotensina 1 para f o r m a r angiotensina I I
ativa.
F o s f a t a s e Á c i d a : E n z i m a da classe hidrolase q u e catalisa a
clivagem de o r t o f o s f a t o a p a r t i r de monoésteres
ortofosfóricos sob condições ácidas.
Fosfatase A l c a l i n a : E n z i m a da classe hidrolase que catalisa a
clivagem de ortofosfato a p a r t i r de monoésteres
ortofosfóricos sob condições alcalinas.
G a m a - g l u t a m i l t r a n s f e r a s e : E n z i m a q u e catalisa reversivelmente
a transferência de u m g r u p o g l u t a m i l de u m g l u t a m i l -
p e p t í d i o e u m a m i n o á c i d o para u m p e p t í d i o e u m g l u t a m i l -
aminoácido.
G l i c o s e - 6 - f o s f a t o D e s i d r o g e n a s e ( G 6 P D ) ; E n z i m a que catalisa a
p r i m e i r a etapa na via da hexose m o n o f o s f a t o , isto é, a
conversão de glicose-6-fosfato a 6-fosfogliconato, gerando
NADPH.
G l u t a m a t o D e s i d r o g e n a s e : E n z i m a m i t o c o n d r i a l q u e catalisa a
remoção do h i d r o g ê n i o d o L-glutamato para f o r m a r o
c e t o a m i n o á c i d o correspondente q u e sofre h i d r ó l i s e
espontânea a 2-oxoglurato.
I s o e n z i m a : F o r m a m o l e c u l a r que se OTigina n o nível dos genes
que c o d i f i c a m as estruturas das proteínas enzimáticas e m
questão.
I s o f o r m a : F o r m a enzimática m o l e c u l a r que f o i m o d i f i c a d a pós-
traducionalmente.
L a c t a t o D e s i d r o g e n a s e (LD): E n z i m a da classe oxidorredutase
que catalisa reversivelmente a redução de p i r u v a t o a
(L)-lactato, u s a n d o N A D H c o m o d o a d o r de elétron.
Lipase: U m a enzima que cliva h i d r o l i t i c a m e n t e u m â n i o n de
ácido graxo a p a r t i r de u m t r i g l i c e r í d e o o u f o s f o l i p í d i o .
Q u i m i o t r i p s i n a : Serina protease d o pâncreas. H i d r o l i s a
preferencialmente peptídios q u e c o n t ê m Leu, Phe, T y r o u
T r p e ligações ésteres.
T r i p s i n a : Serina endopeptidase q u e catalisa a clivagem de
ligações peptídicas na porção carboxila de A r g o u Lys.
O
i p r i n c í p i o s básicos de e n z i m o l o g i a clínica são discutidos
no C a p í t u l o 9. As enzimas i n d i v i d u a i s são discutidas
nesse capítulo. Por questões de organização, as enzimas
i n d i v i d u a i s são discutidas em relação à f u n ç ã o nos órgãos nos
quais são importantes. U m a superposição considerável, entretanto,
existe nessa classificação porque m u i t a s enzimas são usadas para a
investigação de doenças e m diversos órgãos.
CONCEITOS BÁSICOS
A seleção de q u a l enzima m e d i r n o soro c o m p r o p ó s i t o prognós-
tico o u diagnóstico depende de vários fatores. U m fator i m p o r -
tante é a d i s t r i b u i ç ã o das enzimas entre os vários tecidos, c o m o
m o s t r a d o para enzimas selecionadas na Figura 19-1. As p r i n c i p a i s
328 PARTE IV Analitos

enzimas de v a l o r c l í n i c o estabelecido, j u n t o c o m sua o r i g e m Asparia ta

aminotransferase
tecidual e as aplicações clínicas estão listadas na Tabela 19-1. 10.000
A massa de u m órgão d a n i f i c a d o o u e m m a u f u n c i o n a m e n t o ,
j u n t o c o m o gradiente célula/sangue enzimático i n f l u e n c i a o 1 oco
•AOs
resultante a u m e n t o da atividade enzimática no sangue. E n t ã o , o &
gradiente de atividade da fcsfatase ácida prostática ( A C P ) entre
100
a próstata e o sangue é de cerca de 1.000:1, e a massa d o órgão
é 2 0 g. Por outro lado, o gradiente célula/sangue da a l a n i n a
10
aminotransferase ( A L T ) na célula hepática é 10.000:1 e a massa
S GÍ°
d o figado p o d e exceder 1.000 g. M e n o s células precisam estar
1
danificadas n o fígado do q u e n a prósrara para a a n o r m a l i d a d e Tecido
ser detectada por u m a u m e n t o da enzima n o sangue. E n t r e t a n t o , Alanina
se existir u m e n v o l v i m e n t o t o t a l d o ÓTgão, então o vasto n ú m e r o aminotransferase
10.000 AO
de células hepáticas afetadas eleva as concentrações sanguíneas
de q u a l q u e r enzima hepática. Por estimativa, se somente u m a e m 2
Co

Inn
1000
cada 7 5 0 células hepáticas estiver danificada, o a u m e n t o na quan- »s
tidade de A L T n o sangue é detectável.
O dano patológico a u m tecido engloba u m grande espectro de 100
efeitos. Portanto, u m a leve e reversível inflamação virai d o fígado, i—I
tal c o m o u m ataque leve de hepatite virai, provavelmente irá aumen- 10
tar somente a permeabilidade da m e m b r a n a celular e p e r m i t i r que Soí°

enzimas cito plasmáticas vazem n o sangue. U m forte ataque que 1

Tecido
cause necrose celular t a m b é m perturba a m e m b r a n a m i t o c o n d r i a l
e as enzimas m i t o c o n d r i a i s e citoplasmáticas são detectadas n o ^ feílcP vo Creatinoquinase

sangue. Portanto, o c o n h e c i m e n t o da localização intracelular das 50.000

^ * p f
enzimas ajuda a determinar a natureza e a severidade de u m pro- 10 000
cesso patológico se enzimas adequadas f o r e m medidas no sangue.

ENZIMAS MUSCULARES 1000

As enzimas discutidas nessa categoria i n c l u e m a creatinoquinase

100
( C K ) e a lactato desidrogenase ( L D ) .

10
Creatinoquinase
A c r e a t i n o q u i n a s e ( C K ) (EC2.7.3.2; adenosina trifosfatoicrea-
1
t i n a N-fosfotransferase) é u m a enzima d i m é r i c a (82 k D a ) que Tecido
catalisa a fosforilação reversível da creatina ( C r ) pela adenosina
trifosfato (ATP). H g ura 19-1 Os gradientes de concentração entre alguns tecidos e
soro humanos para aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase
e creatinoquinase. O eixo do gradiente de concentração è logarítmico.
Fosfocreatina
(creatina fosfato)
Creatina

O H
CH3 NH O H CH3 N H
S
c— è — N - C v O
V N VH, n® y i V J W
b i t ó r i o . A enzima é r e l a t i v a m e n t e instável n o SOTO, sendo a ativi-
dade p e r d i d a c o m o resultado da oxidação do g r u p o s u l f i d r i l a d o
PH = 9. o j (|)0
sítio ativo da enzima. A atividade é parcialmente restaurada pela
+
CK, ME, incubação da preparação enzimática c o m compostos sulfidrílicos
pH = 6.7 c o m o a N-acetilcisteína, o d i t i o t r e i t o l (reagente de C l e l a n d ) e a
O o
g l u t a t i o n a . O agente de escolha a t u a l é a N-acetilcisteína.
A M P — P—O—P—Ü AMP—P—O-.0
i© |i© di ô Bioquímica
A d e n o s i n a trifosfato A d e n o s i n a difosfato
A atividade de C K é m a i o r n o tecido muscular estriado e n o
tecido cardíaco, os quais c o n t ê m cerca de 2.500 e 5 5 0 U / g de
proteína, respectivamente. O u t r o s tecidos, c o m o (1) o cérebro,
Eisiologicamente, q u a n d o o m ú s c u l o se c o n t r a i , o A T P é (2) o trato gastrointestinal e (3) a bexiga u r i n á r i a c o n t ê m signifi-
c o n v e r t i d o a adenosina difosfato ( A D P ) e a C K catalisa a refos- cativamente menos atividade e o fígado e os eritrócitos são essen-
forilação de A D P a A T P usando a creatina fosfato (CrP) c o m o cialmente desprovidos de atividade (Tabela 19-2).
reservatório da fosforilação. A C K é u m d í m e r o c o m p o s t o de duas subunidades, cada u m a
O s valores de p H ó t i m o para as reações direta ( C r + A T P —» c o m u m peso molecular de cerca de 41.000 D a . Essas subunida-
A D P + CrP) e reversa ( A D P + C r P C r + A T P ) são 9,0 e 6,7, des (B e M ) são os p r o d u t o s dos loci nos cromossomos 14 e 19,
respectivamente. O M g 2 + é u m í o n ativador o b r i g a t ó r i o que respectivamente. C o m o a f o r m a ativa da enzima é u m d í m e r o ,
f o r m a complexos c o m o A T P e o A D P . A faixa de concentração existem três diferentes pares de subunidades: B B ( o u CK-1), M B
ó t i m a para o M g 2 4 é u m p o u c o estreita e o excesso de Mg 3 *, ini- ( o u CK-2) e M M ( o u CK-3). A d i s t r i b u i ç ã o dessas isoenzimas nos
 Enzimas CAPÍTULO 19 329

TABELA 19-1 Distribuição e Aplicaçao de Enzimas Importantes Clinicamente

Enzima Fontes Principais da Enzima no Sangue Aplicações Clínicas

Alanína aminotransferase Fígado Doenças parenquimais hepáticas

Fosfatase alcalina Fígado, osso, mucosa intestinal, placenta Doenças ósseas, doenças hepatobiliares
Amílase Glândulas salivares, pâncreas Doenças pancreáticas
Aspartato aminotransferase Fígado, músculo esquelético, coração, eritrócitos Doenças parenquimais hepáticas, doenças musculares
Colinesterase Fígado Envenenamento por inseticidas organofosforados, sensibilidade ao
suxametõnio, doenças parenquimais hepáticas
Creatinoquinase Músculo esquelético, coração Doenças musculares (intarto do miocárdio)
7-Glutamil transferase Fígado Doenças hepatobiliares, marcador de abuso de álcool
Lactato desidrogenase Coração, fígado, músculo esquelético, eritrócitos, Memólise, doenças parenquimais hepáticas, marcador tumoral
plaquetas, linfonodos
Lipase Pâncreas Doenças pancreáticas
5'-Nucleotidase Fígado Doenças hepatobiliares
Tripsina Pâncreas Doenças pancreáticas
- -

TABELA 19-2 C o n c e n t r a ç õ e s A p r o x i m a d a s da A t i v i d a d e de C r e a t i n o q u i n a s e (CK) T e c i d u a l (Expressa c o m o M ú l t i p l o s das

Concentrações de Atividade de CK no Soro) e C o m p o s i ç ã o de Isoenzimas Citoplasmáticas

ISOENZIMAS, %
Atividade
Tecido Relativa de CK CK-BB CK-MB CK-MM

Músculo esquelético (tipo 1, contração lenta ou fibras vermelhas) 50.000 <1 3 97

Músculo esquelético (tipo 11, contração rápida ou fibras brancas) 50.000 <1 1 99
Coração 10.000 < 1 22 78
Cérebro 5.000 100 0 0

M ú s c u l o lisa
Trato gastrointestinal 5.000 96 1 3
Bexiga urinária 4.000 92 6 2

vários tecidos h u m a n o s é m o s t r a d a na Tabela 19-2. Todas as três
espécies de isoenzimas são encontradas n o citossol da célula.
E n t r e t a n t o , existe u m a quarta f o r m a q u e difere das outras t a n t o
i m u n o l o g i c a m e n t e q u a n t o pela m o b i l i d a d e eletrofoTética. Essa
isoenzima ( C K - M t ) está localizada entre as m e m b r a n a s externa e
i n t e r n a da m i t o c ô n d r i a e c o n s t i t u i , n o coração, por exemplo, até
1 5 % da atividade t o t a l de C K . O gene para C K - M t está localizado
n o c r o m o s s o m o 15.
A atividade de C K t a m b é m é e n c o n t r a d a na f o r m a m a c i o m o -
lecular, a chamada m a c r o - C K . A m a c r o - C K é encontrada, fre-
q ü e n t e m e n t e de f o r m a transiente, no soro até 6 % dos pacientes
hospitalizados, mas somente u m a pequena p r o p o r ç ã o destes t e m
atividade aumentada de C K n o soro. Ela existe em duas formas,
tipos 1 e 2. A t i p o 1 é u m c o m p l e x o de C K , em geral C K - B B , e
u m a i m u n o g l o b u l i n a (Ig), f r e q ü e n t e m e n t e I g G , mas outros com-
plexos t ê m sido descritos, tais c o m o C K - M M c o m I g A . T e m sido
estimado q u e a prevalência esteja entre 0 , 8 % e 2,3%. Ela freqüen-
temente ocorre e m mulheres c o m mais de 5 0 anos. A t i p o 2 é
C K - M t oligomérica, c o m u m a prevalência descrita entre 0 , 5 % e
2 , 6 % . E encontrada p r e d o m i n a n t e m e n t e e m adultos q u e estão
gravemente doentes c o m malignidades o u doença hepática o u
em crianças que t e n h a m tecido c o m d a n o notável. O apareci-
m e n t o dessa enzima n o soro está n o r m a l m e n t e associado a u m
prognóstico r u i m . A m a c r o - C K interfere na dosagem de C K - M B
p o r métodos de i m u n o i n i b i ç ã o .
T a n t o a s u b u n i d a d e M q u a n t o a B t ê m u m resíduo de lisina
t e r m i n a l , mas somente a p r i m e i r a é h i d r o l i s a d a pela ação de
carboxipeptidases n o r m a l m e n t e presentes n o sangue. As carboxi-
peptidases B { E C 3.4.17.2) o u N ( a r g i n i n a carboxipeptidasej E C
3.417.3) h i d r o l i s a m seqüencialmente os resíduos de lisina da
C K - M M para p r o d u z i r duas i s o f o r m a s de C K - M M — C K - M M 2
( u m residuo de lisina r e m o v i d o ) e C K - M M ] (os dois resíduos de
lisina removidos). A perda de lisina carregada positivamente
p r o d u z u m a m o l é c u l a de C K mais negativamente carregada c o m
m a i o r m o b i l i d a d e para o â n o d o na eletroforese. C o m o C K - M B
tem somente u m a s u b u n i d a d e M , o d í m e r o c o d i f i c a d o pelos
genes M e B é d e n o m i n a d o C K - M B 2 e o d í m e r o c o m a lisina
hidrolisada, C K - M B i .
Significado Clínico
A atividade sérica de C K está m u i t o elevada em todos os tipos
de distrofia muscular. N a distrofia m u s c u l a r progressiva (particu-
l a r m e n t e a d i s t r o f i a muscular de D u c h e n n e ligada ao sexo), a
atividade enzimática n o soro é mais alta na p r i m e i r a infância e
na i n f â n c i a (7 a 10 anos de idade) e p o d e c o n t i n u a r a u m e n t a d a
antes que a doença seja c l i n i c a m e n t e aparente. A atividade sérica
de C K cai caracteristicamente à m e d i d a q u e os pacientes se
t o r n a m mais velhos e a massa muscular f u n c i o n a l d i m i n u i c o m
a progressão da doença. CeTca de 5 0 % a 8 0 % das m u l h e r e s
assintomáticas p o r t a d o r a s de d i s t r o f i a de D u c h e n n e m o s t r a m
a u m e n t o s de três a seis vezes da a t i v i d a d e de C K . Valores u m
p o u c o altos de C K são n o t a d o s na m i o s i t e v i r a i , na p o l i m i o s i t e
e nas doenças musculares similares. E n t r e t a n t o , nas doenças
musculares neurogênicas, tais c o m o (1) m i a s t e n i a grave, (2)
esclerose m ú l t i p l a j (3) p o l i o m i e l i t e e (4) p a r k i n s o n i s m o , a ativi-
dade sérica da e n z i m a é n o r m a l . A a t i v i d a d e m u i t o alta é
t a m b é m e n c o n t r a d a na h i p e r t e r m i a m a l i g n a , u m a d o e n ç a f a m i -
liar caracterizada p o r febre alta e ocasionada pela a d m i n i s t r a ç ã o
330 PARTE IV Analitos
de anestesia p o r inalação ( h a b i t u a l m e n t e h a l o t a n o ) ao indiví-
d u o afetado.
Exercício e trauma muscular irão aumentar a C K sérica. Por
exemplo, o exercício sustentado, como em corredores de longa
distância b e m treinados, aumenta o conteúdo de C K - M B do
músculo esquelético devido ao fenômeno de "reversão fetal", n o
qual os padrões fetais de síntese protéica reaparecem. Portanto,
a isoenzima C K - M B sérica pode aumentar em tais circunstâncias.
Essa explicação pode ser usada também para os valores de CK-
M B elevados algumas vezes observados na falência renal crônica
(miopatia urêmica).
Na rabdomiólise aguda com destruição muscular grave, as
atividades séricas de C K excedendo 200 vezes o limite de referên-
cia superior p o d e m ser encontradas. As atividades séricas de C K
também são aumentadas por outros traumas musculares diretos,
inclusive injeções intramusculares e intervenções cirúrgicas.
Finalmente, várias drogas em doses farmacológicas aumentarão
as atividades séricas de C K .
As variações na C K sérica e sua isoenzima M B após o infarto
do miocárdio serão discutidas no C a p í t u l o 33. Outras condições
cardíacas t a m b é m t ê m sido descritas como capazes de aumentar
a C K sérica e a C K - M B no soro, tais como (1) cirurgia de íryfms
da artéria coronária, (2) transplante cardíaco, (3) miocardite e (4)
embolia p u l m o n a r . Para o diagnóstico de i n f a r t o agudo do mio-
cárdio, agora é vantajoso usar testes cardíacos não-enzimáticos
específicos, tais como a t r o p o n i n a cardíaca I ou T.
A atividade sérica de C K demonstra uma relação inversa com
a atividade tireoidiana. Cerca de 6 0 % dos indivíduos hipotireói-
deos mostram u m a elevação média da atividade de C K cinco vezes
maior do que o l i m i t e de referência superior. A p r i n c i p a l isoen-
zima presente é a C K - M M , sugerindo envolvimento muscular.
D u r a n t e o parto n o r m a l há u m a elevação de seis vezes na
atividade sérica de C K materna total. A intervenção cirúrgica
durante o trabalho de parto aumenta ainda mais a atividade de
C K no soro. C K - B B pode estar elevada em neonatos, particular-
mente em recém-nascidos com danos cerebrais ou c o m peso
m u i t o baixo ao nascimento. A presença de CK-BB n o sangue,
habitualmente em baixas concentrações, pode, entretanto, repre-
sentar u m achado n o r m a l nos primeiros dias de vida.
Métodos de Análise para Atividade e Conteúdo de
Isoenzimas
A atividade de C K e o conteúdo de isoenzima são medidos no
laboratório.
Dosagem da Atividade de CK
Inúmeros métodos (1) fotométricos, (2) f l ú o r i m é t r i c o s e (3)
enzimas acopladas têm sido desenvolvidos para o ensaio da ativi-
dade de C K , usando tanto a reação direta (Cr —» CrP) quanto a
reversa (Cr <— CrP). Analiticamente, a reação reversa é preferida
porque ela procede cerca de seis vezes mais rápido do que a reação
direta.
CK
Creatioa fosfato + ADP * creatma + ATP
p H 6,7
HK
ATP + glicose c'licose-6-fosfato + ADP
© GÓPD
gli cos e-6-fos fato + NADP 6-tosíogliconato + NADPH
A C K catalisa a conversão de C r P a C r c o m a fosforilação
concomitante de A D P a ATP. O A T P produzido é dosado pelas
reações acopladas de hexoquinase (HK)/glicose-6-fosfato desidro-
genase ( G 6 P D ) que, enfim, convertem N A D P a N A D P H , o qual
é m o n i t o r a d o espectrofotometricamente. Szasz e colegas otimiza-
r a m o ensaio pela adição de N-acetilcisteína para ativar C K ,
E D T A para ligar Ca 2 " e aumentar a estabilidade da mistura de
reação, e adenosina pentafosfato (Ap 5 A) além de A M P para i n i b i r
adenilato quinase (AK). U m m é t o d o de referencia baseado nessa
experiência prévia foi desenvolvido pela I n t e r n a t i o n a l Federation
o f C l i n i c a i Chemistry a n d Laboratory M e d i c i n e ( I F C C ) ; ele f o i
m o d i f i c a d o para produzir u m procedimento de referência para a
dosagem de C K a 37 °C. 7
A atividade de C K no soro é relativamente instável e é rapi-
damente perdida durante o armazenamento. As estabilidades
médias são menores do que 8 horas à temperatura ambiente, 48
horas a 4 °C e 1 mês a - 2 0 °C. Portanto, a amostra de soro deve
ser armazenada a 4 ° C se o soro não for analisado imediatamente.
U m leve grau de hemólise é tolerado porque os eritrócitos não
contêm atividade de C K . Entretanto, amostras severamente
hemolisadas são insatisfatórias porque as enzimas e os interme-
diários ( A K , A T P e G 6 P D ) liberados dos eritrócitos p o d e m afetar
a fase de retardamento e o lado das reações no sistema de
ensaio.
A atividade sérica de C K está sujeita a muitas variações fisio-
lógicas, i n c l u i n d o (1) sexo, (2) idade, (3) massa muscular, (4)
atividade física e (5) raça. Por exemplo, homens têm valores mais
altos que as mulheres, e os negros têm valores mais baixos que
os não-negros. E m indivíduos caucasianos, o intervalo de referên-
cia é de 46 a 171 U / L para homens e de 34 a 145 U / L para
mulheres quando dosado c o m u m ensaio confiável ao procedi-
m e n t o de referência da I F C C a 37 °C.
Dosagem das Isoenzimas de CK
Os métodos eletroforéticos são úteis para a separação de todo o
padrão de isoenzimas de C K . As bandas de isoenzimas são visu-
alizadas pela incubação do suporte com uma mistura de ensaio
de C K concentrada usando a reação reversa. O N A D P H f o r m a d o
nessa reação é então detectado pela observação da fluorescência
branca azulada após excitação pela luz ultravioleta (360 nm). O
N A D P H pode ser quantificado pela densitometria por fluores-
cência, a qual é capaz de detectar bandas de 2 a 5 U / L . Exemplos
típicos de resultados obtidos por essa técnica com uma amostra
de soro de u m adulto saudável e para u m paciente que havia
sofrido u m infarto ! do m i o c á r d i o 24 horas antes são mostrados
na Figura 19-2, A . O poder de discriminação da eletroforese
t a m b é m permite a detecção de bandas de C K anormais, muitas
das quais estão mostradas na Figuia 19-2, B.
Os métodos i m u n o q u í m i c o s são aplicáveis para a dosagem
direta de C K - M B . N a técnica de i m u n o i n i b i ç ã o , u m anti-soro
anti-subunidade C K - M é usado para i n i b i r tanto as subunidades
M da C K - M M quanto a única subunidade M de C K - M B e por-
tanto permite a determinação da atividade enzimática da subu-
nidade B de C K - M B , das subunidades B de CK-BB e de macro-
C K . Para determinar C K - M B , essa técnica assume a ausência de
CK-BB (e de outras fontes de interferência tais como macro-CK)
no soro testado, uma circunstância que não ocorre sempre. E m
razão dessa inespecificidade, a técnica de i m u n o i n i b i ç ã o tem sido
suplantada pelos ensaios de massa de C K - M B .
Diferentemente da i m u n o i n i b i ç ã o , que mede a isoenzima
C K - M B pela determinação de sua atividade catalítica, os imuno-
ensaios de massa m e d e m a concentração de proteína C K - M B .
Vários ensaios de massa, usando vários marcadores, estão agora
disponíveis comercialmente e são usados para a determinação de
C K - M B de rotina. As dosagens usam a técnica de "sanduíche",
na qual u m anticorpo reconhece especificamente somente o
dímero M B . Os ensaios de massa são mais sensíveis que os
 Enzimas C A P Í T U L O 19 331

CK-3 CK-3 QUADRO 19-1 Composições de Subunidades de Cinco

Isoenzimas de LD na Ordem Decrescente de
Suas Mobilidades para o Ânodo e m um Meio
Alcalino

LD 1 (HHHH; HJ
LD-2 (HHHM; H3M)
LD-3 (HHMM; H2M2)
LD-4 (HMMM; HM3)
LD-5 (MMMM; MJ

CK Bandas de CK
mitocondrial CK-3 CK-2 CK-1 de ocorrência Bioquímica
1 I comum A L D t e m u m peso m o l e c u l a r de 134 k D a e é composta de q u a t r o
rS
cadeias polipeptídicas de dois tipos: M ( o u A ) e H ( o u B), cada
ve +ve uma sob c o n t r o l e genético separado. A s estrututas de L D - M e
L D - H são determinadas p o r íoci nos cromossomos 11 e 12, res-
pectivamente. As composições de subunidades das cinco isoenzi-
B
t Bandas anormais mas estão listadas n o Q u a d r o 19-1 na o r d e m decrescente de suas
Macro-CK Macro-CK Albumina ou bandas normais m o b i l i d a d e s eletroforéticas e m direção ao â n o d o e m m e i o alca-
(tipo 2) (tipo 1) fluorescente que necessitam lino.
Isoformas de Isoforma de da aplicação de U m a sexta isoenzima de L D diferente, L D - X ( t a m b é m
CK-3 >CK-3 2 CK-2 >CK-2 1 técnicas de chamada de LD C ), composta de q u a t r o subunidades X (ou C),
e CK-3, separação está presente nos testes h u m a n o s pós-púberes. A sétima L D ,
especiais chamada de L D - 6 , t e m sido i d e n t i f i c a d a nos soros de pacientes
gravemente doentes.
Figura 19-2 A , Análises densitométricas da separação eletroforética
A atividade de L D está presente e m todas as células d o c o r p o
de isoenzimas de C K séricas de u m a d u k o saudável (à esquerda) e de u m
e é i n v a r i a v e l m e n t e e n c o n t r a d a apenas n o citoplasma da célula.
paciente (á direi:a) que teve u m i n f a r t o d o m i o c á r d i o 24 horas antes.
As concentrações da enzima e m vários tecidos são cerca de 5 0 0
B , Representação em diagrama das f o r m a s moleculares de C K
vezes maiores d o que aquelas encontradas n o r m a l m e n t e n o soro.
visualizadas na eletroforese.
Diferentes tecidos m o s t r a m diferentes composições de isoenzi-
mas. N o m ú s c u l o cardíaco, nos r i n s e nos eritrócitos, as isoenzi-
mas mais rápidas eletroforeticamente L D - 1 e L D - 2 p r e d o m i n a m ,
e n q u a n t o n o fígado e n o m ú s c u l o esquelético, as isoenzimas L D - 4
m é t o d o s baseados na atividade c o m u m l i m i t e de detecção para e LD-5 que m i g r a m mais para o cátodo p r e d o m i n a m — e m b o r a
C K - M B h a b i t u a l m e n t e < 1 f i g / L . O l i m i t e de referência s u p e r i o r o dano ao m ú s c u l o esquelético possa t a m b é m resultar c m padrões
para h o m e n s é 5,0 p g / L , c o m valores para as m u l h e r e s menores mais na direção d o â n o d o . As isoenzimas de m o b i l i d a d e inter-
d o que os valores para homens. 4 m e d i á r i a dão c o n t a da atividade de L D de fontes tais c o m o (1)
baço, (2) p u l m õ e s , (3) l i n f b n o d o s , (4) leucócitos e (5) plaquetas.
Lactato Desidrogeriase
A l a c t a t o d e s i d r o g e n a s e ( E C 1.1.1.27; L-lactato: N A D * oxidorre- Significado Clínico
dutase; LD) é u m a enzima de transferência de h i d r o g ê n i o que D e v i d o à sua ampla d i s t r i b u i ç ã o e m todos os tecidos, elevações
catalisa a oxidação d o L-lactato a p i r u v a t o c o m a mediação de séricas de L D o c o r r e m e m várias condições clínicas — inclusive
N A D + c o m o u m aceptor de h i d r o g ê n i o . (1) i n f a r t o d o m i o c á r d i o , (2) hemólise e (3) desordens d o fígado,
dos rins, d o p u l m ã o e d o m ú s c u l o .
A hemólise, se i n s u f i c i e n t e m e n t e grave, p r o d u z u m padrão
Lactato
de isoenzimas de L D similar àquele d o i n f a r t o d o m i o c á r d i o . A s
CH 3 Desidrogenase CH3
anemias megaloblásticas, h a b i t u a l m e n t e resultantes da deficiên-
pH 8,8 a 9,8
H - A - OH
+ N A D0
u NADH
cia de f o l a t o o u v i t a m i n a B ] 2 , causam q u e b r a da célula precursora
ÀXqO
çyí
pH 7,4 a 7,a AxO° de eritrócitos n a m e d u l a óssea (eritropoiese ineficaz), r e s u l t a n d o
na liberação de grandes quantidades de isoenzimas L D - 1 e L D - 2 .
L-lactato Piruvato
Elevações marcantes da atividade t o t a l de L D n o soro — de até
50 vezes o l i m i t e de referência superior — t ê m sido observadas
nas anemias megaloblásticas. Essas elevações r e t o r n a m rapida-
C o m o i n d i c a d o , a reação é reversivel, e o e q u i l í b r i o da reação mente ao n o r m a l após t r a t a m e n t o a p r o p r i a d o .
favorece f o r t e m e n t e a redução d o p i r u v a t o a lactato (P —» L) — a As elevações na atividade de L D são observadas na doença
"reação reversa". hepática, mas essas elevações n ã o são tão grandes q u a n t o os
A especificidade da enzima se estende d o L-lactato para vários aumentos n a atividade de aminotransferase. As elevações são espe-
2-hidroxiácidos e 2-oxiácidos relacionados. A oxidação catalítica cialmente altas (10 vezes o n o r m a l ) n a hepatite tóxica c o m icterí-
d o 2 - h i d r o x i b u t i r a t o , o m a i o r h o m ó l o g o p r ó x i m o ao lactato, a cia. Valores ligeiramente mais baixos são observados n a hepatite
2 - o x o b u t i r a t o é referida c o m o u m a atividade de 2 - h i d r o x i b u t i r a t o virai e n a m o n o n u c l e o s e infecciosa, a ú l t i m a f r e q ü e n t e m e n t e asso-
desidrogenase ( H B D ) . O E D T A i n i b e a enzima talvez p o r ligar ciada a elevações de LD-3. A atividade de L D é n o r m a l o u n o
Zn 2 + ; e n t r e t a n t o , o papel ativador p o s t u l a d o para os íons zinco m á x i m o o d o b r o d o l i m i t e de referência superior na cirrose e na
não está t o t a l m e n t e estabelecido. icterícia obstrutiva. A LD-5 sérica está f r e q ü e n t e m e n t e elevada e m
332 PARTE IV Anaiitos

pacientes com doença hepática primária ou com anoxia hepática Aminotransferases

secundária à d i m i n u i ç ã o da perfusão de oxigênio.
Pacientes c o m doença maligna m o s t r a m atividade de L D
aumentada n o soro; até 7 0 % dos pacientes c o m metástases hepá-
ticas e de 2 0 % a 6 0 % dos pacientes com outras metástases não-
hepáticas têm atividade total de L D aumentada. L D - 1 notavel-
mente aumentada é observada em tumores de células germinati-
vas ( 6 0 % dos casos), tais como (1) teratoma, (2) seminoma de
testículo e (3) disgerminoma de ovário. A percentagem de pacien-
tes com L D - 1 aumentada depende do estágio da doença. Para
propósitos de m o n i t o r a m e n t o , L D é relevante em predizer a
duração e taxa de sobrevida em doença de H o d g k i n e em l i n f o m a
n ã o - H o d g k i n e n o acompanhamento d o disgerminoma.
As aminotransferases constituem u m grupo de enzimas que cata-
lisa a interconversão de aminoácidos a 2-oxiácidos pela transfe-
rência de grupos a m i n o . A aspartato aminotransferase (EC
2.6.1.1; L-aspartato-.a-cetoglutarato aminotransferase; A S T ) e a
alanina aminotransferase (EC 2.6.1.2; L-aIanina:a-cetoglutarato
aminotransferase; A L T ) são exemplos de aminotransferases de
interesse clinico.
A dupla a-c e t o glu c a r ato/L-gl u t a m a to serve como u m par
aceptor e doador de grupo a m i n o em todas as reações de trans-
ferência de amino.; a especificidade das enzimas individuais
deriva d o aminoácido em particular que serve como o o u t r o
doador de u m grupo a m i n o . Portanto, a A S T catalisa a reação:

Métodos de Análise para Atividade e Conteúdo de

Isoenzimas COO© COOc"! coo0 coo':
AST, P-5'-P I
A atividade de L D e o conteúdo de isoenzimas n o sangue são LI—C—NH2 + è—o
medidos n o laboratório. CH-, if.Hj
CHj Glfe
ÍH2 r o o 0
CH,
Dosagem da Atividade de LD
ioo0 CO<t
P
Métodos de r o t i n a para as reações direta (L —> P) e reversa (P —>
L) estão disponíveis. TJm m é t o d o de referência L —> P, otimizado L-Aspaitato a-Ceroglutaiato Oxalo acera to l,( ilnrsx^rn

para L D - 1 foi desenvolvido pela I F C C como u m procedimento

de referência a 37 °C. 8
O soro é a amostra preferida para a dosagem da atividade de A A L T catalisa a reação análoga:
L D . As amostras de plasma p o d e m estar contaminadas c o m
plaquetas, as quais c o n t ê m altas concentrações de L D . O soro
COO 9 COO° COO© coof*
deve ser separado do coágulo tão logo quanto possível após a ALT, P-5'-P
amostra ter sido obtida. O soro hemolisado não deve ser usado ! é b * k=o H—C—NTTR
p o r q u e os eritrócitos contêm 150 vezes mais atividade de L D CH2
(particularmente LD-1 e LD-2) do que o soro. As diferentes iso-
u 4H,
enzimas variam em suas sensibilidades ao frio, a - 2 0 °C. Por-
ílno e
èo<jP
tanto, as amostras de soro devem ser armazenadas à temperatura
ambiente, na qual n e n h u m a perda da atividade ocorre por pelo
L-Alaním a-Ceraglutaiato Fímvato L-Glufamato
menos 3 dias.
Os valores para a atividade de L D n o soro variam considera-
As reações são reversíveis, mas os equilíbrios das reações da
velmente, dependendo da direção da reação enzimática e do
A S T e da A L T favorecem a formação de aspartato e alanina,
método usado. O intervalo de referência para adultos, determi-
nado pelo procedimento de referência a 37 °C da I F C C é de 125 respectivamente.
O piridoxal-5'-fosfato (P-5'-P) e seu análogo amino, píridoxa-
a 220 U / L . O intervalo de referência para L D é maior em crian-
ças (180 a 360 U / L ) . mina-5'-fosfato, f u n c i o n a m como coenzimas nas reações de trans-
ferência de amino. O P-5'P está ligado à apoenzima e serve como
u m grupo prostético verdadeiro. O P-5'-P ligado à apoenzima
Dosagem das Isoenzimas de LD
aceita o grupo a m i n o do p r i m e i r o substrato, aspartato ou alanina,
A separação ele tro for ética em géis de agarose ou em membranas
para formar a enzima ligada ao P-5'-P e o p r i m e i r o p r o d u t o da
de acetato de celulose é o procedimento mais co m u mente usado
reação, oxaloacetato o u piruvato, respectivamente. A coenzima
para demonstrar as isoenzimas de L D . Após a separação das
na forma a m i n o então transfere seu grupo a m i n o para o segundo
isoenzimas por eletroforese, u m a mistura de reação é colocada
substrato, a-cetoglutarato, para formar o segundo p r o d u t o , glu-
sobre o meio de separação. O N A D H gerado sobre as zonas de
tamato. O P-5'-P é então regenerado.
L D é detectado p o r sua fluorescência, q u a n d o excitado p o r luz
Podem estar presentes n o soro tanto as apoenzimas deficien-
ultravioleta longa, ou por sua redução com u m sal tetrazólio para
tes em coenzimas quanto as holoenzimas. Portanto, a adição de
formar u m formazano colorido.
P-5VP sob condições que p e r m i t e m a recombinação com as
Usando-se u m a técnica em gel de agarose c o m quantificação
enzimas habitualmente produz u m aumento na atividade de ami-
f l u o r i m é t r i c a do N A D H gerado, os seguintes intervalos de refe-
notransferase. De acordo com o p r i n c í p i o de que todos os fatores
rência para as isoenzimas foram obtidos (expressos em porcenta-
que afetam a velocidade de reação devem ser otimizados e con-
gem d o total de L D ) : LD-1, 14% a 26%; LD-2, 2 9 % a 3 9 % ;
trolados, a I F C C recomenda a adição de P-5'-P nos métodos de
LD-3, 2 0 % a 26%; LD-4, 8 % a 16% e LD-5, 6 % a 16%.
aminotransferase para garantir que toda a atividade enzimática
ENZIMAS HEPÁTICAS seja dosada.

As enzimas nesta categoria incluem (1) alanina e (2) aspartato

aminotransferases, (3) y-glutamiltransferase ( G G T ) , (4) fosfatase
alcalina (ALP), (5) 5-núcleotidase (NTP), (6) colinesterase sérica
( C H E ) e (7) glutamato desidrogenase ( G L D ) . As aminotransferases
e a A L P são amplamente usadas. Elas têm sido chamadas há m u i t o
erroneamente, como u m grupo, "testes de função hepática".
Bioquímica
As tiansaminases estão amplamente distribuídas através d o
corpo. A A S T é encontrada p r i n c i p a l m e n t e (1) n o coração, (2)
n o fígado, (3) n o músculo esquelético e (4) n o r i m . A A L T é
encontrada principalmente n o fígado e n o r i m (Tabela 19-3). A

TABELA 19-3 Atividades de Aminotransferases em Tecidos
H u m a n o s , e m Relação ao Soro c o m o U n i d a d e
AST ALT
Coração 7.800 450
Fígado 7.100 2.850
Músculo esquelético 5.000 300
Rins 4.500 1 200
Pâncreas 1.400 130
Baço 700 80
Pulmões 500 45
Eritrócitos 15 7 do fígado, c o m a A S T n o r m a l m e n t e sendo m a i o r d o q u e a A L T ,
Soro 1 1
De /Ong ] Practical clinicai £Tvrmioto,. Lontlres: D Vau Nostrcuui Co, Lld, 1965.
A L T é exclusivamente citoplasmática; t a n t o formas m i t o c o n d r i a i s
q u a n t o citoplasmáticas de A S T são encontradas nas células- Essas
são isoenzimas geneticamente distintas c o m u m a estrutura dimé-
rica composta de duas s u b u n i d a d e s polipeptídicas idênticas de
cerca de 4 0 0 resíduos de aminoácidos. Cerca de 5 % a 1 0 % da
atividade de A S T n o soro de i n d i v í d u o s saudáveis é de o r i g e m
mitocondrial.
Significado Clínico
A doença hepática é a causa mais i m p o r t a n t e de a u m e n t o de
atividade de transaminase n o soro ( C a p í t u l o .36). N a m a i o r i a dos
tipos de doenças hepáticas, a atividade de A L T é m a i o r d o que
a de A S T . Exceções p o d e m ser vistas em (1) hepatite alcoólica,
(2) cirrose hepática e (3) neoplasia hepática. N a h e p a t i t e v i r a i e
e m outras formas de doenças hepáticas associadas c o m necrose
hepática aguda, as concentrações séricas de A S T e A L T estão
elevadas m e s m o antes que os sinais clínicos e os sintomas da
doença (tais c o m o icterícia) apareçam. A s atividades para ambas
as enzimas p o d e m alcançar valores tão altos q u a n t o 100 vezes o
l i m i t e de referência superior, e m b o r a elevações de 10 a 4 0 vezes
sejam mais f r e q ü e n t e m e n t e encontradas. Os valores dos picos de
atividade de aminotransferase o c o r r e m entre o sétimo e o 122
dia. As atividades então d i m i n u e m gradativamente, chegando às
atividades n o r m a i s pela terceira o u q u a r t a semana se a recupera-
ção é de r o t i n a . Os picos de atividade não possuem relação c o m
o prognóstico e p o d e m cair c o m a p i o r a da c o n d i ç ã o d o
paciente.
A persistência de A L T a u m e n t a d a p o r mais de 6 meses após
u m episódio de h e p a t i t e aguda é usada para diagnosticar h e p a t i t e
crônica. A m a i o r i a dos pacientes c o m h e p a t i t e crônica t e m u m
m á x i m o de A L T m e n o r do que sete vezes o valor de referência
superior. A A L T p o d e estar persistentemente n o r m a l e m 1 5 % a
5 0 % dos pacientes c o m hepatite C crônica, mas a p r o b a b i l i d a d e
de A L T c o n t i n u a m e n t e n o r m a l d i m i n u i c o m o a u m e n t o n o
n ú m e r o de dosagens. E m pacientes c o m hepatite C aguda, a A L T
deve ser dosada p e r i o d i c a m e n t e d u r a n t e os p r ó x i m o s 1 a 2 anos
para d e t e r m i n a r se sua atividade r e t o r n o u ao n o r m a l .
N a lesão hepática i n d u z i d a pelo acetaminofeno, o p i c o de
aminotransferase é m a i o r do que 85 vezes o valor de referência
superior em 9 0 % dos casos, u m v a l o r r a r a m e n t e visto na h e p a t i t e
v i r a i aguda. A l é m disso, as atividades de A S T e A L T n o r m a l -
m e n t e chegam r á p i d o a u m p i c o n o i n í c i o e caem r a p i d a m e n t e .
A l é m das hepatites v i r a i e alcoólica, a esteato-hepatite não-
alcoólica é a causa mais c o m u m de a u m e n t o s de aminotransfe-
Enzimas CAPÍTULO 19 333
rase. A s concentrações aumentadas de aminotransferase t ê m sido
observadas na colestase extra-hepática, c o m atividades t e n d e n d o
a serem maiores q u a n t o mais c r ô n i c a for a obstrução. As ativida-
des de aminotransferase observadas na cirrose v a r i a m c o m o
estado do processo c i r r ó t i c o e v a r i a m do l i m i t e de referência
superior a q u a t r o o u cinco vezes m a i o r , c o m u m a p r o p o r ç ã o
A S T / A L T m a i o r do que 1. A elevação na p r o p o r ç ã o p o d e r e f l e t i r
o grau de fibrose nesses pacientes. Isso parece ser a t r i b u í d o a u m a
redução da p r o d u ç ã o de A L T n o fígado d a n i f i c a d o .
As elevações de duas a c i n c o vezes de ambas as enzimas
o c o r r e m e m pacientes c o m c a r c i n o m a p r i m á r i o o u metastático
mas as atividades são f r e q ü e n t e m e n t e n o r m a i s nos estágios ini-
ciais da i n f i l t r a ç ã o maligna do fígado. Elevações leves o u mode-
radas das atividades de A S T e A L T t ê m sido observadas após a
administração de vários m e d i c a m e n t o s , tais c o m o (1) drogas
a n t i i n f l a m a t ó r i a s não-esteróides, (2) a n t i b i ó t i c o s , (3) drogas
antiepilépticas, (4) i n i b i d o r e s d e h i d r o x i m e t i l g l u t a r i l - c o e n z i m a A
redutase (estatuías) o u (5) opiatos. E m pacientes c o m aminotrans-
ferases aumentadas, marcadores virais negativos e h i s t ó r i a nega-
tiva de ingestão de álcool o u drogas, o p l a n e j a m e n t o deve i n c l u i r
causas menos c o m u n s de lesão hepática crônica, c o m o (1) hemo-
cromatose, (2) doença de W i l s o n , (3) hepatite a u t o - i m u n e , (4)
cirrose b i l i a r p r i m á r i a , (5) colangite esclerosante e (6) deficiência
em a r a n t i t r i p s i n a .
E m b o r a as atividades séricas de A S T e A L T se t o r n e m eleva-
das sempre que u m processo p a t o l ó g i c o afeta a integridade da
célula hepática, a A L T é a enzima mais específica para o fígado.
As elevações séricas da atividade de A L T são r a r a m e n t e observa-
das em outras condições além da doença p a r e n q u i m a l hepática.
A l é m disso, as elevações da atividade de A L T persistem p o r mais
t e m p o do q u e aquelas da atividade de A S T .
A p ó s o i n f a r t o agudo d o m i o c á r d i o , aparece n o soro a ativi-
dade a u m e n t a d a de A S T . A atividade de A S T t a m b é m está
a u m e n t a d a na distrofia m u s c u l a r progressiva e na d e r m a t o m i o -
site, alcançando concentrações de até o i t o vezes o valor de refe-
rência superior. Elas estão h a b i t u a l m e n t e d e n t r o d o i n t e r v a l o de
referência em outros tipos de doenças musculares, especialmente
naquelas de o r i g e m neurogênica. Elevações leves o u moderadas
são notadas na doença h e m o l í t i c a .
V á r i o s estudos t ê m descrito a A S T ligada a i m u n o g l o b u l i n a s ,
o u macro-AST. Os achados típicos são u m a u m e n t o persistente
da atividade sérica de A S T em u m i n d i v í d u o assintomático, c o m
a ausência de q u a l q u e r p a t o l o g i a d e m o n s t r á v e l e m órgãos ricos
e m A S T . A atividade a u m e n t a d a de A S T reflete o desapareci-
m e n t o d i m i n u í d o do c o m p l e x o a n o r m a l do plasma. A s macro-
A S T não têm relevância clínica conhecida. E n t r e t a n t o , a i d e n t i -
ficação é i m p o r t a n t e para evitar p r o c e d i m e n t o s diagnósticos
desnecessários nesses i n d i v í d u o s .
Métodos de Análise
O sistema de ensaio para a dosagem de atividade de a m i n o t r a n s -
ferase c o n t é m dois a m i n o á c i d o s e dois oxiácidos. C o m o n ã o
existe u m m é t o d o conveniente para dosar aminoácidos, é dosada
a formação o u o c o n s u m o de oxiácidos. Os m é t o d o s de m o n i t o -
r a m e n t o c o n t í n u o são usados pelo a c o p l a m e n t o de reações de
aminotransferases a reações de desidrogenases específicas. Os
oxiácidos f o r m a d o s n a reação são dosados i n d i r e t a m e n t e pela
redução enzimática aos h i d r o x i á c i d o s correspondentes, sendo o
a c o m p a n h a m e n t o da variação na concentração de N A D H m o n i -
t o r a d o espectrofotometricamente. O a-cetoglutarato, f o r m a d o na
reação de A S T , é Teduzido a m a l a t o na presença de m a l a t o desi-
drogenase ( M D ) .
334 PARTE IV Analitos

a-cetüglutaiato —... L-Aspartato L-Malato NAD o,. .O

\
X
"N

-Y \ í
.W» tf I
'
O. OH

©
L-Glutamato Oxaloacetaro "• N A D H + H
T AH
y-UUi tamil transíerase
Ml
Reação de aminotransferase Reação de desidrogenase
(Formação de oxaloacetato) (Quantificação de 0* a lo acetato) n-4 pH S.2
Reação ensaio Reação t-ndkâdota t &
I
|j < i i , N
I W ""H
a niNHi
O piruvato f o r m a d o na reação de A L T é reduzido a lactato Glicílglicina O. OH
pela L D . O substrato, N A D H , e as enzimas auxiliares, M D o u cx Aceimnte V
O** OH
L D , precisam estar presentes em quantidade suficiente de tal ÍH2
Substrato (doaderr)
f o r m a que a velocidade de reação seja limitada somente pelas ÍLLH
y-Glu t amil-J>-ni tioanilida
quantidades de A S T e A L T , respectivamente. À m e d i d a que a (i—O
reação procede, o N A D H é oxidado a N A D \ O desaparecimento
^H2
do N A D H é acompanhado pela medida da d i m i n u i ç ã o da absor- I
vância a 340 n m por vários minutos. A variação da absorvância NH
por m i n u t o ( A A / m i n ) é p r o p o r c i o n a l aos micromoles de N A D H o=c
oxidados e, p o r sua vez, aos micromoles de substrato transfor- ÍH2
mado por m i n u t o . U m período de incubação p r e l i m i n a r é neces- O*1

sário para garantir que a redução dependente de N A D H de f>-Nitroani]ina

oxiácidos endógenos na amostra esteja completa antes da adição
de a-cetoglutarato para iniciar a reação de aminotransferase.
C o n f o r m e mencionado, a suplementação com P-5r-P garante que
toda a atividade de aminotransferase da amostra seja dosada.
Procedimentos de referência primários da I F C C para a
dosagem das atividades catalíticas de A S T e A L T a 37 ° C estão
disponíveis. 10,11 Para garantir a exatidão e a comparabilidade entre
os laboratórios, os valores do calibrador do p r o d u t o do fabricante
e os resultados de dosagens obtidos na r o t i n a diária com sistemas
comerciais devem estai de acordo com esses procedimentos de
dosagem de referência (Capítulo 9).
A atividade de A S T n o soro é estável por até 48 horas a
4°C. As amostras devem ser armazenadas congeladas se forem
mantidas por maiores períodos. A atividade de A L T deve ser
dosada n o dia da coleta da amostra uma vez que a atividade é
perdida à temperatura ambiente, a 4 ° C e a - 2 5 °C. A estabili-
dade de A L T é mais b e m m a n t i d a a - 7 0 °C. As amostras hemo-
lisadas não devem ser usadas.
Q u a n d o se usam exames confiáveis aos procedimentos de
referência da I F C C , os limites de referência superiores de A S T
para adultos são 31 U / L para mulheres e 35 U / L para homens,
respectivamente. Os limites de referência superiores de A L T cor-
respondentes são 34 U / L e 45 U / L .
Gama-glutamiltransferase
As peptidases são enzimas que catalisam a clivagem hidrolítica
de peptídios para formaT aminoácidos o u peptídios menores.
Elas constituem u m grupo amplo de enzimas de especificidade
variada. Algumas enzimas individuais agem como transferases de
aminoácidos e catalisam a transferência de aminoácidos de u m
peptídeo para u m outro aminoácido o u peptídio. A gama-gluta-
miltransferase ( E C 2.3.2.2; y-glutamil-peptídio: aminoácido y-glu-
tamiltransferase [ G G T ] ) catalisa a transferência do grupo y-gluta-
m i l de peptídios e compostos que o contêm para u m aceptor. Os
substratos para G G T i n c l u e m (1) o aceptor de y-glutamil, (2)
alguns aminoácidos ou peptídios, (3) ou mesmo água, no caso
de ocorrer u m a hidrólise simples. A enzima age somente sobre
peptídios o u compostos semelhantes a peptídios c o n t e n d o u m
resíduo de glutamato t e r m i n a l ligado ao restante do composto
n o t e r m i n a l carbóxi (-y-) c o m o a seguir-
Resíduo doador ÍHNH,
OH
y-Glutamilglicilglicina
Produto da transferência
A glicilglicina é cinco vezes mais efetiva como aceptor a do
que a glicina ou o tripeptídio (gly-gly-gly). A reação de transferên-
cia da peptidase é consideravelmente mais rápida do que a reação
de hidrólise simples.
Bioquímica
A G G T está presente (em o r d e m de abundância decrescente) (1)
no t ú b u l o renal proximal, (2) n o fígado, (3) no pâncreas e (4) no
intestino. A enzima está presente n o citoplasma (microssomos),
mas a maior fração está localizada na membrana celular e pode
transportar aminoácidos e peptídios paia as células através da
membrana celular na forma de y-glutamilpeptídios.
}
Significado Clinico
Mesmo o tecido renal tendo a maior concentração de G G T , a
enzima presente no soro se origina primariamente do sistema
hepatobiliar. Ela é u m indicador sensível da presença de doença
hepatobiliar, estando elevada na maioria dos indivíduos com
doença hepática independentemente da causa. Sua utilidade
clínica, entretanto, é limitada pela falta de especificidade. C o m o
a ALP, ela é mais alta nos casos de obstrução biliar intra- e pós-
hepática, alcançando atividades de cerca de 5 a 30 vezes o limite
de referência superior. Altas elevações de G G T também são obser-
vadas em pacientes com neoplasmas hepáticos primários ou metas-
táticos. Nessas condições, as variações podem ocorrer precoce-
mente e são mais pronunciadas do que aquelas de outras enzimas
hepáticas. Elevações moderadas (duas a cinco vezes o limite de
referência superior) ocorrem em hepatites infecciosas. Aumentos
pequenos da atividade de G G T são observados em pacientes com
fígado gordo, e aumentos similares mas transientes são notados em
casos de intoxicação por drogas. N a pancreatite aguda ou crônica
e alguns tipos de malignidades pancreáticas (especialmente se asso-
ciadas a obstrução hepatobiliar), a atividade enzimática pode ser
de 5 a 15 vezes o l i m i t e de referência superior.

A t i v i d a d e s aumentadas de G G T são encontradas nos sotos
de pacientes c o m hepatite alcoólica e na m a i o r i a dos soros de
pessoas que são etilistas pesados. Concentrações aumentadas da
enzima t a m b é m são encontradas n o soro de i n d i v í d u o s que
recebem drogas anticonvulsivantes, tais c o m o a f e n i t o í n a e o
fenobarbital. T a l a u m e n t o na atividade de G G T n o soro p o d e
r e f l e t i r a i n d u ç ã o de atividade enzimática nova pela ação d o
álcool e de drogas e / o u p o r seus efeitos tóxicos nas estruturas
microssomiais das células hepáticas.
Métodos de Análise
Os primeiros exames de G G T usavam L-y-glutamil-fmi troa n i lida
( G G P N A ) como substrato, c o m glicilglicina servindo como o aceptor
do resíduo y-glutamil. A p-nitroanilida produzida na reação é deter-
minada pela sua cor amarela, a qual é monitorada a 405 n m .
E n t r e t a n t o , a G G P N A tem solubilidade l i m i t a d a na m i s t u r a
de reação. P o r t a n t o , c o m G G P N A , é d i f í c i l obter concentrações
saturantes de substrato. Derivados de G G P N A , nos quais vários
grupos f o r a m i n t r o d u z i d o s n o anel benzenoj t ê m sido usados
para a u m e n t a r a h i d r o s s o l u b i l i d a d e . N o p r o c e d i m e n t o de refe-
rência de dosagem de G G T da I F C C , a L-y-glutamil'3-carbóxi-4-
n i t r o a n i l i d a serve c o m o substrato, c o m glicilglicina a t u a n d o
c o m o u m aceptor. O t a m p o n a m e n t o é realizado pela p r ó p r i a
glicilglicina. O c o m p r i m e n t o de o n d a de dosagem do p r o d u t o de
reação, S - a m i n o - ^ n i t r o b e n z o a L o , é 410 nm. 9
A G G T é u m a enzima c o m p a r a t i v a m e n t e estável i n vúro. A
atividade é estável p o r pelo menos 1 mês a 4 ° C e p o r 1 ano a
- 2 0 °C. O soro não-hemolisado é a amostra preferencial, mas o
plasma c o m E D T A t a m b é m pode ser usado. A h e p a r i n a p r o d u z
turbidez na m i s t u r a de reação; citrato, oxaloacetato e f l u o r e t o
d i m i n u e m a atividade de 10% a 15%.
E m adultos, o l i m i t e de referência superior para a atividade
de G G T n o soro é de 38 U / L para mulheres e 55 U / L para
h o m e n s . Os limites de referência são a p r o x i m a d a m e n t e duas
vezes maiores em pessoas de ancestralidade africana. E m neona-
tos a t e r m o n o r m a i s , a atividade de G G T ao nascimento é apro-
x i m a d a m e n t e de seis a sete vezes a faixa de referência para adultos.
A atividade então declina, alcançando os valores de adultos na
idade de 5 a 7 meses.
Fosfatase Alcalina
A fosfatase a l c a l i n a { E C 3.1.3.1; ortofosfórico-monoésteT fosfo-
hidrolase [ ó t i m o alcalino]; A L P ) catalisa a h i d r ó l i s e alcalina de
Fígura 19-3 identidades, designações
cromossômicas e principais expressões
fisiológica e patológica de genes que
codificam fosfatases alcalinas humanas. I I
As ímkas tracejadas mostram duas origens Cromossomo 1
alternativas propostas de fosfatase alcalina
intestinal fetal. A seqüência de um D N A
complementar (cDNA) é apresentada j Toocto não-sspociftGQ
como idêntica àquela da fosfatase alcalina
intestinal adulta (AP). Todas as
Glicosilaçftn
isoenzimas e isoformas são glicoprotcínas, diferenciai
impondo um maior grau de micro-
heterogeneidade Diferentes processos de Variantes
clivagem ou preservação do domínio de tecido-espcci ficas
ancoramento na membrana podem gerar
isoformas adicionais. (Modificado de
~l
Moss DW. Perspectives in alkaline
Rim Figado Osso Outros
phosphatase research. Clin Chem I
1992;38:2486-92.) Modificações somáticas no câncer
Enzimas CAPÍTULO 19 335
u m a grande variedade de substratos de ocorrência n a t u r a l e sin-
téticos. Os íons divalentes, tais c o m o M g 2 + , Co 2 + , e M n z + , são
ativadores da enzima, e o Z n 2 ' é o í o n metálico c o n s t i t u i n t e . Os
íons fosfato, borato, oxalato e cianeto são i n i b i d o r e s da atividade
de A L P . O t i p o de tampão presente na reação catalítica pode
afetar a velocidade de atividade. Os tampões para o ensaio de
A L P são classificados c o m o (1) inertes (carbonato e barbiral), (2)
i n i b i d o r e s (glicina e p r o p i l a m i n a ) o u (3) ativadores (2-ainino-2-
m e t i l - l - p r o p a n o l [ A M P ] , tris ( h i d r o x i m e t i l ) a m i n o m e t a n o [TRIS]
e dietanolamina [DEA]).
Bioquímica
A atividade de A L P está presente na m a i o r i a dos órgãos do c o r p o
e está especialmente associada a m e m b r a n a s e superfícies célula-
res localizadas (1) na mucosa do i n t e s t i n o delgado e nos túbulos
c o n t o r c i d o s proximais d o r i m , (2) no osso (osteoblastos), (3) n o
fígado e (4) na placenta. E m b o r a a f u n ç ã o metabólica exata da
enzima não seja c o m p r e e n d i d a , parece que a A L P está associada
c o m o transporte de lipídios n o intestino e c o m o processo de
calcificação óssea.
A A L P existe e m m ú l t i p l a s formas, algumas das quais são
isoenzimas verdadeiras, codificadas e m loci separados (Figura 19-
3). As formas de A L P do osso, d o fígado e do r i m c o m p a r t i l h a m
u m a estrutura p r i m á r i a c o m u m codificada pelo mesmo locus
gênico, mas d i f e r e m n o c o n t e ú d o de carboidratos.
Significado Clínico
A s elevações na atividade de A L P sérica se o r i g i n a m c o m u m e n t e
do fígado e do osso. C o n s e q ü e n t e m e n t e , as dosagens séricas de
A L P são de p a r t i c u l a r interesse na investigação de doença hepa-
t o b i l i a r e na doença óssea associada a atividade osteoblástica
aumentada.
Doença Hepatobiliar
A resposta do fígado a qualquer f o r m a de obstrução da árvore
hepática i n d u z a síntese de A L P pelos hepatócitos. Algumas das
enzimas recentemente formadas e n t r a m na circulação para aumen-
tar a atividade enzimática n o soro. A elevação tende a ser mais
notável ( m a i o r do que três vezes) na obstrução extra-hepática d o
que na obstrução íntra-hepática e é t a n t o m a i o r quanto mais
completa ÍOT a obstrução. As atividades enzimáticas séricas p o d e m
alcançar de 10 a 12 vezes o l i m i t e de referência superior e habitu-
almente r e t o r n a m ao nomnal c o m a remoção cirúrgica da obstru-
ção. U m a u m e n t o similar é visto e m pacientes c o m câncer hepá-
Origens das Isoformas de Fosfatase Alcalina
Loci gênicos
i
Cromossomo 2
q>
Célula
garmrvitivn
1
Mutações
patogênica»
no osso
Expressão Expressão Expressão
inapropriada no inapropriada no inapropriada
câncer
I 1 câncer no câncer
(Nagao) (Regan) (Kasahara)
336 PARTE IV Analitos
tico p r i m á r i o avançado o u c o m metástases hepáticas secundárias
generalizadas. As doenças hepáticas q u e afetam p r i n c i p a l m e n t e as
células parenquimais, tais c o m o a hepatite infecciosa, m o s t r a m
geralmente atividades de A L P séricas somente m o d e r a d a m e n t e
aumentadas (menos de três vezes) ou mesmo normais. Os aumen-
tos t a m b é m p o d e m ser vistos c o m o conseqüência de u m a reação
à terapia c o m droga. A isoenzima de A L P intestinal, u m a glico-
proteína sem ácido siálico n o r m a l m e n t e depurada pelos recepto-
res hepáticos de glicopioteínas sem ácido siálico, está f r e q ü e n t e
m e n t e aumentada em pacientes c o m cirrose hepática.
Doença Óssea
A A L P óssea é p r o d u z i d a pelo osteoblasto e t e m sido demons-
trada nas vesículas da m a t r i z depositadas c o m o " g o m o s " deriva-
dos da m e m b r a n a celular. A enzima é, p o r t a n t o , u m excelente
i n d i c a d o r da atividade de formação óssea global. D e n t r e as
doenças ósseas, as concentrações de A L P mais altas são encon-
tradas na doença de Paget (osteíte deformante) c o m o resultado
da ação de células osteoblásricas à m e d i d a q u e elas t e n t a m recons-
t r u i r o osso que está sendo reabsorvido pela atividade descontro-
lada dos osteoclastos. Valores de 10 a 25 vezes o l i m i t e de refe-
rência superior são usuais, e, em termos amplos, o a u m e n t o
reflete a extensão da doença. N a deficiência de v i t a m i n a D (osteo-
malácia e r a q u i t i s m o ) , p o d e m ser observadas atividades de duas
a q u a t r o vezes o l i m i t e de referência superioT, e elas caem lenta-
m e n t e ao n o r m a l d u r a n t e o t r a t a m e n t o . Os hiperparatireoidis-
mos p r i m á r i o e secundário estão associados a elevações séricas
de A L P de leves a moderadas, c o m a existência e o grau de ele-
vação r e f l e t i n d o a presença e a extensão do e n v o l v i m e n t o esque-
lético. Concentrações enzimáticas m u i t o altas estão presentes n o
soro de pacientes c o m câncer ósseo osteogênico. A t i v i d a d e s leve-
m e n t e aumentadas de A L P têm sido observadas na osteoporose,
mas os i n d i v í d u o s c o m osteoporose não são claramente distin-
guíveis de controles pareados pela idade. Elevações transientes
p o d e m ser encontradas d u r a n t e a cicatrização de fraturas ósseas.
O crescimento ósseo fisiológico a u m e n t a a A L P óssea n o soro e
essa é a razão para que n o soro de crianças e m crescimento a
concentração enzimática seja de l j 5 a 7 vezes aquela n o soro de
adultos saudáveis, o m á x i m o sendo mais precoce em meninas do
que e m m e n i n o s .
Outras Condições que Aumentam a ALP
U m a u m e n t o de até duas o u três vezes o l i m i t e de referência
superior é observado em mulheres n o terceiro trimestre de ges-
tação, c o m a enzima a d i c i o n a l originada da placenta. Existem
t a m b é m relatos de u m a elevação f a m i l i a r b e n i g n a na atividade
sérica de A L P em razão do a u m e n t o da concentração de A L P
intestinal. A u m e n t o s benignos e transientes de A L P sérica p o d e m
ser encontrados em criançaSj c o m variações f r e q ü e n t e m e n t e
maiores d o que 10 vezes o l i m i t e de referência superior. São
observados aumentos t a n t o na f o r m a hepática q u a n t o na f o r m a
óssea. Essas variações parecem r e f l e t i r u m a redução na remoção
de A L P d o sangue causada pelas modificações transientes da
glicosilação da enzima.
U m resultado da aplicação de técnicas de análise de isoenzi-
mas para a caracterização de A L P n o soro f o i a descoberta de que
formas da enzima essencialmente idênticas à isoenzima n o r m a l
placentária aparece n o soro de alguns pacientes c o m doenças
malignas. Essas isoenzimas carcinoplacentárias ( d e n o m i n a d a s de
isoenzima Regan) parecem resultar da depressão do gene de A L P
placentário. A presença dessas isoenzimas é p r o n t a m e n t e detec-
tável n o soro por sua estabilidade a 65 °C. O s tumores t a m b é m
p r o d u z e m A L P que parecem ser formas modificadas de isoenzi-
mas não placentárias (p. ex., a isoenzima Kasahara).
Métodos de Análise para Atividade e Conteúdo de
Isoenzimas
A atividade de A L P e o c o n t e ú d o de isoenzimas são m e d i d o s no
laboratório.
Dosagem da Atividade de ALP
O s m é t o d o s para a d e t e r m i n a ç ã o da atividade de A L P t ê m sido
direcionados para o a u m e n t o da velocidade e da sensibilidade do
ensaio pela seleção de substratos hidrolisados p r o n t a m e n t e e de
tampões aceptores de fosfato e o uso de m é t o d o s de m o n i t o r a -
m e n t o c o n t i n u o baseados e m substratos auto-indicadores. O
mais p o p u l a r dos substratos cromogênicos o u auto-indicadores
para a A L P é o 4-fenil fosfato ( n o r m a l m e n t e abreviado como
4-NPP o u PNPP a p a r t i r do n o m e antigo, f j - n i t r o f e n i l fosfato).
Esse éster não tem cor, mas o p r o d u t o f i n a l é amarelo n o p H da
reação:
4-Nitrofenil 4-Nlrrofenóxido (sem COT, 4-NiiTofenóxido (amarelo,
fosfato (sem cor) forma bemenóide) forma quinonóide)
o.v ,o o... x.o U-. o e
f\ •N'-'
Rearranjos
em pH
ALP, Mg2+ alcalino
-
pH 10,3
O O
o—P-o "
6W
cr
4 o—f»—o*
h9O W»
A reação enzimática é m o n i t o r a d a c o n t i n u a m e n t e c o m u m
espectrofotômetro pela observação da velocidade de formação de
íons 4-nitrofenóxidos a 405 n m . C o m as melhoras das condições
de reação, essa reação f o r m a a base dos métodos recomendados
atualmente para o exame de A L P . Nesses métodos, o g r u p o fosfato
liberado é transferido para a água. A velocidade de ação da fosfa-
tase é aumentada, entretanto, se certos aminoálcoois f o r e m usados
c o m o tampões aceptores de fosfato. D e n t r e esses ativadores estão
compostos tais c o m o (1) A M P , (2) D E A , (3) TR1S, (4) etilamino-
etanol ( E A E ) e (5) N-metiLd-glucamina ( M E G ) . O m é t o d o reco-
m e n d a d o pela I F C C (provisório) usa 4-NPP c o m o o substrato e
A M P c o m o o tampão aceptor de fosfato.
Soro o u plasma h e p a r i n i z a d o devem seT usados para a
dosagem de A L P . A n t i c o a g u l a n t e s complexantes — tais como
citrato, oxalato e E D T A — devem ser evitados p o r q u e ligam
cátions, tais como M g J " e Z n : + , os quais são co-fatores necessários
para a dosagem da atividade de A L P . A m o s t r a s de soro recém
coletadas devem ser m a n t i d a s na temperatura a m b i e n t e e ensaia-
das tão logo q u a n t o possível, mas preferencialmente d e n t r o de 4
horas após a coleta. N o soro armazenado a u m a temperatura
refrigerada, a atividade de A L P a u m e n t a l e n t a m e n t e ( 2 % por
dia). As amostras congeladas devem ser degeladas e m a n t i d a s na
t e m p e r a t u r a a m b i e n t e p o r 18 a 24 horas antes da dosagem para
alcançar a reativação enzimática completa.
As atividades de A L P no soro v a r i a m c o m a idade. A s crian-
ças apresentam atividade de A L P m a i o r do que os adultos sau-
dáveis c o m o resultado da saída de A L P óssea dos osteoblastos
d u r a n t e o crescimento ósseo. Os intervalos de referência (percen-
tis 95 centrais) têm sido estabelecidos c o m o uso de procedimen-
tos de referência da I F C C a 37 ° C (Tabela 19-4).
Dosagem das Isoenzimas de A L P
Os ensaios para as isoenzimas de A L P são necessários q u a n d o (1)
a f o n t e de u m a A L P sérica elevada não é obvia e deve ser escla-
 Enzimas CAPÍTULO 19 337

recida, (2) a p r i n c i p a l p e r g u n t ã clínica está relacionada c o m a
detecção da presença de e n v o l v i m e n t o ósseo o u hepático e (3) n o
caso de desordens metabólicas ósseas, averiguai quaisquer m o d i -
ficações na atividade dos osteoblastos para m o n i t o r a r a atividade
da doença e o efeito das terapias apropriadas.
Os critérios que t ê m sido usados para diferenciar as isoenzi-
mas e outras formas m ú l t i p l a s de A L P i n c l u e m : (1) m o b i l i d a d e
eletroforética, (2) estabilidade à desnaturação pelo calor o u com-
postos q u í m i c o s , (3) resposta à presença de inibidores seletivos,
(4) a f i n i d a d e p o r lecitinas específicas e (5) características i m u n o -
químicas.
A p ó s a eletroforese, as bandas de A L P são visualizadas pela
incubação do gel em u m a solução de substrato t a m p o n a d o
(p. ex., 1 - n a f t i l fosfato, ao q u a l u m sistema c r om ogêni c o, n o r m a l -
m e n t e representado p o r u m sal d i a z ô n i o , é adicionado). A A L P
hepática se move t i p i c a m e n t e mais r á p i d o para o â n o d o . A A L P
óssea, que quase sempre gera u m a b a n d a mais difusa d o que a
f o r m a hepática, tem u m a m o b i l i d a d e para o â n o d o ligeiramente
m e n o r , e m b o r a as duas bandas h a b i t u a l m e n t e se s o b r e p o n h a m
u m p o u c o . A A L P i n t e s t i n a l m i g r a mais l e n t a m e n t e d o que a
enzima óssea, e n q u a n t o a isoenzima placentária aparece corau-
m e n t e c o m o u m a b a n d a discreta adjacente à'fração óssea difusa.
U m a b a n d a adicional, que está f r e q ü e n t e m e n t e presente n o soro
de pacientes c o m várias doenças hepáticas, c o n t é m u m a f o r m a
TABELA 19-4 Intervalos de Referência para as Atividades de
Fosfatase Alcalina n o Soro
Sexo Idade (anos) Intervalo de Referência (U/L)
Masculino/Feminino 4-15 54-369
Homens 20-50 53-123
>60 56-119
Mulheres 20-50 42-98
>60 53-141
de A L P de alto peso m o l e c u l a r que é t a m b é m altamente carre-
gada negativamente- Desse m o d o , ela se move l e n t a m e n t e n o gel
de a m i d o o u p o d e m e s m o não entrar n o gel de p o l i a c r i l a m i d a .
E n t r e t a n t o , ela migra mais na direção do â n o d o do q u e a p r i n -
cipal b a n d a hepática em m e i o não-peneirante, tal c o m o o acetato
de celulose. As investigações sobre essa f o r m a t ê m revelado que
ela corresponde à f o r m a hepática p r i n c i p a l ligada à região de
m e m b r a n a . Os complexos entre A L P e i m u n o g l o b u l i n a s , o u
macro-ALP, o c o r r e m ocasionalmente n o soro, gerando bandas
c o m migração a n o r m a l na zona de y-globulinas.
E m geral, a separação das formas óssea e hepática de A L P é
d i f í c i l pela s i m i l a r i d a d e estrutural. Para m e l h o r a r as suas separa-
ções eletroforéticas, o soro é pré-tr atado p o r 15 m i n u t o s a 37 ° C
c o m n e u r a m i n i d a s e para remover parte dos resíduos de ácido
siálico terminais. C o m o os resíduos de ácido siáiico da A L P óssea
são mais atacados do que aqueles da A L P hepática, a m o b i l i d a d e
eletroforética da f o r m a óssea é mais reduzida d o q u e a da A L P
hepática. A separação m e l h o r a d a p e r m i t e que a estimativa quan-
titativa seja feita pela análise d e n s i t o m é t r i c a (Figura 19-4).
A incubação ovemight da amostra de soro c o m n e u r a m i n i d a s e
t a m b é m é usada para c o n f i r m a r a presença de A L P intestinal.
Esse t r a t a m e n t o reduz a m o b i l i d a d e eletroforética na direção d o
â n o d o de todas as isoenzimas de A L P exceto aquela de o r i g e m
intestinal, que é resistente à n e u r a m i n i d a s e p o r q u e seus residuos
de ácido siálico terminais não estão presentes na molécula.
Os i m u n o e n s a i o s para a d e t e r m i n a ç ã o direta de A L P óssea,
os quais dosam t a n t o a atividade enzimática q u a n t o a concentra-
ção de massa, estão disponíveis comercialmente; entretanto, t e m
sido descrita a reatividade cruzada c o m a i s o f o t m a hepática ( 6 %
a 2 0 % ) . N a prática, é d i f í c i l p r o d u z i r a n t i c o r p o s que reajam
seletivamente c o m p r o d u t o s diferentes do gene para A L P não-
tecido-específico, inclusive as isoformas derivadas d o fígado e d o
osso. Apesar de não t e r e m especificidade completa, os i m u n o e n -
saios da A L P óssea p o d e m oferecer algumas vantagens n o m o n i -
t o r a m e n t o de doença óssea e n o efeito de terapias apropriadas,

: \ Sk«o itãü ImUxIu

Tratado com neuraminidase

r s
Toslulasc Fosfatas*; aliialinrt fasaa
ulcalinu I c p ã l i c a
B

Ânodo

Figura 19-4 A , Eletroforese e m gel de p o l i a c r i l a m i d a das fosfatases alcalinas d o osso e d o figado n o soro h u m a n o
A esquerda, M i s o n a de dois soros c o n t e n d o , respectivamente, a t o t a l i d a d e da fosfatase óssea e a t o t a l i d a d e da fosfatase
hepática. A direita, M i s t u r a dos mesmos dois soros após cada u m ter sido tratado c o m n e u r a m i n i d a s e p o r 10 m i n a
37 ° C . A direção d o â n o d o está representada pata baixo. A banda mais p r ó x i m a d o â n o d o é a fosfatase hepática.
B , Análises densitométricas dos padrões eletroforéticos mostrados em A . Linha Tracejada, A n á l i s e da m i s t u r a de soros
não tratados; liníui sólida, análise da m i s t u r a de soros tratados c o m n e u r a m i n i d a s e . O â n o d o está para a esquerda ( D e
Moss D W , Edwards R K . I m p r o v e d electrophoretic r e s o l u t i o n o f b o n e a n d liver alkaline phosphatases r e s u l t m g f r o m
p a r d a l digestion w i t h n e u r a m i n i d a s e . C l i n C h i m A c t a 1984;143:177-82.)
338 PARTE IV Analitos
u m a vez que o diagnóstico d o e n v o l v i m e n t o ósseo tenha sido
estabelecido.
5-Nucleotidase
A N T P ( E C 3.1.3.5; 5'-ribonucleotídeo fosfohidrolase) é u m a fos-
fatase que age somente em núcleotídeos-5'-fosfatos, tais c o m o a
adenosina-5'-monofósfato ( A M P ) , l i b e r a n d o fosfato i n o r g â n i c o .
NH,
PP)
I y ee H„0 IIOPO3
" "" N 0 CH 2 0P0 3
NwcIectiJase
HO ÕH
t>H 6,6 a 7 enzima, ele reduz a p r o p o r ç ã o da atividade t o t a l de A L P que está
Adenosina 5'- mo no fosfato
(AMP)
NH,
CH 2 OH
HO OH
Adenosina
Bioquímica
A N T P é u m a glicoproteína a m p l a m e n t e d i s t r i b u í d a nos tecidos
d o c o r p o e está p r i n c i p a l m e n t e localizada na m e m b r a n a citoplas-
mática das células nas quais ocorre. Seu p H ó t i m o está entre 6,6
e 7,0.
Significado Clínico
Apesar de sua distribuição ubíqua, as atividades séricas de N T P
parecem refletir doenças hepatobihares c o m especificidade con-
siderável. Por exemplo, A N T P está a u m e n t a d a de três a seis vezes
naquelas doenças hepatobiliares nas quais existe interferência na
secreção de bile. Isso pode ser devido a causas extra-hepáticas
(uma pedra o u u m t u m o r o c l u i n d o o d u e t o biliar), o u pode suigiT
de condições intra-hepáticas, tais c o m o a colestase causada pela
infiltração maligna do fígado o u cirrose biliar. Q u a n d o o dano à
célula p a r e n q u i m a l p r e d o m i n a , c o m o na hepatite infecciosa, a
atividade sérica de N T P está somente m o d e r a d a m e n t e elevada.
Os exames -para a atividade de N T P t ê m sido considerados
de valor em adição à dosagem de A L P t o t a l não-específica em
pacientes c o m suspeita de doença hepatobiliar. A atividade
a n o r m a l de N T P é r o t i n e i r a m e n t e interpretada c o m o evidência
de u m a o r i g e m hepática de atividade sérica de A L P aumentada.
E n t r e t a n t o , cerca de metade dos i n d i v í d u o s nos quais a atividade
de A L P está a u m e n t a d a n o soro mostra N T P n o r m a l . A l t e r n a t i -
vamente, a N T P a u m e n t a d a no soro de pacientes c o m A L P
hepática n o r m a l é f r e q ü e n t e m e n t e associada à presença de
doença hepática. Portanto, a dissociação freqüente das duas ati-
vidades enzimáticas apóia a u t i l i d a d e de d e t e r m i n a ç ã o de A L P e
N T P (hepáticas) para a u m e n t a r a eficiência diagnostica para
doenças d o fígado.
M é t o d o s de Análise
Os substratos geralmente mais usados na dosagem da atividade
de N T P são o A M P o u a inosina-5'-fosfato ( I M P ) . E n t r e t a n t o , esses
substratos são ésteres de fosfato orgânicos e p o r t a n t o t a m b é m são
hidrolisados p o r outras fosfatases não específicas (alcalinas),
mesmo em p H tão baixo q u a n t o 7,5, que é o p H ó t i m o para a
atividade de NTP. O s métodos de estimativa de N T P no soro
precisam p o r t a n t o i n c o r p o r a r a alguns meios de correção da h i d r ó -
lise do substrato pelas fosfatases não específicas. N u m ensaio
disponível comercialmente, a N T P sérica catalisa a h i d r ó l i s e de
I M P para gerar inosina, que é então convertida a h i p o x a n t i n a pela
purina-nucleosídeo fosforilase ( E C 2.4.2.1). A h i p o x a n t i n a é
oxidada a urato pela x a n r i n a oxidase ( E C 1.2.3.2). D o i s moles de
p e r ó x i d o de h i d r o g é n i o são produzidos para cada m o l de h i p o -
x a n t i n a liberado e c o n v e r t i d o a ácido úrico. A velocidade de
formação de p e r ó x i d o de h i d r o g ê n i o é m o n i t o r a d a p o r u m espec-
t r o f o t ô m e t r o a 510 n m através da oxidação de u m sistema cromo-
gênico. O efeito de A L P s sobre o I M P á i n i b i d o pelo f3-glicerofos-
fato. Esse material é u m substrato para A L P mas não para N T P ,
e através da formação de complexos d o substrato c o m a p r i m e i r a
direcionada à hidrólise do substrato de N T P , o I M P .
A atividade de N T P n o soro o u n o plasma heparinizado é
estável p o r pelo m e n o s 4 dias a 4 " C e 4 meses a - 2 0 ° C . O
i n t e r v a l o de referência para a atividade de N T P a 37 ° C é de 3 a
9 U / L , sem diferenças relacionadas ao sexo.
Colinesterase
Duas enzimas relacionadas t ê m a capacidade de h i d r o l i s a r acetil-
colina. U m a é a acetilcolinesterase ( E C 3.1.1.7, acetilcolina acetil-
hidrolase), a qual é d e n o m i n a d a colinesterase verdadeira o u
colina esterase I. A colinesterase verdadeira é encontrada (1) nos
eritrócitos, (2) nos p u l m õ e s e n o baço, (3) terminais nervosos e
(4) na matéria cinzenta d o cérebro. Ela é responsável pela h i d r ó -
lise i m e d i a t a da acetilcolina liberada nos terminais nervosos para
mediar a transmissão d o i m p u l s o nervoso através da sinapse. A
degradação de acetilcolina é necessária para a despolarização d o
nervo de t a l f o r m a q u e ele seja repolarizado n o p r ó x i m o evento
de condução.
A segunda colinesterase é a acetilcolina acil-hidrolase ( E C
3.1.1.8, acilcolina acil-hidrolase, C H E ) . Ela t a m b é m é chamada
de (1) pseudocolinesterase, (2) colinesterase sérica, (3) b u t i r i l c o -
linesterase e (3) c o l i n a esterase I I . E m b o r a ela seja e n c o n t r a d a (1)
n o fígado, (2) n o pâncreas, (3) n o coração, (4) na matéria cinzenta
do cérebro e (5) n o soro, seu papel b i o l ó g i c o é desconhecido. O
t i p o de reação catalisada pelas duas colinesterases é
CH3
H3C^ ! ^ch3
©^
CH3
0 CH, h 3 C ^ T ^.CH3
Br H20
u ©^
b G^S) 9 Br0 <f H
I CH 2 OH
c=o Colinesterase
Acetato
CH, Brometn de
colina
m m ™ de acetil-
colina
Bioquímica
As duas colinesterases d i f e r e m e m especificidade para alguns
substratos e n q u a n t o se c o m p o r t a m s i m i l a r m e n t e para outros. A
enzima do soro age sobre a benzoilcolina mas não h i d r o l i s a acetil-
P-metilcolina. Essa especificidade é ao c o n t r á r i o c o m a enzima
das células vermelhas, que h i d r o l i s a acetiI-[3-metilcolina mas não
benzoilcolina.
As variantes atípicas (genéticas) de C H E são as de interesse
clínico, caracterizadas pela atividade d i m i n u í d a contra acetilco-
l i n a e outros substratos, as quais são encontradas nos soros de
u m a pequena fração de pessoas aparentemente saudáveis. O gene
que c o n t r o l a a síntese de C H E (símbolo B C H E ) existe e m m u i t a s
 Enzimas < KPÍTULO 1 9 339

formas alélicas. O f e n ó t i p o n o r m a l , mais c o m u m , é designado f e n ó t i p o s mais suscetíveis à apnéia após a administração de suc-
U / U ( U para usual). A enzima nos soros de pessoas homozigotas c i m l c o l i n a são A / A , A / S , F / F , F / S , S / S , A / F e em certa m e d i d a
para a v a r i a n t e ( A / A ) é s o m e n t e fracamente ativa c o n t r a a m a i o r i a U / A . As dosagens da atividade de C H E t o t a l e a determinação
dos substratos para C H E e d e m o n s t r a resistência a u m e n t a d a à do " n ú m e r o d i b u c a í n a " e do " n ú m e r o f l u o r e t o " são necessárias
i n i b i ç ã o da atividade enzimática pela dibucaína. A v a r i a n t e F (de para caracterizar c o m p l e t a m e n t e as variantes de C H E . Os ú l t i m o s
resistência ao f l u o r e t o ) t a m b é m gera u m a enzima fracamente valores i n d i c a m a porcentagem de i n i b i ç ã o da atividade enzimá-
ativa mas c o m resistência a u m e n t a d a à i n i b i ç ã o pelo f l u o r e t o . A tica sobre substratos especificados na presença de concentrações
variante S (de silenciosa) está associada à ausência da enzima o u padrão de dibucaína o u f l u o r e t o .
à presença de u m a p r o t e í n a c o m atividade catalítica m í n i m a o u
ausente. As mutações que geram as variantes de C H E atípica e Métodos de Análise
resistente ao f l u o r e t o e n v o l v e m a m u d a n ç a na estrutura d o centro M u i t o s métodos de colinesterase usam ésteres de a c i l t i o c o l i n a
ativo. As enzimas variantes (aleloenzimas) são catalisadores menos tais c o m o a b u t i r i l t i o c o l i n a c o m o substratos.
efetivos d o que a f o r m a usual. A a f i n i d a d e das enzimas pelos
substratos está reduzida, (constante de M i c h a e l i s - M e n t i o n [ K m ] CH3
H 3 C_ I ^ c h 3
a u m e n t a d a) e a a f i n i d a d e para i n i b i d o r e s competitivos, tais c o m o
jjr CH3
d i b u c a í n a e f l u o r e t o , s i m i l a r m e n t e d i m i n u í d a . Isso dá o r i g e m às H3C I J:H 3
CH 2 H7O -•c-
propriedades características de resistência à dibucaína e ao f l u o - I I
CH, CH,
reto das variantes genéticas que são exploradas em suas caracte-
•S
V CH 2
rizações. As formas homozigotas, A / A o u F / F , são encontradas ÍH2
I I CH2
e m 0 , 3 % e 0 , 5 % da população caucasiana; suas incidências entre c=o Colinas lertue
CH3 I
I SH
os negros são até mais baixas. A herança de atividade de C H E CH2 Butiiato Tiocolina
a u m e n t a d a t a m b é m tem sido descrita e m poucas famílias. CH,
CH3
Significado Clínico Butiriltiocolina

As dosagens da atividade de C H E n o soro são usadas (1) c o m o

teste de f u n ç ã o hepática, (2) c o m o u m i n d i c a d o r de u m possível Esses substratos são h i d r o l i s a d o s a p r o x i m a d a m e n t e na mesma
e n v e n e n a m e n t o p o r inseticida e (3) para a detecção de pacientes velocidade dos ésteres de c o l i n a e a t i o c o l i n a f o r m a d a é dosada
c o m formas atípicas da enzima que estão em risco de respostas pela reação c o m agentes dissulfeto cromogênicos, tais c o m o o 5,
prolongadas a certos relaxantes musculares usados e m procedi- 5'-ditiobis (nitrobenzoato) ( D T N B ) .
m e n t o s cirúrgicos.
A s dosagens de atividade sérica de C H E t a m b é m servem
NO- OH CH3

A
c o m o i n d i c a d o r e s sensíveis da capacidade de síntese d o fígado. T II.CJ£IÍ 3
N a ausência de causas genéticas o u i n i b i d o r e s conhecidos, qual- <3, OH NO;
quer d i m i n u i ç ã o na atividade de C H E reflete síntese d i m i n u í d a CHT CH-, Á

T
I O
da enzima pelo fígado. U m decréscimo de 3 0 % a 5 0 % na C H E HÍAJ ÇHJ
©N
é observado na hepatite aguda. Decréscimos de 5 0 % a 7 0 %
CH 2 S
o c o r r e m n a cirrose avançada e n o carcinoma c o m metástase
i íiH
hepática. A C H E é essencialmente n o r m a l na icterícia obstrutiva, CH,

ò
Acido
exceto q u a n d o a causa é maligna. Dosagens seriais da C H E t ê m 5-mercapto
sido p r o m o v i d a s c o m o u m a indicação de prognóstico e m pacien- Tiocolina 2-n i trobenzô í CO;
X.O
tes c o m doença hepática e para m o n i t o r a r a função hepática após >( 5-MNBA
(colorido)
o transplante de fígado. NOY OIL NO, AH
D e n t r e os compostos fosfóricos orgânicos que i n i b e m a ativi- DTNB Dhsvlícu»
dade de C H E estão vários inseticidas, tais c o m o (1) p a r a t i o n , (2) (sem cor) uii&u
sarin e (3) tetraetil pirofosfato. Os trabalhadores da a g r i c u l t u r a e
das i n d ú s t r i a s químicas orgânicas p o d e m estar sujeitos ao enve- A reação do p r o d u t o t i o c o l i n a c o m o D T N B sem cor f o r m a
n e n a m e n t o pela inalação desses materiais o u pelo c o n t a t o c o m o ácido 5-mercapto-2-nitrobenzóico c o l o r i d o , o q u a l é m e d i d o
eles. Se m a t e r i a l suficiente é a b s o r v i d o para inativar t o d a a ace- espectrofotometricamente a 410 n m . Os sais i o d e t o de acetiltio-
tilcolinesterase do tecido nervoso, o resultado será a m o r t e . As colina, p r o p r i o n i l t i o c o l i n a , b u t i r i l t i o c o l i n a e s u c c i n i l t i o c o l i n a
duas C H E são inibidas, mas a atividade da enzima d o soro cai t ê m sido usados c o m o substratos.
mais r a p i d a m e n t e do que a da enzima d o e r i t r ó c i t o . A pergunta clínica a ser r e s p o n d i d a p o d e i n f l u e n c i a r a escolha
A s u c c i n i l d i c o l i n a (suxametônio) e o m i v a c ú r i o , drogas usadas d o substrato adequado para a dosagem da enzima. A dosagem da
em cirurgia c o m o relaxantes musculares, são h i d r o l i s a d o s pela atividade de C H E usando s u c c i n i l t i o c o l i n a é o m é t o d o de escolha
C H E , e seus efeitos farmacológicos n o r m a l m e n t e persistem para diagnosticar a sensibilidade à succinilcolina, c o m base pura-
somente o t e m p o necessário para o p r o c e d i m e n t o c i r ú r g i c o . E m mente na atividade da enzima registrada n o soro. Esse m é t o d o é,
pacientes c o m atividades enzimáticas baixas o u naqueles c o m entretanto, adequado para outras aplicações clínicas d o teste. 3
u m a v a r i a n t e fracamente ativa, a destruição da droga não ocor- Usando-se b e n z o i l c o l i n a c o m o u m substrato clássico, t e m
rerá s u f i c i e n t e m e n t e r á p i d o e o paciente p o d e entrar n u m sido d e m o n s t r a d a a diferença q u a l i t a t i v a entre as C H E . Por
p e r í o d o de paralisia p r o l o n g a d a dos músculos respiratórios exemplo, u m teste simples tem sido desenvolvido para classificar
(apnéia) necessitando de ventilação mecânica até que os efeitos o t i p o de C H E c o m o usual, i n t e r m e d i á r i a o u atípica ( " n ú m e r o
da droga g r a d u a l m e n t e se apaguem. O rastreamento pré-operató- dibucaína"), c o m base nas diferenças na sensibilidade à i n i b i ç ã o
r i o t e m sido preconizado para i d e n t i f i c a r pacientes n o s quais a pelo anestésico local dibucaína. U s a n d o essa abordagem, a C H E
a d m i n i s t r a ç ã o de s u x a m e t ô n i o p o d e levar a complicações. O grau usual é i n i b i d a em 8 0 % , mas a C H E atípica somente e m 2 0 % .
de sensibilidade à droga varia c o m o f e n ó t i p o d o paciente. Os Os i n d i v í d u o s heterozigotos para o gene n o r m a l e atípico m o s t r a m
340 PARTE IV Analitos
cerca de 6 0 % de i n i b i ç ã o da C H E . Para diferenciar outros genó-
tipos, o f l u o r e t o de sódio tem sido usado c o m o u m i n i b i d o r de
C H E . Os m é t o d o s de b i o l o g i a molecular t a m b é m estão sendo
usados para detectar os defeitos genéticos de C H E .
O soro é a amostra de escolha. A atividade enzimática n o
soro é estável p o r várias semanas se a amostra é armazenada sob
refrigeração e p o r vários anos se armazenada a - 2 0 ° C .
Usando-se o m é t o d o s u c c i n i l t i o c o l i n a / D T N B a 37 ° C , o
i n t e r v a l o de referência para adultos saudáveis c o m o g e n ó t i p o
usual é estimado e m 33 a 76 U / L para mulheres e 4 0 a 78 U / L
para h o m e n s . A atividade m é d i a e m i n d i v í d u o s c o m o g e n ó t i p o
heterozigoto é 2 2 U / L (varia de 5 a 35 U / L ) e para homozigotos
atípicos 1,5 U / L (varia de 1 a 4 U / L ) . U m v a l o r de < 23 U / L é
a p r o x i m a d a m e n t e cinco vezes mais provável de ocorrer em u m
i n d i v í d u o sensível à s u c c i n i l c o l i n a do que em u m i n d i v i d u o
n o r m a l . 1 A o nascimento, a atividade de C H E é mais baixa do
q u e os valores de adultos em cerca de 5 0 % . Ela a u m e n t a d u r a n t e
os 3 a 6 p r ó x i m o s anos para exceder os valores de adultos em
cerca de 3 0 % . A p a r t i r d o q u i n t o ano de vida, a atividade começa
a d i m i n u i r antes de se estabilizar n o v a l o r d o adulto, o q u a l é
alcançado na puberdade. Existe u m a d i m i n u i ç ã o significante de
C H E ( ~ 3 0 % ) d u r a n t e a gravidez e n o i n í c i o d o p u e r p é r i o , expli-
cado pela h e m o d i l u i ç ã o .
Glutamato Desidrogenase
A g l u t a m a t o desidrogenase ( E C 1.4.1.3; L - g l u t a m a t o : N A D ( P ) +
oxidorredutase, desaminante; G L D ) é u m a enzima m i t o c o n d T i a l
e n c o n t r a d a p r i n c i p a l m e n t e (1) n o fígado, (2) n o m ú s c u l o cardí-
aco e (3) nos rins, mas pequenas quantidades o c o r r e m em outros
tecidos, i n c l u i n d o (4) cérebro, (5) tecido muscular esquelético e
(6) leucócitos. A enzima catalisa a remoção do h i d r o g ê n i o do
L-glutamato para f o r m a r o cetimino-ácido correspondente que
sofre h i d r ó l i s e espontânea a Ot-cetoglutarato.
A G L D está a u m e n t a d a n o soro de pacientes c o m d a n o
hepatocelular, oferecendo u m diagnóstico d i f e r e n c i a l p o t e n c i a l
na investigação de doença hepática, p a r t i c u l a r m e n t e q u a n d o
i n t e r p r e t a d a em c o n j u n t o c o m outros resultados de exames enzi-
máticos. A chave para esse diagnóstico d i f e r e n c i a l p o t e n c i a l é
encontrada na d i s t r i b u i ç ã o intra-órgão e intracelular da enzima.
C o m o u m a enzima exclusivamente m i t o c o n d r i a l , a G L D é libe-
rada de células necróticas e é de v a l o r na estimativa da gravidade
do d a n o à célula hepática.
A atividade de G L D n o soro é estável a 4 ° C por 48 horas e
a - 2 0 a C p o r várias semanas. O s l i m i t e s de referência superiores
para G L D são 6 U / L (mulheres) e 8 U / L (homens), q u a n d o u m
m é t o d o o t i m i z a d o a 37 ° C é usado. 2
ENZIMAS PANCREÁTICAS
Os ensaios de (1) amilase ( A M Y ) , (2) lípase (LPS), (3) t r i p s i n a
( T R Y ) , (4) q u i m i o t r i p s i n a ( C H Y ) e (5) elastase 1 ( E l ) n o soro são
aplicados para a investigação de doença pancreática. A f u n ç ã o
pancreática e a patologia são discutidas n o C a p í t u l o 37.
Amilase
A alfa-amdase ( E C 3.2.1.1; 1,4-a-D-glucano glucano-hidrolase;
A M L ) é u m a enzima da classe hidrolase que catalisa a h i d r ó l i s e
de ligações 1,4-oc-glicosídicas e m polissacarídeos. T a n t o os poligli-
canos de cadeia reta (amilose) q u a n t o os poliglicanos ramificados
( a m i l o p e c t i n a e glicogênio) são hidrolisados, mas em velocidades
diferentes. A e m i m a não ataca as ligações a-1,6 nos pontos de
ramificação. As A M Y são metaloenzimas de cálcio, c o m o cálcio
a b s o l u t a m e n t e necessário para a integridade f u n c i o n a l . Entre-
tanto, a atividade c o m p l e t a só é exibida na presença de vários
ânions — tais c o m o (1) cloreto, (2) b r o m e t o , (3) n i t r a t o , (4) colato
o u (5) fosfato m o n o - h i d r o g ê n i o — c o m o cloreto e o b r o m e t o
sendo os ativadores mais efetivos. A A M Y n o soro h u m a n o t e m
u m p H ó t i m o m o d e r a d a m e n t e estreito de 6,9 a 7,0.
Bioquímica
A s A M Y s de ocorrência n a t u r a l n o plasma h u m a n o são molécu-
las pequenas c o m pesos moleculares v a r i a n d o de 5 4 a 6 2 k D a . A
enzima é, p o r t a n t o , pequena o suficiente para passar através dos
g l o m é i u l o s renais, e a A M Y é a única enzima plasmática fisiolo-
gicamente e n c o n t r a d a na u r i n a . A A M Y está presente em vários
órgãos e tecidos. A m a i o r concentração está presente nas glându-
las salivares, as quais secretam u m a A M Y p o t e n t e ( t i p o S) para
iniciar a hidrólise de amidos e n q u a n t o a c o m i d a ainda está na
boca e n o esôfago. N o pâncreas, a enzima ( t i p o P) é sintetizada
pelas células acinares e então secretada n o trato i nt est i nal p o r
m e i o do sistema d o dueto pancreático, A atividade de A M Y é
t a m b é m encontrada e m extratos de (1) sémen, (2) testículos, (3)
ovários, (4) tubas uterinas, (5) m ú s c u l o estriado, (6) p u l m õ e s e
(7) tecido adiposo. A enzima t a m b é m é encontrada (8) n o colos-
tro, (9) nas lágrimas e (10) n o leite. A l g u n s tumores de p u l m ã o
e ovário p o d e m t a m b é m c o n t e r atividade de A M Y considerável.
Os l í q u i d o s ascítico e p l e u r a l p o d e m conteT A M Y c o m o resultado
da presença de u m t u m o r o u pancreatite.
A atividade de A M Y presente n o soro n o r m a l e na u r i n a t e m
origens pancreática (P-AMY) e da glândula salivar ( S - A M Y ) . Essas
isoenzimas são p r o d u t o s de dois loei i n t i m a m e n t e ligados n o
c r o m o s s o m o 1. As isoenzimas de A M Y t a m b é m sofrem m o d i f i -
cações pós-traducionais de desaminação, glicosilação e desglico-
silação para f o r m a r várias isoformas. Essas isoformas t ê m sido
separadas n o soro e na u r i n a c o m o uso de focalização isoelétrica
o u eletroforese.
Significado Clínico
A atividade de A M Y n o sangue é fisiologicamente baixa e cons-
tante e a u m e n t a m u i t o na pancreatite aguda e na i n f l a m a ç ã o da
g l â n d u l a salivar. N a pancreatite aguda, u m a u m e n t o na atividade
sérica de A M Y ocorre d e n t r o de 5 a 8 horas do aparecimento de
sintomas. As atividades r e t o r n a m ao n o r m a l pelo terceiro o u
q u a r t o dia. U m a elevação na atividade de A M Y de q u a t r o a seis
vezes acima d o l i m i t e de referência superior é h a b i t u a l , c o m a
concentração m á x i m a atingida de 12 a 72 horas. A m a g n i t u d e
da elevação na atividade da enzima sérica não está relacionada à
gravidade d o e n v o l v i m e n t o pancreático; entret ant o, q u a n t o
m a i o r f o r o a u m e n t o , m a i o r a p r o b a b i l i d a d e de pancreatite
aguda. A especificidade clínica da A M Y p a i a o diagnóstico de
pancreatite aguda é, entretanto, baixa ( 2 0 % a 6 0 % , d e p e n d e n d o
da m i s t u r a da população de pacientes estudada) p o r q u e valores
aumentados são t a m b é m encontrados e m várias desordens intra-
a b d o m i n a i s agudas e em diversas condicões extra-hepáticas
(Tabela 19-5).
Doenças do trato biliar, tais c o m o colecistite, causam eleva-
ções de até q u a t r o vezes da atividade sérica de A M Y c o m o u m
resultado d o e n v o l v i m e n t o pancreático p r i m á r i o o u secundário.
V á r i o s eventos intra-abdominais t ê m resultado em u m a u m e n t o
significante nas atividades séricas de A M Y de até q u a t r o vezes e
algumas vezes maior. Tais a u m e n t o s p o d e m ser decorrentes de
d e r r a m a m e n t o de P - A M Y d o i n t e s t i n o na cavidade p e r i t o n e a l e
então na circulação. T e m sido relatado q u e a p e r i t o n i t e e a apen-
d i c i t e aguda p r o d u z e m u m a elevação leve (de até duas o u três
vezes) da atividade sérica de A M Y . N a insuficiência renal, a ati-
vidade sérica de A M Y está a u m e n t a d a e m p r o p o r ç ã o à extensão
da afecção renal ( h a b i t u a l m e n t e , não mais do que cinco vezes o
l i m i t e de referência superior). A hiperamilasemia p o d e t a m b é m
ocorrer nas doenças neoplásicas c o m elevações tão altas q u a n t o
 Enzimas CAPÍTULO 19 341

TABELA 1 9 - 5 Causas de Hiperamilasemia ras n o exame de A M Y t e m m e l h o r a d o a estequiometria da reação

Doença pancreática
Doenças intra-abdominais
que não pancreatite
Doença genitourinária
e levado a condições de h i d r ó l i s e mais controladas e consistentes.
Pancreatite, qualquer causa (P-AMYt)*
Os substratos usados i n c l u e m oligossacarideos pequenos, tais
Trauma pancreático (P-AMYt)
c o m o m a l t o p e n t o s e e maltotetrose.
Doença do trato bilrar (P-AMYt)
Obstrução intestinal (P-AMYt)
infarto do mesentério (P-AMYt) w í. ix-iimnrue
Maltopentose »- malroinose + mal tose
Úlcera péptica perfurada (P-AMYt)
Gastrite, duodenite (P-AMYt) Matotiiose + maltose O^lícosidaK—>- 5 olice
Aneurisma aórtico roto
HoMuiruiK
Apendicite aguda Glicose + ATP G-6-P + ADP
Peritonite
G-Ó-P desidmeencise
Trauma G-6-P+NAD 6-P-gliconolactotia
Gravidez ectópica tubária rota (S-AMYt) + NADH + H ®
Salpingite (S-AMYt)
Malignidade ovariana (S-AMYt) OU

Insuficiência renal (Mista) a-amilíue

Maltotetrose *• 2 maltose
Miscelânea Lesões da glândula salivar (S-AMYt)
Abuso alcoólico agudo (S-AMYt) Mflítosí fosfoTjlasí
Malrose + F, ~1 glicose +^lícosc-l-P
Cetoacidose diabética (S-AMYt)
Macroamilasemia (Mista) P Poí^DJ licom u Wí e
Glícose-1'P ^ Glicose-6-P
Choque séptico (S-ÀMYt)
Cirurgia cardíaca
ff, G-6-F desidrogenase
G-6-P +NAD *- 6-P-gliconolactona
Tumores (habitualmente S-AMYt)
+ NADH+H®
Drogas (habitualmente S-AMYt]

*Aã iscÉnzimaj írnsdomiTUintes são mostradas entre parênteses. P-AMYj pancreática;

São t a m b é m usados substratos que empregam o 4-NP-glicosí-
S-AMY, íflíiitíTí tniítú, -nenhuma
ou ambas as enj irmãs {iodem esmr presentes. deo. Esses substratos são preparados pela ligação de 4-NP ao
t e r m i n a l r e d u t o r de u m oligossacarideo d e f i n i d o .

a-âTniktt£
4-NP-(glicnse)i *- 4-NP-(glicostí),12 + (ghccise)5,4.

5 0 vezes o l i m i t e de referência superior. As lesões da g l â n d u l a OC^liCOsiíJiüíí

salivar causadas p o r (1) infecção, (2) irradiação, (3) obstrução, (4)
cirurgia e (5) t u m o r e s t ê m sido descritas c o m o pr odutor as de u m a
h i p e r a m i l a s e m i a d o t i p o S significante. A h i p e r a m i l a s e m i a pós-
operatória o c o r r e e m cerca de 2 0 % de todos os pacientes subme-
tidos a u m a a m p l a variedade de intervenções cirúrgicas, inclusive
p r o c e d i m e n t o s extra-abdominais. A u m e n t o s de cerca de q u a t r o
vezes o l i m i t e de referência superior são encontrados e m 8 0 %
dos pacientes c o m cetoacidose diabética. N a intoxicação alcoólica
aguda, cerca de 10% dos i n d i v í d u o s t ê m u m a elevação de três
vezes. F i n a l m e n t e , u m a a m p l a variedade de drogas precisa sempre
ser considerada c o m o causa provável de h i p e r a m i l a s e m i a .
As macToamilases estão algumas vezes presentes nos soros e
causam h i p e r a m i l a s e m i a ; essas são complexos entre A M Y (habi-
t u a l m e n t e d o t i p o S) e I g G o u I g A . Essas macroamilases não são
filtradas pelos glomérulos dos rins em v i r t u d e de seu grande
t a m a n h o ( m a i o r do que 2 0 0 k D a ) e são, p o r t a n t o , retidas n o
plasma, o n d e sua presença h a b i t u a l m e n t e a u m e n t a a atividade
de A M Y de duas a o i t o vezes a c i m a d o l i m i t e de referência supe-
rior. N e n h u m s i n t o m a c l í n i c o está h a b i t u a l m e n t e associado a
essa desordem.
Métodos de Análise para Atividade e Conteúdo de
isoenzimas
A atividade de A M Y e o c o n t e ú d o de isoenzimas são m e d i d o s
n o laboratório.
Dosagem da Atividade de AMY
H i s t o r i c a m e n t e , os métodos sacarogênico, amiloclástico e a m i d o
c r o m o l í t i c o são usados para a determinação da atividade de
A M Y . Esses ensaios t ê m sido agora substituídos por m é t o d o s que
usam substratos d e f i n i d o s c o m cadeias glicosil menores. O uso
de substratos de A M Y d e f i n i d o s e enzimas auxiliares e i n d i c a d o -
4-NP-(gli<wV„ 4-N P-(gl ícose)^
+ x-glicose + NP
Se o oligossarídeo for malto-heptose (G7), o substrato é então
4-NP-G7. C o m o i n d i c a d o , a A M Y quebra esse substrato para
p r o d u z i r oligossacarideos livres ( G 5 , G 4 e G 3 ) e 4-NP-G2, 4-NP-
G 3 e 4-NP-G4. N o ensaio o r i g i n a l , a h i d r ó l i s e c o m b i n a d a pela
A M Y na amostra e pela a-glicosidase ( E C 3.2.1.20; maltase)
reagente resulta e m mais do que 3 0 % d o p r o d u t o sendo N P livre.
O N P livre é detectado pela sua absorvância a 405 n m . Entre-
t a n t o , surgem problemas c o m o uso do ensaio de 4-NP-glicosídeo
n o que diz Tespeito à p o u c a estabilidade da m i s t m a de ensaio
reconstituída pela baixa h i d r ó l i s e d o 4-NP-glicosídeo pela a-gli-
cosidase. Esse efeito t e m sido r e d u z i d o pela ligação covalente de
u m g r u p o " b l o q u e a d o r " (isto é, u m g r u p o 4,6-etilideno [substrato
p r o t e g i d o pelo e t i h d e n o (EPS)]) ao t e r m i n a l não-redutor da molé-
cula. O substrato b l o q u e a d o t e m d e m o n s t r a d o u m padrão de
h i d r ó l i s e mais vantajoso e, p o r t a n t o , a liberação a u m e n t a d a de
4-NP. A I F C C tem o t i m i z a d o esse m é t o d o a 37 ° C e o t e m reco-
m e n d a d o c o m o u m p r o c e d i m e n t o de dosagem padrão para a
AMY.12
U m m é t o d o alternativo c o m base n o i n d i c a d o r 2-cloro-fi'
nitrofenol (CNP) usa 2-cloro-p-nítrofenil-a-D-maltotriosídeo
( C N P - G 3 ) c o m o substrato. Esse ensaio não requer glicosidases e
é considerado u m exame " d i r e t o " . Suas desvantagens i n c l u e m (1)
sua baixa velocidade de conversão do substrato comparada c o m
os ensaios G 7 ; (2) a variação na absortividade m o l a r do C N P
associada a variações n o p H , n a t e m p e r a t u r a e n o c o n t e ú d o
protéico e (3) a presença do ativador, t i o c i a n a t o de potássio,
causando mudanças alostéricas n a A M Y e i m p e d i n d o o uso de
a n t i c o r p o s para a determinação da P - A M Y .
342 PARTE IV Analitos

C o m exceção da h e p a r i n a , todos os anticoagulantes c o m u n s A atividade residual de A M Y de menos de 3 0 % n o sobrenadante

i n i b e m a atividade de A M Y p o r q u e q u e l a m Ca 2 + . P o r t a n t o os
ensaios de A M Y devem ser feitos s o m e n t e e m soro o u n o plasma
heparinizado A A M Y é m u i t o estável; a atividade é m a n t i d a
c o m p l e t a m e n t e d u r a n t e o a r m a z e n a m e n t o p o r 4 dias à tempera-
tura a m b i e n t e , 2 semanas a +4 ° C , 1 ano a - 2 5 ° C e 5 anos a
- 7 5 °C.
Os intervalos de referência para a A M Y d e p e n d e m d o
m é t o d o . U s a n d o ensaios confiáveis ao m é t o d o r e c o m e n d a d o
pela I F C C a 37 ° C , o i n t e r v a l o de referência sérico é de 37 a 107
U/L.
Dosagem das Isoenzimas de AMY
A falta de especificidade da dosagem de A M Y t o t a l t e m levado
ao interesse pela dosagem d i r e t a da P - A M Y e m vez da atividade
enzimática t o t a l para o diagnóstico diferencial de pacientes c o m
d o r a b d o m i n a l aguda. Os m é t o d o s para as isoenzimas de A M Y
c o m base e m (1) eíetroforese, (2) cromatografia de troca iônica,
(3) focalização isoelétrica, (4) i n i b i ç ã o seletiva de S - A M Y c o m
i n i b i d o r d o germe de t r i g o , (5) i m u n o p r e c i p i t a ç ã o p o r u m anti-
c o r p o m o n o c l o n a l e (6) i m u n o i n i b i ç ã o estão disponíveis. Entre-
t a n t o , s o m e n t e os m é t o d o s c o m base na i n i b i ç ã o seletiva de
isoenzimas p o r anticorpos m o n o c l o n a i s são c l i n i c a m e n t e úteis.
Por exemplo, u m ensaio c o m a n t i c o r p o m o n o c l o n a l d u p l o está
disponível c o m e r c i a l m e n t e e usa a ação sinérgica de dois anticor-
pos m o n o c l o n a i s i m u n o i n i b i t ó r i o s para S - A M Y . A p ó s a atividade
de S - A M Y estar i n i b i d a pela adição dos anticorpos, a atividade
de P - A M Y não i n i b i d a é dosada usando EPS-4-NP-G7 c o m o
substrato. Resultados de P - A M Y falso-positivos t a m b é m t ê m sido
descritos e m i n d i v í d u o s c o m macroamilasemia, nos quais a imu-
n o g l o b u l i n a complexada a formas de A M Y d i m i n u i o u a n u l a a
capacidade dos a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s i n c l u í d o s n o ensaio ini-
b i r e m eficientemente a S-AMY.
M e d i a n t e eletroforese, a m a c r o - A M Y f o r m a h a b i t u a l m e n t e
u m a b a n d a m i g r a t ó r i a a m p l a , claramente d i f e r e n t e das bandas
homogêneas q u e são produzidas pelas isoenzimas de A M Y pre-
sentes n o soro. Se a separação eletroforética não está disponível,
a precipitação d o m a c r o c o m p l e x o p o r u m a solução de polietile-
n o g l i c o l (PEG) 6 0 0 0 (240 g / L ) representa u m a boa alternativa.
é i n d i c a t i v a de m a c r o a m i l a s e m i a (Figura 19-5).
E m adultos saudáveis, a P - A M Y representa a p r o x i m a d a m e n t e
de 4 0 % a 5 0 % da atividade enzimática t o t a l n o soro. Usando-se
o m é t o d o de i m u n o i n i b i ç ã o a 37 ° C , o i n t e r v a l o de referência
para a atividade de P - A M Y nos soros de adultos é de 13 a 5 3
U / L . A p ó s o n a s c i m e n t o , a atividade sérica de S - A M Y a u m e n t a
u n i f o r m e m e n t e c o m a idade e alcança os valores de adultos aos
2 anos de idade. A atividade sérica de P - A M Y n ã o é demonstrá-
vel e m crianças mais jovens d o que 6 meses, mas a atividade
a u m e n t a l e n t a m e n t e a p a r t i r daí para alcançar os valores de
adultos aos 5 anos de idade, r e f l e t i n d o o d e s e n v o l v i m e n t o pós-
n a t a l da f u n ç ã o pancreática exócrina.
C o m a aplicação d e u m l i m i t e de decisão de u m a atividade
igual a três vezes o l i m i t e de referência superior, a especificidade
clínica de P - A M Y para o diagnóstico de pancreatite aguda é
> 9 0 % . 6 A sensibilidade na detecção t a r d i a dessa condição é
t a m b é m n o t a v e l m e n t e m e l h o r a d a c o m a P - A M Y . Os valores de
P - A M Y p e r m a n e c e m elevados e m 8 0 % dos pacientes c o m pan-
creatite n ã o c o m p l i c a d a 1 semana após o início, q u a n d o somente
3 0 % a i n d a m o s t r a m atividade de A M Y t o t a l a u m e n t a d a . Esse
a u m e n t o p r o l o n g a d o n a atividade de P - A M Y n o soro t a m b é m
t o m a r e d u n d a n t e a dosagem t r a d i c i o n a l da A M Y t o t a l na u r i n a ,
u m exame realizado p a i a alcançar m e l h o r sensibilidade diagnos-
tica na fase tardia da pancreatite.
U m a atividade d i m i n u í d a de A M P n o soro ( m e n o r d o que o
l i m i t e de referência i n f e r i o r ) i d e n t i f i c a pacientes c o m insuficiên-
cia pancreática e x ó c r i n a e esteatorréia e t o r n a os exames de
i n t u b a ç ã o para a f u n ç ã o pancreática desnecessários. Se, entre-
t a n t o , a P A M Y é n o r m a l , u m a f u n ç ã o pancreática reduzida não
pode ser excluída.
Lípase
A lípase h u m a n a ( E C 3.1.1.3; triacilglicerol acil-hidrolase; LPS) é
u m a glicoproteína de cadeia ú n i c a c o m u m peso m o l e c u l a r de
48 k D a e u m p o n t o isoelétrico de cerca de 5,8. O gene LPS reside
n o c r o m o s s o m o 10. Para atividade catalítica c o m p l e t a e m a i o r
especificidade, a presença de sais biliares e u m co-fator d e n o m i -
n a d o colípase, secretado pelo pâncreas, são necessários. A LPS é
u m a m o l é c u l a pequena e é f i l t r a d a atTavés dos gl omérul os. E
t o t a l m e n t e reabsorvida pelos túbulos renais, e n ã o é n o r m a l -
m e n t e detectada na' u r i n a .

Bioquímica
As lípases são definidas c o m o enzimas q u e h i d r o l i s a m ésteres de
glicerol de ácidos graxos de cadeia longa.

H2C-OFA(1) H 2 C—OH H 2 C—OH

HC—OFA(2) H(T—OFA(2) H^—OFA(2X
HJO | H,0 I
H2C-OFA<3) OHQ HJC—OFA(3) N U Q0 —OH
OH
Triglicciídco a.,p-Diglicerideü + P-Monoglicerideo * ,
AG(L)OH AG (3) OH
(Acidei graxo I) (Acido graxo III)

Í5úmeTÍ£flÇf3o
/
HIC—OH H 2 C—OH
HÍ—OH *Lípase HÍ—OH
I H-,0 |
H,C—OH
-—OH H,C—IOFA(2)
OH

M M P/S M M Glicerol + a-Monoglicerideo

A G ( 2 ) O H (Ácido
graxo II)

Figura 19-5 Demonstração de macroamilasemia por solução de S o m e n t e as ligações ésteres nos carbonos 1 e 3 (posições a )
polietilenoglicol (PEG) 6000. são atacadas, e os p r o d u t o s da reação são 2 moles de ácidos graxos

e 1 m o l de 2-acilglicerol (J3-monoglicerídeo) por m o l de substrato.
O ú l t i m o é resistente à hidrólise, provavelmente em v i r t u d e da
restrição estérica, mas ele irá isomerizar espontaneamente à
forma a (3-acilgIicerol). Essa isomerização permite que o terceiro
ácido graxo seja retirado em uma velocidade m u i t o menor. A LSP
age somente quando o substrato está presente em u m a f o r m a
emulsificada na interface entre a água e o substrato. A velocidade
de ação da LPS depende da área de superfície do substrato dis-
perso. Os ácidos biliares garantem que a superfície do substrato
disperso permaneça livre de outras proteínas, inclusive as enzimas
lipoliticas, pelo revestimento da superfície do substrato insolúvel
e pelo meio aquosa.
A maior parte da atividade de LPS encontrada no soro é
derivada do pâncreas, mas alguma parte também é secietada
pelas mucosas gástrica e intestinal. A concentração de LPS no
pâncreas é de cerca de 9.000 vezes maior do que em qualquer
outro tecido, e o gradiente de concentração entre o pâncreas e o
soro é de -"20.000 vezes. A ausência completa de LPS tem sido
descrita. Tal ausência congênita resulta em má absorção de
gordura e esteatorréia grave.
Significado Clínico
A dosagem de LPS n o soro é usada para diagnosticar pancreatite
aguda. A sensibilidade clínica é de 8 0 % a 100%, dependendo do
l i m i t e de corte diagnóstico selecionado. A especificidade clínica
é de 8 0 % a 100%, dependendo da mistura da população estu-
dada. Após u m ataque de pancreatite aguda, a atividade sérica
de LPS (1) aumenta dentro de 4 a 8 horas, (2) chega a u m
máximo em 24 horas e (3) d i m i n u i ao longo de 8 a 14 dias. As
concentrações freqüentemente permanecem elevadas por mais
tempo do que aquelas de A M Y . As elevações entre duas e 50 vezes
o limite de referência superior têm sido descritas. O aumento na
atividade sérica de LPS não é necessariamente proporcional à
gravidade do ataque.
Ocasionalmente a pancreatite aguda é difícil de diagnosticar
p o i q u e ela precisa ser diferenciada de outras desordens intra-
abdominais agudas com achados clínicos similares, tais como (1)
úlcera gástrica o u duodenal perfurada, (2) obstrução intestinal
o u (3) obstrução vascular mesentérica. N o diagnóstico diferen-
cial, a elevação de LPS sérica maior do que cinco vezes o l i m i t e
de referência superior é u m achado diagnóstico mais específico
do que os aumentos na atividade sérica de A M Y .
Doenças do trato biliar, tais como colecistite aguda, p o d e m
causar u m aumento na atividade sérica de LPS. A obstrução do
dueto pancreático por u m cálculo o u por carcinoma do pâncreas
o u a investigação do trato biliar pela pancieatografia retrógrada
endoscópica pode também aumentar a atividade sérica de LPS.
Finalmente, em pacientes com uma velocidade de filtração glo-
merular reduzida, a atividade sérica de LPS está aumentada.
Portanto, deve-se tomar cuidado na interpretação de valores de
LPS séricos elevados na presença de insuficiência renal.
Métodos de Análise
M u i t o s métodos para LPS t ê m sido descritos; eles têm usado
substratos tanto triglicerídeos quanto não-triglicerídeos e técnicas
{1) titrimétricas, (2) turbidimétricas, (3) espectrofométricas, (4)
fluorimétricas e (5) imunológicas. E m geral, substratos triglicerí-
deos de cadeia longa (e alguns diglicerídeos) têm demonstrado
uma correlação de resultados com o estado clínico que é superior
àquele com os métodos que usam outros substratos.
Nos métodos titrimétricos, a LPS catalisa a hidrólise de ácidos
graxos em u m a emulsão de óleo de oliva o u de ácido oleico. Os
ácidos graxos liberados são titulados com u m álcali diluído. A
quantidade de álcali usada é registrada como uma função do
Enzimas CAPÍTULO 19 343
tempo e serve como uma medida do ácido graxo produzido
durante a reação. Esse método tem sido proposto como u m
procedimento de dosagem de referência.
N o método turbidimétrico, a LPS catalisa a hidrólise de
ácidos graxos em uma emulsão de ácido oléico com a d i m i n u i ç ã o
simultânea na turbidez da mistura de reação. A absorvância a
340 n m é lida e o A A / m i n , é tomado como uma medida da
atividade de LPS.
Vários substratos e sistemas complexos auxiliares e indicado-
res são usados nos métodos espectrofotométricôs. Por exemplo,
o l,2-0-dilauril-rac-glicero-3-ácido glutárico-(4-metil-resorufina)-éster
tem sido proposto para a dosagem da atividade de LPS.' A LPS
hidrolisa o substrato em u m m e i o alcalino a u m éster ácido
dicarbônico instável que se hidrolisa espontaneamente para gerar
ácido glutárico e metil-resorufina. Esta ú l t i m a é u m cromóforo
roxo azulado com pico de absorção a 580 n m .
H 2 D:—OFA(3) \
], 2-O-d il a uri1-iac-g] icero-3-á eido glutáiico(4-metil-
re soru fi n a)«s te r
H2C—OH
H(t—OFA(2)
H 2 d:—OFA(3)
Esfitin(<ÍTi£G
CHI
Giura rato
Vermelho, X = 580 nm
A velocidade de formação de metil-resorufina é diretamente
proporcional à atividade de LPS da amostra. O l i m i t e de referên-
cia superior é de 38 U / L a 37 °C. A atividade de LPS n o soro é
estável à temperatura ambiente p o r 1 semana; os soros podem
ser armazenados por 3 semanas n o refrigerador e por vários anos
se congelados.
Tripsina
A tripsina (EC 3.4.21.4; sem n o m e sistemático) é u m a serina
proteinase que hidrolisa ligações peptídicas formadas pelos
grupos caTboxila de lisina o u arginina com outros aminoácidos.
Os ésteres e as amidas que envolvem esses aminoácidos são cli-
vados mais rapidamente do que as ligações peptídicas.
Bioquímica
As células acinares do pâncreas h u m a n o sintetizam duas tripsinas
diferentes (1 e 2) na forma de proenzimas inativas (ou zimogê-
nios), tripsinogênios 1 e 2. Esses zimogênios são armazenados em
grânulos e secretados n o d u o d e n o sob o estímulo do nervo vago
ou do h o r m ô n i o intestinal colecistocinina-pancreozimina. O trip-
344 PARTE IV Analitos
sinogênio 1 está presente em cerca de quatro vezes a concentração
do tripsinogênio 2. N o trato intestinal, os tripsinogênios são
convertidos à enzima ativa T R Y pela enzima intestinal enteroqui-
nase ou pela T R Y pré-formada (autocatálise). Q u a n d o os tripsi-
nogênios são convertidos à T R Y ativa, u m pequeno peptídio é
clivado a partir da região N - t e r m i n a l do tripsinogênio (peptídio
de ativação do tripsinogênio ou TAP).
A TRY-1 é t a m b é m descrita como catiônica e a TRY-2 como
aniônica devido às suas mobilidades eletroforéticas diferentes.
TRY-1 e TRY-2 t ê m pesos moleculares de 25,8 e 22,9 k D a e
valores de p i de 4,6 a 6,5 e maior do que 6,5, respectivamente.
Os inibidores de T R Y — pclipeptidios pequenos, tais como a
ax-antitripsina ( i n i b i d o r de protease a-j) e oti-macroglobina — que
se c o m b i n a m irreversivelmente c o m T R Y e a inativam através do
bloqueio do centro ativo — estão presentes (1) n o suco pancreá-
tico, (2) no soro e (3) na urina. Esses inibidores protegem as
proteínas plasmáticas e outras contra a hidrólise pela T R Y e
outras proteases se qualquer quantidade apreciável de enzima
entrar no sistema vascular. A ausência de a^-antitripsina está
associada a uma tendência aumentada para o enfisema panlobu-
lar no início da vida; esse exemplo ilustra os efeitos de proteases
não-inibidas sobre a função do órgão.
Significado Clínica
E m indivíduos saudáveis, o tripsinogênio 1 livre é a p r i n c i p a l
forma encontrada no soro. A p ó s u m ataque de pancreatite aguda,
a TRY-1 sérica aumenta em paralelo c o m a atividade sérica de
A M Y para atingir valores de pico de 2 a 400 vezes o l i m i t e de
referência superior. E m comparação com as dosagens de P - A M Y
e LPS, TRY-1 é o exame mais difícil de se realizar, necessitando
de várias horas para se completar. C o m o não existe u m papel
d e f i n i d o da estimativa de T R Y na conduta de pacientes c o m
pancreatite aguda, esse exame é, porranto, considerado de valor
clinico l i m i t a d o . A TRY-1 no soro está elevada na falência renal
crônica, assim como a A M Y e a LPS séricas. Logo, a falência renal
precisa ser excluída na interpretação de concentrações elevadas.
Na pancreatite crônica sem esteatorréia, as concentrações
plasmáticas de TRY-1 não são diferences das normais. Q u a n d o a
esteatorréia está presente, entretanto, as concentrações em j e j u m
são m u i t o baixas. N a fase de recaída da pancreatite crônica, a
T R Y plasmática pode estar consideravelmente elevada. N o carci-
n o m a de pâncreas, as concentrações de T R Y podem estar altas,
normais ou até mesmo baixas. Na fibrose cística, as concentra-
ções plasmáticas de T R Y têm sido descritas como aumentadas
em neonatos. A medida que a doença progride, a concentração
cai. Amostras de sangue seco t ê m sido sugeridas para uso em
ensaios de rastreamento.
Métodos de Análise
Os estudos iniciais usavam ensaios catalíticos, mas logo percebeu-
se que outras enzimas proteolíticas presentes no soro poderiam
hidrolisar os mesmos substratos. O maior avanço tem sido o
desenvolvimento de imunoensaios para quantificar T R Y no
sangue. N o caso de TRY-1, os imunoensaios detectam (1) tripsi-
nogênio 1, (2) TRY-1 e (3) complexo TRY-1-ct ]-anti tripsina. Imu-
noensaios comerciais estão disponíveis. C o m o não existe padro-
nização de ensaio, os limites de referência são dependentes do
método.
Quimiotripsina
A q u i m i o t r i p s i n a (EC 3.4.21.1; sem nome sistemático; C H Y ) é
uma serina proteinase que hidrolisa ligações peptídicas que envol-
vem grupos carboxila de (1) T r p , (2) Leu, (3) Tyr o u (4) Phe, c o m
preferência pelos resíduos aromáticos.
As células acinares do pâncreas h u m a n o sintetizam duas qui-
miotripsinas diferentes (1 e 2, a ú l t i m a sendo a espécie principal)
na forma de pró-enzimas inativas (ou zimogênios), quimiotripsi-
nogênio 1 e 2. Esses zimogênios são armazenados em grânulos e
são secretados como q u i m i o t r i p s i n o g ê n i o no dueto pancreático.
N o trato intestinal, os quimiotripsinogênios são convertidos a
C H Y pela ação da TRY. A C H Y é mais resistente do que a T R Y
à degradação no intestino; é, p o r t a n t o , a enzima de escolha para
o ensaio em fezes (a atividade de C H Y nas fezes permanece
constante à temperatura ambiente pOT até 7 dias). O peso mole-
cular das duas formas é aproximadamente 25 k D a . A C H Y , como
a TRY, é ligada no plasma pela a i - a n t i t r i p s i n a e pela a 2 -macro-
globina.
A p r i n c i p a l aplicação dos ensaios que medem a atividade de
C H Y nas fezes é a investigação da insuficiência pancreática
crônica. A C H Y nas fezes está freqüentemente reduzida a menos
do que o limite de referência inferior (12 U / g de fezes) nos indi-
víduos que desenvolvem esteatorréia, mas não é ú t i l na identifi-
cação de indivíduos com insuficiência pancreática precoce. As
dosagens de C H Y em pacientes com insuficiência pancreática
crônica tratados com suplemento oral de enzimas pancreáticas
podem indicar se a terapia está adequada ou se é necessária uma
suplementação aumentada.
Elastase-1
A elastase-1 pancreática h u m a n a (EC 3.4.21.36; sem n o m e siste-
mático; E l ) também é uma serina protease. Ela é uma carboxien-
dopeptidase que catalisa a hidrólise de elastina nativa, a principal
proteína fibrosa estrutural no tecido conjuntivo, com afinidade
especial pelo grupo carboxila de A l a , Val e Leu.
A E l humana (peso molecular de cerca de 26 kDa) é sinteti-
zada pelas células acinares do pâncreas j u n t o de outras enzimas da
digestão. A enzima é sintetizada como uma pré-proelastase. Após
processamento à proelastase, ela é armazenada nos grânulos de
zimogênio e mais tarde é ativada a elastase pela T R Y no duodeno,
sofrendo degradação m í n i m a durante o trânsito intestinal.
A dosagem de E l nas fezes é o procedimento não invasivo
mais confiável e sensível para o diagnóstico de insuficiência pan-
creática crônica. Entretanto, tal exame não separa consistente-
mente os casos de insuficiência leve e moderada dos controles
saudáveis. Diferentemente da C H Y fecal, a E l não fornece infor-
mações úteis para á conduta terapêutica do paciente.
A enzima é estável em amostras de fezes por até 1 semana à
temperatura ambiente. O l i m i t e de referência inferior é de 200
|j.g/g de fezes.
OUTRAS ENZIMAS CLINICAMENTE
IMPORTANTES
A A C P e a glicose-6-fosfato desidrogenase ( G 6 P D ) são enzimas
que t a m b é m têm relevância clínica.
Fosfatase Ácida (Resistente ao Tartarato)
Sob o n o m e de fosfatase ácida (EC 3.1.3.2; ortofosfórico-mono-
éster fosfo-hidrolase [ótimo ácido]; ACP) estão incluídas todas as
fosfatases com atividade ó t i m a abaixo de p H 7,0. A A C P está
presente nos lisossomos, organelas presentes em todas as células
com a exceção possível dos eritrócitos. ACPs extralisossomais
t a m b é m estão presentes em muitas células. As maiores concen-
trações de atividade de A C P o c o r r e m (1) na próstata, (2) n o osso
(osteoclastos), (3) no baço, (4) nas plaquetas e (5) nos eritrócitos.
As enzimas lisossomal e prostática são fortemente inibidas pelos
íons tartarato dextrorrotatórios, enquanto as isoenzimas do eri-
trócito e do osso não são. A maior parte da atividade baixa de
A C P fisiológica do soro (não hemolisado) é do t i p o resistente ao
 Enzimas CAPÍTULO 19 345

tarrarato ( T R - A C P ) e provavelmente se o r i g i n a p r i n c i p a l m e n t e r TABELA 19-G | Classes de Gravidade da D e f i c i ê n c i a de

nos osteoclastos.
de Glicose-6-Fosfato Desidrogenase
Pelo menos q u a t r o genes d e t e r m i n a n t e s de A C P t ê m sido
(G6PD)
i d e n t i f i c a d o s e mapeados. O gene de A C P d o e r i t r ó c i t o está L
localizado n o c r o m o s s o m o 2 e é p o l i m ó r f i c o , e u m o u t r o gene Classe I Deficiência grave associada a anemia hemolítica
n o c r o m o s s o m o 19 codifica a T R - A C P expressa nos osteoclastos crônica
Classe II Deficiência grave (< 10% da atividade residual),
e outros macrófagos teciduais, tais c o m o os macrófagos alveolares
habitualmente sem anemia hemolítica crônica
e as células de K u p f f e r ( A C P t i p o 5). Os genes que c o d i f i c a m as
Classe III Deficiência moderada a leve (10% a 60% da atividade
A C P i n i b i d a s pelo tartarato lisossomal e prostática, mapeado nos
residual)
cromossomos 11 e 13, respectivamente, e x i b e m h o m o l o g i a con-
Classe IV Deficiência muito leve cu nenhuma deficiência
siderável.
Classe V Atividade aumentada (semente uma variante foi
As atividades de T R - A C P n o soro estão aumentadas fisiolo-
descrita, G6PD Heklcen)
gicamente e m crianças e m crescimento e patologicamente e m
condições de osteólise a u m e n t a d a e r e m o d e l a m e n t o ósseo. Ele-
vações n a atividade sérica de T R - A C P f r e q ü e n t e m e n t e o c o r r e m
(1) na doença de Paget, (2) n o b i p e r p a r a t i r e o i d i s m o c o m envol-
v i m e n t o esquelético e (3) na presença de invasão m a l i g n a dos
ossos p o r cânceres. A l t a s concentrações de T R - A C P n o soro
QUADRO 19-2 Síndromes Clínicas Associadas à Deficiência
de Glicose-6-Fasfato
desses pacientes r e f l e t e m a atividade osteoclástica a u m e n t a d a
apropriada, c o m o n o osso n o r m a l e m crescimento, o u malífica, Desidrogenase
c o m o na doença metastásica. Essa enzima é p o r t a n t o u m marca- Hemólise induzida por drogas
d o r p o t e n c i a l m e n t e ú t i l de condições c o m u m c o m p o n e n t e oste- Hemólise induzida por infecção
o l í t i c o notável. E n t r e t a n t o , a T R - A C P parece mostrar variações Favismo
Icterícia neonatal
d i n â m i c a s r e l a t i v a m e n t e pequenas e m comparação c o m outros
Anemia hemolítica não-esferocítica crônica
marcadores da reabsorção óssea (p. ex., aqueles relacionados ao
m e t a b o l i s m o d o colágeno t i p o I [ C a p í t u l o 38]). Isso pode ser
a t r i b u í d o ao fato de q u e a enzima é liberada n o m i c r o a m b i e n t e
d o osteoclasto e m vez de d i r e t a m e n t e na circulação.
A ú n i c a c o n d i ç ã o não-óssea na q u a l atividades elevadas de da doença é heterogênea, e cinco síndromes clínicas diferentes
T R A C P são encontradas n o soro é a doença de G a u c h e r d o t ê m sido reconhecidas ( Q u a d r o 19-2).
baço, u m a d e s o r d e m de armazenamento lisossomal. Suas fontes A m a i o r i a dos i n d i v í d u o s deficientes e m G 6 P D desenvolve
nessa doença são os macrófagos anormais n o baço e outros hemólise somente q u a n d o ocorre estresse oxidativo, c o m o nas
tecidos, os quais superexpressam esse c o n s t i t u i n t e macrofágico infecções e após a ingestão de certas drogas o u de feijão-de-fava.
n o r m a l . E m b o r a antes a m p l a m e n t e usada para detectar o u m o n i - Fora esses casos, eles h a b i t u a l m e n t e são assintomáticos. Entre-
torar o c a r c i n o m a de próstata, a d e t e r m i n a ç ã o da atividade de t a n t o , a deficiência de G 6 P D t a m b é m leva à hemólise c r ô n i c a de
A C P ( i n i b i d a p o r tartarato) n o soro agoTa é considerada obsoleta leve a grave, exarcebada pelo estresse oxidativo.
para esse p r o p ó s i t o e t e m sido substituída pelo antígeno prostá- O i n t e r v a l o de referência para G 6 P D nos eritrócitos é de 8
tico específico (PSA). Veja o C a p í t u l o 20. a 14 U / g de H b . Valores maiores d o que 18 U / g de H b são
As A C P são instáveis, especialmente e m temperaturas supe- f r e q ü e n t e m e n t e e n c o n t r a d o s e m q u a l q u e r c o n d i ç ã o associada
riores a 37 ° C e e m p H acima de 7,0. A acidificação da amostra c o m células sanguíneas vermelhas mais jovens d o q u e o n o r m a l
de soro a u m p H abaixo de 6,5 ajuda a estabilizar a atividade (como nas anemias hemolíticas n ã o devidas à deficiência e m
enzimática. As amostras de soro hemolisadas são c o n t a m i n a d a s G 6 P D ) , mas não são de significado clínico.
c o m q u a n t i d a d e s consideráveis de T R - A C P de e r i t r ó c i t o e devem
ser rejeitadas.

REFERENCIAS
Glicose-6-Fosfato Desidrogenase
A G 6 P D ( E C 1.1.1.49; D-glicose-6-fosfato: N A D P + óxido-redutase)
é expressa e m todas as células e catalisa a p r i m e i r a etapa n a via
da hexose m o n o f o s f a t o , a conversão de glicose-6-fosfato a 6-fosfo-
gluconato, g e r a n d o N A D P H . A enzima é u m d í m e r o ( p r e d o m i -
n a n t e m e n t e ) o u u m tetrâmero (dependente d o p H ) na f o r m a
ativa composta de subunidades idênticas, c o m 515 a m i n o á c i d o s
e pesando cerca de 59 k D a .
O gene que c o d i f i c a a G 6 P D está localizado n o c r o m o s s o m o
X . A deficiência e m G 6 P D é a e n z i m o p a t i a mais c o m u m , afe-
t a n d o 4 0 0 m i l h õ e s de pessoas ao r e d o r d o m u n d o . M a i s de 4 0 0
tipos diferentes de variantes de G 6 P D t ê m sido descritos, levando
a diferentes atividades enzimáticas associadas a u m a ampla faixa
de f e n ó t i p o s clínicos e b i o q u í m i c o s . As variantes são agrupadas
e m c i n c o categorias de acordo c o m a q u a n t i d a d e de atividade
enzimática e o f e n ó t i p o clínico (Tabela 19-6). A expressão clínica
1. Davis L, Britten JJ, Morgan M. Chnlinesterase: its significance in
anaesthetic practicc. Anaesthesia 1997;52:244-60.
2. Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie. Proposal of standard
mcrhods for the derermination of enzyme catalytic concentrai íons in
serum and plasma at 37 °C. III. Glutamate dehydrogenase (L-glutamate:
NAD(P) + oxidoreductase (deaminating), EC 1.41.3). EurJ Clin Chem
Clin Biochem 1992;30:493-502.
3. Mosca A, Bonora R, Ceriotti F, Franzini C, Lando G, Patrosso MC,
et al. Assay using succinyldithiocholine as substrate: rhe method of
choice for the measurement of cholinesteiase catalytic activity in
serum to diagnose succinylcholine sensitivity. Clin Chem Lab Víed
2003;41:317-22.
4 Panteghini M. Diagnostic application of CK-MB mass deteimination.
Clin Chim Acta 1998;272:23-31.
5. Panteghini M, Bonora R, Pagani F. Measurement of pancreatic lipase
activity in serum by a kinetic colorimetric assay using a new
chromogenic substrate. Ann Clin Biochem 2001;38:365-70.
346 PARTE IV Analitos
6. P a n t e g h i n i M , C e r i o t t i F, Pagani F, Secchiero S, Z a n i n o t t o M , F r a n z i n i
C , for the I t a l i a n Society o f C l i n i c a i B i o c h e m i s t r y a n d C l i n i c a i
M o l e c u l a r B i o l o g y ( S I B i o C ) W o r k i n g G r o u p o n Enzymes.
R e c o m m e n d a t i o n s f o r t h e r o u t i n e use o f p a n c r e a t i c amylase
m e a s u r e m e n t mstead o f t o t a l amylase f o r the diagnosis a n d m o n i t o r i n g
o f pancreatic pathology. C l i n C h e m Lab M e d 2002;40:97-100.
7. S c h u m a n n G , B o n o r a R , C e r i o t t i F, C l e r c - R e n a u d P, Ferrero C A , Férard
G , et al. I F C C p r i m a r y reference p r o c e d u r e s f o r t h e m e a s u r e m e n t o f
catalytic activity c o n c e n t r a t i o n s o f enzymes at 37 ° C . Part 2. Reference
p r o c e d u r e f o r t h e m e a s u r e m e n t o f catalytic c o n c e n t r a t i o n o f c r e a t i n e
kinase. C l i n C h e m L a b M e d 2 0 0 2 ; 4 0 : 6 3 5 - 4 2 .
8 S c h u m a n n G , B o n o r a R , C e r i o t t i F, C l e r c - R e n a u d P, Ferrero C A , FéTard
G , et al. I F C C p r i m a r y reference procedures for the m e a s u r e m e n t o f
catalytic activity c o n c e n t r a t i o n s o f enzymes at 37 ° C . Part 3. Reference
p r o c e d u r e f o r the m e a s u r e m e n t o f catalytic c o n c e n t r a t i o n o f lactate
dehydrogenase. C l i n C h e m L a b M e d 2 0 0 2 ; 4 0 : 6 4 3 - 8 .
9. S c h u m a n n G , B o n o r a R , C e r i o t t i F, C l e r c - R e n a u d P, Férard G ,
Ferrero C A , et al I F C C p r i m a r y reference p r o c e d u r e s for t h e
m e a s u r e m e n t o f catalytic activity c o n c e n t r a t i o n s o f enzymes at
37 ° C . Part 6. Reference p r o c e d u r e f o r the m e a s u r e m e n t o f catalytic
c o n c e n t r a t i o n o f y-glu t a m y l t r a n s fer a s e, C h n C h e m L a b M e d
2002,40.734-8
10. S c h u m a n n G , B o n o r a R , C e r i o t t i F, F é r a r d G , Ferrero C A , F r a n c k P F H ,
et al I F C C p r i m a r y reference procedures for the m e a s u r e m e n t o f catalytic
activity c o n c e n t r a t i o n s o f enzymes at 37 ° C . Part 4. Reference p r o c e d u r e
f o r t h e m e a s u r e m e n t o f catalytic c o n c e n t r a t i o n o f a l a n i n e
aminotransferase. C l i n C h e m L a b M e d 2002;40-718-24
11. S c h u m a n n G , B o n o r a R , C e r i o t t i F, F é r a r d G , Ferrero C A , F r a n c k P F H ,
et al I F C C p r i m a r y reference p r o c e d u r e s for the m e a s u r e m e n t o f catalytic
activity c o n c e n t r a t i o n s o f enzymes at 37 ° C . Part 5. Reference p r o c e d u r e
for t h e m e a s u r e m e n t o f catalytic c o n c e n t r a t i o n o f aspartate
aminotransferase. C l i n C h e m L a b M e d 2 0 0 2 ; 4 0 : 7 2 5 - 3 3 .
12 S c h u m a n n G , A o k i R, Ferrero C A , Ehlers G , Férard G , G e l l a FJ, et al.
I F C C p r i m a r y reference procedures f o r t h e m e a s u r e m e n t o f catalytic
activity c o n c e n t r a t i o n s o f enzymes at 37 ° C : Part 8. Reference p r o c e d u r e
for t h e m e a s u r e m e n t o f catalytic c o n c e n t r a t i o n o f a-amylase: [a-Amylase:
1,4-a-D-glucan 4-glucanohydrolase ( A M Y ) , E C 3.2.1.1], C l i n C h e m Lab
M e d 2006;44:1146-55.
CAP
TÍULO 2
Daniel W. Chan, Ph.D., D.A.B.C.C., F.A.C.B., Ronald A. Booth, Ph.D., F.C.A.C.B.,
e Eleftherios P. Diamandis, M.D., Ph.D., F.R.C.P.(C.)
OBJETIVOS
1. Definir os seguintes termos:
Câncer
Marcador tumoral
Antígeno oncofetal
Marcador de carboidrato
Oncogene
Gene supressor de tumor
Microarranjc
2. Descrever as propriedades de um marcador tumoral ideal.
3. Discutir o uso de valores de referência na detecção do câncer.
4. Discutir a aplicação clínica dos marcadores tumorais e seus usos
potenciais.
5. Descrever os usos clínicos do antígeno prostático-específico (PSA).
6. Listar pelo menos dois marcadores tumorais oncofetais e descrever
sua recomendação de uso na clínica.
7. Listar pelo menos dois marcadores tumorais de carboidrato, os
tipos de câncer que eles detectam e as doenças não-tumorais que
causam sua elevação.
8. Listar dois genes supressores de tumor e dois oncogenes, e
comparar a função celular dos genes supressores de tumor e dos
oncogenes.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A n t í g e n o O n c o f e t a l : Proteínas produzidas durante a fase fetal
cujas concentrações se t o r n a m baixas o u não detectáveis
após o nascimento. Elas reaparecem em algumas formas de
câncer por causa da reativação de u m gene nas células
malignas transformadas.
Câncer: U m crescimento relativamente a u t ô n o m o de tecido.
E s t a d i a m e n t o d o C â n c e r : O processo pelo qual o câncer é
d i v i d i d o em grupos de doença inicial e doença avançada;
ú t i l para o prognóstico e para orientar o tratamento.
Gene Supressor T u m o r a l : U m gene envolvido na regulação do
crescimento celular; a perda de u m gene supressor de
t u m o r tem o potencial de p e r m i t i r o crescimento
autônomo.
M a r c a d o r T u m o r a l : U m a substância produzida por u m tumor,
encontrada n o sangue, nos fluidos corporais ou nos
tecidos, e que pode ser usada para predizer a presença do
tumor, seu t a m a n h o e a resposta ao tratamento.
Marcadores T u m o r a i s de Carboidrato: Antígenos contendo
u m componente de carboidrato principal, geralmente
encontrados na superfície das células ou secretados pelas
células (p. ex., mucinas o u antígenos de grupos sanguíneos).
Microarranjo: U m pedaço pequeno de silicone, plástico ou
vidro, sobre cuja superfície foi construído u m arranjo
bidimensional, estruturado, de compartimentos que são
acessados por suas posições no arranjo (os compartimentos
p o d e m conter D N A , R N A , proteína, anticorpos ou
pequenos pedaços de tecido).
Marcadores Tumorais
Oncogene: U m gene celular m u t a d o n o r m a l (proto-oncogene)
que causa a transformação maligna de células normais
quando ativado.
Prognóstico? U m a predição dos futuros curso e conseqüência
da doença do paciente baseada nos indicadores atualmente
conhecidos (p. ex., idade, sexo, estágio do t u m o r ,
concentração do marcador t u m o r a l etc.).
S í n d r o m e Ectópica: Produção de u m h o r m ô n i o por tecido
t u m o r a l não-endócrino que n o r m a l m e n t e não produz o
h o r m ô n i o (p. ex., produção de A D H pelo carcinoma de
células pequenas de pulmão).
U
m marcador t u m o r a l é uma substância produzida por
u m t u m o r , o u pelo hospedeiro em resposta a u m tumor,
que é usada para diferenciar u m tecido tumoral do
n o r m a l ou para determinar a presença de u m t u m o r com base
em medidas no sangue ou em secreções. Tais substâncias são
encontradas em células, tecidos ou fluidos corporais e são
medidas qualitativa ou quantitativamente p o i métodos diagnós-
ticos químicos, imunológicos o u moleculares.
Morfologicamente, o tecido t u m o r a l tem sido reconhecido
pelos patologistas como mais parecido com o tecido fetal do que
com o tecido diferenciado de u m adulto normal. Os tumores são
classificados de acordo c o m seu grau de diferenciação como (1)
bem diferenciados, (2) pobremente diferenciados o u (3) anaplá-
sicos (sem forma). Os marcadores tumorais são as contrapartidas
bioquímicas ou imunológicas do estado de diferenciação do
t u m o r . E m geral, alguns marcadores tumorais representam a
reexpressão de substâncias produzidas n o r m a l m e n t e por u m
tecido embriogenicamente relacionado (Tabela 20-1).
Alguns marcadores tumorais são específicos para u m tipo de
câncer, enquanto outros são vistos em diversos tipos de câncer.
M u i t o s dos marcadores b e m conhecidos são observados tanto em
doenças não malignas quanto no câncer. Consequentemente,
estes marcadores de t u m o r não são diagnósticos para o câncer.
Entretanto, em muitos casos, as concentrações sanguíneas de
marcadores tumorais refletem a atividade e o volume do t u m o r .
Clinicamente, u m marcador t u m o r a l ideal deve ser específico
para u m dado tipo de câncer e sensível o bastante para detectar
tumores pequenos, para p e r m i t i r o diagnóstico precoce o u o seu
uso n o rastreamento. Infelizmente, poucos marcadores são espe-
cíficos para u m único t i p o de t u m o r (marcadores tumorais espe-
cíficos); a maioria é encontrada em diferentes tumores do mesmo
t i p o de tecido (marcadores tumorais associados). Eles estão pre-
sentes em quantidades maiores n o tecido t u m o r a l o u no sangue
de pacientes com câncer do que nos tumores benignos ou n o
sangue de indivíduos normais. N a prática, os marcadores t u m o -
rais são mais úteis na avaliação da progressão do estado da doença
após o tratamento inicial e n o m o n i t o r a m e n t o das modalidades
de tratamento subseqüente.
Este capítulo começa com discussões gerais sobre (1) câncer,
(2) o cenário histórico dos marcadores tumorais, (3) suas aplica-
348 PARTE IV Analitos
TABELA 20-1 "Níveis" de Expressão de Marcadores T u m o r a i s Associados ao D e s e n v o l v i m e n t o
P R O D U Ç Ã O D E M A R C A D O R E S T U M O R A I S POR D I V E R S O S T E C I D O S
Intimamente Relacionado
Marcador Produção Normal Embriagenicamente
CEA Cólon Estômago, fígado, pâncreas
AFP Fígado, saco vitelino Cólon, estômago, pâncreas
hCG Placenta Tumores germinativos
Serotonina Carcinóide enteroendócrino Ad renal
Modificado de Seíl S. Câncer Tjunkers. In: Moossa A R Schimpff SC, Rotaon M C , eds. Comprehenswe
1991-225-38.
C E A , Antígeno caránoembrioiuÍTio-, A F P , alfa-fetoproteína-, h C G , gonaàeimfina coriõnica
ções clínicas, (4) c o m o sua u t i l i d a d e é avaliada, (5) orientações
clínicas para seu uso e (6) c o m o eles são m e d i d o s . Diversos mar-
cadores t u m o r a i s c l i n i c a m e n t e relevantes de cada u m a dessas
categorias são, então, discutidos e m detalhe. Estes são agrupados
e m categorias gerais de enzimas, h o r m ô n i o s , antígenos oncofe-
tais, marcadores de c a r b o i d r a t o , antígenos de grupos sanguíneos,
proteínas, receptores o u genes. I n f o r m a ç õ e s mais detalhadas
sohre os marcadores t u m o r a i s a q u i discutidos e vários outros
marcadores p o d e m ser encontradas e m u m livro-texto de 2 0 0 2
sohre o assunto. 3
CÂNCER
N o s E U A , e m 2007, a estimativa de n ú m e r o de casos novos de
câncer, e x c l u i n d o o de pele, f o i 1,44 m i l h õ e s . O câncer de prós-
tata o c u p o u a p r i m e i r a posição, seguido pelos cânceres de
p u l m ã o , m a m a , cólon-reto e bexiga. O câncer é u m i m p o r t a n t e
p r o b l e m a de saúde p ú b l i c a nos Estados U n i d o s e e m outros
países desenvolvidos. A t u a l m e n t e , u m a e m q u a t r o mortes, nos
E U A , é devida ao câncer. Apesar d o e n o r m e e m p e n h o das pes-
quisas, a taxa de m o r t a l i d a d e g l o b a l p o r câncer não m u d o u sig-
n i f i c a t i v a m e n t e d u r a n t e os ú l t i m o s 4 0 anos. N o e n t a n t o , a ten-
dência de m o r t a l i d a d e p o r câncer varia c o m os diferentes tipos
de t u m o r . Redução significativa ( m a i o r que 15%) de m o r t a l i d a d e
f o i observada na doença de H o d g k m e nos cânceres de cérvice,
estômago e útero. Já os a u m e n t o s de m o r t a l i d a d e ( m a i o r que
15%) o c o r r e r a m n o câncer de p u l m ã o , n o m e l a n o m a , n o m i e l o m a
m ú l t i p l o e n o l i n f o m a n ã o - H o d g k i n . Essas tendências sustentam
a conclusão de q u e detecção precoce e t r a t a m e n t o mais efetivo
c o m b i n a d o s c o m prevenção (p. ex., redução d o h á b i t o de f u m a r
e u m a dieta m e l h o r ) p o d e m reduzir consideravelmente a taxa de
m o r t a l i d a d e p o r câncer n o f u t u r o .
A d e f i n i ç ã o simples de câncer é " u m crescimento relativa-
m e n t e a u t ô n o m o de t e c i d o " . E n t e n d e r a causa d o crescimento
a u t ô n o m o e v i d e n t e m e n t e facilitaria a pesquisa de u m a cura;
e n t r e t a n t o , esta é u m a tarefa árdua u m a vez q u e cada t i p o de
cânceT t e m mecanismos celulares únicos e c o m u m e n t e m ú l t i p l o s
q u e levam ao crescimento a u t ô n o m o .
U m carcinógena é u m agente que causa câncer. Ele p o d e ser
físico (p. ex., radiação), q u í m i c o (p. ex., u m h i d r o c a r b o n e t o poli-
cíclico) o u b i o l ó g i c o (p. ex., u m vírus). A exposição a tais agentes
p o d e causar câncer pela p r o d u ç ã o d i r e t a de efeitos genotôxicos
sobre o ácido d e s o x i r r i b o n u c l é i c o ( D N A ) (p. ex., c o m a radiação)
n u pelo a u m e n t o da proliferação celular (p. ex., p o r u m h o r m ô -
nio), o u ambos (p. ex. através d o uso de tabaco).
Avanços n a genética molecular têm proporcionado um
m e l h o r e n t e n d i m e n t o da carcinogênese h u m a n a . A proliferação
de células n o r m a i s é regulada p o r oncogenes p r o m o t o r e s de
crescimento e compensada p o r genes supressores de t u m o r que
r e s t r i n g e m o crescimento. O d e s e n v o l v i m e n t o d o câncer parece
Remotamente
Relacionado Não Relacionado
Pulmão, mama Lintoma
Pulmão
Fígado Pulmão epídármicG
Célula pequena, pulmão Pulmão epidérmico
i
textbook of oncologj, 2™ ed, V o l 1. fia In more: W i l l i o m j & Wilkíns,
humana.
envolver a ativação o u a expressão alterada de oncogenes o u a
perda o u a inativação de u m gene supressor de t u m o r .
A detecção precoce de câncer oferece m a i o r chance de cura.
O o b j e t i v o é diagnosticar o câncer q u a n d o u m t u m o r a i n d a é
p e q u e n o o bastante para ser c o m p l e t a m e n t e r e m o v i d o cirurgica-
mente. I n f e l i z m e n t e , a m a i o r i a dos cânceres não p r o d u z s i n t o m a
até os t u m o r e s estarem m u i t o grandes para serem removidos
c i r u r g i c a m e n t e o u até que as células malignas já t e n h a m se dis-
s e m i n a d o para outros tecidos (metastizado).
E m b o r a outros m o d o s de t r a t a m e n t o , tais c o m o a admi ni s-
tração de toxinas químicas o u irradiação, sejam f r e q ü e n t e m e n t e
efetivos n a destruição d a m a i o r i a das células t u m o r a i s , eles geral-
m e n t e n ã o são curativos. As poucas células malignas residuais e
viáveis são capazes de proliferar, desenvolver resistência ao trata-
m e n t o posterior e, eventualmente, causar a m o r t e d o paciente.
PASSADO, PRESENTE E FUTURO DOS
MARCADORES TUMORAIS
O p r i m e i r o m a r c a d o r t u m o r a l descrito f o i a p r o t e í n a Bence
Jones. Desde a sua descoberta, e m 1847, p o r precipitação de u m a
p r o t e í n a n a u r i n a acidificada e fervida, a dosagem da p r o t e í n a
Bence Jones tem sido u m teste diagnóstico para o m i e l o m a m ú l -
t i p l o ( u m t u m o r de células plasmáticas). M a i s de 100 anos após
a sua descoberta, os estudos, ganhadores d o P r ê m i o N o b e l , de
Porter e de E d e l m a n e P o u l i k , i d e n t i f i c a r a m a p r o t e í n a Bence
Jones c o m o a cadeia leve m o n o c l o n a l de i m u n o g l o b u l i n a secre-
tada p o r células plasmáticas malignas. PaTaproteínas m o n o c l o -
nais aparecem c o m o bandas intensas n a área das g l o b u l i n a s nos
padrões eletroforéticos d o soro. O diagnóstico d o m i e l o m a m ú l -
t i p l o é f r e q ü e n t e m e n t e feibo c o m base neste achado o u na pre-
sença de u m a concentração elevada de i m u n o g l o b u l i n a " m o n o -
c l o n a l " n o soro.
A segunda era dos marcadores t u m o r a i s , de 1928 a 1963,
i n c l u i u a descoberta de h o r m ô n i o s , enzimas, isoenzimas e proteí-
nas, e suas aplicações para o diagnóstico d o câncer e o começo
da análise cromossômica de t u m o r e s . O c a s i o n a l m e n t e , tais mar-
cadores f o r a m úteis n o diagnóstico de t u m o r e s i n d i v i d u a i s , mas
a aplicação geral dos marcadores t u m o r a i s para o m o n i t o r a m e n t o
de pacientes c o m câncer n ã o c o m e ç o u até a terceira era, c o m a
descoberta da alfa-fetoproteína (AFP), e m 1963, e o antígeno
c a r c i n o e m b r i o n ã r í o ( C E A ) , e m 1965. A p r o d u ç ã o desses marca-
dores d u r a n t e o d e s e n v o l v i m e n t o fetal e nos t u m o r e s levou ao
uso d o t e r m o marcadores tumorais associados ao desenvolvimento.
A quarta era c o m e ç o u e m 1975 c o m o desenvolvimento de
anticorpos m o n o c l o n a i s e seu uso subseqüente para detectar antí-
genos oncofetais e antígenos derivados de linhagens de célula
t u m o r a l . C o m o exemplo, podem-se citar os antígenos de carboi-
drato, tais c o m o C A 125, C A 15-3 e C A 27.29. Avanços na gené-

tica molecular, usando sondas moleculares e anticorpos m o n o c l o -
nais para detectar alterações em cromossomos o u proteínas,
i n c l u i n d o o estudo de oncogenes, genes supressores e genes envol-
vidos no reparo do D N A , t ê m levado ao r á p i d o e n t e n d i m e n t o e
uso de marcadores t u m o r a i s e m nível molecular. Estes marcadores
estão se t o r n a n d o cada vez mais úteis em nível celular. Por exemplo,
o oncogene ms m u t a d o p o d e ser detectado n o D N A celular libe-
rado n o material fecal e, p o r t a n t o , pode ser usado para diagnosti-
car câncer de cólon. A descoberta de genes de suscetibilidade ao
câncer de mama, B i í C A J e BRCA2, t e m levado ao rastreamento
de câncer de m a m a familiar em indivíduos de alto risco.
Neste i n í c i o do século X X I , novas tecnologias estão sendo
aplicadas para a descoberta de marcadores t u m o r a i s e suas apli-
cações clínicas. D e n t r e elas, é notável a i n t r o d u ç ã o das tecnolo-
gias de genômica e p r o t e õ m i c a , tais c o m o a m e d i d a de D N A
c o m p l e m e n t a r ( c D N A ) , microarranjos de proteína e tecido, e o
uso de espectrometria de massa, c o m o u m a f e r r a m e n t a de diag-
nóstico. A l é m disso, o advento de técnicas de b i o i n f o r m á t i c a ,
i n c l u i n d o redes neurais, regressão logística, m á q u i n a de vetor
s u p o r t e e outros algoritmos, está f a c i l i t a n d o o uso de análise
m u l t i p a r a m é t r i c a (analito m ú l t i p l o ) para o diagnóstico de câncer,
p r o g n ó s t i c o e predição de t r a t a m e n t o .
APLICAÇÕES CLÍNICAS
O s usos potenciais dos marcadores t u m o r a i s estão resumidos na
Tabela 20-2. E m geral, os marcadores t u m o r a i s p o d e m ser usados
para diagnóstico, p r o g n ó s t i c o e m o n i t o r a m e n t o dos efeitos d o
t r a t a m e n t o e c o m o alvos de localização e terapia. D e m o d o ideal,
u m m a r c a d o r t u m o r a l deve ser p r o d u z i d o pelas células malignas
e ser detectável nos f l u i d o s corporais. Ele não deve estar presente
em pessoas saudáveis o u e m doenças benignas. A s s i m , ele p o d e
ser usado n o rastreamento da presença de câncer e m i n d i v í d u o s
assintomáticos na p o p u l a ç ã o geral, A m a i o r i a dos marcadores
t u m o r a i s está presente em tecidos n o r m a i s , b e n i g n o s e malignas
e não é específica o bastante para ser usado n o rastreamento d o
câncer. N o e n t a n t o , se a i n c i d ê n c i a de câncer é alta entre certas
populações, o rastreamento p o d e ser viável. U m e x e m p l o é o uso
de A F P n o rastreamento de c a r c i n o m a hepatocelular n a C h i n a
e n o Alasca. O antígeno prostático específico (PSA) t e m sido
usado j u n t a m e n t e c o m o exame retal d i g i t a l para a detecção
precoce de câncer de próstata. Por causa da elevação de PSA
sérico na hiperplasia prostática b e n i g n a ( B P H ) , a velocidade de
PSA e o PSA livre t ê m sido usados para m e l h o r a r a detecção de
câncer de próstata.
O estadiamento clínico do câncer (estadiamento do câncer) é
sustentado pela quantificação d o marcador (ou seja, a concentra-
ção sérica de alguns marcadores reflete a carga t u m o r a l ) . O valor
do marcador n o m o m e n t o do diagnóstico pode ser usado c o m o
u m i n d i c a d o r prognóstico de progressão da doença e sobrevida do
paciente. Isto é possível para u m paciente i n d i v i d u a l , mas as dife-
rentes concentrações dos marcadores produzidos p o r tumores dis-
tintos geralmente não p e r m i t e m determinar o prognóstico de u m
t u m o r a p a r t i r da concentração inicial. N o entanto, após o trata-
m e n t o inicial bem-sucedido, t a l c o m o cirurgia, o valor do marca-
dor deve d i m i n u i r . A taxa da d i m i n u i ç ã o pode ser predita usando
a meia-vida d o marcador. Se a meia-vida após o t r a t a m e n t o é mais
longa do que a meia-vida esperada, o tratamento não f o i b e m
sucedido na remoção d o t u m o r . A m a g n i t u d e da redução do mar-
cador pode, entretanto, refletir o grau do sucesso do tratamento
o u a extensão do e n v o l v i m e n t o da doença.
Detectar a recidiva do câncer p o d e ser ú t i l para i n i c i a r o
t r a t a m e n t o precoce o u a m u d a n ç a de terapia. Ensaios ultra-sen-
síveis de PSA p e r m i t e m a detecção mais precoce de câncer de
próstata após prostatectomia radical. T e m sido m o s t r a d o que o
Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 349
m a r c a d o r de câncer de m a m a C A 27.29 detecta doença recor-
rente antes de q u a l q u e r evidência clínica e m pacientes c o m
câncer de m a m a recebendo q u i m i o t e r a p i a adjuvante.
A m a i o r i a dos valores de m a r c a d o r t u m o r a l se correlaciona
c o m a eficiência do t r a t a m e n t o e as respostas à terapia. N o câncer
de mama, a concentração de marcadores, tais c o m o C A 15-3 o u
C A 27.29, m u d a c o m o t r a t a m e n t o e o resultado c l í n i c o d o
paciente. Os valores do m a r c a d o r geralmente a u m e n t a m c o m a
doença progressiva, d i m i n u e m c o m a remissão e não m u d a m
significativamente c o m a doença estável. A cinética do marcador
t u m o r a l n o m o n i t o r a m e n t o de câncer p o d e t a m b é m ser mais
complicada. Os valores de m a r c a d o r em resposta ao t r a t a m e n t o
p o d e m mostrar u m atraso i n i c i a l o u u m a u m e n t o paradoxal antes
de d e m o n s t r a r o padrão esperado de m u d a n ç a .
A l é m disso, os a n t i c o r p o s contra marcadores t u m o r a i s mar-
cados r a d i o ativamente são usados para localizar as massas t u m o -
rais ( r a d i o i m u n o c i n t i l o g r a f i a ) o u pata fornecer uma direção para
a n t i c o r p o s marcados para atacar o local do t u m o r . C o m o exem-
plos, pode-se citar o uso de a n t i c o r p o s marcados r a d i o a t i v a m e n t e
c o n t r a C E A , para localizar tumores de c ó l o n , e a aplicação de
a n t i c o r p o s marcados c o n t r a f e r r i t i n a , para t r a n s f o r m a r em alvo
o c a r c i n o m a hepatocelular. Esta abordagem é t a m b é m usada n o
t r a t a m e n t o p o r p e r m i t i r q u e o a n t i c o r p o se ligue aos epítopos d o
marcador t u m o r a l e m a t e as células malignas c o m a dose de
radioatividade.
AVALIAÇÃO DA UTILIDADE CLÍNICA
Para avaliar a u t i l i d a d e clínica de u m marcador de t u m o r , é
necessário estabelecer os valores de referência, calcular os valores
preditivos, avaliar a d i s t r i b u i ç ã o de valores d o marcador e deter-
m i n a r a f u n ç ã o dos valores n o gerenciamento da doença.
Valores de Referência
Os valores de referência de u m m a r c a d o r t u m o r a l são o b t i d o s de
u m a população saudável, preferencialmente c o m i n d i v í d u o s pare-
ados p o r idade e sexo. A d e t e r m i n a ç ã o dos valores de referência
é d e m o r a d a e requer u m a população saudável grande (n >120
indivíduos). 1 A análise estatística usando a m é d i a ± 2 de desvio-
padrão (SD) paTa u m a p o p u l a ç ã o c o m d i s t r i b u i ç ã o gaussiana
( n o r m a l ) é u m m é t o d o f r e q ü e n t e m e n t e usado. Para u m a distri-
buição não-gaussiana, o m é t o d o dos percentis é u m a abordagem
simples e f r e q ü e n t e m e n t e usada (para discussão a d i c i o n a l de
valores de referência, ver C a p í t u l o 14).
Os valores de referência d e t e r m i n a d o s usando i n d i v í d u o s
saudáveis desta f o r m a são aplicáveis a analitos c o m concentrações
fisiologicamente b e m definidas. Para testes c o m aplicações rela-
tivamente específicas, tal c o m o o uso de marcadores t u m o r a i s n o
diagnóstico e n o gerenciamento de câncer, u m l i m i t e de decisão
p o d e ser mais a p r o p r i a d o d o que o l i m i t e superior de u m a p o p u -
lação saudável. N a m a i o r i a dos casos, usar pacientes c o m doença
b e n i g n a c o m o o g r u p o de não-doentes é mais adequado d o que
usar u m a p o p u l a ç ã o saudável. O l i m i t e de decisão p o d e ser
d e t e r m i n a d o usando u m m o d e l o de valor p r e d i t i v o .
Modelo de Valor Preditivo
O m o d e l o de valor p r e d i t i v o i n c l u i a sensibilidade clínica, a
especificidade e o v a l o r p r e d i t i v o de u m teste. V a r i a n d o o l i m i t e
de decisão, a sensibilidade clínica e a especificidade se alterarão
em direções opostas.
U m a a b o r d a g e m ú t i l para avaliar testes m ú l t i p l o s para o
m e s m o a n a l i t o o u marcadores m ú l t i p l o s para o m e s m o t i p o de
câncer é a c u r v a característica de operação do receptor ( R O C )
(Silver e colaboradores 9 ). A curva R O C p o d e ser c o n s t r u í d a pela
p l o t a g e m de s e n s i b i l i d a d e versus 1 m e n o s a especificidade o u a
350 PARTE IV Analitos

TABELA 20-2 i Aplicações Atuais de Marcadores T u m o r a i s e suas L i m i t a ç õ e s

Utilidade
Aplicação Atual Comentários

Rastreamento de câncer
Diagnostico de câncer
Avaliação de prognóstico
do câncer
Predição de resposta
terapêutica
Estadiamento do tumor
Detecção de recorrência
do tumor ou remissão
Localização de tumor
e direcionamento
de agentes
radiaterapêuticos
Monitoramento da
eficiência da terapia
do câncer
Limitada 1. Para rastreamento, deve-se ter um marcador que é elevado rios estágios iniciais da doença, quando a
doença está localizada e é potencialmente curável A maioria dos marcadores de câncer circulantes (com
exceção do PSA) é notavelmente elevada nos estágios avançados da doença, Dessa torrna, a
sensibilidade do diagnóstico é geralmente baixa para a doença em seu estágio inicial
2. Com exceção do PSA, a maioria dos marcadores de câncer não é específica para um tecido em particular,
e as elevações podem ser devidas a doenças em outros tecidos, incluindo doenças benignas e
inflamatórias. Portanto a especificidade diagnostica pode ser baixa, levando a muitos faiso-positivos.
No rastreamento, existe a necessidade de um méiodo diagnóstico definitivo que irá separar os positivos
verdadeiros dos falso-positivos. Se esse procedimento é invasivo (p. ex., cirurgia) e/ou caro, os pacientes
não o aceitarão
3. O rastreamento, mesmo que efetivo para o diagnóstico inicial de câncer, deve demonstrar benefício para
a população rastreada em termos de sobrevivência ou de outras conseqüências clínicas
Limitada O mesmo que anteriormente. Baixas sensibilidade e especificidade diagnosticas. Entretanto, para subgrupos
selecionados de pacientes de alto risco, nos quais a probabilidade de câncer é elevada (alta prevalência),
a análise de marcador tumoral pode ajudar o médico a solicitar testes mais elaborados (p. ex., técnicas
de imagem ou investigações iaparoscópicas)
Limitada A maioria dos marcadores de câncer tem valor prognóstico, mas sua precisão não é boa o bastante para
garantir intervenções terapêuticas específicas. Por exemplo, níveis pré-operatórios mais altos de PSA
estão associados a penetração capsular, escore de Gleason elevado, margens cirúrgicas positivas e
estado dos linfonodos positivo, mas a decisão de tratar com dois diferentes métodos terapêuticos (p. ex.,
prostatectomia radical versus abordagens não cirúrgicas) não pode ser feita apenas com base nos dados
do marcador tumoral. O mesmo se aplica a muitos outros cânceres
Importante Apesar da importância de se usarem biomarcadores na predição de resposta a terapias específicas,
pouquíssimos marcadores conhecidos têm tal valor preditivo. Estes incluem os receptores de hormônio
esteróides, para predizer a resposta a antiestrógenos, e a amplificação de Her-2/neu, para predizer a
resposta à herceptina em pacientes com câncer de mama. Deve-se ter marcadores mais preditivos para
individualizar a terapia e maximizar a resposta clínica
Limitada O mesmo que para o prognóstico. Os dados não são hons o bastante para o estadiamento preciso a menos
que o valor reflita o volume do tumor
Controversa Apesar da importância de se usarem biomarcadores para detectar recidiva do câncer, os marcadores atuais
são limitados pelo seguinte
(a) O tempo do processo é curto (semanas a poucos meses) e não afeta significativamente o resultado,
mesmo que a terapia seja instituída mais cedo
|b) As terapias para o tratamento da doença recorrente não são efetivas no momento
(c) Em certos grupos de pacientes, os biomarcadores não são produzidos e não detectam recidivas
(d) Algumas vezes os biomarcadores fornecem informações equivocadas (p. ex., recidivas clínicas ocorrem
sem elevação do biDmarcador, ou o biomarcador é elevado de forma inespecífica, sem doença
progressiva, levando ao supertratamento ou à interrupção de um protocolo de tratamento atual e
hem-sucedido)
Limitada Somente alguns poucos biomarcadores se encontram disponíveis para esta aplicação e o sucesso é limitado
Importante Para pacientes com doença avançada, que são tratados com diversos métodos terapêuticos, é importante
saber se o tratamento funciona. A este respeito, os biomarcadores geralmente fornecem informação que
é prontamente interpretável, mais econômica, mais sensível e mais segura do que os procedimentos
radiológicos ou invasivos. Para certos cânceres, isto pode contrihuir para o registro aumentado de
pacientes em ensaios clínicos terapêuticos

Modificado de Didmaruiis EP Tumor markers: past, present, and future In. Di a inani is EP, Frttsch»- HA, Lijfi H, Cíifln DW Schumcs: MK. Tumor marlters: plr/siolog fmthcbiolo®,
technolngy, and clínica! ãpplica!ion. Washington, DC' AACC Press, 2002:5

t a x a d e p o s i t i v o s v e r d a d e i r o s versus a t a x a de falso-positivos. A Distribuição de Valores d o Marcador

vantagem da curva R O C é a representação do desempenho A aplicação do m o d e l o preditivo é difícil para analitos que n ã o
s o b r e a f a i x a i n t e i r a de l i m i t e s de d e c i s ã o . Pode-se a p o n t a r o constituem diagnóstico para u m a única doença. As concentra-
nível de decisão onde sensibilidade e especificidade ótimas ç õ e s d a m a i o r i a , se n ã o d e t o d o s os m a r c a d o r e s t u m o r a i s , s ã o
podem ser atingidas. Pela s o b r e p o s i ç ã o das c u r v a s R O C de e l e v a d a s e m m a i s d e u m a c o n d i ç ã o p a t o l ó g i c a . Q u a n d o se u s a i
vários marcadores, a m a i o r i a dos marcadores p r e d i t i v o s p o d e o m o d e l o p r e d i t i v o , é necessário selecionar u m a p o p u l a ç ã o q u e
ser s e l e c i o n a d a . A l g u n s e x e m p l o s são m o s t r a d o s nas Figuras i n c l u a g r u p o s c o m e s e m d o e n ç a . Q u a i s p a c i e n t e s d e v e m ser
20-1 e 20-2. incluídos nestes d o i s grupos? A d e c i s ã o d e v e ser b a s e a d a n a s
 Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 351

questões clinicas específicas. Se a questão se refere à sensibilidade

diagnostica de C E A para o carcinoma colorretal ativo, o grupo
de doentes deve i n c l u i r s o m e n t e pacientes c o m carcinoma color-
retal ativo. A seleção d o g r u p o de não-doentes é mais desafiadora.
Os i n d i v í d u o s saudáveis e aqueles c o m doenças benignas devem
ser incluídos? Se sim, q u a n t o s grupos de doença benigna devem
ser incluídos? Os pacientes e m remissão devem t a m b é m ser incluí-
dos p o r não t e r e m as doenças ativas? Os valores calculados de
05 PAPm
•o sensibilidade e especificidade d e p e n d e m m u i t o dos tipos de
uX grupos i n c l u í d o s e d o n ú m e r o de pacientes e m cada g r u p o .
A distribuição de valores de m a r c a d o r t u m o r a l é geralmente
ai mostrada c o m o a porcentagem de pacientes c o m valores elevados
CO
c o n f o r m e d e t e r m i n a d o usando vários valores de c o i t e dos grupos
saudáveis, benignos e cancerosos. Os critérios de estadiamento
internacional são usados para classificar pacientes com câncer, e
o diagnóstico é baseado nos achados patológicos. Os grupos são
selecionados a p a r t i r de experiências anteriores c o m marcadores
similares. U s a n d o o câncer de m a m a c o m o exemplo, as mulheres
normais são usadas c o m o a população saudável para efeito de
i
20 40 60 80 100 comparação. Os grupos c o m doenças iião-iiialigiias ou benignas
100 - Especificidade (%) são selecionados para i n c l u i r pessoas c o m as causas mais prováveis
de elevação d o marcador: doenças benignas de fígado e m a m a e
Figura 2 0 - 1 Curvas R O C para PSA, fosfatase ácida prostática por gravidez. Os grupos de câncer não m a m a metastático, usando
imunoensaio monoclonal (PAPm) e fosfatase ácida prostática enzimática carcinomas de e n d o m é t r i o , cólon, p u l m ã o , próstata e ovário, são
(PAPe). Os dados de 128 pacientes com doença prostática foram selecionados para mostrar a especificidade d o marcador. Evita-se
plotados com vários limites de decisão quantitativos (como indicado na agrupar todos os pacientes c o m câncer de m a m a e m u m a ú n i c a
figura) para cada ensaio. As unidades são p g / L para PAPm e PSA, e categoria p o r q u e a m a i o r i a dos marcadores é elevada n o câncer
U / L para PAPe. (De Rock RC, Chan DW, Bruzek DJ, et al. Evaluation de m a m a ativo. O g r u p o auxiliar consiste e m pacientes que não
of a monoclonal immunoradiometric assay for prostate-specific antigen. t i n h a m metástase, sofreram mastectomia e t r a t a m e n t o c o m qui-
Clin Chem 1987;33:2257-61.) mioterapia adjuvante, e n ã o t i n h a m evidência da doença. N ã o se
espera que o valor d o marcador seja elevado. O g r u p o c o m metás-
tase i n c l u i pacientes c o m remissão completa, remissão parcial o u
câncer de m a m a progressivo a c o m p a n h a d o por metástase local o u
distante. O g r u p o de câncer de m a m a progressivo tem a m a i o r
porcentagem de valores de marcador elevados. O grupo de remis-
são parcial t e m u m a porcentagem i n t e r m e d i á r i a de valores de
100
marcador elevados. O g r u p o de remissão completa tem a porcen-
tagem mais baixa de valores de marcador elevados.

Gerenciamento da Doença
A m a i o r i a dos marcadores t u m o r a i s é usada para m o n i t o r a r o
t r a t a m e n t o e a progressão d o câncer. Os marcadores p o d e m ser
usados para d e t e r m i n a r o sucesso d o t r a t a m e n t o inicial (p. ex.,
"O cirurgia o u radiação), detectar a recorrência de câncer e m o n i t o -
CD
rar a eficiência da m o d a l i d a d e de t r a t a m e n t o . Para m o n i t o r a r a
eficiência da terapia d o câncer, o valor d o m a r c a d o r deve aumen-
CU tar c o m a progressão d o câncer, d i m i n u i r c o m a regressão d o
cn
câncer, e não se alterar e m presença de doença estável. C o m o
t r a t a m e n t o p a r c i a l m e n t e bem-sucedido, o v a l o r do m a r c a d o r
p o d e não cair c o m a meia-vida n o r m a l . Ele p o d e cair para u m a
concentração estável que é m a i o r d o que o n o r m a l , ou p o d e cair
d e n t r o d o i n t e r v a l o de referência dos i n d i v í d u o s saudáveis. U m
a u m e n t o subseqüente d o v a l o r d o m a r c a d o r sugere recorrência
T d o câncer.
40 60 100 O W o r k i n g G r o u p o n T u m o r M a r k e r C r i teria da I n t e r n a t i o -
100 - Especificidade (%) n a l Society f o r O n c o d e v e l o p m e n t a l B i o l o g y a n d M e d i c i n e p u b l i -
c o u os seguintes critérios para a interpretação de alterações dos
Figura 2 0 - 2 R O C para CA 549 (kU/L) e CEA (jig/L). A valores de m a r c a d o r t u m o r a l 1 :
sensibilidade, a especificidade e a eficiência são baseadas no limite de • "Se n ã o f o r feito n e n h u m t r a t a m e n t o , pelo menos u m
decisão de CA 549 (11 kU/L) e CEA (5 fig/L). Os dados incluem a u m e n t o linear e m três amostras consecutivas ( o u seja,
pacientes com câncer de mama e doenças benignas de mama (331, para intervalos de t e m p o entre dois eventos consecutivos) e m
CA 549; 322, para CEA). Os valores de decisão são indicados na curva. u m a escala l o g a r í t m i c a deve ser registrado para
{De Chan DW, Beveiidge RA, Bruzek DJ, et al. Monitoring breast estabelecer u m a recidiva. Intervalos usuais p o d e m ser
câncer with CA 549. Clin Chem 1988;34:2000-4.) de três meses, mas eles são d e t e r m i n a d o s clinicamente.
352 PARTE IV Analitos
Após u m p r i m e i r o aumento, as amostras seguintes
devem ser obtidas após duas a quatro semanas,
independentemente do nível absoluto."
• Se for feito algum tratamento, as mudanças dos valores
do marcador devem refletir a progressão clínica da
doença. "Doença progressiva é definida por u m
aumento do nível do marcador de pelo menos 2 5 % . A
amostragem deve ser repetida dentro de duas a quatro
semanas para a evidência adicional. O intervalo da
amostragem durante a terapia pode depender do t i p o
de t u m o r e deve ser relacionada ao acompanhamento
clínico."
• U m a d i m i n u i ç ã o do valor do marcador de pelo menos
5 0 % é indicativo de remissão parcial " c o m o conceito
de que a carga t u m o r a l está relacionada a mudanças nos
níveis séricos do marcador de t u m o r . " O grupo de
trabalho t a m b é m estabeleceu u m parecer geral de que
" u m a remissão completa não pode ser determinada por
níveis d o marcador, mas se os níveis estiverem elevados,
a determinação clínica da remissão completa baseada
nos métodos convencionais deve ser considerada
incorreta a menos que seja dada uma explicação sobre o
nível elevado."
ORIENTAÇÕES CLÍNICAS
O diagnóstico e o estadiamento do câncer envolvem muitas
ferramentas, i n c l u i n d o exame físico, imagem e estudos laborato-
riais. A aplicação dessas ferramentas t e m resultado em m u i t o s
marcadores tumorais que são usados para rastreamento, diagnós-
tico, estadiamento e prognóstico, e para direcionar os tipos de
tratamento. Entretanto, n e m todos ns marcadores de t u m o r são
apropriados para todos os usos, e n e m todos os cânceres têm
marcadores estabelecidos. Dessa forma, cada t i p o de câncer e
cada marcador t u m o r a l devem ser corretamente avaliados para
uso, e os médicos devem ser instruídos sobre o uso correto dos
marcadores para conservar os recursos.
M u i t o s grupos internacionais têm liberado orientações sobre
a seleção e o uso de marcadores tumorais na clínica. Estes grupos
incluem a N a t i o n a l Academy o f Clinicai Biochemistry ( N A C B ) , o
European G r o u p o n T u m o r Markers ( E G T M ) , a A m e r i c a n Câncer
Society (ACS), a A m e r i c a n Society for Clinicai Oncology (ASCO),
e outros."3'12 Todos estes grupos são compostos por especialistas nas
áreas avaliadas, e muitos dos critérios são usados para consolidar
as recomendações, i n c l u i n d o o nível de evidência do marcador
tumoral (níveis I a V, com o nível I sendo dos ensaios clínicos
múltiplos aleatoriamente b e m desenhados e controlados) e o
sistema de graduação de utilidade do marcador ( T M U G S ) 3 . A
Tabela 20-3 resume as recomendações de muitos desses grupos.
METODOLOGIA ANALÍTICA
Os marcadores tumorais são medidos por uma variedade de
técnicas analíticas, i n c l u i n d o ensaio enzimático (Capítulos 9 e
19); imunoensaio (Capítulo 10); ensaio de receptor e técnicas
instrumentais, tais como cromatografia (Capítulo 7); eletroforese
(Capítulo 6); espectrometria de massa conectada a cromatógrafos
de l í q u i d o o u gás (Capítulo 8) e microarranjos (Capítulo 17). Os
detalhes dessas técnicas são encontrados nos capítulos indicados.
A q u i discutiremos mais minuciosamente sobre o uso de espec-
trometria e microarranjos para a análise de marcadores tumorais
protéicos e genéticos.
Espectrometria de Massa
A espectrometria de massa de moléculas pequenas tem sido usada
no laboratório clínico por mais de 40 anos. Entretanto, desenvol-
vimentos recentes têm p e r m i t i d o a identificação, por espectrome-
tria de massa, de compostos de alto peso molecular ( M W ) ,
i n c l u i n d o proteínas e ácidos nucléicos. As novas tecnologias de
ionização f o r a m reconhecidas pelo Prêmio N o b e l de Q u í m i c a em
2002. Estes avanços levaram a investigações usando a tecnologia
para o diagnóstico o u o prognóstico de câncer, ou para a desco-
berta de novos biomarcadores de câncer. E m uma abordagem,
soro o u outros fluidos de pacientes c o m câncer o u de controles
são tratados c o m várias superfícies absorventes, tais como chips de
troca tônica, hidrofóbicos ou de ligação ao metal. Após lavagem,
para retirada do excesso de proteínas, os chips são sujeitos à análise
de espectrometria de massa usando o método M A L D 1 (ionização/
dessorção por laser de matriz assistida) ou S E L D I (ionização/des-
sorção por laser realçado de superfície)-TOF (espectrometria de
massa por tempo de vôo). Esta análise gera muitos picos de diver-
sas razões massa/carga. C o m p a r a n d o esses padrões proteómicos
c o m os padrões obtidos a partir de amostras de indivíduos saudá-
veis, e usando métodos de bioinformática e computacionais sofis-
ticados, alguns pesquisadores t ê m tentado identificar padrões que
estejam associados ao câncer. Esta abordagem tem sido estudada
para o diagnóstico de cânceres de ovário, próstata, bexiga e muitos
outros. 3 As sensibilidades e especificidades diagnosticas descritas
desta tecnologia são impressionantes e superam aquelas obtidas
usando-se os biomarcadores de câncer atuais. N o entanto, este
método não foi ainda avaliado prospectivamente, e muitas des-
vantagens desta tecnologia t ê m sido identificadas. 5
A mesma tecnologia e os mesmos princípios estão t a m b é m
sendo usados para identificar novos biomarcadores de câncer.
A t é o m o m e n t o , muitas moléculas têm sido identificadas e estão
sob investigação para o uso clínico.
Microarranjos
U m m i c r o a r r a n j o é u m pequeno pedaço de silicone, plástico ou
vidro, em que foi produzido, sobre a superfície, u m arranjo bidi-
mensional, estruturado, de compartimentos que são acessados
por suas posições no arranjo. Estes compartimentos p o d e m
conter D N A , R N A , proteínas, anticorpos o u pequenos pedaços
de tecido. Microarranjos de oligonucleotídeos pequenos imobili-
zados (p. ex., os chips da A f f y m e t r í x ) , c D N A s de vários genes,
proteínas e anticorpos t ê m sido construídos. 6 Alguns chips contêm
mais de 20.000 a 40.000 elementos e, conseqüentemente, possi-
b i l i t a m a análise ampla do genoma em concentrações pequenas
de ácido ribonucléico mensageiro ( m R N A ) e proteína. As aplica-
ções de microarranjos i n c l u e m avaliação quantitativa de expres-
são gênica, detecção de mutações e polimorfismos, seqúencia-
mento de D N A e estudo de expressão de proteínas e de intera-
ções proteína-proteina. Algumas aplicações usam métodos semi-
auto matizados.
Estes dispositivos são t a m b é m usados para descobrir novos
candidatos a biomarcadores. U s a n d o a análise de microarranjo
de perfis de expressão gênica de tecidos tumorais e normais,
genes altamente superexpressos são identificados, Os genes iden-
tificados são então avaliados para uso como biomarcadores
potenciais de câncer.
U m a outra aplicação de microarranjos é na classificação de
cânceres baseada em seus perfis de expressão gênica. Existem
agora inúmeros exemplos de pesquisa de subclassificação de cân-
ceres de mama, ovário, próstata, cérebro, hematológicos e outros,
usando esta tecnologia. Para o câncer de mama, análise de micro-
arranjo de tecidos pode estratificar pacientes de acordo com o
prognóstico, e estas análises p o d e m ajudar na seleção de trata-
mento adjuvante. V a n de V i j v e r e colaboradores mostraram que
u m n ú m e r o relativamente pequeno de genes (cerca de 70) pode
ser usado para classificar pacientes em grupos de alto e baixo
 Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 353

TABELA 20-3 Resuma das Recomendações dos Principais Guias

Tipo de Câncer NACB ASCO ACS EGTM

Mama ER e PR em todos os cárceres.
CA 15-3/CA 27.29 para o
monitoramento de doença
avançada
t
Ovário CA 125 como uma ajuda
diagnostica e para
monitoramento de
tratamento
Próstata PSA com DRE. %fPSA
quando PSA está entre
4 e 10 ng/mL e ORE é
negativa
Células germinativas AFP, hCG, LD para detecção
e monitoramento de tumores
testiculares. AFP é diagnóstico
para NSGCT
Cólon CEA para monitoramento
de tratamento
Neuroendócrino Catecolaminas urinárias, VMA,
HVA como indicadores
para feocrcmocitoma e
neuroblastoma. Calcitonina
para carcinoma medular
de tireóide
Mieloma Eletroforese de proteína sérica
de M estreita (spike M)
Pulmão Nenhum
Uso de rotina de CA 15-3 ou CA
27.29 sozinhos não é
recomendado
Aumento de CA 15-3 ou CA
27.29 pode ser usado para
sugerir falha do tratamento.
Uso de rotina de CEA não é
recomendado. ER e PR
determinados para lesões
primárias. Uso de receptores
de hormônio esteróide para
selecionar pacientes para
tratamento endócrino.
Superexpressão ou
amplificação de HER-2/neu
(c-ErbB-2) podem ser usadas
para selecionar pacientes
para tratamento com
herceptina (trastuzumab)
Nenhum
Orientações no caso
de desenvolvimento de
doença metastátioa
Nenhum
CEA para prognóstico, detecção
de recidiva e monitoramento
de tratamento
Nenhum
Nenhum
Nenhum
Nenhum Receptores de esteróide no tecido
prediz resposta à hormonoterapia;
CEA e uma proteína relacionada ao
gene MUC1 no soro para
prognóstico, seguimento e
monitoramento de tratamento
HER-2/neu no tecido para predição da
resposta a herceptina
(trastuzumab) em pacientes com
doença avançada
Nenhum CA 125 como uma ajuda no
diagnóstico, para monitoramento
de tratamento e predição precoce
de recidiva
PSA e DRE para tPSA com DRE para rastreamento
rastreamento e (estudos), descoberta de caso ou
detecção prognóstico. tPSA no seguimento e
no monitoramento de tratamento
se meios adicionais de tratamento
podem ser oferecidos no caso de
elevação de tPSA. %fPSA para o
diagnóstico diferencial quando tPSA
está entre 4 e 10 ng/rnL e DRE é
negativa
Nenhum AFP, hCG, LD e PLAP* para
descoberta de caso, estadiamento,
prognóstico, seguimento e
monitoramento de tratamento. AFP
é diagnóstico para NSGCT
Nenhum CEA para descoberta de caso,
prognóstico, seguimento e
monitoramento de tratamento
Nenhum Nenhum
Nenhum Nenhum
Nenhum NSE no diagnóstico diferencial.
CYFRA 21-1, CEA e/ou NSA para
seguimento e monitoramento de
tratamento

Modificado de Diamandij EP TwmoT majkeTs• past, present, and future. In: Duínmridts EP, Frrtscfie HA, Liia H, Chan DW, Schuwrtj: MK. Twmor matkers: pfvjíioíogj, paihobiologj,
tecfinoíogj, and clinicai application. Wasíiington, DC: AACC PTÊSÍ, 2002:57.
NACB, National Academy of Clinicai Biochemíscrj; A S C O , American Sociecy of Clínica! Qncoloffl; ACS, American Câncer Societ-j; E G T M , Eitropean Group on Tumor MarJceTí;
tPAS, PSA totílí; fPSA, PSA livre-, N S G C T , tumores de células germiti-a ti nas não seminúmas.
"Nenhum" indica que o grupo relevante ainda não considerou este tipo de câncer.
*Vosfaiase alcalina plac&mãria (PLAP) é para o monitoramento de seminomas em não-fumantes apenas
354 PARTE IV Analitos
risco. A t é j u n h o de 2003, este m é t o d o foi aplicado c l i n i c a m e n t e
para selecionar pacientes c o m câncer de m a m a para q u i m i o t e r a -
pia adjuvante.
A aplicação de microarranjos para a classificação e o prognós-
tico de. câncer e para a descoberta de novos biomarcadores é relati-
vamente nova. Este m é t o d o t e m o potencial para revolucionar o
prognóstico d o câncer e a predição de tratamento pelo uso de chips
c o m este objetivo. Entretanto, é necessária a padronização futura.
ENZIMAS
As enzimas f o r a m u m dos p r i m e i r o s grupos de marcadores t u m o -
rais i d e n t i f i c a d o s . Suas atividades elevadas f o r a m usadas para
i n d i c a r a presença de vários tipos de câncer. A m e d i d a de ativi-
dade enzimática é relativamente fácil usando-se d e t e r m i n a ç ã o
espectrofotométrica, e, c o m a i n t r o d u ç ã o de i m u n o e n s a i o , o
c o n t e ú d o de enzima p o d e ser m e d i d o c o m o u m a massa de antí-
geno protéico e m vez de sua atividade catalítica.
C o m poucas exceções, u m a u m e n t o da atividade o u d a massa
de u m a enzima o u isoenzima não é específico o u sensível o bas-
tante para ser usado para i d e n t i f i c a r o t i p o de câncer o u o
e n v o l v i m e n t o de u m órgão específico. U m a exceção para isto é
o PSA, que é expresso p o r glândulas prostáticas n o r m a i s , benig-
nas, hiperplásicas e cancerosas c m i n i m a m e n t e p o r o u t r o s tecidos.
A t é a i n t r o d u ç ã o de PSA c o m o u m m a r c a d o r d o câncer de prós-
tata, as enzimas de t u m o r t i n h a m p e r d i d o m u i t o de sua popula-
r i d a d e para uso c o m o marcadores de câncer. As enzimas f o r a m
h i s t o r i c a m e n t e usadas c o m o marcadores t u m o r a i s antes da des-
coberta de antígenos oncofetais e o advento de a n t i c o r p o s m o n o -
clonais. A s anormalidades de enzimas c o m o marcadores de
câncer são a expressão da f o r m a fetal da enzima (isoenzima) o u
a p r o d u ç ã o ectópica de enzimas.
As enzimas estão presentes em concentrações m u i t o maiores
d e n t r o da célula e são liberadas na circulação sistêmica c o m o
resultado de necrose t u m o r a l ou de u m a m u d a n ç a na permeabi-
lidade da m e m b r a n a das células malignas. As atividades aumen-
tadas de enzimas são t a m b é m observadas n o b l o q u e i o de duetos
pancreáticos o u biliares e na i n s u f i c i ê n c i a renal. A localização
i n t r a c e l u l a r da enzima p o d e t a m b é m d e t e r m i n a r a taxa da libe-
ração. Q u a n d o as enzimas são liberadas n a circulação sistêmica,
a rnetástase dos tumores p o d e ter o c o r r i d o . A m a i o r i a das enzimas
n ã o é ú n i c a para u m órgão específico. A s s i m , as enzimas sãu mais
adequadas c o m o marcadores t u m o r a i s n ã o específicos; entre-
t a n t o , as atividades elevadas de enzimas p o d e m sinalizar a pre-
sença de m a l i g n i d a d e . A s isoenzimas e as f o r m a s m ú l t i p l a s de
enzimas p o d e m fornecer especificidade a d i c i o n a l de órgão.
Fosfatase Alcalina
A fosfatase alcalina (ALP) p o d e se o r i g i n a r d o fígado, d o osso o u
da placenta; n o e n t a n t o , a A L P d o soro de adultos n o r m a i s se
o r i g i n a p r i n c i p a l m e n t e d o fígado o u d o t r a t o biliar. A t i v i d a d e s
elevadas de A L P são vistas n o câncer p r i m á r i o o u secundário de
fígado. A A L P p o d e ser ú t i l na avaliação de câncer metastático
c o m e n v o l v i m e n t o de osso o u fígado. As maiores elevações são
observadas e m pacientes c o m lesões osteoblásticas, tais c o m o e m
câncer de próstata c o m rnetástase óssea. Elevações m í n i m a s são
vistas e m pacientes c o m lesões osteolíticas, tais c o m o câncer de
m a m a c o m rnetástase óssea.
Q u a n d o usada para a avaliação dc rnetástase de fígado, a
atividade de A L P sérica mostra u m a m e l h o r correlação c o m a
extensão d o e n v o l v i m e n t o d o fígado d o que o u t r o s testes de
funções hepáticas. Para diferenciar a o r i g e m de atividades de A L P
elevadas, outras enzimas hepáticas p o d e m ser analisadas, tais
c o m o 5'-nucleotidase o u y - g l u t a m i l transferase. A determinação
de isoenzimas de A L P pode fornecer especificidade a d i c i o n a l . A
isoenzima d o fígado é t e r m i c a m e n t e mais estável d o que a isoen-
zima de osso ( C a p í t u l o 19, para u m a discussão mais detalhada).
Outras doenças malignas, tais c o m o leucemia, sarcoma e l i n f o m a ,
complicadas c o m i n f i l t r a ç ã o hepática, p o d e m t a m b é m mostrar
atividades elevadas de A L P .
A fosfatase alcalina placentdria (PLAP) é sintetizada pelo tre-
foblasto e é elevada n o soro de mulheres grávidas. P L A P f o i pri-
m e i r a m e n t e identificada c o m o a isoenzima Regan, e m 1968, p o r
F i s h m a n e colaboradores, e f o i reconhecida c o m o u m dos p r i m e i -
ros marcadores t u m o r a i s associados ao desenvolvimento junta-
mente c o m A F P e C E A . A P L A P é elevada e m u m a variedade de
doenças malignas, i n c l u i n d o cânceres de ovário, p u l m ã o , trofo-
blástico e gastrointestinal, s e m i n o m a e doença de H o d g k i n .
Lactato Desidrogenase
A lactato desidrogenase ( L D ) é u m a enzima d a via glicolítica e é
liberada c o m o resultado de d a n o celular. A elevação de L D n o
câncer é p a r t i c u l a r m e n t e n ã o específica. Ela t e m sido demons-
trada e m u m a variedade de cânceres - i n c l u i n d o fígado, l i n f o m a
n ã o - H o d g k i n , l i n f o m a , leucemia aguda, câncer de testículo de
célula g e r m i n a t i v a não s e m i n o m a t o s o , s e m i n o m a , neuroblas-
t o m a e o u t r o s carcinomas, tais c o m o de m a m a , cólon, estômago
e p u l m ã o . T e m sido m o s t r a d o que a L D sérica se correlaciona
c o m a massa t u m o r a l e m tumores sólidos e fornece u m i n d i c a d o r
p r o g n ó s t i c o paTa a progressão da doença. E n t r e t a n t o , sua i m p o r -
tância n o m o n i t o r a m e n t o d o t r a t a m e n t o é p a r t i c u l a r m e n t e l i m i -
tada. As diversas isoenzimas f o r n e c e m apenas especificidade
m a r g i n a l d o e n v o l v i m e n t o de órgão. Por exemplo, a elevação da
isoenzima L D 5 está associada a metástases de fígado A elevação
de L D 5 n o f l u i d o espinal t a m b é m pode ser u m a indicação
precoce de metástases d o sistema nervoso central.
Enolase Neurônio-específica
A enolase é u m a enzima glicolítica t a m b é m conhecida c o m o
f o s f o p i r u v a t o bidratase. A enolase neurônio-específica (NSE) é a
f o r m a de enolase e n c o n t r a d a n o tecido n e u r o n a l e e m células d o
sistema n e u r o e n d ó c r i n o d i f u s o e n o tecido d e absorção e descar-
boxilação de a m i n a ( A P U D ) . A N S E é e n c o n t r a d a em tumores
associados à o r i g e m n e u r o e n d ó c r i n a , i n c l u i n d o câncer de p u l m ã o
de célula pequena ( S C L C ) , n e u r o b l a s t o m a , f e o c r o m o c i t o m a , car-
cínóide, c a r c i n o m a m e d u l a r da tireóide, m e l a n o m a e t u m o r e s
e n d ó c r i n o s pancreáticos.
A concentração de N S E sérica p o d e ser m e d i d a por r a d i o i m u -
noensaio (RIA), ensaio de imunoadsorção enzimática ( E L I S A ) o u
i m u n o e n s a i o enzimático automatizado (EIA). E m pacientes c o m
S C L C , é relatado que a sensibilidade é de 8 0 % . A especificidade
é de pelo menos 8 0 % a 9 0 % . As concentrações de N S E parecem
se correlacionar c o m o estadiamento e fornecer u m prognóstico
ú t i l para a progressão da doença. A i m p o r t â n c i a da N S E na detec-
ção de recidiva da doença não f o i provada. E m b o r a as descobertas
sejam confusas, a N S E t a m b é m parece ser ú t i l n o m o n i t o r a m e n t o
da q u i m i o t e r a p i a e se correlaciona ao estado da doença. A u m e n t o s
transitórios são observados q u a n d o ocorre a hse do t u m o r . A
imunocoloração d o tecido t u m o r a l para N S E pode t a m b é m ajudar
a distinguir a S C L C de outros tipos histológicos de carcinoma.
T e m sido relatado que mais de 9 0 % das crianças c o m neuro-
blastoma avançado t ê m concentrações elevadas de N S E sérica.
As concentrações de N S E parecem se correlacionar c o m o esta-
d i a m e n t o da doença, e as concentrações altas de N S E estão
associadas a prognóstico r u i m . O m o n i t o r a m e n t o d o t r a t a m e n t o
c o m N S E sérica é controverso, p a r t i c u l a r m e n t e c o m respeito ao
aspecto de especificidade. E n t r e t a n t o , as concentrações elevadas
de N S E em crianças c o m n e u r o b l a s t o m a estágio I V f o r a m asso-
ciadas a u m p i o r resultado.

Fosfatase Ácida Prostática
O uso clínico da fosfatase ácida prostática (PAP) t e m sido subs-
t i t u í d o pelo de PSA. A PAP não é tão sensível quanto o PSA para
o rastreamento o u para a detecção de câncer precoce. E menos
provável que ela esteja elevada em B P H em comparação com o
PSA; n o entanto, não se obtém n e n h u m a informação mediu-
do-se PAP quando o PSA está disponível. A t u a l m e n t e , o m é t o d o
preferencial para PAP é a medida de sua atividade enzimática.
Antígeno Prostático Específico
O PSA é atualmente u m dos marcadores tumorais disponíveis
mais promissores. Ele é u m dos poucos marcadores órgão-especí-
fico. O câncer de próstata é o câncer mais incidente em homens
mais velhos, e quando detectado precocemente (confinado ao
órgão) é potencialmente curável por prostatectomia radical. Por-
tanto, a detecção precoce é i m p o r t a n t e para homens com u m a
expectativa de vida de pelo menos 10 anos. Para uma atualização
da aplicação clínica de PSA, veja Freedland e Partin. 5
Bioquímica
O PSA é uma glicoproteína de cadeia única de 237 resíduos de
aminoácidos e quatro cadeias laterais de carboidrato. Ele tem
peso molecular ( M W ) de 28.430. As ligações de carboidratos
ocorrem nos aminoácidos 45 (asparagina), 69 (serina), 70 (treo-
nina) e 71 (serina). O p o n t o isoelétrico de PSA varia de 6,8 a 7,2
devido a suas várias isoformas.
O gene de PSA, K L K 3 , está localizado no cromossomo
19ql3.42. Ele é similar ao gene da cahcreína-1. c o m 8 2 % de
homologia. Funcionalmente, PSA é u m a serina protease da
família da calicreína. 8 Ele é produzido exclusivamente pelas
células epiteliais dos ácinos e duetos da glândula prostática. O
PSA é secretado no l ú m e n d o dueto prostático e no f l u i d o
seminal. Ele cliva uma proteína específica da vesícula seminal em
diversas proteínas de baixo peso molecular como parte do pro-
cesso de liquefação do coágulo seminal. Portanto, o PSA possui
atividade similar às de q u i m i o t r i p s i n a e de tripsina. A autodiges-
tão de PSA tem sido descrita em três possíveis localizações - Lys
148, Lys 185 e A r g 85. A adição de inibidores de protease pode
ser i m p o r t a n t e para evitar a auto-hidrólise de PSA em solução.
Formas Moleculares do Antígeno Prostático
Específico
O PSA existe tanto livre como complexado na circulação sanguí-
nea. A maior parte do PSA está complexada com o i n i b i d o r de
protease a v - a n t i q u i m i o t r i p s i n a (ACT) ( M W 100.000) o u com
a r m a c r o g l o b u l i n a ( A M G ) . U m componente m i n o r i t á r i o é o PSA
livre (fPSA, M W 28.430). A maioria dos imunoensaios mede
t a n t o PSA livre como P C A complexado c o m A C T , mas n e n h u m
PSA complexado c o m A M G . N o f l u i d o seminal h u m a n o , o PSA
pode ser fracionado em cinco isoformas. P S A A e PSA-B são
enzimas ativas, intactas, capazes de formar complexos c o m A C T .
PSA-C, - D e -E são formas cortadas com ligações dissulfeto cliva-
das; elas possuem baixa ou n e n h u m a atividade enzimática. As
formas inativas de fPSA são compostas por três formas molecu-
lares distintas - bPSA, pPSA e iPSA. O bPSA no tecido está
geralmente localizado na zona de transição da próstata e contri-
b u i para o fPSA em soro de paciente com B P H . O pPSA está
localizado na zona periférica da próstata e c o n t r i b u i para o fPSA
em soro de paciente com câncer.
Propriedades Fisiológicas
A taxa de depuração metabólica de PSA segue u m modelo de dois
compartimentos com meias-vidas iniciais de 1,2 e 0,75 horas para
PSA livre e PSA total e meias^idas subsequentes de 22 e 33 horas.
Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 355
Por causa desta meia-vida relativamente longa, 2 a 3 semanas
podem ser necessárias para o PSA sérico retornar às concentrações
basais após certos procedimentos, i n c l u i n d o biópsia transretal,
ultra-sonografia transretal, ressecção transuretral da próstata e
prostatectomia radical. Prostatite e retenção urinária aguda podem
também elevar a concentração de PSA E m b o r a o exame retal
digital não tenha efeitos clinicamente importantes nas concentra-
ções de PSA sérico na maioria dos pacientes, em alguns ele pode
levar a uma elevação de duas vezes.
Parece existir variação fisiológica significante de concentra-
ções de PSA sérico (até 30%). É relatado que o PSA sérico é
reduzido em 18% após u m paciente ter sido hospitalizado por
24 horas. A razão para esta redução não é conhecida. Pode ser
porque, nesse caso, os pacientes estejam sedentários (p. ex., per-
maneçam na posição deitada de barriga para cima) ou c o m a
atividade sexual suspensa. Talvez seja u m a boa prática coletar
amostras de soro de pacientes no ambulatório.
PSA Não-prostático
Originalmente, os pesquisadores pensaram que PSA era apenas
expresso n o tecido prostático. Entretanto, os estudos mostraram
que PSA é t a m b é m expresso e m inúmeros tecidos, a maioria
deles notavelmente regulada por h o r m ô n i o s . Esta descoberta não
é surpreendente porque o p r o m o t o r do gene de PSA contém três
elementos de resposta a andrógeno e pode ser ativado por andró-
genos, progestinas e glucocorticóides. A presença de PSA n o
tecido mamário está relacionada à positividade de receptor de
progesterona e estrógeno e se correlaciona c o m u m prognóstico
favorável, mas surpreendentemente com resistência ao trata-
m e n t o com tamoxifen. Encontrou-se que a positividade de PSA
está significativamente associada a tumores menores, positivi-
dade de receptores de esteróides, celularidade baixa, tumores
diplóides, baixa fração de fase S, doença menos avançada e sobre-
vivência mais longa. O PSA t a m b é m tem sido m e d i d o em f l u i d o
aspirado do m a m i l o (NAF) c o m o uma ferramenta possível para
avaliação de risco ao câncer de mama. Mulheres sem fatores de
risco tiveram PSA relativamente alto no N A F , e mulheres com
câncer de mama tiveram medidas de PSA no N A F em geral mais
baixas.
Aplicações Clínicas
O PSA é usado para rastrear, estadiar e m o n i t o r a r o tratamento
e a recidiva de câncer de próstata.
Detecção Precoce do Câncer de Próstata
O teste de PSA por si só não é efetivo para o rastreamento ou
para a detecção de câncer de próstata precoce, porque o PSA é
específico para o tecido prostático, mas não para o câncer pros-
tático. A B P H é u m a doença c o m u m em homens de 50 anos ou
mais. Estudos têm mostrado que os valores de PSA em pacientes
com B P H são similares, ainda que estatisticamente diferentes
daqueles associados ao câncer prostático precoce (ou seja, os de
pacientes com câncer confinado ao órgão) Infelizmente, a sobre-
posição de valores de PSA entre estes dois grupos é tão extensa
que selecionar u m valor de corte ó t i m o de PSA, 4 ou 10 p g / L ,
é quase impassível. O uso de PSA sérico j u n t a m e n t e com o
exame retal digital seguido de ultra-sonografia transretal fornece
u m diagnóstico mais preciso e sensível do que apenas o exame
digital.
A sensibilidade clínica de PSA no valor de corte de 4,0 p g / L
é 78%. A o reduzir o valor de corte para 2,8 p g / L , a sensibilidade
aumenta para 92%, enquanto a especificidade d i m i n u i de 3 3 %
para 23%. Elevar o valor de corte para 8 Hg/L. melhora a especi-
ficidade para 9 0 % , mas d i m i n u i a sensibilidade. Pela análise
35G PARTE IV Analitos
R O C (Figura 20-1), o PSA é u m p r e d i t o r m e l h o r d o q u e a PAP
para o diagnóstico de câncer de próstata e tem, p o r t a n t o , substi-
t u í d o a PAP.
Para a u m e n t a r a possibilidade do teste de PSA de detectar o
câncer de próstata i n i c i a l , várias abordagens são seguidas. U m a
abordagem usa intervalos de referência ajustados p o r idade: 0 a
2,5 lÀg/L para h o m e n s c o m idade entre 4 0 e 49 anos, 0 a 3,5
| i g / L , para os de 5 0 a 59 anos, 0 a 4,5 [ I g / L , para os de 6 0 a 69
anos, e 0 a 6,5 |-ig/L, para os de 7 0 a 79 anos. A o reduzir o l i m i t e
superior d o i n t e r v a l o de referência, mais câncer será detectado
e m h o m e n s mais jovens, para q u e m u m a cura p o t e n c i a l por
prostatectomia radical é mais benéfica. U m a o u t r a abo rdagem
usa a densidade de PSA ( o u seja, a concentração de PSA d i v i d i d a
pelo v o l u m e prostático c o n f o r m e d e t e r m i n a d o p o r ultra-sonogra-
fia transretal). Pacientes c o m PSA entre 4 e 10 p.g/L, u m resul-
tado negativo n o exame retal d i g i t a l e densidade de PSA elevada
t ê m risco a u m e n t a d o de câncer de próstata. A terceira abordagem
usa velocidade de PSA - a taxa de a u m e n t o de PSA c o m o u m a
f u n ç ã o do t e m p o . A p ó s estabelecer u m a concentração basal de
PSA em cada paciente, a taxa de a u m e n t o de PSA é e n t ã o calcu-
lada. O a u m e n t o de PSA e m pacientes saudáveis, c o m B P H e
câncer de próstata parece ser diferente, c o m a m a i o r taxa (>0,75
M g / l V a n o ) observada e m pacientes c o m câncer de próstata. A
especificidade m e l h o r a para 9 0 % para B P H , e a sensibilidade é
7 2 % para câncer de próstata.
U m estudo de 1996 da velocidade de f P S A e n c o n t r o u que o
fPSA percentual é o marcador sérico mais precoce para predizer
diagnóstico subseqüente de câncer de próstata. O f P S A percen-
t u a l t e m sido usado para m e l h o r a r a sensibilidade e a especifici-
dade na detecção d o câncer de próstata, p a r t i c u l a r m e n t e em
pacientes na zona diagnostica "cinza" de PSA entre 4 e 10 n g / L
o u 2 e 20 n g / L . T e m sido relatado que o ProPSA (pPSA) é
m e l h o r do que f P S A na detecção de câncer de próstata c o m PSA
t o t a l na faixa de 2,5 e 4,0 Jig/L. O PSA complexado (cPSA)
m o s t r o u especificidade m e l h o r em relação ao PSA t o t a l para a
detecção de câncer de próstata em u m ensaio c l í n i c o m u l t i c ê n -
tricô.
A l é m das abordagens descritas a n t e r i o r m e n t e , m u i t o s algorit-
mos usando PSA e o u t r o s analitos t ê m sido desenvolvidos para
a u m e n t a r a sensibilidade de detecção de câncer de próstata. Eles
i n c l u e m o uso de regressão logística e redes neurais artificiais,
que não são discutidos aqui.
Estadiamento da Câncer de Próstata
O PSA se correlaciona c o m estágios clínicos de câncer de prós-
tata; maiores concentrações de PSA e maiores percentagens de
TABELA 20-4 A n t í g e n o Prostático Específico e Estado d o T u m o r e m 297 H o m e n s A c o m p a n h a d o s por 1 a 13 A n o s A p ó s
Prostatectomia Radical
Estágio Patológica <0,5 ng/L NED"
Confinada ao órgão 169
Penetração capsular 51
Envolvimento da vesícula seminal 9 10
Linianodos positivos 4 15
Total 233
De Walsh PC, Oesterling ]E, Efisíeín ]i, et al. The value of prosmuspecifíc antigen in t T n a n a g e m e n t of Iccalizcd prosiate canal.
[rrogrcss in urológica! câncer. New Yotk: Alan R Liss Inc, 1989:27-33-
* Nenhuma evidência da doença.
Recidiva local e/ou doença metas tática.
pacientes c o m PSA elevado estão associadas a estágios mais avan-
çados. E n t r e t a n t o , o teste de PSA não é s u f i c i e n t e m e n t e conf i ável
para d e t e r m i n a r o estadiamento em base i n d i v i d u a l .
T a m b é m f o i observado q u e o PSA se correlaciona c o m está-
gios patológicos de extensão do t u m o r e rnetástase. Estágios
patológicos avançados estão associados a maiores concentrações
de PSA n o soro. Pacientes c o m doença c o n f i n a d a ao órgão
r a r a m e n t e t ê m u m a concentração de PSA m a i o r que 5 0 | i g / L ,
s u g e r i n d o que pacientes c o m concentrações iguais o u maiores
q u e 5 0 H g / L t ê m mais p r o b a b i l i d a d e de ter extensão de t u m o r
extracapsular. C o m o o c o r r e sobreposição significativa dos
valores de PSA entre os estágios, o PSA não p o d e ser usado para
d e t e r m i n a r o estágio p a t o l ó g i c o em u m d a d o i n d i v í d u o . Por-
t a n t o , o PSA por si só não p o d e ser usado para d e c i d i r se u m
paciente t e m câncer de próstata c o n f i n a d o ao órgão e, assim, se
é u m provável c a n d i d a t o para a p r o s t a t e c t o m i a radical. A con-
centração de PSA p o d e servÍT c o m o u m guia e é mais ú t i l para
a avaliação de presença de rnetástase. Pacientes c o m concentra-
ções de P S A menores que 2 0 f i g / L r a r a m e n t e t ê m rnetástase
óssea. Estudos t ê m m o s t r a d o que o PSA p o d e s u b s t i t u i r a c i n t i -
lografia óssea em pacientes c o m câncer de próstata recentemente
diagnosticados e não tratados, q u e t ê m u m a concentração sérica
de PSA baixa ( m e n o r que 10 (Jg/L) e não t ê m sintomas relacio-
nados ao sistema esquelético.
Monitoramento do Tratamento
O uso c l í n i c o mais i m p o r t a n t e de PSA é o m o n i t o r a m e n t o do
t r a t a m e n t o d e f i n i t i v o de câncer próstata, Este t r a t a m e n t o i n c l u i
prostatectomia radical, r a d i o t e r a p i a e terapia a n t i a n d r ó g e n o .
T a m b é m t e m sido sugerido q u e o PSA desempenha u m a f u n ç ã o
na progressão do t u m o r .
PrOStâtBCtOfTtiâ RsdiCât. Esta cirurgia remove t o d o o tecido
prostático. C o m o o PSA é p r o d u z i d o quase que exclusivamente
pelo tecido prostático, após a p r o s t a t e c t o m i a radical a concentra-
ção de PSA deve cair abaixo d o l i m i t e de detecção do ensaio. Isto
p o d e requerer 2 a 3 semanas devido à meia-vida de 2 a 3 dias do
PSA. Se a meia-vida é mais longa do que o n o r m a l , deve-se
assumir que t u m o r residual está presente. Por exemplo, W a l s h e
colaboradores relataram u m estudo a l o n g o prazo de 297 h o m e n s
que f o r a m acompanhados p o r 1 a 13 anos após p r o s t a t e c t o m i a
radical (Tabela 20-4). Para os 180 pacientes c o m câncer c o n f i n a d o
ao órgão, somente 11 ( 6 % ) apresentaram concentrações de PSA
elevadas (>0,5 p g / L ) . Três desses pacientes tiveram recidiva docu-
mentada, e n q u a n t o os o u t r o s o i t o não t i n h a m evidência de
câncer. A freqüência de concentrações elevadas de PSA aumen-
t o u c o m o avanço d o estágio patológico. D o grupo i n t e i r o , 12%
NÍVEL PÓS-OPERATÓRIO DE P S A
>0,5 ng/L
NED Recidiva" <%)
8 3 6
3 10 20
9 68
6 84
36 28
Jn: Murphy G, Khowry 5, eds

t m h a m concentrações elevadas de PSA sem evidência de recidiva.
M u i t o provavelmente estes pacientes t i n h a m doença residual.
Todos os pacientes com recidiva de câncer tinham concentrações
elevadas de PSA.
A medida de PSA é recomendada a cada 3 meses durante o
primeiro ano após cirurgia, a cada 4 meses no segundo ano, e a
cada 6 meses após esse período. O l i m i t e m í n i m o clínico de u m
PSA elevado varia com cada instituição em uma faixa de 0,1 e
0,3 |Ug/L. O limite m í n i m o clínico será afetado pela sensibilidade
analítica do teste e a variação biológica do PSA sérico. E m qual-
quer caso, uma concentração de PSA crescente após prostatecto-
mia radical é uma forte indicação de recidiva da doença. Sinais
clínicos de recidiva aparecem 1 a 5 anos após a elevação da con-
centração de PSA.
Radioterapia. A função do PSA no monitoramento de pacien-
tes após radioterapia definitiva é bem menos definida quando
comparada c o m a função após prostatectomia radical. A maioria
dos pacientes mostra uma redução inicial de concentração de
PSA após radioterapia. PSA é melhor do que o exame retal digital
para detectar câncer residual após radioterapia.
Terapia Antiandrógeno. A terapia antiandrógeno i n c l u i orquiec-
tomia bilateral e tratamento com análogos1 de h o r m ô n i o libera-
dor de h o r m ô n i o luteinizante, dietilestilbestrol e flutamida. O
teste de PSA é ú t i l para predizer prognóstico e m o n i t o r a m e n t o
de resposta ao tratamento a este tipo de terapia nos pacientes
com câncer de próstata estágio D2. A concentração de PSA é
inversamente proporcional ao tempo de sobrevivência e aumenta
com a progressão do câncer, d i m i n u i na remissão e permanece
inalterada na doença estável. O PSA poderia substituir a cintilo-
grafia óssea para o m o n i t o r a m e n t o de pacientes com doença
avançada.
O tratamento com privação de andrógeno pode ter u m efeito
direto na concentração de PSA, que é independente do efeito
antitumoral, porque a produção de PSA está sob a influência de
hormônios, tais como diidrotestosterona. Portanto, as concentra-
ções de PSA em pacientes que recebem terapia antiandrógeno
podem ter u m significado diferente do que em pacientes rece-
bendo outros tipos de terapias.
Progressão do Tumor
Também tem sido sugerido que o PSA desempenha u m a função
na progressão do tumor. O PSA digere as proteínas de matriz
extracelular l a m i n i n a e fibronectina, o que pode promover metás-
tase. O PSA também digere a proteína-3 de ligação ao fator de
crescimento similar à insulina (IGFBP-3), aumentando a concen-
tração local de fatores de crescimento similares à insulina, que
também podem promover crescimento tumoral.
Metodologia Analítica
Ensaios tradicionais e ultra-sensíveis estão disponíveis para medir
PSA.
Ensaios Tradicionais
Imunoensaios comerciais são usados para medir PSA. A maioria
deles usa sondas não isotópicas, tais como enzima, fluorescência
ou quimioluminescência. A maioria desses ensaios é automati-
zada em u m sistema de imunoensaio. Diferentes análises e até
mesmo a mesma análise com lotes distintos de reagentes podem
produzir resultados diferentes. As razões para tais diferenças são
devidas a alterações na calibração do ensaio, variação do lote,
tempo de reação do ensaio, matrizes de reagentes, sensibilidade
do ensaio e imprecisão. Os anticorpos reagem c o m diferentes
epítopos de PSA; assim, alguns deles reagem de forma diferente
com as várias formas moleculares de PSA. Os ensaios são classi-
Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 357
ficados como equimolares, se eles se ligam igualmente a fPSA e
cPSA, e não equimolares, se eles se ligam diferentemente a fPSA
ou cPSA. Exemplos de ensaios equimolares são o ensaio de PSA
ACCESS Hybritech (Beckman Coulter, Brea, Calif) e o ensaio
imunométrico T O S O H N e x I A (que usa os mesmos anticorpos
que o ensaio Access). A Organização M u n d i a l de Saúde, a Fede-
ração Internacional de Química Clínica e o National C o m m i t t e e
for Clinicai Laboratory Standards têm desenvolvido duas prepa-
rações internacionais para facilitar a tentativa de padronizar os
ensaios de PSA: 100% de PSA livre (código 96/686) e 90% do
complexo PSA-ACT e 10% de PSA livre (código 96/700).
Ensaios Ultra-Sensíveis
Os ensaios de PSA ultra-sensíveis t ê m limites de detecção de 0,01
a 0,001 |-ig/L, que são significativamente menores do que os dos
ensaios de PSA tradicionais. O principal uso do PSA ultra-sensí-
vel é a detecção de câncer de próstata residual após prostatecto-
mia. Após prostatectomia radical, as concentrações circulantes de
PSA são extremamente baixas; 8 0 % dos pacientes têm u m PSA
mais baixo do que 0,01 p g / L , e 20% têm u m PSA abaixo de
0,001 f-ig/L. U m aumento de PSA pós-prostatectomia está asso-
ciado à recidiva da doença. Métodos de PSA de rotma não
podem detectar u m aumento de PSA até que ele atinja cerca de
0,1 p g / L ; no entanto, métodos ultra-sensíveis podem detectar u m
aumento m u i t o antes do métodos tradicionais (1 a 2 anos).
Os métodos ultra-sensíveis também são úteis para medir PSA
em mulheres porque as concentrações normais de PSA em
mulheres são iguais ou menores que 0,01 (Jg/L. U m PSA aumen-
tado em mulheres é observado durante a gTavidez e em pacientes
com câncer de mama.
Sistema Ativador de Plasminogênio do Tipo
Uroquinase
O sistema ativador de plasminogênio do tipo uroquinase consiste
em três componentes principais, o ativador do plasminogênio do
tipo uroquinase (uPA, uma serina protease de 53 kDa), o receptor
de uPA ligado à membrana (uPAR) e os inibidores do ativador
do plasminogênio, PAI-1 e PAI-2. O uPA é produzido como u m
único polipeptídeo inativo, que é ativado por clivagem. A cliva-
gem é catalisada por muitas proteases, incluindo catepsinas B e
L e calicreína glandular humana 2. A forma ativa de uPA consiste
em uma cadeia A , que interage c o m seu receptor de superfície
celular (uPAR), e uma cadeia B cataliticamente ativa. A atividade
mais perfeitamente caracterizada de uPA é a conversão de plas-
minogênio em plasmina ativa, que degrada os componentes da
matriz extracelular (ECM) e ativa as metaloproteinases da matriz
(MMPs), que posteriormente degradam a E C M e ativam e liberam
fatores de crescimento específicos [fator de crescimento de fibro-
blastos (FGF)2 e fator de crescimento transformante (TGF)-p). A
atividade de uPA é controlada in vivo por duas moléculas inibi-
doras, PAI-1 e PAI-2. Elas não só amam como inibidores de uPA,
mas também t ê m muitas outras funções, i n c l u i n d o angiogênese,
adesão e migração celular e inibição de apoptose.
Aplicações Clinicas
O uPA tem sido estudado como u m marcador de prognóstico
para o câncer de mama e muitos outros cânceres, mas ainda não
está em uso ativo.
Câncer de Mama
O uPA foi a primeira protease envolvida em metástase avaliada
quanto ao valor prognóstico em seres humanos Pelo menos 20
grupos independentes têm demonstrado que pacientes com
câncer de mama com atividade alta de uPA em seus tumores
358 PARTE IV Analitos
p r i m á r i o s têm u m prognóstico livre de doença p i o r do que os
pacientes c o m atividade baixa de u P A . O impacto prognóstico de
uPA parece ser i n d e p e n d e n t e de outros marcadores usados tradi-
cionalmente, tais c o m o estado dos n ó d u l o s axilares, t a m a n h o do
t u m o r , grau e estado do receptor de estrógeno (ER). N a maioria
dos estudos, o uPA é u m p r e d i t o r mais potente da sobrevivência
geral do que o t a m a n h o do t u m o r , grau ou estado de ER, e tão
poderoso q u a n t o o estado nodal. Os pacientes que mais se bene-
f i c i a r i a m da m e d i d a de u P A seriam aqueles recém-diagnosticados
c o m n ó d u l o s locais histologicamente negativos. A sobrevivência a
l o n g o prazo deste g r u p o é 7 0 % a 8 0 % c o m apenas terapia local,
e n e n h u m o u t r o benefício é ganho c o m q u i m i o t e r a p i a adjuvante.
O uPA pode ser capas de detectar o pequeno n ú m e r o de pacien-
tes sob m a i o r risco de doença recorrente e de p o u p a r os pacientes
curados de q u i m i o t e r a p i a desnecessária.
PAI-1 t a m b é m t e m sido associado à progressão de câncer de
mama. Paradoxalmente, concentrações elevadas de PAI-1 se cor-
r e l a c i o n a m c o m doença mais agressiva. Isto parece ser devido ao
e n v o l v i m e n t o de PAI-1 na angiogênese e na i n i b i ç ã o de apoptose
ao c o n t r á r i o da i n i b i ç ã o de uPA. Recentemente u m estudo pros-
pectivo de 674 pacientes c o m câncer de m a m a nódulo-negativo
d e m o n s t r o u que mulheres c o m altas concentrações de uPA, PAI-1,
o u ambos, t ê m u m p e r í o d o livre de doença n o t a v e l m e n t e mais
c u r t o d o que aquelas c o m concentrações baixas de ambas as
proteínas. A evidência pata o uso prognóstico de u P A e PAI-1
deve p e r m i t i r que estes marcadores e n t r e m n o uso de r o t i n a da
avaliação de câncer de m a m a . Recentemente, as revisões e os
estudos de metanálise sugerem que u P A e PAl-1 estão p r o n t o s
para uso c o m o marcadores de prognósticos de câncer de m a m a
na clinica.
Outros C á r c e r e s
O u P A t a m b é m t e m d e m o n s t r a d o sua u t i l i d a d e c o m o u m mar-
cador de p r o g n ó s t i c o e m câncer colorretal. F o i observado que
u P A é u m m a r c a d o r de conseqüência da doença em pacientes
c o m invasão t u m o r a l , mas estado n o d a l negativo (estágio D u k e s
B). T a m b é m se observou que altas concentrações de u P A se
c o r r e l a c i o n a m c o m doença agressiva e m cânceres gástrico e eso-
fágico. Estudos preliminares t ê m a p o n t a d o u P A c o m o u m mar-
cador de prognóstico em cânceres de ovário, renal, hepatocelular,
pancreático, u r i n á r i o e de bexiga, gliomas e adenocarcinoma de
p u l m ã o e cervical. P o r t a n t o , u P A p o d e f u n c i o n a r c o m o u m mar-
cador de p r o g n ó s t i c o geral e m câncer.
Métodos Analíticos
O ensaio o r i g i n a l desenvolvido para uPA mede sua atividade
catalítica. Este ensaio t e m sido substituído pelo E L I S A , e m u i t o s
kits de pesquisa t ê m sido desenvolvidos para detecção de u P A e
PAI-1 e m tecido t u m o r a l . G e r a l m e n t e , concentrações aumenta-
das de u P A , PAI-1, o u ambos, i n d i c a m u m prognóstico r u i m .
Concentrações de u P A abaixo de 3 n g / m g de t e c i d o t o t a l e de
PAI-1 abaixo de 14 n g / m g de tecido total t ê m u m p r o g n ó s t i c o
n o t a v e l m e n t e m e l h o r . A m a i o r i a dos estudos m o s t r a n d o u m
valor prognóstico de u P A t e m usado E L I S A para detecção; entre-
t a n t o , alguns f o r a m feitos usando i m u n o i s t o q u í m i c a , que é mais
fácil e requer menos tecido, mas a interpretação é subjetiva e
apenas semi quantitativ a.
Catepsinas
As catepsinas são proteases lisossômicas, e as catepsinas B, D e
L t ê m sido investigadas q u a n t o às suas funções n o desenvolvi-
m e n t o e na progressão do t u m o r . C o m o outras proteases, as
catepsinas são sintetizadas c o m o precursores de alto peso mole-
cular que r e q u e r e m processamento para ativação. A catepsina B
( C B ) é u m a protease d e p e n d e n t e de t i o l , n o r m a l m e n t e encon-
trada nos lisossomos, e é ativada pela catepsina D ( C D ) e pelas
M M P s de matriz. A C B ativada pode, na seqüência, ativar uPA
e M M P s específicas. A catepsina L ( C L ) t e m especificidade s i m i l a r
à de C B . A catepsina D , c o m o C B , é u m a protease lisossõmica;
e n t r e t a n t o , C D pertence ao g r u p o das aspartil proteases.
A expressão e a localização de C B parecem estar alteradas em
tumores c o m relação ao tecido n o r m a l . E m tecido t u m o r a l , C B
p o d e estai associada à m e m b r a n a plasmática o u sei secieLada.
Expressão a u m e n t a d a tem sido d e m o n s t r a d a em t u m o r e s de
m a m a , colorretal, gástrico, de p u l m ã o e de próstata, carcinomas,
gliomas, melanomas e osteoclastomas, sugerindo u m a ligação
c o m o desenvolvimento d o t u m o r , progressão, ou ambos. Loca-
lização alterada de C B t a m b é m t e m sido vista em vários tecidos
t u m o r a i s , tais c o m o carcinomas de c ó l o n , cânceres de t i reói de,
gliomas e tumores epiteliais de m a m a . Pensa-se que estas expres-
são e localização alteradas estejam envolvidas em invasão de
tecido através de degradação da E C M e p r o m o ç ã o de cresci-
mento.
Aplicações Clínicas
A m a i o r i a dos dados relativos ao valor prognóstico de C D é em
relação ao câncer de m a m a ; e n t r e t a n t o , sua u t i l i d a d e e m carci-
n o m a de células escamosas ( S C C ) de cabeça e pescoço, carci-
n o m a hepatocelular e a d e n o c a r c i n o m a gástrico t e m sido investi-
gada em poucos estudos. U m relato c o n t e n d o 2.810 pacientes
c o m câncer de m a m a m o s t r o u que t u m o r e s c o m C D alta tiveram
u m a sobrevivência livre de recidiva p i o r d o que aqueles c o m
baixas concentrações de C D . N o e n t a n t o , em S C C e outros
cânceres, são necessários estudos posteriores para d e t e r m i n a r a
u t i l i d a d e prognóstica de C D c o m o u m marcador indepen-
dente.
O uso de C L c o m o u m i n d i c a d o r de prognóstico t e m sido
mais b e m estudado e m câncer de mama. A m a i o r i a dos estudos
m e d i u C L a p a r t i r de extratos de t u m o r e c o r r e l a c i o n a r a m altas
concentrações de C L c o m u m a redução de sobrevivência livre de
recidiva. C L parece ser u m m a r c a d o r de p r o g n ó s t i c o indepen-
dente t a n t o e m câncer de m a m a nódulo-negativo c o m o em
n ó d u l o - p o s i t i v o , especialmente q u a n d o c o m b i n a d o s c o m outros
marcadores de prognóstico, tais c o m o C B , C D , estado n o d a l e
estado de receptor de h o r m ô n i o esteróide.
Metodologia Analítica
A s concentrações de catepsina são geralmente medidas em extra-
tos de tecido p o r R I A o u E L I S A o u d i r e t a m e n t e nos tecidos p o r
imunoistoquímica.
Metaloproteinases de Matriz
As M M P s são u m a f a m í l i a de 23 endopeptidases dependentes de
zinco, e s t r u t u r a l m e n t e relacionadas, capazes de degradar compo-
nentes da E C M (para maiores informações, ver referência 3). A
m a i o r i a das M M P s é secretada c o m o u m zimogênio, e a ativação
envolve a remoção de u m d o m í n i o a m i n o t e r m i n a l de 10 k D a
U m a vez na f o r m a ativa, sua atividade proteolítica é i n i b i d a p o r
i n i b i d o r e s teciduais conhecidos c o m o i n i b i d o r e s teciduais de
metaloproteinases ( T I M P s ) . A s M M P s t ê m sido f u n c i o n a l m e n t e
agrupadas em quatro subgrupos c o m base em sua especificidade
na E C M : colagenases, gelatmases, estromelismas e M M P s de
membrana.
As M M P s estão envolvidas e m m u i t a s funções, i n c l u i n d o
r e m o d e l a g e m do tecido e cicatrização de feridas; ent ret ant o, elas
t a m b é m t ê m sido associadas ao crescimento do t u m o r , invasão e
rnetástase. Expressão a u m e n t a d a t e m sido associada à agressivi-
dade do t u m o r e a u m p i o r p r o g n ó s t i c o .

As M M P s p o d e m ser usadas n o f u t u r o c o m o preditores de
recidiva o u risco m e tas tático. Elevadas concentrações séricas pré-
operatórias de M M P - 2 o u M M P - 3 são pteditivas de recidiva e m
pacientes c o m c a r c i n o m a u r o t e l i a l avançado. A l é m disso, altas
concentrações de M M P - 2 e m células de t u m o r ovariano p o d e m
predizer recidiva de t u m o r . A expressão de certas M M P s é predi-
tiva de risco metastático. Por exemplo, a expressão de M M P - 1 está
associada à metástase em l i n f o n o d o s nas metástases cervical e
p e r i t o n e a l n o câncer gástrico. A i n i b i ç ã o de M M P p o d e ser u m a
estratégia terapêutica para o câncer.
HORMÔNIOS
Os h o r m ô n i o s t ê m sido reconhecidos c o m o marcadores t u m o r a i s
por mais de 50 anos. A i n t r o d u ç ã o de métodos de R I A de espe-
cíficos para u m h o r m ô n i o em p a r t i c u l a r que tenha m u i t a pouca
reatividade cruzada c o m h o r m ô n i o s similares possibilita m o n i t o -
rar o t r a t a m e n t o de pacientes c o m câncer.
C o m a i n t r o d u ç ã o e o uso de a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s , a
m e d i d a de h o r m ô n i o s é agora acurada e precisa. A p r o d u ç ã o de
h o r m ô n i o s n o câncer envolve duas rotas separadas. P r i m e i r o , o
tecido e n d ó c r i n o , que n o r m a l m e n t e o expressa, p o d e p r o d u z i r
quantidades excessivas do h o r m ô n i o . Segundo, u m h o r m ô n i o
p o d e ser p r o d u z i d o e m u m lugar distante por u m tecido não
e n d ó c r i n o , que n o r m a l m e n t e n ã o o p r o d u z . A ú l t i m a c o n d i ç ã o
é chamada s í n d r o m e ectópica. Por exemplo, a p r o d u ç ã o de hor-
m ô n i o a d r e n o c o r t i c o t r ó f i c o ( A C T H ) é n o r m o t ó p i c a pela pituitá-
ria e é ectópica pela célula pequena do p u l m ã o . Conseqüente-
mente, a elevação de u m d a d o h o r m ô n i o não c o n s t i t u i diagnós-
t i c o de u m t u m o r específico p o r q u e u m h o r m ô n i o p o d e ser
p r o d u z i d o p o r u m a variedade de cânceres.
As síndromes de neoplasia e n d ó c r i n a m ú l t i p l a ( M E N ) (MEN-1,
M E N - 2 A e M E N - 2 B ) são exemplos de cânceres e n d ó c r i n o s fami-
liares, que são herdados e m u m padrão autossômico d o m i n a n t e .
A s í n d r o m e se manifesta p o r t u m o r e s se o r i g i n a n d o de vários
tecidos n e u r o e n d ó c r i n o s A P U D . Estes tecidos sintetizam m u i t o s
h o r m ô n i o s polipeptídeos, tais c o m o A C T H , calcitonina, gas-
t r i n a , glucagon, i n s u l i n a , h o r m ô n i o melanócito-estimulante,
secretina e p o l i p e p t í d e o i n t e s t i n a l vasoativo. A f r e q ü ê n c i a da
p r o d u ç ã o h o r m o n a l se correlaciona c o m o grau da relação
e m b r i o l ó g i c a da o r i g e m do cânceT c o m o u t r o s tecidos do sistema
A P U D . O gene M E N - 1 codifica m e n i n a e está localizado e m
l l q l 3 . O c a r c i n o m a m e d u l a r de tireóide ( M T C ) , que é parte de
M E N - 2 , t e m sido mapeado na localização cromossômica 10q 11.2.
Exemplos de h o r m ô n i o s que são usados c o m o marcadores t u mo-
TABELA 20-5 H o r m ô n i o s c o m o Marcadores Tumorais
Hormônio Tipo de Câncer
ACTH Síndrome de Cushíng, pulmão (células
pequenas)
Hormônio antidiurética Pulmão (células pequenas), córtex
adrenal, pancreático, duodenal
Bombesina Pulmão (células pequenas)
Calcitonina Medular de tireóide
Gastrina Glucagonoma
Hormônio de crescimento Adenoma pituitário, renal, pulmão
hCG Embrionário, coriocarcinoma, testicular
(não seminomas)
Lactogènio placentárlo humano Trofoblástico, gônadas, pulmão, mama
Neurotisinas Pulmão (células pequenas)
Hormônio paratireóide Fígado, renal, mama, pulmão, vários
Prolactlna Adenoma pituitário, renal, pulmão
Peptídeo intestinal vasoativo Pâncreas, broncogênlco,
teocromocitoma, neurablastoma
Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 359
rais estão listados na Tabela 20-5. A C T H , c a l c i t o n i n a e gonado-
t r o f i n a c o r i ô n i c a h u m a n a ( h C G ) são discutidas mais detalhada-
m e n t e a seguir.
Hormônio Adrenocorticotrófico
O A C T H é u m h o r m ô n i o p o l i p e p t í d e o c o m 39 a m i n o á c i d o s e
u m P M de 4-500, que é p r o d u z i d o pelas células corticotróficas
da glândula p i t u i t á r i a a n t e r i o r ( C a p í t u l o 39). E m 1928, f o i des-
crito u m paciente c o m c a r c i n o m a de célula pequena d o p u l m ã o
que t i n h a os sinais e sintomas do q u e agora é sabido ser excesso
de cortisol. U m p e q u e n o n ú m e r o desses carcinomas p o d e pro-
duzir p r o - A C T H , o precursor de A C T H . Este precursor t e m u m
M W de 22.000, u m a b i o a t i v i d a d e de 5 % , e a m a i o r parte da
i m u n o a t i v i d a d e de A C T H . O R I A t r a d i c i o n a l mede t a n t o o
precursor q u a n t o o h o r m ô n i o . Concentrações séricas elevadas de
A C T H p o d e m ser resultado da p r o d u ç ã o da p i t u i t á r i a o u ectó-
pica. U m a concentração alta de A C T H (>200 n g / L ) é sugestiva
de o r i g e m ectópica. Falha do teste de supressão de dexametasona
é t a m b é m i n d i c a t i v a de p r o d u ç ã o ectópica. Cerca da metade da
p r o d u ç ã o ectópica de A C T H é resultado de c a r c i n o m a de célula
pequena do p u l m ã o . Outras doenças que elevam as concentra-
ções de A C T H t ê m sido relatadas, i n c l u i n d o cânceres pancreá-
tico, de mama, gástrico e de c ó l o n , e doenças benignas, tais c o m o
doença p u l m o n a r obstrutiva crônica, depressão m e n t a l , obesi-
dade, hipertensão, diabetes meííitus e estresse. O valor de A C T H
n o m o n i t o r a m e n t o do t r a t a m e n t o ainda é desconhecido.
Calcitonina
A c a l c i t o n i n a é u m p o l i p e p t í d e o c o m 32 aminoácidos, tem u m
M W de cerca de 3.400, e é p r o d u z i d a pelas células C da tireóide.
N o r m a l m e n t e , a calcitonina é secretada em resposta ao cálcio
sérico a u m e n t a d o . Ela i n i b e a liberação de cálcio do osso e, por-
tanto, reduz a concentração de cálcio sérico. A meia-vida sérica é
de cerca de 12 m i n u t o s . A concentração sérica em i n d i v í d u o s
saudáveis é m e n o r que 0,1 M-g/L, e u m a concentração elevada está
geralmente associada ao carcinoma m e d u l a r da tireóide.
A c a l c i t o n i n a é mais ú t i l na detecção de c a r c i n o m a m e d u l a r
f a m i l i a r da t i r e ó i d e ( F M T C ) , u m a doença autossômica d o m i -
nante. M e m b r o s assintomáticos da f a m í l i a de pacientes afetados
se b e n e f i c i a m do rastreamento c o m t o m o g r a f i a c o m p u t a d o r i z a d a
p o r q u e as concentrações basais de c a l c i t o n i n a são elevadas nestas
pessoas. Teste provocativo c o m administração intravenosa de
cálcio e pentagastrina t a m b é m p r o d u z concentrações aumenta-
das de c a l c i t o n i n a . Câncer m i c r o s c ó p i c o o u o c u l t o t e m sido
detectado em pacientes que apresentam varredura radioisotópica
negativa e glândulas da tireóide n o r m a i s n o exame físico.
A s concentrações de c a l c i t o n i n a parecem se correlacionar
c o m tais indicadores de extensão da doença, c o m o v o l u m e do
t u m o r e e n v o l v i m e n t o d o t u m o r e m metástases local e distante.
A c a l c i t o n i n a é ú t i l para o m o n i t o r a m e n t o d o t r a t a m e n t o e a
detecção de recidiva da doença.
A s concentrações de c a l c i t o n i n a são t a m b é m elevadas em
alguns pacientes c o m c a r c i n ó i d e e câncer de p u l m ã o , mama, r i m
e fígado. A u t i l i d a d e da c a l c i t o n i n a c o m o u m marcador t u m o r a l
nestas malignidades não f o i provada. A elevação de c a l c i t o n i n a
t e m sido relatada e m outras doenças não-malignas, tais c o m o
doença p u l m o n a r , pancreatite, h i p e r p a r a t i r e o i d i s m o , anemia
perniciosa e doença de Paget do osso, e na gravidez.
Gonadotrofina Coriônica Humana
Concentrações elevadas de h C G são vistas na gravidez, doenças
tro fobias ti cas e tumores de células germinativas. A h C G t a m b é m
é u m marcador ú t i l para tumores da placenta (tumores trofoblás-
ticos) e alguns tumores dos testículos. C o m o d i s c u t i d o n o Capí-
t u l o 43, ela t a m b é m é ú t i l para diagnóstico e m o n i t o r a m e n t o da
gravidez.
360 PARTE IV Analitos
Bioquímica
A h C G é u m a glicoproteína de 45 k D a secretada pelas células
sinciciotrofoblásticas da placenta n o r m a l . Ela consiste e m duas
subunidades diferentes a e p. A s u b u n i d a d e a é c o m u m a vários
outros h o r m ô n i o s : h o r m ô n i o l u t e i n i z a n t e ( L H ) , h o r m ô n i o folí-
culo-estimulante (FSH) e h o r m ô n i o e s t i m u l a n t e da t i r e ó i d e
( T S H ) . A s u b u n i d a d e P é ú n i c a para h C G , e os 28 a 3 0 a m i n o -
ácidos que c o m p õ e m o t e r m i n a l c a r b o x i l são antigenicamente
distintos. O l i m i t e de referência s u p e r i o r em h o m e n s e mulheres
não-grávidas é 5,0 U I / L .
As produções das subunidades a e P de h C G estão sob con-
trole genético d i s t i n t o . N o i n í c i o da gravidez, a s u b u n i d a d e p
l i v r e é p r o d u z i d a j u n t a m e n t e c o m h C G intacta (molécula inteira).
N o f i n a l da gravidez, p r e d o m i n a a s u b u n i d a d e a livre. A p r o d u -
ção diferencial das subunidades t e m sido observada e m pacientes
c o m câncer; entretanto, o n ú m e r o de pacientes que p r o d u z e m
apenas a s u b u n i d a d e livre é relativamente p e q u e n o . A m a i o r i a
dos pacientes c o m câncer p r o d u z subunidades p livres e molécu-
las intactas.
Aplicações Clínicas
A h C G é elevada em quase todos os pacientes c o m tumores
trofoblásticos ( M m i l h ã o U I / L ) , e m 7 0 % dos pacientes c o m
t u m o r e s cle testículo nao-seminomatoso, e m e n o s freqüente-
m e n t e nos pacientes c o m s e m i n o m a . Percentagens menores de
elevação t ê m sido relatadas e m casos de m e l a n o m a e carcinomas
de m a m a , t r a t o gastrointestinal, p u l m ã o e ovário, e e m doenças
benignas, tais c o m o cirrose, úlcera d u o d e n a l e doença i n f l a m a -
tória intestinal. A h C G t a m b é m é ú t i l , j u n t o c o m AFP, n a iden-
tificação de pacientes c o m t u m o r e s de testículo não-seminoma-
coso. As concentrações de h C G se c o r r e l a c i o n a m c o m o v o l u m e
d o t u m o r e o p r o g n ó s t i c o da doença. A presença de h C G n o
s e m i n o m a p o d e i n d i c a r a presença de c o r i o c a r c i n o m a . C o m o a
h C G n ã o atravessa a barreira hematoencefálica, a razão n o r m a l
entre o l í q u i d o cerebrospinal (CSF) e o soro é 1:60. A l t a s con-
centrações n o C S F p o d e m i n d i c a r rnetástase n o cérebro. A l é m
disso, a resposta à terapia de pacientes c o m rnetástase n o sistema
nervoso central p o d e ser i n d i c a d a pelo m o n i t o r a m e n t o da con-
centração de h C G n o CSF.
A h C G é mais ú t i l para m o n i t o r a r o t r a t a m e n t o e a progres-
são de doença trofoblástica q u a n d o suas concentrações se c o r r e
l a c i o n a m c o m o v o l u m e d o t u m o r . E m casos de pacientes c o m
h C G i n i c i a l m a i o r que 4 0 0 . 0 0 0 U I / L , é considerado u m alto
risco de falha d o t r a t a m e n t o . A p ó s remoção cirúrgica d o t u m o r ,
espera-se q u e a h C G d i m i n u a . A meia-vida n o r m a l da h C G sérica
é de 12 a 2 0 horas. D i m i n u i ç ã o lenta o u concentrações persis-
tentes de h C G sugerem a presença de doença residual. D u r a n t e
a q u i m i o t e r a p i a , recomenda-se m e d i d a semanal de h C G . A p ó s
se atingir a remissão, recomenda-se m e d i d a a n u a l de h C G para
TABELA 2 0 - 6 A n t í g e n o s Oncofetais c o m o Marcadores T u m o r a i s
Nome Natureza
AFP Glicoproteína, 70 kDa, 4% de CHO
Antígeno p-oncofetal 80 kDa
Ferritina carcinotetal Glicoproteína, 600 kDa
CEA Glicoproteína, 22 kDa, 50% de CHO
Oncofetal pancreática Glicoproteína, 40 kDa
Antígeno de célula escamosa Glicoproteína, 40-48 kDa
Aníigeno Tennessee Glicoproteína, 100 kDa
Antígeno polipeptídico tecidual Citoqueratinas 8,18,19
C H O , CarboidraLa.
detectar recidiva O l i m i t e de detecção d o ensaio é i m p o r t a n t e
p o r q u e q u a l q u e r atividade de h C G residual p o d e i n d i c a r a pre-
sença de u m t u m o r . A especificidade d o ensaio para a subuni-
dade p de h C G t a m b é m é u m fator i m p o r t a n t e p o r q u e níveis
baixos de reatividade cruzada c o m L H o u F S H p o d e m causar
resultados falso-positivos e teste o u t r a t a m e n t o adicionais i n a p r o -
priados.
Metodologia Analítica
A dosagem de h C G sérica m e l h o r o u m u i t o nos anos de 1970. A
especificidade d o ensaio m e l h o r o u c o m o uso de u m a n t i c o r p o
contra a s u b u n i d a d e p de h C G c o m pouca reatividade cruzada
c o m outros h o r m ô n i o s glicoprotéicos, L H , F S H e T S H . A t u a l -
mente, a m a i o r i a das análises de h C G usa u m f o r m a t o i m u n o -
m é t r i c o ("sanduíche"). O ensaio de h C G m e d e a m o l é c u l a intacta
(inteira) q u a n d o u m a n t i c o r p o c o n t r a a s u b u n i d a d e a e u m
a n t i c o r p o c o n t r a a s u b u n i d a d e P são usados n o f o r m a t o i m u n o -
m é t r i c o . Este t i p o de ensaio n ã o mede subunidades a e p livres
p o r q u e as subunidades livres n ã o p o d e m f o r m a r u m sanduíche
c o m ambos os anticorpos. A análise de P - h C G t o t a l mede t a n t o
o h C G i n t a c t o q u a n t o as subunidades p livres. C o m o m a r c a d o r
t u m o r a l , prefeTe-se o ensaio de p - h C G t o t a l p o r q u e os pacientes
c o m câncer p r o d u z e m quantidades notáveis da s u b u n i d a d e P
livre. N e n h u m dos ensaios de h C G disponíveis c o m e r c i a l m e n t e
foi aprovado pela F o o d and D r u g A d m i n i s c r a t i o n ( F D A ) para uso
c o m o ensaio de marcador t u m o r a l . A n t i c o r p o h e t e r ó f i l o ,
incluindo anticorpo anticamundongo h u m a n o ( H A M A ) , pode
causar falso-positivos c o m o explicado n o C a p í t u l o 10. Testar
h C G na u r i n a pode ajudar a diferenciar doenças trofoblásticas a
p a r t i r de interferência n o ensaio.
ANTÍGENOS ONCOFETAIS
A n t í g e n o s oncofetais são proteínas produzidas d u r a n t e a v i d a
fetal. Estas proteínas estão presentes e m alta concentração nos
soros de fetos e d i m i n u e m para concentrações baixas o u desapa-
recem após nascimento. E m pacientes c o m câncer, estas proteí-
nas reaparecem. A p r o d u ç ã o delas d e m o n s t r a que certos genes
são reativados c o m o resultado da transformação maligna das
células.
A descoberta dos antígenos oncofctais A F P e C E A nos anos
de 1960 revolucioncfu a era m o d e r n a dos marcadores t u m o r a i s .
A A F P f o i p r i m e i r a m e n t e e n c o n t r a d a n o soro de c a m u n d o n g o s
c o m câncer de fígado e p o s t e r i o r m e n t e e m soros de seres h u m a n o s
c o m c a r c i n o m a hepatocelular. O C E A f o i descoberto e m 1965
per G o l d e F r e e m a n e f o i c o n h e c i d o i n i c i a l m e n t e c o m o o "antí-
geno de o u r o " ("Gold antigen"). A n t í g e n o s oncofetais que t e n h a m
sido usados c o m o marcadores t u m o r a i s , i n c l u i n d o A F P e C E A ,
estão listados na Tabela 20-6.
Tipo de Câncer
Hepatocelular, células germinativas (não seminoma)
Cólon
Fígado
Colorretal, gastrointestinal, pancreático, pulmão, mama
Pancreático
Cervical, pulmão, pele, cabeça e pescoço (escamoso)
Cólon, gastrointestinal, bexiga
Vários (mama, colorretal, ovariano, bexiga)

Alfa-Fetoproteína
A AFP é u m marcador de carcinoma hepatocelular e de célula
germinativa (não-seminoma).
Bioquímica
A AFP é uma glicoproteína com uma massa molecular de 70 k D a .
Ela consiste em uma única cadeia polipeptídica, e aproximada-
mente 5% é carboidrato. AFP é sintetizada em grandes quanti-
dades durante o desenvolvimento e m b r i o n á r i o pelo saco v i t e l i n o
fetal e fígado. Ela é uma das principais proteínas na circulação
fetal, mas sua concentração máxima é cerca de 10% a de albu-
mina. A A F P é i n t i m a m e n t e relacionada genética e estrutural-
mente à albumina, tendo homologias extensas nas seqüências de
aminoácido. A medida que a síntese de albumina aumenta
durante o desenvolvimento fetal tardio, as concentrações de AFP
no soro fetal começam a cair. Elas finalmente atingem as concen-
trações-traço encontradas em adultos normais 18 meses após o
nascimento.
Aplicações Clínicas
A concentração de AFP sérica é normalmente m e n o r que 10
p g / L em adultos saudáveis. D u r a n t e a gravidez, as concentrações
de A F P materna aumentam a partir de 12 semanas de gestação
até u m pico de cerca de 500 p.g/L durante o terceiro trimestre. A
A F P fetal atinge u m pico de 2 g / L em 14 semanas e, então, cai a
cerca de 70 m g / L no nascimento. O uso de AFP para detectar
fetos com defeitos n o tubo neural é discutido no C a p í t u l o 43.
A l é m da gravidez, concentrações elevadas de AFP sérica também
estão associadas a doenças hepáticas benignas, tais como hepatite
e cirrose. A maioria dos pacientes com estas doenças benignas
(95%) t e m concentrações de A F P mais baixas que 200 p g / L .
Exceto em pacientes grávidas, concentrações de A F P maiores
que 1.000 p g / L são u m indicativo de câncer. Nessas concentra-
ções de AFP, cerca da metade dos carcinomas hepatocelulares
( H C C s ) p o d e ser detectada. N o entanto, porque a concentração
de AFP se correlaciona com o t a m a n h o do tumor, a detecção de
H C C é mais ú t i l nos estágios iniciais, q u a n d o o t u m o r é pequeno
o bastante para ser operável (menos que 5 cm), do que q u a n d o
o t u m o r é grande. Para detectar pequenos tumores, a concentra-
ção de corte para A F P tem que ser ajustada a u m valor baixo;
u m ponto de corte de 10 a 20 p g / L tem sido recomendado. N o
entanto, nesta concentração, hepatite e cirrose devem ser consi-
deradas possíveis causas da elevação.
Rastreamento de H C C t e m sido tentado em áreas de alta
incidência, tais como África, C h i n a , Formosa, Japão e Alasca. O
rastreamento inicial em larga escala na C h i n a , usando técnicas
menos sensíveis (p. ex., aglutinação e imunodifusão, que têm
valores de corte de 400 a 1.000 p g / L ) , foi capaz de detectar
números notáveis de novos casos deste tipo de câncer. M é t o d o s
de imunoensaio mais sensíveis, c o m valores de corte de 10 a 20
p g / L , e ultra-sonografia têm sido usados em Formosa e Japão
com mais sucesso na detecção de H C C nos estágios iniciais
AFP t a m b é m é ú t i l para determinar prognóstico e n o moni-
toramento do tratamento de H C C . A concentração de A F P é u m
indicador prognóstico de sobrevivência. Concentrações elevadas
de A F P (maiores que 10 p g / L ) e concentrações de b i l i r t u b m a
sérica maiores que 2 m g / d L estão associadas a tempo de sobre-
vivência mais curto.
A concentração de A F P t a m b é m é ú t i l para m o n i t o r a r o
tratamento e as alterações do estado clínico. Concentrações ele-
vadas de A F P após cirurgia p o d e m indicar remoção incompleta
do t u m o r o u a presença de metástase. Queda o u aumento de
concentrações de A F P após terapia p o d e m determinar o sucesso
ou a falha d o sistema de tratamento. U m aumento notável de
Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 361
concentrações de A F P em pacientes considerados livres de t u m o r
metastático pode indicar o desenvolvimento de metástase.
A combinação de A F P e h C G é usada para classificar e esta-
diar tumores de célula germinativa. Estes tumores p o d e m ser
predominantemente de u m tipo de célula ou p o d e m ser uma
mistura de seminoma, saco v i t e l i n o , elementos coriocarcinoma-
tosos (carcinoma embrionário) ou teratoma. A A F P é elevada em
tumores do saco vitelino, enquanto h C G é elevada em coriocar-
cinoma. Ambas são elevadas n o carcinoma embrionário. E m
seminomas, a A F P não é elevada, enquanto a h C G é elevada em
10% a 3 0 % dos pacientes que t ê m células sinciciotrofoblásticas
no tumor. N e n h u m marcador é elevado em teratomas. U m o u
ambos os marcadores são elevados em cerca de 9 0 % dos pacien-
tes c o m t u m o r de testículo não-seminomatoso. As elevações
foram encontradas em menos de 2 0 % dos pacientes com doença
no estágio I, 5 0 % a 8 0 % com doença no estágio II, e 9 0 % a 100 %
com doença n o estágio I I I . Estes marcadores se correlacionam
com o volume do t u m o r e o prognóstico da doença.
O uso combinado de ambos os marcadores também é ú t i l no
m o n i t o r a m e n t o de pacientes com tumores de célula germinativa.
A elevação do marcador indica recidiva da doença o u desenvol-
v i m e n t o de metástase. O sucesso da quimioterapia pode ser ava-
liado calculando-se a d i m i n u i ç ã o das concentrações de ambos os
marcadores usando as meias-vidas de A F P (5 dias) e h C G (12 a
20 horas).
E m 2005, a F D A aprovou u m novo teste, AFP-L3%, para
detecção de H C C baseado na capacidade do A F P de se ligar à
lectina aglutinina de Lens culincnis ( L C A ) . C o m base em sua afi-
nidade de se ligar à L C A , a AFP pode ser dividida em três glico-
formas (AFP-L1, -L2 e -L3). A AFP-L1 t e m uma baixa afinidade
por L C A e está associada a doenças hepáticas crónicas (hepatite
e cirrose). A AFP-L2 t e m u m a afinidade intermediária e é ampla-
mente derivada de tumores de saco vitelino e câncer de fígado
metastático. A AFP-L3 é quase exclusivamente produzida por
hepatócitos malignos. Ela é m e d i d a por determinação do percen-
tual de AFP-L3 em relação à A F P total.
A AFP-L3% parece ser ú t i l t a n t o para o rastreamento de
populações de alto risco como para estimar prognóstico. Os
pacientes de alto risco para H C C [aqueles que têm hepatite
crônica por infecção por vírus B ( H B V ) ou vírus C ( H C V ) , ou
cirrose] freqüentemente têm concentrações elevadas de AFP. Esta
descoberta complica a detecção precoce de H C C c o m base na
A F P total. Concentrações elevadas de A F P - L 3 % (>10% de AFP
total) sugere a presença de H C C . N o corte > 10%, A F P - L 3 % tem
a capacidade de detectar tumores pequenos (<2 cm) 9 a 12 meses
antes da detecção por imagem, o que aumenta a probabilidade
de tratamento efetivo. A produção de AFP-L3 pelo t u m o r t a m b é m
parece se correlacionar c o m a agressividade do t u m o r e, p o r t a n t o ,
pode ajudar na predição do curso clínico. E m b o r a AFP-L3% seja
ú t i l para detecção e prognóstico de H C C , pode ser usada apenas
quando AFP é elevada.
Metodologia Analítica
Sistemas de imunoensaio automatizados são usados para medir
AFP. O limite de detecção do imunoensaio de A F P é cerca de 1
a 2 p g / L . A AFP-L3% é medida por u m i n s t r u m e n t o automati-
zado (LiBASys, W a k o Chemicals U S A , Inc., R i c h m o n d , V A ) que
separa as frações de A F P por colunas de cromatografia e deter-
m i n a as frações específicas de A F P usando anticorpos monoclo-
nais e detecção fluorométrica.
Antígeno Carcinoembrionário
O C E A é mais ú t i l como marcador para carcinomas colorretal,
gastrointestinal, de p u l m ã o e de mama. Ele f o i descoberto por
362 PARTE IV Analitos
G o l d e Freeman, em 1965, através da imunização de coelhos com
extratos de tecido de câncer de cólon h u m a n o . Os anti-soros
resultantes f o r a m absorvidos com extratos de cólon h u m a n o
n o r m a l . Alguns anti-soros reagiram c o m os extratos de tumor,
mas não com os extratos de tecido normal. O antígeno, que foi
encontrado no tecido e m b r i o n á r i o , foi d e n o m i n a d o antígeno cm-
cinoembrionáno.
Bioquímica
C E A é uma glicoproteína c o m u m a massa molecular de 150 a
300 kDa, que contém 4 5 % a 55% de carboídrato. Ele é uma
única cadeia polipeptídica consistindo em 641 aminoácidos, com
lisina em sua posição N - t e r m i n a l . A heterogeneidade de C E A
pode ser demonstrada usando-se focalização isoelétrica para
separar as variantes.
O C E A consiste em uma grande família de glicoproteínas de
superfície celular relacionadas. As proteínas C E A são codificadas
por cerca de 10 genes localizados no cromossomo 19. Até 36
diferentes glicoproteínas f o r a m identificadas na família C E A . As
principais proteínas são C E A e o antígeno de reação cruzada não
específica ( N C A ) . O d o m í n i o estrutural de C E A , N C A 5 0 , e a
cadeia pesada da i m u n o g l o b u l i n a I g G são m u i t o parecidos. Por-
tanto, C E A é parte da "superfamília" do gene da imunoglobu-
lina.
Aplicações Clínicas
O C E A é elevado em uma variedade de cânceres, tais como os
carcinomas colorretal (70%), de pulmão (45%), gástrico (50%),
de mama (40%), pancreático (55%), ovariano (25%) e u t e r i n o
(40%). Por causa das elevações associadas à doença benigna (ou
seja, resultados falso-positivos) e o n ú m e r o de tumores que não
produzem C E A (ou seja, resultados falso-negativos), o teste de
C E A não deveria ser usado para o rastreamento
Testar C E A pode ser ú t i l para auxiliar o estadiamento clínico.
Concentrações persistentemente elevadas que são 5 a 10 vezes o
l i m i t e de referência superior sugerem fortemente a presença de
câncer de cólon, mas podem estar associadas a outros cânceres.
N o câncer de cólon, as concentrações de C E A se correlacionam
com o estágio da doença. O C E A é elevado em 2 8 % dos pacien-
tes com câncer colorretal estágio A de Dukes e em 4 5 % dos
pacientes com estágio B. A concentração de C E A pré-tratamento
é prognóstico do desenvolvimento de rnetástase, e uma concen-
tração alta de C E A está associada a uma maior probabilidade de
desenvolver rnetástase. H á evidências de que C E A é uma molécula
de adesão celular que pode potencializar invasão e rnetástase.
Após a terapia inicial bem-sucedida, C E A decai. D u r a n t e a
remissão, C E A é estável. A elevação dos valores de C E A pode
indicar recidiva da doença. O intervalo de tempo da elevação de
C E A até a recorrência clínica é cerca de 5 meses. U m a laparoto-
mia repetida pode ser realizada para confirmar a recidiva, que é
detectada em 9 0 % dos casos. N o m o n i t o r a m e n t o do câncer de
c ó l o n metastático, o C E A é ú t i l para acompanhar pacientes
durante a terapia e o curso clínico da doença.
O C E A é t a m b é m ú t i l para m o n i t o r a r carcinomas de mama,
de pulmão, gástrico e pancreático. N o câncer de mama, o C E A
elevado está associado à doença metastática. E n q u a n t o o câncer
de mama inicial ou localizado não eleva o C E A , a doença metas-
tática freqüentemente o faz, t o r n a n d o o C E A ú t i l para o m o n i -
toramento de rnetástase durante o tratamento. As elevações
ocorrem com o desenvolvimento de rnetástase óssea o u de
p u l m ã o O uso de C E A em pacientes com câncer de m a m a está
sendo substituído por outros marcadores mais específicos, tais
como C A 15-3. N o câncer de p u l m ã o , a determinação de C E A
é ú t i l para diagnosticar carcinoma de células não-pequenas do
p u l m ã o (>65% dos pacientes t ê m C E A elevado) e no monitora-
mento do câncer.
Metodologia Analítica
Tal c o m o com a AFP, a maioria dos ensaios usa o formato de
ensaio i m u n o m é t r i c o ( I M A ) para a determinação de C E A sérico.
A n t i c o r p o s pohclonais o u monoclonais, ou uma combinação de
ambos os tipos, têm sido usados nos imunoensaios de C E A .
N a população saudável, o l i m i t e superior de C E A é cerca de
3 |Ug/L para não-fumantes e 5 JJg/L paia fumantes. C o m o a
medida da concentração de C E A é dependente do método, os
valores deveriam sempre ser comparados usando-se o mesmo
método. N o caso de mudança de método, todos os pacientes que
estão sendo monitorados deveriam ser testados em paralelo com
ambos os métodos, velho e novo. A concentração de C E A é
elevada em alguns pacientes c o m doenças benignas, tais como
cirrose (45%), enfisema p u l m o n a r (30%), pólipos retais (5%),
doença benigna de mama (15%) e colite ulcerativa (15%).
CJTOQUERATINAS
As citoqueratinas são u m grande grupo de aproximadamente 20
proteínas que compõem os filamentos intermediários do citoes-
queleto das células epiteliais e das células de origem epitehal (para
maiores informações, ver referência 3). As citoqueratinas p o d e m
ser grosseiramente divididas em dois grupos, tipo 1, menores e
ácidas, e tipo 2, maiores e de neutras a básicas. Os membros clini-
camente úteis desta família são o antígeno polipeptídico tecidual
(TPA), antígeno pohpetídeo-específico tecidual (TPS), fragmentos
da citoqueratina 19 ( C Y F R A 21-1) e antígeno SCC. Apenas o
antígeno S C C (SCCA) é disponível nos Estados Unidos.
Antígeno Polipeptídico Tecidual
A descoberta de T P A antecedeu a de A F P e C E A ; entretanto, o
T P A não é u m marcador t u m o r a l específico. O T P A é produzido
por células normais e cancerosas, e concentrações elevadas de
T P A sérico estão relacionadas â atividade proliferativa e à reno-
vação de células, p e r m i t i n d o que ele seja usado como u m marca-
dor de proliferação. O T P A aumenta na gravidez e retorna ao
n o r m a l 5 dias após o parto Ele é t a m b é m elevado em doenças
inflamatórias; portanto, não é ú t i l para o diagnóstico do câncer.
N o entanto, ele pode ser ú t i l para m o n i t o r a r metástases. O T P A
é mais ú t i l para m o n i t o r a r câncer de mama, em combinação com
C E A e C A 15-3, câncer de cólon, com C E A e C A 19-9, e câncer
ovariano, c o m C A 125. O T P A é ú t i l na diferenciação entre
colangiocarcinomas (nos quais a concentração de T P A é elevada)
e H C C (no qual a concentração de T P A não é detectável).
Antígeno Polipeptídeo-Específico Tecidual
O TPS é de fato u m sítio antigênico no complexo T P A especifi-
camente reconhecido pelo anticorpo m o n o c l o n a l M 3 . Este
epítopo foi apresentado como u m marcador específico de proli-
feração celular, e ele é detectável n o soro usando-se u m radioi-
munoensaio específico. O TPS parece se correlacionar com a
atividade prolifera tiva de minores de pulmão, independente-
mente da histologia e do volume do tumor, com aumento de TPS
observado com o aumento do estágio. A l é m disso, concentrações
elevadas de TPS se correlacionam com u m resultado pior.
Fragmentos de Citoqueratina 19
C Y F R A 21-1 é elevado em todos os tipos de câncer de p u l m ã o ,
embora seja mais sensível para câncer de p u l m ã o de células não
pequenas e SCC. As concentrações de C Y F R A 21-1 se correla-
cionam positivamente c o m o aumento do estágio e são úteis n o
m o n i t o r a m e n t o do curso da doença e no acompanhamento pós-
 Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 363

cirúrgico. E m u m estudo de pacientes c o m câncer de p u l m ã o de c o m o marcadores de t u m o r e t e n d e m a ser mais específicos d o

células n ã o pequenas, mostrou-se que C Y F R A 21-1 se correla-
c i o n a i n d e p e n d e n t e m e n t e c o m a d i m i n u i ç ã o da sobrevivência, o
estado n o d a l e o estágio d o t u m o r , c o n f i r m a n d o sua u t i l i d a d e
c o m o u m marcador de t u m o r de p u l m ã o .
Antígeno de Carcinoma de Célula Escamosa
S C C A é u m a glicoproteína previamente d e n o m i n a d a " an tígeno
4 associado ao t u m o r " . Subtrações de S C C A f o r a m separadas p o r
focalização isoelétrica e m frações neutras e ácidas. T e m sido mos-
trado q u e ambas as células escamosas malignas e não-malignas
c o n t ê m a fração n e u t r a , e n q u a n t o a fração ácida é e n c o n t r a d a
p r i n c i p a l m e n t e e m células malignas e é a f o r m a liberada na cir-
culação.
O S C C A é elevado e m u m a variedade de SCCs, i n c l u i n d o
os de cérvice, p u l m ã o , pele, cabeça, pescoço, t r a t o digestivo,
ovários e trato u r o g e m t a l . E m geral, a concentração de S C C A é
p r o p o r c i o n a l avanço dos estágios d o câncer. O rastreamento não
é efetivo, visto que s o m e n t e u m a pequena porcentagem de
pacientes c o m estágios iniciais de câncei mostra valores elevados
de S C C A . Valores elevados de S C C A pré-tratamento parecem
estar associados a u m p i o r prognóstico. O S C C A é ú t i l na detec-
ção de recorrência de câncer e n o m o n i t o r a m e n t o de t r a t a m e n t o
e progressão da doença.
M u l h e r e s saudáveis, não grávidas, t ê m valores de S C C A
abaixo de 1,5 [J-g/L. As concentrações de S C C A sérico p o d e m
estar elevadas (>1,5 f.ig/L) em certas doenças benignas, i n c l u i n d o
infecção p u l m o n a r , doença de pele, insuficiência r e n a l e doença
hepática. Ele t a m b é m está presente na saliva, n o suor e e m secre-
ções respiratórias. Por causa disso, máscaras devem ser usadas
pelo pessoal de l a b o r a t ó r i o q u a n d o estiverem analisando S S C A .
Ele é m e d i d o usando ensaio i m u n o r r a d i o m é t r i c o o u i m u n o e n -
saio enzimático de m i c r o p a t t í c u l a s n o analisador I m x ( A b b o t t
D i a g n o s t i c , Chicago).
MARCADORES DE CARBOIDRATO
M a r c a d o r e s t u m o r a i s de c a r b o i d r a t o são (1) antígenos de super-
fície de célula t u m o r a l o u (2) secretados pelas células t u m o r a i s .
T e m sido observado que estes marcadores são c l i n i c a m e n t e úteis
que os marcadores n a t u r a l m e n t e secretados, tais c o m o enzimas
e h o r m ô n i o s . B i o q u i r n i c a m e n t e , eles são m u emas de alto peso
m o l e c u l a r (Tabela 20-7) o u antígenos de grupos sanguíneos
(Tabela 20-8).
Ensaios de C A 15-3, C A 5 4 9 e C A 27.29 detectam u m a
m u c i n a glicoprotéica de alto peso m o l e c u l a r expressa pelo epité-
l i o m a m á r i o , conhecida c o m o episialina. O antígeno episiahna
circulante é u m a m o l é c u l a heterogênea. Ensaios de C A 15-3, C A
5 4 9 e C A 27.29 detectam epítopos similares, mas diferentes, na
episialina. As p r i n c i p a i s diferenças são os a n t i c o r p o s usados para
a detecção.
CA 15-3
C A 15-3 é detectado p o r u m a n t i c o r p o m o n o c l o n a l m u r í n i c o
( M A b ) D F 3 p r o d u z i d o c o n t r a u m extrato e n r i q u e c i d o c o m m e m -
brana de u m câncer de m a m a h u m a n o c o m metástase para o
fígado. U m o u t r o a n t i c o r p o m o n o c l o n a l , 115D8, f o i desenvol-
v i d o c o n t r a a m e m b r a n a dos glóbulos de g o r d u r a d o leite
h u m a n o . O antígeno DF3-reativo circulante é u m a molécula
heterogênea c o m u m a massa m o l e c u l a r de 3 0 0 a 4 5 0 k D a . A
clonagem de c D N A i n d i c a que a parte central d o peptídeo D F 3
consiste em u m a seqüência altamente conservada de nucleotí-
deos de 60 pares de base e m repetição i n tandem. A variabilidade
do antígeno é resultado dos n ú m e r o s diferentes de repetições na
parte central d o peptídeo. O a n t i c o r p o D F 3 reconhece u m
epítopo d e n t r o desta seqüência de repetição de 20 a m i n o á c i d o s
d o centro d o peptídeo. O r e c o n h e c i m e n t o d o e p í t o p o é t a m b é m
afetado p o r glicação.
Aplicações Clínicas
C A 15-3 é mais ú t i l na avaliação d o câncer de m a m a , sendo
elevado em 6 9 % dos casos avançados. Ele n ã o é ú t i l n o rastrea-
m e n t o p o r q u e é elevado e m m u i t a s doenças benignas, i n c l u i n d o
t u m o r e s ovarianos benignos, doenças benignas da mama, hepa-
tite crônica, cirrose hepática, sarcoidose, tuberculose, lúpus eri-
tematoso sistêmico e h i p o t i r e o i d i s m o . C A 15-3 elevado t a m b é m
é e n c o n t r a d o e m outras doenças malignas, c o m o cânceres pan-

TABELA 20-7 Marcadores Tumorais de M u c i n a

Nome Antígeno e Fonte Anticorpo Tipo de Câncer

CA 125 Glicoproteína, >200 kDa, 0VCA 433 0C 125 Ovário, endométrio

Episialina
CA 15-3 Glicoproteína, 400 kDa, BrCa membrana enriquecida DF3 e115D8 Mama, ovário
CA 549 Glicoproteína de alto MW BC4E549,BC4N154 Mama, ovário
CA 27.29 Glicoproteína de alto MW B27.29 Mama
MCA Glicoproteína de 350 kDa b-12 Mama, ovário
DU-PAN-2 Mucina, epítopo peptídico de 1.000 kDa DU-PAN-2 Pancreático, ovário, gastrointestinal,
pulmão

M W , Peso molecular.

TABELA 20-8 Marcadores de Câncer Relacionados a A n t í g e n o de G r u p o Sanguíneo

Nome Antígeno e Fonte Anticorpo Tipo de Câncer

CA 19-9 Le"3 sialilado, CA de cólon SW-1116 19 9 Pancreático, gastrointestinal, hepático

CA 19-5 Lea e Leaa sialilado 19-5 Gastrointestinal, pancreático, ovário
CA 50 Lea sialilado e forma afucosil C50 Pancreático, gastrointestinal, cólon
CA 72-4 Tn sialilado B27.3. cc49 Ovário, mama, gastrointestinal, cólon
CA 242 CH0 sialilado C242 Gastrointestinal, pancreático
364 PARTE IV Analitos
creático (80%), de p u l m ã o (71%), ovariano (64%), colorretal
( 6 3 % ) e de fígado (28%).
C A 15-3 não deve ser usado para diagnosticar câncer de
m a m a p r i m á r i o p o r q u e a i n c i d ê n c i a de elevação ( 2 3 % ) é clara-
m e n t e baixa. Ele é mais ú t i l n o m o n i t o r a m e n t o d o t r a t a m e n t o e
da progressão da doença em pacientes c o m câncer de m a m a
metastático. U m a alteração significativa d o valor deve ser de pelo
menos 2.5% e t e m sido correlacionada c o m a progressão da
doença em 9 0 % dos pacientes e c o m a regressão em 7 8 % .
N e n h u m a m u d a n ç a correlaciona-se c o m a estabilidade da doença
e m 6 0 % . U m a u m e n t o paradoxal em C A 15-3 p o d e ser visto
naqueles que r e s p o n d e m ao t r a t a m e n t o . Provavelmente isso é
causado pela lise d o t u m o r e liberação de C A 15-3; p o r t a n t o ,
deve-se t o m a r c u i d a d o ao i n t e r p r e t a r precocemente as concentra-
ções de C A 15-3 d u r a n t e o t r a t a m e n t o
O uso mais i m p o r t a n t e de C A 15-3 é n o a c o m p a n h a m e n t o
de pacientes c o m câncer de m a m a tratados sem evidência de
doença. U m a u m e n t o das concentrações de C A 15-3 ( > 2 5 % )
d u r a n t e o a c o m p a n h a m e n t o sugere recidiva, especialmente e m
tecido visceral o u ósseo. O i n t e r v a l o de t e m p o varia de 1 a 11
meses; e n t r etanto, o i m p a c t o clínico do i n t e r v a l o de t e m p o é
desconhecido.
Metodologia Analítica
D o i s a n t i c o r p o s são usados e m imunoensaios: M A b 115D8 é
ligado a u m suporte s ó l i d o e f u n c i o n a c o m o o a n t i c o r p o de
captura, e n q u a n t o M A b D F 3 é o a n t i c o r p o de detecção marcado.
A F D A tem aprovado m u i t o s dos ensaios disponíveis comercial-
mente.
C A 27.29
C A 27.29 é detectado p o r u m a n t i c o r p o m o n o c l o n a l , B27.29,
que é p r o d u z i d o c o n t r a u m antígeno de ascite e m pacientes c o m
c a r c i n o m a de m a m a metastático. O e p í t o p o m í n i m o c o m o qual
B27.29 reage é a seqüência de 8 a m i n o á c i d o s ( S A P D T R P A )
d e n t r o da seqüência de repetição in tandem dos 2 0 a m i n o á c i d o s
do c e n t r o da m u c i n a . A seqüência reativa de B27.29 se sobrepõe
à sequência de D F 3 usada n o ensaio de C A 15-3.
C A 27.29 f o i aprovado pela F D A para uso c l í n i c o na detecção
de câncer de m a m a recorrente em pacientes c o m doença nos
estágios I I o u I I I . Ele fornece i n f o r m a ç ã o s i m i l a r à de C A 15-3;
e n t r e t a n t o , ele não tem sido tão a m p l a m e n t e investigado. C A
27.29 é m e d i d o p o r i m u n o e n s a i o c o m p e t i t i v o em fase sólida.
T a n t o o ensaio baseado em E L I S A q u a n t o o autom ati zado se
e n c o n t r a m disponíveis.
C A 549
C A 549 é u m a glicoproteína ácida c o m u m p o n t o isoelétrico de
p H 5,2, N a eletroforese em gel de p o l i a c r i l a m i d a / d o d e c i l sulfato
de sódio sob condições redutoras, C A 5 4 9 p o d e ser separado e m
duas espécies c o m massas moleculares de 4 0 0 e 512 k D a . U m
anticorpo monoclonal, uma IgGi murinica denominada BC4E
549, originou-se p o r i m u n i z a ç ã o de c a m u n d o n g o s c o m prepara-
ções de m e m b r a n a p a r c i a l m e n t e p u r i f i c a d a da l i n h a g e m de
células de t u m o r de m a m a h u m a n o T417. O o u t r o a n t i c o r p o ,
B C 4 N 154 ( u m I g M m u r í n i c o ) , f o i desenvolvido c o n t r a m e m -
brana dos glóbulos de g o r d u r a de leite h u m a n o .
Aplicação Clínica
D e f o r m a similar ao C A 15-3, C A 549 não é ú t i l para detectar
c a r c i n o m a de m a m a i n i c i a l p o r q u e a p r o p o r ç ã o de pacientes c o m
concentrações elevadas de C A 549 é baixa. Pela análise R O C ,
C A 5 4 9 é m e l h o r do que C E A na identificação de câncer de
m a m a ativo (Figura 20-2). Ele é ú t i l na detecção de recidiva de
câncer de m a m a e m pacientes após t r a t a m e n t o i n i c i a l seguido
p o r terapia adjuvante. U m a u m e n t o do valor de C A 549 após
u m a d i m i n u i ç ã o i n i c i a l o u estabilização i n d i c a o desenvolvi-
m e n t o de metástase. N o m o n i t o r a m e n t o de pacientes c o m câncer
de m a m a avançado, C A 549 se correlaciona c o m a progressão da
doença e a regressão e ajuda a detectar metástase.
E m u m a população de m u l h e r e s saudáveis, 9 5 % da popula-
ção t ê m valores de C A 5 4 9 abaixo de 11 k U / L . Gravidez e doença
de m a m a b e n i g n a m o s t r a m elevação m í n i m a , e alguns pacientes
c o m doença hepática b e n i g n a m o s t r a m u m a leve elevação. T e m
sido m o s t r a d o que C A 549 é elevado em u m a variedade de car-
cinomas metastáticos não m a m á r i o s , i n c l u i n d o os carcinomas
ovariano ( 5 0 % ) , de próstata ( 4 0 % ) e de p u l m ã o (33%).
C A 125
C A 125 é u m a glicoproteína de massa molecular alta ( > 2 0 0 k D a )
reconhecida pelo a n t i c o r p o m o n o c l o n a l O C 125. Ela c o n t é m
2 4 % de carboidrato e é expresso p o r t u m o r e s ovarianos epiteliais
e outros tecidos patológicos e n o r m a i s de o r i g e m de duetos m ü l -
lerianos. A função fisiológica é desconhecida.
Bast e colaboradores desenvolveram o M A b O C 125 usando
u m a l i n h a g e m celular ( O V C A 433) de u m a paciente c o m u m
cistoadenocarcinoma papilar seroso do ovário. O clone O C 125
f o i selecionado p o r sua reatividade c o m a l i n h a g e m celular
O V C A 433 e p o r sua falta de reatividade c o m u m a l i n h a g e m de
l i n f ó c i r a B da mesma paciente.
Aplicações Clínicas
C A 125 é mais ú t i l c o m o m a r c a d o r de câncer ovariano. E m u m a
população saudável, o l i m i t e superior de C A 125 é 35 k U / L .
Elevação de C A 125 é observada e m m u i t o s carcinomas não
ovarianos, i n c l u i n d o tumores de e n d o m é t r i o , pancreático, de
p u l m ã o , de mama, colorretal e outros gastrointestinais. Ele
t a m b é m é elevado em mulheres na fase f o l i c u l a r do ciclo mens-
t r u a l e em doenças benignas, tais c o m o cirrose, hepatite, endo-
metriose e pericardite, e n o i n i c i o da gravidez. C A 125 p o d e ser
ú t i l na avaliação do estado da doença em pacientes c o m endo-
metriose avançada, mas não n o rastreamento de câncer ovariano
em populações assintomáticas, p o r q u e ele t e m baixa especifici-
dade para o câncer de ovário. Ele t a m b é m não p o d e ser usado
para diferenciar câncer ovariano de outras malignidades.
N o c a r c i n o m a ovariano, o C A 125 é elevado e m 5 0 % dos
pacientes c o m doença n o estágio I, 9 0 % c o m estágio I I e mais
de 9 0 % c o m estágios I I I e I V . A concentração de C A 125 se
correlaciona c o m o t a m a n h o e o estadiamento do t u m o r . C A
125 é t a m b é m ú t i l para diferenciar doença b e n i g n a de maligna
em pacientes c o m massas ovarianas palpáveis. Esta diferenciação
é i m p o r t a n t e porque a intervenção cirúrgica para massas ovaria-
nas malignas é m u i t o mais extensa do que a de massas benignas.
E i n h o r m e colaboradores estudaram 100 pacientes que sofreram
l a p a r o t o m i a diagnostica de massas anexiais palpáveis; desses, 23
apresentaram m a l i g n i d a d e . U s a n d o u m v a l o r de decisão de 35
k U / L , a sensibilidade, a especificidade e os valores preditivos
positivo e negativo para a doença m a l i g n a f o r a m , respectiva-
mente, 7 8 % , 9 5 % , 8 2 % e 91%.
Q u a n d o usado e m termos de prognóstico, u m C A 125 pré-
o p e r a t ó r i o m e n o r q u e 65 k U / L está associado a u m a taxa de
sobrevivência de 5 anos significativamente m a i o r ( 4 2 % versus
5%). Concentrações de C A 125 pós-operatório e a taxa de declí-
n i o são t a m b é m preditores de sobrevivência. Pacientes c o m meia-
vida p r o l o n g a d a (22 dias) r e s p o n d e r a m p o b r e m e n t e ao trata-
m e n t o q u a n d o comparados c o m aqueles c o m u m a meia-vida
mais c u r t a (9 dias). A meia-vida n o r m a l de C A 125 é 4,8 dias.
C A 125 t a m b é m é ú t i l para detectar doença residual e m
pacientes c o m câncer que seguem o t r a t a m e n t o inicial. A sensi-

bilidade de C A 125 para detectar tumores antes de laparotomia
repetida é 5 0 % e a especificidade é 96%. Após quimioterapia, as
concentrações de C A 125 fornecem uma indicação do prognós-
tico da doença. U m a diminuição da concentração de C A 125
por u m fator de 10, após o primeiro ciclo de quimioterapia, é
u m indicativo de melhora. Elevação persistente das concentra-
ções de C A 125 após três ciclos de quimioterapia indica u m
prognóstico r u i m .
N a detecção de metástase recorrente, o uso de C A 125 como
u m indicador é aproximadamente 75% acurado. O intervalo de
tempo da elevação de C A 125 até a recidiva clinicamente detec-
tável é cerca de 3 a 4 meses. C A 125 se correlaciona com pro-
gressão ou regressão da doença em 80% a 90% dos casos.
Metodologia Analítica
U m ensaio imunorradiométrico de C A 125 foi primeiramente
desenvolvido e produzido por Centocor, Inc., agora Fujirebio
Diagnostics, Malvern, PA, usando u m único anticorpo. U m a
segunda geração de ensaio ( C A 12511) usa u m anticorpo mono-
clonal, M i l , como anticorpo de captura e O C 125 como o
conjugado. Vários imunoensaios automatizados se encontram
disponíveis.
O u t r o s B i o m a r c a d o r e s de Câncer Ovariano
Muitos outros potenciais biomarcadores de câncer ovariano têm
sido descobertos usando-se tecnologias de microarranjo e outros
métodos. Alguns dos biomarcadores recentemente descobertos
incluem calicreínas, mesotelina, proteína HE4, prostasina, osteo-
pontina e outros antígenos de carboidrato que se mostraram ele-
vados em uma pequena proporção dos cânceres de ovário (p. ex.,
C A 19-9, C A 15-3 etc.). Agora existe uma tendência geral de com-
binar biomarcadores múltiplos, incluindo C A 125, para aumentar
a sensibilidade de detecção de câncer ovariano, especialmente nos
sistemas de rastreamento. Outros têm proposto a taxa de aumento
de C A 125 como uma ferramenta de rastreamento efetiva. O uso
combinado dos marcadores séricos com ultra-sonografia transvagi-
nal geralmente aumenta a sensibilidade dos programas de rastrea-
mento de câncer ovariano, mas compromete a especificidade. O
uso de marcadores bioquímicos como painéis no rastreamento de
câncer de ovário ainda está sob investigação.
ANTÍGENOS DE GRUPOS SANGUÍNEOS
Carboidratos de grupos sanguíneos identificados por anticorpos
monoclonais que têm sido usados como marcadores de cânceres
estão listados na Tabela 20-8. Estes incluem C A 19-9 (Le^ sialilado),
C A 50 (Lê" sialilado, formas afucosiladas), C A 72-4 (Tn sialilado)
e C A 242 (carboidrato sialilado co-expresso com C A 50).
CA 19-9
C A 19-9 é u m marcador de ambos os carcinomas colorretal e
pancreático. Este antígeno de carboidrato é u m glicolipidio -
especificamente, gangliosideo lacto-N-fucopentose sialilado, que
é u m derivado sialilado do antígeno do grupo sanguíneo Lea e é
designado Lexíl. A expressão do antígeno requer o p r o d u t o gênico
de Lewis, 1,4-fucosil transferase. C A 19-9 é sintetizado pelas
células dos duetos pancreático e biliar humanos normais e pelos
epitélios gástrico, do cólon, do endométrio e salivar. N o soro, ele
existe como uma mucina, u m complexo glicoprotéico de alta
massa molecular (200 a 1.000 kDa). Pacientes que são genotipi-
camente Le ab (cerca de 5%) não expressam C A 19-9. O anticorpo
monoclonal contra C A 19-9 foi desenvolvido a partir de uma
linhagem de células de carcinoma de cólon h u m a n o , SW-1116.
A p l i c a ç õ e s Clínicas
A medida quantitativa de C A 19-9 n o soro tem sido aprovada
pela F D A para uso como auxiliar no m o n i t o r a m e n t o de pacien-
Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 365
tes diagnosticados com câncer pancreático que têm concentra-
ções elevadas. Concentrações elevadas de C A 19-9 (>37 k U / L )
discriminam o câncer pancreático da doença pancreática benigna;
estudos relatam sensibilidades e especificidades que variam de
69% a 93% e 76% a 99%, respectivamente. C o m o com todos os
marcadores tumorais, elevar o limite de decisão aumenta a espe-
cificidade para o câncer pancreático, mas d i m i n u i a sensibilidade.
Concentrações elevadas são encontradas em pacientes com cân-
ceres pancreático (80%), hepatobiliar (67%), gástrico (40% a
50%), hepatocelular (30% a 50%), colorretal (30%) e de mama
(15%). Alguns pacientes (10% a 20%) com pancreatite e outras
doenças gastrointestinais benignas têm concentrações elevadas
até 120 k U / L . Concentrações de C A 19-9 se correlacionam com
o estadiamento de câncer pancreático. C o m o corte de 37 k U / L ,
67% dos pacientes com câncer pancreático ressecável e 87%
daqueles com câncer não ressecável têm valores elevados. Aumen-
tando o corte para 1.000 k U / L , 3 5 % dos pacientes com tumores
não operáveis e somente 5 % daqueles com tumores operáveis
têm valores de C A 19-9 elevados.
C A 19-9 também é ú t i l para estabelecer prognóstico no diag-
nóstico inicial. Concentrações de C A 19-9 sérico possuem valor
preditivo independente para a determinação de ressecabilidade
de câncer pancreático e de sobrevivência do paciente em geral.
Concentrações elevadas ou crescentes também podem indicar
recidiva 1 a 7 meses antes da detecção por radiografias ou dos
achados clínicos. Infelizmente, detecção precoce de recidiva não
pode ser ú t i l por causa da falta de tratamento efetivo para câncer
pancreático.
Metodologia Analítica
Várias empresas têm produzido imunoensaios para C A 19-9.
Geralmente o anticorpo C A 19-9 é usado tanto como anticorpo
de captura como de sinal
CA 72-4
C A 72-4 é um marcador de carcinomas do trato gastrointestinal
e de ovário. B72.3 é u m anticorpo monoclonal desenvolvido a
partir da fração enriquecida em membrana de u m carcinoma de
mama de u m paciente com metástase de fígado. Quando 6 k U / L
é usado como l i m i t e de decisão, as seguintes percentagens de
elevação são observadas: indivíduos saudáveis, 3,5%; doenças
gastrointestinais benignas, 6,7%; carcinoma gastrointestinal,
40%; câncer de pulmão, 36%; e câncer de ovário, 24%. U m a
correlação clínica r u i m entre as concentrações de C E A e C A 72-4
f o i encontrada n o câncer gástrico. Os valores de C E A e C A 72-4
podem ser complementares. A depuração plasmática de C A 72-4
foi estudada pela dosagem sequencial de valores de C A 72-4 em
pacientes com carcinoma primário de mama e com cânceres gás-
trico, colorretal e ovariano. Após remoção do tumor, o tempo
médio necessário para a concentração d i m i n u i r para 4 k U / L foi
23,3 dias. Isto sugere que C A 72-4 pode ser ú t i l na detecção de
tumor residual nestes pacientes com câncer.
C A 72-4 é medido usando-se u m ensaio imunorradiométrico
( I R M A ) fornecido por Fujirebio Diagnostics. Ele usa dois anti-
corpos monoclonais que foram desenvolvidos n o National
Câncer Institute. B72.3 é o conjugado, enquanto cc49 é o anti-
corpo de captura.
CA 242
C A 242 é u m marcador para cânceres pancreático e colorretal.
Ele é u m anticorpo monoclonal desenvolvido a partir de uma
linhagem celular de carcinoma colorretal humano, C O L O 205.
O determinante antigênico é u m carboidrato sialilado. C A 242
reconhece os epítopos de C A 50 e C A 19-9. Ele é encontrado
366 PARTE IV Aralitos
TABELA 20-9 Proteínas como Marcadores Tumorais
Nome Natureza
PrMicroglobulina 11 kDa
Peptídeo C 3,6 kDa
Ferritina Proteína de ligação ao ferro de 450 kDa
Imunoglobulina 160-900 kDa, 3%-12% de CH0
Antígeno associado a melanoma 90-240 kDa
Antígeno associado ao pâncreas 100 kDa, 20% de CH0
Proteína 1 específica da gravidez 10 kDa, 30% de CH0
Precursor de prolrombina Prolrombina des-r-carboxi
Inibidor de tripsina associado a tumor Polipeptídeo de 6 kDa
nas células ductais e apicais da b o r d a d o pâncreas h u m a n o e n o
e p i t é l i o e células globet da mucosa d o c ó l o n .
C o m u m valor de corte de 20 k U / L , os valores elevados de
C A 242 f o r a m e n c o n t r a d o s e m 5% a 3 3 % dos pacientes c o m
doenças benignas d o c ó l o n , gástricas, hepáticas, pancreáticas e
d o trato b i l i a r ; e m 6 8 % a 7 9 % dos pacientes c o m câncer pancre-
ático m a l i g n o ; em 5 5 % a 8 5 % dos pacientes c o m câncer color-
retal; e e m 4 4 % dos pacientes c o m câncer gástrico. Os coeficien-
tes de correlação (R 2 ) dos valores de C A 242, C A 5 0 e C A 19-9
e m pacientes c o m doenças culurretais, d o fígado, pancreáticas e
d o trato b i l i a r v a r i a m de 0,81 a 0,95. E m geral, C A 242 parece
ser m e n o s eficiente que C A 19-99 o u C A 5 0 n a detecção de
câncer pancreático; e n t r e t a n t o , isto p o d e depender dos valores
de decisão usados.
PROTEÍNAS
Diversas proteínas c o m p o t e n c i a l de m a r c a d o r t u m o r a l estão
listadas n a Tabela 20-9. Incluídas neste g r u p o de marcadores de
t u m o r estão as proteinas q u e n ã o são enzimas, h o r m ô n i o s , o u
aquelas c o m c o n t e ú d o elevado de c a r b o i d r a t o . Pesquisa a d i c i o n a l
se faz necessária para avaliar a u t i l i d a d e clínica da m a i o r i a desses
marcadores.
Imunoglobulina
A i m u n o g l o b u l i n a m o n o c l o n a l t e m sido usada c o m o marcador
de m i e l o m a m ú l t i p l o p o r mais de 100 anos. Paraproteínas m o n o -
clonais aparecem c o m o bandas intensas n a área da g l o b u l i n a de
padrões eletroforéticos d o soro. M a i s de 9 5 % dos pacientes c o m
m i e l o m a m ú l t i p l o t ê m este padrão eletroforético. O apareci-
m e n t o de i m u n o g l o b u l i n a s m o n o c l o n a i s não malignas a u m e n t a
c o m a idade, a t i n g i n d o 5 % dos pacientes c o m mais de 75 anos.
Estas bandas m o n o c l o n a i s não malignas estão geralmente e m
concentração mais baixa d o que as bandas malignas (<10 g / L ) e
n ã o estão associadas à p r o t e í n a Bence Jones. A expressão "gamo-
patia m o n o c l o n a l de significado i n d e t e r m i n a d o " ( M G U S ) é fre-
q ü e n t e m e n t e usada para se referir a estas i m u n o g l o b u l i n a s . A
p r o t e í n a Bence Jones é u m a cadeia leve de i m u n o g l o b u l i n a
m o n o c l o n a l livre n a u r i n a . A concentração de i m u n o g l o b u l i n a
m o n o c l o n a l n o diagnóstico i n i c i a l é u m i n d i c a d o r p r o g n ó s t i c o
de progressão da doença. D u r a n t e o t r a t a m e n t o , a concentração
sérica da p r o t e í n a Bence Jones u r i n á r i a o u a m e d i d a das cadeias
leves livres n o soro r e f l e t e m o sucesso da terapia. Concentrações
mais baixas estão associadas a u m resultado mais favorável. Para-
proteínas séricas são discutidas n o C a p í t u l o 18.
Proteínas S-100
As proteínas S-100 são u m g r u p o de pelo m e n o s 19 proteínas de
ligação ao cálcio relacionadas. Sua f u n ç ã o fisiológica é incerta;
Tipo de Câncer
Mieloma múltiplo, linfoma de célula B,
leucemia lirifocítica crônica, macroglobulinemia
de Waldenstrcm
Insulinoma
Fígado, pulmão, mama, leucemia
Mieloma múltiplo, lintomas
Melanoma
Pancreático, estômago
Trofoblástica, célula germinativa
Hepatoceluiar
Pulmão, gastrointestinal, ovário
e n t r e t a n t o , alguns m e m b r o s têm sido associados à progressão d o
câncer, especialmente S-100A4, S-100A2, S-100A6 e S-100p. S-
1 0 0 A 4 é n o r m a l m e n t e expressa e m células i m u n e s selecionadas,
c o m expressão fraca e m q u e r a t i n ó c i t o s , m e l a n ó c i t o s e células de
Langerhans 9 . Ela não é expressa n a m a m a , n o c ó l o n , na tireóide,
n o p u l m ã o , n o r i m o u n o pâncreas. A expressão de S-100A4 n o
câncer de m a m a , n o c a r c i n o m a escamoso d o esôfago e nos cân-
ceres gástricos se correlaciona c o m u m a conseqüência p i o r e
doença mais agressiva, e f o i m o s t r a d o que ela é u m m a r c a d o r
i n d e p e n d e n t e de p r o g n ó s t i c o na análise m u l t i v a r i a d a . A falra de
expressão e m tecido n o r m a l e sua expressão n o tecido t u m o r a l a
t o r n a m u m excelente c a n d i d a t o ao uso histológico de r o t i n a
c o m o u m marcador de câncer.
S-100(3 é r o t i n e i r a m e n t e usada c o m o u m marcador histológico
diagnóstico de m e l a n o m a e metástase de m e l a n o m a . Recente-
m e n t e a m e d i d a de suas concentrações séricas t e m sido investi-
gada para m o n i t o r a r recidiva da doença. N a ausência de mela-
n o m a , as concentrações séricas de 3-100(3 são n o r m a l m e n t e não
detectáveis; entretanto, c o m doença recorrente, S-100J3 aumenta.
Usando-se u m i m u n o e n s a i o ( L I A - m a t Sangtec 100; Byk-Sagtec
Diagnostics, A l e m a n h a ) , f o i sugerido que u m corte de 0,12 ] i g / L
fornece sensibilidade e especificidade de 0,29 e 0,93, respectiva-
mente. S-100p é u m m a r c a d o r mais sensível e específico para
m e l a n o m a recorrente e é capaz de detectar recidiva mais cedo que
L D o u A L P (marcadores tradicionais de recidiva de melanoma).
Tireoglobuliria e Anticorpos
A t i r e o g l o b u l i n a (Tg) é p r o d u z i d a pela g l â n d u l a tireóide c o m o
precursor d o h o r m ô n i o da tireóide ( C a p í t u l o 41). O p r i n c i p a l
uso da m e d i d a de Tg é c o m o m a r c a d o r t u m o r a l para pacientes
c o m u m diagnóstico de câncer de tireóide diferenciado. 1 0 A p r o -
x i m a d a m e n t e dois terços desses pacientes t ê m u m T g pré-opera-
t ó r i o elevado. U m a concentração de Tg pré-operatória elevada
c o n f i r m a a capacidade d o t u m o r de secretar T g e valida o uso da
m e d i d a pós-operatória de Tg para m o n i t o r a r a recidiva d o t u m o r .
E m termos pós-operatórios, o m é t o d o mais sensível para detectar
t u m o r residual o u metástase é a observação após e s t í m u l o de
T S H . E m t u m o r e s b e m diferenciados, u m a u m e n t o de dez vezes
nas concentrações de T g é observado após e s t í m u l o de T S H .
T u m o r e s p o b r e m e n t e diferenciados, que n ã o c o n c e n t r a m iodo,
p o d e m revelar u m a resposta brusca ao e s t í m u l o de T S H . M o n i -
torar T g geralmente n ã o é ú t i l e m pacientes que n ã o t ê m T g
pré-operatório elevado.
A n t i c o r p o s a n t i t i r e o g l o b u l i n a p o d e m t a m b é m ser usados
para m o n i t o r a r doença residual o u recidiva, ou ambos. 11 M e d i d a s
de anti-Tg seriadas t ê m sido propostas c o m o u m i n d i c a d o r prog-
nóstico i n d e p e n d e n t e d o t r a t a m e n t o p o r q u e u m a u m e n t o nos
a n t i c o r p o s anti-Tg p o d e sugerir recidiva d o t u m o r .

I M A e R I A são os dois principais métodos usados para a
medida de Tg. Os ensaios de I M A têm a vantagem de ter u m
tempo de incubação mais curto e são automatÍ2áveis; entretanto,
eles sofrem interferências maiores. As principais interferências
em ambos os ensaios são anticorpos antitireoglobulina, que
causam uma subestimativa de Tg no I M A . Anticorpos antitireo-
glogulina podem ser medidos diretamente em todos os pacientes
ou, se ambos I M A e R I A são usados para medir Tg, u m resultado
discordante sugere a presença de anticorpos antitireoglobulina.
Cromograninas
Cromograninas são uma família de componentes proteicos pre-
sentes nos grânulos secretores da maioria das células neuroendó-
crinas. A família granina consiste em três principais grupos de
proteína, cromogranina A (CgA), B (CgB) e secretogranina I I , III,
I V e V As cromograninas são encontradas nas células neuroen-
dócrinas por todo o corpo, i n c l u i n d o as células neurais dos sis-
temas nervosos central e periférico. Tem sido sugerido que elas
desempenham uma função na regulação dos grânulos secretores.
A l é m disso, as cromograninas secretadas podem ser proteolitica-
mente processadas pata formar peptídeos bioativos. A cromogTa-
nina A é a mais estudada das cromogtaríinas, é amplamente
expressa por tecido neuroendócrino e é co-secretada por células
neuroendócrinas juntamente com hormônios peptídeos e neuro-
peptídeos. Esta ampla distribuição e co-secreção a torna u m exce-
lente marcador histoquímico e plasmático de tumores neuroen-
dócrinos.
Aplicações Clínicas
Estudos têm mostrado que tanto CgA quanto CgB são úteis na
detecção de vários tumores neuroendócrinos, incluindo tumores
carcinóides, feocromocitoma e neuroblastoma. Na maioria dos
casos, CgA é produzida em concentrações mais altas do que CgB;
entretanto, em alguns casos, CgB é positiva quando CgA é nega-
tiva, portanto, pode ser vantajoso medir as duas. N o caso dos
tumores carcinóides, os tumores dos intestinos anterior e médio
são normalmente tumores funcionais que produzem serotonina.
CgA é tão específico para detecção de ambos os tumores carci-
nóides dos intestinos anterior e médio quanto o metabólito de
serotonina ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA), e é o marcador
preferido dos tumores distais, que são comumente não funcio-
nais. Embora os tumores não funcionais tenham perdido a capa-
cidade de secretar serotonina, eles retêm a capacidade de secretar
cromograninas. Para detecção de feocromocitomas, C g A pode ser
tão sensível e específico quanto as catecolaminas plasmáticas ou
metanefrinas urinárias.
Metodologia Analítica
Atualmente, C g A é medida por imunoensaio. Dependendo do
ensaio, anticorpos policlonais o u monoclonais são usados. Deve-
se tomar cuidado na escolha de u m teste, visto que C g A e as
outras cromograninas são m u i t o processadas após liberação, o
que pode torná-las não detectáveis pelo ensaio e produzir resul-
tados falso-negativos. Portanto, u m teste que reconheça as molé-
culas intactas e processadas é desejável. Ensaios comerciais para
a CgB ainda não estão disponíveis.
RECEPTORES E OUTROS MARCADORES
TUMORAIS
Outros marcadores tumorais - incluindo catecolaminas, poliami-
nas, ácido siálico associado a lipídio e receptores - t ê m sido
usados clinicamente com vários graus de sucesso. Os receptores
são provavelmente os mais bem sucedidos deste grupo de marca-
Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 367
dores. As catecolaminas e seus metabólitos são discutidos no
Capítulo 26.
Receptores de E s t r ó g e n o e Progesterona
Os receptores de estrógeno e progesterona são usados para o câncer
de mama como indicadores de hormonoterapia,' Os pacientes
com receptores de estrógeno e progesterona positivos tendem a
responder ao tratamento hormonal. Aqueles com receptores nega-
tivos serão tratados por outras terapias, tais como quimioterapia.
Os receptores de h o r m ô n i o também servem como fatores prognós-
ticos em câncer de mama. Pacientes positivos para os receptores
de estrógeno e progesterona têm u m prognóstico melhor.
Bioquímica
Os receptores de estrógeno (ERs) e de progesterona (PRs) são
membros da família de receptores de h o r m ô n i o esteróide nuclea-
res e estão envolvidos na ativação transcricional hormônio-dite-
cionada. Ambos os ERs e PRs estão presentes em um grande
complexo proteico, e sob a ligação do h o r m ô n i o , os receptores
migram para o núcleo, ligam-se ao D N A e ativam a transcrição.
Estrógeno e progesterona têm pelo menos dois receptores
separados. Estrógeno tem E R a e E R p , que são transcritos a partir
de genes distintos. Duas formas de PR, PR-A e PR-B, também
existem e ambos são transcritos a partir do mesmo gene. PR-A
não tem os primeiros 165 aminoácidos de PR-B.
Os ERs e PRs são encontrados em tecidos, tais como os de
útero, glândula pituitária, hipotálamo e mama, e parecem estar
envolvidos n o desenvolvimento e na progressão do tumor. A l é m
disso, o estado de ER e PR se correlaciona tanto com o prognós-
tico quanto com a resposta ao tratamento; portanto, medir as
concentrações de ERs e PRs é clinicamente útil.
Aplicações Clínicas
A dosagem de ER no tecido t u m o r a l de mama é ú t i l como indi-
cador prognóstico e na determinação de probabilidade de hor-
monoterapia. Dos pacientes com carcinoma da mama, 60% t ê m
tumores que são ER-positivos. E 7 a 8 vezes mais provável que
estes respondam à terapia endócrina, tais como tamoxifen, tore-
mifeno e droloxifeno. A l é m disso, a U.S. National Câncer Insti-
tute Consensus Statement sugere que todos os pacientes com
câncer de mama que têm ER-positivos devem sofrer tratamento
h o r m o n a l independentemente de suas idades, estado de meno-
pausa, estado nodal ou tamanho do tumor. Noventa e cinco por
cento dos pacientes com tumores ER-negativos falham nesta res-
posta. Quanto maior o conteúdo de ER do tumor, mais alta é a
taxa de resposta à terapia endócrina. Aproximadamente u m terço
das mulheres com carcinoma de mama metastático obtém remis-
são clínica seguindo vários tipos de terapia endócrina direciona-
dos para d i m i n u i r suas concentrações de estrógeno. Tais terapias
incluem ooforectomia, hipofisectomia e adrenalectomia (terapia
ablativa), e administração de antiestrógenos e andrógenos (terapia
aditiva). C o m o u m indicador prognóstico, a positividade de ER
sugere uma melhor sobrevida de 5 anos; entretanto, após 5 anos
os tumores ER-negativos têm u m prognóstico melhor.
Ocasionalmente um t u m o r é definido como ER-negativo,
mas a paciente responde à terapia endócrina (resultados falso-
negativos produzidos em u m ensaio de ER). Resultados falso-
positivos de ensaios de ER ( t u m o r ER-positivo, mas nenhuma
resposta à terapia endócrina) são mais comuns do que os resul-
tados falso-negativos. A explicação mais freqüente é a heteroge-
neidade do tumor, com biópsia de um local que não é represen-
tativo de outros depósitos tumorais. A l é m deste problema, existe
evidência de que algumas células tumorais têm defeitos de recep-
tor nas etapas anteriores às iniciais de ligação do h o r m ô n i o .
368 PARTE IV Analitos
O teste de PR é u m auxiliar útil para o ensaio de ERs. C o m o a
síntese de PR parece ser dependente da ação do estrógeno, a dosagem
da atividade de PR fornece a confirmação de que todas as etapas da
ação de estrógeno estão intactas. De fato, as pacientes com câncer
de mama metastático com ambos os tumores ER- e PR-positivos têm
uma taxa de resposta à terapia endócrina de 75%, enquanto aquelas
com tumores ER-positivos e PR-negativos têm uma taxa de resposta
de 40%. A l é m disso, somente 25% de pacientes ER-negativos/PR-
positivos respondem à terapia endócrina, enquanto menos de 5 %
dos pacientes ER-negativos/PR-negativos respondem. A porcenta-
gem de amostras positivas é maior em mulheres pós-menopausa do
que naquelas que estão em pré-menopausa.
Metodologia Analítica
Os ensaios imunocitoquímicos são usados para medir receptores
de h o r m ô n i o esteróide. Tanto o método bioquímico quantitativo
clássico para analisar os receptores de esteróide em amostras de
tecido tumoral (ensaio de titulação) quanto os imunoensaios
enzimáticos são obsoletos porque os ensaios imunocitoquímicos
são mais baratos e mais simples, requerem menos tempo e podem
ser realizados usando menos tecido.
Os ensaios imunocitoquímicos usam anticorpos monoclo-
nais para detectar proteínas receptoras de esteróide em seções de
tecido congelado, tecidos em bloco de parafina, aspirados por
agulha fina e efusões malignas. Nestes procedimentos, o anti-
corpo monoclonal primário é incubado com uma seção fina do
tecido m o n t a d o em uma lâmina de microscópio. A localização e
a visualização d o material receptor são subseqüentemente reali-
zadas por uma coloração de imunoperoxidase indireta. Amostras
com coloração em pelo menos 20% das células malignas são
geralmente consideradas receptor-positivas. Ensaios imunocito-
químicos não são influenciados pela presença de estrógenos,
antiestrógenos ou proteínas de ligação a esteróide. A l é m disso,
os métodos imunocitoquímicos possibilitam estudar o conteúdo
de receptor especificamente em células tumorais.
Receptor d o Fator de C r e s c i m e n t o
Epidérmico
O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) é u m
protótipo de u m a família de receptores de tirosina quinase. Os
ligantes naturais do EGFR são o fator de crescimento epidérmico
(EGF) e o fator de crescimento transformante (TGF)-a. Em
tecido tumoral, estes fatores podem promover crescimento tanto
do tipo parácrmo quanto do tipo autócrino. Em uma análise de
mais de 200 estudos completados entre 1985 e 2000, determi-
nou-se que a superexpressão de E G F R tinha valor prognóstico
em muitos cânceres. Foi observado que o EGFR é u m indicador
de prognóstico forte em cânceres de cabeça e pescoço, de ovário,
cervical, de bexiga e esofágico. Os pacientes com EGFR elevado
mostraram sobrevivência geral reduzida em 70% dos estudos.
Nos cânceres de mama, colorretal, gástrico e de endométrio,
observou-se que EGFR é u m indicador prognóstico moderado,
com 5 2 % dos estudos mostrando sobrevivência reduzida quando
quantidades elevadas de E G F R são observadas. O fato de que
E G F R está envolvido na progressão de vários tipos de tumor
significa que ele representa u m potencial ponto de intervenção
e tratamento destes cânceres. T ê m sido desenvolvidos muitos
compostos que inibem a sinalização de EGFR por bloqueio da
ligação do ligante ou inibição da atividade de tirosina quinase.
EGFR é medido em tecido por ensaios imunocitoquímicos e
hibridização in situ por fluorescência (FISH).
MARCADORES GENÉTICOS
O crescimento tumoral é uma característica herdável das células
e se acredita que seja o resultado de mudanças genéticas. M ú l t i -
plas alterações genéticas podem ser necessárias para a transfor-
mação de uma célula de u m estado normal para u m tumoral e,
finalmente para a disseminação metastática. Portanto, a avaliação
de alterações cromossômicas pode preencher a lacuna deixada
pelos marcadores bioquímicos tradicionais do soro n o estabele-
cimento do risco de câncer e rastreamento de câncer.
Duas classes de genes estão envolvidas no desenvolvimento
do câncer- oncogenes e genes supressores. Os oncogenes são
derivados dos proto-oncogenes que podem ser ativados por muta-
ções dominantes, tais como mutações de ponto, inserções, dele-
ções, translocações ou inversões. A maioria dos oncogenes codi-
fica proteínas que f u n c i o n a m em alguma etapa da ativação de
células para proliferação, e sua ativação leva à divisão celular.
Grande parte dos oncogenes está associada a cânceres hematoló-
gicos, tais como leucemia e, em uma menor extensão, a tumores
sólidos. A outra classe de genes tumorais, os genes supressores,
tem sido isolada, na maioria das vezes, de tumores sólidos. A
oncogenicidade de genes supressores é derivada da perda do
gene, ao invés de sua ativação, como com os oncogenes. Deleção
ou monossomia podem levar à perda dos genes supressores de
tumor. O principal gene supressor de tumor, TP53, atua no
reparo do dano ao D N A e pode iniciar a apoptose (morte celular
programada). O reparo é mediado pela ativação da produção de
p21, que bloqueia o ciclo celular no final de G j para permitir
que o reparo aconteça. A perda de função deste gene causada por
perda o u mutação pode resultar na incapacidade do processo de
reparo do D N A e levar à tumotigênese.
E esperado que o conhecimento da seqüência do genoma
h u m a n o e a identificação de todos os genes permitirão a deter-
minação de quais genes são expressos diferencialmente ou de
forma anormal n o câncer, e da função das mutações ou dos
rearranjos desses genes no desenvolvimento e na progressão do
câncer. Por exemplo, a identificação de polimorfismos de u m
único nucleotídeo e de outras diferenças genéticas entre os indi-
víduos pode permitir o desenvolvimento de modelos para predi-
zer a predisposição i n d i v i d u a l ao câncer e a propagação de estra-
tégias de prevenção efetivas, tais como vigilância, quimiopreven-
cão e modificações nutricionais e de estilo de vida.
Oncogenes
Os proto-oncogenes são genes celulares normais relacionados aos
genes de vírus tumorais. Foi observado que a ativação dos proto-
oncogenes está associada ao câncer. Estes genes codificam produ-
tos que estão envolvidos nos processos celulares normais, tais
como vias de sinalização de fatores de crescimento. Superexpres-
são do oncogene levará ao crescimento celular anormal, resul-
tando em câncer. Tem sido mostrado que dos mais de 40 proto-
oncogenes identificados, somente uns poucos são marcadores
tumorais úteis.
Genes ras
Os genes ras foram primeiramente identificados como sendo
responsáveis pelas propriedades tumorigênicas dos vírus dos sar-
comas de Harvey (H^rcu) e Kirsten (K-ras), que produzem tumores
em animais, e forneceram a primeira evidência de que as equiva-
lências nas células humanas poderiam estar envolvidas n o desen-
volvimento de tumores. As proteínas codificadas pelos genes ras
estão localizadas na face interna da membrana plasmática. Elas
se ligam a nucleotídeos de guanina e atuam como interruptores
moleculares que regulam os sinais mitogênicos dos fatores de
crescimento para o núcleo através das vias de transdução de sinal.
As proteínas Ras são ativadas em associação com os receptores
de proteína-tirosina quinase e são necessárias para a proliferação
induzida por fator de crescimento ou para a diferenciação de

m u i t o s tipos celulares. N^ras é e n c o n t r a d o n o braço c u r t o d o
c r o m o s s o m o h u m a n o 1. Alterações e m N-ras parecem c o n s t i t u i r
u m a etapa crítica da caicinogênese. O gene N-ras m u t a d o é
e n c o n t r a d o e m n e u r o b las tomas e leucemia m i e l ó i d e aguda. K-ras
m u t a d o está presente e m 9 5 % dcs cânceres pancreáticos, 4 0 %
dos cânceres de c ó l o n , e 3 0 % dos cânceres de p u l m ã o e bexiga,
e e m percentagens mais baixas em o u t r o s tumores. U m a ú n i c a
m u t a ç ã o de p o n t o n o d é c i m o segundo c ó d o n de K-TOS altera o
a m i n o á c i d o c o d i f i c a d o de glicina para v a l i n a na p r o t e í n a p21.
Esta m u t a ç ã o é de longe a mais f r e q ü e n t e m e n t e e n c o n t r a d a e m
cânceres. M u t a ç õ e s de K-ras parecem se correlacionar c o m prog-
n ó st ico p o b r e e sobrevivência livre de doença mais c u r t a e m
pacientes c o m a d e n o c a r c i n o m a de p u l m ã o e c a r c i n o m a de endo-
m é t r i o . N o e n t a n t o , e m geral, a presença de mutações e m ras t e m
pouca aplicação prática para d e t e r m i n a ç ã o d o prognóstico. O ras
ativado é detectado p o r expressão d o p r o d u t o do gene ras, p21,
e m tecido t u m o r a l . Por i m u n o i s t o q u í m i c a , o p r o d u t o de ras é
e n c o n t r a d o não apenas e m cerca de 4 0 % dos tumores de c ó l o n ,
mas t a m b é m e m p ó l i p o s de c ó l o n , que supostamente são pré-
malignos. U m a intensidade relativa de coloração mais alta para
p21-ras pode d i s c r i m i n a r tecidos t u m o r a i s de n o r m a i s o u de
lesões benignas de tecidos de m a m a , pâncreas; estômago, p u l m ã o ,
ú t e r o o u tireóide. O nível de expressão n o tecido parece se cor-
relacionar c o m o estágio o u grau d o t u m o r , mas p21-ras p o d e
t a m b é m ser visco e m a l g u m tecido n o r m a l , e outros estudos n ã o
m o s t r a m diferença significativa entre t u m o r e s benignos e malig-
nos. O uso de p21 c o m o m a r c a d o r t u m o r a l n o tecido o u n o soro
n ã o é b e m estabelecido. Mutações dos oncogenes ras t ê m sido
detectadas n o D N A das fezes de 9 de 15 pacientes c o m tumores
colorretais curáveis.
Gene c-myc
O gene c-m^c é o proto-oncogene d o vírus d o m i e l o c i t o m a de aves.
Ele se liga ao D N A e está envolvido na regulação da transcrição.
O p r o d u t o gênico, p 6 2 , está localizado n o núcleo de células
transformadas, e os níveis de c-nryc se c o r r e l a c i o n a m c o m a taxa
de divisão celular. A proteína c-myc é essencial para a replicação
do D N A e aumenta a transcrição do m R N A . A ativação d o gene
c-myc está associada a l i n f o m a s de célula B e T, sarcomas e endo-
teliomas. E m leucemias e l i n f o m a s , a expressão a u m e n t a d a de
c-myc p o d e ser devida à amplificação o u translocação cromossô-
mica d o gene. E m leucemias agudas de células T, existe u m a
translocação (8:14) ( q 2 4 : q l l ) q u e resulta e m ativação d o gene, e
esta ativação está associada a u m prognóstico r u i m . U m a d i m i -
n u i ç ã o da expressão de c-mjc após o i n í c i o da q u i m i o t e r a p i a
sugere u m a resposta favorável. Superexpressão de p 6 2 p o d e ser
vista e m 7 0 % a 1 0 0 % dos cânceres de m a m a p r i m á r i o s usando
i m u n o i s t o q u í m i c a , e a intensidade da coloração é m a i o r c o m o
a u m e n t o d o estágio d o t u m o r . A m p l i f i c a ç ã o e m carcinomas de
p u l m ã o e gliomas se correlaciona c o m a agressividade clínica.
Pode existir u m a expressão 5 a 4 0 vezes m a i o r de c-rrvyc e m cân-
ceres de c ó l o n q u a n d o se compara c o m mucosa n o r m a l , mas o
n í v e l de expressão não se correlaciona c o m progressão. U m a
relação s i m i l a r tem sido e n c o n t r a d a e m cânceres cervical, gás-
trico, de fígado e outros. Concentrações sérícas de c-myc t ê m sido
usadas para detectar recidiva, mas não para diferenciar câncer de
doenças benignas.
Her-2/neu
O gene Her-Z/neu ( t a m b é m c o n h e c i d o c o m o c-erbB-2) é assim
c h a m a d o p o r sua associação c o m rumores neurais (neu). Este gene
codifica u m a p r o t e í n a t r a n s m e m b r a n a de 185 k D a expressa e m
células epiteliais e pertence à f a m í l i a E G F de receptores de tiro-
sina quinase. A f a m í l i a E G F i n c l u i q u a t r o m e m b r o s ; o receptor
Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 369
de E G F (EGFR; também conhecido como ErbBl/HER-1),
E r b B 2 / H E R - 2 / n e u , E r b B 3 / H E R - 3 e E r b B 4 / H E R - 4 . A família
E G F de receptores t e m a mesma estrutura geral, c o n s i s t i n d o e m
u m d o m í n i o extracelular de ligação ao ligante ( E C D ) , u m ú n i c o
domínio t r a n s m e m b r a n a e u m d o m í n i o intracelular de tirosina
quinase. O d o m í n i o extracelular p o d e sofrer clivagem proteolí-
tica p o r metaloproteases, l i b e r a n d o o E C D ( c o n h e c i d o c o m o
pl05) no sangue, que pode ser detectado. Todos estão envolvidos
e m proliferação celular, diferenciação e sobrevivência. HER-2/neu
n o r m a l m e n t e é expresso n o e p i t é l i o de i n ú m e r o s órgãos,
i n c l u i n d o p u l m ã o , bexiga, pâncreas, m a m a e próstata, e t e m se
m o s t r a d o elevado e m células t u m o r a i s .
Aplicações Clínicas
A amplificação de H E R - 2 / n e u é observada e m t u m o r e s de m a m a ,
ovariano e gastrointestinal. E m câncer de m a m a , parece ser ú t i l
c o m o i n d i c a d o r t a n t o de p r o g n ó s t i c o de sobrevivência geral
c o m o de t a m a n h o de t u m o r o u expressão de E R e PR, mas n ã o
tão b o m q u a n t a o n ú m e r o de l i n f o n o d o s envolvidos e m metás-
tase. T e m sido m o s t r a d o que coiiceiitrações séTicas elevadas de
antígeno de H E R - 2 / n e u se correlaciona c o m d i m i n u i ç ã o de res-
posta à hormonoterapia de câncer de mama. Dos três oncogenes -
HER-2/neu, ras e c-myc - H E R - 2 / m u t e m o valor prognóstico mais
forte e m câncer de mama.
Concentrações sérícas de p l 0 5 são mais úteis e m câncer de
m a m a , c o m a l g u m uso e m pacientes c o m câncer ovariano. As
concentrações de p l 0 5 e m câncer de m a m a se correlaciona c o m
u m p r o g n ó s t i c o p i o r e u m estado livre de doença mais c u r t o .
Concentrações elevadas de H E R - 2 / n e u t a m b é m se c o r r e l a c i o n a m
c o m t a m a n h o s maiores de t u m o r , positividade de l i n f o n o d o e
escore de grau alto. As concentrações séricas de H E R - 2 / n e u n ã o
são apenas usadas para o p r o g n ó s t i c o , mas p o d e m ser usadas para
o r i e n t a r o t r a t a m e n t o . U m estudo de 719 pacientes c o m câncer
de m a m a m o s t r o u q u e concentrações elevadas de H E R - 2 / n e u e m
pacientes c o m cânceres ER-positivos apresentavam benefício
clínico significativamente m e n o r das terapias h o r m o n a i s . A l é m
disso, o estudo m o s t r o u u m a t e n d ê n c i a e m direção a melhores
resultados c o m inibidores de aromatase dos pacientes c o m H E R -
2/neu sérico elevado. As concentrações séricas de H E R - 2 / n e w são
úteis e m pacientes c o m câncer de m a m a recorrente q u a n d o o
tecido é d i f í c i l de ser o b t i d o . T r a t a m e n t o c o m herceptina ( u m
a n t i c o r p o m o n o c l o n a l d i r e c i o n a d o c o n t r a o receptor de H E R -
2/neu) é agora a d m i n i s t r a d o apenas às pacientes c o m câncer de
m a m a que têm amplificação de H E R - 2 / W u .
E m câncer ovariano, p l 0 5 elevado se correlaciona c o m agres-
sividade a u m e n t a d a d o t u m o r , estágio c l í n i c o mais avançado e
p i o r conseqüência clínica. H E R - 2 / n e u n ã o é ú t i l e m c o m b i n a ç ã o
c o m C A 125 o u sozinho para d i s t i n g u i r t u m o r e s ovarianos benig-
nos de malignos, mas ele pode ser ú t i l n a identificação de u m
s u b g r u p o de pacientes de alto risco.
Metodologia Analilica
A imunoistoquímica é usada para detectar quantidades
aumentadas da p r o t e í n a H E R - 2 / n e u e m células t u m o r a i s . F I S H
t e m sido usado para a detecção da amplificação d o gene HER-
2/neu. A i m u n o i s t o q u í m i c a é u m p r o c e d i m e n t o relativamente
simples e pode ser feita na m a i o r i a dos laboratórios, mas sofre
c o m a variação entre os analistas. F I S H é m e n o s dependente d o
analista, mas só detecta a u m e n t o s n o n ú m e r o de cópias d o gene.
Detecção d o E C D de H E R - 2 / n £ u (p 105) n o SOTO é feito por
E L I S A e i m u n o e n s a i o a u t o m a t i z a d o . A m b o s os ensaios usam os
mesmos anticorpos m o n o c l o n a i s que r e c o n h e c e m diferentes epi-
topos d o E C D que n ã o reagem de f o r m a cruzada c o m q u a l q u e r
o u t r o m e m b r o da f a m í l i a E G F . E i m p o r t a n t e destacar que n ã o
370 PARTE IV Analitos
existe interferência do a n t i c o r p o m o n o c l o n a l terapêutico, her-
ceptina, em q u a l q u e r u m dos ensaios.
bct-2
O p r o d u t o do oncogene bcl-2 é u m a nova proteína integral de
m e m b r a n a de 25 k D a e 239 aminoácidos, que se localiza p r i n c i -
p a l m e n t e nas m e m b r a n a s m i t o c o n d r i a i s e e m outras m e m b r a n a s
celulares. Sabe-se q u e esta p r o t e í n a i n i b e apoptose e c o n t r i b u i
para a sobrevivência de células tumorais, especialmente l i n f o m a
e células leucêmicas. O proto-oncogene bcl-2 f o i i d e n t i f i c a d o e m
l i n f o m a s foliculares, nos quais u m a translocação 14:18 resulta em
formação de u m gene f u s i o n a d o bcí-2-cadeia pesada de i m u n o g l o -
b u l i n a . A ativação do gene bcl-2 através do p r o m o t o r de i m u n o -
g l o b u l i n a resulta em p r o d u ç ã o de altas quantidades da proteína
bcl-2. A proteína é n o r m a l m e n t e expressa em células que têm u m
p e r í o d o de vida l o n g o (p. ex., n e u r ô n i o s ) e em células prolifera-
tivas de linhagens celulares de renovação rápida, tais c o m o as
células epiteliais basais. O oncogene bcí-2 é altamente expresso
em u m a variedade de cânceres hematológicos, i n c l u i n d o l i n f o -
mas, mielomas e leucemias crônicas (doenças malignas caracteri-
zadas p o r sobrevivência celular prolongada). N o c ó l o n n o r m a l ,
células bcl-2-positivas estão restritas a células epiteliais basais,
e n q u a n t o , e m p ó l i p o s displásicos e carcinomas, muitas células
positivas p o d e m ser encontradas nas regiões parabasal e superfi-
cial. A expressão a n o r m a l d o gene bcl-2 parece sei u m evento do
i n í c i o da carcinogênese colorretal. A l é m disso, a superexpressão
do gene bcí-2 está associada ao desenvolvimento de resistência à
q u i m i o t e r a p i a citotóxica de câncer em u m a variedade tumores,
i n c l u i n d o tumores epiteliais e linfomas. P o r t a n t o , a detecção do
p r o d u t o do gene bcl-2 em tumores é u m a indicação de progressão.
Estudos f u t u r o s p o d e m d e t e r m i n a r sua u t i l i d a d e para predizer
resistência à q u i m i o t e r a p i a .
BCR-ABL
A leucemia m i e l ó i d e crônica ( C M L ) é u m a doença m i e l o p r o l i f e -
rativa resultante da expansão c l o n a l de u m a célula-tronco hema-
topoiética m u l t i p o t e n t e t r a n s f o r m a d a . E m a p r o x i m a d a m e n t e
9 0 % dos pacientes corn C M L , o evento t r a n s f o r m a n t e é a f o r m a -
ção do c r o m o s s o m o P h i l a d e l p h i a , u m a translocação balanceada
entre os cromossomos 9 e 22 [ t ( 9 ; 2 2 ) ( q 3 4 ; q l l ) ] c r i a n d o o gene
de fusão BCR-ABL. A proteína derivada desta fusão é u m a tiro-
sina quinase citoplasmática c o n s t i t u t i v a m e n t e ativa que ativa
muitas vias de sinalização que levam ao crescimento e à i n i b i ç ã o
da apoptose.
A detecção da B C R - A B L é ú t i l n o diagnóstico de C M L e n o
d i r e c i o n a m e n t o do t r a t a m e n t o , p o r q u e existem muitas estraté-
gias que t ê m c o m o alvo o gene B C R - A B L p o r oligonucleotídeos
anti-sensos, o u o d o m í n i o quinase de B C R - A B L pelo i n i b i d o r de
tirosina quinase ST1571. A detecção de BCR-ABL, p o r transcri-
ção reversa-reação de polimerase e m cadeia (RT-PCR), t a m b é m é
ú t i l n o m o n i t o r a m e n t o da doença residual m í n i m a em pacientes
que sofreram transplante de m e d u l a óssea. N o subgrupo de
pacientes c o m leucemia linfoblástica aguda que possuem o cro-
m o s s o m o P h i l a d e l p h i a , u m a R T - P C R positiva para o gene BCK-
A B L representa u m risco m u i t o m a i o r de recidiva comparado ao
resultado negativo. E m pacientes c o m C M L após transplante de
m e d u l a óssea, resultados de R T - P C R positivo aos 6 a 12 meses
f o r a m associados ao risco 26 vezes m a i o r de recidiva, e u m resul-
tado positivo aos 3 meses não f o i p r e d i t i v o de risco. A q u a n t i d a d e
de t r a n s c r i t o de B C R - A B L p o r ng de R N A t a m b é m se correlacio-
n o u c o m o risco de recidiva; menos de 1% dos pacientes c o m
u m nível decrescente de m R N A de B C f r A B L o u menos de 5 0
transcritos p o r j i g de R N A em queda, e 7 2 % dos pacientes c o m
mais de 5 0 transcritos p o r |ig de R N A e m queda.
RET
O receptor de tirosina quinase R E T está envolvido e m morfogê-
nese do r i m , maturação do sistema nervoso periférico e diferen-
ciação de espermatogônia. O receptor R E T existe em u m com-
plexo m u l t i m é r i c o que i n c l u i u m dos q u a t r o co-receptores ligados
ao g l i c o s i l f o s f a t i d i l i n o s i t o l (GPI) ( G F R a l , 2, 3 e 4). O complexo
responde a q u a t r o ligantes: fator n e u r o t r ó f i c o derivado da glia
( G D N F ) , n e u r t u r i n a ( N T N ) , persefina (PSP) e artemina. A ativa-
ção de R E T parece ocorrer através de dimerização e transfosfoii-
lação do receptor que recruta i n ú m e r a s moléculas de sinalização.
RET, c o m o outros receptores de t i r o s i n a quinase, ativa as vias de
crescimento posteriores e p o d e r e s u l t a i em sinalização descontro-
lada do câncer.
A ativação inadequada de R E T t e m sido extensivamente estu-
dada em ( í ) câncer de t i r e ó i d e papilar, (2) M E N - 2 e (3) F M T C .
E m cada u m , o mecanismo de ativação de R E T ocorre p o r m e i o
de dimerização e transfosforilação desreguladas do receptor RET.
N o caso do câncer de t i r e ó i d e papilar, u m evento genético cria
u m a fusão entre o d o m í n i o de tirosina quinase do R E T e u m
d o m í n i o de dimerização que p o d e ser d o a d o p o r m u i t o s genes.
E m M E N - 2 A e F M T C , mutações de p o n t o d o d o m í n i o extrace-
lular i n d u z ligações dissulfeto entre os receptores, i n d u z i n d o ,
assim, a dimerização. E m M E N - 2 B , u m a mutação de p o n t o n o
d o m í n i o quinase parece alterar a especificidade do substrato da
tirosina quinase e aparentemente leva à ativação i n a p r o p r i a d a das
vias de crescimento posteriores.
Genes Supressores de Tumor
H i s t o r i c a m e n t e , a evidência dos genes supressores de t u m o r f o i
derivada do estudo de células híbridas de células n o r m a l e
m a l i g n a que se c o m p o r t a v a m n o r m a l m e n t e . Concluiu-se que
células n o r m a i s c o n t i n h a m u m gene que s u p r i m i u a expressão
da m a l i g n i d a d e . Reversão à m a l i g n i d a d e o c o r r e u q u a n d o as
células em cultura p e r d e r a m cromossomos n o r m a i s . O estudo
dos genes supressores p o d e f o r n e c e i u m a pista q u a n t o ao desen-
v o l v i m e n t o d o câncer a p a r t i r do estado celular n o r m a l ao estado
b e n i g n o e canceroso e à metástase. O desenvolvimento do câncer
de c ó l o n requer m ú l t i p l a s etapas que envolvem várias mutações.
A perda de u m gene d o c r o m o s s o m o 5 leva a u m a u m e n t o do
crescimento celular. A d e n o m a em sua fase precoce está associado
à perda de grupos m e t i l da f i t a de D N A . C o m a mutação d o gene
ras e a perda d o gene D C C n o c r o m o s s o m o 18, o ad enoma avança
para o estágio t a r d i o . O c a r c i n o m a é e n c o n t r a d o c o m a perda do
gene TP53 no c r o m o s s o m o 17. F i n a l m e n t e , a metástase ocorre
c o m outras perdas cromossômicas. A u t i l i d a d e clínica de detec-
ção de mutações nos genes supressores de t u m o r recai não apenas
n o diagnóstico e n o prognóstico de câncer, mas t a m b é m na
predição de suscetibilidade q u a n d o a m u t a ç ã o está presente na
l i n h a g e m germinativa, tal c o m o c o m os genes de câncer de m a m a
B R C A 1 e BRCA2.
Gene Retinoblastoma
O r e t i n o b l a s t o m a (RB) é u m t u m o r r a i o de crianças que ocorre
t a n t o em famílias q u a n t o esporadicamente. O trabalho de
K n u d s o n sobre a i n c i d ê n c i a f a m i l i a r específica de R B resultou
na hipótese two-hit. Ele c o n s i d e r o u que, na f o r m a herdada do
t u m o r , u m a mutação estava presente na l i n h a g e m g e r m m a t i v a e
e m todas as células do c o r p o , o o u t r o evento m u t a c i o n a l ocor-
r e n d o somaticamente em u m a das células da retina em desenvol-
v i m e n t o . N a f o r m a esporádica, ambas as mutações o c o r r e m
somaticamente n o m e s m o retinoblasto em d e s e n v o l v i m e n t o , u m
evento relativamente raro. A hipótese tu/ofiit t e m servido c o m o
m o d e l o para outros genes supressores de t u m o r . O gene RB f o i
localizado n o cromossomo 13q p o r perda de u m a região do

b a n d e a m e n t o CTomossômico dos l i n f ó c i t o s d o sangue periférico
de pacientes c o m a f o r m a f a m i l i a r e p o r estudos de perda de
heterozigosidade t a n t o de RBs q u a n t o de alguns osteossarcomas.
E n t r e t a n t o , a m a i o r i a dos t u m o r e s não cem deleções grandes,
mas mutações de p o n t o o u inserções e deleções pequenas que
resultam em truncamenco p r e m a t u r o do p r o d u t o protéico. O
p r o d u t o protéico do gene RB é u m a fosfoproteína nuclear c o m
u m a massa m o l e c u l a r de cerca de 105 k D a ( p l 0 5 - R B ) . Esta pro-
teína se liga a u m p r o d u t o de u m vírus t u m o r a l de D N A ,
i n c l u i n d o a proteína E I A d o vírus t u m o r a l m u r i n o e a p r o t e í n a
E7 do p a p i l o m a v í r u s h u m a n o . Q u a n d o p l 0 5 - R B é h i p o f o s f o r i -
lado, ele se c o m p l e x a com^fatores de transcrição, tais c o m o E2F,
e b l o q u e i a a transcrição de genes das células na fase S. E2F
dimeriza c o m u m a proteína D P e regula a transcrição de vários
genes envolvidos na síntese de D N A . Inativação o u perda de
p 105-RB desregula as sínteses de D N A e a u m e n t a a proliferação
celular. P o r t a n t o , RB é u m gene supressor de t u m o r , na m e d i d a
em que ele s u p r i m e a síntese de D N A . A detecção de mutações
e m RB é ú t i l na determinação da suscetihilidade de u m i n d i v í d u o
ao d e s e n v o l v i m e n t o de R B na f o r m a f a m i l i a r , mas ela não é usada
como marcador tumoral.
Gene TP53
D e particular interesse é o gene TP53 que se localiza n o cromos-
somo 17q. Acredita-se que p 5 3 nativa o u selvagem c o n t r o l a a
divisão celular p o i regulai a entrada na fase S. Este efeito de
c o n t r o l e da proteína p 5 3 pode ser p e r d i d o p o r deleção d o gene
o u produção de u m a proteína m u t a n t e capaz de c o m p e t i r . E n t r e
3 5 % e 4 0 % dos carcinomas de c ó l o n m o s t r a m deleção e m u m
alelo de TP53 e u m a mutação de p o n t o n o o u t r o alelo; p o r t a n t o ,
n e n h u m a proteína p53 selvagem é expressa nestes/ tumores.
Deleção alélica de TP53 ocorre apenas raramente e m / a d e n o m a s
(menos de 10%), sugerindo que a inativação de TP53 p o d e ser
u m evento relativamente t a r d i o na carcinogênese de c ó l o n . A l é m
disso, até 2 5 % dos cânceres de m a m a t a m b é m têm TP53 alterado.
Mutações e m TP53 p r o d u z e m proteínas p 5 3 inativas, p e r m i t i n d o
que as células se m o v a m através do ciclo celular e c o n t r i b u i n d o
para o crescimento a u t ô n o m o do câncer. M u i t a s mutações dife-
rentes de TP53 t ê m sido encontradas em cânceres h u m a n o s .
G r a n d e parte das mutações de p o n t o está localizada e m q u a t r o
regiões da proteína (resíduos de aminoácidos 117-142, 171-181,
134-158 e 270-286); três "hot-sfots" (regiões preferencialmente
mutadas) afetam os resíduos 175, 248 e 273. A l é m disso, mutações
seletivas de g u a n i n a para t i m i n a são encontradas n o c ó d o n 249
e m H C C s h u m a n o s de pacientes de áreas de alta i n c i d ê n c i a da
Á f r i c a e da Ásia associadas à exposição à aflatoxina. Mutações nos
códons 245 e 258 são encontradas na s í n d r o m e de L i - F r a u m e n i ,
u m a s í n d r o m e autossômica d o m i n a n t e rara, caracterizada p o r
diversos neoplasmas e m m u i t o s diferentes locais n o c o r p o .
A n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s c o n t r a proteínas p53 mutadas t ê m
sido desenvolvidos. A p 5 3 selvagem está n o r m a l m e n t e presente
e m quantidades m u i t o pequenas que não são detectadas p o r
i m u n o i s t o q u í m i c a , e n q u a n t o a proteína m u t a n t e se a c u m u l a e m
quantidades f a c i l m e n t e detectáveis. Superexpressão das proteínas
m u t a n t e s t e m sido detectada e m até 7 0 % dos cânceres colorretais
p r i m á r i o s . Superexpressão de p 5 3 em cânceres de m a m a está
associada a p r o g n ó s t i c o r u i m , mas esta associação não é tão f o r t e
c o m o a associação c o m c-erbB-2. A t é 7 5 % dos S C C s parecem
superexpressar u m a proteína m u t a n t e (mutação misseme). Final-
mente, a n t i c o r p o s circulantes c o n t r a proteínas p53 m u t a n t e s t ê m
sido e n c o n t r a d o s nos soros de pacientes c o m cânceres de m a m a
e p u l m ã o e l i n f o m a s das células B . Esta resposta d o a n t i c o r p o
pode ser ú t i l neste subgrupo de pacientes para o m o n i t o r a m e n t o
de recidiva.
Marcadores Tumorais CAPÍTULO 20 371
APC
U m dos p r i m e i r o s eventos nas supostas etapas de progressão das
lesões precursoras e m câncer de c ó l o n é a perda do gene polipose
adenomatosa de c ó l o n ( A P C ) era p ó l i p o s pré-malignos. O gene
A P C codifica u m a proteína de 3 0 0 k D a que pode estar truncada
nas células t u m o r a i s . A função n o r m a l do p r o d u t o do gene A P C
não é conhecida, mas ele interage c o m proteínas, tais c o m o a - e
p-cateninas, envolvidas e m interações célula-célula em células
epiteliais. Este gene é m u t a d o nas síndromes hereditárias de
câncer colorretal dos tipos p o l i p o s e e não-polipose. N o s tipos
polipose, centenas e até mesmo milhares o u mais de t u m o r e s
benignos (pólipos) surgem antes d o desenvolvimento do câncer.
N o s tipos não-polipose, m u i t o s p o u c o s pólipos são observados,
mas o risco elevado de câncer é essencialmente similar. O gene
A P C f o i detectado p o r u m a deleção intersticial do c r o m o s s o m o
5 q em u m paciente c o m centenas de pólipos. M a i s de 8 0 % dos
i n d i v í d u o s c o m câncer colorretal h e r e d i t á r i o t ê m mutações ger-
minativas em u m dos alelos A P C , i n c l u i n d o deleções grandes o u
mutações localizadas. As formas hereditárias de câncer c o l o r r e t a l
são relativamente i n c o m u n s , mas mutações somáticas parecem
ser de m u i t a i m p o r t â n c i a n o d e s e n v o l v i m e n t o de cânceres color-
retais não hereditários. M a i s de 7 0 % dos tumores colorretais,
i n d e p e n d e n t e m e n t e do t a m a n h o o u da histologia, t ê m u m a
m u t a ç ã o específica em u m dos d o i s alelos A P C , e a mutação p o d e
t a m b é m ser e n c o n t r a d a e m o u t r o s tipos de t u m o r , i n c l u i n d o
tumores de mama, esôfago e cérebro. A u t i l i d a d e da perda da
p r o t e í n a A P C para diagnóstico e p r o g n ó s t i c o está agora sob inves-
tigação.
Neurofibromatose Tipo 1
N e u r o f i b r o m a t o s e t i p o 1 ( N F 1 ) , o u doença de v o n Recklinghau-
sen, é u m a s í n d r o m e herdada e m padrão d o m i n a n t e , manifes-
tada p r i n c i p a l m e n t e por proliferação de células da crista neural,
r e s u l t a n d o e m n e u r o f i b r o m a s m ú l t i p l o s , manchas café-com-leite
e n ó d u l o s de Lisch da íris. M u t a ç õ e s n o gene N F 1 t ê m sido
encontradas em ceTca de 2 0 % dos pacientes c o m N F 1 . O gene
N F 1 f o i localizado na região p e r i c e n t r o m é r i c a do c r o m o s s o m o
17q, b a n d a 11. Ele é u m gene g r a n d e q u e codifica u m a p r o t e í n a
p 3 0 0 , chamada n e u r o f i b r o m i n a . Esta proteína t e m u m alto grau
de s i m i l a r i d a d e c o m proteínas ativadoras de GTPase. E m b o r a o
m e c a n i s m o de ação exato da p r o t e í n a não seja c o n h e c i d o , parece
que a perda o u a inativação da f u n ç ã o da n e u r o f i b r o m i n a leva a
alterações das vias de transdução d e sinal reguladas p o r proteínas
G similares a ras pequenas, r e s u l t a n d o em sinais c o n t í n u o s do
t i p o "ligado" de ativação celular. M u t a ç õ e s ínativadoras de N F 1
t a m b é m t ê m sido encontradas e m câncer colorretal, m e l a n o m a
e neurobíastoma.
BRCA1 e BRCA2
T e m sido m o s t r a d o que u m s u b g r u p o de pacientes c o m câncer
de m a m a tem u m a predisposição herdada c o m o u m traço autos-
s ô m i c o d o m i n a n t e para desenvolver cânceres de m a m a e ovário.
D o i s loci genéticos t ê m sido i d e n t i f i c a d o s : B R C A l , n o cromos-
s o m o 17q, e BRCA2, que se localiza n o 13q 12-13. B R C A l codi-
fica u m a proteína de 1863 a m i n o á c i d o s q u e p o d e atuar c o m o
fator de transcrição. A capacidade de detectar mutações e m
B R C A l e B R C A 2 em células somáticas p e r m i t e a identificação
de i n d i v í d u o s nas famílias c o m câncer de m a m a que carregam o
gene m u t a d o . Estima-se que 1 e m 2 0 0 mulheres nos Estados
U n i d o s p o d e ter u m a m u t a ç ã o g e r m i n a t i v a n o gene B R C A l . Isto
t e m criado u m d i l e m a ético p a r a os médicos, pacientes e suas
famílias e companhias de seguro e organizações de m a n u t e n ç ã o
da saúde, na m e d i d a e m q u e agora é possível predizeT c o m razoá-
vel certeza que u m i n d i v í d u o q u e carrega u m a m u t a ç ã o em u m
372 PARTE IV Analitos
destes genes desenvolverá cânceres de m a m a e / o u ovário. O que
deve ser feito caso seja observado q u e u m i n d i v í d u o saudável
carrega u m a m u t a ç ã o n o gene BKCA? Portadores de u m a mutação
n o gene BRCA1 t ê m u m risco de 8 5 % de desenvolver câncer de
m a m a e u m risco de 4 5 % de desenvolver câncer de ovário c o m
85 anos. Estes pacientes devem fazer mastectomia ou ovariecto-
m i a preventiva? As c o m p a n h i a s de seguro e as organizações de
m a n u t e n ç ã o de saúde devem ter taxas mais altas para os porta-
dores? Sempre f o i objetivo da pesquisa do câncer ser capaz de
i d e n t i f i c a r i n d i v í d u o s sob risco. A g o r a que é possível, nós
devemos desenvolver u m a política para lidar c o m a informação. 6
E m b o r a a detecção da m u t a ç ã o não seja ú t i l c o m o marcador
t u m o r a l p o r si só, c o m m a i o r e n t e n d i m e n t o de c o m o os p r o d u t o s
d o gene m u t a d o atuam, p o d e ser possível entender os eventos
moleculares que levam ao desenvolvimento de alguns cânceres
de m a m a e ovário.
Deletado em Carcinoma Colorretal
O gene deletado em c a r c i n o m a colorretal ( D C C ) c o d i f i c a u m a
proteína de m e m b r a n a da superfamília da i m u n o g l o b u l i n a . A
f u n ç ã o exata de D C C ainda não f o i elucidada. N o e n t a n t o ,
estudos t ê m sugerido u m a f u n ç ã o n o desenvolvimento axonal
c o m o u m c o m p o n e n t e do receptor de netrina-1, e outros t ê m
sugerido u m a função na p r o m o ç ã o de apoptose. E m câncer de
c ó l o n , acredita-se que D C C atua c o m o u m supTessoT de t u m o r ,
p o r t a n t o , deleção o u expressão reduzidas se c o r r e l a c i o n a m c o m
o a u m e n t o do estágio e u m p r o g n ó s t i c o mais pobre. A o contrá-
r i o , a perda da expressão de D C C e m câncer gástrico esteve
associada a u m m e l h o r prognóstico e u m a m a i o r diferenciação
de células t u m o r a i s . M a i s t r a b a l h o é necessário para d e t e r m i n a r
a função exata de D C C t a n t o e m câncer de c ó l o n q u a n t o e m
o u t r o s cânceres gástricos.
MARCADORES DIFERENTES
N o v o s marcadores i n c l u e m ácidos nucléicos liberados de células,
marcadores de angiogênese e as próprias células tumorais circulan-
tes. Somente os ácidos nucléicos livres de célula serão discutidos.
Á c i d o s Nucléicos Liberados de Células
D N A e R N A circulantes t ê m sido identificados desde os anos de
1970, mas apenas n o f i n a l dos anos de 1980 é que as caracterís-
ticas neoplásicas do D N A f o r a m reconhecidas. D N A e R N A
circulantes t ê m sido propostos c o m o marcadores de certos tipos
de câncer. Para se usar D N A circulante c o m o marcador de câncer,
deve existir u m m e c a n i s m o para diferenciar D N A n o r m a l de
D N A neoplásico. Isto é alcançado p o r detecção de mutações n o
D N A circulante que está presente nas células t u m o r a i s (p. ex.,
mutações e m ras que o c o r r e m em diversos cânceres), por análise
de microssatélite do D N A c i r c u l a n t e o u p o r detecção de translo-
cações cromossômicas c o m u n s que causam câncer. Alterações
epigenéticas de D N A circulante, tais c o m o padrões de metilação
alterados, p o d e m t a m b é m ser detectadas. E m b o r a esta tecnologia
seja relativamente nova, d u r a n t e a p r ó x i m a década, a detecção
de D N A circulante c o m b i n a r á u m n ú m e r o crescente de técnicas
c l i n i c a m e n t e úteis; e n t r e t a n t o , m u i t a s questões devem ainda ser
respondidas, tais c o m o a f o n t e d o D N A liberado de células e q u e
formas existem do D N A e d o R N A . N o f u t u r o , esta tecnologia
poderá ter a capacidade de fornecer u m p a i n e l mais global das
a n o r m a l i d a d e s presentes n o paciente.
REFERÊNCIAS
I. Bonfrer J M G . W o r k i n g group o n t u m o r marker criteria ( W G T M C ) .
T u m o u r B i o l 1990:11:287-8.
2. C o l a n t o n i o D A , C h a n D W . T h e clinicai application of proteomics C l i n
C h i m A c t a 2005;357:151-8.
3. D i a m a n d i s EP, Fritsche H A , Lilja H , C h a n D W , Schwartz M K , eds.
T u m o r markers: Physiology, pathobiology, technology and clinicai
applications. Washington, D C . A A C C Press, 2002.
4. Feldman SA, E i d e n LE. T h e chromogranins: t h e i r roles m secretion
f r o m neuroendocrine cells a n d as markers for neuroendocrine neoplasia.
E n d o c r Pathol 2003;14:3-23.
5. Freedland S], Parcin A W . Prostate-specific antigen: update 2006. U r o l o g y
2006;67:458-60.
6. H a r p e r PS. Research samples from families wich genetic diseases. A
proposed code o f conduct. Br M e d J 1993;306:1391-3.
7. M o l i n a R, Barak V, v a n D a l e n A , D u f f y M ] , Einarsson R, G i o n M , et al.
T u m o r markers in breast câncer—European G r o u p o n T u m o r Markets
/ recommendations. T u m o u r B i o l 2005;26:281-93.
Si Obiezu C V , D i a m a n d i s ER H u m a n tissue k a l l i k r e i n gene family:
applications i n câncer. Câncer Lett 2005;16:1-22.
9. Silver H K B , A r c h i b a l d B-L, Raga ], CoLdman AJ. Relative operating
characteristic analysis a n d group m o d e l i n g for t u m o r markers:
c o m p a r i s o n o f C A 15.3, carcinoembryonic antigen, and mucin-like
carcino ma-associated antigen i n breast carcinoma. Câncer Res
1991;51:1904-9.
10. Spencer C A , LoPresti JS, Fa t e m i S, N i c o l o f f JT, D e t e c t i o n o f residual
a n d recurrent differentiated t h y r o i d carcinoma by serum t h y r o g l o b u l i n
measurement. T h y r o i d 1999;9:435-41.
I I . Spencer C A , Takeuchi M , Kazarosyan M , W a n g C C , G u t t l e r RB, Singer
PA, et al. Serum t h y r o g l o b u l i n autoantibodies: prevalence, i n f l u e n c e o n
serum t h y r o g l o b u l i n measurement and prognostic significance i n
patients w i t h differentiated t h y r o i d carcinoma. J C l i n E n d o c n n o l M e t a b
1998;83:1121-7.
12. Srurgeon C . Practice guidelínes foi t u m o r marker use in the clinic. C l i n
C h e m 2002;48:1151-9.
C A P Í T U L O 2 1
Creatinina, Uréia e Ácido Úrico
Edmund J. Lamb, Ph.D., F.R.C.Path., e Christopher P. Price, Ph.D., F.R.C.Path.
OBJETIVOS
1. Resumir a biossíntese da uréia, creatinina e ácido úrico.
2. Determinar a função e a importância clínica da uréia, creatinina e
ácido úrico.
3. Discutir a utilidade clínica e as limitações da dosagem da uréia
como um marcador da função renal.
4. Resumir o transporte renal do ácido úrico e determinar seu papei
na patogenia da gota e dos cálculos do trato urinário.
5. Enumerar os requerimentos de amostras, os métodos analíticos, os
princípios e as interferências analíticas possíveis da uréia,
creatinina e ácido úrico.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
G o t a : U m g r u p o de d i s t ú r b i o s do m e t a b o l i s m o de p u r i n a e
pirimidina.
H i p e r u r i c e m i a : Excesso de ácido ú r i c o o u uratos n o sangue; é
u m pré-requisito para o desenvolvimento da gota e p o d e
levar à doença renal.
H i p o u r i c e m i a ; D i m i n u i ç ã o da concentração de ácido ú r i c o n o
sangue, às vezes devida à deficiência de x a n t i n a oxidase, a
enzima necessária para a conversão da h i p o x a n t m a e m
x a n t i n a e da x a n r i n a e m ácido ú r i c o .
Reação de Jaffe; A reação da creatinina c o m o p i era to alcalino
para f o r m a r u m c o m p o s t o c o l o r i d o . Usada paia m e d i r a
creatinina.
T a x a de F i l t r a ç ã o G l o m e r u l a r ( G F R ) : Taxa em m i l i l i t r o s por
m i n u t o na q u a l pequenas substâncias c o m o a c r e a t i n i n a e a
uréia são filtradas através dos g l o m é r u l o s renais. E u m a
m e d i d a da q u a n t i d a d e de n é f r o n s ativos.
U r é i a : O p r i n c i p a l m e t a b ó l i t o n i t r o g e n a d o do c a t a b o l i s m o
protéico no h o m e m .
A
c r e a t i n i n a , a uréia e o ácido ú r i c o são m e t a b ó l i t o s n i t r o -
genados não proteicos depurados d o corpo através do r i m
após a filtração g l o m e r u l a r . A s dosagens das concentra-
ções plasmáticas e séricas desses metabólitos são usadas c o m u -
m e n t e c o m o indicadores da f u n ç ã o renal e de outras condições.
CREATININA
A c r e a t i n i n a ( M W 113 Da) é o a n i d r i d o cíclico da creatina q u e
é gerado c o m o p r o d u t o f i n a l da decomposição da fosfocreatina.
Ela é excretada na u r i n a ; as dosagens da creatinina plasmática e
de sua depuração renal são usadas c o m o indicadores diagnósticos
da função r e n a l ( C a p í t u l o 34).
Bioquímica e Fisiologia
A c r e a t i n i n a é sintetizada nos (1) rins, (2) fígado e (3) pâncreas
p o r duas reações mediadas e n z i m a t i c a m e n t e . N a p r i m e i r a , a tran-
samidação da a r g i n i n a e da g l i c i n a f o r m a o ácido guanidinoacé-
tico. N a segunda reação, a metilação d o ácido g u a n i d i n o a c é t i c o
ocorre c o m a S - a d e n o s i l m e t i o n i n a c o m o d o a d o r de metila. E n t ã o ,
a creatina é t r a n s p o r t a d a n o sangue para o u t r o s órgãos, tais c o m o
músculos e cérebro, o n d e é fosforilada para fosfocreatina, u m
composto de alta energia.
O
HN NH 2 CreaiinOí/uinzise ^ ®
x ^ °
TsT
H3C ^CH 2 ATP ADP HJC"' X:H2
O-'A ^ 0 ° e
c * S )
Creatina Fosfocreatina
s
k
( KV.tÚUlUI
A interconversão de fosfocreatina e da creatina é u m a carac-
terística p a r t i c u l a r dos processos metabólicos da contração mus-
cular. U m a p r o p o r ç ã o de creatina livre (acredita-se q u e se]a de
1% a 2 % ao dia) converte-se espontânea e irreversivelmente para
seu p r o d u t o de excreção na f o r m a de a n i d r i d o - a creacinina.
Logo, a q u a n t i d a d e total de c r e a t i n i n a p r o d u z i d a a cada dia é
relativamente constante e é relativa à massa muscular. C o m b o a
saúde, a concentração de c r e a t i n i n a na corrente sanguínea é
relativamente constante. E n t r e t a n t o , d e p e n d e n d o da ingestão de
carne do i n d i v í d u o , a dieta p o d e i n f l u e n c i a r essa concentração.
A creatinina encontra-se presente e m todos os f l u i d o s e secreções
corporais, sendo f i l t r a d a l i v r e m e n t e pelo g l o m é r u l o . Apesar de
não ser reabsorvida em q u a n t i d a d e relevante pelos túbulos renais,
há u m a pequena secreção t u b u l a r , p o r é m significativa. A p r o d u -
ção de creatinina t a m b é m d i m i n u i c o n f o r m e o nível c i r c u l a n t e
dessa creatinina a u m e n t a ; f o r a m propostos diversos mecanismos
para isso, i n c l u i n d o (1) i n i b i ç ã o da p r o d u ç ã o de creacinina, (2)
reconversão da c r e a t i n i n a e m creatina e (3) conversão para o u t r o s
metabólitos.
Importância Clínica
A creatinina é p r o d u z i d a e n d o g e n a m e n t e e liberada nos f l u i d o s
corporais n u m a taxa constante, e sua concentração plasmática é
m a n t i d a d e n t r o de l i m i t e s estreitos, p r e d o m i n a n t e m e n t e pela
filtração glomerular. C o n s e q ü e n t e m e n t e , t a n t o a concentração
plasmática da creatinina q u a n t o a sua depuração renal ("clearance
de creatinina") t ê m sido utilizadas c o m o marcadores da taxa de
f i l t r a ç ã o g l o m e r u l a r ( G F R ) . A aplicação e as limitações desses
testes são debatidas no C a p í t u l o 34-
Metodologia Analítica
A creatinina plasmática é m e d i d a c o m u m e n t e usando-se m é t o d o s
q u í m i c o s o u enzimáticos. O u t r o s m é t o d o s , i n c l u i n d o a espectro-
metria de massa c o m d i l u i ç ã o d o i s ó t o p o , t a m b é m t ê m sido
374 PARTE IV Analitos
utilizados. 3 '' 9 A m a i o r i a dos laboratórios usa adaptações do
mesmo m é t o d o para as medições t a n t o n o plasma q u a n t o na
urina.
Métodos Químicos: a Reação de Jaffe
A m a i o r i a dos métodos clínicos para a dosagem da creatinina
baseia-se em sua reação c o m o p i c r a t o alcalino. C o m o descrito
pela p r i m e i r a vez p o r Jaffe em 1886, a creatinina reage c o m o i o n
picrato n u m m e i o alcalino p a t a resultar n u m c o m p l e x o laranja-
avermelhado.
U m p r o b l e m a analítico sério c o m a reação de Jaffe é a sua
falta de especificidade para a c r e a t i n i n a . Por exemplo, relatou-se
que m u i t o s compostos p r o d u z i r a m u m cromógeno semelhante
ao de Jaffe, i n c l u i n d o (1) o ácido ascórbico, (2) os p r o d u t o s que
substituem o sangue, (3) as cefalosporinas, (4) a glicose, (5) a
g u a n i d i n a , (6) os corpos cetônicos, (7) a proteína e (8) o p i r u v a t o .
O grau de interferência desses c o m p o n e n t e s depende das condi-
ções específicas da reação escolhida. O efeito das cetonas e ceto-
ácidos provavelmente é de grande i m p o r t â n c i a clínica, embora
este efeito seja m u i t o dependente d o m é t o d o . A s s i m , os relatórios
da interferência d o acetoacetato v a r i a m de u m a u m e n t o despre-
zível a u m a u m e n t o de 3,5 m g / d L (310 j J m o l / L ) na concentração
de creatinina aparente n u m a concentração de acetoacetato de
8 m m o l / L . A b i l i r r u h i n a é u m i n t e r f e r e n t e negativo na reação
de Jaffe. A adição de ions de t a m p o n a m e n t o , tais c o m o b o r a t o
e fosfato, j u n t o c o m surfactante, t e m sido utilizada para m i n i m i -
zar os efeitos desta interferência. A l é m disso, adicionou-se ferri-
cianeto - m é t o d o de 0 ' L e a r y - para oxidar a b i l i r r u b i n a em
b i l i v e r d i n a , r e d u z i n d o p o r t a n t o a sua interferência. Os cromóge-
nos não-creatmina geralmente n ã o c o n t r i b u e m para a concentra-
ção u r i n á r i a m e d i d a da creatinina.
O m a i o r sucesso e m termos de uso c o m u m e especificidade
veio a p a r t i r do uso da abordagem dosagem cinética em combi-
nação c o m a escolha cuidadosa das concentrações de reagente.
E m geral, os métodos manuais t ê m sido t r a d i c i o n a l m e n t e
m é t o d o s de e q u i l í b r i o , c o m a espera de 10 a 15 m i n u t o s para o
desenvolvimento da cor em temperatura ambiente. Os ensaios
cinéticos f o r a m desenvolvidos para p r o p o r c i o n a r análises mais
específicas, rápidas e automatizadas. O s estudos iniciais das inter-
ferências nos métodos cinéticos i d e n t i f i c a r a m dois tipos de cro-
mógenos não-creatinina. N u m g r u p o , a taxa de formação de
adutos é m u i t o rápida e ocorre nos p r i m e i r o s 20 s após a m i s t u r a
d o reagente e da amostra. O acetoacetato é u m exemplo desse
tipo de interferente. N o segundo g r u p o , a taxa de formação de
adutos não é significativa até que se a t i n j a m 80 a 100 s após a
m i s t u r a (p. ex., proteína). A "janela" entre 20 e 80 s, p o r t a n t o ,
f o i u m peTÍodo n o q u a l o sinal da taxa observada poderia ser
a t r i b u í d o p r e d o m i n a n t e m e n t e à reação creatinina-picrato. A
m e l h o r i a da especificidade nos ensaios cinéticos f o i alcançada
selecionando-se os tempos das medições de taxa de 20 a 80 s após
o i n í c i o da reação (mistura). A abordagem f o i i m p l e m e n t a d a em
vários i n s t r u m e n t o s automatizados, e agora os ensaios cinéticos
são a m p l a m e n t e utilizados para m e d i r as concentrações de crea-
t i n i n a nos f l u i d o s corporais.
Existe l i t e r a t u r a b e m abrangente a respeito da escolha das
concentrações de reagente, do i n t e r v a l o de leitura, da escolha d o
c o m p r i m e n t o de o n d a e da t e m p e r a t u r a da reação.
Concentração de Picrato
A reação de Jaffe é de pseudo-primeira o r d e m n o que diz respeito
ao picrato de até 30 m m o l / L , c o m a m a i o r i a dos m étodos empre-
gando u m a concentração entre 3 e 16 m m o l / L . Nas concentra-
ções acima de 6 m m o l / L , a taxa de evolução da cor torna-se
nao-linear; logo, é necessário u m i n t e r v a l o f i x o de dois pontos
e m vez de u m a abordagem de m ú l t i p l o s p o n t o s de dados.
Concentração de Hidróxido
A taxa de reação i n i c i a l é de pseudo-primeira o r d e m n o que diz
respeito às concentrações de h i d r ó x i d o acima de 0,5 m m o l / L .
Porém, a 500 m m o l / L , há u m a degradação elevada d o complexo
de Jaffe. A l é m disso, nas concentrações de h i d r ó x i d o acima de 200
m m o l / L , a absorvância do branco aumenta significativamente.
Comprimento de Onda
E m b o r a a absorvância m á x i m a da reação de Jaffe esteja entre 490
e 500 n m , melhores linearidades e redução dos brancos já f o r a m
relatadas e m outros c o m p r i m e n t o s de onda, v a r i a n d o a escolha
de acordo c o m a concentração de h i d r ó x i d o .
Temperatura
A taxa de formação do complexo de Jaffe e a absortividade desse
complexo d e p e n d e m da temperatura, sendo observadas diferen-
ças mensuráveis até mesmo entre 2 5 ° C e 37°C. Conseqüente-
mente, o c o n t r o l e de temperatura é u m c o m p o n e n t e i m p o r t a n t e
da r e p r o d u t i b i l i d a d e do ensaio.
Métodos Enzimáticos
Enzimas de várias vias metabólicas f o r a m investigadas para a
dosagem enzimática da creatinina. Todos os méto dos envolvem
u m a abordagem de m ú l t i p l a s etapas, levando a u m e q u i l í b r i o
f o t o m é t r i c o (Figura 21-1). Existem basicamente três abordagens,
descritas a seguir.
Creatininase
A creatininase (EC 3.5.2.10; creatinina amidoidrolase) catalisa a
conversão da creatminâxem creatina. E n t ã o , a creatina é detec-
tada c o m u m a série de reações mediadas p o r enzima envolvendo
a creatinoquinase, a p i r u v a t o quinase e a lactato desidrogenase,
c o m o m o n i t o r a m e n t o da d i m i n u i ç ã o da absorvância a 340 n m
(Figura 21-1, A ) . O i n í c i o da reação c o m a creatininase viabiliza
a remoção da creatina endógena e d o p i r u v a t o n u m a reação de
pré-mcubação. A cinética da reação é analiticamente problemá-
tica, sendo necessária u m a incubação de 30 m i n u t o s para p e r m i -
tir que a reação alcance o e q u i l í b r i o . Essa lacuna f o i p r e e n c h i d a
p o r u m a abordagem cinética, p o r é m c o m u m a redução subse-
q ü e n t e na capacidade do m é t o d o em detectar a creatinina. C o n -
seqüentemente, esta abordagem n ã o é a m p l a m e n t e utilizada.
Creatininase e Creatinase
TJma abordagem alternativa t e m sido o uso da creatinase ( E C
3.5.3.3; creatina amidoidrolase), que resulta em sarcosina e uréia,
sendo a p r i m e i r a m e d i d a e m etapas posteriores mediadas p o r
enzima usando a sarcosina oxidase ( E C 1.5 3,1). Isto p r o d u z (1)
glicina, (2) formaldeído e (3) peróxido de hidrogênio (Figura 21-1, B),
sendo este ú l t i m o detectado e m e d i d o através de vários métodos.
C o n t u d o , deve-se ter c u i d a d o q u a n t o às interferências (p. ex.,
pela b i l i r r u b i n a ) na seqüência f i n a l da reação. Esse p r o b l e m a t e m
sido m i n i m i z a d o pela adição de ferricianeto de potássio ( c o m
sucesso l i m i t a d o ) o u b i l i r r u b i n a oxidase. A i n t e r f e r ê n c i a poten-
cial causada pelo ácido ascórbico f o i vencida pela inclusão de
ascorbato oxidase (L-ascorbato. oxigênio oxidorredutase, E C
1.10.3.3). A i n f l u ê n c i a da creatinina endógena i n t e r m e d i á r i a e
da uréia t e m sido m i n i m i z a d a adicionando-se u m a etapa de pré-
incubação e depois i n i c i a n d o a reação com a creatirunase. Este
sistema f o i i n c o r p o r a d o à p l a t a f o r m a de testes r á p i d o s do paciente
(point-of-care) c o m u m dispositivo de teste usando detecção pola-
rográfica U m sistema de detecção alternativo envolve a dosagem
 Creatinina, Uréia e Ácido Úrico CAPÍTULO 21 375

creatininase
creatinina + H , 0 creatina

creatinoquinase
creatina + ATP fosfocreatina + ADP

piruvato quinase
ADP + fosfoenolpiruvato piruvato + ATP

lactato desidrogeriase
piruvato + NADH + H 4 • lactato + NAD +

creatininase
B creatinina + H 7 0 creatina

creatinase
creatina + H 2 0 sarcosina + uréia

sare os/na oxidase

sarcosina + O, + H 2 0 formaldeído + giicina + H 2 0 2

peroxidase
indicador (reduzido) + H 2 0 2 indicador (oxidado) + 2 H 2 0

ou
formaldeído
desidrogenase
C formaldeído + NAD + + H 2 0 HCOOH + NADH + H"1
creatinina
desaminase
D creatinina + H 2 0 N-metilidantoína + NH-.

L-metilidantoinase
N-metilidantoína + ATP + H 2 0 > carbamoilsarcosina + ADP + Pi

L-carbamoilsarcosina
aminoidroiase
carbamoilsarcosina + H 2 0 sarcosina + C 0 2 + NH 3

sarcosina oxidase
sarcosina + O? + H , 0 H 2 0 + giicina + HCHO

peroxidase
indicador (reduzido) + H 2 0 2 indicador (oxidado) + 2 H 2 0

Figura 21-1 D e t e r m i n a ç ã o da c r e a t i n i n a usando-se diversos m é t o d o s e n z i m á t i c o s . Leia o t e x t o p a r a o b t e r

m a i s detalhes.

da redução d o d i n u c l e o t i d e o a d e n i n a n i c o t i n a m i d a ( N A D ) pelo u m a camada semipermeãvel e o p t i c a m e n t e opaca para reagir c o m

f o r m a l d e í d o na presença de f o r m a l d e í d o desidrogenase (Figura
21-1, C).
Creatinina Desaminase
A c r e a t i n i n a desaminase ( E C 3.5.4-21; c r e a t i n i n a i m i n o i d r o -
lase) catalisa a conversão da c r e a t i n i n a e m N - m e t i l i d a n t o í n a e
a m ó n i a . O s p r i m e i r o s m é t o d o s concentravam-se n a detecção
da a m ó n i a usando a g l u t a m a t o desidrogenase o u a reação de
B e r t h e l o t . U m a abordagem alternativa envolve a enzima N - m e t i -
l i d a n t o i n a amidoidrolase (Figura 2 L 1 , D).
Sistemas de Química Seca
V á r i o s m é t o d o s de reagente seco m u l t i c a m a d a f o r a m descritos
para a dosagem da creatinina usando reações mediadas p o r
enzima. U m a abordagem i n i c i a l de "duas l â m i n a s " empregava a
c r e a t i n i n a desaminase, c o m a a m ó n i a d i f u n d i n d o - s e através de
o azul de b r o m o f e n o l para elevar a absorvância e m 6 0 0 n m . U m a
segunda película m u l t i c a m a d a sem a enzima foi utilizada para
q u a n t i f i c a r a a m ó n i a endógena, v i a b i l i z a n d o a correção d o
b r a n c o . U m m é t o d o posterior de l â m i n a ú n i c a u t i l i z o u a seqüên-
cia de reação creatminase-creatinase. Relatou-se que os m e t a b ó l i -
tos da l i d o c a í n a i n t e r f e r e m nesse m é t o d o . Esse sistema c r e a t i n i n a
desaminase descrito t a m b é m foi u t i l i z a d o e adaptado para o uso
c o m o u m dispositivo de teste point-ofeare (Figura 21-1, D). E m
todos os casos a cor p r o d u z i d a na película é q u a n t i f i c a d a pela
espectro f o t o m e t r i a de reflectãncia. T a m b é m foi descrito u m
sistema de q u í m i c a seca n o q u a l foi utilizada u m a a b o r d a g e m não
enzimática baseada n a reação c o m o ácido 3 , 5 - d i n i t r o b e n z ó i c o .
Outros Métodos
F o i descrito u m m é t o d o d e f i n i t i v o que emprega a espectrometria
de massa c o m d i l u i ç ã o de i s ó t o p o ( I D - M S ) . 9 U m m é t o d o para a
376 PARTE IV Aralitos
creatinina que tende a ser uma referência e é ligado a este método
definitivo usa a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
de troca iônica isocrática com a detecção do ultravioleta ( U V ) em
234 nm. 1
Considerações sobre Qualidade com os Métodos
de Creatinina
C o m o foi debatido anteriormente, os diferentes métodos para
testar a creatinina plasmática tem graus dc acuidade c imprecisão
variados. C o m o advento da análise cinética automatizada, dentro
do laboratório, por dia, espera-se urna imprecisão média de apro-
ximadamente 3,0% nas concentrações patológicas, com desem-
penho reduzido dentro do intervalo de referência Isto ainda está
fora dos padrões de desempenho desejados, definidos em termos
de variação biológica
A estimativa da G F R baseada na concentração de creatinina
plasmática irá variar claramente dependendo da precisão e do
ajuste da dosagem da creatinina. 2 Q u a n t o mais u m método supe-
restimar a creatinina "real", maior será a subestimação da G F R
e vice-versa. C o m o resultado da reação com cromógenos não-
creatinina, considerou-se que normalmente os métodos finais de
Jaffe superestimam a concentração real de creatinina plasmática
em aproximadamente 20% nas concentrações fisiológicas. Con-
seqüentemente, os métodos cinéticos, enzimáticos e cromatográ-
ficos produzem medições de creatinina aproximadamente 20%
mais baixas do que os métodos de Jaffe iniciais. Porém, uma vez
que isso pode resultar na superestimativa da GFR, alguns fabri-
cantes de reagentes e instrumentos calibraram seus ensaios para
produzir resultados de creatinina plasmática mais elevados.
C o m o conseqüência, os métodos de creatinina disponíveis
comercialmente podem demonstrar u m ajuste positivo, compa-
rados com os métodos de ID-MS, particularmente nas concentra-
ções dentro dos intervalos de referência. Inversamente, alguns
fabricantes manipularam seus testes para ajustar a saída do anali-
sador para a interferência do cromógeno não-creatinina (os cha-
mados ensaios compensados). N a prática atual os coeficientes de
variação (CVs) interlaboratoriais <3% são atingíveis dentro de
grupos de métodos. C o n t u d o , o consenso global interlaboratorial
através dos métodos é bem mais fraco, e é c o m u m a variação de
0,2 a 0,4 m g / d L (18 a 36 |umol/L) entre os laboratórios. A l é m
disso, o consenso interlaboratorial e dentro do próprio laborató-
rio se deteriora conforme a concentração de creatinina plasmá-
tica se aproxima do intervalo de referência: a relação exponencial
entre a creatinina plasmática e a G F R significa que a imprecisão
nas baixas concentrações de creatinina contribui para u m erro
maior na estimativa da G F R do que nas concentrações de crea-
tinina mais elevadas. Obviamente, a padronização da dosagem
da creatinina é crucial, e estão em andamento as tentativas de
preparar u m padrão internacional a ser utilizado na calibração
dos testes de creatinina plasmática/
Intervalos de Referência
Os intervalos de referência para a creatinina plasmática depen-
dem do método. Tipicamente, os intervalos de referência para a
creatinina plasmática, medidos pelos métodos de Jaffe, são de 0,9
a 1,3 m g / d L (80 a 115 [ i m o l / L ) nos homens e de 0,6 a 1,1 m g /
d L (53 a 97 J i m o l / L ) nas mulheres, embora se devam aplicar
intervalos de referência significativamente menores quando se
utilizam métodos específicos e mais precisos, tal como o ID-MS.
As concentrações de creatinina plasmática nos pacientes com
insuficiência renal terminal não tratada (ESRD) podem ultrapas-
sar 11 m g / d L (1.000 jj.mol/L).
A excreção urinária da creatinina é mais elevada nos homens
(de 14 a 26 m g / k g / d i a , 124 a 230 |umol/kg/dia) do que nas
mulheres (de 11 a 20 m g / k g / d i a , 97 a 177 pnnol/kg/dia). A
excreção da creatinina d i m i n u i com a idade. Tipicamente, para
u m h o m e m de 70 kg, a excreção da creatinina d i m i n u i r á de
aproximadamente 1.640 para 1.030 m g / d i a (14,5 a 9,1 m m o l /
dia) com a progressão da idade dos 30 aos 80 anos. Acredita-se
que a dosagem da excreção urinária da creatinina seja u m indi-
cador ú t i l da totalidade de uma coleta cronometrada da urina.
URÉIA
O catabolismo das proteínas e aminoácidos resulta na formação
da uréia, a qual é eliminada do corpo predominantemente pelos
rins.
Proteína
Proceóltie, /imicipalrnerue enrimárica
T
Aminoácidos
Transamirusção e desaminação oxidativa
AmiYnia
Síntese enzimática no "ciclo da uréia"
Uréia
Bioquímica e Fisiologia
A uréia (CO[NFL] 2 ) é o principal p r o d u t o metabólico nitroge-
nado do catabolismo protéico em humanos, c o n t r i b u i n d o para
mais de 75% do nitrogênio não protéico eventualmente excre-
tado. A biossíntese da uréia a partir da amónia derivada do
nitrogênio de aminoácido é feita exclusivamente pelas enzimas
hepáticas do ciclo da uréia. D u r a n t e o processo de catabolismo
da proteína, o nitrogênio de aminoácido é convertido para uréia
n o fígado pela ação das chamadas enzimas do ciclo da uréia
(Figura 21-2).
Mais de 9 0 % da uréia é excretada através dos rins, e as perdas
através do trato gastrointestinal e da pele contribuem para a
maior parte da fração menor remanescente. Consequentemente,
a doença renal é associada ao acúmulo de uréia no sangue. U m
aumento na concentração de uréia plasmática caracteriza o estado
urêmico (azotêmico). A uréia não é reabsorvida ativamente e nem
secretada pelos túbulos, mas sim filtrada livremente pelos glo-
mérulos. N u m r i m normal, de 4 0 % a 70% da uréia altamente
difusível move-se passivelmente para fora do túbulo renal e para
dentro do interstício, para, finalmente, reentrar n o plasma. A
retrodifusão da uréia também depende da taxa de fluxo da urina,
com pouca entrada n o interstício nos estados de alto fluxo
(p. ex., gravidez) e vice-versa. Conseqüentemente, a depuração da
uréia subestima geralmente a GFR. Na ESDR, a diurese osmótica
nos néfrons funcionais remanescentes limita a retrodifusão da
uréia de modo que a depuração da mesma aproxima-se da depu-
ração da inulina (considerado o método de referência para avaliar
a GFR).
I m p o r t â n c i a Clínica
A dosagem da uréia sanguínea e plasmática tem sido utilizada há
muitos anos como u m indicador da função renal. Todavia, hoje
é geralmente aceito que a dosagem da creatinina proporciona
informações melhores a esse respeito. Porém, a dosagem da uréia
plasmática e urinária amda pode fornecer informações clínicas
úteis em determinadas circunstâncias, e a dosagem da uréia nos
 Creatinina, Uréia e Ácido Úrico CAPÍTULO 21 377

C 0 2 4- N H 3 elevada c o m concentrações normais de c r e a t i n i n a o r i g i n a n d o pro-

porções elevadas p o d e ser vista c o m qualquer dos estados pré-
- - 2 ATP
x
renais descritos a n t e r i o r m e n t e . A s taxas elevadas associadas às
• fCPSI Fumara to concentrações de c r e a t i n i n a elevadas p o d e m i n d i c a r a obstrução
pós-renal o u a azotemia pré-renal superpostas n a doença renal.
V
2 ADP + P A depuração da uréia é u m i n d i c a d o r i n f e r i o r da G F R , já que
1
a sua taxa de p r o d u ç ã o depende de vários fatores não renais,
Fosfato
i n c l u i n d o a dieta e a atividade das enzimas d o ciclo da uréia.
de carbamoil
U m a dieta rica e m p r o t e í n a provoca a u m e n t o s significativos na
yX \ excreção da uréia u r i n á r i a . A l é m disso, a q u a n t i d a d e variável de
O m i t i na Ar<;ini na retrodifusão i n f l u e n c i a r á ambas as concentrações de uréia plas-
/ ^ mática e u r i n á r i a . A dosagem da uréia u r i n á r i a ocupa p o u c o
/ \ espaço n o diagnóstico e n a c o n d u t a clínicos. E n t r e t a n t o , ela
p r o p o r c i o n a u m í n d i c e grosseiro d o e q u i l í b r i o global de nitrogê-
; i n i o e pode ser utilizada c o m o u m guia para a reposição nos
t ore pacientes que estejam recebendo alimentação parenteral. N u m a
i dieta protéica m é d i a , a excreção u r i n á r i a expressa c o m o nitrogê-
i( * n i o uréico é de 12 a 2 0 g / d i a .

\ j M e t o d o l o g i a Analítica
A m b o s os m é t o d o s q u í m i c o e enzimático são usados para quan-
Citrulina Argininossuccinaro
\ / ' / t i f i c a r a uréia nos l í q u i d o s corporais. s

/ \ _ MS Métodos Químicos
Aspar ca to " < A m a i o r parte dos métodos químicos para a uréia baseia-se na reação
.• N de Feaion, e m que o diacetil se condensa c o m a uréia para formar
ATP AMP - P o cromógeno diazina, o qual absorve fortemente a 540 n m .

Figura 21 -2 A via d o ciclo da uréia. CPS I, C a r b a m o i l fosfato H,N H © TÍ,C.

"'C:' 1
sintetase 1; * N - a c e t í l g l u t a m a t o c o m o efetor alostérico p o s i t i v o ; O T C , C=0 + I \ \ = Q + 2 H20
o r n i t i n a transcarbamilase; AAS, argininossuccinato sintetase; A L , HjN HjC^O Calor
HjC' " •
a r g i n i n o s s u c c i n a t o liase; AR, arginase; ADP, difosfato de adenosina; Uréia Diacecila
Diaziria
A M P , m o n o f o s f a t o de adenosina; ATP, tTifosfato de adenosina; Pi,
fosfato i n o r g â n i c o .
C o m o a diacetila é instável, n o r m a l m e n t e é gerada n o sistema
de reaçao da d i a c e t i l m o n o x i m a e d o ácido. E m b o r a a m p l a m e n t e
u t i l i z a d o n o passado, esse m é t o d o tem sido s u b s t i t u í d o pelas
abordagens enzimáticas.
l í q u i d o s da diálise é a m p l a m e n t e utilizada na avaliação da ade-
quação da terapia de substituição renal. V á r i o s fatores extra- Métodos Enzimáticos
renais i n f l u e n c i a m na concentração de uréia circulante, l i m i - Os métodos enzimáticos para a dosagem da uréia baseiam-se
t a n d o sua validade c o m o u m teste da f u n ç ã o renal. Por exemplo, n a h i d r ó l i s e p r e l i m i n a r da uréia c o m a urease (uréia a m i d o i d r o -
a concentração de uréia plasmática eleva-se c o m (1) u m a dieta lase, E C 3.5.1.5; cuja p r i n c i p a l f o n t e é o feijão) para gerar a m ó n i a ,
rica e m proteína, (2) catabolismo p r o t é i c o elevado, (3) reabsorção a qual é então q u a n t i f i c a d a . Esta abordagem t e m sido utilizada
das proteínas sanguíneas após a h e m o r r a g i a gastrointestinal, (4) nos sistemas (1) f o t o m é t r i c o de e q u i l í b r i o , (2) f o t o m é t r i c o ciné-
t r a t a m e n t o c o m c o r t i s o l o u seus análogos sintéticos, (5) desidra- tico, (3) c o n d u t i m é t n c o e (4) de q u í m i c a seca.
tação, e c o m (6) a perfusão reduzida dos r m s (p. ex., i n s u f i c i ê n c i a
Urease
cardíaca). Nessas situações pré-renais, a concentração de creati- 0 0
C=0 2 H20 2 NH ® - CO
n i n a plasmática pode estar n o r m a l . Nas condições pós-renais
obstrutivas (p. ex., m a l i g n i d a d e , nefrolitíase e p r o s t a t i s m o ) , as H,N

concentrações t a n t o da c r e a t i n i n a plasmática q u a n t o da uréia Uréia

serão elevadas, e m b o r a nessas situações haja quase sempre u m
A s abordagens espectrofotométricas para a quant i f i cação da
a u m e n t o m a i o r n a uréia plasmática d o que n a c r e a t i n i n a d e v i d o
a m ô m a i n c l u e m a reação de Bertfielot e o ensaio enzimático c o m
à retrodifusão elevada. Essas considerações o r i g i n a m a u t i l i d a d e
g l u t a m a t o desidrogenase [ L - g l u t a m a t o - N A D ( p ) oxirredutase
clínica p r i n c i p a l da uréia plasmática, a q u a l reside n a dosagem
(desaminante), E C 1.4.1.3]. Esta ú l t i m a a b o r d a g e m t e m sido
e m c o n j u n t o c o m a da creatinina plasmática e n o cálculo subse-
aceita c o m o m é t o d o de referência e adaptada para muitas plata-
q ü e n t e da p r o p o r ç ã o de n i t r o g ê n i o u r é i c o / c r e a t i n i n a . Essa pro-
f o r m a s analíticas.
porção t e m sido usada c o m o u m d i s c r i m i n a d o r grosseiro entre a
azo tem ia pré-renal e pós-renal. Por exemplo, para u m i n d i v í d u o q Qluianlúft) úkjúírogeridse
n o r m a l e m dieta n o r m a l , o i n t e r v a l o de referência para a p r o p o r - NH4 — 2-Ojcogliitarato ^7 Glufamaro + H20
ção está entre 12 e 2 0 m g u r é i a / m g de c r e a t i n i n a (49 a 81 m o l NADH NAD®
de u r é i a / m o l de creatinina). As proporções s i gni fi c ati vamente + H©
mais baixas d e n o t a m n o r m a l m e n t e (1) a necrose t u b u l a r aguda,
(2) a baixa ingestão de proteína, (3) a inanição o u (4) a doença N o s ensaios de plasma, o sistema de reação c o n t é m urease,
hepática aguda (síntese de uréia d i m i n u í d a ) . A uréia plasmática de m o d o que a adição de amostra c o n t e n d o uréia i n i c i a a reação.
378 PARTE IV Analitos

U m a d i m i n u i ç ã o na absorvância resultante da reação da gluta-
m a t o desidrogenase é m o n i t o r a d a a 340 n m . N u m o u t r o exemplo
de sistema de teste enzimático para a uréia, a a m ô r i i a p r o d u z i d a
a p a r t i r dessa uréia pela urease reage c o m o g l u t a m a t o e o tnfos-
fato de adenosina (ATP) na presença da g l u t a m i n a sintetase ( E C
6.3.1.2). E n t ã o , o difosfato de adenosina ( A D P ) p r o d u z i d o nesca
segunda reação enzimática é q u a n t i f i c a d o n u m a terceira e quarta
etapas usando p i r u v a t o quinase ( E C 2.7.1 40) e p i r u v a t o oxidase
( E C 1.2.3.3), respectivamente, gerando, assim, p e r ó x i d o . N a
etapa f i n a l , o p e r ó x i d o reage c o m o f e n o l e a 4-aminofenazona,
catalisado pela peroxidase de raiz-forte (doador: hidrogênio-peró-
x i d o oxirredutase; E C 1.11.1.7), resultando n u m corante q u i n o n a -
m o n o a m i n a , que é q u a n t i f i c a d o espectrofotometricamente.
F o r a m descritos métodos para a dosagem da uréia usando
sistemas de q u í m i c a seca e u t i l i z a n d o a abordagem da urease,
assim c o m o vários métodos de detecção. N u m a abordagem, u m a
m e m b r a n a semipermeável separa o p r i m e i r o estágio da teação
envolvendo a urease, e a a m ó n i a é detectada usando-se u m a
teação de i n d i c a d o r d o p H simples. A uréia t a m b é m t e m sido
m e d i d a usando-se u m m é t o d o c o n d u t i m é t r i c o n o q u a l u m a
amostra e u m reagente c o n t e n d o urease são incubados n u m a
célula de c o n d u t i v i d a d e , sendo m o n i t o r a d a a taxa de variação
dessa c o n d u t i v i d a d e a m e d i d a e m que a uréia é convertida e m
u m a f o r m a iônica. N u m a abordagem p o t e n c i o m é t r i c a , é empre-
gado u m e l e t r o d o seletivo e m relação ao íon a m ó n i o e a urease
é i m o b i l i z a d a n u m a m e m b r a n a : o p r i n c í p i o t e m sido aplicado
em alguns dispositivos point-of-cãre.
A especificidade de todos os m é t o d o s geralmente é aceitável,
p a r t i c u l a r m e n t e n o caso do p r o c e d i m e n t o da urease-glutamato
desidrogenase; e n t r e t a n t o , deve-se esperar a interferência da
a m ó n i a endógena q u a n d o o p r o t o c o l o empregar a amostra para
i n i c i a r a reação. Isto pode ser relevante nas amostras antigas, e m
algumas u rinas e em d e t e r m i n a d o s distúrbios metabólicos. T i p i -
camente, os C V s d e n t r o do prazo de menos de 3 , 0 % , c o m valores
m é d i o s abaixo de 4 , 0 % , são alcançados n o i n t e r v a l o de concen-
tração de 14 a 20 m g / d L (5,0 a 7,0 m m o l / L ) , D a d a a elevada
variação biológica intrínseca da uréia plasmática, isso se e n c o n t r a
bem d e n t r o dos padrões de d e s e m p e n h o analítico desejadus.
Intervalos de Referência
O i n t e r v a l o de referência para o n i t r o g ê n i o uréico plasmático nos
adultos saudáveis é de 6 a 20 m g / d L (2,1 a 7,1 m m o l / L expresso
c o m o uréia). N o s adultos c o m mais de 60 anos de idade, o inter-
valo de referência é de 8 a 23 m g / d L (2,9 a 8,2 m m o l / L ) . As
concentrações plasmáticas t e n d e m a ser ligeiramente mais baixas
nas crianças e d u r a n t e a gravidez, sendo ligeiramente mais eleva-
das nos h o m e n s do que nas mulheres. A s concentrações de uréia
plasmática n u m paciente c o m E S R D não tratada alcançam tipi-
camente 108 a 135 m g / d L (40 a 50 m m o l / L ) .
ÁCIDO ÚRICO
O ácido úrico é u m c o m p o s t o n i t r o g e n a d o ( C 5 H 4 N 4 0 3 / 2 , 6 , 8 -
t r i i d r o x i p u r i n a ) presente c o m o o p r i n c i p a l c o m p o s t o nitroge-
nado d o excremento dos répteis e pássaros. Ele é e n c o n t r a d o e m
pequenas q u a n t i d a d e s na u r i n a dos mamíferos, e seus sais
o c o r r e m nas articulações na gota.
Bioquímica e Fisiologia
E m humanos, o ácido ú r i c o é o p r o d u t o p r i n c i p a l do catabolismo
x i m a d a m e n t e 400 mg. A s fontes de dieta c o n t r i b u e m para outros
3 0 0 mg. N o s h o m e n s que c o n s o m e m u m a dieta sem p u r i n a , a
reserva c o r p o r a l total de urato intercambiável é estimada em
1.200 mg. Nas mulheres, é estimada em 600 m g Por o u t r o lado,
os pacientes c o m a r t r i t e gotosa e deposição tecidual de u r a t o
p o d e m ter reservas de u r a t o de até 18.000 a 3 0 . 0 0 0 mg. A super-
p r o d u ç ã o de ácido ú r i c o pode resultar da síntese elevada dos
precursores da p u r i n a .
O transporte r e n a l d o ácido ú r i c o é c o m p l e x o e envolve
q u a t r o etapas seqüenciais: (1) filtração glomerular de t o d o o
ácido ú r i c o n o plasma capilar que adentra o g l o m é r u l o ; (2) rea-
bsorção n o t ú b u l o c o n t o r c i d o p r o x i m a l de a p r o x i m a d a m e n t e
9 8 % a 100% do ácido ú r i c o f i l t r a d o ; (3) secreção subseqüente
d o ácido ú r i c o d e n t r o do l ú m e n na porção distai do t ú b u l o
p r o x i m a l ; e (4) reabsorção posterior n o t ú b u l o distai. A excreção
u r i n á r i a l í q u i d a do ácido ú r i c o é de 6 % a 12% da q u a n t i d a d e
filtrada.
Importância Clínica
A t é hoje f o r a m reconhecidos mais de 20 distúrbios herdados do
m e t a b o l i s m o da p u r i n a o r i g i n a n d o ranto a h i p e r u r i c e m i a q u a n t o
a h i p o u r i c e m i a . A m a i o r i a deles é m u i t o rara, e o diagnóstico
d e m a n d a o a p o i o de u m l a b o r a t ó r i o especializado e m p u r i n a . Os
sintomas que devem gerar suspeitas i n c l u e m (1) insuficiência
renal o u cálculos n u m a criança o u a d u l t o jovem, (2) " p e d r i n h a s "
na fralda de u m bebê, (3) problemas neurológicos inexplicáveis
n u m bebê, criança o u adolescente e (4) a presença de gota n u m
h o m e m o u m u l h e r c o m menos de 30 anos de idade. fi
Hiperuricemia
A h i p e r u r i c e m i a é d e f i n i d a mais c o m u m e n t e pelas concentra-
ções de ácido úrico plasmático acima de 7,0 m g / d L (0,42 m m o l / L )
QUADRO 21-1 Causas da Hiperuricemia
FORMAÇÃO ELEVADA
Primária
Idiopática
Distúrbios metabólicos herdados
Secundária
Ingestão excessiva de purina
Rodízio elevado de ácido nucléico (p. ex., leucemia, mieloma, radioterapia,
quimioterapia e trauma)
Psoríase
Metabolismo de ATP alterado
Hipoxia tecidual
Pré-eclâmpsia
Álcool
EXCREÇÃO REDUZIDA
Primária
Idiopática
Secundária
Doença renal aguda ou crônica
Reabsorção renal elevada
Secreção reduzida
Envenenamento com chumbo

de nucleosídeos purínicos, adenosina e guanosina (Figura 21-3). Pré-eclâmpsia

As p u r i n a s d o catabolismo do ácido nucléico da dieta são conver- Ácidos orgânicos (p ex., lactato e acetoacetato)
Salicilato (baixas doses)
tidas d i r e t a m e n t e em ácido úrico. O v o l u m e p r i n c i p a l de purinas
Diuréticos de tiazida
excretado c o m o ácido úrico surge da degradação dos ácidos nucléi-
Trissomia do 21 (síndrome de Down)
cos endógenos. A taxa de síntese diária do ácido ú r i c o é de apro-
 Creatinina, Uréia e Ácido Úrico CAPÍTULO 21 379

Ribose-5-fosfato
Síntese das purínas
ATP
\
PRPP Sintetase
AMP

Fosforribosilpirofosfato (PRPP)
Glulamina
PRPP-amidotransferase
G luta mato A
k , PP,

5-fosforribosilamina

(múltiplas etapas
subseqüentes da
biossíntese da purina)

Monofosfato de inosina (IMP)

(Etapas subseqüentes)

Monofosfato Monofosfato de
de adenosina guanosina
(AMP) (GMP)

Catabolismo das purínas

AMP IMP GMP

Purina 5'-nucleotidase
j-».p

Adenosina Pi ^•Pi

I Adenosina Inosina Guanosina

J desaminase
NH; Purina
P
'> nucleosídeo / Pi
d fosforílase
Ribose-1-P Ribose-1-P
•« t
Hipoxantina Guanina
o2

Xantina
oxidase

Xantina

02 Xantina oxidase

Ácido úrico

Vias alternativas da purina

Hipoxantina Guanina Adenina

PRPPN PRPP F PRPP

HGPRT* HGPRT* APRV
PPi ^PPi ^PP:

IMP GMP AMP

* Hipoxantins-guanina fosforribosil Iransferase.

\ Adenina fosforribosil Iransferase.

Figura 21-3 M e t a b o l i s m o das p u r i n a s . A , sintese; B , c a t a b o l i s m o e C , vias a l t e r n a t i v a s .

380 PARTE IV Analitos
nos h o m e n s o u acima de 6,0 m g / d L (0,36 m m o l / L ) nas m u l h e -
res. A s causas principais da h i p e r u r i c e m i a estão resumidas n o
Q u a d r o 21-1. A h i p e r u r i c e m i a assintomática é detectada fre-
q ü e n t e m e n t e através da triagem b i o q u í m i c a . O acompanha-
m e n t o de l o n g o prazo dos pacientes c o m h i p e r u r i c e m i a assinto-
mática é e m p r e e n d i d o p o r q u e m u i t o s deles c o r r e m o risco de
apresentar doença r e n a l q u e p o d e se desenvolver c o m o resul-
tado dessa h i p e r u r i c e m i a e da h i p e r u r i c u r i a ; poucos desses
pacientes chegam a desenvolver a s í n d r o m e clínica da gota
A dosagem d o ácido ú r i c o plasmático é usada p r e d o m i n a n -
t e m e n t e na investigação da gota, o u como resultado de u m a
h i p e r u r i c e m i a p r i m á r i a o u causada p o r outras condições o u
tratamentos que o r i g i n a m h i p e r u r i c e m i a s secundárias. T a m b é m
é utilizada n o diagnóstico e m o n i t o r a m e n t o da hipertensão
i n d u z i d a pela gravidez (toxemia pré-eclâmptica).
Gota
A gota ocorre q u a n d o o u r a t o m o n o s s c d i c o se precipita dos
l í q u i d o s corporais supersaturados. Os depósitos de u r a t o são
responsáveis pelos sinais e sintomas clínicos. A artrite gotosa
p o d e estar associada aos cristais de u r a t o n o l í q u i d o da articu-
lação e a depósitos de cristais (tofos) n o tecido que c i r c u n d a a
articulação. O s depósitos t a m b é m p o d e m ocorrer e m o u t r o
tecido mole. E m qualquer lugar que ocorram, eles despertam
u m a resposta i n f l a m a t ó r i a intensa consistindo em leucócitos
p o l i m o r f o n u c l e a r e s e macrófagos. A articulação d o dedão d o pé
( p r i m e i r a metatarsofalângica) é o sítio clássico da gota. A gota é
u m a c o n d i ç ã o caracterizada p o r crises ocasionais e longos perí-
odos de remissão. E i m p o r t a n t e aferir que a concentração plas-
mática de ácido ú r i c o é quase sempre n o r m a l d u r a n t e u m a crise
aguda. A doença renal associada à h i p e r u r i c e m i a p o d e t o m a r
u m a o u mais formas: (1) n e f r o p a t i a gotosa c o m deposição de
u r a t o n o p a r ê n q u i m a renal, (2) deposição í n t r a t u b u l a r aguda de
cristais de u r a t o e (3) nefrolitíase de urato.
A gota é classificada c o m o p r i m á r i a o u secundária. A gota pri-
mária está associada à h i p e r u r i c e m i a "essencial" que tem u m a base
poligênica. E m mais de 9 9 % dos casos, a causa é incerta, p o r é m
deve-se provavelmente a u m a combinação de (1) superprodução
metabólica de purinas [ 2 5 % dos pacientes apresentam elevação da
atividade de fosforribosilpirofosfato [PRPP]-amidotransferase (E.C.
2.4.2.14)], (2) excreção renal reduzida (80% dos pacientes exibem
secreção tubular renal do ácido úrico d i m i n u í d a ) e (3) ingestão
alimentar elevada. M u i t o raramente a gota primária é atribuível a
defeitos enzimáticos herdados nas vias do metabolismo da purina.
A síndrome de Lesch-Nyhan caTacteriza-se pela deficiência completa de
hipoxanrina-guanma-fosforribosíl transierase ( H G P R T , E C 2.4.2.8),
a enzima principal da via alternativa da purina (Figura 21-3). Este
distúrbio genético ligado ao X manifesta-se clinicamente por (1)
retardamento mental, (2) m o v i m e n t o s musculares anormais e (3)
problemas comportamentais (automutilação e agressividade pato-
lógica). Nas primeiras semanas de vida, os pacientes p o d e m apre-
sentar sintomas de cristalúria, insuficiência renal aguda e gota.
Estão presentes a hiperuricemia, hiperuricuria e atividades b e m
reduzidas de H G P R T nos eritrócitos, fibrobíastos e outras células.
As concentrações intracelulares de PRPP e as taxas de síntese da
p u r i n a são elevadas. Os sintomas neurológicos desta síndrome
p o d e m estar relacionados c o m a disponibilidade de purinas para
o cérebro em desenvolvimento, o qual possui capacidade limitada
para novas sínteses de purina. Ele conta, p o r t a n t o , c o m as vias
alternativas de p u r i n a para abastecê-lo c c m a maior parte dos
nucleotídeos p u r i n a que lhe são necessários. A tecnologia de D N A
t e m sido aplicada ao diagnóstico pré-natal no p r i m e i r o trimestre
usando-se material de biópsia coriônica. Os ensaios de H G P R T
nos fibrobíastos sob cultura obtidos pela amniocentese p o d e m ser
usados n o segundo trimestre. A deficiência parcial de H G P R T
(gota grave ligada ao X ) apresenta-se na adolescência o u n o início
da idade adulta c o m o (1) gota incipiente, (2) insuficiência renal o u
(3) nefrolitíase. Sabe-se que ocorrem concentrações elevadas de
PRPP intracelular c o m o conseqüente a u m e n t o das concentrações
de ácido úrico, resultantes de mutações na PRPP sintetase ( E C
2.7.61) (superatividade de PRPP sintetase), o que t a m b é m é herdado
como u m traço recessivo ligado ao X . T a m b é m foi reconhecida u m a
nefropatia hiperuricêmica juvenil familiar autossômica d o m i n a n t e .
A deficiência de glicose-6-fosfatase t a m b é m leva à h i p e r u r i c e m i a
como resultado da superprodução e da subexcreção do ácido
úrico.
A gota secundária resulta da hiperuricemia atribuível a diversas
causas identificáveis A retenção renal do ácido úrico pode ocorrer na
doença renal aguda o u crônica de qualquer tipo ou como conseqüên-
cia da administração de medicamentos: os diuréticos, em particular,
estão implicados nesta ú l t i m a instância. A acidemia orgânica - causada
pela elevação do ácido acetoacético na cetoacidose diabética o u pela
acidose láctica - pode interferir na secreção tubular do urato. A rota-
tividade elevada do ácido nucléico e o conseqüente aumento no
catabolismo das purinas p o d e m ser encontrados na proliferação rápida
das células tumorais e na destruição ampla dessas células na terapia
c o m certos agentes quimioterápicos.
O t r a t a m e n t o de u m a crise aguda de gota envolve geralmente
o uso de m e d i c a m e n t o s a n t i i n f l a m a t ó r i o s não esteroidais
( N S A I D s ) . Os pacientes devem ser aconselhados a evitar (1) ali-
mentos que t e n h a m u m c o n t e ú d o de p u r m a elevado (p. ex.,
fígado, rins, carne v e r m e l h a e sardinhas) e (2) m e d i c a m e n t o s que
afetem a excreção do u r a t o (diuréticos de tiazida e sal i cila tos). As
intervenções farmacológicas específicas i n c l u e m o uso de medi-
camentos uricosúricos (p. ex., p r o b e n e c i d e sulfinpirazona) q u e
m e l h o r a m a excreção renal d o ácido ú r i c o b l o q u e a n d o os con-
dutores nas células tubulares que m o d u l a m a reabsorção o u o
a l o p u r i n o l i n i b i d o r d e x a n t i n a oxidase. Nesse c o n t e x t o , a dosagem
da excreção u r i n á r i a de ácido ú r i c o é u m auxílio na seleção do
t r a t a m e n t o a p r o p r i a d o . Os pacientes que excretam menos de 6 0 0
m g / d i a (3,6 m m o l / d i a ) de ácido ú r i c o são candidatos ao trata-
m e n t o c o m medicamentos uricosúricos, os quais são contra-indi-
cados aos pacientes c o m cálculos de u r a t o o u i n s u f i c i ê n c i a renal.
Por o u t r o lado, os pacientes que excretam mais de 6 0 0 m g / d i a
(3,6 m m o l , / d i a ) são candidatos ao t r a t a m e n t o c o m a l o p u r i n o l .
As N S A I D s azapropazona e ácido t i a p r o f ê n i c o possuem u m
efeito u r i c o s ú r i c o è, p o r t a n t o , t ê m sua i m p o r t â n c i a n o c o n t r o l e
de l o n g o prazo e agudo da gota.
Cerca de u m em cada cinco pacientes c o m gota clínica t a m b é m
tem cálculos de ácido ú r i c o n o t r a t o u r i n á r i o . E m b o r a o ácido
ú r i c o plasmático e u r i n á r i o deva ser m e d i d o em formadores de
cálculo, m u i t o s desses formadores de cálculo de ácido ú r i c o não
d e m o n s t r a m h i p e r u r i c u r i a o u h i p e r u r i c e m i a . E n t r e t a n t o , isso
pode refletir o uso de intervalos de referência derivados n u m a
sociedade ocidentalizada e rica e m p u r i n a . A causa da formação
de cálculos de ácido ú r i c o t a m b é m envolve a passagem de u m a
u r i n a persistentemente ácida c o m perda de maré alcalina pós-
p r a n d i a l . O ácido ú r i c o não associado (pK a = 5,57) é relativamente
insolúvel. A c i m a d o p H 5,57 ele existe p r e d o m i n a n t e m e n t e c o m o
seu í o n u r a t o mais solúvel e, c o m u m p H 7,0, é acima de 10 vezes
mais solúvel. Assim, nos pacientes c o m p H u r i n á r i o persistente-
m e n t e abaixo de 6,0, as concentrações urinárias n o r m a i s de ácido
ú r i c o p r o d u z i r ã o supersaturação. C o m isso, a dosagem do p H
u r i n á r i o n o decorrer do dia é f r e q ü e n t e m e n t e ú t i l . Os cálculos de
ácido ú r i c o p u r o c o n t r i b u e m para a p r o x i m a d a m e n t e 8 % de todos
os cálculos do trato u r i n á r i o e, diferente de m u i t o s cálculos que
c o n t ê m cálcio, são radiotransparentes. O a l o p u r i n o l é o esteio do
t r a t a m e n t o dos cálculos de ácido ú r i c o . A h i p e r u r i c u r i a t a m b é m
é u m fator de risco na formação d o cálculo de cálcio, Conseqüen-

temente, as tentativas de a u m e n t a r o p H u r i n á r i o c o m sais de
álcali potássio p o d e m ser contraproducentes c o m o resultado da
formação elevada e cálculo de cálcio.
Toxemia Pré-eclâmptica
Essa c o n d i ç ã o está associada à concentração crescente de ácido
ú r i c o plasmático, causada provavelmente pela quebra t e c i d u a l
uteroplacentária e pela perfusão renal reduzida. A dosagem da
u r a t o plasmático t e m sido utilizada c o m o u m i n d i c a d o r da gra-
v i d a d e da pré-eclâmpsia. Observou-se que as concentrações acima
de 6,0 m g / d L (0,36 m m o l / L ) e m 32 semanas de gestação estão
associadas a u m a alta taxa de m o r t a l i d a d e perinatal. 5
Hipouricemia \ automatizados. A m a i o r i a dos ensaios enzimáticos do ácido ú r i c o
A h i p o u r i c e m i a é d e f i n i d a c o m o u m a condição na qual as con-
centrações plasmáticas de u r a t o são menores do que 2,0 m g / d L
(0,12 m m o l / L ) . E m u i t o menos c o m u m d o que a h i p e r u r i c e m i a .
Pode ser secundária a qualquer u m a de várias condições. A l g u n s
exemplos são a (1) doença hepatocelular grave c o m síntese de
p u r i n a o u atividade de x a n t i n a oxidase reduzidas e (2) defeitos na
reabsorção t u b u l a r renal do ácido úrico. A reabsorção defeituosa
p o d e ser congênita, c o m o na s í n d r o m e generalizada de Fanconi,
o u a d q u i r i d a . O defeito de reabsorção p o d e ser a d q u i r i d o aguda-
mente, devido à injeção de m e i o de contraste radiopaco, o u cro-
nicamente, devido à exposição a agentes tóxicos. O tratamento
exagerado da h i p e r u r i c e m i a c o m a l o p u r i n o l o u medicamentos
uricosúricos e a q u i m i o t e r a p i a d o câncer c o m 6-mercaptopurina
o u azatioprina (inibidores da síntese de novo de p u r i n a ) t a m b é m
p o d e m causar h i p o u r i c e m i a . M u i t o raramente, pode ocorrer
h i p o u r i c e m i a resultante de u m defeito m e t a b ó l i c o herdado. A
h i p o u r i c e m i a c o m b i n a d a c o m x a n t i n u r i a é encontrada raramente
e sugere u m a deficiência de x a n t i n a oxidase, o u isoladamente o u
fazendo parte de u m a deficiência do co-fator de m o l i b d ê n i o com-
b i n a d o (deficiência de sulfito o x i d a s e / x a n t i n a oxidase).
M e t o d o l o g i a Analítica
A s técnicas comuns para a dosagem do ácido ú r i c o nos l í q u i d o s
corpoTais incluem (1) o ácido fosfotúngstico ( P T A ) , (2) a uricase
e (3) os m é t o d o s baseados em H P L C . 4
Métodos de Ácido Fosfotúngstico
Esses m é t o d o s baseiam-se n o d e s e n v o l v i m e n t o de u m c r o m ó g e n o
de reação azul (azul de tungsténio) à m e d i d a que o P T A é redu-
zido pelo u r a t o n u m m e i o alcalino. A absorvância do c r o m ó g e n o
na m i s t u r a da reação é m e d i d a e m c o m p r i m e n t o s de o n d a de
6 5 0 a 7 0 0 n m . Os métodos P T A estão sujeitos a muitas interfe-
rências, e os esforços para modificá-los t ê m sido p o u c o eficazes
na m e l h o r i a de sua especificidade.
Métodos de Uricase
Os m é t o d o s de uricase são mais específicos do que as abordagens
P T A . A uricase [(urato-.oxigênio) oxirredutase; E C 1.7.3.3; p r i n -
cipais fontes: As^ergilluí flavus, Candidã utilis, Bacülus fastidiosus e
fígado suíno] é usada c o m o etapa ú n i c a o u i n i c i a l para o x i d a r o
ácido úrico. A uricase age n o ácido ú r i c o para p r o d u z i r alantoína,
p e r ó x i d o de h i d r o g ê n i o e d i ó x i d o de c a r b o n o .
° x
"-s.À^n U r iM i e
- i JO
HiN -r
cr X
\—í
O' HjO;
J, A
CO..
U r a to Alantoína
Creatinina, Uréia e Ácido Úrico CAPÍTULO 21 381
Os m é t o d o s de uricase tornaram-se viáveis e populares c o m o
resultado da d i s p o n i b i l i d a d e de preparações de alta qualidade e
baixo custo da enzima bacteriana. A precipitação p r e l i m i n a r da
proteína não é necessária. G e r a l m e n t e , apenas a guanina, a
x a n t i n a e o u t r o s poucos análogos estruturais do ácido ú r i c o agem
c o m o substratos alternativos e, então, apenas em concentrações
improváveis nos l í q u i d o s biológicos.
A reação é observada n o m o d o cinético o u n o m o d o de
e q u i l í b r i o . A d i m i n u i ç ã o da absorvância c o m o u r a t o é convertida
e m e d i d a c o m u m espectrofotômetro a 293 n m . Isto f o r m a a base
de u m p r o c e d i m e n t o de referência proposto, mas requer u m
espectrofotômetro de alta q u a l i d a d e c o m u m a passagem de b a n d a
estreita, o q u a l r a r a m e n t e se e n c o n t r a i n c l u í d o nos analisadores
plasmático envolve u m sistema de peroxidase pareado c o m u m
d e n t r e vários aceptores de o x i g ê n i o para p r o d u z i r u m cromó-
geno. Por exemplo, u m m é t o d o m e d e o p e r ó x i d o de h i d r o g ê n i o
c o m o auxílio de u m a peroxidase da raiz-forte e u m aceptor de
oxigênio para resultar n u m c r o m ó g e n o n o espectro visível. Os
aceptores de oxigênio que t ê m sido utilizados c o m esse p r o p ó s i t o
i n c l u e m (1) 4-ammofenazona e u m f e n o l substituído, (2) 3-metil-
1-benzotiazolma hidrazona ( M B T H ) , 2,2'-azinodil-(3-etil-benzotia-
zo!ina)-6-sulfonato ( A B T S ) e (3) o-dianisidina.
E m b o r a t e n h a m sido descritas m u i t a s combinações de aceptor
de oxigênio e fenol, a escolha deve ser guiada pela m i n i m i z a ç ã o
da interferência e pela absorvância suficiente para assegurar b o a
precisão. O uso de u m f e n o l s u b s t i t u í d o r e s u l t a n d o n u m p r o d u t o
de alta absorção ajuda a reduzir a interferência p o t e n c i a l ao
d i m i n u i r a d e m a n d a de v o l u m e da amostra. Os interferentes
principais a serem m i n i m i z a d o s são o ácido ascórbico e a b i l i r r u -
b i n a . Por exemplo, alguns m é t o d o s usam a ascorbato oxidase para
e l i m i n a r o ácido ascórbico. O uso de aminofenasona c o m u m
f e n o l s u b s t i t u í d o o u a adição de ferrocianeto tem sido feito para
m i n i m i z a r a i n t e r f e r ê n c i a da b i l i r r u b i n a . Demonstrou-se t a m b é m
que os metabólitos desconhecidos n o plasma dos pacientes c o m
insuficiência renal, que supostamente são compostos fenólicos,
interferirão ao c o m p e t i r e m c o m o fenol reagente, gerando u m a
baixa recuperação do urato. T e m sido empregado u m derivado
fenólico para m i n i m i z a r essa interferência, gerando assim u m
p r o d u t o altamente absorvente e r e d u z i n d o o v o l u m e da amostra.
T a m b é m f o r a m descritos os dispositivos que usam uricase n u m a
forma de reagente seco para m e d i r o ácido ú r i c o . Por e x e m p l o ,
u m sistema de película m u l t i c a m a d a emprega a uricase e a pero-
xidase separadas p o r u m a m e m b r a n a semipermeável a p a r t i r de
u m corante que é o x i d a d o para f o r m a r u m p r o d u t o c o l o r i d o . U m
sistema de m a t r i z de celulose emprega uricase, peroxidase e
M B T H c o m o aceptor de oxigênio. A l é m disso, esse m é t o d o
precisa apenas de u m a amostra de plasma d i l u í d o que ajuda a
reduzir as interferências. O ácido ascórbico, entretanto, é u m
interferente significativo. U m terceiro sistema i n c o r p o r a a sepa-
ração do plasma das células vermelhas e a uricase, a peroxidase
e o f e n o l s u b s t i t u í d o para m e d i r o ácido ú r i c o . Os três sistemas
empregam u m sistema de m e d i d o r de reflectância para facilitar
a quantificação exata e precisa da variação de cor.
Métodos de HPLC
O s métodos de H P L C que u s a m colunas de troca i ô n i c a o u de
fase i n v e r t i d a t ê m sido usados para separar e q u a n t i f i c a r o ácido
ú r i c o . O e f l u e n t e da c o l u n a é m o n i t o r a d o a 293 n m para detec-
tar o ácido ú r i c o em eluição. Os métodos de H P L C são específi-
cos e mais rápidos; as fases móveis são simples, e o t e m p o de
retenção do ácido ú r i c o é m e n o r do que 6 m i n u t o s . Graças a
esses m u i t o s atributos, a H P L C t e m sido utilizada para desenvol-
ver m é t o d o s de referência para m e d i r o ácido ú r i c o . U m m é t o d o
382 PARTE IV Analitos
definitivo proposto para o ensaio do ácido úrico no plasma usa
ID-MS.
Intervalos de Referência
Usando-se u m método enzimático, relatou-se que o intervalo
de referência para o ácido úrico estava na faixa de 3,5 a 7,2 m g /
d L (0,208 a 0,428 m m o l / L ) para os homens e de 2,6 a 6,0
m g / d L (0,155 a 0,357 m m o l / L ) para as mulheres. A concentra-
ção de ácido úrico plasmático aumenta gradualmente com a
idade, crescendo cerca de 10% entre os 20 e os 60 anos de
idade. H á u m aumento entre as mulheres após a menopausa,
alcançando concentrações similares às dos homens. Durante a
gravidez, as concentrações de ácido úrico plasmático caem durante
o primeiro semestre e até 24 semanas de gestação, quando as
concentrações começam a aumentar e, eventualmente, ultrapassar
os níveis fora da gravidez. Usando u m ensaio enzimático, os
intervalos de referência em 32, 36 e 38 semanas de gestação foram
relatados como 1,9 a 5,5 m g / d L (0,110 a 0,322 m m o l / L ) , 2,0 a
5,8 m g / d L (0,120 a 0,344 m m o l / L ) e 2,7 a 6,5 m g / d L (0,157 a
0,381 m m o l / L ) , respectivamente.
U m a abordagem alternativa à interpretação das concentrações
de ácido úrico plasmático é a de considerar o grau de hiperurice-
mia em relação ao risco de desenvolvimento da gota; os homens
com concentrações de ácido úrico plasmático acima de 9,0 m g / d L
(0,540 m m o l / L ) têm uma probabilidade 150 vezes maior de
possuir artrite gotosa coexistente do que os homens com concen-
trações de ácido úrico abaixo de 6,0 m g / d L (0,360 m m o l / L ) .
A excreção urinária de ácido úrico nos indivíduos sob dieta
contendo purinas é de 250 a 750 m g / d i a (1,5 a 4,5 m m o l / d i a ) .
A excreção pode d i m i n u i r de 2 0 % a 25% numa dieta sem purina
para menos de 400 mg/dia.
REFERÊNCIAS
1. A m b r o s e RT, K e t c h u m D F , S m i t h J W . C r e a t i n i n e d e t e r m i n e d by " h i g h
p e r f o r m a n c e " l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . C l i n C h e m 1983;29:256-9.
2. M y e r s G L , M i l l e r W G , C o r e s h J, F l e m i n g J, G r e e n b e r g N , er al.
R e c o m m e n d a t i o n s for i m p r o v i n g s e r u m c r e a t i n i n e m e a s u r e m e n t : A
r e p o r t f r o m the l a b o r a r o r y w o r k i n g g r o u p o f t h e N a t i o n a l K i d n e y
Disease E d u c a r i o n P r o g r a m . C l i n C h e m 2006,52:5-18.
3. Perrone R D , M a d i a s N E , Levey A S . S e r u m c r e a t i n i n e as an Índex o f r e n a l
f u n c t i o n : N e w insights i n t o o l d concepts. C l i n C h e m 1992;38:1933-53.
4. Price CP, James D R . A n a l y t i c a l reviews i n c l i n i c a i b i o c h e m i s t r y : T h e
m e a s u r e m e n t o f urate. A n n C l i n B i o c h e m 1988;25:484-98.
5. R e d m a n C W G , B e i l i n LJ, B o n n a r J, W i l k i n s o n R H . Plasma u r a t e
measurements i n p r e d i c t í n g f e t a l d e a t h i n hypertensive pregnancy.
Lancet 1976;1:1370-3.
6. S i m m o n d s H A . P u n n e a n d p y r i m i d i n e dísorders. I n : H o l t o n JB, ed.
T h e i n h e r i t e d m e t a b o l i c diseases. C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e 1994;
297-350.
7. Spencer K . A n a l y t i c a l Teviews i n c l i n i c a i b i o c h e m i s t r y : the e s t i m a t i o n o f
creatinine. A n n C l i n B i o c h e m 1986;23:1-25.
8. Taylor A ] , V a d g a m a P. A n a l y t i c a l reviews i n c l i n i c a i b i o c h e m i s t r y : t h e
e s t i m a t i o n o f urea, A n n C l i n B i o c h e m 1992;29:245-64.
9. W e l c h M J , C o h e n A , H e r t z H S , N g KJ, Schaffet R , V a n der L i j n P.
D e t e i m i n a t i o n o f s e r u m c r e a t i n i n e by isotope d i l u t i o n mass
s p e c t r o m e t r y as a c a n d i d a t e d e f i n i t i v e m e t h o d . A n a l C h e m
1986;58:1681-5.
CAPÍTULO 2 2

Carboidratos
David B. Sacks, M.B., Ch.B, F.R.C.Path.

OBJETIVOS Diabetes M e l l i t u s G e s t a c i o n a l ( G D M ) : I n t o l e r â n c i a a
carboidratos que surge d u r a n t e a gestação.
1. Definir os seguintes termos:
Genes D i a b e t o g ê n i c o s : Genes que c o n t r i b u e m para o
Carboidrato
d e s e n v o l v i m e n t o d o diabetes; u m a base genética é
Monossacarídeo, dissacarídeo e polissacarídeo
i d e n t i f i c a d a e m m e n o s de 5% dos i n d i v í d u o s c o m diabetes
Cetora
t i p o 2.
Insulina
G l i c o g ê n i o : Polissacarídeo que t e m a f ó r m u l a ( C 6 H 1 0 O 5 ) n e é
Diabetes mellitus
u t i l i z a d o pelos músculos e p e l o fígado para a r m a z e n a m e n t o
Glicogênio de carboidratos.
Glicogênese Glicose; U m açúcar simples de seis carbonos que é o p r i n c i p a l
Glicogenólise combustível para a m a i o r i a dos organismos e u m
Glicólise i m p o r t a n t e precursor de o u t r o s c o n s t i t u i n t e s corporais.
Gliconeogênese H e m o g l o b i n a G l i c a d a : H e m o g l o b i n a que t e m u m Tesíduo de
Tolerância à glicose açúcar ligado; a H b A 1 C ê a p r i n c i p a l fração (~ 8 0 % ) de
Hiperglicemia e hipoglícemia h e m o g l o b i n a glicada; t a m b é m c o n h e c i d a c o m o gíico-
Glicação hemoglobina.
2. Dar exemplos de um monossacarídeo, dissacarídeo e H i p e r g l i c e m i a : Concentrações elevadas de glicose n o sangue.
polissacarídeo. H i p o g l i c e m i a : C o n c e n t r a ç õ e s reduzidas de glicose n o sangue.
3. Discutir a regulação da concentração da glicose no corpo e I n s u l i n a : H o r m ô n i o protéico p r o d u z i d o pelas células fS d o
determinar o intervalo de referência para a glicose em indivíduos pâncreas que d i m i n u i as concentrações de glicose n o
sadios. sangue.
4. Comparar o diabetes tipo 1 e tipo 2 em relação à prevalência, L a c t a t o : P r o d u t o i n t e r m e d i á r i o d o m e t a b o l i s m o de
causas, idade de aparecimento, sintomas e valores laboratoriais. carboidratos q u e se a c u m u l a n o sangue p r e d o m i n a n t e m e n t e
5. Determinar cs critérios básicos para o diagnóstico de diabetes q u a n d o ocorre d i m i n u i ç ã o da oxigenação tecidual; a
mellitus, incluindo as orientações da American Diabetes Association. concentração elevada de lactato n o sangue é chamada de
6. Discutir as relações metabólicas anormais entre a glicose, as acidemia láctica e resulta e m acidose láctica.
cetonas, os ácidos graxas e os ácidos metabólicos em um indivíduo M i c r o a l b u m i n ú r i a : Taxa de excreção de a l b u m i n a na u r i n a (20
deficiente em insulina. a 2 0 0 | i g / m i n ) entre a p r o t e i n ú r i a n o r m a l e a maciça; a
7. Delinear c procedimento para a administração de um teste oral de excreção u r i n á r i a elevada de a l b u m i n a precede e é
tolerância à glicose e interpretar os resultados. altamente p r e d i t i v a de n e f r o p a t i a diabética.
8. Listar os procedimentos laboratoriais envolvidos na avaliação do P r o d u t o s F i n a i s de Glicação A v a n ç a d a ( A G E ) : Proteínas q u e
diabetes mellitus em não-gestante. f o r a m m o d i f i c a d a s irreversivelmente p o r ligação não
9. Listar as três causas de hipoglicemia. enzimática da glicose; p o d e m c o n t r i b u i r para as
10. Listar quatro métodos de análise de glicose sérica, determinando os complicações crônicas d o diabetes.
requisitos para as amostras e os princípios de cada método, e listar
as interferências conhecidas em cada método.
11. Definir hemoglobina glicada e hemoglobina A1C| determinando a
utilidade clínica da determinação destas, e listar três métodos de

análise de hemoglobina glicada.
12. Resolver os estudos de caso sobre a análise de carboidratos na
avaliação de distúrbios relacionados acs carboidratos.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
C a r b o i d r a t o s : C o m p o s t o s neutros f o r m a d o s p o r carbono,
h i d r o g ê n i o e o x i g ê n i o (em u m a p r o p o r ç ã o de 1:2:1) q u e
c o n s t i t u e m u m a classe i m p o r t a n t e de alimentos.
Cetonas: C o m p o s t o s que surgem a p a r t i r da quebra de ácidos
graxos; a deficiência de i n s u l i n a provoca o a u m e n t o de
cetonas séricas, as maiores responsáveis pela acidose
m e t a b ó l i c a que ocorre e m i n d i v í d u o s c o m cetoacidose
diabética.
Diabetes M e l l i t u s : G r u p o de d i s t ú r b i o s metabólicos d o
m e t a b o l i s m o de carboidratos n o q u a l a glicose é
subutilizada p r o d u z i n d o h i p e r g l i c e m i a .
O
carboidratos, i n c l u i n d o o açúcar e o amido, estão ampla-
mente distribuídos e m plantas e animais. Eles realizam
múltiplas funções, tais c o m o serem componentes estrutu-
rais e m R N A e D N A (açúcares ribose e desoxirribose) e fornecerem
u m a fonte de energia (glicose). A glicose forma-se a partir da (1)
quebra de carboidratos na dieta (grãos, vegetais amiláceos e legumes)
o u de estoques corporais (glicogênio) e (2) da síntese endógena a
partir de proteínas o u da porção glicerol dos triglicerideos. Q u a n d o
a ingestão de energia excede o seu gasto, o excesso é convertido e m
gordura e glicogênio para armazenamento n o tecido adiposo e n o
fígado o u músculo, respectivamente. Q u a n d o o gasto energético
excede a ingestão calórica, a formação de glicose endógena ocorre a
p a r t i r da quebra dos estoques de carboidratos e de fontes não car-
boidratos (p. ex., aminoácidos, lactato e glicerol).
A i n s u l i n a , o glucagon e a e p i n e f r i n a m a n t ê m a concentração
de glicose n o sangue e m u m i n t e r v a l o razoavelmente estreito sob
384 PARTE IV Analitos

condições diversas (alimentação, j e j u m o u exercício severo). A dos açúcares n o c o r p o h u m a n o possui a configuração D. H à

dosagem de glicose é u m dos p r o c e d i m e n t o s mais c o m u m e n t e várias estruturas diferentes, e tal variedade depende das posições
realizados em hospitais e em o u t r o s laboratórios q u í m i c o s de relativas dos grupos hidroxilas nos átomos de carbono.
serviços de saúde. O d i s t ú r b i o do m e t a b o l i s m o de carboidratos A f ó r m u l a da glicose pode ser escrita na f o r m a de aldeído
e n c o n t r a d o c o m mais f r e q ü ê n c i a é a glicose sanguínea elevada, o u enol, u m a espécie reativa de v i d a breve. A m u d a n ç a para o
devida ao diabetes méüitus, c o n d i ç ã o que afeta 8 % da população â n i o n e n o l é favorecida e m solução alcalina, c o m o segue:
dos E U A . A i n c i d ê n c i a de h i p o g l i c e m i a (glicose sanguínea redu-
zida) é desconhecida, mas é substancialmente m e n o r . H—0=0 H—C—OH H—C—06
H—i—OH — ^ ü—OH -iiiífÜül» C-OH + H,0
QUÍMICA I I I
E n o ]
O s carboidratos são derivados aldeídicos o u cetonas de álcoois Aldeído  n i o n enol

p o l i - h i d r o x i lados (mais de u m grupo - O H ) o u de compostos

q u e p r o d u z e m esses derivados q u a n d o hidrolisados. A presença de u m a dupla-ligação e u m a carga negativa no
â n i o n e n o l t o r n a a glicose u m a substância r e d u t o r a ativa que è
oxidada p o r agentes oxidantes relativamente moderados, tais
Monossacarídeos
c o m o íons c ú p r i c o ( C u 5) e férrico (Fe'"). A glicose e m solução
Monossacarídeo é u m açúcar simples que consiste e m u m a
alcalina q u e n t e reduz p r o n t a m e n t e os íons cúpricos a íons cupro-
u n i d a d e cetõnica o u aldeídica poli-hidroxilada e não p o d e ser
sos. A alteração de coloração é utilizada c o m o u m a indicação
h i d r o l i s a d o para u m a f o r m a mais simples. O esqueleto é f o r m a d o
c o n v i n c e n t e da presença de glicose, e, p o r m u i t o s anos, as glico-
p o r vários átomos de carbono. Os açúcares que c o n t ê m três,
ses sanguínea e u r i n á r i a f o r a m medidas dessa f o r m a . M u i t o s
quatro, cinco, seis e sete átomos de carbono são conhecidos c o m o
o u t r o s açúcares t a m b é m reduzem os íons cúpricos e m solução
trios es, tetros es, pentoses, fiexoses e heptoses, respectivamente. U m dos
alcalina e, coletivamente, são chamados de açúcares redutores.
átomos de c a r b o n o é u n i d o p o r u m a dupla ligação a u m á t o m o
O g r u p o aldeído reage c o m o g r u p o h i d r o x i l a n o c a r b o n o 5,
de oxigênio para f o r m a r u m g r u p o carbonila. U m aldeído t e m o
representado por u m anel s i m é t r i c o e descrito pela f ó r m u l a de
grupo carbonila na extremidade da cadeia carbônica, p o r é m , se o
H a w o r t h , n o q u a l se considera que a glicose possui a mesma
g r u p o c a r b o n i l a estiver em qualquer o u t r a posição, forma-se u m a
estrutura básica d o p i r a n o (Figura 22-3). Nessa f ó r m u l a , consi-
cetona (Figura 22-1). O carboidrato mais simples é o glicolalde-
dera-se o p l a n o do anel p e r p e n d i c u l a r ao p l a n o do papel, c o m
ído, o derivado aldeídico do etileno glicol. Os derivados aldeídi-
as linhas grossas a p o n t a n d o em direção ao leitor. Os grupos
cos e cetônicos do glicerol são, respectivamente, o gliceraldeído
hidroxilas na posição 1 ficam, p o r t a n t o , abaixo do p l a n o (con-
e a d iidroxia cetona (Figura 22-1). Os monossacarídeos que são
figuração a ) o u acima do p l a n o (configuração P) U m açúcar
aldeídos o u cetnnas são chamados, respectivamente, aldoses e cetases
(Figura 22-2). c o m anel de seis m e m b r o s que c o n t é m cinco carbonos e u m
oxigênio é u m a derivação do p i r a n o e é c h a m a d o de pmznose.
Os compostos que são idênticos em composição e d i f e r e m
Q u a n d o ocorre ligação c o m a f o r m a ç ã o de u m anel de cinco
somente em suas configurações espaciais são chamados de este-
membros q u e c o n t é m q u a t r o carbonos e u m oxigênio, o açúcar
reoisômeros. Os átomos de c a r b o n o na cadeia não r a m i f i c a d a são
possui a mesma estrutura básica do f u r a n o e é c h a m a d o de
n u m e r a d o s de 1 a 6, c o m o mostrado pelos n ú m e r o s à esquerda
furanose. A frutose é m o s t r a d a em duas formas cíclicas. A fruto-
da f ó r m u l a da D-glicose na Figura 22-2. A designação D- o u L-
piranose é a configuração do açúcar livre, e a frutofuTanose
refere-se à posição do g r u p o h i d r o x i l a n o á t o m o de c a r b o n o
ocorre sempre que a frutose existir c o m b i n a d a c o m dissacarídeos
adjacente ao ú l t i m o (parte i n f e r i o r ) grupo C H 2 O H . De f o r m a
e polissacarídeos, c o m o na sacarose e na i n u l i n a .
geral, a designação D- e L- para u m a molécula de açúcar refere-se
às formas estereoisoméricas d o á t o m o de c a r b o n o assimétrico
c o m a numeração maior.* Por convenção, os D-açúcares são Dissacarídeos
escritos c o m o g r u p u h i d r o x i l a à direita e os L-açÚcares são escri- D o i s monossacarídeos ligam-se covalentemente p o r u m a ligação
tos c o m o g r u p o h i d r o x i l a à esquerda (Figura 22-2). A m a i o r i a O-glicosídica, c o m a perda de u m a m o l é c u l a de água, para
f o r m a r u m dissacarídeo. A ligação q u í m i c a entre os açúcares
H-(-C—O | , j.
CH,OH sempre envolve o g r u p o aldeídico o u cetônico de u m monossa-
H—C=0 "t ' carideo ligado ao g r u p o á l c o o l (p.ex., maltose) o u u m grupo
H—C—OH
U i 2 H aldeídico o u cetônico (p.ex., sacarose) d o o u t r o monossacarídeo
° ch2oh CHjOH
(Figura 22-4). O s dissacarídeos mais c o m u n s são os seguintes:
Glico aldeído Gliceraldeído
D i id ioxiace Cona
(aldeído) (ceco na) Maltose = glicose + glicose
Lactose = glicose + galactose
Figura 22-1 C a r b o i d r a t o s de dois e três carbonos. Sacarose = glicose + frutose

Se a ligação entre dois monossacarídeos ocorre entre o grupo

H—C=0 H—c—0 ch3oh H—C=0 aldeídico o u cetônico de u m a m o l é c u l a e u m g r u p o h i d r o x i l a de
o u t r a m o l é c u l a ( c o m o n a maltose e na lactose), permanece no
H—k—OH HO—Í—H Í—O H—d:—oh
segundo monossacarídeo u m g r u p o cetônico o u aldeídico poten-
T

H—i—OH
-o—
ffi

H O — H
i

0
1

cialmente livre. C o n s e q ü e n t e m e n t e , o segundo resíduo de

1

4 H—C—OH HO—C—H h—d:—OH HO—à—H glicose p o d e ser o x i d a d o e é capaz de existir nas formas o. ou
o—
ffi

5 H — Í — O H H O — H H-Í—OH
ir!
o
1
1

6 ÍH2oh ÍH2oh <^H2oh Íh3oh

D-Glicose L-Glicose D-Frutose DGalaccose * E m b o r a sejam usadas as designações D e L nesse capítulo, os leitores devem
(Al dose) (Aldcse) (Ce rose) (Aldose)
atentai para o fato de que, n o sistema de Cahn-Ingold-Prelog, uma série de
regras determina as configurações. Nesse novo sistema, utilizam-se os símbolos
Figura 22-2 Açúcares típicos de seis c a i b o n o s . R e S paia designar as configurações.
 Carboidratos CAPÍTULO 2 2 385

ch2oh
(3-piranosídicas. P o r t a n t o , o dissacarídeo é u m açúcar r e d u t o r ,
H I
mas seu p o d e r r e d u t o r é apenas a p r o x i m a d a m e n t e 4 0 % do
\A p o d e r r e d u t o r dos dois monossacarídeos j u n t o s . Alternativa-
HO > — r OH mente, se a ligação entre os d o i s monossacarídeos envolver os
H H ÓH grupos aldeídicos o u cetònicos de ambas as moléculas ( c o m o na
\
c — c \ sacarose), há a formação de u m açúcar não r e d u t o r , já que
N a -D-Glícose
// n e n h u m g r u p o aldeídico o u c e t ô n i c o permanece livre.
H C H C II a-D-Gl icopiianose

y( I! Polissacarídeos
Eir-.it.iTri
K I CH,OH A ligação de m ú l t i p l a s u n i d a d e s monossacarídicas resulta na
.-ri pÍT^nrt<i-
/ •T' formação de polissacarídeos. O s principais carboidratos de
V "<• reserva são a m i d o nas plantas e g l i c o g ê n i o nos animais, e ambos
TIO OH
f o r m a m grânulos d e n t r o das células. Os polissacarídeos p o d e m
ou n
fornecer s u p o r t e estrutural. A celulose é usada pelas plantas,
a-D-Ftutase e n q u a n t o a q u i t i n a é o p r i n c i p a l c o m p o n e n t e do exoesqueleto
a-D-F ru to p íts n ose de artrópodes (msetos e crustáceos).

6 C Amido e Glicogênio
- O -
A m a i o r i a dos amidos é c o m p o s t a p o r u m a m i s t u r a de amiloses
H—C
V
h/
c — c
"--C—H
// ' O e amilopectinas. A amilose consiste e m u m a longa cadeia não
r a m i f i c a d a de unidades de glicose ligadas p o r ligações a-1,4 c o m
o g r u p o aldeídico t e r m i n a l livre. N a a m i l o p e c t i n a , a m a i o r i a das
Esrturura da
Fora no unidades estão ligadas p o r ligações a-1,4, mas t a m b é m há liga-
furanose a-D-Frutose
a - D F r u tohjranosc ções a-1,6 a cada 24 a 3 0 resíduos, o q u e p r o d u z cadeias laterais.
A a m i l o p e c t i n a c o n t é m até 1 m i l h ã o de resíduos de glicose. A
Figura 22-3 A fóimula de Haworth pata os açúcares. estrutura do g l i c o g ê n i o é semelhante à da a m i l o p e c t i n a , mas a
ramificação é mais extensa e o c o r r e a cada 8 a 12 resíduos de
glicose. Essas ramificações a u m e n t a m a s o l u b i l i d a d e do glicogê-
n i o e p e r m i t e m que os resíduos de glicose sejam p r o n t a m e n t e
mobilizados. O glicogênio é mais a b u n d a n t e n o fígado e t a m b é m
ch3oh ch,oh é e n c o n t r a d o n o m ú s c u l o esquelético. A diferença e s t r u t u r a i
o. 11 H J H entre a amilose e a a m i l o p e c t i n a é i m p o r t a n t e na seleção d o
H substrato a m í d i c o a p r o p r i a d o para as determinações da amilase
OH H /
( C a p í t u l o 19). A taxa de h i d r ó l i s e é afetada pelas diferenças
OTT >1 (i H —
estruturais n o a m i d o .
Ah TT OH r í rr rui pn
G

Ct-D-Maltose
redutoT
Celulose
O-a-D-Glicopiranosil-ü —»4)- a-D-glicopiranose A celulose é u m i m p o r t a n t e polissacarídeo estrutural em plantas.
Ela é u m p o l í m e r o não r a m i f i c a d o de resíduos de glicose ligados
Grupo p o r ligações (3-1,4- A configuração p facilita a f o r m a ç ã o de longas

.
redutor cadeias retas, p r o d u z i n d o fibras de alta resistência tênsil. As
CH 2 OH CHJOH
l i g ações |ü-l,4 não são hidrolisadas p o r a-amilases. C o m o os
OH •O. OI
X II
A v h u m a n o s não p r o d u z e m celulases, eles não conseguem digerir
5
»• > 1 <0 o u H

>—K»
K OH H f i b r a vegetal.
iXi \Sl
A Ah H 011 Glicoproteínas
M u i t a s proteínas integrais de m e m b r a n a possuem oligossacarí-
(3-D- Lactose
deos covalentemente ligados na região extracelular, f o r m a n d o as
0-(3-D-Galactopiranosil-í 1—>4)-P-D-glicopiranose
glicoproteínas. A l é m disso, m u i t a s proteínas q u e são secretadas,
tais c o m o anticorpos, h o r m ô n i o s e fatores de coagulação, são
glicoproteínas. O n ú m e r o de resíduos de carboidratos ligados
varia entre as proteínas, e tais resíduos c o n s t i t u e m 1% a 7 0 %
-O 1- CHjOH ii do peso das glicoproteínas. Os oligossacarídeos são ligados p o r
ligações O-glícosídicas ao o x i g ê n i o da cadeia lateral dos resíduos
v °"n" H Is * P Ps? H HO
de serina o u t r e o n i n a o u p o r ligações N-gli cosi dicas ao nitrogê-
< .HIX ^l - o - X I L

n .
CHjOH
I I n i o da cadeia lateral dos resíduos de asparagina.
0]l
U m a f u n ç ã o biológica das cadeias de carboidratos é regular
Sacarose a vida ú t i l das proteínas. Por e x e m p l o , a perda dos resíduos de
O-a-D-G 1 i c op i rai\osil-{ 1 —> 2)- (3 -D-f ru t o f u ran o S e ácido siáhco da extremidade das cadeias oligossacarídicas nos
eritrócitos resulta na remoção dos glóbulos vermelhos da circu-
Figura 22-4 F ó r m u l a s estruturais de dissacaiídeos. lação. Os carboidratos t a m b é m estão envolvidos n o reconheci-
m e n t o célula-célula, na secreção e n o d i r e c i o n a m e n t o de proteí-
nas para d o m í n i o s celulares específicos.
386 PARTE IV Analitos
As glicopTOteinas de interesse especial são a h e m o g l o b i n a
glicada ( G H b ) e proteínas semelhantes q u e são utilizadas paia
m o n i t o r a r o c o n t r o l e das glicoses a l o n g o prazo e m pessoas c o m
diabetes mellitus. A l é m disso, a G H b é u m a m e d i d a do risco do
desenvolvimento de complicações do diabetes.
Q u i m i c a m e n t e , a glicação é a adição não enzimática de u m
resíduo de açúcar aos grupos aminas de proteínas. A hemoglo-
b i n a adulta h u m a n a ( H b ) consiste geralmente em H b A ( 9 7 %
do total), H b A2 (2,5%) e H b F (0,5%). A H b A é composta por
q u a t r o cadeias polipeptídicas, duas cadeias a e duas cadeias p.
A análise cromatográfica da H b A i d e n t i f i c a várias h e m o g l o b i n a s
menores, H b A l a , H b A l b e H b A] C ) q u e são coletivamente conhe-
cidas c o m a H b A j , hemogíofciriíxs rápidas (porque elas m i g r a m mais
r á p i d o d o q u e a H b A e m u m campo elétrico), glica-hemoglobinas
o u h e m o g l o b i n a s glicadas. A J o i n t C o m i s s i o n o n B i o c h e m i c a l
N o m e n c l a t u r e da I n t e r n a t i o n a l U n i o n o f Pure a n d A p p l i e d
C h e m i s t r y recomenda o t e r m o neoghcoproteína para tais deriva-
dos e o t e r m o glicação para descrever esse processo. Portanto,
e m b o r a o t e r m o giicosilada e glucosilada sejam a m p l a m e n t e u t i l i -
zados na literatura, prefere-se o t e r m o glicada. A H b A I c é f o r m a d a
pela condensação da glicose c o m o resíduo de v a l i n a da região
N - t e r m i n a l de ambas as cadeias P da H b A para f o r m a r u m a base
de S c h i f f instável ( a l d i m i n a , p r é - H b A l c ; Figura 22-5). A base de
S c h i f f p o d e dissociar-se o u sofrer u m rearranjo de A m a d o r i para
f o r m a r u m a c e t o a m i n a estável, H b A i c . H b A l a ! e H b A 1 a l , q u e
f o r m a m H b A i a , t ê m frutose-1,6-difosfato e gliccse-6-fosfato, res-
pectivamente, ligadas ao a m i n o t e r m i n a l da cadeia p. A H b A i h ,
i d e n t i f i c a d a p o r espectrometria de massa, c o n t é m ácido p i r ú v i c o
ligado à valina a m i n o t e r m i n a l da cadeia p, provavelmente p o r
u m a ligação c e t a m i n a o u e n a m i n a . A H b A l c ê a maior fração,
c o n s t i t u i n d o a p r o x i m a d a m e n t e 8 0 % da H b A ^
A glicação pode ocorrer e m outros sítios na cadeia (3, tais c o m o
nos resíduos de lisina, e pode ocorrer na cadeia a . Essas G H b s
não p o d e m ser separadas da h e m o g l o b i n a não glicada p o r métodos
baseados em carga (tais c o m o cromatografia p o r troca iônica), mas
são medidas p o r cromatografia de afinidade ao boronato.
BIOQUÍMICA E FISIOLOGIA
A glicose é a f o n t e p r i m á r i a de energia para o c o r p o h u m a n o .
A p ó s a absorção ( C a p í t u l o 37), o m e t a b o l i s m o de todas as
hexoses procede de acordo c o m as necessidades corporais. Esse
m e t a b o l i s m o resulta em (1) p r o d u ç ã o de energia p o r conversão
para d i ó x i d o de carbono e água, (2) armazenamento na f o r m a
de glicogênio no fígado e triglicerideo n o tecido adiposo o u (3)
conversão para cetoácidos, a m i n o á c i d o s o u proteína.
O esquema c o m p l e t o do m e t a b o l i s m o i n t e r m e d i á r i o dos
carboidratos é complexo e se conecta ao m e t a b o l i s m o de l i p í d i o s
e a m i n o á c i d o s . Para detalhes, os leitores devem consultar u m
l i v r o texto de b i o q u í m i c a .
Regulação da Concentração da Glicose
Sanguínea
A concentração da glicose n o sangue é regulada p o r u m a com-
plexa interação de m ú l t i p l a s vias que é m o d u l a d a por vários
Grupo amino
do N-cermirial Aldimina
Glicose (base de Schiff) Ce coar
Rearranjo
NH: H—C=0 H—C-N—PA de A m a d o r i HnC—NH-pA
PA h—d:— O H H — O H *" b=Q
rápido lento
Hb A + Glicose •— pré-Hb A , c Hb A l c
Figura 22-5 F o r m a ç a o ds h e m o g l o b i n a A ] c , H b , H e m o g l o b i n a .
h o r m ô n i o s . A gheogênese é o n o m e para a conversão da glicose
em glicogênio, o polissacarídeo de reserva mais i m p o r t a n t e n o
fígado e n o músculo. O processo reverso, o u seja, a quebra do
glicogênio e m glicose e em outros p r o d u t o s i n t e r m e d i á r i o s , é
chamado de glicogenólise. A formação da glicose a partir de fontes
não carboidratos, tais c o m o aminoácidos, glicerol o u lactato, é
chamada de g/iconeogénese. A conversão de glicose o u outras
hexoses em lactato o u piruvato é chamada de glicólise. A oxidação
completa até d i ó x i d o de carbono e água ocorre através do ciclo
de Krebs (ácido cítrico) e da cadeia de transporte de elétrons
acoplada à fosforilação oxidativa na m i t o c ô n d r i a . Esse processo
gera a adenosina trifosfato (ATP), molécula que fornece energia
q u í m i c a para m u i t o s processos corporais. A oxidação da glicose
até d i ó x i d o de carbono e água t a m b é m ocorre através da via das
pentoses, via que pToduz a f o r m a Teduzida da n i c o t i n a m i d a
a d e n i n a d i n u c l e o t í d e o fosfato ( N A D P H ) .
D u r a n t e u m breve j e j u m , ocorre a prevenção de u m grande
d e c l í n i o da concentração de glicose sanguínea através da quebra
de glicogênio armazenado n o fígado e da síntese de glicose n o
fígado. U m a pequena q u a n t i d a d e de glicose t a m b é m p o d e ser
p r o d u z i d a a p a r t i r da síntese nos rins. Esses órgãos c o n t ê m
glicose-6-fosfatase, enzima necessária para a p r o d u ç ã o de glicose
a p a r t i r da glicose-6-fosfato, a foTma de glicose que é p r o d u z i d a
t a n t o pela gliconeogênese q u a n t o pela glicogenólise. O m ú s c u l o
esquelético não possui essa enzima, e o glicogênio muscular,
p o r t a n t o , não p o d e c o n t r i b u i r d i r e t a m e n t e para a glicose san-
guínea. Nos casos de j e j u m mais p r o l o n g a d o (>42 horas), a gli-
coneogênese é a responsável p o r essencialmente toda a p r o d u ç ã o
de glicose. E m contraste, após u m a refeição, a glicose absorvida
é convertida e m glicogênio (para armazenamento n o fígado e n o
m ú s c u l o esquelético) o u em g o r d u r a (para armazenamento n o
tecido adiposo).
i n d e p e n d e n t e m e n t e das grandes flutuações n o s u p r i m e n t o
e na d e m a n d a de carboidratos, a concentração da glicose n o
sangue é n o r m a l m e n t e m a n t i d a e m u m i n t e r v a l o estreito p o r
h o r m ô n i o s que m o d u l a m o m o v i m e n t o da glicose d e n t r o do
c o r p o . Esses h o r m ô n i o s são insulina, que d i m i n u i a glicose
sanguínea, e os h o r m ô n i o s contra-reguladores (glucagon, epine-
f r i n a , c o r t i s o l e h o r m ô n i o do crescimento), que a u m e n t a m as
concentrações de glicose sanguínea (Figura 22-6). A captação
n o r m a l da glicose depende (1) da h a b i l i d a d e d o pâncreas em
secretar i n s u l i n a , (2) da h a b i l i d a d e da i n s u l i n a em p r o m o v e r a
captação de glicose nos tecidos periféricos e (3) da h a b i l i d a d e da
i n s u l i n a em s u p r i m i r a p r o d u ç ã o da glicose hepática. Os p r i n c i -
pais órgãos que são alvos da i n s u l i n a são o fígado, o m ú s c u l o
esquelético e o tecido adiposo. Esses órgãos e x i b e m algumas
diferenças e m suas respostas à i n s u l i n a . Por exemplo, a i n s u l i n a
estimula a captação de glicose atTavés de u m t r a n s p o r t a d o r espe-
cífico de glicose, o G L U T 4 , no m ú s c u l o e nos adipócitos, mas
não nos hepatócitos.
Regulação da Concentração da Glicose
Sanguínea pela Insulina
A i n s u l i n a é u m a p r o t e í n a p r o d u z i d a pelas células p das
i l h o t a s de L a n g e r h a n s n o pâncreas. A i n s u l i n a f o i (1) o p r i -
m e i r o h o r m ô n i o p r o t é i c o a ser s e q u e n c i a d o , (2) a p r i m e i r a
substância a ser m e d i d a p o r r a d i o i m u n o e n s a i o ( R I A ) e (3) o
p r i m e i r o c o m p o s t o p r o d u z i d o pela t e c n o l o g i a d o D N A recom-
b i n a n t e para uso p r á t i c o . A i n s u l i n a é u m h o r m ô n i o anabó-
l i c o que e s t i m u l a a captação de glicose pelos tecidos a d i p o s o
e m u s c u l a r , p r o m o v e a conversão de glicose em g l i c o g ê n i o o u
g o r d u r a para a r m a z e n a m e n t o , i n i b e a p r o d u ç ã o de glicose
p e l o fígado, e s t i m u l a a síntese p r o t e i c a e i n i b e a q u e b r a pro-
téica. A liberação e o m e c a n i s m o de ação da i n s u l i n a são

Glucagon
Hormônio do crescimento
Cortisol
Figura 22-€ Regulação h o r m o n a l da
glicose sanguínea. C o r t i s o l , h o r m ô n i o d o
crescimento e epinefrina t a m b é m antagonizam
o efeito da i n s u l i n a . +, E s t i m u l o ; - i n i b i ç ã o . .
a b o r d a d o s de f o r m a mais d e t a l h a d a n o C a p í t u l o 45 da versão
a m p l i a d a deste capítulo. 1 2
A i n s u l i n a h u m a n a (massa m o l e c u l a r de 5 . 8 0 8 Da) consiste
em 51 a m i n o á c i d o s em duas cadeias ( A e B) unidas p o r duas
pontes dissulfeto c o m u m a terceira p o n t e dissulfeto d e n t r o da
cadeia A . A i n s u l i n a de m u i t o s animais é i m u n o l ó g i c a e biolo-
gicamente semelhante à i n s u l i n a h u m a n a , e, n o passado, pacien-
tes f o r a m tratados c o m i n s u l i n a p u r i f i c a d a de pâncreas de gado
o u de p o r c o . Praticamente todos os pacientes são a t u a l m e n t e
tratados c o m i n s u l i n a h u m a n a r e c o m b m a n t e .
A pré-pró-insulina, u m a p r o t e i n a de cerca de 100 aminoáci-
dos, não é detectável na circulação sob condições n o r m a i s , já
que ela é clivada e n z i m a t i c a m e n t e e c o n v e r t i d a e m pró-insulina.
A p r ó - i n s u l i n a fica armazenada nos grânulos secretores n o com-
plexo de G o l g i das células p, o n d e sofre clivagem p r o t e o l í t i c a
c o m a f o r m a ç ã o da i n s u l i n a e d o peptídeo de conexão (peptídeo
C). Esse processamento pós-traducional é catalisado p o r duas
endopeptidases reguladas p o r Ca + 2 d e n o m i n a d a s convertases de
p r ó - h o r m ô n i o 1 e 2 ( P C I e PC2). Os i n t e r m e d i á r i o s da quebra
da p r ó - i n s u l i n a , o f r a g m e n t o p r ó - i n s u l i n a 32,33 e o f r a g m e n t o
p r ó - i n s u l i n a 65,66, são a i n d a h i d r o l i s a d o s até i n s u l i n a e peptí-
deo C . N a m e m b r a n a celular, a i n s u l i n a e o p e p t í d e o C são
liberados na circulação p o r t a l em quantidades equimolares.
A l é m disso, pequenas quantidades de p r ó - i n s u l i n a e de f o r m a s
i n t e r m e d i á r i a s da clivagem e n t r a m na circulação.
A p r ó - i n s u l i n a , que possui relativamente baixa atividade bio-
lógica ( a p r o x i m a d a m e n t e 10% da potência da insulina), é a
m a i o r f o r m a de reserva de i n s u l i n a . N o r m a l m e n t e , somente
pequenas quantidades (cerca de 3 % da q u a n t i d a d e de i n s u l i n a ,
em base m o l a r ) de p r ó - i n s u l i n a e n t r a m na circulação. C o m o a
r e m o ç ã o hepática da p r ó - i n s u l i n a é somente 2 5 % da r e m o ç ã o
da i n s u l i n a , a meia-vida da p r ó - i n s u l i n a é duas a três vezes m a i o r
e as suas concentrações n o estado de j e j u m são aproximada-
m e n t e 1 0 % a 1 5 % das concentrações de i n s u l i n a .
Acredita-se q u e o peptídeo C tenha atividade biológica, e ele
parece necessário para garantir a estrutura correta da i n s u l i n a .
E m b o r a a i n s u l i n a e o p e p t í d e o C sejam secretados na circulação
p o r t a l e m quantidades equimolares, as concentrações de peptí-
Carboidratos CAPÍTULO 2 2
.. - Somatostatina
Ilhota
\ Glicose Insulina
Epinefrina **
\ i
Fígado Tecido adiposo Músculo
deo C em j e j u m é de c i n c o a dez vezes m a i o r d o que as concen-
trações de i n s u l i n a p o r causa da meia-vida m a i o r d o p e p t í d e o C
(cerca de 35 m i n u t o s ) . O fígado n ã o extrai o peptídeo C , que é
r e m o v i d o da circulação pelos r i n s e degradado c o m u m a fração
excretada de f o r m a inalterada na u r i n a .
Transporte de Glicose
U m dos efeitos f u n d a m e n t a i s da i n s u l i n a é a u m e n t a r a captação
de glicose pelas células. O m e c a n i s m o m o l e c u l a r da ação da
i n s u l i n a é e x t r e m a m e n t e complexo. O transporte de glicose para
d e n t r o das células é m o d u l a d o p o r duas famílias de proteínas.
O co-transportador de s ó d i o e / o u glicose i n t e s t i n a l p r o m o v e a
captação da glicose e da galactose da luz d o i n t e s t i n o delgado e
a reabsorção dessas moléculas a p a r t i r da u r m a n o r i m . A segunda
família de transportadores de glicose, conhecidos c o m o transpor-
tadores de glicose facilitada (GLUTÍ), localiza-se na superfície de
todas as células (Tabela 22-1). Esses transportadores são desig-
nados G L U T 1 a G L U T 1 2 c o m base na o r d e m e m que f o r a m
identificados. C o m base nas semelhanças entre suas seqüências,
os G L U T s p o d e m ser d i v i d i d o s e m três subfamílias: classe I
( G L U T 1 - 4 ) , classe I I ( G L U T 5, 7, 9 e 11) e classe I I I ( G L U T 6,
8, 10 e 12, recentemente descritos). O G L U T 1 é a m p l a m e n t e
expresso e fornece, para muitas células, a q u a n t i d a d e basal de
glicose que elas necessitam. O G L U T 1 na barreira hematoence-
fáhca e o G L U T 3 nos n e u r ó n i o s p r o p o r c i o n a m concentrações
altas e constantes de glicose necessárias pelo cérebro. O G L U T 2
é expresso nos hepatóeitos, nas células (3 d o pâncreas e nas
m e m b r a n a s basolaterais das células epiteliais intestinais e renais.
O G L U T 2 é u m sistema de transporte de baixa a f i n i d a d e e baixa
capacidade que p e r m i t e o m o v i m e n t o i l i m i t a d o de glicose para
d e n t r o e para f o r a dessas células. O G L U T 4 catalisa a etapa
l i m i t a n t e para a captação e o m e t a b o l i s m o da glicose n o m ú s c u l o
esquelético, o m a i o r órgão de c o n s u m o de glicose. Q u a n d o as
concentrações de i n s u l i n a circulante estão baixas, a m a i o r parte
do G L U T 4 fica inativa e m c o m p a r t i m e n t o s intracelulares. A p ó s
u m a refeição, o pâncreas libera i n s u l i n a , o q u e estimula a trans-
locação do G L U T 4 para a m e m b r a n a plasmática, que, p o r sua
388 PARTE IV Analitos
TABELA 22-1 Transportadores de Glicose Humanos
Nome Tecido
GLUT1 (eritrócitos) Ampla distribuição, especialmente no cérebro, no rim, no cólon e em tecidos fetais
GLLTT2 (fígado) Fígado, céiuias p do pâncreas, intestino delgado e rim
GLUT3 (cérebro) Ampla distribuição, especialmente em neurônios, placenta e testículos
GLUT4 (músculo) Músculos esquelético 6 cardíaco e tecido adiposo
GLUT5 (intestino delgado) Intestino delgado, rins, músculo esquelético, cérebro e tecido adipose
GLUT6 Leucócitos e cérebro
GLUT7 Fígado
GLLÍT8 Testículos, biastocistos, cérebro, músculo e tecido adiposo
GLLFT9 Fígado e rins
GLimo Fígado e pâncreas
GLUT11 Coração e músculo esquelética
GLLÍT12 Músculos esquelético e cardíaco, tecido adiposo e mamas
vez, p r o m o v e a captação de glicose nos tecidos muscular esque-
lético e adiposo. O transporte de glicose para d e n t r o d o m ú s c u l o
esquelético, e s t i m u l a d o pela i n s u l i n a , f i c a p r e j u d i c a d o e m i n d i -
v í d u o s c o m diabetes mellitus t i p o 2, mas ainda não se d e t e r m i -
n o u o m e c a n i s m o patológico envolvido. O G L U T 5 é responsá-
vel pela captação de frutose n o i n t e s t i n o . Pouco se sabe a respeito
dos outros G L U T s . F o i d e m o n s t r a d o que os G L U T 6, 8, 11 e
12 t r a n s p o r t a m glicose.
Formação da Hemoglobina Glicada
A f o r m a ç ã o da G H b é essencialmente irreversível, e sua concen-
tração sanguínea depende t a n t o do t e m p o de v i d a d o g l ó b u l o
v e r m e l h o (cerca de 120 dias) q u a n t o da concentração de glicose
sanguínea. C o m o a taxa de f o r m a ç ã o da G H b é d i r e t a m e n t e
p r o p o r c i o n a l à concentração da glicose sanguínea, a concentração
de G H b representa os valores integrados da glicose ao iongo dai 6 a 8
semanas precedentes. Esse fato fornece u m critério a d i c i o n a l para
avaliar o c o n t r o l e da glicose, já que os valores de G H b estão
livres das flutuações diárias da glicose e não são afetados p o r
exercício recente o u p o r ingestão de alimentos. A c o n t r i b u i ç ã o
da concentração de glicose plasmática para a G H b m e d i d a em
u m d a d o m o m e n t o depende d o i n t e r v a l o de r e m p o antes da
coleta de sangue; as concentrações de glicose mais recentes
possuem m a i o r c o n t r i b u i ç ã o para a G H b d o que os valores mais
antigos, já que, pelo menos parcialmente, mais glóbulos verme-
lhos sobrevivem a p a r t i r de u m p e r í o d o recente do q u e a p a r t i r
de u m p e r í o d o de t e m p o mais remoto. A glicose plasmática nos
30 dias precedentes d e t e r m i n a 5 0 % da H b A i e , e n q u a n t o que,
nos 60 a 120 dias precedentes, a glicose sanguínea d e t e r m i n a
somente 2 5 % . A p ó s u m a alteração a b r u p t a nas concentrações
de glicose sanguínea, a taxa de alteração da H b A 1 c fica mais
rápida d u r a n t e os dois meses iniciais, seguida p o r u m a alteração
mais gradual que se a p r o x i m a do estado d i n â m i c o de e q u i l í b r i o
depois de três meses. A meia-vida é de 35 dias.
A interpretação da G H b depende dos glóbulos vermelhos
que possuem u m t e m p o de vida n o r m a l . Os pacientes c o m
doença h e m o l í t i c a o u outras condições em que os glóbulos
vermelhos possuem u m t e m p o de sobrevivência mais c u r t o
e x i b e m u m a redução substancial na G H b . J As concentrações de
G H b a i n d a p o d e m ser utilizadas para m o n i t o r a r esses pacientes
q u a n d o a sobrevivência dos seus glóbulos vermelhos não estiver
alterada, mas devem-se comparar os valores c o m os valores ante-
riores do m e s m o paciente e não c o m os intervalos de referência
publicados. Os i n d i v í d u o s c o m perda recente significativa de
glóbulos v e r m e l h o s possuem valores baixos falsos p o r causa de
u m a fração m a i o r de e n t r ó c i t o s jovens; a G H b então a u m e n t a r á
Função
Transporte basal de glicose
Transporte ilimitado de glicose
Transporte de glicose em neurônios
Transporte de glicose estimulado por insulina
Transporte de frutose (não glicose)
Transporte de Glicose
Liberação de glicose do retículo
endoplasmático
Transporte de glicose
Transporte de glicose
à medida que as células envelhecem, d i s p o n i b i l i z a n d o t e m p o
suficiente para a ligação de glicose à h e m o g l o b i n a para f o r m a r
G H b . Foi d e m o n s t r a d a a ocorrência de concentrações altas de
G H b em anemia p o r deficiência de ferro, provavelmente p o r
causa da alta p r o p o r ç ã o de eritrócitos velhos. O efeito das varian-
tes da h e m o g l o b i n a (tais c o m o H b F, H b S e H b C) depende d o
m é t o d o específico de análise (discutido adiante). 3 D e p e n d e n d o
da h e m o g l o b i n o p a t i a p a r t i c u l a r e d o m é t o d o de ensaio, os resul-
tados p o d e m apresentar u m a elevação o u u m a d i m i n u i ç ã o
espúria. O u t r a f o n t e de erro e m métodos selecionados é a hemo-
globina carbamilada que se f o r m a pela ligação de uréia à hemo-
globina e está presente e m grandes quantidades na disfunção renal,
patologia c o m u m e m pacientes c o m diabetes.
Hormônios Contra-reguladores
M u i t o s h o r m ô n i o s possuem ações opostas às da i n s u l i n a . Esses
h o r m ô n i o s contra-reguladores são catabólicos e a u m e n t a m a
produção de glicose hepática, i n i c i a l m e n t e pelo a u m e n t o da
quebra do glicogênio e m glicose (glicogenólise) e, mais tarde,
pelo estímulo da síntese de glicose (gliconeogênese). A resposta
i n i c i a l do c o r p o (em m i n u t o s ) à baixa glicose sanguínea é o
a u m e n t o da p r o d u ç ã o de glicose estimulada pelo glucagon e pela
e p i n e f r i n a . C o m o t e m p o (3 a 4 horas), o h o r m ô n i o do cresci-
m e n t o e o d o r t i s o l a u m e n t a m a mobilização da glicose e d i m i -
n u e m a utilização da glicose (Figura 22-6). H á t a m b é m evidên-
cias de que a p r o d u ç ã o de glicose pelo fígado é u m a f u n ç ã o
inversa da concentração a m b i e n t e de glicose, i n d e p e n d e n t e de
fatores h o r m o n a i s (auto-regulação da glicose). O papel de o u t r o s
h o r m ô n i o s o u neurotransmissores não é claro, mas parece não
ser i m p o r t a n t e . Os m ú l t i p l o s h o r m ô n i o s contra-reguladores
e x i b e m r e d u n d â n c i a e h i e r a r q u i a . O glucagon é o mais i m p o r -
tante, e a e p i n e f r i n a torna-se f u n d a m e n t a l na ausência do glu-
cagon. Os outros fatores possuem papéis menos i m p o r t a n t e s .
Glucagon
O glucagon é u m p o l i p e p t í d e o de 29 aminoácidos secretado
pelas células a do pâncreas. O m a i o r alvo do glucagon é o fígado,
o n d e ele se liga a receptores específicos e a u m e n t a a adenosina-
5'-monofosfato ( A M P ) e o cálcio intracelulares. O glucagon esti-
m u l a a p r o d u ç ã o de glicose n o fígado p o r glicogenólise o u gli-
coneogênese (Figura 22-6). A l é m disso, o glucagon a u m e n t a a
cetogênese n o fígado. OutTO alvo menos i m p o r t a n t e d o glucagon
é o tecido adiposo, o n d e o h o r m ô n i o a u m e n t a a lipólise. A
secreção do glucagon é regulada p r i m a r i a m e n t e pelas concentra-
ções de glicose plasmática, sendo as concentrações baixa e alta
de glicose plasmática estimuladoras e i n i b i d o r a s , respectiva-

m e n t e . O diabetes meííitus d u r a d o u r o p r e j u d i c a a resposta d o
glucagon à h i p o g l i c e m i a , a u m e n t a n d o a i n c i d ê n c i a de episódios
hipoglicêmicos. Estresse, exercício e a m i n o á c i d o s t a m b é m
i n d u z e m a liberação de glucagon. A i n s u l i n a i n i b e a liberação
de glucagon d o pâncreas e d i m i n u i a expressão gênica do gluca-
gon, d i m i n u i n d o , p o r t a n t o , sua biossíntese. Acredita-se que
concentrações elevadas de glucagon secundárias à deficiência de
i n s u l i n a c o n t r i b u e m para a h i p e r g l i c e m i a e para a cetose do
diabetes.
Epinefrína
A e p i n e f r í n a (adrenalina), u m a catecolamina secretada pela
m e d u l a adtenal, estimula a q u e b r a d o glicogênio (glicogenólise)
e d i m i n u i a utilização da glicose, a u m e n t a n d o , p o r t a n t o , as
concentrações de glicose sanguínea. Ela t a m b é m estimula a
secreção de glucagon e i n i b e a secreção de i n s u l i n a pelo pâncreas
(Figura 22-6), a u m e n t a n d o a i n d a mais, p o r t a n t o , a glicose san-
guínea. A e p i n e f r í n a parece exercer u m papel i m p o r t a n t e na
contra-regulação da glicose q u a n d o a secreção do glucagon está
p r e j u d i c a d a (p.ex., nos casos de diabetes mellitus t i p o 1). O estresse
físico o u e m o c i o n a l a u m e n t a a p r o d u ç ã o de e p i n e f r í n a c o m
liberação de glicose para energia. Os t u m o r e s da m e d u l a adrenal,
conhecidos c o m o /eocromocitomas secretam e p i n e f r í n a o u norepi-
n e f r i n a e m excesso e p r o d u z e m h i p e r g l i c e m i a m o d e r a d a
e n q u a n t o as reservas de glicogênio estão disponíveis n o fígado.
Hormônio do Crescimento
O h o r m ô n i o d o crescimento é u m p o l i p e p t í d e o secretado pela
glândula p i t u i t á r i a a n t e r i o r ( C a p í t u l o 40). Ele estimula a glico-
neogênese, a u m e n t a a lipólise e antagoniza a captação de glicose
estimulada pela i n s u l i n a .
Cortiso!
O cortisol, secretado pelo córtex adrenal em resposta ao h o r m ô -
n i o a d r e n o c o r t i c o t r ó f i c o ( A C T H ) , estimula a gliconeogênese e
a u m e n t a a quebra de proteínas e gorduras ( C a p í t u l o 39). H i p e r -
plasia o u tumores do córtex adrenaí p o d e m p r o d u z i r c o r t i s o l em
excesso ( s í n d r o m e de C u s h i n g ) , causando, p o r t a n t o , hiperglice-
m i a . Por o u t r o l a d o , i n d i v í d u o s c o m a doença de A d d i s o n
d e m o n s t r a m insuficiência a d r e n o c o r t i c a l p o r causa da destrui-
ção o u atrofia do córtex adrenal e p o d e m exibir h i p o g l i c e m i a .
Outros H o r m ô n i o s que Influenciam o
M e t a b o l i s m o da Glicose
A tiroxina e a somatostatina também aíetam o metabolismo de
glicose.
Tiroxina
A tiroxina, secretada pela glândula tireóide, não está envolvida
diretamente na homeostase da glicose, mas estimula a glicogenólise
e aumenta a taxa de esvaziamento gástrico e a absorção intestinal
da glicose (Capítulo 41). Esses fatores p o d e m produzir intolerância
à glicose em indivíduos drotóxicos, mas tais indivíduos geralmente
possuem u m a concentração n o r m a l de glicose plasmática em
jejum,
Somatostatina
A somatostatina, t a m b é m c o n h e c i d a c o m o hormonio inibidor do
hormônio de crescimento e h i s t o r i c a m e n t e c o n h e c i d a c o m o f a t o r
de i n i b i ç ã o da liberação de s o m a t o t r o f i n a (SRIF), é u m peptídeo
de 14 aminoácidos e n c o n t r a d o n o trato gastrointestinal, h i p o -
tálamo e células delta das ilhotas pancreáticas. E m b o r a a soma-
tostatina não pareça ter u m efeito d i r e t o n o m e t a b o l i s m o dos
carboidratos, ela i n i b e a liberação de h o r m ô n i o de crescimento
Carboidratos CAPÍTULO 22 389
da p i t u i t á r i a . A l é m disso, a somatostatina i n i b e a secreção de
glucagon e de i n s u l i n a pelo pâncreas, m o d u l a n d o , p o r t a n t o , a
relação recíproca entre esses dois h o r m ô n i o s .
C o r p o s Cetônicos
O desenvolvimento de cetose requer alterações t a n t o n o tecido
adiposo q u a n t o n o fígado. Os substratos p r i m á r i o s para a for-
mação dos corpos cetônicos são ácidos graxos livres das reservas
de gordura. N o r m a l m e n t e , os ácidos graxos de cadeia longa são
captados pelo fígado, reesterificados em triglicerídeos e armaze-
nados n o fígado, o u são convertidos em l i p o p r o t e í n a s de densi-
dade m u i t o baixa e devolvidos ao plasma. E m i n d i v í d u o s c o m
diabetes descontrolado, as baixas concentrações de i n s u l i n a
causam a u m e n t o da lipóhse e d i m i n u i ç ã o da reesterificação de
ácidos graxos e m triglicerídeos, a u m e n t a n d o , p o r t a n t o , os ácidos
graxos livres n o plasma. A l é m disso, o a u m e n t o da p r o p o r ç ã o
entre o glucagon e a i n s u l i n a do paciente a u m e n t a a oxidação de
ácidos graxos n o fígado. Portanto, o a u m e n t o da p r o d u ç ã o hepá-
tica de cetona e a d i m i n u i ç ã o do seu m e t a b o l i s m o nos tecidos
periféricos causam a c ú m u l o de acetoacetato n o sangue. U m a
pequena fração sofre descarboxilaçao espontânea e f o r m a acetona,
mas a m a i o r i a é convertida e m ]3-hidroxibutirato:
cu o- P-liidroxihutirato O O
desiditigenase ( n o fígado)
Ah2 /* *\ <^2
O'"' CH 3
r
N A D H + H®
^
NAD®
ho^CH
A 3
Acetoacetato
P-hidroxibutirato
Espontâneo
CO.
H3C X:H3
Acetona
A p r o p o r ç ã o relativa na q u a l os três corpos cetônicos estão
presentes n o sangue varia d e p e n d e n d o do estado redox da célula.
E m i n d i v í d u o s sadios, o |3-hidroxibutirato e o acetoacetato pre-
sentes em concentrações a p r o x i m a d a m e n t e equimolares consti-
t u e m p r a t i c a m e n t e todas as cetonas séricas. A acetona é u m
c o m p o n e n t e m e n o r . E m casos de diabetes grave, a p r o p o r ç ã o de
fS-hidroxibutirato/acetoacetato p o d e a u m e n t a r em até 6:1 p o r
causa da presença de grandes quantidades da f o r m a reduzida de
n i c o t i n a m i d a adenina d i n u c l e o t í d e o C N A D H ) , que favorece a
p r o d u ç ã o de p - h i d r o x i b u t i r a t o .
L a c t a t o e Piruvato
O ácido láctico, u m i n t e r m e d i á r i o n o m e t a b o l i s m o dos carboi-
dratos, origina-se p r e d o m i n a n t e m e n t e do m ú s c u l o esquelético
b r a n c o , cérebro, pele, m e d u l a renal e eritrócitos. A concentração
de lactato sanguíneo depende da taxa de p r o d u ç ã o nesses tecidos
e da taxa metabólica n o fígado e nos rins. O fígado utiliza apro-
x i m a d a m e n t e 65% (75 g / d i a ) d o lactato basal t o t a l p r o d u z i d o
p r e d o m i n a n t e m e n t e na gliconeogênese. O ciclo de C o r i é a
conversão da glicose e m lactato na periferia e a reconversão do
lactato em glicose n o fígado. A remoção extra-hepática de lactato
é realizada p o r oxidação n o m ú s c u l o esquelético v e r m e l h o e n o
córtex renal. O a u m e n t o m o d e r a d o na p r o d u ç ã o de lactato
causa a u m e n t o da remoção hepática d o lactato, mas sua capta-
ção pelo fígado é saturável q u a n d o as concentrações excedem 2
m m o l / L . D u r a n t e exercício intenso, p o r exemplo, as concentra-
ções médias de lactato p o d e m a u m e n t a r significativamente de
390 PARTE IV ftnalitos
cerca de 0,9 para mais de 20 m m o l / L em 10 segundos. N e n h u m a
concentração de lactato é u n i f o r m e m e n t e aceita para o diagnós-
tico de acidose láctica, mas concentrações de lactato que excedem
5 m m o l / L c o m p H m e n o r do q u e 7,25 i n d i c a m acidose láctica
significativa.
SIGNIFICÂNCIA CLÍNICA
O diabetes mellitus e a h i p o g l i c e m i a são condições clínicas asso-
ciadas ao m e t a b o l i s m o a n o r m a l dos catboidratos.
Diabetes Mellitus
O diabetes m e l l i t u s é u m g r u p o de distúrbios metabólicos d o
m e t a b o l i s m o dos carboidratos n o q u a l a glicose é suhurilizada,
p r o d u z i n d o hiperglicemia. A l g u n s i n d i v í d u o s p o d e m experi-
m e n t a r episódios hiperglicêmicos agudos debilitantes, tais c o m o
ceroacidose o u coma hiperosmolar. Q u a n d o a doença p r o g r i d e ,
a u m e n t a o risco de os i n d i v í d u o s desenvolverem complicações
específicas, i n c l u i n d o r e t i n o p a t i a (que p o d e causar cegueira),
disfunção renal, n e u t o p a t i a (lesão nervosa) e aterosclerose. A
ú l t i m a c o n d i ç ã o p o d e causar derrame, gangrena o u doença arte-
rial coronária.
E m 1987, a prevalência de diabetes diagnosticada era de 6,8
milhões. E m 2001, o U.S. Centers o f Disease C o n t r o l and Pre-
v e n t i o n ( C D C ) e s t i m o u u m a prevalência de 7 , 9 % em adultos,
o u 16,7 milhões de pessoas. C o m o pelo menos 3 0 % de todos
os casos são subdiagnosticados, acreditava-se que o n ú m e r o t o t a l
poderia ser de cerca de 22 milhões. Esse a u m e n t o na prevalência
do diabetes é u m f e n ô m e n o global, já que ela f o i estimada em
4 , 0 % , e m 1995, em adultos ao redor do m u n d o e antecipou-se
u m crescimento para 5 , 4 % (300 m i l h õ e s de adultos) em 2025.
Dos 3 0 0 m i l h õ e s de adultos, mais de 7 5 % estarão em países e m
desenvolvimento. Essas estatísticas fazem c o m que o diabetes seja
descrito c o m o " u m a das p r i n c i p a i s ameaças à saúde h u m a n a n o
século 21". A prevalência de diabetes mellitus a u m e n t a c o m a
idade, e a p r o x i m a d a m e n t e metade de todos os casos ocorre em
pessoas c o m mais de 55 anos de idade. N o s Estados U n i d o s ,
- 2 0 % da população c o m mais de 65 anos de idade t ê m diabetes.
H á predileção racial, e, c o m 65 anos de idade, 3 3 % dos hispâ-
nicos, 2 5 % dos negros e 17% dos brancos nos Estados U n i d o s
terão diabetes mellitus. E m 2002, estimou-se que o diabetes mellitus
era responsável p o r u m gasto de U S $ 132 bilhões em serviços
de saúde nos Estados U n i d o s . Os custos diretos f o r a m estimados
em U S $ 9 2 bilhões, c o m 5 0 % sendo i n c o r r i d o s p o r i n d i v í d u o s
c o m mais de 65 anos de idade. A estimativa de 186.000 mortes
anuais é a t r i b u í d a a diabéticos, sendo duas vezes mais mortes
e m mulheres americanas diabéticas que em por tador as de câncer
de m a m a . A p r o x i m a d a m e n t e , u m em cada cinco dólares gastos
nos serviços de saúde dos Estados U n i d o s e m 2 0 0 2 f o i c o m
pessoas c o m diabetes mellitus.
Classificação
O diabetes f o i i n i c i a l m e n t e d i a g n o s t i c a d o p e l o teste o r a l de
t o l e r â n c i a à glicose ( O G T T ) . E m 1979, u m g r u p o de t r a b a l h o
do N a t i o n a l D i a b e t e s D a t a G r o u p p r o p ô s c r i t é r i o s m o d i f i c a -
dos para o d i a g n ó s t i c o . Esse esquema de classificação reco-
n h e c e u duas f o r m a s maiores de diabetes — diabetes mellitus
t i p o I ( d e p e n d e n t e de i n s u l i n a ; I D D M ) e diabetes mellitus t i p o
I I (não d e p e n d e n t e de i n s u l i n a ; N I D D M ) . Os termos diabetes
juvenil e diabetes adulto f o r a m abolidos. Para classificar o diabetes
c o m base na etiologia, e não c o m base no t r a t a m e n t o , a A m e r i -
can Diabetes A s s o c i a t i o n ( A D A ) , em 1995, f o r m o u u m g r u p o
de t r a b a l h o para reexaminar a classificação e o diagnóstico do
diabetes mellitus. A classificação revisada, publicada em 1997,
e l i m i n a os termos diabetes mellitus dependente de insulina e diabetes
QUADRO 22-1 Classificação do Diabetes Mellitus e Outras
Categorias de Intolerância à Glicose
Diabetes tipo 1
A Imuriomediado
B Idicpático
Diabetes tipo 2
Outros tipos específicas de diabetes
Diabetes mellitus gestacionai (GDM)
Tolerância à glicose prejudicada (IGT)
Glicose de jejum prejudicada (IFG)
Da American Diabetes Assoítaíion. Repoit of the experi camjntttee on lhe diagnosis
and clnssificaüon of diabetes míllitus Diabetes Care 1997;20:1183 1201
mellitus não dependente de insulina, que atualmente são conhecidas
c o m o diabetes tipo 1 e diabetes tipo 2, respectivamente ( Q u a d r o
22-1). O u t r a alteração significativa é a eliminação das categorias
de a n o r m a l i d a d e prévia de tolerância à glicose e a n o r m a l i d a d e
p o t e n c i a l de tolerância à glicose.
Diabetes Mellitus Tipo 1
O diabetes mellitus t i p o 1 era c o n h e c i d o a n t e r i o r m e n t e c o m o
I D D M ou diabetes t i p o I o u j u v e n i l . A p r o x i m a d a m e n t e 5 % a
10% de todos os i n d i v í d u o s c o m diabetes mellitus estão nessa
categoria. Os sintomas (p. ex., p o l i ú r i a , p o l i d i p s i a e perda r á p i d a
de peso) se apresentam de f o r m a aguda; os i n d i v í d u o s possuem
i n s u l i n o p e n i a ( u m a deficiência de insulina) p o r causa da perda
das células p da i l h o t a pancreática e d e p e n d e m de t r a t a m e n t o
c o m i n s u l i n a para sustentar a v i d a e evitar cetose. A m a i o r i a dos
i n d i v í d u o s possui anticorpos que i d e n t i f i c a m u m processo auto-
i m u n e (ver discussão adiante); alguns não possuem evidências
de a u t o - i m u n i d a d e e são classificados c o m o de tipo 1 idiopático.
O pico de incidência dessa doença ocorre na i n f â n c i a e na ado-
lescência. A p r o x i m a d a m e n t e 7 5 % a d q u i r e m a doença antes dos
3 0 anos de idade, mas o s u r g i m e n t o na porcentagem restante
dos i n d i v í d u o s p o d e ocorrer e m q u a l q u e r idade. A idade na
apresentação não é u m c r i t é r i o para a classificação.
Diabetes Mellitus Tipo 2
A n t e r i o r m e n t e c o n h e c i d o c o m o N I D D M , o diabetes t i p o 2
c o n s t i t u i a p r o x i m a d a m e n t e 9 0 % de todos os casos de diabetes.
O s pacientes (1) possuem sintomas m í n i m o s , (2) não são pro-
pensos à cetose e (3) não são dependentes de insulina para i m p e d i r
a ocorrência de cetonúria. As concentrações de insulina podem estar
dentro do intervalo de referência ou podem estar elevadas ou diminuí-
das, e, na m a i o r i a das pessoas c o m essa f o r m a de diabetes, a ação
da i n s u l i n a está prejudicada. A obesidade está c o m u m e n t e asso-
ciada, e perda de peso sozinha geralmente a u m e n t a a hiperglice-
mia. Porém, m u i t o s i n d i v í d u o s c o m diabetes t i p o 2 p o d e m
necessitar de u m a dieta especial, u m agente h i p o g l i c ê m i c o oral
o u terapia c o m i n s u l i n a para c o n t r o l a r a hiperglicemia. A
m a i o r i a dos pacientes a d q u i r e a doença após 40 anos de idade,
mas ela pode ocorrer em pessoas mais jovens. O diabetes t i p o 2
e m crianças e adolescentes é u m p r o b l e m a emergente e signifi-
cativo. Entre crianças n o Japão, o diabetes tipos 2 é, atualmente,
mais c o m u m d o q u e o t i p o 1.
Diabetes Mellitus Gestacianal
O diabetes m e l l i t u s gestacional ( G D M ) é a i n t o l e r â n c i a a car-
b o i d r a t o s de gravidade variável com surgimento ou primeiro reconhe-
cimento durante a gravidez.9 Observe q u e as mulheres c o m diabetes

que f ica ra m grávidas não estão incluídas nessa categoria. As
estimativas da freqüência de tolerância a n o r m a l à glicose d u r a n t e
a gravidez v a r i a m de 1% a 14%, d e p e n d e n d o da população
estudada e dos testes diagnósticos empregados. N o s Estados
U n i d o s , a G D M ocorre em 6 % a 8 % das gestações. A s mulheres
c o m G D M possuem u m risco significativamente elevado de
diabetes subseqüente, p r e d o m i n a n t e m e n t e a t i p o 2. A incidên-
cia acumulada do diabetes t i p o 2 após G D M varia entre as
populações, de ~ 4 0 % a 7 0 % . A i n c i d ê n c i a anual está marcada-
m e n t e elevada sobre a i n c i d ê n c i a na população geral e a u m e n t a
d u r a n t e os p r i m e i r o s 5 anos, alcançando u m platô após 10 anos.
Nas 6 a 12 semanas pós-parto, todas as pacientes que t i v e r a m
G D M devem ser avaliadas, e, caso o diabetes não esteja presente,
elas devem ser reavaliadas pelo m e n o s a cada 3 anos.
Outros Tipos Específicos de Diabetes Mellitus
Essa subclasse i n c l u i os pacientes cuja hiperglicemia ocorre p o r
causa de u m d i s t ú r b i o especifico subjacente, tais c o m o (1) defei-
tos genéticos da f u n ç ã o das células |3; (2) defeitos genéticos na
ação da i n s u l i n a ; (3) doença d o pâncreas exócrino; (4) endocri-
nopatias (p. ex., doença de C u s h i n g , acromegalia e glucago-
n o m a ) ; (5) a administração de h o r m ô n i o s o u drogas que i n d u z e m
disfunção das células J3 (p.ex., glicocorticóides, tiazidas e (3-adre-
nérgicos); (6) infecções; (7) formas i n c o m u n s de diabetes i m u n o -
mediada; o u (8) outras condições genéticas (p.ex., s í n d r o m e de
D o w n , s í n d r o m e de K l i n e f e l t e r e p o r f i r i a ; ver A D A I a para u m a
lista detalhada). Esses tipos de diabetes eram conhecidos c o m o
diabetes secundário.
Tolerância à Glicose Prejudicada
Diagnostica-se tolerância à glicose prejudicada ( I G T ) em pessoas
cujas concentrações de glicose sanguínea e m j e j u m são menores
do que as concentrações necessárias para o diagnóstico de diabe-
tes meííitiis, mas possuem resposta à glicose d u r a n t e o O G T T
e n t i e os estados n o r m a l e diabético. O O G T T é necessário para
d e t e r m i n a r se o paciente pertence a essa classe. O desenvolvi-
m e n t o de diabetes c o m claros sintomas ocorre c o m u m a taxa de
1% a 5 % p o r ano e m pessoas c o m I G T , mas u m a grande pro-
porção reverte espontaneamente para a tolerância à glicose
n o r m a l . A doença microvascular é rara nesse grupo, e os pacien-
tes geralmente n ã o e x p e r i m e n t a m complicações renais o u reti-
nais do diabetes. Os pacientes t ê m u m a u m e n t o da prevalência
de aterosclerose e m o r t a l i d a d e de doença cardiovascular.
Glicose de Jejum Prejudicada
A glicose de j e j u m prejudica ( I F G ) é análoga à I G T , mas é diag-
nosticada através de u m valor de glicose de jejum acima d o
n o r m a l , mas abaixo da concentração para o diagnóstico de dia-
betes. E u m a etapa metaból i c a entre a homeostase n o r m a l da
glicose e o diabetes. A s s i m c o m o a I G T , as pessoas c o m I F G
possuem u m risco elevado de desenvolvimento de diabetes e
doença cardiovascular. A I F G e a I G T não são entidades clínicas,
mas são fatores de risco para diabetes e doença cardiovascular.
Patogênese do Diabetes Meliitus Tipo 1
A maior parte do diabetes mellitus t i p o 1 ocorre devido a uma des-
truição auto-imune das células secretoras de insulina das células J3
pancreáticas.2,1"1 N a maioria dos pacientes, a destruição é mediada
por células T. T a l patologia é chamada de diabetes tipo I A ou
i m u n o m e d i a d o . As células a , 5 e outras células das ilhotas perma-
necem preservadas. As células das ilhotas possuem u m infiltrado
crônico de células m o n o nucleares, chamado de insu/ite. O processo
auto-imune que causa o diabetes tipo l inicia-se meses o u anos antes
da apresentação clínica, e é necessária u m a redução de 8 0 % a 9 0 %
Carboidratos CAPÍTULO 22 391
n o v o l u m e das células (3 para induzir o diabetes t i p o l sintomático.
A taxa de destruição de células é variável e geralmente mais rápida
em crianças do que em adultos
Anticorpos
A n t i c o r p o s circulantes são marcadores da a u t o - i m u n i d a d e contra
as células {3. Tais anticorpos são detectados n o soro anos antes
do i n i c i o da hiperglicemia. São eles2,13:
1. Os anticorpos antieéluhxs d/is ilhotas ( I C A s ) reagem c o m u m
antígeno sialoglicoconjugado presente n o citoplasma de todas
as células endócrinas das ilhotas pancreáticas. Esses anticor-
pos são detectados nos soros de 0 , 5 % dos i n d i v í d u o s normai s
e 7 5 % a 8 5 % dos pacientes c o m novos diabetes d p o 1 diag-
nosticados.
2. Os auto-anücorpos antiinsulina (LAAs) estão presentes em mais
de 9 0 % das crianças que desenvolvem diabetes t i p o 1 antes
dos 5 anos de idade, mas e m menos de 4 0 % dos i n d i v í d u o s
que desenvolvem diabetes após os 12 anos de idade. A fre-
quência desses a n t i c o r p o s em pessoas sadias é semelhante à
dos I C A s .
3. Os anticorpos antiisoforma de 65 kD dã ácido gUitâmico descar-
boxilase ( G A D 6 5 ) são e n c o n t r a d o s e m até 10 anos antes do
s u r g i m e n t o clínico do diabetes t i p o 1 e estão presentes em
- 6 0 % dos pacientes c o m novos diabetes diagnosticados. Os
a n t i c o r p o s a n t i - G A D 6 5 são utilizados para i d e n t i f i c a r pacien-
tes c o m diabetes t i p o 2 aparente que irá p r o g r e d i r para o
diabetes t i p o 1.
4. D o i s antígenos associados ao insuíinomíi, 1 A - 2 A e l A - 2 p
( t a m b é m c h a m a d o de l A - 2 p A ) , t ê m c o m o alvo duas tirosina
fosfatases. Esses antígenos são detectados em mais de 5 0 %
dos pacientes recém-diagnosticados c o m diabetes t i p o 1.
Genética
A suscetibilidade ao diabetes t i p o 1 é hereditária, mas a f o r m a
de hereditariedade é complexa e a i n d a não está d e f i n i d a com-
p l e t a m e n t e . O diabetes t i p o 1 é u m a doença m u l t i g ê n i c a , e o
p r i n c i p a l iocus é o complexo de h i s t o c o m p a t i b i l i d a d e p r i n c i p a l
n o c r o m o s s o m o 6. Pelo menos o u t r o s 11 loci em 9 cromossomos
t a m b é m c o n t r i b u e m , c o m a região reguladora d o gene da insu-
l i n a n o c r o m o s s o m o l l p l 5 sendo u m locus i m p o r t a n t e . A taxa
de c o n c o r d â n c i a entre gêmeos idênticos é de a p r o x i m a d a m e n t e
3 0 % , e a p r o x i m a d a m e n t e 9 5 % dos brancos c o m diabetes t i p o 1
expressam o antígeno leucocitário h u m a n o ( H L A ) - D R 3 o u o
H L A - D R 4 . Porém, até 4 0 % da população não diabética t a m b é m
expressam esses alelos. E m contraste, o alelo H L A - D Q B 1*0602
eleva significativamente o risco de diabetes t i p o 1. A tipagem de
H L A p o d e indicar o risco absoluto de diabetes. O risco de u m
i r m ã o desenvolver diabetes é de 1%, 5 % e 10% a 2 0 % se o
n ú m e r o de h a p l ó t i p o s for zero, u m e dois, respectivamente.
Porém, somente 10% dos pacientes c o m t i p o 1 t ê m u m parente
de p r i m e i r o grau afetado. A m u l t i p l i c i d a d e das regiões cromos-
sômicas independentes associadas a u m a predisposição ao dia-
betes t i p o 1 sugere que outros genes suscetíveis serão identifica-
dos. A determinação r o t i n e i r a de marcadores genéticos não t e m
valor neste m o m e n t o para o diagnóstico o u c o n t r o l e de pacien-
tes c o m diabetes t i p o l . 1 j
Ambiente
Acredita-se que fatores ambientais estejam envolvidos n o surgi-
m e n t o do diabetes. Por exemplo, implicam-se alguns virus, c o m o
os da rubéola, caxumba e o coxsackievírus B. Sugere-se ainda o
e n v o l v i m e n t o de outros fatores ambientais, c o m o p r o d u t o s quí-
micos o u leite b o v i n o .
392 PARTE IV Analitos
Patogênese do Diabetes Mellitus Tipo 2
A resistência a insulina e a disfunção das células p são defeitos
patológicos e m pacientes c o m diabetes t i p o 2. A resistência à
i n s u l i n a é u m a d i m i n u i ç ã o da h a b i l i d a d e da i n s u l i n a em agir no
tecido periférico, e acredita-se que essa d i m i n u i ç ã o seja o pro-
cesso p a t o l ó g i c o p r i m á r i o subjacente. A disfunção das células P
é a falta de h a b i l i d a d e do pâncreas em p r o d u z i r i n s u l i n a sufi-
ciente para compensar a resistência à insulina. C l i n i c a m e n t e , há
u m a deficiência relativa de i n s u l i n a no i n í c i o da doença e u m a
deficiência absoluta de i n s u l i n a nas etapas mais tardias da
doença. N ã o está claro se o diabetes t i p o 2 ocorre p r i m a r i a m e n t e
devido ao defeito na secreção das células P, à resistência perifé-
rica à i n s u l i n a o u a ambos. Porém, há dados para apoiar o
conceito de que a resistência à i n s u l i n a é o defeito p r i m á r i o que
precede o desarranjo na secreção da i n s u l i n a e o diabetes c l í n i c o
p o r mais de 20 anos. I n d e p e n d e n t e m e n t e da falta de consenso,
está claro que o diabetes mellitus t i p o 2 é u m a doença extrema-
m e n t e heterogênea e que u m a causa única é inadequada para
explicar a progressão da doença da tolerância n o r m a l à glicose
até o diabetes. O s defeitos moleculares f u n d a m e n t a i s na resis-
tência à i n s u l i n a e na secreção da i n s u l i n a r e s u l t a m de u m a
c o m b i n a ç ã o genética e de fatores genéticos e ambientais.
Resistência à Insulina
Defme-se resistência à insulina como uma diminuição da resposta bio-
íógica às concentrações normais de insulina circulante. Ela é encontrada
tanto em indivíduos obesos não diabéticos quanto em pacientes c o m
diabetes tipo 2. A patofisiologia subjacente ainda não foi identifi-
cada, mas geralmente se atribui a resistência à insulina a u m defeito
na ação da insulina. A determinação da resistência à insulina na
clínica é difícil, e dosagens indiretas, tais como a concentração de
insulina em jejum, são utilizadas para fornecer u m a avaliação indi-
reta da função da insulina. H á u m largo espectro clinico de resistên-
cia à insulina que varia da euglicemia (com u m aumento notável na
insulina endógena) à hiperglicemia, independentemente das altas
doses de insulina exógena.
A síndrome de resistência à insulina (também conhecida c o m o
síndrome X o u síndrome metabólica, http://www.americanheaTt.
org) é u m a constelação de achados clínicos e laboratoriais associados
que consistem em (1) resistência à insulina, (2) hiperinsulinemia,
(3) obesidade, (4) dislipidemia (triglicerídeo alto e colesterol H D L
baixo) e (5) hipertensão. A síndrome metabólica é diagnosticada se
u m i n d i v i d u o atender a três o u mais dos seguintes critérios:
• Obesidade a b d o m i n a l : circunferência da c i n t u r a m a i o r
do que 88,9 c m (mulheres) o u 101,6 c m (homens)
• Concentrações de triglicerideos maiores que 150 m g / d L
• Concentrações de colesterol H D L menores que 5 0 m g /
d L (mulheres) o u menores que 40 m g / d L (homens)
• Pressão sanguínea m a i o r o u igual a 1 3 0 / 8 5 m m H g
• Glicose plasmática de j e j u m (FPG) m a i o r ou igual a
110 m g / d L
I n d i v í d u o s c o m essa s í n d r o m e t ê m risco elevado de doença
cardiovascular. Várias síndromes clínicas raras t a m b é m estão
associadas à resistência à insulina. O p r o t ó t i p o é a s í n d r o m e de
resistência à i n s u l i n a t i p o A , que é caracterizada p o r (1) h i p e r i n -
s u l i n e m i a , (2) acantose nigricans e (3) h i p e r a n d r o g e n i s m o ova-
riano.
Perda da Função das Células p
A elevação da d e m a n d a das células P i n d u z i d a pela resistência à
i n s u l i n a está associada a u m a perda progressiva de função das
células J3 necessária para o desenvolvimento de h i p e r g l i c e m i a de
j e j u m . O p r i n c i p a l defeito é a perda da liberação de i n s u l i n a
i n d u z i d a p o r glicose, que é conhecida c o m o nãosresponsividade
seletiva à glicose. A h i p e r g l i c e m i a parece c o n t r i b u i r para a não-
responsividade crescente das células p à glicose ( u m a condição
chamada de gíico toxicidade), e o grau de disfunção se correlaciona
t a n t o c o m a concentração de glicose q u a n t o c o m a duração da
hiperglicemia. A recuperação da euglicemia resolve r a p i d a m e n t e
o defeito. O u t r a s a n o r m a l i d a d e s da secreção de i n s u l i n a em
i n d i v í d u o s c o m diabetes t i p o 2 i n c l u e m a perturbação da libe-
ração pulsátil de i n s u l i n a e u m a p r o p o r ç ã o elevada e n t r e pró-
i n s u l i n a e i n s u l i n a sanguíneas. Evidências em c a m u n d o n g o s
knockout i n d i c a m que a resistência à i n s u l i n a nas células P pode
c o n t r i b u i r para as alterações na secreção de i n s u l i n a , c o m o
ocorre no diabetes t i p o 2.
Genes Diabetogênicos
Fatores genéticos c o n t r i b u e m para o desenvolvimento d o diabe-
tes t i p o 2. Por exemplo, a taxa de c o n c o r d â n c i a para o diabetes
t i p o 2 em gêmeos idênticos se a p r o x i m a de 100%. A l é m disso,
há 10 vezes mais chance de ocorrer diabetes t i p o 2 e m u m indi-
v í d u o obeso c o m u m pai que t e m diabetes do q u e e m u m
i n d i v í d u o igualmente obeso sem u m a h i s t ó r i a f a m i l i a r de diabe-
tes. A f o r m a de hereditariedade, p o r é m , é desconhecida, e o
diabetes t i p o 2 é descrito c o m o " o pesadelo d o geneticista". Por
exemplo, ele é geneticamente mais c o m p l e x o do que distúrbios
m e n d e l i a n o s e não é herdado de acordo c o m as regras mende-
lianas. M ú l t i p l o s fatores genéticos i n t e r a g e m c o m influências
exógenas (tais c o m o fatores ambientais) para p r o d u z i r o fenó-
tipo.
Os m ú l t i p l o s fatores c o m p l i c a m a busca p o r genes diabeto-
gênicos n o diabetes t i p o 2.Vários m é t o d o s já i d e n t i f i c a r a m
vários genes que estão associados ao diabetes t i p o 2. Porém,
i n d e p e n d e n t e m e n t e dos consideráveis esforços de investigação
para a identificação da base genética do diabetes mellitus t i p o 2,
os defeitos genéticos identificados até o m o m e n t o são responsá-
veis por menos de 5 % dos i n d i v í d u o s c o m diabetes t i p o 2.
P o r t a n t o , o gene o u os genes que causam as formas c o m u n s de
diabetes t i p o 2 permanece(m) desconhecido(s). Os genes conhe-
cidos afetam a secreção de i n s u l i n a , p a r t i c i p a m na ação da insu-
l i n a o u regulam o peso corporal.
Ambiente
Fatores ambientais, tais c o m o dieta e exercício, são d e t e r m i n a n -
tes i m p o r t a n t e s na patogênese d o diabetes t i p o 2. Evidências
convincentes l i g a m a obesidade ao desenvolvimento de diabetes
t i p o 2, mas a associação é complexa. E m b o r a 6 0 % a 8 0 % dos
i n d i v í d u o s c o m diabetes t i p o 2 sejam obesos, o diabetes se desen-
volve em menos de 1 5 % dos i n d i v í d u o s obesos. Por o u t r o lado,
praticamente todas pessoas obesas, m e s m o aquelas c o m tolerân-
cia n o r m a l aos carboidratos, têm h i p e r i n s u l i n e m i a e são resis-
tentes à i n s u l i n a . O u t r o s fatores, c o m o (1) história f a m i l i a r de
diabetes t i p o 2 (predisposição genética), (2) a duração da obesi-
dade e (3) a d i s t r i b u i ç ã o de gordura, t a m b é m são i m p o r t a n t e s .
H á u m a relação inversa entre o nível de atividade física e a
prevalência de diabetes t i p o 2. O risco de diabetes t i p o 2 d i m i n u i
em 6 % a cada elevação de 5 0 0 kcal n o gasto energético diário.
Acredita-se que o m e c a n i s m o do efeito p r o t e t o r d o exercício é a
elevação da sensibilidade à i n s u l i n a n o m ú s c u l o esquelético e no
t e c i d o adiposo.
Diagnóstico
O diagnóstico d o diabetes mellitus depende u n i c a m e n t e da demons-
tração de hiperglicemia ( Q u a d r o 22-2). Para o diabetes t i p o 1, o
diagnóstico geralmente é fácil, já que a h i p e r g l i c e m i a (1) aparece
a b r u p t a m e n t e , (2) é grave e (3) é a c o m p a n h a d a por sérios distúr-
bios metabólicos. O diagnóstico do diabetes t i p o 2 p o d e ser

QUADRO 22-2 Critérios para o Diagnóstico de
Diabetes Meliitus
DIABETES MELLITUS
Qualquer um dos seguintes critérios é diagnóstico:'
1. Sintomas clássicos de diabetes e concentração de glicose plasmática
f Medicamentos (p.ex., tia2idas, contraceptivos orais e corticosteróides
casual i 2 0 ü mg/dL (11,1 mmol/L).
4
2. Glicose plasmática de jejum > 1 2 6 rng/dL (7 mmol/L)
3. Concentração de glicose plasmática após 2 horas de ingestão de glicose
>200 mg/dL durante o OGTT (11,1 mmol/L).
GLICOSE DE JEJUM PREJUDICADA
Glicose plasmática em j e j u m entre 100 e 125 mg/dL (6,1 e 7,0 mmol/L))
TOLERÂNCIA À GLICOSE PREJUDICADA
Deve-se atender a dois critérios:
1. Glicose plasmática em jejum < 1 2 6 mg/dL (7 mmol/L)
2. Concentração de glicose plasmática após 2 horas de ingestão de glicose
durante o OGTT entre 140 e 199 mg/dL (7,8 e 11,1 mmol/L)
Da Ameriom Diótberes Asíociation. Standards of Medicai Care - 2007. D iatecesCare
2007;30 (Suppl !)• S4-S41-
OGTT, Teste oral de tolerância â giieosé.
Se positivo, confirmar repetindo-se o teste no dia subseqüente.
^Independente do tempo da refeição precedente.
*Sein ingestão calórica Jui pele mfnas 8 Ti.
Observação: As concentrações de glicose no sangue comi ião aproximadamente 10% a 12%
menores do que as concentrações plasmáticas.
d i f í c i l p o r q u e as alterações metabólicas não são graves o sufi-
ciente para o paciente n o t a r os seus sintomas.
Concentrações de Glicose Plasmática em Jejum
Concentrações de F P G superiores a 126 mg/'dL (7 mmol/L) em mws de
uma ocasião são u m diagnóstico de diabetes meí/itus (Quadro 22-2).
Determina-se o diagnóstico da maioria dos casos de diabetes me Di tus
c o m esse critério. Porém, alguns investigadores acreditam que a
hiperglicemia pode ser u m desenvolvimento relativamente tardio
n o curso do diabetes t i p o 2, fato que retarda o diagnóstico e subes-
tima a prevalência de diabetes meliitus na população. As complicações
do diabetes, como retinopatia, proteinúria e doença neuromuscular,
estão presentes em aproximadamente 3 0 % dos pacientes c o m diag-
nóstico clínico de diabetes t i p o 2. O surgimento do diabetes tipo 2
ocorre provavelmente pelo menos em 4 a 7 anos antes do diagnós-
tico clínico. Recomenda-se, atualmente, a realização de u m a triagem
para a busca de indivíduos c o m alto risco de diabetes.1,11 A A D A
considera apropriada uma F P G ou u m a O G T T de 2 horas. Deve-se
considerar a realização do teste e m todas as pessoas assintomáticas
c o m 45 anos de idade (ou em indivíduos mais jovens com risco
elevado), c o m repetição do teste a cada 3 anos.
Teste Oral de Tolerância à Glicose
O O G T T é mais sensível do que a glicose de j e j u m n o começo
do curso do diabetes t i p o 2, o que resulta e m u m a falta de equi-
valência entre os valores da glicose de j e j u m e de 2 horas. A
dosagem e m série da glicose plasmática antes e após a adminis-
tração oral de u m a q u a n t i d a d e específica de glicose deve fornecer
u m método-padrão para a avaliação dos i n d i v í d u o s e para a
determinação dos valores e m i n d i v í d u o s sadios e doentes. E m b o r a
o teste de tolerância à glicose seja mais sensível do que a deter-
minação da FPG, ele é afetado p o r vários fatores que resultam
e m baixa reprodutibilidade ( Q u a d r o 22-3) 2 A l é m disso, aproxima-
d a m e n t e 2 0 % dos O G T T s caem na categoria não diagnostica
(p.ex., somente u m a amostra de sangue exibe concentração
Carboidratos CAPÍTULO 22 393
QUADRO 22-3 Fatores Não Diabéticos que Podem
Influenciar o Teste Oral de Tolerância à Glicose
PREPARAÇÃO DO PACIENTE
Duração do j e j u m
Ingestão anterior de carboidratos
Trauma
Doença intercorrente
Idade
Atividade
Peso
ADMINISTRAÇÃO DE GLICOSE
Forma da glicose (anidra ou monoidratada)
Quantidade de glicose ingerida
Volume administrado
Velocidade de ingestão
DURANTE 0 TESTE
Postura
Ansiedade
Cafeína
Tabagismo
Atividade
Hora do dia
elevada de glicose). A menos que i n i c i a l m e n t e os resultados sejam
evidentemente anormais, deve-se realizar o OGTT era duas ocasiões
separadas antes de os resultados serem considerados anormais.
Deve-se atender às seguintes condições para a realização d o
O G T T : (1) descontinuar, q u a n d o possível, os m e d i c a m e n t o s que
afetam a tolerância à glicose; (2) realizar o teste d u r a n t e o p e r í o d o
m a t u t i n o após 3 dias de dieta ( c o n t e n d o pelo m e n o s 150 g de
carboidratos p o r dia) e exercício sem restrições; (3) realizar o
teste após u m j e j u m de 10 a 16 h s o m e n t e em i n d i v í d u o s
a m b u l a t o r i a i s (a i m o b i l i z a ç ã o n o l e i t o p r e j u d i c a a tolerância à
glicose), que devem permanecer sentados d u r a n t e o teste, sem
f u m a r . N ã o se deve realizar o teste de t o l e r â n c i a à glicose e m
pacientes hospitalizados, c o m doença aguda o u inativos. D e v e '
se começar o teste e n t r e 7 e 9 horas da m a n h ã . Deve-se m e d i r
a glicose plasmática n o j e j u m , e d e p o i s a cada 3 0 m i n u t o s p o r
2 horas após u m a carga de glicose oral. Recomenda-se u m a
carga de 75 g para a d u l t o s não gestantes, o q u e p o d e não ser
u m e s t í m u l o m á x i m o ; para crianças, 1,75 g / k g , administra-se
até o m á x i m o de 75 g. Deve-se dissolver a glicose e m 3 0 0 m L
de água, e deve-se i n g e r i r a solução preparada em até 5 m i n u t o s .
Deve-se i n g e r i r u m a f o r m a de glicose c o m e r c i a l mais palatável,
mas a i n d a n ã o está claro c o m o u t i l i z a r a f o r m a a n i d r a o u
m o n o i d r a t a d a de glicose.
O A D A não r e c o m e n d a o O G T T para uso c l í n i c o r o t i n e i r o
c o m o o p r i m e i r o teste de triagem (para utilização na G D M , ver
discussão adiante). O O G T T c o n t i n u a a ser r e c o m e n d a d o de
f o r m a l i m i t a d a pela Organização M u n d i a l da Saúde ( O M S ) , e
sua utilização permanece controversa. A F P G e o O G T T não
i d e n t i f i c a m necessariamente os mesmos i n d i v í d u o s c o m o t e n d o
diabetes. A sensibilidade da F P G é m e n o r do que a sensibilidade
d o O G T T para diagnosticar diabetes, e alguns autores a f i r m a m
que o O G T T i d e n t i f i c a m e l h o r os pacientes c o m risco de desen-
v o l v i m e n t o de complicações do diabetes. U m valor de F P G
m e n o r que 100 m g / d L é suficiente para descartar o diagnóstico
de diabetes meliitus.
394 PARTE IV Analitos
Monitoramento a Longo Prazo
A G H b se estabeleceu c o m o u m índice das concentrações de
glicose sanguínea a longo prazo e c o m o u m a m e d i d a do risco de
desenvolvimento de complicações em pacientes c o m diabetes
mellitus. 7,13 A G H b f o i f u n d a m e n t a l no Diabetes C o n t r o l a n d
C o m p l i c a t i o n s T r i a l ( D C C T ) . 6 (Para prevenir v a r i a b i l i d a d e n o
ensaio [ver a seção sobre padronização d o ensaio, adiante neste
capítulo]) todos os ensaios de G H b no D C C T f o r a m feitos e m
u m l a b o r a t ó r i o central que m e d i u a H b A ] c p o r cromatografia
l í q u i d a de alta p e r f o r m a n c e [ H P L C ] ) . O D C C T d o c u m e n t o u
que há u m a relação direta entre as concentrações de glicose
sanguínea (avaliada pela H b A 1 f ) e o risco de complicações. Os
riscos absolutos de r e t i n o p a t i a e nefropatia f o r a m d i r e t a m e n t e
p r o p o r c i o n a i s à H b A í e média. O risco de r e t i n o p a t i a a u m e n t o u
c o n t i n u a m e n t e c o m a elevação da H b A ) c , e u m a m e d i d a i n d i -
v i d u a l de H b A l c p r e v i u a progressão da r e t i n o p a t i a 4 anos mais
tarde. D e fato, a análise subseqüente revelou que a H b A l c m é d i a
foi a preditoTa p r e d o m i n a n t e de progressão da retinopatia, e
u m a concentração de H b A l c 10% m e n o r ( c o m o u m a d i m i n u i -
ção de 10% a 9 % ) f o i associada a u m a d i m i n u i ç ã o de 4 5 % n o
risco. O risco de complicações microvasculares varia c o n t i n u a -
m e n t e c o m a H b A l c , e não há u m a concentração de H b A j c
abaixo da q u a l o risco seja e l i m i n a d o .
Observaram-se correlações análogas entre a H b A l c e compli-
cações em pacientes c o m o diabetes tipo 2 n o U n i t e d K i n g d o m
Prospective Diabetes Study ( U K P D S ) . ' 3 Cada redução de 1 % na
H b A 1 t (p.ex., de 8 % para 7%) f o i associada a reduções de risco
de 3 7 % de doença microvascular, 2 1 % de mortes relacionadas ao
diabetes e 14% de i n f a r t o do miocárdio. 1 5 C o m base n o D C C T
e n o U K P D S , a A D A recomenda que u m objetivo p r i m á r i o do
t r a t a m e n t o em adultos c o m diabetes deve ser a glicemia " p r ó x i m a
da n o r m a l " c o m H b A 1 c menoT que 7%. N ã o se r e c o m e n d a a H b
A l c para o diagnóstico o u triagem de diabetes n o m o m e n t o , ' mas
pode ser i m p l e m e n t a d a n o f u t u r o .
I n t e r m e d i á r i o s lábeis (pré-Hb A i c , base de Schiff) da f o r m a -
ção da H b A j c p o d e m estar presentes nas dosagens da H b A l c i
especialmente nos métodos c o m u n s de troca iônica, o que p o d e
p r o d u z i r resultados errôneos. A fração lábi! muda rapidamente com
mudanças agudas na concentração de glicose sanguínea, e, portanto,
ela. não é uma indicadora do controle glicêmico a longo prazo. A p r é - H b
A l c c o n s t i t u i 5 % a 8 % da H b A ! c total em i n d i v í d u o s sadios e
varia de 8 % a 3 0 % c m pacientes c o m diabetes, d e p e n d e n d o d o
grau de c o n t r o l e da concentração de glicose sanguínea n o
m o m e n t o o u p r ó x i m o d o m o m e n t o de coleta do sangue. Se o
m é t o d o analítico m e d i r ambas as frações, a p r é - H b A l e deve ser
r e m o v i d a p r i m e i r o para i m p e d i r resultados falsamente elevados.
N a ausência de glicose, a p r é - H b A | c reverte-se para glicose e H b
A (Figura 22-5). Esse f e n ô m e n o fornece a base para alguns pro-
cedimentos de elimina ç ão da fração Iábil através da incubação
de glóbulos v e r m e l h o s lavados em salina. E m alguns m é t o d o s
p o r b o r o n a t o (veT a seção adiante sobre a m e t o d o l o g i a analítica),
as condições d o ensaio favorecem a rápida dissociação da base
de S c h i f f
Diabetes Mellitus Gestacional
A gravidez n o r m a l está associada à elevação da resistência à
i n s u l i n a , especialmente n o f i n a l do segundo e do terceiro trimes-
tres. A euglicemia mantém-se através do a u m e n t o da secreção de
i n s u l i n a , c o m desenvolvimento de G D M nas mulheres que
f a l h a m em a u m e n t a r suficientemente a insulina. Os fatores de
risco para G D M são h i s t ó r i c o f a m i l i a r de diabetes em u m parente
de p r i m e i r o grau, obesidade, idade m a t e r n a l avançada, glicosúria
e ocorrências adversas selecionadas em u m a gestação a n t e r i o r
(p.ex., n a t i m o r t a l i d a d e o u macrossomia). As recomendações da
A D A para o diagnóstico l a b o r a t o r i a l de G D M baseiam-se no
F o u r t h I n t e r n a t i o n a l W o r k s h o p - C o n f e r e n c e o n G e s t a t i o n a l Dia-
betes M e l l i t u s . 9
Testes diagnósticos não são necessários para pacientes de
baixo risco. A situação de baixo risco limita-se às m u l h e r e s que
a t e n d e m a todos os critérios seguintes: (1) idade m e n o r q u e 25
anos, (2) peso n o r m a l antes da gravidez, (3) m e m b r o de u m
g r u p o étnico c o m u m a baixa prevalência de G D M , (4) sem
diabetes conhecida e m parentes de p r i m e i r o grau, (5) sem histó-
r i a de tolerância à glicose a n o r m a l e (6) sem h i s t ó r i a de ocorrên-
cias obstétricas ruins. Para pacientes de risco m é d i o (todas as
pacientes que f i c a m entre os riscos baixo e alto), devem-se reali-
zar testes e m 24 a 28 semanas de gestação (ver a discussão adiante
sobre estratégia de teste). Para pacientes de alto risco, devem-se
realizar testes imediatos. Tais pacientes possuem q u a l q u e r uma
das seguintes características: obesidade notável, h i s t ó r i a pessoal
de G D M , glicosúria o u u m a h i s t ó r i a f a m i l i a r de diabetes.
A primeira etapa no teste laboratorial é idêntica àquela para
diagnosticar o diabetes em uma nãogestante (p.ex., u m a FPG 2:126
m g / d L [7 m m o l / L ] o u glicose plasmática casual >200 m g / d L [11,1
m m o l / L ] . Porém, na ausência desse grau de hiperglicemia, faz-se u m
teste de sobrecarga de glicose c o m as pacientes de risco médio e alto
de acordo c o m u m dos dois métodos a seguir (Tabela 22-2)13:
1. P r i m e i r a etapa: Realizar o O G T T c o m 100 g o u 75 g de
glicose. Esse m é t o d o de u m a etapa p o d e ter u m b o m c u s t o /
benefício e m pacientes o u populações de alto risco (p.ex.,
alguns.grupos americanos nativos). O O G T T c o m 100 g é o
teste-padrão mais c o m u m e n t e utilizado e apoiado pelos
dados divulgados. A l t e r n a t i v a m e n t e , pode-se realizar u m
O G T T de 75 g, mas esse teste não é tão b e m v a l i d a d o q u a n t o
o teste c o m 100 g, e os valores de corte são arbitrários. N o
teste c o m 75 g, os critérios diagnósticos para as concentra-
ções de glicose plasmática são as mesmas d o teste c o m 100
g, exceto pelo fato de q u e não há dosagens de 3 horas (Tabela
22-2).
TABELA 22-2 T r i a g e m e D i a g n ó s t i c o de Diabetes Meilicws
Gestacional
TRIAGEM
1. Realize entra as semanas 24 e 28 de gestação cm todas mulheres
grávidas de médio e alto riscas não identificadas como portadoras de
intolerância à glicose.
2. Administre 50 g de carga oral de glicose independente da hora do dia ou
hora da última refeição.
3. Mega a glicose plasmática venosa em 1 fiora.
4. Se a glicose estiver >140 m g / d L * realize o leste de tolerância à glicose,
DIAGNÓSTICO
1. Realize durante o período da manhã após jejum de 8 a 14 horas.
2. Mega a glicose plasmática venosa de jejum.
3. Administre oralmente 75 ou 100 g de glicose.
4. Meça a glicose plasmática de hora em hora por 3 horas (ou 2 horas se
forem administrados 75 g de glicose).
5. Pelo menos deis valores devem atender ou exceder os seguintes:
Carga de 100 g Carga de
75 g
Jejum 95 mg/dL 95 mg/dL
1 h 180 mg/dL 180 mg/dL
2 h 155 mg/dL 155 mg/dL
3 h 14C mg/dL —
6. Se os resultados estiverem normais em uma situação clinicamente
suspeita, repita durante o terceiro trimestre.
especialistas recomendam um vaiar de corte de 130 mg/dL.

2. Segunda etapa (Tabela 22-2): A p r i m e i r a etapa é uma carga
de glicose oral de 50 g (a paciente não precisa estar em j e j u m )
seguida p o r u m a determinação de glicose plasmática após 1
h o r a . U m v a l o r de glicose plasmática igual o u m a i o r d o q u e
140 m g / d L (7,7 m m o l / L ) i n d i c a a ncccssidadc dc u m teste
d e f i n i t i v o . A p r o x i m a d a m e n t e 1 5 % das pacientes têm u m a
concentração de glicose plasmática venosa em 1 hora igual
o u m a i o r que 140 m g / d L (7,7 m m o l / L ) e precisam de u m
teste de tolerância à glicose completo. Esse subgrupo i n c l u i
- 8 0 % de todas as mulheres c o m G D M . A l g u n s especialistas
r e c o m e n d a m u m valor igual o u m a i o r que 130 m g / d L . Esse
valor de corte a u m e n t a r á a sensibilidade para a detecção de
G D M para 9 0 % , mas i n c l u i r á 2 5 % de todas as mulheres
grávidas. O segundo e d e f i n i t i v o teste é u m dos dois O G T T s
descritos a n t e r i o r m e n t e . O s critérios para o diagnóstico são
diferentes daqueles para os i n d i v í d u o s não gestantes ( Q u a d r o
22-2).
A i n d a há u m a falta de consenso sobre a utilização do O G T T
c o m 100 g versus 75 g para o diagnóstico d e f i n i t i v o de G D M .
E m b o r a o O G T T c o m 75 g pareça prático e aceitável, há mais
dados para o O G T T c o m 100 g. A l é m disso, os limites diagnós-
ticos apropriados p e r m a n e c e m em disputa.
E m b o r a a G D M seja assintomática e não seja p r e j u d i c i a l à
mãe, essa c o n d i ç ã o está associada ao a u m e n t o da incidência de
m o r t a l i d a d e e m o r b i d a d e neonatais, i n c l u i n d o hipocalcemia,
h i p o g l i c e m i a e macrossomia. A h i p e r g l i c e m i a m a t e r n a l faz c o m
que o feto secrete mais i n s u l i n a , r e s u l t a n d o n o estimulo do
crescimento fetal e da macrossomia. O r e c o n h e c i m e n t o é i m p o r -
tante p o r q u e a terapia p o d e reduzir a m o r b i d a d e e a m c r t a l i d a d e
perinatais. As complicações maternais i n c l u e m alta taxa de cesa-
rianas, hipertensão e elevação d o risco de diabetes.
A gravidez e m u m a paciente c o m diabetes preexistente
(~ 19.000 p o r ano nos Estados U n i d o s ) é diferente da G D M . T a l
c o n d i ç ã o está associada a u m a i n c i d ê n c i a elevada de malforma-
ções congênitas, mas u m c o n t r o l e glicêmico meticuloso d u r a n t e
as 8 p r i m e i r a s semanas p o d e d i m i n u i r significativamente o risco
de malformações congênitas. O c o n t r o l e restrito resulta em u m a
elevação na i n c i d ê n c i a de h i p o g l i c e m i a m ater nal , condição que
é teratogênica em animais, mas não causa malformações e m
humanos.
Complicações Crônicas do Diabetes Meliitus
Diabetes Tipo 1
E m b o r a se tenha h i p o t e t i z a d o p o r m u i t o s anos q u e u m m e l h o r
c o n t r o l e g l ic êmic o d i m i n u i r i a as taxas de complicações do dia-
betes meliitus a l o n g o prazo, t a l hipótese f o i derrubada após a
p u b lica çã o d o D C C T em 1993 6 . O D C C T f o i u m estudo c l í n i c o
m u l t i c ê n t r i c o e r a n d o m i z a d o que c o m p a r o u os efeitos da terapia
c o m i n s u l i n a c o n v e n c i o n a l e intensiva n o d e s e n v o l v i m e n t o e
progressão de complicações e m 1.441 pacientes c o m diabetes
t i p o 1. D u r a n t e o p e r í o d o de estudo, q u e d u r o u , e m média, 6,5
anos, pacientes i n t e n s i v a m e n t e c o n t r o l a d o s m a n t i v e r a m con-
centrações de glicose sanguínea médias significativamente
menores. C o m p a r a d a c o m a terapia c o n v e n c i o n a l , a terapia
intensiva r e d u z i u o risco de r e t i n o p a t i a , n e f r o p a t i a e n e u r o p a t i a
em 4 0 % a 7 5 % . 6 A terapia intensiva r e t a r d o u o i n í c i o e d i m i -
n u i u a velocidade da progressão dessas três complicações, inde-
p e n d e n t e de sexo, idade o u duração do diabetes. Os riscos
absolutos de r e t i n o p a t i a e n e f r o p a t i a f o r a m p r o p o r c i o n a i s à
G H b m é d i a (discutida adiante neste capítulo). A terapia i n t e n -
siva t a m b é m r e d u z i u o d e s e n v o l v i m e n t o de hipercolesterolemia.
Esse i m p o r t a n t e estudo teve u m i m p a c t o significativo sobre os
objetivos terapêuticos e a compreensão da patogênese das com-
plicações do diabetes.
Carboidratos CAPÍTULO 22 395
N a conclusão do D C C T , 9 5 % dos participantes e n t r a r a m
n o estudo de a c o m p a n h a m e n t o a l o n g o prazo, c h a m a d o de
E p i d e m i o l o g y o f Diabetes I n t e r v e n t i o n s a n d C o m p l i c a t i o n s
( E D I C ) . C i n c o anos após o t é r m i n o d o D C C T , não houve dife-
rença n o c o n t r o l e m e t a b ó l i c o (avaliado p o r dosagens da G H b )
entre os grupos que f o r a m tratados c o m a terapia c o n v e n c i o n a l
e a intensiva. Todavia, a progressão da r e t i n o p a t i a f o i ~ 7 0 %
m e n o r n o g r u p o tratado c o m terapia intensiva, d e m o n s t r a n d o
que os efeitos benéficos d o t r a t a m e n t o intensivo persistiram p o r
pelo menos vários anos além d o p e r í o d o da intervenção mais
estrita. Estudos subseqüentes i n d i c a m que a terapia intensiva
reduz significativamente o risco de doenças cardiovasculares
( i n f a r t o e derrame).
Diabetes Tipo 2
Determinou-se o papel da hiperglicemia n o desenvolvimento de
complicações em indivíduos c o m diabetes tipo 2 n o U K P D S 1 5 . O
U K P D S f o i u m grande estudo clínico multicêntrico e randomizado
que i n c l u i u 5.102 pacientes c o m diabetes t i p o 2 recém-diagnosti-
cada, que foram acompanhados p o r u m período m é d i o de 10 anos.
Análogo aos achados do D C C T , o U K P D S demonstrou em pacien-
tes c o m diabetes t i p o 2 que o tratamento intensivo d i m i n u i em
~ 1 0 % a 4 0 % o desenvolvimento de complicações microvasculares. 15
E m b o r a o tratamento intensivo tenha d i m m u i d o a taxa de ocorrên-
cia de complicações macrovasculares (grandes vasos sanguíneos), a
redução não foi estatisticamente significativa U m obstáculo impor-
tante tanto do D C C T quanto do U K P D S foi que a terapia intensiva
elevou a incidência de hipoglicemia grave em três vezes.
Papel do Laboratório Clínico no Diabetes Meliitus
O laboratório clínico tem u m papel vital tanto n o diagnóstico
q u a n t o n o c o n t r o l e do diabetes meílitus. A l g u n s dos p a r â m e t r o s
i m p o r t a n t e s q u e são d e t e r m i n a d o s estão m o s t r a d o s na Tabela
22-3. E m 2 0 0 2 , a N a t i o n a l A c a d e m y o f C l i n i c a i B i o c h e m i s -
t r y ( N A C B ) p u b l i c o u orientações baseadas e m evidências para
a análise l a b o r a t o r i a l n o diabetes meliitus. 13 A s o r i e n t a ç õ e s
f o r a m revistas pelo Professional Practice C o m m i t t e e da A D A
e f o r a m consistentes nas áreas o n d e a A D A t a m b é m p u b l i c o u
recomendações. A s recomendações específicas para os testes labo-
ratoriais c o m base e m dados p u b l i c a d o s ou c o m base n o consenso
de especialistas estão presentes nessas recomendações. n Neste
capítulo, é apresentada u m a visão geral e r e s u m i d a dessas reco-
mendações.
Diagnóstico
Pré-Clínico (Triagem). H á evidências de estudos em animais
de que a terapia de intervenção i m u n o l ó g i c a antes d o apareci-
m e n t o dos sintomas clínicos retarda o u previne o diabetes t i p o 1.
M u i t o s estudos clínicos extensos estão sendo realizados c o m o
objetivo de avaliar várias estratégias terapêuticas designadas para
retardar o u prevenir o i n í c i o d o diabetes t i p o 1 em h u m a n o s .
A t é que seja d i s p o n i b i l i z a d a u m a terapia de intervenção eficaz e
sejam desenvolvidas estratégias de triagem c o m b o m custo/bene-
fício para crianças, não se r e c o m e n d a a triagem de anticorpos. 5 3
A t u a l m e n t e , não se garante a triagem através da determinação
do t i p o de H L A , c o m exceção e m estudos de pesquisa. A pri-
meira a n o r m a l i d a d e f u n c i o n a l das diabetes t i p o 1 e t i p o 2 é a
d i m i n u i ç ã o da secreção de i n s u l i n a estimulada por glicose.
Todavia, não se r e c o m e n d a , atualmente, a realização de testes de
secreção de i n s u l i n a para utilização clínica r o t i n e i r a .
A triagem do diabetes t i p o 2 e m i n d i v í d u o s assintomáticos
é alvo de m u i t a controvérsia. A A D A , que a n t e r i o r m e n t e não
apoiava a triagem, agora defende esse p r o c e d i m e n t o e m t o d o s
os i n d i v í d u o s assintomáticos acima dos 45 anos de idade. 1 A s
396 PARTE IV Analitos

TABELA 22-3 Papel do Laboratório no Diabetes u m livro-texto padrão de m e d i c i n a . As orientações da N A C B

Mellitus t a m b é m f o r n e c e m informações sobre os testes que são utiliza-
dos.
DIAGNÓSTICO
C r ô n i c a . Os estudos D C C T 6 e U K P D S 1 3 d o c u m e n t a r a m
Pré-clinico (Triagem) Clínica
u m a correlação entre as concentrações da glicose sanguínea e o
Marcadores imunológicos Glicose sanguínea desenvolvimento de complicações do diabetes a l o n g o prazo. As
ICA OGTT dosagens de glicose e de proteínas glicadas f o r n e c e m u m índice
IAA Cetonas (urina e sangue) de c o n t r o l e glicêmico a c u r t o e l o n g o prazos, respectivamente
Anticorpos anti-GAD Outro (p.ex., insulina, peptídeo C e (ver a seção sobre proteínas glicadas adiante neste capítulo). C o n -
Anticorpos antiprateína tirosina testes de estímulo) seguem-se realizar a detecção e o m o n i t o r a m e n t o de complica-
fosfatase (IA-2) ções através da determinação de uréia, creatinina, excreção de
Marcadores genéticos (p.ex., HLA) a l b u m i n a u r i n á r i a e lipídios séricos. Pode-se m o n i t o r a r o sucesso
Secreção da insulina
de novas terapias, c o m o o transplante de células das ilhotas o u de
Jejum
pâncreas, através da dosagem d o peptídeo C sérico o u concen-
Pulsos
trações de i n s u l i n a .
Em resposta à carga de glicose
Glicose sanguínea
Hipoglicemia
A h i p o g l i c e m i a é u m a concentração de glicose sanguínea abaixo
CONTROLE do v a l o r e m j e j u m , mas a d e f i n i ç ã o de u m l i m i t e específico é
Aguda Crônica difícil. 1 4 O v a l o r de corte mais u t i l i z a d o é 5 0 m g / d L , mas alguns
autores sugerem 6 0 m g / d L . Pode ocorrer u m d e c l í n i o t r a n s i t ó r i o
Glicose Glicose em 1,5 a 2 horas após u m a refeição, e não é i n c o m u m observar,
Sangue Sangue (jejum-aleatório) e m 2 horas após a ingestão de u m a carga o r a l de glicose, u m a
Urina Urina concentração de glicose plasmática abaixo dos 5 0 m g / d L . D e
Cetonas Proteínas glicadas f o r m a semelhante, podem-se observar, ocasionalmente, valores
Sangue GHb de glicose sanguínea de j e j u m e x t r e m a m e n t e baixos sem sinto-
Urina Frutosamina mas o u evidências de doença subjacente.
Estado ácido e básico Proteína urinária Os sintomas de h i p o g l i c e m i a v a r i a m entre os i n d i v í d u o s e
(pH bicarbonato) UAE (microalbumínúria) n e n h u m deles é específico. A e p i n e f r i n a p r o d u z os sinais e sin-
Lactato Proteinüria tomas clássicos de h i p o g l i c e m i a : t r e m o r , suor, náusea, pulso
Outras anormalidades Avaliação de complicações (p.ex., r á p i d o , sensação de desmaio i m i n e n t e , f o m e e desconforto epi-
relacionadas è desidratação creatinina, colesterol e gástrico. Podem-se observar esses sintomas a u t ô n o m o s e m outras
celular ou terapia (p.ex., potássio, triglicerídeos) condições, c o m o n o h i p e r t i r e o i d i s m o , na f e c r o m o c i t o m a o u
sádío, fosfato e osmolalidade) Avaliação do transplante de m e s m o na ansiedade. E m b o r a controverso, alguns investigadores
pâncreas p r o p õ e m q u e u m a rápida d i m i n u i ç ã o na glicose sanguínea p o d e
{peptídeo C, insulina) deflagrar os sintomas mesmo se a p r ó p r i a glicose sanguínea não
chegar a concentrações hipoglicêmicas, e n q u a n t o o i n í c i o
gradual para u m a concentração de glicose semelhante p o d e não
p r o d u z i r sintomas.
O cérebro é c o m p l e t a m e n t e d e p e n d e n t e de glicose sanguínea
para a p r o d u ç ã o de energia sob condições fisiológicas, e aproxi-
m a d a m e n t e dois terços da utilização da glicose e m adultos e m
repouso ocorre n o sistema nervoso central ( C N S ) . C o n c e n t r a -
justificativas para a triagem são que (1) pelo menos 3 3 % dos ções m u i t o baixas de glicose plasmática (<20 o u 3 0 m g / d L )
i n d i v í d u o s c o m diabetes t i p o 2 não são diagnosticados, (2) as causam disfunção grave do C N S . D u r a n t e j e j u m o u hipoglice-
complicações estão f r e q ü e n t e m e n t e presentes n o m o m e n t o do m i a prolongada, as cetonas p o d e m ser utilizadas c o m o f o n t e de
diagnóstico e (3) o t r a t a m e n t o retarda o i n í c i o das complica- energia. O a m p l o espectro de sintomas e sinais de disfunção do
ções. C N S varia de d o r de cabeça, confusão, visão t u r v a e t o n t u r a a
Clinico. O diagnóstico l a b o r a t o r i a l de diabetes é realizado convulsões, perda de consciência e m e s m o m o r t e ; esses sintomas
exclusivamente através da demonstração de hiperglicemia. são conhecidos c o m o neuroghcopenia. A restauração da glicose
O u t r o s ensaios, c o m o o O G T T , c o n t r i b u e m para a classificação plasmática geralmente produz recuperação imediata, mas p o d e
e caracterização. E m b o r a se p r o p õ e a realização de outros testes ocorrer lesão irreversível.
(p.ex., análise d o peptídeo C e da insulina) para auxiliar n o A idade de i n í c i o de h i p o g l i c e m i a é u m a f o r m a conveniente
diagnóstico e na classificação da doença, tais testes não possuem para classificar o d i s t ú r b i o , mas ocorre sobreposição entre vários
u m papel fora dos estudos de pesquisa atualmente. 1 3 grupos. Por exemplo, alguns distúrhios de armazenamento de
Controlo glicogênio p o d e m surgir na terceira década de vida e p o d e m
A g u d a . Na cetoacidose diabética, n o coma hiperosmolar não ocorrer deficiências h o r m o n a i s na infância.
cetótico e na hipoglicemia, o l a b o r a t ó r i o clínico tem u m papel
essencial tanto n o diagnóstico q u a n t o n o m o n i t o r a m e n t o da Hipoglicemia em Recém-Nascidos e Bebês
terapia. Realiza-se f r e q ü e n t e m e n t e a determinação de vários As concentrações de glicose sanguínea n e o n a t a l são m u i t o
metabólitos para o r i e n t a r os clínicos nos regimes de tratamento menores do que e m adultos ( m é d i a de ~35 m g / d L ) e d e c l i n a m
para restaurar a euglicemia e corrigir outros distúrbios metabóli- logo após o n a s c i m e n t o q u a n d o as reservas de glicogênio do
cos. As anormalidades metabólicas dessas condições estão além fígado são depletadas. Podem ocorrer concentrações de glicose
do escopo deste l i v r o , e os leitores interessados devem consultar abaixo de 3 0 m g / d L em u m recém-nascido a t e r m o e 2 0 m g / d L

e m u m recém-nascido p r e m a t u r o sem evidências clínicas de
h i p o g l i c e m i a . As causas mais c o m u n s de h i p o g l i c e m i a n o p e r í o d o
n e o n a t a l i n c l u e m p r e m a t u r i d a d e , diabetes m a t e r n o , G D M e
t o x e m i a materna. A h i p e r g l i c e m i a nesses casos é geralmente
transitória. A h i p e r g l i c e m i a c o m i n í c i o na p r i m e i r a i n f â n c i a é
geralmente menos transitória e p o d e ocorrer p o r causa de erros
inatos d o m e t a b o l i s m o o u h i p o g l i c e m i a cetótica; esse t i p o de
h i p o g l i c e m i a geralmente aparece após j e j u m o u u m a doença
febril.
Hipoglicemia de Jejum em Adultos
A h i p o g l i c e m i a resulta da d i m i n u i ç ã o da taxa de p r o d u ç ã o de
glicose hepática o u da elevação da taxa de utilização de glicose.
O s sintomas sugestivos de h i p o g l i c e m i a são comuns, mas os
d i s t ú r b i o s h i p o g l i c ê m i c o s são raros. Porém, a verdadeira hipogli-
cemia geralmente i n d i c a u m a doença subjacente séria e p o d e ser
letal. N e m sempre é possível d e t e r m i n a r u m l i m i t e exato para a
detecção de h i p o g l i c e m i a , e podem-se e n c o n t r a r valores menores
q u e 3 0 m g / d L em m u l h e r e s sadias e pré-menopáusicas d u r a n t e
o teste clássico, u m j e j u m de 72 horas. Os s i n t o m a s geralmente
c o m e ç a m q u a n d o as concentrações de glicose sanguínea f i c a m
abaixo de 55 m g / d L , e o prejuízo na f u n ç ã o cerebral começa
q u a n d o a glicose fica abaixo de 5 0 m g / d L .
Deve-se c o n d u z i r o j e j u m de 72 horas e m u m h o s p i t a l .
D u r a n t e o j e j u m , deve-se p e r m i t i r aos pacientes o c o n s u m o livre
de líquidos sem calorias e sem cafeína. Devem-se coletar as amos-
tras para as análises da glicose plasmática, i n s u l i n a , peptídeo C
e p r ó - i n s u l i n a a cada 6 horas. Q u a n d o a concentração da glicose
plasmática estiver igual o u m e n o r q u e 6 0 m g / d L , devem-se rea-
lizar as análises a cada 1 a 2 horas. Deve-se c o n c l u i r o j e j u m
q u a n d o a concentração da glicose plasmática alcançar u m a con-
centração pré-determinada ( c o m o 45 m g / d L o u menos) o u
q u a n d o o paciente exibir sinais o u sintomas de h i p o g l i c e m i a ou,
ainda, após 72 horas. A m a i o r i a dos pacientes c o m h i p o g l i c e m i a
verdadeira m o s t r a u m v a l o r a n o r m a l m e n t e baixo após 12 horas
do i n í c i o do j e j u m . As m u l h e r e s e x i b e m concentrações de glicose
significativamente menores d o que os h o m e n s . S o m e n t e a
glicose plasmática baixa não é s u f i c i e n t e para a determinação do
diagnóstico, e a ausência de sinais o u s i n t o m a s de h i p o g l i c e m i a
d u r a n t e o j e j u m exclui o diagnóstico de u m d i s t ú r b i o hipoglicê-
m i c o c o m o causa de tais sintomas.
Já f o r a m relatadas mais de 100 causas de h i p o g l i c e m i a . A s
drogas são a causa mais prevalente, e muitas delas, i n c l u i n d o o
p r o p a n o l o l , os salicilatos e a d i s o p i r a m i d a , p r o d u z e m hipoglice-
m i a . Os agentes h i p o g l i c ê m i c o s orais que possuem meia-vida
longa (35 horas para a c l o r p r o p a m i d a ) são a causa mais fre-
q ü e n t e de h i p o g l i c e m i a i n d u z i d a p o r droga e p o d e m ser m e d i d o s
d i r e t a m e n t e n o sangue o u na u r i n a . A a d m i n i s t r a ç ã o de i n s u l i n a
é detectada através da descoberta de baixas concentrações de
p e p t í d e o C c o m a elevação das concentrações de insulina.
O etanol p r o d u z h i p o g l i c e m i a através da i n i b i ç ã o da glico-
neogênese, e essa i n i b i ç ã o se agrava pela desnutrição (estoques
baixos de glicogênio), c o m o se observa c o m f r e q ü ê n c i a elevada
e m i n d i v í d u o s c o m a l c o o l i s m o c r ô n i c o . Os i n d i v í d u o s c o m dis-
f u n ç ã o hepática (p.ex., h e p a t i t e v i r a i , toxinas) possuem a glico-
neogênese prejudicada o u os estoques de glicogênio prejudica-
dos, o que p o d e resultar em h i p o g l i c e m i a . A d i m i n u i ç ã o da
p r o d u ç ã o de glicose hepática ocorre se a d i s f u n ç ã o atingir mais
de 8 0 % do fígado. As deficiências de h o r m ô n i o d o crescimento
(especialmente c o m deficiência c o n c o m i t a n t e de A C T H ) , glico-
corticóides, h o r m ô n i o s t i r e o d i a n o s o u glucagon t a m b é m p o d e m
p r o d u z i r h i p o g l i c e m i a . E m b o r a a deficiência de glicocorticóides
(p.ex., doença de A d d i s o n ) esteja mais consistentemente asso-
ciada à h i p o g l i c e m i a , a m a i o r i a dos adultos deficientes e m glico-
Carboidratos CAPÍTULO 2 2 397
corticóides não é h i p o g h c ê m i c a . A deficiência h o r m o n a l causa
h i p o g l i c e m i a c o m mais freqüência e m crianças d o q u e e m
adultos.
A demonstração de concentração de glicose plasmática baixa na
presença de u m valor alto de insulina plasmática é altamente suges-
tiva de t u m o r de células das ilhotas pancreáticas produtoras de
insulina. C o m o se encontra uma grande variação na concentração
de insulina na população sadia, a hiperinsulinemia ocorre e m menos
de 5 0 % dos indivíduos c o m insulinoma. Concentrações de insulina
sérica inapropriadamente altas para os valores concomitantes de
glicose plasmática denotam uma secreção autônoma de insulina.
Testes de provocação (glucagon, tolbutamida ou cálcio) o u testes de
supressão (infusão de insulina e dosagem de peptídeo C), embora
recomendados n o passado, não são geralmente necessários.
As neoplasias não-pancreáticas que causam h i p o g l i c e m i a são,
c o m freqüência, neoplasias mesenquimais e x t r e m a m e n t e grandes
que parecem utilizar m u i t a glicose, mas t a m b é m p o d e m ter u m
efeito i n i b i d o r sobre a mobilização desta.
A hipoglicemia causada p o r septicemia deve ser relativamente
fácil de ser diagnosticada. O mecanismo ainda não está b e m
d e f i n i d o , mas o esgotamento das reservas de glicogênio, a glico-
neogênese prejudicada e o a u m e n t o da utilização periférica da
glicose p o d e m ser todos fatores contribuintes. A tolerância à glicose
geralmente d i m i n u i em i n d i v í d u o s c o m doença renal, e pode
ocorrer hipoglicemia nos indivíduos c o m disfunção renal e m fase
terminal.
A l g u m a s condições que p r o d u z e m h i p o g l i c e m i a de j e j u m são
p r o n t a m e n t e aparentes, mas outras r e q u e r e m u m teste diagnós-
tico extenso. Q u a n d o se d e m o n s t r a a existência da h i p o g l i c e m i a
de j e j u m , devem-se realizar testes específicos para a determinação
da causa subjacente. O O G T T não é u m estudo a p r o p r i a d o para
a avaliação de u m paciente c o m suspeita de h i p o g l i c e m i a .
Hipoglicemia Pós-praridial
Drogas, a n t i c o r p o s c o n t r a i n s u l i n a o u c o n t r a o receptor de insu-
lina, erros inatos (p.ex., deficiência de frutose-l,6-bifosfato) e
hipoglicemia reativa ( t a m b é m conhecida c o m o h i p o g l i c e m i a fun-
cional) p r o d u z e m h i p o g l i c e m i a n o estado pós-prandial (após
refeição). Propõe-se que, para i n d i v í d u o s c o m sintomas vagos
após ingestão alimentar, se utilize a t e r m i n o l o g i a hipoglicemia
reativa idiapática n u síndrome pós-prandial idiopática.
N o T h i r d I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o n Hypoglycemia,
definiu-se a h i p o g l i c e m i a reativa c o m o " u m d i s t ú r b i o c l í n i c o n o
q u a l o paciente t e m sintomas pós-prandiais sugestivos de h i p o -
glicemia q u e o c o r r e m n o dia-a-dia e são a c o m p a n h a d o s p o r u m a
concentração de glicose sanguínea m e n o r que 45 a 5 0 m g / d L
d e t e r m i n a d a p o r u m a dosagem específica de glicose em sangue
venoso o u sangue capilar, respectivamente." Os pacientes se
q u e i x a m dos sintomas a u t ô n o m o s que o c o r r e m aproximada-
m e n t e e m 1 a 3 horas após a refeição, e parece que tais sintomas
são aliviados, p o r 30 a 45 m i n u t o s , p o r ingestão alimentar. Esses
sintomas raramente o c o r r e m p o r causa de concentrações baixas
de glicose sanguínea. I n i c i a l m e n t e , u m teste de tolerância à
glicose de 5 o u 6 horas era o p r o c e d i m e n t o - p a d r ã o para a deter-
m i n a ç ã o da presença de h i p o g l i c e m i a pós-prandial, mas não se
c o n f i a mais e m tal p r o c e d i m e n t o . C o n s e q ü e n t e m e n t e , o O G T T
não deve ser utilizado no diagnóstico de hipoglicemia reativa.
A h i p o g l i c e m i a p ó s - p r a n d i a l não é f r e q ü e n t e , e é necessária
a d e m o n s t r a ç ã o de h i p o g l i c e m i a d u r a n t e a o c o r r ê n c i a espon-
tânea de episódios s i n t o m á t i c o s para a d e t e r m i n a ç ã o d o diag-
n ó s t i c o . Se isso não f o r possível, propõe-se a realização de u m
teste de tolerância à refeição de 5 horas (que e s t i m u l a a c o m p o -
sição de u m a dieta n o r m a l ) o u u m teste de refeição "hiperglicí-
d i c a " ( m u i t a glicose).
398 PARTE IV Analitos
Utiliza-se o diagnóstico de h i p o g l i c e m i a pata explicar u m a
ampla variedade de d i s t ú r b i o s que parecem não se relacionar
c o m concentrações a n o r m a i s de glicose sanguínea. Esses sinto-
mas inespecíficos i n c l u e m fadiga, espamos musculares, palpita-
ções, d o r m ê n c i a , f o r m i g a m e n t o , dor, suadouro, lerdeza m e n t a l ,
sonolência, fraqueza e desmaio. A t r i b u e m - s e i n c o r r e t a m e n t e as
anormalidades c o m p o r t a m e n t a i s , o b a i x o d e s e m p e n h o escolar e
a d e l i n q ü ê n c i a às concentrações baixas de glicose. N ã o se deve
realizar u m diagnóstico de h i p o g l i c e m i a a menos q u e o paciente
atenda aos critérios da tríade cíe Whipple da concentração de glicose
sanguínea: (1) sintomas causados o u provavelmente causados p o r
h i p o g l i c e m i a , (2) glicose baixa m e d i d a n o m o m e n t o de ocorrên-
cia dos sintomas e (3) alívio dos sintomas q u a n d o a glicose volta
à concentração n o r m a l . A demonstração de u m a concentração
de glicose plasmática n o r m a l q u a n d o o i n d i v i d u o exibe sintomas
exclui a possibilidade de u m d i s t ú r b i o h i p o g l i c ê m i c o .
Hipoglicemia no Diabetes Mellitus
A h i p o g l i c e m i a ocorre f r e q ü e n t e m e n t e t a n t o n o diabetes t i p o 1
q u a n t o n o diabetes t i p o 2. O s pacientes que u t i l i z a m i n s u l i n a
e x p e r i m e n t a m a p r o x i m a d a m e n t e u m a dois episódios de h i p o -
glicemia s i n t o m á t i c a p o r semana, e a h i p o g l i c e m i a grave que
requer assistência de outras pessoas o u está associada a perda de
consciência afeta cerca de 1 0 % dessa p o p u l a ç ã o p o r ano. E m
pacientes que p r a t i c a m terapia intensiva c o m i n s u l i n a (p.ex.,
m ú l t i p l a s injeções o u i n f u s ã o subcutânea c o n t i n u a de i n s u l i n a ) ,
esses n ú m e r o s são duas a seis vezes maiores. O evento adverso
p r i n c i p a l associado à terapia intensiva n o D C C T f o i u m a u m e n t o
de três vezes na incidência de h i p o g l i c e m i a grave. D e f o r m a
semelhante, ocorre h i p o g l i c e m i a e m pacientes c o m diabetes t i p o
2 (causado p o r agentes h i p o g l i c ê m i c o s orais o u insulina), mas
tal ocorrência é menos f r e q ü e n t e do que n o diabetes t i p o 1. A
contra-regulação a n o r m a l da glicose e a perda de percepção da
h i p o g l i c e m i a são dois mecanismos patofisiológicos q u e c o n t r i -
b u e m para a h i p o g l i c e m i a e m pacientes c o m diabetes.
Contra-regulação Anormal da Glicose
As respostas contra-reguladoras ficam prejudicadas em pacientes
c o m diabetes tipo 1, a u m e n t a n d o o risco de hipoglicemia. A secre-
ção de glucagon em reposta à hipoglicemia é prejudicada por u m
mecanismo desconhecido que ocorre n o início do curso do diabetes
t i p o 1. A secreção da epinefrina em reposta à hipoglicemia toma-se
deficiente em u m m o m e n t o mais tardio n o curso da doença. Esses
defeitos são seletivos já que outros estímulos c o n t i n u a m a deflagrar
a secreção de glucagon e de epinefrina. A contra-regulação da glicose
parece n o r m a l em pacientes c o m diabetes t i p o 2.
Perda de Percepção da Hipoglicemia
A t é 5 0 % dos pacientes c o m diabetes t i p o 1 de l o n g a duração
(mais de 3 0 anos) não e x p e r i m e n t a m sintomas neurogênicos e
estão propensos a u m a h i p o g l i c e m i a mais grave. Acredita-se q u e
o m e c a n i s m o envolvido seja u m a d i m i n u i ç ã o da resposta da
e p i n e f r i n a à h i p o g l i c e m i a . E m pacientes c o m diabetes t i p o 1
tratados i n t e n s i v a m e n t e , são necessárias concentrações menores
de glicose plasmática para o s u r g i m e n t o dos sintomas de h i p o -
glicemia. A l g u n s autores a f i r m a m que a utilização terapêutica de
i n s u l i n a h u m a n a , em vez de outras insulinas, resulta em u m a
i n c i d ê n c i a elevada da perda de percepção da h i p o g l i c e m i a , mas
a análise de 45 estudos não revelou diferenças significativas e m
episódios hipoglicêmicos entre as espécies de i n s u l i n a .
C e t o n e m i a e Cetonúria
A formação excessiva de corpos cetônicos resulta e m concentrações
sanguíneas elevadas (cetonemia) e aumento da excreção na u r i n a
(cetonúria). Observa-se esse processo em condições associadas à
d i m i n u i ç ã o da disponibilidade de carboidratos (como falta de ali-
mentação o u vômitos freqüentes) o u d i m i n u i ç ã o da utilização de
carboidratos [como diabetes melíitus, doença de reserva de glicogênio
(doença de v o n Gierke) e alcalosej. O diabetes mellitus e o consumo
de álcool são as causas comuns de cetoacidose. A determinação
semi quantitativa de corpos cetônicos n o sangue é mais acurada do
que a determinação desses compostos na u r i n a n o tratamento de
cetoacidose diabética. E m b o t a n e m sempre excretadas proporcio-
nalmente às concentrações das cetonas sanguíneas, as cetonas uri-
nárias, por conveniência, são amplamente utilizadas no monitora-
m e n t o de controle em pacientes c o m diabetes t i p o 1. O teste de
u r i n a para determinação de cetonas é realizado nos indivíduos c o m
diabetes tipo 1 durante estresse o u doença aguda, c o m elevação
consistente de glicose sanguínea que excede 2 4 0 m g / d L T a m b é m
se realiza esse teste durante a gravidez o u quando há sintomas de
cetoacidose. Podem ocorrer leituras positivas de cetonas durante o
j e j u m e na gravidez. Certos medicamentos p o d e m gerar testes falso-
positivos, enquanto a exposição prolongada das tiras de teste ao ar
pode produzir resultados falso-negativos.
A c i d o s e Láctica
A acidose láctica ocorre e m duas formas clínicas — (1) t i p o A
(hipóxica), associada à d i m i n u i ç ã o de oxigenação tecidual, c o m o
choque, h i p o v o l e m i a e disfunção v e n t r i c u l a r esquerda; e (2) t i p o
B (metabólica), associada a doenças (p.ex., diabetes meüitus, neo-
plasias e doenças hepáticas), d r o g a s / t o x i n a s (p.ex., etanol,
m e t a n o l e salicilatos) o u erros inatos d o m e t a b o l i s m o . A acidose
láctica não é i n c o m u m e ocorre em a p r o x i m a d a m e n t e 1 % dos
i n d i v í d u o s a d m i t i d o s n o hospital. Essa c o n d i ç ã o tem u m a taxa
de m o r t a l i d a d e m a i o r do q u e 6 0 % e se a p r o x i m a dos 1 0 0 % na
presença de hipotensão. O t i p o A é m u i t o mais c o m u m .
U m caso i n c o m u m de acidose láctica que não é diagnosticado
c o m freqüência é a acidose D-láctica. A absorção e o a c ú m u l o de
D-lactato de bactérias intestinais anormais p o d e m causar acidose
sistêmica. Essa condição ocorre após u m a cirurgia de desvio
j e j u n o i l e a l e se manifesta c o m o u m estado m e n t a l alterado (de
t o n t u r a leve a coma) c o m concentrações sanguíneas elevadas de
D-lactato. Praticamente todos os ensaios laboratoriais comu-
m e n t e utilizados para detecção de lactato u t i l i z a m a L-lactato
desidrogenase, enzima que não reconhece o D-lactato. O D -
lactato pode ser m e d i d o p o r cromatografia gás-líquido o u enzi-
maticamente c o m u m a D-lactato desidrogenase específica.
O lactato n o l í q u i d o cerebrospinal (CSF) n o r m a l m e n t e acom-
p a n h a as concentrações sanguíneas. C o m alterações b i o q u í m i c a s
n o C N S , p o r é m , os valores de lactato n o C S F m u d a m indepen-
d e n t e m e n t e dos valores sanguíneos. Observam-se concentrações
elevadas n o C S F e m i n d i v í d u o s c o m acidentes cetebrovasculares,
h e m o r r a g i a intracranial, m e n i n g i t e bacteriana, epilepsia e outros
distúrbios do C N S .
Erros Inatos do M e t a b o l i s m o de C a r b o i d r a t o s
A deficiência o u ausência de u m a enzima que p a r t i c i p a n o
m e t a b o l i s m o de carboidratos p o d e resultar n o a c ú m u l o de
monossacarídeos, a c ú m u l o este q u e p o d e ser m e d i d o na u r i n a .
A m a i o r i a dessas condições é h e r d a d a de f o r m a autossõmica
recessiva (ver a versão a m p l i a d a deste capítulo). 1 2 Os açúcares
aparecem c o m freqüência na u r i n a c o m o resultado de seu
c o n s u m o excessivo, sem a presença de doença subjacente.
As técnicas utilizadas para separar e i d e n t i f i c a r os açúcares
i n c l u e m fermentação, rotação óptica, formação de osazona c o m
fenilidrazina, testes q u í m i c o s específicos e cromatografia em
papel o u de camada fina. A d i s p o n i b i l i d a d e de fitas de teste
c o m glicose oxidase, específicas para a glicose, s i m p l i f i c o u m u i t o

a diferenciação da glicose de outras substâncias redutoras. POT
razões práticas, os açúcares u r i n á r i o s de interesse c l í n i c o são a
glicose e a galactose. Os testes u r i n á r i o s de bebês e crianças p o r
glicose oxidase o u redução de cobre i d e n t i f i c a r ã o os i n d i v í d u o s
c o m erros inatos d o m e t a b o l i s m o . Devem-se i d e n t i f i c a r , poste-
r i o r m e n t e , as substâncias redutoras distintas da glicose através
de p r o c e d i m e n t o s cromatográficos (ver a versão ampliada deste
capítulo). 1 2
Doença de A r m a z e n a m e n t o de Glicogênio
O glicogênio, e m b o r a presente na m a i o r i a dos tecidos, é arma-
zenado p r e d o m i n a n t e m e n t e n o fígado e n o m ú s c u l o esquelético.
D u r a n t e o j e j u m , o glicogênio hepático é c o n v e r t i d o em glicose
para o f o r n e c i m e n t o de energia para t o d o o c o r p o . Por o u t r o
lado, o m ú s c u l o esquelético n ã o possui glicose-6-fosfatase, e o
glicogênio muscular só p o d e ser u t i l i z a d o l o c a l m e n t e para obten-
ção de energia. A doença de a r m a z e n a m e n t o de glicogênio é u m
n o m e genérico que agrupa pelo m e n o s 10 d i s t ú r b i o s de armaze-
n a m e n t o de glicogênio nos tecidos que são hereditários e raros.
As diferentes formas de doença de a r m a z e n a m e n t o de glicogênio
são categorizadas p o r n u m e r a i s de a c o r d o c o m a o r d e m c r o n o -
lógica n a q u a l elas f o r a m identificadas. C a d a f o r m â é causada
p o r u m a deficiência de u m a enzima específica n o m e t a b o l i s m o
d o glicogênio, o que p r o d u z u m d i s t ú r b i o q u a n t i t a t i v o o u qua-
l i t a t i v o d o a r m a z e n a m e n t o de glicogênio.
C o m o o fígado e o m ú s c u l o esquelético possuem as maiores
taxas de m e t a b o l i s m o d o glicogênio, essas são as estruturas mais
afetadas. As f o r m a s hepáticas (tipos I, I I I , I V e V I ) caracterizam-
se p o r hepatomegalia ( p o r causa d o a u m e n t o dos estoques de
g l i c o g ê n i o hepático) e p o r h i p o g l i c e m i a (causada pela falta de
h a b i l i d a d e de converter o glicogênio e m glicose). A h i p o g l i c e m i a
manifesta-se p o r sintomas clínicos a u t ô n o m o s (suadouro, treme-
deira e sensação de desmaio), retardo d o crescimento e achados
laboratoriais de d i m i n u i ç ã o das concentrações de i n s u l i n a e
a u m e n t o das concentrações de glucagon n o sangue. As f o r m a s
musculares (tipos I I , I l l a , V e V I I ) , p o r o u t r o lado, possuem
sintomas leves q u e aparecem geralmente e m jovens adultos
d u r a n t e exercícios puxados p o r causa da falta de h a b i l i d a d e de
f o r n e c i m e n t o de energia para a contração muscular. O u t r o s
d i s t ú r b i o s musculares p o d e m e x i b i r sintomas semelhantes, mas
tais d i s t ú r b i o s p o d e m ser p r o n t a m e n t e diferenciados através da
avaliação dos estoques de glicogênio. Realiza-se d i r e t a m e n t e o
diagnóstico específico de cada t i p o através da d e m o n s t r a ç ã o d o
defeito enzimático n o tecido. Para u m a descrição detalhada, os
leitores devem consultar C h e n e Burchell.' 1
METODOLOGIA ANALÍTICA _ _
Nesta seção, discutem-se os m é t o d o s analíticos para a determina-
ção de glicose, corpos cetônicos, lactato, p i r u v a t o , h e m o g l o b i n a
glicada, f r u t o s a m i n a , p r o d u t o s finais de glicação avançada, albu-
m i n a u r i n á r i a , i n s u l i n a , p r ó - i n s u l i n a , peptídeo C e glucagon.
D e t e r m i n a ç ã o de Glicose e m Fluidos
Corporais
V á r i o s m é t o d o s são utilizados para m e d i r a glicose n o sangue,
SOTO, plasma e u r i n a . As avaliações d o College o f A m e r i c a n
Pathologists ( C A P ) d e m o n s t r a m que t o d o s os m é t o d o s e x i b e m
u m coeficiente de variação ( C V ) m e n o r d o que 5 % para os
valores de glicose e m soro l i o f í l í z a d o , sendo que, c o m métodos
automatizados, o C V é m e n o r d o que 2 , 6 % .
Coleta e Armazenamento de Amostra
E m i n d i v í d u o s c o m h e m a t ó c r i t o n o r m a l , a concentração de
glicose de j e j u m e m sangue t o t a l é a p r o x i m a d a m e n t e 10% a 1 2 %
Carboidratos CAPÍTULO 22 399
m e n o r d o que a concentração de glicose plasmática. E m b o r a as
concentrações de glicose na fase aquosa de glóbulos vermelhos
e de plasma sejam semelhantes (a m e m b r a n a plasmática d o eri-
t r ó c i t o é t o t a l m e n t e permeável à glicose), o c o n t e ú d o de água
d o plasma ( 9 3 % ) é a p r o x i m a d a m e n t e 11% maioT d o que o
c o n t e ú d o de água d o sangue total. N a m a i o r i a dos l a b o r a t ó r i o s
clínicos, utiliza-se plasma o u soro para a m a i o r i a das d e t e r m i n a -
ções de glicose; os m é t o d o s para o a u t o m o n i t o r a m e n t o da glicose
u t i l i z a m amostras de sangue t o t a l , mas tais m é t o d o s p o d e m
m e d i r a concentração de glicose n a fase plasmática. D u r a n t e o
j e j u m , a concentração de glicose n o sangue capilar é s o m e n t e 2
a 5 m g / d L m a i o r d o que a concentração de glicose n o sangue
venoso. A p ó s u m a carga de glicose, p o r é m , as concentrações de
glicose n o sangue capilaT t ê m valores de 20 a 70 m g / d L [(média
- 3 0 m g / d L ) , equivalente a 2 0 % a 2 5 % ] maiores d o que as con-
centrações nas amostras de sangue venoso coletadas c o n c o m i -
tantemente. 1 4
A glicólise d i m i n u i a glicose sérica e m a p r o x i m a d a m e n t e 5 %
a 7 % e m 1 h o r a (5 a 10 m g / d L ) n o sangue coagulado n o r m a l
n ã o c e n t r i f u g a d o e m t e m p e r a t u r a a m b i e n t e . A taxa da glicólise
i n nitTO é m a i o r n a presença de leucocitose o u c o n t a m i n a ç ã o
bacteriana. E m soro estéril não h e m o l i s a d o separado, a concen-
tração de glicose é geralmente estável p o r 8 horas e m 2 5 ° C e até
72 horas e m 4 ° C ; observa-se i n s t a b i l i d a d e e m períodos mais
longos de a r m a z e n a m e n t o . O plasma r e m o v i d o das células após
centrifugação m o d e r a d a c o n t é m leucócitos que t a m b é m meta-
b o l i z a m a glicose — e m b o r a o plasma estéril sem células não
possua atividade glicolítica.
Para a i n i b i ç ã o da glicólise e estabilização da glicose p o r três
dias e m t e m p e r a t u r a a m b i e n t e , pode-se a d i c i o n a r f l u o r e t o de
s ó d i o (NaF) o u , menos c o m u m e n t e , iodoacetato de s ó d i o à
amostra. Os íons f l u o r e t o i m p e d e m a o c o r r ê n c i a da glicólise
através da i n i b i ç ã o da enolase, u m a enzima q u e precisa de M g 2 \
A i n i b i ç ã o ocorre p o r causa da f o r m a ç ã o de u m c o m p l e x o i ô n i c o
c o m Mg 2 + , fosfato i n o r g â n i c o e íons f l u o r e t o ; esse c o m p l e x o
interfere na interação entre a e n z i m a e o substrato. O f l u o r e t o
t a m b é m é u m a n t i c o a g u l a n t e fraco p o r q u e ele se liga ao cálcio;
p o r é m , p o d e ocorrer coagulação após m u i t a s horas, e, p o r t a n t o ,
aconselha-se a utilização de u m a mistura combinada de fluoreto-
Dxalato, c o m o 2 m g de oxalato de potássio (K2C2O4) e 2 m g de
N a F / m L de sangue, paTa prevenir a coagulação tardia. U t i l i z a m -
se, t a m b é m , o u t r o s anticoagulantes (p.ex., ácido e t i l e n o d i a m i n o -
tetracético [ E D T A ] , citrato o u heparina). í o n s f l u o r e t o e m altas
concentrações i n i b e m a atividade da urease e de outras enzimas;
c o n s e q ü e n t e m e n t e , as amostras p o d e m estai i m p r ó p r i a s para a
d e t e r m i n a ç ã o de uréia e m p r o c e d i m e n t o s que necessitam da
urease e para o ensaio d i r e t o de algumas enzimas séricas. O
K^C^O^faz c o m que as células percam água, d i l u i n d o , p o r t a n t o ,
o plasma. P o r t a n t o , n ã o se devem u t i l i z a r as amostras coletadas
nesses t u b o s para a dosagem de o u t r o s metabólitos. E m b o r a o
f l u o r e t o m a n t e n h a a estabilidade da glicose sanguínea a l o n g o
prazo, a taxa de d e c l í n i o na p r i m e i r a h o r a após a coleta da
amostra n ã o se altera. Provavelmente, então, a utilização d o t u b o
c o n t e n d o f l u o r e t o é desnecessária nas análises de r o t i n a se o
plasma for separado das células o u se a glicose f o r m e d i d a e m
até 6 0 m i n u t o s após a coleta d o sangue. Porém, i n i b i d o r e s de
glicólise são necessários e m pacientes c o m c o n t a g e m m u i t o
elevada de leucócitos, pois há diferenças de até 65 m g / d L entre
os valores de glicose c o m e sem i n i b i d o r e s glicolíticos após 1 a
2 horas de c o n t a t o c o m as células sanguíneas.
C o m o o C S F pode ser c o n t a m i n a d o p o r bactérias o u outras
células, a d e t e r m i n a ç ã o da glicose deve ser realizada imediata-
m e n t e . Se f o r inevitável u m atraso na dosagem, deve-se c e n t r i f u -
gar e armazenar a amostra e m 4 ° C a -20°C.
400 PARTE IV Analitos
Nas coletas de u r i n a de 24 h , pode-se preservar a glicose
através da adição de 5 m L de ácido acético glacial ao recipiente
antes d o i n í c i o da coleta. Dessa forma, o p H f i n a l da u r i n a
geralmente fica entre 4 e 5, c o n d i ç ã o na q u a l a atividade bacte-
riana é i n i b i d a . O u t r o s conservantes propostos são 5 g de ben-
zo ato de s ó d i o p o r amostra de 24 horas o u c l o r e x i d i n a e n i t r a t o
de sódio (NaN^) 0 , 1 % c o m cloreto de b e n z e t ô n i o 0 , 0 1 % . Tais
conservantes p o d e m ser inadequados e deve-se armazenar a
u r i n a em 4 Q C d u r a n t e a coleta. A s amostras de u r i n a p o d e m
perder mais de 4 0 % da glicose após 24 horas em t e m p e r a t u r a
ambiente.
Dosagem da Glicose no Sangue
A hexoquinase e a glicose oxidase são a m p l a m e n t e utilizadas e m
ensaios para m e d i r a concentração de glicose n o sangue. U t i l i z a -
se a glicose desidrogenase e m alguns métodos.
Métodos que Utilizam Hexoquinase
Os m é t o d o s que u t i l i z a m a hexoquinase ( H K ) baseiam-se em u m
ensaio enzimático que utiliza a H K e a glicose-6-fosfato desidro-
genase (G-Õ-PD):
Hexoquinase
Glicose Glicose-6-fosfato
+ ATP - + ADP
Glicose-ó-fosfato G-6-PD Ó-Fosfogliconaco
NADP" NADPH + H
(orNAD") (ar N A D H )
C o m o i n d i c a d o , a glicose é p r i m e i r o fosforilada pelo A T P
na presença de H K e Mg 2 + . A glicose-6-fosfato f o r m a d a é oxidada
pela G - 6 - P D e m ó-fosfogliconato na presença de n i c o t i n a n u d a -
adenina d i n u c l e o t í d e o fosfato ( N A D P * ) . A q u a n t i d a d e de N A D P
reduzida ( N A D P H ) p r o d u z i d a é d i r e t a m e n t e p r o p o r c i o n a l à
q u a n t i d a d e de glicose na amostra e é m e d i d a pelo a u m e n t o na
absorvância em 340 n m . Utiliza-se a G-6-PD derivada de leve-
dura n o ensaio, c o m N A D P " c o m o o co-fator. O N A D " é o co-
fator se for u t i l i z a d a a G j 6 - P D bacteriana (Leucontrnoc mesenteroi-
deí), e o N A D H p r o d u z i d o t a m b é m é m e d i d o em 340 n m . F o i
desenvolvido e v a l i d a d o u m m é t o d o de referência c o m base
nesse p r i n c í p i o . N o m é t o d o de referência, desprotemiza-se o
soro o u o plasma através da adição de soluções de h i d r ó x i d o de
b á r i o ( B a J O H h ) e sulfato de zinco ( Z n S 0 4 ) . Mistura-se o sobre-
n a d a n t e t r a n s p a r e n t e a u m reagente c o n t e n d o A T P , N A D " ,
hexoquinase e G-6-PD, incuba-se a solução r e s u l t a n t e em 2 5 ° C
até o t é r m i n o da reação e mede-se o N A D H . C a l i b r a d o r e s e
brancos são utilizados d u r a n t e t o d o o processo, i n c l u i n d o a
etapa de desproteinização.
E m b o r a a l t a m e n t e acurado e preciso, o m é t o d o de referência
requer m u i t a precisão e é m u i t o d e m o r a d o para ser utilizado
r o t i n e i r a m e n t e em u m l a b o r a t ó r i o clínico. U m m é t o d o alterna-
t i v o é aplicar a reação d i r e t a m e n t e ao soro o u ao plasma e u t i l i -
zar u m b r a n c o para c o r r i g i r as interferências das substâncias que
absorvem e m 3 4 0 n m .
Pode-se u t i l i z a r soro o u plasma. Pode-se u t i l i z a r N a F c o m
u m anticoagulante c o m o E D T A , h e p a r i n a , oxalato o u citrato.
A s amostras hemolisadas c o n t e n d o mais de 0,5 g de hemoglo-
h i n a / d L são insatisfatórias p o r q u e os ésteres de fosfato e as
enzimas liberadas dos glóbulos v e r m e l h o s i n t e r f e r e m n o ensaio.
O u t r a s fontes de i n t e r f e r ê n c i a i n c l u e m drogas, b i l i t r u b i n a e
l i p e m i a (triglicerídeo ^ 5 0 0 m g / d L que causa u m a i n t e r f e r ê n c i a
positiva).
Medem-se as absorvâncias das misturas de reação da amostra
o u d o calibrador após o t é r m i n o das reações (reação n o estado
de e q u i l í b r i o d i n â m i c o , m é t o d o d o " p o n t o f i n a l " ) o u em u m
t e m p o fixo após o i n í c i o da reação (cinética de t e m p o fixo). N o s
métodos de p o n t o f i n a l , podem-se calcular d i r e t a m e n t e as con-
centrações de glicose c o m base na absortividade m o l a r do
N A D P H o u d o N A D H , mas recomenda-se a inclusão de u m
g r u p o de calibradores para a detecção de possível deterioração
das enzimas e dos m e t a b ó l i t o s A T P , N A D P ' e N A D , todos ins-
táveis. Os reagentes t a m b é m c o n t ê m substâncias que reagem
c o m as coenzimas. Avalia-se a presença dessas substâncias através
d o a u m e n t o da absorvância observada em u m reagente b r a n c o
d u r a n t e a dosagem. O calibrador mais c o n c e n t r a d o fornece u m a
verificação da l i n e a r i d a d e da resposta e a adequação do reagente
enzimático. O p r o c e d i m e n t o é linear de 0 a 5 0 0 m g / d L . Devem-
se d i l u i r as amostras de soro e de plasma c o m concentrações de
glicose maiores do que 5 0 0 m g / d L (geralmente c o m salina iso*
tônica) e depois realizar o ensaio.
T a m b é m estão disponíveis p r o c e d i m e n t o s c o m a hexoqui-
nase nos quais as reações indicadoras p r o d u z e m p r o d u t o s colo-
ridos cujas absorvâncias p o d e m ser medidas na faixa visível.
Reage-se u m sistema de oxidação-redução c o n t e n d o metossulfato
de fenazina (PMS) e u m composto tetrazólico substituído, o
cloreto de 2-(fModofenil)-3-£-nitrofenil-5-feniltetrazólio (1NT),
c o m o N A D P H f o r m a d o na reação. O 1 N T r e d u z i d o t e m u m a
coloração c o m absorvância m á x i m a e m 5 2 0 n m .
Métodos que Utilizam Glicose Oxidase
A glicose oxidase catalisa a oxidação da glicose e m ácido glicô-
n i c o e p e r ó x i d o de h i d r o g ê n i o ( H z O z ) :
G U St 0 l
Glicose + H 2 0 + 02 ' ° "^ ) Á c i d o glicõnico + 2 H 2 0 2
A adição da enzima peroxidase e u m aceptor de o x i g ê n i o
cromogênico, c o m o a o-dianisidina, resulta na formação de u m
composto c o l o r i d o que é m e d i d o :
o-Dianisidina + H 2 0 7
JVrmfjaie—^ o-Dianisidina O x i d a d a + H 2 0
(Colorido)
A glicose oxidase é altamente específica para a {i-D-glicose.
C o m o 3 6 % a 6 4 % da glicose e m solução estão nas formas a e
P, respectivamente, a reação c o m p l e t a requer m u t a r r o t a ç ã o da
f o r m a a para a f o r m a [3. A l g u m a s preparações comerciais de
glicose oxidase c o n t ê m u m a enzima, a mutarrotase, que acelera
essa reação. Sem a mutarrotase, ocorre conversão espontânea se
o t e m p o de i n c u b a ç ã o f o r estendido.
A segunda etapa, envolvendo a peroxidase, é m u i t o m e n o s
específica do que a reação da glicose oxidase. Várias substâncias,
c o m o ácido ú r i c o , ácido ascórbico, b i l i r r u b i n a , h e m o g l o b i n a ,
tetraciclina e g l u t a t i o n a , i n i b e m a reação (provavelmente p o r
competição c o m o c r o m ó g e n o para H 2 O I ) p r o d u z i n d o valores
menores. A l g u m a s preparações de glicose oxidase c o n t ê m cata-
lase, enzima que d e c o m p õ e o p e r ó x i d o e d i m i n u i a intensidade
da coloração f i n a l o b t i d a . Devem-se analisar s i m u l t a n e a m e n t e
os calibradores e as substâncias desconhecidas sob as condições
nas quais a taxa de oxidação é p r o p o r c i o n a l à concentração de
glicose.
O s métodos c o m glicose oxidase são apropriados para a
dosagem da glicose n o CSF. A u r i n a c o n t é m altas concentrações

de substâncias que i n t e r f e r e m na reação da peroxidase ( c o m o o
ácido úrico) q u e p r o d u z e m resultados falsamente baixos. Por-
tanto, não se deve utilizar o m é t o d o da glicose oxidase na u r i n a .
F o i descrito n a l i t e r a t u r a u m m é t o d o n o q u a l a u r i n a é p r i m e i r o
pré-tratada c o m u m a resina de troca iônica para a r e m o ç ã o de
substâncias interferentes.
A l g u n s i n s t r u m e n t o s u t i l i z a m u m eletrodo polarográfico de
oxigênio que m e d e a taxa de c o n s u m o de oxigênio após a amostra
ser a d icio nada a u m a solução c o n t e n d o glicose oxidase. C o m o
essa dosagem envolve somente a reação da glicose oxidase, elimi-
nam-se as interferências encontradas na etapa da peroxidase. Para
prevenir a formação de oxigênio d o b L O ? pela catalase presente
em algumas preparações de glicose oxidase, remove-se a H 2 0 2
através de duas reações adicionais:
Catahlse
H 2 Q + C 2 H , O H ) CH 3 CH0+2H 2 0
H , Q, + 2 H + +21" i ^ - b í í
^ l 2H, 0
2 +
Essa ú l t i m a reação é eficaz m e s m o q u a n d o ocorre d i m i n u i -
ção da atividade da catalase n o estoque de reagentes. Aplica-se
esse p r o c e d i m e n t o d i r e t a m e n t e na u r i n a , soro, plasma o u CSF.
Porém, não se deve utilizá-lo para a determinação da glicose em
sangue total, já que as células sanguíneas c o n s o m e m o x i g ê n i o .
E m sistemas automatizados c o m múltiplas camadas de lâminas
secas, mede-se a glicose através de u m p r o c e d i m e n t o utilizando-se
a glicose oxidase. Coloca-se 10 p L de amostra de soro, plasma,
u r i n a o u S C F sobre u m f i l m e poroso localizado acima de u m a
camada q u e c o n t é m os reagentes. A glicose difunde-se através
d o f i l m e e reage c o m os r e a g e n t e s p a r a p r o d u z i r u m p r o -
d u t o f i n a l c o l o r i d o o u u m indicador. Mede-se a intensidade desse
i n d i c a d o r através de u m f i l m e transparente posicionado abaixo da
camada de reagentes utilizando-se espectrofotometria de refletân-
cia. As vantagens desse m é t o d o são a utilização de pequena quan-
tidade de amostra, a não utilização de reagentes líquidos e a u m e n t o
da estabilidade d u r a n t e o armazenamento.
Método que Utiliza Glicose Desidrogenase
A enzima glicose desidrogenase (p-D-glicose: N A D o x i d o r r e d u -
tase, E C 1.1.1.47) catalisa a oxidação da glicose em glicolac-
tona:
Giicose desidrogenase
Glicose - D-Glicose-5-lactona
1
NAD NADH + H "
Adiciona-se a mutarrotase para e n c u r t a r o t e m p o necessário
para se alcançar o e q u i l í b r i o . A q u a n t i d a d e de N A D H gerada é
p r o p o r c i o n a l à concentração de glicose. A reação parece ser
altamente específica para a glicose, não mostra i n t e r f e r ê n c i a p o r
anticoagulantes c o m u n s e substâncias n o r m a l m e n t e encontra-
das n o soro e fornece resultados p r ó x i m o s aos obtidos c o m os
p r o c e d i m e n t o s que u t i l i z a m hexoquinase. O p r o c e d i m e n t o que
utiliza a glicose desidrogenase não é a m p l a m e n t e u t i l i z a d o nos
Estados U n i d o s .
Automonitoramento da Glicose Sanguínea por
Medidores de Glicose
O s pacientes c o m diabetes, especialmente aqueles que precisam
de terapia c o m i n s u l i n a , necessitam de u m m o n i t o r a m e n t o cui-
Carboidratos CAPÍTULO 22 401
dadoso para m a n t e r o c o n t r o l e da glicose sanguínea. Tal fato
tornou-se p a r t i c u l a r m e n t e i m p o r t a n t e c o m os resultados d o
D C C T e a recomendação aos pacientes para u t i l i z a r e m regimes
de terapia intensiva c o m i n s u l i n a para a obtenção de u m a glice-
m i a p r ó x i m a a da n o r m a l . Esses regimes i n c l u e m m ú l t i p l a s inje-
ções diárias de i n s u l i n a , b o m b a s de i n s u l i n a e injeções subcutâ-
neas c o n t i n u a s de i n s u l i n a .
Os m e d i d o r e s portáteis para a determinação das concentra-
ções da glicose sanguínea ( C a p í t u l o 12) são utilizados de três
formas p r i n c i p a i s : (1) em instituições de saúde ( n o leito do
paciente e e m clínicas o u hospitais); (2) em c o n s u l t ó r i o s médicos;
e (3) pelos pacientes em casa, n o trabalho e na escola. N o s
Estados U n i d o s , a ú l t i m a f o r m a de determinação, isto é, o auto-
m o n i t o r a m e n t o da glicose sanguínea ( S M B G ) , utilizada p o r
a p r o x i m a d a m e n t e 1 m i l h ã o de pacientes c o m diabetes, é feito
pelo menos u m a vez ao dia poT 4 0 % e 2 6 % dos i n d i v í d u o s c o m
diabetes t i p o 1 e 2, respectivamente. 1 3
U t i l i z a n d o esses medidores, os pacientes m e d e m suas pró-
prias concentrações de glicose sanguinea e m o d i f i c a m suas doses
de i n s u l i n a c o m base nos seus valores de glicose. N ã o é prático
para os pacientes realizarem as determinações de glicose através
dos métodos descritos a n t e r i o r m e n t e , mas estão disponíveis
várias tiras de teste simples que p e r m i t e m dosagens rápidas e
razoavelmente acuradas c o m u m a gota de sangue total. Essas
tiras u t i l i z a m a mesma m e t o d o l o g i a descrita a n t e r i o r m e n t e para
a análise da glicose — p r e d o m i n a n t e m e n t e c o m glicose oxidase
o u hexoquinase — mas algumas tiras c o n t ê m glicose desidroge-
nase. E m muitas tiras, colore-se u m i n d i c a d o r pela reação cro-
mogênica da glicose oxidase-peroxidase. Os reagentes são com-
binados na f o r m a seca em u m a pequena área de superfície de
u m a tira de teste, e as cores que aparecem p o d e m ser avaliadas
v i s u a l m e n t e p o r comparação c o m u m q u a d r o de cores (rara-
m e n t e utilizado atualmente) o u q u a n t i f i c a d a s e m u m m e d i d o r
especial. A leitura uiswal com um quadro de cores não é suficiente-
mente acurada para a m a i o r i a das circunstâncias clínicas. Estão
disponíveis pelo m e n o s 25 m e d i d o r e s diferentes de glicose san-
guínea q u e v a r i a m e m t a m a n h o , peso, m é t o d o de calibração e
outras características.
Para realizar a dosagem, coloca-se u m a amostra de sangue
(geralmente de p o n t a de dedo, mas pode-se u t i l i z a r sangue t o t a l
anticoagulado, coletado em E D T A o u heparina) na zona de teste
anexada a u m suporte plástico. Insere-se a t i r a de teste, então,
n o m e d i d o r antes da aplicação da amostra. A p ó s u m período de
t e m p o , o resultado aparece e m u m m o s t r a d o r digital. Os medi-
dores u t i l i z a m f o t o m e t r i a de refletância o u eletroquímica para
m e d i r a taxa da reação o u a concentração f i n a l dos p r o d u t o s . A
f o t o m e t r i a de refletância mede a q u a n t i d a d e de luz refletida da
região de teste q u e c o n t é m o reagente. E m sistemas e l e t r o q u í m i -
cos, a reação enzimática em u m e l e t r o d o i n c o r p o r a d o na tira de
teste p r o d u z u m f l u x o de elétrons. A corrente, q u e é d i r e t a m e n t e
p r o p o r c i o n a l à q u a n t i d a d e de glicose na amostra, é c o n v e r t i d a
e m u m a leitura digital. H á u m a grande variabilidade entre os
m e d i d o r e s em relação ao t e m p o d o teste (15 a 120 segundos) e
ao i n t e r v a l o de l e i t u r a (40 a 4 0 0 m g / d L a 0 a 6 0 0 m g / d L ) . A
calibração é a u t o m á t i c a e m alguns dispositivos, e n q u a n t o o u t r o s
u t i l i z a m tiras o u chips específicos . T o d o s os fabricantes f o r n e c e m
soluções c o n t r o l e . E necessário q u e as instruções sejam estrita-
m e n t e seguidas para a obtenção de resultados acurados. A l g u n s
m e d i d o r e s possuem u m a m e m b r a n a porosa que separa os eritró-
citos, e a análise é realizada n o plasma resultante. A Í concentrações
de glicose no sangue total são aproximadamente 10% a 15% menores
do que no plasma ou no soro, mos os medidores podem ser calibrados
para a exibição de valores de glicose plasmática, mesmo quando a
amostra for sangue total. U m g r u p o de trabalho da I n t e r n a t i o n a l
402 PARTE IV Anafitos
Federation o f C l i n i c a i C h e m i s t r y ( I F C C ) r e c o m e n d o u recente-
m e n t e que os m e d i d o r e s de glicose relatem a concentração de
glicose n o plasma, i n d e p e n d e n t e do t i p o de amostra o u de tec-
nologia.
Objetivos Analíticos (Especificações de Desempenho)
H á m ú l t i p l o s objetivos analíticos propostos para o d e s e m p e n h o
dos m e d i d o r e s de glicose. Por exemplo, o objetivo analítico da
A D A de 1996 é u m erro analítico m e n o r d o que 5 % . N e n h u m
estudo p u b l i c a d o sobre medidores de glicose alcançou esse obje-
tivo. O C l i n i c a i a n d L a b o r a t o r y Standards I n s t i t u t e ( C L S , antigo
N a t i o n a l C o m m i t t e e for C l i n i c a i L a b o r a t o r y Standards [ N C C L S ] )
recomenda q u e os resultados p o d e m variar em até 2 0 % das
concentrações de glicose m e d i d a e m l a b o r a t ó r i o q u a n d o o valor
for m a i o r d o q u e 75 m g / d L e e m até 15 m g / d L da concentração
de glicose se esta for m e n o r o u igual a 75 m g / d L . H á o u t r o s
objetivos propostos. 1 3
Desempenho dos Medidores de Glicose
Os avanços na tecnologia e l i m i n a r a m os erros mais c o m u n s n o
S M B G , c o m o a aplicação i m p r ó p r i a , t e m p o correto de realização
d o teste e r e m o ç ã o do excesso de sangue. A s inovações adicionais
que reduzem o erro do o p e r a d o r são (1) sistemas que a b o r t a m
o teste se o v o l u m e de amostra f o r i n a d e q u a d o , (2) programas
e m b u t i d o s que s i m p l i f i c a m o c o n t r o l e de qualidade e (3) m e m ó -
rias que p e r m i t e m que o i n s t r u m e n t o armazene centenas de
leituras de glicose que p o d e m ser transferidas para u m c o m p u -
tador.
V á r i o s fatores afetam a acurácia e a r e p r o d u t i b i l i d a d e d o
S M B G . São eles (1) a v a r i a b i l i d a d e n o d e s e m p e n h o e n t r e usuá-
rios — até 5 0 % dos valores p o d e m variar mais de 2 0 % dos valores
de referência; (2) o h e m a t ó c r i t o — a presença de a n e m i a (falso
a u m e n t o ) o u p o l i c i t e m i a (falsa d i m i n u i ç ã o ) p o d e resultar em
u m a v a r i a b i l i d a d e de até 3 0 % ; e (3) defeitos nas tiras de testes
o u m a l f u n c i o n a m e n t o de i n s t r u m e n t o s (raro). O u t r a s variáveis
são alterações na a l t i t u d e , n a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e o u na
u m i d a d e ; h i p o t e n s ã o ; h i p o x i a ; e concentrações altas de triglice-
rídeos. A l é m disso, esses ensaios não são confiáveis em concentrações
muito altas e muito baixas de glicose (p.ex., <60 m g / d L e > 5 0 0
m g / d L ) . C o m o a d i m i n u i ç ã o do v o l u m e intravascular, u m a
característica c o m u m da cetoacidose diabética, a u m e n t a m u i t o
a viscosidade d o sangue, há a possibilidade de o b t e n ç ã o de
resultados falsamente baixos de glicose sanguínea. V á r i a s drogas
i n t e r f e r e m , mas não e m todos os medidores. O u t r o fator i m p o r -
tante é a falta de correlação entre os medidores, até m e s m o de
u m m e s m o fabricante, causada pelos diferentes métodos de ensaio
e arquitetura. F o r a m publicadas as características d o desempe-
n h o analítico de vários medidores. 1 2 Os fatores relacionados c o m
os pacientes t a m b é m são i m p o r t a n t e s , p a r t i c u l a r m e n t e o treina-
m e n t o adequado. A educação c o n t í n u a nas visitas clínicas e a
comparação d o S M B G c o m a análise l a b o r a t o r i a l da glicose
m e l h o r a m a acurácia das leituras de glicose sanguínea dos
pacientes. A l é m disso, é i m p o r t a n t e realizar a avaliação da
técnica do paciente em intervalos regulares
O d e s e m p e n h o de diferentes medidores varia a m p l a m e n t e .
Sob condições c u i d a d o s a m e n t e controladas nas quais todos os
ensaios f o r a m realizados p o r u m ú n i c o técnico m é d i c o , ~ 5 0 %
das análises c o m os medidores atuais a t e n d e r a m ao c r i t é r i o da
A D A de u m desvio m e n o r que 5 % dos valores de referência. O
d e s e m p e n h o de medidores antigos f o i substancialmente pior.
Observe que o d e s e m p e n h o alcançado pelos m e d i d o r e s de
glicose q u a n d o manuseados pelos técnicos médicos é m e l h o r do
que o d e s e m p e n h o alcançado q u a n d o os m e d i d o r e s são manu-
seados pelos pacientes. A comparação de quase 2 2 . 0 0 0 dosagens
de glicose capilar realizadas p o r pacientes que u t i l i z a r a m medi-
dores c o m os valores l a b o r a t o r i a i s n ã o revelou uma m e l h o r a
significativa n o d e s e m p e n h o do m e d i d o r entre 1989 e 1999. 12
Monitoramento Minimamente invasivo da Glicose
Sanguínea
M e n o s de 10% dos pacientes c o m diabetes realizam rotineira-
m e n t e o S M B G porque esse p r o c e d i m e n t o é d o l o r o s o e incon-
veniente. Desde a década de 1960, estudiosos estão t e n t a n d o
desenvolver u m m é t o d o i n d o l o r de m o n i t o r a m e n t o das concen-
trações de glicose sanguínea. Três m é t o d o s gerais são utilizados:
sensores implantáveis, m o n i t o r a m e n t o m i n i m a m e n t e invasivo e
m o n i t o r a m e n t o não invasivo . I j
Sensores Implantáveis
V á r i o s biossensores implantáveis f o r a m desenvolvidos e avalia-
dos t a n t o e m animais q u a n t o e m h u m a n o s . Os sistemas de
detecção baseiam-se em reações enzimáticas o u na geração de
sinais elétricos o u fluorescentes. O m é t o d o mais a m p l a m e n t e
estudado é o sensor e l e t r o q u í m i c o que utiliza glicose oxidase.
Implanta-se esse sensor de f o r m a intravenosa o u subcutânea.
Estão sendo desenvolvidas alternativas às enzimas, i n c l u i n d o
"receptores" artificiais de glicose. Os implantes subcutâneos são
os m e n o s bem-sucedidos. O i m p l a n t e de u m sensor d o t i p o
agulha n o tecido subcutâneo i n d u z repostas i n f l a m a t ó r i a s que
alteram a sensibilidade do dispositivo. Para m i n i m i z a r esse pro-
blema, utihza-se m i c r o d i á l i s e c o m fibras ocas o u u l t r a f i l t r a ç ã o
c o m material b i o l o g i c a m e n t e inerte.
Monitoramento Minimamente Invasivo da Glicose
Os dispositivos baseiam-se na observação de que a concentração
de glicose no f l u i d o intersticial se correlaciona c o m a concentração
de glicose sanguínea. Por exemplo, o p r i n c í p i o do G l u c o W a t c h
(Cygnus, R e d w o o d City, C A , Estados U n i d o s ) é a aplicação de
u m a corrente elétrica fraca na pele, que m d u z o m o v i m e n t o
eletrosmótico da glicose através da pele o n d e ela é m e d i d a p o r
u m detector c o m glicose oxidase. H á u m a alta correlação entre
as concentrações de glicose n o f l u i d o transdérmico e n o plasma.
A aplicação mais clara do G l u c o W a t c h , projetado para m e d i r a
glicose três vezes p o r h o r a p o r até 12 horas, parece ser a detecção
de h i p o g l i c e m i a e m casos nos quais não há suspeita dessa condi-
ção. E necessário realizar u m a calibração através da utilização de
dosagens da glicose plasmática. Os estudos clínicos iniciais
revelam u m a correlação razoável do G l u c o W a t c h c o m o S M B G .
O dispositivo ainda não f o i rigorosamente testado e m a m b i e n t e
d o m i c i l i a r o u em crianças, mas sua aprovação pela U.S. F o o d a n d
D r u g A d m i n i s t r a t i o n ( F D A ) provavelmente estimulará maiores
esforços para trazer outras tecnologias para o uso clínico.
Monitoramento Não Invasivo da Glicose
O m o n i t o r a m e n t o não invasivo m viuo da glicose é u m a área de
investigação ativa. Dispositivos espectroscópicos p r ó x i m o s d o
i n f r a v e r m e l h o m e d e m a absorção o u a reflexão de luz d o tecido
subcutâneo, mas há i n t e r f e r ê n c i a de m u i t a s substâncias. U m
c o m p u t a d o r i n d i v i d u a l m e n t e calibrado e l i m i n a as interferências
para a obtenção d o resultado da glicose. Limitações semelhantes
p r e v i n e m a utilização benvsucedida do espalhamento de luz. A
espectroscopia fotoacústica, m é t o d o que utiliza luz infraverme-
l h a pulsada, é u m a t e c n o l o g i a recente q u e parece promissora.
Determinação da Glicose na Urina
A determinação da glicose é rápida, barata e não-invasiva e é
utilizada para rastreaT grandes números de amostras.' , ! 3 O m o n i -

toramento da glicose u r i n á r i a não é sensível e n e m específico
e não fornece n e n h u m a informação sobre as concentrações
da glicose sanguínea abaixo do l i m i t e renal (geralmente 180
m g / d L ) . Os testes de triagem mais antigos detectam todos os
açúcares que reduzem cobre e também reagem com substâncias
redutoras que não são açúcares. Os testes específicos para a
dosagem de glicose que são quantitativos ou semiquantitativos
estão amplamente disponíveis e substituíram os testes inespecí-
ficos em adultos. Utiliza-se o teste de redução do cobre para fazei
a triagem de recém-nascidos e bebês para a detecção de erros
inatos do metabolismo que podem resultar no aparecimento de
açúcares redutores distintos da glicose (p.ex., galactose ou frutose)
na urina.
Método Qualitativo para a Dosagem de Substâncias Redutoras
Totais
O reagente qualitativo de Benedict contém íons cúpricos com-
plexados com citrato em solução alcalina. As substâncias redu-
toras convertem íons cúpricos em íons cuprosos, formando
h i d r ó x i d o cuproso amarelo ou óxido cuproso vermelho. U m a
adaptação conveniente do procedimento é comercializada na
forma de c o m p r i m i d o (Clinicest). Os comprimidos contêm
sulfato cúprico anidro, h i d r ó x i d o de sódio ( N a O H ) , ácido cítrico
e bicarbonato de sódio ( N a H C 0 3 ) . Misturam-se cinco gotas
(0,25 mL) de urina com 10 gotas de água em u m tubo de ensaio.
Adiciona-se u m comprimido, e deixa-se a mistura em repouso
por 15 segundos. Agita-se, então, a mistura e observa-se a forma-
ção de cor. Utiliza-se uma tabela de cores fornecida pelo fabri-
cante para interpretar o resultado. Gera-se calor por causa do
contato entre o N a O H e a água. A reação inicial entre o ácido
cítrico e o N a H C 0 3 causa a liberação de dióxido de carbono
que deixa a mistura transparente e reduz o contato com o oxi-
gênio do ar para impedir a reoxidação dos íons cuprosos. Se uma
quantidade grande de açúcar (>2 g / d L ) estiver presente na urina,
a solução passa por várias cores e retorna para o marrom-esver-
deado. Esse evento pode causar uma leitura errônea baixa, a
menos que toda a reação seja cuidadosamente observada. A
urina que reage dessa forma deve ser testada novamente com
duas gotas de urina em vez de cinco. As interferências falso-
posittvas podem ser causadas por outras substâncias redutoras
que podem aparecer na urina.
Dosagem Semiquantitativa da Glicose na Urina
Estão comercialmente disponíveis a partir de vários fabricantes
tiras de teste convenientes, por exemplo, o Clinistix, o Keto-
Diastix, o Chemstrip p G K e o Tes-Tape. Todos esses testes utili-
zam a enzima glicose oxidase em u m ensaio cromogênico. Por
exemplo, o Clinistix tem u m papel de filtro impregnado com
glicose oxidase, peroxidase e o indicador o-tolidina. Outros indi-
cadores podem ser utilizados, como o tetrametilbenzidina (TMB).
A zona de teste da tira é umedecida com u i i n a fresca e exami-
nada após 10 segundos. Aparecerá uma coloração azul se a
glicose estiver presente em uma concentração igual ou maior do
que 100 m g / d L . Esse teste é mais sensível para a glicose do que
o teste de redução de cobre (Clinitest), cujo l i m i t e de detecção
é de 250 m g / d L .
Os resultados falso-positivos podem ser produzidos pela con-
taminação da urina com H 2 0 2 ou u m agente oxidante forte,
como hipoclorito (água sanitária). Os resultados falso-negativos
podem ser produzidos pela presença de grandes quantidades de
substâncias redutoras, como cetonas, ácido ascórbico e salicila-
tos. De forma geral, para exames de rotina, interpreta-se u m
resultado negativo produzido pelo teste da tira como ausência
de glicose na urina.
Carboidratos CAPÍTULO 2 2 403
!
I n t e r v a l o s de R e f e r ê n c i a para Glicose de
J e j u m ( m g / d L ) p o r T i p o de A m o s t r a
PLASMA/SORO
Adulto 74 a 99 (4,1 a 5,5 mmol/L)
Criança 60 a 100 (3,5 a 5,5 mmol/L)
Recém-nascidos prematuros 20 a 60 (1,1 a 3,3 mmol/L)
Recém-nascidos a termo 30 a 60 (1,7 a 3,3 mmol/L)
Sangue total 65 a 95 (3,6 a 5,3 mmol/L)
CSF 40 a 70 (60% do valor
do plasma)
(2,2 a 3,9 mmol/L)
URINA
24 horas 1 a 15 mg/dL (0,1 a 0,8 mmol/L)
Outros testes de tira (como o Keto-Diastix e o Chemstrip
| j G K ) servem para a estimativa semiquantitativa da glicose e dos
corpos cetônicos. A parte da tira para teste de glicose utiliza o
método da glicose oxidase-peroxidase. O peróxido de hidrogênio
produzido oxida o iodeto em iodo, gerando várias intensidades
de maTrom que correspondem às concentrações crescentes de
glicose na urina. O limite de detecção é de 100 m g / d L .
Métodos Quantitativos para a Determinação da Glicose na Urina
As aplicações de vários procedimentos para a determinação semi-
quantitativa de glicose na urina foram discutidas anteriormente
na seção sobre a determinação da glicose em fluidos corporais.
Recomendam-se os procedimentos que utilizam hexoquinase ou
glicose desidrogenase para uma maior acurácia e especificidade.
Os procedimentos que utilizam glicose oxidase que dependem
somente do consumo de oxigênio o u da produção de H 2 0 2
também são confiáveis. Não se utilizam para a urina os procedi-
mentos com glicose oxidase que incluem a reação da H 2 0 2 -pero-
xidase.
Intervalos de Referência
Embora a determinação da glicose seja feita por vários procedi-
mentos analíticos diferentes, os intervalos de referência não
variam significativamente entre os métodos. Os seguintes valores
são representativos das determinações de glicose:
Não há diferença entre os sexos. As concentrações de
glicose plasmática a u m e n t a m com a idade — as concentrações
da glicose de jejum aumentam aproximadamente 2 m g / d L por
década; concentrações pós-prandiais a u m e n t a m em 4 m g / d L
por década; e concentrações após u m a carga de glicose aumen-
t a m em 8 a 13 m g / d L por década.
As concentrações de glicose no CSF devem ser aproximada-
mente 60% das concentrações do plasma e devem sempre ser
comparadas com a glicose plasmática concomitantemente medida
para uma interpretação clínica adequada.
C o r p o s C e t ô n i c o s no Soro
N e n h u m dos métodos comumente utilizados para a detecção e
determinação de corpos cetônicos n o soro ou na u r i n a
reagem com todos os três corpos cetônicos. O teste do cloreto
férrico de Gerhardt reage somente com o acetoacetato. Os testes
que utilizam nitroprussiato são pelo menos 10 vezes mais sensí-
veis ao acetoacetato do que à acetona e não reagem com o p-
hidroxibutirato. Portanto, a maioria dos testes a serem descritos
detecta essencialmente ou mede somente o acetoacetato. Pode
ocorrer uma situação paradoxal. Q u a n d o se detecta inicialmente
404 PARTE IV Analitos
u m a cetoacidose e m u m indivíduo, o teste para detecção d e
cetonas p o d e ser f r a c a m e n t e positivo. C o m terapia, o 3-hidroxi-
b u t i r a t o é c o n v e r t i d o em acetoacetato e a cetose piora. O s testes
tradicionais p a r a detecção d e P-hidroxibutirato são indiretos e
precisam de u m a fervura breve da urina p a r a a r e m o ç ã o de
acetona e de acetoacetato p o r evaporação (com u m a conversão
inicia] e s p o n t â n e a d o acetoacetato em acetona), seguido p o r
oxidação leve d o P-hidroxibutirato em acetoacetato e em acetona
c o m p e r ó x i d o , íons férricos e b i c r o m a t o . O acetoacetato f o r m a d o ,
p o r t a n t o , p o d e ser d e t e c t a d o c o m o teste de G e r h a r d t o u u m
dos p r o c e d i m e n t o s q u e utilizam n i t r o p r u s s i a t o (ver a discussão
adiante). Está disponível c o m e r c i a l m e n t e u m ensaio enzimático
para P-hidroxibutirato s a n g u í n e o ou u r i n á r i o .
Determinação de Corpos Cetônicos no Soro
D e f o r m a geral, os testes descritos a n t e r i o r m e n t e n ã o são utili-
zados c o m o testes de rotina. O s testes s e m i q u a n t i t a t i v o s utiliza-
dos c o m mais f r e q ü ê n c i a , o Acetest e o Keto-Diastix, d e p e n d e m
da reação c o m o n i t r o p r u s s i a t o e são insensíveis ao p-hidroxibu-
tirato. P o r t a n t o , é i m p o r t a n t e l e m b r a r q u e u m teste de nitro-
prussiato negativo n ã o descarta cetoacidose.
Acetest
O s c o m p r i m i d o s d e Acetesr c o n t ê m u m a mistura d e glicina,
n i t r o p r u s s i a t o d e sódio, fosfato d e sódio e lactose. O acetoace-
tato o u a acetona (em m e n o r extensão) n a presença de glicina
f o r m a m u m complexo lilás c o m o n i t r o p r u s s i a t o . O P-hidroxi-
b u t i r a t o n ã o reage c o m o n i t r o p r u s s i a t o . O fosfato de sódio cria
u m p H ó t i m o p a r a a reação, e a lactose a u m e n t a a coloração.
Para mais detalhes sobre o p r o c e d i m e n t o d e t a l h a d o para a
detecção dos c o r p o s cetônicos pelo Acetest, ver as instruções
fornecidas pelo f a b r i c a n t e e m cada e m b a l a g e m de c o m p r i m i d o s .
A p ó s a adição d e u m a gota de u r i n a , soro o u sangue, a cor
aparece e m 3 0 segundos, 2 m i n u t o s ou 10 m i n u t o s , respectiva-
m e n t e . O Acetest serve p r i n c i p a l m e n t e para a detecção d e c o r p o s
cetônicos na u r i n a . Se for utilizado soro, os c o m p r i m i d o s devem
ser t r i t u r a d o s e u m a gota d e soro deve ser a d i c i o n a d a ao p ó .
C a s o esse p r o c e d i m e n t o n ã o seja seguido, obtêm-se resultados
c o m valores f a l s a m e n t e baixos. Devem-se fazer controles negati-
vos e positivos. Esse p r o c e d i m e n t o é mais confiável d o q u e o
m é t o d o d o Ketostix.
U m a reação positiva ( a p a r e c i m e n t o d e cor lilás) indica a
presença d e corpos cetônicos na c o n c e n t r a ç ã o igual ou m a i o r
q u e .5 m g / d L (0,5 m m o l / L ) para u r i n a e 10 m g / d L para sangue.
Utiliza-se u m a tabela d e cores fornecida na e m b a l a g e m para
estimar as c o n c e n t r a ç õ e s reais d e corpos cetônicos. Faz-se a semi-
q u a n t i f i c a ç ã o através dos valores a p r o x i m a d o s atribuídos aos
blocos d e cores, c o m 20 m g / d L (2 m m o l / L ) paia "pequeno", 30
a 40 m g / d L para " m o d e r a d o " e 80 a 100 m g / d L para "grande".
Se necessário, podem-se pTeparar diluições d o soro com salina para
medir as concentrações de corpos cetônicos acima de 80 m g / d L .
(Observe q u e q u a l q u e r diluição c o m salina i n t r o d u z erro já q u e
a reação é afetada p o r proteínas). As c e t o n a s n ã o são detectadas
n o sangue o u n a urina e m i n d i v í d u o s c o m m e t a b o l i s m o d e
carboidTatos n o r m a l .
Ketostix
O Ketostix é u m a m o d i f i c a ç ã o d o teste de nitroprussiato n o qual
se utiliza u m a tira d e reagente e m vez de c o m p r i m i d o . O teste d o
Ketostix fornece u m a reação positiva e m 15 segundos em u m a
amostra c o n t e n d o pelo m e n o s 5 0 mg d e acetoacetato p o r litro.
A tabela d e cores q u e a c o m p a n h a o teste f o r n e c e leituras para
concentrações de cetonas d e 50, 150, 400, 8 0 0 e 1.600 m g / L . A
acetona t a m b é m reage, mas a sensibilidade é m e n o r .
Determinação de P-hidroxib u tira to
Nesse teste, o P-hidroxibutirato n a presença d e N A D + é conver-
t i d o pela p-hidroxibutirato desidrogenase e m acetoacetato, pro-
d u z i n d o N A D H q u e p o d e ser m e d i d a em u m a v a r i e d a d e d e
f o r m a s . E m u m a i m p l e m e n t a ç ã o , a diaforase catalisa a r e d u ç ã o
d o nitroazul d e tetrazólio (NBT) p e l o N A D H p a r a produzir u m
c o m p o s t o roxo, e sua absorvãncia é lida e m u m m e d i d o r especial
q u e fornece u m a leitura digital.
O s valores de p-hidroxibutirato variam de 0,02 a 0,27 m m o l / L
(0,21 a 2,81 m g / d L ) em indivíduos sadios após u m j e j u m n o t u r n o .
O s corpos cetônicos n o sangue p o d e m chegar a 2,0 m m o l / L c o m
u m exercício p r o l o n g a d o .
Determinação dos Corpos Cetônicos na Urina
O Acetest e o Ketostix t a m b é m são a p r o p r i a d o s para a detecção
d e c o r p o s cetônicos na urina. A sensibilidade e a especificidade
dos testes são as m e s m a s descritas para o soro.
O teste de G e r h a r d t baseia-se n a reação d o cloreto férrico
c o m acetoacetato, p r o d u z i n d o u m a cor v er mel h o -v in h o . O teste
é inespecíficOj e outros c o m p o n e n t e s , c o m o salicilatos, f e n o l e
antipirina, geram a m e s m a cor; portanto, u m a reação positiva
sinaliza somente u m a possível presença d e acetoacetato. Para
c o n f i r m a r sua presença, aquece-se a urina para d e c o m p o r o
acetoacetato em acetona e remover a acetona. Repete-se, e n t ã o ,
o teste. Se agora o resultado for negativo, pode-se atribuir a
coloração original c o m o presença d e acetoacetato. Esse teste foi
s u b s t i t u í d o pelos p r o c e d i m e n t o s d o Acetest e d o Ketostix.
L a c t a t o e Piruvato
A d o s a g e m d o p i r u v a t o é útil n a avaliação de pacientes c o m erros
inatos d o m e t a b o l i s m o cujas c o n c e n t r a ç õ e s d e lactato sérico
a u m e n t a r a m . U m a p r o p o r ç ã o d e lactato para p i r u v a t o m e n o r
d o q u e 25 sugere u m defeito n a gliconeogênese, e n q u a n t o u m
a u m e n t o nessa p r o p o r ç ã o (>35) i n d i c a condições intracelulares
reduzidas e n c o n t r a d a s na hipoxia. O s erros inatos associados a
u m a p r o p o r ç ã o l a c t a t o / p i r u v a t o elevada i n c l u e m deficiência d e
p i r u v a t o carboxilase e defeitos n a fosforilação oxidativa. O piru-
vato t a m b é m é m e d i d o e m estudos clínicos q u e avaliam reper-
f u s ã o após i s q u e m i a miocárdica.
Determinação de Lactato em Sangue Total
O lactato é o x i d a d o em p i r u v a t o pela lactato desidrogenase na
presença de N A D + . O N A D H f o r m a d o nessa reação é m e d i d o
e s p e c t r o f o t o m e t r i c a m e n t e e m 3 4 0 n m e serve c o m o u m a m e d i d a
da c o n c e n t r a ç ã o de lactato:
Lactato desidrogenase
p H 9,0 - 9,6
L-Lactato ^ P i r u v a t o
/ \
NAD® NADH + H®
O equilíbrio da reação t e n d e n o r m a l m e n t e p a r a a esquerda.
PoTém, através d o t a m p o n a m e n t o d o p H e n t r e 9,0 e 9,6, da
adição d e u m excesso d e N A D ' e da captura d o p i r u v a t o pela
hidrazina, o equilíbrio p o d e ser m u d a d o para a direita. O piru-
vato t a m b é m p o d e ser r e m o v i d o através da reação c o m L-gluta-
m a t o na presença d e alanina a m i n o t r a n s f e r a s e .
Por causa de sua alta especificidade e simplicidade, o m é t o d o
enzimático é o m é t o d o d e escolha para a dosagem d o lactato,
e m b o r a outros métodos t a m b é m possam sei utilizados (p.ex., cro-
matografia a gás e fotometria).
O analisador Vitros, antigo E k t a c h e m , utiliza u m ensaio n o
qual o ácido láctico é o x i d a d o e m pLruvato pela lactato oxidase.
O H I 0 2 gerado oxida o c r o m ó g e n o d o sistema, e a absorvãncia

d o c o m p l e x o c o l o r i d o resultante, m e d i d o e s p e c t r o f o t o m e t r i c a -
mente em 540 n m , é diretamente proporcional à concentração
d e l a c t a t o n a a m o s t r a . C a d a m o l d e lactato q u e é o x i d a d o p r o d u z
0,5 m o l d e c o m p l e x o colorido.
Coleta e Armazenamento de Amostras
S ã o necessárias técnicas estritas de p r e p a r a ç ã o e m a n u s e i o de
a m o s t r a s para i m p e d i r alterações n a s c o n c e n t r a ç õ e s d e lactato
d u r a n t e e a p ó s a coleta de sangue. O s p a c i e n t e s d e v e m estar e m
j e j u m e e m r e p o u s o c o m p l e t o p o r p e l o m e n o s 2 h o r a s p a r a as
c o n c e n t r a ç õ e s d e lactato a l c a n ç a r e m o estado de equilíbrio dinâ-
mico.
As a m o s t r a s v e n o s a s devem ser o b t i d a s s e m a utilização d e
t o r n i q u e t e s o u i m e d i a t a m e n t e a p ó s a aplicação de u m torni-
q u e t e . A l t e r n a t i v a m e n t e , o t o r n i q u e t e deve ser r e m o v i d o a p ó s a
realização da p e r f u r a ç ã o , e deve-se deixar q u e o s a n g u e f l u a p o r
vários m i n u t o s a n t e s d e a a m o s t r a ser coletada. T a m b é m se p o d e
coletai" s a n g u e arterial p a r a evitar esses p r o b l e m a s . O s p a c i e n t e s
d e v e m evitar realizaT exercícios c o m a m ã o o u c o m o b r a ç o
imediatamente antes e durante o procedimento.
Pode-se coletar t a n t o sangue v e n o s o q u a n t o arterial e m serin-
gas c o m h e p a r i n a , e o sangue deve ser i m e d i a t a m e n t e c o l o c a d o
e m u m a q u a n t i d a d e p r é - m e d i d a d e p r e c i p i t a n t e p r o t é i c o gelado,
c o m o á c i d o tricloroacético, ácido m e t a f o s f ó r i c o ou ácido percló-
rico. O s o b r e n a d a n t e t r a n s p a r e n t e , após a c e n t r i f u g a ç ã o , é
estável e m 4 ° C por até 8 dias. E necessária m u i t a a t e n ç ã o para
a p r e p a r a ç ã o d a a m o s t r a . Se o s a n g u e n ã o for p r o c e s s a d o dessa
f o r m a , o c o r r e u m r á p i d o a u m e n t o d o l a c t a t o n o sangue c o m o
r e s u l t a d o d a glicólise. Esse a u m e n t o é de 2 0 % e m 3 m i n u t o s e
7 0 % e m 30 m i n u t o s e m 2 5 ° C . As a m o s t r a s coletadas d a f o r m a
descrita nessa seção t a m b é m são a p r o p r i a d a s p a r a a d e t e r m i n a -
ção d o pÍTUvato.
Se for necessária u m a a m o s t r a de p l a s m a , deve-se coletar
s a n g u e e m u m t u b o c o n t e n d o 10 m g de N a F e 2 m g d e K 2 C 2 0 ^
p o r mililitro d e sangue. A a m o s t r a deve ser i m e d i a t a m e n t e res-
friada, e as células, separadas e m até 15 m i n u t o s . Q u a n d o o
p l a s m a é s e p a r a d o das células, o l a c t a t o fica estável.
Intervalos de Referência
O s intervalos d e r e f e r ê n c i a para o lactato são:
LACTATO
Amostra mmol/L mg/dL
SANGUE VENOSO
Em repouso 0,5 a 1,3 5 a 12
No hospital 0,9 a 1,7 8 a 15
SANGUE ARTERIAL
Em repouso 0 , 3 6 a 0,75 3 a 7
No hospital 0,36 a 1,25 3 a 11
O s i n d i v í d u o s n o h o s p i t a l a p r e s e n t a m u m a ampla variação
de valores. O c o r r e acidose láctica c o m as c o n c e n t r a ç õ e s d e
lactato s a n g u í n e o acima d e 5 m m o l / L (45 m g / d L ) . O exercício
severo a u m e n t a d r a m a t i c a m e n t e as c o n c e n t r a ç õ e s de lactato, e
m e s m o o m o v i m e n t o d o s m ú s c u l o s da p e r n a pelos i n d i v í d u o s
e m r e p o u s o n o leito p o d e resultar e m a u m e n t o significativo. O
valor p l a s m á t i c o é cerca de 7 % m a i o r d o q u e n o sangue total,
e m b o r a essa d i f e r e n ç a d e p e n d a d o p r o c e d i m e n t o utilizado. O s
Carboidratos CAPÍTULO 2 2 405
valores n o C S F são g e r a l m e n t e s e m e l h a n t e s às c o n c e n t r a ç õ e s
sanguíneas, mas p o d e m m u d a T de f o r m a i n d e p e n d e n t e e m dis-
t ú r b i o s d o C N S . A diurese d e 24 h o r a s n o r m a l d e lactato é de
5,5 a 22 m m o l / d i a .
Determinação do Piruvato em Sangue Total
A reação envolvida n a d e t e r m i n a ç ã o d o p i r u v a t o é essencial-
m e n t e o reverso d a reação utilizada n a d e t e r m i n a ç ã o d o
lactato:
Lactato dásidrogenase
Piruvato == Lactato
/ \
NADH + H~ NAD
P r ó x i m o de u m p H 7,5, a c o n s t a n t e d e e q u i l í b r i o favorece a
reação para a direita. O m é t o d o é m u i t o específico e o 2-oxoglu-
tarato, o oxalacetato, o acetoacetato e o P - h i d r o x i b u t i r a t o n ã o
i n t e r f e r e m n o s m é t o d o s colorimétricos. O p i r u v a t o é extrema-
m e n t e instável n o sangue, e devem-se observar as m e s m a s pre-
cauções já d e t a l h a d a s n a p r e p a r a ç ã o d e a m o s t r a s para a determi-
n a ç ã o de lactato.
O sangue venoso em jejum, coletado q u a n d o o indivíduo
está e m r e p o u s o , tem u m a c o n c e n t r a ç ã o de p i r u v a t o de 0,03 a
0,10 m m o l / L (0,3 a 0 , 9 m g / d L ) . O s a n g u e arterial c o n t é m 0 , 0 2
a 0 , 0 8 m m o l / L (0,2 a 0,7 m g / d L ) . O s valores p a r a o C S F são
0 , 0 6 a 0,19 m m o l / L (0,5 a 1,7 m g / d L ) . A diurese d e p i r u v a t o é
n o r m a l m e n t e m e n o r ou igual a 1 m m o l / d i a . Poucas indicações
clínicas g a r a n t e m a d e t e r m i n a ç ã o das c o n c e n t r a ç õ e s plasmáticas
o u u r i n á r i a s de p i r u v a t o .
Proteínas Glicadas
A dosagem de p r o t e í n a s glicadas, p r i m a r i a m e n t e G H b , é eficaz
n o m o n i t o r a m e n t o d o c o n t r o l e de glicose a l o n g o prazo e m
pessoas c o m diabetes mellitus Ela f o r n e c e u m í n d i c e retrospectivo
d o s valores i n t e g r a d o s d a glicose plasmática ao longo d e u m
p e r í o d o m a i o r d e t e m p o e n ã o está sujeita às a m p l a s f l u t u a ç õ e s
observadas q u a n d o se d e t e r m i n a m as c o n c e n t r a ç õ e s de glicose
s a n g u í n e a . A d e t e r m i n a ç ã o das c o n c e n t r a ç õ e s de G H b , por-
t a n t o , é u m teste a d j u n t o valioso a m p l a m e n t e utilizado p a r a a
d e t e r m i n a ç ã o d a glicose s a n g u i n e a para o m o n i t o r a m e n t o d o
c o n t r o l e glicêmico a l o n g o prazo. A l é m disso, a G H b é u m a
m e d i d a d o risco para o d e s e n v o l v i m e n t o de complicações d o
diabetes.
Métodos para a Determinação de Hemoglobinas
Glicadas
H á mais d e 30 m é t o d o s d i f e r e n t e s p a r a a d e t e r m i n a ç ã o d e
G H b s . Esses m é t o d o s d i s t i n g u e m a h e m o g l o b i n a d a G H b c o m
a utilização de técnicas baseadas e m diferenças de carga (cromato-
grafia de troca iônica, H P L C , eletroforese e isoeletrofocalização),
diferenças estruturais ( c r o m a t o g r a f i a d e a f i n i d a d e e i m u n o e n s a i o ) ,
análi se química ( f o t o m e t r i a e espectro f o t o m e t r i a ) ou massa (espec-
trometria d e massa). I n d e p e n d e n t e m e n t e d o m é t o d o , o resul-
t a d o é expresso e m p o r c e n t a g e m de h e m o g l o b i n a total. A seleção
d o m é t o d o p o r u m l a b o r a t ó r i o é i n f l u e n c i a d a p o r vários fatores,
i n c l u i n d o (1) v o l u m e d a a m o s t r a , (2) p o p u l a ç ã o d e pacientes e
(3) custo. Aconselha-se c o n s u l t a r os clínicos nesse processo. A
A D A r e c o m e n d a q u e os l a b o r a t ó r i o s utilizem s o m e n t e ensaios
de G H b c e r t i f i c a d o s p e l o N a t i o n a l G l y c o h e m o g l o b i n S t a n d a r d i -
zation P r o g r a m (agora c o n h e c i d o c o m o N G S P ) c o m o traçadores
de D C C T . 1 , 7 1 3
406 PARTE IV Analitos
Q u a s e t o d o s os l a b o r a t ó r i o s n o s Estados U n i d o s utilizam
a t u a l m e n t e i m u n o e n s a i o o u c r o m a t o g r a f i a de troca iônica.
M é t o d o s mais antigos, c o m o c r o m a t o g r a f i a p o r a f i n i d a d e , ele-
troforese e isoeletrofocalização, p r a t i c a m e n t e d e s a p a r e c e r a m .
N o v e n t a e n o v e p o r c e n t o d o s l a b o r a t ó r i o s relatam a H b Ai c .
Minicolunas de Troca Iônica
A c r o m a t o g r a f i a de troca iônica separa as variantes d e hemoglo-
b i n a c o m base n a carga ( C a p í t u l o 7). A resina de troca catiônica
(carregada n e g a t i v a m e n t e ) , e m p a c o t a d a e m u m a m i n i c o l u n a des-
cartável, t e m a f i n i d a d e pela h e m o g l o b i n a , q u e é p o s i t i v a m e n t e
carregada. A a m o s t r a d o p a c i e n t e é h e m o l i s a d a , e aplica-se u m a
a l í q u o t a d o h e m o l í s a d o n a c o l u n a . Aplica-se u m t a m p ã o e coleta-
se o eluente. A s G H b s — A t a + A ^ + A l c 1 expressas coletivamente
c o m o H b Ai — são m e d i d a s e m u m e s p e c t r o f o t ô m e t r o . A d i c i o n a -
se n a c o l u n a , e n t ã o , u m s e g u n d o t a m p ã o c o m força iônica
d i f e r e n t e p a r a eluir a f r a ç ã o de h e m o g l o b i n a p r i n c i p a l mais
p o s i t i v a m e n t e carregada. Essa fração é lida em u m espectrofotô-
metro, e a G H b é expressa e m p o r c e n t a g e m d e h e m o g l o b i n a
total. A l t e r n a t i v a m e n t e , elui-se s o m e n t e a H b A j e faz-se u m a
diluição s e p a r a d a d o h e m o l i s a d o original, ao qual a H b A ( é
comparada.
E m todos os m é t o d o s q u e utilizam c o l u n a d e troca iônica, é
i m p o r t a n t e controlar a temperatura dos reagem&s e das colunas p a r a
a o b t e n ç ã o d e resultados a c u r a d o s e reprodutíveis; a termostati-
zação é a técnica p r e f e r e n c i a l p a r a c o n t r o l a r a t e m p e r a t u r a das
c o l u n a s . A l t e r n a t i v a m e n t e , pode-se aplicar u m f a t o r d e correção
d e t e m p e r a t u r a se a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e diferir d a tempera-
tura ó t i m a especificada. A l é m disso, deve-se m a n t e r u m c o n t r o l e
rígido d o p H e d a força iônica. As c o n d i ç õ e s de a r m a z e n a m e n t o
da a m o s t r a t a m b é m são i m p o r t a n t e s .
As frações lábeis d a p r é - H b A j e l u e m c o m c e t o a m i n a s está-
veis e p r o d u z e m valores f a l s a m e n t e altos, ao m e n o s q u e essas
c e t o a m i n a s s e j a m d e s t r u í d a s p o r p r é - t r a t a m e n t o d o s glóbulos
v e r m e l h o s . Valores f a l s a m e n t e elevados t a m b é m a p a r e c e m
q u a n d o a carga d a h e m o g l o b i n a é alterada pela ligação d e com-
p o n e n t e s n ã o c a r b o i d r a t o s q u e p o d e m ser co-cromatografados
c o m as G H b s , c o m o n a u r e m i a ( h e m o g l o b i n a carbamilada),
alcoolismo, e n v e n e n a m e n t o p o r c h u m b o o u t r a t a m e n t o c r ô n i c o
c o m altas doses de aspirina ( h e m o g l o b i n a acetilada). A s variantes
d a h e m o g l o b i n a o u as h e m o g l o b i n a s q u i m i c a m e n t e m o d i f i c a d a s
que eluem s e p a r a d a m e n t e da H b A e da H b Alc têm p o u c o
efeito s o b r e as d o s a g e n s d a H b Ai c . Se n ã o for possível s e p a r a r
a h e m o g l o b i n a m o d i f i c a d a (ou seu d e r i v a d o glicado) d a H b A
ou da H b A l c , s e r ã o o b t i d o s r e s u l t a d o s e r r o n e a m e n t e elevados
ou r e d u z i d o s . 3 U m a v a r i a n t e que elui c o m a H b A t c p r o d u z i r á
u m a s u p e r e s t i m a t i v a grosseira d a H b A ] c , e u m a v a r i a n t e q u e
elui c o m a H b A s u b e s t i m a r á a H b Ai e . O b s e r v e q u e u m a ú n i c a
v a r i a n t e d a H b p o d e elevar o u d i m i n u i r f a l s a m e n t e a H b A ] c ,
d e p e n d e n d o d o m é t o d o utilizado. 3
HPLC
A H b Ai e e outras frações de h e m o g l o b i n a são separadas p o r
H P L C c o m c o lu n a s de troca catiônica. Estão disponíveis vários
sistemas c o m p l e t a m e n t e a u t o m a t i z a d o s . O s ensaios precisam
s o m e n t e de 5 p L de sangue total, e as a m o s t r a s de p o n t a de d e d o
p o d e m ser coletadas e m u m t u b o capilar para análise. Dilui-se o
sangue a n t i c o a g u l a d o c o m u m reagente h e m o l í t i c o c o n t e n d o
borato. As amostras são i n c u b a d a s e m 3 7 ° C p o r 30 m i n u t o s para
r e m o ç ã o da base de Schiff e depois inseridas n o a u t o - a m o s t r a d o r
(Alguns i n s t r u m e n t o s têm u m a etapa mais curta de pré-incuba-
ção e ourros s e p a r a m a A j c lábil c r o m a t o g r a f i c a m e n t e , elimi-
n a n d o a etapa de r e m o ç ã o d a base d e Schiff). Passa-se pela c o l u n a
u m g r a d i e n t e seqüencial d e três t a m p õ e s fosfato c o m forças
iónicas crescentes. A detecção é realizada e m 415 e 6 9 0 n m , e os
resultados são q u a n t i f i c a d o s integrando-se a área sob os picos.
O t e m p o de análise é mais c u r t o d o q u e 3 a 5 m i n u t o s . Todos
os m é t o d o s de H P L C tiveram C V s m e n o r e s que 3 , 5 % e m u m a
avaliação da C A P e m 2003. Utilizou-se o H P L C d a H h A | c para
a análise d e todas as amostras dos pacientes n o D C C T e n o
UKPDS.
Imunoensaio
F o r a m desenvolvidos ensaios p a r a a H b A j c c o m a utilização de
a n t i c o r p o s c o n t r a o p r o d u t o de A m a d o r i d a glicose (ceroamina)
mais os p r i m e i r o s ( q u a t r o a oito) a m i n o á c i d o s n a e x t r e m i d a d e
N-terminal d a cadeia P d a h e m o g l o b i n a . U m e n s a i o a m p l a m e n t e
utilizado m e d e a H b A i c e m s a n g u e rotal através da inibição da
aglutinação d o látex. O a g l u t i n a d o r , u m p o l í m e r o sintético q u e
c o n t é m m ú l t i p l a s cópias d a p o r ç ã o i m u n o r r e a t i v a d a H b A I c ,
liga-se ao a n t i c o r p o m o n o c l o n a l a n t i - H b A l c q u e fica ligado às
esferas de látex. Essa a g l u t i n a ç ã o p r o d u z e s p a l h a m e n t o de luz
q u e é m e d i d o c o m o u m a u m e n t o n a absorvãncia. A H b A l c n a
a m o s t r a d o p a c i e n t e c o m p e t e p e l o a n t i c o r p o n o látex, i n i b i n d o
a aglutinação e d i m i n u i n d o , p o r t a n t o , o e s p a l h a m e n t o d a luz.
I m u n o e n s a i o s enzimáticos q u e utilizam a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s
estão disponíveis c o m e r c i a l m e n t e . Esses ensaios são precisos e
f o r n e c e m r e s u l t a d o s q u e se c o r r e l a c i o n a m c o m os resultados d o
H P L C . O s a n t i c o r p o s n ã o r e c o n h e c e m os i n t e r m e d i á r i o s lábeis
o u outras G H b s ( c o m o H b A I a o u H b A ^ ) p o r q u e a c e t o a m i n a
c o m a glicose e as s e q u ê n c i a s especificas d e a m i n o á c i d o s são
necessárias p a r a a ligação. D e f o r m a s e m e l h a n t e , outras variantes
d a h e m o g l o b i n a , c o m o a H b F, a H b A?, a H b S e a h e m o g l o b i n a
c a r b a m i l a d a n ã o são detectadas. 3 O p r o c e d i m e n t o foi a d a p t a d o
p a r a amostras d e s a n g u e capilar c o m a utilização de u m analisa-
d o r d e b a n c a d a c o m c a r t u c h o s de reagentes designados para
utilização e m l a b o r a t ó r i o s de c o n s u l t ó r i o s m é d i c o s .
Cromatografia de Afinidade
A s colunas d e gel de a f i n i d a d e são utilizadas p a i a separar a G H b ,
q u e se liga ao ácido m - a m i n o f e n i l b o r ô n i c o n a c o l u n a , da fração
n ã o glicada. Depois, adiciona-se sorbitol p a r a eluir a G H b . As
absorvâncias das frações ligadas e n ã o ligadas, m e d i d a s e m 415 n m ,
são utilizadas para calcular a p o r c e n t a g e m d e G H b . Essa técnica
n ã o sofre i n t e r f e r ê n c i a das h e m o g l o b i n a s n ã o glicadas e s o f r e
u m a i n t e r f e r ê n c i a desprezível d a f o r m a i n t e r m e d i á r i a lábil d a H b
A l c . Essa técnica n ã o é a f e t a d a por variações n a t e m p e r a t u r a e
possui u m a precisão aceitável. As variantes da h e m o g l o b i n a ,
c o m o a H b F, a H b S o u a H b C , p r o d u z e m p o u c o efeito. O s
m é t o d o s de a f i n i d a d e m e d e m a G H b total, i n c l u i n d o c o m p o n e n -
tes diferentes d a H b A ] c . pois esses ensaios d e t e c t a m as estrutu-
ras das c e t o a m i n a s n o s r e s í d u o s d e lisina e valina e m a m b a s as
cadeias a e P d a h e m o g l o b i n a . Alguns sistemas disponíveis comer-
cialmente são calibrados t a m b é m para d e t e r m i n a r u m valor
p a d r o n i z a d o d e H b Ai c . E m b o r a a m p l a m e n t e utilizado anterior-
m e n t e , p o u c o s l a b o r a t ó r i o s utilizam a c r o m a t o g r a f i a d e afini-
dade atualmente.
Remoção da Hemoglobina Glicada Lábil dos
Glóbulos Vermelhos
A c o n c e n t r a ç ã o d a f o r m a lábil d e H b A l c ( b a s e de Schiff) f l u t u a
r a p i d a m e n t e e m r e p o s t a às m u d a n ç a s agudas n a s c o n c e n t r a ç õ e s
d e glicose plasmática e deve ser r e m o v i d a antes d a realização de
ensaios c o m base e m carga. Essa r e m o ç ã o p o d e ser feita através
d a i n c u b a ç ã o d o s glóbulos v e r m e l h o s e m soluções salinas ou
t a m p ã o e m p H 5 a 6 ou através d e diálise o u ultrafiltração dos
h e m o l i s a d o s . A m a i o r i a d o s kits p a r a ensaios de c o l u n a c o n t é m
reagentes q u e r e m o v e m esse c o m p o n e n t e lábil.

Padronização do Ensaio
O s laboratórios clínicos m e d e m a G H b através de vários ensaios
que utilizam múltiplos m é t o d o s e quantificam diferentes compo-
nentes. O s resultados do D C C T acentuaram a necessidade d e u m a
determinação acurada da G H b e forneceram u m forte í m p e t o para
a padronização dos ensaios de G H b . N o final d o D C C T , observou-
se que a ausência t a n t o de u m m é t o d o de referência q u a n t o d e u m
p a d i ã o ú n i c o de G H b t i n h a gerado confusão. N ã o foi possível
realizar a comparação entre laboratórios, e m e s m o u m a única
amostra de controle de qualidade analisada p o r u m único m é t o d o
teve C V s maiores do q u e 16,5%. T a m b é m se observou u m a g r a n d e
variabilidade entre laboratórios n a E u r o p a . C o m i t ê s para padroni-
zar os ensaios de G H b foram d e t e r m i n a d o s sob a orientação d a
A m e r i c a n Association for Clinicai Chemi s t ry (AACC) e da I F C C .
O N G S P ( h t t p : / / w w w . n g s p org) foi i m p l e m e n t a d o e m 1996
para calibrar os resultados da G H b de a c o r d o c o m valores equi-
valentes aos d o D C C T . E m p r e g a n d o u m a r e d e de l a b o r a t ó r i o s
d e referência, o N G S P interage c o m os fabricantes dos m é t o d o s de
detecção da G H b p a r a ajudá-los n a calibração dos seus m é t o d o s
e traçar os valores de a c o r d o c o m o D C C T . 8 O s f a b r i c a n t e s
c a n d i d a t a m - s e à certificação através d a realização d e testes d e
a c o r d o c o m as o r i e n t a ç õ e s da C L S I / N C C L S EP5-A e m o s t r a m
os resultados e m valores de A ] c equivalentes ao d o D C C T . Esse
esforço d e calibração m e l h o r o u m u i t o a h a r m o n i z a ç ã o d o s resul-
t a d o s e r e d u z i u as diferenças interlaboratoriais. 8 O s r e s u l t a d o s
o b t i d o s c o m os ensaios certificados pelo N G S P c o n c o r d a m
t a n t o c o m os resultados d o D C C T e d o U K P D S que até p o d e m
ser a l i n h a d o s c o m os d a d o s de r e s u l t a d o s clínicos desses e s t u d o s .
A A D A r e c o m e n d a q u e os l a b o r a t ó r i o s clínicos utilizem s o m e n t e
os ensaios c e r t i f i c a d o s p e l o N G S P e p a r t i c i p e m d o teste d e
proficiência o f e r e c i d o p e l o C A P . A avaliação do C A P - G H 2
utiliza a m o s t r a s a g r u p a d a s d e s a n g u e total e m três c o n c e n t r a ç õ e s
de G H b . O s valores a serem a t i n g i d o s são d e t e r m i n a d o s pela
r e d e d o N G S P . P o r t a n t o , os l a b o r a t ó r i o s individuais p o d e m
c o m p a r a r d i r e t a m e n t e seus r e s u l t a d o s de G H b com os resulta-
dos d o D C C T .
A I F C C a d o t o u u m m é t o d o d i f e r e n t e q u e gerou u m sistema
d e referência p a r a a p a d r o n i z a ç ã o c o m base n a H b Ai c . O g r u p o
d e t r a b a l h o d a I F C C desenvolveu u m a m i s t u r a de H b A j c e H b
Afl p u r i f i c a d a s c o m o material p r i m á r i o de referência. F o r a m
p r o p o s t o s c o m o c a n d i d a t a s a m é t o d o s de referência a espectro-
m e t r i a de m a s s a com ionização p o r eletrospray (ESI-MS) e a ele-
troforese capilar. Esses m é t o d o s m e d e m e s p e c i f i c a m e n t e a valina
glicada da região N - t e r m i n a l d a cadeia (3 d a h e m o g l o b i n a . A
análise é realizada através d a digestão d a m o l é c u l a d e h e m o g l o -
b i n a c o m a e n d o p r o t e i n a s e G l u - C , enzima q u e cliva a cadeia J3
e n t r e a Glu-6 e a Glu-7, l i b e r a n d o o h e x a p e p t i d e o N - t e r m i n a l .
O s h e x a p e p t í d e o s glicados e n ã o glicados são s e p a r a d o s e q u a n -
tificados p o r H P L C - E S I - M S o u p o r H P L O e l e t r o f o r e s e capilar.
A H b A ] c é m e d i d a c o m a p r o p o r ç ã o entre o hexapeptídeo N-ter-
m i n a l glicado e o n ã o glicado. Esse m é t o d o é t r a b a l h o s o e ina-
p r o p r i a d o p a r a a análise r o t i n e i r a de a m o s t r a s dos p a c i e n t e s . As
c o m p a r a ç õ e s e n t r e os m é t o d o s de referência da I F C C e d o
N G S P (e o u t r o s sistemas de referência, i n c l u i n d o os sistemas d o
J a p ã o e da Suécia) i n d i c a m u m a relação p r ó x i m a e estável.
P o r é m , os r e s u l t a d o s d a H b A j c o b t i d o s utilizando-se os m é t o d o s
de referência d a I F C C são 1 , 5 % a 2 % m e n o r e s (p.ex., 5 , 3 % <us.
7 % ) d o q u e os r e s u l t a d o s d o N G S P {e m e n o r e s do q u e os resul-
t a d o s de o u t r o s sistemas d e referência). U m a u n i f o r m i z a ç ã o
i n t e r n a c i o n a l p r o p o r c i o n a r i a o a l i n h a m e n t o m u n d i a l d o s resul-
tados d a d e t e r m i n a ç ã o d a G H b c o m os r e s u l t a d o s dos p a c i e n t e s
d o D C C T e d o U K P D S . Iniciou-se u m esforço global e n t r e clí-
nicos e l a b o r a t o r i s t a s p a r a a o b t e n ç ã o de u m c o n s e n s o interna-
cional e m c o m o reconciliar as d i f e r e n ç a s n o s valores d e H b A l c
Carboidratos CAPÍTULO 2 2 407
e n t r e os p r o g r a m a s d e p a d r o n i z a ç ã o , c o m o objetivo f i n a l de
m e l h o r a r o a t e n d i m e n t o ao paciente. 1 1
Coleta e Armazenamento da Amostra
O s pacientes n ã o precisam estar e m j e j u m . Deve-se coletar
sangue v e n o s o e m t u b o s c o m E D T A o u oxalato e f l u o r e t o . A
estabilidade da a m o s t r a d e p e n d e d o m é t o d o de ensaio. 1 3 O
s a n g u e total p o d e ser a r m a z e n a d o e m 4 ° C p o r até 1 s e m a n a .
A c i m a de 4°C, o a u m e n t o d a H b A í a + í l o c o r r e d e a c o r d o c o m o
t e m p o e a t e m p e r a t u r a , m a s a H b A l t é p o u c o afetada. N ã o se
r e c o m e n d a o a r m a z e n a m e n t o d a s amostras e m - 2 0 ° C . Para a
m a i o r i a d o s m é t o d o s , as a m o s t r a s de s a n g u e total a r m a z e n a d a s
e m - 7 0 ° C são estáveis p o r p e l o m e n o s 18 meses. Devem-se reali-
zar testes c o m a m o s t r a s h e p a r i n i z a d a s e m até 2 dias, e essas
a m o s t r a s p o d e m n ã o estar a p r o p r i a d a s p a r a alguns m é t o d o s de
análise (p.ex., elenroforese).
Intervalos de Referência
O s valores das G H b s são expressos e m p o r c e n t a g e m d a h e m o -
g l o b i n a s a n g u í n e a total. G e r a l m e n t e se m e d e u m a das três
p r i n c i p a i s f o r m a s d e G H b , isto é, H b Ai, H b Aj CJ o u de G H b
total. A t u a l m e n t e , n o s E s t a d o s U n i d o s , a g r a n d e m a i o r i a d o s
laboratórios m e d e a H b Alc. Os intervalos de referência variam
d e p e n d e n d o d o t i p o de G H b m e d i d a e se a f r a ç ã o lábil está
presente n o ensaio. O intervalo d e referência para a H b A l c é
de 4 % a 6%.
O s efeitos d a i d a d e sobre o s intervalos de referência são
controversos. A l g u n s e s t u d o s m o s t r a m elevações relacionadas à
idade ( ~ 0 , 1 % p o r d é c a d a após os 3 0 anos d e idade) e o u t r o s n ã o
m o s t r a m n e n h u m a elevação. O s r e s u l t a d o s n ã o são afetados p o r
d o e n ç a s agudas. As variabilidades intra-individual e diária são
m í n i m a s . E m pacientes c o m diabetes melíitus n ã o c o n t r o l a d o , os
valores p o d e m chegar a d u a s vezes o limite superior d o intervalo
d e referência, mas r a r a m e n t e e x c e d e m 15%. Valores maiores d o
q u e 15% r e q u e r e m estudos adicionais para investigar a possibili-
d a d e d a presença de u m a h e m o g l o b i n a v a r i a n t e / O b s e r v e q u e os
valores-flíw da A D A a d v i n d o s d o D C C T e d o U K P D S , e n ã o
os valores de referência n a p o p u l a ç ã o , são os valores utilizados
para a avaliação d o controle m e t a b ó l i c o e m pacientes.
N ã o h á u m valor específico de H b A ] c abaixo d o qual se
e l i m m a c o m p l e t a m e n t e o risco d e complicações diabéticas. A
A D A a f i r m a que o objetivo d o t r a t a m e n t o deve ser a m a n u t e n -
ção d a H b A k J m e d i d a de a c o r d o c o m os m é t o d o s certificados
pelo N G S P , abaixo d e 7%. (Algumas organizações r e c o m e n d a m
u m a H b AIc m e n o r q u e 6 , 5 % , e os valores p e l o m é t o d o d a I F C C
seriam m e n o r e s a i n d a ) . P o r t a n t o , os valores-alvo r e c o m e n d a d o s
pela A D A são aplicados s o m e n t e se o m é t o d o de ensaio for
certificado c o m o e q u i v a l e n t e à r e f e r ê n c i a d o D C C T . C a d a labo-
r a t ó r i o deve d e t e r m i n a r seu p r ó p r i o i n t e r v a l o de referência n ã o
diabético. A precisão d o ensaio é i m p o r t a n t e p o r q u e cada p o r
c e n t o d e m u d a n ç a n a H b A k (p.ex., d e 7 % p a r a 8 % ) r e p r e s e n t a
u m a alteração d e a p r o x i m a d a m e n t e 3 5 m g / d L n a glicose sanguí-
nea média.
N ã o h á c o n s e n s o sobre a m e l h o r f r e q u ê n c i a de realização d o
teste. A A D A r e c o m e n d a q u e a G H b deve ser monitorada rotineira-
mente pelo menos duas vezes por ano em pacientes que atingem os obje-
tivos do tratamento (e que possuem controle ghcêmico estável).1'1 Essas
r e c o m e n d a ç õ e s são para pacientes c o m diabetes tipo 1 ou tipo 2.
E m certas situações clínicas, p o r exemplo, q u a n d o os pacientes
n ã o atingem os objetivos d o t r a t a m e n t o o u q u a n d o h á m u d a n ç a
n a terapia, recomenda-se m o n i t o r a m e n t o a cada 3 meses.
408 PARTE IV Analitos
Frutosamina
E m pacientes c o m diabetes meüitus selecionados (p.ex., G D M o u
m u d a n ç a na terapia), p o d e haver a necessidade d a realização d e
ensaios mais sensíveis às alterações a c u r t o prazo nas c o n c e n t r a -
ções m é d i a s d e glicose s a n g u í n e a d o q u e os ensaios d e d e t e r m i -
n a ç ã o d e G I Ib. O c o r r e t a m b é m ligação n ã o enzimática d a glicose
aos g r u p o s a m i n a d e o u t r a s p r o t e í n a s além d a h e m o g l o b i n a
(p.ex., p r o t e í n a s séricas, p r o t e í n a s d e m e m b r a n a e d o cristalino).
C o m o as p r o t e í n a s séricas t ê m u m a taxa de r e n o v a ç ã o mais
r á p i d a d o q u e os eritrócitos (a meia-vida d a a l b u m i n a circulante
é d e cerca d e 2 0 diasj, a concentração da albumina sérica glicada
reflete o controle da glicose ao longo de um período de 2 a 3 semanas.
P o r t a n t o , as evidências de d e t e r i o r a ç ã o d o c o n t r o l e e d e m e l h o r a
c o m a t e r a p i a a p a r e c e m mais c e d o n a dosagem da f r u t o s a m i n a
d o q u e n o s e n s a i o s d e d e t e r m i n a ç ã o de G H b .
A /rutoiamina é o n o m e genérico para as cetoaminas. 7 , 1 3 O
n o m e se refere à e s t r u t u r a d o p r o d u t o d o r e a r r a n j o d a c e t o a m i n a
f o r m a d o pela i n t e r a ç ã o da glicose c o m o g r u p o e - a m i n o n o s
resíduos d e lisina d a a l b u m i n a . C o m o as dosagens d a G H b , as
d o s a g e n s d e f r u t o s a m i n a p o d e m ser utilizadas c o m o u m índice
d a c o n c e n t r a ç ã o m é d i a d e glicose s a n g u í n e a ao l o n g o d e u m
p e r í o d o d e t e m p o mais e x t e n s o ( p o r é m mais c u r t o q u e d a
GHb).
C o m o t o d a s as p r o t e í n a s séricas glicadas são f r u t o s a m i n a s e
a a l b u m i n a é a p r o t e í n a sérica mais a b u n d a n t e , acredita-se que
a determinação da frutosamina é u m a dosagem da a l b u m i n a
glicada, mas isso é q u e s t i o n a d o p o r alguns investigadores.
E m b o r a o e n s a i o d e d e t e r m i n a ç ã o d e f r u t o s a m i n a seja a u t o m a -
tizado e mais b a r a t o e mais r á p i d o d o q u e o e n s a i o de d e t e r m i -
n a ç ã o da G H b , há uma falta de consenso sobre sua utilidade
clínica.
Determinação da Frutosamina
O s m é t o d o s p a r a a q u a n t i f i c a ç ã o das p r o t e í n a s glicadas são (1)
c r o m a t o g r a f i a d e a f i n i d a d e c o m a utilização de ácido f e n i l b o r o -
n i c o i m o b i l i z a d o ( s e m e l h a n t e ao ensaio da G H b ) ; (2) H P L C de
resíduos de lisina glicada a p ó s hidrólise das p r o t e í n a s glicadas;
(3) u m p r o c e d i m e n t o f o t o m é t r i c o n o qual a hidrólise ácida suave
libera 5 - h i d r o x i m e t i l f u r f u r a l e d e p o i s se p r e c i p i t a m as p r o t e í n a s
c o m ácido rricloroacético e o s o b r e n a d a n t e reage c o m o ácido
2-tiobarbitúrico; e (4) o u t r o s p r o c e d i m e n t o s q u e utilizam fenili-
drazina e £-N-(2-furoilmetil)-L-lisina (furosina). N e n h u m desses
ensaios é p o p u l a r p o r q u e eles n ã o são a p r o p r i a d o s p a r a os labo-
ratórios clínicos de rotina. O d e s e n v o l v i m e n t o d e a n t i c o r p o s
m o n o c l o n a i s c o n t r a a a l b u m i n a glicada, e m b o r a t e o r i c a m e n t e
vantajoso, ainda n ã o resultou em u m a ampla disponibilidade de
ensaios de a l b u m i n a glicada comerciais. Deve-se o b s e r v a r q u e o
a r m a z e n a m e n t o p r o l o n g a d o e m t e m p e r a t u r a s ultrabaixas (-96°C)
i m p e d e a glícação m vitro das p r o t e í n a s séricas.
U m m é t o d o alternativo p a r a a d e t e r m i n a ç ã o de f r u t o s a m i n a
é u m a m o d i f i c a ç ã o d o m é t o d o original d e J o h n s o n e colabora-
dores. S o b c o n d i ç õ e s alcalinas, a f r u t o s a m i n a s o f r e u m r e a r r a n j o
d e A m a d o r i e o c o m p o s t o r e s u l t a n t e t e m u m a atividade r e d u t o r a
q u e p o d e ser d i f e r e n c i a d a d e o u t r a s substâncias r e d u t o r a s . N a
p r e s e n ç a d e t a m p ã o c a r b o n a t o , a f r u t o s a m i n a se r e a r r a n j a e m
u m a forma enólica que reduz o N B T e m formazam. Mede-se a
absorvãncia e m 530 n m e m dois m o m e n t o s e a m u d a n ç a de absor-
vãncia é p r o p o r c i o n a l à c o n c e n t r a ç ã o de f r u t o s a m i n a . E necessá-
ria u m a p r é - i n c u b a ç ã o de 10 m i n u t o s p a r a evitar a i n t e r f e r ê n c i a
d e s u b s t â n c i a s r e d u t o r a s q u e reagem r a p i d a m e n t e . O ensaio é
f a c i l m e n t e a u t o m a t i z a d o e t e m u m a precisão analítica e n t r e
a m o s t r a s excelente. A h e m o g l o b i n a (> 100 m g / d L ) e a b i l i r r u b i n a
(>4 m g / d L ) i n t e r f e r e m ; p o r t a n t o , n ã o se devem utilizar a m o s t r a s
m o d e r a d a m e n t e a i n t e n s a m e n t e h e m o l i s a d a s e a m o s t r a s ictéri-
cas. C o n c e n t r a ç õ e s d e á c i d o ascórbico m a i o r e s q u e 5 m g / d L
p o d e m causar i n t e r f e r ê n c i a negativa. M é t o d o s estão disponíveis
c o m e r c i a l m e n t e . Existe u m e n s a i o q u e m e d e a f r u t o s a m i n a
através da oxidação da c e t o a m i n a utilizando-se a e n z i m a cetoa-
m i n a oxidase c o m a l i b e r a ç ã o d e H ? 0 ? q u e é q u a n t i f i c a d o através
d e u m a reação f o t o m é t r i c a . U m dispositivo a p r o v a d o p e l o F D A
q u e utiliza u m m e d i d o r p o r t á t i l d e u s o d o m i c i l i a r p o r adultos
foi d e s c o n t i n u a d o .
Intervalos de Referência
O s valores e m u m a p o p u l a ç ã o n ã o diabética v a r i a m de 2 0 5 a
2 8 5 [ i m o l / L . O intervalo d e referência corrigido p a r a a l b u m i n a
é de 191 a 2 6 5 ( i m o l / L .
Produtos Finais de Glicação Avançada
O m e c a n i s m o m o l e c u l a r p e l o q u a l a hiperglicemia p r o d u z efeitos
tóxicos é d e s c o n h e c i d o , m a s a glicação d e p r o t e í n a s teciduais
p o d e ser i m p o r t a n t e . A ligação n ã o enzimática d a glicose às
moléculas d e longa d u r a ç ã o , c o m o o c o l á g e n o tecidual, gera
p r o d u t o s iniciais glicados estáveis de A m a d o r i . Esses p r o d u t o s
s o f r e m u m a série de r e a r r a n j o s adicionais, d e s i d r a t a ç ã o e reações
d e f r a g m e n t a ç ã o q u e r e s u l t a m e m p r o d u t o s f i n a i s d e glicação
a v a n ç a d a (AGE). A q u a n t i d a d e desses p r o d u t o s n ã o volta ao
n o r m a l q u a n d o se corrige a hiperglicemia, e eles se a c u m u l a m
c o n t i n u a m e n t e ao longo d o p e r í o d o d e d u r a ç ã o d a p r o t e í n a . A
hiperglicemia acelera a f o r m a ç ã o d e A G E s ligados à p r o t e í n a e
os pacientes c o m diabetes meílitus, p o r t a n t o , t ê m u m a q u a n t i d a d e
elevada de A G E s e m seus tecidos c o r p o r a i s . Através d o s efeitos
sobre as p r o p r i e d a d e s f u n d a m e n t a i s das p r o t e í n a s e da matriz
extracelular, os A G E s p o d e m c o n t r i b u i r p a r a a o c o r r ê n c i a de
complicações microvasculares e macrovas cu lares d o diabetes mellt-
tus. A l é m disso, foi d e m o n s t r a d o q u e u m i n i b i d o r d a f o r m a ç ã o
d e A G E s , a a m i n o g u a n i d i n a , p r e v i n e a o c o r r ê n c i a d e várias
complicações d o diabetes e m m o d e l o s a n i m a i s e x p e r i m e n t a i s e
está s e n d o e s t u d a d o e m p a c i e n t e s e m e s t u d o s clínicos.
Foram desenvolvidos vários ensaios para determinação de
AGEs. U m m é t o d o antigo, fluorescência relativa d e p e n d e n t e de A G E ,
sofria de contribuições espúrias n a fluorescência total p o r adutos
em proteínas não-AGE, c o m o produtos de oxidação gerados pela
glicose ou p o r lipídios que possuem espectros de fluorescência
semelhantes. Foi desenvolvido u m ensaio de Todiorreceptor que se
baseia na presença de receptores de A G E s n a superfície de u m a
linhagem celular tumoral semelhante aos macrófagos; esse ensaio é
capaz de quantificar os A G E s e m proteínas circulantes (albumina)
e teciduais. Foram produzidos anticorpos contra a h e m o c i a n i n a de
caramujo c o m glicação avançada e a l b u m i n a sérica bovina c o m
glicação avançada. Esses anticorpos reagem com várias proteínas
com glicação avançada. Foi desenvolvido u m ensaio imunoenzimá-
tico (ELISA) de competição c o m anticorpo policlonal anti-AGE
para mediT a hemoglobina c o m glicação avançada. Utilizando esse
ensaio, demonstrou-se u m a correlação linear entre a H b Ai c e a
hemoglobina com glicação avançada. E m pessoas sadias, a hemo-
globina com glicação avançada é responsável p o r 0 , 4 % da hemoglo-
b i n a circulante, com valores significativamente maiores e m pacien-
tes c o m diabetes meiíitus. A p ó s u m a alteração aguda na glicemia, as
concentrações da h e m o g l o b i n a m u d a m , mas a taxa de m u d a n ç a é
2 3 % m e n o r d o que a d a H b A]<:. Portanto, a hemoglobina com
glicação avançada fornece u m a m e d i d a d o controle diabético que
d u r a mais t e m p o que o controle d a G H b , refletindo as concentra-
ções de glicose sanguínea ao longo d e u m p e r í o d o maior da vida
dos glóbulos vermelhos. A i n d a n ã o se d e t e r m i n o u se o conheci-
m e n t o dos valores de hemoglobina-AGE oferece benefício clínico.

A l b u m i n a Urinária
O s i n d i v í d u o s c o m diabetes mellitus p o s s u e m risco elevado de
d e s e n v o l v i m e n t o d e lesão renal ( C a p í t u l o 34). A lesão renal
t e r m i n a l q u e r e q u e r diálise o u t r a n s p l a n t e desenvolve-se e m
a p r o x i m a d a m e n t e u m terço dos i n d i v í d u o s c o m diabetes t i p o 1,
e o d i a b e t e s é a causa mais c o m u m d e d i s f u n ç ã o r e n a l n o s
E s t a d o s U n i d o s e n a E u r o p a . E m b o r a a n e f r o p a t i a seja m e n o s
c o m u m e m i n d i v í d u o s c o m diabetes tipo 2, a p r o x i m a d a m e n t e
6 0 % d e t o d o s os casos de n e f r o p a t i a diabética o c o r r e m nessas
pessoas p o r causa da m a i o r i n c i d ê n c i a dessa f o r m a de diabetes.
A p r o t e i n ú r i a persistente detectável p o r testes rotineiros d e
triagem (equivalentes a u m a taxa de excreção urinária de albumina
[TJAEJ > 2 0 0 p,g/min) indica n e f r o p a t i a diabética de claros sin-
t o m a s . D e f o r m a geral, associa-se essa c o n d i ç ã o c o m u m a d o e n ç a
d e l o n g a d u r a ç ã o e é i n c o m u m sua o c o r r ê n c i a e m m e n o s d e 5
a n o s após o início d o diabetes t i p o 1. Q u a n d o o c o r r e n e f r o p a t i a
diabética, a f u n ç ã o renal deteriora-se r a p i d a m e n t e e o c o r r e evo-
lução da insuficiência renal. O t r a t a m e n t o nessa fase p o d e retar-
dar a taxa de progressão, m a s n ã o i n t e r r o m p e ou reverte a lesão
renal. A n t e s dessa fase, n ã o se d e t e c t a u m a U A E elevada p o r
m é t o d o s d e r o t i n a . Essa variação d e 2 0 a 2 0 0 \xg/minuto (ou 3 0
a 3 0 0 m g / 2 4 horas) de U A E elevada d e f i n e a ffiicroalbuminú-
ria. 1 3 O t e r m o microalbummúua, e m b o r a g e r a l m e n t e aceito, n ã o
é a p r o p r i a d o . Tal t e r m o implica u m a versão p e q u e n a d a molé-
cula d e a l b u m i n a e m vez de u m a taxa de excreção de a l b u m i n a
maior do que a normal, mas m e n o r do que a anteriormente
d e t e c t a d a . P o r t a n t o , e m b o r a o t e r m o esteja e r r a d o , ele é ampla-
m e n t e utilizado e p r o v a v e l m e n t e n ã o será s u b s t i t u í d o p o r alter-
nativas (p.ex., p a u c i a l b u m i n ú r i a ) . 1 3
A p r e s e n ç a d e U A E elevada i n d i c a u m a u m e n t o n a taxa de
escape transcapilar de a l b u m i n a e é, p o r t a n t o , u m m a r c a d o r de
d o e n ç a microvascular. U m a U A E m a i o r d o q u e 2 0 p g / m i n u t o
causa u m risco v i n t e vezes m a i o r de d e s e n v o l v i m e n t o de d o e n ç a
r e n a l c l i n i c a m e n t e o b s e r v a d o e m i n d i v í d u o s c o m diabetes tipo
1 e t i p o 2. E s t u d o s prospectivos d e m o n s t r a r a m q u e u m a U A E
elevada p r e c e d e e é a l t a m e n t e preditiva de (1) n e f r o p a t i a diabé-
tica, (2) d o e n ç a r e n a l t e r m i n a l e (3) r e t i n o p a t i a proliferativa e m
i n d i v í d u o s c o m diabetes t i p o 1. O c o n t r o l e estrito da glicemia
n a s diabetes t i p o 1 e tipo 2 retarda a progressão p a i a n e f r o p a t i a .
A l é m disso, u m a U A E elevada identifica u m g r u p o d e indiví-
d u o s n ã o diabéticos c o m risco elevado para o d e s e n v o l v i m e n t o
d e d o e n ç a arterial c o r o n á r i a . I n t e r v e n ç õ e s c o m o o c o n t r o l e da
p r e s s ã o s a n g u í n e a , p a r t i c u l a r m e n t e c o m i n i b i d o r e s da e n z i m a
c o n v e r s o r a d e a n g i o t e n s i n a (ACE), e o c o n t r o l e das c o n c e n t r a -
ções d e glicose s a n g u í n e a r e t a r d a m a taxa d e d e c l í n i o n a f u n ç ã o
renal.
Coleta e Armazenamento de Amostras
O m é t o d o p a r a a coleta d e u m a a m o s t r a de u r i n a p a r a a d o s a g e m
s u b s e q ü e n t e da a l b u m i n a u r i n á r i a é i m p o r t a n t e . A s variações n o
f l u x o u r i n á r i o e m u m a pessoa p o d e ser corrigida pela expressão
de a l b u m i n a e m relação à c r e a t i n i n a (isto é, a l b u m i n a / c r e a t i -
n i n a ) . O c o r r e elevação d a U A E p o r fatores fisiológicos (p.ex.,
exercício, p o s t u r a e diurese), e, p o r essa razão, deve-se p a d r o n i z a r
a coleta de u r i n a . N ã o se d e v e m coletar as a m o s t r a s (1) após
esforço, (2) n a p r e s e n ç a de infecção d o trato u r i n á r i o , (3) d u r a n t e
d o e n ç a aguda, (4) i m e d i a t a m e n t e após u m a cirurgia o u (5) após
u m a i n j e ç ã o aguda de f l u i d o . T o d a s as a m o s t r a s d e u r i n a seguin-
tes são a t u a l m e n t e aceitáveis:
1. C o l e t a de 24 h o r a s
2. C o l e t a n o t u r n a d e 8 a 12 h o r a s
3. C o l e t a de 1 a 2 h o r a s (em l a b o r a t ó r i o ou clínica).
4. P r i m e i r a a m o s t r a da m a n h ã para a d o s a g e m s i m u l t â n e a de
albumina e de creatinina.
Carboidratos CAPÍTULO 2 2 409
As a m o s t r a s n o t u r n a s de 8 a 12 h o r a s ou d e 24 h o r a s são as
mais sensíveis, m a s c o m o a razão e n t r e a a l b u m i n a e a c r e a t i n i n a
é mais prática e c o n v e n i e n t e p a r a o p a c i e n t e , r e c o m e n d a - s e a
utilização desse m é t o d o . A p r i m e i r a a m o s t r a d a m a n h ã é a
m e l h o r p o r q u e ela tem u m a variação m t r a p e s s o a l da relação
e n t r e a l b u m i n a e c r e a t i n i n a m e n o r d o q u e u m a am os t r a aleató-
ria d e u r i n a . Devem-se ensaiar pelo m e n o s três a m o s t r a s separa-
das, coletadas e m dias diferentes, p o r causa da alta variação intra-
mdividual (CV de 3 0 % a 5 0 % ) e variação d i u r n a ( 5 0 % a 100%
m a i o r d u r a n t e o dia). Deve-se armazenar a. u r i n a e m 4 ° C após a
coleta. Alternativamente, pode-se adicionar 2 m L de 5 0 g / L d e azida
d e sódio p o r 5 0 0 m L d e u r i n a , m a s n ã o se r e c o m e n d a a utiliza-
ção d e conservantes para alguns ensaios. A c o n t a m i n a ç ã o bacte-
riana e a glicose n ã o t ê m efeito.
Ensaios Semiquantitativos
Estão disponíveis vários ensaios s e m i q u a n t i t a t i v o s p a r a a triagem
d e U A E elevada. Essas tiras d e teste, m u i t a s das quais são otimi-
zadas p a r a u m a leitura "positiva" e m u m a d e t e r m i n a d a c o n c e n -
tração d e a l b u m i n a , são a p r o p r i a d a s para os p r o g r a m a s d e
triagem. Por causa d a a m p l a variabilidade n a U A E , u m valor
" n o r m a l " n ã o descarta d o e n ç a renal. C o m o esses ensaios m e d e m
a c o n c e n t r a ç ã o de a l b u m i n a , a u r i n a diluída p o d e f o r n e c e r u m
r e s u l t a d o falso-negativo. A n t e s da realização das análises, as
amostras refrigeradas de u r i n a d e v e m estar a 10°C pelo m e n o s .
O teste A l b u S u r e s d e t e c t o u c o n c e n t r a ç õ e s de a l b u m i n a u r i n á r i a
m a i o r e s d o q u e 20 ou 3 0 m g / L . O ensaio é u m teste de inibição
de a g l u t i n a ç ã o de látex n o qual se m i s t u r a a u r i n a c o m u m
a n t i c o r p o a n t i - a l b u m i n a h u m a n a d e cabra, c u j o título é a j u s t a d o
p a r a q u e t o d o s os sítios d e ligação ao a n t i c o r p o sejam o c u p a d o s
e m c o n c e n t r a ç õ e s d e a l b u m i n a u r i n á r i a iguais ou m a i o r e s d o
q u e 20 o u 3 0 m g / L . O excesso d e sítios de ligação à a l b u m i n a
são d e t e c t a d o s pela a d i ç ã o de u m a gota de microesferas d e látex
revestidas c o m a l b u m i n a . C o n c e n t r a ç õ e s de a l b u m i n a abaixo d e
2 0 o u 3 0 m g / L p r o d u z e m aglutinação. O M i c r o - B u m i n t e s t
utiliza azul de b r o m o f e n o l e m u m a matriz alcalina para detectar
c o n c e n t r a ç õ e s de a l b u m i n a acima de 4 0 m g / L . Esse teste se
baseia n o erro p r o t é i c o d o i n d i c a d o r azul de b r o m o f e n o l . A
sensibilidade d o d i a g n ó s t i c o é de a p r o x i m a d a m e n t e 9 5 % , m a s
c o m o outras p r o t e í n a s t a m b é m são detectadas, a especificidade
para a m i c r o a l b u m i n ú r i a é igual o u m e n o r a 8 0 % .
N a tira d e teste M i cr al ( R o c h e Diagnostics, I n d i a n á p o l i s ,
I n d , EUA), u m a n t i c o r p o m o n o c l o n a l anti-IgG f o r m a u m com-
plexo c o m a |3-galactosidase. A a l b u m i n a n a u r i n a se liga ao
c o n j u g a d o e n z i m a - a n t i c o r p o n a tira de teste. O excesso d e con-
j u g a d o fica r e t i d o e m u m a região s e p a r a d a q u e c o n t é m a l b u m i n a
imobilizada, e s o m e n t e a a l b u m i n a ligada ao i m u n o c o m p l e x o
a n t i c o r p o - e n z i m a se d i f u n d e p a r a a região d e reação. Nessa
região, a a l b u m i n a reage c o m u m s u b s t r a t o t a m p o n a d o (verme-
l h o de clorofenol) p a r a p r o d u z i r u m a coloração v e r m e l h a q u a n d o
a P-ga 1 actos idas e h i d r o l i s a a galactose. Mergulha-se a tira d e teste
n a u r i n a p o r 5 s e g u n d o s , e a i n t e n s i d a d e d a coloração após 5
minutos é proporcional à concentração de albumina urinária.
Faz-se a c o m p a r a ç ã o visual direta c o m b l o c o s de cores impressos
— amarelo, marrom-claro, m a r r o m - m é d i o , vermelho-tijolo e b o r d ô j
r e p r e s e n t a n d o 0, 10, 20, 5 0 e 100 m g / L , r e s p e c t i v a m e n t e . N ã o
se observa n e n h u m a i n t e r f e r ê n c i a c o m drogas, glicose, uréia o u
o u t r a s proteínas. A c o m p a r a ç ã o c o m u m m é t o d o d e referência
d e m o n s t r a u m a sensibilidade e u m a especificidade d e aproxima-
d a m e n t e 1 0 0 % e 9 1 % , r e s p e c t i v a m e n t e . O s t e m p o s de c o n t a t o
c o m a u r i n a e d e leitura são críticos. U m a m o d i f i c a ç ã o desse
teste (Micral II) utiliza u m a n t i c o r p o m a r c a d o c o m o u r o e m vez
de e n z i m a . Esse m é t o d o a u m e n t a a estabilidade, p e r m i t i n d o
c o m que a tira seja lida a q u a l q u e r m o m e n t o d e 1 a pelo m e n o s
410 PARTE IV Analitos
60 m i n u t o s . A s amostras de u r i n a com concentrações de albu-
m i n a maiores d o q u e 100 a 3 0 0 m g / L p o d e m ser diluídas e
submetidas a u m novo teste. A concentração atribuída ao bloco
de cores é multiplicada pelo fator de diluição para a o b t e n ç ã o
da concentração n a amostra. Esses ensaios semiquantitativos são
r e c o m e n d a d o s s o m e n t e para triagem. Porém, estudos publicados
revelam q u e as sensibilidades limitam os seus valores para
tTiagem. O teste I m m u n o D i p (DCL, Prince Edward Island,
Canadá), c o m o os métodos d o Micral, utiliza anticorpos m o n o -
clonais contra a l b u m i n a h u m a n a .
Ensaios Quantitativos
T o d o s os ensaios sensíveis e específicos paTa a d e t e r m i n a ç ã o da
albumina urinária utilizam i m u n o q u í m i c a com anticorpos c o n t r a
a l b u m i n a h u m a n a . As m e t o d o l o g i a s q u e estão disponíveis são
(1) RIA, (2) ELISA, (3) i m u n o d i f u s ã o radial e (4) i m u n o t u r b i -
metria. C a d a m é t o d o tem vantagens e desvantagens, e a escolha
d e p e n d e d a experiência local e d o a p o i o técnico. E m b o r a
ensaios de ligação a i n d i c a d o r e s e ensaios de p r e c i p i t a ç ã o de
p r o t e í n a s t e n h a m sido descritos, tais ensaios são insensíveis
e inespecíficos e n ã o devem ser utilizados. O s d e t a l h e s desses
m é t o d o s são e n c o n t r a d o s e m u m a versão a m p l i a d a deste capí-
tulo. 1 2
intervalos de Referência
Excecão Urinária de Alhumina
Corrigida
(mg/g de
creatinina
Condição íig/min mg/24 horas urinária)
Normal <20 <30 <30
UAE elevada 20 a 200 30 a 300 30 a 300
(micraalbuminüria)
Microalbuminúria >200 >300 >300
(preteinúria clinica)
N o p r o n u n c i a m e n t o oficial da A D A J é r e c o m e n d a d o u m a deter-
minação inicial da U A E em (1) pacientes com diabetes tipo 1
q u e sofrem dessa condição há pelo m e n o s 5 anos e (2) e m todos
os pacientes c o m diabetes tipo 2. N o diabetes tipo 2, deve-se
realizar a triagem n o m o m e n t o d o diagnóstico e d u r a n t e a gra-
videz. Todos os pacientes com u m resultado negativo na triagem
devem ser submetidos a novos testes anualmente. Se a triagem for
realizada com u m ensaio semiquantitativo, os resultados positi-
vos devem ser avaliados por u m ensaio quantitativo.
Se o teste c o n f i r m a t ó r i o for positivo, deve-se iniciar um tra-
t a m e n t o com inibidores da A C E . O s inibidores da A C E r e d u z e m
a UAE, e a N a t i o n a l Kidney F o u n d a t i o n r e c o m e n d a a utilização
desses inibidores e m pacientes n o r m o t e n s o s e hipertensos c o m
diabetes tipo 1 e ripo 2. N ã o tratada, a U A E a u m e n t a r i a 10% a
3 0 % p o r ano, e n q u a n t o a p r o p o r ç ã o a l b u m i n a / c r e a t i n i n a e m
indivíduos sob t r a t a m e n t o com inibidores da A C E deve estabi-
lizar ou d i m i n u i r e m 5 0 % .
Insulina, Pró-lnsulina, Peptídeo C e G l u c a g o n
Vários m é t o d o s são utilizados para m e d i r insulina, pró-insulina,
peptídeo C e glucagon. Neste capítulo, há u m a breve visão geral
desses m é t o d o s . O s detalhes adicionais são e n c o n t r a d o s e m u m a
versão ampliada deste capítulo. 1 2
Insulina
A aplicação clínica primária da dosagem da insulina é n a avalia-
ção dos pacientes com hipoglicemia de jejum. T a m b é m se p r o p õ e
que a determinação da insulina seja valiosa n a seleção de u m a
terapia inicial ótima para pacientes c o m diabetes meilitus tipo 2.
Em ceoria, q u a n t o m e n o r a concentração de insulina n o pré-
t r a t a m e n t o , mais apropriada é a insulina ou u m secretagogo de
insulina c o m o t r a t a m e n t o d e escolha. E m b o r a intelectualmente
apelativo, não há evidências de q u e o c o n h e c i m e n t o da concen-
tração de insulina leve a u m t r a t a m e n t o mais eficaz. U m a utili-
zação emergente para os ensaios de insulina é a avaliação e
controle das pacientes c o m s í n d r o m e d o ovário policístico. As
mulheres com essa condição t ê m resistência à insulina e meta-
b o l i s m o a n o r m a l de carboidratos que p o d e m responder aos
agentes hipoglicêmicos orais. E m b o r a alguns investigadores reco-
m e n d e m a dosagem da insulina j u n t o c o m a glicose d u r a n t e um
O G T T c o m o u m auxílio ao diagnóstico precoce de diabetes melli-
tus, n ã o se r e c o m e n d a esse m é t o d o .
E m b o r a se realize o ensaio de insulina há mais de 40 anos,
n ã o há n e n h u m p r o c e d i m e n t o disponível altamente acurado,
preciso e confiável que meça a q u a n t i d a d e de insulina e m u m a
amostra de paciente. M u i t o s ensaios de insulina estão comercial-
m e n t e disponíveis. 5 São utilizados i m u n o e n s a i o s para m e d i r a
insulina. Utiliza-se o t e r m o insulina imunorreatwa em referência
aos ensaios que p o d e m reconhecer, além da insulina, substratos
que c o m p a r t i l h a m epítopos antigênicos com a insulina. O s
exemplos são a pró-insulina, os intermediários de conversão da
pró-insulina e os derivados de insulina produzidos por glicação
ou dimerização. O s anti-soros produzidos contra a insulina
m o s t r a m reatividade cruzada c o m pró-insulina, mas n ã o com o
p e p t í d e o C. A especificidade não é u m problema nos indivíduos
sadios p o r q u e concentrações baixas de pró-insulina não afetam
m u i t o as concentrações m e d i d a s d e insulina. E m certas situações
(p.ex., pacientes c o m diabetes ou c o m tumores de células das
ilhotas), a pró-insulina está p r e s e n t e em altas concentrações, e o
ensaio direto do plasma p o d e superestimar falsamente a concen-
tração real de insulina. C o m o a pró-insulina tem pouca ativi-
dade, pode-se chegar a conclusões incorretas sobre a disponibi-
lidade da insulina biologicamente ativa em pacientes c o m dia-
betes. A m a g n i t u d e d o erro d e p e n d e d a concentração de pTÓ-
insulina e da intensidade da reação cruzada d o anti-soro com a
pró-insulina n o ensaio.
A ADA determinou u m grupo de trabalho para padronizar o
ensaio de insulina. 10 A avaliação de 12 diferentes ensaios comercial-
mente disponíveis de 9 fabricantes mostrou CVs intra-ensaios de
3,7% a 39% e CVs interensaios de 12% a 66%, com uma mediana
de 24%. U m a preparação de referência c o m u m para a insulina não
m u d o u o C V interensaio e falhou em melhorar a uniformização
dos resultados entre os ensaios. O s ensaios detectaram insulinas
modificadas em vários níveis. O relatório concluiu que "a discor-
dância nos resultados dos ensaios de insulina comerciais é provavel-
mente mulrifatorial, e será preciso u m esforço contínuo para a
compreensão das diferenças e a obtenção da consistência e da uni-
formização desejadas entre os imunoensaios comerciais". 10
O s intervalos de referência v a r i a m e n t r e os ensaios, e cada
l a b o r a t ó r i o deve d e t e r m i n a r seus próprios intervalos de refe-
rência. Devem-se relatar os valores e m u n i d a d e s SI ( p m o l / L ) .
A p ó s u m jejum n o t u r n o , as c o n c e n t r a ç õ e s de insulina e m
pessoas sadias, n o r m a i s e n ã o obesas variam de 12 a 150 p m o l /
L (2 a 25 f j U I / m L ) . Ensaios mais específicos que têm reatividade
cruzada m í n i m a c o m a p r ó - i n s u l i n a revelam u m a c o n c e n t r a -
ção de insulina plasmática d e jejum m e n o r d o que 60 p m o l / L
(9 ( l U I / m L ) . O s valores da insulina de jejum são maiores em
pessoas obesas, n ã o diabéticas e m e n o r e s em atletas treinados.

Pró-lnsulina
Geralmente, observam-se concentrações altas de pró-insulina em
indivíduos com tumores benignos ou malignos de células {3 do
pâncreas. A maioria desses tumores tem concentrações elevadas de
insulina, peptídeo C e pró-insulina, mas ocasionalmente somente
há elevação da concentração de pró-insulina. Independente de sua
atividade biológica, a concentração de pró-insulina pode estar sufi-
cientemente alta para produzir hipoglicemia. Além disso, h á u m a
forma rara de hiperproinsulinemia família[ causada por u m defeito
na conversão para insulina. A dosagem da pró-insulina pode auxiliar
na determinação da quantidade de material semelhante à pró-insu-
lina que reage de forma cruzada em u m ensaio de insulina. Alguns
indivíduos com diabetes tipo 2 demonstram proporções elevadas
de pró-insulina e de intermediários da conversão da pró-insulina;
as concentrações altas estão associadas a fatoies de risco cardiovas-
cular. Cada hiperglicemia relativamente leve produz hiperproinsu-
linemia com concentrações que excedem 4 0 % da concentração de
insulina nos pacientes com diabetes tipo 2. Concentrações elevadas
de pró-insulina t a m b é m podem ser detectadas e m indivíduos com
falha renal crônica, cirrose ou hipertireoidismo.
A quantificação acurada d a pró-insulina é difícil p o r várias
razões; as concentrações sanguíneas são baixaS; a p r o d u ç ã o de
anticorpos é difícil; a maior parte dos anti-soros reage de forma
cruzada c o m insulina e p e p t í d e o C presentes em concentrações
m u i t o maiores; os ensaios m e d e m as formas d e clivagem da pró-
insulina; e as preparações de referência de pró-insulina pura n ã o
estão p r o n t a m e n t e disponíveis. As prc-insulinas biossintéticas
p e r m i t i r a m , recentemente, a p r o d u ç ã o de anticorpos monoclo-
nais contra a pró-insulina e a p r o d u ç ã o d e calibradores e de
preparações de referência.
O s intervalos de referência para a pró-insulina são altamente
dependentes do método de análise, do grau de reatividade cruzada
dos anti-soros e da pureza dos calibradores d i pró-insulina. Cada
laboratório deve determinar seus próprios intervalos de referência.
Os intervalos de referência em indivíduos sadios em jejum relatados
na literatura variam de 1,1 a 6,9 p m o l / L a 2,1 a 12,6 p m o l / L .
Peptídeo C
A dosagem do p e p t í d e o C oferece algumas vantagens sobre a
dosagem da insulina. C o m o o seu m e t a b o l i s m o hepático é
desprezível, as concentrações de p e p t í d e o C são indicadores
m e l h o r e s da f u n ç ã o da célula [} d o q u e a c o n c e n t r a ç ã o perifé-
rica da insulina. A l é m disso, os ensaios c o m peptídeo C n ã o
m e d e m a insulina exógena e n ã o reagem de f o r m a cruzada c o m
os a n t i c o r p o s contra insulina que interferem nos i m u n o e n s a i o s
para insulina.
A indicação primária para a medição do peptídeo C é a avalia-
ção da hipoglicemia de jejum. Alguns indivíduos com tumores de
células P produtoras de insulina, particularmente se a hiperínsuli-
nemia for persistente, p o d e m exibir concentrações elevadas de pep-
tídeo C com concentrações normais de insulina. Q u a n d o ocorre
hipoglicemia devida à injeção sub-reptícia de insulina, as concentra-
ções de insulina aumentam, mas as concentrações de peptídeo C
permanecem baixas; essa diferença ocorre porque o peptídeo C não
é encontrado em preparações comerciais de insulina e a insulina
exógena suprime a atividade da função da célula p.
As concentrações basal e estimulada (pelo glucagon ou pela
glicose) de peptídeo C p o d e m fornecer u m a estimativa da capa-
cidade e d a taxa de secreção de insulina de u m indivíduo.
E m b o r a valiosa na pesquisa clinica, a dosagem do peptídeo C
exerce u m papel desprezível n o controle rotineiro dos pacientes
c o m diabetes.
A determinação d o p e p t í d e o C é utilizada para m o n i t o r a r as
respostas individuais à cirurgia pancreática. O peptídeo C deve
Carboidratos CAPÍTULO 2 2 411
ser indetectãvel após u m a pancreatectomia radical e sua concen-
tração deve a u m e n t a r após u m transplante bem-sucedido de
pâncreas ou de células das ilhotas.
O s ensaios para d e t e r m i n a ç ã o do peptídeo C não reagem
c o m anticorpos anti-insulina. Porém, problemas metodológicos
p r o d u z e m grandes variações entre os métodos. Essas dificulda-
des incluem especificidade variável entre diferentes anti-soros,
reatividade cruzada variável c o m pró-insulina e o tipo de prepa-
ração de p e p t í d e o C utilizado c o m o calibrador. U m a compara-
ção, n o intervalo clinicamente relevante, utilizando q u a t r o ícits
comerciais e q u a t r o anti-soros comerciais contra o peptídeo C
resultou valores v a r i a n d o de 0,54 a 1,06 n m o l / L na m e s m a
amostra. H á vários métodos i m u n o m é t r i c o s para a dosagem d o
peptídeo C descritos e vários m é t o d o s estão disponíveis comer-
cialmente.
As concentrações do peptídeo C e m jejum e m pessoas sadias
variam de 0,78 a 1,89 n g / r n L (0,25 a 0,6 n m o l / L ) . A p ó s estí-
m u l o c o m glicose ou glucagon, os valores variam de 2,73 a 5,64
n g / m L (0,9 a 1,87 m o l / L ) , três a cinco vezes o valor n o pré-
estímulo. O peptídeo C u r i n á r i o fica, geralmente, n o intervalo
de 74 a 26 [J.g/L (25 a 8,8 p m o l / L ) .
Glucagon
Concentrações e x t r e m a m e n t e altas de glucagon estão presentes
e m indivíduos c o m glucagonomas, que são tumores das células
a do pâncreas. O s indivíduos c o m esse tipo de t u m o r f r e q ü e n -
temente e x p e r i m e n t a m perda de peso, eritema migratório necro-
lítico, diabetes mellitus, estomatite e diarréia. A maioria dos
tumores tem metástases n o m o m e n t o d o diagnóstico. As con-
centrações baixas de glucagon estão associadas a pancreatite
crônica e terapia c o m sulfoniluréia a longo prazo.
Está disponível u m RIA de competição para m e d i r o gluca-
gon. O s valores d o calibrador são atribuídos pelo fabricante
através da utilização da Glucagon Internacional S t a n d a r d
(69/194) da O M S . '
As concentrações plasmáticas de glucagon n o jejum variam
de 20 a 52 p m o l / L (70 a 180 n g / L ) . Podem-se e n c o n t r a r valores
até 500 vezes maiores d o q u e o limite superior e m indivíduos
c o m neoplasia de células a de secreção autonômica.
REFERÊNCIAS
1. American Diabetes Association. Standards of medicai caie in diabetes—
2007 Diabetes Care 2007;30 {Suppl 1):S4-S41.
la. American Diabetes Association. Diagnosis and classificaiion of
diabetes mellitus. Diabetes Care 2007;30:S42-7.
2. Atkinson MA, Eisenbarth GS. Type 1 diabetes: new perspectives o n
diseasc pachogenesis and treatmenc. Lancec 2001;358-221-9.
3. Bry L, Chen PC, Sacks DB. Effects of hemoglobin vaiiants and
chemically modified derivatives on assays for glycohemoglobin [Review],
Clin Chem 2001;47:153-63.
4. Chen Y-T, Buichell A. Glycogen storage diseases. In: Scriver AL,
Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. The metabolic and molecular bases
of inherited disease, 7th ed. New York: McGtaw-HilI, 1995:935-65.
5. Clark PM. Assays for insulin, proinsulin(s) and C-peptide A n n Clin
Biochem 1999 ; 36 (Pt 5):541-64.
6. DCCT. The effect of intensive treatmenc of diabetes on the
deveiop ment and progression of long-term complications in insulin-
dependent diabetes mellitus. N E ] M 1993;329:977-86.
7. Goldstein DE, Littlc RR, Lorenz RA, Malane JI, Nathan D, Peterson
CM, et al. Tests of glycemia in diabetes. Diabetes Care 2004;27:1761-73.
8 Little RR, Rohlfing CL, Wiedmeyer HM, Myeis GL, Sacks DB,
Goldstein DE. T h e national glycohemoglobin standardizacíon program:
a five-year progress report. Clin C h e m 2001;47:1985-92.
412 PARTE IV Analitos
9. Metzger BE, Coustan DR. Summary and recommendations of the
Fourth International Wo rfe shop-Confere ti ce on Gestational Diabetes
Melhtus. Diabetes Care 1998;21=B 161-7.
10. Marcovina S, Bowsher RR, Miller W G , Sraten M, Myers G, Caudill SP,
et al. Standardizaticn of insulin immunoassays: report of the American
Diabetes Aísociation Workgroup C h n C h e m 2007;53:711-6.
11. Saclcs DB. Global harmonization of hemoglobin A ^ . Clin Chem
2005;51:681-3.
12. Saeks DB. Carbohydrates. In: Burtis C, Ashwood E, Bruns D, eds.
Tietz textbook of clinicai chemistry and molecular diagnostica, 4th ed.
St. Louis: Saunders, 2006:837-902.
13. Sacks DB, Bruns DE, Goldstein DE, Maclaren NK, McDonald JVI,
Parrott M. Guidelines and recommendations for laboratory analysis in
the diagnosis and management of diabetes mellitus. Clin Chem
1992;48:436-72.
14. Service FJ. Hypoglycemic disorders. N Engl ] Med 1995;332:1144-52.
15. U.K. Prospective Diabetes Study (UKPDS) Gioup. Intensive blood-
glucose control with sulphonylureas or insulin compared with
conventional treatment and risk of complications in patients with type
2 diabetes (UKPDS 33). Lancet 1998;352:837-53.
APÍTULO 2 3

Lipídios, Lipoproteínas,
Apolipoproteínas e Outros Fatores de
Risco Cardiovascular*
Nader Rifai, Ph.D., G. Russell Warnick, M.S.,
e Alan T. Remaley, M.D., Ph.D.

OBJETIVOS espumosas de macrófagos são formados dentro das camadas

1. Definir os seguintes termos: íntima e média das artérias de m é d i o e grande calibre.
Lipídio Colesterol: Álcool esreróide, C27H450H, que é u m c o m p o n e n t e
Ácido graxo essencial d o metabolismo lipídico. Freqüentemente
Prostagl andina encontrado esterificado com u m ácido graxo.
Apoliproteína
Fosfolipídio: Qualquer lipídio que contém fósforo, incluindo
Lipoproteína
aqueles com u m a estrutura central de glicerol
(fosfoglicerídeos) e esfingosina o u substâncias relacionadas
Quilomícron
(esfingomielinas). Os fosfolipídios são a principal forma de
Aterosclerose
lipídio nas membranas celulares.
2. Discutir o metabolismo do colesterol e dos triglicerídeos e
Lipídios: Qualquer grupo heterogêneo de gorduras e
determinar o intervalo de referência de cada um para indivíduos
substâncias semelhantes à gordura caracterizado por ser
aparentemente sadios.
insolúvel em água e solúvel em solventes não polares como
3. Determinar a importância das apolipoproteínas na saúde e na
álcool, éter, clorofórmio, benzeno etc.
doença.
Lipoproteínas: Qualquer complexo lipid io-proteína n o qual os
4. Comparar e contrastar as cinco classes de lipoproteína com base
lipídios são transportados n o sangue. As partículas de
na composição química e significância clínica.
lipoproteína consistem em u m núcleo hidrofóbico esférico
5. Listar as hiperlipoprcteinemias e expor os achados laboratoriais
de triglicerídeos ou ésteres de colesterol circundados por
associados a cada uma delas.
u m a m o n o c a m a d a de fosfolipídios, colesterol e
6. Listar as hipolipoprotsinemias e expor os achados laboratoriais
apolipoproteínas.
asscciados a cada uma delas.
P r o s t a g l a n d i n a : Qualquer grupo d e compostos derivados de
7. Expor os procedimentos básicos de exames para colesterol e
ácidos graxos insaturados de 2 0 carbonos (principalmente
triglicerídeos séricos e as exigências, princípios e interferências
ácido araquidônico) por meio d a via de ciclooxigenase.
para a amostra em cada um deles.
Estes compostos são potentes mediadores de u m grupo
diverso de processos fisiológicos.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
Q u i l o m í c r o n : U m a partícula da classe das lipoproteínas
Acido Graxo Essencial: U m ácido graxo que não é sintetizado responsável pelo transporte de colesterol exógeno e
pelo corpo h u m a n o . Ácidos linoléico, linolênico e triglicerídeos d o intestino delgado até os tecidos após as
araquidônico são exemplos. refeições. U m quilomícron é u m a partícula esférica com u m
Ácido Graxo; Q u a l q u e r ácido monocarboxílico de cadeia
núcleo de triglicerídeos circundado por u m a m o n o c a m a d a
linear. Os ácidos graxos são geralmente classificados c o m o :
de fosfolipídios, colesterol e apolipoproteínas.
ácidos graxos saturados, aqueles sem ligações duplas; ácidos
Triglicerídeo: U m composto orgânico que consiste em até três
graxos monoinsaturados, aqueles com u m a ligação dupla, e
moléculas de ácidos graxos esterificados ao glicerol.
ácidos giaxos poliinsaturados, aqueles com múltiplas
ligações duplas.
A p o l i p o p r o t e í n a s : C o m p o n e n t e s proteicos das lipoproteínas.
Aterosclerose: U m distúrbio n o qual depósitos de placas

amareladas c o n t e n d o colesterol, material lipóide e células
*Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições prévias dos Drs. John
Albers e Paul Bachorik, nas quais se baseiam partes deste capítulo. Outras partes
foram adaptadas de Rifai N, Kwiterovich PO Jr. Disorders of lipid and lipopro-
tein metabolism in children and adolescents. Em: Soldin SJ, Rifai N, Hick JMB,
eds. Biochemical basis of pediatric diseases. 3rd ed. Washington. DC: A A C C
Press, 1998.
O
s lipídios têm importantes funções em praticamente
todos os aspectos da vida: (1) servem como hormônios,
(2) servem como fonte de energia, (3) a ju d a m na digestão
e (4) agem como componentes estruturais nas m e m b r a n a s celu-
lares. Além disso, os lipídios e as lipoproteínas estão intimamente
envolvidos n o desenvolvimento d e aterosclerose, u m processo
patogênico que é a causa subjacente de distúrbios cardiovascula-
res c o m u n s de (1) infarto d o miocárdio, (2) doença cerebrovas-
cular e (3) doença vascular periférica (Capítulo 33). Neste capítulo,
são discutidos a bioquímica básica, o metabolismo, a importância
clínica e a análise laboratorial de cada u m a das principais classes
414 PARTE IV Analitos
de lipídios e lipoproteínas e outros fatores de risco cardiovascular,
c o m o p r o t e í n a C-reativa e homocisteína.
LIPÍDIOS BASICC i 15-17
O t e r m o lipídio aplica-se a uma classe de compostos q u e sâo
solúveis em solventes orgânicos, mas quase insolúveis e m água.
Q u i m i c a m e n t e , os lipídios c o n t ê m p r i n c i p a l m e n t e ligações
carbono-hidrogênio não-polares ( O H ) e tipicamente p r o d u z e m
ácidos graxos e ou álcoois complexos após hidrólise. Alguns lipí-
dios t a m b é m c o n t ê m grupos carregados ou polares, c o m o grupos
(1) siálico, (2) fosforil, (3) amrno, (4) sulfuril ou (5) hidroxil. A
presença destes grupos químicos confere às moléculas Iipídicas
u m a a f i n i d a d e c o m a água e c o m os solventes orgânicos (anfipá-
ticos). Isso os possibilita existir na interface aquosa das membra-
nas biológicas. D e m o d o geral, os lipídios são a m p l a m e n t e sub-
divididos e m seis grupos, c o m base na sua estrutura química: (1)
colesterol, (2) ácidos graxos, (3) acilgliceróis, (4) esfingolipídios,
(5) prostaglandinas e (6) terpenos.
Colesterol
O colesterol é e n c o n t r a d o quase exclusivamente em animais e é
u m c o m p o n e n t e essencial da m e m b r a n a de todas as células. E
u m álcool esteróide c o m 27 átomos de c a r b o n o que são dispostos
em u m sistema em anel tetracíclico de esterano, c o m u m a cadeia
lateral C-H {Figura 23-1). O c o n h e c i m e n t o d o sistema de n u m e -
ração para os átomos de c a r b o n o no colesterol é i m p o r t a n t e
p o r q u e é a base d o sistema de n o m e n c l a t u r a de i n ú m e r a s enzimas
envolvidas e m várias vias bioquímicas relacionadas c o m o coles-
terol, como: (1) vitamina D (Capítulo 27), (2) h o r m ô n i o s esterói-
des (Capítulo 40) e (3) vias da biossíntese de ácidos biliares. O
colesterol é p r i n c i p a l m e n t e c o m p o s t o de ligações O H e p o r t a n t o
quase não é solúvel e m água. E n t r e t a n t o , ele c o n t é m u m g r u p o
hidroxil ( O H ) polar e m seu anel A (Figura 23-1). Portanto, é u m a
molécula t a n t o polar c o m o n ã o polar (anfipãtica).
Absorção de Colesterol
Estima-se q u e a dieta n o r t e americana e m m é d i a c o n t e n h a apro-
x i m a d a m e n t e 300 a 4 5 0 mg de colesterol p o r dia, que vêm
p r i n c i p a l m e n t e do c o n s u m o de p r o d u t o s animais. U m a quanti-
dade s e m e l h a n t e de colesterol é absorvida n o intestino a partir
das secreções e turnover biliares e liberação de células d a mucosa
intestinal. Praticamente t o d o o colesterol n o intestino está pre-
sente n a f o r m a não-esterificada (livre). O colesterol esterificado,
Esqueleto de petidrocidopenraiiofeiian treno
(esterano)
HO
Colesterol
Figure 2 3 - 1 Estrutura do colesterol.
que c o n t é m u m ácido graxo fixado ao g r u p o hidroxil n o anel A,
é r a p i d a m e n t e hidrolisado n o intestino e m colesterol livre e
ácidos graxos pelas colesterol esterases secretadas d o pâncreas
e intestino delgado.
A n t e s de ser absorvido, o colesterol p r i m e i r a m e n t e é solubi-
lizado através de u m processo c h a m a d o emulsificação. A emulsi-
ficação ocorre p o r meio d a formação de micelas mistas que
c o n t ê m : (I) colesterol não-esterificado, (2) ácidos graxos, (3)
monoglicerídeos, (4) fosfolipídios e (5) ácidos biliares conjuga-
dos. O s ácidos biliares, ao agir c o m o detergentes, são o fator mais
crítico na formação de micelas. E m sua ausência, a digestão e
absorção tanto d o colesterol c o m o do triglicerídeo são grave-
m e n t e prejudicadas. A capacidade d o colesterol em f o r m a r
micelas t a m b é m é i n f l u e n c i a d a pela q u a n t i d a d e de gordura die-
tética, mas n ã o p o r seu grau de saturação. Q u a n t i d a d e s aumen-
tadas de gordura n a dieta resultam n o a u m e n t o de micelas mistas,
o que por sua vez p e r m i t e q u e mais colesterol seja absorvido. A
m a i o r parte da absorção d e colesterol ocorre n o j e j u n o m é d i o e
íleo terminal d o intestino delgado e é mediada pela proteína de
superfície do enterócito, N P C I L 1 . Esta proteína é o alvo para o
fármaco ezetimiba que b l o q u e i a a absorção de colesterol. Geral-
mente, entre 3 0 % e 6 0 % d o colesterol dietético são absorvidos
p o r dia, o que representa até 1 g / d i a q u a n d o se faz u m a dieta
c o m alto teor de gordura. Q u a n d o o colesterol entra n a célula
da mucosa intestinal, é a c o n d i c i o n a d o c o m triglicerídeos, fosfo-
lipídios e uma grande p r o t e í n a chamada apolipoproteína (apa) E-48
e m partículas grandes de lipoproteína chamadas q u i l o m í c r o n s .
O s quilomícrons são secretados n a linfa e s u b s e q ü e n t e m e n t e
e n t r a m na circulação o n d e distribuem o lipídio dietético absor-
vido para o fígado e tecidos periféricos.
Síntese de Colesterol
O colesterol t a m b é m é sintetizado e n d o g e n a m e n t e , c o m quase
9 0 % de sua síntese o c o r r e n d o n o fígado e intestino. A maior
parte das células periféricas, ao contrário, d e p e n d e de distribui-
ção exógena do colesterol pelas lipoproteínas. A biossíntese de
coleste;ol ocorre e m três estágios. N o primeiro estágio (Figura
23-2), acetil-CoA, u m intermediário metabólico essencial deri-
vado de carboidratos, a m i n o á c i d o s e ácidos graxos, forma o tio-
éster de seis carbonos H M G - C o A . N o segundo estágio (Figura
KJ
H 3 < r ^ s SCoA
c
Acetil-CoA
At eco acetil-CoA
0 o
1 A
H3CR X:IÍ; SCOA
AEC toaceti 1-CoA
Acetil-CoA
HMG-CoA
sintctase
HO 1 ÇH3 o
^C—CH,-C—CH J
2 -C
JO I
OH
\
SCoA
3-h í d rox Í.-3-m e tilgl u taril-C oA
(HMG-CoA)
Figure 2 3 - 2 Biossíntese do colesterol (estágio 1)
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular CAPÍTULO 2 3 415

Esidgio 2 2 NADPH

+ 2 HJ x © 2 NADP
G
O CH3 O ©' O ÇH3
/
C C H 3 Ç C H 2 - C Y.—CH2-C—CH 2 -CH 2 OH

<F OH SCOA HMG-CoA redutase Q /

OH
, , ., .- . , i- . (enzima l i m i t a d o r a da veloci-
.i-hidroxio-metilgiutanl-L-oA , i i Mevalonato
(HMG-CoA) ' — 3 ATP

Mnffi©
V 3 ADP
CO-j -+ Pi
•°o
H3C O O
Jt CHJ O
\ II Q >—o—P—0°
C—CHJ-CH 2 0—P—O—P—O FC—CH^A—CH,-CH20—. „ .

H / i® i© é A} Ae A0
°o-l=o
lsopentenil pirofosfato
A-
3-fosfo-5-pirofosfomevalonato
lsopentenil
PPl
pirofosfato
h3C V HlÇ
CH3 0 O
\ íí II ^
C = C H — C H 2 0 — P — O — P — O C
L- = CV-— C H I - C H I - « ! > = C — C H J - O — I — O — L I — O ®
0
Hjc/ i A® • u / i A Ae iP
Dimetilalil p i r o f o s f a t o Geranil pirofosfato

lsopentenil
pirofosfato
Transferase

H3C ÇH3 ÇH3 O O

\ 1 I II II ©
c=c—CH 2 —CH 2 ~C=C—CH 2 —CH 2 —C=0—( N 2 -O—P—O—P—O

H3C H i, l, Ae Ae
Farnesil p i r o f o s f a t o

NADPH + H ® — ^ Famesil
Síiuetase pirofosfato

MADP ITi

Esqualeno

Figure 23-3 Biossíntese d o colesterol (estágio 2).

23-3), o H M G - C o A é reduzido em mevalonato e em seguida é
descarboxilado em uma série de unidades isopreno de cinco
carbonos. Estas unidades de isopreno são então condensadas
para formar primeiramente u m intermediário de 10 carbonos
(geranil pirofosfato) e depois u m de 15 carbonos (farnesil piro-
fosfato). Duas destas moléculas C15 então se c o m b i n a m para
produzir o p r o d u t o final d o segundo estágio, esqualeno, u m
hidrocarboneto aciclico de 30 carbonos. O segundo estágio é
importante porque contém a etapa que envolve a enzima micros-
sômica H M G - C o A redutase, que é a enzima limitadora de velo-
cidade na biossíntese de colesterol e é inibida pelos fármacos d o
tipo estatinas. A enzima que forma farnesil pirofosfato, geranil
transferase, é u m i m p o r t a n t e segundo sítio de regulação (Figura
23-3) porque a inibição neste p o n t o permite a formação de iso-
prenóides intermediários fisiologicamente importantes na ausên-
cia de síntese de colesterol. O terceiro estágio (Figura 23-4) ocorre
n o retículo endoplasmático, com muitos dos produtos interme-
diários sendo ligados a u m a proteína carreadora especifica. O
esqualeno é inicialmente oxidado e depois passa por ciclização
para formar o intermediário de 4 anéis e 30 carbonos, o lancs-
terol. Em u m a série de reações de oxidação-descarboxilação, inú-
meras cadeias laterais são removidas da estrutura do anel tetrací-
clico de esterano para formar a molécula de 27 carbonos de
colesterol.
Esteríficação do Colesterol
O colesterol é esterificado em ácido graxo para formar u m éster
de colesteril por meio de duas enzimas diferentes. Na célula, o
excesso de colesterol é esterificado por acilcolesterol aciltransfe-
rase (ACAT), que ajuda a reduzir a citotoxi cidade d o excesso de
colesterol livre. U m a vez esterificados, os ésteres de colesteril são
armazenados nas gotas lipídicas intracelulares. A esterificação do
colesterol pela A C A T (Figura 23-5) envolve a ativação d e p e n d e n t e
de energia de u m ácido graxo com tiocoenzima A (CoASH) para
formar u m acil-CoA, que por sua vez reage com o grupo hidroxil
n o colesterol para formar u m éster.
Os ésteres de colesteril t a m b é m são formados na circulação
pela ação da lecitina colesterol aciltransferase (LCAT) n o coleste-
rol nas lipoproteínas, particularmente nas lipoproteínas de alta
densidade (HDL). A reação da L C A T não requer C o A S H . Ela
resulta de transferência de ácido graxo da posição do segundo
carbono da lecitina (fosfatidilcolina) em colesterol (Figura 23-5).
416 PARTE IV Analitos

Estdgio 3 O s ésteres de colesteril são responsáveis p o r cerca d e 7 0 % d o

colesterol total n o p l a s m a , e a L C A T é responsável pela f o r m a ç ã o

í
d a m a i o r p a r t e d o s ésteres de colesteril n o p l a s m a . A L C A T é
Esqualeno epoxidase secretada p e l o fígado na circulação e é ativada pela a p o l i p o p r o -
t e í n a A-I, a principal p r o t e í n a n o H D L . Q u a n d o o colesterol é
es ter ifiçado, ele p e r d e seu g r u p o h i d r o x i l livre e torna-se m u i t o
NADPH
mais h i d r o f ó b i c o , e vai d a s u p e r f í c i e das partículas d a l i p o p i o t e i n a
Esqualeno
para o centro hidrofóbico.

Catabolismo do Colesterol
Exceto p a r a células e n d ó c r i n a s especializadas q u e u s a m colesterol
'' I Esqualeno epóxido para a síntese de h o r m ô n i o s esteróides, a maioTia das células
periféricas a p r e s e n t a c a p a c i d a d e l i m i t a d a de catabolizar m a i s
colesterol. O s ésteres de colesteril são h i d r o l i s a d o s e m colesterol
livre p o r m e i o d e várias lípases e m t o d a s as células, mas, e m
seguida, o colesterol t e m q u e r e t o r n a r p a r a o f í g a d o para passar
p o r q u a l q u e r c a t a b o l i s m o posterior. A p r o x i m a d a m e n t e u m teTço
d a p r o d u ç ã o diária de colesterol, ou cerca de 4 0 0 m g / d i a , é
c o n v e r t i d a n o fígado e m ácidos biliares (Figura 23-6). C e r c a de
9 0 % d o s ácidos biliares são r e a b s o r v i d o s n o terço i n f e r i o r d o íleo
e são s u b s e q ü e n t e m e n t e r e t o r n a d o s para o fígado pela circulação
110
X êntero-hepática. O s á c i d a s biliares q u e e n t r a m n o i n t e s t i n o
Lnnoesterol
grosso são p a r c i a l m e n t e d e s c o n j u g a d o s pelas enzimas b a c t e r i a n a s
e m ácidos biliares s e c u n d á r i o s . O ácido cólico é c o n v e r t i d o , p o r
e x e m p l o , e m ácido desoxicólico, e o á c i d o q u e n o d e s o x i c ó l i c o é
c o n v e r t i d o e m á c i d o litocólico.
Zimosterol N e m t o d o o colesterol d i s t r i b u í d o para o f í g a d o é c o n v e r t i d o
e m sais biliares. G r a n d e p a r t e dele é n o v a m e n t e secretada n a
circulação e m lipoproteínas, e o restante é d i r e t a m e n t e excretado
na bile s e m alterações, o n d e é solubilizado e m micelas mistas
pelos ácidos biliares e fosfolipídios. Q u a n d o a q u a n t i d a d e de
colesterol n a bile excede a c a p a c i d a d e destes agentes solubilizan-
tes, é possível q u e o colesterol precipite e f o r m e cálculos biliares
de colesterol.

HO Á c i d o s Graxos
R C O O H é a f ó r m u l a q u í m i c a geral p a r a u m á c i d o graxo, o n d e
"R" é u m a cadeia alquil. O s c o m p r i m e n t o s d e cadeia d e á c i d o
graxo v a r i a m e c o m u m e n t e são classificados c o m o ácidos graxos
de cadeia c u r t a {2 a 4 á t o m o s d e c a r b o n o ) , cadeias m é d i a s (6 a
10 á t o m o s d e c a r b o n o ) ou cadeias longas (12 a 2 6 á t o m o s d e
Colesterol c a r b o n o ) . A q u e l e s ' q u e são i m p o r t a n t e s n a n u t r i ç ã o e m e t a b o -
lismo h u m a n o s são a classe de cadeia longa q u e c o n t é m u m
Figura 2 3 - 4 Biossíntese de colesterol (estágio 3). n ú m e r o p a r de á t o m o s d e c a r b o n o .
O s ácidos graxos t a m b é m são classificados de a c o r d o c o m seu
grau d e saturação. O s ácidos graxos s a t u r a d o s n ã o t ê m ligações
duplas ( C = C ) e n t r e seus á t o m o s de c a r b o n o ; os ácidos graxos
m o n o i n s a t u r a d o s c o n t ê m u m a ligação d u p l a ; e os ácidos graxos
IntTdcetul/XT p o l i i n s a t u r a d o s c o n t ê m múltiplas ligações d u p l a s (Figura 23-7).
Acido graxa + CoASH As ligações duplas n o s ácidos graxos p o l i i n s a t u r a d o s e m geral t ê m
Aat-CoA 5Í7itfitase *• Acil-CoA
u m intervalo d e três á t o m o s d e c a r b o n o . O s ácidos graxos d e
ATP ppi + A M P
peixes m a r i n h o s q u e m o r a m e m águas frias e p r o f u n d a s , c o m o o
salmão, p o s s u e m até seis ligações d u p l a s i n s a t u r a d a s e e m geral
ACAT +
t ê m mais de 20 á t o m o s de c a r b o n o de c o m p r i m e n t o . O s ácidos
Acil-CoA + colesterol Éster de colesterol CoASH
graxos i n s a t u r a d o s são mais p r o p e n s o s à oxidação pela reação
não-enzimática de oxigênio c o m suas ligações duplas. A m a r c a ç ã o
íntravascukn dos á t o m o s de c a r b o n o nos ácidos graxos começa n a e x t r e m i d a d e
Lecitina + colesterol —
LCAT
-—*- Éster de colesterol + lisolecitína d o carboxil t e r m i n a l (sistema d e n u m e r a ç ã o A) o u n a e x t r e m i d a d e
metil t e r m i n a l (sistema de n u m e r a ç ã o r\ o u td; Tabela 23-1). A l é m
Figura 2 3 - 5 Esterificação intracelular e intravascular de colesterol disto, os á t o m o s de c a r b o n o p o d e m ser m a r c a d o s c o m símbolos
mediada por A C A T e LCAT, respectivamente.
gregos, s e n d o q u e a é a d j a c e n t e ao g r u p o carboxil e ra é o m a i s
distante. N o sistema A, os ácidos graxos são abreviados d e a c o r d o
c o m o: (1) n ú m e r o de á t o m o s d e c a r b o n o , (2) n ú m e r o d e ligações
d u p l a s e (3) posição(ões) da(s) ligação(ões) dupla(s). Por exemplo,
 Lipídios, Lípoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular CAPÍTULO 2 3 417

Colesterol
n/
Fígado
X.
J
H l / v
7CL-h,idwxil(ise

Ti
C
j"
HO" ^ OH

/ 7 a-hidroxi coles te rol

OH
r coou
i r i
]
COO II

;jc
>
Ácidos
f " biliares
HO' OH HO OTT primários
ii
. Ácido
Ácido cólico
Glicina i Taurina Glicina quenodesoxi cólico Taurina
r r i
Acido Acido Acido Ácido
glicocólico taurocólico glicoquenodesoxicólico tauroquenodesoxicólico

intestino Transformação
bacteriana
{desconjugação e

L Xi
OH
7a-desidroxilacão)
COOH OOH

:r
JC
Ácidos

ir
biliares
secundários

110' HO'
H
Acido desoxicólico Acido litocólíco

Circulação enteropática Fezes

Figura 23-6 Síntese de ácido biliar.

H H H H o ácido linoléico seria escrito c o m o Cie:2 9 , n e c o n t é m 18 c a r b o n o s

h n
4 4 4 - c - e duas ligações i n s a t u r a d a s e n t r e os c a r b o n o s 9 e 10 e os c a r b o n o s
12 e 13. U s a n d o o sistema r| ou to, o ácido linoléico seria abre-
Saturado viado c o m o Cig:2n-6, o n d e a p e n a s o p r i m e i r o c a r b o n o que f o r m a
o p a r i n s a t u r a d o é escrito. A classificação d e Genebra ou sistemá-
tica, q u e se baseia e m seus n o m e s químicos, é u m terceiro sistema
H H H H de n o m e n c l a t u r a c o m u m para ácidos graxos (Tabela 23-1).
- A ^ U - A - N o s ácidos graxos s a t u r a d o s , a cadeia é e s t e n d i d a é flexível;
os á t o m o s de c a r b o n o s o f r e m r o t a ç ã o l i v r e m e n t e ao r e d o r de seu
A A eixo l o n g i t u d i n a l . O s ácidos graxos i n s a t u r a d o s , c o n t u d o , apre-
M o n o insaturado
s e n t a m d o b r a s rígidas d e 30° e m suas cadeias e m cada ligação
d u p l a . D e p e n d e n d o d o p l a n o n o qual esta d o b r a ocorre, o
í s ô m e r o eis ou t-mns é p r o d u z i d o . N o s m a m í f e r o s , todos os ácidos
H H H H H
graxos i n s a t u r a d o s d e o c o r r ê n c i a n a t u r a l são da v a r i e d a d e eis. O s
T ácidos graxos trans r e s u l t a m de h i d r o g e n a ç ã o catalítica n a qual
H as ligações d u p l a s i n s a t u r a d a s são q u i m i c a m e n t e reduzidas para
Poliinsaturado elevar seu p o n t o de f u s ã o , Este processo é u s a d o para " e n d u r e c e r "
ou solidificar g o r d u r a s n a fabricação de d e t e r m i n a d o s a l i m e n t o s ,
Figura 2 3 - 7 Ácidos graxos saturados e insaturados.
como a margarina.
418 PARTE IV Analitos
TABELA 23-1 Ácidos Graxos C o m u m e n t e Encontrados no Tecido H u m a n o
Nome Comum Nome Sistemático
Láurico Dodecanóíco
Mirístico Tetradecanóico
Palmítico Hexadecanóico
Palmitoléico 9-Hexadecenóicc
Esteárico Gctadecanóico
Oleico 9-Qctadecenáico
Linoléico* 9,12-Octadecadienóico
Linolênico* 9,12,15-Octadecairienóico
flraquídico Eicosanóico
Araquidônico 5,8,11,14-Eicosatetraenóico
"Ácidas graics essenciais.
A m a i o r i a das g o r d u r a s n o c o r p o h u m a n o é d e r i v a d a d a
dieta, q u e e m m é d i a c o n t é m até 4 0 % de g o r d u r a , 9 0 % d o s quais
são triglicerídeos. A l é m disso, os seres h u m a n o s são capazes d e
sintetizar a m a i o r i a d o s ácidos graxos. E n t r e t a n t o , eles são inca-
pazes de sintetizar alguns ácidos graxos, c o m o o ácido linoléico
(C 1 8 :2 9 n ) , q u e é e n c o n t r a d o a p e n a s n a s p l a n t a s . Pelo f a t o d e ser
essencial p a r a a s a ú d e , c r e s c i m e n t o e d e s e n v o l v i m e n t o , é c h a m a d o
de á c i d o graxo essencial. O ácido linoléico é c o n v e r t i d o e m ácido
a r a q u i d ô n i c o , q u e é u m p r e c u r s o r p a r a a síntese d e prostaglan-
d i n a e t a m b é m é i m p o r t a n t e n a mielinização d o sistema n e r v o s o
central.
O s ácidos graxos existem n a circulação e m e s t a d o n ã o esteri-
f i c a d o o u livre, este ú l t i m o p r i n c i p a l m e n t e ligado à a l b u m i n a , ou
e m várias formas esterificadas, c o m o os triglicerídeos, fosfolipí-
d i o s o u ésteres d e colesteril. O g r u p o carboxil d o ácido graxo livre
t e m u m p K a de a p r o x i m a d a m e n t e 4,8; assim, as m o l é c u l a s de
ácido graxo livre existem p r i n c i p a l m e n t e e m suas f o r m a s ioniza-
das. A c o n c e n t r a ç ã o n o r m a l de ácidos graxos livres n o p l a s m a
h u m a n o é d e 0 , 3 a 1,1 m m o l / L (8 a 31 m g / d L ) . O f l u x o de ácidos
graxos livres através d o p l a s m a é considerável e sensível às d e m a n -
das fisiológicas d e energia e à d i s p o n i b i l i d a d e d e f o r m a s alterna-
tivas de c o m b u s t í v e l m e t a b ó l i c o , c o m o a glicose.
Catabolismo do Ácido Graxo
O s ácidos graxos são catabolizados p o r oxidação e n z i m á t i c a n a
m i t o c ô n d r i a e p r o d u z e m energia p o r m e i o de u m a série de
reações c o n h e c i d a s c o m o fi-oxidação. Este processo t r a b a l h a repe-
t i d a m e n t e e e n c u r t a a cadeia de ácido graxo em dois á t o m o s de
c a r b o n o d e cada vez a partir da e x t r e m i d a d e c a r b o x i t e r m i n a i da
m o l é c u l a . Por e x e m p l o , u m m o l de ácido p a l m í t i c o (Cus) é con-
v e r t i d o e m oito m o l e s de acetil-CoA. O acetil-CoA n o r m a l m e n t e
n ã o a c u m u l a n a célula, m a s é c o n d e n s a d o e n z i m a t i c a m e n t e c o m
oxaloacetato, d e r i v a d o p r i n c i p a l m e n t e d o m e t a b o l i s m o d e car-
b o i d r a t o (Figura 23-8), p a r a p r o d u z i r citrato, u m c o m p o n e n t e
p r i n c i p a l d o ciclo d o ácido tricarboxílico (ciclo de Krebs). O ciclo
de Ktehs é u m a via c o m u m para a oxidação f i n a l d e q u a s e t o d o s
os combustíveis m e t a b ó l i c o s , i n d e p e n d e n t e de ser d e r i v a d o de
c a r b o i d r a t o , g o r d u r a o u p r o t e í n a , e f i n a l m e n t e resulta n a p r o d u -
ção d e a d e n o s í n a trifosfato (ATP), a p r i n c i p a l m o l é c u l a de a r m a -
zenamento de energia n o corpo. O catabolismo completo do
ácido palmítico, p o r e x e m p l o , p r o d u z 16 m o l e s de CO2, 16 m o l e s
de H j O e 129 m o l e s d e A T P (2.340 calorias). A q u a n t i d a d e de
energia p r o d u z i d a p e l o c a t a b o l i s m o d e 1 m o l de ácido p a l m í t i c o
(16 á t o m o s d e c a r b o n o ) é de a p r o x i m a d a m e n t e duas vezes a
p r o d u z i d a pelo c a t a b o l i s m o de u m a q u a n t i d a d e e q u i v a l e n t e (2,5
mol) d e glicose (6 á t o m o s d e c a r b o n o p o r molécula). O s triglice-
rídeos c o n t ê m três m o l é c u l a s d e ácido graxo e são, p o r t a n t o , u m a
A-Numeração n-(co) Numeração
12:0 12:0
14:0 14:0
16:0 16:0
16:1 9 16:1 n-7
18:0 18:0
18:1 9 18:1 n-9
18:2 912 18:2n-6
18:39.12,:s 18:3n-3
20:0 20:0
2O : 45Í.".« 20:4n-6
f o r m a r e l a t i v a m e n t e e f i c i e n t e de a r m a z e n a m e n t o de energia
metabólica- A l é m disto, o a r m a z e n a m e n t o de energia pelos trigli-
cerídeos t a m b é m é eficiente e m t e r m o s d e espaço p o r q u e ele n ã o
r e q u e r q u a l q u e r q u a n t i d a d e d e água p a r a h i d r a t a ç ã o , diferente-
m e n t e d o s carboidratos.
Formação de Cetona
D u r a n t e privação d e a l i m e n t o s p r o l o n g a d a ou q u a n d o o meta-
b o l i s m o d e c a r b o i d r a t o s é d e f i c i e n t e , c o m o n o diabetes mellitus
d e s c o m p e n s a d o , a f o r m a ç ã o d e acetil-CoA excede o s u p r i m e n t o
de oxaloacetato. A a b u n d â n c i a de acetil-CoA resulta d e mobili-
zação excessiva de ácidos graxos d o tecido a d i p o s o e d e g r a d a ç ã o
excessiva d o s ácidos graxos p o i (3-oxidação n o fígado. O excesso
de acetil-CoA r e s u l t a n t e é desviado p a r a u m a via alternativa n a
m i t o c ô n d r i a para a f o r m a ç ã o de: (1) ácido acetoacético, (2) ácido
P-hidroxibutírico e (3) a c e t o n a , os três c o m p o s t o s c o n h e c i d o s
c o l e t i v a m e n t e c o m o corpos cetônicos (Figura 23-9). A cetose, por-
t a n t o , desenvolve-se a paTtir d e p r o d u ç ã o excessiva d e acetil-CoA,
à m e d i d a q u e o c o r p o t e n t a o b t e r energia necessária d a g o r d u r a
a r m a z e n a d a n a a u s ê n c i a de u m s u p r i m e n t o a d e q u a d o de meta-
bólitos d e c a r b o i d r a t o ( C a p i t u l o 23). T o d o o processo d a cetose
é revertido por m e i o d a r e s t a u r a ç ã o de u m a c o n c e n t r a ç ã o ade-
q u a d a de c a r b o i d r a t o s . E m casos de privação d e a l i m e n t o s , a
r e s t a u r a ç ã o consiste e m ingestão a d e q u a d a de c a r b o i d r a t o s . N o
diabetes mellitus, a cetose é revertida pela a d m i n i s t r a ç ã o de insu-
lina, q u e p e r m i t e q u e a glicose circulante n o s a n g u e seja c a p t a d a
pelas células. U m a vez r e s t a u r a d o o e s t a d o m e t a b ó l i c o n o r m a l , a
liberação de ácidos graxos a p a r t i r d e tecido a d i p o s o é s u p r i m i d a
e a p r o d u ç ã o r e t o m a d a de o x a l o a c e t a t o possibilita q u e ele seja
c o n j u g a d o c o m acetil-CoA, q u e inibe f o r m a ç ã o posterior d e
c e t o n a (Figura 23-8).
Acilgliceróis (Ésteres d e Glicerol)
O glicerol é u m álcool c o m três c a r b o n o s q u e c o n t é m u m g r u p o
h i d r o x i l e m cada u m de seus á t o m o s de c a r b o n o . Q u i m i c a m e n t e ,
é possível esterificar cada g r u p o hidroxil c o m u m ácido graxo
(Figura 23-10). O s dois á t o m o s d e c a r b o n o t e r m i n a i s n a m o l é c u l a
d e glicerol são q u i m i c a m e n t e e q u i v a l e n t e s e d e s i g n a d o s c o m o a.
e a 1 . O c a r b o n o c e n t r a l é c h a m a d o de (3. U m sistema de marca-
ção alternativo c o m u m usa o n u m e r a i 1 p a r a o a - c a r b o n o , 2 p a r a
p - c a r b o n o e 3 para o a ' - c a r b o n o . A classe d e acilglicerol é deter-
m i n a d a pelo n ú m e r o de g r u p o s acil graxos presente: (1) u m ácido
graxo, monoacilgliceróis (monoglicerídeos); (2) dois ácidos graxos,
diacilgliceTÓis (diglicerídeos); e (3) três ácidos gTaxos, triacilglice-
róis (triglicerídeos). E m u m monoacilglicerol, o ácido graxo p o d e
ser ligado a q u a l q u e r d o s três á t o m o s de c a r b o n o . Por exemplo,
1 - m o n o g l i c e r i d e o i n d i c a q u e u m ácido graxo está f i x a d o ao a -
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular CAPÍTULO 2 3 419

Deficiência de insulina

Glicose I C i l i i ;*>*'
intracelular sílica

a-glicernifirwíiro Fo&íaticiuoe Glicet(d«x*>

Derivado* de acil-CoA dc cadeia longa Á c í d ios graxos

R—CH,-CK,-CHÍ-CO—SCoA
Pn:tciiu riruvato de fcdibenol
\
R — C L L J — C H ^ C H — C O — S < :» A
K'—eu.>-cc> SCoA
AJanina Piruvato Tjkíato
•HvO

CvAStl OH
V K -CHj-CH Cl li t:0—SCoA
Acecil-CoA • — —
\ o
NADPI: ri
\ \ R Cll, C-CHj-CO—SCnA £i

v
X*DP

Aceto*ic?ti l CoA (^hidruxi-|J-inctilglutaril-CoA

Ácidos graxos CO.
v-> Piocdna

l
Atctoaiviato ÀCClOlldL
Aspartato Oxaloacenatio
.vVXHilluUratO C HutaitlltiU

P-taidroxibutiratc
PfiHelna t:0,

Figura 2 3 - 6 Relações metabólicas entre intermediários d o metabolismo do carboidrato, gordura e proteína.

Observar q u e o acetil-CoA é produzido a partir de carboidratos e gordura. O s aminoácidos glicogênicos,
derivados do metabolismo da proteína, e n t r a m nas vias glicolíticas como oc-acetoácidos. Os aminoácidos
cetogênLcos e n t r a m c o m o acetil-CoA.

carbono. Este sistema de numeraçao aplica-se a todos os ac ilgli-
ceróis, incluindo os fosfoglicerídeos (Figura 23-11).
Os triglicerídeos constituem 9 5 % da gordura de armazena-
m e n t o no tecido e são a forma predominante de ésteres de glice-
ril encontrados n o plasma. Os resíduos de ácido graxo encontra-
dos em: (1) monoglicetídeos, (2) diglicerídeos ou (3) triglicerídeos
variam consideravelmente e, geralmente, incluem combinações
diferentes d e ácidos graxos de cadeia longa (Tabela 23-1). Em
geral, os triglicerídeos de oTigem vegetal, como o milho, girassol
e cártamo t e n d e m a ser enriquecidos nos ácidos graxos insatura-
dos, como O C ] 8 :2 OU ácido linoléico e são óleos líquidos em
temperatura ambiente. Os triglicerídeos de animais, especial-
mente os ruminantes, tendem a ter ácidos saturados, que variam
de C 1 2 :0 até C ] 8 :0 e são sólidos em temperatura ambiente.
Os triglicerídeos dietéticos são digeridos n o d u o d e n o e absor-
vidos no íleo proximal. Através da ação das lípases pancreáticas
e intestinais e na presença de ácidos biliares, eles são primeira-
mente hidrolisados em glicerol, monoglicerideos e ácidos graxos.
Após absorção, estes componentes dos triglicerídeos são nova-
mente reunidos como triglicerídeos nas células epiteliais intesti-
nais e, então, são acondicionados com o colesterol e apo B-48
para f o r m a r quilomíerons. O s quilomíerons são secretados n o
sistema linfático e subseqüentemente atingem a circulação. Os
triglicerídeos são o combustível metabólico principal carregado
pelos quilomíerons e são distribuídos para o fígado e células
periféricas após serem hidrolisados em ácidos graxos pelas
lípases.
O u t r a classe importante de acilgliceróis é aquela que contém
ácido fosfórico n o terceiro á t o m o de carbono (a 1 ), os chamados
fosfoglicerídeos (Figura 23-11). Em sua forma mais simples, o grupo
A é u m á t o m o de hidrogênio e a molécula é chamada de diacil-
fosfoglicerídeo. Em geral, o grupo A é alguma forma de álcool,
como: (1) colina, (2) serina, (3) inositol ou (4) etanolamina. Se o
grupo A for colina, por exemplo, a molécula é chamada de fosfa-
Lidiicolirm (lecitina). Se for etanolamina, a molécula é chamada de
fosfatidiletanolamina. C o m o os tipos de resíduos de ácido graxo
R.! e R 2 são variados, inúmeros tipos de fosfolipídios são forma-
dos. Estes fosfoglicerídeos são nomeados de acordo com os ésteres
acil d o ácido graxo fixados e m C - l e C-2 d o glicerol. Os ácidos
graxos saturados são tipicamente esterificados para a posição C-l,
e n q u a n t o os ácidos graxos poliinsaturados f r e q ü e n t e m e n t e são
fixados na posição C-2. Nas membranas mitocondriais internas,
encontram-se os fosfoglicerídeos mais complexos, conhecidos
como cardiolifiiTias. Eles são derivados de duas moléculas de fos-
foglicerídeos unidos por u m a p o n t e de glicerol.
Esfingolipídios
Os esfingolipídios são a q u a r t a classe de lipídios encontrada em
seres h u m a n o s e são derivadas do aminoálcool esfingosina (Figura
23-12). Este álcool diídrico c o m 18 carbonos contém u m grupo
a m i n o em C-17. U m ácido graxo que contém 18 o u mais átomos
420 PARTE IV Analitos

á H2C-0 — R,
CoA
1-Monoglicerídeo HO—C^H
Acetil-CoA
H,D:—OH

"XoA
O H.C-OH
R c 0-11
CoASH 2-Monoglicerídeo 2— —
O v 0
H,^—OH
o

U
ÍH2 j]
COASH H ,C^ x
CoA O ^ C H 3
H,C—C—OH
O H2C^O— ü— Rj
í (!:H,
1,2-Diglicerídeo R3-IU-AH
O^^CúA H3D;—OH

|3'hidroxi- Ace to a ce t i 1-C oA

p-metilglutaril-CoA
H2C—O—<ü—R]

1,3-Diglicerídeo ho—ÍH O
O
H
h 3 Í ^ O _ Ü _ R ,
HnC^^CoA

O H2C—O—ü—R,
P-hidroxibutirato
desidrogenase
°s Jp Triglicerideo R 2 —C—O—CH o
fc
"-Ç
(no fígado) I
—O—C—R3
Íh2 CH^
A
'
NADH + H
_
NAD
© í Figura 2 3 - 1 0 Estrutura e classificação de ésteres de glicerol
o ^ ^CH3
(acilgliceróis). R], R z e R3 são ácido(s) graxo(s) de comprimentos de
Acetoacetato cadeia variados.
p-hidroxibutirato

Espontâneo Ácido fosfatídico

O HJC-O—U—RJ A = —H
R2—^—"O—<^H O
Fosfatidiletanolamina*
Acetona H 2 (Í:—o——o—a ©
A = CH2CH2NH3
ÍQ
F i g u r a 2 3 - 9 Formação d e corpos cetônicos.
Fosfatidilcolina (lecitina) @
A - —CH 2 CH 2 N(CH 3 ) 3

de carbono é fixado ao grupo a m i n o através de u m a ligação de Fosfatidilserina* ®

a m i d o pata formar CÉramida. Esta é u m a estrutura intermediária A = —CH 2 CHNH 3
na formação de: (1) esfingomielina, (2) galactosilceramida e (3) COO®
glicosilceramida (Figura 23-12). Além disso, as ceramidas que OH OH
contêm açúcar t a m b é m têm u m grupo sulfato fixado e m geral à Fosfatidilinositol
posição 2 d o resíduo de galactose para formar os sulfatídeos. As A =
glicosilceramidas t a m b é m têm porções adicionais de monossaca-
rídeos, como: (1) galactose, (2) N-acetilgalactosamina e (3) ácido * C o m u m e n t e conhecidos c o m o cefahnas.
N-acetilneuraminico, para formar globosídeos e gangliosídeos
complexos- Os gangliosídeos são especialmente abundantes nas Figura 23-11 Estruturas de fosfoglicerídeos e grupos álcool comuns
membranas da substância cinzenta do cérebro, e n q u a n t o os gli- associados a eles. R j e R 2 são ácidos graxos de comprimentos de átomo
cosfingolipídios têm u m papel mais geral nas interações celulares de carbono variáveis.
e são t a m b é m antígenos de grupo sanguíneo e tumores.

Prostaglandinas precursor recebeu o n o m e trivial de ácido fjrosttmóico. Por conven-

As prostaglandinas e compostos relacionados são derivados de
ácidos graxos, principalmente araquidonato. Os tromboxanos,
alguns derivados de hidroperoxi- e hidroxil-ácido graxo e leuco-
trienos são todos quimicamente relacionados às prostaglandinas.
Estes lipídios bioativos exercem ações fisiológicas diversas (Tabela
23-2) em concentrações de apenas 1 (Jg/L.
As prostaglandinas são u m a série de ácidos graxos insatura-
dos C 2 0 que c o n t ê m u m anel de ciclopentano; o ácido graxa
ção, as prostaglandinas são abreviadas como PG, com a classe
designada par u m a letra maiúscula (A, B, E, F, G, H e I), seguida
de u m n ú m e r o e, em alguns casos, u m a letra grega (Figura 23-13).
C o m exceção da P G G e P G H , que têm a mesma estrutura em
anel (endoperóxido de ciclopentano) e são intermediárias na
formação de outras PG, as letras referem-se a estruturas anelares
diferentes. O n ú m e r o após a letra maiúscula em geral é subscrito
e é usado para designar o n ú m e r o de ligações insaturadas nas
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular CAPÍTULO 2 3 421

&f
HO H O O
A
HA—^=C(CH2)L2CH3
L .•
H2N—ÍH
HJA—OH
H

R,
Cl"
Esfingosina PGA PGB

HO H O HO
,Ri
/"X
o H(|:—A=Ç(CH2)|2CH3
R-C-NH-CH

H5C—OH
H
vX R3

Ceramida
IIÕ HÓ
PGE PGF

HO H o
I ^.^OH
O
R-Ü-NH-AH
HC—C=CH(CH2)|3CH3
o
J
©
H2C—O—P—O—CH^CH2N(CH3)3
ó©
•R.
Esfingomielma O •"/"•-•

HO H
HA—C=C(CH2)12CH3
KJG IIO
Q1
R—(!- nh^H A CH5oh Itrll PGI

0
O H
H 2 C—O O !
Figura 2 3 - 1 3 Principais classes de pTostaglandinas (séries). Ri e R3
são cadeias laterais de prostaglandinas.
1
OK
Galactosilceramida

TABELA 2 3 - 3 PTostaglandinas de Ocorrência Natural (PG)

HO H
PG Primária Outras PG
O HC—A —C(CH 2 )NCH 5
PGE1 PGA
Í-Ü-NH-AH H CH3 OH
PGF1A PGA?
H2C—O O ^ PGÈ2 19 A -0HPGA
'/I PGF!Q 19A-0HPGA;
'ÒH PGG, PGBT
Lin PGH2 PGB2
Glicosilceramida PGÍ2 19A-GHPGB 2
Trcmboxano Aa PGE3
Figura 2 3 - 1 2 Estruturas dos esfingolipídios. Tromhoxano B2 PGF3TT

TABELA 2 3 - 2 Efeitos Mediados pela Prostaglandina

Local de Ação Resposta Fisiológica sete, j u n t a m e n t e c o m dois t r o m b o x a n o s , são c o m u m e n t e e n c o n -
t r a d a s e m t o d o o c o r p o . Estas são c h a m a d a s de prostaglandinas
Músculo liso arterial Altera pressão arterial
primárias.
Músculo uterino Induz 0 parto, aborto terapêutico
E m b o r a as p r o s t a g l a n d i n a s p a r e ç a m s e m e l h a n t e s a h o r m ô -
Trato gastrointestinal inferior Aumenta motilidade
n i o s n a ação, elas são diferentes d o s h o r m ô n i o s c o n v e n c i o n a i s
Músculo liso brônquico Broncospasmo
Plaquetas Aumenta a coagulação
p o i s são sintetizadas n o local de ação e são p r o d u z i d a s e m quase
Capilares Aumenta permeabilidade t o d o s os tecidos. O ácido linoléico (Cig:2 9,13 ) é p r e c u r s o r de dois
Estômago Aumenta secreção do ácido gástrico d o s três ácidos graxos c o m 20 c a r b o n o s q u e f o r m a m as prosta-
Tecido adiposo Inibe lipólise de triglicerídeos g l a n d i n a s ; o ácido l i n o l ê n i c o (Cia:2 9 , n 1 5 ) é o u t r o p r e c u r s o r . Estes
ácidos graxos são c o n s i d e r a d o s essenciais p o r q u e n ã o são sinteti-
zados n o c o r p o e p o r t a n t o t ê m de estar presentes n a dieta. O s
cadeias laterais de P G , e n ã o d e n t r o d a e s t r u t u r a a n e l a r e m si. O t r ê s ácidos graxos C 2 o f o r m a d o s e m seguida são: (1) C 2 o:3 s , a , n
uso d a letra grega ( a o u p) aplica-se a p e n a s às séries F e refere-se (ácido eícosatrienóico), (2) C 2 0 : 4 ^ 1 , , M (eicosatetraenóico o u ácido
ao g r u p o hidroxil e n c o n t r a d o e m C-9. N a série a , o g r u p o hidro- a r a q u i d ô n i c o ) e (3) C 20 ;5 8,11,14,11 (ácido e i c o s a p e n t a e n ó i c o ) . Estes
xil projeta-se abaixo d o p l a n o d o anel n a m e s m a direção q u e o três ácidos graxos f o r m a m as séries PG], P G 2 e P G 3 , respectiva-
g r u p o h i d r o x i l G i l , e n q u a n t o a série P d e n o t a que o h i d r o x i l m e n t e . U m a vez f o r m a d a s , as p r o s t a g l a n d i n a s a p r e s e n t a m efeitos
e m G 9 está a c i m a d o p l a n o d o anel. Dezesseis p r o s t a g l a n d i n a s d e c u r t a d u r a ç ã o e são catabolizadas e m u m p e r í o d o d e s e g u n d o s .
d e o c o r r ê n c i a n a t u r a l f o r a m descritas (Tabela 23-3), m a s a p e n a s A inativação da p r o s t a g l a n d i n a parece ser m e d i a d a p o r d u a s
422 PARTE IV Analitos
enzimas, 15 tt-h idroxi-prostaglandina desidrogenase e A 13 -prosta-
glandina redutase. As prostaglandinas não são armazenadas.
Entretanto, os ácidos graxos precursores C 2 0 estão presentes n o
tecido, fixados à posição C-2 dos fosfoglicerídeos. Q u a n d o a
síntese de prostaglandina é estimulada, o precusor C 2 0 é hidroli-
sado dos fosfolipídios pela fosfolípase A 2 . A liberação do ácido
graxo C-70 parece ser a etapa limitante da velocidade na síntese
de prostaglandina e é estimulada por vários mediadores, como a
bradicmma, trombinas ou angiotcnsina II.
Embora seja provável que todas as prostaglandinas sigam u m a
via sintética semelhante, C 2 0 :4 (ácido araquidônico) foi o mais
intensivamente estudado e é usado para ilustrar a via geral (Figura
23-14). U m a vez liberado, o ácido araquidônico acompanha uma
de duas vias. A via da lipooxigenase produz o ácido 12-L-hidrope-
roxi-5,8,10,14 eicosatetraenóico (HPETE); o H P E T E espontanea-
mente decompõe-se em ácido 12-L-hidroxi-5,8,10,14 eicosatetrae-
nóico (HETE). A via alternativa é mediada pela ciclooxigenase
(COX) para produzir os endoperóxidos P G G 2 e P G H 2 . O que
controla a entrada em u m a via específica continua sendo especu-
lação; entretanto, sabe-se que os fármacos antunflamatórios não-
esteroidais ((NSAIDs): ácido acetilsalicílico, ibuprofeno e indo-
metacina] inibem as enzimas COX, reduzindo assim a síntese de
prostaglandina. COX-1 e COX-2 são duas isofotmas de COX.
COX-1 é constitutivamente expresso nas células, e n q u a n t o COX-
2 é sintetizado em resposta a inflamação. Os fármacos que são
específicos para COX-2 foram desenvolvidos para reduzir os
efeitos colaterais nefrogênicos e ulcerogênicos da inibição de
COX-1, mas o uso prolongado destes fármacos recentemente foi
associado a a u m e n t o da incidência de infarto do miocárdio, o
que p o d e limitar sua utilidade clínica.
P G I 2 J O U prostaciclina, é derivada do ácido araquidônico
(Figura 23-13) n o endotélio vascular. Ela tem u m a ação vasodila-
tadora potente, especialmente nas artérias coronárias, e t a m b é m
Fosfoglicerídeo com grupo C2Ü: 4 no segundo carbono
J-aí/oíipii.íe A?
(aumentada pela angiotemina JI,
{jradicinittfl e crornfiína)
Lisofosfogl icei í deo + ácido araquidônico (C;o4)
i y fCiclooxiganflse
•
HPETF. PCrG,
IHill. HHI
X
PGE, PGI. TXA,
y
PGF,. TXB.
Figura 2 3 - 1 4 Síntese d e p r o s t a g l a n d i n a s a partir de p r e c u r s o r
a r a q u i d ô n i c o . PG, p r o s t a g l a n d i n a ; TX, t r o m b o x a n o ; H P E T E , H E T E ,
H H T 12-L-hidroxi-5,8 ,10-ácido h e p t a d e c a t r i e n ó i c o .
é responsável pela inibição da agregação plaquetária. O trombo-
xano A2 é sintetizado a partir d o ácido araquidônico, mas t a m b é m
é produzido pelas plaquetas. Ele tem o efeito oposto da prostaci-
clina porque estimula a contração do músculo liso arterial e
aumenta a agregação plaquetária. Ele tem u m a meia-vida de cerca
de 30 segundos e é rapidamente convertido em seu metabólito
inativo, tromboxano B 2 . OS tromboxanos são ligeiramente dife-
rentes em estrutura de outras prostaglandinas, pois contêm anéis
de seis lados de cinco átomos de carbono e u m á t o m o de oxigê-
nio (Figura 23-15).
Terpenos
Os terpenos são polímeros da u n i d a d e de isopreno com cinco
carbonos e incluem vitaminas A, E e K (Capítulo 27) e os doli-
cóis, que desempenham u m papel importante na glicosilação da
proteína.
UPOPROTEÍNAS
Os lipídios sintetizados n o fígado e intestino são transportados
n o plasma nos complexos macromoleculares conhecidos como
lipoproteínas.
Química
As lipoproteínas são partículas tipicamente esféricas com lipídios
neutros não polares (triglicerídeos e ésteres de colesterol) em seu
núcleo e lipídios anfipáticos mais polares (fosfolipídios e coleste-
rol livre) na sua superfície (Figura 23-16). 5 Eles t a m b é m contêm
u m a ou mais proteínas específicas, chamadas apolipoproteínas,
em suas superfícies. A associação dos lipídios d o núcleo com o
fosfolipídio e apolipoproteínas é não-covalente, ocorrendo prima-
riamente através da ligação do hidrogênio e forças de van der
Waals. A ligação dos lipídios às apolipoproteínas é fraca e possi-
bilita a troca de lipídios e apolipoproteínas entre as lipoproteínas
plasmáticas e entre as membranas celulares e lipoproteínas. A
ligação da Iipoproteína é suficientemente forte, contudo, para
possibilitar que as várias classes de lipoproteínas sejam isoladas
por u m a variedade de técnicas analíticas.
Classificação
As lipoproteínas têm propriedades físicas e químicas diferentes
(Tabela 23-4) porque contêm diferentes proporções de lipídios e
proteínas (Tabela 23-5). Tradicionalmente, as lipoproteínas foram
categorizadas com base nas diferenças em suas densidades hidra-
tadas, como determinado pela ultracentrifugação. Estas catego-
rias incluem: (1) quilomícrons, (2) Iipoproteína de muito baixa
densidade (VLDL), (3) Iipoproteína de densidade intermediária
X)H
-Q -
ÕH
T r o m b o x a n o A : (TXAj)
OH
HO' X>
ÕH
T r o m b o x a n o B 2 (TXB 2 )
Figura 2 3 - 1 5 Estnituras de tromboxanos.
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular CAPÍTULO 2 3 423

Apolipoproteina (IDL), (4) lipoproteína de baixa densidade (LDL), (5) lipoprote-

Colesterol
não-esterificado Éster de ína de alta densidade (HDL) e (6) lipoproteína(a) [Lp(a)]. Hm
colesteril
geral, as lipoproteínas maiores contêm mais lipídios, triglicerí-
deos e éster de colesteril d o núcleo, são mais leves em densidade
Fosfolipídlo Triglicerídeos
e contêm u m a porcentagem m e n o r de proteína. N o estado de
jejum, a maior parte dos triglicerídeos plasmáticos está presente
n o VLDL. N o estado pós-prandial, os quilomíerons aparecem
temporariamente e contribuem de maneira significativa para a
concentração de triglicerídeos plasmáticos totais. O LDL carrega
cerca de 7 0 % do colesterol plasmático total, mas muito p o u c o
triglicerídeo (Tabela 23-5) O H D L tipicamente contém cerca de
2 0 % a 30% d o colesterol plasmático.
Lp(a) é u m a classe distinta de lipoproteínas 8 (Tabela 23-5),
que está estruturalmente relacionada com o LDL porque ambas
as lipoproteínas possuem u m a molécula de apo B-100 por partí-
cula e apresentam composições lipídicas semelhantes. Diferente-
m e n t e do LDL, a Lp(a) t a m b é m contém u m a proteína rica em
carboidrato [apo(a)] que é covalentemente ligada a apo B-100
J a S E > - - ^ através de ligação dissulfídica. A apo(a) exibe u m a homologia de
seqüência significativa com o plasminogênio e u m alto grau de
Figura 2 3 - 1 6 Estrutura de uma partícula de lipoproteína típica. variação n o comprimento da cadeia de polipeptídeo (Figura 23-
17). A apo(a) contém u m a disposição em tandem do motivo de
uma proteína chamada de d o m í n i o krmgíe. Os polimorfismos
de t a m a n h o diferente da apo(a) são causados por u m n ú m e r o
variável de domínios kríngie 4 do tipo 2.

TABELA 2 3 - 4 Características de Lipoproteínas Plasmáticas Humanas

Variável Quilomícron VLDL IDL LDL HDL Lp(a)

Densidade (g/mL) <0,95 0,95-1,006 1,006-1,019 1,019-1,063 1,063-1,21.0 1,040-1,130

Mobilidade eletroforétíca Origem Pré-beta Entre beta e Beta Alia Pré-beta
pré-beta
Peso molecular (Da) 0 , 4 - 3 0 x 10 s 5 - 1 0 x IO 6 3,9-4,8 x 10 6 2,75 x 10 6 1,8-3,6 x 10 5 2,9-3,7 x 10 6
Diâmetro (nm) >70 26-70 22-24 19-23 4-10 26-30
Raíão Lipídio: lipoproteína 99:1 90:10 85:15 80:20 50:50 75:26-64:36
Principais lipídios Triglicerídeos Triglicerídeos Triglicerídeos Ésteres de Foslolipídios Ésteres de
exógenos endógenos endógenos, colesteril colesteril,
ésteres de fosfolipídios
colesteril
Principais proteínas Al B-100 B-100 B-100 A-l (a)
B-48 C-l E A-ll B-100
C-l C-ll —

C-ll C-lll
C-lll E
V L D L , lipofwoteíníls de mui to baixa densidade, I D L , lipoproteínas de densidade intermediária, H D L , iifJOfJTOtemas de alta densidade, Lp(a), lipoproieinã(a).

TABELA 23-5 Composição Química (%) de Lipoproteínas Plastmátícas Humanas Normais

Esteres de lipídios COMPONENTES DA SUPERFÍCIE LIPÍDIOS BO NÚCLEO
do Núcleo Colesterol Fosfolipídios Apolipoproteínas Triglicerídeos Colesterol

Quilomíerons 2 7 2 86 3
VLDL 7 18 8 55 12
I0L 9 19 19 23 29
LDL 8 22 22 6 42
HDL 2 5 33 40 5 17
HDL 3 4 25 55 3 13

DÈ Havei RJ, Kane JF. Incroduction: Smwture and meiaboltsm of pfosma !JF)OT>RO leias Em • Scriver CR, Beauãet AL, S!j WS, Valle D, eds. The metabolic and molecular bases of
inherited diseases. 7° ed. VOL 11. Nova York. McGraiv-HíII, 1995 1841-50 Reproduzido com permissão de The McGraw-Hill Companies.
V L D L , lipoproteína de muito baixa densidade; IDL, UpoproleJna de densidade inrermedidna H D L , lipoproteína de alta densidade. Componentes de superfície e Jípídios do niícieo
fornecidoí como porcentagem de massa seca.
424 PARTE IV Analitos

As lipoproteínas t a m b é m são separadas por várias técnicas de
eletroforese. C o m u m p H de 8,6, o H D L migra com as a-globu-
linas, o LDL com as j3-globulinas e V L D L e Lp(a) entre a e |3-
globulinas, na região pré-p-globulinas. O IDL forma u m a faixa
ampla entre p e pré-P-globulinas. Os quilomícrons c o n t i n u a m n o
p o n t o de aplicação. As classes principais de Iipoproteína foram
nomeadas de acordo com as localizações na eletroforese: pré-[3-
lipoproteína, VLDL; |3-lipoproteína, LDL; e a-lipoproteína,
H D L . A separação por eletroforese das lipoproteínas era a base
para a classificação fenotípica mais antiga (Tipo 1-5) das dislipi-
demias familiares.
APOLIPOPROTEÍNAS
As apolipoproteínas são os componentes protéicos das lipopro-
teínas. Algumas de suas características físicas e principais funções
estão resumidas na Tabela 23-6. Cada classe de Iipoproteína tem
várias apolipoproteínas em proporções diferentes. Apo A-I é a
principal proteína n o H D L . A p o C-I, II, III e E estão presentes
em várias proporções em todas as lipoproteínas. Apo B-100 é a
principal proteína n o LDL, e apo B-48, que é produzida a partir
d o R N A mensageiro de B-100 (mRNA) por u m processo de
edição do R N A , está nos quilomícrons. Tanto apo B-100 como
apo B-48 estão firmemente ligadas às lipoproteínas e não realizam
trocas entre as diferentes lipoproteínas como as outras apolipo-
proteínas. As apolipoproteínas têm as seguintes funções princi-
pais: (1) modular a atividade das enzimas que agem nas lipopro-
teínas, (2) manter a integridade estrutural d o complexo lipo-
proteico e (3) facilitar a captação de Iipoproteína agindo como
ligandos para receptores de superfície celular específicos. A
maioria das apolipoproteínas c o n t é m Hélices anfipáticas, que são
a-hélices, sendo que uma face contém aminoácidos hidrofóbicos
e a outra face contém aminoácidos polares ou carregados. Esta
característica permite que as apolipoproteínas se liguem aos lipí-
dios e ainda interajam com o ambiente aquoso circundante.
METABOLISMO DAS LIPOPROTEÍNAS 57
O metabolismo da Iipoproteína c o m u m e n t e é dividido nas vias:
(1) exógena, (2) endógena, (3) transporte de colesterol intracelu-
lar e (4) transporte reverso de colesterol.
Via Exógena
O papel da via exógena é o transporte de lipídios dietéticos que
são absorvidos pelo intestino até o fígado e células periféricas e
é amplamente mediado pelos quilomícrons (Figura 23-18). Qui-
lomícrons nascentes, que são 9 0 % de triglicerídeos, são primei-
ramente agrupados pela proteína de transferência microssómica
(MTP) n o retículo endoplasmático dos enterócitos pela combina-
ção de triglicerídeos e outros lipídios c o m apo B-48. Os quilomí-
crons são secretados na linfa e, após entrarem na circulação,
adquirem d o H D L lipoproteínas adicionais, como a apo E e a
apo C. A apo C-II é u m ativador potente da Iipoproteína lípase
(LPL), que é fixada à superfície luminal das células endoteliais e
rapidamente hidrolisa os triglicerídeos nos quilomícrons em
ácidos graxos livres. Os ácidos graxos liberados c o m b i n a m com
albumina e são captados pelas células musculares como fonte de
energia ou pelas células adiposas para armazenamento de energia
como triglicerídeos. C o m o conseqüência da lipólise, os quilomí-
crons são transformados em partículas remanescentes de quilo-
mícrons menores e excesso de fosfolipídios de superfície, e as
apolipoproteínas A são transferidas de volta para o H D L . Os
quilomícrons remanescentes ainda retêm, contudo, a maior parte
de seus triglicerídeos. Mas diferente dos quilomícrons nascentes,
eles são rapidamente captados pelo fígado ("endocitados") pelos
receptores hepáticos de remanescentes que reconhecem apo E e
apo B-48. Os triglicerídeos distribuídos para o fígado passam por
p-oxidação para fornecer eneTgia para a atividade de biossíntese
d o fígado. Eles t a m b é m são armazenados como gotas lipídicas

TABELA 2 3 - 6 Classificação e P r o p r i e d a d e s das P r i n c i p a i s A p o l i p o p r o t e í n a s Plasmáticas H u m a n a s

Peso Localização
Apolipoproteína Molecular (Da) Cromossômica Função Carreador da Lipoproteína

Apo A-l 29.016 11 Co-fator LCAT Quilomícron, HDL

Apo A-ll 17.414 1 Não conhecida HDL
Apo A-IV 44.465 11 Ativa LCAT Quilomícron, HDL
Apo B-100 512.723 2 Secreção de triglicerídeo da proteína de ligação VLDL, IDL, LDL
do fígado para o receptor LDL
Apo-B-48 240.800 2 Secreção de triglicerídeo do intestino Quilomícron
Apo C-l 6.630 19 Ativa LCAT Quilomícron, VLDL, HDL
Apo C-ll 8.900 19 Co-fator LPL Quilomícron, VLDL, HDL
Apo (Mil 8.800 11 Iriibe ativação de C-ll de LPL Quilomícron, VLDL, HDL
Apo E 34.145 19 Facilita captação de qullomícron remanescente Quilomícron, VLDL, HDL,
o ini
• IUL
Apo(a) 187.000-662.000 6 Desconhecida Lp(a)

V L D L , lipoproteínas dé muito baixa densidade; IDL, lipoproteínas de densidade intermediária-, LDL, [ipofwoteíníis de baixa deiuidade; H D L , lipoproteínas de alta densidade; Lp(a),
ItpopToieÍTui(a); LCAT, lecitina colfsleril acilvransfeiase', LPL, hpoprouí-na lípase-
Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular CAPÍTULO 2 3 425

F i g u r a 2 3 - 1 8 Via exógena de metabolismo de lipoproteína. TG, Triglicerídeo; CE) éster de colesterol; FC,
colesterol livre; PL, fosfolipídios; HDL, lipoproteínas de alta densidade; FA, ácido graxo; LPL, lipoproteína lípase;
B, apolipoproteína B-48; A, apolipoproteína A-I; C, apolipoproteína C-ll; E, apolipoproteína E. (De Rifai N.
Lipoproteins and apolipoproteins: Composition, merabolism, and association with coronary heart disease. Arch
Pathol Lab M e d 1986;110:694-701. Copyright 1986, American Medicai Association.)

Figura 2 3 - 1 9 Via endógena de metabolismo da lipoproteína. TG, Triglicerídeo; CE, éster de colesterol;
FC, colesterol livre; PL fosfolipídios; HDL, lipoproteínas de alta densidade; LDL, lipoproteínas de baixa
densidade; IDL, lipoproteínas de densidade intermediária; VLDL, lipoproteínas de muito baixa densidade; FA,
ácido graxo; LPL, lipoproteína lípase; LCAT, lecitina colesterol aciltransferase; B, apolipoproteína B-100; A,
apolipoproteína A-I; C, apolipoproteína C-ll; E, apolipoproteína E. (De Rifai N. Lipoproteins and
apolipoproteins- Composition, metabolism, and association with coronary heart disease. Arch Pathol Lab Med
1986;110:694-701. Copyright 1986, American Medicai Association.)
426 PARTE IV Analitos
intracelulares ou são n o v a m e n t e a c o n d i c i o n a d o s com apo B-100
e n o v a m e n t e secretados nas partículas de VLDL.
Via Endógena
A função primária da via endógena é transferir os lipídios deriva-
dos do fígado, especialmente triglicerídeos, para as células perifé-
ricas para metabolismo de energia. E m e d i a d a pela apo B-100 q u e
c o n t é m lipoproteínas (Figura 23-19). O s lipídios hepáticos repre-
sentam lipídios que foram sintetizados pelo fígado ou lipídios
dietéticos que f o r a m transferidos para o fígado pela via exógena.
O VLDL, que c o n t é m aproximadamente 5 5 % de triglicerídeos
por massa e c o n t é m u m a molécula de apo B-100 e algumas apo
E e apo C, é a principal lipoproteína que c o n t é m apo B que é
secretada pelo fígado. Assim como os quilomícrons, a apo O I 1
presente na superfície do V L D L t a m b é m ativa LPL nas células
endoteliais. Isto leva à hidrólise de triglicerídeos V L D L e à libera-
ção de ácidos graxos livres, que são captados pelas células perifé-
ricas. A lipólise progressiva dos triglicerídeos a partir d o núcleo
da V L D L transforma-o e m IDL e s u b s e q ü e n t e m e n t e e m LDL.
A p r o x i m a d a m e n t e metade das partículas que c o n t ê m apo B-100
nesta via é removida pelos receptores remanescentes hepáticos
antes de passar pela lipólise completa, e a porção restante é depois
convertida d u r a n t e t o d o o c a m i n h o até LDL. O triglicerídeo n o
L D L é posteriormente removido pela proteína de transferência de
ésteres de colesterol (CETP), que remove o triglicerídeo do LDL
e o troca pelos ésteres de colesteril do H D L . D u r a n t e a transfor-
mação lipolitica d o V L D L em partículas menores de LDL, o
excesso de fosfolipídios e apolipoproteínas de superfície, exceto
para apo B-100, é transferido para o H D L . E m b o r a quase todas
as células expressem o receptor de LDL, a maior parte d o L D L
retorna ao fígado através do receptor do LDL, que Teconhece apn
B-100. O colesterol que Tetornou para o fígado é reutilizado para
a secreção de lipoproteínas o u é utilizado na produção de sais
biliares ou é excretado diretamente n a bile.
Via de Transporte de Colesterol Intracelular
A via de transporte de colesterol intracelujar representa os vários
mecanismos homeostáticos que as células usam para m a n t e r seu
equilíbrio de colesterol. E m b o r a o colesterol seja um c o m p o n e n t e
necessário e essencial para todas as m e m b r a n a s celulares, o excesso
de colesterol alterará as propriedades biofísicas das m e m b r a n a s e
mais tarde se tornará tóxico para a célula. Além da p r o d u ç ã o a
partir da biossíntese celular, todas as células t a m b é m recebem
colesterol por meio da captação de lipoproteínas extracelulares
pelos receptores da superfície celular, c o m o o receptor de LDL
(Figura 2.3-20). A maior parte dos receptores de lipoproteína dis-
tribui as partículas de lipoproteína intactas para os lisossomos,
o n d e elas são degradadas. Quaisquer apolipoproteínas associadas
são degradadas e m p e q u e n o s peptídeos e aminoácidos. Além
disso, os ésteres de colesteril são convertidos em colesterol livre
por meio de lipase ácida lisossômica. Pelo fato de a maioria das
células n ã o catabolizar colesterol posteriormente, q u a l q u e r coles-
terol distribuído para a célula é: (1) usado para biogênese da
m e m b r a n a , (2) armazenado nas gotas lipídicas intracelulares após
reesterificação por A C A T ou (3) carregado da célula pela via de
transporte reverso do colesterol. A l é m disso, as células têm u m
mecanismo complexo que envolve t a n t o a regulação transcricional
c o m o pós-transcricional, de forma que qualquer excesso intrace-
lular de colesterol inibirá qualquer biossíntese posterior de coles-
terol por meio d a infra-regulação (downregulation) de H M G - C o A
redutase e várias outras enzimas n a via da biossíntese de colesterol.
O excesso de colesterol intracelular t a m b é m inibirá a expressão
do receptor d o LDL e induzirá a síntese de proteínas envolvidas
n o transporte reverso de colesterol.
Os heparócitos são exclusivos, pois o colesterol intracelular tem
vários outros destinos possíveis. Por exemplo, ele é: (1) novamente
acondicionado e secretado nas lipoproteínas, (2) convertido em sais
biliares ou (3) diretamente excretado na bile. O mecanismo principal
pelo qual as estatinas reduzem a incidência de eventos coronarianos
é u bloqueio da biossíntese de colesterol, que resulta na supra-regu-
lação {upregulation) do receptor do LDL. O aumento da concentração
de receptores LDL, particularmente n o fígado, remove as partículas
pró-aterogênicas de LDL da circulação, sendo assim responsável pelo
efeito antiaterogênico dos fármacos do tipo estatina. Os macrófagos
também são exclusivos, pois expressam altas concentrações de vários
tipos diferentes de receptores scãvenger, que reconhecem formas oxi-
dadas ou outras modificadas de LDL. Diferentemente do receptor
LDL, estes receptores scavenger não são infra-regulados em resposta
ao excesso de colesterol intracelular. Esta é u m a das principais razões
pela qual os macrófagos são propensos a acumular o excesso de
colesterol nas gotas lipídicas intracelulares e formar as chamadas
células espumosas, que d e s e m p e n h a m u m papel importante no
desenvolvimento de placas ateroscleróticas.
Via de Transporte Reverso de Colesterol
A f u n ç ã o da via de t r a n s p o r t e reverso de colesterol é remover o
excesso de colesterol celular das células periféricas e retorná-lo
para o fígado para excreção. Este processo é a m p l a m e n t e m e d i a d o
pelo H D L (Figura 23-21). Pelo fato de a maioria das células peri-
féricas não catabolizar colesterol e não secretar colesterol nas
lipoproteínas, o colesterol sob determinadas circunstâncias irá se
acumular e se tornar tóxico para as células. O H D L ajuda as
células e m sua h o m e o s t a s e d e colesterol removendo-o das células
p o r meio de vários mecanismos diferentes. O colesterol é ativa-
mente b o m b e a d o para fora das células pelo t r a n s p o r t a d o r
A B C A 1 n a apo A-I pobre e m lipídios, q u e se liga às células. Este
processo resulta n a f o r m a ç ã o de H D L nascente em forma de
disco, que é produzido n o fígado e n o intestino. O H D L discoi-
dal t a m b é m interage com A B C A 1 nas células periféricas, tal
c o m o os macrófagos, e remove o colesterol adicional. LCAT, que
esterifica o colesterol n o H D L , d e s e m p e n h a u m papel impor-
tante n o transporte reverso do colesterol p o r q u e os ésteres de
colesteril são m u i t o mais hidrofóbicos do que o colesterol e
c o n t i n u a m presos n o núcleo d o H D L até que sejam removidos
pelo fígado. A esterificação do colesterol n o H D L converte o
H D L nascente e m forma d e disco e m H D L esférico. O H D L
esférico, a forma principal d e H D L na circulação, t a m b é m age
c o m o u m aceptor extracelular para o colesterol que pode ser
removido das células pelo t r a n s p o r t a d o r A B C G 1 ou p o r u m
m e c a n i s m o de difusão passiva.
N o estágio seguinte da via de transporte reverso de colesterol,
o fígado remove seletivamente os ésteres de colesteril do H D L
esférico rico em lipídios e deixa o H D L com depleção de lipídios
retornar para a circulação para rodadas adicionais de remoção de
colesterol das células periféricas. A C E T P t a m b é m d e s e m p e n h a
um papel importante nesta via porque u m a fração significativa de
colesterol que é removida das células pelo H D L é transferida como
ésteres de colesteril no LDL pela C E T P e é subseqüentemente
removida da circulação pelos receptores hepáticos de LDL. A l é m
de promover o efluxo do excesso de colesterol celular, o H D L
t a m b é m tem propriedades antioxidantes, antiinflamatórias e anti-
coagulantes, que ainda não são b e m compreendidas mas provavel-
mente t a m b é m são benéficas n a redução da aterosclerose.
IMPORTÂNCIA CLÍNICA 6
A importância clínica dos lipídios está principalmente associada
a sua contribuição para a coronário paria ( C H D ) e para vários
distúrbios lipoprotéicos.
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular CAPÍTULO 2 3 427

Figura 2 3 - 2 0 Via de transporte de colesterol intracelular. LDL, lipoproteínas de baixa densidade; ACAT,
acil-CoA colesterol aciltransferase-, HMG-CoA redutase, 3-htdrcxi-3-metilglutaril ccenzima A redutase. Devido à
presença de apolipoproteína B-100 em sua superfície, a partícula L D L é reconhecida por u m receptor de LDL
específico em uma depressão revestida e levada para a célula em u m a vesícula revestida (alto, à direita). As
vesículas revestidas fundem-se para formar u m e n d o s s o m o . O ambiente ácido do e n d o s s o m o faz c o m q u e a
partícula de LDL se dissocie dos receptores, q u e r e t o r n a m para a superfície da célula. As partículas de L D L são
levadas para um .isossomo, o n d e a apolipoproteína B-100 é degradada em aminoácidos e o éster de colesterol é
convertido em colesterol livre devido a exigências celulares. A concentração de colesterol celular é auto-regutada.
O s u p r i m e n t o excessivo de colesterol levará a: (1) u m a redução da velocidade de síntese de colesterol por meio
da inibição de H M G - C o A redutase, (2) u m a u m e n t o do a r m a z e n a m e n t o de ésteres de colesteril por meio da
ativação de A C A T e (3) u m a inibição da síntese de novos receptores LDL pela supressão da transcrição do gene
receptor em m R N A . (De Brown MS, Goldstein ]L. H o w LDL receptois influence cholesterol a n d atherosclerosis
Sei A m 1984;251:58-66. Copyright 1984 pela Scientific American, Inc, Todos os direitos reservados).

Associação a Coronariopatias Distúrbios Genéticos do Metabolismo da

O a u m e n t o do colesterol é u m fator na causa das doenças ateros-
cleróticas (Capítulo 33). Já em 1910, W i n d a u s descrevia o coles-
rernl nas lesões de artérias com doença aterosclerótica. Inúmeros
estudos estabeleceram q u e q u a n d o as concentrações de colesterol
total e de colesterol LDL são altas, a incidência e prevalência de
C H D t a m b é m são altas. A o contrário do colesterol LDL, o
a u m e n t o das concentrações de colesterol H D L mostrou ser pro-
tetor para a C H D , tanto em estudos experimentais epidemioló-
gicos como clínicos. Pelo fato de a aterosclerose começar na
infância e poder levar décadas para manifestar-se clinicamente, a
mensuração dos lipídios e lipoproteínas plasmáticas é u m meio
valioso de identificar indivíduos em risco para C H D e determi-
nar a terapia mais apropriada.
Lipoproteína
A maioria dos pacientes com dislipidemia n ã o tem uma única
explicação genética imediatamente identificável ou u m a mutação
gênica. Devido à complexidade do metabolismo da lipoproteína,
muitos fatores que variam em importância, d e p e n d e n d o do indi-
víduo, provavelmente são responsáveis pela maioria dos casos de
hipercolesterolemia. Por exemplo, sabe-se que: (1) dieta, (2) fre-
qüência de exercícios e (3) obesidade d e s e m p e n h a m os principais
papéis na contribuição para hipercolesterolemia. Além disso,
acredita-se que polimorfismos genéticos comuns de muitas: (1)
enzimas, (2) proteínas estruturais e (3) receptores envolvidos n o
metabolismo da lipoproteína têm coletivamente u m impacto
maior na tendência de qualquer indivíduo a desenvolver u m a
428 PARTE IV Analitos

Macrófago
HDL dlscoidal

Figura 2 3 - 2 1 Via de transporte

reverso d e colesterol. HDL, l i p o p r o t e í n a s
de alta d e n s i d a d e ; LDL, l i p o p r o t e í n a s d e
Fígado
baixa d e n s i d a d e ; LCAT lecitina
colesterol aciltransferase; C E T P , p r o t e í n a
Transferidora d e ésteres d e colesterol;
APOA-J, a p o l i p o p r o t e í n a A - l ; A B G A 1 ,
t r a n s p o r t a d o r A l (ATP-biníJirtg cassete
AJ); A B C G I , t r a n s p o r t a d o r G l (ATP-
binding cassete G l ) ; SR-B1, receptor
Scavenger B-l; LDL-R, r e c e p t o r d e L D L .
A p ó s formação n o fígado e i n t e s t i n o , o
H D L n a s c e n t e d isco i dal r e m o v e o
colesterol das células periféricas p o r
meio do transportador ABCA1.
C o l e s t e r o l adicional t a m b é m p o d e ser
r e m o v i d o pelo H D L pelo t r a n s p o r t a d o r
A B C G I e p o r u m m e c a n i s m o de d i f u s ã o
passiva. O L C A T esterifica o c o n t e ú d o
d e colesterol d o H D L p a r a evitar q u e ele
e n t r e n o v a m e n t e nas células O s ésteres
de colesterol são d i s t r i b u í d o s p a r a o
fígado pelo r e c e p t o r SR-B1 o u p e l o LDL-
R após transferir p a r a L D L p e l a C E T P .

dislipidemia. Também há muitas causas secundárias de dislipide-
mia que são u m a conseqüência de distúrbios ou condições rela-
tivamente comuns (Tabela 23-7). Embora raras, as causas genéti-
cas estabelecidas de dislipidemia foram identificadas.
Deficiência na Atividade da Lipoproteína Lipase
A atividade deficiente da lipoproteína lipase devida a mutações
no gene da LPL é um distúrbio autossômico recessivo raro carac-
terizado por hiperqui lo micro ne mia notável, com concentrações
de triglicerídeos que atingem 10.000 m g / d L (113 m m o l / L ) . A
LPL é essencial pata a hidrólise de triglicerídeos nos quílomí-
crons e sua subseqüente conversão em quilomíerons remanescen-
tes. E possível também que a concentração de colesterol V L D L
seja a u m e n t a d a , mas as concentrações de colesterol H D L e LDL
sejam baixas (padrão do tipo I). Este distúrbio f r e q ü e n t e m e n t e é
diagnosticado na infância, em geral após episódios recorrentes
de dor abdominal intensa e ataques repetidos de pancreatite. O s
xantomas eruptivos e lipemia retinahs em geral estão presentes
q u a n d o as concentrações plasmáticas de triglicerídeos excedem
2,000 e 4.000 m g / d L (22,6 a 45,2 m m o l / L ) , respectivamente. A
concentração de triglicerídeos f r e q ü e n t e m e n t e apresenta grandes
oscilações na resposta à dieta e outros fatores que não são b e m
compreendidos. Os indivíduos com este distúrbio não estão pre-
dispostos a doença aterosclerótica. O diagnóstico é feito por meio
da determinação de atividade de LPL n o plasma coletado após a
injeção de heparina nos pacientes para liberar o LPL q u e está
ligado aos sulfatos de heparina e outros glicosaminoglicanos na
superfície das células endotekais.
O apo C-II deficiente ou defectivo, o principal ativador de
LPL, t a m b é m resulta e m u m a deficiência de catabolismo de
quilomícron, embora seja m e n o s grave d o que com mutações
genéticas de LPL. O diagnóstico é feito por meio da demonstra-
ção de baixa atividade de LPL n o plasma pós-heparina que é
restaurada após a adição de apo C-II à mistura do ensaio de LPL.
A deficiência de apo C-II t a m b é m é herdada de m o d o autossô-
mico recessivo, mas ocorre a u m a freqüência ainda mais baixa
do que as mutações de LPL.
Hiperiipidemia Combinada Familiar
A hiperiipidemia combinada familiar (FCHL) é a forma familiar
mais c o m u m de hiperiipidemia. Seu defeito genético, contudo,
é desconhecido. Ela é responsável por até 10% a 15% dos indi-
víduos com C H D prematura. As famílias com F C H L freqüente-
mente apresentam a u m e n t o das concentrações plasmáticas de
colesterol total e LDL (tipo lia) ou triglicerídeos (tipo IV), ou
ambos (tipo Ilb). O s padrões da lipoproteína também variam em
u m indivíduo com o passar d o tempo. Em todos os casos, as
concentrações de apo B-100 são aumentadas devido à superpro-
dução. O LDL nestes pacientes t e n d e a ser p e q u e n o e denso em
virtude de uma redução da razão lipídio-proteína. O colesterol
LDL em geral é apenas modestamente a u m e n t a d o para cerca de
190 m g / d L (2,14 m m o l / L ) , que é mais baixo d o que o tipica-
mente observado na hipercolesterolemia familiar heterozigota
(FH) (350 m g / d L ; 3,95 m m o l / L ) . Os triglicerídeos em geral
ficam entre 200 e 400 m g / d L (2,26 e 4,52 m m o l / L ) , mas p o d e m
ser significativamente mais altos. A concentração de colesterol
H D L em geral é ligeiramente diminuída, particularmente em
pacientes com hipertrigliceridemia.
Hip erapobetalipopro teinemia
A hiperapobetalipoproteinemia é caracterizada por a u m e n t o das
concentrações de apo B-100 com colesterol LDL normal ou
apenas m o d e r a m e n t e a u m e n t a d o . A razão entre o colesterol LDL
e a apo B-100 em geral é de 1,2 ou menos. As concentrações de
colesterol total e triglicerídeos p o d e m ser normais, mas em geral
são aumentadas, e as concentrações de colesterol H D L e apo
A-I são diminuídas. Este distúrbio aparentemente é causado por
u m a superprodução de VLDL e apo B-100 n o fígado. O m o d o
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular CAPÍTULO 2 3 429

lADtLA Causas de Hiperlipidemia Secundária e n h e c i d a , parece estar associada a u m a u m e n t o d a p r o d u ç ã o e / o u

Dislipoproteínemin r e d u ç ã o da r e m o ç ã o de V L D L . A atividade d e LPL nestes indi-
v í d u o s é n o r m a l ou baixa, e a c o n c e n t r a ç ã o plasmática d e a p o
Distúrbio Causa
O I I é n o r m a l . As a p r e s e n t a ç õ e s clínicas i n c l u e m : (1) x a n t o m a s
Exógeno Fármacos: corticosteróides, isotretinoína eruptivos, (2) lipemia Tetinalis, (3) p a n c r e a t i t e e (4) tolerância
(Acutane), tiazídicos, anticonvulsivantes, a n o r m a l à glicose. As complicações ateroscleróticas p r e m a t u r a s
^-bloqueadores, esteróides anabólicos, n ã o são t ã o c o m u m e n t e o b s e r v a d a s c o m o n a F H . Esta s í n d r o m e
determinados contraceptivos orais h e t e r o g ê n e a parece ser h e r d a d a e m u m m o d o a u t o s s ô m i c o d o m i -
Álcool nante.
Obesidade
Endócrino e metabólico Partiria intermitente aguda
Diabetes mellitus Disbetalipoproteinemia (Tipo IH)
Hipopituitarismo A d i s b e t a l i p o p r o t e i n e m i a , t a m b é m c h a m a d a de h i p e r l i p o p r o t e i -
Hipotireoidismo n e m i a d o tipo III, é c a u s a d a p o r u m defeito n a Temoção d e
Lipodistrolia lipoproteínas remanescentes tanto dos quilomícrons como d o
Gravidez V L D L . A a p o E p r e s e n t e n a superfície das partículas d e lipopro-
Doença por depósito Doença de depósito de cistina teínas r e m a n e s c e n t e s interage c o m receptores h e p á t i c o s específi-
Doença de Gaucher cos e facilita a r e m o ç ã o destas partículas. A a p o E existe e m três
Doença de depósito de glicogênio p o l i f o r m i s m o s c o m u n s o u variantes, d e s i g n a d o s Ei, E 3 e E 4 .
Doença de Tay-Sachs juvenil A l g u n s i n d i v í d u o s c o m d i s b e t a l i p o p r o t e i n e m i a são h o m o z i g o t o s
Doença de Niemann-Pick para a i s o f o r m a a p o E 2 l q u e n ã o se liga d e m a n e i r a eficiente aos
Doença de Tay-Sachs receptores h e p á t i c o s d e r e m a n e s c e n t e s , levando, poTtanto, ao
Renal Insuficiência renal crôiíica a c ú m u l o d e partículas r e m a n e s c e n t e s . E m b o r a raras, as m u t a ç õ e s
Síndrome hemolítica-urêmica
genéticas n o gene da a p o E t a m b é m f o r a m associadas ao distúr-
Síndrome nefrótica
bio. As partículas r e m a n e s c e n t e s q u e se a c u m u l a m são ricas e m
Hepática Colestasia intra-hepática recorrente benigna
colesterol, t ê m u m a d e n s i d a d e m e n o r q u e 1,006 g / m L e são
Atresia biliar congênita
c o m u m e n t e c h a m a d a s d e p-VLDL ou l i p o p r o t e í n a P f l u t u a n t e ,
Agudo e transitário Queimaduras
c o m base e m seu p a d r ã o de m i g r a ç ã o eletroforética. T a n t o o
Hepatite
colesterol L D L c o m o o H D L estão mais baixos q u e o n o r m a l
Traumatismo agudo (cirurgia)
intarto do miocárdio
nestes indivíduos. A d i s b e t a l i p o p r o t e i n e m i a t e m início t a r d i o e
infecções bacterianas e virais
r a r a m e n t e se m a n i f e s t a n a infância. A m a n i f e s t a ç ã o clínica mais
Outras Anorexia nervosa distintiva d e d i s b e t a l i p o p r o t e i n e m i a é a p r e s e n ç a de x a n t o m a s
Inanição p a l m a r e s e d e p ó s i t o s d e g o r d u r a a m a r e l a n a s d o b r a s das p a l m a s .
Hipercaicemia idiopática X a n t o m a s t u b e r o s o s e t u b e r o e r u p t i v o s t a m b é m o c o r r e m , mas
Síndrome de Klinefelter n ã o são exclusivos desta s í n d r o m e . C o m u m e n t e se desenvolve
Progeria (síndrome de Hutchinson-Giltord) aterosclerose p r e m a t u r a , p a r t i c u l a r m e n t e n o s m e m b r o s inferio-
Lúpus eritematoso sistêmico res. A i n c i d ê n c i a de d i s b e t a l i p o p r o t e i n e m i a é d e aproximada-
Síndrome de Werner m e n t e 0 , 1 % n a p o p u l a ç ã o geral. A h o m o z i g o s i d a d e d e a p o E 2 ,
c o n t u d o , ocorre e m cerca d e 1 % d a p o p u l a ç ã o n a A m é r i c a d o
N o r t e . P o r t a n t o , a o c o r r ê n c i a dos alelos defectivos é necessária,
mas n ã o s u f i c i e n t e para p r o d u z i r o d i s t ú r b i o . A expressão ou
exato de h e r a n ç a e a prevalência d o d i s t ú i h i o c o n t i n u a m obscu- p e n e t r â n c i a d a d o e n ç a é a p a r e n t e m e n t e m o d u l a d a p o r fatores
ros. Relata-se q u e as m a n i f e s t a ç õ e s c o m u n s à h i p e r a p o b e t a l i p o - genéticos, h o r m o n a i s e / o u fatores a m b i e n t a i s , tais c o m o diabe-
p r o t e i n e m i a t a m b é m o c o r r e m c o m F C H L , s u g e r i n d o associações tes, h i p o t i r e o i d i s m o , o b e s i d a d e e dieta.
m e t a b ó l i c a s e genéticas e n t r e os dois d i s t ú r b i o s .

Hipertríglicerídemia Familiar Hipercolesterolemia Familiar

A h i p e r t r i g l i c e r i d e m i a f a m i l i a r ( F H T G ) é caracterizada p o r u m
a u m e n t o m o d e r a d o d o s triglicerídeos séricos. Acredita-se q u e a
s u p e r p r o d u ç ã o de g r a n d e s p a r t í c u l a s de V L D L c o m c o n t e ú d o d e
triglicerídeos a n o r m a l m e n t e alco é responsável por este d i s t ú r b i o ,
m a s o d e f e i t o g e n é tic o exato é d e s c o n h e c i d o . O c o n t e ú d o d e
colesterol d o V L D L t a m b é m é a u m e n t a d o , m a s a c o n c e n t r a ç ã o
d e colesterol L D L plasmático está d e n t r o d o i n t e r v a l o d e referên-
cia, o q u e sugere q u e h á u m a conversão tardia d e V L D L e m L D L
nestes pacientes. D i f e r e n t e m e n t e d a F C H L , a a p o B-100 n ã o é
elevada. Provavelmente d e v i d o à h i p e r t r i g l i c e r i d e m i a , o colesterol
H D L plasmático e m geral é n o t a v e l m e n t e r e d u z i d o . Este distúr-
b i o parece ser h e r d a d o e m u m p a d r ã o a u t o s s ô m i c o d o m i n a n t e
c o m u m a expressão t a r d i a e u m a f r e q ü ê n c i a e s t i m a d a n a p o p u -
lação d e cerca d e 1 e m 5 0 0 .
Hiperlipoproteinemia do Tipo V
A h i p e r l i p o p r o t e i n e m i a d o tipo V é caracterizada p o r u m a u m e n t o
d o s q u i l o m í c r o n s e V L D L . E m b o r a sua causa exata seja desco-
A F H é c a u s a d a p o r defeitos n a expressão e / o u f u n ç ã o d o recep-
tor d o LDL, q u e se liga e r e m o v e L D L d a circulação. O L D L
e n t ã o se a c u m u l a n o p l a s m a , o q u e resulta e m a u m e n t o de sua
d e p o s i ç ã o n a pele, n o s t e n d õ e s e nas artérias, o n d e causa ateros-
clerose. A a p o B-100, a p r i n c i p a l p r o t e í n a n o LDL, é a u m e n t a d a
p r o p o r c i o n a l m e n t e ao colesterol LDL. A c o n c e n t r a ç ã o de trigli-
cerídeos é n o r m a l ou a p e n a s ligeiramente a u m e n t a d a , e a con-
c e n t r a ç ã o d e colesterol H D L é ligeiramente reduzida. A m a i o r i a
destes pacientes a p r e s e n t a defeitos genéticos n o receptor L D L e m
si. M e n o s c o m u m e n t e , os defeitos e m d u a s p r o t e í n a s auxiliares,
A R H - 1 e Psk9, q u e estão envolvidas n a i n t e i n a l i z a ç ã o ou proces-
s a m e n t o d o r e c e p t o r LDL, t a m b é m p o d e m causar F H . As m u t a -
ções n o r e c e p t o r L D L e P s k 9 são h e r d a d a s e m u m p a d r ã o autos-
s ô m i c o c o - d o m i n a n t e . O s pacientes h o m o z i g o t o s c o m F H são
g r a v e m e n t e atingidos, e n q u a n t o os heterozigotos e m geral t ê m
f e n ó t i p o mais b r a n d o , m a s a i n d a são c l i n i c a m e n t e afetados. O s
defeitos n o A R H - 1 são h e r d a d o s e m u m p a d r ã o a u t o s s ô m i c o
recessivo.
430 PARTE IV Analitos
A FH heterozigota causada por mutações n o receptor LDL é
u m dos distúrbios genéticos mais comuns, com u m a incidência
de 1 em 500 nos EUA. O colesterol LDL plasmático m é d i o em
crianças e adultos heterozigotos em geral é duas ou três vezes
aquele dos indivíduos normais, e n q u a n t o o colesterol LDL dos
homozigotos e m geral é quatro a seis vezes acima d o normal. A
hipercolesterolemia f r e q ü e n t e m e n t e está presente ao nascimento
e persiste d u r a n t e toda a vida. Nos heterozigotos, os xantomas
aparecem por volta d o final da segunda década, e as manifesta-
ções clínicas da doença aterosclerótica aparecem geralmente
d u r a n t e a quarta década.
Nos homozigotos, os xantomas cutâneos geralmente se desen-
volvem aos 4 anos de idade, se n ã o estiverem presentes já ao
nascimento. Se não houver tratamento, a morte por infarto do
miocárdio geralmente ocoire nos homozigotos antes d o final da
segunda ou terceira década de vida.
Apolipoproteína B-100 Defectiva Familiar
A apo B-100 deiectiva familiar é resultado de mutações na apo
B-100, que reduz sua afinidade pelo receptor LDL. O colesterol
LDL é a u m e n t a d o , mas os triglicerideos e colesterol H D L em
geral são normais. Assim como na FH, estes indivíduos também
têm u m a u m e n t o da incidência de C H D . A diferenciação clínica
entre este distúrbio e a FH heterozigota algumas vezes é difícil,
mas o tratamento de ambos os distúrbios é semelhante. A fre-
qüência desta mutação é de 1:500 a 1:600 nos indivíduos hiper-
colesterolêmicos de populações de descendência européia, mas é
muito rara nos não europeus.
Hipoalfalipoprotein em ia
A hipoalfalipoproteinemia, ou baixo colesterol HDL, é causada
por vários defeitos genéticos e f r e q ü e n t e m e n t e está associada a
u m a u m e n t o da incidência de C H D devido ao papel benéfico
do H D L na prevenção da aterosclerose. As mutações ou deleções
do gene da apo A-I são u m a causa rara de hipoalfalipoproteine-
mia. A deficiência de LCAT t a m b é m está associada a baixo H D L .
Estes pacientes geralmente têm córneas turvas, como resultado
de infiltração de lipídios, e glomerulosclerose devida à produção
de u m a partícula de lipoproteína anormal que fica presa n o
glomérulo.
A doença de Tangier é u m distúrbio autossômico recessivo
raro que t a m b é m está associado a u m a redução evidente do
HDL. Assim como com a FH, a elucidação d o defeito genético
na doença de Tangier adicionou muito ao nosso conhecimento
sobre o metabolismo da lipoproteína e a via de transporte reverso
de colesterol em particular. O s principais sinais clínicos da
doença de Tangier são: (1) tonsilas alaranjadas hiperplásicas, (2)
esplenomegalia e (3) neuropatia periférica. Outros possíveis sinais
incluem hepatomegalia e opacidades das córneas. Há u m a u m e n t o
da deposição de ésteres de colesteril em vários tecidos d o corpo,
particularmente macrófagos, que formam células espumosas. A
doença de Tangier é causada por mutações n o transportador
ABCA1, que medeia a primeira etapa da via de transporte reverso
de colesterol, o efluxo de colesterol das células (Figura 23-20). A
A B C A 1 promove a Iipidação da apoA-I com fosfolipídios e coles-
terol. Sem este processo, a apo A-I é rapidamente catabolizada
por meio de depuração renal e hepática devido ao seu t a m a n h o
pequeno. A A B C A l promove a lipidação de apo A-I t a n t o n o
fígado como n o intestino e é responsável pela biogênese da maior
parte d o H D L circulante. O efluxo de excesso de colesterol dos
macrófagos t a m b é m é amplamente d e p e n d e n t e da atividade
de ABCA1, e, sem ele, eles rapidamente acumularão ésteres de
colesterol e f o r ma r ã o células espumosas.
TABELA 2 3 - 8 Painel de Tratamento do Adulto (PTA) III
Classifirarap de Colesterol LDL, Total e
H D L (mg/dL)*
Colesterol LDL <100 Ideal
100-129 Próximo ou acima do ideal
130-159 Limítrofe alto
160-189 Alto
>190 Muito alto
Colesterol total <200 Desejável
200-239 Limítrofe alto
>240 Alto
Colesterol HDL <40 Baixo
>60 Alto
Modíficado de resumo execuiwo do terceiro relato do N d ti on dl Cholesterol Education
pTogiãm (NCEP) Expevt Pane! on Detecúon, Evãluation, and Treatment of Higíi
Btooii Choksterol in Adules (Aduii Treacmenl Panei ÍI1). J A M A 2001 ;2 85:
2456-97.
*LDL, lifjojwndna de baixa densidade-, H D L , lipoproieína de alta de-nsidad,1
D i a g n ó s t i c o de Distúrbios Lipoprotéicos1,9
O diagnóstico inicial de dislipoproteinemia e a determinação da
melhor abordagem de t r a t a m e n t o para u m paciente são ampla-
m e n t e dependentes da mensuração de: (1) colesterol total, (2)
triglicerídeos, (3) colesterol H D L e (4) colesterol LDL, o que
c o m u m e n t e é chamado de perfil lipídico. Os resultados dos
exames de lipídio e lipoproteína, contudo, têm de ser interpreta-
dos n o contexto de u m a anamnese para estabelecimento do risco
de desenvolvimento de C H D . A anamnese e outros resultados de
exames laboratoriais t a m b é m são importantes para determinar
se u m a dislipoproteinemia é resultado de uni distúrbio lipopro-
téico primário ou é conseqüência de u m a ou mais das causas
secundárias de hiperiipidemia (Tabela 23-7), que, se presentes,
provavelmente alterarão a abordagem de tratamento. Diferente-
m e n t e de outros exames laboratoriais, a hipercolesterolemia é
definida com base nos achados de estudos epidemiológicos que
foram usados para estabelecer u m a concentração desejável para
redução do risco de C H D (Tabela 23-8), e não com base em u m
estudo de referência de indivíduos normais.* O exame de coles-
terol é r e c o m e n d a d o a cada 5 anos para todos os adultos acima
de 20 anos de idade e devem envolver a mensuração em jejum
de: (1) colesterol total, (2) triglicerídeos, (3) colesterol H D L e (4)
colesterol LDL calculado o u medido. Se u m a amostra em jejum
não estiver disponível, então apenas o colesterol total e H D L
devem ser considerados. Neste caso, se o colesterol total for maior
que 200 m g / d L (5,18 m m o l / L ) , ou o colesterol H D L for m e n o r
que 40 m g / d L (1,04 m m o l / L ) , então u m perfil lipoprotéico em
jejum é necessário.
Em seguida, deve-se fazer u m a avaliação do risco para C H D .
Esta se baseia nas evidências clínicas de C H D existentes ou na
presença de problemas que estão estreitamente associados à
C H D , como: (1) doença sintomática da artéria carótida (angina),
(2) doença vascular periférica e (3) aneurisma aórtico abdominal,
que são chamados equivalentes de risco de C H D . A avaliação de
risco para C H D t a m b é m é baseada na presença de fatores de
risco conhecidos para C H D , como: (1) hipertensão, (2) taba-
* Várias tabelas de distribuições populacionais de lipídios foram publicadas em
Rifai Kl, Warnick GR. Lipids, lipoproteins, apolipoproceins and other cardio-
vascular rísk factors. Em: Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. Tietz
textbook of clinicai chemistry and molecular diagnostks, 4th ed. Filadélfia
Saunders, 2006-90.3-81.
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular CAPÍTULO 2 3 431

gismo e (3) história familiar ( Q u a d r o 23-1). Colesterol H D L baixo
é considerado u m fator de risco, e n q u a n t o o colesterol H D L alto
é considerado u m fator de risco negativo. Os pacientes sem evi-
dências clínicas para C H D o u sem equivalentes de risco para
C H D , mas com dois ou mais fatores de risco, que n ã o o a u m e n t o
d o colesterol LDL, devem ser posteriormente analisados para seu
risco, usando u m algoritmo baseado n o Estudo Cardíaco de
Framingham, q u e inclui fatores como: (1) idade, (2) sexo, (3)
colesterol total, (4) colesterol H D L , (5) pressão arterial e (6)
tabagismo.
O National Cholestetol E d u c a t i o n Piogram ( N C E P ) / E x p e r t
Panei o n Blood Cholesterol Leveis in C h i l d r e n and Adolescents
e a American Academy of Pediatrics definiram "colesterol alto"
como concentrações de mais d o q u e o percentil 95 para coleste-
rol total e LDL, considerando limítrofes os valores entre os per-
centis 75 e 95 e desejáveis os valores abaixo d o percentil 75. O
colesterol H D L baixo t a m b é m foi d e f i n i d o como u m a concen-
tração abaixo de 35 m g / d L (0,90 m m o l / L ) . As crianças t e n d e m
a ter concentrações mais. altas de colesterol H D L do que os
adultos; portanto, é importante determinai tanto as concentra-
ções de colesterol LDL c o m o H D L antes de classificar u m a
criança como hipercolesterolêmica. Diferentemente dos critérios
para o sistema de classificação do colesterol baseada n o risco
usados em adultos, as diretrizes para crianças e adolescentes
foram baseadas em consenso, e n ã o diretamente na associação
com C H D , em virtude da baixa incidência da doença nesta
QUADRO 2 3 - 1 Principais F a t o r e s d e R i s c o (Exclusiva
d e C o l e s t e r o l LDL)
população. Embora haja alguma preocupação de que as recomen-
dações sejam m u i t o conservadoras, de acordo com a N C E P e a
American Academy of Pediatrics, apenas as crianças com mais de
2 anos de idade devem ser tríadas para hipercolescerolemia
q u a n d o têm u m progenitor com hipercolesterolemia (mais de
240 m g / d L / 6 , 2 1 m m o l / L ) ou u m a história familiar positiva de
C H D precoce. A triagem universal para aqueles com mais de 16
anos de idade foi sugerida com base em u m achado de que até
6 6 % dos adolescentes com a u m e n t o de colesterol LDL são per-
didos em u m protocolo de triagem mais seletivo.
Tratamento de Distúrbios Lipoprotéicos no
Adulto9
As alterações terapêuticas n o estilo de vida (Quadro 23-2) são a
base da terapia para distúrbios lipídicos. A concentração de coles-
terol LDL é usada para decidir sobre a terapia mais apropriada
e para monitorar a efetividade da terapia. As diretrizes para o
tratamento d o adulto para hipercolesterolemia são ilustradas na
Tabela 23-9. Observar que a agressividade d o tratamento d e p e n d e
da categoria de risco d o paciente e de sua concentração inicial
de colesterol LDL. Aqueles pacientes com risco mais alto para
C H D (risco de 10 anos maior que 20%) ou que já apresentam
evidências clínicas de C H D , ou u m equivalente de risco de C H D ,
apresentam o limiar mais baixo para tratamento de colesterol
LDL e a meta mais baixa para colesterol LDL. Idealmente, estes
pacientes, após a terapia, devem ter u m colesterol LDL abaixo de
100 m g / d L (2,59 mmol/L), o que provavelmente envolverá, para
muitos deles, algum tipo de t r a t a m e n t o medicamentoso. Aqueles

• Tabagismo QUADRO 2 3 - 2 A l t e r a ç õ e s T e r a p ê u t i c a s n o Estilo d e

• Hipertensão (pressão arterial > 1 4 0 / 9 0 m m H g ou sob tratamento com Vida para P r e v e n ç ã o d e CHD
medicação anti-hipertensiva)
• Colesterol HDL baixo (<40 mg/dL)* Dieta
• História familiar de CHD prematura {CHD e m parente de primeiro grau do • Gordura saturada < 7 % das calorias, colesterol < 2 0 0 mg/dia
sexo masculino < 5 5 anos de idade; CHD em parente de primeiro grau do • Considerar aumento de tibra (10 a 2 5 g/dia) viscosa (solúvel) e estanóis/
sexo feminino < 6 5 anos de idade) esteróis vegetais (2 g/dia) c o m o opções terapêuticas para aumentar a
• Idade (homens > 4 5 anos; mulheres > 5 5 anos) redução do LDL
Tratamento do peso
Modificada de resumo executivo do terceiro relato dn National C/iclesterai Education
Aumento da Atividade Física
ProgYdm (NCEP) Expert Panei on Detectio-ri, Evaluation, and Traatment of High
Blood CHolesterol in Adults (Adult Treatment Panei JJJ). }AMA 2001;285:2486-97- Modificado de resumo executivo do terceiro relato do National Cfiofesteral Education
LDL, lipoproteína de baixa densidade-, HDL, lipoproteína de alta densidade. Ptogram (NCEP) Expert Panei on Deteciion, Evaluation, and Treíiiment o/High
"Colesterol HDL > 6 0 mg/dL conta como fator de risco "negativa"; sua presença Blood Cholesterol in Adult! (Aiíuit Treaíment Panei IH). JAMA 2001;285:
remoce um fator de risco da comagim total. 2486-97-

TABELA 2 3 - 9 I Metas para o Colesterol LDL e Pontos de Corte para Alterações Terapêuticas do Estilo de Vida (TLCl e Terapia
Medicamentosa nas Diferentes Categorias de Risco
Concentração de LDL na
qual se Iniciam Alterações Concentração de LDL
Terapêuticas do Estilo na qual Considerar Terapia
Categoria de Risco M e t a de LDL (m g / d L ) de Vida ( m g / d L ) Medicamentosa ( m g / d L )

CHD ou equivalentes risco de CHD <100 >100 > 3 0 0 (100-129; fármaco

(risco de 10 anos > 2 0 % ) opcional)
2 + fatores de risco (risco de <130 >130 Risco de 10 anos 1 0 % - 2 0 % : > 1 3 0
10 a r o s < 2 0 % ) Risco de 10 anos < 1 0 % : > 1 6 0
0-1 fator de risco (fisco de <160 >160 > 1 9 0 (160-189; fármaco para
10 anos < 1 0 % ) diminuir LDL opcional)

Modificado de resumo executivo do lerceira relato da National Cholesterol Education Piogram (NCEPJ Expert Panei on Deteaion, Eiwluation, and Treaiment of Higk Blood
Cfiolejterol MI Adults (Aduít Treaíment Panei i l í j . / A M A 2001\285:2486-97.
LDL, lipoproteírui de baixa densidade; C H D , carona-nopatia.
432 PARTE IV Analitos
pacientes e m u m a categoria de risco intermediária (risco de 10
anos m e n o r q u e 2 0 % ) a presentam u m a concentração mais alta
para colesterol L D L e, em alguns casos, d e p e n d e n d o d o colesterol
L D L inicial, p o d e m ser tratados apenas c o m alterações terapêu-
ticas do estilo de vida, se efetivo. Para aqueles pacientes n a cate-
goria de mais baixo risco (fatores de risco de 0 a 1), o colesterol
LDL desejável é m e n o r q u e 160 m g / d L (4,14 m m o l / L ) e a terapia
m e d i c a m e n t o s a deve ser considerada apenas se o colesterol L D L
inicial estiver acima de 190 mg/'dL (2,15 m m o l / L ) . T a m b é m h á
recomendações específicas para a freqüência de m o n i t o r a m e n t o
dos exames de lipídios e lipoproteínas e para q u a n d o t e n t a r a
terapia m e d i c a m e n t o s a naqueles pacientes que n ã o atingem as
metas de t r a t a m e n t o do colesterol L D L apenas com alterações
terapêuticas d o estilo de vida. Assim c o m o para o t r a t a m e n t o de
pacientes c o m s í n d r o m e metabólica, recomenda-se u m a aborda-
gem c o m b i n a d a de: (1) redução d o peso, (2) a u m e n t o da ativi-
dade física e (3) controle a p r o p r i a d o dos níveis lipídicos.
Os triglicerídeos a u m e n t a d o s e colesterol H D L baixo t a m b é m
são considerados distúrbios q u e alteram de maneira i n d e p e n -
d e n t e o risco para C H D e p o d e m alterar o t r a t a m e n t o recomen-
d a d o . Em a m b o s os casos, c o n t u d o , o objetivo principal deve ser
o de reduzir o colesterol L D L e, secundariamente, o de corrigir
os triglicerídeos a u m e n t a d o s ou d o baixo H D L , se estes distúr-
bios persistirem após a r e d u ç ã o do colesterol LDL, C a d a paciente
sob risco de C H D deve t a m b é m ser avaliado q u a n t o a presença
de s í n d r o m e metabólica e deve ser tratado para quaisquer causas
subjacentes e quaisquer sintomas associados. O u t r o s exames de
lipoproteína r e c e n t e m e n t e desenvolvidos, como: (1) Lp(a), (2)
lipoproteínas remanescentes, (3) L D L p e q u e n o e d e n s o e outros
marcadores, c o m o (4) proteína C-reativa (CRP) e (5) homociste-
ína, t a m b é m p o d e m ser valiosos n a estratificação de risco de
C H D , p a r t i c u l a r m e n t e para pacientes q u e estão em risco limí-
trofe ou i n t e r m e d i á r i o com base nos exames convencionais para
lipídios e lipoproteínas.
U m a g r a n d e variedade de agentes farmacológicos para reduzir
o colesterol nos adultos está disponível 3 e é prescrita individual-
m e n t e ou e m c o m b i n a ç ã o para reduzir o colesterol LDL,
incluindo: (1) resinas de ligação ao ácido biliar (colestiramina e
colestipol), (2) niacina, (3) gemfibrozila, (4) ezetimiba e (5) inibi-
dores de H M G - C o A redutase (p.ex., a torvas ta tina, fluvastatina,
lovastatina, pravastatma, resuvastatina e sinvastatina); descobriu-
se que este ú l t i m o g r u p o reduz o colesterol LDL e m até 4 0 % .
Alguns desses fármacos são mais b e m tolerados p o r pacientes
i n d i v i d u a l m e n t e do que outros, e todos d e m o n s t r a r a m segurança
prolongada e m o s t r a r a m reduzir o risco de C H D . M u i t o s desses
fármacos a u m e n t a r ã o m o d e s t a m e n t e o colesterol H D L , mas a
niacina em particular é efetiva n a elevação d o colesterol H D L .
Ingestão Vigente de Gordura por Adultos, Crianças e Adolescentes Norte-Americanos e as Dietas de Etapa TJm
e Etapa Dois da American Heart Association
Nutrientes Adultos
GORDURA TOTAL
Porcentagem de calorias totais 35%-36%
Gordura saturada 14%
Gordura polinsaturada 6%
Gordura monoinsaturada 13%-14%
Colesterol (mg/dia) 300-400
Modi/rcúdo do Nariotidí Chdésterol Educaiion Progmm, Seção de Me embolismo L ipíáico, Diuisão do instituto do Coração, Puíynáo e Sangue: The. Repcnt of the Expert Panei on Blood
Cholesterol Leveis in Cfiildren anã Adolescente. Bethesda, M D . National Institutos of Health, 1991.
Tratamento Pediátrico d o s Distúrbios
Lipoprotéicosl
Para reduzir a c o n c e n t r a ç ã o sérica de colesterol nas crianças e
adolescentes, a N C E P a d o t o u abordagens populacionais e indi-
viduais.
Abordagem Populacional
As crianças e os adolescentes n o n e - a m e r í c a n o s apresentam con-
centrações relativamente altas de colesterol e u m a alta ingestão
de ácidos graxos saturados. A abordagem populacional tenta
reduzir a concentração m é d i a d e colesterol nos E U A p o r meio
de modificações, n a população, na ingestão de nutrientes e nos
hábitos alimentares. Recomenda-se a Etapa 1 da dieta da Ameri-
can H e a r t Association (AHA) (Tabela 23-10) para crianças com
mais de 2 até 3 anos de idade. A N C E P t a m b é m e n c a m i n h o u
recomendações para: (1) escolas, (2) profissionais da área de
saúde, (3) agências governamentais, (4) indústria alimentícia e (5)
meios de comunicação de massa, para a j u d a r a influenciar e
modificar os hábitos alimentares de crianças e adolescentes.
Abordagem individualizada
A abordagem individualizada t e m c o m o objetivo reduzir as con-
centrações de colesterol de crianças com mais de 2 anos de idade
e adolescentes que estão em risco. Aqueles com u m a concentra-
ção m é d i a de colesterol L D L entre 110 e 129 m g / d L devem ser:
(1) colocados n a Etapa 1 da dieta da A H A (Tabela 23-10), (2)
aconselhados sobre outros fatores de risco para cardiopatias e (3)
reavaliados após 1 ano. Aqueles com colesterol L D L m é d i o m a i o r
que 130 m g / d L t a m b é m devem: (1) ser colocados na Etapa 1 da
dieta da A H A , (2) ser avaliados q u a n t o a causas secundárias e (3)
ter a família submetida a triagem. Se, após 3 meses d o início da
dietoterapia, a concentração de colesterol LDL c o n t i n u a r m a i o r
que 130 m g / d L (3,37 m m o l / L ) , o paciente deve ser colocado na
Etapa 2 da dieta da A H A , q u e impõe u m a redução maior da
ingestão de ácidos graxos saturados e da ingestão de colesterol
(Tabela 23-10). A terapia m e d i c a m e n t o s a foi r e c o m e n d a d a pela
N C E P e m crianças com 10 anos de idade ou mais, caso a con-
centração de colesterol LDL c o n t i n u e maior que 190 m g / d L após
adesão diligente à dietoterapia (6 meses a 1 ano). Recomenda-se
u m a concentração de ação mais baixa de ,160 m g / d L (4,15
m m o l / L ) para pacientes q u e t ê m u m a história familiar positiva
de C H D prematura ou aqueles com dois ou mais fatores de risco.
A p e n a s as resinas de ligação aos ácidos biliares, c o m o a colesti-
r a m i n a e colestipol, q u e agem ligando os ácidos biliares n o l ú m e n
intestinal, são r e c o m e n d a d a s pelo grupo para uso e m crianças e
adolescentes. A eficácia, os efeitos colaterais ou a segurança de
INGESTÃO VIGENTE
Crianças e
Adolescentes Etapa Um Etapa Dais
36% <30% <30%
15% <10% 7%
16% 10% 10%
15% 10%-15% 10%-15%
400-500 <300 <200
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular
outros fármacos que reduzem o colesterol n ã o foram bem esta-
belecidos em crianças e adolescentes, e, portanto, seu uso é
desencorajado nesta população.
M u d a n ç a s na C o n c e n t r a ç ã o de Lipídios,
Lipoproteínas e A p o l i p o p r o t e í n a s c o m o
Envelhecimento
Q u a n d o se interpretam os valores dos exames de lipídios e lipo-
proteínas, é importante reconhecer que eles m u d a m com o enve-
lhecimento. Ao nascimento, a concentração plasmática típica de
colesterol é de cerca de 66 m g / d L (1,71 m m o l / L ) e é quase
igualmente distribuída entre LDL e H D L , com uma quantidade
m u i t o p e q u e n a de VLDL. A concentração de triglicerídeos é de
cerca de 36 m g / d L (0,41 m m o l / L ) apenas. Apo A-I, apo B-100 e
Lp(a) d o sangue d o cordão apresentaram concentrações médias
de cerca de 80, 33 e 4 mg/dL, respectivamente. As concentrações
de lipídios, colesterol da lipoproteína e apolipoproteína aumen-
tam drasticamente durante os primeiros meses de vida, sendo
que o LDL se torna o principal p o r t a d o r de colesterol plasmático
e então sc m a n t ê m relativamente sem alterações até a puberdade.
U m perfil q u e consiste em: (1) concentração de colesterol total de
cerca de 155 m g / d L (4,01 m m o l / L ) , (2) concentração de coleste-
rol LDL de 90 m g / d L (2,33 mmol/L), (3) concentração de coles-
terol H D L de 53 m g / d L (1,37 mmol/L), (4) concentração de
triglicerídeos de 55 m g / d L (0,62 m m o l / L ) , (5) concentração de
apo B-100 de 86 m g / d L e (6) concentração de apo A-I de cerca
de 130 m g / d L é típico para u m sujeito normal pré-puberdade.
Após a puberdade, há um a u m e n t o dos triglicerídeos, colesterol
LDL e apo B-100 em ambos os sexos e uma redução no colesterol
H D L e apo A-I nos homens. As concentrações lipídicas conti-
n u a m a aumentar durante a vida adulta, sendo que o colesterol
total e LDL e apo B-100 são mais altos nos h o m e n s do que nas
mulheres até cerca de 55 anos de idade. Depois desta época, as
mulheres que n ã o estão recebendo suplementação de estrógeno
apresentam colesterol total e LDL e apo B-100 mais altos d o que
os h o m e n s na mesma idade. Ao contrário de outros lipídios,
lipoproteínas e apolipoproteínas, a concentração de Lp(a) aumenta
lenta e gradualmente até atingir valores de Lp(a) do adulto após
o terceiro a n o de vida.
ANÁLISE DOS LIPÍDIOS, LIPOPROTEÍNAS E
APOLIPOPROTEÍNAS 1 0 1 5 1 8
Os exames de rotina de lipídios e lipoproteínas são realizados
pela maioria dos laboratórios clínicos. Os m é t o d o s de referência
correspondentes também foram desenvolvidos pelos Centers for
Disease C o n t r o l and Prevention (CDC). Estes métodos de refe-
rência foram cruciais na padronização dos exames de lipídios e
lipoproteínas. Q u a n d o os p o n t o s de corte relacionados com risco
I
TABELA 2 3 - 1 1 Recomendações do National
Cholesterol Education P r o g r a m para
L
D e s e m p e n h o A n a l í t i c o das M e n s u r a ç õ e s
de Lipídios e L i p o p r o t e í n a
ERRO TOTAL
(%)
Colesterol 8,9
<15
Triglicerídeos
Colesterol HDL <13
C o l e s t e r o l LDL <12
C V j Coeficiente de vãriãçoo', HDL, {ipoproteinã de altã densidade,
lipopTCieinã de baixa densidade
CAPÍTULO 2 3 433
(Tabela 23-9) foram usados n o t r a t a m e n t o clínico dos pacientes,
uma definição c o m u m de acurácia, em termos de m é t o d o de
referência, foi crucial para estabelecer a classificação de riscn
exata de C H D dos pacientes por meio de métodos rotineiros.
Houve grande e m p e n h o para a melhora e padronização dos
exames de perfil lipídico e lipoprotéico, para assegurar sua reali-
zação adequada (Tabela 23-11) e a comparabilidade de seus resul-
tados entre métodos diferentes e laboratórios diferentes, redu-
zindo assim o TÍSCO de classificação errônea dos pacientes para
risco de C H D .
M e n s u r a ç ã o d o s Lipídios
Os lipídios básicos que são medidos n o laboratório incluem: (1)
colesterol, (2) triglicerídeos, (3) colesterol H D L e (4) colesterol
LDL.
Exames para Colesterol
Os métodos enzimáticos tornaram-se os exames preferenciais
para a mensuração de rotina do colesterol. Eles são precisos e
exatos q u a n d o apropriadamente calibrados e facilmente adapta-
dos para uso em analisadores automatizados. Os reagentes para
colesterol, comercialmente disponíveis, c o m u m e n t e c o m b i n a m
todas as enzimas e outros componentes necessários em u m único
reagente fotométrico. O reagente em geral é: (1) misturado com
u m a alíquota de 3 a 10 jiL de soro ou plasma e (2) incubado sob
condições controladas para desenvolvimento de cor, e (3) a absor-
vâr.cia é medida na porção visível do espectro, geralmente a cerca
de 500 n m . Os reagentes geralmente usam u m a colesteril-éster
hidTolase bacteriana para clivar os ésteres de colesteril:
iTolestenl-ésier
Éster de colesteril + H ? 0 ^ colesterol + ácido graxo
(1)
O grupo 3 - O H do colesterol é então oxidado e m cetona em u m a
reação que exige oxigênio catalisada por colesterol oxidase:
ÍOIMÍCTOI
Colesterol + O? > colest-4-en-3-ona + H 2 0 2
(2)
O H 2 0 2 é então m e n s u r a d o em u m a reação catalisada por pero-
xidade q u e forma u m corante colorido:
+
H202 fenol + 4-aminoantipirina (3)
Peioxidase—^ , c o r a n t e quinoneimina + 2 H 2 0
Os métodos enzimáticos estão sujeitos a interferências de outros
compostos coloridos ou daqueles que competem com a reação
de oxidação, como: (1) bilirrubina, (2) ácido ascórbico e (3)
COMPATÍVEL CCM hemoglobina. Os exames em geral são lineares até cerca de 600
Viéis (%) CV (%) a 700 m g / d L (15,54 até 18,13 m m o l / L ) . Os reagentes foram
<±2 <3
refinados pela adição de substâncias como bilirrubina oxidase, e
<i5 <5
leituras de duplo c o m p r i m e n t o de o n d a foram adicionadas para
<+5 <4 minimizar os efeitos da hemólise. A interferência da bilirrubina
<i4 <4 em geral não é u m a preocupação para concentrações abaixo de
5 m g / d L (85,5 [amol/L). Os reagentes enzimáticos, contudo, n ã o
LDL>
são inteiramente específicos para colesterol porque outros este-
róis que c o n t ê m hidroxil, como o esterol vegetal sitosterol.
 434 PARTE IV Aralitos

t a m b é m reagem com estas enzimas. N o plasma h u m a n o , c o n t u d o , Lactato

4
este não é u m problema maior p o r q u e estes esteróis interferentes, iPiruvato N A D H + H4 'T ^ - ) iactato + N A D f
em geral, estão em concentrações m u i t o baixas. Q u a n d o u m
sistema reagente-calibrador-instrumento de u m ú n i c o fabricante
A perda de absorvância à m e d i d a que o N A D H é c o n s u m i d o é
é usado, as mensurações do colesterol n o laboratório em geral
m e d i d a p o r u m f o t ô m e t r o a 340 n m .
são precisas, em u m a faixa de valores de referência de 1% a 3 % ,
O s m é t o d o s enzimáticos para triglicerídeos são b e m específi-
e estes sistemas são r o t i n e i r a m e n t e operados c o m coeficientes de
cos, pois n ã o detectam glicose ou fosfolipídios. Eles são lineares
variação de 1,5% a 2,5%.
na faixa de concentração até cerca de 700 m g / d L (7,91 m m o l / L )
e q u a n d o automatizados são operados c o m coeficientes de varia-
Triglicerídeos ção na faixa de a p r o x i m a d a m e n t e 2 % a 3 % . Pelo fato de o glice-
O s triglicerídeos t a m b é m são hoje c o m u m e n t e m e n s u r a d o s com rol ser u m p r o d u t o de processos metabólicos normais, está pre-
reagentes enzimáticos. Várias seqüências enzimáticas diferentes sente n o soro. Assim, a q u a n t i d a d e m e d i d a de triglicerídeos n o
têm sido usadas. E m todos estes métodos, a primeira etapa é a soro é ligeiramente superestimada, se n ã o for corrigida para gli-
hidrólise catalisada pela lipase dos triglicerídeos em glicerol e cerol e n d ó g e n o . E m indivíduos sadios, o glicerol e n d ó g e n o repre-
ácidos graxos. senta o equivalente a m e n o s de 10 m g / d L (0,11 m m o l / L ) de
triglicerídeos, e, p o r t a n t o , o erro causado pelo glicerol em geral
não é clinicamente significativo. E m determinadas condições,
+
Triglicerídeo 3 H z O——E a s e > glicerol + 3 ácidos graxos (4) como: (1) diabetes mellitus, (2) estresse emocional, (3) administra-
ção intravenosa de fármacos ou nutrientes que c o n t ê m glicerol,
O glicerol é então fosforilado em u m a reação d e p e n d e n t e de A T P (4) c o n t a m i n a ç ã o dos dispositivos de coleta de sangue pelo glice-
catalisada p o r gliceroquinase: rol e (5) a r m a z e n a m e n t o p r o l o n g a d o do sangue total sob condi-
ções n ã o refrigeradas, concentrações endógenas de glicerol intro-
Glicerol + A T P (5) duzem u m erro significativo. C o n s e q ü e n t e m e n t e , alguns labora-
tórios empregam u m exame de triglicerídeos alternativo, n o qual
Gliceroquinase i- r c ^
» ghceroioslato o glicerol e n d ó g e n o é p r i m e i r a m e n t e "apagado" ajustando-se os
4
adenosina difosfato (ADP) calibradores para c o m p e n s a r u m viés m é d i o ou c o n s u m i n d o
enzimaticamente o glicerol e m u m a etapa pré-reação antes de
N o s m é t o d o s mais c o m u m e n t e usados, o glicerofosfato é oxidado medir os triglicerídeos.
em diidroxiacetona e H 2 0 2 e m u m a reação catalisada p o r glice-
rofosfato oxídase: Colesterol da Lipoproteína de Aita Densidade
A concentração de H D L no plasma em geral é avaliada determi-
iGlicerofosfato + O i (6) nando-se a concentração de colesterol associada ao H D L . Basica-
mente, as lipoproteínas n ã o - H D L s ã o primeiro fisicamente remo-
Gliceiofosíato
vidas ou efetivamente mascaradas; então, o colesterol total é
— » diidroxiacetona + H2O2
medido.
O s exames de precipitação baseiam-se e m lipoproteínas não-
H D L - VLDL, IDL, Lp(a), LDL e quilomíerons - c o m poliâ-
e o H j O i formado na reação é medido como descrito na reação (3).
nions, c o m o : (1) sulfato de dextrano, (2) heparina ou (3) fosfo-
Alternativamente, o glicerofosfato é m e d i d o e m u m a forma
tungstato. O s poliânions reagem c o m grupos positivamente car-
reduzida de u m a reação p r o d u t o r a de nicotinamida-adenina
regados nas lipoproteínas, e esta interação é p o s t e r i o r m e n t e
d-inucleotídeo ( N A D H ) , e o N A D H é m e d i d o por u m espectro-
facilitada n a presença de cátions divalentes, c o m o o magnésio.
f o t ô m e t r o ajustado em 340 n m ou em u m a reação catalisada por
Q u a n d o os poliânions são adicionados a u m a alíquota de plasma
diaforase para f o r m a r u m p r o d u t o de reação cuja absorvância é
ou soro, forma-se u m precipitado de lipoproteínas n ã o - H D L e m
medida a 500 nm.
u m p e r í o d o de 10 a 15 m i n u t o s em t e m p e r a t u r a ambiente. O
precipitado é removido por centrifugação por pelo m e n o s 45.000
g-minutos ou o equivalente a 1.500 x g por 30 m i n u t o s . O coles-
Glicerofosfato 4 nicotinamida-adenina (7)
terol H D L é então m e d i d o enzimaticamente n o s o b r e n a d a n t e .
dinucleotideo (NAD) Várias combinações poliãnion-cátion divalente f o r a m usadas,
Glicerofosfato incluindo; (1) sulfato de heparina-MnClj, (2) sulfato de dextrano-
— ^ fosfato de diidroxiacetona MgCl 2 e (3) fosfotungstato-MgCl;. O s exames de colesterol H D L
são considerados imprecisos e m amostras q u e c o n t ê m altas con-
+ N A D H + H+
centrações de triglicerídeos, acima de 400 m g / d L (4,52 m m o l / L ) .
Para minimizar este problema, estas amostras são pré-tratadas
para remover ou reduzir a interferência por lipoproteínas ricas
N A D H + corante de tetrazólio— D ""°' a ——» f o r m a z a n 4 N A D + ^ e m triglicerídeos, que não precipitam c o m p l e t a me n te . As técni-
cas usadas para pré-trataT as amostras incluem: (1) centrifugação,
O u t r o s m é t o d o s m e d e m o A D P p r o d u z i d o na reação (5), como (2) filtração e (3) diluição. Sabe-se que os aditivos do tubo para
mostrado nas equações (9) e (10): coleta de sangue, i n c l u i n d o anticoagulantes, tais c o m o o citrato
e fluoreto, têm efeitos osmóticos grandes que fazem com que a
água desvie das células para o plasma e assim altere os resultados
Piruvato lipídicos. Estes aditivos t a m b é m diluem as lipoproteínas e m até
10% e p r o d u z e m valores e r r o n e a m e n t e baixos. O anticoagulante
A D P + piruvato de fosfoenol — t J ' n a s e — » A T P + piruvato ^
preferido para mensurações de lipoproteína é o ácido etilenodia-
minotetracético (EDTA) p o r q u e ele inibe a oxidação dos lipídios
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular
e a proteólise das apolipoproteínas. C o n t u d o , ele provoca u m a
ligeira diluição de cerca de 3% q u a n d o comparado com as men-
surações de lipoproteína n o soro, nas quais se baseiam os p o n t o s
de corte vigentes.
U m m é t o d o semelhante ao m é t o d o de precipitação do coles-
terol H D L usa u m precipitante que forma u m complexo com
partículas magnéticas. U m a vez f o r m a d o o complexo de precipi-
tante de lipoproteína-partícula magnética, ele deve ser rapida-
m e n t e removido sem centrifugação pelo uso de um imã externo.
O sobrenadante que contém H D L é então removido e o coleste-
rol H D L é m e d i d o enzimaticamente. O método t a m b é m foi
adaptado para uso em u m analisador químico-clínico automati-
zado, possibilitando que o sobrenadante seja analisado sem a
necessidade de removê-lo d o complexo sedimentado.
Os exames diretos de colesterol HDL, também conhecidos
como exames homogêneos, atualmente são muito usados para
mensurar rotineiramente o colesterol H D L . Em princípio, eles
f u n c i o n a m de maneira semelhante aos outros exames de coleste-
rol HDL, pois t a m b é m d e p e n d e m de mensuração enzimática do
colesterol d o HDL, mas, diferentemente de outros exames, não
há separação física entre o H D L e as frações não-HDL.
Em vez disso, o colesterol H D L é mensurado seletivamente
mascarando d e maneira efetiva o colesterol das fiações não-HDL
de forma que elas não reajam com as enzimas usadas para medir
o colesterol d o HDL. Isto é atingido por meio de uma variedade
de métodos, d e p e n d e n d o do tipo de exame. Por exemplo, alguns
exames envolvem o uso de anticorpos ou vários polímeros ou
agentes formadores de complexos, como ciclodextrina, que evitam
que o colesterol nas frações não-HDL reaja com enzimas que
m e d e m colesterol. Alguns exames t a m b é m dependem das modi-
ficações da colesteril esterase e colesterol oxidase, que os torna
mais seletivos para colesterol HDL. Einalmente, alguns exames
usam u m a etapa de consumo seletivo do colesterol das frações
não-HDL. Diferentemente dos outros exames de colesterol H D L ,
não há u m a etapa pré-tratamento da amostra, e, portanto, exames
diretos p o d e m ser completamente automatizados.
Colesterol da Lipoproteína de Baixa Densidade
Tanto os métodos indiretos como os diretos são usados para
mensurar o colesterol LDL.
Métodos Indiretos
O s métodos indiretos partem do princípio de que o colesterol
total é composto principalmente de colesterol na VLDL, LDL e
H D L . O colesterol LDL é então medido indiretamente pelo uso
da equação de Friedewald ou por p-quantificação. E i m p o r t a n t e
observar, c o n t u d o , que ambos estes métodos p o d e m n ã o ser
completamente responsáveis pelo colesterol associado ao I D L e
Lp(a). O alvo de acurácia atualmente aceito, o M é t o d o de Refe-
rência usado n o s C D C para colesterol LDL, inclui IDL e Lp(a)
com LDL em u m a fração de LDL chamada de "broad-cut".
Embora o I D L e Lp(a) em geral contribuam com apenas alguns
miligramas de colesterol por decilitro para a mensuração indireta
de colesterol LDL, suas contribuições p o d e m ser maiores e por-
tanto mais problemáticas, particularmente em alguns pacientes
com dislipidemia. Pelo fato de o colesterol associado ao IDL, ao
Lp(a) e ao L D L serem todos positivamente associados ao risco
para C H D , sua inclusão na fração LDL não é considerada u m
problema na caracterização de risco de C H D nos pacientes.
Equação de Friedewald. N o método indireto mais a m p l a m e n t e
usado: (1) colesterol total, (2) triglicerídeos e (3) colesterol H D L
são medidos e o colesterol L D L é calculado a partir das mensu-
Tações primárias por meio d o uso da equação empírica d e Frie-
dewald:
CAPÍTULO 2 3 435
Colesterol LDL = [Colesterol total] - [Colesterol HDL]
- [triglicerídeos]/5
(11)
onde todas as concentrações sao dadas em miligramas por deci-
litro. O triglicerídeo/2,22 é usado q u a n d o o colesterol LDL é
expresso em milimoles por litro. O fator [triglicerídeo]/5 é u m a
estimativa da concentração d o colesterol V L D L e é baseado na
razão média entre triglicerídeos e colesterol n o VLDL.
Na prática, a equação de Friedewald não deve ser usada em:
(1) amostras que têm concentrações de triglicerídeos acima de
400 m g / d L (4,52 mmol/L), (2) amostras que contêm quantida-
des significativas de quilomícrons (amostras sem jejum) ou (3)
pacientes com disbetalipoproteinemia. Nestes casos, o fator [tri-
gIicerídeo]/5 não fornece u m a estimativa precisa do colesterol
VLDL, que leva a erros grandes n o colesterol LDL calculado.
(3-Quantificação. Pelo fato de ser entediante realizá-la, a p-
quantificação em geral é reservada para amostras nas quais a
equação de Friedewald é inadequada, como naquelas com con-
centrações de triglicerídeos acima d e 400 m g / d L (4,52 m m o l / L ) .
O plasma tratado com EDTA é a amostra escolhida, e o método
envolve u m a combinação de ultracentrifugação preparatória e
precipitação de poliânions. U m a alíquota de plasma (densidade
[d] = 1,006 g / m L ) é ultracentrifugada a 105.000 X g por 18 horas
a 10°C. Sob estas condições, o VLDL, quilomícrons e P-VLDL
acumulam-se em u m a camada flutuante, e n q u a n t o o infrana-
dante com u m a densidade maior d o que 1,006 g / m L irá conter
principalmente LDL e H D L . Esta fração t a m b é m p o d e conter
qualquer IDL e Lp(a) que possa estar presente. A camada flutu-
ante é removida com a ajuda de u m cortador de tubo. O infra-
nadante é novamente misturado, reconstituído a u m volume
conhecido, e seu conteúdo de colesterol é medido. O colesterol
H D L em geral é medido em u m a alíquota separada de plasma.
Entretanto, é possível t a m b é m medi-lo n o infranadante após a
precipitação das lipoproteínas restantes que contêm apo B-100
[IDL, LDL e Lp(a)]. O colesterol V L D L e o LDL são calculados
usando-se as seguintes equações:
[colesterol VLDL] = [colesterol total] (12)
- [d > 1,006 g / m L colesterol]
[colesterol LDL] = [d > 1,006 g / m L colesterol] (13)
- [colesterol HDL]
O colesterol LDL medido pelo p r o c e d i m e n t o de p-quantificação
não é afetado pela presença de: (1) quilomícrons, (2) outras
lipoproteínas ricas em triglicerídeos ou (3) P-VLDL. O colesterol
V L D L em geral é calculado a partir da equação (12), e não
medido diretamente n o sobrenadante ultracentrifugado. Este
m é t o d o é usado porque a recuperação quantitativa desta fração,
particularmente q u a n d o as concentrações de triglicerídeos são
altas, geralmente é difícil. Este procedimento t a m b é m é útil n o
diagnóstico de disbetalipoproteinemia.
A razão entre colesterol V L D L e triglicerídeos plasmáticos,
expressa em termos de massa, e m geral é de 0,2, o u ainda mais
baixa com pacientes com outras f o r m a s de hiperlipidemia. Na
disbetalipoproteinemia, esta razão é de 0,3 ou maior devido à
presença de p-VLDL, e a razão a u m e n t a d a persiste m e s m o após
o t r a t a m e n t o ser iniciado. A l é m disso, é possível observar
d i r e t a m e n t e o P-VLDL por m e i o de eletroforese c o m gel de
agarose d o s o b r e n a d a n t e p r o d u z i d o d u r a n t e o p r o c e d i m e n t o
de p-quantificação.
436 PARTE IV Analitos
Métodos Diretos
V á r i o s m é t o d o s usados para a m e n s u r a ç ã o d i r e t a do colesterol
L D L baseiam-se n a p r e c i p i t a ç ã o seletiva, c o m sulfato d e polivinil
o u h e p a r i n a a u m p H baixo. A l t e r n a t i v a m e n t e , u m m é t o d o de
p r é - t r a t a m e n t o m a i s específico, mas e n t e d i a n t e , usa u m a mistura
d e a n t i c o r p o s policlonais c o m a p o A-I e a p o E ligados a u m a
resina q u e se liga e r e m o v e V L D L , I D L e H D L . C o n t u d o , estes
m é t o d o s f o r a m a t u a l m e n t e s u p l a n t a d o s p o r u m a nova classe d e
reagentes h o m o g ê n e o s diretos q u e são s e m e l h a n t e s aos reagentes
h o m o g ê n e o s desenvolvidos para m e d i r colesterol H D L .
Estes ensaios m e d e m s e l e t i v a m e n t e o colesterol n o L D L a p ó s
m a s c a r a r o colesterol associado às o u t r a s frações n a o - L D L o u p o r
m e i o d a solubilização seletiva d e L D L . Por exemplo, u m a abor-
d a g e m inicial beneficiou-se d o f a t o d e q u e a a p o B-100 é essen-
c i a l m e n t e a ú n i c a a p o l i p o p r o t e í n a n o LDL. U m a m i s t u r a d e
a n t i c o r p o s policlonais c o m a p o A-I e a p o E foi u s a d a p a r a ligar
e m a s c a r a r o colesterol n o V L D L , I D L e H D L , e e n t ã o o coles-
terol L D L é m e d i d o e n z i m a t i c a m e n t e . A análise d o colesterol
L D L p o r m é t o d o s diretos n ã o envolve a m e n s u r a ç ã o d e triglice-
rídeos, p o r t a n t o , é possível usar amostras s e m j e j u m . E m geral,
estes ensaios p r o d u z e m r e s u l t a d o s s e m e l h a n t e s ao d o colesterol
L D L c a l c u l a d o e d a q u e l e s a p a r t i r da P - q u a n t i f i c a ç ã o nas amos-
tras n o r m o l i p i d ê m i c a s . As avaliações d o s ensaios h o m o g ê n e o s de
L D L i n d i c a m q u e os coeficientes d e variação ( C V ) e m geral f i c a m
e m 3 % e c o n s i s t e n t e m e n t e d e n t r o d a m e t a d e d e s e m p e n h o de
m e n o s de 4 % dos C V s (Tabela 23-11). E m c o n t r a p a r t i d a , os C V s
p a r a cálculo d e Friedewald f o r a m e s t i m a d o s e m a p r o x i m a d a -
m e n t e 4 % n o s l a b o r a t ó r i o s especializados e e m até 1 2 % n o s
l a b o r a t ó r i o s clínicos d e rotina, c o m o e s t i m a d o a partir de pesqui-
sas de teste de proficiência. A u t i l i d a d e clínica dos testes d e
colesterol L D L h o m o g ê n e o s , c o n t u d o , n ã o foi b e m estabelecida
c o m o os m é t o d o s de colesterol L D L mais antigos para prever
risco d e C H D . T a m b é m h á a l g u m a s evidências d e q u e os dife-
rentes exames p o d e m n ã o ser específicos e m e d i r algumas das
o u t r a s l i p o p r o t e í n a s q u e c o n t ê m a p o B suficientes para deixar
passar algumas s u b f r a ç õ e s d e LDL, c o m o o d e n s o e p e q u e n o
L D L pró-aterogênico. A l é m disso, os o u t r o s exames d e perfil
l i p í d i c o e l i p o p r o t e í n a q u e s ã o u s a d o s p a r a calcular o colesterol
L D L pela e q u a ç ã o de Friedewald. f r e q ü e n t e m e n t e a i n d a são neces-
sários, p a r t i c u l a r m e n t e n a avaliação inicial d e u m p a c i e n t e .
M é t o d o s Analisadores de D e s k t o p
O s analisadores portáteis, t a m b é m c h a m a d o s de: (1) "analisado-
res de desktop", (2) "analisadores de c o n s u l t ó r i o m é d i c o " o u (3)
"analisadores n o local de a t e n d i m e n t o " , f o r a m desenvolvidos
p a r a uso e m locais q u e n ã o os l a b o r a t ó r i o s ( C a p í t u l o s 5 e 12).
V á r i o s desses dispositivos são capazes d e m e d i r o colesterol d e
m a n e i r a precisa e acurada, e a maioria t a m b é m q u a n t i f i c a os
triglicerídeos e colesterol H D L , c o m cálculo de colesterol LDL,
e m alguns microlitros d e s a n g u e total, soro o u p l a s m a e m u m
p e r í o d o de alguns m i n u t o s , o q u e t o r n a esses tipos de analisado-
res i d e a l m e n t e a d e q u a d o s p a r a p r o g r a m a s p ú b l i c o s de triagem de
colesterol.
M e n s u r a ç ã o de A p o l i p o p r o t e í n a s
As a p o l i p o p r o t e í n a s são m e d i d a s p o r : (I) r a d i o i m u n o e n s a i o
(RIA), (2) e n s a i o i m u n o a b s o r v e n t e ligado à e n z i m a (ELISA), (3)
i m u n o d i f u s ã o radial (RID), ( 4 ) ens ai o i m u n o t u r b i d i m é t r i c o e (*5)
ensaio imunonefelométrico. A concentração de uma determi-
n a d a a p o l i p o p r o t e í n a e m geral d e t e r m i n a o m é t o d o .
E m b o r a os ensaios para a p o l i p o p r o t e í n a evitem algumas das
a r m a d i l h a s d o s ensaios d e l i p o p r o t e í n a , eles t ê m seus p r ó p r i o s
desafios. O s e p í t o p o s nas a p o l i p o p r o t e í n a s n e m s e m p r e p o d e m
ser r e c o n h e c i d o s pelos a n t i c o r p o s q u a n d o f o r m a m c o m p l e x o s
c o m lipídios. Isso p o d e alterar, p o r exemplo, a c a p a c i d a d e de u m
a n t i c o r p o d e r e c o n h e c e r i g u a l m e n t e a p o B-100 e m partículas d e
LDL, IDL, V L D L e Lp(a). O s d e t e r g e n t e s n ã o iónicos, c o m o o
T w e e n 20 o u Tw een 80, e m geral são a d i c i o n a d o s às soluço es-
t a m p ã o d o s ensaios para r n m p e r as partículas de l i p o p r o t e í n a e
t o r n a r rodos os locais antigênicos nas a p o l i p o p r o t e í n a s acessíveis
aos a n t i c o r p o s . A relativa i n s o l u b i l i d a d e d a a p o B t a m b é m
t o r n o u difícil desenvolver c a l i b r a d o r e s e materiais de r e f e r ê n c i a
confiáveis. T a m b é m foi d e m o n s t r a d o q u e os ensaios i m u n o t u r -
b i d i m é t r i c o s e i m u n o n e f e l o m é t r i c o s são afetados pela t u r v a ç ã o
do m e i o das amostras, c o m o aqueles c o m c o n c e n t r a ç õ e s de tri-
glicerídeos. A adição d e d e t e r g e n t e s aos t a m p õ e s d o ensaio r e d u z
a dispersão d e luz n ã o especifica, o q u e t e m a j u d a d o a d i m i n u i r
este p r o b l e m a .
Apoliprotéinas A-1 e B-100
O s ensaios i m u n o t u r b i d i m é t r i c o s e i m u n o n e f e l o m é t r i c o s são
t i p i c a m e n t e usados para m e d i r a p o A-I e a p o B-100. Alternativa-
m e n t e , técnicas mais sensíveis, c o m o o E L I S A e RIA, e m geral
são mais a d e q u a d a s p a r a aquelas a p o l i p o p r o t e í n a s p r e s e n t e s e m
c o n c e n t r a ç õ e s significativamente m a i s baixas, c o m o a p o C - l e
a p o C-II. Esforços consideráveis f o r a m d e s p e n d i d o s n o p a s s a d o
para p a d r o n i z a r as m e n s u r a ç õ e s d c a p o A-I c B-100. Isso m e l h o -
rou s i g n i f i c a t i v a m e n t e o d e s e m p e n h o geral desses ensaios.
Lipoproteína(a)8
O s d e t e r m i n a n t e s a n t i g ê n i c o s r e p e t i d o s estão presentes e m
n ú m e r o s variáveis e m partículas Lp(a) diferentes. D e m o n s t r o u - s e
q u e a i m u n o r r e a t i v i d a d e d o s a n t i c o r p o s d i r e c i o n a d o s para estes
e p í t o p o s varia c o m o f u n ç ã o d o t a m a n h o d a apo(a). A s s i m , os
i m u n o e n s a i o s t e n d e m a s u b e s t i m a r a c o n c e n t r a ç ã o de apo(a) n a s
amostras c o m apo(a) d e t a m a n h o s m e n o r e s d o q u e a apo(a)
p r e s e n t e n o calibrador d o ensaio e s u p e r e s t i m a r a c o n c e n t r a ç ã o
de apo(a) nas amostras c o m apo(a) maior. O s ensaios b a s e a d o s
e m a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s t ê m a n t i c o r p o s q u e são i m u n o q u i -
m i c a m e n t e caracterizados e pré-selecionados c o m base e m sua
especificidade a e p í t o p o s ú n i c o s . E n t r e t a n t o , a caracterização dos
a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s é u m p r o c e d i m e n t o b e m complexo, e
n e m t o d o s os a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s a t u a l m e n t e utilizados n o s
ensaios c o m e r c i a l m e n t e disponíveis f o r a m b e m caracterizados e m
l e r m o s d a especificidade d o e p í t o p o . U m a d e s v a n t a g e m a d i c i o n a l
dos a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s é q u e eles n ã o são f a c i l m e n t e u s a d o s
nos i m u n o e n s a i o s q u e r e q u e r e m a p r e c i p i t a ç ã o do c o m p l e x o
antígeno-anticorpo.
Os métodos turbidimétrico, nefelométrico, radiométrico e
enzimático são t o d o s usados a t u a l m e n t e p a r a m e n s u r a ç ã o de
Lp(a). A maioria desses ensaios, exceto os i m u n o e n s a i o s enzimá-
ticos (ELISA), baseia-se n o uso d e a n t i c o r p o s policlonais d e várias
espécies animais. C o m e r c i a l m e n t e disponível, os ELISA de ligação
direta, d o tipo s a n d u í c h e , e m geral são b a s e a d o s n o uso de u m a
c o m b i n a ç ã o de a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s e policlonais. U m a abor-
dagem beneficia-se d a presença t a n t o das partículas de apo(a)
c o m o a p o B n o Lp(a). E m o u t r a a b o r d a g e m , t a n t o os a n t i c o r p o s
d e c a p t u r a c o m o de detecção s ã o específicos para apo(a). Atual-
m e n t e , n ã o se sabe q u a l a b o r d a g e m seria m e l h o r com relação à
estimativa d o risco d e C H D o u A V C p o r q u e os m e c a n i s m o s
patogênicos envolvidos a i n d a n ã o f o r a m elucidados.
T r a d i c i o n a l m e n t e , as c o n c c n t r a ç õ c s de Lp(a) f o r a m relatadas
em t e r m o s d a massa d a p a r t í c u l a de Lp(a) total ou, alternativa-
m e n t e , e m t e r m o s d a p r o t e í n a Lp(a). Se o objetivo é f o r n e c e r
valores de Lp(a) q u e s e j a m i n d e p e n d e n t e s d o t a m a n h o de apo(a),
recomenda-se q u e o ensaio d e Lp(a) use a n t i c o r p o s d i r e c i o n a d o s
para u m d o m í n i o apo(a) q u e n ã o o kringle 4 tipo 2 o u p a r a o
c o m p o n e n t e B-100 d e Lp(a). Isso possibilitaria q u e os valores
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular CAPÍTULO 2 3 437

fossem expressos e m n a n o m o l e s p o r litro. As misturas p a n - m o n o - m i n a ç ã o d e i s o f o r m a s a p o E foi avaliada p o r técnicas de focaliza-

clonais de a n t i c o r p o s ao krmglfi 4 t i p o 2 p o d e m ser p r e f e r i d a s se
d e t e r m i n a d o s t a m a n h o s d e p o l i m o r f o s c o n t r i b u í r e m para o
risco. A t u a l m e n t e , as m e n s u r a ç õ e s d e Lp(a) n ã o são b e m padro-
nizadas, e a m a i o r i a dos ensaios de Lp(a) n ã o foi avaliada para
sua sensibilidade ao t a m a n h o d e apo(a). C o n s e q ü e n t e m e n t e , os
valores d e Lp(a) relatados n o s e s t u d o s clínicos são difíceis de
s e r e m c o m p a r a d o s . Apesar disso, u m valoT d e cerca de 3 0 m g / d L
d a massa d a p a r t í c u l a d e Lp(a) total foi t r a d i c i o n a l m e n t e u s a d o
c o m o c o r t e acima d o qual o a u m e n t o das c o n c e n t r a ç õ e s de Lp(a)
é associado a u m a u m e n t o d o risco d e C H D . As c o n c e n t r a ç õ e s
Lp(a) t a m b é m f o r a m expressas e m t e r m o s de: (1) n ú m e r o d e
partículas, (2) massa de apo(a), (3) a p o B-100 o u (4) colesterol
Lp(a). A t u a l m e n t e , os valores de Lp(a) são m a i s c o m u m e n t e
expressos e m t e r m o s da massa de Lp(a) total. Hm vista d o atual
estado d e p a d r o n i z a ç ã o precária para Lp(a), é difícil d e f i n i r os
cortes exatos a serem u s a d o s c l i n i c a m e n t e . U m a a b o r d a g e m seria
a d e estabelecer u m intervalo de referência p a r a cada ensaio e
relatar os r e s u l t a d o s isolados e m t e r m o s d o s valores d e p e r c e n t i s
d e n t r o destes intervalos. O s pacientes c a u c a s i a n o s c o m valores
de Lp(a) acima d o percentil 80 são c o n s i d e r a d o s e m risco a u m e n -
t a d o p a r a aterosclerose c o r o n a r i a n a ; e n t r e t a n t o , pelo fato de os
valores d e Lp(a) variarem e n t r e os g r u p o s étnicos, os valores d e
r e f e r ê n c i a d e v e m seT b a s e a d o s n a p o p u l a ç ã o . Por e x e m p l o , os
a f r o - a m e r i c a n o s e m geral a p r e s e n t a m c o n c e n t r a ç õ e s significativa-
m e n t e m a i s altas de Lp(a) d o q u e os caucasianos.
Apolipoproteína E detecte m u t a ç õ e s d e s c o n h e c i d a s d e a p o E, ele a p r e s e n t a a des-
A h o m o z i g o s i d a d e para a p o E 2 é característica d a h i p e r l i p o p r o -
t e i n e m i a familiar d o tipo 111. A h o m o z i g o s i d a d e para a p o E 3 é
u m a c o n d i ç ã o necessária, mas n ã o s u f i c i e n t e p a r a expressão da
h i p e r l i p o p r o t e i n e m i a do tipo III. U m s e g u n d o defeito o u c o n d i -
ção genética p a r e c e ser n e c e s s á r i o p a r a causar a h i p e r l i p i d e m i a
característica. A heterozigosidade p a r a alguns m u t a n t e s raros de
a p o E t a m b é m p o d e m ser associados à h i p e r l i p o p r o t e i n e m i a d o
tipo III. O e s t u d o de variantes a p o E a s s u m i u m a i o r i m p o r t â n c i a
n o s ú l t i m o s a n o s graças à associação e n t r e o alelo de a p o E 4 e o
mal d e A l z h e i m e r e a d e m ê n c i a , mas n ã o se sabe c o m o a a p o E 4
está r e l a c i o n a d a c o m estes d i s t ú r b i o s . T r a d i c i o n a l m e n t e , a deter-
ção isoelétrica (IEF) q u e p e r m i t e m a identificação d e variações
de carga das d i f e r e n t e s i s o f o r m a s . N o s e s t u d o s iniciais, os fenóti-
pos d e a p o E f o r a m avaliados após I E F p o r imunobíottmg c o m
a n t i c o r p o s específicos para a p o E. É i m p o r t a n t e q u e as a m o s t r a s
para esta técnica s e j a m analisadas frescas ou, se a r m a z e n a d a s , q u e
s e j a m m a n t i d a s a - 7 0 ° C a n t e s da análise para m i n i m i z a r a intro-
d u ç ã o d e artefatos. A classificação e r r ô n e a o c o r r e u d e v i d o a
m o d i f i c a ç õ e s pós-tTanslacionais o u glicosilação n ã o e m i m ã t i c a d e
a p o E. A i n t e r p r e t a ç ã o dos p a d r õ e s de eletroforese dessas varian-
tes r e q u e r experiência significativa n o u s o da técnica.
A d i s p o n i b i l i d a d e de técnicas baseadas na reação e m cadeia
d e p o l i m e r a s e ( P C R ) p e r m i t e u m a análise d a variação na
s e q ü ê n c i a d o n u c l e o t í d e o d o gene a p o E (Figura 23-22). U m a
a b o r d a g e m para g e n o t i p a g e m de a p o E usa o l i g o n u c l e o t í d e o s
para amplificar as s e q ü ê n c i a s d o gene a p o E q u e c o n t ê m os
a m i n o á c i d o s nas posições 112 e 158; os p r o d u t o s a m p l i f i c a d o s
são digeridos c o m a e m i m a H h a l e d e p o i s s u b m e t i d o s à eletrofo-
rese e m géis de p o l i a c r i l a m i d a . A l t e r n a t i v a m e n t e , os oligonucle-
o t í d e o s alelo-específicos (ASO) f o r a m u s a d o s para a m p l i f i c a r
e s p e c i f i c a m e n t e as s e q ü ê n c i a s p o l i m ó r f i c a s E 2 | E 3 e E 4 d o gene
a p o E. O sistema d e amplificação refratária a m u t a ç õ e s (ARMS)
é o u t r a a b o r d a g e m q u e se baseia n a P C R alelo-específica, q u e
d e p e n d e d o e m p a r e l h a m e n t o perfeito das bases dos n u c l e ó t i d o s
d a região 3' t e r m i n a l . E simples, r á p i d o e n ã o isotópico. O
m é t o d o d e p o l i m o r f i s m o d e c o n f o r m a ç ã o de fita simples (SSCP)
t a m b é m t e m sido u s a d o p a r a g e n o t i p a g e m de a p o E. E m b o r a
v a n t a g e m de exigir o l i g o n u c l e o t í d e o s r a d i o m a r c a d o s . Pelo f a t o
de a isotipagem de restrição ser rápida, exigindo a p e n a s 1 h o r a
para digerir o p r o d u t o de P C R e algumas h o r a s p a r a eletroforese
e n ã o r e q u e r e r reagentes radioativos, ela p o d e ser o m é t o d o mais
prático neste m o m e n t o para g e n o t i p a g e m d e a p o E n o laborató-
rio clínico diagnóstico. D e v i d o aos potenciais erros n a interpre-
tação o u artefatos inevitáveis n o m é t o d o d e f e n o t i p a g e m de a p o
E, a g e n o t i p a g e m d e a p o E é m a i s confiável para d e t e r m i n a r os
alelos de a p o E c o m u n s e é o m é t o d o e s c o l h i d o se o D N A estiver
disponível p a r a análise. A m a i o r i a dos m é t o d o s d e g e n o t i p a g e m
de a p o E, c o n t u d o , n ã o é p r o j e t a d a para detectar m u t a ç õ e s raras.

112 158
5'

3
i.E2j TGC TGC .3'

K)
NH 2 - Cys Cys • COOH

5' . TGC CGC .3'

NH2 Cys Arg COOH

:eÍ)
5' • TGC CGC 3'
NH-' Arg Arg COOH

&
Amplificação do DNA pela PCR

/ I \
Identificação dos polimorfismos

Polimorfismo
em conformação Hibridação Isotipagem por restrição com
Seqüenciamenio Sistema refratário de amplificação
de fila única com ASO endonuclease Hhal de mutações (ARMS)

Figurã 23-22 Métodos diferentes para investigar polimorfismo da apolipoproteína E no nível genômico.
PCR, reação em cadeia de polimerase; ASO, oligonucleotideo alelo-específica. (De Siest G, Pillot T, Regis-Bailly
A, Leinínger-Muller B, Steinmetz J, et ai. Apolipoprotein E: A n importanr gene and procein to follow in
laboratory medicine. Clin C h e m 1995;41:1068-86.)
438 PARTE IV Analitos
Relataram-se discrepâncias d e 5 % a 2 0 % e n t r e os r e s u l t a d o s da
fenotipagem e genotipagem.
Novos Ensaios de Lipídios e Lipoproteínas"! 6
Vários exames alternativos para lipídios e l i p o p r o t e í n a s estão
s e n d o desenvolvidos p a r a m e d i r s u b f r a ç õ e s d e l i p o p r o t e í n a , lipo-
proteínas de densidade intermediária (remanescentes) e L D L
oxidado.
Ensaios de Subtração de Lipoproteína
Várias a b o r d a g e n s f o r a m u s a d a s p a r a q u a n t i f i c a r as l i p o p r o t e í n a s
totais e, e m a l g u n s casos, as s u b f r a ç õ e s d e n t r o das classes m a i o r e s
d e l i p o p r o t e í n a , e m u m a ú n i c a o p e r a ç ã o . M u i t o s desses m é t o d o s
d e l i p o p r o t e í n a total são realizados apenas p o r l a b o r a t ó r i o s espe-
cializados, e a significância clínica e a u t i l i d a d e das d i f e r e n t e s
subfrações d e l i p o p r o t e í n a a i n d a n ã o estão c o m p l e t a m e n t e esta-
belecidas.
O mais r á p i d o desses m é t o d o s é a espectroscopia p o r resso-
n â n c i a n u c l e a r magnética. Este m é t o d o detecta grupos acila
metila e m e t i l e n o d e ácidos graxos associados à l i p o p r o t e í n a , e
os sinais de i n ú m e r a s s u b f r a ç õ e s d e V L D L , L D L e H D L são
resolvidos m a t e m a t i c a m e n t e . O s valores são relatados e m t e r m o s
d e c o n c e n t r a ç õ e s de colesterol d e l i p o p r o t e í n a c o m base e m
suposições s o b r e as c o m p o s i ç õ e s m é d i a s d e colesterol das diferen-
tes classes p r i n c i p a i s de l i p o p r o t e í n a . U m a única a m o s t r a é ana-
lisada e m a l g u n s m i n u t o s c o m cerca de 0,5 m L de soro. O
m é t o d o r e q u e r amostras frescas, e q u i p a m e n t o especializado e
experiência, e m b o r a seja p r o p e n s o à a u t o m a ç ã o . O u t r a aborda-
gem t e m s i d o usar u m a u l t r a c e n t r i f u g a ç ã o de g r a d i e n t e d e den-
s i d a d e e m u m r o t o r vertical e m e d i r o colesterol c o n t i n u a m e n t e
n a s frações eluídas d o g r a d i e n t e . O m é t o d o é capaz de derivar as
c o n c e n t r a ç õ e s de: (1) V L D L , (2) IDL, (3) LDL, (4) Lp(a) e (5)
colesterol H D L . Esta a b o r d a g e m é t e c n i c a m e n t e exigente e r e q u e r
i n s t r u m e n t a ç ã o q u e n e m s e m p r e está disponível n a maioria d o s
laboratórios clínicos. As l i p o p r o t e í n a s t a m b é m f o r a m separadas
nas p r i n c i p a i s classes e s u b f r a ç õ e s p o r eletroforese, e m gel de
gradiente, d e soro n ã o f r a c i o n a d o ou f r a c i o n a d o . O eletroforeto-
grama é o b t i d o através da d e n s i t o m e t r i a , e as áreas sob os vários
picos de l i p o p r o t e í n a são integradas e convertidas e m concentra-
ções equivalentes de colesterol l i p o p r o t é i c o através d o u s o de
supostas c o m p o s i ç õ e s médias de colesterol para l i p o p r o t e í n a s . A
eletroforese b i d i m e n s i o n a l d e lipoproteínas, q u e envolve eletro-
forese e m gel de agarose a c o m p a n h a d a de eletroforese e m gel de
g r a d i e n t e d e s n a t u r a n t e , oferece a mais alta res ol ução p a r a sepa-
ração das d i f e r e n t e s s u b f r a ç õ e s de lipoproteína, m a s é ampla-
m e n t e u s a d a c o m o objetivo de pesquisas e m v i r t u d e da comple-
x i d a d e d o ensaio.
Lipoproteínas de Densidade Intermediária
(Remanes cen tes)
D e m o n s t r o u - s e q u e os p r o d u t o s lipolíticos d o V L D L e quilomí-
erons, c h a m a d o s de " l i p o p r o t e í n a s r e m a n e s c e n t e s " , e r a m predi-
tivos p a r a risco d e C H D . U m m é t o d o que usa a n t i c o r p o s para
m e n s u r a r o c o n t e ú d o de colesterol das partículas s e m e l h a n t e s às
r e m a n e s c e n t e s (RLP) tornou-se c o m e r c i a l m e n t e disponível.
D e m o n s t r o u - s e q u e ele é útil n a previsão d o risco de C H D e m
vários estudos, m a s a i n d a n ã o é a m p l a m e n t e u s a d o .
LDL Oxidado
O L D L o x i d a d o (oxLDL), q u e é gerado m vivo, a p r e s e n t a várias
p r o p r i e d a d e s pró-ateTogênicas, i n c l u i n d o : (1) r á p i d a c a p t a ç ã o p o r
macrófagos p a r a f o r m a r células espumosas, (2) q u i m i o a t r a ç ã o p o r
m o n ó c i t o s circulantes, (3) p r o m o ç ã o da d i f e r e n c i a ç ã o de m o n ó -
citos e m m a c r ó f a g o s teciduais e (4) inibição da m o t i l i d a d e dos
macrófagos residentes. T a m b é m é citotóxico para vários tipos de
células e é i m u n o g ê n i c o . U m m é t o d o E L I S A comercial p a r a
d e t e r m i n a ç ã o d e o x L D L está a t u a l m e n t e disponível.
Fontes de Variação e Viés na M e n s u r a ç ã o d o
Teste
A s c o n c e n t r a ç õ e s das várias l i p o p r o t e í n a s e suas partes consti-
t u i n t e s - lipídios e a p o l i p o p r o t e í n a s - v a r i a m entre os i n d i v í d u o s
( C a p í t u l o 3). A s variações analíticas p a r a estas m e n s u r a ç õ e s são
relativamente p e q u e n a s , g e r a l m e n t e cerca d e 2 % a 3% d e C V
para colesterol e triglicerídeos e m e n o s de 4 % p a r a colesterol
L D L e H D L , e e m geral estão d e n t r o das diretrizes de d e s e m p e -
n h o analítico da N C E P (Tabela 23-ll). 1 1 E m c o n t r a p a r t i d a , as
variações fisiológicas são m u i t o m a i o r e s e c o n t r i b u e m p a r a a
m a i o r p a r t e da variância geral de c o n c e n t r a ç õ e s d e lipídios e
lipoproteínas. Por esta razão, u m a c o n c e n t r a ç ã o u s u a l de lipídio
o u l i p o p r o t e í n a de u m p a c i e n t e n ã o é confiavelrnente estabele-
cida a partir d e u m a ú n i c a m e n s u r a ç ã o . O N C E P L a b o r a t o r y
S t a n d a r d i z a t i o n Panei l a n ç o u as seguintes r e c o m e n d a ç õ e s espe-
cíficas sobre fatores pré-analíticos e p r o c e d i m e n t o s d e processa-
m e n t o d e amostras p a r a r e d u ç ã o da variação de e x a m e d e lipídios
e lipoproteínas:
1. U m perfil lipídico e l i p o p r o t é i c o isolado deve ser m e d i d o
a p e n a s q u a n d o o i n d i v í d u o está e m e s t a d o m e t a b ó l i c o
estável.
2. O s indivíduos d e v e m m a n t e r sua dieta e peso usual p e l o
m e n o s 2 s e m a n a s antes da d e t e r m i n a ç ã o de seus lipídios e
lipoproteínas.
3 . M ú l t i p l a s m e n s u r a ç õ e s e m u m p e r í o d o d e 2 meses, c o m
intervalo de p e l o m e n o s 1 s e m a n a , d e v e m ser realizadas antes
d e se t o m a r u m a decisão clínica s o b r e f u t u r a s ações.
4. O s indivíduos n ã o devem realizar atividade física vigorosa n o
p e r í o d o d e 24 h o r a s antes d o exame.
5. As amostras e m j e j u m o u sem j e j u m d e v e m ser usadas p a r a
e x a m e de colesterol total. E n t r e t a n t o , é necessária u m a
a m o s t r a e m j e j u m de 12 h o r a s p a r a triglicerídeos e lipopro-
teínas.
6. O s indivíduos d e v e m sentar-se p o r peto m e n o s 5 m i n u t o s
antes da coleta da a m o s t r a .
7. O t o r n i q u e t e n ã o deve ser m a n t i d o p o r mais de 1 m i n u t o
d u r a n t e a p u n ç ã o da veia.
8. Deve-se usar soro o u p l a s m a p a r a m e d i r as c o n c e n t r a ç õ e s de
colesterol total, triglicerídeos e colesterol H D L . Q u a n d o o
E D T A é u s a d o c o m o anticoagulante, o p l a s m a deve ser res-
f r i a d o i m e d i a t a m e n t e p a r a 2 ° C a 4 ° C p a r a evitar m u d a n ç a s
na composicão, e os valores devem ser m u l t i p l i c a d o s p o r
1,039.
9. Para exame de colesterol total, o soro deve ser t r a n s p o r t a d o
a 4 ° C ou c o n g e l a d o . O a r m a z e n a m e n t o das amostras a - 2 0 ° C
é a d e q u a d o para a m e n s u r a ç ã o d o colesterol total; n o e n t a n t o ,
as amostras t ê m d e ser a r m a z e n a d a s a -70°C, ou m e n o s , p a r a
e x a m e de triglicerídeos, l i p o p r o t e í n a e a p o l i p o p r o t e í n a .
10. A s amostras d e s a n g u e devem s e m p r e ser c o n s i d e r a d a s p o t e n -
cialmente infecciosas e, p o r t a n t o , devem ser m a n i p u l a d a s d e
maneira adequada.
OUTROS FATORES DE RISCO CARDÍACO 2
A p e s a r da forte associação e n t r e c o n c e n t r a ç õ e s de lipídios e risco
d e C H D , há m u i t o é r e c o n h e c i d o q u e m e t a d e d e t o d o s os infar-
tos d o m i o c á r d i o o c o r r e e n t r e i n d i v í d u o s sem h i p e r i i p i d e m i a
evidente. C o n s e q ü e n t e m e n t e , u m a a m p l a v a r i e d a d e d e m a r c a d o -
res b i o q u í m i c o s n ã o lipídicos foi a t u a l m e n t e i d e n t i f i c a d a para
possível uso na avaliação d o risco cardiovascular. D o i s dos mais
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular
promissores sao a proteína C-reativa de alta sensibilidade (hsCRP)
e a homocisteína.
Proteína C-reativa de Alta Sensibilidade 1 3 , 1 4
A C R P foi descoberta e m 1930, e mais tarde foi d e m o n s t r a d o
que ela é u m reagente de fase aguda. R o t i n e i r a m e n t e , é monito-
rada c o m o u m a indicação de infecção e de doenças auto-imunes
(Capítulo 18).
A inflamação crônica t a m b é m é u m c o m p o n e n t e i m p o r t a n t e
n o desenvolvimento e progressão de aterosclerose. I n ú m e r o s
estudos epidemiológicos d e m o n s t r a r a m que o a u m e n t o das con-
centrações de C R P sérica é positivamente associado a risco de
f u t u r o s eventos de C H D q u a n d o se usa o ensaio de hsCRP.
Estudos t a m b é m d e m o n s t r a r a m u m a associação significativa
entre C R P e f u t u r o risco de: (1) s í n d r o m e metabólica, (2) diabetes
meiiitiís e (3) hipertensão. Estes achados s u s t e n t a m a hipótese de
que inflamação, aterotrombose, diabetes e hipertensão estão de
alguma forma f i r m e m e n t e inter-relacionados e partilham meca-
n i s m o s patogênicos c o m u n s .
Bioquímica
A C R P consiste e m cinco s u b u n i d a d e s de polipèptídeos n ã o
glicosilados idênticos e ligados n ã o covalentemente para f o r m a r
u m polímero cíclico em f o r m a de disco c o m u m peso molecular
de 115 kDa. Ela c o n t é m p o u c o ou n e n h u m carboidrato e é sin-
tetizada n o fígado. Sua p r o d u ç ã o é controlada pela interleucina-
6 e liga-se a polissacarídeos presentes em muitas bactérias, fungos
e protozários, assim como policátions, c o m o as histonas.
Importância Clínica
As diretrizes nacionais para m e n s u r a ç ã o da C R P c o m o marcador
de risco de C H D f o r a m lançadas e m c o n j u n t o pela A H A e C D C
(AHA/CDC).
Doença Cardiovascular
Estudos epidemiológicos prospectivos m o s t r a r a m que u m a única
m e n s u r a ç ã o p o r h s C R P é u m forte previsor de: (1) infarto d o
miocárdio, (2) AVC, (3) d o e n ç a vascular periférica e (4) m o r t e
cardíaca súbita em indivíduos sem u m a história de caidiopatia.
E m u m a c o m p a r a ç ã o direta dos marcadores bioquímicos tradi-
cionais e novos d o risco de C H D , a h s C R P foi o preditor mais
forte d e eventos coronarianos futuros.
Possível Papel da CRP na Aterogênese
A t u a l m e n t e , n ã o se sabe se a C R P é u m m a r c a d o r que reflete a
i n f l a m a ç ã o sistêmica ou vascular ou se, na verdade, é u m parti-
cipante na aterogênese. Achados de estudos patológicos e in nitro
m o s t r a r a m que a C R P a u m e n t a a expressão de: (1) moléculas de
adesão da superfície celular endotelial local, (2) proteína-1 qui-
mioatrativa d o m o n n c i t o , (3) endotelina-1 e (4) inibidor-1 do
ativador d o plasminogênio endotelial. A C R P t a m b é m : (1) reduz
a bioatividade do óxido nítrico endotelial; (2) a u m e n t a a i n d u ç ã o
de f a t o r tecidual nos m o n ó c i t o s e a captação de LDL pelos
macrófagos e (3) o c u p a a m e s m a posição d o complexo do com-
p l e m e n t o de ataque à m e m b r a n a em lesões ateroscleróticas. A l é m
disso, demonstrou-se que a expressão de C R P h u m a n a em
c a m u n d o n g o s transgênicos a u m e n t a d i r e t a m e n t e a trombose
intravascular tanto n a lesão arterial c o m o nos m o d e l o s de lesão
f o t o q u í m i c a d o r o m p i m e n t o endotelial.
Papel r a Intervenção da Doença
Vários agentes farmacológicos que d e m o n s t r a r a m capacidade
cardioprorerora, c o m o o ácido acetilsalicílico e estatinas, irão
reduzir h s C R P e / o u risco de C H D q u e está associado a a u m e n t o
CAPÍTULO 2 3 439
da concentração de hsCRP. E m u m experimento primário de
g r a n d e p o r t e sobre prevenção, a redução do risco de i n f a r t o d o
miocárdio f u t u r o associado ao ácido acetilsalicílico foi de 5 6 %
entre aqueles c o m concentrações de h s C R P n o quartil mais alto
e d i m i n u i u p r o p o r c i o n a l m e n t e c o m valores de h s C R P n o quartil
mais baixo. Isso sugere que o ácido acetilsalicílico p o d e evitar
eventos isquêmicos através de efeitos anti inflamatórios e antipla-
quetários. Todos os fármacos estatínicos mostraram reduzir
hsCRP, mas, de m o d o interessante, a m a g n i t u d e da redução d o
colesterol LDL causada pela terapia c o m estatina está m i n i m a -
m e n t e correlacionada c o m a m a g n i t u d e da redução da hsCRP.
O s dados de vários experimentos randomizados de grande p o r t e
sugerem que a redução d o risco cardiovascular atribuível à terapia
c o m estatina pode ser mais notável para aqueles com a u m e n t o
das concentrações d e h s C R P na linha de base.
Análise de CRP
O s métodos de h s C R P foram desenvolvidos para detectar as
baixas concentrações necessárias para previsão d o risco vascular.
Das várias técnicas usadas para m e l h o r a r a sensibilidade dos
ensaios de CRP, a a b o r d a g e m mais b e m sucedida foi ampliar as
propriedades de dispersão da luz do complexo antígeno-anti-
c o r p o por meio do a c o p l a m e n t o covalente de partículas de látex
e m u m a n t i c o r p o específico, u m p r o c e d i m e n t o facilmente auto-
matizado usando-se i n s t r u m e n t a ç ã o labora to rial-padr ao. M u i t o s
ensaios de h s C R P comerciais c o m limites de detecção mais baixos
m e n o r e s que 0,3 m g / L estão disponíveis, alguns c o m imprecisão
analitica d e n t r o do laboratório de m e n o s de 10%. E n t r e t a n t o , os
resultados da h s C R P de ensaios de diferentes laboratórios fre-
q ü e n t e m e n t e são discordantes. H á esforços em a n d a m e n t o para
padronizar os ensaios hsCRP.
Variabilidade Biológica da CRP
Apesar de ser u m reagente de fase aguda, a h s C R P exibe u m grau
relativamente baixo de variabilidade individual e m pacientes cli-
nicamente estáveis. E m u m estudo desses pacientes, duas mensu-
rações i n d e p e n d e n t e s de hsCRP, feitas com 90 dias de intervalo
entre elas, possibilitaram a classificação de 9 0 % dos participantes
no tercil exato ou i m e d i a t a m e n t e adjacente d o hiomarcador, u m a
porcentagem comparável àquela observada para o colesterol.
A l é m disso, a correlação ajustada à idade entre duas mensurações
de h s C R P de amostras de sangue retiradas c o m intervalo de 5
anos foi de 0,6, u m valor comparável àquele do colesterol. Ficando
estabelecido que u m valor m e n o r que 10 m g / L é obtido, o painel
da A H A / C D C r e c o m e n d a que duas mensurações de h s C R P
sejam feitas c o m u m intervalo de 2 semanas ou mais entre elas,
c o m u m valor médio usado para estimar o risco vascular. C o m o
o a u m e n t o das concentrações p o d e refletir infecção subclínica, os
valores de h s C R P maiores que 10 m g / L devem inicialmente ser
desconsiderados, e o teste deve se repetido q u a n d o o paciente
estiver estabilizado. A l é m disso, como os valores de h s C R P não
são afetados pela ingestão de alimentos e exibem pouca variação
circadiana, as amostras e m jejum n ã o são necessárias.
Valores de Referência
O s dados de várias coortes norte-americanas e européias d e
g r a n d e p o r t e indicam que a distribuição das concentrações cir-
culantes de h s C R P parece comparável entre h o m e n s e mulheres
que não u s a m terapia de reposição h o r m o n a l (HRT) pós-meno-
pausa, s e n d o q u e o percentil 50 para ambos os sexos é de cerca
de 1,5 m g / L . As concentrações de h s C R P são mais altas nas
mulheres q u e fazem uso de HR.T oral d o q u e e m mulheres q u e
n ã o o fazem. T a m b é m h á diferenças limitadas nas concentrações
de C R P entre diferentes faixas etárias e grupos raciais e étnicos.
440 PARTE IV Analitos
Colesterol LDL, mg/dL
Figura 2 3 - 2 3 Algoritmo para avaliação de risco de CHD
e m p r e g a n d o C R P e colesterol LDL. (De Rifai N, Ridker PM. Population
distributions of Oreactive piotein in apparently healthy m e n a n d
w o m e n in the U n i t e d States: implication for clinicai interpretation. C h n
C h e m 2003;49.666-9.)
Os valores de referencia de m e n o s de 1, 1 a 3 e maiores que 3
mg/L, que correspondem a tereis aproximados da distribuição de
C R P nos adultos sadios, são recomendados para classificação de
indivíduos em grupos de risco baixo, m o d e r a d o e alto e m situa-
ções de prevenção primária pelo painel A H A / C D C . Devido ao
efeito aditivo prognóstico da h s C R P à triagem lipidica, foi pro-
posto u m algoritmo c o m b i n a n d o h s C R P e colesterol LDL u s a n d o
pontos de corte da N C E P (Figura 23-23).
Homocisteína
Demonstrou-se que concentrações aumentadas da homocisteína
total (tHcy) se correlacionam com CHD.' 1
Bioquímica
A homocisteína (Hcy) é u m aminoácido que contém enxofre;
cada molécula de homocisteína contém u m átomo de enxofre.
Ela é formada d u r a n t e o metabolismo de metionina e requer
ácido fõlico c o m o co-fator (Capítulo 27). Em concentrações
baixas, a Hcy é convertida de volta em metionina em u m ciclo
que envolve tetraidro folato ou é catabolizada em cisteína por
enzimas que requerem vitaminas B como co-fator. Conseqüente-
mente se descobriu que u m a deficiência de ácido fólico ou vita-
minas B s e Bi2 resulta em a u m e n t o das concentrações de Hcy
(Capítulo 27).
Hcy n o r m a l m e n t e não se acumula n o plasma porque é muito
instável em solução aquosa e, q u a n d o presente em excesso, passa
por oxidação rápida em homocistina.
Importância Clínica
Inúmeros estudos sugeriram u m a associação entre concentrações
elevadas de Hcy circulante e vários distúrbios vasculares e cardio-
vasculares. 4 Além disso, as concentrações de tHcy t a m b é m estão
relacionadas com: (1) defeitos congênitos, (2) complicações da
gravidez, (3) distúrbios psiquiátricos e (4) deficiência mental nos
idosos. Clinicamente, a mensuração de tHcy é considerada impor-
tante: (1) para diagnosticar homocistinúria, (2) identificar indiví-
duos com deficiência de cobalamina ou folato, ou em risco de
desenvolvê-la, e (3) avaliar tHcy como fator de risco para C H D .
E m b o r a inúmeros estudos t e n h a m demonstrado uma relação
causal entre tHcy e C H D , ainda há controvérsias sobre a impor-
tância clínica desta relação, como: (1) o polimorfismo M T H F R
677CAT, uma enzima essencial n o metabolismo de Hcy, é u m
fator de risco forte para a u m e n t o de tHcy, mas não para C H D ;
(2) há u m a discrepância aparente entre estudos de caso-controle
prospectivos e retrospectivos; e (3) u m estudo controlado prospec-
tivo falhou em mostrar benefícios de suplementação de folato na
prevenção de eventos de C H D . Devido a esta preocupação sobre
a importância clínica da relação causal entre tHcy e C H D , Refsum
e colaboradores desenvolveram as seguintes recomendações 1 2 :
1. A mensuração de tHcy na população geral para fazei triagem
para risco de C H D não é recomendada.
2. N o s pacientes jovens (com menos de 40 anos) com C H D ,
tHcy deve ser medido para excluir homocistinúria.
3. N o s pacientes com C H D ou pessoas em risco paia eventos
de C H D , u m a alta concentração de tHcy deve ser usada como
fator prognóstico para eventos de C H D e mortalidade.
4. Pacientes com C H D c o m tHcy maior que 15 p m o l / L perten-
cem a u m grupo de alto risco; é especialmente i m p o r t a n t e
para eles seguir u m estilo de vida saudável e receber tratamen-
tos adequados para fatores de risco causais conhecidos.
5. O aumento de tHcy c o m b i n a d o com baixas concentrações de
vitamina B deve ser tratado como u m a potencial deficiência
de vitamina. Outras causas de a u m e n t o de tHcy devem ser
consideradas.
Análise de Homocisteína Total
Fisiologicamente, existe Hcy nas formas: (1) reduzida, (2) oxidada
e (3) ligada a proteína Métodos para tHcy foram primeiramente
introduzidos na metade da década de 1980 e resolveram os pro-
blemas relacionados à presença de múltiplas espécies de Hcy
instáveis n o plasma convertendo todas as espécies de Hcy à forma
reduzida. C o n s e q ü e n t e m e n t e , os métodos m o d e r n o s exigem pré-
tratamento de amostras d o plasma ou soro com u m agente
redutor, como: (1) ditioeritritol, (2) ditiotreitol, (3) mercaptoeta-
nol, (4) tributil fosfina ou (5) tris(2-carboxi-etil) fosfina, que con-
verte todas as espécies Hcy à forma reduzida, HcyH. Os métodos
m o d e r n o s para' tHcy incluem imunoensaios enzimáticos e
métodos baseados em cromatografia. Na prática, os imunoen-
saios são mais f r e q ü e n t e m e n t e usados com objetivos de rotina,
como imunoensaio por fluorescência polarizada. Os ensaios cro-
matográficos incluem u m a ampla variedade de métodos, como:
(1) análise de aminoácidos; (2) cromatografia líquida de alta efi-
ciência (HPLC) com detecção por ultravioleta, fluorescência ou
eletroquímica; (3) eletroforese capilar com detecção por fluores-
cência; (4) cromatografia a gás-espectrometria de massas ( G O
MS); e (5) cromatografia líquida com MS em tandem (MS-MS).
Os diferentes métodos para tHcy apresentam resultados compa-
ráveis, mas ainda há necessidade de melhora na padronização.
Para obter resultados precisos, recomenda-se que as amostras
sejam refrigeradas e rapidamente centrifugadas. Se as amostras
forem deixadas em temperatura ambiente, a glicólise contínua
das células sanguíneas p o d e dobrar as concentrações de homo-
cisteína. A adição de fluoreto ou inibidores da S-adenosil-homo-
cisteína hidrolase evitará este problema. Intervalos de referência
para concentrações de Hcy em jejum foram relatados como
sendo de 13 a 18 ]umol/L para soro e 10 a 15 n m o l / L para o
plasma. O intervalo de referência para Hcy total nos pacientes
pediátricos foi relatado c o m o sendo de 3,7 a 10,3 p m o l / L .
 Lipídios, Lipoproteínas, Apolipoproteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular
REFERÊNCIAS
1. American Academy of Pediatrics C o m m i t t e e on Nutrition.
Indication for cholesterol testing in children, Pediatrics 1989;83:141-2.
2. Eaton CB. Traditional and emerging TÍSIÍ factors for cardiovascular
disease. Prim Care 2005;32:963-76.
3. G r u n d y SM. Cholesterol-lowermg drugs as cardioprotecrive agents.
A m } Cardiol 1992;70:271-321.
4. G u t h i k o n d a S, Haynes W G , Homocysteine: role and implications
in atherosclerosis Curr Atheroscler Rep 2006;8:100-6.
5. Havei RJ, Kane JP. Introduction: structure and metabolism of
plasma lipoproteins. In- Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D,
eds. T h e metabolic and molecular bases of inherited diseases, 8th
ed. New York: McGtaw-Hill, 2001:2705-16.
6. Huxley R, Lewington S, Clarke R. Cholesterol, coronary heart
disease and stroke: a review of published evidence from
observational studies and randomized controlled trials. Semm Vasc
Med 2002;2:315-23.
7. Mahley RW, Innerarity TL, Rali SC, ]r., Weisgraber KH Plasma
lipoproteins: apolipoprotein structure and function J Lipid Res
1984;25 1277-94.
8. Marcovina SM, Koschinsky ML, Albers J], Skarlatos S. Report of
the National Heart, Lung, and Blood Institute Workshop o n
Lipoprotem(a) and Cardiovascular Disease: Recent Advances a n d
Future Directions. Clin C h e m 2003;49:1785-96.
9. National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert panei on
detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in
adults (Adult Treatment Panei III). Third Report of the National
Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panei on Detection,
Evaluation, and Treatment of H i g h Blood Cholesterol in Adults
CAPÍTULO 2 3 441
{Adult Treatment Panei III) final report. Circulation 2002,106:
3143-421.
10. Nauck M, Warnick GR, Rifai N . Methods for measurement of
LDL-cholesterol: a criticai assessment of direct measurement by
homogeneous assays versus calculatíon. Clin C h e m 2002;48:
236-54.
11. Recommendations on lipoprotein measurement: from the working
group on lipoprotein measurement. National Cholesterol Education
Program, Bethesda, MD: N I H / N H L B I N I H Publkation, 1995:
95-3044.
12. Refsum H, Smith AD, Ueland PM, Nexo E, Clarke R, McParthn J,
et al. Facts and recommendations about total homocysteine
determinations; an expert opinion. Clin C h e m 2004,50:3-32.
13. Ridker P, Rifai N, eds. GReactive protein and cardiovascular
disease.
St Laurent, Canada: MediEdition, 2006.
14. Rifai N, Ballantyne CM, C u s h m a n M, Levy D, Myers GL. High-
sensitivity C-reactive protein a n d cardiac C-reactive protein assays:
is there a need to differentiate? Clin C h e m 2006;52:1254-6.
15 Rifai N, Domimczak M, Warnick G R , eds. H a n d b o o k of
lipoprotein testing, 2nd ed. Washington, DC: A A C C Press, 2000
16. Sebedia ]L, Perkins EG. New trends in lipid and lipoproteins
analysis. Champaign, 111: A O C S Press, 1995.
17. Vance DE, Vance JE. Biochemistry of lipids, lipoproteins, and
membranes. New York: Elsevier ScLence, 1996
18. Warnick GR, Nauck M, Rifai N . Evolution of methods for
measurement of HDL-cholesterol: f r o m ultracentrifugation to
homogeneous assays. Clin C h e m 2001,47:1579-96.
CAPÍTULO 2 4

Eletrólitos e Gases Sanguíneos

Mitchell G. Scott, Ph.D., Vicky A. LeGrys, D.A., M.T.(A.S.C.P.), C.L.S.fN.C.A.),
e J. Stacey Klutts, M.D., Ph.D.

OBJETIVOS Fibrose Cística (CE): U m distúrbio hereditário da proteína

1. Definir os seguintes termos: reguladora da c o n d u t â n c i a t r a n s m e m b r a n a (CFTR) que
Eletrólito
causa a doença p u l m o n a r obstrutiva e pancreática crônica.
Gases Sanguíneos: P C 0 2 e P 0 2 (pressões parciais de dióxido de
Osmolalidade
carbono e oxigênio) geralmente n o sangue total.
Teste do suor
H e m o g l o b i n a (Hb): U m carreador de oxigênio, proteína
Gases sanguíneos
c o n t e n d o h e m e a b u n d a n t e n o s eritrócitos.
Saturação de oxigênio I o n t o f o r e s e p o r P i l o c a r p i n a : O processo de utilizar eletricidade
P50 para forçar o fármaco pilocarpina para d e n t r o da pele c o m
2. Listar os principais eletrólitos fisiológicos. o propósito de induzir suor naquele local.
3. Discutir as funções fisiológicas e regulação de sódio, potássio e I o n t o f o r e s e : U m m é t o d o n ã o invasivo de propulsão de altas
cloreto no organismo e listar os intervalos de referência saudáveis concentrações de u m a substância carregada
para cada um deles. t r a n s d e r m i c a m e n t e p o r u m a força eletromotiva repulsiva
4. Apresentar o princípio do método do eletrodo seletivo de íon utilizando u m a carga elétrica p e q u e n a aplicada a u m a
especificamente para a análise de sódio, potássio e cloreto. câmara iontoforética que c o n t é m u m agente ativo carregado
5. Listar as quatro propriedades coligativas de uma solução. de forma semelhante e o seu veículo.
M e n s u r a ç ã o Ácido-Base: A m e n s u r a ç ã o d o p H e gases
6. Apresentar o princípio do teste do suor quantitativo para fibrose
sanguíneos do sangue total.
cística.
O s m o m e t r i a : A técnica para m e n s u r a r a concentração de
7. Comparar testes do suor quantitativo e qualitativo.
partículas de soluto dissolvidas e m u m a solução.
8. Relacionar as questões críticas na realização do teste do suor.
P 5 0 : A P 0 2 para u m a dada amostra de sangue e m q u e m e t a d e
9. Apresentar a equação Henderson-Hasselbalch. da h e m o g l o b i n a do sangue está saturada com 0 2 ; P 50 reflete
10. Apresentar os métodos utilizados para definir pH, C02, 0 2 e a afinidade da hemoglobina pelo 0 2 .
saturação de oxigênio sanguíneos. p H : O logaritmo negativo da atividade do íon hidrogênio.
11. Listar as fontes de erro pré-analítico na análise dos gases Pressão Parcial: A fração da substância (mole) de gás
sanguíneos. multiplicada pela pressão total; p o r exemplo, a pressão
parcial de oxigénio, P 0 2 , é a fração de gás oxigênio
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES multiplicada pela pressão barométrica.
C l o r e t o d o S u o r : A concentração do cloreto n o suor; o cloreto Saturação de O x i g ê n i o : A fração (porcentagem) de
do suor a u m e n t a d o é característico de fibrose cística. h e m o g l o b i n a f u n c i o n a l que é saturada com oxigênio,
C u r v a d e Dissociação d o Oxigênio! A curva sigmoidal obtida abreviada c o m S 0 2 .
q u a n d o S 0 2 do sangue é representada graficamente contra Testagem L a b o r a t o r i a l R e m o t a : Teste clínico realizado
a P02. p r ó x i m o ao paciente, geralmente c o m u m dispositivo
Eletrólitos: Moléculas carregadas, de baixo peso molecular, m a n u a l e u m a amostra n ã o processada coletada
i m e d i a t a m e n t e antes d o teste.
presentes n o plasma e citosol, geralmente íons de sódio,
potássio, cálcio, magnésio, cloreto, bicarbonato, fosfato,
sulfato e lactato.

Eletrodos Seletivos de I o n (ISE): U m tipo de eletrodo
potenciométrico para u m a finalidade especial consistindo
em u m a m e m b r a n a seletivamente permeável para u m a
espécie iônica. O potencial p r o d u z i d o na interface
membrana-solução de amostra é proporcional ao logaritmo
da atividade iônica ou concentração.
E f e i t o de Exclusão d o Eletrólito: O s eletrólitos são excluídos
da fração do v o l u m e de plasma total o c u p a d o por sólidos, o
q u e acarreta a subestimação da concentração de eletrólitos
por alguns m é t o d o s .
E q u a ç ã o de H e n d e r s o n - H a s s e l b a l c h : U m a equação que define
a relação entre p H , bicarbonato e pressão parcial do gás
dióxido de c a r b o n o dissolvido:
C H C Q 3
{H = £>fC' + log
( a + PCO,)
A
m a n u t e n ç ã o da homeostasia da água é essencial para a
vida de todos os organismos. N o s mamíferos, a m a n u t e n -
ção da pressão osmótica e distribuição da água nos vários
c o m p a r t i m e n t o s de fluidos corporais é p r i m a r i a m e n t e u m a
f u n ç ã o dos q u a t r o principais eletrólitos: sódio (Na*), potássio
0 0 , cloreto (Cl') e b i c a r b o n a t o ( H C O 3 ) . E m adição à homeosta-
sia da água, estes eletrólitos d e s e m p e n h a m u m papel i m p o r t a n t e :
(1) n a m a n u t e n ç ã o do p H , (2) na f u n ç ã o apropriada do coração
e músculos, (3) nas reações de oxidoiredução e (4) c o m o co-
fatores para enzimas. N a verdade, quase não existem processos
metabólicos que sejam i n d e p e n d e n t e s dos eletrólitos ou que n ã o
sejam afetados p o r eles. As concentrações anormais de eletrólitos
p o d e m ser a causa ou a conseqüência de vários distúrbios. Por-
tanto, a determinação das concentrações dos eletrólitos é u m a
das funções mais i m p o r t a n t e s de u m laboratório clínico. A inter-
pretação de valores anormais da osmolalidade e de ácido-base
requer c o n h e c i m e n t o específico dos eletrólitos. Por causa das

443
444 PARTE IV Analitos
suas inter-relações fisiológicas e clínicas, este c a p í t u l o d i s c u t e a
d e t e r m i n a ç ã o de eletrólitos, osmolalidade, estado ácido-base e
oxigenação s a n g u í n e a .
ELETRÓLITOS
O s eletrólitos são classificados c o m o ánions, íons c o m carga nega-
tiva q u e se m o v e m e m direção a u m â n o d o , o u cátions, íons
carregados p o s i t i v a m e n t e q u e se m o v e m e m direção a u m c á t o d o .
O s eletrólitos fisiológicos i n c l u e m Na + , K \ Ca 2 + , Mg 2 ', C l , H C 0 3 '
,H 2 P0 4 ", H2PO4 2 ', S0 4 2 " e alguns â n i o n s orgânicos, c o m o o lactato.
E m b o r a os a m i n o á c i d o s e p r o t e í n a s e m solução t a m b é m carre-
g u e m u m a carga elétrica, g e r a l m e n t e eles são c o n s i d e r a d o s sepa-
r a d a m e n t e d o s eletrólitos. O s principais eletrólitos (Na + , K + , C l e
H C 0 3 ) o c o r r e m p r i m a r i a m e n t e c o m o í o n s livres, e n q u a n t o
q u a n t i d a d e s significativas (>40%) de Ca 2 *, Mg2_f e elementos-
traço estão ligados a p r o t e í n a s c o m o a a l b u m i n a .
A d e t e r m i n a ç ã o das c o n c e n t r a ç õ e s de f l u i d o s c o r p o r a i s d o s
q u a t r o eletrólitos p r i n c i p a i s (Na + , K \ Cl' e HCO3") é c o m u m e n t e
c o n h e c i d a c o m o "perfil eletrolítico". O u t r o s eletrólitos q u e apre-
s e n t a m f u n ç õ e s especiais e m c o n t e x t o s particulares são discuti-
d o s e m o u t r a s partes: C a 2 + e fosfatos n o C a p í t u l o 38; ferro n o
C a p i t u l o 28, m a g n é s i o e elementos-traço n o C a p í t u l o 27; e ami-
n o á c i d o s n o C a p í t u l o 18.
A m o s t r a s para Determinação d o s Eletrólitos
Soro o u plasma são as a m o s t r a s mais c o m u n s analisadas para Na*,
K*, Cl' e H C O 3 . Estes são o b t i d o s a partir d o sangue c o l h i d o p o r
v e n i p u n ç ã o e m u m t u b o a v á c u o ( C a p í t u l o 3). O sangue capilar,
c o l h i d o e m t u b o s de m i c r o a m o s t r a s , t u b o s capilares ou aplicados
d i r e t a m e n t e d e u m a la n cet a digital para a l g u m dispositivo d e
teste r á p i d o , t a m b é m é u m a a m o s t r a c o m u m . A s a m o s t r a s de
sangue total h e p a r i n i z a d o arterial ou v e n o s o o b t i d a s para deter-
m i n a ç ã o de gases s a n g u í n e o s e p H t a m b é m p o d e m ser utilizadas
c o m e l e t r o d o s seletivos d e í o n (ISEs) diretos. As diferenças dos
valores e n t r e o soro e o p l a s m a e e n t r e amostras venosas ou
arteriais são d o c u m e n t a d a s p a r a estes eletrólitos, m a s s o m e n t e as
d i f e r e n ç a s d e K + e n t r e o soro e o p l a s m a são c o n s i d e r a d a s clini-
c a m e n t e significantes. A utilização d e h e p a r i n a , lítio o u sal de
a m ó n i o é necessária q u a n d o o ensaio é realizado c o m p l a s m a ou
sangue total. A utilização de p l a s m a ou sangue total a p r e s e n t a a
v a n t a g e m de m i n i m i z a r o t e m p o d o ensaio p o r n ã o ser necessário
esperar a coagulação d o sangue. A l é m disso, p l a s m a ou sangue
total a p r e s e n t a m u m a v a n t a g e m indubitável n a d e t e r m i n a ç ã o das
c o n c e n t r a ç õ e s de K + , q u e são invariavelmente mais altas n o soro,
d e p e n d e n d o d a c o n t a g e m d e plaquetas. 1 6
O s t u b o s de a m o s t r a s d e v e m ser c e n t r i f u g a d o s t a m p a d o s e o
s o r o ou p l a s m a deve ser s e p a r a d o p r o n t a m e n t e . S a n g u e s excessi-
v a m e n t e lipêmicos são f o n t e s d e erro analítico c o m alguns
m é t o d o s (ver a seguir a seção de efeito d e exclusão d o eletrólito).
Assim, é necessária a u l t r a c e n t r i f u g a ç ã o d o s o r o o u p l a s m a para
a m o s t r a s lipêmicas antes d a análise. A h e m ó l i s e gera resultados
e r r ó n e o s de c o n c e n t r a ç õ e s altas de K + , e este p r o b l e m a n ã o é
detectável q u a n d o se analisa sangue total. A l é m disso, amostras
n ã o h e m o l i s a d a s q u e n ã o são i m e d i a t a m e n t e processadas p o d e m
a p r e s e n t a r c o n c e n t r a ç õ e s a u m e n t a d a s de KH' por causa d a p e r d a
d e K" pelos eritrócitos q u a n d o o s a n g u e é e s t o c a d o a 4°C. Estes
c u i d a d o s e o u t r a s p r e o c u p a ç õ e s à coleta da a m o s t r a e m a n u s e i o
estão descritos nas páginas seguintes d e f o r m a r e l a c i o n a d a aos
analitos individuais.
A coleta d e urina p a r a análise de Na*, K + , Cl" deve ser feita
s e m a adição d e preservativos. Fezes e aspirados e d r e n a g e m d e
d i f e r e n t e s p o r ç õ e s d o trato gastrointestinal t a m b é m p o d e m ser
s u b m e t i d o s à análise d e eletrólitos. A coleta e análise d o s u o t são
descritas p o s t e r i o r m e n t e n e s t e capítulo.
Sódio
O sódio é o p r i n c i p a l c á t i o n d o f l u i d o extracelular. O Na + repre-
senta a p r o x i m a d a m e n t e 9 0 % d o s 154 m m o l de cátions inorgâ-
nicos p o r litro de plasma, por isso é responsável p o r q u a s e m e t a d e
d a força osmótica d o p l a s m a . P o r t a n t o , o m e s m o a p r e s e n t a u m a
f u n ç ã o c e n t r a l n a m a n u t e n ç ã o d a d i s t r i b u i ç ã o n o r m a l d e água e
pressão o s m ó t i c a n o c o m p a r t i m e n t o d e f l u i d o extracelular (ECF).
A dieta diária n o r m a l c o n t é m 8 a 15 g (130 a 2 6 0 m m o l ) de
N a C l , q u e é quase c o m p l e t a m e n t e a b s o r v i d o n o trato gastroin-
testinal. O o r g a n i s m o r e q u e r a p e n a s 1 a 2 m m o l / d i a , e o excesso
é excretado pelos rins, q u e são os reguladores finais da q u a n t i -
d a d e de Na 1 (e p o r t a n t o de água) n o c o r p o .
O s ó d i o é l i v r e m e n t e f i l t r a d o pelos glomérulos. S e t e n t a a
o i t e n t a p o r c e n t o da carga d e N a " filtrada é e n t ã o a t i v a m e n t e
r e a b s o r v i d a n o s t ú b u l o s proximais c o m o Cl', e a água segue
p a s s i v a m e n t e de m a n e i r a isosmótica e e l e t r i c a m e n t e n e u t r a
( C a p í t u l o 34). O u t r o s 2 0 % a 2 5 % são r e a b s o r v i d o s n a alça d e
H e n l e j u n t a m e n t e c o m o Cl* e mais água. N o s t ú b u l o s distais, a
i n t e r a ç ã o d o h o r m ô n i o a d r e n a l a l d o s t e r o n a c o m a d u p l a Na + -K +
e Na*-H + d e sistemas de troca resulta d i r e t a m e n t e n a reabsorção
de Na + , e i n d i r e t a m e n t e d e Cl", dos 5 % a 10% restantes d a q u a n -
tidade filtrada. A regulação desta ú l t i m a fração d e N a ' f i l t r a d o
d e t e r m i n a p r i m a r i a m e n t e a q u a n t i d a d e d e Na + excretado n a
u r i n a . Estes processos são discutidos n o C a p í t u l o 35.
Amostras
As a m o s t r a s analisadas para Na + i n c l u e m (1) soro, (2) p l a s m a
h e p a r i n i z a d o , (3) sangue total, (4) suor, (5) u r i n a , (6) fezes ou (7)
f l u i d o s gastrointestinais. As coletas c o m t e m p o m a r c a d o d e
u r i n a , fezes o u f l u i d o s gastrointestinais são preferidas para per-
m i t i r a c o m p a r a ç ã o dos valores c o m os intervalos d e referência
e para d e t e r m i n a r as taxas d e p e r d a d e eletrólitos. Soro, p l a s m a
e u r i n a p o d e m ser estocados a 2 ° C a 4 ° C ou congelados. O s
eritrócitos c o n t ê m a p e n a s u m d é c i m o d o N a ' p r e s e n t e n o plasma,
p o r t a n t o a h e m ó l i s e n ã o causa erros significativos n o s valores de
N a 1 ' n o soro o u p l a s m a . As a m o s t r a s lipêmicas devem ser ultra-
c e n t r i f u g a d a s , e analisa-se o i n f r a n a d a n t e , a m e n o s q u e seja u s a d o
u m ISE direto.
As a m o s t r a s de fezes ou f l u i d o s gastrointestinais r e q u e r e m
p r e p a r a ç ã o antes d a análise. A p e n a s as fezes líquidas justificam a
d i f i c u l d a d e da análise p o r q u e h á significativa p e r d a d e eletrólitos
q u a n d o as fezes estão líquidas. I m e d i a t a m e n t e após a coleta, deve
ser retirada a matéria p a r t i c u l a d a das a m o s t r a s de fezes líquidas
p o r filtração o u c e n t r i f u g a ç ã o . O risco de c o n t a m i n a ç ã o bacte-
r i a n a d o s sistemas d e a m o s t r a s d o s i n s t r u m e n t o s a u t o m a t i z a d o s
é m a i o r c o m amostras d e fezes; p o r isso, devem-se fazer a limpeza
e p r o c e d i m e n t o s especiais logo após a análise.
Metodologia Analítica
O s ó d i o é d e t e r m i n a d o : (1) p o r e s p e c t r o f o t o m e t r i a de a b s o r ç ã o
a t ô m i c a (AAS), (2) p o r e s p e c t r o f o t o m e t r i a de emissão d e c h a m a
(FES), (3) e l e t r o q u i m i c a m e n t e c o m Na + -ISE o u (4) espectrofoto-
m e t r i c a m e n t e . Destes m é t o d o s , os m é t o d o s ISE são os mais
c o m u m e n t e utilizados. O sódio e o potássio são r o t i n e i r a m e n t e
analisados juntos, p o r isso os m é t o d o s d e análise são descritos
j u n t o s p o s t e r i o r m e n t e neste capítulo.
intervalos de Referência
O intervalo de referência para o Na" sérico é d e 135 a 145 m m o l / L
da i n f â n c i a à vida a d u l t a . O i n t e r v a l o p a r a recém-nascidos pre-
m a t u r o s e m 4 8 horas é de 128 a 148 m m o l / L , e o valor para o
s a n g u e de c o r d ã o u m b i l i c a l d e recém-nascidos a t e r m o é - 1 2 7
m m o l / L . A excreção d e sódio urinário varia de a c o r d o c o m a dieta
alimentar, m a s para os i n d i v í d u o s c o m dieta-padrão c o n t e n d o 8
 Eletrólitos e Gases Sanguíneos
a 15 g / d i a , o intervalo típico é de 40 a 220 m m o l / d i a . Existe
u m a grande variação durante o dia na excreção de Na + , sendo
que a taxa de excreção de Na + durante a noite é de apenas 2 0 %
daquela durante o dia. A concentração de Na + do f l u i d o cerebros-
p i n a l é 136 a 150 m m o l / L . 2 0 A média de excreção de Na + fecal
é m e n o r que 10 m m o l / d i a .
Potássio
O potássio é o p r i n c i p a l cátion intracelular. Nas células teciduais,
sua concentração média é de 15C m m o l / L e, nos eritrócitos, é
de 105 m m o l / L ( - 2 3 vezes sua concentração no plasma). Altas
concentrações intracelulares são mantidas pela b o m b a de Na + ,
K + -ATPase, que é abastecida p o r energia oxidativa e transporta
c o n t i n u a m e n t e K + para dentro da célula contra u m gradiente de
concentração. Esta b o m b a é u m fator crítico na manutenção e
ajuste dos gradientes iónicos dos quais dependem os impulsos
nervosos e a contratilidade d o músculo. Q u a n d o a atividade da
b o m b a está d i m i n u í d a , a difusão de K* d o interior da célula para
o plasma excede o transporte de IC para o meio intracelular
mediado pela bomba. A importância destas considerações na
integridade da amostra para análise de K + é discutida posterior-
mente neste capítulo.
A necessidade corporal de K + é satisfeita com a ingestão na
dieta alimentar de 5 0 a 150 m m o l / d i a . O potássio absorvido a
partir do trato gastrointestinal é rapidamente distribuído, c o m
u m a pequena quantidade sendo absorvida pelas células e a maior
parte sendo excretada pelos rins. O potássio filtrado pelo glo-
m é r u l o é quase que completamente reabsorvido nos túbulos
proximais e então é secretado nos túbulos distais na troca por
Na + sob a i n f l u ê n c i a da aldosterona.
Os fatores que regulam a secreção de K + n o t ú b u l o distai são:
(1) ingestão de Na + e K + , (2) concentração plasmática de minera-
locorticóides e (3) balanço ácido-base. A taxa de filtração glome-
rular d i m i n u í d a e a conseqüente d i m i n u i ç ã o na velocidade de
f l u x o n o t ú b u l o distai é u m i m p o r t a n t e fator na retenção de KT
observada na insuficiência renal crônica. A acidose tubular renal
e acidoses e alcaloses metabólica e respiratória t a m b é m compro-
metem a regulação renal de excreção de fC. Estes tópicos serão
discutidos nos Capítulos 34 e 35.
Amostras
Os comentários feitos anteriormente sobre as amostras para
análise de Na + são geralmente aplicáveis àquelas para análise de
K*. N o entanto, alguns pontos adicionais devem ser considera-
dos. As concentrações de potássio n o plasma e n o sangue total
são 0,1. a 0,7 m m o l / L menores que n o soro, e os intervalos de
referência estabelecidos para o K + sérico são 0,2 a 0,5 m m o l / L
mais altos que aqueles para o K + plasmático. A extensão desta
diferença depende, n o entanto, da contagem de plaquetas porque
o K + adicional n o soro é primariamente u m resultado da r u p t u r a
de plaquetas durante a coagulação. lâ Esta variação na quantidade
de K + adicional n o soro torna o plasma a amostra preferencial e
enfatiza a necessidade de notificar nos relatórios os intervalos de
referência apropriados para soro ou plasma.
As amostras para determinar as concentrações de K + n o soro
ou plasma devem ser coletadas por métodos que m i n i m i z a m a
hemólise, pois a liberação de K + de 0 , 5 % dos eritrócitos aumenta
os valores de KT em 0,5 m m o l / L . U m aumento de 0 , 6 % de K + é
estimado para cada 10 m g / d L de h e m o g l o b i n a (Hb) plasmática
como decorrência da hemólise. Assim, u m a hemólise leve ( - 5 0
m g H b / d L ) irá aumentar os valores de K + - 3 % , hemólise mode-
rada ( - 2 0 0 m g H b / d L ) 12% e hemólise intensa (>500 m g H b / d L )
3 0 % . Portanto, é imperativo que qualquer hemólise visível seja
notificada com os valores de K + relatados e que seja i n c l u í d o u m
CAPÍTULO 24 445
comentário dizendo que os resultados são falsamente elevados. Se
as concentrações de K~ são determinadas por ISE nas amostras de
sangue total utilizando-se u m i n s t r u m e n t o de análise de gases
sanguíneos ou u m dispositivo de teste rápido, o aumento nas
concentrações reais de K + causado por hemólise pode ser facil-
mente ignorado. U m a porção da amostra deve ser centrifugada
para a inspeção visual quando a hemólise for suspeita.
Os erros pré-analíticos clinicamente significativos ocorrem
nas determinações de KT q u a n d o as amostras de sangue não são
processadas prudentemente. A manutenção d o gradiente de K 4
intracelular-extracelular depende da atividade da Na'-K* ATPase
dependente de energia. Se u m a amostra de sangue total é res-
friada antes da separação, a glicólise é i n i b i d a e a Na + -K + ATPase
dependente de energia não irá manter o gradiente, e o a u m e n t o
de K + plasmático irá ocorrer à medida que o K" escapar dos eri-
trócitos e de outras células. O aumento de K + n o soro é da ordem
de 0,2 m m o l / L em 1,5 horas a 25°C, enquanto a 4 Q C, o a u m e n t o
relatado é de 2 m m o l / L após 4 horas.
Os valores de K + falsamente d i m i n u í d o s são inicialmente
observados se uma amostra não separada fica estocada a 37°C
por causa da ocorrência da glicólise e deslocamento intracelular
de K + . Mesmo à temperatura ambiente, a leucocitose inicial-
mente causa falsas diminuições nas concentrações de K + . A exten-
são desta d i m i n u i ç ã o depende da contagem de leucócitos, tem-
peratura e concentrações de glicose, mas foi relatada como sendo
0,7 m m o l / L a 37°C. N o entanto, este efeito é bifásico. Inicial-
mente, o K + plasmático d i m i n u i como resultado da glicólise, mas
0 K* começa a escapar das células após a exaustão d o substrato
glicose. Assim, a recomendação para a determinação mais confi-
ável de BC é: (1) coletar o sangue com heparina, (2) mantê-lo entre
2 5 ° C e 37°C e (3) separar o plasma em poucos m i n u t o s p o r meio
de centrifugação em velocidade alta sem resfriamento. Todavia,
em termos práticos, é improvável a ocorrência de u m erro consi-
derável na maioria dos casos em que a separação é feita em até
1 h o r a e as amostras são mantidas em temperatura ambiente.
A atividade dos músculos esqueléticos causa o efluxo de K +
das células musculares para o plasma, resultando em uma eleva-
ção notável nos valores de K* plasmático. U m exemplo em par-
ticular, mas c o m u m , ocorre quando u m torniquete n o braço não
é retirado antes de começar a coleta de sangue após o paciente
fechar o p u n h o repetidamente. Q u a n d o isto acontece, é possível
que os valores de K* plasmático a u m e n t e m em 2 m m o l / L como
artefato por causa da atividade muscular. 10
Intervalos de Referência
Os intervalos de referência relatados para o soro de adultos são
3,5 a 5,0 m m o l / L e 3,7 a 5,9 para os recém-nascidos. Os inter-
valos freqüentemente citados são 3,5 a 4,5 e 3,4 a 4,8 m m o l / L
para o plasma em adultos. As concentrações d o f l u i d o cerebros-
p i n a l são ~ 70% do plasma. 20 A excreção urinária de K + varia com
a dieta alimentar, mas o intervalo tipicamente observado para
u m a dieta-padrão é 25 a 125 m m o l / d i a . A perda gastrointestinal
pode ser de 60 m m o l / d i a em casos de diarréia grave.
Metodologia Analítica para a Determinação de
Sódio e Potássio
Os métodos A A S , FES o u espectrofotométricôs são utilizados
para a análise de Na* e K \ N o entanto, a maioria dos laboratórios
atualmente utiliza o m é t o d o ISE. Por exemplo, dos mais de 5.000
laboratórios participantes dos exames de proficiência do College
o f A m e r i c a n Patbologists (CAP), > 9 9 % estavam utilizando o
m é t o d o ISE para analisar Na + e K + em 2005. Os princípios de
cada u m a dessas abordagens (que são discutidas em detalhes nos
446 PARTE IV Analitos
C a p í t u l o s 4 e 5) são os mesmos se a i n s t r u m e n t a ç ã o é dedicada
o u integrada a u m sistema m u l t i c a n a l .
O efeito de exclusão d o e l e t r ó l í t o t a m b é m interfere n a men-
su ração de N a * e K~.
Eletrodos Seletivos de íon
U m ISE é u m eletrodo p o t e n c i o m é t r i c o , de f i n a l i d a d e especial,
c o n s i s t i n d o e m u m a m e m b r a n a seletivamente permeável para
u m ú n i c o t i p o de espécie iônica. O p o t e n c i a l p r o d u z i d o na inter-
face membrana-amostra e m solução é p r o p o r c i o n a l ao l o g a r i t m o
da atividade iônica o u concentração.
O ISE integrado a analisadores q u i m i c o s geralmente c o n t é m
eletrodos N a + c o m m e m b r a n a s de v i d r o e eletrodos K + c o m
m e m b r a n a s de troca i ô n i c a líquidas que i n c o r p o r a m v a l i n o m i -
cina. (Os eletrodos típicos e os p r i n c í p i o s da p o t e n c i o m e t r i a são
d e s d i t o s e m detalhes n o C a p í t u l o 5.) N a prática, o sistema de
mensuração p o t e n c i o métrica é calibrado utilizando-se soluções
calibradoras c o n t e n d o quantidades definidas de Na + e K \ Os
potenciais dos calibradores são d e t e r m i n a d o s e a concentração
A E / A log é armazenada n a m e m ó r i a d o c o m p u t a d o r c o m o u m
fator para calcular uma concentração desconhecida q u a n d o se
mensura E da amostra de v a l o r des c onhec i do. A calibração fre-
qüente, i n i c i a d a pelo usuário o u pela retirada automática de u m a
amostra d o reservatório de calibrador, é característica da m a i o r i a
dos sistemas. A l g u n s i n s t r u m e n t o s são projetados para m e d i r N a +
e 10 n o sangue total, p a r t i c u l a r m e n t e os dispositivos de teste
r á p i d o e os novos analisadores de gases sanguíneos.
O s dois tipos de ISEs existentes são o i n d i r e t o e o d i r e t o . lSJo
ISE indireto, a amostra é i n t r o d u z i d a e m u m a câmara de mensu-
ração após ser m i s t u r a d a c o m u m grande v o l u m e de d i l u e n t e . A
utilização de u m grande v o l u m e é vantajosa p o r q u e cobre ade-
q u a d a m e n t e a superfície de u m e l e t r o d o grande e m i n i m i z a a
concentração de proteína na superfície d o eletrodo. Os ISEs
i n d i r e t o s são mais c o m u n s nos analisadores a u t o m á t i c o s grandes
e de alta a m p l i t u d e , N o m é t o d o ISE direto, a amostra é exposta
ao eletrodo sem d i l u i r . Os ISEs diretos são utilizados nos anali-
sadores de gases sanguíneos, dispositivos de testes rápidos e
o u t r o s i n s t r u m e n t o s de uso ú n i c o . U m teste de p r o f i c i ê n c i a d o
C A P e m 2 0 0 5 m o s t r o u que a p r o x i m a d a m e n t e dois terços dos
l a b o r a t ó r i o s u t i l i z a r a m ISE i n d i r e t o para m e n s u r a r Na + e K + . As
diferenças i m p o r t a n t e s e n t r e os m é t o d o s d i r e t o e i n d i r e t o , q u e
causam diferenças significativas nos resultados analíticos, são
discutidas na seção posterior de e/eito de. exclusão do eletrólíto.
Os erros observados n o uso de ISEs são decorrentes de: (1)
ausência de seletividade analítica, (2) revestimento r e p e t i d o de
p r o t e í n a n a m e m b r a n a sensível a íons e (3) c o n t a m i n a ç ã o da
m e m b r a n a o u p o n t e de sal pelos ions que c o m p e t e m o u reagem
c o m o í o n selecionado e, p o r t a n t o , a l t e r a m a resposta d o ele-
t r o d o . Estes erros fazem c o m que sejam necessárias trocas perió-
dicas da m e m b r a n a c o m o parte da m a n u t e n ç ã o r o t i n e i r a .
Métodos de Espectrofotometria
Os m é t o d o s espectrofotométricos são baseados e m : (1) ativação
enzimática, (2) detecção da alteração espectral p r o d u z i d a q u a n d o
Na 4 o u K + se liga ao c r o m ó f o r o macrocíclico e (3) mensuração da
fluorescência. Estes tipos de m é t o d o s n ã o são utilizados r o t i n e i -
r a m e n t e p o r q u e os reagentes são caros e existem poucos proble-
mas c o m os métodos ISEs. C o n s e q ü e n t e m e n t e , os métodos
espectro f o t o métricos são empregados p r i m a r i a m e n t e e m alguns
i n s t r u m e n t o s menores utilizados nos c o n s u l t ó r i o s m é d i c o s o u
clínicas.
U m ensaio espectrofotométrico c i n é t i c o para N a + é baseado
n a ativação da enzima (3-galactosidase pelo Na + para h i d r o l i s a i
o-nitrofenil-p-D-galactopiranosídeo ( O N P G ) . A taxa de p r o d u ç ã o
de o - n i t r o f e n o l (o c r o m ó f o r o ) é m e n s u r a d a a 4 2 0 n m .
CH^OH
UH /
G alactose
P^flidctosiíídse
H OH o-nitrofenol
o-n irro fe n il-p-D-ga I ac to p i ra n o s ídeo C1,™* " 420 nm)
Os ioTió/oros macTodclicos são moléculas cujos átomos são orga-
nizados para f o r m a r u m a cavidade d e n t r o da q u a l os íons metá-
licos se organizam e se l i g a m c o m alta a f i n i d a d e . Estes compostos
t a m b é m são conhecidos c o m o éteres poíicíclicos, éteres de coroa ou
criptandos. Diferentes macrocíclicos são feitos c o m cavidades
adaptadas para se ajustar ao raio í ô n i c o de diferentes elementos.
A alteração espectral ocorre q u a n d o se liga u m c á t i o n aos i o n ó -
foros que apresentam propriedades cromogênicas.
Espectrofotometria de Emissão de Chama
E m b o r a t e n h a sido u m dos métodos mais a m p l a m e n t e utilizados
para m e n s u r a r a análise de Na + e K + , a t u a l m e n t e a FES não é
mais u m m é t o d o l a b o r a t o r i a l c o m u m . C o m a FES, as amostras
são diluídas e m u m d i l u e n t e c o n t e n d o quantidades conhecidas
de l í t i o ( o u césio, se o p r ó p r i o l í t i o está sendo mensurado) e
aspiradas para d e n t r o de u m a chama de p r o p a n o . Os íons sódio,
potássio, l í t i o e césio, q u a n d o excitados, e m i t e m espectros c o m
linhas nítidas e b r i l h a n t e s a 589, 768, 671 e 852 n m , respectiva-
mente. A luz e m i t i d a a p a r t i r dos íons excitados termicamente é
d i r e c i o n a d a através de f i l t r o s de interferência separados para os
foto detectores correspondentes. O sinal de emissão de L i + o u Cs +
são utilizados c o m o padrões i n t e r n o s (geralmente 15 m m o l / L )
aos quais são comparados os sinais de N a * e K~.
Efeito de Exclusão do Eletrólitol
O efeito de exclusão d o e l e t r ó l í t o é a exclusão de elerrólitos da
fração d o v o l u m e t o t a l de plasma ocupada p o r sólidos. O v o l u m e
de sólidos totais ( p r i n c i p a l m e n t e p r o t e í n a e l i p í d i o ) e m u m a
alíquota dc plasma é de a p r o x i m a d a m e n t e 7%- A s s i m 9 3 % d o
v o l u m e d o plasma é, n a verdade, água. Os p r i n c i p a i s eletrólitos
(Na + , K + , C l ' e HCO3) estão essencialmente c o n f i n a d o s na fase
aquosa. Q u a n d o u m v o l u m e f i x o de plasma total, p o r exemplo
10 |uL, é p i p e t a d o para d i l u i ç ã o antes da análise p o r f o t o m e t r i a
de c h a m a o u ISE i n d i r e t o , somente 9,3 (J.L d o plasma aquoso
c o n t e n d o eletrólitos é realmente a d i c i o n a d o ao d i l u e n t e . Por-
t a n t o , a concentração de N a ' d e t e r m i n a d a pela f o t o m e t r i a de
chama o u ISE i n d i r e t o de 145 m m o l / L é a concentração n o
v o l u m e t o t a l do plasma e não n o v o l u m e aquoso d o plasma. N a
verdade, se o plasma c o n t é m 9 3 % de água, a concentração de
Na + n o plasma aquoso é 145 x ( 1 0 0 / 9 3 ) , o u 156 m m o l / L .
Este " e r r o " negativo n a análise d o e l e t r ó l í t o plasmático é
c o n h e c i d o h á vários anos. E m b o r a apenas a concentração dos
eletrólitos n o plasma aquoso seja fisiológica, assumiu-se q u e a
fração d o v o l u m e de água n o plasma é s u f i c i e n t e m e n t e constante,
de f o r m a q u e esta diferença p o d e ser ignorada. D e fato, todos os
intervalos de referência dos eletrólitos são baseados nesta supo-
sição e r e a l m e n t e r e f l e t e m as concentrações n o v o l u m e t o t a l d o
plasma, e n ã o n o v o l u m e de água. A l é m disso, p r a t i c a m e n t e todas
as concentrações mensuradas nos l a b o r a t ó r i o s q u í m i c o s clínicos
são relativas ao v o l u m e t o t a l da amostra e m vez de serem relativas
ao v o l u m e de água. Este efeito de exclusão de eletrólíto torna-se
p r o b l e m á t i c o q u a n d o estão presentes condições patofisiológicas

que alteram o volume aquoso do plasma, como hiperlipidemia
o u híperproteinemia. Nestas condições, são obtidos valores falsa-
mente baixos de eletrólitos quando as amostras são diluídas antes
da análise, como na fotometria de chama ou ISE indireto 1 (Figura
24-1). Os métodos de fotometria de chama e ISE indireto estão
sujeitos ao efeito de exclusão do eletrólito por causa da diluição
do volume total de plasma e da suposição de que o volume
aquoso do plasma é constante. E m certas condições, como a
cetoacidose com hiperlipidemia grave8 o u mieloma m ú l t i p l o com
hiperproteinemia grave, o efeito de exclusão negativo pode ser
tão grande que os resultados laboratoriais levam os médicos a
acreditar que as concentrações de eletrólitos estão normais ou
baixas quando, na verdade, a concentração na fase aquosa pode
ser alta o u normal, respectivamente. 1
Nos métodos ISE diretos, a diluição não é realizada e a ativi-
dade do eletrólito mensurada é diretamente proporcional à con-
centração na fase aquosa, e não à concentração do v o l u m e total.
A maioria dos métodos ISE diretos opera n o comumente conhe-
cido " m o d o chama" para tornar os resultados deste método
equivalentes àqueles obtidos por fotometria de chama e ISE
indireto. Neste m o d o , a concentração medida diretamente n o
plasma aquoso é multiplicada pela média da fração do volume
aquoso do plasma (0,93). Embora o ú l t i m o possa variar ampla-
mente, enquanto a atividade do i o n específico é constante, a
concentração do íon na fase aquosa toina-se independente da
proporção relativa entre água e sólidos totais se os íons não
estiverem ligados às proteínas, como é o caso do Ca 2 *. Portanto,
os métodos ISE diretos estão livres dos efeitos da exclusão de
eletrólitos e os valores determinados pelos métodos ISE diretos,
mesmo no m o d o chama, são diretamente proporcionais à ativi-
dade na fase aquosa e definem as concentrações dos eletrólitos
de forma mais fisiológica e físico-química.
Os métodos ISE diretos atualmente são considerados os
métodos de escolha para a análise de eletrólitos. Isto é baseado
n o fato de que grandes alterações nos lipídios, proteínas e outros
sólidos plasmáticos ocorrem com freqüência em condições clíni-
cas relativamente comuns e em terapias como a alimentação
100
80
| 60 100% 90% 80%
H2O h2O
•>
40
20
Potenciometria direta 100 100
Fotometria de chama 100 90
ou
Potenciometria indireta
Figura 24-1 Previsão da i n f l u ê n c i a da q u a n t i d a d e de água n a
mensuração d o s ó d i o para u m a solução de N a C l a 100 m m o l / L p o r
e l e t r o d o seletivo de í o n (ISE) direto uersus f o t o m e t r i a de emissão de
c h a m a o u I S E i n d i r e t o . As áreas vermelhas representam v o l u m e s n ã o
aquosos, q u e p o d e m consistir e m l i p í d i o s , proteínas ou m e s m o traços
de partículas de látex o u areia. (Reimpresso c o m a permissão de A p p l e
FS, K o c h D D , Graves S, L a d e n s o n ] H . R e l a t i o n s h i p between direct-
potentiometric and flame-photometric measurement of s o d i u m in
b t o o d . C l i n C h e m 1982; 28:1931-5.)
Eletrólitos e Gases Sanguíneos CAPÍTULO 2 4 447
parenteral com emulsões lipídicas. s A l é m disso, mesmo na ausên-
cia de grandes alterações no volume das frações sólidas, os resul-
tados obtidos pelos métodos diretos refletem de forma mais real
o estado clínico e por isso são mais efetivamente utilizados n o
diagnóstico e tratamento. Todavia, espera-se que os resultados
dos métodos diretos c o n t i n u e m sendo convertidos em concen-
trações do volume total de plasma pela utilização do m o d o
chama, que é a recomendação do Clinicai and Laboratory Stan-
dards Institute (CLSI). 4 As Tabelas 24-1 e 24-2 resumem os
métodos de mensuração da concentração e atividade dos eletró-
litos, respectivamente.
Cloreto
O cloreto é o principal â n i o n extracelular, com concentrações
medianas no plasma e f l u i d o intersticial de - 1 0 3 m m o l / L (con-
centração do â n i o n inorgânico total de - 1 5 4 m m o l / L ) Juntos,
o sódio e o cloreto representam a maior parte dos constituintes
osmoticamente ativos do plasma. Ele está envolvido de forma
significativa na: (1) manutenção da distribuição da água, (2)
pressão osmótica e (3) balanço ânion-cátion no ECE. E m con-
traste às suas altas concentrações n o ECF, a concentração de
Cl" n o f l u i d o intracelular dos eritrócitos é de 45 a 54 m m o l / L e
no f l u i d o intracelular da maioria das outras células teciduais é
de apenas - 1 m m o l / L .
Os íons cloreto da alimentação são quase que completamente
absorvidos no trato intestinal, Eles são filtrados do plasma pelos
glomérulos e passivamente reabsorvidos, j u n t o com o Na + , nos
túbulos proximais (Capítulo 34). N o ramo ascendente grosso da
alça de Henle, o Cl' é ativamente reabsorvido pela bomba de
cloreto, cuja ação promove a absorção passiva de Na + . Os diuré-
ticos de alça, como furosemida e ácido etacrínico, i n i b e m a
bomba de cloreto. O Cl' excedente é excretado na urina e também
é eliminado no suor. E medido como u m indicador de fibrose
cística.
Amostras
O cloreto é mais freqüentemente mensurado no: (1) soro ou (2)
plasma, na (3) urina e no (4) suor. Ele é m u i t o estável no soro e
no plasma. Mesmo quando a hemólise é intensa, não ocorre
alteração significativa nas concentrações de C í no soro o u plasma
TABELA 2 4 - 1 Métodos para Mensurar a Concentração
ao Volume de Amostra Total e, Portanto,
Sujeitos ao Efeito de Exclusão do Eletrólito
HjO
Método Analilos
Fotometria de chama Na+, K4, Li+
Espectrometria de absorção atômica Ca54, Mg 2 " e outros
Amperometria/coulometria cr
Potenciometria indireta Na + , K+, Ca24, Cl'
100
80
í TABELA 2 4 - 2 Métodos para Mensurar a Atividade,
Molalidade ou Concentração na Fase
Aquosa e, Portanto, Não Sujeitos ao Efeito
de Exclusão do Eletrólito
Método Analitos
ISE com amostra não diluída H + (pH), Na+, K 4 , Ca34, Cl, Li4
Eletrodos de gás C0g (ÍÍÍO2), O2 (MJ2)
HCOg" (calculado a partir do pH e fC0 a )
Depressão da ponto de congelamento H 2 0 (osmolalidade)
448 PARTE IV Analitos
porque a concentração de Cl" nos eritrócitos é aproximadamente
metade daquela n o plasma. M u i t o pouco Cl" se encontra ligado
a proteínas, por isso alterações na postura, estase ou uso de tor-
niquetes também apresentam pouca influência na sua concentra-
ção plasmática. A determinação de Cl* fecal pode ser ú t i l no
diagnóstico de alcalose hipoclorêmica congênita.
Metodologia Analítica
Historicamente, o cloreto era mensurado nos sólidos e fluidos
corporais por titulação mercurimétrica e métodos de espectrofo-
tometria. C o m o estes métodos não são mais utilizados, a titula-
ção coulométrica-ampeiométrica e os ISEs são os métodos prefe-
renciais para mensurar Cl' nos fluidos corporais.
Titulação Coulométrica-Amperométrica
As determinações coulométricas-amperométricas de C l depen-
dem da geração de Ag + a partir do eletrodo de prata a ama taxa
constante e da reação de Ag + com C l na amostra para formar
cloreto de pTata insolúvel:
A g + + c r —»AgCl
Após atingir o p o n t o estequiométrico, o excesso de Ag + na
mistura desencadeia a paralisação do sistema de geração de Ag".
U m cronômetro marca o tempo passado entre o início e a pausa
na geração de Ag + . O intervalo de tempo é proporcional à quan-
tidade de Cl" presente na amostra, por isso a concentração do
C l é calculada da seguinte forma:
Cloreto ( m m o l / L ) - " tempo,, r3nm
^ ^ríililrarlíir
tem|:o„|lbl,dri tempo, h t a r i e r
onde C^jbradoT é a concentração do calibrador.
As aplicações deste principio (freqüentemente chamado de
cloridômetro de Cotlove) são os métodos mais precisos para
mensurar Cl* em todos os intervalos de concentrações apresenta-
dos pelos fluidos corporais- O método está sujeito a interferên-
cias por outros íons halogêmos, pelos íons CN* e SCN", pelos
grupos sulfídricos e por contaminação com metais pesados.
Eletrodos Seletivos de íon
Eletrodos seletivos para o cloreto são preparados utilizando-se
membranas poliméricas solventes que incorporam os trocadores
de âníon do sal quaternário de amónio, como o decanol cloreto
de tri-n-octilpropilamonia. Estes eletrodos, todavia, sofrem com
a instabilidade da membrana e inconsistência lote a lote na
seletividade de outros ânions. Os ânions que tendem a ser pro-
blemáticos são outros halóides e ânions inorgânicos, como o
SCN", que são particularmente problemáticos por causa de sua
capacidade de se solubilizat na membrana orgânica polimérica
destes eletrodos.
Intervalos de Referência
Os intervalos de referência para o Cl" no soro ou plasma variam
entre 98 e 107 m m o l / L e 100 a 108 m m o l / L . Os valores séricos
variam pouco durante o dia. As concentrações de C l no f l u i d o
espinal são - 1 5 % mais altos que n o soro. A excreção urinária de
Cl" varia com a dieta alimentar, mas o intervalo típico é de 110
a 250 m m o l / d i a .
Mensuração do Cloreto no Suor (Teste do Suor)
A análise d o suor para verificar a concentração do eletrólíto é
utilizada para confirmar o diagnóstico de fibrose cística (CF). A
C F é o distúrbio genético letal mais c o m u m na população cau-
casiana com apresentações clínicas de amplo espectro, incluindo
doença pulmonar obstrutiva crônica e insuficiência pancreática.
A C F é causada por u m defeito na proteína reguladora da con-
dutância transmembrana da fibrose cística (CFTR), uma proteína
que normalmente regula o transporte de eletrólitos através das
membranas epiteliais. Foram identificadas mais de m i l mutações
em C F T R . Embora a análise mutacional direta esteja disponível,
ela não é informativa em todos os casos, e o teste quantitativo
de cloreto n o suor continua sendo o teste de diagnóstico padrão.
E m u m esforço para padronizar o teste, o C L S I desenvolveu o
documento de instruções C34-A2. 5 A l é m disso, a Cystic Fibrosis
Foundation produziu u m vídeo detalhando a execução e a inter-
pretação do teste do suor.
O teste do suor freqüentemente é realizado juntamente com
os programas de triagem do recém-nascido. A triagem de recém-
nascidos para a C F está se tornando mais c o m u m nos Estados
Unidos e no mundo, pois estudos demonstraram uma melhor
nutrição das crianças submetidas à triagem. 9,12 A maioria dos
protocolos de triagem de recém-nascidos começa com o teste de
tripsinogênio imunorreativo (IRT) no soro a partir de uma gota
de sangue seca, seguido de u m segundo I R T ou teste de DNA. 1 7
As crianças com teste de triagem do recém-nascido positivo são
conduzidos para o teste de cloreto no suor quantitativo, resul-
tando em u m aumento no n ú m e r o de testes de suor realizados
em indivíduos com menos de 2 meses de idade.
O teste do suor é realizado em três fases: (1) estímulo do suor
por meio de iontoforese por pilocarpina, (2) coleta do suor e (3)
análise qualitativa ou quantitativa do cloreto, sódro, condutivi-
dade ou osmolalidade do suor.
,
Estímulo da Sudorese e Coleta
Os eletrólitos aumentam transitoriamente n o suor logo após o
nascimento, por isso os indivíduos devem ter pelo menos 48
horas de idade antes da realização do teste do suor. O indivíduo
deve estar: (1) fisiológica e nutricionalmente estável, (2) comple-
tamente hidratado e (3) livre de doença aguda. A pele não deve
apresentar cortes, rachaduras e inflamações para evitar a conta-
minação da amostra de suor com fluidos serosos. Por exemplo,
o teste do suor nunca deve ser realizado sobre u m a área de
eczema.
Estimulo. Para estimular o suor, a sudorese localizada é pro-
duzida por iontoforese por pilocarpina de u m fármaco colinér-
gico, o nitrato de pilocarpina, em uma área da pele. A iontofo-
rese utiliza uma pequena corrente elétrica para depositar pilocar-
pina dentro da glândula sudorípara a partir do eletrodo positivo,
enquanto uma solução eletrolítica no eletrodo negativo completa
o circuito. Nota: embora a Occupational Safety and Health
Administra ti o n ( O S H A ) não liste o suor como potencialmente
infeccioso, os funcionários dos laboratórios devem tomar as
mesmas precauções universais que eles teriam c o m qualquer
outro f l u i d o corporal.
Coleta. Após a iontoforese, o suor é coletado em: (1) suporte
com gaze pré-pesado, (2) papel filtro, (3) espiral de Macroduct ou
(4) células sensoras de condutividade N a n o d u c t utilizando técni-
cas para minimizar a evaporação e contaminação. Se o suor é
coletado em uma gaze ou papel filtro, os eletrodos geralmente
são feitos de cobre e são u m pouco menores que a área de esti-
mulação e coleta. A composição da solução eletrolítica pode ser
selecionada para evitar a contaminação com a amostra de suor.
Antes de realizar a coleta, a gaze ou papel f i l t r o utilizados para a
coleta cio suor devem ser colocados em u m recipiente para
pesagem com tampa de segurança selada, e o recipiente deve ser
marcado e pesado em u m a balança analítica. O leitor deve con-
 Eletrólitos e Gases Sanguíneos
sultar o documento C34-A2 do CLSI 5 para veiificat o procedi-
mento detalhado para a estimulação e a coleta.
Alternativamente para a estimulação do suor, os eletrodos e
a fonte de corrente são integrados, como ocorre nos sistemas
Wescor Macroduct e N a n o d u c t (Wescor, Logan, Utah), que uti-
lizam géis contendo pilocarpina. N o sistema Macroduct, o suor
é coletado em u m coletor em espiral tubular de microdiâmetro
descartável. Após a coleta de suor suficiente, o suor é transferido
do espiral para u m recipiente de microamostra selável. O sistema
Nanoduct emprega uma célula sensora de condutividade inte-
grada no dispositivo de coleta de uso único.
Aspectos Críticos Associados à Estimulação e Coleta do Suor,
Durante a coleta, o analista deve: (1) evitar a evaporação e con-
taminação da amostra, (2) coletar uma quantidade suficiente de
amostra e (3) minimizar as reações cutâneas. A determinação e a
aderência de u m volume ou peso m í n i m o são fundamentais para
a obtenção de resultados válidos do teste de suor. A necessidade
de uma quantidade m í n i m a garante taxa de suor e concentração
suor-eletrólito apropriadas. Isso independe do instrumento utili-
zado para mensurar os eletrólitos do suor. Infelizmente, vários
analistas interpretam erroneamente a necessidade de coletar o
volume correto, acarretando testes de suor positivos falsos e nega-
tivos falsos, o que apresenta implicação significativa n o trata-
mento do paciente.
A concentração suor-eletrólito está relacionada à taxa de suor.
E m baixas taxas de suor, a concentração suor-eletrólito d i m i n u i
e a oportunidade de evaporação da amostra aumenta. Para garan-
tir u m resultado válido, a taxa média de suor deve exceder 1 g /
m 2 / m i n u t o . Para padronizar e simplificar o processo de coleta,
os eletrodos e os materiais absorvente e de coleta devem ser
aproximadamente do mesmo tamanho. Amostras insuficientes
não devem ser misturadas para a análise.
Q u a n d o a taxa aceitável é aplicada aos parâmetros descritos
no documento do CLSI, a amostra m i n i m a m e n t e aceitável para
a análise de u m único sítio com a utilização de uma gaze ou papel
filtro de 2 por 2 polegadas para estimulação e coleta é de 75 mg
de suor coletados em 30 minutos. 5 C o m o sistema Macroduct,
os eletrodos e a área de estimulação são menores e o m í n i m o de
amostra aceitável é de 15 j.iL coletados em 30 minutos.
Q u a n d o o processo de coleta desvia dos parâmetros padroni-
zados, o volume ou peso de suor m i n i m a m e n t e aceitáveis mudam.
O suor deve ser coletado por apenas 30 minutos. Se o tempo de
coleta exceder 30 minutos, deve-se aumentar a quantidade de
suor necessária para garantir a estimulação adequada. A extensão
do tempo de coleta permite uma oportunidade adicional para a
evaporação do suor e, praticamente, não aumenta o rendimento
de suor de forma significativa. A aquisição da amostra m í n i m a
não deve ser u m problema se forem seguidos o documento de
procedimento do CLSP e as recomendações do fabricante. A
porcentagem de amostra insuficiente, na média do processo de
coleta, não deve exceder 5 % para os pacientes com mais de três
meses de idade. As amostras de suor insuficientes resultam de
vários fatores, como: (1) idade, (2) peso, (3) raça, (4) condições
da pele e (5) sistema de coleta. Por exemplo, as crianças pesando
menos de 2.000 gramas ou mais jovens que 38 semanas após a
concepção ou de raça afro-americana apresentam probabilidade
aumentada de produzirem amostra insuficiente. 11 Os resultados
do programa de triagem do recém-nascido apresentaram 17% de
taxa insuficiente em crianças com duas semanas de idade, caindo
para 3 % a 11% nas crianças de três a oito semanas de idade. 1 '
Queimaduras na pele do paciente após a iontoforese são
extremamente raras, mas ocorrem com qualquer eletrodo. Se a
queimadura ocorrer no sítio de estimulação por pilocarpina, o
suor não deve ser coletado. O leitor deve consultar o documento
CAPÍTULO 24 449
C34-A2 do CLSI quanto às técnicas para m i n i m i z a i o potencial
de queimaduras. 5
Testes Qualitativos
U m teste de suor qualitativo representa u m teste de triagem para
CF. Os indivíduos que apresentam resultados positivos ou limí-
trofes devem ser submetidos ao teste quantitativo de suor. Os
exemplos de testes de triagem incluem Wescor Sweat-Chek e
Nanoduct para condutividade, C F Indicator System chloride
patch (PolyChrome Medicai Inc, Brooklin, M N ) e testes para
osmolalidade. Os testes de triagem podem o u não mensurar a
quantidade de suor coletado e podem apresentar u m resultado
como positivo, negativo ou limítrofe ou dar a concentração real
dos analitos do suor. Embora u m a variedade de sistemas seja
utilizada para o teste do suor, vários desses métodos relataram
problemas, tornando-os inapropriados para o uso clínico. Por
exemplo, analisadores de condutividade antigos que utilizam reci-
pientes coletores não aquecidos não são recomendados como
procedimento diagnóstico por causa dos problemas relatados
sobre evaporação e condensação de amostras e capacidade de
quantificar adequadamente as amostras de suor.
A Cystic Fibrosis Foundation aprovou o Wescor Macroduct
Sweat-Chek para a triagem em sítios clínicos, como hospitais
comunitários, utilizando o critério de que u m indivíduo apresen-
tando condutividade do suor de 50 m m o l / L ou maior deve ser
encaminhado para u m centro de tratamento de CF para fazer o
teste quantitativo de cloreto n o suor. Note que os métodos de
condutividade do suor produzem resultados mais elevados, em
aproximadamente 15 m m o l / L , que a concentração suor-cloreto.
Esta diferença provavelmente é causada pela presença de ànions
não mensurados, como o lactato e o bicarbonato. 13 Por causa desta
diferença, os laboratórios não devem informar os resultados de
condutividade como se fossem resultados do cloreto. E m adição
aos resultados de condutividade (em m m o l / L ) , o resultado deve
incluir os intervalos de referência de condutividade do suor.
Testes Quantitativos
O diagnóstico de C F i n c l u i a mensuração quantitativa do cloreto
do suor, que consiste em: (1) coleta do suor em uma gaze, papel
filtro ou espirais Macroduct; (2) avaliação da quantidade coletada
em peso (miligramas) ou v o l u m e (microlitros) e (3) mensuração
subseqüente da concentração de cloreto n o suor. A concentração
de cloreto é determinada por titulação coulométrica com u m
cloridômetro ou titulação manual com nitrato mercúrico. Se o
laboratório escolher quantificar o cloreto do suor com u m ana-
lisador automático que emprega u m ISE, estes métodos devem
ser validados sistematicamente quanto à acurácia, precisão e
menor limite de detecção. Para qualquer método, o menor l i m i t e
do intervalo de mensuração analítica para o cloreto do suor deve
ser menor ou igual a 10 m m o l / L . N o contexto dos achados cli-
nicamente significativos, uma concentração de cloreto no suor
maior que 60 m m o l / L é condizente com CF; concentrações entre
40 e 60 m m o l / L são consideradas limítrofes, e valores menores
que 40 m m o l / L geralmente são considerados normais. Nos
recém-nascidos, pode ser apropriado ajustar o intervalo de refe-
rência para menor que 30 m m o l / L . A l é m disso, algumas muta-
ções no gene da C F estão associadas a concentrações normais ou
limítrofes de cloreto no suor. 17,ls
Garantia de Qualidade
Os laboratórios que realizam teste de suor de alta qualidade
devem; (1) selecionar os métodos apropriados, (2) apresentar
volumes de testes para garantir familiaridade com o teste e (3)
limitar as pessoas que executam u m teste a u m pequeno número
450 PARTE IV Analitos

de i n d i v í d u o s b e m treinados. Para m o n i t o r a r a acurácia e a pre- m e n t o de grandes v o l u m e s e análise automatizada das amostras

cisão do processo analítico, duas concentrações de c o n t r o l e
devem ser analisadas d i a r i a m e n t e c o m as amostras dos pacientes.
As concentrações de cloreto n o suor maiores que 160 m m o l / L
não são f i s i o l o g i c a m e n t e possíveis e r e p i e s e n t a m c o n t a m i n a ç ã o
da amostra o u erro analítico. U m a parte i m p o r t a n t e do p l a n o de
c o n t r o l e de qualidade i n c l u i a validação externa da acurácia da
análise do suor através da participação nos testes de p r o f i c i ê n c i a ,
c o m o aqueles oferecidos pelo CAP.
Fontes de Erro no Teste do Suor
M e t o d o l o g i a n ã o confiável, erros técnicos e erros na interpreta-
ção acarretam resultados errôneos nos testes do suor. M é t o d o s
que não m e d e m a q u a n t i d a d e de suor coletado o u que não
apresentam u m a q u a n t i d a d e m í n i m a estabelecida estão sujeitos
a resultados negativos falsos p o r q u e não pode ser garantida u m a
taxa adequada de suor. O u t r o s problemas c o m o teste d o suor
i n c l u e m erros p o r evaporação e c o n t a m i n a ç ã o e aqueles na d i l u i -
ção, calibração do i n s t r u m e n t o , identificação da amostra e
emissão d o resultado. Estes erros o c o r r e m mais f r e q ü e n t e m e n t e
e m instituições que realizam relativamente poucos testes. Os
laboratórios c o m p o u c o v o l u m e de testes para análise d o suor
devem considerar a descontinuação do teste e i n d i c a r os pacien-
tes para centros de t r a t a m e n t o da C F para teste e avaliação. Os
erros de interpretação são causados por: (1) c o n h e c i m e n t o técnico
i n a d e q u a d o , (2) falha em repetir os resultados limítrofes e posi-
tivos, (3) falha em repetir os resultados negativos q u a n d o eles são
incompatíveis c o m o q u a d r o clínico e (4) falha em reperir o teste
em pacientes diagnosticados c o m C F q u e não apresentam o
curso c l í n i c o esperado. A má n u t r i ç ã o , desidratação, eczema e
rachadura a u m e n t a m os eletrólitos n o suor, e n q u a n t o o edema
e a administração de m i n e r a l o c o r t i c ó i d e s d i m i n u e m os eletróli-
tos n o suor. Várias condições que não a C F estão associadas a
elevações nos eletrólitos do suor; todavia, estas condições geral-
m e n t e são distinguíveis da C F c o m base na apresentação clínica
do paciente c o m o descrito n o C L S I , d o c u m e n t o C 3 4 - A 2 . 5
garante que a m a i o r i a das mensurações de C 0 2 seja realizada c o m
amostras que p e r d e r a m a l g u m C 0 2 gasoso dissolvido simples-
m e n t e p o r q u e a preservação das condições anaeróbicas não f o i
praticada d u r a n t e o t e m p o e m que o plasma f o i colocado n o
e q u i p a m e n t o e processado. A s s i m , o t e r m o " b i c a r b o n a t o " p o d e
ser, na verdade, preferível ao " C O 2 t o t a l " . A l t e r n a t i v a m e n t e , é
provável que o resultado de u m a amostra de urgência, que é
r a p i d a m e n t e processada e i m e d i a t a m e n t e analisada, apresente
u m erro m u i t o m e n o r .
Metodologia Analítica
O p r i m e i r o passo na mensuração do C 0 2 é a acidificação o u
alcalinização da amostra. A acidificação da amostra, c o m u m
tampão ácido, converte as várias formas de C 0 2 n o plasma e m
C 0 2 gasoso. A alcalinização da amostra converte t o d o o C 0 2 e
ácido carbônico em H C 0 3 . A mensuração d o C 0 2 t o t a l nos
i n s t r u m e n t o s automatizados m o d e r n o s é baseada e m eletrodos
o u enzimática- N o s métodos baseados em eletrodos indiretos, o
C 0 2 gasoso liberado após a acidificação é d e t e r m i n a d o p o r u m
e l e t r o d o P C 0 2 ( C a p í t u l o 5). A metodologia do /SE direto para C 0 2
t o t a l não é c o m u m nos analisadores automatizados, s o m e n t e
u m a pequena porcentagem dos laboratórios utiliza esta aborda-
gem. O s métodos diretos apresentam problemas c o m a especifi-
cidade. N o s métodos enzimáticos para C 0 2 , a amostra é p r i m e i r a -
m e n t e alcalinizada para c o n v e r t e i t o d o o C O 2 e ácido c a r b ô n i c o
e m HCO3". O H C 0 3 então é m e n s u r a d o utilizando-se u m ensaio
enzimático duplo:
O 0
o - ^ o 0 Fosfoenolpíruvato
carboxilase r = n
O + HCO?
H 2 C=C—<? 1
\x G
oo
Fosfoenolpíruvato Oxaloacetato

Bicarbonato (Dióxido de Carbono Total) <V°~ Malaco 0^.^,0

O d i ó x i d o de c a r b o n o t o t a l é a q u i u t i l i z a d o para descrever a desidrogenase |
1
q u a n t i d a d e mensurada c o m mais freqüência nos analisadores c=o = HO—CH
automatizados p o r : (1) acidificação de u m a amostra do soro o u
tSk ^
NADH NÀTV
NAD
CH
I 2
plasma e mensuração d o d i ó x i d o de c a r b o n o l i b e r a d o pelo pro-
cesso o u (2) alcalinização e mensuração d o b i c a r b o n a t o total. Sob cSP * H+
O - S ?
certas condições de coleta e m a n i p u l a ç ã o da amostra, os valores Oxaloacetato Malato
de d i ó x i d o de c a r b o n o d e t e r m i n a d o s desta f o r m a são compará-
veis c o m os valores para a concentração calculada de d i ó x i d o de A d i m i n u i ç ã o na absorvãncia da n i c o t i n a m i d a adenina d i n u -
c a r b o n o t o t a l o b t i d o s na análise de gases sanguíneos (ver seção cleotídeo reduzida (NADF1) a 3 4 0 n m é p r o p o r c i o n a l ao conte-
posterior neste capítulo nos métodos para gases sanguíneos). A ú d o t o t a l de C 0 2 .
fisiopatologia do b i c a r b o n a t o nos d i s t ú r b i o s acidobásicos é dis- Estes métodos enzimáticos são utilizados por cerca da metade
c u t i d a n o C a p í t u l o 35. de todos os laboratórios que r e l a t a m valores de C 0 2 total, e o
I S E i n d i r e t o é utilizado pela o u t r a metade.
Amostras
T a n t o o soro q u a n t o o plasma h e p a r i n i z a d o p o d e m seT analisa- Intervalos de Referência
dos. A amostra usual é o sangue venoso coletado c o m t u b o a Os intervalos de referência geralmente d e p e n d e m d o equipa-
vácuo, e m b o r a t a m b é m possa ser analisado o sangue capilar e m m e n t o , e os manuais dos fabricantes devem ser consultados e m
m i c r o t u b o o u t u b o capilar. A amostra coletada em t u b o a vácuo casos específicos. E m geral, os valores d o plasma e soro são 22 a
apresenta a determinação da concentração t o t a l de C O 2 mais 32 m m o l / L .
precisa: (1) q u a n d o o ensaio é realizado i m e d i a t a m e n t e após a
abertura d o tubo, (2) o q u a n t o antes após a coleta e (3) q u a n d o OSMOLALIDADE DO PLASMA E DA URINA
a amostra de sangue é centrifugada n o t u b o fechado. O ar A osmose é o processo que c o n s t i t u i o m o v i m e n t o do solvente
a m b i e n t e c o n t é m m u i t o m e n o s C 0 2 que o plasma e C 0 2 gasoso através da m e m b r a n a em resposta a diferenças de pressão osmó-
dissolvido. P o r t a n t o , o C O 2 irá escapar da amostra para o ar, c o m tica entre os dois lados da m e m b r a n a . A água migra através da
u m a conseqüente d i m i n u i ç ã o no valor de C 0 2 de até 6 m m o l / L m e m b r a n a em direção ao lado c o n t e n d o o s o l u t o mais concen-
após u m a h o r a de espera. N a prática, a logística do processa- trado. A o s m o m e t r i a é u m a técnica para mensurar a concentra-
 Eletrólitos e Gases Sanguíneos
ção de partículas de soluto que c o n t r i b u e m para a pressão osmó-
tica de u m a solução. A pressão osmótica governa o m o v i m e n t o
d o solvente (água nos sistemas biológicos) através das m e m b r a n a s
que separam duas soluções. A s m e m b r a n a s que c i r c u n d a m os
vasos glomerulares e capilares são exemplos de m e m b r a n a s sele-
tivas b i o l o g i c a m e n t e i m p o r t a n t e s . Estas são permeáveis à água e
essencialmente a todas as moléculas pequenas e íons, mas não a
grandes moléculas protéicas. A s diferenças nas concentrações de
moléculas o s m o t i c a m e n t e ativas que não atravessam u m a m e m -
brana i n d u z e m aquelas capazes de se m o v e r a estabelecei u m
e q u i l í b r i o o s m ó t i c o . Este m o v i m e n t o de solutos e íons permeá-
veis exerce o que se conhece c o m o pressão osmótica.
A d e t e r m i n a ç ã o das osmolalidades do plasma e da u i i n a é
utilizada para avaliar os d i s t ú r b i o s de eletrólitos e acidobásicos.
A comparação das osmolalidades d o plasma e da u r i n a d e t e r m i n a
a adequação e estado de regulação da água pelos r i n s na deter-
m i n a ç ã o de distúrbios eletrolíticos graves, c o m o pode o c o r r e r n o
diabetes insipidus o u na s í n d r o m e de secreção i n a p r o p r i a d a do
h o i m ô n i o a n t i d i u r é t i c o ( S 1 A D H ) ( C a p í t u l o s 35 e 39). A s p r i n c i -
pais substâncias osrnóticas n o plasma n o r m a l são Na + , Cl", glicose
e uréia; assim a provável osmolalidade d o plasma é calculada a
p a r t i r da equação empírica a seguir:
m O s m / k g = 1,86 (Na + [ m m o l / L ] )
+ glicose [ m m o l / L ]
+ uréia [ m m o l / L ]
+ 9
ou
m O s m / k g = 1,86 (Na+ [ m m o l / L ] )
+ glicose [ m g / d L ] / 1 8
+ uréia N [ m g / d L ] / 2 , 8
+9
O 9 m O s m / k g a d i c i o n a d o à equação acima representa a c o n t r i -
buição de outras substâncias o s m o t i c a m e n t e ativas n o plasma,
c o m o o K \ Ca 2+ e proteínas. A constante 1,86 reflete as c o n t r i -
buições d o N a * e Cl'. O i n t e r v a l o de referência para o osmolali-
dade do plasma é de 275 a 3 0 0 m O s m / k g . A comparação da
o s m o l a l i d a d e mensurada c o m a o s m o l a l i d a d e calculada ajuda a
i d e n t i f i c a r a presença de u m "gap o s m o l a l " , considerado i m p o r -
t a n t e na d e t e r m i n a ç ã o da presença de substâncias osrnóticas exó-
genas. A s comparações das osmolalidades calculada e m e n s u r a d a
t a m b é m são utilizadas para c o n f i r m a r o u descartar a suspeita de
p s e u d o - h i p o n a t r e m i a c o m o resultado do efeito de exclusão d o
eletrólito previamente discutido.
E m adição ao a u m e n t o da pressão o s m ó t i c a q u a n d o o s o l u t o
é a d i c i o n a d o ao solvente, a pressdo de vapor da solução diminui e
torna-se m e n o r que a do solvente p u r o . C o m o resultado da
m u d a n ç a n a pressão de vapor, o ponto de ebulição da solução
aumenta e torna-se m a i o r que o do solvente p u r o , e o ponto de
congelamento da solução d i m i n u i e torna-se m e n o r que o do sol-
vente p u r o .
Propriedades Coligativas
E m q u í m i c a , as propriedades coligativas são os fatores q u e deter-
m i n a m c o m o as propriedades de u m a solução l í q u i d a são altera-
das d e p e n d e n d o da concentração do soluto na solução. N o labo-
r a t ó r i o c l í n i c o , as propriedades coligativas das soluções consideradas
são: (1) pressão osmótica aumentada, (2) pressão de v a p o r d i m i -
n u í d a , (3) p o n t o de ebulição a u m e n t a d o e (4) p o n t o de congela-
m e n t o d i m i n u í d o . Todos eles são d i r e t a m e n t e relacionados ao
n ú m e r o total de partículas de soluto p o r massa de solvente. Por
CAPÍTULO 24 451
exemplo, u m a solução aquosa 1 m o l a l ferve a u m a t e m p e r a t u r a
0 , 5 2 ° C mais alta e congela a u m a temperatura 1,858°C mais baixa
que a água pura. A pressão osmótica da mesma solução está
aumentada de zero a 17.000 m m H g (22,4 atmosferas). O t e r m o
osmolãlidãde expressa as concentrações relativas à massa d o sol-
vente (solução 1 osmolal é d e f i n i d a p o r conter 1 o s m o l / k g H 2 0 ) ,
e n q u a n t o o t e r m o osmolaridade expressa concentrações p o r v o l u m e
de solução (solução 1 osmolar é d e f i n i d a p o r conter 1 o s m o l / L
solução). A osmolalidade ( o s m o l / k g H z O ) é a expressão t e r m o d i -
n a m i c a m e n t e mais exata p o r q u e as concentrações das soluções
expressas c o m base n o peso são independentes da temperatura,
e n q u a n t o aquelas baseadas n o v o l u m e irão variar c o m a tempera-
tura. E m b o r a o t e r m o " o s m o l a r i d a d e " seja f r e q ü e n t e m e n t e utili-
zado na literatura médica, os laboratórios clínicos m e n s u r a m a
osmolalidade, que é t i m t e r m o mais i n f o r m a t i v o .
U m e l e t r ó l i t o em solução dissocia-se em duas (no caso do
N a C l ) o u três (no caso d o C a C l ; ) partículas, e, p o r t a n t o , os
efeitos coligativos destas soluções são m u l t i p l i c a d o s pelo n ú m e r o
de íons dissociados f o r m a d o s p o r molécula. C o n t u d o , várias
soluções não se c o m p o r t a m de f o r m a ideal, e u m a solução 1
m o l a l p o d e apresentar u m a pressão osmótica m e n o r que a teori-
camente esperada p o r causa da dissociação i n c o m p l e t a dos ele-
trólitos e associação entre as moléculas de s o l u t o e solvente. O
coeficiente da atividade o s m ó t i c a é u m fator usado para corrigir
o desvio d o c o m p o r t a m e n t o " i d e a l " d o sistema:
O s m o l a l i d a d e = o s m o l / k g H 2 0 = (jmC
onde
(|) = coeficiente o s m ó t i c o
n = n ú m e r o de partículas na q u a l cada m o l é c u l a na solução
p o t e n c i a l m e n t e se dissocia
C = m o l a l i d a d e em m o l / k g H ^ O
A glicose e o e t a n o l apresentam coeficientes osmóticos de 1,00,
e n q u a n t o o t[) para o cloreto de sódio é 0,93 nas concentrações
encontradas n o soro - p o r isso, a derivação de 1,86 x Na* ( m m o l )
na f ó r m u l a para calcular a o s m o l a l i d a d e plasmática. A osmolali-
dade t o t a l ou pressão osmótica de u m a solução é igual à soma
das pressões osrnóticas o u osmolalidades de todas as espécies de
solutos presentes. O s eletrólitos Na + , Cl* e H C 0 3 * , presentes em
concentrações relativamente altas, são os maiores c o n t r i b u i n t e s
para a osmolalidade do soro. Substâncias não eletrólitos, c o m o
a glicose e a uréia, que n o r m a l m e n t e estão presentes em baixas
concentrações m o l a l , c o n t r i b u e m menos. A s proteínas séricas
c o n t r i b u e m c o m menos de 0 , 5 % da osmolalidade t o t a l do soro
p o r q u e m e s m o a p r o t e í n a mais a b u n d a n t e está presente e m con-
centrações m i l i m o l a r .
Teoricamente, q u a l q u e r u m a das q u a t r o propriedades coliga-
tivas (pressão de vapor, p o n t o de ebulição, p o n t o de congela-
m e n t o o u pressão osmótica) p o d e ser utilizada c o m o base para
mensuração da osmolalidade. N o e n t a n t o , a depressão do p o n t o
de congelamento é mais c o m u m e n t e usada nos l a b o r a t ó r i o s clí-
nicos p o r ser mais simples.
Mensuração da Osmolalidade
Os i n s t r u m e n t o s utilizados para mensurar a o s m o l a l i d a d e
i n c l u e m o o s m ô m e t r o de depressão do p o n t o de c o n g e l a m e n t o
e o s m ô m e t r o da pressão de vapor.
Osmômetro de Depressão do Ponto de
Congelamento
Os componentes de u m o s m ô m e t r o de depressão do p o n t o de
congelamento incluem:
452 PARTE IV Analitos
1. U m b a n h o o u b l o c o de resfriamento t e r m o s t a t i c a m e n t e con-
trolado mantido a - 7 ° C .
2. U m m e c a n i s m o de agitação r á p i d a para i n i c i a r ("semear") o
c o n g e l a m e n t o da amostra.
3. U m a s o n d a t e r m i s t o r conectada a u m c i r c u i t o para mensurar
a t e m p e r a t u r a da amostra. ( O t e r m i s t o r é u m a esfera de v i d r o
ligado a u m t r o n c o de m e t a l cuja resistência varia rapida-
m e n t e e previsivelmente c o m a temperatura.)
4. U m de d i o d o emissor de luz ( L E D ) q u e i n d i c a o curso
de t e m p o da curva de c o n g e l a m e n t o e o resultado f i n a l .
Para mensurar a osmolalidade, p r i m e i r a m e n t e a t e m p e r a t u r a
da amostra é d i m i n u í d a n o b a n h o e, c o m agitação branda, é
super-resfriada a u m a t e m p e r a t u r a vários graus abaixo d o seu
p o n t o de c o n g e l a m e n t o ( - 7 ° C ) . Q u a n d o o de L E D i n d i c a
que ocorreu super-resfriamento suficiente, a amostra é elevada a
u m p o n t o acima do l í q u i d o n o b a n h o de resfriamento e o agita-
d o r é alterado de u m a velocidade b r a n d a de agitação para u m a
a m p l i t u d e vigorosa m o m e n t a n e a m e n t e , o que i n i c i a o congela-
m e n t o da solução super-resfriada. Este congelamento é apenas
até o estágio de c o n g e l a m e n t o parcial, c o m cerca de 2 % a 3 % d o
solvente solidificado. O calor l i b e r a d o da fusão i n i c i a l m e n t e
aquece a solução, e então a temperatura atinge u m plarô e per-
manece estacionária, i n d i c a n d o a temperatura de e q u i l í b r i o na
q u a l está o c o r r e n d o o c o n g e l a m e n t o e d e r r e t i m e n t o da solução.
N o f i n a l d o p l a t ô da t e m p e r a t u r a de e q u i l í b r i o , o galvanômetro
n o v a m e n t e i n d i c a a d i m i n u i ç ã o da t e m p e r a t u r a à m e d i d a que a
amostra congela mais para se t o r n a r c o m p l e t a m e n t e sólida.
U m exemplo do cálculo para se obter a o s m o l a l i d a d e é: se o
p o n t o de c o n g e l a m e n t o observado for -0,53 D C, então
m o s m o l / k g H 2 0 - -0,53/-1,8 6 x 1.000 = 285
o n d e -1,86°C é a depressão do p o n t o de c o n g e l a m e n t o 1 m o l a l
da água pura.
Osmâmetro da Pressão de Vapor
O o s m â m e t r o da pressão de vapor é o u t r o t i p o de o s m â m e t r o .
A mensuração da o s m o l a l i d a d e nesses i n s t r u m e n t o s , n o e n t a n t o ,
não está d i r e t a m e n t e relacionada à m u d a n ç a na pressão do vapor
(em m i l í m e t r o s de m e r c ú r i o ) , mas à d i m i n u i ç ã o da temperatura
da ponto de condensação do solvente p u r o (água) causada pela
d i m i n u i ç ã o na pressão de vapor do solvente pelos solutos.
U m a diferença clínica i m p o r t a n t e entre a técnica de pressão
de vapor e o o s m ô m e t r o de depressão do p o n t o de congelamento
é a falha d o p r i m e i r o e m i n c l u i r qualquer soluto v o l á t i l presente
n o soro na sua mensuração da osmolalidade total. Substâncias
c o m o o etanol, m e t a n o l e i s o p r o p a n o l são voláteis e, p o r t a n t o ,
escapam da solução e a u m e n t a m a pressão de vapor em vez de
d i m i n u i r a pressão de vapor do solvente (água). Portanto, os
osmômetros de pressão de vapor não são empregados na identifi-
cação de gap o s m o l a l nos distúrbios acidobásicos ( C a p í t u l o 35).
GASES SANGUÍNEOS E pH
O t r a t a m e n t o c l í n i c o de distúrbios metabólicos e respiratórios
depende da mensuração r á p i d a e precisa d o oxigênio e d i ó x i d o
de c a r b o n o n o sangue. M e d i d a s ativas para m a n t e r a vida em
pacientes c o m d a n o c a r d i o p u l m o n a r d e p e n d e m a m p l a m e n t e da
ventilação assistida u t i l i z a n d o misturas de gases que são adapta-
das em resposta aos resultados laboratoriais de ácido-base e gases
sanguíneos. A determinação dos gases sanguíneos t a m b é m exerce
u m a parte i m p o r t a n t e na detecção n o desbalanço ácido-base e
m o n i t o r a ç ã o da terapia. Detalhes da patofisiologia dos gases san-
guíneos em relação aos distúrbios acidobásicos e respiratórios são
discutidos e m detalhes n o C a p í t u l o 35.
A n o m e n c l a t u r a relativa nesta área de análise f o i d e f i n i d a
pelo C L S I * , algumas delas estão resumidas n o Q u a d r o 24-1.
Comportamento dos Gases
A determinação das pressões dos gases n o ar expirado o u sangue
depende da aplicação de certos p r i n c í p i o s físicos ( Q u a d r o 24-1).
A pressão p a r c i a l de u m gás dissolvido n o sangue é, p o r d e f i n i -
ção, igual à pressão parcial d o gás em u m a fase gasosa ideal
i m a g i n á r i a e m e q u i l í b r i o c o m o sangue. E m e q u i l í b r i o , a pressão
parcial (tensão) de u m gás é a mesma nos eritrócitos e plasma,
então a pressão parcial de u m gás é a mesma em t o d o o sangue
e plasma. A pressão parcial de u m gás em u m a m i s t u r a gasosa é
d e f i n i d a c o m o a fração da substância d o gás (fração m o l a r ) vezes
a pressão total.
E n t r e os vários espaços o n d e os gases estão presentes estão:
(1) sala o n d e o e q u i p a m e n t o está instalado, (2) árvore b r o n q u i a l
e alvéolos do paciente e (3) câmara de mensuração d o equipa-
m e n t o laboratorial. E m todos estes espaços, a pressão prevalente
é a pressão atmosférica (barométrica), P(Amb). Todavia, a pressão
parcial de cada u m dos gases presentes nestes espaços deve aumen-
tar o valor da P(Amb), que irá variar c o m a altitude e pressão
barométrica. A convenção científica reduz as mensurações dos
volumes gasosos feitas à P(Amb) à temperatura (0°C o u 273,16 K )
e pressão (760 m m H g o u 101,325 kPa) padrões para os gases secos
( S T P D ) para tornar os dados experimentais transferíveis. N a
prática, entretanto, as mensurações da pressão parcial são sempre
feitas à temperatura c o r p o r a l (geralmente 37°C), à P(Amb) e na
presença de vapor d'água saturado ( P H 2 0 = 47 m m Hg). A utili-
zação desta convenção BTPS (padrão de temperatura e pressão
corporais) ( Q u a d r o 24-1) apresenta os seguintes efeitos práticos:
1. I n d i c a que os dados laboratoriais para os gases sanguíneos
são estritamente relacionados à localização geográfica d o
paciente, então os intervalos de referência tornam-se depen-
dentes da altitude.
2. Assume que a t e m p e r a t u r a corporal-padrão é de 3 7 ° C e que
o aparelho de mensuração t a m b é m m a n t é m a amostra de
sangue exatamente a 37°C. Esta suposição requer cuidados
especiais c o m a estabilidade térmica do aparelho e e m situa-
ções e m que a t e m p e r a t u r a d o paciente não é 3 7 ° C c o m o na
h i p o t e r m i a imposta. 1 5
3. Reconhece que as pressões parciais dos gases mensuradas no
sangue coexistçm c o m a pressão de vapor saturado (SVP)
constante e padrão, que é i d ê n t i c a para as condições de cali-
bração d o i n s t r u m e n t o e condições de mensuração da amostra
de sangue.
As leis de Boyle e Charles e a hipótese de A v o g a d r o são
combinadas na c h a m a d a equação geral dos gases:
p _(nRT)
V
onde
P = pressão e m u n i d a d e s de m i l í m e t r o s de m e r c ú r i o ( m m H g )
o u quilopascal (kPa)
V - v o l u m e em litros no q u a l u m gás ideal está c o n t i d o ,
T = temperatura e m graus K e l v i n ( 0 ° C = 273,16 K),
n = n ú m e r o de moles d o gás
R = constante do gás
A u n i d a d e do SI de P é o pascal (Pa). N o entanto, o emprego
de m i l í m e t r o s de m e r c ú r i o ( t a m b é m c o n h e c i d o c o m o torr) conti-
n u a sendo p o p u l a r (ver Q u a d r o 24-1 para os fatores de conversão).
 Eletrólitos e Gases Sanguíneos CAPÍTULO 24 453

Q U A D R O 24-1 Fatores de Conversão, Prefixos, S í m b o l o s e TABELA 2 4 - 3 Princípio s Físicos Aplicados às Mensuraçoes

Descritores Utilizados nas Discussões de de Gases Sanguíneos
M e n s u r a ç ã o de Gases no Sangue e no Ar
Expirado L e i d e B o y l e : 0 volume de um gás ideal a uma V oc 1/P
temperatura constante é inversamente proporcional
à sua pressão.
FATORES DE CONVERSÃO
Lei de C h a r l e s ( G a y - L u s s a c ) : Q volume de um V ccT
1 mm Hg = 0,133 kPa
gás ideal a pressão constante é diretamente proporcional
1 kPa = 7,5 mm Hg
à sua temperatura absoluta.
kPa: 1 quilopascal = 1.000 pascal. 0 pascal é a unidade derivada do SI de
Hipótese de Avogadro: Volumes iguais de gases Ni/Vi = nj/Vj
pressão; é igual a 1 Newton/m2.
ideais diferentes à mesma temperatura e pressão
PREFIXOS GERAIS contêm o mesmo número de moléculas.
P. pressão parcial ou tensão L e i d e D a l t o n : A pressão total exercida por uma mistura P- ÜPi
Use: P0„ PC Os,ffl20 de gases ideais é a soma das pressões parciais de cada
Alternativa: p0 2 um dos gases na mistura.
Si fração de saturação L e i d e H e n r y : A quantidade de gás solúvel C= a x P
Uso: S0a moderadamente dissolvido em um líquido é proporcional
Alternativa: s02 à pressão parcial do gás sobre o líquido.
c. concentração da substância
Uso: ct02 para a concentração total de 0 2
Uso: ctC02 para a concentração total de C02
Uso: ctHCOg para a concentração de bicarhonato P ( A m b ) = P O , + P C 0 2 + PN 2 + P H z O + PX
d: gás dissolvido, utilizado com a concentração da substância (cj
t: total, utilizado com a concentração da substância (c), portanto ctC02 = HC03~ o n d e PX é a pressão de qualquer o u t r o gás na amostra de ar. A
+ cdC03 lei de D a l t o n não se aplica aos gases em soluções. Isto é, a soma
Origem da amostra é indicada por letras minúsculas. Sangue total e plasma das pressões parciais de todos os gases dissolvidos p o d e ser m e n o r ,
são distinguidos por letras maiúsculas.
igual o u m a i o r que a pressão da solução mensurada. Por exemplo,
a: arterial B: sangue
se a soma das tensões dos gases é significativamente m a i o r que a
v: venoso P: plasma
c: capilar
pressão da solução, pode ocorrer a formação de bolhas, c o m o
Uso: POz (aB), para a pressão parcial de 0 2 no sangue arterial acontece n o sangue de mergulhadores e m e r g i n d o de locais pro-
f u n d o s (gerando u m a condição conhecida c o m o "doença des-
PREFIXOS ASSOCIADOS À RESPIRAÇÃO EXTERNA cornpressiva") o u na amostra de sangue resfriada sendo aquecida
V. volume de ar au sangue (unidade, litro) para análise. A lei de D a l t o n para as pressões parciais c o n t i n u a
V: taxa de volume {unidade, L/min) i m p o r t a n t e , de qualquer m o d o , para a calibração e c o n t r o l e dos
F. fração da substância, também chamada de fração molar aparelhos de mensuração.
e: ar expirado C o n s i d e r e u m calibrador de gás certificado c o n t e n d o 15%
i: ar inspirado de 0 2 ( L / L o u m o l / m o l ) e 5 % de CO?, e o restante de N 2 . Esta
a: ar alveolar mistura, após a saturação c o m vapor d'água a 3 7 ° C (para m i m e -
Uso: l/(a) significa ventilação alveolar; e l/(b), débito cardíaco; A32(i), fração de tizar o sangue o u ar alveolar d o paciente), é i n t r o d u z i d a na
0 2 no ar inspirado; FG2(a), pressão parcial de 0 2 no ar alveolar; e PC02{e),
câmata de mensuração de gases sanguíneos ( m a n t i d o a 3 7 ° C para
pressão parcial de C02 no ar expirado.
mimetizar a temperatura c o r p o r a l do paciente) c o m o p r o p ó s i t o
de calibrar o i n s t r u m e n t o para mensuraçoes subseqüentes de
OUTROS DESCRITORES
gases nas amostras dos pacientes. Se a pressão b a r o m é t r i c a local,
BTPS: Temperatura corporal (37°C ou 310,16 K) e ftessão ambiente
P ( A m b ) , nesta ocasião é de 747 m m Hg, então o gás calibrador
completamente Saturada (fH 3 0 - 47 mm Hg ou 6,25 kPa)
STPS: CbndiçÕes Afarmais de Temperatura (0QC ou 273,16 K) e ttessao (760 u m i d i f i c a d o está presente na câmara e m pressão ambiente, baro-
mm Hg ou 101,08 kPa) de gás Seco. métrica, c o m o a seguir
Amb: atmosfera ambiente (unidade é atm, atmosfera)
B: barométrica (atmosférica) P ( A m b ) = 747 m m H g = P 0 2 + P C 0 2 + P N 2 + P H 2 0
BTPS: Uso: ^amb), P[Amb)
SVP: Pressão de Lfcpor Saturado, a pressão de vapor da água. SVPT significa Para ajustar o i n s t r u m e n t o à P 0 2 e P C 0 2 do gás calibrador,
SVP em uma temperatura específica, p. ex., SVP37=C = 47 mm Hg; TH20 a P ( A m b ) deve ser ajustada a 47 m m H g , a P H 2 0 a 37°C. Por-
(saturado)
tanto
ATPS: Temperatura e /Cessão Anbientes aturadas com vapor d'água.

P ( A m b ) - P H 2 0 = P 0 2 + P C 0 2 + PNz
= 747 - 47 = 700 m m H g

A P ( A m b ) corrigida para PHnO representa a soma das pres-

A utilização das unidades do SI apresenta u m a vantagem prática
sões parciais para os gases secos cujas frações molares são conhe-
e m que 1 a t m é quase igual a 100 kPa (1 a t m = 101,325 kPa). As
cidas. Os valores exatos de P 0 2 e P C 0 2 para a calibração dos
pressões parciais expressas em quilopascais são, p o r t a n t o , estima-
i n s t r u m e n t o s são
das de f o r m a m u i t o aproximada às porcentagens dos gases na
mistura a 1 atm. A pressão, P (ou p)j p o d e significar a pressão P 0 2 = 700 x 0,15 = 105 m m H g
total, c o m o na expressão P(Amb) para a mistura de gases n o ar P C 0 2 = 700 x 0,05 = 35 m m H g
ambiente, o u a pressão parcial n o sangue, c o m o a P 0 2 (aB).
A lei de Dalton (Tabela 24-3) pode ser d e t e r m i n a d a para o ar
A lei de pressão parcial t a m b é m é aplicada em misturas de
ambiente como
gases definidas utilizadas para d e t e r m i n a r P 0 2 (0,5) o u P50 e o u t i a
454 PARTE IV Analitos

quantidades derivadas e c o n t r o l a a i n s t r u m e n t a ç ã o c o m amostras p H (= - l o g cH + ) e p K J (= - l o g K 1 ). O p H é d e f i n i d o c o m o o l o g

submetidas à t o n o m e t r i a . (Amostras de sangue submetidas à negativo da atividade de H * (flH + ), que é a entidade verdadeira-
t o n o m e t r i a apresentam P 0 2 e P C 0 2 ajustadas a pressões d e f i n i - m e n t e mensurada pelos p H m e t r o s . A equação H e n d e r s o n - H a s -
das pela exposição da amostra de sangue a u m a m i s t u r a de gás selbalch tornou-se
de composição precisamente conhecida.)
A lei de Henry prediz a q u a n t i d a d e de gás dissolvido e m u m cH c o ;
p H = p K ' + log
l í q u i d o em c o n t a t o c o m a fase gasosa (Tabela 24-3). ( a x PCO,)
O coeficiente de s o l u b i l i d a d e d o 0 2 no sangue a 3 7 ° C ( a 0 2 )
é 0,00140 ( m o l / L ) / m m H g . P o r t a n t o , q u a n d o a P 0 2 arterial é
ou
n o r m a l (100 m m Hg), a concentração de O2 dissolvido n o sangue
arterial, c d 0 2 , é 0,140 m m o l / L , o que é u m a p r o p o r ç ã o m u i t o
[ctC02 - ( a x PC02)]
pequena de c o n t e ú d o c t 0 2 n o sangue ( - 9 m m o l / L ) ; a m a i o r p H = p K ' + log
parte deste O? está ligado à h e m o g l o b i n a . O a u m e n t o da fração (cc x P C O , )
de 0 2 d o ar i n s p i r a d o para 1 0 0 % o u o a u m e n t o da pressão do
ar inspirado, c o m o na câmara hiperbárica, força mais 0 2 para fC é a constante de dissociação total (combinada) aparente para
d e n t r o da solução. A previsão das concentrações de c d 0 2 nestas o ácido carbônico. Deve-se n o t a r que K ' não depende somente da
terapias é ú t i l p o r q u e a oxigenação t e c i d u a l p o r 0 2 dissolvido temperatura, mas t a m b é m da forca iônica da solução.
torna-se progressivamente i m p o r t a n t e q u a n d o a d i s t r i b u i ç ã o de Para o sangue a 3 7 ° C , o v a l o r m é d i o n o r m a l é pJC'(P) = 6,103
O i mediada pela h e m o g l o b i n a está prejudicada. O c d 0 2 é calcu- e o coeficiente de s o l u b i l i d a d e para o gás C O i , a , é 0 , 0 3 0 6 m m o l
lado da mesma f o r m a : a C 0 2 a 3 7 ° C no plasma = 0,0306 m m o l / x L 1 x m m Hg' 1 .
L / m m H g . A s s i m , à P C 0 2 de 4 0 0 m m H g , o c d 0 2 = 4 0 X 0 , 0 3 0 6 I n s e r i n d o p K 1 e a para o plasma n o r m a l a 3 7 ° C , a equação
~ 1,224 m m o l / L . Henderson-Hasselbalch assume a seguinte f o r m a :

A p l i c a ç ã o da Equação Henderson- cHCo;

p H = 6,103 + log
Hasselbalch nas M e n s u r a ç õ e s de Gases (0,0306 x PC O , )
Sanguíneos
O d i ó x i d o de c a r b o n o e a água reagem para f o r m a r ácido carbô-
ou
n i c o , que p o r sua vez se dissocia em íons h i d r o g ê n i o e H C O / :

a C O ( 0 0 3 0 6 x F C
pH=6,103 + l o g ' - ' ° ^
hidrfltoçio asociaçào
,© (0,0306 x P C 0 2 )
co2 + h2q H 3 CO 3 HCO?

Assim, as concentrações totais de (1) C 0 2 ( c t C 0 2 ) , (2) bicar-
b o n a t o c H C C V , (3) C Ò 2 dissolvido ( c t l C 0 2 ) e (4) í o n H + (cH 4 )
são inter-relacionadas, A constante K para a reação de hidratação
é 2,29 X 10"3 (píC = 2,64 a 37°C). iC para a dissociação d o ácido
c a r b ô n i c o é 2,04 x 10"4 ( p K = 3,69).
H e n d e r s o n c o m h i n o u as duas reações acima e i n c o r p o r o u a
constante K' c o m u m valor de 4,68 x 10 7 , e assim u m p í C de
6,33 a 37°C:
cHC0
K'=,H*x > 40
cdCO,
A concentração d o C 0 2 dissolvido incíui a pequena quanti-
dade de ácido c a r b ô n i c o não dissociado (dissolvido). Isto é
expresso c o m o c d C 0 2 = a X P C 0 2 , o n d e a é o coeficiente de
s o l u b i l i d a d e para o C 0 2 . O t e r m o c H C 0 3 " representa c t C 0 2
menos c d C O í , o que i n c l u i o ácido c a r b ô n i c o . A concentração
de " b i c a r b o n a t o " p o r esta d e f i n i ç ã o i n c l u i b i c a r b o n a t o de sódio
2
não dissociado, c a r b o n a t o (CO3 *) e carbamato ( c a r b a m i n o - C 0 2 ;
R C N H C O O ' ) , q u e estão presentes em pequenas quantidades
excedentes n o plasma.
Se a equação de H e n d e r s o n é rearranjada e c d C 0 2 é t r o c a d o
p o r tx x PCO-7, resulta a equação seguinte:
PC O,
cH+ =K'xax
cH C O ,
E m 1916, Hasselbalch m o s t r o u q u e a transformação logarítmica
da equação possuía u m a f o r m a mais ú t i l e u t i l i z o u os s í m b o l o s
o n d e P C 0 2 é m e n s u r a d o e m m i l í m e t r o s de m e r c ú r i o e c H C O ^ ' e
c t C 0 2 são mensurados em m i l i m o l e s p o r l i t r o . T e n d o o antilo-
g a r i t m o , c o m b i n a n d o as constantes e expressando [ H " ] e m n m o l /
L, a equação torna-se
PCO,
cH+ = 2 4 , l x
cHCo;
Se os valores norm'ais são substituídos na equação,
c H + - 24, l x — — n m o l / L = 38 j O n m o l / L
25,4
Assim, pela mensuração de quaisquer dois dos q u a t r o parâ-
metros, P C 0 2 o u c d C 0 2 ) p H , c t C O i o u c H C O ^ " e u t i l i z a n d o a
equação c o m os valores acima para p K 1 e a , os outros dois parâ-
metros p o d e m ser calculados. U m a v a n t a g e m deste v a l o r cal-
culado é q u e este reflete essencialmente a atividade de H C 0 3 ' na
fase aquosa d o plasma. A s s i m , o m e s m o não é afetado pelos efeitos
de exclusão de eletrólitos, c o m o p o d e ocorrer c o m outras men-
surações indiretas de H C 0 3 " .
Oxigênio no Sangue
O c o n t e ú d o total de O i , c t 0 2 , de u m a amostra de sangue é a soma
das concentrações de 0 2 ligado à h e m o g l o b i n a e O i dissolvido.
E m u m c t 0 2 de 9 m m o l / L , o c d O i é aproximadamente 0,14
m m o l / L , e o restante de 0 2 é associado à h e m o g l o b i n a como a
oxiemoglobma (02Hb). O 0 2 H b é definido como a hemoglobina
nos eritrócitos c o m 0 2 ligado reversivelmente ao Fe2" d o grupa-
m e n t o heme. Cada m o l de hemoglobina-Fe^ liga u m m o l de 0 2 .
 Eletrólitos e Gases Sanguíneos
U m g de h e m o g l o b i n a é capaz de ligar 1,39 m L ( 0 , 0 6 2 m m o L )
de O 2 . Este valor refere-se à capacidade específica da hemoglo-
b i n a A ( H b A , o p r o d u c o gêmeo do a d u l t o n o r m a l ) de hgar-se ao
0 2 , q u e liga reversivelmente o 0 2 ao seu g r u p a m e n t o heme. A
m e t e m o g l o b i n a ( M e t H b ) , c a r b o x i e m o g l o b m a ( C O H b ) , sulfemo-
g l o b i n a ( S u l f H b ) e ci ano m e t e m o g l o b i n a são formas da h e m o g l o -
b i n a q u e n ã o são capazes de ligação reversível ao 0 2 p o r causa
das alterações químicas n o g r u p a m e n t o h e m e ( C a p í t u l o 28).
Estas h e m o g l o b i n a s q u i m i c a m e n t e alteradas são coletivamente
chamadas de dísemoglobinas. As h e m o g l o b i n a s c o m modificações
geneticamente determinadas e m suas seqüências de a m i n o á c i d o s
que a k e t a m a ligação de O2 são coletivamente chamadas de
variantes da h e m o g l o b i n a o u h e m o g l o b i n o p a t i a s . M a i s de 9 0 0
h e m o g l o b i n o p a t i a s f o r a m descritas ( h t t p : / / g l o b i n . c s e psu.edu),
sendo u m exemplo a h e m o g l o b i n a de célula f a l c i f o r m e (HbS).
A r e t i r a d a de 0 2 pelo sangue nos p u l m õ e s é p r i m a r i a m e n t e
governada pela PG 2 d o at alveolar e pela capacidade do 0 2 de se
d i f u n d i r l i v r e m e n t e da m e m b r a n a alveolar para o sangue. M a i s
de 9 5 % da h e m o g l o b i n a irão se ligar ao 0 2 à PO? n o r m a l m e n t e
presente n o ar alveolar (~ 102 m m H g ) e c o m m e m b r a n a e hemo-
g l o b i n a A n o r m a i s . E m u m a P 0 2 > 1 1 0 m m Hg, m a i s de 9 8 %
de h e m o g l o b i n a A n o r m a l se ligar ao 0 2 . Q u a n d o toda hemo-
g l o b i n a está saturada c o m 0 ? ., u m a u m e n t o a d i c i o n a l na P 0 2 d o
ar alveolar a u m e n t a apenas a concentração de c d 0 2 n o sangue
arterial. A d i s t r i b u i ç ã o de 0 2 p e l o sangue para os tecidos é gover-
nada p e l o grande gradiente entre PO? do sangue a r t e r i a l e aquela
das células teciduais, e pela dissociação cie 0 2 H b n o s eritrócitos
em u m a P 0 2 m e n o r na interface sangue-célula tecidual.
Três propriedades do sangue arterial são essenciais para
garantir a d i s t r i b u i ç ã o adequada de 0 2 para os tecidos:
1. A P 0 2 arterial deve ser s u f i c i e n t e m e n t e alta ( - 9 0 m m H g )
p a r a criar u m gradiente de difusão d o sangue a r t e r i a l para as
células teciduais. A baixa P 0 2 arterial ( h i p o x e m i a ) resulta em
h i p o x i a t e c i d u a l (falta de 0 2 ) .
2. A capacidade de ligação de O2 d o sangue deve ser n o r m a l . A
d i m i n u i ç ã o na concentração de H b p o d e causar a c o n h e c i d a
h i p o x i a anêmica.
3. A h e m o g l o b i n a deve ser capaz de ligar 0 2 nos p u l m õ e s e
liberá-lo nos tecidos (a a f i n i d a d e da h e m o g l o b i n a pelo 0 2
deve ser n o r m a l ) . U m a a f i n i d a d e m u i t o grande da hemoglo-
b i n a pelo 0 2 p o d e causar h i p o x i a tecidual "baseada na afini-
d a d e " e m que o 0 2 não é libera cio na interface capilar-tecido
(ver adiante). A PO? na extremidade venosa dos capilares deve
ser de a p r o x i m a d a m e n t e 38 m m H g , e, p o r t a n t o , a diferença
arteriovenosa n o r m a l na P 0 2 é de 5 0 a 60 m m H g .
Saturação de Oxigênio da Hemoglobina
A n t e s de d i s c u t i r os fatores q u e afetam a afinidade d a H b pelo
0 2 , é i m p o r t a n t e d e f i n i r o c o n c e i t o de saturação de o x i g ê n i o da
hemoglobina (S02):
C o n t e ú d o de o x i g ê n i o
so2 =
Capacidade d o o x i g ê n i o
Esta é a fração (porcentagem) de h e m o g l o b i n a f u n c i o n a l que é
saturada c o m o x i g ê n i o e é essencialmente u m a f o r m a i n d i r e t a de
estimar a P 0 2 . N o e n t a n t o , existem pelos m e n o s crês abordagens
diferentes para d e t e r m i n a r a "saturação" do oxigênio, e e m b o r a
cada u m a seja distinta, elas são f r e q ü e n t e m e n t e utilizadas ínter-
cambiavelmente para d e t e r m i n a r a "saturação d o o x i g ê n i o " . Estes
termos: (1) saturação de o x i g ê n i o da h e m o g l o b i n a ( S 0 2 ) , (2)
o x i e m o g l o b m a fracionada ( F 0 2 H b ) e (3) saturação cio oxigênio
estimada ( 0 2 S a t ) apresentam definições distintas estabelecidas
pelo C L S I (C46-A). f i A utilização ambígua destes três termos
CAPÍTULO 24 455
decorre do f a t o de que os valores destes parâmetros são m u i t o
semelhantes e m i n d i v í d u o s saudáveis c o m quantidades n o r m a i s
de h e m o g l o b i n a n o r m a l . N o e n t a n t o , as suposições feitas para
i n d i v í d u o s n o r m a i s e saudáveis geram conclusões errôneas e m
pacientes seriamente doentes e naqueles c o m dísemoglobinas o u
variantes de h e m o g l o b i n a q u a n d o estes valores são utilizados
p e r m u tavelmente.
Os m é t o d o s de espectrofotornetria são utilizados para deter-
m i n a r 0 ? H b e h e m o g l o b i n a reduzida ( H H b ) c o m S 0 2 calculado
de acordo c o m
cO,Hb
S02 -
(cO,Hb+cHHb)
onde c 0 2 H b é a concentração de oxiemoglobina, c H H b é a con-
centração de cieoxiemoglobina, e a soma de o x i e m o g l o b i n a e deo-
x i e m o g l o b i n a representa t o d a a h e m o g l o b i n a capaz de ligar 0 2
reversivelmente. A S 0 2 geralmente é expressa em porcentagem.
A S 0 2 é f r e q ü e n t e m e n t e d e t e r m i n a d a p o r o x i m e t r i a de pulso.
Esta é u m a técnica não invasiva e m q u e u m sensor é colocado
e m u m a p a r t e r e l a t i v a m e n t e f i n a da a n a t o m i a d o paciente, geral-
m e n t e na p o n t a dos dedos o u n o l ó b u l o da orelha o u , em casos
de neonatos, n o pé. Luz v e r m e l h a e i n f r a v e r m e l h a é d i r e c i o n a d a
através d o tecido, e a absorvancia cia luz t r a n s m i t i d a é mensu-
rada. A o x i m e t r i a de pulso mede 0 2 H b e H H b , mas não C O H b ,
M e t H b o u S u l f H b . Estes dispositivos m e d e m absorvâncias a 6 6 0
e 9 4 0 n m para as quais 0 2 H b e H H b apresentam padrões ú n i c o s
de absorvância. Estes m o n i t o r e s geralmente são utilizados ao lado
do paciente acamado para m o n i t o r a r a saturação de 0 2 H b . N o
e n t a n t o , o uso de S 0 2 na avaliação i n i c i a l de u m paciente c o m
dísemoglobinas o u outras h e m o g l o b i n a s anormais gera interpre-
tações erradas. Por e x e m p l o , em u m paciente comatoso c o m 1 5 %
de C O H b , a S 0 2 pela o x i m e t r i a de pulso simples p o d e ser de
0,95, e n q u a n t o a fração de 0 2 H b pode ser na realidade de apenas
0,80. P o r t a n t o , deve-se d e t e r m i n a r a presença de dísemoglobinas
antes de utilizar S 0 2 c o m propósitos clínicos. O i n t e r v a l o de
referência para S 0 2 em adultos saudáveis é de 9 4 % a 9 8 % .
O u t r a expressão para "saturação" de oxigênio é F O ? H b , que
é calculada da seguinte f o r m a :
c 0 ; H b
F O , H b =
ctHb
o n d e a concentração da h e m o g l o b i n a t o t a l c t H b é igual a soma
de 0 2 H b , H H b , C O H b , M e t H b e S u l f H b . Este valor requer a
determinação de todas as espécies de h e m o g l o b i n a e geralmente
é realizado em u m co-oxí m e t r o . Estes i n s t r u m e n t o s são espectro-
f o t ô m e t r o s que d e t e r m i n a m a q u a n t i d a d e t o t a l de h e m o g l o b i n a
e a porcentagem de cada u m a das espécies m e n c i o n a d a s acima
e m u m h e m o l i s a d o de sangue total. C o m isso, a absorvância é
m e n s u r a d a e m 6 a 128 c o m p r i m e n t o s de o n d a fixados entre 535
e 670 n m . A l g u n s co-oxí metros novos u t i l i z a m u m arranjo de
diocio. C a d a espécie de h e m o g l o b i n a apresenta seu p r ó p r i o
p a d r ã o de absorvância, p e r m i t i n d o q u e u m c o m p u t a d o r calcule
a p o r c e n t a g e m de cada u m a . O i n t e r v a l o de referência para
E 0 2 H b é 0,90 a 0,95.
O software utilizado pelos c o m p u t a d o r e s integrados aos ins-
t r u m e n t o s de mensurar gases sanguíneos irá estimar a saturação
d o oxigênio ( S 0 2 ) a p a r t i r d o p H , P 0 2 e h e m o g l o b i n a mensura-
dos c o m a utilização de equações empíricas. Se usado c o m o u m
t o d o , este valor refere-se c l a r a m e n t e à S 0 2 estimada, mas freqüen-
t e m e n t e é r e p o r t a d o c o m o " 0 2 S a t " . Valores calculados c o m o
456 PARTE IV Analitos
u
0 2 S a t " devem ser i n t e r p r e t a d o s c o m cautela p o r q u e esta abor-
dagem algorítmica assume: (1) a f i n i d a d e n o r m a l da h e m o g l o b i n a
pelo O i , (2) concentração de 2,3-difosfoglicerol (2,3-DPG) n o r m a l
e (3) ausência de disemoglobinas. Estas estimativas calculadas
v a r i a m 6 % e m relação aos valores mensurados. Conseqüente-
mente, a utilização dos valores estimados é desencorajada.'
A d i m i n u i ç ã o na F 0 2 H b i n d i c a baixa P 0 2 a r t e r i a l o u prejuízo
da capacidade da h e m o g l o b i n a de ligar-se ao 0 2 . A d i m i n u i ç ã o
na P 0 2 i n d i c a u m a capacidade reduzida do 0 2 de difundir-se do
ar alveolar para o sangue. Isto é decorrente de h i p o v e n t i l a ç ã o o u
desvio v e n o a r t e r i a l a u m e n t a d o , que é secundário à insuficiência
cardíaca o u p u l m o n a r . A h e m o g l o b i n a t o t a l baixa é considerada
c o m o resultante de u m a d i m i n u i ç ã o n o n ú m e r o de eritrócitos
c o n t e n d o concentrações n o r m a i s de h e m o g l o b i n a (anemia nor-
m o c r ô m i c a ) o u u m a d i m i n u i ç ã o na concentração m é d i a de
h e m o g l o b i n a nos eritrócitos (anemia h i p o c r ô m i c a ) . A d i m i n u i -
ção de F 0 2 H b t a m b é m ocorre c o m o resultado de intoxicações
que c o n v e r t e m parte da h e m o g l o b i n a nas espécies C O H b ,
M e t H b , S u l f H b o u c i a n o m e t e m o g l o b i n a que não irão ligar 0 2
o u fazer trocas gasosas de f o i m a apropriada. C l i n i c a m e n t e , é
i m p o r t a n t e d i s t i n g u i r : (1) h i p o x e m i a arterial ( P 0 2 a r t e r i a l d i m i -
n u í d a e d i m i n u i ç ã o em S 0 2 o u F 0 2 H b p o r causa da m e n o r
d i s p o n i b i l i d a d e de 0 2 ) e (2) cianose ( d i m i n u i ç ã o de F 0 2 H b p o r
causa de altas concentrações anormais de h e m o g l o b i n a Teduzida
o u h e m o g l o b i n a q u i m i c a m e n t e alterada incapaz de carrear o 0 2 ) .
E i m p o r t a n t e n o t a r que, n o i n í c i o da cianose, a mensuração de
S O i o u S 0 2 estimada ( u 0 2 Sat T 1 ) p o d e ser n o r m a l se a cianose é
decorrente da presença de M e t H b o u C O H b .
A concentração de oxigênio n o sangue ( c t 0 2 ) é a soma de 0 2
ligado à h e m o g l o b i n a e c d 0 2 - Os analisadores de gases sanguí-
neos d e t e r m i n a m c t 0 2 p o r m e i o d o seguinte cálculo:
ct02 ( m L / d L ) = [FO,Hb X b O , x ctHb(g/dL)] + ( a 0 2 x P02)
o n d e b 0 2 é igual a 1,39 m l V g e a , 0 2 , O coeficiente de solubili-
dade de 0 2 a 3 7 ° C , é igual a 0,0031 ( m L / d L ) / m m H g . Este
cálculo é baseado em F 0 2 H b e c t H b . Se for utilizada a S 0 2 l é
necessário usar a concentração de h e m o g l o b i n a efetiva sub-
t r a i n d o a concentração de q u a l q u e r d i s e m o g l o b i n a presente da
concentração d e c t H b . A s s i m , n o exame i n i c i a l de u m paciente,
pode ser necessário obter u m valor preciso de cíOt para ser uti-
lizado nos cálculos subseqüentes.
Dissociação Hemogiobina-Oxigênio
O grau de associação o u dissociação entre o 0 2 e a h e m o g l o b i n a
é d e t e r m i n a d o pela P 0 2 e pela a f i n i d a d e da h e m o g l o b i n a pelo
0 2 . Q u a n d o a S 0 2 d o sangue é d e t e r m i n a d a e m u m i n t e r v a l o de
POT e representada graficamente c o n t r a a P 0 2 ) obtém-se u m a
curva s i g m ó i d e conhecida c o m o c u r v a de dissociação d o oxigê-
n i o . O forniu to da curva resulta da eficiência crescente da molé-
cula H H b de ligar-se ao 0 2 à m e d i d a que mais 0 2 é ligado
( " c o o p e r a t i v i d a d e " ; ver t a m b é m C a p í t u l o 28). A posição da curva
em relação à P 0 2 necessária para atingir u m a concentração par-
ticular de S 0 2 n o sangue é u m a função da a f i n i d a d e da hemo-
g l o b i n a pelo 0 2 .
A a f i n i d a d e da h e m o g l o b i n a pelo 0 2 depende de; (1) tempe-
ratura, (2) p H , (3) P C 0 2 , (4) concentração de 2 , 3 - D P G e (5)
presença de h e m o g l o b i n a s m i n o r i t á r i a s , c o m o C O H b e M e t H b .
A Figura 24-2 ilustra o efeito d o p H plasmático n a curva de
dissociação (efeito B o h r ) . Gráficos semelhantes p o d e m ser feitos
para as variações de P C 0 2 , 2 , 3 - D P G e temperatura.
Determinação da P50
A P i 0 é d e f i n i d a c o m o a P 0 2 para u m a dada amostra de sangue
em que a h e m o g l o b i n a d o sangue está 5 0 % saturada c o m 0 2 . O
Figura 24-2 C u r v a d e dissociação d o oxigênio paTa sangue h u m a n o
c o m p H plasmático diferente, mas PCO2 constante de 4 0 m m H g ,
concentração de 2,3-difosfoglicerol n o s eritrócitos de 5,0 m m o l / L e
t e m p e r a t u r a a 37°C.
valor de P 50 m e n s u r a d o difere d o valor-padrao da P 50 de a c o r d o
c o m a extensão e m que: ( I ) o p H difere de 7,40, (2) a P C 0 2 difere
de 40 m m H g , (3) a T difere de 37°C e (4) a concentração de
2 , 3 - D P G difere de 5,0 m m o l / L P o r t a n t o , o valor de P50 torna-se
u m a m e d i d a da alteração da a f i n i d a d e da h e m o g l o b i n a decor-
rente da i n f l u ê n c i a destes fatores. Q u a n d o o p H é ajustado e m
7,40 e a P C 0 2 e m 4 0 m m Hg, esta P50 " p a d r ã o " é u m a mensu-
ração i n d i r e t a da concentração de 2 , 3 - D P G na ausência de H b
variantes.
Intervalos de Referência
Para adultos, 9 5 % dos limites são de 25 a 29 m m H g para a P50
m e d i d a a 37 U C e p H ( P ) c o r r i g i d o para 7,4. Para os recém-nasci-
dos, o i n t e r v a l o é de 18 a 24 m m H g p o r causa da presença de
H b fetal (HbF).
Importância Clínica'
O s valores a u m e n t a d o s para P50 i n d i c a m deslocamento para a
d i r e i t a da curva de dissociação d o 0 2 , i n d i c a n d o u m a a f i n i d a d e
d i m i n u í d a da h e m o g l o b i n a pelo 0 2 . As p r i n c i p a i s causas são: (1)
h i p e r t e r m i a , (2) acidemia, (3) h i p e r c a p n i a , (4) altas concentra-
ções de 2 , 3 - D P G o u (5) presença de variantes da h e m o g l o b i n a
c o m a f i n i d a d e d i m i n u í d a pelo O?. AS concentrações de 2 , 3 - D P G
t e n d e m a a u m e n t a r na alcalemia crônica, anemia e h i p o x e m i a
crônica. A h e m o g l o b i n a Kansas é u m exemplo de h e m o g l o b i n a
c o m afinidade d i m i n u í d a pelo 0 2 .
Os efeitos fisiológicos da a f i n i d a d e d i m i n u í d a da h e m o g l o -
b i n a são m í n i m o s . E m geral, a a f i n i d a d e ainda é suficiente para
p e r m i t i r que a h e m o g l o b i n a ligue quantidades adequadas de 0 2
nos pulmões. A baixa afinidade facilita a dissociação da 0 2 H b
nas células dos tecidos periféricos. A l é m disso, na anemia, a baixa
a f i n i d a d e (como resultado d o a u m e n t o em 2 , 3 - D P G ) é u m meca-
n i s m o c o m p e n s a t ó r i o desejável. Os pacientes c o m h e m o g l o b i n a
Kansas apresentam P5C de a p r o x i m a d a m e n t e 80 m m H g e baixa
c t H b , mas não são afetados.
Baixos valores para P50 s i g n i f i c a m deslocamento da curva de
dissociação do 0 2 para a esquerda, i n d i c a n d o u m a a f i n i d a d e
a u m e n t a d a da h e m o g l o b i n a . As p r i n c i p a i s causas são: ( I ) h i p o -
t e r m i a , (2) alcalemia aguda, (3) h i p o c a p n i a , (4) baixas concentra-
 Eletrólitos e Gases Sanguíneos
ções de 2 , 3 - D P G , (5) C O H b e M e t H b aumentadas o u (6) u m a
h e m o g l o b i n a variante. A d i m i n u i ç ã o de 2 , 3 - D P G é c o m u m e n t e
observada nos estados acidêmicos p e r s i s t i n d o p o r mais de
algumas horas; o a u m e n t o i n i c i a l na P 50 causado pela acidemia
é gradualmente compensado por uma d i m i n u i ç ã o em 2,3-DPG,
então a P 50 d i m i n u i para u m valor m e n o r q u e o n o r m a l . A con-
seqüência fisiológica da a f i n i d a d e a u m e n t a d a da h e m o g l o b i n a
pelo O? é a dissociação de 0 2 H b menos eficiente nos tecidos
periféricos e m e n o r P 0 2 tecidual.
Tonometria
A t o n o m e t r i a é o processo de exposição de u m l i q u i d o a u m a
fase gasosa e m que cada gás da fase gasosa então se d i s t r i b u i e
atinge u m e q u i l í b r i o entre o l i q u i d o e o gás. Esse e q u i l í b r i o
p a r t i l h a a P C 0 2 e P 0 2 d o gás e m e q u i l í b r i o c o m o sangue, e este
é exposto ao t o n ô m e t r o . O e q u i l í b r i o p o r t o n o m e t r i a u t i l i z a gases
de composição conhecida, u m i d i f i c a d o s a 3 7 ° C para gerar u m a
pressão de v a p o r d'água saturado de 47 m m H g . A P C 0 2 o u P 0 2
destes gases é calculada de acordo c o m a lei de D a l t o n (ver seção
a n t e r i o r , C o m p o r t a m e n t o dos Gases). A t o n o m e t r i a é utilizada
para t r a t a r as amostras de sangue para vários estudos especiais
q u e são r a r a m e n t e requeridos na m a i o r i a dòs hospitais e para
preparar m a t e r i a l de c o n t r o l e de q u a l i d a d e e m t o d o o sangue. A
d e t e r m i n a ç ã o direta da P50 e d o bicarbonato-padrão são duas
aplicações da t o n o m e t r i a . As aplicações de garantia da q u a l i d a d e
i n c l u e m : (1) preparação de amostras de sangue total para o con-
trole de q u a l i d a d e e (2) d e t e r m i n a ç ã o da linearidade dos eletro-
dos P 0 2 e P C 0 2 .
Determinação de PC02, P02 e pH
Os i n s t r u m e n t o s utilizados para d e t e r m i n a r P C 0 2 , P 0 2 e p H são
automatizados. A coleta e o m a n u s e i o apropriados da amostra
são essenciais para a d e t e r m i n a ç ã o precisa.
Amostras
O sangue t o t a l é a amostra escolhida para a análise de gases e
p o d e ser o b t i d o de q u a l q u e r sítio acessível ao cateterismo vascular
o u acessos venosos. Estes sítios c o m u m e n t e são os vasos sanguí-
neos das extremidades, mas estudos especiais p o d e m requerer
acesso às câmaras cardíacas e aos vasos sanguíneos calibrosos d o
tórax. Os analistas devem estar cientes de q u e algumas amostras
são de d i f í c i l obtenção e devem ser m a n i p u l a d a s c o m o m á x i m o
de c u i d a d o . A s diferenças entre os valores mensurados dos gases
sanguíneos arteriais e venosos são mais p r o n u n c i a d a s para a P 0 2 .
N a verdade, a PO z é a ú n i c a razão clínica para a coleta mais d i f í c i l
de sangue arterial. A P 0 7 geralmente é 6 0 a 70 m m H g m e n o r
n o sangue venoso após a liberação de 0 2 nos capilares, e n q u a n t o
a P C O j é 2 a 8 m m H g m a i o r n o sangue venoso. O p H geral-
m e n t e é apenas 0,02 a 0,05 unidades de p H m e n o r na amostra
venosa.
A garantia da q u a l i d a d e das análises sanguíneas para os gases
e p H é d e p e n d e n t e d o c o n t r o l e dos erros pré-analíticos ( C a p í t u l o
3) e d o c o n t r o l e dos i n s t r u m e n t o s analíticos e processamento dos
testes. N e m sempre os profissionais d o l a b o r a t ó r i o c o n t r o l a m a
coleta das amostras arterial e venosa, p o r isso eles devem traba-
l h a r j u n t a m e n t e e de f o r m a cooperativa c o m médicos, enfermei-
ras, terapeutas respiratórios e outros profissionais que o b t ê m
estas amostras.
A p u n ç ã o arterial apresenta u m p e q u e n o risco m é d i c o e n ã o
deve ser realizada p o r pessoas que não f o r a m treinadas para este
f i m . A p u n ç ã o arterial sempre é feita c o m seringa e agulha. O
t o r n i q u e t e n ã o é utilizado, e n e n h u m a tração o u apenas u m a
tração leve é aplicada ao ê m b o l o da seringa à m e d i d a que a
pressão arterial e m p u r r a sangue para d e n t r o da seringa. O pro-
CAPÍTULO 24 457
t o c o l o aprovado pelo C L S I , H - 1 1 A 4 , descreve o p r o c e d i m e n t o
apropriado.7
O sangue venoso para mensurar gases sanguíneos e p H geral-
m e n t e é coletado c o m agulha e seringa, e m b o r a alguns laborató-
rios t a m b é m aceitem a coleta e m t u b o a vácuo c o n t e n d o h e p a r i n a
sódica seca. N a coleta d o sangue venoso de u m a veia d o braço, a
amostra deve ser o b t i d a após a liberação d o t o r n i q u e t e , e n ã o se
deve p e r m i t i r que o paciente f l e x i o n e os dedos o u cerre o p u n h o .
A aplicação p r o l o n g a d a d o t o r n i q u e t e e / o u a atividade muscular
irá d i m i n u i r P 0 2 e p H venosos. Cateteres inseridos c o m p o r t a
para injeção de heparina para terapias endovenosas são utilizados
para coletar amostra após o cateter ser p r e e n c h i d o c o m p l e t a m e n t e
c o m u m jato de sangue (geralmente 5 vezes o v o l u m e d o cateter)
antes da coleta da amostra. A falha em lavar c o m u m jato forte
de sangue a p o r t a para injeção de f o r m a apropriada apresenta
efeitos imprevisíveis nas quantidades mensuradas e freqüente-
m e n t e gera resultados estranhos e não fisiológicos.
A s amostras arteriais o u venosas i d e a l m e n t e são coletadas
anaerobicamente c o m o anticoagulante h e p a r i n a liofilizada e m
seringas estéreis c o m capacidade de 1 a 5 m L . E m b o r a teorica-
m e n t e seja preferível a utilização de seringas de v i d r o para evitar
trocas gasosas através da parede da seringa, a m a i o r i a das seringas
para gases sanguíneos a t u a l m e n t e é de plástico e a troca de gás
que ocorre e m 1 h o r a é insignificante. A h e p a r i n a liofilizada é
preferível à h e p a r i n a l í q u i d a . N o e n t a n t o , (1) o t a m a n h o da
seringa, (2) a concentração e o v o l u m e da h e p a r i n a l í q u i d a e (3)
o v o l u m e de sangue d r e n a d o para d e n t r o da seringa são i m p o r -
tantes q u a n d o se utiliza a h e p a r i n a l í q u i d a . A anticoagulação
adequada ( - 0 , 0 5 m g h e p a r i n a / m L de sangue) é alcançada pela
drenagem de solução de h e p a r i n a l í q u i d a suficiente para d e n t r o
da seringa de f o r m a que.- (1) seja u m e d e c i d a u m a área m á x i m a
da superfície i n t e r n a da seringa e (2) o ar e o excesso de h e p a r i n a
sejam ejetados d e i x a n d o o espaço m o r t o da seringa p r e e n c h i d o
c o m heparina. U m a p r o p o r ç ã o alta entre h e p a r i n a e sangue gera
u m efeito cada vez mais notável na PCO? m e n s u r a d a e nos parâ-
metros calculados a p a r t i r desta PCOT.
O b v i a m e n t e , a amostra coletada sob condições anaeróbicas deve
seT exposta o m í n i m o possível ao ar atmosférico. A P C 0 2 d o ar
seco é a p r o x i m a d a m e n t e 0,25 m m H g e é m e n o r que a d o sangue
( ~ 4 0 m m Hg). E n t ã o o c o n t e ü d o de C 0 2 e P C 0 2 d o sangue
exposto ao ar irá d i m i n u i r e o p H d o sangue, q u e é u m a f u n ç ã o
da P C 0 2 , irá aumentar. A P 0 2 d o ar atmosférico ( - 1 5 0 m m H g )
é a p r o x i m a d a m e n t e 6 0 m m H g m a i o r q u e a d o sangue arterial e
a p r o x i m a d a m e n t e 120 m m H g m a i o r que a d o sangue venoso.
P o r t a n t o , o sangue dos pacientes r e s p i r a n d o o ar a m b i e n t e que
é exposto ao ar atmosférico recebe 0 2 . 1 5 E m contraste, o sangue
c o m P 0 2 excedendo 150 m m H g , c o m o ocorre c o m os pacientes
s u b m e t i d o s à terapia de 0 2 , perde 0 2 ao ser exposto ao ar.
M e s m o q u a n d o a amostra é m a n i p u l a d a c o m c u i d a d o , o sangue
f r e q ü e n t e m e n t e é exposto ao ar presente n a agulha e n o espaço
m o r t o da seringa. O erro será m í n i m o se a b o l h a resultante f o r
ejetada i m e d i a t a m e n t e após a remoção da agulha d o sítio de
p u n ç ã o . O efeito p o t e n c i a l de pequenas bolhas nos resultados de
gases sanguíneos f o i claramente d e m o n s t r a d o e m u m estudo em
que u m a b o l h a de 100 f i L de ar a m b i e n t e f o i adicionada a 10
amostras de 2 m L de sangue c o m valores de P 0 2 entre 25 e 4 0
m m H g . Nestas amostras, a P 0 2 a u m e n t o u 4 m m H g e m m é d i a
e m apenas 2 m i n u t o s , e n q u a n t o a P C 0 2 d i m i n u i u 4 m m Hg. 1 5
O sangue capilar arterializado algumas vezes é aceitável c o m o
alternativa ao sangue arterial: (1) q u a n d o a perda de sangue
precisa ser m i n i m i z a d a , (2) q u a n d o u m a cânula arterial n ã o está
disponível o u (3) para evitar p u n ç ã o arterial repetida. O sangue
cutâneo f l u i n d o l i v r e m e n t e origina-se das arteríolas e apresenta
composição semelhante a d o sangue arterial. Todavia, o sangue
458 PARTE IV Analitos
capitai arterializado não é aceitável: (1) q u a n d o a pressão sanguí-
nea sistólica é m e n o r que 95 m m H g , (2) e m casos de vasocons-
trição, (3) de pacientes sob terapia de 0 2 , (4) de recém-nascidos
d u r a n t e as p r i m e i r a s horas após o n a s c i m e n t o o u (5) de recém-
nascidos c o m a s í n d r o m e do estresse respiratório. Estas situações
p r o p o r c i o n a m u m risco p a r t i c u l a r de misturar sangue capilar
arterializado c o m sangue das vênulas, r e s u l t a n d o em valores
baixos de P O j errôneos. A p u n ç ã o capilar deve ser precedida de
a q u e c i m e n t o d o sítio de p u n ç ã o na pele por 10 m i n u t o s para
alcançar a vasodilatação e f l u x o sanguíneo adequado nos capila-
res locais. O a q u e c i m e n t o p o d e ser feito pela imersão d o braço
o u da perna em água aquecida a 4 5 ° C para a coleta a p a r t i r dos
dedos de u m a criança o u de u m a d u l t o o u d o calcanhar de u m
bebê. A p r i m e i r a gota de sangue deve ser enxugada, e as gotas
formadas subsequentemente devem ser recolhidas e m t u b o de
coleta capilar c o n t e n d o h e p a r i n a liofilizada. A p e n a s o sangue de
f l u x o livre fornece amostra satisfatória, e a coleta das gotas assim
que estas são formadas m i n i m i z a m a exposição aeróbica.
O transporte e a análise das amostras devem ser imediatos.
M é d i c o s que u t i l i z a m as mensurações dos gases sanguíneos e p H
n o m a n e j o d o c u i d a d o c r i t i c o geralmente necessitam q u e o
t e m p o entre a aquisição da amostra e o resultado seja m u i t o
c u r t o . O ideal é q u e as amostras n u n c a sejam estocadas antes da
análise. E n t r e t a n t o , o atraso na análise em até 1 h o r a apresentará
efeitos m í n i m o s nos valores relatados para a m a i o r i a das amos-
tras. O p H do sangue fresco d r e n a d o e guardado d i m i n u i a u m a
taxa de 0 , 0 4 a 0,08 p H U / h a 37°C, 0,02 a 0 , 0 3 / h a 2 2 ° C e
< 0 , 0 1 / h a 4 ° C . A d i m i n u i ç ã o n o p H é acompanhada p o r u m a
d i m i n u i ç ã o c o r r e s p o n d e n t e na glicose e u m a u m e n t o equivalente
n o lactato. A P C O j a u m e n t a - 5 m m H g / h a 3 7 ° C , 1 m m H g / h
a 2 2 ° C e apenas - 0 , 5 m m H g / h a 2 ° C a 4 ° C . A glicólise pelos
leucócitos, plaquetas e reticulócitos é a causa p r i m á r i a destas
O; alio
CO* baixn
w
GasBs
calibradoras
O- baixo
CO. alto w
PH
alto
Tampôas-
pacrSo
PH
baixo
dtti
1 6
LOJ
Sonda de
anostra
Figura 24-3 Esquema de um equipamento de análise de gás sanguíneo. H, dispositivo de um ficaçãOj V, válvula;
C, câmara; B, banho de temperatura constante a 37°C; W, lixo; M, computador; D/P, mostrador/ mpressora. E
(eletrodos) onde Bj é POj, E2 PCOi, E^ pH e E^ Teferência para o pH..
mudanças. E m u m sangue fresco d r e n a d o c o m P O j n o r m a l
m a n t i d o anaerobicamente, a respiração celular acarreta d i m i n u i -
ção na P 0 2 a u m a taxa de - 2 m m H g / h a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e
e 5 a 10 m m H g / h a 37°C. O s efeitos adversos da glicólise e
respiração n o p H , c t C O ^ , PO2 e P C 0 2 do sangue são evitados
q u a n d o a análise é realizada em até 3 0 m i n u t o s após a coleta. Se
a análise precisa ser adiada o u se as circunstâncias c r i a m u m risco
de atraso, a seringa o u o t u b o c o n t e n d o o sangue deve ser imerso
e m u m a m i s t u r a de gelo e água até ser possível realizar a análise.
Sob estas condições, inibe-se a glicólise e as alterações são insig-
nificantes.
As pequenas alterações esperadas nos valores c o m atrasos na
análise são reais apenas q u a n d o a c o n t a g e m de leucócitos ( W B C )
é n o r m a l o u levemente elevada. A glicólise, e os efeitos resultan-
tes n o p H , POT e P C 0 2 , a u m e n t a d r a m a t i c a m e n t e c o m a elevação
acentuada na c o n t a g e m de leucócitos, c o m o ocorre na leucemia
q u a n d o a P 0 2 d i m i n u i r a p i d a m e n t e em vários minutos. 1 4 A ú n i c a
alternativa para o b t e r valores precisos dos gases sanguíneos destes
pacientes é realizar a análise imediata u t i l i z a n d o dispositivos de
teste r á p i d o o u levando o analisador de gases sanguíneos até o
paciente.
Instrumentação
U m esquema característico de u m i n s t r u m e n t o típico é m o s t r a d o
na Figura 24-3. Os p r i n c í p i o s e l e t r o q u í m i c o s e aspectos estrutu-
rais dos eletrodos são discutidos n o C a p í t u l o 5. Desenvolvimen-
tos recentes na i n s t r u m e n t a ç ã o i n c l u e m " p e r f i l de u r g ê n c i a " ,
e q u i p a m e n t o s para testes rápidos o u para serem utilizados ao
lado d o paciente. V á r i a s empresas a t u a l m e n t e p r o d u z e m instru-
mentos: (1) pequenas, (2) portáteis, (3) a u t ô n o m o s e (4) fáceis de
setem operados, projetados para operações "satélites ao laborató-
M
bomba
\
T5
J-AJV
w
 Eletrólitos e Gases Sanguíneos
r i o " e alguns e q u i p a m e n t o s de uso m a n u a l que u t i l i z a m eletrodos
descartáveis.
A operação dos analisadores de gases sanguíneos tradicionais
começa c o m o o p e r a d o r e x p o n d o u m a amostra de sangue à
sonda de amostra. U m c o m a n d o através do teclado retira u m a
amostra do sangue através da sonda p o r m e i o da b o m b a peristál-
tica q u e preenche a câmara c o m 6 0 a 150 p,L de amostra do
fluido. A b o m b a está sob o c o n t r o l e d o c o m p u t a d o r e pára após
a admissão da amostra, p e r m i t i n d o que a amostra f i q u e na
câmara para e q u i l í b r i o t é r m i c o e a mensuração seja completada.
A p ó s o t é r m i n o da mensuração, a b o m b a e m p u r r a a amostra para
o lixo, e n q u a n t o o resultado é d i s p o n i b i l i z a d o em u m m o s t r a d o r ,
em u m papel impresso e f r e q ü e n t e m e n t e em u m sistema de
i n f o r m a ç ã o do l a b o r a t ó r i o através de u m a interface.
Calibração
A m a i o r i a dos i n s t r u m e n t o s f o r a m ptojetados para autocalibra-
ção. Sob o c o m a n d o do c o m p u t a d o r , gases calibradores e tampões
são circulados em curtos intervalos através da câmara e respostas
eletrônicas são c o n t i n u a m e n t e m o n i t o r a d a s e restauradas às suas
constantes iniciais para P C 0 2 e P 0 2 altas e baixas e p H alto e
baixo dos materiais calibradores. N o s Estados U n i d o s , os regula-
mentos escritos para os C l i n i c a i L a b o r a t o r y I m p r o v e m e n t A m e n -
d m e n t s de 1988 ( C L 1 A '88) estabelecem u m p o n t o de calibração
a cada 3 0 m i n u t o s o u d e n t r o de 30 m i n u t o s de toda amostra de
paciente e dois p o n t o s de calibração a cada 8 horas.
E necessária a calibração f r e q ü e n t e dos eletrodos para p H ,
P C 0 2 e P 0 2 p o r q u e os eletrodos não são estáveis p o r longos
períodos de t e m p o . O sistema de mensuração do p H é calibrado
p r i m a r i a m e n t e c o n t r a tampões-padrão colocados m a n u a l o u
a u t o m a t i c a m e n t e d e n t r o da câmara de amostra. Os tampões são
soluções fosfato que devem satisfazer as especificações do N a t i o -
n a l Inscitute o f Standards a n d Technology ( N I S T / h t t p : / / w w w .
n i s t . g o v / ) . Os tampões de calibração que satisfazem as especifica-
ções do N I S T são disponibilizados pelos fabricantes d o equipa-
m e n t o , geralmente em recipientes de t a m a n h o e f o r m a t o apro-
priados para encaixe c o m o u m reservatório n o e q u i p a m e n t o . Os
valores do p H dos tampões calibradores alto e baixo são estabe-
lecidos pelo fabricante, mas t i p i c a m e n t e encontram-se entre 6,8
e 7,4 a 3 7 ° C .
PC02 e P02
Gases de composição 0 2 e C O 2 conhecida são utilizados para
calibrar os analisadores de gases. Gases c o m p r i m i d o s , c o m u m
certificado de análise f o r n e c i d o pelo fabricante, f r e q ü e n t e m e n t e
são utilizados c o m o padrões p r i m á r i o s . A m i s t u r a " b a i x o gás"
para calibração geralmente apresenta composição f r a c i o n a d a de
5 % de C O j , 0 % de 0 2 e 9 5 % de N 2 . A m i s t u r a " a l t o gás" apre-
senta composição f r a c i o n a d a de 10% de C 0 2 , 2 0 % de 0 2 e 7 0 %
de N i . Estas composições c o r r e s p o n d e m a p r o x i m a d a m e n t e a u m
i n t e r v a l o de calibração de 38 a 76 m m H g para P C O z e 0 a 150
m m H g para P 0 2 .
O m o d o da calibração é d e t e r m i n a d o pelo m o d e l o d o equi-
p a m e n t o . A m a i o r i a dos e q u i p a m e n t o s c o n t é m u m b a r ó m e t r o
o u u m t r a n s d u t o r responsivo a P ( A m b ) de f o r m a que a pressão
b a r o m é t r i c a sempre é conhecida. C o m estes equipamentos, é
necessário apenas registrar n o teclado a composição das frações
de O z e C 0 2 nas misturas de baixo e alto gases calibradores.
A t u a l m e n t e , a m a i o r i a dos analisadores se autocalibra sem a
necessidade de interferência d o usuário. A l g u n s sistemas ainda
apresentam "pacotes" descartáveis de gases calibradores que são
colocados d e n t r o dos analisadores. O c o m p u t a d o r calcula os
valores para P O j e P C 0 2 (de acordo c o m a lei de D a l t o n ) para
os gases saturados c o m vapor d'água a 37°C.
CAPÍTULO 24 459
Diferença Líquido-Gás de um Eletrodo P02
U m a p r o p r i e d a d e p a r t i c u l a r do eletrodo P 0 2 deve ser considerada
q u a n d o se calibra u m analisador de gás sanguíneo c o m u m gás.
Esta p r o p r i e d a d e é conhecida c o m o diferença sangue-gás ou líquido-
gás. Os eletrodos P 0 2 e P C 0 2 são semelhantes na difusão do gás
de u m a amostra l í q u i d a o u gasosa, passando através de u m a
m e m b r a n a permeável a gás, para u m a solução eletrolítica em
contato c o m os elementos de mensuração e referência. E m ambos
os eletrodos, a taxa de difusão de u m gás através das membranas
é m e n o r a p a r t i r de u m a fase l í q u i d a que a p a r t i r de u m a fase
gasosa. N o entanto, os eletrodos P C 0 2 e P 0 2 u t i l i z a m princípios
diferentes de mensuração ( C a p i t u l o 5). C o m o o 0 2 , ao atravessar
a m e m b r a n a do eletrodo P 0 2 i entra em u m a reação irreversível
no cátodo polarizado, a corrente gerada pela reação é p r o p o r c i o -
n a l à quantidade de 0 2 reduzido. A q u a n t i d a d e de 0 2 disponível
para c o n s u m o depende da taxa de difusão do 0 2 através da m e m -
brana U m estado de e q u i l í b r i o é alcançado q u a n d o a taxa de
difusão é igual à taxa de redução. Portanto, o eletrodo responde
em m e l h o r grau ao 0 2 d i f u n d i n d o de u m a fase gasosa que de u m a
fase l í q u i d a . A diferença líquido-gás para o eletrodo P 0 2 torna-se
significante q u a n d o u m eletrodo é calibrado c o m gás, mas é uti-
lizada para mensurar P 0 2 do sangue. A diferença geralmente é
expressa c o m o a razão entre a P 0 2 (amostra gasosa) e a P 0 2
(amostra líquida). Para a m a i o r i a dos eletrodos, a razão é c o m u -
m e n t e de 1,02 a 1,06. Para a r o t i n a clínica, f r e q ü e n t e m e n t e se
assume u m a razão de 1,04 e m vez de determiná-la.
Garantia de Qualidade
Os elementos de garantia da qualidade ( Q A ) e controle da quali-
dade ( Q C ) das mensuraçoes do p H e gases sanguíneos incluem: (1)
manutenção apropriada dos equipamentos, (2) utilização de mate-
riais de controle e (3) precisão na temperatura de mensuração.
Manutenção da Instrumentação
A determinação confiável e precisa do p H e de gases sanguíneos
necessita de m a n u t e n ç ã o meticulosa. Programas de software, dos
c o m p u t a d o r e s dos e q u i p a m e n t o s f r e q ü e n t e m e n t e f o r n e c e m n o t i -
ficações e rotinas de diagnósticos que alertam o o p e r a d o r e asses-
soram n o processo de solução dos problemas. A freqüência da
m a n u t e n ç ã o depende do n ú m e r o de análises realizado n o labo-
r a t ó r i o . A freqüência sugerida p e l o fabricante deve ser conside-
rada c o m o m í n i m a , sendo q u e a experiência i n d i c a r á a freqüên-
cia da m a n u t e n ç ã o .
A limpeza da câmara de amostra e dos canais é especialmente
i m p o r t a n t e . A m a i o r i a dos i n s t r u m e n t o s c o m eletrodos perma-
nentes apresenta u m dispositivo q u e a u t o m a t i c a m e n t e lava c o m
u m jato forte a câmara de amostra e os canais após cada mensu-
ração de u m a amostra sanguínea. A lavagem m a n u a l deve ser feita
q u a n d o r e c o m e n d a d a pelo fabricante. Pode ocorrer o e n t u p i -
m e n t o parcial o u c o m p l e t o da câmara e / o u dos canais m e s m o
q u a n d o a lavagem é feita de f o r m a correta. A freqüência de
e n t u p i m e n t o s geralmente está relacionada ao n ú m e r o de amos-
tras de sangue capilar h e p a r i n i z a d o analisadas. Fios de f i b r i n a e
pequenos coágulos p o d e m estar presentes na amostra o u p o d e m
ser f o r m a d o s e n q u a n t o a amostra permanece n a câmara de aque-
cimento.
A assistência imediata e confiável do fabricante o u de u m enge-
n h e i r o b i o m é d i c o i n t e r n o é essencial para que o laboratório realize
várias análises diariamente. T a m b é m é i m p o r t a n t e que o fabricante
o u o almoxarifado d o laboratório t e n h a m disponíveis materiais
auxiliares como: (1) materiais de calibração (tampões para p H e
gases de qualidade certificada), (2) membranas para substituição e
(3) pequenas peças para manutenção dos eletrodos.
460 PARTE IV Analitos
Testes de p r o f i c i ê n c i a estabelecidos pela l e i federal nos
Estados U n i d o s ( C L 1 A '88) a d m i t i r a m nova i m p o r t â n c i a para o
c o n t r o l e de q u a l i d a d e n a análise de gases sanguíneos. Estas regras
tornaram-se efetivas em j a n e i r o de 1991 e estabeleceram critérios
para o d e s e m p e n h o i n t e r l a b o r a t o r i a l satisfatório c o m o : (1) p H ,
valor estipulado + 0,04; (2) P O í , valor estipulado ± 3 D P e (3)
P C 0 2 , valor estipulado ± 8 % o u + 5 m m Hg, o que for maior.
V á r i o s analisadores novos apresentam " a u t o Q C " o u u t i l i z a m
" Q C e l e t r ô n i c o " . O a u t o Q C consiste em u m m a t e r i a l Q C on
baard (na placa de c i r c u i t o ) que é a u t o m a t i c a m e n t e analisado pelo
e q u i p a m e n t o e m intervalos d e t e r m i n a d o s q u e p r e e n c h e m os
r e q u e r i m e n t o s reguladores. O Q C eletrônico é mais c o m u m e m
e q u i p a m e n t o s c o m cartuchos de eletrodos descartáveis e consiste
em cartuchos q u e v e r i f i c a m a especificação eletrônica dos instru-
mentos. Estes sistemas de Q C e l e t r ô n i c o devem fornecer u m
resultado q u a n t i t a t i v o , em vez de getai resultados qualitativos
c o m o " O K " o u "não O K " , para serem aceitáveis para a m a i o r i a
das agências reguladoras. Para discussão a d i c i o n a l deste tema, ver
testes rápidos n o C a p í t u l o 12.
Materiais de Controle
Os materiais de c o n t r o l e de qualidade v a r i a m de f l u i d o s comer-
ciais c o m base e m sangue a f l u i d o s aquosos. A l t e r n a t i v a m e n t e ,
tampôes-padrão independentes t ê m sido usados para c o n t r o l e do
p H e sangue t o t a l s u b m e t i d o à t o n o m e t r i a para c o n t r o l e P C 0 2
e POj.
Materiais de Controle com Base em Sangue e com Base e m
Fluorocarbono
M a t e r i a l de c o n t r o l e comercial c o m base e m sangue t i p i c a m e n t e
consiste e m e r i t r ó c i t o s h u m a n o s usados e m teste de h e m a g l u t i -
nação (tflnned) suspensos e m u m a solução t a m p ã o e selados em
recipientes c o m u m a m i s t u r a gasosa c o m c o n t e ú d o s de O? e C O j
conhecidos. M a t e r i a i s de f l u o r o c a r b o n o não-sanguineos c o m
p r o p r i e d a d e carreadora de O2 semelhante àquela d o sangue
t a m b é m estão disponíveis. Estes p r o d u t o s geralmente são feitos
em três concentrações de: (1) p H , (2) P C 0 2 e (3) PO?. Q u a n d o
lacrados, estes tipos de m a t e r i a l de c o n t r o l e apresentam a vanta-
gem de t e m p o de validade extenso na geladeira: 20 a 28 dias para
os eritrócitos usados em teste de h e m a g l u t i n a ç ã o e u m t e m p o
m a i o r para os outros.
Materiais de Controle Fluidos Aquosos
O s materiais de c o n t r o l e f l u i d o s aquosos disponíveis consistem
e m m e i o t a m p o n a d o selado em recipientes c o m misturas gasosas.
O f l u i d o é e q u i l i b r a d o c o m o gás p o r m e i o de agitação vigorosa
m a n u a l p o r u m p e r í o d o de t e m p o prescrito i m e d i a t a m e n t e antes
de o operador abrir o recipiente e colocar o f l u i d o n o instru-
m e n t o . A desvantagem dos controles aquosos é a falta de seme-
lhança c o m o sangue. Viscosidade e tensão s u p e r f i c i a l baixas
conferem diferentes características à lavagem e p r e j u d i c a m a capa-
cidade de r e f l e t i r coagulação. A m a i o r c o n d u t i v i d a d e elétrica
d i m i n u i a sua eficiência na detecção de superfície inadequada, e
os coeficientes t é r m i c o s mais baixos os t o r n a m lentos na detecção
de falhas n o c o n t r o l e da temperatura. Estas desvantagens são
mais evidentes em relação a P 0 2 . E m alguns laboratórios, con-
troles s u b m e t i d o s à t o n o m e t r i a são utilizados j u n t a m e n t e c o m os
controles comerciais, mas isso está se t o r n a n d o raro c o m o resul-
tado da c o n f i a b i l i d a d e e da facilidade de uso dos analisadores de
gases sanguíneos m o d e r n o s .
Sangue total Submetido à Tonometria
A utilização de sangue s u b m e t i d o à t o n o m e t r i a para c o n t r o l e de
qualidade de P 0 2 e P C 0 2 é considerada o m é t o d o preferencial
p o r ser o m a t e r i a l de c o n t r o l e que mais se a p r o x i m a das amostras
dos pacientes na suas interações c o m os eletrodos para gases.
A i n d a , este material é mais sensível à deterioração das m e m b r a -
nas permeáveis a gases dos eletrodos q u e os controles f l u i d o s
aquosos. A s desvantagens substanciais são: (1) o t e m p o necessário
para a t o n o m e t r i a , p a r t i c u l a r m e n t e se f o r e m desejáveis duas o u
três concentrações d o c o n t r o l e ; (2) dificuldades para se o b t e r e m
amostras de sangue frescas e n o r m a i s ; (3) necessidade de cálculos
repetidos (e risco de erro de cálculo) de P C O i e P 0 2 dos gases
de e q u i l í b r i o ; (4) necessidade de m a n t e r misturas especiais de
gases e (5) i n a p l i c a b i l i d a d e n o c o n t r o l e da mensuração d o p H .
Controle da Temperatura e Correção
A t e m p e r a t u r a exata de 3 7 ° C é essencial para a mensuração
acurada do p H e gases sanguíneos, a i n s t r u m e n t a ç ã o estado-da-
arte é f o r n e c i d a c o m sensores térmicos encaixados n o aquecedor
que c i r c u n d a a câmara de mensuração e se c o m u n i c a m c o m o
c o m p u t a d o r . A l a r m e s audíveis o u visíveis sinalizam o desvio da
t e m p e r a t u r a além da tolerância estabelecida (geralmente 37 ±
0,1°C). T a m b é m são utilizados tampões sensíveis â temperatura,
c o m o o H E P E S (ácido N-[2-hidroxietil|-piperazina-N'-2-etanossul-
f ô n i c o ) o u T E S (ácido N - t r i s l h i d r o x i m e t i l ] m e t i l - 2 - a m i n o e t a n o s -
s u l f õ n i c o ) , nos p r o c e d i m e n t o s de garantia de qualidade do p H .
N a equação de Henderson-Hasselbalch, p K 1 e a são utilizados
c o m o constantes para a t e m p e r a t u r a a 3 7 ° C . A câmara de amostra,
c o m t e m p e r a t u r a c o n t r o l a d a , de u m i n s t r u m e n t o apresenta 37 ±
0 , l a C , e é nesta t e m p e r a t u r a que são realizadas todas as mensu-
rações de p H e pressão parcial dos gases. A t e m p e r a t u r a c o r p o r a l
de u m paciente f e b r i l p o d e estar elevada, 4 0 C C a 4 1 ° C , o u u m
paciente p o d e estar h i p o t é r m i c o para u m a cirurgia de revascula-
rização c a r d i o p u l m o n a r e apresentar temperatura de 2 3 ° C . A
m a i o r i a dos i n s t r u m e n t o s de gases sanguíneos, após o Tegistro no
teclado da t e m p e r a t u r a real d o paciente, irá calcular e apresentar
o p H e P C 0 2 corrigidos de acordo c o m a t e m p e r a t u r a e calcular
os valores derivados dos dados p r i m á r i o s corrigidos de acordo
c o m a temperatura.
A correção do p H e P C 0 2 de acordo c o m a t e m p e r a t u r a real
do paciente geralmente é o m i t i d a em estados de h i p e r t e r m i a . A
m a g n i t u d e da correção para 4 0 ° C (104°F) seria de + 0,045 para
o p H e + 13% para a P C 0 2 . Existem discordâncias c o m relação
aos estados hipotérmicos. 1 9 U m a p o l í t i c a p r u d e n t e para o labora-
t ó r i o é gerar e relatar resultados corrigidos de acordo c o m a
t e m p e r a t u r a para o pH
e PCOT apenas q u a n d o h o u v e r requeri-
m e n t o específico do m é d i c o . A l é m disso, c o m o recomendação
do C L S I (C46-A) É , os resultados corrigidos de acordo c o m a
t e m p e r a t u r a n u n c a devem seT relatados sem os resultados origi-
nais m e d i d o s a 37 Q C.
Intervalos de Referência
Os intervalos de referência para P O i , S O i , PCO-j e p H d o sangue
arterial estão listados n o C a p í t u l o 45. A P 0 3 d o sangue arterial,
baixa ao nascimento, a u m e n t a para u m a concentração n o a d u l t o
de 83 a 108 m m H g . A fração de saturação, S 0 2 (aB), p o d e ser
tão baixa q u a n t o 0 , 4 0 ao nascimento, mas depois sobe para 0,95
a 0,98. A F 0 2 é 0 , 9 0 a 0,95 e m adultos saudáveis. A P 50 corrigida
para o p H 7,40 é 18 a 24 m m H g para os recém-nascidos e 24 a
29 m m H g para os adultos. Os intervalos de referência para
P C 0 2 d o sangue arterial, n o nível do mar, das crianças é u m
p o u c o m e n o r em relação aos adultos. O i n t e r v a l o de referência
para os adultos é de 35 a 45 m m H g . Os valores d i m i n u e m c o m
a a l t i t u d e acima d o nível do m a r na taxa de 3 m m H g / k m (5 m m
H g / m i l h a ) . D u r a n t e a gravidez, a P C 0 2 cai g r a d u a l m e n t e para
u m a m é d i a de 28 m m H g i m e d i a t a m e n t e antes d o paTto.
 Eletrólitos e Gases Sanguíneos
O p H d o sangue arterial nas primeiras horas de v i d a pode
variar n o intervalo de 7,09 a 7,50, mas depois varia entre 7,35 e
7,45.
Monitoramento Contínuo e Não Invasivo d o s
Gases Sanguíneos
C o m o descrito anteriormente, os oxímetros de pulso são dispo-
sitivos não invasivos que m o n i t o r a m S O j H b . Os oxímetros de
pulso antigos eram suscetíveis a erros dependendo da colocação
e movimentação, mas novas tecnologias tornaram estes dispositi-
vos m u i t o confiáveis.
A monitoração transcutânea de P C 0 2 e PO2 apresenta u m
valor particular e sucesso geral n o cuidado neonatal e pediátrico. 3
Estes dispositivos consistem em u m eletrodo adesivo envolto por
gel que aquece a pele de 4 3 ° C a 4 4 ° C para arterializar os capila-
res e facilitar a difusão do O2 através da pele. Embora os eletrodos
sejam consideravelmente diferentes na aparência daqueles utili-
zados nos instrumentos analisadores de gases sanguíneos, eles
operam exatamente com o mesmo p r i n c í p i o eletroquimico. A
monitoração transcutânea de PO? varia amplamente dependendo
se o lado da aplicação reflete o f l u x o sanguíneo arterial, capilar
o u venoso. Todavia, existe pouca diferença entre a P C O j arterial
e venosa; p o r isso, o m o n i t o r a m e n t o transcutâneo da P C 0 2 é
menos problemático, e os oxímetros de pulso freqüentemente são
utilizados c o m o u m substituto para a P 0 2 . 3 N o entanto, é reco-
mendado que os valores arteriais de base sejam obtidos antes de
iniciar o m o n i t o r a m e n t o não invasivo.
A l é m do m o n i t o r a m e n t o de P 0 2 e P C 0 2 , estão disponíveis
dispositivos que t a m b é m m o n i t o r a m p H , eletrólitos e hemató-
crito. U m deles é de uso ú n i c o , com cartucho alinhado consis-
t i n d o em seis eletrodos convencionais. 2 O cartucho é anexado a
uma l i n h a arterial e, c o m o comando do operador, drena " 1 , 5
m L de sangue para dentro do cartucho o n d e acontece a análise.
A análise d u r a cerca de 60 segundos, e depois deste t e m p o o
sangue retorna pela l i n h a arterial. Os cartuchos são submetidos
à calibração de dois pontos antes de serem utilizados, e u m p o n t o
de calibração é usado para lavar os sensores após cada análise.
R E F E R Ê N C I A S
1. A p p l e FS, Koch D D , Graves S, Ladenson JH. Relationship between
direct-potentiometric and flame-photometiic measurement of s o d i u m in
blood. C l i n C h e m 1982,28:1931-5.
2 B i l l m a n GF, Hughes A B , D u d a l l G G , W a l d m a n E, Adcock L M , H a l l
D M , et al C l i n i c a i performance of an in-line, ex-vivo point-of-care
m o n i t o r A multicenter study. C l i n C h e m 2002;48 2030-43
3 Binder N , A t h e r t o n H , ThorkeLsson T, H o a t h SB Measurement of
transcuraneous carbon dioxide i n low birthweight infanta d u t i n g the
first two weeks o f l i f e . A m ] Perinatol 1994; 11 237-41
CAPÍTULO 24 461
4 C l i n i c a i and Laboratory Standards I n s t i t u t e / N C C L S . Standardization of
sodium and potassium ion-selective electrode systems to thc flame
phoromecric reference method; A p p r o v e d Guideline, 2nd ed. C L S I /
N C C L S D o c u m e n t C29-A2. Wayne, FA: Clinicai and Laboratory
Standards Institute, 2000.
5 C l i n i c a i and Laboratory Standards I n s t i t u t e / N C C L S . Sweat testing:
Sample collection and quantitative analysis; A p p r o v e d Guideline, 2 n d
ed. C L S I / N C C L S D o c u m e n t C34-A2. Wayne, PA: C l i n i c a i and
Laboratory Standards Institute, 2000.
6. C l i n i c a i and Laboratory Standards I n s t i t u r e / N C C L S . B l o o d gas and p H
analysis and related measurements. A p p r o v e d Guideline. C L S I / N C C L S
D o c u m e n t C46-A. Wayne, PA: C l i n i c a i and Laboratory Standards
Institute, 2001.
7- Clinicai and Laboratory Standards I n s t i t u t e / N C C L S . Procedures for the
collection of arterial b l o o d specimens; A p p r o v e d Guideline, 4 t h ed.
C L S I / N C C L S D o c u m e n t H11-A4. Wayne, PA: C l i n i c a i and Laboratory
Standards Institute, 2004-
8. Creer M H , Ladenson J. Analytical errors due to lipidemia. Lab M e d
1983,14.351-5.
9, Cystic Fibrosis Foundation Center Committee: Sweat testing guidclines.
Bethesda, M D . Cystic Fibrosis F o u n d a t i o n { h t t p : / / w w w . c f f org), 2005.
10. D o n BR, Sebastian A , C h e i t l i n M , Christiansen M , Schambelan M
Pseudohyperkalemia caused by fist clenchíng d u r i n g phlebotomy. N Engl
J M e d 1990;322:1290-2.
11. Eng W , LeGrys V A , Schechter M , Laughton M , Parker P M Sweat testing
in preterm and f u l l t e r m infants less than 6 weeks of age. Pediatr
P u l m o n o l 2005;40:64-7-
12 Farrell PM, Lai HJ, L i Z, Kosorok M R , Lavoza A , Green C G , et al.
Evidence o n improved outcomes w i t h early diagnosis of cystic fibrosis
through neonatal screening. enough is enough. J Pediatr 2005; 147:
S30-S36
13. H a m m o n d KB, Turcios N L , G i b s o n LE C l i n i c a i evaluation of the
macroduct sweat collection system and conductivity analyzer i n the
diagnosis o f cystic fibrosis. J Pediatr 1994;124:255-60.
14. Hess CE, Nichols AB, H u n t W B , Suratt PM. Pseudohypoxemia
secondary to leukemia and thrombocytosis. Kl Engl J M e d 1979;301.
361-3.
15. Mueller RG, Lang G E Blood gas analysis: effects o f air bubbles in
syririge and delay i n estimation. Br M e d J C l i n Res 1982;285:1659.
16. Nijsten M W N , deSmet BJ, D o f f e r h o f f A S M . Pseudohyperkalemia and
platelet counts. 1SI Engl J M e d 1991 -,325:1107.
17. Parad RB, Comeau A M , D o r k i n H , Dovey M , Gerstle R, M a r t i n T,
et al. Sweat testing infants decected by cystic fibrosis n c w b o i n screening.
J Pediatr 2005;147:S69-S72
18. Rosenstein BJ, C u t t i n g GR. T h e diagnosis of cystic fibrosis: A consensus
statement. ] Pediatr 1998;132:589-95.
19. Tallman R. Acid-base regulation, alpha-stat, and the E m p e r o r s new
cio th es. J Cardiothorac Vasc A n e s t h 1997;11:282-8.
20. Watson M A , Scott M G . C l i n i c a i u t i l i t y of biochemical analysis o f
cerebrospinal f l u i d . C l i n C h e m 1995;41:343-60
CAPÍTULO 2 5

Hormônios**
Michael Kleerekoper, M.D., F.A.C.B., M.A.C.E.

OBJETIVOS P a r á c r i n o : U m t i p o de função h o r m o n a l na qual o h o i m ô n i o

1. Deíinir os seguintes termos: sintetizado dentro de u m t i p o de célula e liberado por ela
Endocrinologia se liga a receptores h o r m o n a i s em células vizinhas, de t i p o
Hormônio esferoidal diferente, e afeta suas funções.
Receptor: U m a estrutura molecular, dentro de u m a célula ou
Hormônio peptídico
na sua superfície, caracterizada por (1) ligação seletiva de
Hormônio derivado de aminoácido
substâncias específicas e (2) efeito fisiológico específico que
Adeno-hipófise
acompanha a ligação; os exemplos são receptores na
Neuro-hipóiise
superfície celular para h o r m ô n i o s peptídicos,
Eixo hipotálamo hipófise
neurotransmissores, antígenos, fragmentos de complemento
Receptor hormonal
e i m u n o g l o b u l i n a s e receptores citoplasmáticos para
2. Listar três funções fisiológicas dos hormônios e discutir os h o r m ô n i o s esteroidais.
mecanismos envolvidos na regulação da secreção hormonal. Sistema C r o m a f i m : Células do corpo que se coram c o m sais
3. Discutir o significado de hormônio livre e ligado. de cromo.
4. Especificar os dois tipos de interação hormônio-receptor e o efeito Sistema E n d ó c r i n o : O sistema de glândulas que libera suas
específico que cada tipo produz na célula. secreções (hormônios) diretamente no sistema circulatório.
5. Listar os hormônios sintetizados no hipotálamo e na glândula Em adição ao sistema de glândulas endócrinas, estão
hipófise anterior e descrever suas principais ações fisiológicas. incluídos o sistema c r o m a f i m e o sistema neurossecretor.
6. Listar os hormônios armazenados na glândula hipófise posterior e Sistema H i p o t á l a m o - h i p o f i s á r i o : U m sistema de neurônios,
descrever suas principais ações fisiológicas. fibras, tecido endócrino e vasos sanguíneos responsável pela
7. Listar seis principais causas de desordens endócrinas. produção e liberação dos h o r m ô n i o s hipofisátios dentro da
8. Discutir três técnicas analíticas usadas para medir hormônios nos circulação sistêmica.
fluidos corporais.

PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A d e n o - h i p ó f i s e : L o b o glandular anterior da hipófise.
A u t ó c r i n o : U m m o d o de ação h o r m o n a l n o qual u m
h o r m ô n i o se liga aos receptores na superfície o u dentro da
U m h o r m ô n i o é u m a substância química produzida n o
corpo por u m órgão específico, células de u m órgão o u
células espalhadas que têm u m efeito regulatório especí-
fico na atividade de u m órgão ou órgãos. Eles são produzidos em
u m local n o corpo e exercem sua(s) ação(óes) em locais distantes
célula que o p r o d u z i u e, desse m o d o , afeta a função
através do que é chamado sistema e n d ó c r i n o . Tem havido cres-
daquela célula.
cente reconhecimento de que vários h o r m ô n i o s exercem ações
B i o r r i t m o : Ocorrência cíclica de eventos fisiológicos, como u m
localmente pelo chamado sistema parácrino. O u t r o s h o r m ô n i o s
r i t m o circadiano.
exercem suas ações nas células de origem, regulando sua própria
E n d o c r i n o l o g i a : O estudo científico da função e patologia das
síntese e secreção via sistema a u t ó c r i n o . Os h o r m ô n i o s endócri-
glândulas endócrinas.
nos clássicos i n c l u e m insulina, tiroxina e cortlsol. Neurotransmis-
Horaeostasia: O processo de manter o ambiente i n t e r n o d o
sores e neuro-hormônios são exemplos de sistema parácrino, e
c o r p o estável.
certos fatores de crescimento que estimulam a síntese e secreção
H o r m ô n i o : U m a substância química que tem u m efeito
de h o r m ô n i o s verdadeiros a partir da mesma célula são exemplos
regulatório na atividade de certo(s) órgão(s) o u tipos de
de sistemas autócrinos. A Figura 25-1 mostra a localização de
células.
várias glândulas endócrinas n o corpo, e a Tabela 25-1 resume os
H o r m ô n i o s H i p o t a l â m í c o s : H o r m ô n i o s do h i p o t á l a m o que
tipos de ações hormonais.
exercem controle sobre outros órgãos, principalmente a
glândula hipófise.
Meia-vida: E m endocrinologia, o tempo necessário para a
CLASSIFICAÇÃO
concentração de u m h o r m ô n i o cair ã metade n a circulação
Os h o r m ô n i o s são geralmente classificados como (1) p o l i p e p t í d i o
(sangue) ou em o u t r o f l u i d o corporal específico.
ou proteína, (2) esteróide o u (3) derivados de aminoácidos.

Hormônios Polipeptídicos ou Protéicos

* 0 autor agradecidamente reconhece as contribuições piévías do D r R o n a l d
) W h i t l e y , nas quais se baseiam partes deste capitulo.
+
As Figuras 25*2 a 25-5 publicadas neste capítulo foram reproduzidas, com
permissão, dos Capítulos 1 e 2 do Texibook of Endocrinaiogj, editado p o r M .
C o n n e S. M e l m e d , publicado pela H u m a n a Press em 1997. Somos m u i t o
gratos pela permissão de reprodução destes excelentes acréscimos ao nosso
texto.
A insulina, o p a r a t o r m ô n i o ( P T H ) e a adrenocorticotrofina
( A C T H ) (Capítulos 22, 38 e 39, respectivamente) são exemplos
de h o r m ô n i o s peptídicos ou protéicos. Esses h o r m ô n i o s são geral-
mente solúveis em água e circulam livremente n o plasma c o m o
a molécula inteira ou c o m o fragmentos ativos ou inativos. A
meia-vida destes h o r m ô n i o s no plasma é de 10 a 30 m i n u t o s ou
464 PARTE IV Analitos

Hipófise solúveis e m água, mas c i r c u l a m n o plasma l i v r e m e n t e (catecola-

Corpo pineal
minas) o u ligados a proteínas (tiroxina). Por exemplo, a t i r o x i n a
liga-se avidamente a três proteínas ligadoras e t e m u m a meia-vida
de cerca de 7 a 10 dias, e n q u a n t o as catecolaminas livres, c o m o a
epinefrina, t ê m u m a meia-vida m u i t o curta de 1 m i n u t o o u menos.
C o m o os h o r m ô n i o s p e p t í d i c o s e protéicos solúveis em água,
estes h o r m ô n i o s i n t e r a g e m c o m receptores associados á m e m -
Tlraòklo ParatírsúkleH brana e usam u m sistema de segundo mensageiro.
Timo
AÇÃO DOS HORMÔNIOS
As funções dos h o r m ô n i o s são classificadas, e m termos gerais,
c o m o (1) crescimento e d e s e n v o l v i m e n t o , (2) c o n t r o l e homeostá-
t i c o das vias metabólicas e (3) regulação da p r o d u ç ã o , uso e
Fígado estoque de energia.
Duodeno fcstõmaflo

Pârtcreas
Baço
Adronyí
Córtex renal
lusliculo Ovários
Figura 25-1 Localização das glândulas endócrinas em humanos.
(Modificada de Turner CD. General Endócrina lo gy, 4th ed,
Philadelphia: W B Saunders, 1996)
menos, e amplas flutuações e m suas concentrações p o d e m ser
vistas e m várias circunstâncias fisiológicas e patológicas. Estes
h o r m ô n i o s i n i c i a m suas respostas ligando-se a receptores da
m e m b r a n a celular (na superfície o u d e n t r o da m e m b r a n a ) e
( n o r m a l m e n t e ) e s t i m u l a n d o u m sistema celular de "segundo
mensageiro" { c o m o aqueles e n v o l v e n d o a adenosina m o n o f o s f a t o
cíclico [ A M P ] d e n t r o da célula) q u e levam às ações específicas
destes h o r m ô n i o s na célula.
Hormônios Esteroidais
O c o r t i s o l e o estrógeno são exemplos de h o r m ô n i o s esteroidais
( C a p í t u l o s 4 0 e 42, respectivamente). Eles são h i d r o f ó b i c o s e
insolúveis e m água. N o plasma, estes h o r m ô n i o s c i r c u l a m ligados
reversivelmente às proteínas transportadoras (p. ex., g l o b u l i n a
ligadora de c o r t i s o l e g l o b u l i n a ligadora de h o r m ô n i o sexual)
c o m somente u m pequena fração livre o u não ligada d i s p o n í v e l
para exercer a ação fisiológica.' 1,6,12 A meia-vida dos h o r m ô n i o s
esteroidais é de 30 a 9 0 m i n u t o s . Os h o r m ô n i o s esteroidais livres,
sendo h i d r o f ó b i c o s , e n t r a m na célula p o r difusão passiva e se
l i g a m a receptores intracelulares n o citoplasma o u no n ú c l e o .
Hormônios Relacionados c o m Aminoácido
Os h o r m ô n i o s que são derivados de a m i n o á c i d o s , c o m o as cate-
colaminas e a t i r o x i n a (Capítulos 2 6 e 41, respectivamente), são
Crescimento e Desenvolvimento
O crescimento e o d e s e n v o l v i m e n t o n o r m a i s de t o d o o orga-
n i s m o h u m a n o é d e p e n d e n t e de u m a complexa f u n ç ã o integra-
tiva de muitos h o r m ô n i o s , i n c l u i n d o os esteróides go nada is
(estrógeno e andrógeno), h o r m ô n i o de crescimento, c o r t i s o l e
t i r o x i n a . O u t r o s h o r m ô n i o s são responsáveis especificamente
pelo crescimento e d e s e n v o l v i m e n t o das próprias glândulas endó-
crinas e, p o r t a n t o , responsáveis pelo c o n t r o l e da síntese e secre-
ção de outros h o r m ô n i o s . Estes são p r e d o m i n a n t e m e n t e os hor-
m ô n i o s da g l â n d u l a h i p ó f i s e a n t e r i o r e i n c l u e m :
• G o n a d o t r o f i n a s [ h o r m ô n i o luteinizante ( L H ) e h o r m ô n i o
f o l í c u l o estimulante ( F S H ) ] r e g u l a m o d e s e n v o l v i m e n t o , o
crescimento e a f u n ç ã o dos ovários e testículos. Estes
h o r m ô n i o s , p o r sua vez, regulam o crescimento puberal, o
desenvolvimento e a m a n u t e n ç ã o d o esqueleto e músculos
e a d i s t r i b u i ç ã o da g o r d u r a c o r p o r a l ( C a p í t u l o 42).
• A C T H regula o crescimento das glândulas adrenais e a
síntese e secreção de seus h o r m ô n i o s ( C a p í t u l o 39).
• H o r m ô n i o e s t i m u l a n t e da t i r e ó i d e ( T S H ) regula o
crescimento da g l â n d u l a t i r e ó i d e e a i o d i n i n a ç ã o de
a m i n o á c i d o s para p r o d u z i r os h o r m ô n i o s t i r e o i d i a n o s
t r i i o d o t i r o n i n a e t i r o x i n a ( C a p í t u l o 41). 1
A p r o d u ç ã o e liberação destes h o r m ô n i o s hipofisários são
controladas pelos h o r m ô n i o s h i p o t a l ã m i c o s do sistema h i p o -
tálamo-hipofisário.
Controle Homeostático das Vias Metabólicas
As m ú l t i p l a s vias metabólicas estão sob c o n t r o l e h o r m o n a l .
Exemplos i m p o r t a n t e s i n c l u e m a regulação da glicose sanguínea
e a homeostasia d o m e t a b o l i s m o d o cálcio, água e eletrólitos.
Regulação da Glicose Sanguínea
E m resposta a u m aporte de glicose, há p r o n t a liberação de insu-
l i n a pelo pâncreas que regula a d i s t r i b u i ç ã o da glicose para d e n t r o
das células (tecido adiposo, m ú s c u l o , fígado, cérebro) para o
m e t a b o l i s m o necessário a f i m de p r o d u z i r energia a p a r t i r desta
glicose. U m n ú m e r o de h o r m ô n i o s contra-reguladores e n t r a m e m
jogo para regular ainda este processo e assegurar que os níveis
sanguíneos de glicose não se t o r n e m m u i t o baixos. Estes i n c l u e m
glucagon, cortisol, e p i n e f r i n a e h o r m ô n i o de crescimento.
Regulação do Cálcio Séríco
U m receptor sensível a cálcio (CaSR) na g l â n d u l a p a r ó t i d a reco-
nhece a concentração do cálcio i o n i z a d o n o a m b i e n t e e regula a
síntese e secreção d o p a r a t o r m ô n i o ( P T H ) . Q u a n d o a concentra-
ção d o cálcio i o n i z a d o cai (tão i m p e r c e p t i v e l m e n t e que a m a i o r i a
dos métodos analíticos não é sensível o suficiente para detectar
a m u d a n ç a ) , a síntese e secreção d o P T H são estimuladas. Este
P T H a d i c i o n a l tentará restaurar o cálcio sérico (livre) aumen-
 Hormônios CAPÍTULO 25 465

T A B E L A 2 5 - 1 I H o r m ô n i o s Freqüentemente Dosados e Precursores Hormonais

Natureza Química Principais
Órgãos Endócrinos e Hormônios dos Hormônios Sítios de Ação Principais Ações

HIPOTÁLAMO
Hormônio liberador de tireotrolina (TRH) Peptídio (3 aa, Glu-His-Pro)* Hipófise anterior Liberação de TSH e prolactina (PRL)
Hormônio liberador de gonadotrofina Peplídio {10 aa) Hipófise anterior Liberação de FSH e LH
(Gn-RH) ou hormônio liberador do
hormônio luteinizante (LIl-RII)
Hormônio liberador de corticotrofina (CRH) Peptídio (41 aa) Hipófise anterior Liberação de ACTH e hormônio p-lipotrópico
(LPH)
Hormônio liberador do hormônio Peptídios (40, 44 aa) Hipófise anterior Liberação do hormônio de crescimento (GH)
de crescimento (GH-RH)
Somatostatina1 (SS) ou hormônio inibidor Pepiídios (14 e 28 aa) Hipófise anterior Supressão da secreção de vários hormônios
do hormônio de crescimento (GH-IH) (p.ex., GH, TSH, gastrina, polipeptídio
intestinal vasoativo [VIP], polipeptídio
inibidor da gastrina [GIP], secretina,
motilina, glucagon e insulina)

LOBO ANTERIOR DA HIPÓFISE

Tireotrofina ou hormônio estimulante Glicoproteína, heterodímero* Glândula tireóide Estimulação da formação e secreção do
da tireóide (TSH) (a, 92 aa; p, 112 aa) hormônio da tireóide
Hormônio folículo estimulante (FSH) Glicoproteína, heterodímero* Ovários Crescimento de folículos com o LH,
(a, 92 aa; p, 117 aa) secreção de estrógeno e ovulação
Testículo Desenvolvimento dos túbulos seminíferos;
espermatogênese
Hormônio luteinizante (LH) Glicoproteína, heterodímero* Ovário Ovulação; formação do corpo lúteo;
(a, 92 aa; (3,121 aa) secreção de progesterona
Testículo Estimulação do tecido intersticial; secreção
de andrógenos
Prolactina (PRL) Peptídio (199 aa) Glândula mamária Proliferação da glândula mamária; promove
início da secreção de leite; antagonista da
ação da insulina
Hormônio de crescimento (GH) ou Peptídio (191 aa) Fígado Produção de IGF-I (promotor do
somatotrofina crescimento)
Fígado e tecidos periféricos Efeitos antiinsulina e anabólicos
Corticotrofina ou adrenocorticotrofina Peptídio (39 aa) Córtex adrenal Estimula a formação e secreção de
(ACTH) esteróide adrenocortical

LOBO POSTERIOR DA HIPÓFISE JRO-HIPÓF ISE)

Vasopressina ou hormônio antidiurético Peptídio (9 aa) Arteríolas Elevação da pressão sanguínea; reabsorção
(ADH) Túbulos renais de água

Oxitccina Peptídio (9 aa) Músculos lises (útero, Contração; ação no trabalho de parto e no
glândula mamária) transporte do esperma; ejeção de leite

GLÂNDULA PINEAL
Serotorina ou 5-hidroxitriptamina Indoleamina Sistemas cardiovascular, Ncurotransmisscr; estimulação ou inibição
(5-HT) respiratório e de vários músculos lisos e nervos
gastrointestinal; cérehro
Melatonina Indoleamina Hipotálamo Supressão da secreção de gonadetrofina e
GH; indução do sono

GLÂNDULA TIREÓIDE
Tiroxina (T,,) e triiodotironina (Ta) lodoamino ácidos Tecido corporal geral Estimulação do consumo de oxigênio e da
taxa metabólica do tecido
Calcitonína ou tirocalcitonina Peptídio (32 aa) Esqueleto Incerto nos humanos

GLÂNDULA PARATIREÓIDE
Paratormônio (PTH) ou paratirina
Peptídio (84 aa) Rim Aumenta reabsorção de cálcio; inibe
reabsorção de fosfato; aumenta da
produção de 1,25-diidroxicolecalciferol
Esqueleto Aumenta da reabsorção óssea

Continua
466 PARTE IV Analitos

TABELA 25-1 H o r m ô n i o s Freqüentemente Dosados e Precursores H o r m o n a i s - Cont.

Natureza Química Principais

Órgãos Endócrinos e Hormônios dos Hormônios Sítios de Ação Principais Ações

CÓRTEX ADRENAL
Aldosterona Esferóide Rim Balanço de água e sal
Androstenedíona5 Esteróide Precursor hormonal Convertido para estrógeno e testosterana
Cortisol Este roide Vários Metabolismo dos carhoidratos, proteínas e
gorduras; efeitos antiinflamatórios; outros
Deidroepiandrosterona (DHEA) e Esteróides Precursores hormonais Convertidos para estrógeno e testosterona
sulfata de deidroepiandrostenediona
(SDHEA)
17-hidroxiprogestercna Esteróide Precursor hormonal Convertido para cortisol

MEDULA ADRENAL
Norepinefrina e epinefrina Aminas aromáticas Receptores simpáticos Estimulação do sistema nervoso simpático
Epinefrina Fígado e músculo, Glicogenólise
tecido adiposo Lipólise

OVÁRIO
DHEA e SDHEA Esteróides Precursores hormonais Convertidos para androstenediona
Estrógenos Esteróides fenólicos Órgãos sexuais femininos Desenvolvimento de características sexuais
secundárias
Gsso Controle da maturação esquelética
Inibiria A Peptídio (suburidade a Hipotálamo, tolículo Inibe a secreção de FSH; estimula a
e subunidade ovariano produção de ardrcgeno pelas células da
teca
Inibina B Peptídio (subunidade a e Ver Inibina A Ver Inibina A
subunidade pB)
Progesterana Esteróide Estruturas reprodutivas Preparação do útero para a implantação do
acessórias femininas óvulo fecundado, manutenção da gestação

TESTÍCULO
Inibina B Ver acima Hipófise anterior, hipotálamo Controle da secreção de LH e FSH
Testosterona Esteróide Órgãos sexuais masculinos Desenvolvimento das características sexuais
acessórios secundárias, maturação e função normal

PLACENTA
Estrógenos Ver acima Ver acima Ver acima
Progesterana Ver acima Ver acima Ver acima
Gonadotrofina coriônica (CG) ou Glicoproteína, heterodímero' Mesmos do LH Mesmas do LH; prolonga a função da corpo
coriogonadotrofina (a, 92 aa; p, 145 aa] lúteo

PÂNCREAS
Glucagon Peptídio {29 aa) Fígado Glicogenólise
insulina Peptídio" Fígado, gordura, músculo Regula o metabolismo dos carboidratos;
lipogênese

TRATO GASTROINTESTINAL
Gastrina Peptídio (17 aa) Estômago Secreção do ácido gástrico, crescimento da
mucosa gástrica
Grelina (GHRP) Peptídio {28 aa) Hipófise anterior Secreção de GH

RIM
1,25-(OH)2 colecalciferol Estero]
Eritropoietina Peptídio (165 aa)
Sistema renina-angiotensina-aldosterona Peptídios (renina, 297 aa;
Ang 1,10 aa; Ang II, 8aa,
produzida a partir da Ang 1
pela enzima conversora do
angiatensinagênio)
Intestino Facilita a absorção de cálcio e fósforo;
Osso aumenta a reabsorção óssea
em conjugação com o PTH
Rim Aumenta a reabsorção de cálcio filtrado
Medula óssea Estimula a formação de células vermelhas
Renina (renal) catalisa a Ang II aumenta a pressão sanguínea e
hidrólise do estimula a secreção de aldosterona
angiotensinogênio (hepático, (ver adrenal)
485 aa) em Ang 1 no
espaço intravascular
 Hormônios CAPÍTULO 25 467

TABELA 25-1 | H o r m ô n i o s Freqüentemente Dosados e Precursores Flormonaís - C o n t .

Natureza Química Principais
Úrgãos Endócrinos e Hormônios dos Hormônios Sítios de Ação Principais Ações

FÍGADO
IGF-I anteriormente denominada Peptídio (70 aa) Maicria das células Estimula o crescimento linear das células
somatomedina
IGF-II Peptídio (67 aa) Maioria das células Atividade semelhante à insulina

CORAÇÃO
Peptídio nairiurético tipo B Peptídio com uma ligação Tecidos vascular, renal Regula o volume sanguíneo e a pressão
dissulfídica dentro da e adrenal sanguínea
cadeia (32 aa)

TECIDO ADIPOSO
Adiponectina Peptídio oligòmero de Músculo Aumenta a oxidação de ácidos graxos
subunidades de 30 kD Fígado Suprime a formação de glicose
Leptina Peptídio (167 aa) Hipotálamo Inibe o apetite, estimula o metabolismo
Resistira Peptídio (94 aa) Fígado Resistência insulínica

VÁRIOS TIPOS CELULARES

Peptídio relacionado com o paratormônio Peptídios { 1 3 9 , 1 4 1 , 1 7 3 aa) Rim, osso Função fisiológica conjetural; ações
(PTH-RP) semelhantes ao PTH; criador de tumores

MONÓCITOS/LINFÓCITOS/MACRÓFAGOS
Ciiocinas (p. ex.: interleucinas 1-18, Peptídios Muitos Estimula ou inibe o crescimento celular;
fator de necrose tumoral, interferon) outro

*aa, resíduos aminoácidos.

^PTüdujiiio também pelo [rato gastrointestinal e pelo pâncreas.
^Hormônios glicofrrotêkos compostos de DOÚ peptídioi diferentes Aí cadeias A 5ÍÍO SEMEIHTÍNTES ÜTTI estrutura ou idênticas; AS cadeias (3 diferem entre os hormônios e conferem especificidade.
^Antlrostenciona lãmbém é produzida no ovário e no testículo.
"Dtms cadeias ligadas por dons ligações dismlfídicas' a , 21 aa; (3, 30 aa.

t a n d o a reabsorção t u b u l a r r e n a l de cálcio e t a m b é m o e f l u x o de afeta a m a i o r parte dos órgãos do c o r p o e m o d u l a , p o r exemplo,

cálcio do esqueleto. O P T H p o r sua vez catalisa a síntese do
h o r m ô n i o r e n a l c a l c i t r i o l ( 1 , 2 5 - d i i d r o x i v i t a m i n a D ) , o q u a l age
n o i n t e s t i n o para a u m e n t a r a absorção de cálcio. Esta resposta
m u i t o rápida do P T H e do c a l c i t r i o l r a p i d a m e n t e restaura o
cálcio livre para u m a concentração na q u a l o CaSR n ã o é mais
ativado e a síntese e secreção t a n t o do P T H c o m o d o c a l c i t r i o l
v o l t a m aos níveis basais.
Regulação do Metabolismo dos Eletrólitos e de
Água
Esta via é regulada peta aldosterona p r o d u z i d a pela glândula
adrenal, pela r e n i n a p r o d u z i d a pelos r i n s e pela vasopressina
[ b o i m ô n i o a n t i d i u r é t i c o ( A D H ) ] pela h i p ó f i s e posterior.
a freqüência cardíaca, o suor, a f e r t i l i d a d e e a reprodução.
RECEPTORES HORMONAIS
A ação " ú n i c a " o u específica de u m h o r m ô n i o e m seu tecido-alvo
é u m a f u n ç ã o da interação entre o h o r m ô n i o e o seu r e c e p t o r .
C o m o discutido previamente, há vários tipos de interações hor-
mônio-receptor. 2 4 ' 6 ' 1 2 O c o m p l e x o h o r m ô n i o - r e c e p t o r p r o p o r -
ciona u m a especificidade m u i t o alta da ação do h o r m ô n i o , per-
m i t i n d o que o tecido-alvo reconheça o h o r m ô n i o a p r o p r i a d o
dentre as várias moléculas às quais ele é exposto. Isto é essencial
já que os h o r m ô n i o s geralmente c i r c u l a m e m concentrações pico-
molares o u n a n o m o l a r e s (10~9 a 10~12 m o l / L ) . C o m o n o t a d o , os
receptores h o r m o n a i s p o d e m estar na superfície celular o u n o
espaço intracelular d e n t r o d o citoplasma o u do núcleo.

Receptores de Superfície Celular

Regulação de Produção, Uso e Estoque de
Energia
E m condições n o r m a i s , estas funções de h o r m ô n i o s estão sob
controle hormonal rigoroso. Em condições de mudança, normal-
m e n t e e m a u m e n t o da d e m a n d a d e energia, c o m o n o exercício,
fome, infecção, t r a u m a o u estresse e m o c i o n a l , as concentrações
circulantes de m u i t o s h o r m ô n i o s estão aumentadas para contro-
lar não s o m e n t e as concentrações circulantes de n u t r i e n t e s , mas
t a m b é m o m e t a b o l i s m o destes n u t r i e n t e s na direção da energia
necessária. E s t a atividade m u i t o complexa, a q u a l p o d e envolver
h o r m ô n i o s de órgãos diferentes, t a m b é m está sob c o n t r o l e neu-
rológico c o m u m n ú m e r o de h o r m ô n i o s n e u r o e n d ó c r i n o s parti-
c i p a n d o ativamente neste processo m e t a b ó l i c o i n t e g r a d o que
Os h o r m ô n i o s peptídicos ligam-se a receptores na superfície
celular, e a m u d a n ç a c o n f o r m a c i o n a l que resulta desta ligação
ativa u m sistema efetor, o qual, p o r sua vez, é responsável pelas
ações a jusante do h o r m ô n i o (Figura 25-2). 8 9 Para a m a i o r i a dos
h o r m ô n i o s peptídicos, o efetor intracelular que é ativado pela
interação h o r m ô n i o - r e c e p t o r é u m a proteína G específica (pro-
teína ligadora de g u a n i l - n u c l e o t í d i o ) , e os receptores são chama-
dos de receptores ligados a proteína G ( G P C R s , Figura 25-3). 3,7,10,13
Os G P C R s são moléculas hepta-helicoidais c o m sete d o m í n i o s
que se estendem sobre a m e m b r a n a . O a m i n o t e r m i n a l é extrace-
lular e o c a r b o x i t e r m i n a l é intracelular. As p r i n c i p a i s classes
estruturais de G C P R s f o r a m identificadas, cada u m a c o n t e n d o
receptores para s u b c o n j u n t o s específicos de h o r m ô n i o s (Figura
468 PARTE IV Analitos
Progesterona
5 entra na célula via difusão passiva e se liga aos receptores intra-
xá*
Respostas biológicas
F i g u r a 2 5 - 2 Sinalização hormonal por receptores de superfície
celular e intracelulares. Os receptores para hormônios polipeptídicos
solúveis em água L H e fator de crescimento semelhante à insulina
OGF-I) são proteínas integrais da membrana localizadas na superfície
celular. Eles ligam os hormônios usando seqüências extracelulares e
transduzem um sinal pela geração de segundos mensageiros, cAMP para
o receptor de LH e substratos fosforilados em tirosina para o receptor
de IGF-I. Embora os efeitos na expressão de genes sejam indicados,
também são observados efeitos diretos nas proteínas celulares (p. ex.,
canais iónicos). Por outro lado, o receptor para hormônio esteroidal
lipofilico progesterona está no núcleo celular. Ele se liga ao hormônio,
se torna ativo e capaz de modular diretamente a transcrição do gene
alvo. FT, fator de transcrição; R, molécula receptora. (De Conn PM,
Melmed S. Textbook of endocrinology. Totowa, NJ: Humana Press,
1997.)
25-4). O g r u p o I é o m a i o r g r u p o , c o n t e n d o receptores para
m u i t o s h o r m ô n i o s peptídicos e catecolaminas. O g r u p o I I c o n t é m
receptores para a f a m í l i a dos h o r m ô n i o s gastrointestinais (secre-
tina, glucagon, p o l i p e p t í d i o i n t e s t i n a l vasoativo). O g r u p o I I I
c o n t é m o C a S R e o receptor de g l u t a m a t o . A estimulação de u m a
proteína G i n i c i a os processos intracelulares de transdução de
sinal, os quais caracterizam a ação especifica do h o r m ô n i o . As
proteínas G são compostas de subunidades a , P e y e são classi-
ficadas de a c o r d o c o m a s u b u n i d a d e a , da q u a l 20 f o r a m iden-
tificadas até o m o m e n t o (Figura 25-4). E n t r e as proteínas G ,
algumas e s t i m u l a m a a d e n i l a t o ciclase (proteínas G t i p o G J e
outras a i n i b e m ( t i p o G|). A l g u n s h o r m ô n i o s não peptídicos
t a m b é m usam receptores de superfície celular.
Receptores Intracelulares
Os h o r m ô n i o s lipossolúveis são transportados n o plasma
ligados a proteínas carreadoras c o m somente u m a p e q u e n a fração
d o h o r m ô n i o n o estado livre ou não ligado. O h o r m ô n i o livre
celulares n o citoplasma ou n o n ú c l e o (Figura 25-2). Estes recep-
tores são caracterizados p o r u m d o m í n i o de ligação ao h o r m ô n i o ,
u m d o m í n i o de ligação ao D N A e u m d o m í n i o a m í n o t e r m i n a l
variável. A s s i m c o m o a interação dos h o r m ô n i o s protéicos o u
p o l i p e p t í d i c o s c o m os receptores na superfície celular m u d a a
c o n f o r m a ç ã o do Teceptor p r o t e i c o , a ligação de u m h o r m ô n i o
lipossolúvel ao d o m í n i o de seu receptor específico intracelular
m u d a a c o n f o r m a ç ã o m o l e c u l a r do receptor. Esta m u d a n ç a con-
f o r m a c i o n a l , chamada de ativação d o receptor, t o r n a o c o m p l e x o
h o r m ô n i o - r e c e p t o r capaz de se ligar a seqüências regulatórias
específicas n o D N A de u m gene-alvo, p e r m i t i n d o o c o n t r o l e da
expressão do gene específico. 3 Para que o receptor ligado ao
h o r m ô n i o se ligue ao D N A nuclear, ele deve se mover até o
núcleo se ele já não estiver lá.
AÇÕES HORMONAIS PÓS-RECEPTOR
Os receptores de superfície celular e i n t r a c e l u l a r t ê m diferentes
ações pós-receptor.
Receptores de Superfície Celular
U m a vez que os G P C R s estão ocupados p o r u m h o r m ô n i o , as
subunidades da p r o t e í n a G i n i c i a m u m a cascata de ativação de
enzimas específicas que g e i a m moléculas que servem c o m o
segundos mensageiros para efetuarem a resposta h o r m o n a l . Os
mais conhecidos deles são (1) adenilato ciclase, q u e gera o ade-
nosina m o n o f o s f a t o cíclico ( c A M P ) , e (2) fosfolípase C , a q u a l
gera o i n o s i t o l 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol. A p r o d u ç ã o
de segundos mensageiros, e a subseqüente m a g n i t u d e do efeito
d o h o r m ô n i o , é u m a f u n ç ã o da q u a n t i d a d e de h o r m ô n i o ligada
ao G P C R . A ligação de u m a pequena q u a n t i d a d e de moléculas
de h o r m ô n i o na superfície celular leva à p r o d u ç ã o de m u i t a s
moléculas do segundo mensageiro, a m p l i f i c a n d o , então, o sinal
enviado pelo h o r m ô n i o (o q u a l é e n t e n d i d o c o m o o p r i m e i r o
mensageiro).
As proteínas quinases dependentes de c A M P são u m a f a m í l i a
de enzimas quej na presença de c A M P , fosforila u m n ú m e r o de
enzimas e outras proteínas, r e g u l a n d o , p o r t a n t o , suas funções.
C o m o meios adicionais de regular as ações h o r m o n a i s , estas
quinases dependentes de c A M P consistem em duas subunidades
catalíticas e duas régulatórias. As subunidades regulatórias existem
c o m o u m d í m e r o que liga moléculas de c A M P , e a ligação de
c A M P libera as subunidades catalíticas, as quais são então ativas
c o m o enzimas fosforiíadas.
A fosfolípase C age n o f o s f o i n o s i t o l na m e m b r a n a celular
para p r o d u z i r IP3 e diacilglicerol. U m efeito do IP3 é abrir os
canais iónicos para f a c i l i t a i a entrada de cálcio n o citoplasma,
o n d e ele parece agir c o m o u m segundo mensageiro.
O s receptores de i n s u l i n a representam u m a classe de recep-
tores de superfície celular q u e c o n t é m intrínseca atividade tiro-
sina quinase ativada p o t h o r m ô n i o , e acredita-se que não preci-
sem de u m a pequena m o l é c u l a q u e f u n c i o n e c o m o u m segundo
mensageiro solúvel. 11 A estrutura do receptor de i n s u l i n a serve
c o m o o p r o t ó t i p o deste t i p o de receptor. Ela consiste em duas
subunidades a e duas p ligadas p o r pontes dissulfídicas. Os
d o m í n i o s extracelulares ligadores de h o r m ô n i o são as subunida-
des a , e n q u a n t o as subunidades P são intracelulares. Eles c o n t ê m
u m l o c a l para ligação de adenosina trifosfato (ATP) e u m d o m í n i o
quinase catalítico p o r i n t e r m é d i o do q u a l a t i r o s i n a quinase é
ativada i m e d i a t a m e n t e q u a n d o a i n s u l i n a se liga ao receptor. A
tirosina quinase m o d i f i c a as atividades das proteínas intracelula-
res por fosforilá-las, assim t r a n s m i t i n d o a "mensagem"da i n s u l i n a
para a célula.
 Hormônios CAPÍTULO 25 469

NH 2 NH*

Estoque do retículo
endoplasrn ático

Cí*nodiJltri3 \
quin«S& ;

Figura 25-3 T r a n s d u ç ã o de sinal p o r receptores de superfície celular que estão acoplados c o m proteínas G .
São mostrados dois receptores sete de d o m í n i o s t r a n s m e m b r a n a , ligados a diferences proteínas G (G s e G J .
A ativação d o G J e v a à estimulação da e n z i m a efetora adenilato ciclase e à p r o d u ç ã o d o segundo mensageiro
c A M P , causando a ativação da p r o t e í n a quinase A ( P K A ) e a iniciação de potenciais cascatas de fosforilacão A
ativação da G q leva à estimulação da enzima efetora fosfolípase C-|3 e à p r o d u ç ã o dos segundos mensageiros IP3
e d i a c i l g l i c e r o l ( D A G ) , que a t i v a m a p r o t e í n a quinase C (PKC) e i n i c i a m u m a cascata p o t e n c i a l de fosforilacão.
{De C o n n P M , M e l m e d S, Eds. T e x t b o o k o f e n d o c n n o l o g y . T o t o w a , N ) : H u m a n a Press, 1997.)

C o m o os h o r m ô n i o s c u m p r e m u m a função reguladora, há Isto resulta n u m a mudança conformacional que permite que o

muitas etapas autolimitantes n o processo mencionado. Para o
cAMP, isto envolve a mativação da estimulação da proteína G da
adenilato ciclase pela guanosinatrifosfatase (GTPase). N a ausên-
cia da interação do h o r m ô n i o com o G P C R (estado basal o u não
estimulado), G s está ligado à guanosina difosfato (GDP) TJma
vez que o h o r m ô n i o está ligado ao receptor, G D P é liberado de
G s e substituído pelo G T P e o complexo G S -GTP ativa a adenilato
ciclase (Figura 25-5). O complexo G S -GTP é inativado pela
GTPase, restaurando o estado G S -GDP que não pode estimular
a formação de c A M P até que mais h o r m ô n i o se ligue ao G P C R .
Após poucos m i n u t o s (ou menos) da interação do h o r m ô n i o com
G P C R e do início da ação h o r m o n a l , o receptor é fosfcrilado
pela proteína quinase A e proteína quinase C Esta fosforilacão
do receptor h o r m o n a l permite a internalização do complexo a
partir da superfície celular para dentro da célula. Então, ocorre
a defcsforilação, p e r m i t i n d o a degradação do h o r m ô n i o e a reci-
clagem do G P C R para sua localização transmembrana original,
aguardando a ligação com mais h o r m ô n i o .
Receptores Intracelulares
Fisiologicamente, os h o r m ô n i o s lipossolúveis se ligam ao d o m í n i o
de ligação h o r m o n a l de receptores citoplasmático ou nuclear. 8,9
complexo hormônio-receptor se ligue a seqüências regulatórias
específicas do D N A na terminação 5 ' do gene-alvo.5 A especifici-
dade de ligação do receptor (ligado ao h o r m ô n i o ) para regiões
específicas do D N A do gene-alvo é determinada por estruturas
chamadas dedos de zinco n o d o m í n i o de ligação do D N A do
receptor. E a ligação do complexo hormônio-receptor a elementos
regulatórios do D N A que aumenta ou reprime a transcrição
gênica. O R N A mensageiro, o qual é aumentado ou reduzido
pela ligação do hormônio-receptor ao gene-alvo, regula a síntese
de proteínas específicas que medeiam as ações fisiológicas do
h o r m ô n i o . O sistema é regulado ainda pela presença o u ausência
de co-ativadores o u co-repressores da expressão gênica.
DESORDENS CLÍNICAS DOS HORMÔNIOS
As doenças endócrinas resultam da deficiência ou do excesso de
u m único h o r m ô n i o o u de vários h o r m ô n i o s , ou da resistência
à ação de h o r m ô n i o s , A deficiência h o r m o n a l pode ser congênita
o u adquirida, enquanto o excesso h o r m o n a l pode ser decorrente
de uma superprodução endógena (de dentro do corpo) ou
exógeno por medicação em dose excessiva. A resistência h o r m o -
nal ocorre em vários níveis, mas é simplesmente caracterizada
como mediada por receptor, mediada por pós-receptor o u ao
470 PARTE IV Analitos

Superfamília do receptor acoplado à proteína G (GPCR)

Família A: Receptores relacionados com rodopsina e receptores

fi-adrenérgicos Família D: Receptores relacionados com o receptor de feromônio STE2

Grupa I: Receptores olfatário, adenosina, melanocortina Grupo I: Receptores de fator alfa feromônio
Grupo II: Receptores adrenérgico. muscarínico, de serotonina, de DA
Grupo 111: Receptores de rieurcpeptidio e opsinas de vertebrados
Grupo IV: Receptores de bradicinina e de opsinas de invertebrados
Grupo V: Receptores de hormônios peptídicos e glicoprotéicos, de Família E : Receptores relacionados com o receptor de feromônio
quimiocira STE3
Grupo VI: Receptores de melatonina e órfãos
Grupo I: Receptor de fator A feromônio

Família B: Receptares relacionados com receptores de calcitonína e

paratornnõnio Família F: Receptores relacionados com o receptor cAMP

Grupo I: Receptores de calcitonína, calcitonina-Wre e CRF

Grupo II: Receptores de PTH e PTHrP Grupo I: Receptor de Dictyostelium cAR1 -4
Grupo III: Receptores de glucagon, secretina, VIP e GHRH

Família C: Receptores relacionados com receptores de glutamato

metabotrópico

Grupo I: Receptores de glutamato metabotrópico

Grupo II: Receptores sensores do íon cálcio extracelular
A

GlicusiUi^ãu

Ligação agonista

Cisteínas conservadas
Ligação antagonista

T M D 1 - * TMD2/ ' TMD3-®TMD4 TMD5 TMD7

y
JZ • -
v y
a V j
%
•a!®
PdlmiT:

da PKA

Necessários para ligação da

catecolamina e ativação
k A s p 113 • Ser 204, 2 0 7
Proteína G acoplada

COOH

Fosforilação de |3ARK

Figura 2 5 - 4 Classificação e a r q u i t e t u r a básica dos receptores de superfície celular que se l i g a m às proteínas

G. O p a i n e l A lista as p r i n c i p a i s famílias e grupos de G P C R s . Os receptores m a m í f e r o s são restritos a famílias A ,
B e C . A f a m í l i a A é a m a i o r e i n c l u í os diversos receptores o d o r a n t e s e prototípicos G P C R s , c o m o o receptor
para r o d o p s i n a e o receptor |B-adrenérgico. O p a m e l B mostra u m a estrutura esquemática de u m dos mais
extensamente caracterizados G P C R s , o receptor (3-adrenérgico. A s p r i n c i p a i s características estruturais estão
indicadas e são expandidas n o texto. (De C o n n P M , M e l m e d S, Eds. T e x t b o o k o f e n d o c r i n o l o g y T o t o w a ,
NJ: H u m a n a Press, 1997 )

Ligante
í «
N d e t e r m i n a n t e s em c o m u m . E m geral, os ensaios baseados em
|
GDP
Figura 2 5 - 5 C i c l o da p r o t e í n a G . ( D e C o n n P M , M e l r n e d S,
Eds. T e x t b o o k o f e n d o c r i n o l o g y . T o t o w a , N ] : H u m a n a Press,
1997.).)
nível d o tecido-alvo. A s manifestações clínicas dependerão d o
sistema h o r m o n a l afetado e d o t i p o de a n o r m a l i d a d e ( C a p í t u l o s
22, 26 e 38-42). A doença e n d ó c r i n a mais c o m u m nos Estados
U n i d o s é o diabetes mellitus ( D M ) . O D M t i p o 1 resulta da falên-
cia do pâncreas em secretar a i n s u l i n a ainda que o pâncreas esteja
de o u t r o m o d o n o r m a l ( C a p í t u l o 22). O D M t i p o 2 é o t i p o mais
c o m u m de D M e resulta da resistência do órgão-alvo à ação da
insulina, a q u a l é secretada p e l o pâncreas e m quantidades abun-
dantes e circula e m altas concentrações. O D M secundário ocorre
q u a n d o u m a doença não e n d ó c r i n a , c o m o a pancreatite, destrói
o pâncreas, i n c l u i n d o as células secretoras de i n s u l i n a . A carac-
terística b i o q u í m i c a do D M é a hiperglicemia. Por o u t r o lado,
existem tumores r a i o s do pâncreas p r o d u t o r e s de i n s u l i n a (insu-
l i n o m a s ) nos quais a p r o d u ç ã o de i n s u l i n a não é regulada pela
concentração sanguínea da glicose, e sua característica b i o q u í -
mica é a hipoglicemia.
FORMAS DE MEDIDA DOS HORMÔNIOS E
ANALITOS RELACIONADOS
Os h o r m ô n i o s são m e d i d o s p o r u m a variedade de técnicas ana-
líticas, i n c l u i n d o biomarcadores, marcadores de receptores, i m u -
noensaio e técnicas i n s t r u m e n t a i s , c o m o a espectrometria de
massa associada a cromatografia l í q u i d a o u gasosa.
Técnicas de Bioensaio
Os bioensaios são baseados nas observações de respostas fisioló-
gicas específicas para o h o r m ô n i o que esteja sendo dosado. Os
bioensaios i n vivo n o r m a l m e n t e envolvem a injeção do m a t e r i a l
testado ( c o m o o sangue o u u r i n a de u m paciente) e m animais
preparados adequadamente. As respostas da glândula-alvo, c o m o
u m crescimento o u esteroidogênese, são então medidas. Os bio-
ensaios i n vitro envolvem a incubação de tecido, membranas,
células dispersas o u linhas celulares permanentes em u m m e i o
de c u l t u r a d e f i n i d o , c o m subseqüente m e d i d a da resposta apro-
priada de u m h o r m ô n i o . A m a i o r i a dos bioensaios in vitro mede
as respostas p r o x i m a l o u distai a u m segundo mensageiro, c o m o
a estimulação da f o r m a ç ã o de c A M P . Os bioensaios t e n d e m a ser
imprecisos e r a r a m e n t e são usados clinicamente.
Ensaios Baseados em Receptores
Os ensaios baseados em receptores d e p e n d e m da interação i n
vitro de u m h o r m ô n i o c o m seu receptor biológico. Neste t i p o de
Hormônios CAPÍTULO 25 471
ensaio, o h o r m ô n i o não marcado desloca quantidades rastreadas
de h o r m ô n i o marcado r a d i o a t i v a m e n t e dos sítios do receptor.
U m segundo c a m i n h o m e d e u m a resposta, c o m o a produção de
c A M P , q u a n d o u m a amostra testada é a d i c i o n a d a a u m a prepa-
ração que i n c l u i o receptor e os co-fatores necessários. E m geral,
os ensaios baseados em receptor são mais simples de se realizarem
que os bioensaios e t ê m m a i o r sensibilidade. O ensaio receptor
t a m b é m t e m u m a v a n t a g e m sobre os i m u n o e n s a i o s e m que eles
r e f l e t e m a f u n ç ã o biológica de u m h o r m ô n i o , chamada de capa-
cidade de se ligar a sítios específicos d o receptor. E m contraste,
os i m u n o e n s a i o s p o d e m m e d i r o h o r m ô n i o ativo e o p r ó - h o r m ô -
n i o i n a t i v o , o h o r m ô n i o p o l i m é r i c o e os m e t a b ó l i t o s q u a n d o
todos possuem u m d e t e r m i n a n t e a n t i g ê n i c o ou u m c o n j u n t o de
receptor não são tão sensíveis c o m o os i m u n o e n s a i o s , e enzimas
nas amostras biológicas p o d e m degradar o receptor o u destruir
o traçador marcado. A c o m p l e x i d a d e e l a b i l i d a d e adicionais das
preparações de receptores t a m b é m c o n t r i b u e m para a aplicação
l i m i t a d a destes ensaios na r o t i n a clínica dos laboratórios.
Técnicas de Imunoensaios
O s i m u n o e n s a i o s que empregam a n t i c o r p o s são a m p l a m e n t e
usados para q u a n t i f i c a r os h o r m ô n i o s ( C a p í t u l o 10). G e r a l m e n t e ,
os ensaios de a n t i c o r p o marcado ( i m u n o r r é f r i m ) com marcado-
res n ã o isotópicos são o m é t o d o escolhido para m e d i r vários
h o r m ô n i o s , especialmente os maiores c o m o os h o r m ô n i o s pep-
tídicos e proteicos. Os ensaios i m u n o m é t r i c o s u s a m concentra-
ções saturantes de dois o u mais a n t i c o r p o s (freqüentemente
m o n o c l o n a i s ) q u e são preparadas c o n t r a diferentes epítopos da
m o l é c u l a de proteína. U m o u dois dos a n t i c o r p o s são n o r m a l -
m e n t e ligados a u m sistema de separação de fase sólida e extraem
o h o r m ô n i o da amostra de soro e o i m o b i l i z a m na superfície
sólida. O a n t i c o r p o remanescente é ligado a u m a m o l é c u l a sina-
lizadora, a q u a l é m e d i d a depois q u e o a n t i c o r p o se liga ao hor-
m ô n i o i m o b i l i z a d o . O sinal resultante é u t i l i z a d o para q u a n t i f i -
car o h o r m ô n i o ligado.
Técnicas Instrumentais
Os espectrómetros de massa ( C a p í t u l o 8) associados aos cromató-
grafos gasoso e l í q u i d o ( C a p í t u l o 7) são ferramentas analíticas
qualitativas e quantitativas poderosas que são amplamente usadas
para m e d i r h o r m ô n i o s . Os avanços técnicos na espectrometria de
massa resultaram n o desenvolvimento da técnica de ionização/
dessorção a laser assistida p o r m a t r i z ( M A L D i ) e de técnicas de
ionização p o r elmo spray que p e r m i t e m seqüenciamento de peptí-
dios e determinação de massa de quantidades de picomoles de
anahtos.
REFERENCIAS
1. Brení GA. The molecular basis o/ thjroid fwnnone ac.tion. N Engl j Meti
1994,331:847-53.
2. Edivards DP. The role of coactivators anti corepressors in the biolog) and
mechflnism of acti cm of s tero íd homwne rcceptoTS. J Mammary Gkmd Biol
Neofiksia 2000,5 307-24
3. Fdrfel 2, Bourne RR, liri T. The expanding spectrum of G protein dijeflse- N
Engl) Med 1999;340:1012-20.
4. Funder JW. Mmerfllocorticoids, glwcocorticoiíis, receptors and response elements.
Science 1993;259:1132-3.
5. Glasí CK. Differential recognition of targec genes b j nuclear receptor monomers,
dimers, and heierodimers. Endocr Re<v 1994] 15:391 407.
6 fCIinge CM. Estrogen receptor inteTíiction wítJi estrogen response elemenls
Nucleic Aci ás Res 2001;29:2905-19
7. Lefkowitz Kl- G pToteim in medicine. N Engl] Med 1995,332.186-7.
472 PARTE IV Analitos

8. Mílngelsdorf D), Thummel C, Beata M , Herlict P, Scfiitlc^ G, 1990-39:1009-16.

L/mescmO K, et ai. The miciear receptor super famib): the .second decade. Celi 12. Pifíe AC, Bríozotwki A M , Hubbard RE. A structurai biologijti fiew of the
1995,83:835-9. oesirogen receptor. ] Steroid Biocliem M o l Biol 2000,74:261-8.
9 McKenna NJ, Lanz RB, O'Maliey B W NwcWr receptor coregulators: cellulãr 13. Vaugfiíln M Signüling £9 heteTotrimeric G protein5 mínírevíeui .series.
and moíeculíJT biologj. Endocr RED 1999,20.321-44. ] Biol Chen 1998-273:667-8.
10. Neer El. Heterotrimeric G proteiní: organizers of crflnímÉirtiiranE signa ts. Celi
1995,80:249-57
11. Ok/sítj ]M. The iaswlin receptor: a muhifuTictioiídl protein. Diabetes
CAPÍTULO 2 6
Catecolaminas e Serotonina
Graeme Eisenhofer, Ph.D., Thomas G. Rosano, Ph.D., D.A.B.F.T., D.A.B.C.C.,
e Ronald J. Whitley, Ph.D., F.A.C.B., D.A.B.C.C.
OBJETIVOS
1. Listar os hormônios sintetizados pela medula adrenal, assim como
as ações fisiológicas, regulação da secreção e significância clínica
de cada um; determinar um métcdo de análise.
2. Definir feocromocitoma e os resultados laboratoriais obtidos na
avaliação dessa doença.
3. Resumir a via metabólica das catecclaminas e determinar a
significância clínica dos metabólitos.
4. Discutir a significância clínica da serotonina e do seu metabólito;
determinar um método de análise.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
3,4-DÍidroxifenilglicol ( D H P G ) : O metabólito produzido
dentro dos nervos noradrenérgicos do sistema simpático
periférico ou do sistema nervoso central através da
desaminação da norepinefrina (também pode ser formado a
partir da epinefrina); é O-metilado para metoxi-
hidroxifenilglicol nos tecidos extraneurais.
Á c i d o 5-Hidroxiindolacético ( 5 ' H I A A ) : U m metabólito da
serotonina (5-hidroxitriptamina) que é excretado em
grandes quantidades por pacientes com tumores
carcinóides.
A c i d o H o m o v a n í l i c o ( H V A ) : U m produto do metabolismo da
dopamina; concentrações urinárias elevadas são usadas para
diagnosticar neuroblastomas.
A c i d o V a n i l i l m a n d é l i c o ( V M A ) : O principal produto final do
metabolismo da norepinefrina e da epinefrina excretado
pela urina; formado primariamente n o fígado através da
oxidação do metoxi-hidroxifenilglicol.
Catecoíamina: Pertence a u m grupo de aminas biogênicas que
possuem uma ação simpaticomimética, cuja porção
aromática da molécula é o catecol e a porção alifática, uma
amina; os exemplos incluem a dopamina, a norepinefrina e
a epinefrina.
Célula C r o m a f i m : Células neuroendócrinas derivadas da crista
neural embrionária, encontradas na medula da glândula
adrenal e em outros gânglios do sistema nervoso simpático;
assim denominadas devido à presença de grânulos
citoplasmáticos que produzem uma reação acastanhada com
os sais de cromo.
D o p a m i n a : U m a catecoíamina formada n o corpo pela
descarboxilação da dopa; é u m produto intermediário na
síntese da norepinefrina, age como u m neurotransmissor
no sistema nervoso central; é produzido perifericamente e
age sobre receptores periféricos.
E p i n e f r i n a (adrenalina): U m h o r m ô n i o catecolamínico
secretado pela medula adrenal.
Feocromocitoma: U m tumor geralmente benigno, bem
encapsulado, lobular e vascularizado de tecido cromafim da
medula adrenal ou dos paragânglios simpáticos.
L - D o p a : U m aminoácido, 3,4-diidroxifenilalanina, produzido
pela oxidação da tirosina pela tirosina hidroxilase; é o
precursor da dopamina e u m p r o d u t o intermediário na
biossíntese da norepinefrina, epinefrina e melanina.
Metabólitos das Catecolaminas: Produtos do metabolismo das
catecolaminas, tais como o ácido diidrofenilacético, a
metoxitiramina, o ácido homovanílico, o diidrofenilglicol, o
metoxi-hidroxifenilglicol, a normetanefrma, a metanefrina e
o ácido vanililmandélico.
M e t a n e f r i n a : U m metabólito farmacológica e fisiologicamente
inativo das catecolaminas resultante da O-metilação da
epinefrina; formada principalmente n o interior das células
cromafins da adrenal; excretada na urina como u m
metabólito conjugado a sulfato; as dosagens dos metabólitos
livres e conjugados fornecem testes diagnósticos úteis para o
feocromocitoma.
Metoxi-hidroxifenoglicol ( M H F G ) : U m metabólito da
epinefrina e da norepinefrina formado primariamente pela
O-me til ação do diidroxifenil glicol e, em menores
quantidades, pela desaminação da notmetanefrina e da
metanefrina; encontrado n o cérebro, sangue, CSF e urina,
onde suas concentrações podem ser usadas para dosar a
renovação das catecolaminas.
Neuroblastoma: U m sarcoma constituído por neuroblastos
malignos, surgindo geralmente no sistema nervoso
autônomo (simpaticoblastoma) ou na medula adrenal;
considerado u m tipo de t u m o r neuroepitelial que afeta
principalmente os lactentes e crianças até 10 anos de idade.
N o r e p i n e f r i n a (noradrenalina): U m importante
neurotransmissor produzido por alguns neurônios cerebrais
e nervos simpáticos periféricos que agem sobre receptores
adrenérgicos alfaj e beta^ produzida pelas células cromafins
da adrenal como u m precursor da epinefrina.
N o r m e t a n e f r i n a : U m metabólito O-metilado da norepinefrina
produzido por células extraneuronais e pela medula
adrenal; excretada pela urina como u m metabólito
conjugado a sulfato; as dosagens dos metabólitos livres e
conjugados fornecem testes úteis para o diagnóstico do
feocromocitoma.
Serotonina (5-hidroxitriptamina): U m vasoconstritor
monoamínico sintetizado pelas células enterocromafins
intestinais ou em neurônios centrais ou periféricos;
encontrada em altas concentrações em vários tecidos
corporais, i n c l u i n d o a mucosa intestinal, o corpo pineal e o
sistema nervoso central.
S í n d r o m e Carcinóide: U m complexo sistema associado aos
tumores carcinóides e caracterizado por crises de rubor
cianótico da pele — com duração de minutos a dias — e por
evacuações diarréicas aquosas, crises broncoconstritivas,
quedas abruptas da pressão sanguínea, edema e ascite. Os
sintomas são provocados pela secreção tumoral de
serotonina, prostaglandinas e outras substâncias
biologicamente ativas.
T u m o r Carcinóide: U m tumor amarelado, circunscrito,
originado das células enterocromafins, geralmente no
474 PARTE IV Analitos

i n t e s t i n o delgado, apêndice, estômago o u c ó l o n , e menos OH

c o m u m e n t e n o b r ô n q u i o ; algumas vezes usado HO. .ri HO. .NH-,
isoladamente para se referir ao t u m o r gastrointestinal
( t a m b é m d e n o m i n a d o avgentafinoma).
^ N •
Nlli
HO'
YT
I

A
H Norepineírina
s catecolaminas e a s e r o t o n i n a são aminas biogênicas que Serotonina (Noradrenalina)
servem c o m o sinais neuronais o u h o r m o n a i s e m u m a (5-Hidroximptamina, 5-HT)
a m p l a gama de processos fisiológicos. As catecolaminas
de o c o r r ê n c i a n a t u r a l , d o p a m i n a e n o r e p i n e í r i n a ( n o r a d r e n a - HO H
l i n a ) , f u n c i o n a m c o m o neuTOtransmissores n o cérebro e nervos HO . NH-. HO.
simpáticos p e r i f é r i c o s , e n q u a n t o a e p i n e f r i n a ( a d r e n a l i n a ) age
c o m o u m h o r m ô n i o l i b e r a d o pela m e d u l a adrenal. 2 As cateco-
l a m i n a s são essenciais para a m a n u t e n ç ã o da homeostase cor-
HO'
I HO"
CHi

p o r a l e n a resposta ao estresse agudo e c r ô n i c o , através de u m a Dopamina Epinefrina

[p(3,4-Diiciroxifenil)etil amina) (Adrenalina)
orquestração de atividades cardiovasculares, metabólicas, glan-
dulares e viscerais. A s e r o t o n i n a ( 5 - h i d r o x i t r i p t a m i n a ) t a m b é m
serve c o m o u m neurotransmissor n o cérebro e c o m o u m m o d u - Figura 26-1 Estrutura química das catecolaminas e da serotonina.
l a d o r das funções vascular e g a s t r o i n t e s t i n a l n a periferia. A
p r o d u ç ã o a n o r m a l de c a t e c o l a m i n a s o u de s e r o t o n i n a p o d e
o c o r r e r e m u m a série d e t u m o r e s n e u T o e n d ó c r i n o s nos quais
Biossíntese da Biossíntese da serotonina e
os sinais e s i n t o m a s clínicos r e f l e t e m as p r o p r i e d a d e s farmaco-
catecolamina da melatonina
lógicas das a m i n a s secretadas. A dosagem c l í n i c a das aminas
biogênicas o u dos seus m e t a b ó l i t o s a u x i l i a n a detecção e m o n i -
t o r a m e n t o t u m o r a l , e os avanços analíticos p r o d u z i r a m m é t o d o s
l a b o r a t o r i a i s sensíveis e específicos que se e n c o n t r a m d i s p o n í -
veis para a p r á t i c a c l i n i c a .
r T NHí

COOH
HO
Tirosina
QUÍMICA, BIOSSÍNTESE, LIBERAÇÃO E I
METABOLISMO Tiroiirifl hidroxilase Triplo/uno judroxilisf
A q u í m i c a das aminas biogênicas será descrita e m p r i m e i r o lugar,
seguida pela sua biossíntese, liberação e metabolismo. Esses peque-
HO.. ^
1 „NH2 HO
V
I

s *
nos c o m p o n e n t e s eletricamente carregados d e s e m p e n h a m u m
papel v i t a l na homeostase. X . J COOH
Tr o o H
HO

Química Diidroxifenilalanina (dopa) 5-H idroxi triptofano

As catecolaminas, d o p a m i n a , n o r e p i n e í r i n a (noradrenalina) e
e p i n e f r i n a (adrenalina) são f e n i l e t i l a m i n a s c o m grupos h i d r o x i l Ldescarboxilase dos aminoácidos aromáticos

nas posições três e q u a t r o d o anel benzênico, e u m a e t i l a m i n a na

Ti
cadeia lateral na posição u m (Figura 26-1). As substituições h i d r o - HO NHi HO„ NHi
x i l e m e t i l n o lado e t i l a m i n a da cadeia d i s t i n g u e m as catecolami-
L
nas i n d i v i d u a i s tanto e m sua estrutura q u a n t o e m sua função. As
HO
catecolaminas d e m o n s t r a m graus variáveis de instabilidade alca- Dopamina
H
l i n a nos f l u i d o s biológicos, e a sua estrutura d i i d r o x i b e n z ê n i c a o u 5-HidroxitTÍ ptamina (Serotonina)
catecol é sensível à formação oxidativa de q u i n o n a s na presença I I
Dopíi mi rui (3-/iícÍT0X!Ídse Serotonina N-ucelikransfeTasí
de ar e luz. A serotonina, c o m a sua estrutura i n d o l e a m í n i c a , é
d i s t i n t a das catecolaminas, mas é t a m b é m u m a i m p o r t a n t e a m i n a
OH
l
biogênica de ocorrência natural. A m e l a t o n i n a é a p r i n c i p a l i n d o -
l e a m i n a p r o d u z i d a a p a r t i r da serotonina pela glândula pineal. HO ..NH; HO. v NH
Yi ^ I
Cr CHJ
Biossíntese llO
A etapa l i m i t a d o r a da velocidade na biossíntese das catecolaminas Norepineírina N-Ace ci l-5-h i d roxitrí ptamina
envolve a conversão d a t i r o s i n a para 3 , 4 - d i i d r o x i f e n i l a l a n i n a I
Feniletanoluminú H idTM lindo í •
(L-dopa) pela enzima tirosina-hidToxilase (Figura 26-2). U m a enzima
NtruriLtrans/frajf 0-m ê [ i I na ii afera se
correlata, a t r i p t o f a n o hidroxilase, catalisa a conversão d o tripto-
fano a 5-hidroxitripcofano n a p r i m e i r a etapa da síntese da seroto- k I
OH H
n i n a . As fontes teciduais de catecolaminas são p r i n c i p a l m e n t e
HO.. A .N_ H3C—0„ ^ NH
dependentes da presença da tirosina hidroxilase, que está, e m TH,
grande parte, c o n f i n a d a aos n e u r ô n i o s dopaminérgicos e noradre- O CHj
nérgicos d o sistema nervoso central e aos sistemas simpático e HO
H
m e d u l a r adrenal nos tecidos periféricos. Semelhantemente, as Epinefrina N - A c e t Ll'5-me toxi tri p t a m i n a
fontes de serotonina são bastante dependentes da presença da (Melatonina)

t r i p t o f a n o hidroxilase nos n e u r ô n i o s serotoninérgicos d o sistema Figura 26-2 Biossíntese das catecolaminas e serotonina e
nervoso central, na glândula p i n e a l e e m alguns tecidos endócrinos metabolismo da serotonina para melatonina.

periféricos, p a r t i c u l a r m e n t e as células enterocromafins do trato
digestivo. As plaquetas t a m b é m c o n t ê m grandes quantidades de sero-
tonina, mas esta é derivada da serotonina sintetizada pelas células
enterocromafins do trato gastrointestinal.
T a n t o a conversão de L-dopa pata d o p a m i n a q u a n t o a d o 5-
h i d r o x i t n p t o f a n o paTa serotonina são catalisadas pela L-descarbo-
xilase dos a m i n o á c i d o s aromáticos (Figura 26-2), u m a enzima
c o m u m a extensa d i s t r i b u i ç ã o t e c i d u a l e ampla especificidade de
substratos para a m i n o á c i d o s aromáticos. A d o p a m i n a e a seroto-
n i n a formadas n o citoplasma pela L-descarboxilase dos a m i n o á -
cidos aromáticos são então transportadas e m grânulos secretóiios
vesiculares o n d e as aminas são concentradas e armazenadas p r o n t a s
para a liberação exocítica c o m o os principais neurotransmissores
dos n e u r ô n i o s d o p a m i n é r g i c o s e serotoninérgicos do sistema
nervoso central. A d o p a m i n a f o r m a d a nos n e u r ô n i o s noradre-
nérgicos e nas células c r o m a f i n s é p o s t e r i o r m e n t e c o n v e r t i d a e m
n o r e p i n e f r i n a pela d o p a m i n a P-hidroxilase, uma enzima c o m
presença exclusiva nos grânulos secretórios. A presença a d i c i o n a l
da f e n i l e t a n o l a m i n a N-metiltransferase nas células c r o m a f i n s da
m e d u l a adrenal acarreta a conversão posterior de n o r e p i n e f r i n a
em e p i n e f r i n a .
A m e l a t o n i n a é sintetizada a p a r t i r da serotonina na g l â n d u l a
pineal, p o r duas enzimas a l t a m e n t e específicas, sendo a p r i m e i r a
etapa catalisada pela serotonina-N-acetiltransferase e a segunda,
pela h i d r o x m d o l - O - m e t i l t r a n s f e r a s e .
Armazenamento e Liberação
As m o n o a m i n a s armazenadas nos grânulos secretórios existem
e m u m e q u i l í b r i o altamente d i n â m i c o c o m o citoplasma circun-
dante, c o m o extravasamento passivo de m o n o a m i n a s para o
citoplasma sendo c o n t r a b a l a n ç a d o pelo transporte i n t e r i o r ativo
sob o c o n t r o l e dos transportadores vesiculares de m o n o a m i n a s
(Figura 26-3)- 1 A s m o n o a m i n a s c o m p a r t i l h a m o a m b i e n t e ácido
da matriz dos grânulos secretórios c o m o trifcsfato de adenosina
(ATP), p e p t í d i o s e proteínas, sendo as c r o m o g r a n m a s as mais
conhecidas. A s cromograninas são componentes c o m u n s dos grâ-
n u l o s secretores que c o n t ê m m o n o a m i n a s . Sua presença dissemi-
nada entre os tecidos e n d ó c r i n o s t o r n o u a sua dosagem n o
plasma ú t i l , e m b o r a relativamente inespecífica, c o m o u m marca-
d o r de t u m o r e s n e u r o e n d ó c r i n o s ( C a p í t u l o 20).
As m o n o a m i n a s são liberadas das vesículas secretórias p a r a o
espaço extracelular pelo processo de exocitose, que é e s t i m u l a d o
p o r u m i n f l u x o de cálcio, p r i m a r i a m e n t e c o n t r o l a d o nos n e u r ô -
nios pela despolarização de m e m b r a n a mediada pelo i m p u l s o
nervoso e nas células da m e d u l a adrenal pela a c e t i l c o l i n a libe-
rada pelos nervos da inervação esplâncmca. A liberação n e u r o n a l
t a m b é m p o d e ocorrer através de processos não-exocíticos inde-
pendentes de cálcio q u e envolvem u m a u m e n t o da perda de
m o n o a m i n a s pelas vesículas de armazenamento para o citoplasma
e a reversão d o t r a n s p o r t e n o r m a l , m e d i a d o p o r t r a n s p o r t a d o r ,
de m o n o a m i n a s para o i n t e r i o r para u m transporte para o exte-
r i o r , para o a m b i e n t e extracelular. Exemplos desse processo i n c l u e m
a liberação de catecolaminas i n d u z i d a pela t i r a m i n a e pela anfe-
tamina.
Captação e Metabolismo
U m a vez que as enzimas responsáveis pelo m e t a b o l i s m o das cate-
colaminas 1 possuem localizações intracelulares, o m e c a n i s m o pri-
m á r i o l i m i t a d o r da duração da ação das catecolaminas n o espaço
i n t r a c e l u l a r é a captação p o r t r a n s p o r t e ativo (Figura 26-3). A
captação é f a c i l i t a d a p o r t r a n s p o r t a d o r e s q u e p e r t e n c e m a duas
f a m í l i a s de pr oteínas c o m localizações p r i n c i p a l m e n t e n e u r o -
nais e e x t r a n e u r o n a i s . Os t r a n s p o r t a d o r e s n e u r o n a i s de m o n o -
aminas o f e r e c e m o p r i n c i p a l m e c a n i s m o para a r á p i d a t e r m i n a -
Catecolaminas e Serotonina CAPÍTULO 26 475
Corrente sanguínea
Terminação
nervosa simpática
- * DHPG
L-DOPA
NE
NMN
- • m h p g
Célula extra neuronal
Figura 26-3 D i a g r a m a esquemático i l u s t r a n d o a d i n â m i c a da
síntese, liberação exocítica (RJ, Te captação n e u r o n a l ( N U ) , captação
e x t r a n e u r o n a l (EU), extravasamento vesicular (VL), seqüestro vesicular
(VS) e m e t a b o l i s m o da n o r e p i n e f r i n a ( N E ) nas terminações nervosas
simpáticas em relação c o m o tecido e x t r a n e u r o n a l e a c o r r e n t e
sanguínea. A s m a g n i t u d e s relativas dos diversos processos estão
refletidas n o t a m a n h o das setas. T H , T i r o s i n a hidroxilase; M A O ,
m o n o a m i n a oxidase; C O M T catecol-O-metiitrans/erase, TYR, t i r o s i n a , L -
dopa, 3 , 4 - d i i d r o x i f e n i I a l a n i n a ; DA, d o p a m i n a ; D H P G , 3,4-
diidroxifenilglicol; N M N , normetanefrma; M H P G ,
3 - m etox i-4-hi dr o x i fe n i Igli co 1.
cão d o s i n a l da transmissão n e u r o n a l , e n q u a n t o os t r a n s p o r t a -
dores das localizações e x t r a n e u r o n a i s são mais i m p o r t a n t e s para
a l i m i t a ç ã o da disseminação d o s i n a l e pela d e p u r a ç ã o das
catecolaminas da c o r r e n t e sanguínea. Para a n o r e p i n e f r i n a libe-
rada pelos nervos simpáticos, cerca de 9 0 % são r e m o v i d o s de
v o l t a para os nervos pela captação n e u r o n a l , 5 % são r e m o v i d o s
p o r captação e x t r a n e u r o n a l e 5% escapam desses processos para
e n t r a r e m na c o r r e n t e sanguínea. A o c o n t r á r i o , para a epine-
f r i n a l i b e r a d a d i r e t a m e n t e na c o r r e n t e sanguínea pelas adre-
nais, cerca de 9 0 % são r e m o v i d o s pela captação e x t r a n e u r o n a l
de m o n o a m i n a s .
A l é m da t e r m i n a ç ã o das ações das m o n o a m i n a s liberadas, os
transportadores de m o n o a m i n a s da m e m b r a n a plasmática fun-
c i o n a m e m seqüência c o m os transportadores vesiculares de
m o n o a m i n a s para reciclar as catecolaminas para u m a nova libe-
ração {Figura 26-3). Desse m o d o , a m a i o r parte da n o r e p i n e f r i n a
liberada e recapturada pelos nervos simpáticos é seqüestrada de
volta para o i n t e r i o r dos grânulos secretórios pelos t ransport ado-
res vesiculares de m o n o a m i n a s , r e d u z i n d o , assim, a necessidade
de síntese de novos transmissores. Os transportadores de m o n o -
aminas da m e m b r a n a plasmática t a m b é m f u n c i o n a m c o m o p a r t e
dos sistemas de metabolização, exigindo ações adicionais de enzimas
para a inativação reversível das a m i n a s liberadas.
As catecolaminas s o f r e m metabolização através de m ú l t i p l a s
vias que e n v o l v e m séries diferenciadas de diversas enzimas, c o m
476 PARTE IV Analitos

expressões diferenciadas nas variadas células e tecidos (Figura NE E

2 6 4 ) . 1 A m a i o r parte d o m e t a b o l i s m o acontece d e n t r o das mesmas
células o n d e as catecolaminas são sintetizadas, sendo a sua
m a i o r i a d e p e n d e n t e do extravasamento de aminas dos grânulos
secretórios para o citoplasma. N o s nervos simpáticos, a presença
da m o n o a m i n a oxidase ( M A O ) acarreta a conversão de norepi-
Nen'os Tecidos Células
n e f r i n a a 3 , 4 - d i i d r o x i f e n i l g l i c o l ( D H P G ) . O D H P G é, e n t ã o , em extraneuronais cromafins adrenais
simpáticos
grande parte metabolizado pela catecol-O-metiltransferase ( C O M T ) ,
em tecidos extraneuronais, a 3-metoxi«4-hidroxifenílglicol ( M H P G ) . MAO COMT COMT
O ácido v a n i l i l m a n d é l i c o ( V M A ) , o p r i n c i p a l p r o d u t o f i n a l d o I t + *
m e t a b o l i s m o da e p i n e f r i n a e da n o r e p i n e f r i n a , é p r o d u z i d o quase DHPG MN
q u e exclusivamente n o fígado. Esta p r o d u ç ã o é d e p e n d e n t e da
localização hepática da álcool-desidrogenase, u m a enzima neces-
sária para a conversão de M H P G a V M A . COMT
Nas células c r o m a f i n s adrenais, a presença a d i c i o n a l de C O M T
acarreta a metabolização da n o r e p i n e f r i n a à m e t a n e f r i n a (Figura
26-4). 1 U m a vez que a via i n t r a n e u r o n a l de desaminação predo-
m i n a e m m u i t o sobre a via e x t r a n e u r o n a l de O-metilação, a
n o r m e t a n e f r i n a e a m e t a n e f r i n a representam p r o d u t o s relativa-
m e n t e secundários d o m e t a b o l i s m o das catecolaminas. E m con-
SULT1A3 SULT1A3
seqüência, a m e d u l a adrenal representa a ú n i c a grande f o n t e
ADH IntasUnos
tecidual de n o r m e t a n e f r i n a e m e t a n e f r i n a , sendo responsável p o r
2 4 % a 4 0 % da p r i m e i r a e 9 0 % da segunda. A m e t a n e f r i n a e a + *
n o r m e t a n e f r i n a produzidas pela m e d u l a adrenal o u p o r tecidos NMN-SO 4
VMA MHPG-SO, MN-S04
extraneuronais — a p r i m e i r a a p a r t i r das catecolaminas q u e extra-
vasam dos grânulos secretórios, e a segunda de catecolaminas
liberadas de fontes simpático-adrenais — p o d e m ser desaminadas
para M H P G e então convertidas para V M A no fígado o u p o d e
ser sulfato-conjugado p o r u m a enzima sulfotransferase p r i n c i p a l - Depuração circulatória pelos rins
m e n t e expressa pelos tecidos gastrointestinais.
A s e r o t o n i n a não é u m substrato para a C O M T e segue vias
mais simples de metabolização d o que aquelas das catecolaminas.
Excreção urinária
A s e r o t o n i n a é desaminada a ácido 5 - h i d r o x ü n d o lacético (5-
H 1 A A ) , o p r i n c i p a l p r o d u t o de excreção u r i n á r i a do metabo-
lismo da s e r o t o n i n a . F i g u r a 2 6 - 4 Diagrama esquemático exibindo as principais vias do
metabolismo da norepinefrina e epinefrina derivadas de fontes
FISIOLOGIA DOS SISTEMAS simpaticoneuronais e adrenomedulares. A desaminação nos nervos
CATECOLAMINÉRGICOS E simpáticos (rosa) é a principal via do metabolismo das catecolaminas e
SEROTONINÉRGICOS envolve a desaminação intraneuronal da norepinefrina que extravasa dos
As catecolaminas e a serotonina regulam eventos fisiológicos ao grânulos de armazenamento ou da norepinefrina recapturada após a
nível celular através da interação c o m famílias de receptores de super- liberação pelos nervos simpáticos. O metabolismo nas células cromafins
fície celular. A n o r e p i n e f r i n a e a epinefrina atuam sobre duas adrenais (preto) envolve a O-metilação das catecolaminas que extravasam
grandes classes de receptores adrenérgicos, as famílias de adreno- dos grânulos de armazenamento para o citoplasma das células da
ceptores a e f}. 4 A d o p a m i n a t r a n s m i t e sinais p r i m a r i a m e n t e medula adrenal. A v i a extraneuronal (vermelbodaro) constitui uma via
através da interação c o m u m a ampla f a m í l i a de receptores dopa- relativamente secundária do metabolismo das catecolaminas liberadas
minérgicos. U m a família a i n d a m a i o r de subtipos de receptores dos nervos simpáticos ou da medula adrenal, mas é importante para o
serotoninérgicos f o i i d e n t i f i c a d a através de técnicas histológicas e processamento ulterior dos metabólitos produzidos pelos nervos
moleculares. O s principais efeitos fisiológicos das catecolaminas e simpáticos e células cromafins. As três metanefrinas produzidas pelos
da serotonina são explicados, e m parte, p o r essas diversas intera- tecidos extraneuronais das células cromafins adrenais são, mais adiante,
ções c o m receptores q u e o c o r r e m e m localizações função-específi- metabolizadas por desaminação ou por conjugação a sulfatos. NE,
cas p o r toda vasculatura e sistemas orgânicos do c o r p o . Norepinefrina; E, epinefrina; DHPG, 3,4-díidroxifenilglicol; MN,
metanefrina; NMN, normetanefrina; MHPG, 3-metoxi-4-
Sistema Nervoso Central hidroxifenilglicol; VMA, ácido vanililmandélico, MHPG-SO^, sulfato de
N o r e p i n e f r i n a , d o p a m i n a e serotonina são produzidas, p r i m a r i a - 3-metoxi-4-hidroxifenilglicol, NMN-SO^, sulfato de normetanefrina; MN-
mente, e m regiões do t r o n c o encefálico p o r n e u r ó n i o s c o m pro- SO4, sulfato de metanefrina; MAO, monoamina oxidase; COMT, catecol-
jeções para outras áreas d o cérebro e da m e d u l a espinal. 14 Cerca O-metiltransferase, ADH, álcool desidrogenase, SL/LTIA3,
da metade da n o r e p i n e f r i n a d o cérebro é p r o d u z i d a e m neurô- fenolsulfotransferase tipo 1A3.
nios p r o d u t o r e s de n o r e p i n e f r i n a na porção i n f e r i o r do t r o n c o
encefálico, q u e e n v i a m projeções axonais difusas p o r t o d o o
cérebro, até o c ó r t e x cerebral. Eles t a m b é m env i am fibras descen-
dentes para a m e d u l a espinal, o n d e estas estabelecem sinapses
c o m n e u r ô n i o s simpáticos pré-ganglionares q u e se c o m u n i c a m
c o m o sistema nervoso simpático periférico. Os n e u r ô n i o s pro-
dutores de n o r e p i n e f r i n a d o t r o n c o encefálico p a r t i c i p a m da

regulação da atividade do sistema nervoso simpático e do estado
geral de atenção e vigilância.
A d o p a m i n a produzida nos neurônios dopaminérgicos, que
são responsáveis p o r mais da metade de toda a p r o d u ç ã o de
catecolaminas do cérebro, possui funções e exibe distribuições
que são notavelmente diferentes daquelas da n o r e p i n e f r i n a . A
d o p a m i n a n o cérebro i n f l u e n c i a o c o m p o r t a m e n t o de busca de
gratificação, sendo i m p o r t a n t e para a iniciação e m a n u t e n ç ã o do
m o v i m e n t o . Os distúrbios da produção e liberação de d o p a m i n a
n o cérebro estão, p o r t a n t o , envolvidos em estados de dependên-
cia a drogas e são centrais n o distúrbio do m o v i m e n t o que carac-
teriza a doença de Parkinson. A neurotransmissão da d o p a m i n a
t a m b é m está envolvida n o processamento dos sinais sensórios e
na regulação da liberação h o r m o n a l . Os neurônios d o p a m i n é r -
gicos da retma e do b u l b o o l f a t ó r i o possuem projeções ultracur-
tas que t r a n s m i t e m sinais d e n t r o desses centros neuronais para
a visão e o olfato. Os n e u r ô n i o s dopaminérgicos n o h i p o t á l a m o
possuem influências regulatórias sobre a liberação de diversos
h o r m ô n i o s da hipófise.
A serotonina, assim como a n o r e p i n e f r i n a , é p r o d u z i d a por
pequenos grupamentos de n e u r ô n i o s em regiões d o t r o n c o ence-
fálico, mas serve a u m a diferente gama de funções c o m p o r t a m e n -
tais e fisiológicas. Os processos fisiológicos e comportamentais
influenciados p o r esse sistema serotoninérgico incluem a m e m ó r i a ,
aprendizado, c o m p o r t a m e n t o alimentar, padrões de sono, ter-
moTregulação, modulação da dor, função cardiovascular e regu-
lação h i p o t a l â m i c a dos h o r m ô n i o s hipofisários.
Sistema Nervoso Simpático
A transmissão nervosa simpática opera abaixo do nível da cons-
ciência n o controle da função fisiológica de vários órgãos e tecidos
corporais (Figura 26-5). 4 O sistema nervoso simpático desempe-
n h a u m papel p a r t i c u l a r m e n t e i m p o r t a n t e na regulação da
função cardiovascular e m resposta ao estresse postural, ao d o exer-
cício físico, ao térmico e ao mental. C o m a ativação simpática, a
freqüência cardíaca é aumentada, as arteríolas periféricas sofrem
constrição, as arteríolas esqueléticas se d i l a t a m e a pressão san-
guínea se eleva. Os sinais simpáticos trabalham e m e q u i l í b r i o
c o m a porção parassimpática do sistema nervoso a u t ô n o m o a f i m
de manter u m ambiente i n t e r n o estável.
Os sinais eferentes o u aferentes do sistema nervoso central
são transmitidos através de n e u r ô n i o s simpáticos colinérgicos
pré-ganglionares, que saem da medula espinal e convergem para
gânglios simpáticos ao longo da coluna espinal ou para gânglios
viscerais (Figura 26-5). Os ramos terminais das fibras pós-ganglio-
nares que se p r o j e t a m desses gânglios para órgãos-alvo possuem
varicosidades que f o r m a m u m rico terreno de plexos para o
contato sináptico c o m u m grande n ú m e r o de células efetoras e m
glândulas e fibras musculares. A maioria dos nervos simpáticos
pós-ganglionares libera n o r e p i n e f r i n a c o m o o seu neurotransmis-
sor. E m localizações limitadas, as terminações dos nervos simpá-
ticos l i b e r a m acetilcolina. As fibras simpáticas que l i b e r a m ace-
tilcolina i n e r v a m as glândulas sudoríparas e a medula adrenal,
esta ú l t i m a estimulando a liberação de epinefrina pelas células
cromafins.
A n o r e p i n e f r i n a plasmática e a u r i n á r i a são p r i n c i p a l m e n t e
derivadas de n e u r ô n i o s simpáticos pós-ganglionares c o m pouca
c o n t r i b u i ç ã o d o sistema nervoso central o u da liberação h o r m o -
nal pela m e d u l a adrenal. D e v i d o a processos intervenientes neu-
ronais e extraneuronais de remoção, a quantidade de norepine-
f r i n a que escapa para a corrente sanguínea representa menos de
10% da n o r e p i n e f r i n a total liberada pelos nervos simpáticos.
Alterações da liberação e da concentração plasmática da norepi-
nefr ina o c o r r e m e m resposta a estados fisiológicos e patológicos.
Catecolaminas e Serotonina CAPÍTULO 26 477
Exercício, alimentação excessiva, baixa ingesta de sal, posição
ereta, estresse m e n t a l e o envelhecimento a u m e n t a m a descarga
simpática. Concentrações plasmáticas aumentadas de norepine-
f r i n a t a m b é m são encontradas em distúrbios c o m o insuficiência
cardíaca, hipertensão e depressão.
Sistema Medular Adrenal
As glândulas adrenais humanas r e c o b r e m os pólos superiores dos
rins. Cada glândula consiste em u m córtex externo e u m a f i n a
medula central interna c o n t e n d o células cromafins. U m traço
característico das células cromafins medulares adrenais é a pre-
sença de numerosos grânulos de armazenamento de catecolami-
nas. Esses grânulos se t o r n a m acastanhados q u a n d o expostos às
soluções de b i c r o m a t o de potássio, n i t r a t o de prata amoniacal ou
tetróxido de ósmio devido à oxidação e polimerização da epine-
f r i n a e da n o r e p i n e f r i n a . Este processo é conhecido c o m o "reação
c r o m a f i m " , de onde v ê m os termos células cromafins e grânulos
cromafins.
C o n q u a n t o seja f r e q ü e n t e m e n t e considerada u m a parte d o
sistema nervoso simpático, a m e d u l a adrenal produz e secreta
u m a catecolamina diferente, a e p i n e f r i n a , c o m funções diferen-
tes daquelas da n o r e p i n e f r i n a secretada pelos nervos simpáticos.
A m e d u l a adrenal e os nervos simpáticos t a m b é m são regulados
separadamente, f r e q ü e n t e m e n t e em direções divergentes, e m
resposta a diferentes formas de estresse. A epinef ri n a é secretada
pelas células cromafins adrenais d i r e t a m e n t e na corrente sanguí-
nea para agir sobre células distantes dos locais de liberação. A
e p i n e f r i n a e a n o r e p i n e f r i n a p o s s u e m u m a p o t ê n c i a de efeito
c o i n c i d e n t e , mas t a m b é m d i f e r e n t e sobre os adrenoceptores a
e |3. A p r o x i m i d a d e entre os locais de liberação da n o r e p i n e -
f r i n a e da e p i n e f r i n a e os adrenoceptores t a m b é m d e t e r m i n a
diferenças nas respostas mediadas pelo a d r e n o c e p t o r às duas
catecolaminas. D e v i d o a esses fatores, a e p i n e f r i n a exerce os
seus efeitos e m populações de adrenoceptores diferentes daque-
las da n o r e p i n e f r i n a A e p i n e f r i n a liberada pelas glândulas
adrenais é mais i m p o r t a n t e c o m o u m agente m e t a b ó l i c o do
que c o m o u m h o r m ô n i o r e g u l a d o r h e m o d i n â m i c o . E m parti-
cular, a e p i n e f r i n a estimula a lipólise, a cetogênese, a termogê-
nese e a glicólise, elevando a glicose plasmática através d o estí-
m u l o à glicogenólise e à gliconeogênese. A e p i n e f r i n a t a m b é m
possui potentes efeitos sobre a f u n ç ã o p u l m o n a r , p r o v o c a n d o a
dilatação das vias aéreas.
Sistema Dopaminérgico Periférico
A d o p a m i n a geralmente é encarada como u m neurotransmissor
cerebral ou c o m o u m i n t e r m e d i á r i o na produção de norepinefrina
e epinefrina nos tecidos periféricos. A contribuição do cérebro para
as concentrações plasmáticas e excreção urinária de metabólitos
da dopamina é, c o n t u d o , relativamente secundária, e a d o p a m i n a
produzida pelos nervos simpáticos e pela medula adrenal é prin-
cipalmente convertida em norepinefrina. A m a i o r parte da dopa-
m i n a e dos metabólitos dopaminérgicos circulantes e urinários é,
portanto, derivada de outras fontes (Figura 26-6)-1
Nos rins, a d o p a m i n a f u n c i o n a como u m a substância efetora
autócrma ou parácrina que c o n t r i b u i para a regulação da excreção
de sódio. A o contrário dos sistemas catecolaminérgicos neuronais,
a produção de d o p a m i n a nos rins é, em grande parte, indepen-
dente da síntese local de L-dopa pela tirosina hidroxilase. A pro-
dução de d o p a m i n a nos rins depende, principalmente, da capta-
ção de L-dopa da circulação e da sua conversão em d o p a m i n a pela
descatboxila.se dos aminoácidos aromáticos (Figura 26-6). Por-
tanto, a maior parte da d o p a m i n a excretada na u r i n a deriva da
captação renal de descarboxilação da L-dopa circulante.
478 PARTE IV Analitos

Cérebro
Cabeça e pescoço,
p. ex., pupilas,
glândulas salivares,
vasos intracranianos ^
e faciais

Trato respiratório}'" ^ __ C1 -
e pulmões Porção

— 1
cervical da
medula
Coração <J espinal

Sangue periférico ..
vasos
————
f
Gânglio
/
/
Parçáo
torácica da
medula
- ^ celíaco
Estomago, v espinal
fígado, pâncreas '' —

Gân
Medula ?[io
mesenterico
adrenal
superior

—
Porção
Gânglio mesentérico
Rins e lombar da
superior
intestinos medula
espinal

Cólon
pélvico
Porção
sacra da
Gânglios medula
• \ yX hipogástricos espinal
Bexiga urinária e
órgãos genitais

Órgaos- Gânglios Medula

aivo simpáticos espinal

Fibras simpáticas pré-ganglionares

(neurotransmissor-acetilcolira)

Fibras simpáticas pós-ganglionares

(neurotransmissor-norepinefrina) / - •

Figura 26-5 Diagrama esquemático da divisão simpática d o sistema nervoso a u t ô n o m o . As fibras

colinérgicas pré-ganglionaras (linlizis sólidas) da medula espinal se projetam para a cadeia simpática paravertebral,
gânglios periféricos viscerais e medula adrenal, e n q u a n t o fibras noradrenérgicas pós-ganglionares (Imfws tracejadas)
se projetam das gânglios simpáticos para os órgãos-alvo inervados. Cerca de 5% a 10% da norepinefrina liberada
pelos nervos simpáticos que m e r v a m os órgãos-alvo escapam das captações neuronal e extraneuronal para
adentrai a corrente sanguínea. Isso está e m contraste c o m a epinefrina, que funciona c o m o u m h o r m ô n i o
circulante, sendo liberada diretamente pela me d u l a adrenal para a corrente sanguínea. A maior parte das
catecolaminas que entram na corrente sanguínea é removida pelo processo extraneuronal de captação, s e n d o
metabolizada (p. ex., n o fígado) de m o d o que s o m e n t e pequenas proporções sejam excretadas pela unna.

Traio gastrointestinal,
fontes endógenas
e dieta
Dieta, nervos
.>75% simpáticos, outras
ir rente
nguínea
1
DOPA
- y
f
i _
DOPA
L-AADO |
DA
V algumas regiões intestinais. A transmissão n e u r a l d e n t r o d o E N S
DA-SO4 DA
3 |xmol/24h
Figura 26-6 D i a g r a m a esquemático i l u s t r a n d o as p r i n c i p a i s fontes
de d o p a m i n a ( D A ) e dos p r i n c i p a i s m e t a b ó l i t o s da d o p a m i n a — ácido
h o m o v a n í l i c o ( H V A ) , ácido d i i d r o f e n i l a c é t i c o ( D O P A C ) e sulfato de
d o p a m i n a (DA-SO^) — n o plasma e na u r i n a . O cérebro t e m
c o n t r i b u i ç ã o r e l a t i v a m e n t e secundária, e n q u a n t o a d o p a m i n a sintetizada
n o trato gastrointestinal o u derivada da dieta c o n t r i b u i s u b s t a n c i a l m e n t e
para f o r m a ç ã o dos m e t a b ó l i t o s da d o p a m i n a na corrente sanguinea e na
u r i n a . Isso contrasta c o m a d o p a m i n a livre excretada na UTina, q u e é
derivada quase i n t e i r a m e n t e da extração renal da diidTOxiíenilalanina
c i r c u l a n t e ( D O P A ) e da descarboxilação local para d o p a m i n a pela L -
descarboxilase dos a m i n o á c i d o s aromáticos ( L - A A D C )
E m b o r a os rins representem a p r i n c i p a l f o n t e de d o p a m i n a
l i v r e u r i n á r i a , esta fonte não é responsável pelas quantidades
m u i t o maiores de m e t a b ó l i t o s excretados d a d o p a m i n a , tais
c o m o o ácido homovanílico (HVA.) e o sulfato de d o p a m i n a . Pro-
porções substanciais desses m e t a b ó l i t o s são produzidas n o trato
gastrointestinal, o n d e a d o p a m i n a parece f u n c i o n a r c o m o u m
n e u r o m o d u l a d o r entérico o u c o m o u m a substância p a r á c n n a o u
a u t ó c r i n a . Todavia, ao c o n t r á r i o dos rins, o n d e a d o p a m i n a é
p r o d u z i d a p r i n c i p a l m e n t e a p a r t i r da L-dopa circulante, a p r o d u -
ção de d o p a m i n a n o t r a t o gastrointestinal exige a presença da
tirosina hidroxilase o u de outras fontes de L-dopa.
O c o n s u m o de a l i m e n t o s eleva as concentrações de L-dopa,
de d o p a m i n a e dos m e t a b ó l i t o s da d o p a m i n a , p a r t i c u l a r m e n t e o
sulfato de d o p a m i n a , i n d i c a n d o q u e os constituintes dietéticos
t a m b é m p o d e m representar uma i m p o r t a n t e f o n t e de d o p a m i n a
periférica (Figura 26-6). A t u a l m e n t e está claro que o sulfato de
d o p a m i n a é p r i n c i p a l m e n t e p r o d u z i d o p e l o trato gastrointestinal
a p a r t i r da d o p a m i n a dietética ou da l o c a l m e n t e sintetizada. Isso
c compatível c o m os achados de que o trato gastrointestinal c o n t é m
elevadas concentrações da enzima suífotransferase específica res-
ponsável pela conjugação das catecolaminas e dos m e t a b ó l i t o s
c a t e c o l a m í n i c o s c o m sulfatos.
Sistema Nervoso Entérico
O sistema nervoso e n t é r i c o (ENS) é d e f i n i d o c o m o u m sistema
i n d e p e n d e n t e e i n t e g r a d o de n e u r ó n i o s e células de s u p o r t e
localizado n o t i a t o gastrointestinal, vesícula b i l i a r e pâncreas. 3 O
E N S é c o m p o s t o p o r duas redes de plexos de n e u r ó n i o s i n t r í n -
secos, o plexo mesentérico e o plexo submucoso. A m b o s estão
e m b u t i d o s na parede d o i n t e s t i n o e se estendem d o esôfago ao
Catecolaminas e Serotonina CAPÍTULO 26 479
ânus. Essas redes c o n t ê m mais de 100 m i l h õ e s de n e u r ó n i o s
sensórios, i n t e r n e u r ô n i o s e n e u r ô n i o s motores. O plexo mesen-
térico situa-se entre as camadas l o n g i t u d i n a l e circular do m ú s c u l o
intestinal liso e c o n t r o l a os m o v i m e n t o s propulsivos (peristalse).
O plexo s u b m u c o s o i n e r v a o e p i t é h o glandular, as células endó-
crinas intestinais e os vasos sanguíneos submucosos. Esta rede
sente o a m b i e n t e n o i n t e r i o r d o l ú m e n , regula o f l u x o sanguíneo
local e c o n t r o l a a secreção das células epiteliais.
O E N S está conectado ao sistema nervoso central através de
n e u r ó n i o s parassimpáticos extrínsecos e simpáticos motores, assim
c o m o por n e u r ó n i o s sensórios espinais e vagais. Através dessas
conexões b i d i r e c i o n a i s , o E N S p o d e ser m o n i t o r a d o e m o d i f i -
cado. 3 A despeito da presença dessas conexões nervosas extrín-
secas, o E N S t a m b é m p o d e f u n c i o n a r de f o r m a a u t ó n o m a e m
é c o n t r o l a d a p o r u m a g r a n d e v a r i e d a d e de n e u r o t r a n s m i s s o -
res e de p e p t í d i o s n e u r o m o d u l a d o r e s , tais c o m o a s e r o t o n i n a ,
2 n o r e p i n e f r i n a , acetilcolina, A T P e ó x i d o n í t r i c o . A s e r o t o n i n a
atua c o m o u m a m o l é c u l a p a r á c r i n a local, p a r t i c i p a n d o da trans-
dução .sensória da mucosa. M a i s de 9 5 % da s e r o t o n i n a c o r p o r a l
é p r o d u z i d a n o i n t e r i o r d o trato gastrointestinal, c o m a m a i o r
p a r t e sendo sintetizada e armazenada nas células enterocroma-
fins da mucosa i n t e s t i n a l . N e u r ó n i o s sensórios intrínsecos, ati-
vados pela s e r o t o n i n a , e s t i m u l a m o r e f l e x o peristáltico e a secre-
ção, e n q u a n t o os n e u r ô n i o s sensórios extrínsecos i n i c i a m sensa-
ções intestinais, tais c o m o náusea, v ô m i t o s , d o r e distensão
a b d o m i n a i s . A s ações parácrinas da s e r o t o n i n a são finalizadas
através da captação para o i n t e r i o r das células epiteliais p e l o
m e s m o t r a n s p o r t a d o r de s e r o t o n i n a u t i l i z a d o pelos n e u r ô n i o s
serotoninérgicos.
APLICAÇÕES CLÍNICAS
A dosagem das catecolaminas, da s e r o t o n i n a e dos seus metabó-
litos é usada nas investigações de u m a variedade de processos
fisiopatológicos, mas as dosagens laboratoriais clínicas das aminas
e dos seus m e t a b ó l i t o s são direcionadas, p r i n c i p a l m e n t e , para o
diagnóstico dos tumores n e u r o e n d ó c r i n o s . Os tumores n e u r o e n -
d ó c r i n o s p r o d u t o r e s de catecolaminas i n c l u e m f e o c r o m o c i t o m a s ,
paragangliomas e neuroblastomas, e n q u a n t o os tumores p r o d u -
tores de s e r o t o n i n a são t i p i c a m e n t e carcinóides.
Feocromocitoma
Os tumores p r o d u t o r e s de catecolaminas que d e r i v a m de células
c r o m a f i n s p o d e m o c o r r e r t a n t o n o i n t e r i o r das glândulas adre-
nais, o n d e são d e n o m i n a d o s f e o c r o m o c i t o r n a s , c o m o e m locais
extra-adienais, o n d e são d e n o m i n a d o s paragangliomas.' Os para-
gangliomas derivados de tecidos c r o m a f i n s simpáticos extra-adre-
nais geralmente p r o d u z e m quantidades significativas de catecola-
minas — e t a m b é m são c o m u m e n t e d e n o m i n a d o s feocromocito-
mas extra-adrenais.
A presença de u m f e o c r o m o c i t o m a geralmente é suspeitada
d e v i d o aos sinais e sintomas que r e f l e t e m os efeitos biológicos
das catecolaminas liberadas pelo t u m o r . A hipertensão é o sinal
mais c o m u m , p o d e n d o ser m a n t i d a o u paroxística. Os sintomas
i n c l u e m cefaléia, palpitações, diaforese (sudorese excessiva), palidez,
náusea, crises de ansiedade e fraqueza generalizada. 8
Os feocromocitomas são raros, o c o r r e n d o e m menos de 0 , 2 %
dos pacientes c o m hipertensão. C o n t u d o , e m v i r t u d e da elevada
prevalência da hipertensão e d o a m p l o espectro de sintomas pro-
duzidos pelos f e o c r o m o c i t o m a s , m u i t o s dos quais o c o r r e m e m
outras condições clínicas, os f e o c r o m o c i t o m a s deve ser conside-
rados em m u i t o s pacientes c o m e sem hipertensão. Os pacientes
c o m u m alto risco de f e o c r o m o c i t o m a , nos quais os exames
p o d e m ser realizados i n d e p e n d e n t e m e n t e da presença de sinais
480 PARTE IV Analitos
e sintomas, i n c l u e m aqueles c o m u m a história f a m i l i a r o u c o m
u m a h i s t ó r i a prévia de t u m o r , o u c o m o achado i n c i d e n t a l de
u m a massa a d r e n a l d u r a n t e p r o c e d i m e n t o s a b d o m i n a i s r o t i n e i -
ros de imagem. C o n s u l t e o Q u a d r o 26-1 para u m r e s u m o dos
pontos-chave sobre os f e o c r o m o c i t o m a s .
A m a i o r i a dos f e o c r o m o c i t o m a s é esporádica, mas até cerca
de u m q u a r t o possui u m a base hereditária. 1 0 As formas hereditá-
rias dos t u m o r e s são devidas a mutações e m cinco genes causa-
dores i d e n t i f i c a d o s até o m o m e n t o . Os f e o c r o m o c i t o m a s na
neoplasia e n d ó c r i n a m ú l t i p l a d o t i p o 2 r e s u l t a m de mutações n o
proto-oncogene ret. Essas mutações t a m b é m r e s u l t a m e m u m a
predisposição para o câncer m e d u l a r de tireóide e para diversos
o u t r o s tumores o u condições hiperplásicas. N a s í n d r o m e de v o n
H i p p e l - L i n d a u ( V H L ) , mutações familiares específicas n o gene
supressor de t u m o r e s V H L d e t e r m i n a m a variada apresentação
clínica dos t u m o r e s , i n c l u i n d o angiomas retinais, hemangioblas-
tomas d o sistema nervoso central, f e o c r o m o c i t o m a s e t u m o r e s
dos rins, pâncreas e testículos. O s paragangliomas e os feocro-
m o c i t o m a s f a m i l i a i s t a m b é m o c o r r e m s e c u n d a r i a m e n t e a muta-
ções dos genes das s u b u n i d a d e s B e D da succinato desidroge-
nase ( S D H B e S D H D ) . Os f e o c r o m o c i t o m a s t a m b é m o c o r r e m
em cerca de 1 % dos pacientes c o m n e u r o f i b r o m a t o s e d o t i p o 1.
Os exames p e r i ó d i c o s para f e o c r o m o c i t o m a s em pacientes c o m
as três p r i m e i r a s das q u a t r o síndromes familiais acima são atual-
m e n t e r e c o m e n d a d o s c o m o parte da triagem de r o t i n a e d o p l a n o
de vigilância.
I
Q U A D R O 2 6 - 1 | Pontos-Chave dos Feocromocitomas
BIOLOGIA
• Tumores raros, principalmente de células adrenais crcmatins que
produzem, armazenam, metabolizam e secretam catecolaminas,
geralmente com uma predominância da norepinefrina sobre a epinefrina.
• Aqueles que se desenvolvem a partir de tecidos cromafins simpáticos
extra-adrenais — denominados paragangliomas — geralmente produzem
quase exclusivamente norepinefrina e, muito raramente,
predominantemente dopamina.
APRESENTAÇÃO
• Geralmente se suspeita do tumor em virtude dos sinais e sintomas de
excesso de catecolaminas (p. ex., hipertensão, palpitações, cefaláias ou
sudorese excessiva) ou pelo achado incidental de uma massa adrenal
durante os procedimentos de imagem realizados devido a condições
clínicas não-correlacionadas.
• A maioria dos feocromocitomas é benigna; 10% a 15% são malignos.
• Cerca de um quarto dos feocromocitomas possui uma base hereditária,
resultando de mutações de cinco genes.
• Meros de 1% dos pacientes testados por causa de sinais e sintomas
possuem o tumor (baixa prevalência pré-teste), mas a prevalência á mais
elevada entre os pacientes com mutações identificadas dos genes
causadores da doença ou entre aqueles com uma massa adrenal
incidental; portanto, o exame desses pacientes está recomendado
independentemente da presença de sinais e sintomas.
DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO
• 0 diagnóstico bioquímico é baseada na evidência de produção excessiva
de catecolaminas, geralmente determinado a partir de dosagens de
catecolaminas e dos seus metabólitos na urina ou no plasma.
• Uma vez que a secreção das catecolaminas pelos tumores é episódica,
mas o seu metabolismo a metanefrinas no interior dos lumores é
continuo, as dosagens plasmáticas ou urinárias das metanefrinas
fracionadas fornecem testes diagnósticos mais confiáveis para o tumor do
que as dosagens das catecolaminas (metanefrinas aumentadas em > 97%
e catecolaminas em 69% a 92% dos pacientes com feocromocitomas).
E m b o r a p r e d o m i n a n t e m e n t e benignos, cerca de 10% a 15%
dos f e o c r o m o c i t o m a s são m a l i g n o s . O risco de f e o c r o m o c i t o m a s
malignos é m a i o r e m pacientes c o m t u m o r e s extra-adrenais, par-
t i c u l a r m e n t e nos pacientes c o m mutações S D H B . O diagnóstico
do f e o c r o m o c i t o m a m a l i g n o não é possível c o m base nas carac-
terísticas histopatológicas; e m vez disso, depende da evidência de
lesões metastáticas (p. ex., n o fígado, p u l m õ e s , n ó d u l o s linfáticos
e ossos). Todos os pacientes c o m u m a h i s t ó r i a prévia d o t u m o r
estão sob o risco de doença recorrente o u m a l i g n a e deveriam ser
s u b m e t i d o s a u m a triagem p e r i ó d i c a para o t u m o r .
M e s m o se benignos, os f e o c r o m o c i t o m a s e os paragangliomas
p r o d u t o r e s de catecolaminas são t u m o r e s traiçoeiros q u e quase
invariavelmente provocarão complicações cardiovasculares devas-
tadoras e a m o r t e , se não i d e n t i f i c a d o s e adequadamente trata-
dos. 0 Desse m o d o , u m a vez q u e se suspeite de u m t u m o r desses,
é i m p e r a t i v o que exames b i o q u í m i c o s apropriados sejam empre-
gados para u m diagnóstico preciso. O diagnóstico b i o q u í m i c o d o
f e o c r o m o c i t o m a t e m , t r a d i c i o n a l m e n t e , se apoiado nas dosagens
das catecolaminas urinárias, metanefrinas e V M A . 1 2 A m a i o r i a
dos pacientes c o m h i p e r t e n s ã o e sintomas provocados p o r feo-
c r o m o c i t o m a s ativos apresenta grandes aumentos nas suas dosa-
gens, t o r n a n d o o t u m o r r e l a t i v a m e n t e fácil de ser diagnosticado.
Os problemas o c o r r e m naqueles pacientes nos quais a h i p e r t e n -
são é paroxística e que p o d e m apresentar u m a secreção insignifi-
cante de catecolaminas entre os episódios. Os resultados falso-
negativos para os exames são mais c o m u m e n t e encontrados nos
pacientes c o m " f e o c r o m o c i t o m a s silenciosos" nos quais os exames
são realizados não d e v i d o aos sinais e sintomas, mas p o r c o n t a
de u m t u m o r adrenal descoberto i n c i d e n t a l m e n t e ( u m inciden-
taloma), o u c o m o paTte de u m p l a n o de vigilância de r o t i n a para
f e o c r o m o c i t o m a s recorrentes o u hereditários.
U m a vez que a não-descoberta de u m f e o c r o m o c i t o m a p o d e
ter conseqüências fatais, u m a das considerações mais i m p o r t a n -
tes na escolha do exame i n i c i a l é u m alto grau de c o n f i a b i l i d a d e
de q u e o teste venha a fornecer u m resultado p o s i t i v o naquele
raro paciente c o m o t u m o r . C o n t r a r i a m e n t e , isso t a m b é m pro-
p o r c i o n a r á a confiança de q u e u m resultado negativo excluirá o
t u m o r , e v i t a n d o , assim, a necessidade de m ú l t i p l o s o u repetidos
exames b i o q u í m i c o s , o u m e s m o estudos de i m a g e m caros e des-
necessários para descartar o t u m o r . Portanto, exames b i o q u í m i c o s
c o n v e n i e n t e m e n t e sensíveis p e r m a n e c e m a p r i m e i r a escolha na
investigação de u m paciente suspeito de ser p o r t a d o r de u m feo-
cromocitoma.
C o m as considerações acima em m e n t e , o e n c o n t r o de u m
g r u p o de especialistas no P r i m e i r o S i m p ó s i o I n t e r n a c i o n a l sobre
F e o c r o m o c i t o m a realizado e m o u t u b r o de 2 0 0 5 r e c o m e n d o u q u e
os exames b i o q u í m i c o s iniciais para o f e o c r o m o c i t o m a deveriam
i n c l u i r as dosagens da excreção u r i n á r i a o u das concentrações
plasmáticas das metanefrinas fracionadas ( n o r m e t a n e f r i n a e meta-
nefrina). 1 0 A base para a elevada eficácia diagnostica das metane-
frinas fracionadas plasmáticas livres e urinárias é explicada pela
presença nas células medulares adrenais e f e o c r o m o c i t o m a em
células t u m o r a i s de catecol-O-metiltransferase, a enzima q u e
metaboliza as catecolaminas para metanefrinas. Isso contrasta
c o m o n e r v o simpático, que c o n t é m M A O mas não catecol-O-
metiltransferase. U m a vez q u e as catecolaminas são metaboliza-
das p r i n c i p a l m e n t e n o i n t e r i o r dessas células o n d e são sintetiza-
das, a presença de u m f e o c r o m o c i t o m a leva a u m a u m e n t o des-
p r o p o r c i o n a l na p r o d u ç ã o de O m e t i l a d o s , em vez dos metabóli-
tos desaminados. M a i s i m p o r t a n t e , as metanefrinas são produzi-
das c o n t i n u a m e n t e c o m o resultado do c o n t í n u o extravasamento
de catecolaminas dos grânulos c r o m a f i n s de armazenamento para
o citoplasma celular; p o r o u t r o lado, as catecolaminas p o d e m ser
liberadas esporadicamente.

A elevada sensibilidade diagnostica da dosagem plasmática o u
urinária fracionada de normetanefrina e metanefrma t o m a esses
testes a escolha mais adequada para a avaliação inicial de u m
paciente c o m suspeita de feocromocitoma. Os resultados negativos
desses exames praticamente excluem u m feocromocilorna. As exce-
ções i n c l u e m pequenos tumores (< 1 cm) encontrados durante
triagens de rotina de tumores que não sintetizam norepinefrina o u
epinefrina. Os tumores que produzem exclusivamente dopamina
p o d e m não ser descobertos através das dosagens de normetane-
frina, metanefrina e aminas precursoras. Tais tumores, contudo,
p o d e m ser detectados através da dosagem de metoxitiramina plas-
mática o u urinária, o metabólico O-metilado da dopamma. As
dosagens da dopamina plasmática também podem ser úteis, consi-
derando que a dopamina urinária é, em grande parte, derivada de
extração renal e descarboxilação da L-dopa e, conseqüentemente,
proporciona u m teste relativamente insensível e inespecífico para a
detecção de u m t u m o r produtor de dopamina (Figura 26-6).
As elevações das metanefrinas fracionadas plasmáticas o u
urinárias são geralmente altas o suficiente para estabelecer con-
clusivamente a presença da m a i o r i a dos casos de feocromoci-
toma. Todavia, se o paciente apresentar u m t u m o r que produza
u m a pequena quantidade de catecolaminas, os resultados falso-
posítivos p o d e m c o n t i n u a r difíceis de serem distinguidos dos
verdadeiros resultados positivos e exames b i o q u í m i c o s adicionais
são necessários. 10 Antes que os exames bioquímicos sejam inicia-
dos, deve-se considerar a eliminação das possíveis causas de resul-
tados falso-posirivos, Estas p o d e m ser devidas a condições inade-
quadas de coleta das amostras (p. ex., coleta de sangue sem u m
período prévio de 20 m i n u t o s de repouso em decúbito dorsal),
o u a medicamentos
Q u a n d o os exames bioquímicos c o n t i n u a m a produzir resulta-
dos duvidosos, o teste de supressão pela clonidina pode ser ú t i l
para uma ulterior confirmação o u exclusão de u m feocromoci-
toma. C o n f o r m e originalmente apresentado, este teste foi conce-
b i d o para diferenciar os pacientes com elevações das catecolaminas
provocadas por feocromocitomas daqueles com aumentos provo-
cados pela ativação simpática. Através da ativação dos adrenocep-
totes alfa 2 n o cérebro e nas terminações nervosas simpáticas, a
c l o n i d i n a suprime a liberação da norepinefrina pelos nervos sim-
páticos. Conseqüentemente, reduções da norepinefrina plasmática
elevada após a clonidina sugerem ativação simpática, enquanto a
ausência de u m a diminuição sugere u m feocromocitoma. Subse-
qüentemente, o teste também se revelou ú t i l na distinção entre
aumentos da normetanefrina plasmática causados p o r u m feocro-
m o c i t o m a e aqueles provocados por ativação simpática.'
Neuroblastoma
O s neuroblastomas são neoplasias que se o r i g i n a m das células
da crista neural p r i m o r d i a l do sistema nervoso simpático.'' 5 Os
neuroblastomas são quase exclusivamente u m câncer pediátrico,
sendo responsáveis p o r aproximadamente 7 % dos cânceres da
infância, e a malignidade mais c o m u m d o p r i m e i r o ano de vida.
A incidência de neuroblastomas é de, aproximadamente, 10 casos
p o r m i l h ã o de crianças. E m b o r a casos familiais tenham sido des-
critos, a maioria dos neuroblastomas se desenvolve esporadica-
mente. G r a n d e parte destes neuroblastomas é intra-abdominai,
o r i g i n ando-se da glândula adrenal o u do abdome superior. Loca-
lizações menos freqüentes i n c l u e m as regiões do tórax, pescoço,
o u pelve. Cerca de 6 0 % são extra-adrenais. As metástases nos
neuroblastomas disseminados p o d e m envolver a m e d u l a óssea,
os ossos, l m f o n o d o s , fígado e, menos freqüentemente, a pele,
testículos e estruturas intracranianas.
O c o m p o r t a m e n t o b i o l ó g i c o de u m neuroblastoma varia da
regressão e maturação a u m curso agressivo c o m u m resultado
Catecolaminas e Serotonina CAPÍTULO 26 481
desfavorável. 15 O s neuroblastomas são mais notáveis n o que diz
respeito a u m subgrupo de casos com completa regressão o u matu-
ração para g a n g l í o n e u r o m a , u m a neoplasia benigna. A m a i o r i a
dos t u m o r e s c l i n i c a m e n t e diagnosticados, c o n t u d o , é agressiva
e apresenta u m resultado desfavorável. O estágio clínico da
doença (localizada versus disseminada) c o n s t i t u i u m i m p o r t a n t e
fator p r o g n ó s t i c o . O s pacientes c o m estágios precoces mais
localizados da doença, o u os lactentes c o m m e n o s de 1 ano de
idade c o m u m t u m o r p r i m á r i o localizado e disseminação l i m i -
tada à pele, fígado e / o u m e d u l a óssea, são considerados de
m e l h o r p r o g n ó s t i c o do que os o u t r o s estágios. I n f e l i z m e n t e , a
i n c i d ê n c i a global de n e u r o b l a s t o m a metastático n o m o m e n t o
do diagnóstico é de, a p r o x i m a d a m e n t e , 6 0 % e a necessidade de
detecção mais precoce de crianças c o m t u m o r e s de dissemina-
ção progressiva permanece u m desafio diagnóstico. C o n s u l t e o
Q u a d r o 26-2 para u m resumo dos pontos-chave sobre os neu-
roblastomas-
A hipertensão e os sinais e sintomas de excesso de catecola-
minas são raros e m u m neuroblastoma, u m resultado da armaze-
nagem ineficiente de catecolaminas que acarreta a metabolização
intracelular e liberação principalmente como metabólitos inativos.
Os pacientes c o m u m e n t e se apresentam c o m uma massa t u m o r a l
e sinais clínicos dos efeitos compressivos sobre estruturas vizinhas
ou anomalias hematológicas decorrentes d o envolvimento da
medula óssea.
As evidências laboratoriais de u m t u m o r f u n c i o n a l p r o d u t o r
de catecolaminas são importantes na avaliação clínica q u a n d o se
suspeita de u m neuroblastoma. Os padrões de secreção de cate-
colaminas e de metabólitos, n o entanto, p o d e m diferir acentua-
damente entre os pacientes com o t u m o r . As células d o neuro-
blastoma possuem a capacidade de sintetizar d o p a m i n a e norepi-
nefrina, dependendo do seu grau de m a t u r i d a d e metabólica,
I
QUADRO 26-2 Pontos-Chave dos Neuroblastomas
BIOLOGIA
• Tumores que ocorrem quase exclusivamente em crianças e que se
desenvolvem a partir de células da crista neural primitiva do sistema
simpaticoadrenal, sendo cerca de 6G% derivados de tecido simpáiico
extra-adrenal e 40% das adrenais.
• 0 comportamento biológico dos tumores é altamente variável, com regressão
espontânea de alguns tumores, mas a maioria (60%) apresenta um curso
agressivo com doença maligna disseminada e um resultado desfavorável.
APRESENTAÇÃO
• Os reuroblaslomas produzem quantidades variáveis de dopamina e
norepineírina, mas demonstram uma capacidade precária de armazenamento
e liberação das catecolaminas. Conseqüentemente, os tumores raramente
produzem sinais e sintomas de excesso de catecolaminas.
" A suspeita da doença geralmente se baseia na palpação de uma massa,
nas complicações geradas pela ocupação de espaços peio tumor, ou pelos
efeitos do envolvimento da medula óssea.
• As causas hereditárias dos neuroblastomas são raras; a maioria dos
neuroblastomas ocorre esporadicamente.
DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO
• 0 diagnóstico bioquímico é baseado na superprodução de dopamina e
norepinefrina, mas uma vez que os tumores possuem um maquinário para
armazenamento e liberação de catecolaminas insuficientemente
desenvolvido, o diagnóstiGO dependerá, principalmente, das dosagens dos
metabólitos das catecolaminas.
• As dosagens do VMA e do HVA urinários representam os testes mais
amplamente utilizados, mas em um grande estudo prospectivo de triagem
demonstraram detectar somente 73% dos tumores.
482 PARTE IV Analitos
mas, assim c o m o os n e u r ô n i o s simpáticos pós-ganglionares, extra-
vasam f e n i l e t a n o l a m i n a N-metiltransferase e não p r o d u z e m epi-
n e f r i n a . D e v i d o à variabilidade da p r o d u ç ã o e metabolização de
catecolaminas, n ã o há u m marcador confiável ú n i c o da superpro-
dução de catecolaminas; combinações de catecolaminas e meta-
b ó l i t o s são, p o r t a n t o , f r e q ü e n t e m e n t e dosadas na avaliação diag-
nostica do n e u r o b l a s t o m a .
O V M A e o H V A são as determinações mais a m p l a m e n t e
utilizadas para o diagnóstico d o neuroblastoma. A excreção uri-
nária elevada de H V A e de V M A é o resultado da excessiva pro-
dução t u m o r a l de d o p a m i n a e n o r e p i n e f r i n a , respectivamente.
U m a pequena variação d i u r n a da excreção de H V A e de V M A
e u m a correlação positiva entre os testes u r i n á r i o s aleatórios e
os de 24 horas p e r m i t e m o c o n v e n i e n t e emprego de amostras
urinárias aleatórias, c o m resultados expressos c o m o a p r o p o r ç ã o
e n t r e os m e t a b ó l i t o s das catecolaminas e a excreção de creati-
n i n a . U m a s e n s i b i l i d a d e clínica n a faixa de 9 0 % foi descrita para
os exames u r i n á r i o s de H V A e de V M A p o r alguns centros.
O u t r o s , p o r é m , r e l a t a r a m u m a taxa mais baixa de detecção de
n e u r o b l a s t o m a s . E m u m a m p l o p r o g r a m a de triagem p a r a neu-
roblastomas, n o q u a l a p o p u l a ç ã o c o m resultados negativos na
triagem foi rastreada para a o c o r r ê n c i a de n e u r o b l a s t o m a s , u m a
elevação de V M A , H V A , o u ambos os m e t a b ó l i t o s ácidos, detec-
tou-se apenas 7 3 % dos tumores. 1 3 O s pacientes c o m d o e n ç a e m
estágio i n i c i a l apresentam taxa mais elevada de resultados falso-
negativos, e os pr ogr amas de rastreamento geralmente n ã o foram
bem-sucedidos na redução da taxa de n e u r o b l a s t o m a s metastá-
ticos na p o p u l a ç ã o .
Marcadores adicionais da s u p e r p r o d u ç ã o de catecolaminas
foram empregados para m e l h o r a r a detecção b i o q u í m i c a dos neu-
roblastomas. As dosagens plasmáticas de d o p a m i n a e L - d o p a , o
a m i n o á c i d o p r e c u r s o r da d o p a m i n a , t a m b é m p o d e m ter v a l o r
c l i n i c o e p e r m i t i r o uso alternativo do plasma. A dosagem dos
metabólitos O-metilados, especialmente a n o r m e t a n e f r i n a , t a m b é m
foi estudada. Q u a n d o n o r m e t a n e f r i n a , m e t a n e f r i n a , meeoxitira-
mina, dopamina, norepinefrina, V M A e H V A urinários foram
dosados, a sensibilidade clínica para a detecção de neuroblasto-
mas foi de 9 7 % a 100%. M e s m o c o m u m p a i n e l estendido de
dosagens de catecolaminas e m e t a b ó l i t o s , u m a baixa i n c i d ê n c i a
de tumores não-secretores c o n t i n u a sendo i d e n t i f i c a d a e deveria
ser considerada na interpretação do resultado negativo de u m
exame.
N o s n e u r o b l a s t o m a s , o padrão d o m e t a b o l i s m o das cateco-
laminas está associado a i m p o r t a n t e s fatores p r o g n ó s t i c o s b i o l ó -
gicos e genéticos. Taxas mais baixas de excreção de V M A , H V A ,
d o p a m i n a e n o r e p i n e f r i n a são mais f r e q ü e n t e m e n t e e n c o n t r a -
das em lactentes c o m estágios iniciais da doença, o q u e p o d e
explicar a s e n s i b i l i d a d e clínica i n i c i a l mais baixa às dosagens de
V M A e ao H V A descrita em pacientes c o m n e u r o b l a s t o m a s e m
estágios iniciais. Q u a n t i d a d e s elevadas de catecolaminas e dos
seus m e t a b ó l i t o s na u r i n a , p o r o u t r o lado, estão relacionadas a
u m c o m p o r t a m e n t o t u m o r a l agressivo. Nos n e u r o b l a s t o m a s , a
excreção relativa das catecolaminas e dos seus metabólitos t a m b é m
p o d e i n d i c a r u m resultado desfavorável. Padrões m e t a b ó l i c o s
imaturos f o r a m observados n o tecido t u m o r a l d o n e u r o b l a s t o m a ,
baseados na relação entre a excreção de d o p a m i n a ou H V A e a
de n o r e p i n e f r i n a o u V M A . U m a elevada p r o p o r ç ã o H V A / V M A ,
d o p a m i n a / V M A o u d o p a m i n a / n o r e p i n e f r i n a indica deficiência
relativa da b e t a - h i d r o x i l a ç ã o c o m u m a r e d u ç ã o da conversão
nas células t u m o r a i s da d o p a m i n a para a n o r e p i n e f r i n a . O
p a d r ã o m e t a b ó l i c o i m a t u r o foi associado a u m c o m p o r t a m e n t o
t u m o r a l agressivo e a o u t r o s fatores p r o g n ó s t i c o s desfavoráveis,
mas a aplicação c l i n i c a dos padrões m e t a b ó l i c o s n ã o f o i esta-
belecida.
F i n a l m e n t e , a especificidade clínica da detecção de neuroblas-
tomas c o m as dosagens das catecolaminas e dos seus m e t a b ó l i t o s
p o d e ser i n f l u e n c i a d a pela escolha dos métodos laboratoriais,
interferências dietéticas e outras condições de s u p e r p r o d u ç ã o de
catecolaminas. Avanços significantes na especificidade analítica
dos m é t o d o s laboratoriais r e d u z i r a m m u i t a s das fontes exógenas
de interferência. A his to patologia permanece c o m o o c r i t é r i o
diagnóstico d e f i n i t i v o para a distinção entTe os neuroblastomas
e os f e o c r o m o c i t o m a s o u o u t r o s tumores neurogênicos p r o d u t o -
res de catecolaminas, tais c o m o os ganglioneuromas e os ganglio-
neuroblastomas.
Carcinóide
Os carcinóides são t u m o r e s p r o v e n i e n t e s d o sistema n e u r o e n d ó -
c r i n o d i f u s o do t r a t o g a s t r o i n t e s t i n a l e pâncreas. 9 D e r i v a d o s
p r i n c i p a l m e n t e das células e n t e r o c r o m a f i n s , esses t u m o r e s são
a m p l a m e n t e distribuídos pelo c o r p o , mas encontrados c o m m a i o r
f r e q ü ê n c i a nos tratos gastrointestinal (74%) e r e s p i r a t ó r i o ( 2 5 % ) .
0 t u m o r c a r c i n ó i d e c o m u m tem u m aspecto sólido e amarelo-
bronzeado. As células t u m o r a i s e x i b e m u m a m o r f o l o g i a m o n ó -
t o n a , c o m u m citoplasma g r a n u l a r róseo e núcleos a r r e d o n d a d o s
c o m mitoses raras. A m a i o r i a dos carcinóides p o d e ser i d e n t i f i -
cada pela sua reação às colorações c o m prata e aos marcadores
celulares n e u r o e n d ó c r i n o s , tais c o m o a c r o m o g r a n i n a e a enolase
neurônio-específica.
Os tumores carcinóides são t r a d i c i o n a l m e n t e classificados de
acordo c o m a sua p r e s u m i d a o r i g e m a p a r t i r do i n t e s t i n o a n t e r i o r
e m b r i o n á r i o ( b r ô n q u i o s , p u l m ã o , estômago, d u o d e n o e pâncreas),
i n t e s t i n o m é d i o (íleo, j e j u n o , apêndice e c ó l o n p r o x i m a l ) , o u
i n t e s t i n o posterior (reto e c ó l o n distai). 6 Os locais mais c o m u n s
desses tumores são os b r ô n q u i o s o u p u l m õ e s ( 3 3 % ) , íleo o u
j e j u n o ( 2 0 % ) , reto ( 1 0 % ) e apêndice (8%). U m n o v o sistema de
classificação t a m b é m f o i p r o p o s t o levando e m c o n t a as variações
das características histopatológicas. 9 A i n c i d ê n c i a g l o b a l de carci-
nóides c l i n i c a m e n t e significantes f o i estimada e m u m a dois casos
p o r 100.000 pessoas. Os t u m o r e s carcinóides p o d e m se desenvol-
ver em todos os grupos etários, mas surgem mais f r e q ü e n t e m e n t e
em adultos, c o m u m a m é d i a etária de 63 anos para os tumores
d o i n t e s t i n o delgado e do t r a t o respiratório. C l i n i c a m e n t e , a
m a i o r i a dos pacientes é assintomática até que as metástases estejam
presentes. A obstrução i n t e s t i n a l e a d o r a b d o m i n a l são os mais
freqüentes sintomas de apresentação.
Os tumores carcinóides e x i b e m c o m p o r t a m e n t o m a l i g n o
agressivo d e p e n d e n d o da sua o r i g e m , p r o f u n d i d a d e de penetra-
ção e t a m a n h o d o t u m o r p r i m á r i o . A m a i o r i a dos carcinomas
retais é e n c o n t r a d a i n c i d e n t a l m e n t e na endoscopia. Eles freqüen-
temente são menores do que 1 c m e apresentam u m a baixa taxa
de metástases, e m b o r a possam exibir u m a extensa disseminação
local. Os carcinóides d o apêndice são observados em cerca de
u m a e m cada 3 0 0 apendicectomias. Quase todos t ê m menos de
1 c m , e as metástases a distância são raras. Por o u t r o lado, 9 0 %
dos carcinóides intestinais q u e p e n e t r a m até a metade da parede
muscular terão se d i s s e m i n a d o para os l i n f o n o d o s e locais distan-
tes n o m o m e n t o d o diagnóstico. M a i s de 7 0 % dos carcinóides
intestinais de 1 a 2 c m de d i â m e t r o metastatizam para o fígado.
Felizmente, a m a i o r parte dos tumores carcinóides cresce lenta-
m e n t e e os pacientes p o d e m viver p o r m u i t o s anos. C o n s u l t e o
Q u a d r o 26-3 para u m r e s u m o dos pontos-chave sobre os tumores
carcinóides.
A s s i m c o m o as células endócrinas intestinais n o r m a i s , os
carcinóides sintetizam, armazenam e l i b e r a m u m a variedade de
h o r m ô n i o s e de aminas biogênicas. U m a das mais b e m caracte-
rizadas dessas substâncias é a serotonina. Os tumores carcinóides
t a m b é m p r o d u z e m e secrecam outras substâncias b i o l o g i c a m e n t e

QUADRO 26-3 Pontos-Chave dos Carcinõides
BIOLOGIA
" São tumores neuroendócrinos derivados das células enterocromafins dos
tratos gastrointestinal e respiratório.
• Geralmente se desenvolvem como tumores pequenos (< 2 cm) de
crescimento lento, mas com propensão a metastatizar.
• Sintetizam, armazenam e liberam uma variedade de hormônios peptídicos
e aminas biogênicas, incluindo a serotonina.
APRESENTAÇÃO
• Obstrução intestinal e dor abdominal.
• Sintomas relacionados à secreção de aminas vasoativas e peptídios
resultando na síndrome carcinóide (rubor, diarréia, brancoconstrição e
insuficiência cardíaca direita) relativamente rara e geralmente ocorrendo
após o desenvolvimento de metástases.
DIAGNOSTICO BIOQUÍMICO
• 0 diagnóstico bioquímico depende, principalmente, das dosagens de
serotonina, de seus metabólitos (5-HIAA) e dos precursores da serotonina
(5-HTP) na urina, plasma, sangue total e plaquetas.
" Os resultados falso-positivos são comuns devido a intluências
dietéticas.
ativas, i n c l u i n d o histamina, calicreína, hradicininas, taquicini-
nas, prostaglandinas, d o p a m i n a e norepinefrina. A produção
dessas substâncias varia em relação ao tecido de origem do t u m o r .
Os carcinõides do intestino m é d i o liberam grandes quantidades
de serotonina, enquanto os tumores derivados do intestino ante-
rior secretam primariamente 5-hidroxitriptofano (5-HTP) (um pre-
cursor serotoninérgico) e histamina, em vez de serotonina. Os
carcinõides primários do intestino posterior geralmente não
exibem atividade secretora.
A secreção de substâncias na circulação sistêmica desempe-
n h a u m i m p o r t a n t e papel no desenvolvimento da s í n d r o m e car-
cinóide. A síndrome completamente desenvolvida associada às
manifestações humorais desses tumores é impressionante, mas
rara, geralmente só ocorrendo após as metástases hepáticas, c o m
a liberação dessas substâncias diretamente na circulação sistê-
mica. A apresentação clínica clássica da síndrome carcinóide
i n c l u i u m r u b o r p r o n u n c i a d o (especialmente na face e no
pescoço), diarréia, broncoconstrição e eventual insuficiência val-
vular cardíaca direita. A superprodução de serotonina é encon-
trada em 9 0 % a 100% dos pacientes c o m síndrome carcinóide,
e acredita-se que esta seja responsável pela diarréia por causa dos
seus conhecidos efeitos sobre a motilidade gástrica e secreção de
fluidos.
A avaliação laboratorial clínica da síndrome carcinóide conta
c o m as dosagens da serotonina e dos seus metabólitos nos f l u i d o s
e tecidos corporais. 5 Nos pacientes c o m a típica síndrome carci-
nóide, a 5 - H T P é convertida em serotonina e armazenada nos
grânulos secretorios tumorais e nas plaquetas. U m a pequena quan-
tidade de serotonina permanece no plasma, mas é convertida em
5-H1AA, que é excretado pela urina. Esses pacientes apresentam
concentrações de serotonina elevadas n o sangue e plaquetas e
uma excreção urinária de 5 - H I A A aumentada. Todavia, alguns
tumores carcinõides do intestino anterior carecem da L-descai-
boxilase ácida dos aminoácidos aromáticos e secretam 5-HTP, em
vez de serotonina, na corrente sanguínea. 9 Os pacientes c o m esses
tumores apresentam concentrações normais de serotonina no
sangue e nas plaquetas, mas as quantidades urinárias estão
Catecolaminas e Serotonina CAPÍTULO 26 483
aumentadas uma vez que o 5 - H T P é convertido em serotonina
nos rins; o 5 - H I A A pode estar levemente elevado.
Os pacientes c o m tumores carcinõides produtores de seroto-
nina geralmente apresentam impressionantes elevações da excre-
ção urinária de 5 - H I A A (de pelo menos 10 vezes), mas ocasional-
mente as elevações são menores. Elevações falso-positivas p o d e m
ocorrer se o paciente ingerir alimentos ricos em serotonina o u
medicamentos, tais como banana, abacaxi, kiwi, ameixa e abacate,
e medicamentos para tosse contendo guaifenesina. Inversamente,
álcool, aspirina e outras drogas p o d e m s u p r i m i r as concentrações
de 5 - H I A A . Os pacientes deveriam evitar esses agentes durante
as coletas de u r m a de 24 horas. As coletas incompletas o u em
excesso de u r i n a de 24 horas p o d e m ser mais precisamente ava-
liadas em termos de taxa de creatinina. O 5 - H I A A plasmático de
jejum foi proposto como u m conveniente substituto para as
coletas urinárias.
A maioria dos médicos se vale da dosagem de 5 - H I A A para
diagnosticar a síndrome carcinóide. Mas quando u m paciente
fortemente suspeito de síndrome carcinóide exibe elevações
normais ou limítrofes de 5 - H I A A u r i n á r i o , a documentação de
concentrações elevadas de serotonina nas plaquetas, plasma, sangue
total ou u r i n a pode ajudar a estabelecer o diagnóstico. A seroto-
n i n a plaquetária f o i descrita c o m o mais sensível do que o 5 - H I A A
u r i n á r i o para a detecção dos carcinõides que produzem pequenas
o u moderadas quantidades de serotonina, tais como os carcinõi-
des do intestino anterior e posterior e os carcinõides do intestino
médio com u m pequeno v o l u m e t u m o r a l . A l é m disso, as concen-
trações plaquetárias de serotonina não são afetadas pela dieta do
paciente. N o entanto, as plaquetas p o d e m estar saturadas na
presença de taxas elevadas de secreção de serotonina, sendo o
5 - H I A A frequentemente preferido para o m o n i t o r a m e n t o da pro-
dução elevada de serotonina.
METODOLOGIA ANALÍTICA
N a prática clínica, as determinações laboratoriais das catecolami-
nas, serotonina e dos seus metabólitos nos líquidos corporais são
principalmente realizadas para diagnóstico e acompanhamento
de pacientes c o m tumores produtores de catecolaminas e seroto-
nina. A maioria dos laboratórios dosa as catecolaminas livres
urinárias, metanefrina, n o r m e t a n e f r i n a e V M A na avaliação dos
feocromocitomas n As dosagens plasmádcas das catecolaminas são
usadas em alguns centros médicos, sendo as metanefrmas plas-
máticas cada vez mais dosadas (Figura 26-7). Para a detecção dos
neuroblastomas, o H V A e o V M A urinários são mais c o m u m e n t e
solicitados na prática clínica, mas outros metabólitos das cateco-
laminas e da dopamina também são dosados. A avaliação diag-
nostica dos pacientes c o m tumores carcinõides envolve, rotinei-
ramente, a dosagem de 5 - H I A A ; a dosagem de serotonina nas
plaquetas e u r i n a t a m b é m é determinada.
Coleta e Armazenamento das Amostras
As condições sob as quais as amostras de plasma e de u r i n a são
coletadas p o d e m ser cruciais para a confiabilidade e interpreta-
ção dos resultados dos exames. N o passado, muitos clínicos pre-
feriam as coletas de urina de 2 4 horas à coleta de amostras san-
guíneas, uma vez que as primeiras evitavam as rígidas condições
associadas à coleta de catecolaminas sanguíneas (p. ex., as amos-
tras devem ser colhidas após 20 m i n u t o s ou mais de repouso em
decúbito dorsal) e são mais convenientemente implementadas
pela equipe clínica. N o entanto, os pacientes acham a coleta de
u r i n a de 24 horas difícil e inconveniente. A confiabilidade do
m o m e n t o da coleta freqüentemente é duvidosa. As metanefrinas
plasmáticas não são p r o n t a m e n t e influenciadas pelo trauma da
f l e b o t o m i a como as catecolaminas, mas as condições de coleta
484 PARTE IV Analitos

A - Padrão B — Mulher normal de 36 anos de idade C - Mulher de 31 anos de idade

com feocromocitoma

HMBA HMBA
NMN EHPEA HMBA
MN

MTY

NMN

MN
LA , /, , s
*wV\J --
1 r -r— 1 i i
10 20 30 0 10 20 30 10 20 30
Tempo (min) Tempo (min) Tempo (min)

Figura 26-7 Cromatogramas obtidos pela HPLC com detecção eletroquímica após a injeção de uma solução-
padrão (A) e após injeções de extratos purificados de amostras do plasma de uma paciente normal (B) e de uma
outra paciente com um feocromocitoma. A solução-padrão continha 500 pg de normetanefrina (NMN),
metanefrina (MN) e metoxiriramina (MTY], e 1.000 pg de dois padrões internos, 3-hidT0xi-4-met0xikenzilamina
(HMBA) e 3-etoxi-4-hidroxifeni 1 ecoxiamina (EHPEA). Os valores mostrados para as concentrações plasmáticas de
N M N e MN em indivíduos com e sem feocromocitoma foram calculados após a correção para recuperações dos
padrões internos a partir de 2 mL de amostras de plasma sujeitos à extração por troca catiõnica.

da amostra de sangue ainda exigem consideração q u a n d o existem
problemas na distinção e n t r e resultados verdadeiramente positi-
vos e os falso-positivos. O paciente deve jejuar p o r 12 boras antes
da coleta. Para as coletas urinárias, as i n f l u ê n c i a s da d i e t a e da
ativação s i m p a t i c o a d r e n a l associadas à atividade física o u a alte-
rações posturais t a m b é m não são tão facilmente controladas c o m o
o são para as coletas sanguíneas. Coletas p o n t u a i s o u n o t u r n a s de
u r i n a corrigindo-se as diferenças na duração da coleta c o m a
utilização da excreção u r i n á r i a de c r e a t i n i n a f o r n e c e m alternati-
vas para as coletas de u r i n a de 24 horas que p o d e m superar alguns
desses problemas.
As catecolaminas nas amostras u r i n á r i a s preservam-se m e l h o r
c o m ácido c l o r í d r i c o , a f i m de q u e se m a n t e n h a a u r i n a ácida.
Para armazenamento p o r períodos prolongados de t e m p o , as
alíquotas t ê m m e l h o r conservação congeladas a - 8 0 ° C para m i n i -
mizar a auto-oxidação e a desconjugação. As amostras sanguíneas
são mais b e m coletadas e m tubos c o n t e n d o h e p a r i n a o u ácido
etilenodiaminotetTacético ( E D T A ) , c o m o anticoagulantes, e guar-
dadas em gelo antes da centrifugação a 4 ° C , c o m separação do
plasma para posterior a r m a z e n a m e n t o a - 8 0 ° C .
A dosagem da s e r o t o n i n a n o sangue t o t a l é p o p u l a r u m a vez
que o d e m o r a d o i s o l a m e n t o das plaquetas não é necessário. Para
a s e r o t o n i n a n o sangue t o t a l , o sangue venoso é extraído para
u m t u b o c o n t e n d o E D T A potássico c o m o anticoagulante, deli-
cadamente m i s t u r a d o , colocado n o gelo e transferido para u m
t u b o de armazenamento. U m a a l í q u o t a de sangue é então remo-
vida para u m a c o n t a g e m plaquetária. As amostras de s e r o t o n i n a
sanguínea são armazenadas congeladas a - 2 0 ° C , preferencial-
m e n t e e m u m i n t e r v a l o de duas horas após a coleta.
As amostras de plasma ricas e m plaquetas são preparadas a
p a r t i r d o sangue t o t a l através de centrifugação e m baixa veloci-
dade. A f i m de prevenir a redução da concentração de serotonina,
o plasma r i c o em plaquetas é preparado d e n t r o de u m a h o r a
depois que o sangue tenha sido coletado e colocado no gelo. A
f i m de reduzir a p r o b a b i l i d a d e de r u p t u r a plaquetária, as amostras
n u n c a devem ser congeladas antes que o plasma livre de células
seja o b t i d o . Plasma e pellets são armazenados congelados a - 2 0 C
e analisados d e n t r o de u m a a duas semanas após a coleta.
A s amostras de u r i n a de 24 horas para s e r o t o n i n a e 5 - H 1 A A
são coletadas em garrafas m a r r o n s de 2 L de p o l i p r o p i l e n o con-
tendo, cada u m a , 2 5 0 m g de m e t a b i s s u l f i t o de sódio e E D T A
c o m o conservantes. As amostras são acidificadas até o p H 4 c o m
ácido acético antes do c o n g e l a m e n t o . M a i s i m p o r t a n t e , a amostra
deve ser refrigerada d u r a n t e a coleta.
Interferências e Influências da Dieta e de
Medicamentos
Os constituintes dietéticos o u m e d i c a m e n t o s t a n t o p o d e m pro-
vocar u m a interferência analítica direta nos ensaios q u a n t o i n f l u e n -
ciar os processos fisiológicos q u e d e t e r m i n a m as concentrações
plasmáticas e urinárias das m o n o a m i n a s e seus metabólitos. N a
p r i m e i r a circunstância, a interferência pode ser altamente variá-
vel, d e p e n d e n d o do m é t o d o de dosagem em particular. N a ú l t i m a
circunstância, a i n t e r f e r ê n c i a geralmente é de natureza mais gené-
rica, sendo i n d e p e n d e n t e do m é t o d o de mensuração.
O desenvolvimento de novas drogas, variações nas técnicas de
ensaio e as contínuas melhorias nos p r o c e d i m e n t o s analíticos
freqüentemente t o m a m difícil identificar quais medicamentos c o m

interferência direta deveriam ser evitados para u m d e t e r m i n a d o
teste analítico. Fontes mais p r o n t a m e n t e identificáveis e generali-
zadas de interferência, que são independentes do m é t o d o de
ensaio e m particular, tendem a estar associadas a drogas que
possuem ações primárias sobre os sistemas m o n o a m í n i c o s . D e v i d o
à i m p o r t â n c i a desses sistemas c o m o alvos terapêuticos, tais medi-
camentos representam u m a f o n t e relativamente c o m u m de resul-
tados falso-positivos. Os antidepressivos tricíclicos e m particular
são u m a i m p o r t a n t e f o n t e de resultados falso-positivos para as
dosagens de n o r e p i n e f r i n a e n o r m e t a n e f r i n a , u m resultado das
ações primárias desses agentes n a i n i b i ç ã o da recaptação das m o n o -
aminas. O u t r o s medicamentos que p o d e m provocar u m a interfe-
rência significante, mas que são menos c o m u m e n t e encontrados
d u r a n t e os exames para f e o c r o m o c i t o m a , i n c l u e m L-dopa, Sinemetj
alfa-metildopa ( A l d o m e t ) e os i n i b i d o r e s da M A O .
A i n t e r f e r ê n c i a dietética p o d e ser p a r t i c u l a r m e n t e preocu-
pante para as dosagens dos m e t a b ó l i t o s da serotonina utilizados
n o diagnóstico dos carcinõides, exigindo u m a instrução dietética
detalhada para esses pacientes. As fontes dietéticas de 5-hidro-
x i i n d ó i s (p. ex., nozes, bananas, abacate, berinjela, abacaxi, ameixa
e tomate) deveriam ser restritas p o r três a q u a t r o dias antes e
d u r a n t e a coleta de u r i n a . Se possível, os pacientes devem se abster
de todas as medicações conhecidas que possam provocar u m a
aparente elevação (guaiacolato de glicerol, mefesina, fenacetina e
acetaminofen) o u redução ( m e t a n a m i n a , fenotiazina, t r a n q ü i l i -
zantes, ácido h o m o g e n t í s i c o , ácido acético e levodopa) do 5-
F I I A A . A o c o n t r á r i o do 5 - H I A A , as dosagens da serotonina não
são significativamente i n f l u e n c i a d a s pela ingestão em c u r t o prazo
de alimentos ricos e m s e r o t o n i n a .
Intervalos de Referência
O uso de populações de referência adequadamente combinadas
é i m p o r t a n t e para u m a triagem eficaz de tumores pr oduto res de
m o n o a m i n a s entre diferentes populações de pacientes. As cateco-
laminas e m e t a n e f i i n a s urinárias e plasmáticas possuem diferentes
faixas em pacientes hipertensos o u hospitalizados, comparadas c o m
v o l u n t á r i o s saudáveis, crianças, comparadas c o m os adultos, e
h o m e n s , c o m mulheres (Figura 26-8). A l é m disso, as quantidades
de catecolaminas e metanefrinas nas amostras de u r i n a de 24 horas
e n o plasma são altamente desviadas para a direita. A normaliza-
ção das distribuições geralmente pode ser o b t i d a através da trans-
formação logarítmica, p e r m i t i n d o , desse m o d o , uma determina-
ção paramétrica de intervalos de referência.
Metanefrinas Urinárias e Plasmáticas
Fracionadas
Metanefrinas, normetanefrina e metanetanefrinaj e o metabólito
O - m e t i l a d o da d o p a m i n a , a m e t o x i t i r a m i n a , estão presentes n o
plasma e u r i n a nas formas livre e conjugada a sulfato o u glicuro-
n í d e o . A s concentrações plasmáticas de conjugados livres são 20
a 3 0 vezes mais elevadas d o que aquelas dos metabólitos livres,
u m a conseqüência da depuração circulatória mais r á p i d a dos
m e t a b ó l i t o s livres d o q u e a dos conjugados. A depuração dos
m e t a b ó l i t o s livres se dá através da captação ativa para os tecidos
e pela posterior metabolização pela desaminação o u conjugação.
Os m e t a b ó l i t o s conjugados e n t ã o produzidos são depurados de
m o d o relativamente l e n t o através da extração renal e efeminação
pela u r i n a . A s metanefrinas u r i n á r i a s são então r o t i n e i r a m e n t e
dosadas após a h i d r ó l i s e ácida, representando, p r i n c i p a l m e n t e ,
m e t a b ó l i t o s conjugados, e n q u a n t o as metanefrinas plasmáticas
geralmente são dosadas sob a f o r m a livre.
O isolamento das metanefrinas a p a r t i r da u r i n a o u do plasma
geralmente é realizado c o m a cromatografia de troca tônica. E m b o r a
a fluorescência nativa e a absorção de u l t r a v i o l e t a possam ser
Catecolaminas e Serotonina CAPÍTULO 26 485
usadas para detectar as metanefrinas na u r i n a , a m a i o r i a dos
p r o c e d i m e n t o s de c r o m a t o g r a f i a l í q u i d a de alta performance
( H P L C ) é baseada na detecção eletroquímica (Figura 26-7). As
condições da c o l u n a e as fases estacionárias v a r i a m ; as aplicações
típicas i n c l u e m a cromatografia de fase reversa c o m reagentes de
pareamento i ô n i c o e c r o m a t o g r a f i a de troca catiônica baseada em
sílica. M é t o d o s novos e progressivamente populares envolvendo
H P L C acoplados a u m espectrômetro de massa ( L C - M S / M S )
oferecem as vantagens do c u r t o t e m p o de corrida c r o m ato gráfica,
elevado r e n d i m e n t o da amostra e e l i m i n a ç ã o da interferência
medicamentosa.
Catecolaminas Urinárias e Plasmáticas
Os m é t o d o s f l u o r i m é t r i c o s e radioenzimáticos para análise das
catecolaminas u r i n á r i a s o u plasmáticas f o r a m substituídos pelos
m é t o d o s H P L C . Numerosas técnicas pré-analíticas de limpeza
estão disponíveis para a extração das catecolaminas do plasma e
da urina. O procedimento de extração mais c o m u m envolve a extra-
ção c o m a l u m i n a (Figura 26-9). Paia as catecolaminas urinárias,
o p r o c e d i m e n t o de extração c o m a l u m i n a p o d e ser c o m b i n a d o
c o m o u sem a etapa de t r o c a c a t i ô n i c a . Géis de ácido b ó r i c o
o f e r e c e m u m a a b o r d a g e m a l t e r n a t i v a para a absorção seletiva
das catecolaminas. Solventes orgânicos, desprotemização ácida,
u l t r a f i l t r a ç ã o e o u t r o s p r o c e d i m e n t o s de extração da fase sólida
t a m b é m p o d e m ser usados n o pré-tratamento das amostras.
M u i t o s p r o c e d i m e n t o s H P L C analisam extratos u t i l i z a n d o a cro-
m a t o g r a f i a de fase reversa c o m reagentes de p a r e a m e n t o i ô n i c o ;
o u t r o s p o d e m usar as colunas H P L C de troca catiônica para
separar as a m i n a s extraídas. A detecção e l e t r o q u í m i c a u t i l i z a n d o
a mensuração a m p e r o m é t r i c a o u c o u l o m é t r i c a é c o m u m e n t e
usada para q u a n t i f i c a r as catecolaminas. A separação H P L C
t a m b é m p o d e ser acoplada à detecção p o r fluorescência, mas
técnicas de derivação pré o u pós-coluna são necessárias para
a p r i m o r a r o l i m i t e de detecção mais b a i x o e a especificidade
q u í m i c a . F o r a m descritos p r o c e d i m e n t o s automatizados q u e
são adequados para as aplicações clínicas de r o t i n a ; o pré-trata-
m e n t o m a n u a l p o d e o u não ser necessário. M a i s r e c e n t e m e n t e
para as dosagens u r i n á r i a s , a m e t o d o l o g i a da espectrometria de
massa f o i desenvolvida c o m alta capacidade e especificidade de
rendimento.
Ácido Vanililmandélico Urinário e Ácido
Homovanílico
O ácido v a n i l i l m a n d é l i c o ( V M A ) é o p r i n c i p a l p r o d u t o f i n a l do
m e t a b o l i s m o da n o r e p i n e f r i n a e da e p i n e f r i n a , e n q u a n t o o ácido
homovanílico (HVA) é o principal produto final do metabolismo
da d o p a m i n a . A m b o s os m e t a b ó l i t o s são excretados na u r i n a em
quantidades u m t a n t o elevadas, t o r n a n d o a sua análise relativa-
m e n t e simples. O V M A , ao c o n t r á r i o do H V A , não é significan-
temente conjugado. N o e n t a n t o , u m a vez que grandes quantida-
des de H V A t a m b é m estão presentes na u r i n a sob a f o r m a livre,
ambos os m e t a b ó l i t o s são c o m u m e n t e dosados sem uma etapa
de hidrólise. C o m p a r a d a s às metanefrinas e às catecolaminas, as
dosagens de V M A e de H V A possuem u m l i m i t a d o valor para o
diagnóstico do f e o c r o m o c i t o m a , mas são c o m u m e n t e usadas para
o diagnóstico do n e u r o b l a s t o m a . O s p r i m e i r o s m é t o d o s espectro-
f o t o m é t r i c ô s para a determinação d o V M A e do H V A foram, em
grande m e d i d a , substituídos pela cromatografia gasosa ou, mais
c o m u m e n t e , pela H P L C . Os m é t o d o s de cromatografia gasosa
c o m ionização p o r chama o u detecção espectrométrica de massa
são altamente específicos e p o d e m , s i m u l t a n e a m e n t e , d e t e r m i n a r
V M A e H V A . A H P L C geralmente retrata a separação isocrática
da fase reversa c o m detecção e l e t r o q u í m i c a , espectrofotométrica,
f l u o r i m é t r i c a o u pós-colunar. A s aplicações de H P L C são relati-
486 PARTE IV Analitos

A Normotensos (n = 175)
90- 60 n 0,46 2,76
80-
50
70 -
60 40
50
30-1
40 H
30 20
20
10-1
10
1
0 I I ! I I I -1—i i
1 2 3 4 5 6 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0

B H i p e r t e n s a s (n = 110)
35 30-1 0,60 4,21
30- 25-

25-
20
20
15
15-
10 ^
10 -
5-
5

0 •1 'i r 0 ~l l~l
0 6 7 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0

Norepinefrina plasmática (nrroUL)

C Normotensos (n=175)

70 35 0,10 0,55

60- 30

50 25

Figura 2 6 - 8 Distribuições de 40 20
freqüência para a norepinefrina
30 15
plasmática ( A e B ) e paia a
normetanefrina plasmática livre (C e 20-] 10
D ) e m voluntários normotensos

rL
saudáveis (A e C) comparados a 10 5
pacientes c o m hipertensão essencial
0 0
(B e D). As distribuições exibidas o 0,2 0,4 0,6 0.8 1.0 0,063 0,125 0,25 0,5 1,0
nos painéis na direita foram
D Hipertensos (n = 110)
normalizadas por transformação
35 30 i 0,13 0,77
logarítmica. O s intervalos de
confiança de 9 5 % (indicados pelas 30- 25 -
linhas verticais tracejadas) foram
25
estimados c o m a utilização de 20
distribuições normalizadas. Observe 20
que as distribuições nos hipertensos 15 -j
exibem u m desvio para 15
concentrações plasmáticas mais 10
10-
elevadas, comparadas às distribuições
5 -I
e m n o r m o t e n s o s c o m limites 5
inferiores e superiores de referência C L _ ~L
0
correspondentemente mais altos. o 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0,063 0,125 0,25 0,5 1,0
Norepinefrina plasmática (nmol/L)
 Catecolaminas e Serotonina CAPÍTULO 2 6 487

1. Adicione um 1 mL de 2. Adicione Tris EDTA ao 3. Adicione 5 mg de

á c i d o perclórico o u ácido tricloroacético a n t e s d a injeção d a
plasma a um tubo padrão interno alumina
de Eppendorf _ a m o s t r a d i r e t a m e n t e sobre a c o l u n a d e H P L C .
A 9 6=3 A m a i o r p a r t e dos ensaios H P L C e m p r e g a c o l u n a s d e fase
reversa de octadecilsilil (C18), e m b o r a p o d e r o s a s c o l u n a s de troca
Tris EDTA catiônica t a m b é m t e n h a m sido empregadas. A cromatografia geral-
pH 0,6 e
padrão interno m e n t e é realizada c o m u m a fase isocrática m ó v e l e m u m p H ácido
Plasma

w w
q u e c o n t é m u m m o d i f i c a d o r o r g â n i c o e, possivelmente, u m rea-
Alumina
g e n t e d e p a r e a m e n t o iônico. A s e r o t o n i n a é p r o t o n a d a e m u m a
faixa d e p H d e 3 a 6 , e a adição de r e a g e n t e de p a r e a m e n t o i ô n i c o
cria u m c o n j u g a d o sem carga q u e a u m e n t a a a f i n i d a d e da sero-
t o n i n a pela fase b i d r o f ó b i c a estacionária, Para as dosagens d e
4. Misture bem por 5. Centrifugue para 6. Aspire o sobrenadante
20 min formar os pellets de q u a n t i d a d e s m u i t o p e q u e n a s de s e r o t o n i n a ou p a r a projetos espe-
de plasma e Tris
cializados, a H P L C c o m d e t e c ç ã o a m p e r o m é t r i c a ou d e t e c ç ã o

O £3
alumina .
coulométrica f r e q ü e n t e m e n t e é preferida à detecção fluorimé-
Catecóis s e
adsorvem à trica. Para a p r i m o r a r a sensibilidade analítica, alguns p r o c e d i m e n -
Catecóis
alumina em tos H P L C i n c o r p o r a m a derivação pré-colunar c o m reagentes
adsorvidos à
um pH f l u o r e s c e n t e s e q u i m i o l u m m e s c e n t e s , a l c a n ç a n d o , desse m o d o ,
alumina
básico
limites de detecção n a faixa de f e n t o m o l .
' 0
Ácido 5-Hidroxiindolacético
Assim c o m o a s e r o t o n i n a , o 5-HLAA é f o r t e m e n t e f l u o r e s c e n t e e
u m a série de p r o c e d i m e n t o s f l u o r i m é t r i c o s f o r a m desenvolvidos
p a t a a análise q u a n t i t a t i v a M é t o d o s m a i s seletivos e sensíveis para
7. Lave a alumina 8. Remava os catecóis 9. Transfira o eluente q u a n t i f i c a ç ã o d o 5-HLAA n a u r i n a e n o p l a s m a i n c l u e m a croma-
duas vezes com H,0 em ácida diluído ácido para o frasco tografia gasosa, i m u n o e n s a i o s , H P L C e L C - M S / M S . A t u a l m e n t e ,
(p. ex., acético a 0,2 M) para injeção na HPLC a H P L C é o m é t o d o mais d i f u n d i d o d e d o s a g e m d o 5 - H I A A n o
l a b o r a t ó r i o clínico, t e n d o s u b s t i t u í d o a m p l a m e n t e os m é t o d o s
Catecóis
Misturado removidos fotométricos e fluorimétricos. N u m e r o s o s m é t o d o s de H P L C f o r a m
com H 2 0, da alumina descritos para a d o s a g e m d o 5-HLAA, t a n t o s e p a r a d a m e n t e q u a n t o
centrifugado- com formação em c o m b i n a ç ã o c o m o u t r a s substâncias de interesse clínico. A
e aspirado de vórtice
m a i o r i a dos p r o c e d i m e n t o s emprega separações d e fase reversa e
em pH ácido • w
p a r e a m e n t o i ô n i c o sob c o n d i ç õ e s isocráticas otimizadas. A sílica
ligada ao alquil, tal c o m o o octadecilsilil (C18), muitas vezes é
Figura 2 6 - 9 P r o c e d i m e n t o de extração p o r a l u m i n a das
utilizada c o m o a fase estacionária h i d r o f ó b i c a , e u m a mistura-
c a t e c o l a m i n a s plasmáticas A l é m da extração das c a t e c o l a m i n a s
t a m p ã o aquosa orgânica e m u m p H ácido é f r e q ü e n t e m e n t e
( n o r e p i n e f r i n a , e p i n e f n n a e d o p a m i n a ) , este p r o c e d i m e n t o t a m h é m
empregada c o m o fase móvel polar.
p e r m i t e a extração de o u t r o s catecóis, i n c l u i n d o o 3,4-diidrofenilglicol
A dececção e l e t r o q u í m i c a u t i l i z a n d o a d o s a g e m c o u l o m é t r i c a
(o m e t a b ó l i t o d e s a m i n a d o d a n o r e p i n e f r i n a e d a epinefrína), o ácido
ou a m p e r o m é t r i c a é preferível para a d o s a g e m específica de p e q u e -
3,4-diidroxifenilacético (o m e t a b ó l i t o d e s a m i n a d o da d o p a m i n a ) e a
n a s q u a n t i d a d e s d e 5-HLAA. A l g u n s sistemas H P L C utilizam a
L-dopa, o p r e c u r s o r da d o p a m m a . d e t e c ç ã o f l u o r i m é t r i c a , c o m o u s e m derivação, p a r a u m a d o s a g e m
m e n o s rigorosa d e 5 - H I A A . A extração p r e l i m i n a r d o 5 - H I A A
p o d e ser u s a d a c o m o e t a p a inicial d e p u r i f i c a ç ã o antes da análise
p o r H P L C . Solventes o i g â n i c o s , resinas d e troca a n i ô n i c a e
o u t r o s p r o c e d i m e n t o s de extração da fase sólida f o r a m utilizados.
v ã m e n t e livres de i n t e r f e r ê n c i a e p o d e m f o r n e c e r d o s a g e n s simul- Para m u i t o s sistemas, a i n j e ç ã o direta d e u r i n a n a c o l u n a analítica
t â n e a s de V M A , H V A e o u t r o s m e t a b ó l i t o s . constitui prática c o m u m e as amostras m u i t a s vezes são mera-
m e n t e diluídas c o m u m t a m p ã o p a r a proteger o sistema H P L C
Serotonina de c o n t a m i n a ç ã o .
A s e r o t o n i n a p o d e ser d o s a d a n o s a n g u e total, soro, p l a s m a rico
e m p l a q u e t a s , p l a s m a p o b r e em p l a q u e t a s (isto é, p l a s m a livre d e
plaquetas), pelkts isolados de plaquetas, u r i n a e l í q u i d o cerebros-
p i n a l (CSF). A H P L C c o m dececção f l u o r i m é t r i c a o u eletroquí- REFERÊNCIAS
mtca constitui o m é t o d o cromatográfico mais f r e q ü e n t e m e n t e
1 Eisenhofer G, Kopin 1J, Goldstein DS. Catecholamine metabolism- a
u s a d o p a i a as d o s a g e n s de s e r o t o n i n a . A s técnicas de H P L C
contemporary view wíth imphcations for physiology and medicine.
f o r a m desenvolvidas p a r a a d o s a g e m d a s e r o t o n i n a separada-
Pharmacol Rev 2004;56:331-49.
m e n t e o u a d a p t a d a s p a r a a d o s a g e m s i m u l t â n e a d o s m d ó i s meta-
2. Goldstein DS, Eisenhofer G , McCarty R, eds. Carecholamines: Bridging
b o l i c a m e n t e r e l a c i o n a d o s , tais c o m o 5 - H T P e 5-H1AA. A extra- basic science with clinicai medicine. Advances in Pharmacology. San
ção p r e l i m i n a r e a desproteinização são necessárias a n t e s da Diego: Academic Press, 1998.
análise, e diversas escolhas estão disponíveis. A extração c o m sol- 3. Goyal RK, H i r a n o 1. T h e enteric nervous system N Engl J Med
v e n t e o r g â n i c o foi, e m g r a n d e m e d i d a , s u b s t i t u í d a p o r procedi- 1996;3 34.1106-15.
m e n t o s q u e e m p r e g a m resinas de troca catiônica. O u t r o s proce- 4. H o f f m a n BB, Taylor P. Neurotransmission: the a u t o n o m i c and somatic
d i m e n t o s d e extração da fase sólida i n c l u e m a c r o m a t o g r a f i a de motor nervous system. In: H a r d m a n JG, Limbird LE, Gilman AG, eds.
fase reversa u t i l i z a n d o c a r t u c h o s descartáveis de octadecilsilil- G o o d m a n and Gilman's the pharrnacological basis of therapeutics, 10th
sílica. U m a série de m é t o d o s s i m p l e s m e n t e d e s p r o t e i n i z a m , c o m ed. New York: McGraw-Hill, 2001:115-53.
488 PARTE IV Analitos
5. Kema IP, de Vries EG, Muskiet FA. Clinicai chemistry of serotonin and
mecabolites. J Chromatogr B Biomed Sei Appl 2000;747:33-48.
6. Kulke MH, Mayer RJ. Carcinoid tumors. N EnglJ Med 1999;340:
858-68.
7. Lenders JW, Eisenhofer G, Mannelli M, Pacak K. Phaeochromocytoma.
Lancet 2005;366:665-75
8. Manger WM, Gifford RW. Clinicai and experimental
pheochromocytoma, 2nd ed. Cambridge, Mass: Blackwell Science, 1996.
9. Oh erg K. Carcinoid tumots, carcinoid syndrome, and related disorders.
In: Larsen PR, Kronenberg HM, Melmed KS, Polonsfcy KS, eds.
Williams textbook of endociinology, 10th ed. Philadelphia: Saunders,
2003:1857-76.
10. Pacak K, Eisenhofer G, eds. Pheochromocytoma; fitst internatiooal
conference. AnnaLs of tbe New York Academy of Sciences. Boston:
Blackwell Science, 2006.
11. Peaston RT, Weinkove C. Measurement of catecbolamines and their
metabolites. Ann Clin Biochem 2004;41:17-38.
12. Rosano TG, Swift TA, Hayes LW. Advances in catecbolamine and
metabolite measurements for diagnosis of pheochromocytoma. Clin
Chem 1991;37:1854-67.
13. Schilling FH, Spix C, Berthold F, Eittmann R, Fehse N, Heio B, et al.
Neurob las toma screening at one year of age. NI Engl ] Med
2002;346:1047-53.
14. von Bohlen und Halhach O, Dermierze) R. Neurotransmitters and
neiiromodulators. Handbook of receptors and biological effeets.
Darmstadt; FRG, 2002.
15. Weinstein JL, Katzenstein HM, Cohn SL. Advances in the diagnosis and
treatment of neuroblastoma. Oncologist 2003;8:278-92.
A
PÍ
TUL
O 27
Vitaminas e Elementos-Traço*
OBJETIVOS
1. Definir vitamina e vitãmero.
2. Classificar as vitaminas de acordo com a solubilidade.
3. Listar as formas naturais de cada vitamina e as funções fisiológicas,
metabolismo, causas e sintomas de excesso e carência.
4. Descrever os métodos de análise para cada vitamina, os princípios
das reações e as possíveis interferências.
5. Definir elemento-traço e elemento-ultratraço.
6. Listar as características dos elementos-traço.
7. Listar os sete elementos-traço fisiologicamente essenciais e
descrever o significado clínico de cada um.
8. Descrever as funções básicas dos sete elementos-traço
fisiologicamente essenciais.
9. Listar os métodos analíticos disponíveis para estimar os elementos-
traço.
10. Descrever as exigências da coleta de amostras para elementos-
traço.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A p o e n z i m a : A porção protéica de u m a enzima que necessita de
u m a coenzima.
A v i t a m i n o s e : U m a doença, descrita c o m o u m a s í n d r o m e da
deficiência, resultante da carência de v i t a m i n a .
C o e n z i m a : U m a substância difusível e termoestável o u
molécula orgânica (algumas vezes derivada de u m a
vitamina) de baixo peso molecular que, q u a n d o c o m b i n a d a
c o m u m a proteína inativa d e n o m i n a d a apoenzima, f o r m a
u m c o m p o s t o ativo ou u m a enzima completa d e n o m i n a d a
holoenzima com f u n ç ã o catalítica em u m sistema
enzimático.
Co-fator: U m reagente natural, u s u a l m e n t e u m íon metálico ou
u m a coenzima, necessário a u m a reação catalítica.
E l e m e n t o - t r a ç o : Molécula inorgânica e n c o n t r a d a em tecidos
h u m a n o s o u animais em concentrações expressas e m
miligrama por quilograma, ou inferior.
E l e m e n t o - u l t r a t r a ç o : Molécula inorgânica e n c o n t r a d a e m
tecidos h u m a n o s o u animais em concentrações expressas
e m micrograma p o r quilograma, ou inferior.
E s t a d o N u t r i c i o n a l : A condição do corpo relacionada à
nutrição, geralmente, o u em referência a u m n u t r i e n t e
específico, c o m o u m elemento-traço.
H i p e r v i t a m i n o s e : U m a condição n ã o saudável resultante do
excesso de vitamina.
H i p o v i t a m i n o s e : U m a condição n ã o saudável resultante da
carência de vitamina, intercambiável c o m a avitaminose.
H o l o e n z i m a : O composto f u n c i o n a l (isto é, cataliticamente
ativo) f o r m a d o pela combinação de u m a apoenzima e u m a
coenzima apropriada.
O autor agradecidamente reconhece as contribuições prévias de Donald B.
McCoTmíck, Harry L. Green, George G. Klee e David B. Milne, nas quais se
baseiam partes deste capítulo.
Alan Shenkin, Ph.D., F.R.C.P., F.R.C.Path.,
e Malcolm Baines, F.R.S.C., F.R.C.Path.
N u t r i e n t e s Essenciais: Aqueles nutrientes (proteínas, minerais,
carboidratos, lipídios, vitaminas) necessários ao
crescimento, às f u n ç õ e s n o r m a i s e à m a n u t e n ç ã o da vida;
esses devem ser supridos pelos alimentos p o r q u e n ã o
p o d e m ser sintetizados pelo corpo.
N u t r i ç ã o P a r e n t e r a l Total ( T P N ) : Prática de alimentar u m a
pessoa p o r via intravenosa, evitando o intestino.
V i t a m i n a : U m m i c r o n u t r i e n t e orgânico essencial que deve ser
suprido exogenamente e em muitos casos é o precursor de
u m a coenzima derivada m e t a b o l i c a m e n t e .
V i t ã m e r o : U m t e r m o utilizado para descrever qualquer u m dos
diversos compostos que p o s s u e m u m a d a d a atividade
vitamínica.
S
u p r i m e n t o s a d e q u a d o s de v i t a m i n a s e elementos-traço são
f u n d a m e n t a i s para a m a n u t e n ç ã o da saúde e o desenvolvi-
m e n t o h u m a n o (http://www.iom.edu). 2 ' 6 A Tabela 27-1
resume a ingestão dietética r e c o m e n d a d a (RDA) estabelecida n o s
Estados U n i d o s da América e as recomendações para ingestão de
nutrientes p o r populações (da c o m u n i d a d e européia) de vitami-
nas e elementos-traço. As conseqüências de u m a ingestão inade-
quada de elementos-traço são mostradas na Figura 27-1.
VITAMINAS
Vitaminas são compostos orgânicos necessários na dieta para a
saúde, o crescimento e a reprodução. 1 ' Historicamente, os grupos
vitamínicos são representados por u m algarismo arábico subs-
crito após u m a letra para designar similaridades estruturais ou
funcionais (p. ex., A j [retinol] e A2 [3-diidrorretinol]) o u para
indicar a o r d e m aproximada em que são identificados c o m o
m e m b r o s d o c o n h e c i d o complexo B (p. ex., Bi [tiamina] e B 2
[riboflavina]. N o m e s químicos usuais são utilizados. Esses fre-
q ü e n t e m e n t e refletem a presença de algum átomo específico
(tiamina), grupo f u n c i o n a l principal (piridoxamina), ou m e s m o
u m a grande p a r t e da estrutura molecular (filo^uinorui). Partes de
alguns n o m e s refletem propriedades f u n c i o n a i s (colecalciferol).
U m a outra classificação está associada à solubilidade relativa
das vitaminas. Aquelas do grupo li£>ossofúuEl (A, D, E e K) são
mais solúveis em solventes orgânicos, e n q u a n t o as d o complexo
B e a vitamina C são Ímirosíoiúwis. Esse f r a c i o n a m e n t o geral
baseado n a solubilidade é útil n ã o apenas para registrar proprie-
dades físicas gerais, mas t a m b é m c o m o u m lembrete de que as
vitaminas hpossolúveis são (1) absorvidas, (2) transportadas e (3)
armazenadas por longos períodos. A maioria das vitaminas
hidrossolúveis é m e n o s retida e mais excretada na urina. E m
geral, as vitaminas hidrossolúveis f u n c i o n a m c o m o coenzimas
para diversas reações enzimáticas i m p o r t a n t e s de mamíferos e
microrganismos. E m contraste, as vitaminas lipossolúveis geral-
m e n t e n ã o f u n c i o n a m c o m o coenzimas e são r a r a m e n t e utilizadas
p o r microrganismos.
TABELA 27-1 Ingestões Oral e Intravenosa de Micro nutrientes por Adultos13

Nutrição parenteral
RDA (USA) PRI (Europa) Quantidade e m 2.000 kcal Ingestão IV

VITAMINAS
Apfl 900 700 1.000-2.160 1000
D ng 5-15 0-10 8,5-14,6 5
E mg 15 0,4/g PUFA 20-64 10
KMA 120 100-200 150
Tiamina mg 1,2 1,1 1,4-3,4 6
Riboílavina mg 1,3 1,6 2-6 3,6
Pirodoxina mg 1,3 1,5 2-13,8 6
Niacina mg 16 18 18-45 40
Folato jjg 400 200 340-880 600
B12 ng 2 1,4 3-15 5
Ácido panflotêriico ng 5* 2-12 1 7-20 15
Biotina fig 30* 15-100 100-660 60
Ácido ascórbico mg 00 45 100-300 200

ELEMENTOS-TRAÇO
Zinco mg 11 9,5 13-36 3,2-6,5
Cobre mg 0,9 1,1 2-3,4 0,3-1,3
Selênio pg 55 55 30-130 40-100
Cromo ng 25 30-200 10-20
Molibdênio pg 45* 74-240 19
Magnésio mg 2-3* 1-10 1 2,4-8 0,05-0,2

Referências de ingestão para recém-nascidos

e crianças são dependentes da idade e do peso.
RDA, ingestão Dietética Recomendada (Estados Unidos da América); PRI, Referência de Ingestão da População (EurofwjJ; PUFA, Aridoj giaics (raliinsa furados
'Ingestão aA^quntla.
' Faixa aceitável.

Funções teciduais
ótimas com estoque
corporal (se
existente) repleto

i
Mobilização de
estoques (se
existente]

Depleção inicial C o m p e n s a ç ã o (se possivel)

- absorção intestinal aumentada
- excreção renal reduzida
i
- velocidade de crescimento reduzida (zinco)

Conteúdo
intracelular reduzido

4,
Funções
bioquímicas Atividade enzimática intracelular reduzida
debilitadas - efeitos metabólicos
- sistemas antioxidantes
Expressão/regulação gènica

Efeitos funcionais
inespeclficos Curto prazo: Efeitos cognitivos
Fadiga/capacidade laboral
Funções imunológicas

Longo prazo: Danos ao DNA/membranas

celulares por radicais livres

Doenças Tipica para cada elemento-traço ou vitamina

clínicas - complicações em c a s o s de deficiências
múltiplas

X
Morte

Figura 27-1 Conseqüências de ingestões inadequadas de minerais e ele mentos-traço, (de S h e n k m A, A i l w o o d

MC. Trace elements and vitamina in adult intravenous nutiicion. In: Rombeau JL, Rolandelli R H , eds. Clinicai
nutrition: Parental nutrition. Philadelphia: W B Saunders, 2001:60-79).
 Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 491

TABELA 2 7 - 2 Necessidade de Vitaminas dos Seres H u m a n o s

Sintomas de
N o m e Químico Deficiência ou E n s a i o s Diretos e
Nome Comum Trivial Funções Gerais Doença Indiretos

LIP0SS0LÚVEIS
Vitamina A Retinol, retinal, ácido Visão, crescimento, reprodução Nictalopia, xeroftalmia, Fotométrico, HPLC,
retinóico queratomalácia fluorimétrico, RIA
Vitamina D2, D3 Ergocalciferol Modulação do metabolismo de Raquitismo (jovem), CPB, HPLC, RIA
Colecalciferol Ca2+, calcificação dos ossos osteomalácia (adulto)
e dentes
Vitamina E Tocaferóis, tocotrienóis Antioxidantes de lipídios Peroxidação lipídica, incluindo Fotométrico. HPLC, hemólise
insaturados, funções fragilidade das células de eritrócito
neurológicas e reprodutivas vermelhas, anemia hemolítica
(prematuros, recám-nascidos)
Vitamina K,, K2 Filoquinonas Coagulação sanguínea, Tempo de coagulação aumentada, HPLC, protrombina,
Menaquinonas osteocalcinas tempo de RIA, doença (pratrombina anormal, teste
hemorrágica (recém-nascido) de PIVKA)

HIDROSSOLÚVEIS
Vitamina B, Tiamina Metabolismo de carboidratos, Beribéri, Síndrome de Fluorimétrico, transcetolase,
funções nervosas, Wernicke-Korsakoff HPLC
Vitamina B2 Ribollavina Reações de oxidação-redução Estomatite angular, Fluorimétrico, HPLC, glutationa
dermatite, fotofobia redutase
Vitamina BE Pirodoxina, piridoxal, Metabolismo de aminoácidos, Convulsões epileptiformes, HPLC, aspartato transaminase,
piridoxamina fosfolipídios e glicogênio dermatite, anemia ácido piridóxico urinário
hipocrômica
Niacina Ácido nicotínico, Reações de oxidação-redução Pelagra Fluorimétrico, HPLC,
nicotinamida coenzimas niacinamida e
nicotinamida
Ácido folico Ácido Pteriolglutâmico Biossíntese de ácidos nucléicos Anemia megaloblástica, CPB, microbiológico,
e aminoácidos defeitos do tubo neural homocisteína
Vitamina B12 Cianocobalamina Metabolismo de aminoácido e Anemias megaloblástica e CPB, microbiológico, RIA,
cetoácido de cadeira perniciosa, neuropatia metiimalonato
ramificada
Biotina Reações de carboxilação Dermatite Microbiológico, CPB,
carboxilase, ligação de avidina
Ácido pantotênico Metabolismo geral, transferência Síndrome do ardor nos pés Microbiológico, RIA, CPB/HPLC
de grupas acetil e acil
Vitamina C Ácido ascórbico Formação do tecido conjuntivo, Escorbuto Fotométrico, HPLC, enzimático
antioxidante

HPLC, cromatografia Uquida de dito eficiência, RIA, radioímitinoensaia; CPB, ligação competiva de frateína, teste de PIVKA, frroietnós i-nduridas om enfoluídas no antagonismo ou
ausência de uituTTiírui K.

A Tabela 27-2 fornece u m a lista das 13 vitaminas conhecidas
e os grupos vitaméricos essenciais para os h u m a n o s .
Vitamina A
A vitamina A exerce muitas f u n ç õ e s importantes no c o r p o , t e n d o
papel de particular significado n a visão.
Química
V i t a m i n a A é o t e r m o nutricional para o grupo de compostos
c o m estrutura f o r m a d a de 20 carbonos c o n t e n d o u m anel de
cicloexenil (anel p-ionona) metil-substituido e u m a cadeia lateral
isoprenóide (Figura 27-2), com u m g r u p a m e n t o hidroxil (retinol),
u m grupo aldeído (retinal), u m g r u p a m e n t o carboxílico (ácido
retinóico) ou u m g r u p a m e n t o éstei (éster de retinil) n o c a r b o n o
terminal C 1 5 . O retinol, o principal v i t ã m e r o da v i t a m i n a A,
será oxidado reversivelmente a retinal - que c o m p a r t i l h a todas
as atividades biológicas d o retinol - ou sofrer posterior oxidação
a ácido retinóico, q u e d e m o n s t r a parte de sua atividade biológica.
As formas principais de a r m a z e n a m e n t o de vitamina A são os
ésteres de retinil, p a r t i c u l a r m e n t e o palmitato. N a família da
vitamina A estão incluídos alguns carotenóides da dieta (compos-
tos poliisoprenóides C40) q u e são classificados c o m o provita-
mina A, pois são clivados biologicamente para produzir retinol.
Exemplos são a-caroteno, p-caroteno e p-criptoxantina. O s com-
postos de vitamina A são óleos amarelados ou sólidos com baixo
p o n t o de fusão ( d e p e n d e n d o da pureza d o isômero), que são
praticamente insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgâ-
nicos e óleo mineral.
Fontes Dietéticas
A vitamina A pré-formada é obtida de alimentos de origem
animal, tais c o m o (1) fígado, (2) outros órgãos formados p o r
músculos e (3) óleos de peixe. O u t r a s fontes são creme de leite
integral, manteiga e margarinas fortificadas. As pró-vitaminas A
carotenóides são obtidas de frutas e vegetais c o m pigmentos
amarelo-alaranjados e de vegetais c o m folhas verdes. O U. S.
N a t i o n a l H e a l t h a n d N u t r i t i o n E x a m i n a t i o n Survey ( N H A N E S -
II) indicou que a p r o x i m a d a m e n t e 2 5 % das necessidades de vita-
492 PARTE IV Analitos

H.r

f
/VV
1
rw

^
ÇIl,
.x\,s v ^ s
» ^
r
A. r R
í r * - ' ,s
Retinóis
R - CH2OH
ll-ds-recinol

JYAIVJ'!
I * sd A
> 1>'PL Retinais / i"4V:v
R = CHO
r.K CHi
iJ;C CU. I
Ácidos recinóicos
I l t.iVTVÃT.nl Op;i: • a AAipwçaf
X ^ J
J*
>. 1W' CS.-UT.I
"0 * i'j |K R = COOH
u A 1
' ^" ].*• 'I.V ' J J r Rodopsina
HiC,.
H:,r Ui, "*« 1» ,1 J Ah.» rr.-io
Rrri- m I •vx.talíXis Opêilia lLI III!
í !| ' V-*
l? á 1 Ui,
H:r. CH,
^ f ^ c M o t r o o íp:ó-v.taa.uia A) '**'• ucrvxwsi
NAPJPJH
Figura 2 7 - 2 Formas vitamínicas de A 1 ; A 2 e {3-caroteno
1tdu Mi<

Riü".:il UuLHf.i:-." ú::i <ÍTnilHç7it:)

m i n a A são fornecidos pelos carotenóides e cerca de 7 5 % , pelo Figura 2 7 - 3 Participaçao de vitâmeros A no ciclo visual.
retinol pré-formado.

Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção O u t r a s funções da v i t a m i n a A incluem seu papel na (1)

A vitamina A pré-formada, n a maioria das vezes e m forma de
éster de retinil ou carotenóides, está sujeita a u m a emulsificação
antes de ser transportada pata as células do intestino. Lá, os
ésteres de retinil são t r a n s p o r t a d o s através d a m e m b r a n a da
mucosa e hidrolisados a retinol d e n t r o da célula, para serem
reesterificados pela proteína II de ligação ao retinol celular e
empacotados e m quilomícrons. Estes e n t r a m n o sistema linfático
mesentérico passando para a circulação sistêmica.
O s carotenóides, t a m b é m na forma micelar, são absorvidos
pelas células da mucosa d u o d e n a l p o r difusão passiva. A eficiên-
cia da absorção de carotenóides é m u i t o inferior àquela da vita-
m i n a A. U m a vez n o interior das células da mucosa, o P-caroteno
é convertido, p r i n c i p a l m e n t e em retinal, pela enzima p-caroteno-
15-15'-dioxigenase, e o retinal é convertido, pela retinal redutase,
e m retinol e esterificado. O s ésteres de retinil recém-sintetizados
passam, então, c o m os quilomícrons para o fígado, via sistema
linfático, o n d e a captação pelas células p a t e n q u i m a i s n o v a m e n t e
envolve hidrólise. N o fígado, o retinol é ligado à proteína de
ligação ao retinol (RPB, peso molecular ~ 21.000 Da) e transtir-
retina (pré-albumina ligada à tiroxina) (peso molecular 5 5 . 0 0 0
Da) na p r o p o r ç ã o de 1:1:1, f o r m a n d o u m complexo com t a m a n h o
suficiente para evitar a perda p o r filtração glomerular. A distri-
buição do retinol para o tecido é controlada pela disponibilidade
do complexo proteína-vitamina A n a circulação, embora esse
m e c a n i s m o de controle possa ser c o n t o r n a d o por altas doses de
retinol. A excreção de v i t a m i n a A ocorre via fezes e urina, usual-
m e n t e após conjugação ou oxidação.
Funções
A vitamina A possui u m a f u n ç ã o significativa n a visão. O retinol
todo-tram é a forma de vitamina A p r e d o m i n a n t e na circulação, e
as células da retina o isomenzam ao álcool 11-eis que é reversiva-
m e n t e desidrogenado a 11-cis-retinal. Esse isômero esférico do
aldeído combina-se como u m a base de Schiff ligada a u m radical
lisil de u m a proteína apropriada (p. ex., opsma) para gerar pigmen-
tos fotossensíveis, tais como rodopsina. A iluminação de tais pig-
mentos causa fotoisomerização e a liberação de rednal todo-trans e
a proteína, u m processo que acopla u m a ampla m u d a n ç a confor-
m a d o nal com u m influxo de íons e a transmissão pelo nervo ótico.
O retinal todo-trans é isometizado a isômero 11-cis, que novamente
se combina com a proteína liberada para reconstituir o fotopig-
mento, n u m ciclo visual mostrado n a Figura 27-3.
r e p r o d u ç ã o , (2) crescimento e desenvolvimento e m b r i o n á r i o e (3)
funções imunológicas. N o crescimento n o r m a l e n a m a n u t e n ç ã o
da integridade das células epiteliais, o ácido retinóico age pela
ativação dos receptores de ácido retinóico (RAR) e receptores
retinóides X (RXR) n o núcleo para regular vários genes q u e
codificam (1) proteínas estruturais, (2) enzimas, (3) proteínas da
matriz extracelular e (4) R B P e receptores. O retinol, seus meta-
bólitos e retinóides sintéticos p o s s u e m efeitos protetores contra
o desenvolvimento de certos tipos de câncer, (1) b l o q u e a n d o a
p r o m o ç ã o do tumor, (2) i n i b i n d o a proliferação, (3) i n d u z i n d o a
apoptose, (4) i n d u z i n d o a diferenciação ou (5) pela c o m b i n a ç ã o
dessas ações. Algum cuidado é necessário, entretanto, c o m
relação à utilização de s u p l e m e n t o s de vitamina A ou p-caroteno,
u m a vez que esses a p a r e n t a m n ã o reduzir a incidência de câncer
gastrointestinal e, sem dúvida, p o d e m a u m e n t a r a incidência de
câncer de p u l m ã o e a m o r t a l i d a d e em certos outros cânceres.
Necessidades e Recomendações para ingestão de
Nutrientes
Estudos históricos em seres h u m a n o s adultos sugeriram q u e a
ingestão de retinol de 500 a 6 0 0 (ig/dia é necessária para a
m a n u t e n ç ã o adequada das concentrações sanguíneas e para pre-
venir os sintomas da deficiência. Por exemplo, o Food a n d Nutri-
tion Board of the U.S. Institute of Medicine r e c o m e n d a o Equi-
valente de Atividade de Retinol (RAE) c o m o base de cálculo para
a ingestão de retinol. Nesse sistema, a razão de equivalência de
1:12:24 é r e c o m e n d a d a (12 pg de p-caroteno ou 24 da mistura
de carotenóides têm a mesma atividade biológica que 1 pg de
retinol). Utilizando esse sistema, as RDAs atuais para a vitamina
A são RAE de 9 0 0 pg para h o m e n s c o m idade de 19 anos ou
mais e de 700 pg para mulheres, com valores superiores permi-
tidos na gravidez e n a lactação. ü
Deficiência
A deficiência de vitamina A afeta principalmente recém-nascidos
e crianças, e a sua prevalência é objeto de vigilância da Organi-
zação M u n d i a l de Saúde (OMS). O s fatores de risco incluem (1)
pobreza, (2) baixo peso ao nascer, (3) condições sanitárias precá-
rias, (4) má nutrição, (5) infecção e (6) parasitismo C o m o o
a c ú m u l o de vitamina A no fígado ocorre d u r a n t e o último tri-
mestre de gravidez, os p r e m a t u r o s são relativamente deficientes
em vitamina A ao nascerem. Prover u m a ingestão diária de vita-

m i n a A que alcance u m a R D A de 4 0 0 pg RAE é, p o r t a n t o ,
i m p o r t a n t e . Recém-nascidos c o m peso inferior a 1.500 g (aqueles
que nascem antes de 30 semanas de gestação) praticamente n ã o
possuem vitamina A hepática alguma e estão c o r r e n d o o risco da
deficiência de vitamina A . A má absorção de gorduras, particu-
l a r m e n t e aquela causada por doença celíaca ou pancreatite
crônica, e a n u t r i ç ã o p o b r e e m energia e proteína p r e d i s p õ e m à
deficiência de vitamina A . Doenças do fígado d i m i n u e m a síntese
de RBP, e o abuso de etanol leva a lesões hepáticas e à competi-
ção com o retinol pela álcool desidrogenase, que é necessária para
a oxidação do retinol a retinal e ácido retinóico. A deficiência de
vitamina A p o d e levar à anemia, embora o m e c a n i s m o exato q u e
leva à essa doença n ã o seja exatamente c o m p r e e n d i d o .
As características clínicas da deficiência de vitamina A são
alterações degenerativas nos olhos e n a pele e dificuldade de
adaptação ao escuro ou cegueira -noturna (nictalopia). Efeitos mais
sérios da deficiência são xeroftalmia, n a qual a c o n j u n t i v a se
torna seca c o m p e q u e n a s placas cinza c o m suiperfície espumosa
(manchas de Bitot), e a queratomálacia, que causa ulceração e
necrose da córnea. U s u a l m e n t e , esses sintomas estão associados
a alterações n a pele, que incluem (1) secura, (2) aspereza, (3)
erupções de pápulas e (4) hiperqueratose folicular.
Toxicidade
E m b o r a o metabolismo da vitamina A seja f o r t e m e n t e regulado,
os efeitos tóxicos da h i p e r v i t a m i n o s e A têm ocorrido c o m o resul-
tado do excesso de ingestão da vitamina ou como efeito colateral
de terapia inapropriada. A hipervitaminose A ocorre (1) após o
estoque hepático de retinol ou se seus ésteres excederem 3.000
(ig/g de tecido, (2) após ingestão superior a 30.000 jig/dia por
meses ou anos ou (3) se as concentrações plasmáticas de viamina
A excederem 140 j i g / d L (4,9 jjmol/L). A intoxicação aguda por
u m a alta dose única é rara. A intoxicação crônica por doses mode-
r a d a m e n t e altas e ingeridas por longos períodos é caracterizada
p o r (1) dores nos ossos e nas juntas, (2) perda de cabelos, (3)
secura e fissuras nos lábios, (4) anorexia, (5) hipertensão intracra-
niana benigna, (6) perda de peso e (7) hepatomegalia.
Evidências epidemiológicas e experimentais indicam q u e a
ingestão elevada de vitamina A p o r seres h u m a n o s , agindo via
ácido 13-cis-retinóico, é terá to gê nica. O Food a n d Nutri tion
Board of the U.S. Institute of Medicine tem r e c o m e n d a d o que
o limite m á x i m o tolerável de ingestão de vitamina A pré-formada
seja de 3.000 ]ug/dia para h o m e n s e concentrações inferiores para
(1) mulheres em idade fértil, (2) recém-nascidos, (3) crianças e (4)
adolescentes. 6 A carotenemia resulta da ingestão crônica exces-
siva de alimentos ricos em carotenóides, principalmente cenoura.
Essa condição, e m q u e a pele amarelada é observada, é benigna
u m a vez que o excesso de caroteno é depositado, e n ã o convertido
e m vitamina A.
Avaliação Laboratorial do Estado
A dosagem da concentração plasmática de vitamina A é larga-
m e n t e utilizada para avaliar o estado desta vitamina. Este, n o
e n t a n t o , não é u m indicador ideal p o r q u e n ã o decai até que os
estoques d o fígado atinjam níveis críticos. Acredita-se que isso
ocorra q u a n d o observadas concentrações de a p r o x i m a d a m e n t e
20 jig/g de tecido hepática. O s m é t o d o s químicos inicialmente
utilizados, tais como os métodos de Carr-Price e Neeld-Pearson,
foram inteiramente substituídos p o r cromatografia liquida de
alta eficiência (HPLC). As técnicas de fase normal e de fase
reversa têm sido utilizadas em c o n j u n t o c o m detectores fotomé-
tricos, eletroquímicos ou espectrômetro de massa.
C o m o o retinol circula n o plasma e m forma de complexo
com R B P e transtirretina n a p r o p o r ç ã o 1:1:1, essas proteínas
Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 493
produzidas n o fígado têm sido medidas c o m o u m indicador do
estado de vitamina A. A RBP p o d e ser m e d i d a p o r nefelometria,
mas sua concentração circulante p o d e ser afetada p o r u m a dieta
i n a d e q u a d a em proteínas, energia ou zinco, todos esses necessá-
rios para a síntese de RBP. U m outro fator q u e causa a imprecisão
da avaliação d o estado de vitamina A é o efeito da resposta de
fase aguda. A m b a s R B P e transtiretina são proteínas ausentes n a
fase aguda, e, assim, as alterações inflamatórias resultarão n a
queda da concentração de ambas as proteínas e n o retinol plas-
mático. Para distinguir as causas inflamatórias e nutricionais n a
redução da concentração plasmática do retinol é necessário medir
u m a proteína típica de fase aguda, c o m o a proteína C-reativa
(CRP).
Intervalos de Referência
A orientação para intervalos de referência para a vitamina A
plasmática é (1) 20 a 40 [lg/dL (0,70 a 1,40 jj,mol/L) para crian-
ças com idade entre 1 e 6 anos, (2) 26 a 49 p g / d L (0,91 a 1,71
p m o l / L ) para crianças com idade entre 7 e 12 anos, (3) 26 a 72
p g / d L (0,91 a 2,51 p m o l / L ) para adolescentes c o m idade entre
13 e 19 anos e (4) 30 a 80 [ i g / d L (1,05 a 2,80 p m o l / L ) para
adultos. Valores acima de 30 p g / d L (1,05 p m o l / L ) estão associa-
dos a reservas apreciáveis n o fígado e se correlacionam b e m c o m
a ingestão de vitamina A. D e n t r o d o intervalo de referência,
valores para h o m e n s são, geralmente, ceTca d e 2 0 % superiores
àqueles para mulheres. O intervalo de referência para o p-caro-
t e n o plasmático é de 10 a 85 [ i g / d L (0,19 a 1,58 p m o l / L ) . Con-
centrações elevadas são e n c o n t r a d a s em pacientes com hipotireoi-
dismo, nos quais a conversão para vitamina A é d i m i n u í d a , e e m
pacientes com hiperlipemia associada ao diabetes meilitus. O inter-
valo de referência para a R B P plasmática é de 3 a 6 m g / d L .
Vitamina D
A vitamina D exerce papel essencial, c o m o h o r m ô n i o , no con-
trole dos metabolismos de cálcio e fósforo. Esse papel é discutido
em detalhes n o C a p í t u l o 38.
Vitamina E
A vitamina E é u m antioxidante que atua c o m o u m sequestrador
de oxigênio molecular e de radicais livres. Ele t a m b é m tem u m
papel n a respiração muscular.
Química
Vitamina E é o termo nutricional para o g r u p o de tocoferóis e
tocotrienóis de ocorrência natural e que possuem atividade bioló-
H CH
CT
JL ' „ 1
p CH3 H
TUÚJÇRTÇR.II' >. F
CH3 3 CHJ ç
y H
T 1 1
- Y 1 w A
5 H H
Figura 2 7 - 4 Formas vitamínicas da vitamina E.
494 PARTE IV Analitos
gica similar ao RRR-a-tocoferol (anteriormente D-a-tocoferol). É
i m p o r t a n t e t a m b é m notar que R R R se refere às posições 2, 4 e 8
de R na cadeia de Tocoferol. O s prefixos gregos a , (3, y e 5 indicam
a presença o u ausência de g r u p a m e n t o s metil nas posições 5 e 7
(Figura 27-4). Tocoferóis e tocotrienóis são (1) óleos viscosos à
temperatura ambiente, (2) lipossolúveis e (1) insolúveis em solu-
ções aquosas. Na ausência de oxigênio, os tocoferóis e tocotrienóis
t a m b é m são estáveis e m a m b i e n t e ácido e quente, mas sensíveis
ao oxigênio em soluções alcalinas e n a luz ultravioleta.
Fontes Dietéticas
As principais fontes dietéticas de vitamina E são (1) óleos e gor-
duras, particularmente óleos de germe de trigo e óleo de girassol,
(2) grãos e (3) nozes. Carnes, frutas e vegetais c o n t r i b u e m p o u c o
para o f o r n e c i m e n t o de v i t a m i n a E. O gama-tocoferol é a princi-
pal f o i m a de vitamina E e n c o n t r a d a em diversas sementes utili-
zadas n a dieta nos Estados U n i d o s , mas está presente em apenas
u m q u a r t o a u m d é c i m o da concentração de a-tocoferol n o
plasma h u m a n o .
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
N a presença da bile, a vitamina E é absorvida n o intestino
delgado. A maioria das formas de vitamina E é absorvida de
maneira não seletiva e excretada nas partículas de quilomícrons.
Essas são transportadas para os tecidos periféricos (principal-
m e n t e o adiposo) com o auxílio da lipoproteína lípase. O fígado
absorve os quilomícrons remanescentes, o n d e o a-tocoferol é
i n c o r p o r a d o à lipoproteína de densidade m u i t o baixa (VLDL). A
vitamina E é excretada pela bile e n a u r i n a c o m o ácido tecoferô-
nico e seu conjugado (3-glicuronídeo.
Funções
A v i t a m i n a E é considerada necessária para (1) funções neuroló-
gicas e reprodutivas, (2) proteção de célula vermelha c o n t r a hemó-
lise, (3) prevenção de retinopatia em recém-nascidos p r e m a t u r o s
e (4) inibição de reações e m cadeias de radicais livres da peroxi-
dação de lipídios. Essa última ocorre, principalmente, com os
ácidos graxos poliinsaturados dos fosfolipídios de m e m b r a n a . O s
tocoferóis e tocotrienóis i n i b e m f o r t e m e n t e a peroxidação de
lipídios p o r q u e eliminam radicais peroxil e m velocidades supe-
riores àquelas que esses radicais livres reagem com a cadeia de
ácido graxo adjacente o u com as proteínas de m e m b r a n a . O s
radicais tocoferil e tocotrienil resultantes p o d e m e n t ã o reagir com
outros radicais peroxil para produzir tocoferonas (não são radicais
livres) ou ser regenerados pela transferência de u m elétron para
o ascorbato, f o r m a n d o o radical ascorbil. Assim, as vitaminas E
e C agem sinergisticamente para diminuiT a peroxidação de lipí-
dios (Figura 27-5). Muitas avaliações epidemiológicas têm mos-
© 0
Radical livre Radical livre
de ascorbato \ \ //
de ascorbato
Desidroascorbsco
/ \ ©
Ascorbato
Figura 2 7 - 5 Ação sinérgica entre a v i t a m i n a E e o ácido ascórbico na quebra da reação em cadeia de radicais.
trado a associação entre a r e d u ç ã o na ingestão de vitamina E (e
outros fatores da dieta) e u m a u m e n t o n a incidência de doença
crônica, p a r t i c u l a r m e n t e em doenças cardiovasculares e câncer.
Entretanto, a maioria dos estudos que avaliam a s u p l e m e n t a ç ã o
tem f a l h a d o ao tentar d e m o n s t r a r q u a l q u e r benefício.
Necessidades e Recomendações para a ingestão
de Nutrientes
A q u a n t i d a d e diária necessária de vitamina E está relacionada
com o c o n t e ú d o celular de ácidos graxos poliinsaturados. Acre-
dita-se q u e a necessidade m í n i m a de v i t a m i n a E para adultos é
de 3 a 4 m g / d i a para aqueles que c o n s o m e m u m a q u a n t i d a d e
m í n i m a de ácidos graxos essenciais n a dieta. Entretanto, a R D A
de v i t a m i n a E para adultos foi a u m e n t a d a , n o ano 2000, pelo
Food a n d N u t r i t i o n Board dos Estados U n i d o s de 10 para 15
m g / d i a . 4 A maioria das recomendações para a ingestão européia
está relacionada à ingestão de ácidos graxos poliinsaturados. U m a
outra modificação nas novas recomendações é de que as necessi-
dades diárias devem ser alcançadas apenas pelo RRR-a-tocoferol,
u m a vez q u e as outras formas de v i t a m i n a E n ã o são convertidas
em a-tocoferol, s e n d o p o b r e m e n t e reconhecidas pela proteína
transportadora de a-tocoferol n o fígado.
Deficiência
Recém-nascidos p r e m a t u r o s e c o m baixo peso são particular-
m e n t e suscetíveis ao desenvolvimento de deficiência de v i t a m i n a
E, u m a vez que a transferência placentária é pobre e os recém-
nascidos possuem q u a n t i d a d e s limitadas de tecido adiposo. O s
sinais da deficiência incluem (1) irritabilidade, (2) edema e (3)
anemia hemolítica. Apesar de os sintomas da deficiência de vita-
m i n a E serem raros e m crianças e adultos, a deficiência ocorre
em algumas condições. Estados de m á absorção de lipídios, c o m o
na fibrose cística e n a colestase crônica em crianças, são conhe-
cidos causadores de n e u r o p a t i a e a n e m i a hemolítica, assim c o m o
da d e s o r d e m genética a b e t a l i p o p r o t e m e m i a (as (Mipoproteínas
são t r a n s p o r t a d o r a s de v i t a m i n a E).
Toxicidade
O excesso da ingestão de v i t a m i n a E é u s u a l m e n t e atingido
apenas p o r suplementação n a dieta e p o d e causar deficiência das
vitaminas D c K, p o r competição pela absorção. U m a revisão
detalhada sobre a ; tolerância e a segurança da vitamina E sugeriu
que a ingestão de até 3 . 0 0 0 m g / d i a é segura Efeitos colaterais
reversíveis, c o m o (1) sintomas gastrointestinais, (2) creatinúria
elevada e (3) inibição da coagulação sanguínea, têm sido obser-
vados para ingestões entre 1.000 e 3.000 m g / d i a . O Food a n d
N u t r i t i o n Board dos Estados U n i d o s t e m r e c o m e n d a d o q u e o
limite m á x i m o tolerável de ingestão de v i t a m i n a E seja de 1.000
jig/dia para adultos com 19 anos ou mais. 4
COOH
/
Vitamina E
TocH o Radical peroxil
\ / o
(da peroxidação de lipídios)
V-\=/'w'00H
Toe " Radical q H i d r o p e r ó x i d o de lipídio
tocoferil
OH
 Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 495

rrV* P. CA., tjaar.Jo n" 4

.CHJ
NADPH
Desidrogenase depen-

^ T T I
CH3
dente de mDPH

NADP
<£>

Tipo Ki (me n aqui nonas) Q u i n o na

p. ex., ÍCjos) quando n - 7
Ditiol Ditiol reduzido
oxidado Warfarina,
alguns anti-

Redutase bióticos Redutase

Ditiol Ditiol
Figura 2 7 - 6 Formas vitamínicas da vitamina K.
reduzido oxidado

Avaliação Laboratorial do Estado Caiboxilase

0^, CO?
A H P L C é a t u a l m e n t e o m é t o d o p r e f e r e n c i a l para q u a n t i f i c a r os
tocofcróis n o soro. Alfa e y-tocoferóis são principais v i t â m e i o s
o b s e r v a d o s , e m b o r a o u t r o s s e j a m detectáveis c o m p e q u e n a s "R
COOH COOH
m o d i f i c a ç õ e s das c o n d i ç õ e s analíticas. C r o m a t o g r a f i a s gás-líquido I ÒH
H—C—COOH CH :
e d e c a m a d a f i n a têm sido utilizadas p a r a separar tocoferóis e I Hidroquinona
Ep óxido
tocotrienóis. CH 2 CII;
I
Proteína Proteína
Intervalos de Referência Proteína Gla
A r e c o m e n d a ç ã o para intervalos de referência para a v i t a m i n a E
n o soro ou n o p l a s m a ( h e p a r i n a ) são (1) 0,1 a 0,5 m g / d L (2,3 a Figura 27- Ciclo metabólico da vitamina K, o efeito da warfarina
11,6 | i m o l / L ) para n e o n a t o s p r e m a t u r o s , (2) 0,3 a 0,9 m / d L (7 e a formação das proteínas Gla.
a 21 jj,mol/L) para crianças (1 a 12 anos), (3) 0,6 a 1,0 m g / d L
(14 a 23 p,mol/L) para a d o l e s c e n t e s e (4) 0 , 5 a 1,8 m g / d L (12 a
4 2 |J,mol/L) p a r a a d u k o s . fígado, a d i s t r i b u i ç ã o intracelular o c o r r e p r i n c i p a l m e n t e n a
fração m i c r o s s ô m i c a . A liberação d a v i t a m i n a K para a c o r r e n t e
Vitamina K s a n g u í n e a p e r m i t e a associação c o m as p 4 i p o p r o t e í n a s circulantes
A v i t a m i n a K p r o m o v e a c o a g u l a ç ã o s a n g u í n e a e é necessária p a r a v i s a n d o ao t r a n s p o r t e p a r a o u t r o s tecidos.
a conversão d e diversos fatores d a c o a g u l a ç ã o e da p r o r r o m b i n a , E m tecidos m e t a b o l i c a m e n t e ativos e q u e utilizam v i t a m i n a
e t e m s i d o d e interesse crescente n o m e t a b o l i s m o ósseo. K, e s p e c i a l m e n t e o fígado, existe u m ciclo d e v i t a m i n a K micros-
s ô m i c o (Figura 27-7). A v i t a m i n a ( q u i n o n a ) é n o r m a l m e n t e redu-
Química zida à h i d r o q u i n o n a p o r u m sistema d e f l a v o p r o t e í n a sensível ao
O s c o m p o s t o s da série da v i t a m i n a K são as 2-metil-l,4-nafitoqui- tiol, q u e se a c o p l a ao oxigênio e ao d i ó x i d o de c a r b o n o p a r a
n o n a s , q u e a p r e s e n t a m substituições n o C 3 das cadeias laterais. f o r m a r u m a p r o t e í n a c o m r e s í d u o s y-carboxiglutamil, G l a (p. ex.,
As d u a s classes n a t u r a i s p r i n c i p a i s d e v i t a m i n a K são as filoqumo- p r o t r o m b i n a ) . O 2,3-epóxido d e v i t a m i n a K, q u e é mais t a r d e
nas (tipo Ki), sintetizadas p o r p l a n t a s , e as menaquinonas (tipo K 2 ),f o r m a d o , é r e d u z i d o para a f o r m a de v i t a m i n a K inicial ( q u i n o n a ) ,
de o r i g e m b a c t e r i a n a (Figura 27-6). Diversos análogos sintéticos u m processo i n i b i d o p o r a n t a g o n i s t a s da v i t a m i n a K, c o m o , p o r
e derivados t ê m sido utilizados n a n u t r i ç ã o h u m a n a . A m a i o r i a exemplo, a w a r f a r i n a . A p e n a s traços d e m e t a b ó l i t o s u r i n á r i o s d e
está r e l a c i o n a d a à o u é d e r i v a d a d a menadiona (K3), a q u a l n ã o v i t a m i n a s Ki e K 2 a p a r e c e m n a u r i n a . U m a p o r ç ã o considerável
a p r e s e n t a u m a s u b s t i t u i ç ã o n a posição 3 d a cadeia lateral, mas é v i t a m i n a K 3 ( m e n a d i o n a ) é c o n j u g a d a p a r a f o r m a r fi-glicuroní-
c o n v e r t i d a à m e n a q u i n o n a (MK). Esses c o m p o s t o s são d e s t r u í d o s deos e ésteres d e sulfato, q u e são excretados.
p o r soluções alcalinas e agentes r e d u t o r e s e são sensíveis à luz
ultravioleta. Funções
O papel essencial e mais b e m d e f i n i d o d a v i t a m i n a K é o d e f a t o r
Fontes Dietéticas dietético a n t i - h e m o r r á g i c o . U m a carboxilase d e p e n d e n t e de vita-
As p r i n c i p a i s f o n t e s dietéticas d e f i l o q u i n o n a s são (1) vegetais m i n a K c o n v e r t e r e s í d u o s g l u t a m i l específicos e m proteínas-alvo
verdes, (2) m a r g a r i n a s e (3) óleos vegetais, e n q u a n t o as m e n a q u i - a r e s í d u o s y-carboxiglutamil (Gla). Essa y-caiboxilação a u m e n t a a
n o n a s são o b t i d a s d e (1) q u e i j o s , (2) o u t r o s p r o d u t o s lácteos e a f i n i d a d e dessas p r o t e í n a s pelo cálcio. A v i t a m i n a K t a m b é m é
(3) ovos. necessária para a f o r m a ç ã o das p r o t e í n a s Gla (1) p r o t r o m b i n a
(fator II), (2) p r o c o n v e r t i n a (fator VII), (3) c o m p o n e n t e plasmá-
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção tico d a t r o m b o p l a s t i n a (fator IX) e (4) f a t o r de S t u a r t (fator X).
A absorção de vitamina K natural n o intestino delgado para o Essas, e m c o n j u n t o c o m d u a s o u t r a s p r o t e í n a s h e m o s t á t i c a s
sistema linfático é facilitada pela bile. A eficiência d a absorção d e p e n d e n t e s d e v i t a m i n a K, p r o t e í n a s C e S e Ca 2 + , i n i c i a m u m
varia d e 1 5 % a 6 5 % . As v i t a m i n a s Ki e K? são ligadas aos quilo- processo para f o r m a r t r o m b i n a q u e , e n t ã o , catalisa a conversão
m í c r o n s p a r a serem t r a n s p o r t a d a s das células da m u c o s a p a r a o d o f i b r i n o g ê n i o e m u m coágulo de f i b r i n a .
fígado. A m e n a d i o n a (K 3 ) é m a i s r á p i d a e c o m p l e t a m e n t e absor- P r o t e í n a s q u e c o n t é m resíduos y-carboxiglutamil t a m b é m são
vida p e l o i n t e s t i n o antes d e e n t r a r n a c o r r e n t e s a n g u í n e a . N o a b u n d a n t e s n o t e c i d o ósseo, c o m a osteocalcina c o r r e s p o n d e n d o
496 PARTE IV Analitos
a até 8 0 % d o c o n t e ú d o total d e y-carboxiglu tamil d o osso m a d u r o .
O u t r a p r o t e í n a G l a m a j o r i t á r i a , a p r o t e í n a Gla de matriz ( M G P )
- c o n t e n d o cinco resíduos ycarboxiglutamil - é encontrada na
m u s c u l a t u r a lisa vascular, n o osso e e m m u i t o s tecidos m o l e s
(coração, rins e p u l m ã o ) . Actedita-se que a M G P se a c u m u l a e m
sítios de calcificação, i n c l u i n d o as válvulas aórticas e ossos calci-
ficados, além d e ser u m p o t e n t e i n i b i d o r da calcificação.
Necessidades e Recomendações para Ingestão de
Nutrientes
E m b o r a as bactérias residentes d o i n t e s t i n o h u m a n o sintetizem
g r a n d e s q u a n t i d a d e s de m e n a q u i n o n a s , a a b s o r ç ã o desses com-
p o s t o s t e m s i d o d e difícil d e m o n s t r a ç ã o , e a restrição de v i t a m i n a
K n a dieta c o r r o b o r a essa d i f i c u l d a d e . A r e c o m e n d a ç ã o para a
ingestão d e v i t a m i n a K foi r e c e n t e m e n t e revisada pelo F o o d a n d
N u t r i t i o n B o a r d of t h e U.S. I n s t i t u t e of M e d i c i n e e é de 120
jj.g/dia p a r a h o m e n s c o m i d a d e s u p e r i o r a 18 anos e 9 0 |j,g/dia
para m u l h e r e s , i n c l u i n d o aquelas grávidas e lactantes. 6 A ingestão
de f i l o q u i n o n a n a dieta d e p o p u l a ç õ e s n o r t e - a m e r i c a n a s e n a
m a i o r i a das p o p u l a ç õ e s e u r o p é i a s e s t u d a d a s foi e s t i m a d a e m
cerca de 150 j j g / d i a para pessoas acima de 5 5 anos e 8 0 (ig/dia
p a r a i n d i v í d u o s mais jovens.
Deficiência
E m b o r a a deficiência de v i t a m i n a K e m a d u l t o s seja í n c o m u m ,
o risco a u m e n t a e m estados d e m á absorção d e g o r d u r a s (obstru-
ção de d u e t o s biliares, fibrose cística e p a n c r e a t i t e crônica) e
d o e n ç a s hepáticas. O risco t a m b é m a u m e n t a c o m o u s o d e drogas
q u e i n t e r f e r e m n o m e t a b o l i s m o d e v i t a m i n a K, tais c o m o os
a n t i c o a g u l a n t e s c u m a r í n i c o s (p. ex., w a r f a r i n a ) ' e alguns antibió-
ticos (p, ex., cefalosporina). A coagulação s a n g u í n e a d e f e i t u o s a e
a observação d e p r o t r o m b i n a a n o r m a l , n ã o carboxilada, são até
o m o m e n t o os ú n i c o s sinais b e m estabelecidos de deficiência d e
v i t a m i n a K.
A o c o r r ê n c i a de doença hemorrágica e m recém-nascidos t e m
sido a t r i b u í d a à (1) t r a n s f e r ê n c i a i n s u f i c i e n t e de v i t a m i n a K pela
p l a c e n t a , (2) i m a t u r i d a d e h e p á t i c a , l e v a n d o à síntese i n a d e q u a d a
d e p r o t e í n a s d a coagulação s a n g u í n e a e (3) baixa c o n c e n t r a ç ã o
d e v i t a m i n a K n o leite m a t e r n o n a fase inicial de a m a m e n t a ç ã o .
As c o n c e n t r a ç õ e s d e p r o t r o m b i n a d u r a n t e episódios d e h e m o r -
ragias e m n e o n a t o s são a p e n a s 2 5 % d a c o n c e n t r a ç ã o total e m
adultos. A d i a r r é i a i n t e n s a e a utilização de a n t i b i ó t i c o s p a r a
s u p r i m i r a d i a r r é i a e x a c e r b a m essa situação, d e tal f o r m a que
q u a n d o a c o n c e n t r a ç ã o d e p r o t r o m b i n a se t o r n a i n f e r i o r a 5 %
d a q u e l a d o s adultos, o c o r r e s a n g r a m e n t o . A a d m i n i s t r a ç ã o pro-
filática de 0,5 a 1,0 m g de f i l o q u i n o n a i n t r a m u s c u l a r o u d e 2,0
m g oral i m e d i a t a m e n t e após o n a s c i m e n t o evita essa c o n d i ç ã o .
Toxicidade
A utilização d e altas doses das v i t a m i n a s K de o c o r r ê n c i a n a t u r a l
(Kj e K 2 ) n ã o a p a r e n t a causar efeitos nocivos; e n t r e t a n t o , o trata-
m e n t o c o m m e n a d i o n a (K 3 ) leva à f o r m a ç ã o de inclusões cito-
plasmáticas e m eritrócitos, c o n h e c i d a s c o m o c o r p o s d e H e i n z , e
à anemia hemolítica.
Avaliação Laboratorial do Estado
Por a p r e s e n t a r c o n c e n t r a ç õ e s plasmáticas r e l a t i v a m e n t e baixas
( a p r o x i m a d a m e n t e 5 0 vezes inferiores às de v i t a m i n a D e 10 3 vezes
mais baixas d o q u e as das v i t a m i n a s A e E), a v i t a m i n a K s e m p r e
r e p r e s e n t o u u m desafio d o p o n t o de vista analítico. C o n s e q ü e n -
t e m e n t e , a avaliação d a presença de vi t ami na K t r a d i c i o n a l m e n t e
foi acessada d e m a n e i r a f u n c i o n a l , p r i m a r i a m e n t e pelo efeito da
v i t a m i n a n o t e m p o d e coagulação. O t e m p o de p r o t r o m b i n a (PT)
é analisado pela adição de t r o m b o p l a s t i n a tecidual ao plasma
recalcificado e c o m p a r a n d o o t e m p o de coagulação c o m aquele
d e u m a amostra-controle n o r m a l . N a deficiência d e v i t a m i n a K,
o P T p o d e ser s u p e r i o r a 3 0 s e g u n d o s (normal: 10 até 14 segun-
dos). Tentativas de p a d r o n i z a ç ã o i n t e r l a b o r a t ó r i o s levou à intro-
d u ç ã o d a N o r m a t i z a ç ã o I n t e r n a c i o n a l d a Razão (INR), o n d e P T
é expresso c o m o u m a f r a ç ã o de t e m p o d a amostra-controle.
A dosagem direta de f i l o q u i n o n a plasmática é, provavel-
m e n t e , o m e l h o r i n d i c a d o r d o e s t a d o d a v i t a m i n a K e t e m sido
c o r r e l a c i o n a d o a d e q u a d a m e n t e c o m a ingestão. A avaliação p o r
H P L C t i p i c a m e n t e r e q u e r 0,5 a 2,0 m L de soro o u p l a s m a e
envolve (1) a p r e c i p i t a ç ã o d e p r o t e í n a s e a extração d e lipídios
( g e r a l m e n t e e m h e x a n o ) , (2) a evaporação d o solvente, (3) u m a
H P L C preparativa (para isolar a v i t a m i n a K de o u t r o s lipídios),
(4) a reevaporação d a f r a ç ã o rica e m v i t a m i n a K, (5) diluição n a
fase móvel e (6) H P L C e q u i p a d o c o m detector e l e t r o q u í m i c o ou
f l u o r i m é t r i c o , f r e q ü e n t e m e n t e após a r e d u ç ã o pós-coluna. Tipi-
c a m e n t e , os valores de i m p r e c i s ã o e n t r e e x p e r i m e n t o s são de
11% a 18% (coeficiente de v a r i a ç ã o [CV]), c o m limites de detec-
ção inferiores a 5 0 p m o l / L .
Intervalos de Referência
O i n t e r v a l o de referência p a r a a v i t a m i n a K plasmática é 0,13 a
1,19 n g / m L (0,29 a 2 , 6 4 n m o l / L ) .
Vitamina B1 - Tiamina
V i t a m i n a B! - t a m b é m c o n h e c i d a c o m o t i a m i n a - f o r m a a coen-
zima t i a m i n a p i r o f o s f a t o (TPP). Essa ê necessária para reações
essenciais d e descarboxilação catalisadas pelos complexos piru-
v a t o d e s i d r o g e n a s e e 2-oxoglutarato d e s i d r o g e n a s e .
Química
A e s t r u t u r a da tiamina (3-[4-amino-2-metil-pirimidil-5-metil]-4-
metil-5-[p-hidroxietil]tiazol) a p r e s e n t a u m anel p i r i m í d i c o , pos-
s u i n d o u m g r u p a m e n t o a m i n o , ligado a u m anel tiazol p o r u m a
p o n t e m e t i l e n o (Figura 27-8). O tiazol tem u m a cadeia lateral d e
álcool p r i m á r i o e m C 5 , q u e é fosforilada in vivo para p r o d u z i r
ésteres d e tiamina fosfato, s e n d o o mais c o m u m a T P P ( t a m b é m
c o n h e c i d a c o m o t i a m i n a d i f o s f a t o , co-carboxilase). Esteres m o n o -
fosfato e trifosfato t a m b é m o c o r r e m .
Fontes Dietéticas
P e q u e n a s q u a n t i d a d e s de t i a m i n a e seus fosfatos estão presentes
n a m a i o r i a dos tecidos vegetais e animais, m a s as f o n t e s mais
a b u n d a n t e s são os grãos d e cereais n ã o r e f i n a d o s . O enriqueci-
m e n t o d e f a r i n h a s e de p r o d u t o s alimentícios derivados, sobre-
t u d o os cereais matinais, a u m e n t a r a m c o n s i d e r a v e l m e n t e a dis-
p o n i b i l i d a d e dessa v i t a m i n a .
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
A a b s o r ç ã o da t i a m i n a o c o r r e p r i m a r i a m e n t e n o i n t e s t i n o delgado
p r o x i m a l p o r processo saturável ( t r a n s p o r t a d o r de t i a m i n a ) e m
baixas c o n c e n t r a ç õ e s (1 ^ i m o l / L o u inferior) e p o r d i f u s ã o passiva
Mil
(li
o ei
HjC >r -s
l l
d)H ÍH
Tiamina pirofosfaco
Figura 2 7 - 8 Tiamina e a coenzima pirofosfato.

e m concentrações superiores. A tiamina absorvida é fosforilada
n a célula, p r i n c i p a l m e n t e a pirofosfato, mas, d o lado seroso, 9 0 %
da tiamina transferida está na f o r m a livre. A tiamina é transpor-
t a d a pelo sangue portal até o fígado. A vitamina livre ocorre n o
plasma, m a s a T P P é o c o m p o n e n t e celular primário. Aproxima-
d a m e n t e 3 0 m g são armazenados pelo corpo, sendo 8 0 % como
pirofosfato, 10% c o m o trifosfato e o restante como t i a m i n a e seu
m o n o f o s f a t o . As três enzimas teciduais conhecidas p o r participa-
rem n a f o r m a ç ã o dos ésteres d e fosfato são (1) tiaminoquinase,
(2) TPP-adenosina trifosfato (ATP) fosforil transferase (5'-adeni-
lico q u i n a s e citossólica) e (3) tiamina trifosfatase.
Cerca da m e t a d e dos estoques corporais é e n c o n t r a d a nos
músculos esqueléticos, sendo o restante em maior parte distribu-
ído entre coração, fígado, rins e tecidos nervosos (incluindo o
cérebro, q u e c o n t é m a maior parte do trifosfato). A meia-vida
estimada d a tiamina é de 9,5 a 18,5 dias.
Funções
A tiamina é necessária ao organismo c o m o pirofosfato (TPP) para
dois tipos gerais de reação: (1) descarboxilação oxidativa de 2-
oxiácidos catalisada p o r complexos de desidiogenases e (2) for-
mação de 2-cetóis (cetoses) catalisada pela transcetolase. A T P P
f u n c i o n a c o m o u m a coenzima c o o r d e n a d a ao Mg2+ n a conhecida
transferência de "aldeído ativo" e m complexos múltiplos enzimá-
ticos que afetam a conversão descarboxilativa dos ácidos 2-oxiá-
cidos para os derivados da acetil-coenzima A (acil-CoA), tal c o m o
na piruvato desidrogenase e n a 2-oxoglutarato desidiogenase.
Essas geralmente estão localizadas na mitocôndria, o n d e são efi-
c i e n t e m e n t e utilizadas n o ciclo de Krebs (ciclo dos ácidos tricar-
boxílicos).
A transcetolase é u m a enzima d e p e n d e n t e de TPP e n c o n t r a d a
n o citosol d e células d e diversos tecidos, especialmente fígado e
células do sangue, o n d e as principais vias metabólicas de carboi-
dratos o c o r r e m . N a via das pentoses fosfato, q u e a d i c i o n a l m e n t e
s u p r e m q u a n t i d a d e s de n i c o t i n a m i d a adenina dinucleotídeo
fosfato reduzidas (NADPH), necessárias para as reações de bios-
síntese, essa enzima catalisa a transferência reversível da porção
glicoaldeídica dos dois primeiros carbonos de u m a cetose fosfato
d o a d o r a para u m c a r b o n o aldeídico de u m a aldose fosfato.
Necessidades e Recomendações para Ingestão de
Nutrientes
C o m o a t i a m i n a é necessária para o metabolismo de carboidra-
tos, gorduras e álcool, existe u m a correlação direta e n t r e a neces-
sidade e a q u a n t i d a d e de ingestão de alimento metabolizável.
Existe u m a necessidade maior e m situações nas quais o metabo-
lismo está a u m e n t a d o (p. ex., e m condições normais de a u m e n t o
de atividade muscular, gravidez ou lactação, ou em casos anor-
mais de febre prolongada, pós-trauma e hipertireoidismo). Sinais
clínicos da deficiência em adultos são evitados com ingestões de
tiamina superiores a 0,15 a 0,2 m g / 1 . 0 0 0 kcal, m a s 0,35 a 0,4
m g / 1 . 0 0 0 kcal p o d e m estar mais próximos da q u a n t i d a d e neces-
sária para m a n u t e n ç ã o da excreção urinária e para a atividade d e
transcetolase de eritrócito d e p e n d e n t e de T P P d e n t r o dos inter-
valos de referência normais. A R D A atual é 1,2 m g / d i a para
adultos d o sexo masculino e 1,1 m g / d i a para mulheres. Necessi-
dades adicionais são r e c o m e n d a d a s na gravidez e lactação. 2
Deficiência
Beribéri é a doença resultante da deficiência de t i a m i n a . Sinais
clínicos da deficiência de t i a m i n a envolvem, p r i m a r i a m e n t e , os
sistemas nervoso e cardiovascular. N o adulto, os s i n t o m a s mais
f r e q ü e n t e m e n t e observados, são: (1) c o n f u s ã o m e n t a l , (2) anore-
xia, (3) fraqueza muscular, (4) ataxia, (5) paralisia periférica, (6)
Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 497
oftalmoplegia, (7) edema (beribéri úmido), (8) desgaste muscular
(beribéri seco), (9) taquicardia e (10) coração a u m e n t a d o . E m
recém-nascidos, os s i n t o m a s aparecem r e p e n t i n a m e n t e e são
graves, u s u a l m e n t e envolvendo falha cardíaca e cianose.
A deficiência de tiamina ocorre por (1) ingestão i n a d e q u a d a
decorrente de dietas d e p e n d e n t e s de grãos beneficiados e n ã o
enriquecidos, c o m o arroz e trigo, e (2) ingestão de peixes crus
c o n t e n d o tiaminases microbianas. O alcoolismo crônico geral-
m e n t e leva à deficiência de tiamina causada pela redução da
ingestão, d i m i n u i ç ã o na absorção e estoques reduzidos e, clinica-
mente, p o d e levar à s í n d r o m e de Wernicke-Korsakoff. O u t r o s
grupos de risco incluem (1) aqueles que recebem nutrição paren-
tal total (TPN) sem a s u p l e m e n t a ç ã o adequada de tiamina, (2)
pacientes idosos utilizando diuréticos e (3) pacientes que fazem
diálise por m u i t o tempo.
Toxicidade
N ã o são conhecidos relatos de efeitos adversos por c o n s u m o
excessivo de tiamina de alimentos e s u p l e m e n t o s (suplementos
de 50 m g / d i a são a l t a m e n t e disponíveis sem prescrições).
Avaliação Laboratorial do Estado
C o m o a f u n ç ã o biológica básica da tiamina é a de agir c o m o co-
f a t o r de pirofosfato e m vários sistemas enzimáticos, duas estraté-
gias diferentes de avaliação do estado são utilizadas. E m u m a , o
analito, livre ou fosforilado, é d o s a d o d i r e t a m e n t e e m u m f l u i d o
corporal ou e m u m tecido apropriado. N a segunda, as proprie-
dades de co-fator enzimático são exploradas n u m ensaio funcio-
nal. A m b a s as estratégias têm vantagens e desvantagens, mas u m
consenso sobre qual é a mais útil ainda n ã o foi alcançado; as duas
são provavelmente complementares, cada u m a a p r e s e n t a n d o
alguma, mas n ã o todas, as informações necessárias para avaliar a
tiamina a d e q u a d a m e n t e .
A enzima mais c o m u m e n t e utilizada para o ensaio f u n c i o n a l
é a transcetolase, e estão disponíveis variados m é t o d o s para a sua
dosagem. N o p r o c e d i m e n t o de Brin, as atividades das formas
holo e apo de transcetolase de eritrócitos h e m o h s a d o s são
medidas antes e depois da adição de TPP. O teste de ativação da
transcetolase é feito em d u a s etapas: u m a m e d e a atividade basal,
e a outra, o grau e m que a atividade basal é a u m e n t a d a pela T T P
exógena, e cada u m a é i n f l u e n c i a d a p o r diferentes fatores. Existem
evidências de que, e m estados de deficiência crônica, a síntese de
a p o e n z i m a p o d e diminuir. E m estudos comparativos das concen-
trações de T P P em eritrócitos, as melhores correlações são obtidas
com a atividade basal, e n ã o com o coeficiente de ativação.
A dosagem direta da c o n c e n t r a ç ã o de tiamina circulante p o d e
ser feita n o plasma, nos eritrócitos ou n o sangue total. Acredita-
se que a concentração n o plasma ou n o soro reflete a ingestão
recente e é, principalmente, t i a m i n a n ã o fosforilada e e m baixas
concentrações (em torno de 10 a 20 n m o l / L ) . C o m o o eritrócito
c o n t é m a p r o x i m a d a m e n t e 8 0 % d o total de tiamina do sangue
total maioritariamente c o m o pirofosfato, e os estoques dos eri-
trócitos são depletados e m taxas similares a outros órgãos princi-
pais, a dosagem de T P P e m eritrócitos, por H P L C , é u m b o m
indicador de estoques corporais. M é t o d o s típicos e m p r e g a n d o a
H P L C incluem (1) u m a etapa d e precipitação de proteínas, (2)
formação do f l u o r ó f o r o t i o c r o m o pré- ou pós-coluna, u s u a l m e n t e
com ferricianeto alcalino e (3) separação isocrática. Amostras de
sangue total p o d e m ser analisadas de maneira similar para eritró-
citos lavados.
Intervalos de Referência
Algumas orientações de intervalos de referência para a atividade
da transcetolase de eritrócito são de 0,75 a 1,30 U / g H b (48,4 a
498 PARTE IV Analitos
83,9 k U / m o l H b ) e, para o efeito n a p e r c e n t a g e m d e T P P (ativa-
ção), 0 % a 1 5 % c o n s i d e r a d o n o r m a l , 16% a 2 5 % m a r g i n a l m e n t e
d e f i c i e n t e e > 2 5 % g r a v e m e n t e d e f i c i e n t e c o m sinais clínicos. Para
d o s a g e n s d i r e t a s d a c o n c e n t r a ç ã o de TPP, os intervalos típicos
são 173 a 2 9 3 n m o l / L p a r a eritrócitos e 9 0 a 140 n m o l / L para
sangue total.
Vitamina B2 - Riboflavina
A v i t a m i n a B 2 , t a m b é m c o n h e c i d a c o m o riboflavina, é u m com-
p o n e n t e essencial das coenzimas d e flavina a d e n i n a dinucleotí-
d e o (FAD) e flavina m o n o n u c l e o t í d e o (FMN), q u e estão envolvi-
das e m m u i t a s reações redox.
Química
V i t a m i n a B z refere-se à r i b o f l a v i n a e seus m e t a b ó l i t o s relaciona-
dos, q u e a t u a m c o m o co-fatores de diversas enzimas envolvidas
e m reações d e redução-oxidação. O c o m p o s t o p a r e n t a l , ribofla-
vina (7,8-dimetil-10-[r-D-ribitil]isoaloxazina) é u m c o m p o s t o
a m a r e l o f l u o r e s c e n t e . Seu p a p e l fisiológico p r i n c i p a l é a t u a r
c o m o p r e c u r s o r d e F M N (riboflavina-5'-fosfato) e FAD. A forma-
ção d o F M N , pela ação da f l a v i n o q u i n a s e , se d á pela fosforilação
d e r i b o f l a v i n a , e o F A D é f o r m a d o pela ação de F A D sintase, a
partir de F M N e A T P (Figura 27-9). As flavinas são termoestáveis,
p o r é m são sensíveis à luz.
Fontes Dietéticas
F o n t e s ricas das f o r m a s da c o e n z i m a são o fígado, r i m e o c o r a ç ã o .
M u i t o s vegetais t a m b é m c o n s t i t u e m boas fontes, assim c o m o o
leite, mas os cereais a p r e s e n t a m baixo teor d e flavina. E n t r e t a n t o ,
as práticas a t u a i s d e f o r t a l e c i m e n t o e e n r i q u e c i m e n t o destes
ú l t i m o s os fizeram c o n t r i b u i n t e s significantes d a d e m a n d a
diária.
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
A m a i o r q u a n t i d a d e de r i b o f l a v i n a d a dieta é c o n s u m i d a c o m o
u m c o m p l e x o d e p r o t e í n a s d o s a l i m e n t o s c o m as c o e n z i m a s F M N
e FAD. Essas c o e n z i m a s são liberadas da associação n ã o c o v a l e n t e
a p r o t e í n a s pela acidificação gástrica. A v i t a m i n a é absorvida,
p r i m a r i a m e n t e , pelo i n t e s t i n o d e l g a d o p r o x i m a l p o r u m transpor-
t a d o r saturável, d e m a n e i r a r á p i d a e p r o p o r c i o n a l à ingestão,
a n t e s d e atingir u m p l a t ô e m d o s e s p r ó x i m a s a 27 m g de ribofla-
vina p o r dia. O s sais biliares a p a r e n t e m e n t e facilitam a a b s o r ç ã o .
O t r a n s p o r t e de f l a v m a s pela c o r r e n t e s a n g u í n e a h u m a n a envolve
a ligação f r o u x a à a l b u m i n a e f o r t e a várias globulinas, particu-
l a r m e n t e i m u n o g l o b u l i n a s . A c a p t a ç ã o de r i b o f l a v i n a pelas
células d o s ó r g ã o s é u m processo q u e r e q u e r u m c a r r e a d o r espe-
FAD
Figura 2 7 - 9 Riboflavina e FMN como componentes do FAD,
cífico e m c o n c e n t r a ç õ e s fisiológicas. E m altas c o n c e n t r a ç õ e s , a
c a p t a ç ã o acontece p o r d i f u s ã o passiva.
A conversão d e r i b o f l a v i n a a c o e n z i m a s o c o r r e n o c i t o p l a s m a
de células d a m a i o r i a d o s tecidos, mas, p a r t i c u l a r m e n t e , n o intes-
tino delgado, fígado, c o r a ç ã o e r i m . O p r i m e i r o passo, t a m b é m
obrigatório, é a fosforilação d e p e n d e n t e de A T P d a v i t a m i n a
catalisada pela f l a v i n o q u i n a s e . O p r o d u t o F M N é c o m p l e x a d o
c o m a p o e n z i m a s específicas p a r a f o r m a r diversas f l a p r o t e í n a s
f u n c i o n a i s , mas a m a i o r p a r t e é p o s t e r i o r m e n t e c o n v e r t i d a e m
F A D n u m a s e g u n d a reação d e p e n d e n t e d e A T P e catalisada pela
F A D sintase (pirofosfortlase). E m v i r t u d e d e o e s t o q u e de ribo-
flavina ser baixo, a excreção u r i n á r i a reflete a ingestão diária.
Funções
As coenzimas de r i b o f l a v i n a são aptas a participar d e processos
de t r a n s p o r t e d e u m e d e dois e l é t r o n s e têm u m p a p e l central
n o a c o p l a m e n t o da via d e o x i d a ç ã o d e dois elétrons da m a i o r i a
dos substratos p a r a a t r a n s f e r ê n c i a d e u m e l é t r o n d a cadeia res-
piratória, e s t a n d o , assim, envolvidas n a p r o d u ç ã o d e energia.
A d i c i o n a l m e n t e , as f l a v o p r o t e í n a s catalisam reações d e (1) desi-
drogenações, (2) hidroxilações, (3) descarboxilações oxidativas,
(4) desoxigenações e (5) r e d u ç õ e s d e oxigênio a p e r ó x i d o d e
h i d r o g ê n i o . O u t r a s f u n ç õ e s i m p o r t a n t e s da r i b o f l a v i n a i n c l u e m
o m e t a b o l i s m o d e drogas e m c o n j u n ç ã o c o m enzimas c i t o c r o m o
P-450 e o m e t a b o l i s m o d e lipídios.
As flavinas t a m b é m a p r e s e n t a m atividades pró-oxidativas e
antioxidativas. Acredita-se q u e essas c o n t r i b u e m p a r a a u m e n t a r o
estresse oxidativo, peta c a p a c i d a d e de p r o d u z i r s u p e r ó x i d o e p o r
catalisar a p r o d u ç ã o d e p e r ó x i d o d e h i d r o g ê n i o . C o m o anti-oxi-
d a n t e , o F A D é u m a c o e n z i m a da g l u t a t i o n a Tedutase n a regene-
ração d e glutationa reduzida a p a r t i r de glutationa oxidada, neces-
sária para a r e m o ç ã o de p e r ó x i d o s d e lipídios. A deficiência d e
riboflavina está associada ao a u m e n t o n a peroxidação d e lipídios.
As flavinas t a m b é m t ê m a h a b i l i d a d e de d i m i n u i r as concentra-
ções de homocisteína, s e n d o o F A D u m co-fator d a metilenote-
t r a i d r o f o l a t o r e d u t a s e n a remetilação da h o m o c i s t e í n a .
Necessidades e Recomendações para Ingestão de
Nutrientes
A avaliação da n e c e s s i d a d e d e r i b o f l a v i n a é f u n d a m e n t a d a n a
relação e n t r e a ingestão e os sinais óbvios de (1) h i p o r r i b o f l a v i -
nose, (2) excreção d a v i t a m i n a pela u r i n a , (3) c o n t e ú d o de ribo-
flavina e m eritrócitos e (4) atividade d e g l u t a t i o n a r e d u t a s e e m
eritTÓcitos. C o m base e m c o n s i d e r a ç õ e s c o m o essas, a R D A atual
foi f i x a d a e m 1,3 m g / d i a p a r a h o m e n s a d u l t o s e 1,1 m g / d i a para
m u l h e r e s . Necessidades a d i c i o n a i s são sugeridas n a gravidez e
lactação.
Deficiência
A deficiência de r i b o f l a v i n a é caracterizada por (1) d o r de gar-
ganta, (2) hipeTemia, (3) e d e m a s de m e m b r a n a s d a f ar i nge e d a
m u c o s a oral, (4) queilose, (5) e s t o m a t i t e angular, (6) glossite
(língua c o m coloração m a g e n t a ) , (7) d e r m a t i t e seborréica e (8)
a n e m i a n o r m o c í t i c a e normocTÔmica. E n t r e t a n t o , alguns desses
s i n t o m a s , c o m o glossite e d e r m a t i t e , q u a n d o e n c o n t r a d o s nesse
cenário, p o d e m ser r e s u l t a n t e s de complicações associadas a
o u t r a s deficiências.
A p e s a r de a r i b o f l a v i n a ser a m p l a m e n t e e n c o n t r a d a e m ali-
m e n t o s , m u i t a s pessoas vivem l o n g o s p e r í o d o s d e baixa ingestão,
e, c o n s e q ü e n t e m e n t e , sinais discretos d a deficiência são c o m u n s
e m m u i t a s partes d o m u n d o . E m adição à ingestão i n s u f i c i e n t e ,
a deficiência f u n c i o n a l t e m s i d o i n d u z i d a p o r doenças, tais c o m o
h i p o t i r e o i d i s m o e insuficiência adrenal, q u e i n i b e m a conversão
d e r i b o f l a v i n a às respectivas coenzimas. E m v i r t u d e da a m p l a

distribuição das coenzimas d e f l a v i n a rio m e t a b o l i s m o i n t e r m e -
d i á r i o e d o e n v o l v i m e n t o n o m e t a b o l i s m o d o ácido fólico, a
deficiência e m (1) p i r i d o x i n a , (2) v i t a m i n a K e (3) n i a c i n a afetará
sistemas enzimáticos adicionais àqueles q u e r e q u e r e m c o e n z i m a s
de f l a v m a .
Toxicidade
P r o v a v e l m e n t e c o m o r e s u l t a d o das limitações de s o l u b i l i d a d e e
a b s o r ç ã o gástrica, n e n h u m efeito adverso t e m sido associado
à ingestão d e riboflavina n o t a v e l m e n t e acima das c o n c e n t r a ç õ e s
da RDA.
Avaliação Laboratorial do Estado
O estado n u t r i c i o n a l da riboflavina é avaliado (1) pela d e t e r m i n a -
ção da excreção urinária d a riboflavina, (2) p o r u m ensaio funcio-
nal utilizando o coeficiente de ativação d a estimulação da enzima
glutationa r e d u t a s e pelo F A D o u (3) p o r dosagens diretas d e ribo-
flavina, ou dos seus metabólitos n o plasma ou nos eritrócitos.
A r i b o f l a v i n a u r i n á r i a é d o s a d a p o r f l u o r i m e t r i a e procedi-
m e n t o s m i c r o b i o l ó g i c o s , mas, p a r a m e d i d a s especificas, a H P L C ,
c o m b i n a d a c o m a detecção f l u o r i m é t r i c a , é o m é t o d o p r e f e r e n -
cial. E m c o n d i ç ã o de ingestão a d e q u a d a , a q u a n t i d a d e excretada
d i a r i a m e n t e é s u p e r i o r a 120 (J.g ou 8 0 p.g/g d e c r e a t i n i n a . C o n -
dições q u e l e v a m a u m b a l a n ç o negativo de n i t r o g ê n i o e a admi-
nistração d e a n t i b i ó t i c o s e d e t e r m i n a d o s psicotrópicos (derivados
d a fenotiazina) elevam as c o n c e n t r a ç õ e s d e riboflavina n a u r i n a ,
c o m o c o n s e q ü ê n c i a d a d e p l e ç ã o tecidual e d e s l o c a m e n t o .
U m m é t o d o f u n c i o n a l u s u a l p a r a avaliar o estado d a ribofla-
vina é a d e t e r m i n a ç ã o da atividade de g l u t a t i o n a r e d u t a s e e m
eritrócitos e o a u m e n t o da atividade com a i n c u b a ç ã o n a p r e s e n ç a
de F A D exógeno. 1 2 A maioria dos m é t o d o s avalia a velocidade de
variação d a absorvância, e m 3 4 0 n m , causada pela oxidação d o
N A D P H , e foi a u t o m a t i z a d a p a r a a o b t e n ç ã o rápida d e r e s u l t a d o s
e C V s inferiores a 2 % d e n t r o d e u m a avaliação, apesar d e alguns
utilizarem a detecção de fluorescência. E m deficiência p r o l o n g a d a
de riboflavina, a atividade d a a p o e n z i m a p o d e ser reduzida,
l e v a n d o a u m cálculo i n c o r r e t o d o coeficiente de atividade.
As d o s a g e n s diretas d e r i b o f l a v i n a , F M N e F A D e m eritróci-
tos ou n o p l a s m a p o d e m ser realizadas p o r H P L C , u s u a l m e n t e
c o m a detecção p o r f l u o r e s c ê n c i a após a precipitação p r o t é i c a o u
p o i eletroforese de z o n a de capilaridade, c o m a d e t e c ç ã o d a flu-
orescência i n d u z i d a p o r laser.
Intervalos de Referência
O s intervalos d e referência p a r a a r i b o f l a v i n a de eritrócitos, uti-
lizando o m é t o d o f l u o r i m é t r i c o , é d e 10 a 5 0 |Ug/dL (266 a 1.330
n m o l / L ) e p a r a c o n c e n t r a ç õ e s plasmáticas é de 4 a 24 fJ.g/dL (106
a 6 3 8 n m o l / L ) . A o r i e n t a ç ã o p a r a intervalos de referência p a r a
o c o e f i c i e n t e d e ativação da g l u t a t i o n a r e d u t a s e p o r F A D , e m
eritrócitos, é d e 1,20 (adequação), 1,21 a 1,40 (deficiência margi-
nal) e 1,41 o u s u p e r i o r (deficiência). 1
R
Figura 2 7 - 1 0 Formas livre e fosforilada da vitamina B^. R =
C H 2 O H para piridoxina, C H 2 N H 2 para piridoxamina e C H O para
piridoxal
Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 499
Vitamina B6 - Piridoxina, Piridoxamina e
Piridoxal
A piridoxina (piridoxal), a piridoxamina e o piridoxal são as três
f o r m a s n a t u r a i s de v i t a m i n a B 6 . Essas são convertidas e m pirido-
xal fostato, q u e é r e q u e r i d o p a r a a síntese, c a t a b o l i s m o e inter-
conversão de a m i n o á c i d o s .
Química
As três f o r m a s naturais: (1) piridoxina (piridoxol) (PN), (2) pirido-
xamina (PM) e (3) piridoxal (PL) são p i r i d i n a s 2'metil-3-hidroxil-5-
h i d r o x i m e t i l substituídas em C 4 (Figura 27-10). D u r a n t e as con-
versões metabólicas, cada v i t â m e r o é f o s f o r i l a d o n a p o s i ç ã o 5-
hidroximetil. E m b o r a a p i r i d o x a m i n a 5' fosfato (PMP) e o piri-
doxal 5 ' fosfato (PLP, P-5'-P) s e j a m f o r m a s interconversíveis de
coenzimas e m reações catalisadas p o r a m i n o t r a n s f e r a s e (transa-
minase), PLP é a f o r m a q u e p a r t i c i p a n a a m p l a m a i o r i a das
reações d e p e n d e n t e s d e v i t a m i n a B^-
Fontes Dietéticas
A vitamina Bfi é a m p l a m e n t e distribuída e m tecidos animais e de
plantas o n d e as f o r m a s fosforiladas, particular m e n t e o PLP, predo-
m i n a m . Carnes, aves e peixes são boas fontes, assim c o m o levedu-
ras, d e t e r m i n a d a s sementes, farelo e b a n a n a s . Cereais fortificados
p r o n t o s para o c o n s u m o têm sido i m p o r t a n t e s f o n t e s dessa vita-
m i n a . A f o r m a comercial da v i t a m i n a mais c o m u m é o hidrocloreto
de piridoxina, que é u m sólido hidrossolúvel, b r a n c o e cristalino.
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
As f o n t e s de o r i g e m a n i m a l c o n t ê m p r i n c i p a l m e n t e PLP c o m
alguma PMP, e n q u a n t o as f o n t e s vegetais c o n t ê m t a m b é m piri-
d o x i n a 5 ' glicosídio, q u e é a b s o r v i d a d e m a n e i r a d i f e r e n t e . As
f o r m a s fosforiladas são h i d r o l i s a d a s pela ação i n t r a l u m i n a l da
fosfatase alcalina intestinal, m a s o p i r i d o x i d i n a 5'glicosídio é
h i d r o l i s a d o p o r glicosidases inespecíficas n o i n t e r i o r das células
de m a n e i r a m e n o s eficiente. O s v i t ã m e r o s não-fosforilados são
p r o n t a m e n t e absorvidos pelas células da m u c o s a p o r d i f u s ã o
passiva. A q u i , c o m o e m o u t r a s células q u e n e c e s s i t a m de B 6 , os
v i t ã m e r o s não-fosforilados p o d e m ser " a p r i s i o n a d o s " metabolica-
m e n t e nas f o r m a s fosforiladas pela f o r m a citoplasmática d a piri-
doxal q u i n a s e , responsável p e l a catálise d e p e n d e n t e de A T P das
três f o r m a s d e v i t a m i n a s . O s v i t ã m e r o s são d e f o s f o r i l a d o s a n t e s
de serem t r a n s p o r t a d o s para o fígado, via veia p o r t a l .
A Figura 27-11 m o s t r a o m e t a b o l i s m o intracelular da vita-
m i n a Bg. A m a i o r i a das células c o n t é m u m a p i r i d o x i n a (pirido-
x a m i n a ) ^ ' - f o s f a t o oxidase d e p e n d e n t e de F M N responsável p o r
catalisar a conversão d e p e n d e n t e d e oxigênio d a p i r i d o x i n a
fosfato e d a p i r i d o x a m i n a f o s f a t o a P L P (e p e r ó x i d o de hidrogê-
nio). A PLP e n t r a d i r e t a m e n t e n a s organelas celulares, c o m o
m i t o c ô n d r i a s de h e p a t ó c i t o s se ligam a n u m e r o s a s a p o e n z i m a s
específicas p a r a realizar f u n ç õ e s catalíticas p o r t o d a a célula. E m
adição, os eritrócitos a p r i s i o n a m P L P c o m o u m a base d e Schiff
conjugada c o m hemoglobina. A vitamina B6 muscular representa
8 0 % d o s estoques c o r p o r a i s , m a i o r i t a r i a m e n t e c o m o PLP ligado
a glicogênio fosforilase. Acreditasse q u e o estoque total d e vita-
m i n a B 6 n o c o r p o seja cerca d e 1 m m o l .
A liberação d a v i t a m i n a livre, p r i n c i p a l m e n t e piridoxal,
ocorre q u a n d o c o n c e n t r a ç õ e s fisiológicas n ã o - s a t u r a n t e s são
absorvidas. O s fosfatos são e n t ã o h i d r o l i s a d o s pela fosfatase alca-
lina inespecífica localizada n a m e m b r a n a plasmática. A l g u m PLP
é t a m b é m liberado n a circulação p e l o fígado. E m b o r a a PLP seja
a p r i n c i p a l f o r m a tecidual d a v i t a m i n a B 6 e o piridoxal c o n s t i t u a
m u i t o da v i t a m i n a circulante, o p r i n c i p a l c a t a b ó l i t o excretado n a
u r i n a é o ácido 4-piridóxico (4-PA).
500 PARTE IV Analitos
Difusão e/ou transporte para/do sangue
Piíidoxamina Piridoxal
\ / \ /* Pi
/ \ /ATt>
"A A-TA k
QuiruiSe
ADP
Piridoxamina Piridoxal 5'-
5'-fosfaco fosfato
Obridose
V- y
Figura 27-11
Funções
C o m o c o e n z i m a PLP, a v i t a m i n a B 6 f u n c i o n a e m mais d e u m a
c e n t e n a d e reações e n v o l v e n d o o m e t a b o l i s m o d e m a c r o n u t r i e n -
tes. E s p e c i a l m e n t e , diversas são as enzimas d e p e n d e n t e s d e PLP
envolvidas n o m e t a b o l i s m o de a m i n o á c i d o s e q u e ligam esse
m e t a b o l i s m o às reações cetogênicas e glicogênicas. O u t r o s exem-
plos d e enzimas d e p e n d e n t e s de PLP são (1) a m i n o á c i d o descar-
boxilases, q u e levam à f o r m a ç ã o d e a m i n a s (p. ex., e p i n e f r i n a ,
n o r e p i n e f r i n a , s e r o t o n i n a e y - a m i n o b u t i r a t o ) , (2) cistefna desulfi-
drase e s e r i n o hidroximetiltranfeTase, q u e utiliza PLP para inter-
ferir n a p e r d a ou t r a n s f e r ê n c i a de cadeias laterais de a m i n o á c i d o s ,
(3) fosforilase, q u e catalisa a fosforólise das ligações a - 1 , 4 d o
glicogênio, e (4) c i s t a t i o n i n a p-sintase, n a via d e t r a n s u l f u r a ç ã o
d a h o m o c i s t e í n a . A d i c i o n a l m e n t e , a biossíntese d o g r u p a m e n t o
h e m e d e p e n d e d a f o r m a ç ã o inicial de 5 - a m i n o l e v u l i n a t o a p a r t i r
da c o n d e n s a ç ã o d e glicina e succinil-CoA d e p e n d e n t e d e PLP,
seguida d a descaboxilação, e u m i m p o r t a n t e papel n o m e t a b o -
lismo d e lipídios é a c o n d e n s a ç ã o d e p e n d e n t e de PLP d a L-serina
com o palmitoil-CoA para formar a 3-deidroesfinganina, u m
p r e c u r s o r de esfingomielinas.
Necessidades e Recomendações para Ingestão de
Nutrientes
A necessidade de v i t a m i n a Bg é a m p l a m e n t e relacionada c o m a
ingestão de proteínas. 2 A p r o p o r ç ã o de 0,016 mg de vitamina
Bfc/g de p r o t e í n a ingerida é sugerida para adultos n o r m a i s e p o d e
seT extrapolada para crianças e adolescentes. As RDAs propostas
são 1,3 m g / d i a para h o m e n s c o m até 5 0 anos e 1,7 m g / d i a para
h o m e n s c o m idade superior; para m u l h e r e s entre 19 e 50 anos, 1,3
m g / d i a , e acima de 50 anos, 1,5 m g / d i a . U m a s u p l e m e n t a ç ã o de
0,6 m g / d i a é sugerida n a gravidez, e d e 0,5 m g / d i a , n a lactação. 2
Deficiência
A deficiência d e v i t a m i n a B 6 isolada é i n c o m u m , s e n d o mais
u s u a l m e n t e associada a déficits de outras v i t a m i n a s d o c o m p l e x o
B. A s s i m c o m o para outras v i t a m i n a s hidrossolúveis q u e f u n c i o -
n a m c o m o coenzimas, a s i n t o m a t o l o g i a progressiva d a deficiência
dessa v i t a m i n a é d e p e n d e n t e da a f i n i d a d e relativa d a c o e n z i m a
para u m a d a d a a p o e n z i m a e d a e x t e n s ã o n a qual a reação catalisa
pela h o l o e n z i m a é essencial. A l g u m a s interações c o m drogas
levam à h i p o v i t a m i n o s e (avitaminose) da v i t a m i n a B 6 . 2 Essas
i n c l u e m a droga a n t i t u b e r c o l o s e isoniazida (hidrazida d o ácido
isonicotínico), q u e forma h i d r a z o n a s c o m o piridoxal e c o m o
PLP, a p e n i c i l a m i n a , as drogas c o n t r a o m a l de P a r k i n s o n , b e n -
serazida, c a r b i d o p a e teofilina.
Existem diversos erros i n a t o s d o m e t a b o l i s m o responsivos à
v i t a m i n a B^, q u e i n c l u e m (1) convulsões e m recém-nascidos, e m
Aldeído
oxidíLse
*" Ácido pirídáxico Piridoxina
lumasí
*.V
?r \ /"ATP
V
Fosfatase uiitase
ADP
Ja* ADP
H,0
Piridoxina
5 -fosfato
Oxida se
Metaholismo da vitamina
q u e a a p o e n z i m a da g l u t a m a t o descarboxilase t e m a f i n i d a d e defi-
ciente pela coenzima, (2) acidúria x a n t u r ê n i c a , e m q u e a afini-
d a d e d a c i n u r e n i n a s e m u t a n t e pelo PLP é d i m i n u í d a e (3) h o m o -
cistinúria c a u s a d a p o r u m a c i s t a t i o n i n a P-sintase t a m b é m defei-
tuosa. N e s t e s casos, q u a n t i d a d e s m a i o r e s (200 a 1.000 m g / d i a )
d e v i t a m i n a a d m i n i s t r a d a são necessárias p o r t o d a a vida d o
paciente. O estado baixo da v i t a m i n a B 6 (em c o n j u n t o c o m a
v i t a m i n a B l 2 baixa e o estado d o folato) e m h u m a n o s foi relacio-
n a d o à h i p e r - h o m o c i s t e i n e m i a , u m f a t o r d e risco i n d e p e n d e n t e
p a r a a d o e n ç a cardiovascular.
C l i n i c a m e n t e , a n o r m a l i d a d e s eletroencefalográficas apare-
c e m d e n t r o d e três s e m a n a s e as convulsões e p i l e p t i f o r m e s são
c o m u n s e m i n d i v í d u o s jovens deficientes de v i t a m i n a B^. A l é m
disso, o c o r r e m m u d a n ç a s n a pele, i n c l u i n d o d e r m a t i t e c o m quei-
tose e glossite. M a n i f e s t a ç õ e s hematológicas p o d e m incluir dimi-
n u i ç ã o n o n ú m e r o de linfõcitos circulantes e, possivelmente,
a n e m i a n o r m o c í t i c a , microcítica o u sideroblástica.
Toxicidade
A p e s a r de n ã o serem c o n h e c i d o s relatos d e efeitos adversos p o r
c o n s u m o excessivo d e a l i m e n t o s c o n t e n d o a v i t a m i n a Bs, suple-
m e n t o oral c o n t e n d o altas doses p r o v o c a m efeitos n e u r o t ó x i c o s
e fotossensibilidade. C o m base n o p o n t o f i n a l d o desenvolvi-
m e n t o de n e u r o p a t i a sensorial, n o s E s t a d o s U n i d o s , as r e c o m e n -
dações atuais d e t e r i n i n a m u m a c o n c e n t r a ç ã o m á x i m a tolerável
p a r a a ingestão de 100 m g / d i a p a r a adultos.
Avaliação Laboratorial do Estado
A s s i m c o m o para o u t r a s v i t a m i n a s d o c o m p l e x o B q u e funcio-
n a m c o m o coenzimas, a avaliação b i o q u í m i c a da v i t a m i n a B 6 é
realizada p o r análises q u í m i c a s diretas d o v i t ã m e r o o u d e seus
metabólitos, o u p o r testes f u n c i o n a i s . Por exemplo, técnicas ana-
líticas são utilizadas para m e d i r (1) PLP n o plasma o u e m células
vermelhas, (2) seu m e t a b ó l i t o 4-PA n a u r i n a ou plasma, (3) a
atividade e o coeficiente de ativação das a m i n o t r a n s f e r a s e s (aspar-
tato e alanina) das células v e r m e l h a s e (4) a excreção de m e t a b ó -
lito n o teste d e sobrecarga de t r i p t o f a n o 1 . C o m o n e n h u m analito
Teflete a d e q u a d a m e n t e o estado, u m a c o m b i n a ç ã o desses marca-
dores oferece a m e l h o r a p r o x i m a ç ã o .
PLP plasmático e 4-PA u r i n á r i o o u plasmático são os mais
c o m u m e n t e d o s a d o s p o r H P L C . PLP é d o s a d o pela detecção da
f l u o r e s c ê n c i a dos f l u o r ó f o r o s p r é - f o r m a d o s s e m i c a b a z o n e ou u m
ácido p i r i d ó x i d o f o s f a t o . E d o s a d a a f l u o r e s c ê n c i a n a t u r a l d e
4-PA. U m m é t o d o h o m o g é n e o e n ã o radioativo utilizando u m a
e n z i m a r e c o m b i n a n t e para avaliar PLP foi descrito e e m p r e g a 5
|iL de plasma, t e m limite de detecção de 5 n m o l / L e p o d e ser
a d a p t a d o a u m analisador a u t o m a t i z a d o .

A avaliação f u n c i o n a l do estado da vitamina B 6 p o d e ser
realizada pela atividade e o coeficiente de ativação da aspartato
(ou alanina) aminotransferase das células vermelhas incubadas
c o m PLP. Esses testes são m e n o s robustos que aqueles emprega-
dos para as vitaminas Bi e B 2 e considerados m e n o s práticos. A
dosagem de metabólitos urinários de triptofano, particularmente
o ácido x a n t u r ê n i c o , após a carga oral de 2 a 5 g de L-triptofano,
é u m dos índices mais c o m u n s utilizados para estudar o estado
n u t r i c i o n a l p o r q u e as m u d a n ç a s são conhecidas p r e c o c e m e n t e e
as dosagens são relativamente fáceis.
Intervalos de Referência
A orientação do intervalo de referência para o PLP plasmático é
de 5 a 30 n g / m L (20 a 121 n m o l / L ) . C o n c e n t r a ç õ e s plasmáticas
inferiores a 5 n g / m L (20 n m o l / L ) são consideradas deficientes.
Coeficientes de ativação inferiores a cerca de 1,5 para aspartato
aminotransferase e 1,2 para alanina aminotransferase são consi-
derados normais, mas d e p e n d e m , em u m certo nível, do m é t o d o
utilizado.
Vitamina B12 - Cianocobalamina
A vitamina B ) 2 t a m b é m é conhecida c o m o ; c i a n o c o b a l a m i n a . E
u m a v i t a m i n a hidrossolúvel e hematopoiética, necessária à matu-
ração dos eritrócitos.
Química
V i t a m i n a B ) 2 é u m t e r m o genérico que se refere ao grupo fisio-
logicamente ativo de substâncias q u i m i c a m e n t e classificadas
como c o b a l a m m a s o u corrinóides. Estes são compostos de anéis
tetrapirólicos que circundam á t o m o s centrais de cobalto e de
cadeias nucleotídicas laterais ligadas ao cobalto. O anel tetrapi-
rólico, composto exclusivamente de cobalto e outras cadeias late-
rais, é d e n o m i n a d o c o m n a . Todos os compostos que apresentam
esse núcleo de corrina são d e n o m i n a d o s corrinóides. O com-
plexo cobalto-corrma é d e n o m i n a d o c o b a m i d a (Figura 27-12).
As cobalaminas diferem entre si pela natureza dos grupos
laterais adicionais ligados ao cobalto. Exemplos são metil (metil-
cobalamina), 5'-desoxiadenosina ([desoxiadenosil ou adenosil]
cobalamina), hidroxil (hidroxocobalamina), H 2 0 (aquacobala-
mina) e cianeto (cianocobalamina). A cianocobalamina é u m
composto estável que forma cristais vermelhos escuros em f o r m a
de agulha. Esse é o composto de referência utilizado como cali-
b r a d o r em m é t o d o s de m e d i d a de cobalamina sérica. A forma
NH:
N-( N 5 '-deoxiadenosil-
N=^
CHj-s p
| OH QRI
cobamida
5:6-dimetil
-benzim jdaiol
CH2OH
Figura 2 7 - 1 2 Estrutura cia S^deoxiadenosil c o b a l a m i n a ( M o d i f i c a d o
d e C h a n a r i n I: T h e megaloblastic anemias, 2 n d ed, O x f o r d : Blackwell
Scientific, 1979 )
Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 501
fisiológica p r e d o m i n a n t e de cobalamina sérica é a metilcobala-
m m a , e n q u a n t o a citossólica é a adenosilcobalamina. A cianoco-
balamina tem peso molecular d e 1.335 D a e é g r a d u a l m e n t e
destruída pela exposição à luz.
Fontes Dietéticas
Toda a vitamina Bj 2 é, em última análise, u m p r o d u t o de síntese
microbiana, e, em v i r t u d e das plantas n ã o utilizarem essa vita-
mina, as principais fontes na dieta são (1) carnes e derivados, (2)
laticínios, (3) peixes e mariscos e (4) cereais fortificados p r o n t o s
para a ingestão.
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
A captação de vitamina B n a partir d o intestino para a circulação
é u m m e c a n i s m o complexo q u e envolve cinco moléculas de
ligação à vitamina B12, receptores e transportadores. A vitamina
B12 liberada do alimento n o estômago se liga à h a p t o c o r r i n a
(proteína R, u m a proteína da saliva) e viaja associada até o intes-
tino, o n d e a h a p t o c o r r i n a é hidrolisada por enzimas pancreáticas.
A vitamina B ] 2 liberada se liga, então, ao fator intrínseco (IF),
u m a glicoproteína com peso molecular de 5 0 kDa, produzida
pelas células da mucosa gástrica. Q u a n d o o complexo vitamina
B12-IF chega n o íleo distai, este se liga a receptores da superfície
das células epiteliais da mucosa e em seguida é internalizado.
D e n t r o dessas células, o complexo vitamina B ]2 -IF se dissocia e a
vitamina B 12 se liga à transcobalamina II (TcII). O complexo
vitamina B12-TcII é t r a n s p o r t a d o através da m e m b r a n a ligado a
um receptor de TcII e, então, é liberado n o plasma dos capilares
da mucosa e, s u b s e q ü e n t e m e n t e , n o sangue da veia portal. Q u a s e
toda a vitamina B ] 2 é capturada pelos hepatócitos, à m e d i d a que
o sangue circulante na veia portal passa pelo fígado. Essa é arma-
zenada n o fígado e liberada n o plasma para suprir a d e m a n d a
fisiológica. Se a q u a n t i d a d e de vitamina B 12 excede a capacidade
dos receptores hepáticos, a maior parte do excesso é excretada
pelos rins. De maneira usual, a p r o x i m a d a m e n t e 1 mg de vita-
mina B 12 é armazenado n o fígado, q u a n t i d a d e c o r r e s p o n d e n t e à
necessidade metabólica de 2.000 dias. Assim, q u a n d o o supri-
m e n t o dietético de vitamina B ] 2 é i n t e r r o m p i d o ou os mecanis-
mos de absorção são comprometidos, a deficiência de vitamina
B12 não é n o t a d a antes de cinco anos ou mais.
A vitamina B 52 é c o n t i n u a m e n t e secretada c o m a bilej mas a
maioria é reabsorvida e disponível para as f u n ç õ e s metabólicas.
Se as concentrações circulantes excederem a capacidade de
captura pelo fígado, o excesso será excretado n a urina, mas n a
maioria das circunstâncias, a excreção se dá pelas fezes.
Funções
A vitamina B12 é exigida c o m o coenzima para mais de 12
diferentes sistemas enzimáticos. E m h u m a n o s , é necessária (1)
c o m o coenzima, na forma de adenosilcobalamina, para a L-metil-
malonil-CoA m u t a s e na conversão do L-metilmalonil-CoA e m
succinil-CoA, e (2) metilcobalamina, a coenzima da m e t i o n i n a
sintase n a conversão da homocisteina e m m e t i o n i n a . Defeitos
congênitos n a síntese de m u t a s e ou a inabilidade de sintetizar a
adenosilcobalamina (adenosil-Cbl) resultam n a necessidade de
tratamentos para toda a vida do paciente da acidúria metilmalô-
nica e da cetoacidose metabólica. Defeitos congênitos na metio-
nina sintase ou na metil-Cbl síntese resultam em hiper-homocís-
teinemia grave.
Necessidades e Recomendações para Ingestão de
Nutrientes
O s estoques totais de vitamina B, 2 estão estimados entre 2 e 5
mg para u m h o m e m adulto, dos quais 1 m g está n o fígado e u m a
502 PARTE IV Analitos
q u a n t i d a d e m e n o r , n o r i m . Acredita-se q u e h a j a u m a p e r d a diária
obrigatória dessa v i t a m i n a , de cerca d e 0 , 1 % d o total c o r p o r a l ,
i n d e p e n d e n t e d o t a m a n h o , s u g e r i n d o q u e a reposição diária p a r a
m a n t e r o e s t o q u e é de 2 a 5 pg. A dieta diária d e p o p u l a ç õ e s
o c i d e n t a i s c o n t é m 5 a 3 0 jig d e v i t a m i n a B ^ , c o m u m a m é d i a
de ingestão diária de 7 a 8 jig p o r h o m e n s a d u l t o s e de 4 a 5 p g
p o r m u l h e r e s a d u l t a s . Q u a n t i d a d e s p e q u e n a s adicionais p o d e m
ser sintetizadas pela m i c r o b i o t a intestinal. D o total i n g e r i d o , 1 a
5 jig são absorvidos.
A R D A p a r a a v i t a m i n a B12 é b a s e a d a n a q u a n t i d a d e neces-
sária p a r a a m a n u t e n ç ã o d o e s t a d o n u t r i c i o n a l h e m a t o l ó g i c o e
c o n c e n t r a ç õ e s n o r m a i s n o soro, a s s u m i n d o 5 0 % de aproveita-
m e n t o d a v i t a m i n a ingerida. A R D A para a d u l t o s (19 a 5 0 anos)
foi estabelecida e m 2,4 p g / d i a , c o m a u m e n t o de 2,6 ( i g / d i a n a
gravidez e 2,8 f l g / d i a n a lactação. 2
Deficiência
A deficiência d e v i t a m i n a B 12 e m h u m a n o s está associada à
a n e m i a megaloblástica e à n e u r o p a t i a . A causa mais c o m u m é a
anemia perniciosa, d o e n ç a a u t o - i m u n e c o m a t r o f i a gástrica crônica
r e s u l t a n t e de a n t i c o r p o s c o n t r a células gástricas parietais e IF,
dirigidos c o n t r a a H ' / K - A T P a s e das células gástricas parietais
H + / K \ A a n e m i a p e r n ici os a t a m b é m p o d e ocorrer e m crianças
p o r f a l h a n a secreção de IF o u n a secreção d e I F b i o l o g i c a m e n t e
inativo. O u t r o s g r u p o s d e risco de deficiência de v i t a m i n a B 12
i n c l u e m aqueles (1) acima de 6 5 anos, (2) c o m q u a d r o d e m á
absorção, (3) vegetarianos, (4) p o r t a d o r e s de d e s o r d e n s auto-
i m u n e s , (5) e m t r a t a m e n t o c o m drogas q u e s a b i d a m e n t e interfe-
rem na absorção ou n o metabolismo da vitamina, incluindo
ó x i d o nitroso, f e n i t o í n a , i ni bi dores da d i i d r o f o l a t o r e d u t a s e ,
m e t f o r m i n a e i n i b i d o r e s de b o m b a s d e p r ó t o n s e (6) recém-nas-
cidos c o m suspeitas d e d e s o r d e n s metabólicas.
A m á absorção intestinal da v i t a m i n a B] 2 p o d e ser causada p o r
gastrectomia o u a m p u t a ç ã o do íleo, h a v e n d o u m a relação inversa
e n t r e o c o m p r i m e n t o d o íleo a m p u t a d o e a absorção de v i t a m i n a
B 12 . O u t r a s causas de m á absorção são (1) psilose (spru tropical),
(2) d o e n ç a s i n f l a m a t ó r i a s d o intestino delgado, (3) estase intesti-
nal c o m c r e s c i m e n t o excessivo de bactérias q u e c o n s o m e m a vita-
m i n a B] 2 ingerida pelo h o s p e d e i r o e (4) infecção pelo vírus d a
i m u n o d e f i c i ê n c i a h u m a n a (HIV). Vegetarianos i n g e r e m m e n o s
v i t a m i n a B 12 q u e os onívoros, e, e m b o r a os sinais clínicos sejam
i n c o m u n s , m a r c a d o r e s b i o q u í m i c o s d o estado p o d e m i n d i c a r defi-
ciência f u n c i o n a l de v i t a m i n a Bi 2 . U m a m p l o n ú m e r o d e d o e n ç a s
está associado à deficiência de c o b a l a m i n a e m recém-nascidos o u
n a infância. Dessas, a mais e n c o n t r a d a é a s í n d r o m e de I m e r s l u n d -
Graesbeck, q u e é caracterizada p o r inabilidade de a b s o r ç ã o de
v i t a m i n a B 12 c o m o u s e m IF e p r o t e i n ú r i a . A p a r e n t e m e n t e , essa
inabilidade é d e c o r r e n t e d a impossibilidade d o intestino d e absor-
ver o complexo B 12 -IF. O s e g u n d o motivo mais c o m u m é a defici-
ência c o n g ê n i t a d e secreção gástrica de IF.
O s efeitos h e m a t o l ó g i c o s d a deficiência d e v i t a m i n a B i 2 são
indistinguíveis d a q u e l e s d e c o r r e n t e s d a deficiência d e f o l a t o . As
alterações m o r f o l ó g i c a s clássicas n o sangue são (1) h i p e r s e g m e n -
tação d e n e u t r ó f i l o s , (2) macrocitose, (3) a n e m i a , (4) l e u c o p e n i a
e (5) t r o b o c i t o p e n i a , c o m as alterações megaloblásticas n a m e d u l a
óssea a c o m p a n h a n d o as alterações n o sangue periférico. T o d a s as
lesões d a m e d u l a óssea são reversíveis c o m terapia à base d e
v i t a m i n a Bn-
E m adição às alterações h e m a t o l ó g i c a s , a deficiência dessa
v i t a m i n a p o d e levar à d e s o r d e m d e s m i e l i n i z a n t e d o sistema
n e r v o s o central. Esta d e s o r d e m provoca o u t r a s c o n d i ç õ e s n e u r o -
lógicas sérias e f r e q ü e n t e m e n t e irreversíveis, tais c o m o (1) quei-
m a ç ã o ou p e r d a da sensibilidade nas extremidades, (2) fraqueza,
(3) espasticidade e paralisia, (4) e s t a d o de c o n f u s ã o , (5) d e s o r i e n -
tação e (6) d e m ê n c i a . Esta d e s o r d e m r e c e b e u o n o m e d e degene-
ração c o m b i n a d a s u b a g u d a d a m e d u l a espinal.
Toxicidade
N ã o são c o n h e c i d o s os efeitos adversos r e l a c i o n a d o s ao c o n s u m o
excessivo d e a l i m e n t o s o u s u p l e m e n t o s dietéticos c o n t e n d o a
v i t a m i n a e m pessoas saudáveis.
Avaliação Laboratorial do Estado
Testes f u n c i o n a i s diretos e indiretos p a r a avaliar o e s t a d o d e
v i t a m i n a B 1 2 estão disponíveis. O s testes indiretos i n c l u e m ensaios
paTa (1) c o n c e n t r a ç õ e s u r i n á r i a s e sorológicas d o ácido metilma-
lônico, (2) h o m o c i s t e í n a plasmática, (3) teste d a supressão de
d e s o x i u r i d i n a e (4) teste d a a b s o r ç ã o de v i t a m i n a B ] 2 .
Ensaios microbiológicos, de ligação competitiva de proteína
(CPB) e imunológicos t ê m sido empregados para a quantificação
direta d a vitamina n o soro. O s ensaios microbiológicos t ê m sido
a m p l a m e n t e substituídos p o r outros m é t o d o s mais convenientes e
precisos, entretanto, p e r m a n e c e m c o m o referência para a determi-
nação da vitamina B 12 biologicamente ativa. Kits comerciais estão
disponíveis para ensaios de C P B . E m u m ensaio a m p l a m e n t e utili-
zado, a vitamina B 12 (cobalamina) compete com cobalamina marcada
com S 7 Co por u m n ú m e r o l i m i t a d o d e sítios de ligação ao IF.
A maioria dos testes i m u n o l ó g i c o s utiliza s e p a r a ç ã o e m fase
sólida via imobilização de ligantes d e I F e m esferas ou partículas
magnéticas. A v i t a m i n a livre, e n t ã o , p e r m a n e c e n o s o b r e n a d a n t e ,
e os analitos ligados se t o r n a m p a r t e d a fase sólida d a s u s p e n s ã o .
Para dosagens s i m u l t â n e a s d e f o l a t o / v i t a m i n a B t 2 , c o n t a d o r e s d e
cintilação gama q u e p o s s a m distinguir e n t r e os e l e m e n t o s 5 7 C o
(para v i t a m i n a Bi 2 ) e 125I (para o folato) devem ser e m p r e g a d o s .
M ú l t i p l o s sistemas a u t o m a t i z a d o s e s e m i - a u t o m a t i z a d o s estão dis-
poníveis p a r a a d o s a g e m d e v i t a m i n a Bi 2 e folato utilizando, p o r
exemplo, q u i m i o l u m i n e s c ê n c i a c o m o sinal.
Testes indiretos acessam a a d e q u a ç ã o f u n c i o n a l de v i t a m i n a
B n . A c o n c e n t r a ç ã o sérica d o ácido m e t i l m a l ô n i c o é a u m e n t a d a
q u a n d o a carência de a d e n i l - C b l b l o q u e i a a conversão de metil-
m a l o n i l - C o A a succinil-CoA. A h o m o c i s t e í n a plasmática total é
u m i n d i c a d o r sensível d o e s t a d o d a v i t a m i n a B n p o r q u e a metil-
C b l é necessária p a r a a r e m e t i l a ç ã o d a h o m o c i s t e í n a a m e t i o n i n a ,
mas n ã o é específica, e s t a n d o elevada n a deficiência d o folato e
das v i t a m i n a s B 6 e B 12 . As d o s a g e n s de h o l o t r a n s c o b a l a m i n a II
são p o t e n c i a l m e n t e úteis c o m o m a r c a d o r e s específicos da vita-
m i n a B 12 b i o l o g i c a m e n t e disponível, p o r q u e a p e n a s a c o b a l a m i n a
ligada ao TcII está e s p e c i f a m e n t e disponível para a captação p o r
todas as células. A l g u n s m é t o d o s f o r a m descritos p a r a m e d i r a
h o l o t r a n s c o b a l a m i n a n o soro, u m deles utilizando u m a n t i c o r p o
m o n o c l o n a l para t r a n s c o b a l a m i n a h u m a n a imobilizada, e e m
seguida a dosagem d e c o b a l a m i n a liberada pela C P B . Esse m é t o d o
está disponível c o m o icit comercial.
O teste de Schilling serve p r i n c i p a l m e n t e para avaliar a absor-
ção de v i t a m i n a B 12 , e n ã o o e s t a d o n u t r i c i o n a l d a v i t a m i n a , m a s
p e r m i t e a diferenciação e n t r e as causas d a deficiência d e v i t a m i n a
Bi2 ( a n e m i a perniciosa e m á absorção intestinal). O procedi-
m e n t o u s u a l m e d e a r a d i o a t i v i d a d e e m u m a a m o s t r a de u r i n a d e
24 horas, coletada após a a d m i n i s t r a ç ã o oral d e 0,5 [ig de vita-
m i n a B 12 marcada c o m C o r a d i o a t i v o após o j e j u m de u m a n o i t e .
E m i n d i v í d u o s n o r m a i s , 8 % ou mais da dose a d m i n i s t r a d a é
excretada n a u r i n a , e n q u a n t o , n a a n e m i a perniciosa, m e n o s de
1% (geralmente d e 0 % a 3 % ) é excretado. U m teste c o n f i r m a t ó -
rio para a falta d e IF r e q u e r a ingestão d e v i t a m i n a B 1 2 e IF.
intervalos de Referência
A O M S d e f i n e c o n c e n t r a ç õ e s séricas de v i t a m i n a B 12 inferiores
a 150 n g / L (110 p m o l / L ) c o m o deficiência e 201 n g / L (147
p m o l / L ) o u superiores c o m o aceitáveis. 14

C o n c e n t r a ç õ e s de ácido metilmalônico inferiores a 376
n m o l / L têm sido consideradas aceitáveis em populações de
idosos nos Estados U n i d o s , assim c o m o as inferiores a 320 n m o l /
L em u m g r u p o de indivíduos idosos alemães.
Vitamina C - Ácido Ascórbico
A vitamina C (ácido L-ascórbico) participa como agente redutor
de muitas reações b i o q u í m i c a s de hidroxilação.
Química
O t e r m o vitamina C refere-se a todas as moléculas que exibem
propriedades antiescorbúticas e m h u m a n o s e inclui o ácido
ascórbico e a sua forma oxidada, o ácido diidroascórbico ( D H A )
(Figura 27-13). O ácido L-ascóibico é a f o r m a enólica da 2-oxo-
L-gulofuranolactona, e a hidroxila enólica d o C 3 do anel tem u m
pKa de 4,2, responsável pela sua natureza ácida. As plantas e a
maioria dos animais possuem a habilidade de sintetizar a vita-
mina a partir de D-glicose via lactonas do ácido D-glicurônico e
ácidos de L-gulônicos. O s h u m a n o s e outros mamíferos, entre-
tanto, n ã o possuem a L-gulonolactona oxidase, a enzima que
catalisa a formação de 2-oxo-L-gulonolactona, que espontanea-
m e n t e tautomeriza a ácido L-ascórbico. Então, a sua ingestão
diária p o r h u m a n o s e alguns mamíferos é essencial.
Fontes Dietéticas
Excelentes fontes de vitamina C são (1) frutas cítricas, (2) bagas,
(3) melões, (4) tomatesj (5) p i m e n t a s verdes, (6) brócolis, (7)
couve de Bruxelas e (8) vegetais de folhas verdes.
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
A absorção gastrointestinal d o ácido ascórbico ocorre, em baixas
concentrações, por transporte ativo d e p e n d e n t e de sódio e, em
altas concentrações, p o r d i f u s ã o simples. O ácido ascórbico
absorvido move-se r a p i d a m e n t e das células intestinais para o
sangue, por difusão facilitada. A captação de ascorbato é mediada
p o r transportadores d e p e n d e n t e s de sódio e do D H A p o r difusão
facilitada por transportadores de glicose. A vitamina C é encon-
trada na maioria dos tecidos, mas os tecidos glandulares, c o m o
(1) pituitária, (2) córtex adrenal, (3) c o r p o lúteo e (4) timo,
c o n t ê m altas quantidades. A retina possui concentrações de 20
a 30 vezes superiores à plasmática. A concentração corporal total
de vitamina C é de 2 g, e a meia-vida biológica, de cerca de 16
dias. A excreção do ascorbato n ã o m o d i f i c a d o cresce com o
a u m e n t o da dosagem, e as doses ingeridas superiores a 5 0 0 mg
são excretatdas quase t o t a l m e n t e e m 24 horas. D H A que n ã o é
reciclável p o d e ser delactonizado irreversivelmente para ácido
2,3-dicetogulõnico e, em seguida, degradado a ácido oxálico para
excreção urinária.
Funções
O ácido ascórbico age c o m o co-fator de diversas oxidases de
f u n ç ã o mista em processos n o s quais promove a atividade enzi-
HO O o o a u m e n t o d o risco de m o r t e p o r infarto, em coorte de pessoas
^1
i '<
I
T ,%
on H,C
i ^OH
ÍH il-I
wiliu L-UrCL 1 IICU Ácidos desidroascórbic
Figura 2 7 - 1 3 Ácidos L-ascórbico e desidioascórbico
Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 503
mática pela m a n u t e n ç ã o de íons metálicos n a forma reduzida
(particularmente ferro e cobre). Exemplos são (1) protocolágeno
hidroxilase, que hidroxila resíduos prolil e lisil e m peptídeos
nascentes, e m proteínas d o tecido conectivo, tais c o m o o colá-
geno (2) biossíntese de carnitina, n a qual atua c o m o co-fator para
a 6-N-trimetil-lisina hidrolase e y-butirobetaína hid rolas e, (3)
degradação da tirosina via 4 - O H fenilpiruvato dioxigenase, (4)
síntese de h o r m ô n i o s adrenais via d o p a m i n a (3-hidroxilase, (5)
biossíntese de corticosteróides e aldosterona, (6) hidroxilação d o
colesterol n a formação de ácidos biliares e (7) metabolismo do
folato e funções leucocitárias.
O ácido ascórbico é u m dos mais efetivos antioxidantes
hidrossolúveis e m fluidos biológicos e é fisiologicamente impor-
tante n a depuração de espécies reativas de oxigênio e de nitrogê-
nio. O radical ascorbil é relativamente estável, graças à estabiliza-
ção da ressonância dos elétrons n ã o pareados. O ascorbato rege-
nera outras moléculas antioxidantes pequenas, i n c l u i n d o (1) a -
tocoferol, (2) glutationa reduzida, (3) urato e (4) P-caroteno, a
partir dos seus respectivos radicais, e p o d e p o r t a n t o prevenir
d a n o s oxidativos a macromoléculas biológicas, i n c l u i n d o D N A ,
lipídios e proteínas.
Necessidades e Recomendações para Ingestão de
Nutrientes
A q u a n t i d a d e necessária de v i t a m i n a C pata aliviar e curar os
sinais clínicos do escorbuto é apenas de 10 m g / d i a , que é, pro-
vavelmente, p r ó x i m o da necessidade m í n i m a h u m a n a . Essa quan-
tidade, entretanto, n ã o é a d e q u a d a para m a n t e r a concentração
próxima à saturação dos tecidos em h o m e n s adultos ou m a n t e r
o estado nutricional ótimo. A recomendações atuais do Institute
of M e d i c i n e dos Estados Unidos 11 são R D A de 90 m g / d i a para
h o m e n s adultos e de 75 m g / d i a para mulheres, c o m o a u m e n t o
da dose d u r a n t e a gravidez e a lactação. Alguns grupos especiais,
c o m o os f u m a n t e s , devem tomar 3 5 m g / d i a adicionais.
Deficiência
A deficiência prolongada de vitamina C leva à doença clássica
d e n o m i n a d a escorbuto, que ainda é observada em diversos
países. O s grupos de risco mais i m p o r t a n t e s incluem (1) h o m e n s
idosos, particularmente os de vida solitária, (2) d e p e n d e n t e s de
álcool, (3) f u m a n t e s , (4) aqueles c o m dieta desbalanceada, (5)
alguns pacientes com doenças mentais, (6) pacientes com insufi-
ciência renal submetidos à diálise peritoneal ou hemodiálise e (7)
alguns pacientes com câncer. A carência de vitamina C leva à
inabilidade n a formação a d e q u a d a da substância intercelular do
tecido conjuntivo e traz conseqüências c o m o o inchaço, fragili-
dade e f r e q ü e n t e m e n t e hemorragias ou injúrias das juntas e de
outras áreas, o n d e o tecido e s t r u t u r a l m e n t e e n f r a q u e c i d o n ã o
suporta a tensão. Alguns pacientes c o m escorbuto p o d e m desen-
volver anemia, alterações radiológicas características de osteopo-
rose ou m o r t e súbita por falha cardíaca. As doenças causadas pela
deficiência de vitamina C q u e p o d e m refletir sua atuação c o m o
antioxidante incluem (1) risco a u m e n t a d o de doenças coronaria-
nas, c o m o d e m o n s t r a d o e m coorte de h o m e n s finlandeses, e (2)
idosas britânicas.
Toxicidade
A vitamina C geralmente é b e m tolerada por pessoas saudáveis,
e ingestões suplementares de 2 a 4 g / d i a - c o m o as feitas p o r
algumas pessoas para prevenir ou m e l h o r a r o resfriado - geral-
m e n t e n ã o são arriscadas, e m b o r a sejam relatadas irritações do
trato gastrointestinal. O u t r o s efeitos adversos potenciais, mas
raros, incluem (1) a u m e n t o n a excreção de oxalato e formação
504 PARTE IV Analitos
de cálculos renais, (2) a u m e n t o na excreção urinária de ácido
úrico, (3) absorção excessiva de ferro, (4) d i m i n u i ç ã o nas concen-
trações de vitamina B n , (5) c o n d i c i o n a m e n t o sistêmico e (6)
escorbuto recorrente. Ingestões de q u a n t i d a d e s superiores a 200
m g / d i a levam a u m p e q u e n o a u m e n t o de concentrações plasmá-
ticas n o estado de equilíbrio e sugerem que a sobrecarga de
vitamina C seja improvável. O limite máximo tolerável em adultos
foi estipulado em 2 g / d i a .
Avaliação Laboratorial do Estado
Até o presente m o m e n t o n ã o existem testes funcionais para a
adequação de vitamina C, assim a avaliação laboratorial do estado
é realizada pela m e d i d a direta n o plasma, n a u r i n a ou e m tecidos
das concentrações de ácido ascórbico, de vitamina C total ou,
raramente, de algum metabólito. A concentração plasmática de
ascorbato é considerada u m indicador confiável da captação
dessa molécula e tem sido avaliada f o t o m e t r i c a m e n t e pela oxida-
ção c o m 2,4-dinitrofenilidrazina para formaT a bis-hidrazona ver-
melha, ou c o m 2,4-dicloTofenol-indofenol, q u e é reduzido a u m a
forma incolor. 13 U m a m a n e i r a mais especifica é utilizar a ascor-
bato oxidase para converter ascorbato em desidroascorbato, que
é acoplado ao O-fenileno d i a m i n a para f o r m a r u m p r o d u t o que
é m e d i d o p o r fluorimetria ou fotometria. Métodos utilizando
H P L C são mais específicos, mas geralmente c o n s o m e m mais
tempo. A detecção p o d e ser feita por u m a derivação pré-coluna
até quinoxalina fluorescente ou por m é t o d o s eletroquímicos ou
colorimérricos. 1 O ácido ascórbico leucocitário é considerado u m
indicador mais a d e q u a d o dos estoques corporais que a medida
de ascorbato plasmática, mas n ã o foi a d o t a d o a m p l a m e n t e em
virtude de problemas técnicos. Excreção urinária e concentrações
e m células vermelhas d o sangue (RBC) não são consideradas
índices específicos ou úteis do estado de vitamina C. A dosagem
de concentrações urinárias de ácido ascórbico, especialmente
após o teste de sobrecarga, tem sido considerada útil n o diagnós-
tico clínico d o escorbuto. 1 3
Intervalos de Referência
C o m a ingestão a d e q u a d a de vitamina C, as concentrações plas-
máticas do total de vitamina (ácido ascórbico mais ácido desidro-
ascórbico) são de 0,4 a 1,5 m g / d L (23 a 85 Jjmol/L). Valores
inferiores a 0,2 m g / d L (11 (imol/L) são considerados deficiência.
A orientação para os intervalos de referência para as concentra-
ções de vitamina C nos leucócitos está entre 20 a 53 (ig/10 8
leucócitos (1,14 a 3,01 fmol/leucócito), com concentrações infe-
riores a 10 | i g / 1 0 e leucócitos (0,57 f m o l / l e u c ó c i t o ) consideradas
deficientes.
Biotina
A biotina t a m b é m é conhecida c o m o vitamina H, o grupo pros-
tético de numerosas reações d e carboxilação.
Química
A biotina é o ácido cis-tetraidro-2-oxotieno[3,4-ci]-imidazolina-4-
valérico (Figura 27-14). Ma maioria dos organismos, a vitamina
o j
Biotina /——1—-N
s T y=o
Figura 2 7 - 1 4 Biotina
está principalmente ligada a proteínas. E m adição, alguma biotina
está associada n ã o covalentemente c o m o u m complexo c o m a
avidina, u m a proteína d a clara d o ovo.
Fontes Dietéticas
Boas fontes de biotina incluem (1) fígado, (2) rim, (3) pâncreas,
(4) ovos, (5) levedura e (6) leite. Grãos de cereais, frutas, a maioria
dos vegecais e carnes são fontes pobres.
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
A maioT p a r t e da biotina da dieta está associada a proteínas e é
digerida p o r enzimas gastrointestinais para produzir peptídeos de
biotinil, que p o d e m ser hidrolisados p o s t e r i o r m e n t e pela biotini-
dase intestinal l i b e r a n d o a biotina. A avidina, u m a p i o t e i n a
e n c o n t r a d a na clara do ovo crua, liga-se f o r t e m e n t e à biotina e
evita a sua absorção. O peptídeo biocitina (£-N-biotinil lisina) é
resistente à hidrólise por enzimas proteolíticas n o trato intestinal,
mas, j u n t a m e n t e c o m a biotina, é p r o n t a m e n t e absorvido. O
t r a n s p o r t a d o r multivitamina d e p e n d e n t e de sódio (SMVT) é u m
carreador de biotina, pelo qual o ácido p a n t o t ê n i c o e o lipoato
c o m p e t e m . O carreador está localizado nas microvilosidades da
m e m b r a n a intestinal e transporta a biotina contra um gradiente
de concentração do íon sódio. A enzima biocitinase plasmática
e de eritrócitos catalisa a hidrólise de biocitina para liberar a
biotina. A biotina é d e p u r a d a da corrente sanguínea mais rapi-
d a m e n t e e m mamíferos deficientes do q u e nos normais. Essa é
captada por tecidos c o m o o fígado, músculo e rins e se localiza
nas carboxilases citossólicas e mitocondriais.
Cerca da metade da biotina absorvida é excretada c o m o os
metabólitos b i s n o r b i o t i n a e sulfóxido de biotina.
Funções
A f u n ç ã o principal da biotina n o h o m e m é ser co-fator de reações
de carboxilação. C i n c o carboxilases são encontradas n o tecido
h u m a n o . U m a delas, u m a acetil-CoA carboxilase, é inativa e p o d e
agir c o m o veículo de a r m a z e n a m e n t o para a biotina. As demais
carboxilases são para (1) acetil-CoA, (2) propionil-CoA, (3) [3-
metilcrotonil-CoA e (4) piruvato. Essas enzimas o p e r a m p o r u m
m e c a n i s m o c o m u m , que envolve a fosforilação de b i c a r b o n a t o
pelo A T P para formar carbonil fosfato. Essa reação é seguida pela
transferência de u m grupo carboxíl fosfato para o nitrogênio
esteticamente m e n o s i m p e d i d o d a porção biotina. A enzima
N(l)-carboxibiotinil resultante e n t ã o troca a f u n ç ã o carboxilato
c o m u m centro reativo n u m substrato. C o m a acetil-CoA carbo-
xilase citossólica, o p r o d u t o é malonil-CoA, utilizado na biossín-
tese de ácidos graxos. N a m i t o c ô n d r i a , a piruvato carboxilase
catalisa a formação de oxaloacetato, que, e m c o n j u n t o com a
acetil-CoA, forma citrato. As demais carboxilases estão envolvidas
n o metabolismo de ácidos graxos ramificados e c o m n ú m e r o
ímpar de átomos de carbono.
Necessidades e Recomendações para Ingestão de
Nutrientes
C o r r e n t e m e n t e , não existe u m a R D A para biotina. A microbiota
intestinal contribui de maneira significativa para a biotina total
disponível n o corpo, d i f i c u l t a n d o determinação da necessidade
da dieta. C o n s e q ü e n t e m e n t e , f o r a m r e c o m e n d a d o s c o m o inges-
tão a d e q u a d a (AI) para adultos (acima de 19 anos) 30 jig/dia.
U m adicional de 5 [lg/dia é r e c o m e n d a d o e m lactantes. 2
Deficiência
A deficiência de biotina é tara, mas p o d e ser observada (1) com o
c o n s u m o prolongado de clara de ovo crua, (2) na T P N sem suple-
mentação de biotina e (3) em pacientes com deficiência genética

d e biotinidase. As deficiências (1) e (2) p o d e m sofrer complicações
p o r efeitos n a microbiota intestinal q u e p r o d u z b i o t i n a . O s sinto-
mas incluem (1) anorexia, (2) náusea, (3) vômito, (4) glossite, (5),
palidez, (6) depressão e (7) d e r m a t i t e seca e escamosa.
Toxicidade
N ã o f o r a m r e l a t a d o s efeitos adversos da b i o t i n a q u a n d o ingerida
até 3 0 0 vezes o q u e se ingere n a dieta n o r m a l , c o m o o b s e r v a d o
e m pacientes c o m deficiência d e b i o t i n i d a s e .
Avaliação Laboratorial do Estado
T r a d i c i o n a l m e n t e , a b i o t i n a tem sido d o s a d a em a m o s t r a s bioló-
gicas p o r ensaios microbiológicos, e m que o sangue total é pri-
m e i r a m e n t e digerido c o m p a p a í n a o u p o r hidrólise ácida p a r a
liberar a b i o t i n a livre e as a m o s t r a s resultantes são a d i c i o n a d a s a
u m meio que não contém biotina, que é inoculado com u m
m i c r o r g a n i s m o teste, c o m o , p o r exemplo, o Lãctahacillus planta-
rum. O u t r o s m é t o d o s para avaliar a b i o t i n a livre i n c l u e m os
ensaios de ligação à a v i d m a , p o r ensaio de c o m p e t i ç ã o c o m a
b i o t i n a ligada ao r a d i o i s ó t o p o 3 H , o u u m ensaio n ã o radioativo
d e a d s o r ç ã o utilizando a e s t r e p t a v i d i n a c o m agente ligante. A
excreção u r i n á r i a de b i o t i n a e d e ácido 3-hidToxiisovalérico p a r e c e
ser u m i n d i c a d o r mais a d e q u a d o d o e s t a d o de b i o t i n a q u e as
c o n c e n t r a ç õ e s na c m r e n r e s a n g u í n e a
Intervalo de Referência
Valores de intervalo d e r e f e r ê n c i a típicos para a b i o t i n a d o s a n g u e
total estabelecidos p o r m é t o d o m i c r o b i o l ó g i c o estão e n t r e 0,5 e
2,20 n m o l / L .
Ácido Fólico
O ácido fólico é u m caTreador de grupamentos de u m carbono
e m muitas reações metabólicas.
Química
Folato e ácido fólico são t e r m o s gerais p a r a u m a família d e com-
postos q u e f u n c i o n a m c o m o c o e n z i m a s e m p r o c e s s a m e n t o de
u n i d a d e s d e u m c a r b o n o . Esses são derivados d o ácido p t e r ó i c o
(Pte), n o q u a l u m a ou mais m o l é c u l a d e ácido g l u t â m i c o estão
associadas. O ácido pteróico é c o m p o s t o por u m a n e l de pteri-
d i n a ligado a u m r e s í d u o de á c i d o p-aminobenzóico (Figura 27-
15). Q u a n d o o ácido p t e r ó i c o é c o n j u g a d o com u m a m o l é c u l a
d e ácido L-glutâmico, o á c i d o pteroilglutâmico (PteGlu) é
h
o ° Y °
2-NHr4-OH Ácido p- Ácido L-glutâmico
pteridina a minob enzóico
Ácido pteróico
Á c i d o fólico
Figura 2 7 - 1 5 Esmitura do ácido fólico.
Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 505
f o r m a d o e é então reduzido a ácido diidrofólico (H2PteGlu ou
D H F / F H 2 ) o u a t e t r a i d r o f o l a t o ( H 4 P t e G l u ou T H F / F H 4 ) . A p e n a s
as f o r m a s reduzidas são b i o l o g i c a m e n t e ativas. O s d e m a i s deriva-
dos de folato a p r e s e n t a m m ú l t i p l o s resíduos d e ácido g l u t â m i c o
(H^PteGluj,). M ú l t i p l a s f o r m a s de ácido fólico são f o r m a d a s pela
substituição de g r u p o s f u n c i o n a i s , tais c o m o metil, formil, meti-
l e n o , h i d r o x i m e t i l e o u t r o s n o s á t o m o s de n i t r o g ê n i o n o r e s í d u o
d e ácido pteróico, u s u a l m e n t e N 3 ou l i g a n d o N s c o m N l c . A
forma principal é o 5-metiltetraidrofolato.
Fontes Dietéticas
As f o n t e s principais d e a l i m e n t o s c o n t e n d o folato são (1) fígado,
(2) e s p i n a f r e , (3) o u t r o s vegetais de folhas verde-escuras, (4)
l e g u m e s tais c o m o feijões d o s tipos r i m e lima e (5) suco de
laranja. E m adição, e m países o n d e o f o r t a l e c i m e n t o d e cereais
c o m folato foi estabelecido, esses são f r e q ü e n t e m e n t e a f o n t e
m a j o r i t á r i a d o folato d a dieta. D e s d e q u e o p r o g r a m a de fortifi-
cação de t o d o s os grãos c o m ácido fólico (140 jlg p o r 100 g) foi
i n t r o d u z i d o pela F o o d a n d D r u g A d m i n i s t r a t i o n (FDA) n o s
E s t a d o s U n i d o s e m 1998, e s t u d o s de p o p u l a ç õ e s t ê m m o s t r a d o
o d o b r o das c o n c e n t r a ç õ e s de f o l a t o plasmático. 8
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
O folato é a b s o r v i d o das fontes, c o m o as listadas acima, princi-
p a l m e n t e c o m o metil- e formil-tetraidropteroilpoliglutamatos
reduzidos. A b i o d i s p o n i b i l i d a d e d o folato d e a l i m e n t o s é variável.
A b i o d i s p o n i b i l i d a d e d o ácido fólico c o m o s u p l e m e n t o p o d e ser
tão alta q u a n t o 1 0 0 % p a r a s u p l e m e n t o s c a p t u r a d o s pelo estômago
vazio, c o m p a r a d a c o m cerca de 5 0 % para folato d e alimentos.
F o r m a s poliglutãmicas d o folato presentes e m a l i m e n t o s são pri-
m e i r a m e n t e convertidas e m m o n o g l u t a m a t o s pela piteroilpoliglu-
t a m a t o hidrolase n a m u c o s a intestinal. A absorção dos m o n o g l u -
tamil folatos e m baixas c o n c e n t r a ç õ e s o c o n e p o r u m processo de
t r a n s p o r t e saturável c o m u m m e c a n i s m o adicional de absorção
a p a r e n t e m e n t e n ã o saturável q u a n d o as c o n c e n t r a ç õ e s de folato
intestinal excedem 5 a 10 [ I m o l / L . A p ó s a captação celular, a
m a i o r p a r t e d o folato é r e d u z i d a e metilada e e n t r a na circulação
c o m o 5-metiltetraidrofolato (5-MTHF), c i r c u l a n d o f r o u x a m e n t e
ligado à a l b u m i n a ou, e m u m grau inferior, à proteína de ligação
ao folato de alta a f i n i d a d e . A captação por d e t e r m i n a d a s células
(rim, placenta e plexo coróide) ocorre p o r m e i o de proteínas d e
ligação ao folato associadas à m e m b r a n a , q u e agem c o m o recep-
tores d e folato. U m a vez d e n t r o d a célula, o 5 - M T H F é desmeti-
l a d o e c o n v e r t i d o n a f o r m a p o l i g l u t a m i l pela folilpoliglulamalo
sintase, q u e a j u d a a reter o folato d e n t r o d a célula. Para a liberação
n a circulação, os poliglutamatos são reconvertidos e m m o n o g l u -
t a m a t o s pela p o l i g l u t a m a t o hidrolase.
O ácido fólico e o m e t a b o l i s m o d a v i t a m i n a B ] 2 são ligados
pela reação q u e transfere u m g r u p a m e n t o metil d o 5 - M T H F para
a c o b a l a m i n a . E m casos de deficiência d e c o b a l a m i n a , o folato
é "aprisionado" como 5-MTHF e "metabolicamente morta", e
n ã o é reciclado c o m o t e t r a i d r o f o l a t o (THF).
O folato n o p l a s m a livre d e p r o t e í n a é f i l t r a d o n o glomérulo,
e a m a i o r p a r t e é r e a b s o r v i d a pelos t ú b u l o s renais proximais. O
folato é p r e d o m i n a n t e m e n t e excretado p e l o catabolismo, seguido
d a clivagem da ligação d o C 9 - N 1 0 p a r a p r o d u z i r p-aminobenzoil-
p o l i g l u t a m a t o s , os quais são, e n t ã o , h i d r o l i s a d o s a m o n o g l u t a m a -
tos e N-acetilado antes d a excreção. A excreção biliar d o folato
t e m sido e s t i m a d a e m cerca d e 100 \lg/dia, mas m u i t o dele é
r e a b s o r v i d o n a circulação ê n t e r o - h e p á t i c a .
Funções
As coenzimas d o folato, e m c o n j u n t o c o m as coenzimas derivadas
das v i t a m i n a s B12, B 6 e B 2 , são essenciais para m e t a b o l i s m o d e
506 PARTE IV Analitos

u m c a r b o n o . B i o q u i m i c a m e n t e , u m a u n i d a d e de c a r b o n o da folato dietético (DFE) t e m sido utilizado para a j u s t a r p a r a apro-

serina o u glicina é transferida para o T H F p a r a f o r m a r o m e t i l e n o -
T H F , q u e é, e n t ã o , (1) utilizado n a síntese de t i m i d i n a (e incor-
p o r a ç ã o ao D N A ) , (2) o x i d a d o a f o r m i l - T H F p a r a ser utilizado n a
síntese d e p u r i n a s (precursores de R N A e D N A ) o u (3) r e d u z i d o
a metil-THF, q u e é necessário para a m e t i l a ç ã o da h o r n o c i s t e í n a
à m e t i o n i n a . M u i t o dessa m e t i o n i n a é c o n v e r t i d a e m S-adenosil-
m e t i o n i n a , u m d o a d o r universal de g r u p o s m e t i l para D N A ,
R N A , h o r m ô n i o s , n e u r o t r a n s m i s s o r e s , lipídios de m e m b r a n a e
p r o t e í n a s . D i f e r e n t e s folatos estão envolvidos nessas reações,
d e p e n d e n d o d o estado q u í m i c o dos f r a g m e n t o s de c a r b o n o trans-
feridos.
O á c i d o fólico t a m b é m está envolvido n o m e t a b o l i s m o de
h o r n o c i s t e í n a . Elevações das c o n c e n t r a ç õ e s plasmáticas d e h o r n o -
cisteína t ê m d e m o n s t r a d o ser fatores de risco i n d e p e n d e n t e s para
d o e n ç a s c o r o n a r i a n a s e, p r o v a v e l m e n t e , d o e n ç a s cerebrovascula-
res. O e n v o l v i m e n t o d o f o l a t o e de suas f o r m a s coenzimáticas n o
m e t a b o l i s m o de hornocisteína e m e t i o n i n a está r e s u m i d o n a
Figura 27-16. O folato é o p r i n c i p a l m i c r o n u t r i e n c e d e t e r m i n a n t e
d o estado d e h o r n o c i s t e í n a , e a s u p l e m e n t a ç ã o c o m folato t e m
sido utilizada c o m o u m a m o d a l i d a d e d e t r a t a m e n t o paTa reduzir
as c o n c e n t r a ç õ e s de h o r n o c i s t e í n a circulante. A e x t e n s ã o dos
b e n e f í c i o s clínicos associados a essa m o d a l i d a d e d e t r a t a m e n t o
permanece desconhecida.9
Necessidades e Recomendações para Ingestão de
Nutrientes
C o m b a s e e m c o n c e n t r a ç õ e s de folato e m a m o s t r a s d e b i ó p s i a de
fígado, e a s s u m i n d o q u e o f í g a d o c o n t é m cerca da m e t a d e de
t o d o s os estoques corporais, os e s t o q u e s c o r p o r a i s totais d o folato
estão e s t i m a d o s e n t r e 12 e 2 8 m g . E s t u d o s s u g e r e m a n e c e s s i d a d e
diária m í n i m a e n t r e 60 e 2 8 0 p g p a r a r e p o r as perdas. 1 3 N o
cálculo da n e c e s s i d a d e n u t r i c i o n a l , o c o n c e i t o de equivalentes de
x i m a d a m e n t e 5 0 % m e n o r a b i o d i s p o n i b i l i d a d e d e folato d e ali-
m e n t o s c o m p a r a d a c o m o á c i d o fólico s u p l e m e n t a r . A s R D A s
acuais d o I n s t i t u t e of M e d i c i n e d o s E s t a d o s U n i d o s são de 4 0 0
p g / d i a d e D F E para a d u l t o s de 19 a n o s o u mais, de 6 0 0 p g / d i a
de D F E n a gestação e de 5 0 0 p g / d i a de D F E para lactantes 1
Deficiência
A deficiência de folato p o d e resultar de (1) ausência de micror-
g a n i m o s intestinais (esterilização d o i n t e s t i n o ) , (2) absorção intes-
tinal i n a d e q u a d a (p. ex., a p ó s a m p u t a ç ã o cirúrgica o u d o e n ç a
celíaca o u spru), (3) ingestão dietética i n s u f i c i e n t e ( i n c l u i n d o
a l c o o l i s m o crônico), (4) d e m a n d a s excessivas ( c o m o na gravidez,
nas d o e n ç a s de f í g a d o e nas malignidades), (5) a d m i n i s t r a ç ã o d e
drogas a n t i f o l a t o (p. ex., m e t o t r e x a t o ) e (6) terapia anticonvulsiva
(que a u m e n t a a d e m a n d a de folato, e s p e c i a l m e n t e d u r a n t e a
gravidez). A a n e m i a megaloblástica (caracterizada p o r g r a n d e s
eritrócitos n u c l e a d o s d e m a n e i r a a n o r m a l n a m e d u l a óssea) é a
principal m a n i f e s t a ç ã o clínica d a deficiência do folato, e m b o r a
perda sensorial e m u d a n ç a s n e u r o p s i q u i á t r i c a s t a m b é m p o s s a m
ocorrer.
A gravidez traz u m a d e m a n d a a u m e n t a d a d e estoques d e
folato e m v i r t u d e d o a u m e n t o d a síntese de D N A c reações de
t r a n s f e r ê n c i a s de u m c a r b o n o , e baixas c o n c e n t r a ç õ e s séricas de
folato na gravidez estão associadas a c o n s e q ü ê n c i a s adversas. Adi-
cionalmente, muitos estudos têm confirmado u m a redução nos
riscos de defeitos d o t u b o n e u r a l ( N T D s ) c o m a s u p l e m e n t a ç ã o
d e á c i d o fólico e m p e r í o d o s q u e a n t e c e d e m a c o n c e p ç ã o .
Existem n u m e r o s o s p o l i m o r f i s m o s d e enzimas q u e a f e t a m o
m e t a b o l i s m o de folato. Dessas, a m a i s e x t e n s i v a m e n t e e s t u d a d a
é a 5,10-metilenotetraidfofolato redutase (MTHFR), a enzima
responsável pela r e d u ç ã o irreversível d e 5 , 1 0 - M T H F R a 5-metil-
t e t r a i d r o f o l a t o (5-MTF1F), o d o a d o r de m e t i l n a t r a n s f o r m a ç ã o

Dieta . H H NH2
I
Folato (F) . - H,C—S — C C—CH
| \
H H COOH
NADPH
©
+ H NADPH
© / Metionina
+ H ATP
Meti o ninei
Diidrofolato (FHi) -> Tetraidrofolato (FH4)
íideno.5ÍÍ
Dirncril
Serma PPi + Pi transferase
\ / "Ikiuü. ,
VitB6
S-Adenosil metionina
Glicina NP-Meril

N 5 ,N 10 -M etileno FH 4
FH4 transferose e ~ AceptoT
vitamina BJ2 Metil transferase
- Aceptor metilado
N5,N10-M etileno

/
FJHL redutase VitB,
S-Adenosil hornocisteína

N5-Metil FFI4
Adenosina

\ H H NHn
>.cl i IV. HS—C—C—CH
H2N h H,N H II II NH? -\
Cistationana \ I 1 1 /
H H V.OOH
H C — C — SH HC—Ç—S —C—C—CH Cistationina
Hornocisteína
Vit B * X
p-siriMiÊ
HOOC/ H HOOc/ h H H COOH
Vit Bfi
Cisteína Cistationina
+ NH? + a-Cetobutirato

Figura 2 7 - 1 6 Metabolismo de hornocisteína e metionina.

 Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 507

d e h o m o c i s t e í n a e m m e t i o n m a . A variante h o m o z i g ó t í c a T T t e m
u m a i n c i d ê n c i a e m t o r n o d e 12% nas p o p u l a ç õ e s asiáticas e
OH "NH-,
caucasianas e u m a p e r d a de atividade enzimática d e cerca de t > 1
5 0 % , e n q u a n t o a v a r i a n t e heterozigótica C T tem u m a i n c i d ê n c i a ' I I xs-
' N''
d e até 5 0 % e m a l g u m a s p o p u l a ç õ e s . U m a o u t r a enzima envolvida
Ácido nicotínico (niacina) Nicotinamida (niacinamida)
n o m e t a b o l i s m o d e folato, a m e t i o n i n a sintase, t a m h é m apre-
senta dois p o l i m o r f i s m o s r e l a t i v a m e n t e prevalentes, apesar d e se
acreditar q u e esses sejam b e n i g n o s . Acredita-se q u e a a b s o r ç ã o NH,
d o folato, a p a r t i r de a l i m e n t o s c o n t e n d o p o l i g l u t a m i l folato, seja HO , 0 , OH N. , X -
r e d u z i d a p o r u m a v a r i a n t e da g l u t a m a t o c a r b o x i p e p t i d a s e II. A- " o o // "f
-o-H-o-H-o-, y - - s > '
r :

C
Toxicidade f y '\ <!>9 AH
N e n h u m efeito adverso tem sido r e l a t a d o pelo c o n s u m o d e ali-
m e n t o s f o r t i f i c a d o s c o m folato, assim, n e n h u m sinal d e toxici-
d a d e é associado à s u p l e m e n t a ç ã o de folato. Pelas l i m i t a d a s evi- a Coenzimas de pitidinas rmcleotídeos
)
V (1
i h

dências, u m a s u p l e m e n t a ç ã o excessiva t i p i c a m e n t e e m doses p—OH NADP

superiores a 10 m g / d i a irá p r e c i p i t a r ou exacerbar n e u r o p a t i a s C!)H
e m i n d i v í d u o s deficientes e m v i t a m i n a B ] 2 e é o f u n d a m e n t o
utilizado p a r a d e t e r m i n a r a c o n c e n t r a ç ã o s u p e r i o r tolerável de 1 Figura 2 7 - 1 7 Niacina, niacinamida e coenzima.
m g A l i a , a p a r t i r de a l i m e n t o s f o r t i f i c a d o s o u s u p l e m e n t o s p a r a
adultos. U m a c o m p l i c a ç ã o r e c o n h e c i d a d a s u p l e m e n t a ç ã o d e
folato é "mascarar" a deficiência de v i t a m i n a Bn, p o r q u e a a n e m i a v i t a m i n a s t e m q u e ser c o n s i d e r a d a , c o m relação ao m e t a b o l i s m o
associada a essa deficiência r e s p o n d e i s o l a d a m e n t e ao folato. Isso e, especialmente, às suas ações farmacológicas e m altas doses. A s
p o d e r e t a r d a r o t r a t a m e n t o da deficiência, p e r m i t i n d o q u e anor- e s t r u t u r a s d o s dois v i t â m e r o s e as duas f o r m a s coenzimáticas são
malidades neurológicas progridam. m o s t r a d a s n a Figura 27- 17-

Avaliação Laboratorial do Estado Fontes Dietéticas

O e s t a d o d o folato p o d e ser avaliado de m a n e i r a confiável p o r
d o s a g e n s diretas das c o n c e n t r a ç õ e s n o soro, eritrócitos o u sangue
total, e suas f u n ç õ e s m e t a b ó l i c a s c o m o coenzimas pelas c o n c e n -
trações de m e t a b ó l i t o s , tal c o m o h o m o c i s t e í n a plasmática. As
c o n c e n t r a ç õ e s de folato séricas são c o n s i d e r a d a s indicativas d e
ingestão r e c e n t e , e n ã o de e s t o q u e s teciduais, mas d o s a g e n s
seriais t ê m sido utilizadas p a r a c o n f i r m a r a ingestão a d e q u a d a .
A s c o n c e n t r a ç õ e s de folato e m sangue total o u e m eritrócitos são
indicativos mais a p r o p r i a d o s d e estoques teciduais, e t e m sido
d e m o n s t r a d o q u e estão m o d e r a d a m e n t e c o r r e l a c i o n a d a s c o m as
c o n c e n t r a ç õ e s de folato d o fígado.
E n s a i o s d e C P B a t u a l m e n t e s u b s t i t u e m a m p l a m e n t e procedi-
m e n t o s m i c r o b i o l ó g i c o s pelas dosagens de folato n o s o r o , sangue
total o u eritrócitos.
Intervalos de Referência
A coleta d e d a d o s d o N H A N E S d e 1988 a 1994 n o s Estados
U n i d o s , n a qual q u a s e 3 . 0 0 0 a m o s t r a s d e sangue f o r a m analisa-
das, p r o d u z i u intervalos de referências d e 2,6 a 12,2 Jig/L (6,0 a
2 8 n m o l / L ) p a r a o folato sérico e 103 a 411 f-lg/L (237 a 9 4 5
n m o l / L ) p a r a o folato e m eritrócitos; e n t r e t a n t o , essas amostras
f o r a m coletadas a n t e s da o b r i g a t o r i e d a d e d e fortificação d e fari-
n h a s . A deficiência b i o q u í m i c a foi d e f i n i d a c o m o u m a concen-
tração sética de f o l a t o <1,4 |Ug/L (<3,2 n m o l / L ) e <110 p.g/L
(<253 n m o l / L ) p a r a o folato e m eritrócitos.
Niacina e Niacinamida
Niflrina e niacinamida ( n i c o t i n a m i d a e a m i d a d o ácido nicotínico)
são c o n v e r t i d a s nas coenzimas r e d o x u b í q u a s n i c o t i n a m i d a
a d e n i n a d i n u c l e o t í d e o (NAD) + e n i c o t i n a m i d a a d e n i n a dinucle-
o t í d e o f o s f a t o (NADP) + .
Química
A niacina refere-se a (1) ácido n i c o t í n i c o (ácido piridína-3-carbo-
xílico), (2) a respectiva a m i d a n i a c i n a m i d a ( n i c o t i n a m i d a ) e (3)
derivados q u e a p r e s e n t a m a m e s m a atividade biológica da nico-
t i n a m i d a . U m a d i s t i n ç ã o e n t r e as d u a s f o r m a s p r i m á r i a s das
F o n t e s d e n i a c i n a i n c l u e m (1) levedura, (2) carnes magras, (3)
fígado, (4) aves, (5) leite, (6) s a l m ã o e n l a t a d o e (7) diversos vege-
tais de folhas verde-escuras. A d i c i o n a l m e n t e , alguns a l i m e n t o s
gêneros alimentícios, e s p e c i a l m e n t e cereais c o m o m i l h o e trigo,
c o n t ê m n i a c i n a ligada a diversos p e p t i d e o s e açúcares e m f o r m a s
n u t r i c i o n a l m e n t e n ã o p r o n t a m e n t e disponíveis ( n i a c i n ó g e n o s ou
n i a c i t m a ) . C o m o o t r i p t o f a n o é u m p r e c u r s o r d a n i a c i n a , as
p r o t e i n a s f o r n e c e m u m a p o r ç ã o considerável d o equi val ent e de
n i a c i n a (tão alto q u a n t o dois terços d a d e m a n d a d e niacina). E m
países o n d e a fortificação d e cereais processados é p r a t i c a d a , isso
significa até 2 0 % d a ingestão d e niacina.
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
O s N A D + e N A D P + da dieta são h i d r o l i s a d o s pelas enzimas da
m u c o s a intestinal para liberar n i c o t i n a m i d a q u e , e m c o n j u n t o
c o m q u a l q u e r á c i d o n i c o t í n i c o , é r a p i d a m e n t e absorvida n o estô-
m a g o e n o i n t e s t i n o p o r d i f u s ã o facilitada d e p e n d e n t e de Na + e m
baixas c o n c e n t r a ç õ e s e p o r d i f u s ã o passiva e m altas c o n c e n t r a -
ções. N i c o t i n a m i d a é a p r i n c i p a l f o r m a circulante n o plasma,
após absorção ou pela l i b e r a ç ã o d o N A D h e p á t i c o h i d r o l i s a d o ,
e depois se d i f u n d e na m a i o r i a d o s tecidos q u e r e q u e r e m N A D .
U m a vez d e n t r o das células, o á c i d o n i c o t í n i c o e a n i c o t i n a m i d a
são convertidos n a s f o r m a s c o e n z i m á t i c a s N o s tecidos, a m a i o r
p a r t e da v i t a m i n a está p r e s e n t e c o m o n i c o t i n a m i d a e m N A D e
N A D P , e m b o r a o f í g a d o possa c o n t e r u m a f r a ç ã o significativa d e
v i t a m i n a livre. Existe u m p e q u e n o estoque d a f o r m a ni aci na.
O excesso d e n i a c i n a é excretado p r i n c i p a l m e n t e c o m o N-
m e t í l n i c o t i n a m i d a ( N M N ) , a p ó s metilação n o fígado.
Funções
A n i a c i n a é essencial c o m o as c o e n z i m a s N A D e N A D P nas quais
a n i c o t i n a m i d a age c o m o u m a c e p t o r de elétrons ou d o a d o r de
h i d r o g ê n i o e m u m a m p l o n ú m e r o de reações redox. M u i t a s das
enzimas f u n c i o n a m c o m o d e s i d r o g e n a s e s e catalisam u m a g r a n d e
diversidade d e reações, tais c o m o a conversão de álcoois e m
aldeídos o u cetonas, de h e m i a c e t a i s e m lactonas, aldeídos e m
ácidos e certos a m i n o á c i d o s e m cetoácidos ( C a p í t u l o 19).
508 PARTE IV Analitos

A m a i o r i a das desidrogenases q u e utiliza N A D o u N A D P ções d o estado n u t r i c i o n a l d e niacina t e m sido baseada n a m e d i d a

f u n c i o n a reversível m e n t e . A g l u t a m a t o desidrogenase, p o r
exemplo, favorece a direção oxidativa, e n q u a n t o outras, c o m o a
g l u t a t i o n a redutase, p r e f e r e n c i a l m e n t e catalisam r e d u ç ã o . O
ácido n i c o t í n i c o , q u a n d o utilizado c o m o u m agente f a r m a c ê u -
tico, t e m p r o p r i e d a d e s a n t i a t e r o g ê n i c a s i m p o r t a n t e s . Esse, efeti-
v a m e n t e , (1) d i m i n u i as c o n c e n t r a ç õ e s d e triglicerídeos, (2)
a u m e n t a as de H D L colesterol e (3) m u d a as partículas L D L para
u m f e n ó t i p o m e n o s aterogênico.
de dois metabólitos urinários, N ' - m e t i l n i c o t i n a m i d a e N'-metil-2-
piridona-5-carboxamida. N o r m a l m e n t e , os adultos excretam 2 0 %
a 3 0 % de niacina n a f o r m a m e t i l n i c o t i n a m i d a e 4 0 % a 6 0 % c o m o
p i r i d o n a . A razão de excreção e n t r e p i r i d o n a e m e t i l n i c o t i n a m i d a
de 1,3 a 4 é, p o r t a n t o , n o r m a l , m a s a deficiência latente d e niacina
é indicada p o r valores inferiores a 1. A H P L C é o m é t o d o escolhido
a t u a l m e n t e , e m b o r a alguns m é t o d o s utilizando eletroforese de
capilaridade t e n h a m sido desenvolvidos.

Necessidades e Recomendações para Ingestão de Intervalos de Referência

Nutrientes
Necessidades de niacina são expressas c o m o equivalentes de
n i a c i n a (NE), q u e levam e m c o n s i d e r a ç ã o a c o n t r i b u i ç ã o d o trip-
t o f a n o d e r i v a d o d e p r o t e í n a . A ingestão m e d i a n a d e niacina pré-
f o r m a d a a partir de alimentos, nos Estados U n i d o s , é d e 2 8 m g
p a r a h o m e n s e 18 mg para m u l h e r e s , e u m e s t u d o de d u a s p o p u -
lações c a n a d e n s e s m o s t r a r a m valores c o r r e s p o n d e n t e s de 41 m g e
2 8 m g / d i a . A d i c i o n a l m e n t e , a dieta m é d i a n o s Estados U n i d o s
s u p r e e n t r e 0,7 e 1,1 g de t r i p t o f a n o p o r dia. C o m base e m d a d o s
d e excreção metabólica de niacina, as R D A s atuais são 16 m g / d i a
d e N E para h o m e n s e 14 m g / d i a para m u l h e r e s . U m a u m e n t o d e
4 N E pOT dia d u r a n t e a gravidei é r e c o m e n d a d o e u m a u m e n t o
d e 3 N E é r e c o m e n d a d o d i a r i a m e n t e para lactantes. 1
Deficiência
A pelagra é a d o e n ç a h u m a n a clássica d e c o r r e n t e da deficiência e
q u e t e m sido observada e n t r e aqueles q u e c o n s o m e m principal-
m e n t e u m a d i e t a baseada e m m i l h o , q u e é p o b r e e m n i a c i n a e
t r i p t o f a n o . E m b o r a sua p a t o g ê n e s e seja associada a u m a defici-
ência desses dois fatores, o u t r o s fatores c o m p l i c a d o r e s associados
são as carências d e PLP, F A D e ferro, q u e a t u a m n a c o n v e r s ã o d e
t r i p t o f a n o e m niacina. A pelagra t a m b é m é u m a m a n i f e s t a ç ã o
ocasional e s e c u n d á r i a n a síndrome carcinóiãe, n a q u a l até 6 0 % d o
t r i p t o f a n o é catabolizado a 5 - O H t r i p t o f a n o e s e r o t o n i n a ; n a
doença de Hartnup u m a d e s o r d e m recessiva a u t o s s ô m i c a n a q u a l
diversos a m i n o á c i d o s , i n c l u i n d o o t r i p t o f a n o , são p r e c a r i a m e n t e
absorvidos; e e m t r a t a m e n t o s a n t i t u b e r c u l o s e c o m a droga iso-
niazida, q u e c o m p e t e c o m o PLP. A a p r e s e n t a ç ã o típica da pelagra
é d e u m a d o e n ç a c r ô n i c a d e g e n e r a t i v a associada a d e r m a t i t e ,
d e m ê n c i a e diarréia.
Toxicidade
E m b o r a n e n h u m efeito tóxico t e n h a sido associado à ingestão de
n i a c i n a de a l i m e n t o s n a t u r a i s , o uso de s u p l e m e n t o s e doses
farmacológicas d e n i a c i n a p r o d u z i u efeitos adversos e m alguns
i n d i v í d u o s . E m d e s o r d e n s e m q u e h á d i s p o n i b i l i d a d e d e tripto-
f a n o reduzida, c o m o a d o e n ç a d o H a r t n u p e a s í n d r o m e carci-
n ó i d e , doses diárias d e n i a c i n a d e 4 0 e 2 0 0 m g p o d e m ser
necessárias, e, n o t r a t a m e n t o d e dislipidemias, até 6 g diários
p o d e m ser utilizados. Tais doses são c o m u m e n t e associadas à
U m a o r i e n t a ç ã o p a r a o i n t e r v a l o de referência para a taxa de
excreção d e N ' - m e t i l n i c o t i n a m i d a é de 2,4 a 6,4 m g / d i a (17,5 a
46,7 n m o l / d i a ) , o u 1,6 a 4,3 m g / g d e c r e a t i n i n a (11,7 a 31,4
[ i m o l / g d e creatinina). 1 2
Ácido Pantotênico
O á c i d o p a n t o t ê n i c o é u m c o m p o n e n t e d a coenzima ( C o A ) e é
necessário para o m e t a b o l i s m o d e g o r d u r a , p r o t e í n a e carboi-
drato, via ciclo d o á c i d o cítrico.
Química
O á c i d o p a i u o i ê n i c u é d e o c o r r ê n c i a u b í q u a n a natureza, o n d e
é sintetizado pela m a i o r i a d o s m i c r o r g a n i s m o s e p l a n t a s a p a r t i r
d o á c i d o p a n t ó i c o (ácido D-2,4-diidroxi-3,3-dimetilbutírico) e Ji-
alanina. A adição de c i s t e a m i n a à e x t r e m i d a d e C - t e r m i n a l e a
fosfoTilação f o r m a m a 4 ' - f o s f o p a n t e t e í n a , q u e atua c o m o u m
g r u p o prostético associado c o v a l e n t e m e n t e às p r o t e í n a s carreado-
ras d e acil e c o m o p a r t e da C o A (Figura 27-18). A f o r m a sintética
comercial m a i s c o m u m é o sal de cálcio.
Fontes Dietéticas
O ácido pantotênico é a m p l a m e n t e distribuído e m alimentos,
m a j o r i t a r i a m e n t e e m c o m p o s t o s c o n t e n d o C o A , e é particular-
m e n t e a b u n d a n t e e m (1) a l i m e n t o s d e o r i g e m a n i m a l , (2) legumes,
(3) grãos d e cereais n ã o - b e n e f i c i a d o s , (4) g e m a de ovo, (5) r i m ,
(6) f í g a d o e (7) levedura.
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
O ácido p a n t o t ê n i c o é o b t i d o n a dieta c o m o c o m p o s t o s de C o A
e 4 ' - f c s f o p a n t e t e í n a , e é h i d r o l i s a d o pela pirofosfatase e pela
fosfatase f o r m a n d o d e f o s f o - C o A , f o s f o p a n t e t e í n a e p a n t e t e í n a n o
l ú m e n intestinal q u e , p o s t e r i o r m e n t e , são h i d r o l i s a d o s f o r m a n d o
o ácido p a n t o t ê n i c o . A v i t a m i n a é p r i m a r i a m e n t e a b s o r v i d a
c o m o ácido p a n t o t ê n i c o p o r u m processo saturável e m baixas
4Fosfopa n te Ce inil
W1-.
Pantotenil
1

^^ J
vasodilatação ou " r u b o r " , u m a q u e i m a ç ã o ou sensação de formi- OH CH, N
í O

\/
g a m e n t o da face ( q u e p o d e ficar ruborizada), d o b r a ç o e d o peito,
H L ! : — C H J — O — P — O — P — O-
e acredita-se q u e é m e d i a d a p o r p r o s t a g l a n d i n a s . O u t r o s efeitos

w
CH 3 AH AH
colaterais d e t r a t a m e n t o s c o m altas doses de n i a c i n a são (1) í HN
p r u r i d o , (2) n á u s e a , (3) v ô m i t o e (4) diarréia, e m b o r a esses sinto-
m a s f r e q u e n t e m e n t e d i m i n u a m c o m terapia c o n t í n u a . O s sinto- Ó ÒH

m a s d e ruboT t ê m sido i n t e r p r e t a d o s c o m o endpoint n a f o r m u l a - Coeniima A O OH

u».
ção d e u m a c o n c e n t r a ç ã o de ingestão m á x i m a tolerável para H N ^ O
AH
n i a c i n a , q u e foi estabelecida e m 3 5 m g / d i a para a d u l t o s .

l*
Avaliação Laboratorial do Estado
A t é o m o m e n t o , n e n h u m m a r c a d o r s a n g u í n e o é c o m u m e n t e uti- Figura 2 7 - 1 8 Pantotenato e 4'-fosfopanteteína como componente
lizado c o m o indicador d o e s t a d o de niacina. A maioria das avalia- de CoA.

c o n c e n t r a ç õ e s e p o r d i f u s ã o simples e m c o n c e n t r a ç õ e s altas. O
processo saturável é facilitado p o r u m t r a n s p o r t a d o r multivita-
m i n a d e p e n d e n t e de s ó d i o . A p ó s a absorção, o ácido p a n t o t ê n i c o
e n t r a n a circulação e é c a p t a d o pelas células de u m a m a n e i r a
similar à sua absorção intestinal. A síntese de C o A a p a r t i r d e
p a n t o t e n a t o é regulada pela p a n t o t e n a t o q u m a s e . O ácido p a n -
t o t ê n i c o é excretado n a u r i n a após a hidrólise d e c o m p o s t o s d e
C o A pelas enzimas q u e clivam as porções fosfato e cisteamina.
Funções
O ácido p a n t o t ê n i c o tem dois papéis m e t a b ó l i c o s p r i n c i p a i s (1)
c o m o p a r t e da C o A e (2) c o m o g r u p o prostético d a p r o t e í n a
c a r r e a d o r a d e acil (ACP). N o p r i m e i r o papel, a C o A está p r i m a -
r i a m e n t e envolvida e m reações d e t rans ferênci a d e acetil e acil
e m processos catabóíicos de c a r b o i d r a t o s , lipídios e proteínas.
E n q u a n t o p o r ç ã o 4 ' - f o s f o p a n t e t e í n a d a ACP, o g r u p o prostético,
associado p o r ligação fosfodiéster, utiliza a e x t r e m i d a d e sulfidril
para trocar c o m m a l o n i l - C o A , para f o r m a r u m a ACP-S m a l o n i l
tioéster, q u e tem a cadeia a l o n g a d a d u r a n t e a biossíntese d e
ácidos graxos.
Necessidades e Recomendações para Ingestão de
Nutrientes
A AI foi estabelecida c o m o 5 m g / d i a p a r a i n d i v í d u o s acima de
13 a n o s . D o s e s adicionais de 1 m g / d i a e 2 m g / d i a são sugeridas
p a r a m u l h e r e s grávidas e lactantes, respectivamente. 2
Deficiência
A extensa d i s p o n i b i l i d a d e d e á c i d o p a n t o t ê n i c o n o s a l i m e n t o s é
p r o p o r c i o n a l aos seus diversos papéis e faz com q u e a deficiência
e m h u m a n o s seja improvável. O s s i n t o m a s p r o d u z i d o s e m volun-
tários a l i m e n t a d o s c o m a n t a g o n i s t a d e p a n t o t e n a t o o u c o m
dietas semi-sintéticas p r a t i c a m e n t e livres d e p a n t o t e n a t o f o r a m
(1) irritabilidade, (2) h i p o t e n s ã o p o s t u r a l e b a t i m e n t o s cardíacos
acelerados n o exercício, (3) distresse epigástrico c o m anorexia e
constipação, (4) d o r m ê n c i a e f o r m i g a m e n t o das m ã o s e d o s pés,
(5) reflexos de t e n d õ e s p r o f u n d o s hiperativos e (6) fraqueza dos
m ú s c u l o s extensores d o s d e d o s . H i s t o r i c a m e n t e , a deficiência de
ácido p a n t o t ê n i c o t e m sido associada à s í n d r o m e d o " a r d o r n o s
pés" vivenciada p o r p r i s i o n e i r o s da S e g u n d a G u e r r a M u n d i a l , n a
Ásia, aliviada a p e n a s c o m a s u p l e m e n t a ç ã o d e ácido p a n t o t ê n i c o ,
e n ã o pela s u p l e m e n t a ç ã o c o m o u t r a s v i t a m i n a s d o g r u p o B.
Toxicidade
N ã o existem relatos de efeitos adversos, c o m exceção d e diarréia
m o d e r a d a ocasional, c o m d o s e s orais elevadas de ácido p a n t o t ê -
nico, c o m o , p o r exemplo, 20 g / d i a
Avaliação Laboratorial do Estado
N ã o existem testes f u n c i o n a i s c o n v e n i e n t e s ou confiáveis p a r a o
estado d e ácido p a n t o t ê n i c o , assim a avaliação é feita p o i dosa-
gens diretas das c o n c e n t r a ç õ e s e m s a n g u e total o u u r i n a . Dosa-
gens n a u r i n a são, talvez, a m a n e i r a mais fácil d e c o n d u z i r e
i n t e r p r e t a r esses testes, e as c o n c e n t r a ç õ e s são i n t i m a m e n t e rela-
c i o n a d a s c o m a ingestão na dieta. 1 2 As dosagens e m sangue total
são preferíveis àquelas e m plasma, q u e c o n t é m a p e n a s ácido
p a n t o t ê n i c o livre e é insensível às variações d e ingestão d o ácido
p a n t o t ê n i c o . As c o n c e n t r a ç õ e s de ácido p a n t o t ê n i c o d e t o d o s os
f l u i d o s descritos a c i m a t ê m sido avaliadas por e n s a i o microbio-
lógico, mais c o m u m e n t e u t i l i z a n d o LdctobaciUus plantarum.
O u t r a s técnicas q u e t ê m s i d o utilizadas i n c l u e m (1) r a d i o i m u n o -
ensaio, (2) c r o m a t o g r a f i a gasosa, (3) c r o m a t o g r a f i a gasosa-espec-
t r o m e t r i a d e massa e (4) e n s a i o d e d i l u i ç ã o d o i s ó t o p o estável.
C o A e A C P t ê m sido d o s a d a s p o r m é t o d o s enzimáticos.
Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 509
Intervalos de Referência
A excreção u r i n á r i a d o ácido p a n t o t ê n i c o inferior a 1 m g / d i a é
c o n s i d e r a d a e x t r e m a m e n t e baixa. A suspeita de ingestão inade-
q u a d a é p o s t e r i o r m e n t e c o r r o b o r a d a se as c o n c e n t r a ç õ e s d o
s a n g u e f o r e m inferiores a 100 (J.g/L. A o r i e n t a ç ã o para i n t e r v a l o
de referência p a r a o ácido p a n t o t ê n i c o n o sangue total ou n o
s o r o é de 3 4 4 a 5 8 3 H g / L (1,57 a 2,66 p m o l / L ) e p a r a a excreção
u r i n á r i a é de 1 a 5 m g / d i a (5 a 6 8 f i m o l / L ) .
ELEMENTOS-TRAÇO
O t e r m o eíemento-traço era o r i g i n a l m e n t e utilizado para descrever
a q u a n t i d a d e de analito i n o r g â n i c o residual d e t e r m i n a d o q u a n -
t i t a t i v a m e n t e e m u m a a m o s t r a . M é t o d o s analíticos mais sensíveis
a t u a l m e n t e f o r n e c e m q u a n t i f i c a ç ã o mais a c u r a d a d a m a i o r i a d o s
m i c r o n u t r i e n t e s i n o r g â n i c o s presentes e m c o n c e n t r a ç õ e s m u i t o
baixas e m f l u i d o s c o r p o r a i s e tecidos. A q u e l e s presentes e m
f l u i d o s c o r p o r a i s ((.ig/dL) e e m tecido ( m g / k g ) são, e n t r e t a n t o ,
a i n d a a m p l a m e n t e referidos c o m o "elementos-tiaço", e aqueles
e n c o n t r a d o s e m n g / d L o u |J.g/kg, c o m o " e l e m e n t o s - u l t r a t r a ç o " .
As necessidades dietéticas c o r r e s p o n d e n t e s são cotadas e m m g /
dia ou | i g / d i a , r e s p e c t i v a m e n t e . U m e l e m e n t o é c o n s i d e r a d o
essencial q u a n d o os sinais e s i n t o m a s i n d u z i d o s pela deficiência
dietética são u n i c a m e n t e revertidos p o r u m s u p r i m e n t o ade-
q u a d o de u m elemento-traço p a r t i c u l a r (Figura 27-19).
Considerações Analíticas
Fatores analíticos q u e devem ser c o n s i d e r a d o s nas dosagens d e
elementos-traço i n c l u e m (1) a d e q u a ç ã o da a m o s t r a , (2) fatores
pré-analíticos, (3) e q u i p a m e n t o p a r a coleta, (4) m e t o d o l o g i a e (5)
segurança na qualidade.
Adequação da Amostra
A m o s t r a s de s a n g u e total, p l a s m a e s o r o são mais c o m u m e n t e
s u b m e t i d a s p a t a análises diretas d e elementos-traço. D e t e r m i n a -
ção direta desses e l e m e n t o s , e n t r e t a n t o , t e m sido feita e m qual-
q u e r f l u i d o c o r p o r a l ou tecido. Por exemplo, a m o s t r a s de t e c i d o s
p a r a análise p o d e m ser obtidas p o r biópsia d e aspiração c o m
agulha (fígado ou osso) ou após u m a autopsia. A m o s t r a s d e
cabelo e u n h a s oferecem u m a m a n e i r a n ã o invasiva d e coletar
a m o s t r a s teciduais e são utilizadas p a r a avaliar exposição a m e t a l
tóxico, mas p r o b l e m a s d e c o n t a m i n a ç ã o e x t e r n a q u e p o d e m
surgir pela p o l u i ç ã o a m b i e n t a l , cosméticos o u x a m p u s são difíceis
de controlar.
Ótir
100%
Figura 2 7 - 1 9 Modelo da relação entre concentração tecidual e
ingestão de u m n u t r i e n t e essencial e a função biológica dependente.
510 PARTE IV Analitos
A c o n c e n t r a ç ã o de elementos-traço essenciais e m células
nucleadas tem sido d e t e r m i n a d a em vários tipos de leucócitos e
e m plaquetas. E n t r e t a n t o , a separação de células brancas e pla-
quetas do sangue total está sujeita a sérios problemas de conta-
minação antes da análise d o elemento-traço.
Fatores Pré-Analíticos
Existem n u m e r o s a s variáveis q u e afetam as determinações de
elementos-traço antes de a realização da análise das amostras ser
realizada, e essas requerem controle cuidadoso. Por exemplo, (1)
idade, (2) sexo, (3) origem étnica, (4) tempo de coleta e m relação
à ingestão de alimentos, (5) p e r í o d o do dia, (6) histórico de
m e d i c a m e n t o s e (7) uso de tabaco devem ser relacionados q u a n d o
se estabelecem intervalos de referência a partir de populações-
controle saudáveis. Para serem interpretados, os resultados
t a m b é m r e q u e r e m o c o n h e c i m e n t o da extensão de q u a l q u e r
reação de fase aguda (APR).
Equipamento de Coleta
A escolha d o recipiente paTa as amostras é i m p o r t a n t e p o r q u e a
c o n t a m i n a ç ã o p o r borracha, cortiça e plásticos coloridos tem sido
u m problema. Para o plasma, tubos de h e p a r i n a lítica c o m o
anticoagulante são apropriados para a maioria das análises. Para
o soro, tubos de vidro planos têm sido usados. Para metais-ultra-
traço (Mn, Cr), arranjos especiais devem ser feitos para coleta de
sangue via cânula plástica ou agulhas de aço siliconizadas, e,
então, a a m o s t r a é colocada d e n t r o de u m recipiente pré-lavado
c o m ácido. T u b o s de coleta a vácuo para avaliar metal-traço estão
disponíveis comercialmente. E u m a boa prática passar soluções
ácidas diluídas e m todos os recipientes e sistemas de coleta para
garantir que t o d o a material utilizado na coleta p e r m a n e ç a o
m á x i m o possível livre de c o n t a m i n a ç ã o .
Para a coleta de u r i n a de 24 horas, é i m p o r t a n t e q u e essa n ã o
seja feita e m coletor de fibra descartável ou recipiente de aço
inoxidável, e garrafas de polietileno devem ser utilizadas com
ácido acético glacial c o m o preservativo.
Metodologia
O s limites de detecção de métodos analíticos utilizados para deter-
minação de elementos-traço e ultratraço e m amostras biológicas
são importantes p o r q u e as concentrações desses elementos estão
na faixa de n a n o g r a m a por grama ou micrograma por grama. N a
prática, a concentração dos elementos-traço e ultratraço devem
estar pelo m e n o s 10 vezes acima d o limite de detecção do m é t o d o ,
assim assegurando acuidade suficiente e precisão.
O s m é t o d o s analíticos c o m u m e n t e utilizados estão resumidos
a seguir:
Espectrofotometria
Q u a n d o aplicados para análise de elementos-traço, os m é t o d o s
de espectrofotometria são baseados n a utilização de u m reagente
f o r m a d o r de cor; entretanto, esses carecem de especificidade.
Interferências t a m b é m acontecem e m amostras hemolisadas, lipê-
micas e ictéricas. N a prática, a técnica só é sensível para os ele-
mentos-traço mais a b u n d a n t e s c o m o ferro, zinco e cobre.
Espectrofotometria de Absorção Atômica (AAS)
A AAS de c h a m a é a m p l a m e n t e utilizada para a d e t e r m i n a ç ã o de
zinco e cobre n o soro (Capítulo 4). Essa técnica não p e r m i t e
medir o cobre n a urina, que requer u m m é t o d o mais sensível e
mais t e c n i c a m e n t e exigente, a espectrometria de absorção atômica
c o m atomização eletrotérmica (ETA-AAS). Nessa técnica, volumes
das amostras tão p e q u e n o s q u a n t o 10 |jL são seqüencialmente
volatilizados e atomizados em um t u b o de grafite. Essa técnica é
útil em situações nas quais o v o l u m e da amostra é limitado o u
para elementos para os quais limites de detecção baixos são
necessários, tais c o m o selênio e manganês. Sistemas ópticos c o m
correção d o b a r u l h o de f u n d o utilizando l â m p a d a de deutério
ou e m p r e g a n d o o efeito Z e e m a n são agora c o m p o n e n t e s de
padronização e m i n s t r u m e n t a ç ã o de ETA-AAS (Capítulo 4).
AASs de chama e eletrotérmica são técnicas para avaliar elemen-
tos isolados, e as análises d e diferentes elementos devem ser
realizadas seqüencialmente, o que implica em desperdício de
tempo e de amostra.
Espectrometria de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente
Acoplado (ICP-OES)
A ICP-OES está s u b s t i t u i n d o a AAS e m alguns laboratórios. As
principais variações para a i n s t r u m e n t a ç ã o de ICP-OES têm
levado à diminuição d o limite de detecção. Esta t a m b é m oferece
u m a ampla escala d i n â m i c a (p. ex., três ordens de m a g n i t u d e para
a maioria dos elementos) q u e permite análise simultânea obtida
a partir de u m a única alíquota diluída da amostra. A alta tempe-
ratura d o plasma, 7.500 °C, t o r n a a técnica largamente livre de
interferências químicas, mas efeitos matriciais, b a r u l h o de f u n d o
e interferências espectrais são superiores àquelas da AAS.
Espectrometria de Massa com Plasma Indutivamente Acoplado
(1CP-MS)
Essa técnica é mais sensível que ETA-AAS ou ICP-OES e é no
m o m e n t o o m é t o d o preferencial pata elementos-ultratraço. Inter-
ferências poliatômicas são mais prováveis para massas me n o r e s
que 80. ICP-MS t a m b é m tem sido usada para m e d i r isótopos
estáveis e para a c o n d u ç ã o de m é t o d o s de traçador c o m isótopo
estável e análise de diluição isotópica. O s princípios de espectro-
metria de massa são discutidos n o C a p í t u l o 8.
Considerações da Garantia de Qualidade
U m esquema de garantia de qualidade efetiva p a i a as análises de
elementos-traço e ultratraço requer a incorporação dos seguintes
itens e m cada grupo de amostras analisado: (1) brancos, (2)
réplica das análises para obter precisão, (3) calibradores dos ele-
mentos-traço de interesse e m faixas de concentração esperadas
das amostras analisadas e (4) solução de referência ou controle
c o m concentrações conhecidas ou certificadas de elementos-traço
para d e t e r m i n a r m e l h o r acuidade e precisão entre as réplicas. O
material de referência deve ser do m e s m o tipo de matriz e conter
a p r o x i m a d a m e n t e as mesmas q u a n t i d a d e s de analito q u e as
amostras. É t a m b é m essencial que os laboratórios que m e d e m
elementos-traço participem e m programas externos de avaliação
de qualidade.
Elementos-Traço Individuais
O s elementos-traço discutidos a seguir incluem (1) cromo, (2)
cobalto, (3) cobre, (4) flúor, (5) manganês, (6) molibdênio, (7)
selênio e (8) zinco.
Cromo
O c r o m o é e n c o n t r a d o n a t u r a l m e n t e e m diversas materiais cris-
talinos. Este é u m e l e m e n t o de transição com m u i t o s interesses
industriais e é descartado n o a m b i e n t e c o m o rejeito industrial.
Química
O c r o m o ( n ú m e r o atômico 24, massa atômica relativa 51,99) é
u m metal de transição que se encontra nos seres vivos c o m as
valências 3" ou 6 + , cada u m a p r e s e n t a n d o propriedades diferentes
e marcantes. O c r o m o trivalente (Cr3"1) é considerado elemento-
traço essencial que a u m e n t a a ação da insulina. O c r o m o hexa-

valente Cr 6 " é u m antioxidante forte e causa d a n o s em tecidos,
embora seja r a p i d a m e n t e reduzido a Cr J * d u r a n t e o contato com
alimentos e c o n t e ú d o gástrico.
U m a forma biologicamente ativa do Cr 3 " é conhecida c o m o
fator de tolerância A glicose (GTF) e é e n c o n t r a d o em leveduras
de cervejarias, mas a sua f u n ç ã o ainda p e r m a n e c e incerta. Acre-
dit a-se que sua estrutura seja u m complexo de c r o m o ern forma
cie octaedro c o m duas moléculas de ácido nicotínico t e n d o
q u a t r o sítios de coordenação ligados ao ácido glutâmico, glicina
e cisteína.
Fontes Dietéticas
As estimativas de q u a n t i d a d e s de c r o m o em alimentos variam e m
virtude de dificuldades analíticas e c o n t a m i n a ç ã o pelo c o n t a t o
c o m aço inoxidável d u r a n t e o processamento, estocagem e cozi-
m e n t o do alimento. Boas fontes de c r o m o incluem (1) carnes
processadas, (2) grãos não-beneficiados, (3) feijões verdes, (4)
brócolis e (5) algumas especiarias. A estimativa de ingestão dieté-
tica para adultos nos Estados U n i d o s varia de 20 a 30 [.ig/dia.
S u p l e m e n t o s c o n t e n d o c r o m o são utilizados por cerca de 8 % dos
adultos nos Estados U n i d o s .
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
A absorção intestinal de Cr J + varia de 0 , 4 % a 2,5%, assim a
excreção fecal é p r i n c i p a l m e n t e c r o m o dietético n ã o absorvido.
A p ó s a absorção, o c r o m o se liga à transferrina plasmática com
afinidade similar à do ferro. O cromo se concentra e m (1) fígado,
(2) baço, (3) outros tecidos moles e (4) ossos h u m a n o s . A excreção
urinária é cerca de 0,2 a 0,3 |j.g/dia, c o m a q u a n t i d a d e excretada
d e p e n d e n t e da ingestão.
Funções
Acredita-se que u m octapeptídeo intracelular de baixo peso mole-
cular (LMWCr), t a m b é m c o n h e c i d o c o m o c r o m o d u l m a , se ligue
ao C r ' 1 a u m e n t a n d o a resposta dos receptores de insulina. N o
m o d o de ação proposto, (l) os receptores inativos de insulina
localizados nas m e m b r a n a s plasmáticas são convertidos e m u m a
forma ativa pela ligação à insulina circulante, (2) essa ligação
estimula o m o v i m e n t o do c r o m o ligado à transferrina plasmática
d e n t r o da célula, (3) o cromo, então, se liga à a p o L M W C r , con-
vertendo-a em sua forma inativa que então se liga a receptores de
insulina, p o t e n c i a n d o a atividade de quinase e (4) u m a vez que
as concentrações de glicose e insulina plasmáticas a t i n j a m níveis
n o r m a i s de glicemia, o fator L M W C r é liberado da célula para
t e r m i n a r seus efeitos.
Necessidades e R e c o m e n d a ç õ e s para Ingestão de Nutrientes
Por não haver evidência suficiente para estabelecer a necessidade
média estimada (EAR), a ingestão média, baseada em ingestões
estimadas, foi estabelecida e m 35 [ag de cromo por dia para
h o m e n s e de 25 jag por dia para m u l h e r e s . N e n h u m limite supe-
rior tolerável foi estabelecido para a ingestão dietética de Cr 3 + .
Deficiência
O s sinais clínicos da deficiência h u m a n a de cromo foram descri-
tos clara e p r i m e i r a m e n t e em pacientes que recebiam n u t r i ç ã o
parenteral por períodos prolongados. Todos os casos que têm
sido publicados apresentam histórias similares, c o m pacientes
previamente estáveis que desenvolveram (l) intolerância à glicose
e resistência à insulina, (2) perda de peso e em alguns casos (3)
déficits neurológicos. Adição de q u a n t i d a d e s substanciais de C r ' "
à dieta p o r via intravenosa (150 a 200 |ig/dia) reverte a intole-
rância à glicose, reduz a necessidade de insulina e leva à m e l h o r a
eventual das desordens neurológicas.
Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 511
Significado Clinico
Acredita-se q u e o c r o m o tenha u m papel na tolerância à glicose
d i m i n u í d a , n o diabetes e e m d o e n ç a cardiovascular.
Tolerância à Glicose Diminuída e Diabetes. O estado nutricional
deficiente de c r o m o p o d e ser u m fator q u e provoca a r e d u ç ã o de
tolerância à glicose em alguns pacientes. E n t r e t a n t o , a variabili-
dade na ingestão dietética do c r o m o e a carência de u m m a r c a d o r
laboratorial ou clínico útil para identificar facilmente aqueles
pacientes com estado deficiente têm criado dificuldades. U m a
metanálise q u e investigou 15 experimentações c o m amostras
escolhidas ao acaso sobre o efeito do c r o m o na glicose, insulina
e h e m o g l o b i n a glicosilada (geralmente conhecida c o m o H b A ^ ) *
concluiu q u e n ã o havia efeitos d o c r o m o sobre a glicose ou insu-
lina em participantes não-diabéticos e q u e os dados para pessoas
c o m diabetes eram inconclusivos. C o n s e q ü e n t e m e n t e , experi-
mentações em grande escala são requeridas.
Sugeriu-se que, a curto prazo, doses inferiores a 1.000 (J-g de
c r o m o por dia p o d e ser u m t r a t a m e n t o adicional útil para a
diabetes tipo 2. A m o n i t o r a ç ã o da f u n ç ã o d o rim e a avaliação
clínica de qualquer m u d a n ç a dermatológica são r e c o m e n d a d a s .
As dosagens utilizadas sugerem u m papel farmacológico para o
cromo, e u m a potencial toxicidade deve ser considerada. A
terapia com c r o m o n o controle e prevenção de diabetes é, con-
s e q ü e n t e m e n t e , de interesse considerável e assunto de muita
controvérsia.
Doença Cardiovascular. Acredita-se que a depleção de c r o m o
possa estar associada a u m a u m e n t o n o risco cardiovascular.
Relatos de respostas favoráveis de lipídios ao s u p l e m e n t o de
c r o m o têm sido publicados.
Toxicidade
O cromo hexavalente é u m r e c o n h e c i d o carcinógeno, e a expo-
sição a fumaças industriais e poeiras c o n t e n d o esse metal está
associada à incidência a u m e n t a d a do câncer de p u l m ã o , derma-
tite e ulcerações da pele (Capítulo 32).
As espécies de C r + são relativamente atóxicas, em parte graças
à absorção intestinal deficiente e excreção rápida pela urina.
Entretanto, o picolinato de cromo é u m suplemento dietético
extensamente utilizado, e foi relatado q u e este composto causa
danos renais e hepáticos q u a n d o utilizado e m doses elevadas.
Avaliação Laboratorial do Estado
U m a resposta benéfica à s u p l e m e n t a ç ã o de c r o m o em pacientes
c o m intolerância à glicose é, atualmente, o ú n i c o meio de con-
firmar a deficiência e m cromo. N e n h u m m é t o d o prático para
avaliar a depleção de c r o m o intracelular está disponível. A l é m
disso, sabe-se, a partir de experiências iniciais com animais, q u e
o c r o m o circulante não está e m equilíbrio com as reservas fisio-
lógicas importantes.
A determinação direta do cromo n o plasma ou n o soro
s o m e n t e é possível se for t o m a d o u m grande cuidado para impedir
a contaminação antes e d u r a n t e a análise. O s p r o c e d i m e n t o s de
coleta de amostras devem evitar qualquer contato c o m aço inoxi-
dável, assim todos os sistemas para coleta de sangue de plástico
ou agulhas de aço siliconizadas devem ser utilizados, e as amostras
devem ser armazenadas e m recipientes lavados com ácido.
A detecção de q u a n t i d a d e s a u m e n t a d a s de c r o m o na u r i n a é
u m a confirmação da exposição ocupacional ou a m b i e n t a l recente
a u m excesso de cromo.
*A Incemational Union of Pure Applied Chemistry (IUPAC) e a International
Federation of Clinicai Chemistry (IFCC) recomendam que o termo apropriado
para hemoglobina glicosilada seja hemoglobina beta-N-l-deoxi frutosil. Esta
recomendação é controversa, e a aceitação global está sob debate.
512 PARTE IV Analitos
Intervalos de Referência
A t u a l m e n t e , valores m u i t o baixos são considerados n o r m a i s para
o soro (0,1 a 0,2 Hg/L [2 a 3 n m o l / L ] ) e, para urina, inferiores a
0,2 (jg de c r o m o por L (<3 n m o l / L ) .
Cobalto
O cobalto é essencial para seres h u m a n o s s o m e n t e c o m o parte
integral da vitamina B ] 2 (cobalamina). N e n h u m a outra f u n ç ã o
para o cobalto n o corpo h u m a n o é conhecida. Detalhes bioquí-
micos e f u n c i o n a i s da v i t a m i n a são discutidos a n t e r i o r m e n t e .
A microbiota d o intestino h u m a n o n ã o pode utilizar cobalto para
sintetizar cobalamina fisiologicamente ativa. A exigência h u m a n a
da vitamina Bn deve ser fornecida pela dieta. O cobalto livre (não
associado à vitamina B ]2 ) não interage com o c o n t e ú d o de vita-
m i n a B n do corpo.
Cobre
O cobre é u m elemento-traço i m p o r t a n t e que está associado a
u m grande n ú m e r o de metaloproteínas. Está presente e m siste-
mas biológicos e m ambos os estados de valências 1* e 2*.
Química
O cnhre ( n ú m e r o atômico 29, massa atômica relativa 63,54) apre-
senta os estados de oxidação de Cu 1 + e Cu 2 + e m sistemas biológi-
cos. A fácil conversão entre estes íons proporciona ao e l e m e n t o
importantes propriedades de redox. E m virtude da elevada afini-
d a d e por elétrons, estes são os íons de elementos-traço essenciais
mais f o r t e m e n t e ligados às moléculas orgânicas. Por exemplo, o
cobre e m material biológico é complexado c o m proteínas, peptí-
deos e outros ligantes orgânicos. U m a série elaborada de proteínas
de ligação e transporte d e n t r o das células protege o g e n o m a contra
ataques de radicais livres de cobre. Isto m a n t é m a concentração
de cobre livre n o citoplasma m u i t o baixa (em t o r n o de 10"15 m o l /
L). A m e t a l o e m i m a c o n t e n d o cobre, superóxido dismutase (SOD),
protege contra danos aleatórios causados por radicais livres n o
citoplasma e n o plasma.
Fontes Dietéticas
O c o n t e ú d o de cobre de alimentos é variável e é afetado p o r
fertilizantes e fungicidas c o n t e n d o cobre aplicados em plantas
comestíveis e pela utilização dc utensílios de cozinha c o n t e n d o
cobre. O metal é o mais a b u n d a n t e e m carnes, tais c o m o o fígado
e o rim, c o m q u a n t i d a d e s relativamente elevadas t a m b é m encon-
tradas e m mariscos, nozes, em grãos de cereais n ã o processados
e em produtos c o n t e n d o cacau. A ingestão m e d i a n a d o cobre nos
Estados U n i d o s está ao redor de 1,0 a 1,6 m g / d i a .
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
A extensão da absorção de cobre pelo intestino delgado varia c o m
o c o n t e ú d o de cobre dietético e está ao redor de 5 0 % e m inges-
tões baixas (inferiores a 1 mg por dia), mas s o m e n t e 2 0 % em
ingestões mais elevadas (>5 mg de cobre p o r dia). A absorção é
reduzida p o r outros c o m p o n e n t e s dietéticos, tais c o m o o zinco
(via metalotioneína), m o l i b d a t o e ferro, e a u m e n t a d a por amino-
ácidos.
O cobre absorvido é t r a n s p o r t a d o até o fígado pelo sangue
p o r t a l ligado à albumina, o n d e esse é i n c o r p o r a d o pelos hepató-
citos e m cuproenzimas e em outras proteínas c, então, e x p o r t a d o
pelo sangue periférico, p r i n c i p a l m e n t e c o m o ceruloplasmina
para os tecidos e os órgãos. E m b o r a dois terços dos 80 a 100 m g
do nível total do cobre n o c o i p o estejam situados no esqueleto
e n o músculo, o fígado é o órgão-chave na homeostase de cobre.
A ceruloplasmina é u m reagente positivo de fase aguda e a u m e n t a
d u r a n t e a infecção e após injúria de tecido. U m a q u a n t i d a d e
m e n o r de cobre n o plasma (<10%) encontra-se ligada à a l b u m i n a .
U m a visão geral d o m e t a b o l i s m o de cobre está ilustrada n a Figura
27-20.
E n t r e 0,5 e 2,0 m g de cobre p o r dia é excretado, via bile, pelas
fezes. O s pacientes com icterícia colestática o u outras f o r m a s de
disfunção d o fígado estão, c o n s e q ü e n t e m e n t e , em risco de
a c ú m u l o de cobre causado p o r falha n a excreção. A presença de
cobre n a urina é n o r m a l m e n t e inferior a 60 p g / d i a .
Funções
O cobre é u m c o m p o n e n t e catalítico de n u m e r o s a s enzimas e é
t a m b é m c o m p o n e n t e estrutural de outras proteínas i m p o r t a n t e s
em h u m a n o s , animais, plantas e microrganismos.
Produção de Energis. A citocromo c oxidase é u m complexo
enzimático com múltiplas s u b u n i d a d e s c o n t e n d o cobre e ferro.
Localizada na face externa da m e m b r a n a mitocondtial, a enzima
catalisa a redução de q u a t r o elétrons do oxigênio molecular,
necessária pata a p r o d u ç ã o de ATP.
Formação do Tecido Conjuntivo. A proteína lisina 6-oxidase (lisil
oxidase) é u m a enzima d e p e n d e n t e de cobre essencial para a
estabilização de matrizes extracelulares, especificamente para a
ligação cruzada entre colágeno e elastina. A enzima está forte-
m e n t e associada ao tecido c o n j u n t i v o e está localizada (1) ria.
aorta, (2) n o tecido c o n j u n t i v o dérmico, (3) e m fibroblastos e (4)
no cítoesqueleto de m u i t a s outras células.
Metabolismo do Ferro. Enzimas c o n t e n d o cobre, e d e n o m i n a -
das (1) ferroxidase I (ceruloplasmina), (2) ferroxidase II e (3)
hefaestina n o enterócito, oxidam a f o r m a ferrosa à férrica. Isto
permite a incorporação de Fe3* n a transferrina e, eventualmente,
na hemoglobina.
Sistema Nervoso Centrai. A dopa m i n a monooxigenase (DM O)
é u m a enzima que requer cobre c o m o co-fator e utiliza o ascor-
bato c o m o u m d o a d o r de elétrons. Esta enzima catalisa a conver-
são de d o p a m i n a a n o r e p i n e f r i n a , u m neurotransmissor impor-
tante. A m o n o a m i n a oxidase é u m a enzima c o n t e n d o cobre que
catalisa a degradação da serotonina n o cérebro.
Síntese de Melanina. A tirosinase é u m a enzima c o n t e n d o cobre,
localizada e m melanócitos e catalisa a síntese de melanina.
Funções Antioxidantes. A m b a s as S O D s , intracelular e extrace-
lular, c o n t ê m cobre e zinco e são capazes de converter radicais
superóxidos em peróxido de hidrogênio, que é subseqüente-
m e n t e removido. A ceruloplasmina t a m b é m se liga a íons de
cobre e, assim, i m p e d e d a n o s oxidativos provocados p o r íons de
cobre livres, que geram radicais hidroxil.
Regulação da Expressão Gênica e da Manipulação de Cobre
Intracelular. A síntese de m e t a l o t i o n e í n a é controlada p o r fatores
de transcrição que r e s p o n d e m ao cobre e é u m a proteína impor-
tante n a regulação da distribuição intracelular d o cobre. Proteí-
nas especializadas adicionais agem c o m o "chaperonas de cobre"
para levar esse metal para espaços intracelulares e para prevenir
danos oxidativos causados por íons de cobre livres.
Erros Inatos do Metabolismo de Cobre. A s í n d r o m e de M e n k e s
é causada por u m gene defeituoso que regula o metabolismo de
cobre n o corpo. A doença de W i l s o n é h e r d a d a c o m o u m traço
autossômico recessivo a p r e s e n t a n d o u m defeito n o metabolismo
do cobre e provoca a c ú m u l o do cobre (1) n o fígado, (2) n o
cérebro, (3) no rim, (4) n a córnea e (5) e m outros tecidos. As
ATPases t r a n s p o r t a d o r a s de cobre do tipo P, conhecidas c o m o
A T P 7 A e ATP7B, são fatores essenciais para a m a n u t e n ç ã o do
balanço de cobre. O t r a n s p o r t e intestinal de cobre é p r e j u d i c a d o
por u m a m u t a ç ã o n o gene de A T P 7 A que leva à deficiência grave
de cobre observada na s í n d r o m e de Menkes. O defeito n o gene
de A T P 7 B afeta a incorporação d o cobre na ceruloplasmina e a
excreção via bile, e esta é a base da doença de Wilson.
 Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 513

( Cobre \
• da dieta 1.2
Figaca
(-9,9 mg)
v
V
\

Plasma,
Cérebro, ceruloplasmina,
músculo, albumina, Sangue
coração, osso, aminoácidos (albumina,
pulmão, etc aminoácidos)
( - 9 0 mg)

i ^
Rim
N
í! ujLC O,1
. jai»-

f Uhna
\ ® 0 ug/tiia )

Figura 2 7 - 2 0 M e t a b o l i s m o d o cobre. ( M o d i f i c a d o d e H a i n s E D . C o p p e r . In: 0 ' D e ] ] BL, S u n d e R A , eds

H a n d b o o k of n u t r i t i o n a l l y essencial m i n e r a l e i e m e n t s . N e w York- Mareei Dekker, 1997:231-73.)

Necessidades e R e c o m e n d a ç õ e s para Ingestão de Nutrientes desenvolver as m u d a n ç a s típicas e m ossos, m e n c i o n a d a s anterior-

A ingestão dietética r e c o m e n d a d a para adultos é 0, 9 mg/dia. f i Ela
está próxima d o limite inferior de 1,0 m g / d i a e n c o n t r a d o em
levantamentos dietéticos, q u e sugeriram q u e a depleção marginal
de cobre poderia ser e n c o n t r a d a n a população dos Estados
U n i d o s . O limite superior tolerável é de 10 mg/dia.
Deficiência
A deficiência de cobre tem sido observada e m numerosas condi-
ções:
Recém-nascidos Malnutrídos, Q u a n d o recém-nascidos malnu-
tridos e c o m histórias de diarréia crônica foram reabilitados com
f ó r m u l a baseada em leite de vaca, eles desenvolveram anemia
resistente ao ferro, n e u t r o p e n i a e outras desordens hematológi-
cas, além de lesões de ossos. A s u p l e m e n t a ç ã o de cobre n o leite
reverteu essas anormalidades.
Recém-nascidos Prematuros. A maior parte d o a c ú m u l o de
cobre n o fígado de fetos ocorre nos últimos três meses de gravi-
dez, e recém-nascidos p r e m a t u r o s com dieta n a qual o cobre não
é suficiente estão em risco para doenças associadas à deficiência,
desde que os estoques de cobre do fígado são inadequados.
A n o r m a l i d a d e s hematológicas e ossos frágeis, facilmente fraturá-
veis, têm sido descritos.
Apoio Nutricional. Adultos e crianças com nutrição intrave-
nosa, sem adição de cobre suficiente, desenvolvem sintomas da
deficiência- As m u d a n ç a s hematológicas que ocorrem n a anemia
h i p o c t ô m i c a e n a n e u t r o p e n i a são revertidas pela suplementação
de cobre. Efeitos similares f o r a m relatados d u r a n t e a alimentação
enter al prolongada após jej u n o s tom ia. Crianças t a m b é m p o d e m
mente.
Síndrome de Menkes. Esta s í n d r o m e ocorre tipicamente e m
recém-nascidos d o sexo masculino com dois a três meses e q u e
apresentam (1) perda n o desenvolvimento, antes normal, (2)
hipotonia, (3) convulsões e (4) falha n o desenvolvimento. M u d a n -
ças físicas n o cabelo (pili torti/cabelo crespo), na aparência facial
e anormalidades neurológicas sugerem o diagnóstico. O s testes
de primeira linha p o d e m e n c o n t r a r concentrações inferiores a 10
H m o l / L de cobre n o plasma, inferiores a 220 m g / L de cerulo-
p l a s m i n a e d e m o n s t r a r pili torti por exames microscópicos.
Síndrome de Má Absorção. O s pacientes de risco incluem
aqueles com (1) doença celíaca, (2) spnt, (3) fibrose cística e (4)
s í n d r o m e do intestino curto. E m alguns casos, a ingestão excessiva
de suplementos orais de zinco causa a deficiência de cobre pela
indução da metalotioneína na mucosa intestinal pelo zinco, que,
então, seqüestra o cobre dietético, b l o q u e a n d o sua absorção.
Doença Cardiovascular. Estudos em animais mostraram que a
deficiência grave de cobre causa d a n o s cardíacos, mas as anorma-
lidades diferem daquelas observadas e m doença cardiovascular
h u m a n a . O s levantamentos epidemiológicos m o s t r a r a m t a m b é m
q u e os valores a u m e n t a d o s de cobre do plasma são u m fator de
risco cardiovascular positivo. U m a u m e n t o na concentração plas-
mática de ceruloplasmina, e p o r t a n t o de cobre, p o d e ser u m a
resposta n ã o inespecífica à inflamação de artérias e n c o n t r a d a n a
arteriosclerose.
Toxicidade
A doença de W i l s o n representa u m a d e s o r d e m genética d o meta-
bolismo de cobre q u e causa u m a u m e n t o de cobre até concen-
514 PARTE IV Analitos
trações tóxicas. A i n c i d ê n c i a d a d o e n ç a de W i l s o n é e s t i m a d a e m
1 / 3 0 . 0 0 0 nascidos vivos. A a p r e s e n t a ç ã o é a l t a m e n t e variável;
assim, adolescentes o u a d u l t o s jovens c o m d o e n ç a d e fígado
inexplicável ou c o m s i n t o m a s n e u r o l ó g i c o s são suspeitos de apre-
s e n t a r essa s í n d r o m e , e m especial aqueles c o m histórico familiar
d a d o e n ç a . A s investigações locais iniciais i n c l u i r i a m o cobre e
c e r u l o p l a s m i n a d o plasma, q u e estarão, g e r a l m e n t e , e m níveis
inferiores (<50 [ig/dL, 8 f i m o l d e cobre p o r L e c e r u l o p l a s m i n a
< 2 0 0 m g / L ) . E m b o t a o c o b r e total d o p l a s m a esteja d i m i n u í d o ,
a fração n ã o ligada à c e r u l o p l a s m i n a está a u m e n t a d a , p e r m i t i n d o
a d e p o s i ç ã o d o cobre n o cérebro, n o s olhos e n o s rins.
O e x a m e o f t a l m o l ó g i c o c o m l â m p a d a de f e n d a p o d e detectar
d e p ó s i t o s de c o b r e n o o l h o (anéis de Kayser-Eleischer), e p o d e
haver a n o r m a l i d a d e s e m testes d e f u n ç ã o hepática, c o m a u m e n t o
n a excreção d e c o b r e u r i n á r i o (>500 p,g p o r L). A biópsia d e
f í g a d o é útil e m casos suspeitos, e os resultados c o m mais d e 2 5 0
p g d e C u / g d e peso seco são u s u a l m e n t e e n c o n t r a d o s ( n o r m a l 8
a 4 0 [ig d e cobre p o r g de p e s o seco). O r a s t r e a m e n t o d o gene e
a detecção d a m u t a ç ã o são possíveis n o m o m e n t o . N a d o e n ç a de
W i l s o n o d i a g n ó s t i c o é f r e q ü e n t e m e n t e difícil n o s casos q u e
envolvem a f a l h a a g u d a d o fígado. U m a u m e n t o e x t r e m o de cobre
n o p l a s m a será e n c o n t r a d o ; e n t r e t a n t o , esse n ã o é a c o m p a n h a d o
d e a u m e n t o compatível n o s níveis d e c e r u l o p l a s m i n a .
A f o r m a c r ô n i c a d a d o e n ç a de W i l s o n é t r a t a d a p o r agentes
q u e l a n t e s de a d m i n i s t r a ç ã o oral, tais c o m o p e n i c i l a m i n a e trien-
tina, q u e r e m o v e m o excesso d e c o b r e d o tecido e a u m e n t a m sua
excreção pela u r i n a .
A toxicidade t a m b é m p o d e acontecer d i r e t a m e n t e pela con-
t a m i n a ç ã o c o m cobre d e f o n t e s d a dieta e d e água.
Avaliação Laboratorial do Estado
O s ensaios d e c o b r e e c e r u l o p l a s m i n a plasmáticos são convenien-
tes e utilizados e x t e n s a m e n t e para c o n f i r m a r a deficiência grave
de cobre. E n t r e t a n t o , n ã o são i n d i c a d o r e s sensíveis n a d e p l e ç ã o
m a r g i n a l d e cobre.
E m virtude de aproximadamente 9 0 % d o cobre d o plasma
estar associado à c e r u l o p l a s m i n a , fatores q u e a u m e n t a m a síntese
hepática de ceruloplasmina, c o m o u m A P R o u contraceptivos
orais, a u m e n t a m o c o b r e d o p l a s m a i n d e p e n d e n t e m e n t e d a inges-
tão de c o b i e n a dieta. E m recém-nascidos p r e m a t u r o s c o m ima-
t u r i d a d e d o fígado e c o m baixa síntese d e c e r u l o p l a s m i n a , os
valores de c o b r e no p l a s m a inferiores a 3 0 | l g / L (<5 j i m o l de C u
p o r L) s u g e r e m a n e c e s s i d a d e d e a u m e n t o d a ingestão d e cobre.
A relação entre as dosagens imunológica e enzimática de ceru-
loplasmina p o d e set u m índice útil d a depleção marginal de cobre.
A apoceruloplasmina n o soro a u m e n t a d u r a n t e a depleção de cobre
e irá contribuir para o ensaio de ceruloplasmina total, mas a ativi-
d a d e enzimática d i m i n u i m e s m o n a depleção marginal d o cobre.
Intervalos de Referência
Para adultos, o cobre p l a s m á t i c o está g e r a l m e n t e n o i n t e r v a l o d e
7 0 a 140 [ i g / d L (10 a 22 ( i m o l / L ) . Valores para m u l h e r e s n a
i d a d e fértil e, e m especial, n a gravidez são mais elevados. A saída
de cobre n a u r i n a é n o r m a l m e n t e m e n o r q u e 6 0 H g / 2 4 h (< 1,0
j i m o l / 2 4 h), e valores s u p e r i o r e s a 200 Jig/24 h (3 [ i m o l / L ) são
e n c o n t r a d o s n a d o e n ç a de W i l s o n .
Flúor
O f l ú o r é o e l e m e n t o - t r a ç o m a i s e x t e n s a m e n t e utilizado dos cie-
men tos-traço farmacologicamente benéficos graças à p r o p r i e d a d e de
prevenir cárie d e n t a l .
Fontes Dietéticas
M u i t o s e s t u d o s n o s ú l t i m o s 5 0 anos estabeleceram q u e a adição
d e f l ú o r à água potável reduz a incidência d a cárie d e n t a l , e, n o s
dias d e hoje, mais de 6 0 % d a p o p u l a ç ã o dos Estados U n i d o s
utiliza água f l u o r e t a d a . E m adição, diversas c o m p a n h i a s acrescen-
t a m f l u o r e t o à água e n g a r r a f a d a ( h t t p : / / w w w . b o t t l e d w a t e r . o r g /
public/ fluorida.htm).
Função
O íon f l u o r e t o é t r o c a d o p e l o radical hidroxil n a e s t r u t u r a cris-
talina d a apatita, o c o m p o n e n t e p r i n c i p a l de ossos e d e n t e s . Isto
estabiliza a superfície d o d e n t e e m regeneração. I n i c i a l m e n t e , o
b e n e f í c i o era c o n s i d e r a d o u n i c a m e n t e p a r a os d e n t e s de crianças
e m e r u p ç ã o , mas os efeitos tópicos e m d e n t e s d e a d u l t o p a r a
prevenir a cárie t a m b é m são r e c o n h e c i d o s .
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
O s í o n s d e f l ú o r são e f i c i e n t e m e n t e a b s o r v i d o s n o e s t ô m a g o e
n o i n t e s t i n o d e l g a d o . Pelo m e n o s 9 5 % d o s 2,6 g d o fluoreto total
d o c o r p o estão localizados n o s ossos e d e n t e s . Q u a s e 9 0 % d o
excesso d e f l ú o r são excretados n a u r i n a .
Toxicidade
A f l u o r o s e d e n t a l é a causa de m a n c h a s n o esmalte de dences e m
e r u p ç ã o , e estima-se q u e afeta, a t u a l m e n t e , cerca d e 2 0 % d a
população.
A exposição o c u p a c i o n a l à p o e i r a c o n t e n d o f l ú o r inalada p o r
t r a b a l h a d o r e s q u e m a n i p u l a m a criolita d u r a n t e o r e f i n o d e
a l u m í n i o resultava e m a n o r m a l i d a d e s ósseas graves, m a s atual-
m e n t e o e q u i p a m e n t o d e s e g u r a n ç a limita tal exposição.
Avaliação Laboratorial do Estado
A d e t e r m i n a ç ã o d o f l ú o r n a u r i n a é utilizada para avaliar a expo-
sição às diferentes fontes de flúor. Para a água potável e a u r i n a , a
d e t e r m i n a ç ã o direta emprega u m eletrodo específico para flúor.
Intervalos de Referência
As c o n c e n t r a ç õ e s d o f l u o r e t o e m f l u i d o s c o r p o r a i s e n o s tecidos
v a r i a m e x t e n s a m e n t e d e p e n d e n d o d o c o n t e ú d o d o flúor n a água
potável e d a ingestão pela dieta, pasta de d e n t e e e n x a g u a t ó r i o s
bucais. Para a u r i n a , o intervalo estabelecido é de 0,2 a 3,2 m g /
L (10,5 a 168 n m o l / L ) .
Manganês
O m a n g a n ê s presente e m sistemas biológicos está ligado a proteínas
e apresenta valências de 2* ou 3 + . Está associado p r i n c i p a l m e n t e à
f o r m a ç ã o d o tecido c o n j u n t i v o e ósseo, com f u n ç õ e s n o cresci-
m e n t o e r e p r o d u ç ã o e n o m e t a b o l i s m o de carboidrato e lipídios.
Química
O m a n g a n ê s ( n ú m e r o a t ô m i c o 25, massa a t ô m i c a relativa 5 4 , 9 4 )
é o p r i m e i r o m e t a l da série de transição ( 3 d V ) . D e n t r e os 11
estados d e oxidação disponíveis para o m a n g a n ê s , a p e n a s o M n 2 +
e Mn 3 * são e n c o n t r a d o s e m sistemas biológicos, a m a i o r p a r t e
ligada a proteínas.
Fontes Dietéticas
As f o n t e s ricas e m m a n g a n ê s i n c l u e m (1) grãos n ã o - b e n e f i c i a d o s ,
(2) nozes, (3) vegetais folhosos, (4) p r o d u t o s d a soja e (5) chás. A
ingestão m é d i a n o s Estados U n i d o s é a p r o x i m a d a m e n t e 2 m g /
dia. As dietas vegetarianas q u e c o n t ê m q u a n t i d a d e s elevadas d e
grãos e d e nozes f o r n e c e m mais de 10 m g / d i a .
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
O m a n g a n ê s dietético é a b s o r v i d o pelo i n t e s t i n o delgado p o r
m e c a n i s m o s q u e p o d e m ter u m a via c o m u m àquela d o ferro. A

absorção do manganês a u m e n t a e m baixas ingestões dietéticas e
d i m i n u i e m ingestões elevadas, e estudos de rastreamento sugerem
eficiência n a absorção entre 2 % e 15%. U m a vez absorvido, o
m a n g a n ê s ligado à albumina é t r a n s p o r t a d o pelo sangue portal
ao fígado e exportado, então, para outro tecido, ligado à trans-
ferrina e, possivelmente, a ci2-macroglobulina. A excreção de
manganês ocorre p r i n c i p a l m e n t e pelas fezes, via bile, s e n d o que
a excreção pela u r i n a é m u i t o baixa.
Funções
O m a n g a n ê s é um constituinte de muitas metaloenzimas impor-
tantes e t a m b é m age como u m ativador inespecífico de algumas
enzimas. O s íons Mn 2 + substituem os íons Mg 2 ' d u r a n t e a ativação
dessas enzimas.
Superóxido Dismutase. A S O D d e p e n d e n t e de m a n g a n ê s é
u m a enzima mitocondrial e constitui u m fator i m p o r t a n t e na
limitação da toxicidade do oxigênio. A enzima catalisa a quebra
do radical 02 a H2O2, que é, então, removido pela catalase e pela
glutationa peroxidase.
Piruvato Carboxiiase. Esta enzima atua em c o n j u n t o com a
fosfoenol piruvato (PEP) carboxiquinase, u m a enzima ativada por
íons manganês. Estas enzimas são necessárias para a formação do
PEP a partir de piruvato, u m a reação-chave na síntese hepática
da glicose.
Arginase. A arginase é a enzima terminal do ciclo da uréia,
hidrolisando a L-arginina, a uréia e ornitina. A atividade da
arginase afeta a p r o d u ç ã o do óxido nítrico, por limitar a dispo-
nibilidade da L-argmina.
GliCOSil Transferases. Estas enzimas são responsáveis pela
adição seqüencial de moléculas de carboidratos nas proteínas
para f o r m a r as proteoglicanas e, em última análise, o tecido
conjuntivo e a cartilagem. São, c o n s e q ü e n t e m e n t e , i m p o r t a n t e s
para a integridade estrutural d o osso e da pele e para a cicatriza-
ção n o r m a l .
Necessidades e RecomendaçõGs para Ingestão de Nutrientes
Em virtude da falta da i n f o r m a ç ã o de d e m a n d a s dietéticas de
manganês, o Food a n d N u t r i t i o n Board estabeleceu c o m o ade-
q u a d a a ingestão para adultos do sexo masculino de 2,3 m g / d i a
e para os d o sexo f e m i n i n o de 1,8 m g / d i a . Há u m a preocupação
relativa à toxicidade potencial do manganês para recém-nascidos,
pois estes apresentam fígado i m a t u r o e reduzida excreção biliar
do excesso de manganês.
Deficiência
A deficiência visível do manganês não foi d o c u m e n t a d a em seres
h u m a n o s com dietas naturais. E n t r e t a n t o , em estudos com
animais, sinais de deficiência e x p e r i m e n t a l m e n t e induzida do
manganês incluem (1) crescimento e f u n ç ã o r e p r o d u t o r a preju-
dicados, (2) anormalidades n o esqueleto, (3) tolerância à glicose
d i m i n u í d a e (4) d a n o s à síntese de colesterol. H o m e n s jovens
alimentados e x p e r i m e n t a l m e n t e c o m dietas de baixas concentra-
ções de manganês desenvolveram lesões de pele e baixos níveis
de colesterol n o plasma.
A deficiência de prolidase em recém-nascidos é u m a desor-
dem genética rara, que s a b i d a m e n t e é associada a anormalidades
na bioquímica d o manganês.
Toxicidade
O risco ocupacional à saúde de trabalhadores sujeitos à exposição
prolongada à poeira ou às emanações c o n t e n d o manganês é b e m
reconhecido (Capítulo 32). Sintomas neurológicos que se asse-
m e l h a m à doença de Parkinson desenvolvem-se l e n t a m e n t e em
meses ou anos.
Vitaminas e Elementas-Traço CAPÍTULO 2 7 515
Pacientes c o m doença grave de fígado p o d e m apresentar
sinais neurológicos e c o m p o r t a m e n t a i s , decorrentes da neuroto-
xicidade do manganês, induzidos p o r falha n a excreção de man-
ganês n a bile. Deposição de m a n g a n ê s n o globus fpaüidws d u r a n t e
falha hepática resulta na hiperintensidade de sinal de ressonância
magnética em T l .
O s pacientes que recebem o manganês intravenosamente
d u r a n t e T P N t a m b é m m o s t r a r a m evidências de retenção e depo-
sição de m a n g a n ê s n o cérebro m é d i o e n o t r o n c o cerebral. O s
sintomas típicos são tremor semelhante ao observado no mal de
Parkinson e anormalidades n a marcha.
Recomenda-se agora que s o m e n t e 1 (ig de m a n g a n ê s p o r
quilograma (18 n m o l / k g ) seja a d m i n i s t r a d o d u r a n t e T P N em
recém-nascidos e q u a n t i d a d e s inferiores a 1 a 2 flg/dia (55 a 110
^ m ó i / d i a ) em adultos. Todos os pacientes que requerem a nutri-
ção intravenosa prolongada (IVN), especialmente aqueles porta-
dores de colestase, devem ser m o n i t o r a d o s q u a n t o à retenção de
manganês.
Avaliação Laboratorial do Estado
C â n u l a s de plásticos devem ser utilizadas para a flebotomia, e a
hemólise deve ser impedida d u r a n t e a separação da amostra. O
sangue total tem a p r o x i m a d a m e n t e dez vezes mais manganês que
o plasma ou o soro e n ã o é afetado pela c o n t a m i n a ç ã o por
agulhas de aço utilizadas n a coleta da amostra. N a prática, isto
faz com que a m e d i d a de m a n g a n ê s d o sangue total seja o m é t o d o
mais extensamente utilizado para m o n i t o r a r o estado d o manga-
nês e m laboratórios clínicos.
Intervalos de Referência
O intervalo de referência para o manganês n o soro é de 0,5 a 1,3
jag/L (9 a 24 nmol/L). O intervalo da referência p a T a o sangue total
é de 5 a 15 [ig/L (90 a 270 n m o l / L ) . Incrementos n o manganês
sérico superiores a 5,4 M-g/L ( > 3 0 n m o l / L ) ou, sanguíneo, superio-
res a 20 |ig/L (> 360 n m o l / L ) indicam retenção de manganês.
Molíbdênio
A necessidade essencial do m o l i b d ê n i o para animais e seres
h u m a n o s é baseada e m sua incorporação às metaloenzimas.
Química
M o l i b d ê n i o ( n ú m e r o atômico 42, massa atômica relativa 95,94)
é u m metal da segunda série de transição. O elemento apresenta
diversos estados de oxidação, p o r é m o mais estável em sistemas
biológicos é M o f i \ c o m o e n c o n t r a d o n o m o l i b d a t o (M0O4 2 ').
Existe u m a sobreposição entre a química do molibdênio, tungs-
ténio e vanádio. As enzimas d e p e n d e n t e s de m o l i b d ê n i o são
ecologicamente vitais, facilitando os i m p o r t a n t e s ciclos do
carbono, nitrogênio e enxofre.
Fontes Dietéticas
Boas fontes d o m o l i b d ê n i o são (1) legumes, tais c o m o ervilhas,
lentilhas e feijões, (2) grãos e (3) nozes. N o s Estados U n i d o s , a
ingestão dietética média de adultos é 76 a 109 jlg M o p o r dia.
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
O m o l i b d ê n i o é absorvido eficientemente e m formas dietéticas
b e m variadas, principalmente c o m o molibdato, e m b o r a a inibi-
ção competitiva da absorção pelo sulfato reduza a absorção intes-
tinal. Entre 8 0 % e 9 0 % do m o l i b d ê n i o n o sangue total encontra-
se ligado às proteínas das células vermelhas. O transporte de
q u a n t i d a d e s inferiores pelo plasma p o d e envolver a a 2 -macroglo-
bulina. A excreção urinária reflete d i r e t a m e n t e a ingestão dieté-
tica do molibdênio.
516 PARTE IV Analitos
Funções
Diversas enzimas importantes de mamíferos, tais c o m o (1) sulfito
oxidase, (2) x a n t i n a desidrogenase e (3) aldeído oxidase, reque-
rem m o l i b d ê n i o c o m o co-factoi. Este c o m p o n e n t e orgânico é u m
complexo de molibdopterina. A sulfito oxidase catalisa a última
etapa da degradação de aminoácidos que contêm enxofre, oxi-
d a n d o o sulfito a sulfato e transferindo elétrons pata o citocromo
c. A xantina desidrogenase e a aldeído oxidase hidroxilam nume-
rosas substâncias heterocíclicas, tais como p u r i n a s e pteridinas.
Necessidades e Recomendações para Ingestão de Nutrientes
A R D A de M o para adultos foi estabelecida e m 4 5 jig p o r dia,
que está abaixo da ingestão dietética média estimada.
Deficiência
A deficiência d o molibdênio n ã o foi observada e m populações
saudáveis c o n s u m i d o r a s de dieta normal. H á um ú n i c o relaro de
paciente q u e recebeu nutrição intravenosa prolongada e que
desenvolveu intolerância clínica a aminoácidos intravenosos,
especialmente à L-metionina. 1 3 Nesse caso, anormalidades bioquí-
micas incluíram concentrações plasmáticas elevadas de metio-
nina e baixas de ácido úrico. H o u v e u m a u m e n t o de sulfito
urinário, associado à baixa excreção do ácido úrico e de metabó-
litos de xantina, sugerindo defeitos n a sulfito oxidase e na xanrina
oxidase. O t r a t a m e n t o com molibdato de a m ó n i a (300 p.g/dia)
aliviou as a n o r m a l i d a d e s clínicas e bioquímicas.
H á também as doenças muito raras de herança recessiva que
resultam de defeitos n a biossíntese do co-fator molibdênio; a maioria
dos casos resulta em mortes prematuras ainda na infância.
Toxícidade
O s compostos do molibdênio apresentam baixa toxicidade para
seres h u m a n o s . A ingestão de m o l i b d ê n i o e m excesso induz a
deficiência d e cobre em r u m i n a n t e s , ao obstruir a absorção de
cobre pela f o i m a ç ã o de u m complexo insolúvel de t i o m o l i b d a t o
de cobre. Esse d a d o levou à sugestão da utilização de molibdato
de a m ó n i o n o t r a t a m e n t o da doença de W i l s o n .
Avaliação Laboratorial do Estado
As concentrações de molibdênio n o sangue total, soro c u plasma
são muito baixas para serem detectadas deficiências. Entretanto,
ProtEÍnas específicas para |Se]Cys
Selenato Selenita
(Se6') (Sen
Vias metabólicas do selênio
(Adaptado de Suride.) A via 1
usa a mserção traducional de
selenocisteína, mediada pelo
tRNA 5 ", enquanto a via 2
incorpora seíenocisteína
usando tRNACT1.
Selenoproteínas específicas para Se
Figura 27-21
a excreção urinária responde a a u m e n t o s ou d i m i n u i ç õ e s da
ingestão. Medidas de urato ou sulfito na urina são os meios mais
disponíveis de c o n f i r m a r desordens associadas a esse co-factor ou
a uma possível deficiência.
Intervalos de Referência
H á a p r o x i m a d a m e n t e 0,5 p.g de M o por L (5 n m o l / L ) n o plasma
ou n o soro e a p r o x i m a d a m e n t e 1 jig de M o por L (10 n m o l / L )
n o sangue total. O s valores de m o l i b d ê n i o n a urina, determina-
dos p o r ICP-MS, são de aproximadamente 40 a 60 n g / L .
Selênio
O selênio (Se) é u m e l e m e n t o essencial para os h u m a n o s , s e n d o
u m constituinte da enzima glutationa peroxidase. Acredita-se q u e
esteja relacionado i n t i m a m e n t e à vitamina E, d o p o n t o de vista
funcional.
Química
O selênio (número a t ô m i c o 34, massa atômica relativa 78,96) é
u m não-metal c o n t e n d o diversas valências e formas químicas. O
selênio está situado n o grupo VI da tabela periódica e, conse-
q ü e n t e m e n t e , é u m elemento inorgânico com química relacio-
n a d a ao enxofre. N o s compostos biológicos ativos mais impor-
tantes c o n t e n d o selênio esse elemento encontra-se em forma de
selenocisteína, o n d e o elemento enxofre da cisteína é substituído
por selênio. C o n s i d e r a d o o vigésimo primeiro aminoácido, a
selenocisteína é i n c o r p o r a d a à cadeia nascente de proteínas
q u a n d o o códon específico U G A está presente n o mensageiro.
Inicialmente, esse c ó d o n era reconhecido, u n i c a m e n te , c o m o u m
c ó d o n de terminação (Capítulo 18).
C o m p o s t o s de selênio ingeridos (1) selenato, (2) selenita, (3)
selenocisteína e (4) s e i e n o m e t i o n i n a são metabolizados ampla-
mente, via seleneto, q u e p o d e estar associado a u m a chaperona.
O seleneto é convertido, então, em selenofosfato, u m precursor
i m p o r t a n t e na síntese de proteínas c o n t e n d o selenocisteína
(Figura 27-21).
Fontes Dietéticas
O selênio entra na cadeia alimentar principalmente como seie-
n o m e t i o n i n a , c o m p o n e n t e de plantas que fazem a captura d o
elemento a partir d o solo, mas a p a r e n t e m e n t e n ã o o utilizam. O
©Tl
[Se]Cys
Proteínas
[Se]Mec -i
específicas para
[SejMet
Proteínas
Selenida
de [igação
(Se3*)
1
ao selênio
Selenofosfato
Serina
[SelCys-tRNA
Vias metabólicas do selênio.

nível de selênio n o solo é altamente variável e é geralmente baixo
e m solos vulcânicos, o n d e os sais solúveis são lixiviados do solo
pela água. Nos Estados U n i d o s e n o C a n a d á , o trigo e outros
cereais são boas fontes de selênio; as ingestões médias n a América
d o N o r t e variam de 80 a 220 jig por dia, e n q u a n t o n o R e i n o
U n i d o essas são de a p r o x i m a d a m e n t e 30 a 60 p g / d i a . Ingestões
na C h i n a são tão baixas q u a n t o 11 p g / d i a e na Nova Zelândia,
28 pg/dia. 1 1
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
A absorção intestinal das diversas formas dietéticas c o n t e n d o
selênio é eficiente, mas não é regulada. O s sais inorgânicos sele-
n i t o e selenato utilizados como s u p l e m e n t o s dietéticos e na for-
tificação alimentar são absorvidos quase c o m p l e t a m e n t e , mas a
maior parte d o íon selenato é r a p i d a m e n t e excretada n a urina.
O selênio c o n t i d o em sais inorgânicos é mais r a p i d a m e n t e incor-
porado à glutationa peroxidase e a outras selenoproteínas do que
o selênio das fontes orgânicas, que c o n t ê m a selenometi o n i n a .
E n t r e t a n t o , leveduras enriquecidas com formas orgânicas de
sclcnio são consideradas m e n o s tóxicas e utilizadas mais extensa-
m e n t e c o m o s u p l e m e n t o dietético.
A p r o x i m a d a m e n t e 5 0 % a 6 0 % do selênio total do plasma
escão presentes c o m o a selenoproteína P, u m a proteína a l t a m e n t e
básica c o n t e n d o múltiplos resíduos de histidina e aproximada-
m e n t e 10 átomos d o selênio p o r molécula. Cerca de 3 0 % d o
selênio do plasma está presente c o m o glutationa peroxidase
(GSHPx-3),) e o restante é i n c o r p o r a d o à albumina, em f o r m a de
s e l e n o m e t ionina. A excreção urinária do selênio é a rota princi-
pal de saída e reflete a ingestão dietética recente.
Funções
Trinta o u mais proteínas biologicamente ativas c o n t e n d o seleno-
cisteína f o r a m identificadas até o m o m e n t o . Algumas das mais
i m p o r t a n t e s estão listadas a seguir.
Glutationa Peroxidase. Esta enzima possui quatro isoformas,
GSHPx-1 e m células vermelhas, GSHPx-2 na mucosa gastrointes-
tinal, GSHPx-3 n o plasma e GSHPx-4 localizada e m m e m b r a n a s .
Estas enzimas utilizam a força redutora da glutationa para remover
u m á t o m o de oxigênio d o peróxido de h i d r o g ê n i o e de hidrope-
róxidos de lipídios.
lodotironina Deiodinase. As isoformas dos tipos 1, II e III são
responsáveis pela conversão do h o r m ô n i o precursor T j na f o r m a
ativa T 3 . A enzima d o tipo I, a tiroxina-5-deiodinase, está locali-
zada n o fígado, n o rim e n o m ú s c u l o e é responsável p o r mais
de 9 0 % da p r o d u ç ã o de T 3 do plasma.
Tioredoxina Redutases. As três isoformas catalisam a r e d u ç ã o
d e p e n d e n t e de N A D P H da tiorredoxina e são i m p o r t a n t e s para
a m a n u t e n ç ã o do estado redox intracelular.
Selenoproteína P. Esta proteína é a principal enzima que
c o n t é m selênio d o plasma, p o d e ser u m a proteína t r a n s p o r t a d o r a
desse e l e m e n t o e t e m f u n ç ã o antioxidante.
Necessidades e Recomendações para Ingestão de Nutrientes
A R D A para o selênio está estabelecida em 55 (ig/dia para
adultos. E m diversos países da Europa, a ingestão é, atualmente,
próxima o u quase inferior a 5 5 jlg/dia e a provisão de selênio
p o d e n ã o estar s e n d o a ideal. 11
Deficiência
Existem doenças importantes de animais da pecuária causadas
pela deficiência de selênio, tais c o m o a doença do m ú s c u l o
branco e m carneiros e gado e miopatia de músculos cardíaco e
esquelético e m cordeiros e bezerros. E m h u m a n o s f o r a m identi-
ficadas diversas faixas de deficiência.
Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 517
Deficiência Grave
D o e n ç a de K e s h a n . A evidência conclusiva para o papel d o
selênio na nutrição h u m a n a veio com a publicação de resultados
de experimentações realizadas e m grande escala na C h i n a , q u e
m o s t r a r a m o efeito p r o t e t o r da s u p l e m e n t a ç ã o de selênio e m
crianças e em adultos jovens s o f r e n d o de u m a cardiomiopatia
endêmica. 1 3 Esse q u a d r o foi observado em áreas d o país (região
de Keshan) o n d e o solo apresenta baixas concentrações de
selênio.
D o e n ç a de Kashin-Beck. Este tipo de artrite grave é descrito
em partes da C h i n a e em áreas vizinhas da Rússia, o n d e as con-
centrações de selênio d o solo são p a r t i c u l a r m e n t e baixas.
N u t r i ç ã o Artificial. A provisão i n a d e q u a d a de selênio em
dietas especializadas utilizadas em t r a t a m e n t o de erros inatos e
d u r a n t e a nutrição parenteral em longo prazo conduziu a casos
da deficiência. Os sintomas da deficiência grave incluem a fra-
queza muscular. Casos envolvendo cardiomiopatia, que geral-
m e n t e são fatais e se assemelham à doença de Keshan, além de
macrocistose e o pseudo-albinismo em crianças, f o r a m descritos.
Deficiências Marginais
F u n ç ã o d a T i r ó i d e . O selênio e outros elementos-traço são
necessários para a f u n ç ã o n o r m a l da tiróide, u m a vez que as
importantes enzimas deiodinases são selenoproteínas. As doenças
endêmicas da tiróide n o Zaire p o d e m estar relacionadas à com-
binação da depleção de iodo e selênio. C u i d a d o s devem ser
t o m a d o s p o r q u e o estímulo do m e t a b o l i s m o dos h o r m ô n i o s
tireoidianos p o d e induzir o hipotireoidismo.
F u n ç ã o I m u n e . A deficiência de selênio é a c o m p a n h a d a pela
perda de i m u n o c o m p e t ê n c i a e esta é relacionada à redução de
selenoproteínas n o fígado, n o baço, e nos l i n f o n o d o s . A resposta
i m u n e celular e a f u n ç ã o das células B são prejudicadas.
D e s o r d e n s R e p r o d u t i v a s . Fonte a d e q u a d a de selênio é neces-
sária para a r e p r o d u ç ã o bem-sucedida e m u m a variedade de
animais da pecuária. A fertilidade h u m a n a masculina pode ser
afetada pela depleção de selênio, desde q u e esse é necessário para
a síntese da testosterona e para a m a n u t e n ç ã o da viabilidade do
esperma.
D e s o r d e n s d o H u m o r . A depleção marginal d o selênio tem
sido associada à ansiedade, à c o n f u s ã o m e n t a l e à hostilidade, e
melhoras têm sido observadas c o m a s u p l e m e n t a ç ã o .
Estados Inflamatórios. Muitos estados inflamatórios e a eleva-
ção do nível de estresse oxidativo p o d e m ser influenciados pelo
estado nutricional do selênio. Efeitos positivos do suplemento foram
relatados em artrites, pancreatites e nos cuidados intensivos.
V i r u l ê n c i a V i r a i . U m a estirpe virulenta rara do vírus de
Coxsackie é provavelmente parte da causa de cardiomiopatia e m
regiões da C h i n a desprovidas de selênio. Isto é compatível com
as variações sazonais da incidência da doença. E m estudos labo-
ratoriais, u m a forma n ã o letal do vírus Coxsacitie B (CVB 3 / 0 )
sofreu m u t a ç ã o p a t a u m a cepa virulenta q u a n d o inoculada em
c a m u n d o n g o s deficientes em selênio, provavelmente c o m o u m
resultado do estresse oxidativo. Estudos adicionais em animais
d e m o n s t r a r a m q u e u m a cepa do vírus influenza, a p r e s e n t a n d o
virulência m e d i a n a , exibe virulência a u m e n t a d a q u a n d o inocu-
lada em c a m u n d o n g o s deficientes em selênio. A relevância destes
estudos para os seres h u m a n o s ainda precisa ser avaliada.
Q u i m i o p r e v e n ç ã o d o C â n c e r . Inquéritos epidemiológicos
e n c o n t r a r a m u m a ligação entre a incidência de câncer e o con-
t e ú d o de selênio n o solo, sugerindo u m a incidência mais elevada
de d e t e r m i n a d o s cânceres e m indivíduos com baixa ingestão de
selênio. Experimentos em grande escala e m populações chinesas
com risco elevado para desenvolver hepatite virai B e câncer
hepático d e m o n s t r a r a m que o sal de cozinha e n r i q u e c i d o com
selênio levou a u m a r e d u ç ã o de 3 5 % n a incidência de câncer n o
518 PARTE IV Analitos
fígado. Parece provável que a suplementação de selênio acima da
necessidade dietética mínima previna câncer, em particular, o
câncer prostático.
Toxicidade
Algumas áreas da C h i n a e dos Estados Unidos contêm quantida-
des elevadas de selênio n o solo, por isso os alimentos produzidos
localmente apresentam excesso de selênio. O d o r de alho ria res-
piração, peida de cabelo e u n h a s danificadas são sinais clínicos
de selenose. O limite superior tolerável foi estabelecido em 400
|!g/dia para adultos, sendo m e n o r para crianças.
Avaliação Laboratorial do Estado
A espectrometria de absorção atômica em forno de grafite
(CFAAS) é, n o m o m e n t o , o procedimento mais extensamente
utilizado para dosar o selênio plasmático e / o u o do soro. Os
componentes principais de selênio d o plasma são GSHPx-3 extra-
celular e selenoproteína P.
GSHPx-1 das células vermelhas e GSHPx-3 plasmática são
dosadas por métodos enzimáticos com o peróxido de butilo ter-
ciário como substrato usual, já que esse não é tão afetado pela
catalase q u a n t o o peróxido de hidrogênio.
Após u m ano em T P N e sem suplementos de selênio, pacien-
tes apresentam baixos níveis plasmáticos de selênio e de G S H P x
em células vermelhas. C o m reposição de selênio na forma de
ácido selenoso, há u m a u m e n t o rápido de GSHPx-3 nas primei-
ras 24 horas, alcançando concentrações normais dentro de u m a
a duas semanas. G S H P x de células vermelhas leva de três a quatro
meses para ser regenerada, o que é compatível com o necessário
para a formação dessas células na presença do selênio.
A principal proteína d o plasma contendo selênio, selenopro-
teína P, é determinada por métodos imunológicos. A concentra-
ção de selenoproteína P n o plasma responde rapidamente à suple-
mentação.
As concentrações plasmáticas de selenoproteína P, de GSHPx-
3 plasmática e de selênio total são diminuídas pela APR em lesões
ou em infecções. Este efeito deve ser considerado ao interpretar
valores d o selênio do plasma em pacientes em pós-operatórios ou
naqueles com infecção ou doença inflamatória.
A excreção d o selênio pela urina é, principalmente, u m
reflexo da ingestão dietética recente e não é empregada extensi-
vamente em exames de populações. A análise do selênio d o
cabelo e das unhas tem sido utilizada como medida da ingestão
dietética de selênio a longo prazo.
Na prática, as medidas plasmáticas de selênio ou G S H P x
fornecem u m a boa estimativa do estado e em particular da ade-
quação da ingestão rcccntc, desde que essas medidas sejam inter-
pretadas relativamente ao conhecimento sobre mudanças de
APR, com a G S H P x de células vermelhas fornecendo o índice de
ingestão a longo prazo.
Intervalos de Referência
O intervalo da referência para o selênio n o sangue total, plasma
ou soro, cabelo e u n h a deve ser estabelecido localmente, desde
que esses índices são afetados pela ingestão dietética d o selênio.
A orientação de valores de intervalo de referência de selênio para
o plasma de adulto é de 63 a 160 p g / L (0,8 a 2,0 |amol/L).
Valores de Se inferiores a 40 pg por L (0,5 p,mol/L) indicam
provável depleção de selênio.
A atividade de GSHPx-1 de células vermelhas para adultos
varia de 13 a 25 U / g Hb, sendo que os valores para crianças são
ligeiramente inferiores. Os intervalos de referência locais relacio-
nados à idade são, mais u m a vez, necessários.
Zinco
A descoberta de u m a variedade de desordens clínicas relaciona-
das ao zinco demonstrou diretamente a importância desse ele-
m e n t o na nutrição h u m a n a . Trata-se d o segundo elemento-traço
mais a b u n d a n t e n o corpo, sendo superado apenas pelo ferro.
Química
O zinco (número atômico 30, massa atômica relativa 65,39) é um
íon particularmente estável O zinco apresenta u m a rápida ciné-
tica de troca dos Iigantes e geometria de coordenação flexível e
constitui u m bom aceptor de elétrons (ácido de Lewis forte), sem
reações redox. Há u m a hipótese de que 10*11 m o I / L de íons de
zinco estão presentes n o citoplasma e que, em equilíbrio com
metaloenzimas de zinco e numerosos fatores de transcrição, eles
atuam como u m "hormônio mestre", particularmente, na divisão
e crescimento celulares.
Fontes Dietéticas
O zinco é amplamente distribuído nos alimentos, principalmente
ligado às proteínas. A biodisponibilidade de zinco dietético é
d e p e n d e n t e da digestão destas proteínas para liberarem o zinco,
p e r m itin d o que esse elemento se ligue a peptídeos, aminoácidos,
fosfato e outros Iigantes dentro do trato intestinal. As fontes
dietéticas mais disponíveis c o n t e n d o zinco são carne vermelha e
peixe. O germe de trigo e o farelo integral são boas fontes, mas
o conteúdo de zinco é reduzido pela moagem e processamento
desses alimentos. 10 A ingestão mediana para h o m e n s nos Estados
U n i d o s é de aproximadamente 14 m g / d i a e para mulheres 9
mg/dia.
Absorção, Transporte, Metabolismo e Excreção
A regulação da absorção intestinal liquida de zinco é controlada
pela eficiência na absorção e varia geralmente de 2 0 % a 5 0 % do
conteúdo dietético. Para ingestão de 12,2 mg de Zn por dia, a
absorção fracional é 26%, mas para ingestões baixas, como 0,23
mg de Zn por dia, foi demonstrado u m a u m e n t o para 100%. A
interação com outros constituintes dietéticos, tais como fitato,
fibra, cálcio e ferro, reduz a absorção líquida de zinco.
Ferro em dosagens suplementares (até 65 mg/dia) pode dimi-
n u i r a absorção de zinco, de m o d o que mulheres grávidas e lac-
tantes em tratamento de reposição de ferro p o d e m requerer
suplementação de"zinco.
O zinco absorvido é transportado para o fígado o n d e ocorre
a incorporação ativa em metaloenzimas e em proteínas d o plasma.
Aproximadamente 8 0 % do zinco plasmático estão associados à
albumina, e o restante, em maior parte, está ligado fortemente a
u m a proteína de alto peso molecular, a aj-macroglobulina. O
zinco associado à albumina está em equilíbrio com os aminoáci-
dos do plasma (principalmente histidma e cisteina), e esta
pequena fração ultrafiltrável (<1 %) pode ser importante para os
mecanismos celulares da absorção (Figura 27-22).
O conteúdo corporal total de zinco em adulto é de aproxi-
m a d a m e n t e 2 a 2,5 g, e o metal está presente em células de todos
os tecidos e órgãos metabolicamente ativos. Aproximadamente
5 5 % d o total são encontrados em músculos e aproximadamente
3 0 % em ossos. A concentração de zinco das células vermelhas é
aproximadamente dez vezes superior à plasmática, em virtude de
grandes quantidades de anidrase carbônica.
A ligação de zinco ao fator de transcrição 1 regulador de metal
(MTF1) ativa a expressão da metalotioneína (Mt). Esta proteína
multifuncional, d e b a i x o peso molecular (9.000 a 10.000 Da), tem
u m elevado conteúdo de cisteina e liga-se reversivelmente ao
zinco. A M t é importante n o tráfico intracelular de zinco e auxilia
na manutenção das concentrações intracelulares de zinco. A

Fígado
(1Uí>mg)
205 m g / d
Tecidos moles, 25 mg/d
músculos, ossos
etc (1.100 mg)
f f^ih na. \
\ iransniraçSc '
Figura 2 7 - 2 2
síntese hepática da M t é induzida por inrerleucina-1, interleucina-
6 e glicocorticóides, e m resposta à infecção, ao t r a u m a e a outros
fatores de estresse.
A excreção fecal inclui t a n t o o zinco dietético n ã o absorvido
q u a n t o o zinco secretado n o v a m e n t e n o intestino. A excreção
u r i n á r i a de zinco é n o r m a l m e n t e apenas cerca d e 0,5 m g / d i a ,
mas a u m e n t a e x t r e m a m e n t e d u r a n t e doença catabólica e cetose.
A liberação d o c o n t e ú d o intracelular do músculo esquelético foi
estabelecida c o m o fonte do excesso de zinco urinário.
Funções
Mais d e 3 0 0 metaloenzimas d e zinco ocorrem e m todas as seis
categorias de sistemas enzimáticos. Exemplos i m p o r t a n t e s e m
tecidos h u m a n o s incluem (1) anidrase carbônica, (2) fosfatase
alcalina, (3) D N A e R N A polimerases, (4) timidina quinase, (5)
carboxipeptidases e (6) álcool desidrogenase. O s papéis-chave d o
zinco n a síntese de proteínas e de ácidos nucléicos explicam a
falha d e crescimento e de cicatrização de feridas observadas e m
indivíduos c o m deficiência d e zinco.
Proteínas f o r m a m d o m í n i o s capazes de se ligarem a átomos
tetraédricos de zinco, p o r coordenação c o m histidina e cisteina,
para formar estruturas dobradas conhecidas c o m o "dedos de
zmco". Estas têm papéis importantes na expressão gênica, a t u a n d o
como fatores de transcrição q u e se ligam ao DNA, c o m o elemen-
tos-chave na biologia d o desenvolvimento e t a m b é m na regulação
da síntese de h o r m ô n i o s esteróides, tireoidianos, e outros.
Necessidades e Recomendações para Ingestão de Nutrientes
N o s Estados U n i d o s , a ingestão dietética de referência (DRI) para
o zinco é de 11 m g / d i a para h o m e n s e 8 m g / d i a para mulheres.
Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 519
Zn do
dieta -10
mg/dia
\ \
\
Pool plasmático (2,4 mg)
(albumina, alfa 3 -
macroglobulina,
5,7 mg/d
aminoácidos)
5,3 mg^d
Rim
w
Ffc7es
-9,6 mg/cto
Urína
0,4 mgidia
v y
Sumário do metabolismo de zinco.
Recém-nascidos e crianças e m fase inicial da infância necessitam
de q u a n t i d a d e s inferiores. E m virtude de a u m e n t o de ácido fítico
e de fibras na dieta, os vegetarianos estritos p o d e m necessitar de
q u a n t i d a d e s até 5 0 % maiores d e zinco por dia. 6
Deficiência Clinica
C o m o p o d e se esperar, a partir das múltiplas funções bioquími-
cas do zinco, a apresentação clínica das doenças de deficiência é
variada, não específica e está relacionada ao grau e à duração da
depleção. Sinais e sintomas i n c l u e m (1) crescimento reduzido
c o m n a n i s m o , (2) a u m e n t o da incidência de infecção, possivel-
m e n t e relacionado a alterações n a f u n ç ã o i m u n e , (3) diarréia, (4)
lesões de pele e (5) alopecia.
EfeitOS no Crescimento. A deficiência dietética de zinco é pre-
valente e m todos os países o n d e a dieta é baseada e m cereais ricos
e m fitato e fibra, mas p o b r e e m proteína animal. E m crianças, o
crescimento reduzido e outras anormalidades n o desenvolvi-
m e n t o são reversíveis pela s u p l e m e n t a ç ã o c o m zinco. O zinco d o
leite h u m a n o é absorvido eficientemente, graças à presença de
fatores c o m o o picolinato e o citrato.
Acrodermatite Enteropática. A acrodermatite e n t e r o p ática (AE)
é caracterizada pela d e r m a t i t e periorificial e acral, alopecia e
diarréia; os sintomas são reversíveis pela s u p l e m e n t a ç ã o oral de
zinco. Esta condição, a n t e r i o r m e n t e fatal, é u m erro inato de
caráter autossômico recessivo q u e afeta a absorção de zinco pela
mucosa intestinal.
Nutrição Parenteral. Alguns pacientes que requerem n u t r i ç ã o
intravenosa pós-cirúrgica são suscetíveis à depleção de zinco e m
v i r t u d e de baixos índices de ingestão oral antes e após u m a
cirurgia. Esses t a m b é m p o d e m apresentar a u m e n t o na perda de
zinco pela via intestinal e m conseqüência de diarréia e, via urina,
520 PARTE IV Analitos
a partir do catabolismo muscular durante períodos de balanço
n i t r o g e n a d o negativo. O u t r o s p r o b l e m a s i n c l u e m (1) diarréia, (2)
depressão m e n t a l , (3) d e r m a t i t e , (4) r e t a r d o n a cicatrização e (5)
alopecia, q u e p o d e m ser o b s e r v a d o s d u r a n t e o p e r í o d o a n a b ó l i c o
de g a n h o r e c o r r e n t e d e peso, q u a n d o há zinco i n s u f i c i e n t e n o
regime n u t r i c i o n a l para a c o m p a n h a r o nível de r e p a r o n o tecido.
Provisão i n t r a v e n o s a a d e q u a d a de zinco para atingir u m b a l a n ç o
positivo está associada à m e l h o r a d o b a l a n ç o d e n i t r o g ê n i o .
Doença Infecciosa. A d e p l e ç ã o d e zinco d i m i n u i a i m u n i d a d e
e tem u m efeito d i r e t o n o trato gastrointestinal, q u e a u m e n t a a
gravidade d e infecções entéricas. U m a revisão de d a d o s o b t i d o s
d e e x p e r i m e n t o s c o n t r o l a d o s m e d i n d o efeitos da s u p l e m e n t a ç ã o
c o m zinco e m crianças de países d e baixa r e n d a e n c o n t r o u bene-
fícios clínicos significativos e m casos d e diarréia p e r s i s t e n t e e de
d o e n ç a respiratória. A i n t e r a ç ã o c o m v i t a m i n a A é i m p o r t a n t e
p o r q u e , e m p o p u l a ç õ e s c o m risco d e deficiência de zinco e vita-
m i n a A, a provisão a p e n a s d e zinco a u m e n t a a i n c i d ê n c i a de
i n f e c ç ã o respiratória, mas, q u a n d o a v i t a m i n a A t a m b é m é adi-
c i o n a d a , as infecções respiratórias são d i m i n u í d a s .
Efeitos Subclínicos d a Deficiência
M e s m o q u e a deficiência de zinco n ã o seja grave o b a s t a n t e para
causar sinais e s i n t o m a s clínicos, ela p o d e provocar efeitos sub-
clínicos (1) n a f u n ç ã o i m u n e , (2) n a síntese e n a ação de h o r m ô -
nios e (3) na f u n ç ã o n e u r o l ó g i c a .
Função imune. Pacientes d o O r i e n t e M é d i o c o m deficiência
de zinco e r a m c o n h e c i d o s p o r m o r r e r a n t e s d o s 2 5 anos, e m
v i r t u d e de diversas infecções e de d o e n ç a s parasíticas. N a defici-
ência de zinco, h á u m a r e d u ç ã o n a atividade d e t i m u l i n a sérica,
u m h o r m ô n i o específico d o t i m o envolvido n a f u n ç ã o d e células
T, q u e provoca u m d e s e q u i l í b r i o e n t r e células helper T h l e T b 2 .
A atividade lítica de células naturai killer t a m b é m d i m i n u i . Estas
m u d a n ç a s c o m p l e x a s r e s u l t a m e m falha d a resposta i m u n e
celular.
Hormônios. O zinco t e m u m p a p e l i m p o r t a n t e n a síntese e n a s
ações d e m u i t o s h o r m ô n i o s , p o r m e i o de fatores de transcrição
c o n t e n d o zinco. A d e p l e ç ã o d e zmco é associada a c o n c e n t r a ç õ e s
circulantes baixas d e (1) testos ter o n a , (2) T 4 livre, (3) fator d o
c r e s c i m e n t o s e m e l h a n t e à i n s u l i n a (IGF)-I e (4) t i m u l i n a . As
c o n c e n t r a ç õ e s plasmáticas de IGF-I e a velocidade de c r e s c i m e n t o
a u m e n t a m e m crianças q u e estão r e c e b e n d o s u p l e m e n t o s c o m
zinco.
Efeitos Neurológicos. A deficiência grave d e zinco é c o n h e c i d a
p o r afetar o bem-estar m e n t a l , c o m graus vari ados d e c o n f u s ã o e
depressão, o q u e explica a i m p o r t â n c i a d e enzimas q u e c o n t ê m
zinco n o d e s e n v o l v i m e n t o e n a f u n ç ã o cerebral.
Toxicidade
O s efeitos clínicos d a ingestão de dieta c o n t a m i n a d a c o m zinco
são (1) d o r a b d o m i n a l , (2) diarréia, (3) n á u s e a e (4) v ô m i t o .
Ingestões superiores a 6 0 m g d e Zn p o r dia são b l o q u e a d o r a s da
absorção intestinal de cobre, l e v a n d o à deficiência desse ú l t i m o
elemento.
Avaliação Laboratorial do Estado
E m b o r a a d e t e r m i n a ç ã o d e zinco n o p l a s m a seja insensível à
ingestão dietética e seja i n f l u e n c i á v e l p o r u m g r a n d e n ú m e r o de
variáveis, ela c o n t i n u a s e n d o o teste de l a b o r a t ó r i o mais extensa-
m e n t e utilizado para c o n f i r m a r a deficiência grave. T a m b é m é
utilizada p a r a m o n i t o r a r a a d e q u a ç ã o d a provisão d e zinco, espe-
c i a l m e n t e se i n t e r p r e t a d a e m c o n j u n t o c o m m u d a n ç a s nas con-
centrações d e a l b u m i n a sérica e d e A P R . N e n h u m p r o c e d i m e n t o
laboratorial identifica c l a r a m e n t e p o p u l a ç õ e s c o m d e p l e ç ã o mar-
ginal d e zinco. Respostas clínicas e b i o q u í m i c a s à s u p l e m e n t a ç ã o
c o m zinco são utilizadas, c o n s e q u e n t e m e n t e , para p o s t u l a r u m
estado d e depleção marginal.
Zinco PlâSmátiCO. E m v i r t u d e da possível c o n t a m i n a ç ã o d e
zinco, originária d e eritrócitos, p l a q u e t a s e leucócitos d u r a n t e a
coagulação e a c e n t r i f u g a ç ã o , a m o s t r a s d o p l a s m a são preferidas
às séricas para a análise de z m c o . As c o n c e n t r a ç õ e s de zinco d o
p l a s m a são m e d i d a s g e r a l m e n t e p o r C F A A S .
C u i d a d o s devem ser t o m a d o s p a r a c o n t r o l a r fatores pré-ana-
líticos q u e d i m i n u i r ã o o zinco d o plasma, i n d e p e n d e n t e m e n t e
d a ingestão dietética. Estes i n c l u e m a coleta da a m o s t r a e m
relação (1) às refeições, (2) à h o r a d o dia e (3) ao uso de esterói-
des, tais c o m o a pílula c o n t r a c e p t i v a . Q u a l q u e r causa de hipoal-
b u m i n e m i a t a m b é m d i m i n u i o zinco plasmático. A a l b u m i n a d o
p l a s m a é u m A P R negativo e, a p a r t i r d o pool plasmático, é redis-
t r i b u í d a pelos espaços intersticiais d u r a n t e a infecção, após
t r a u m a e e m d o e n ç a crônica. A i n d u ç ã o d a síntese h e p á t i c a da
M t d u r a n t e o A P R , e s u b s e q ü e n t e q u e l a ç ã o de zinco, d i m i n u i
a i n d a mais a c o n c e n t r a ç ã o n o p l a s m a . É, p o r t a n t o , essencial
c o n s i d e r a r os resultados de zinco plasmáticos e m c o n j u n t o c o m
a a l b u m i n a e C R P plasmáticas o u u m o u t r o m a r c a d o r d e A P R .
Zinco em Células Sanguíneas. Foi sugerido q u e o c o n t e ú d o d e
zinco e m células b r a n c a s e p l a q u e t a s reflete d e m a n e i r a m a i s
a d e q u a d a o c o n t e ú d o de zinco tecidual. E m e s t u d o s de d e p l e ç ã o
d e zinco e m seres h u m a n o s , foi d e m o n s t r a d o q u e o c o n t e ú d o d e
zinco d e n e u t r ó f i l o s , linfócitos e p l a q u e t a s d i m i n u e m mais rapi-
d a m e n t e q u e o zinco plasmático. E n t r e t a n t o , o v o l u m e relativa-
m e n t e g r a n d e de s a n g u e r e q u e r i d o e os p r o b l e m a s c o m c o n t a m i -
n a ç ã o t o r n a m difícil a aplicação desses ensaios e m pacientes
hospitalizados o u p a r a avaliação d e c o n c e n t r a ç õ e s de zinco n a
população.
Zinco no Cabelo. Baixas c o n c e n t r a ç õ e s d e zinco n o cabelo t ê m
sido associadas à deficiência d o c r e s c i m e n t o d e crianças. Entre-
t a n t o , variáveis c o m o a taxa d e c r e s c i m e n t o de cabelo e a conta-
m i n a ç ã o externa p o r t i n t u r a s e c o s m é t i c o s levaram a resultados
inconsistentes.
Enzimas Dependentes de Zinco. A p e s a r d o g r a n d e n ú m e r o
i d e n t i f i c a d o de m e t a l o e n z i m a s c o n t e n d o zmco, n e n h u m ensaio
e n z i m á t i c o e m p a r t i c u l a r foi c o n s i d e r a d o a d e q u a d o c o m o indi-
cador d o e s t a d o n u t r i c i o n a l de zinco.
Zinco na Urina. H á u m a ligeira q u e d a n a excreção u r i n á r i a d e
zinco d u r a n t e a deficiência dietética. As d i f i c u l d a d e s relacionadas
à c o n t a m i n a ç ã o d e a m o s t r a d u r a n t e a coleta fazem dessa estraté-
gia d e m e d i d a u m a o p ç ã o c o m valor prático l i m i t a d o .
Intervalos de Referência
As c o n c e n t r a ç õ e s d e zinco n o s o r o são, g e r a l m e n t e , 5 % a 1 5 %
mais elevadas d o q u e as d o p l a s m a , e m v i r t u d e d e m u d a n ç a s n a
o s m o l a r i d a d e de f l u i d o s das células d o sangue, induzidas pela
p r e s e n ç a d e anticoagulantes utilizados n a coleta d a a m o s t r a . As
c o n c e n t r a ç õ e s d i m i n u e m após a ingestão de a l i m e n t o s e são mais
elevadas pela m a n h ã d o q u e à n o i t e . A o r i e n t a ç ã o p a r a o inter-
valo de referência é d e 8 0 a 120 p g / d L (12 a 18 p m o l / L ) .
Outros Possíveis Elementos Essenciais
Mais de 15 elementos-traço adicionais são c o n s i d e r a d o s p o t e n -
c i a l m e n t e i m p o r t a n t e s n a m e d i c i n a h u m a n a . E m u m a revisão
realizada p o r Nielsen, eles são e s t u d a d o s e m d e t a l h e s e se discu-
t e m os conceitos e m e r g e n t e s de "essencialidade". 1 C A l g u n s deles,
c o m o (1) c h u m b o , (2) c á d m i o , (3) arsénio, (4) a l u m í n i o e (5)
n í q u e l , serão c o n s i d e r a d o s p o r l a b o r a t ó r i o s clínicos principal-
m e n t e c o m o e l e m e n t o s tóxicos. O u t r o s , c o m o o lítio, são classi-
ficados c o m o f a r m a c o l o g i c a m e n t e b e n é f i c o s e o m o n i t o r a m e n t o
d a dose p o d e ser necessário.
 Vitaminas e Elementos-Traço CAPÍTULO 2 7 521

REFERENCIAS 8. Jacques PF, Selhub J, Bostom AG, Wilson PW, Rosenberg IH. The
effect of folie acid fortification on plasma folate and total homocysteine
1. Bates CJ. Vitamin analysis. A n n Clin Biochem 1997;34
concentrations. N Engl J Med 1999; 340-1449-54.
(Pt 6):599 626.
9. Loscalzo ]. Homocysteine trials-clear outeomes for complex reasons. N
2. Food and Nutrition Boaid IOM. Dietary reference intakes foi thiamin,
E n g l ] Med 2006;354-1629-32
riboflavin, niacm, vitamin folate, vitamin B] 2j pantothenic acid,
10 Nielsen FH. Possibly essential trace elements In: Bogden ]D, Klevay
biotin, and choline. Washington, DC: National Academy Press, 199S
LM, eds. Clinicai nutrition of the essential trace elements and minerais.
3. Food and Nutrition Board IOM. Dietary reference intakes for calcium,
Totawa, NJ: Humana Press, 2000-11-36.
phosphorus, magnesium, vitamin D and fluoride. Washington, DC:
11 Rayman MP. The importance of selenium to human health. Lancet
National Academy Press, 1999.
2000;356:233-41.
4. Food and Nutrition Board IOM. Dietary reference intakes for vitamin
12. Sauberlich HE. Labora to ty tests for die assessment of nutritional status,
C, vitamin E, selenium, and carotenoids Washington, DC: National
2nd ed. Boca Raton, FL: C R C Press, 1999.
Academy Press, 2000
13. Shenkin A, Baines M, Fell G, Lyon T. Vitamins and trace elements In-
5. Food and Nutrition Board IOM. Dietary reference intakes for energy,
Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. Tietz textbook of clinicai
carbohydrate, fiber, fat, facty acids, cholesterol, protein, and amino acids.
chemistry and molecular diagnosties, 4th ed. St Louis: Saunders,
Washington, DC: National Academy Press, 2002.
2005:1075-164.
6. Food and Nutrition Board IOM. Dietary reference intakes for vitamin
14. W H O Scientific Goup. Nutritional anaemias. World Health
A, vitamin K, arsenic, boron, chromium, copper, iodine, ÍTon,
Organisation Technical Report Series No 405 Geneva: World Health
manganese, molybdenum, nickel, silicon, vanadium, and zinc.
Organisation, 1968.
Washington, DC: National Academy Press, 2002.
7. Helphingstine CJ, Bistrian BR. New Food and Drug Admmistration
requirements for inclusion of vitamin K in adult parenteral
multivitamins. JPEN 2003;27:220-4.
CAPITULO 2 8
Hemoglobina, Ferro e Bilirrubina*
Trefor Higgins, F.C.A.C.B., Ernest Beutler, M.D., e Basil T. Doumas, Ph.D.
OBJETIVOS
1. Definir os seguintes termos:
Hemoglobina
Ferritina
Hemossiderina
Transferrina
Hemocromatose
Hemossiderose
Bilirrubina (conjugada e não-conjugada)
Icterícia
2. Discutir a estrutura e a função da hemoglobina, inclusive a
composição bioquímica, a fisiologia e a importância clínica.
3. Descrever a importância do heme ria fisiologia da hemoglobina.
4. Listar quatro talassemias, citar as causas e descrever os achados
laboratoriais associados a cada tipo.
5. Definir "persistência hereditária de hemoglobina F".
6. Explicar a nomenclatura usada para catalogar as várias hemoglobinas
e as classificações usadas para descrever as variantes de
hemoglobina.
7. Listar cinco métodos de avaliação de hemoglobina usados em um
laboratório clínico e descrever o princípio de cada um.
8. Citar as funções fisiológicas do ferro, da transferrina e da ferritina.
9. Descrever a absorção, o transporte e o metabolismo do ferro.
10. Listar e descrever os sintomas de três distúrbios do metabolismo do
ferro.
11. Listar cinco condições que afetam a concentração de ferro sérico e
explicar como ela é afetada em cada uma delas.
12. Descrever os métodos de análise de ferro sérico, ferritina e
capacidade total de ligação de ferro; citar a fórmula usada para
calcular a saturação percentual de ferro.
13. Descrever a via de biossíntese da bilirrubina, inclusive a conjugação
no fígado.
14. Citar a utilidade clínica da análise das concentrações de bilirrubina
sérica, conjugada e não-conjugada, e do urobilinogênio.
15. Descrever os métodos de análise de bilirrubina; descrever os
princípios e as possíveis interferências de cada um deles.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A n e m i a F a l c i f o r m e : U m t i p o a u t o s s ô m i c o d o m i n a n t e de a n e m i a
h e m o l í t i c a c a u s a d a pela p r e s e n ç a de h e m o g l o b i n a S c o m
eritrócitos a n o r m a i s e m f o r m a de foice (células falciformes).
B i l i r r u b i n a C o n j u g a d a : B i l i r r u b i n a q u e foi resgatada pelas
células hepáticas e c o n j u g a d a p a r a f o r m a r o d i g l i c u r o n í d e o
de b i l i r r u b i n a hidtossolúvel.
Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições prévias dos Drs. Virgil
F. Fairbanks e George G. Klee (hemoglobina e feno) e dos Drs. Keith G Tolman
e Robeit Rej (bilirrubina), nas quais se baseiam partes deste capítulo.
B i l i r r u b i n a D i r e t a : A fração d e b i l i r r u b i n a q u e reage com o
reagente diazo n a ausência de álcool.
B i l i r r u b i n a I n d i r e t a : B i l i r r u b i n a livre q u e n ã o foi c o n j u g a d a
c o m o ácido glicurônico.
B i l i r r u b i n a N ã o - c o n j u g a d a : B i l i r r u b i n a livre q u e n ã o foi
c o n j u g a d a c o m o ácido glicurônico.
"Ferritina: O c o m p l e x o ferro-apoferritina, u m a das principais
f o r m a s n a s quais o ferro é a r m a z e n a d o n o c o r p o ; ela ocorre
(1) ria m u c o s a gastrointestinal, (2) n o fígado, (3) n o baço,
(4) n a m e d u l a óssea e (5) n a s células reticuloendoteliais.
H e m e : Q u a l q u e r q u e l a t o d e f e r r o c o m os q u a t r o g r u p o s
pirrólicos de u m a p o r f i r i n a , t a m b é m r e c o n h e c i d o c o m o
ferro-heme ou ferri-heme, q u e se refere aos q u e l a t o s do Fe(II)
e Fe(III), r e s p e c t i v a m e n t e .
H e m o c r o m a t o s e : U m a d o e n ç a genética rara causada p o r
d e p o s i ç ã o d e h e m o s s i d e r i n a nas células p a r e n q u i m a i s ,
c a u s a n d o d a n o ao tecido e d i s f u n ç ã o d o fígado, d o pâncreas,
d o coração e da pituitária. T a m b é m c h a m a d a d o e n ç a de
sobrecarga de ferro.
H e m o g l o b i n a : O p i g m e n t o c a r r e a d o r de oxigênio dos eritrócitos,
f o r m a d o p e l o eritrócito e m d e s e n v o l v i m e n t o n a m e d u l a
óssea. É u m a p r o t e í n a c o n j u g a d a c o n t e n d o q u a t r o g r u p o s
h e m e e globina, c o m a p r o p r i e d a d e de oxigenação reversível.
H e m o g l o b i n o p a t i a : Q u a l q u e r doença herdada causada por
anormalidades da hemoglobina, resultando em condições
c o m o a n e m i a falciforme, a n e m i a h e m o l í t i c a ou talassemia.
HenfeSssiderina: U m a f o r m a d e a r m a z e n a m e n t o intracelular de
ferro; os grânulos c o n s i s t e m e m u m c o m p l e x o m a l d e f i n i d o
d e h i d r ó x i d o s férricos, polissacarídeos e p r o t e í n a s , c o m u m
c o n t e ú d o férrico d e cerca d e 3 3 % d o seu peso.
H e m o s s i d e r o s e ; U m a u m e n t o focal o u geral d o s estoques
férricos n o tecido s e m d a n o t e c i d u a l associado. As
h e m o s s i d e r o s e s h e p á t i c a e p u l m o n a r são caracterizadas p o r
q u a n t i d a d e s a n o r m a i s d e h e m o s s i d e r i n a n o fígado e n o s
pulmões, respectivamente.
H i p e r b i l i r r u b i n e m í a : C o n c e n t r a ç õ e s excessivas d e b i l i r r u b i n a
n o sangue, as quais p o d e m levar à icterícia; as
b i p e r b i l i r r u b i n e m i a s são classificadas c o m o c o n j u g a d a s ou
n ã o - c o n j u g a d a s , d e a c o r d o c o m a f o r m a p r e d o m i n a n t e de
b i l i r r u b i n a n o sangue.
Icterícia: U m a s í n d r o m e caracterizada p o r h i p e r b i l i r r u b i n e m i a e
d e p o s i ç ã o de p i g m e n t o biliar n a pele, n a s m e m b r a n a s
m u c o s a s e n a esclera, c o m r e s u l t a n t e aparência a m a r e l a d a d o
paciente; t a m b é m c h a m a d a d e icterus.
K e r n i c t e m s : U m a s í n d r o m e clínica d o n e o n a t o resultante de altas
concentrações de bilirrubina não-conjugada, que passa pela
barreira h e m a t o e n c e f á l i c a i m a t u r a d o recém-nascido e causa
degeneração das células d a gânglia basal e d o h i p o c a m p o .
Mioglobina: U m a proteína contendo heme encontrada no
m ú s c u l o esquelético v e r m e l h o .
T a l a s s e m i a : U m g r u p o h e t e r o g ê n e o d e a n e m i a s hemolíticas
hereditárias q u e a p r e s e n t a m u m a taxa d e síntese d i m i n u í d a
d e u m a o u mais cadeias p o l i p e p t í d i c a s d a h e m o g l o b i n a e q u e
524 PARTE IV Analitos

são classificadas de acordo com a cadeia envolvida (a, p, 8);

as duas principais categorias são as a e p-talassemias.
T r a n s f e t t i t i a : U m a betaglobulina que transporta ferro n o
sangue.
U r o b i l i n o g ê n i o : U m composto incolor formado n o intestino
pela r e d u ç ã o da bilirrubina.

H e m o g l o b i n a (Hb), ferro e bilirrubina são analitos que

p o d e m ser considerados coletivamente nos processos de
p r o d u ç ã o n o qual a matéria-prima (ferro) é incorporada
a outras matérias-primas, e m u m processo complexo de múltiplos
estágios, r e s u l t a n d o e m u m p r o d u t o final (Hb). M Este p r o d u t o
final tem u m t e m p o d e v i d a limitado, após o qual ocorre a degra-
dação em u m p r o d u t o de excreção (bilirrubina). Nesse processo,
são e n c o n t r a d o s muitos mecanismos bioquímicos requintados
de controle, conservação e síntese. Por exemplo, esse processo
p o d e ser i n t e r r o m p i d o p o r (1) u m a deficiência n o s u p r i m e n t o de
matéria-prima, (2) perda de controle dos mecanismos de síntese,
(3) perda excessiva d o p r o d u t o final ou (4) conversão excessiva
ou deficiência n a eliminação de p r o d u t o s de excreção. Essas
interrupções manifestam-se em distúrbios clínicos de (1) b e m o -
globinopatias, (2) talassemias, (3) anemias p o r deficiência de
ferro, (4) d o e n ç a s hepáticas e (5) várias doenças genéticas—inclu-
sive as s í n d r o m e s de Crigler-Najjar e de Gilbert.
HEMOGLOBINA
H e m o g l o b i n a é o pigmento carreador de oxigênio dos eritrócitos,
o qual é f o r m a d o n o eritrócito em desenvolvimento na medula
óssea. E u m a proteína conjugada que c o n t é m quatro grupos h e m e
e globina e tem a propriedade de oxigenação reversível.
Química
A h e m o g l o b i n a é u m a h e m o p r o t e í n a , de forma globular, com
diâmetro d e 6,4 n m e peso molecular de a p r o x i m a d a m e n t e
64.500 Da. A porção h e m e é u m quelato que c o n t é m ferro com
a porção glohina consistindo e m dois pares de cadeias polipeptí-
dicas de globina, designadas a e n ã o - a . As q u a t r o cadeias de
globina f o r m a m u m a c o n c h a de parede espessa c i r c u n d a n d o u m a
cavidade central, n a qual a p o i ç ã o heme, ligada por interação dos
resíduos de histidina das cadeias de globina ao ferro do heme,
está suspensa (Figura 28-1). O ferro h ê m i c o está n o r m a l m e n t e n o
estado de oxidação ferroso (2*).
O s dois pares de cadeias de globina n a h e m o g l o b i n a n o r m a l
(HbA) são d e n o m i n a d o s a e p. A cadeia a c o n t é m 141 resíduos
de aminoácidos e a cadeia P, 146 resíduos de aminoácidos. N a
h e m o g l o b i n a fetal, HbF, a cadeia a é a m e s m a que a encontrada
na H b A , mas a cadeia n ã o - a é a cadeia y, que t e m o m e s m o
n ú m e r o de resíduos d e aminoácidos e homologia estrutural subs-
tancial com a cadeia p. A H b A z tem a cadeia a habitual, mas a
cadeia n ã o - a é a cadeia 8. Por convenção, a cadeia a é sempre
escrita p r i m e i r o nas abreviações da estrutura da h e m o g l o b i n a .
Por exemplo, H b A é escrita c o m o OL-fii, H b F c o m o CL-ifj e H b A :
c o m o a 2 82- E m adultos normais, a H b A f o r m a cerca de 8 5 % a
9 5 % da h e m o g l o b i n a total, a H b F é m e n o s do que 1%, e a H b A 2
é m e n o s do q u e 3,5%. Variações n a seqüência de resíduos de
aminoácidos das cadeias de globina (uma variação qualitativa)
leva a hemoglobinopatias, e n q u a n t o diminuições n a p r o d u ç ã o
de cadeias de globina (uma variação quantitativa) levam a talas-
semias.
Hemoglobinas Quimicamente Modificadas
A h e m o g l o b i n a p o d e ser modificada pela ligação de compostos
químicos para formar hemoglobinas q u i m i c a m e n t e modificadas.
Algumas dessas hemoglobinas modificadas q u i m i c a m e n t e com-
Figura 28-1 Estrutura da subunidade da Hb. Cadeias de
aminoácidos em segmentos era espiral ou helicoidais são ligadas por
segmentos pequenos não-helicoidais. Os segmentos helicoidais são
denominados de A a H. Nesta ilustração, os aminoácidos são
designados de acordo com o segmento helicoidal ou não-helicoidal no
qual eles ocorrem. (De Dickerson RE. X-ray analysis and piotein
structure. In: Neurath H, ed. The proceins: ccmposition, structure and
function, 2nd ed. Vol. 2. New York: Academic Press, 1964:603-778.
Direitos autorais, Elsevier 1964.)
p r o m e t e m a estabilidade estrutural e / o u a funcionalidade da
hemoglobina. O m o n ó x i d o de carbono, por exemplo, substitui
preferencialmente o oxigênio d o h e m e para formar carboxiemo-
globina. Portanto, a capacidade de transporte de oxigênio da
hemoglobina é c o m p r o m e t i d a e, e m casos extremos, resulta e m
morte, devida à privação de oxigênio ao tecido. A m e t e m o g l o b i n a
é f o r m a d a como resultado de u m a m u d a n ç a n o estado de oxida-
ção d o á t o m o de' ferro n o h e m e do estado de oxidação ferroso
normal (2*) para o estado férrico (3*). Isso resulta e m u m a notável
diminuição da capacidade de transporte de oxigênio. A presença
de nitrato e m água de poço tem sido descrita como causadora de
metemoglobinemia. A sulfaemoglobina, c o m u m e n t e resultante
da exposição a certas drogas, é formada q u a n d o u m ou mais
oxigênios dos anéis porfirínicos d o h e m e é substituído por
enxofre. A remoção da fonte de compostos químicos leva à res-
tauração da hemoglobina n o T m a l .
A h e m o g l o b i n a t a m b é m f o r m a adutos pela ligação de u m a
molécula às cadeias de globina. Embora a ligação seja mais
c o m u m n o residuo d e a m i n o á c i d o N terminal, ela p o d e ocorrer
e m q u a l q u e r lugar ao longo da cadeia de globina. Por exemplo,
a h e m o g l o b i n a carbamilada é f o r m a d a pela ligação de uréia, e a
h e m o g l o b i n a glicada é f o r m a d a pela ligação de glicose ao N-
terminal da p-glohina. O a d u t o h e m o g l o b i n a glicada, HbAi c , é
clinicamente i m p o r t a n t e c o m o u m m o n i t o r de controle glicê-
mico para pacientes com diabetes. A h e m o g l o b i n a fetal (HbF,
a 2 y 2 ) é a única q u e p o d e f o r m a r u m a d u t o acetilado. O h e m e ,
a p r o t o p o r f i r i n a IX ferrosa, consiste em q u a t r o anéis pirrólicos
ao redor de u m á t o m o de ferro com q u a t r o dos seus seis pares
de elétrons ligados aos átomos de nitrogênio dos anéis pirrólicos
(Capítulo 29).
 Hemoglobina, Ferro e Bilirrubina
A h e m i n a resulta da oxidação relativamente fácil d o ferro
hêmico do estado ferroso para o estado férrico. Para permanecer
eletricamente neutra, u m composto com halogênio, geralmente
cloreto, liga-se à hemina. Em solução alcalina, a h e m a t i n a é
formada pela substituição do á t o m o de halogênio da h e m m a por
u m grupo hidroxila.
Bioquímica
O h e m e é sintetizado principalmente na medula óssea e n o
fígado (Figura 29-2, Capítulo 29).
Este é u m processo de oito etapas com cada uma delas envol-
vendo u m a enzima diferente geneticamente controlada. A pri-
meira e as três últimas etapas ocorrem na mitocôndria dos eri-
troblastos c reticulócitos na medula óssea. Os quatro estágios
intermediários ocorrem n o citossol.
Em c o m u m c o m todos os genes, os genes de globina consis-
tem em éxons (seqüências codificadoras) e íntrons (sequências
não codificadoras intercaladas) com códons [triplet (trinca) de
nucleotídeos] codificando aminoácidos específicos. Os genes
de globina têm três éxons e dois íntrons com uma região promo-
tora (específica para a cadeia de globina) na extremidade 5' de
cada gene Os processos de transcrição e tradução são os mesmos
que em qualquer outra síntese de cadeias de aminoácidos.
Função Fisiológica
O ferro d o h e m e está n o r m a l m e n t e n o estado ferroso (2+) e é
capaz de agir c o m o a principal entidade de transporte de oxigênio
pela combinação reversível com o oxigênio. Cooperatividade é o
termo usado para descrever a interação das cadeias de globina de
tal forma que a oxigenação de u m grupo h e m e a u m e n t a a pro-
babilidade de oxigenação de outro ou de todos os grupos heme.
O efeito Bohr refere-se à redução da afinidade do oxigênio pelo
h e m e com u m a diminuição n o pH. Este efeito é particularmente
importante n o músculo em exercício, o n d e os produtos d o meta-
bolismo aeróbico, C 0 2 e ácido carbônico, d i m i n u e m o pH a 6
e a liberação d o oxigênio ligado ao heme é facilitada.
Importância Clínica
As talassemias e as hemoglobinopatias formam dois grupos dife-
rentes de doenças de origem genética. 9 As talassemias originam-se
da produção insuficiente de cadeia de globma. O n o m e é deri-
vado da palavra grega para mar, thalasa, porque todos os casos
iniciais de (3-talassemia foram descritos em crianças de origem
mediterrânea. As hemoglobinopatias, coletivamente, são varian-
tes estruturais de hemoglobina geradas a partir de mutações nos
genes de globinas. Isso resulta em substituições ou interrupções
na seqüência n o r m a l de resíduos de aminoácidos em u m a ou
mais cadeias de globina da hemoglobina. Elas são as doenças
monogênicas mais c o m u n s n o m u n d o .
Talassemias
As talassemias são identificadas de acordo com a cadeia de
globina que apresenta deficiência de produção. Portanto, as a -
talassemias surgem da produção defeituosa da p r o d u ç ã o de
a-globina; as P-talassemias, da p r o d u ç ã o deficiente de p-globina.
e as Ôp-talassemias de deficiências na p r o d u ç ã o de 5 e P-globi-
nas. As talassemias são, ainda, classificadas pela extensão da
redução da p r o d u ç ã o de globina e da anemia resultante. Q u a t r o
genes de globina controlam a p r o d u ç ã o de a-globina. Deleções
ou mutações pontuais em qualquer u m desses genes resultam
em a-talassemia. A gravidade da anemia é u m reflexo n o n ú m e r o
de deleções gênicas. Frequentemente, o diagnóstico de a-talas-
semia é por exclusão. Na presença de índices talassêmicos na
contagem sanguínea completa (CBC) e na ausência de elevação
CAPÍTULO 2 8 525
da H h A , pode ser feito u m diagnóstico presuntivo de a-talasse-
mia. A confirmação pelo teste de D N A é necessária para o
diagnóstico definitivo.
U m a única deleção gênica, escrita como (aa/a-) é, em geral,
clinicamente silenciosa e não tem característica hematológica
significante além de u m volume corpuscular médio (MCV) leve-
mente d i m i n u í d o ocasionalmente.
A deleção de dois genes, algumas vezes chamada traço a-talas-
sêmico e escrita como (aa/- ou a-/a-), tem características clínica
e hematológica significantes. O MCV, a hemoglobina corpuscu-
lar média (MCH) e o índice de Mentzer ( M C V / c o n t a g e m de
eritrócitos) estão todos diminuídos. O esíregaço de sangue peri-
férico mostra uma anemia microcítica e hipocrômica. N ã o há
picos anormais na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
e n e n h u m a banda não usual na eletroforese. A deleção é dita
u m a deleção eis q u a n d o as duas deleções são n o mesmo locus
gênico {aa/-) e u m a deleção trans q u a n d o elas estão em loa
gênicos opostos (a-/a-)
U m a deleção de três genes a ( - / a - ) resulta em doença de
H b H . Entretanto, u m a doença de H b H não causada por deleção
é vista, a qual é mais grave na apresentação clínica do que a
doença de H b H por deleção mais típica. Os pacientes com
doença de H b H têm (1) concentração de hemoglobina baixa,
(2) M C V e M C H diminuídos e (3) contagem de eritrócitos ligei-
ramente aumentada. Os resultados relativos ao ferro são normais.
O cromatograma do HPLC, mostrado na Figura 28-2, mostra a
presença de bandas nítidas próximas ao p o n t o de injeção.
A deleção de quatro genes a ê geralmente incompatível com
a vida sem transfusão maciça intra-uterina e pós-natal. A doença
é n o r m a l m e n t e chamada hidropisia fetal H b de Bart. Tipica-
mente, as mães carregando u m feto com H b de Bart se apresen-
tam, cerca de 20 a 25 semanas de gestação, com a manifestação
de poliidrâmnio. A concentração de hemoglobina n o sangue do
cordão umbilical é grandemente a u m e n t a d a para a idade e há
hipoalbumjnemia. A análise por H P L C do sangue do cordão
umbilical, mostrada na Figura 28-2, mostra uma única banda
nítida n o p o n t o de injeção d o cromatograma. A eletroforese em
pH alcalino mostra u m a banda de migração rápida. Na Figura
28-3, são mostradas a H P L C e a eletroforese em p H alcalino do
sangue do cordão umbilical de u m feto normal de 26 semanas e
de u m feto de idade gestacional similar com H b de Bart. A H P L C
do feto com H b de Bart mostra um pico único característico n o
ponto de injeção, e n q u a n t o a H P L C do feto normal mostra H b F
(tanto a acetilada quanto a normal) com alguma HhA. Em
algumas partes do m u n d o , o n d e duas deleções gêmeas eis são
comuns, o rastreamento de todos os futuros pais é realizado com
a c o m p a n h a m e n t o e aconselhamento apropriados.
As beta (p)-talassemias resultam de uma diminuição na
síntese da cadeia de p-globina. Elas são comuns em áreas próxi-
mas (1) ao Mediterrâneo, (2) a províncias ao sul da C h i n a e
(3) ao subcontinente indiano.
Os métodos de rastreamento da população estão, agora, em
uso" em várias localidades d o m u n d o o n d e a p-talassemia é
comum.
pD-Talassemia (p-Talassemia Major)
Algumas vezes chamada anemia de Cooley, os indivíduos com
p-talassemia major (1) têm infecções frequentes, (2) parecem
pálidos, (3) são desnutridos e (4) exibem esplenomegalia com
mudanças ósseas faciais. Essas manifestações refletem principal-
mente o grau de expansão óssea associada à eritropoiese ineficaz.
A p n -talassemia resulta de mutações que interferem na tradução
ou estão envolvidas na iniciação, n o alongamento ou na termi-
nação da síntese da cadeia de globina.
526 PARTE IV Analitos

30%
0,090
AU (a) (b)

20%
0,060-

0,030-
10%

A
í
A2

0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 ( 5

30% 30%

(d) (o)

20*?; 20%- p

10% 10%- 10%--

I A2 I
I I
l AAJ VA2 ml a n
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5

30% 30% 30% t

(9) (h) <i)

20% 20%- 20%

10%- 10% 10%-

A2 i
li. j A2
,L I . A . l i l w A W l
A2 i/\'|
H 1 1 h

Figura 2 8 - 2 C r o m a t o g r a m a s de H P L C o b t i d o s de diversas variantes a, H b de Bart; b, (3 0 -talassemia major; c,

h o m o z i g o t o H p a r a fJ 4 -tal as se mia; cJ, H b H ; e, h o m o z i g o t o S; /, t r a ç o S; g, h o m o z i g o t o C ; h, traço C ; i, H b S - H b
G P h i l a d e l p h i a . (De Clarke G M , Trefor Kl, Higgins T N . L a b o i a t o r y Invéstigation of h e m o g l o b i n o p a t h i e s a n d
thalassemias: review a n d u p d a t e . C l i n C h e m 2000;46:1284-90.)

A a p r e s e n t a ç ã o clínica o c o r r e g e r a l m e n t e e m m e n o s de 1 tos, (2) n u m e r o s a s células-alvo, q u e p o d e m teT u m a p o n t e ligando

a n o de idade, c o m características q u e i n c l u e m (1) t a m a n h o
p e q u e n o para a idade, (2) expans ão da c i r c u n f e r ê n c i a a b d o m i -
n a l e (3) falha n o d e s e n v o l v i m e n t o . O e x a m e físico d o i n d i v í d u o
p o d e revelar p r o t u b e r â n c i a f r o n t a l ( u m a p r o t u b e r â n c i a a r r e d o n -
d a d a n a f r o n t e ) c a u s a d a pelo e s p e s s a m e n t o d o s ossos craniais,
palidez e p r o e m i n ê n c i a d o s ossos da face. Hm crianças mais
velhas, isso obscurece a base d o nariz e e x p õ e os d e n t e s .
R e s u l t a d o s típicos d a C B C i n c l u e m a n e m i a grave c o m a
c o n c e n t r a ç ã o d e h e m o g l o b i n a e n t r e 3 0 e 6 5 g / L , o M C V de 4 8
a 72 f L e a c o n c e n t r a ç ã o de h e m o g l o b i n a c o r p u s c u l a r m é d i a
( M C H C ) de 230 a 3 2 0 g / L . N o esfregaço d e sangue periférico,
nota-se m o r f o l o g i a a n o r m a l d a célula v e r m e l h a d o s a n g u e
(RBC), característica q u e inclui (1) g r a n d e n ú m e r o d e micráci-
as zonas de p i g m e n t o central e periférica, (3) policromasia,
(4) esferócitos ocasionais, (5) esquistócitos e (6) eritrócitos nucle-
ados. A ferritina está d e n t r o d o seu intervalo de referência. U m
e s t u d o familiar 1 deveria, sempre, ser realizado e m u m a família
c o m u m a criança c o m p-talassemia major. A H P L C d o s a n g u e de
crianças c o m p-talassemia major m o s t r a u m g r a n d e pico de H b F ,
c o m n e n h u m pico de H b A e p o u c o ou n e n h u m pico de H b A j
(Figura 28-2). A l g u m a s vezes, u m a b a n d a p e q u e n a nítida é vista
n o p o n t o d e i n j e ç ã o e t e m sido c h a m a d a p s e u d o - H b d e Bart, mas
é, de fato, b i l i r r u b i n a .
T r a n s f u s õ e s p o r t o d a a vida j u n t a m e n t e c o m terapia de que-
lação são as principais terapias. O t r a n s p l a n t e d e m e d u l a óssea
t a m b é m tem-se m o s t r a d o eficaz.
 Hemoglobina, Ferro e Bilirrubina CAPÍTULO 2 8 527

C S A F
C S F A

+ (b)

I Hl
(a)

i
i
0,125-
0,125

0,100
0,100 (d)

0.075
0,075

5 0.050
0,050
1
1\
1
0.025 0.025

0.000 O.OOO-

0,00 0.75 1.50 2.25 3,00 3,75 4,50 5,25 0,00 1.50 2.25 3,00 3,75 4,50 5,25
T e m p o (mm) T e m p o (min)

Figura 2 8 - 3 Eletroforese de hemoglobina sm p H alcalino (a) e ácido (b) dc um feto n o r m a l de 26 semanas

de idade gestacional {linha 2) e um feto c o m Hb de Bart de idade gestacional similar {linha 3) O s
cromatogramas de H P L C dos mesmos fetos normal (c) e com H b de Bart (d).

p ! '-Talassemia mia, (.3) p o n t i l h a m e n t o basofílico, (4) células-alvo e (5) RBCs

A p~-talassemia é atribuída a uma grande variedade de genõtipos,
mas todos têm em c o m u m uma redução significativa da produ-
ção da P-globina com redução subseqüente da quantidade de
H b A presente. A gravidade clínica em indivíduos com variações
nas duas cadeias de P-globina é muito m e n o r do que quando
existe uma variação em u m único gene, uma condição algumas
vezes denominada p-talassemia dominante. Há uma redução da
gravidade das características clínicas com a co-herança de a-talas-
semia. A P-talassemia á encontrada em países do Mediterrâneo,
especialmente em países n o Mediterrâneo Oriental.
A apresentação clínica varia de sintomas similares aos da
P°-talassemia até aqueles associados ao traço p-talassêmico. As
transfusões normalmente não são necessárias, e a terapia c o m
hidroxiuréia é freqüentemente usada paia aumentar a produção
de hemoglobina F e abrandar os sintomas da doença. A C B C
mostra hemoglobina diminuída com (1) anisocicose, (2) hipocTO-
nucleadas no esfregaço de sangue periférico.
p-Talassemia Minor
O s pacientes com p-talassemia minor são muito freqüentemente
assintomáticos, exceto em ocasiões de estresse hematopoiético,
tais c o m o em infecções ou na gravidei, q u a n d o eles p o d e m
necessitar de transfusões de sangue devido ao desenvolvimento
de anemia. A C B C cm pacientes c o m traço P-talassêmico mostra
hemoglobina e hematócrito n o limite inferior ou diminuídos,
M C V (< 72 fL) a M C H (< 27 pg) diminuídos e uma amplitude
de distribuição dos eritrócitos ( R D W ) normal. Entretanto, para
pacientes com doenças hepáticas e p - t a l a s s e m i a , o M C V e a
M C H p o d e m estar aumentados para o limite superior do inter-
valo de referência.
O esfregaço de sangue periférico mostra RBCs microcíticas
com hipocromia ocasional, pecilocitose c células-alvo. O achado
528 PARTE IV Analitos
de u m a H b A 2 a u m e n t a d a (>3,5%) com índices talassêmicos apro-
priados ( M C V baixo, alta contagem de R B C e R D W n o r m a l ou
próximo do normal) na C B C é essencial para o diagnóstico de
P-talassemia miíior. Indivíduos com deficiência de ferro devem
fazer reposição de ferro antes que u m diagnóstico definitivo de
p - t a l a s s e m i a seja feito, já que a H b A ; p o d e estar falsamente
d i m i n u í d a c o m a depleção d e ferro. A H P L C é o m é t o d o prefe-
rencial para essa quantificação. Em 3 0 % a 4 0 % de todos os casos
de P-talassemia minor, a H b F t a m b é m estará a u m e n t a d a (>1,0%).
Na p - t a l a s s e m i a minor, o t e m p o de vida da R B C pode estar redu-
zida e pacientes com diabetes p o d e m mostrar u m a H b A l c mais
baixa q u a n d o comparados com indivíduos n o r m a i s com controle
glicêmico equivalente. A m u t a ç ã o da p - t a l a s s e m i a pode ser iden-
tificada por S o u t h e r n Blot, usando-se sondas específicas pata a
mutação, ou u m a reação em cadeia da polimerase (PCR) seqüên-
cia-específica
5p-Talassemia
A deleção dos genes 5 e p resulta em Ô p - t a l a s s e m i a com ambas
as condições, heterozigota e homozigota, descritas. A doença é
encontrada em vários grupos étnicos, mas é mais prevalente em
países d o M e d i t e r r â n e o Oriental, especialmente Grécia e Itália
A análise da C B C mostra h e m o g l o b i n a reduzida (80 a 13.5 g/L)
c o m M C V e M C H nos limites inferiores ou ligeiramente dimi-
nuídos. A análise por H P L C mostra um pico de H b A com u m a
concentração de H b A i reduzida e concentração de HbF aumen-
tada. Entretanto, n o tipo Sardo da ÔP-talassemia, existem índices
talassêmicos na C B C ( M C V e M C H baixos, R D W normal) com
u m a concentração de H b A z n o r m a l e uma concentração de H b F
entre 15% e 2 0 % .
Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal
O t e r m o persistência hereditária de hemoglobina fetal (HPFH) é
u s a d o para descrever u m grupo de condições genéticas nas quais
a concentração de H b F está a u m e n t a d a acima do intervalo de
referência com u m a redução da síntese de P-globina e um
a u m e n t o compensatório da síntese de y-globina. Duas classes
principais de H P F H têm sido descritas, heterocelular e delecional.
Diversas variantes delecionais de H P F H têm sido descritas,
incluindo as variantes (1) Grega, (2) Indiana, (3) Italiana, (4) Corfu
e (5) Negra. Nessas variantes de HPFFÍ delecionais, a concentração
de H b F pode estar tão alta q u a n t o 36%.
A H P F H n ã o delecional, algumas vezes chamada H P F H hete-
rocelular, descreve u m g r u p o de doenças nas quais o a u m e n t o de
H b F é distribuído h e t e r o g e n e a m e n t e entre as células vermelhas
de indivíduos h e m a t o l o g i c a m e n t e normais. A concentração de
H b F varia entre 1% e 13% da hemoglobina total em heterozigo-
tos e entre 19% e 21% em homozigotos
Hemoglobínopatias
Mais de 900 hemoglobínopatias têm sido descritas ( h t t p : / /
globin.cse.psu edu); entretanto, s o m e n t e poucas têm importân-
cia clínica A identificação de variantes de h e m o g l o b i n a em áreas
que a n t e r i o r m e n t e t i n h a m baixa incidência (Europa Setentrio-
nal, América d o Sul e C a n a d á ) tem a u m e n t a d o nos últimos anos
devido à imigração a partir de áreas de alta incidência d e hemo-
globinopatias (Africa, Sudeste da Ásia).
Nomenclatura
As variantes de h e m o g l o b i n a têm sido n o m e a d a s com o uso de
letras (S, C, D, E), n o m e familiar do caso-índice (Hb Lepore), o
lugar de descoberta da variante, ou a cidade natal ou o rio que
passa pela cidade do p r o b a n d o . Em alguns casos, são usados a
letra e o n o m e secundário, por exemplo, H b G Cousha t t a , indi-
c a n d o que a variante tem mobilidade eletroforética similar a
outras hemoglobinas Gs e q u e a variante foi originalmente
e n c o n t r a d a n a tribo indígena C o u s h a t t a n o Sul dos Estados
U n i d o s . O termo traço A S (algumas vezes abreviado c o m o traço
S) é usado para descrever a heterozigose de HbS, e o t e r m o SS,
para descrever a homozigose d e H b S A homozigose de H b S é
conhecida como a n e m i a f a l c i f o r m e ou doença falciforme, por
causa das células e m forma de foice que aparecem n o sangue de
indivíduos afetados
U m sistema de n o m e n c l a t u r a sistemática é agora usado para-
lelamente ao n o m e da variante para descrever (I) a cadeia afetada,
(2) a localização da cadeia e (3) a substituição d o aminoácido.
C o m o exemplo, a H b Spanish T o w n (a27[B8] ulu_>Val ) é u m a
variante de hemoglobina n o m e a d a com o n o m e de um distrito
em Kingston, Jamaica, e e n c o n t r a d a e m jamaicanos de descen-
dência africana. Origina-se de u m a substituição de ácido glutâ-
mico p o r valina n a posição 27 da cadeia de a-globina, que está
localizada na posição 8 da hélice B da cadeia a
Classificação das Variantes de Hemoglobina
As variantes de h e m o g l o b i n a são classificadas de acordo com o
tipo de mutação. As m u t a ç õ e s p o n t u a i s em u m a cadeia de
globina causam a substituição d e u m resíduo de a m i n o á c i d o [p.
ex., H b San Diego ( p 109ÍG1 lJVal—>Met)l. A hemoglobina C
H a r l e m é um exemplo de u m a variante de hemoglobina na qual
dois resíduos de aminoácidos são substituídos, ou seja, valina
substituindo ácido glutâmico na posição 6 e asparagina substi-
t u i n d o ácido aspártico na posição 73 da cadeia p .
As variantes delecionais de h e m o g l o b i n a surgem da deleção de
1 a 5 resíduos de aminoácidos na cadeia de globina. As hemoglo-
binas de inserção surgem de u m a inserção de 1 a 3 resíduos de
aminoácidos na cadeia d e globina As hemoglobinas de deleção/
inserção surgem da deleção de u m a parte da seqüência normal de
resíduos de aminoácidos e da inserção de outra seqüência, com
resultante alongamento ou e n c u r t a m e n t o da cadeia de globina.
As hemoglobinas de alongamento resultam de u m a mutação da
único par de bases ou frameshift ( m u d a n ç a n o q u a d r o de leitura)
na extremidade 3' do éxon 3 ou na extremidade 5' do éxon 1 da
cadeia de a L >- ou de p - g l o b i n a As hemoglobinas híbridas/de fusão/
cruzadas resultam da fusão da cadeia de a - ou p - g l o b i n a com u m a
porção de u m a outra cadeia de globina.
Metodologia Analítica
A hemoglobina e os compostos relacionados são dosados por
vários tipos diferentes de métodos. A l é m disso, diversas tecnolo-
gias f o r n e c e m informação que levam ao diagnóstico de talasse-
mias e hemoglobínopatias. Os m é t o d o s usados para esse fim são
divididos naqueles que (1) f o r n e c e m u m a provável identificação
e (2) f o r n e c e m u m a identificação definitiva. Exemplos de testes
que f o r n e c e m provável identificação são C B C , H P L C e eletrofo-
rese, S e q ü e n c i a m e n t o de D N A ou espectroscopia de massa for-
necem informação definitiva. A amostra preferível para a inves-
tigação de hemoglobinas e talassemias é u m a amostra fresca ce
sangue em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), u m antico-
agulante. O a r m a z e n a m e n t o p o r mais de 5 dias a 4 °C pode
c o m p r o m e t e r a integridade da amostra.
Dosagem de Hemoglobina no Sangue Total
A dosagem da concentração de hemoglobina n o sangue venoso
ou capilar é n o r m a l m e n t e realizada usando-se o m é t o d o da cia-
n o m e t e m o g l o b i n a . O princípio do m é t o d o é baseado na oxida-
ção d o Fe2" da h e m o g l o b i n a a Fe 1+ da metemoglobina pelo ferri-
cianeto, com a metemoglobina, então, convertida em cianomete-
moglobina estável pela adição de cianeto de potássio (KCN)-
 Hemoglobina, Ferro e Bilirrubina
H t F e 2 + + FeU(CN)t HbFeu + Fe 2+ (CN) 6 4 "
HbFe"+ + CN~ -> HbFeuCN
o n d e HbFe 2 + r e p r e s e n t a u m m o n ô m e r o de h e m o g l o b i n a , H b F e 1 - ,
u m m o n ô m e r o de m e t e m o g l o b i n a , e H b F e ^ 1 C N , u m m o n ô m e r o
de c i a n o m e t e m o g l o b i n a . A a b s o r v â n c i a d a c i a n o m e t e m o g l o b i n a
é m e d i d a a 540 n m e usada para calcular a c o n c e n t r a ç ã o de
hemoglobina.
Contagem Sanguínea Completa
A C B C p o d e f o r n e c e r a p r i m e i r a indicação de u m a talassemia
o u h e m o g l o b i n o p a t i a , e é essencial realizar u m a C B C c o m o
p a r t e de q u a l q u e r investigação de h e m o g l o b i n o p a t i a s e talasse-
mias. E m talassemias, o M C V e a M C H estão abaixo d o i n t e r v a l o
de referência. A h e m o g l o b i n a p o d e estar abaixo ou d e n t r o d o
i n t e r v a l o de referência. A l g u m a s vezes, o M C V está m u i t o baixo,
c o m a c o n t a g e m de R B C na m e t a d e s u p e r i o r ou a c i m a d o inter-
valo d e referência. O R D W está d e n t r o d o i n t e r v a l o d e referência
o u l e v e m e n t e acima dele. O esfregaço d e s a n g u e p o d e m o s t r a r
u m p a d r ã o microcítico e h i p o c r ô m i c o . N a s h e m o g l o b i n o p a t i a s ,
a C B C m u i t o f r e q ü e n t e m e n t e está n o r m a l . N o esfregaço de
s a n g u e periférico, p o d e m ser o b s e r v a d a s variações q u e estão asso-
ciadas a u m a v a r i a n t e d e h e m o g l o b i n a e m particular, c o m o a
p r e s e n ç a de células falciformes n a d o e n ç a f a l c i f o r m e ( H b S e m
h o m o z i g o s e ) ou células-alvo n a h o m o z i g o s e de H b E .
Várias f ó r m u l a s derivadas de p a r â m e t r o s na C B C têm sido
r e c o m e n d a d a s para d e t e r m i n a r se o p a c i e n t e tem talassemia. U m
e s t u d o p r o p õ e q u e u m M C V m e n o r d o q u e 72 fL (intervalo de
referência ~ 8 0 - 1 0 0 fL) 1 ' é sugestivo de talassemia e q u e esse
p a r â m e t r o s o z i n h o é o m e l h o r d i s c r i m i n a d o r de talassemia. O
índice d e M e n t z e r (Ml) rem sido p r o p o s t o c o m o u m p a r â m e t r o
d e r a s t r e a m e n t o para a p-talassemia 9 , c o m valores m e n o r e s ou
iguais a 1 4 , 6 9 indicativos de talassemia. O M I t a m b é m t e m sido
u s a d o para o r a s t r e a m e n t o de a-talassemia. O f a t o r d i s c r i m i n a n t e
(DF) t e m sido sugerido c o m o u m cálculo de r a s t r e a m e n t o para
d i s c r i m i n a r deficiência de f e r r o e talassemia.
RDW
Fator d i s c r i m i n a n t e (DF) = ( M C V x M C V ) x x 100
Hb
U m D F < 65 está associado à talassemia, e valores > 7 5 estão
associados à deficiência de ferro. Valores e n t r e 65 e 75 são clas-
sificados c o m o d u v i d o s o s e p o d e m indicar deficiência de ferro
c o m b i n a d a com u m a talassemia s u b j a c e n t e
O s p a r â m e t r o s de C B C e cálculos associados o u o esfregaço
de s a n g u e periférico, e n t r e t a n t o , são incapazes de f o r n e c e r o diag-
nóstico definitivo de talassemia ou h e m o g l o b i n o p a t i a s . E t a m b é m
crucial c o n h e c e r o estado de ferro d o p a c i e n t e já q u e a deficiência
de ferro mimetiza ou ameniza as características de u m a talassemia
s u b j a c e n t e E m b o r a a ferritina seja o e x a m e mais p o p u l a r para a
d e t e r m i n a ç ã o d o estado de ferro, ela tem limitações.
Eletroforese
O teste inicial mais c o m u m para o r a s t r e a m e n t o d e h e m o g l o b i -
n o p a t i a o u talassemia é a eletroforese u s a n d o gel d e agarose e u m
t a m p ã o barbital de p H 9,2. E m b o r a esse m é t o d o seja c o m u m e n t e
u s a d o , ele t e m várias limitações. P r i m e i r o , a H b A 2 n ã o p o d e ser
q u a n t i f i c a d a com precisão, e, s e g u n d o , m u i t a s variantes de h e m o -
g l o b i n a m i g r a m a lima m e s m a velocidade, d i f i c u l t a n d o a identi-
ficação. A p ó s a eletroforese (Figura 28-4), as h e m o g l o b i n a s são
visualizadas usando-se P o n c e a u S (coloração a v e r m e l h a d a ) ou
p r e f e r e n c i a l m e n t e A m i d o Black (coloração azul-escura a preta).
CAPÍTULO 2 8 529
I l l
s m s
1 1
1 1
i
B I
N
»
I
M I t
I I I
Figura 2 8 - 4 Eletroforese alcalina e ácida de várias
hemoglobinopatias. Linha 1, H b S, H b FA controle; Linha 2, HB S, H b
F, H b C A controle; Linha 3, doença S C transfundida; Linha 4, doença
SC; Linha 5, H b A (normal); Linha 6, H b Presbyterian; Linha 7, H b S;
Linha 8, H b Ai aumentada (traço p-talassêmico), Linha 9, Hb J
Baltimore, Linha 10, H b C.
As variações d e técnicas eletroforéticas q u e t ê m sido u s a d a s
n a identificação de v a r i a n t e s de h e m o g l o b i n a i n c l u e m eletrofo-
rese p o r focalização isoelétrica e p o r focalização isoelétnca capilar
( C a p í t u l o 6).
Essas técnicas, e m b o r a a p r e s e n t e m m e l h o r resolução d o q u e
eletroforese em gel e m d i f e r e n t e s p H s , são t e c n i c a m e n t e difíceis
de se realizar e t ê m u m baixo r e n d i m e n t o . C o n s e q ü e n t e m e n t e ,
a H P L C é mais a m p l a m e n t e u s a d a já que é mais simples e f o r n e c e
resultados equivalentes aos d a m a i o r i a das complexas técnicas
eletroforéticas.
HPLC
A H P L C , u s a n d o u m a c o l u n a e m p a c o t a d a c o m resina t r o c a d o r a
de cátions, f o r n e c e e m u m a ú n i c a análise a q u a n t i f i c a ç ã o d e
H b A 2 e H b F , e u m a i d e n t i f i c a ç ã o micial de q u a l q u e r v a r i a n t e
de h e m o g l o b i n a p r e s e n t e (Figura 28-2). T ê m sido p u b l i c a d a s
listas extensas d e t e m p o s de r e t e n ç ã o de variantes de hemoglo-
b i n a t a n t o e m m é t o d o s comerciais c o m o n o s desenvolvidos e m
laboratório. 1 1 ' 1 9 As v a n t a g e n s da H P L C sobre a eletroforese são
(1) resolução s u p e r i o r de variantes de h e m o g l o b i n a , (2) t e m p o d e
ensaio r á p i d o e (3) q u a n t i f i c a ç ã o a c u r a d a de frações de hemoglo-
bina, incluindo H b A z e H b F
Espectroscopia de Massa por Eletrospray
(Ele tropulveríza ção)
A espectroscopia de m a s s a p o r eletrospray t o r n o u - s e o m e l h o r
m é t o d o n a escolha para a caracterização de variantes de h e m o -
globina e a d u t o s de h e m o g l o b i n a . Esta técnica estabelece m u i t o
r a p i d a m e n t e (1) se a v a r i a n t e é u m a v a r i a n t e de cadeia a ou fS,
(2) a localização e a i d e n t i d a d e da s u b s t i t u i ç ã o d o r e s í d u o d e
a m i n o á c i d o e (3) a q u a n t i d a d e d e v a r i a n t e presente. Ela neces-
sita, e n t r e t a n t o , d e várias etapas preparativas e e s p e c t r ó m e t r o s d e
massa caros.
Análise de DNA
A principal f u n ç ã o da análise de D N A n a investigação de h e m o -
g l o b i n o p a t i a s e talassemias é identificar, nas p o p u l a ç õ e s c o m
u m a alta incidência c o n h e c i d a da d o e n ç a , aqueles i n d i v í d u o s
específicos s o b risco e q u e p o d e m beneficiaT-se de aconselha-
530 PARTE IV Analitos

m e n t o genético. O s usos de análises d e D N A para esse p r o p ó s i t o s ã m e n t e seu s u p r i m e n t o de ferro, de tal f o r m a q u e m e n o s de

estão listados n o Q u a d r o 28-1
Testes para Hemoglobinas Variantes Específicas
Teste de Solubilidade de HbS
A h e m o g l o b i n a S, q u a n d o desoxigenada, é insolúvel e m t a m p ã o
fosfato c o n c e n t r a d o e produz turbidez visível. Q u a s e todas as
oiitras^hemoglobinas, incluindo as h e m o g l o b i n a s A, F, C , E e D,
são solúveis e m tais soluções. Portanto, esse teste r a p i d a m e n t e
identifica amostras de sangue que c o n t ê m H b S . TJma substância
redutora, hidrossulfito de sódio (Na2S20 4 , ditionita de sódio), é
usada para desoxigenar a h e m o g l o b i n a , e a s a p o n i n a é usada para
lisar as R B C s . A turbidez a u m e n t a d a e m u m a amostra com H b S
é n o t a d a pela visualização de u m cartão impresso (Figura 28-5)
através da amostra tratada, com u m decréscimo n a clareza do
cartão impresso i n d i c a n d o a presença de HbS. Resultados falso-
positivos são e n c o n t r a d o s e m amostras c o m (1) c o r p o s de Heinz,
(2) altas c o n c e n tr a ç õ e s de proteína m o n o c l o n a l ou (3) aglutininas
frias. R e s u l t a d o s falso-negativos são obtidos e m pacientes anêmicos
( h e m o g l o b i n a < 8 0 g/L) o u e m amostras c o m u m hematócrito
m e n o r d o q u e 15%. O u t r a s variantes de h e m o g l o b i n a , i n c l u i n d o
H b C H a r l e m , H b M e m p h i s e H b C Ziguinchor, t a m b é m dão resul-
tados falso-positivos. A interpretação d o teste é m u i t o subjetiva.
0 , 1 % d o c o n t e ú d o d e ferro c o r p o r a l é p e r d i d o d i a r i a m e n t e , prin-
c i p a l m e n t e nas células d e s c a m a d a s .
Distribuição do Ferro no Corpo
O ferro corporal é d i s t r i b u í d o e m vários c o m p a r t i m e n t o s dife-
rentes q u e i n c l u e m (1) h e m o g l o b i n a , (2) ferro a r m a z e n a d o ,
(3) ferro tecidual, (4) mioglobina e (5) pool lábil. A q u a n t i d a d e m é d i a
de ferro nesses compartimentos está resumida na Tabela 28-1.
Hemoglobina
U m mililitro de eritrócitos c o n t é m 1 mg d e ferro. E m u m h o m e m
de 70 kg, a massa d e R B C é cerca de 2 L, c o n t e n d o , p o r t a n t o ,
cerca de 2 g de ferro da h e m o g l o b i n a .
Armazenamento de Ferro
O ferro é a r m a z e n a d o na f o r m a de ferritina e de h e m o s s i d e r i n a .
Ferritina
A f e r r i t i n a consiste e m u m a c o n c h a proteica c i r c u n d a n d o um
núcleo d e ferro, e n q u a n t o a h e m o s s i d e r i n a é f o r m a d a q u a n d o a

Teste de HbH
A H b H , p 4 , é u m t e t r â m e r o insolúvel e n c o n t r a d o e m pacientes
com a-talassemia. Inclusões p o n t i l h a d a s de H b H , n o r m a l m e n t e
descritas c o m o s e m e l h a n t e s a "bolas de golfe", são e n c o n t r a d a s
nas R B C s dc u m esfregaço d e sangue periférico de u m paciente
c o m a-talassemia t r a t a d o c o m azul d e m e t i l e n o ou azul de cresil
b r i l h a n t e a 3 7 ° C . O m é t o d o é trabalhoso e m u i t o subjetivo.
M u i t a s dessas inclusões estão presentes e m i n d i v í d u o s c o m
d o e n ç a d e H b H , e n q u a n t o células c o n t e n d o inclusões são raras
entre i n d i v í d u o s com traço talassemico.

Testes para Hemoglobinas Instáveis

O t r a t a m e n t o da a m o s t r a d e sangue c o m a q u e c i m e n t o a 5 5 ° C a
6 0 ° C o u c o m i s o p r o p a n o l é u s a d o para detectar a presença de
h e m o g l o b i n a s instáveis. Por exemplo, as h e m o g l o b i n a s instáveis
precipitam sob essas condições e são detectadas p o r u m a u m e n t o
da turbidez o u pela precipitação incompleta da amostra após tra-
t a m e n t o . A H b A n o r m a l leva cerca de 4 0 m i n u t o s para precipitar,
mas as h e m o g l o b i n a s instáveis precipitam e m 3 a 4 m i n u t o s .

FERRO Figura 2 8 - 5 Teste de solubilidade da Hb S. A desoxiemoglobma S

N o r m a l m e n t e , q u a n t i d a d e s m u i t o p e q u e n a s de f e r r o estão pre-
(tubo da esquerda) é insolúvel em t a m p ã o fosfato 2,.3 m o l / L . A o
sentes na m a i o r i a das células do c o r p o , n o plasma e e m outros
contrário, o h e m o l i s a d o n o r m a l (iubo da direita) é t r a n s p a r e n t e o
f l u i d o s extracelulares. Fisiologicamente, o c o r p o c o n s e r v a rigoro-
suficiente para q u e o i m p r e s s o seja f a c i l m e n t e lido através dele.

QUADRO 28-1 Utilizaçao da Análise d e DNA p a r a Investigar

TABELA 2 8 - 1 | Conteúdo Médio de Ferro dos
Hemoglobínopatias e Talassemias
Compartimentos de um Homem Médio de 70 kg12
Diagnosticar e caracterizar adalassemias. Compartimento Conteúdo de Ferro Total de Ferro no Corpo
Investigar distúrbios potencialmente fatais da síntese de hemoglobina no teto;
é realizada antes de 10 semanas de gestação em amostras de vilcsidaties Ferro da hemoglobina 2.000 67
coricnicas. Ferro de armazenamento 1.000 27
Caracterizar o genótipo de p-talassemia. (ferritina, hemossiderina)
Rastrear populações em risco para variantes de hemoglobina clinicamente Ferro da mioglobina 130 3,5
significantes Poo! lábil 80 2,2
Distinguir condições que têm apresentações clínicas e laboratoriais similares, Outro ferro tecidual 8 0,2
mas são devidas a condições genéticas diferentes. Ferro de transporte 3 0,08

f e r r i t i n a é q u e b r a d a n o s Iisossomos s e c u n d á r i o s . A hemosside-
rina, p o r t a n t o , parece r e p r e s e n t a r o p o n t o final d a via d e arma-
z e n a m e n t o intracelular d o f e r r o A f e r r i t i n a consiste e m u m a
c o n c h a de a p o f e r r i t i n a c o m p o s t a de 24 s u b u n i d a d e s , as quais são
cadeias d e ferritina L (leve) ou H (pesada) e u m n ú c l e o cristalino
i n t e r n o d e oxiidróxido férrico ( F e O O H ) x (Figura 28-6).
A ferritina é e n c o n t r a d a e m quase todas as células d o c o r p o .
N o s h e p a t ó c i t o s d o fígado e e m macrófagos, a f e r r i t i n a f o r n e c e
u m a reserva d e f e r r o p r o n t a m e n t e disponível p a r a a f o r m a ç ã o de
h e m o g l o b i n a e outras h e m e p r o t e í n a s . É a r m a z e n a d a d e f o r m a
q u e o ferro fica p r o t e g i d o dos f l u i d o s c o r p o r a i s e é incapaz de
p r o d u z i r d a n o oxidativo, o q u e p o d e r i a ocorrer caso ele estivesse
n a f o r m a iônica. N o s h o m e n s , a q u a n t i d a d e d e ferro a r m a z e n a d o
é a p r o x i m a d a m e n t e 8 0 0 mg, p r i n c i p a l m e n t e c o m o ferritina; e m
m u l h e r e s saudáveis, ela é de cerca de 2 0 0 mg. P e q u e n a s quanti-
d a d e s de f e r r i t i n a t a m b é m estão presentes n o soro em concentra-
ções a p r o x i m a d a m e n t e proporcionais ao a r m a z e n a m e n t o de ferro
corporal total. Lesão hepática e u m g r a n d e n ú m e r o de processos
patológicos resultam n a liberação de q u a n t i d a d e s relativamente
grandes de ferritina n o plasma.
Hemossiderina
A h e m o s s i d e r i n a é u m a ferritina agregada, p a r c i a l m e n t e despro-
teinizada. A o c o n t r á r i o da ferritina, a h e m o s s i d e r i n a é insolúvel
H24L0
Células HeLa
Músculo
Timo
Células vermelhas
do sangua
Cérebro
Coração
/ ^ ' V. X \
" • C o
Linfócitos
Figado
Baço
Soro
H0L24
•v_ys
Figura 2 8 - 6 Representação esquemática da estrutura de
s u b u n i d a d e s de ferritinas de vários tecidos. (De Harrison PM, Arosio P.
T h e ferritins: molecular properties, iron storage f u n c t i o n a n d cellular
regulation. Biochim Biophys Acta 1996; 1275-161-203 )
Hemoglobina, Ferro e Bilirrubíria CAPÍTULO 2 8 531
e m soluções aquosas. C o m o a ferritina, a h e m o s s i d e r i n a n o r m a l -
m e n t e é e n c o n t r a d a p r e d o m i n a n t e m e n t e e m células d o fígado,
b a ç o e m e d u l a óssea.
Ferro Tecidual
N u m e r o s a s enzimas e c o e n z i m a s celulares n e c e s s i t a m de ferro,
c o m o u m a p a r t e integral da m o l é c u l a ou c o m o u m co-fator.
Notáveis são as peroxidases e os cito cromos que, c o m o a h e m o g l o -
b i n a , são h e m e p r o t e í n a s . O u t r a s enzimas, c o m o a aconitase e a
ferredoxina, c o n t ê m ferro q u e está c o o r d e n a d o c o m o e n x o f r e e m
u m clusfer ( a g r u p a m e n t o ) ferro-enxofre. Essas enzimas e coenzi-
mas, q u e a p a r e c e m e m t o d a s as células n u c l e a d a s d o c o r p o , são
d e n o m i n a d a s c o l e t i v a m e n t e compartimento de ferro teci dual, nor-
malmente correspondendo a aproximadamente 8 mg
Mioglobina
A m i o g l o b i n a assemelha-se m u i t o a u m a ú n i c a s u b u n i d a d e de
h e m o g l o b i n a , c o n t e n d o u m ú n i c o h e m e p o r molécula.
O Pool Lábil de Ferro
A p r o x i m a d a m e n t e 80 m g de f e r r o são e n c o n t r a d o s n o pool lábil.
Esse c o m p a r t i m e n t o n ã o tem localização a n a t ô m i c a clara; n a
verdade, ele é u m c o n c e i t o d e r i v a d o de m e d i d a s cinéticas c o m
ferro m a r c a d o r a d i o a t i v a m e n t e . 1 6
Transporte d e Ferro
O ferro é t r a n s p o r t a d o d e u m órgão a o u t r o p o r u m a p r o t e í n a
plasmática de t r a n s p o r t e d e ferro, apotransferrina. O c o m p l e x o
apotransferrina-Fe 1 ' é c h a m a d o transferrina. N o r m a l m e n t e j h á
u m total de a p r o x i m a d a m e n t e 2,5 m g de ferro n o plasma.
Q u a n d o a t r a n s f e r r i n a se liga ao receptor de transferrina nas células,
o c o m p l e x o t r a n s f e r r i n a / r e c e p t o r é i n t e r n a l i z a d o e m u m endos-
s o m o . Ele, e n t ã o , se t o r n a acidificado, l i b e r a n d o o ferro p o r sua
transferência e r e d u ç ã o a íon ferroso (Fe 2 í ), q u e é depois trans-
p o r t a d o n a célula através d o t r a n s p o r t a d o r d e metais divalentes,
o D M T 1 . A a p o t r a n s f e r r i n a éj e n t ã o , t r a n s p o r t a d a de volta para
a superfície celular, p r o n t a p a r a t r a n s p o r t a r u m a o u t r a m o l é c u l a
d e t r a n s f e r r i n a para o i n t e r i o r d a célula. Essa série de reações t e m
sido d e n o m i n a d a ciclo da transferrirux.
R e g u l a ç ã o da H o m e o s t a s e do Ferro
A q u a n t i d a d e de ferro p e r d i d a d o c o r p o d e p e n d e a p e n a s m i n i m a -
m e n t e da carga d e ferro. A regulação d o c o n t e ú d o de ferro cor-
poral é, p o r t a n t o , alcançada quase i n t e i r a m e n t e pela m o d u l a ç ã o
d a q u a n t i d a d e de ferro a b s o r v i d o d o trato intestinal superior.
Balanço de Ferro Normal
A regulação d o c o n t e ú d o d e ferro c o r p o r a l é alcançada quase q u e
c o m p l e t a m e n t e pela m o d u l a ç ã o d a q u a n t i d a d e d e ferro a b s o r v i d o
do trato intestinal superior. A dieta americana média fornece 10 a
15 m g de ferro diariamente, em grande parte em forma de (1) heme-
proteínas, (2) h e m o g l o b i n a e (3) mioglobina da carne. Normal-
m e n t e , cerca d e i m g de ferro é absorvido a cada dia, principalmence
n o d u o d e n o . O h e m e é absorvido, diretamente c o m o tal, através de
u m receptor específico. 12 Para ser absorvido, o ferro inorgânico deve
estar n o estado ferroso (Fe2+).
Proteínas que Afetam a Homeostase do Ferro
Várias p r o t e í n a s d e s e m p e n h a m u m a f u n ç ã o na h o m e o s t a s e d o
ferro. M u t a ç õ e s nessas p r o t e í n a s e m h u m a n o s e / o u suas inter-
r u p ç õ e s d i r e c i o n a d a s o u s u p e r p r o d u ç ã o e m ratos r e s u l t a m e m
/ sobrecarga ou deficiência de ferro. A Tabela 28-2 r e s u m e os
efeitos de a l g u m a s dessas p r o t e í n a s n a h o m e o s t a s e d o ferro. A
532 PARTE IV Analitos

TABELA 2 8 - 2 Proteínas que Afetam a Homeostase de Ferro

Proteína Efeito da Deficiência Suposta Função Comentários

HFE Fe aumentado Pode transmitir sinal que estimula a hepicidina A maioria dos pacientes ccm
hemocromatose hereditária é
homozigota para a mutação
845 A ^ G (C282Y) nesse gene
p-microglobina Fe aumentado Transporta HFE para a membrana
Transferrina Fe aumentado Transporta ferro no plasma
Receptor de transferrina-1 Letal, Fe de CNS aumentado Liga e internaliza a transferrina na membrana
Receptor de transferrina-2 Fe aumentado Pode transmitir sinal que estimula a
hepicidina
Ferroportina (SLC11A3] Fe aumentada Uma proteína transmembrana de transporte Herança dominante de sobrecarga de
de ferre que atua como receptor de ferro
hepicidina
Hefaestina Deficiência de Fe Oxida o íon ferroso a íon férrico na membrana Codificada por um gene ligado ao
intestinal luminal sexo. A deleção é a causa de
camundongos s/a
DMT1 Deficiência de Fe em roedores; Transporta íon terroso através das As mutações de ocorrência natural
sobrecarga de ferro em membranas encontradas no camundongo mke
humanos no rato Belgrade são as mesmas
Ceruloplasmina Fe aumentado Oxida ien ferrosa a íon férrico no plasma Acúmulo no cérebro e doença
neurológica
Hepicidina Fe aumentado Bloqueia o transporte de ferro pela ferroportina
Steap3 Deficiência de Fe Reduz o ferro no endossemo.

função exata d e cada uma dessas proteínas, entretanto, não é
c o m p l e t a m e n t e entendida.
I m p o r t â n c i a Clínica
A deficiência e m ferro e a sobrecarga de ferro são os principais
distúrbios d o metabolismo do ferro. Existem, além dessas, muitas
doenças em q u e a distribuição anormal de ferro pode ter uma
função primária o u secundária. A s últimas incluem doenças
c o m o (1) hiperferritinemia c o m catarata, (2) aceruloplasmine-
mia, (3) síndrome G R A C I L E (retaido do crescimento, aminoaci-
dúria, colestase, sobrecarga de feiro, lactacidose e morte precoce),
(4) neuroferritínopatia, (5) atransferrinemia e, possivelmente,
(6) doenças neurodegenerativas, tais c o m o parkinsonismo, sín-
drome de Hallervorden-Spatz e doença de Alzheimer.
Deficiência de Ferro
A deficiência de ferro é a doença mais prevalente em h u m a n o s .
E particularmente uma doença de (1) crianças, (2) mulheres
jovens e (3) pessoas mais velhas, mas ocorre em pessoas de todas
as idades e classes sociais. Em crianças, ela é freqüentemente
devida à deficiência na dieta porque o leite contém baixo teor de
ferro. Em adultos, ela é quase sempre resultado de perda crônica
de sangue o u parto.' 3
Muitas medições diferentes têm sido preconizadas para o diag-
nóstico de deficiência de ferro. Originalmente, ênfase foi dada aos
índices de RBC. A anemia hipocrômica era geralmente conside-
rada u m s i n ô n i m o de deficiência de ferro na primeira metade do
século XX. Mais tarde, (1) a coloração da medula paTa identificação
de ferro, e as dosagens de (2) ferro sérico, (3) capacidade de ligação
de ferro, (4) ferritina sérica e (5) protoporfirina n o eritrócito se
tornaram úteis e são usadas e estudadas amplamente por suas
capacidades de diagnosticar a deficiência de ferro. Tem sido obser-
vado, também, que valores de receptor de transferrina circulante
e de hemoglobina no reticulõcito têm utilidade diagnostica.
Embora a maioria dos métodos identifique muito pronta-
m e n t e a deficiência de ferro grave e não complicada, o grande
n ú m e r o de exames que tem sido preconizado para o diagnóstico
de deficiência de ferro é um reflexo do fato que n e n h u m deles
sozinho é suficiente para detectai a deficiência de ferro moderada
o u a deficiência de ferro e m uma circunstância clinicamente
complexa. N ã o existe u m m é t o d o melhor e vários estudos diferem
nas conclusões obtidas com relação às vantagens de u m m é t o d o
sobre o outro. 3
Sobrecarga de Ferro
O s termos sobrepostos hemossiderose e hemocromatose são con-
dições associadas à sobrecarga de ferro.
Hemossiderose
H e m o s s i d e r o s e é u m termo usado para indicar sobrecarga de
ferro sem lesão tecidual associada. Ela ocorre localmente e m sítios
de hemorragia ou inflamação e pode ser generalizada e m pessoas
às quais tenha sido dada grande quantidade de ferro, c o m o medi-
cação ou c o m o transfusões d e sangue.
Hemocromatose
A h e m o c r o m a t o s e é uma doença na qual o corpo acumula quan-
tidades excessivas de ferro. O s sintomas dc hemocromatose
incluem a "tríade clássica" de (1) bronzeamento da pele, (2) cirrose
e (3) diabetes. Outras manifestações incluem ca rd io mi opa tias e
arritmias, deficiências endócrinas e possíveis artropatias.
A hemocromatose secundária é a conseqüência da adminis-
tração aumentada de ferro na forma de transfusões de sangue
freqüentemente acompanhada pela absorção excessiva de ferro
da dieta. As causas mais c o m u n s de hemocromatose secundária
são a talassemia major e os estados mielodisplásicos adquiridos,
mas existem muitas doenças raras nas quais ocorre a sobrecarga
de ferro secundária.
A o contrário da h e m o c r o m a t o s e secundária, a hemocromatose
hereditária resulta de anormalidades herdadas de proteínas que
regulam a homeostase do ferro. N o s últimos anos recentes, as
 Hemoglobina, Ferro e Bilirrubina
lesões genéticas responsáveis p o r m u i t a s f o r m a s d a d o e n ç a t ê m
sido descobertas.
Hemocromstose Primária. Ahemocromatose hereditária é a d o e n ç a
clássica de sobrecarga d e ferro. Cerca de 10% a 15% dos norte-
e u r o p e u s são heterozigotos p a r a u m a m u t a ç ã o d o gene HFE,
c . 8 4 5 G > A (C282Y) e, p o r t a n t o , a p r o x i m a d a m e n t e 5 / 1 . 0 0 0 são
homozigotos. O p r o d u t o gênico H F E parece ser necessário p a r a
que a h e p i c i d i n a seja f o r m a d a c o m o u m a resposta à sobrecarga
d e ferro, mas os m e c a n i s m o s exatos pelos quais isso ocorre n ã o
são c o n h e c i d o s . A p e n e t r â n c i a b i o q u í m i c a d o estado h o m o z i g o t o
para a m u t a ç ã o p r i n c i p a l (C282Y) é b a s t a n t e elevada. Mais de
5 0 % de tais i n d i v í d u o s têm saturações d a t r a n s f e n i n a e / o u con-
centrações de ferritina elevadas 4 , e cerca d e 10% têm atividades
d e t r a n s a m i n a s e s g l u t â m i c o oxalacético séricas elevadas. Primeira-
m e n t e , pensava-se q u e m u i t o s o u que a m a i o r i a dos h o m o z i g o t o s
fossem s e r i a m e n t e afetados, 1 8 m a s agora se sabe que a p e n e t r â n c i a
clínica d o estado h o m o z i g o t o é m u i t o baixa, provavelmente d a
o r d e m d e 1%. 5 R a r a m e n t e a h e m o c r o m a t o s e hereditária resulta
d e m u t a ç õ e s n o gene d o receptor de transferrina 2.
A hemocromatose juveni! é u m a d o e n ç a h e r d a d a r a r a q u e se
a s s e m e l h a c l i n i c a m e n t e à h e m o c r o m a t o s e hereditária, m a s q u e
t e m u m a m é d i a de i d a d e de início m u i t o .mais precoce e u m a
t e n d ê n c i a m a i o r ao d e s e n v o l v i m e n t o d e m a n i f e s t a ç õ e s endócri-
nas e cardíacas d o q u e a h e m o c r o m a t o s e hereditária. A m u t a ç ã o
n ã o é n o gene HFE, mas n o g e n e q u e codifica a h e m o j u v e l i n a
ou n o q u e codifica a h e p i c i d i n a . 2 0
A f o r m a d o m i n a n t e m e n t e h e r d a d a de d o e n ç a d e armazena-
m e n t o d o ferro resulta d e m u t a ç õ e s n a f e r r o p o r t i n a (SLC11A3).
Nesse caso, o a r m a z e n a m e n t o d e ferro f r e q ü e n t e m e n t e o c o r r e
principalmente nos macrófagos, não n o parênquima hepático. O
a c ú m u l o de ferro p a r e c e ser m a i s c o m u m e m a f r i c a n o s d o q u e
e m e u r o p e u s . E m b o t a a d i e t a possa ter u m p a p e l p r i n c i p a l , acre-
dita-se q u e exista, t a m b é m , u m a p r e d i s p o s i ç ã o genética q u e p o d e
ser responsável p e l o a u m e n t o d a carga d o ferro, e u m polimor-
f i s m o que parece ser u m fator d e risco t e m sido i d e n t i f i c a d o e n t r e
africanos/0
Hemocromatose Secundária. A causa mais c o m u m de sobre-
carga de ferro s e c u n d á r i a é a P-talassemia. As anemias sideroblásti-
cas são u m g r u p o d e d i s t ú r b i o s de carga d e ferro, m u i t o s dos
quais são d e causa d e s c o n h e c i d a . E m u m tipo h e r e d i t á r i o dessa
d o e n ç a , h á a deficiência d e ácido 5 - a m i n o l e v u l í n i c o sintetase
específica de eritrócito e m precursores de R B C , devida a m u t a -
ções e n v o l v e n d o o gene ligado ao X q u e codifica essa enzima. 8 O
a r m a z e n a m e n t o de f e r r o é c o m u m e m pacientes c o m a n e m i a
díseritropoiética c o n g ê n i t a e p o d e ser e n c o n t r a d o e m pacientes
c o m deficiências de enzimas d e R B C , p a r t i c u l a r m e n t e deficiên-
cia e m p i r u v a t o q u i n a s e .
Metodologia Analítica
Vários m é t o d o s são u s a d o s p a r a a d o s a g e m de f e r r o e analitos
r e l a c i o n a d o s . E n t r e eles estão os m é t o d o s para (1) ferro sérico,
(2) c a p a c i d a d e de ligação de ferro, (3) s a t u r a ç ã o d a t r a n s f e r r i n a
e (4) f e r r i t i n a sérica.
Métodos para a Determinação de Ferro Sérico,
Capacidade de Ligação de Ferro e Saturação da
Transferrina
Princípio
O ferro é l i b e r a d o d a t r a n s f e r r i n a pelo d e c r é s c i m o d e p H d o soro;
ele é r e d u z i d o de Fe 3 a Fe 2+ e, e n t ã o , c o m p l e x a d o c o m u m cro-
m ó g e n o , tal c o m o b a t o f e n a n t r o l i n a o u ferrozina. Tais c o m p l e x o s
f é r r o - c r o m ó g e n o têm u m a absorva ncia e x t r e m a m e n t e alta n o
c o m p r i m e n t o de o n d a a d e q u a d o , q u e é p r o p o r c i o n a l à concen-
tração de ferro.
CAPÍTULO 2 8 533
A c a p a c i d a d e d e ligação d e f e r r o i n s a t u r a d a sérica e a capaci-
d a d e total de ligação d e ferro (T1BC) são d e t e r m i n a d a s pela
adição de Fe 3 " suficiente p a r a saturar os sítios de ligação ao ferro
da t r a n s f e r r i n a . O excesso de Fe 3+ é r e m o v i d o , p o r exemplo, pela
a d s o r ç ã o ao p ó leve d e c a r b o n a t o d e m a g n é s i o (MgCC^), e o
e n s a i o para o c o n t e ú d o d e ferro é, e n t ã o , r e p e t i d o . A T I B C é
o b t i d a a p a r t i r dessa s e g u n d a m e d i ç ã o .
A s a t u r a ç ã o da t r a n s f e r r i n a é calculada c o m o a seguir:
S a t u r a ç ã o d a t r a n s f e r r i n a (%) = 100 x ferro s é r i c o / T I B C
Importância Clinica
A c o n c e n t r a ç ã o de ferro sérico se refere ao Fe 3+ ligado à transfer-
r i n a sérica e n ã o inclui o ferro c o n t i d o n o soro c o m o h e m o g l o b i n a
livre. A c o n c e n t r a ç ã o de ferro sérico está d i m i n u í d a e m m u i t o s ,
mas n ã o e m todos os pacientes c o m a n e m i a p o r deficiência de
ferro e e m d o e n ç a s i n f l a m a t ó r i a s crônicas, tais c o m o infecção
aguda, i m u n i z a ç ã o e i n f a r t o d o m i o c á r d i o (Tabela 28-3).
C o n c e n t r a ç õ e s de ferro sérico maiores d o q u e o n o r m a l
o c o r r e m (1) n o s d i s t ú r b i o s de carga de ferro, tais c o m o h e m o c r o -
matose, (2) e m pacientes c o m a n e m i a aplástica, (3) e m envene-
n a m e n t o a g u d o p o r f e r r o e m crianças, (4) a p ó s i n g e s t ã o o r a l
de ferro c o m o m e d i c a m e n t o , (5) após a d m i n i s t r a ç ã o parenteral de
f e r r o o u (6) e m h e p a t i t e a g u d a . P o r e x e m p l o , u m c o m p r i m i d o
de 0,3 g de sulfato ferroso ingerido por u m a d u l t o p o d e a u m e n -
t a r a c o n c e n t r a c ã o d e f e r r o sérico d e 5 0 a 9 0 f i m o l / L ( 3 0 0 a
5 0 0 iug/dL).
T i p i c a m e n t e , cerca d e u m terço d o s sítios de ligação ao ferro
d a t r a n s f e r r i n a é o c u p a d o p o r Fe , + . A t r a n s f e r r i n a sérica, por-
t a n t o , tem c a p a c i d a d e de ligação a o ferro de reserva considerável.
Isso é c h a m a d o capacidade de ligação ao f e r r o i n s a t u r a d a sérica.
A T I B C é u m a m e d i d a d a c o n c e n t r a ç ã o m á x i m a de f e r r o q u e a
t r a n s f e r r i n a liga. A T I B C sérica varia e m d i s t ú r b i o s d o m e t a b o -
lismo d o ferro. Está f r e q ü e n t e m e n t e a u m e n t a d a n a deficiência
d e ferro e d i m i n u í d a nas d o e n ç a s i n f l a m a t ó r i a s crônicas o u
malignas, e está f r e q ü e n t e m e n t e d i m i n u í d a , t a m b é m , n a h e m o -
cromatose.
Comentários e Precauções
Exceto q u a n d o a espectroscopia p o r absorção a t ô m i c a é u s a d a , a
h e m ó l i s e t e m m u i t o p o u c o efeito n o s r e s u l t a d o s da d o s a g e m de
ferro sérico p o r q u e o ferro d a h e m o g l o b i n a n ã o é l i b e r a d o d o
h e m e p e l o t r a t a m e n t o c o m ácido. E n t r e t a n t o , q u a n d o as amos-
tras d e soro m o s t r a m h e m ó l i s e i m p o r t a n t e , u m a p e q u e n a q u a n -
t i d a d e de ferro p o d e ser liberada da h e m o g l o b i n a .
M u i t o s fatores i n f l u e n c i a m a c o n c e n t r a ç ã o de ferro sérico e
a T I B C . Variações q u e p o d e m ser observadas e m diversas condi-
ções fisiológicas o u patológicas estão listadas n a Tabela 28-3.
Variações n o dia-a-dta são b a s t a n t e a c e n t u a d a s e m pessoas saudá-
veis. U m a variação d i u r n a d i s t i n t a resulta e m c o n c e n t r a ç õ e s
de ferro sérico m e n o r e s de t a r d e d o q u e pela m a n h ã e a c e n t u a -
d a m e n t e baixas à n o i t e (tão baixas q u a n t o 2 a 4 ( i m o l / L [10 a
20 p g / d L ] e m pessoas saudáveis). D e v i d o às n u m e r o s a s causas d e
c o n c e n t r a ç ã o baixa de ferro sérico, os r e s u l t a d o s devem ser inter-
p r e t a d o s c o m c u i d a d o . A l é m disso, i n d i v í d u o s c o m deficiência
m o d e r a d a d e ferro, algumas vezes, a p r e s e n t a m valores n o r m a i s
d e c o n c e n t r a ç ã o d e ferro sérico e T I B C .
Métodos para a Determinação de Ferritina Sérica
Princípio
A d o s a g e m d e f e r r i t i n a sérica p o d e ser Tealizada p o r q u a l q u e r u m
d e vários m é t o d o s , i n c l u i n d o (1) ensaio i m u n o r r a d i o m é t r i c o ,
(2) ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) e métodos (3) imu
n o q u i m i o l u m i n e s c e n t e s e (4) i m u n o f l u o r o m é t r i c o s . O s reagentes
534 PARTE IV Analitos
TABELA 2 8 - 3 Condições Conhecidas que Afetam as Concentrações Séricas de Ferro, a Capacidade Total de Ligação de Ferro e a
Saturação da Transferrina
Condição
Variação diurna
Cicio menstrual
Gravidez
Ingestão de lerro (inclusive vitaminas com ferro)
Contraceptivos orais (semelhantes a progesterona)
Contaminação per ferro de seringa, tubo Vacutainer ou
outras vidrarias (o fenômeno pode ser rara, esporádico,
muito difícil de ser provado)
Injeção de ferro dextrano
Hepatite
Inflamação aguda (infecção respiratória), abscesso,
imunização, infarto do miocárdio
Inflamação crônica ou malignidade
Deficiência de ferro
Sobrecarga de ferre (hemocromatose)
De FíiítÍmiiÍíj VF. Laboratot) testing for iron status. Hosf> Pract 199^,26:19.
SI, conc£n£iafdo àe ferre sérico; TIBC, Capacidade temi de ligação de ferro, Tsat,
para esse ensaio estão disponíveis na forma de kit e em instrumen-
tos de imunoensaio automatizados de diversos fabricantes.
Importância Clínica
A ferritina está presente n o sangue em concentração muito baixa.
Embora seja uma proteína de fase aguda, sob condições normais
ela reflete grosseiramente o teor de ferro corporal. A proteína
circulante é basicamente a apofeiritina. Ela é pobre e m ferro e
consiste principalmente e m cadeias L glicosiladas, pobres em
ferro. A concentração de ferritina plasmática declina muito pre-
cocemente no desenvolvimento da deficiência em ferro, muito
antes que sejam observadas variações na concentração de hemo-
globina d o sangue, n o t a m a n h o da R B C o u na concentração de
ferro sérico. Dessa forma, a dosagem da concentração de ferritina
sérica é usada c o m o u m indicador muito sensível da deficiência
de ferro, que não é complicada por outras doenças concorrentes.
Alternativamente, u m grande n ú m e r o de doenças crônicas resulta
em concentração de ferritina sérica aumentada (Tabela 28-3).
Método para a Determinação do Receptor de
Transferrina Sérica
As membranas celulares dos precursores de R B C em desenvolvi-
m e n t o na medula óssea são m u i t o ricas e m receptores de trans-
ferrina, aos quais o complexo ferro-transferrina se liga antes de
ser internalisado e o ferro ser liberado da transferrina n o citossol.
O n ú m e r o de receptores de transferrina aumenta na presença de
deficiência de ferro e d i m i n u i n o excesso de ferro. Essas variações
na quantidade de receptores de transferrina no tecido eritropoi-
ético são, também, refletidas e m variações n o receptor de trans-
ferrina sérico, mas, e m grande parte, os valores de receptor de
transferrina sérico refletem a quantidade de atividade ertitropni-
ética, i n d e p e n d e n t e m e n t e do estado de ferro d o paciente.
Método para a Determinação do Conteúdo de
Hemoglobina no Reticulócito (CHr)
Dispositivos automáticos que m e d e m o conteúdo de hemoglobina
nos reticulócitos estão disponíveis comercialmente, e sua dosagem
Efeito
Valores normais pela manhã; valores baixos no meio da tarde; valores muito baixos próximo
à meia-noite
Antes da menstruação, valores elevados (SI aumentada de 10%-30%); durante a menstruação,
valores baixos (SI diminuído em 10%-3O%)
Pode aumentar SI devido ao aumento de progesterona; pode diminuir SI devido à deficiência de ferro
Valores altos; pode aumentar SI em + 54 ^mol/L (+ 300 ng/dL) e Tsat em 100%
Valores altos; pode aumentar SI para > 36 ^mol/L {> 200 pg/dL) e Tsat em 75%; também aumenta
Tl BC
Valores altos; p. ex., SI > 30 pmol/L (> 170 pg/dL); Tsat de 75%-100%
Valores muito altos; SI pode ser > 180 jimol/L (> 1.000 ug/dL), Tsat 100%; provavelmente a partir do
ferro dextrano circulante; o efeito pode persistir por várias semanas
Valores muito altos; SI pode ser >180 (amoVL (:> 1.000 pg/dL) devido à hiperferritinemia de injúria do
tiepafócito
SI baixo ou normal; Tsat normal ou baixa
SI baixo ou normal; Tsat normal ou baixa
SI baixo ou normal; Tsat baixa normal; TIBC aumentada
SI alto; Tsat alta; TIBC normal ou baixa
saturação da transferrina.
tem-se mostrado útil para diferenciar a anemia por deficiência de
ferro daquela por inflamação crônica,' embora exista considerável
sobreposição entre essas categorias diagnosticas.
BILIRRUBINA
A bilirrubina é o pigmento amarelo-alaranjado derivado das
RBCs senescentes. A p ó s a formação nas células reticuloendote-
liais, a bilirrubina é transportada e biotransformada principal-
mente n o fígado e excretada na bile e na urina.
Química
A bilirrubina é uma molécula tecrapirrólica linear (Figura 28-7)
que é insolúvel e m água e prontamente solúvel em vários solven-
tes apoiares. Ela tem tanto ísômeros trans quanto eis. Q u a n d o
exposta à luz, a bilirrubina na configuração trans é convertida à
configuração eis, que é mais hidrossolúvel. Na prática, esta é a
justificativa clínica para a exposição de neonatos que t e n h a m
icterícia clinicamente significante à luz, para reduzir as concen-
trações plasmáticas de bilirrubina não-conjugada. As quatro
frações de bilirrubina que t ê m sido isoladas do soro estão listadas
n o Quadro 28-2.
Bioquímica
A bilirrubina I X a é produzida a partir d o catabolismo da pT0t0-
porfirina IX por uma h e m e oxigenase microssômica. O produto
tetrapirrólico da abertura do anel na p o n t e a - m e t e n o é o pig-
m e n t o verde biliverdina, a qual é subseqüentemente reduzida à
bilirrubina por uma enzima citossólica biliverdina redutase
(Figura 28-8). Para cada mol de heme catabolisado por essa via,
é produzido u m m o l de (1) m o n ó x i d o de carbono, (2) bilirrubina
e (3) ferro férrico. A produção diária de bilirrubina a partir de
todas as fontes no h o m e m é, e m média, de 2 5 0 a 3 0 0 mg. Apro-
ximadamente 85% do total de bilirrubina produzida são deriva-
dos da porção h e m e da h e m o g l o b i n a liberada dos eritrócitos
 Hemoglobina, Ferro e Bilirrubina CAPÍTULO 2 8 535

HO x „.0 <V Vn Me
*C'
Cl li ch> C>1, v
II ' w ' "
u
c CU Me CH:. iw: :
/ Ti" \ Hfflll'
4 r. n i. \
/—n' N--<
"A A":
'• . .
; .4
B
.J c
A - n
'N N ~ V Mi-4. V. J
V V r
II ii k
!!><>
y f °-

A- X p Í Y""%-/ NADPH -

p 4 J á / n*r^{: »riO:
)• À

Q f í £ i O
v_ ""*• tX) ,Kxcit..iJv> |V.L*í pulirfies)
X "Vf ^ V < C '•••K 7i» JRíuTiltsaJc}
X
crS-s
Vn Me
J-.V. -<>rx
v n
Figura 28-7 E s t r u t u r a da b i l i r r u b i n a I X a . Acima, A e s t r u t u r a de y e / r "Y S
tetrapirrol a b e r t a ou lineaT m o s t r a n d o as ligações Z. Abaixo, A i\.J
H H
c o n f o r m a ç ã o f e c h a d a m o s t r a n d o extensivas p o n t e s de h i d r o g ê n i o / \ ^ liv^fcn,. lX.i
\
internas. (Reimpresso com p e r m i s s ã o de Elsevier Science P u b l i s h i n g /-íN v
N —í
Co., Inc., de S c h i m d R. Bilirubin metabolisni: state of t h e a n . y,!
G a s t r o e n t e r o l o g y 1978'74:1307-12, com p e r m i s s ã o da A m e r i c a n
M e - —CIT,
Gastroenterological Association.)
Vn- CH=CH-j
VIA 1)1*11 11 ~J
•» è-.V»J . J Ceí- CU- CU, COOH
TYkitfl *!/-
Q U A D R O 2 8 - 2 | F r a ç õ e s de Bilirrubina ^ NAD? i"|• ~ HluvlIlMIlleivMI

Bilirrubina não-conjugada (a-úilirrubina) VfT - v Jo rransivíitc

iL IJLÍHHI.* li'.iwtxx(NCiiir;ii
Bilirrubina monoconjugada (p-bilirrubina) vil >.C
Bilirrubina desconjugada {y-bilirrubina) .Ott. .A
Vr.y Y Y % V
Uma fração irreversivelmente ligada à proteína (S-bilirrutina)
V-ri /
/ H Tí' V liiinuiiiiii: IXa
\ HH /

y M]
T
Ltl
senescentes, q u e são d e s t r u í d o s n a s células reticulocndotcliais d o
fígado, d o b a ç o e da m e d u l a óssea. O s 1 5 % restantes são p r o d u -
zidos a partir d o c a t a b o l i s m o de o u t r a s proteínas q u e c o n t ê m Figura 2 8 - 8 C a t a b o l i s m o d o berne a b i l i r r u b i n a I X a . (De B e r l m

h e m e , tais c o m o m i o g l o b i n a , c i t o c r o m o s e peroxidases. N I , Berk PD. Q u a n t i t a t i v e aspects o f b i l i r r u b i n m e t a b o l i s n i for

N o sangue, a b i l i r r u b i n a é ligada à a l b u m i n a e t r a n s p o r t a d a hematologists. Blood 1981:57-983-99)

para o fígado. A b i l i r r u b i n a e n t ã o se dissocia d a a l b u m i n a n a

m e m b r a n a d o h e p a t ó c i t o . D e p o i s , ela é t r a n s p o r t a d a através d a
m e m b r a n a (Figura 28-9). D e n t r o das células hepáticas, a bilirru-
bina é reversivelmente ligada a p r o t e í n a s solúveis c o n h e c i d a s
c o m o l i g a n d m a s ou p r o t e í n a Y. As ligandinas t a m b é m ligam
vários o u t r o s compostos, tais c o m o (1) esteróides, (2) bromossul-
faleina (BSP), (3) verde de i n d o c i a n i n a e (4) alguns carcinógenos.
N o i n t e r i o r dos hepatócitos, a b i l i r r u b i n a é r a p i d a m e n t e conju-
gada c o m o ácido glicurônico p a r a p r o d u z i r m o n o e diglicuroní-
d e o de b i l i r r u b i n a , q u e são, e n t ã o , excretados n a bile (Figura
28-10). A e n z i m a m i c r o s s ô m i c a b i l i r r u b i n a u r i d i n a difosfato
(UDP)-glicuronosiltransferase ( E C 2.4-1 17) catalisa a f o r m a ç ã o
de m o n o g h c u r o n í d e o de b i l i r r u b i n a e, talvez, a conversão de
m o n o g l i c u r o n í d e o a d i g l i c u r o n í d e o . N o i n t e s t m o , os glicuroní-
deos de bilirrubina são h i d r o l i s a d o s p o r P-glicuronidases d o
fígado, das células intestinais epitehais e de bactérias. A bilirru-
b i n a n ã o - c o n j u g a d a é, então, reduzida pela m i c r o b i o t a intestinal
a três tetrapirróis incolores coletivamente c h a m a d o s urobilinogê-
nios. Eles c o n t ê m 6, 8 o u 12 á t o m o s de h i d r o g ê n i o a mais d o q u e
a b i l i r r u b i n a e são d e n o m i n a d o s (1) ejtercobilinogénio, (2) mesobiíi-
nogênio e (3) urobitinogénio, respectivamente Parte d o urobilinogê-
nio é r e a b s o r v i d o d o intestino, c a p t a d o pelo fígado e reexcretado
na bile. U m a p e q u e n a p a r t e e n t r a n a circulação geral e aparece
na u r i n a . N o trato intestinal inferior, os três u r o b i i i n o g ê n i o s são
oxidados aos p i g m e n t o s biliares c o r r e s p o n d e n t e s (1) estercobilma,
(2) m e s o b i l i n a e (3) urobilina, q u e são m a r r o m - a l a r a n j a d o s e os
principais p i g m e n t o s das fezes.
Importância Clínica
Defeitos n o m e t a b o l i s m o da b i l i r r u b i n a r e s u l t a n d o e m icterícia
p o d e m ocorrer e m cada u m a das etapas d a via m e t a b ó l i c a (Figura
536 PARTE IV Analitos

Pool da
, heme livre /

/Macro moléculas % /
; BR-citossólicas *| Biliverdina
Receptor \(p. ex.. lioandina)J / Herreprateinas \
de (p. ex., citocromo P4Í:0) >
/Blllrrubimi (BR)\ afbiMiínf)?
V Albumina / /
BR / J

Itutispudo rrtumbr&nâ- Monoíjlicuronideo

/ - ?
mcmbrons? det3R

Bilirrubina (BR)
Protoiim Dialicurondeo
rfà ligaçüo de BR \ '
d& ânion s
OíQànkxi? Rfltículo UDP-glicu ronosiltrs nsferase
sndopiasmátK»
Momfcwarw
Msmbrarui canalicular
Plasma sinusoidai

Figura 2 8 - 9 C a p t a ç ã o , m e t a b o l i s m o e t r a n s p o r t e de b i l i r r u b i n a n o h e p a t ó c i t o . (De G o l i a n JL, S c h m i d R.

Bilirubin m e t a b o h s m . In P o p p e r H , S c h a f f n e r F, eds. Progress in liver diseases, Vol. 7, C h a p t e t 15. Philadeíphia:
W B S a u n d e r s C o , 1982.)

28-9). Os distúrbios são normalmente classificados como (1) dis-
túrbios herdados do metabolismo da bilirrubina ou (2) icterícia
neonatal. Todos esses distúrbios são caracterizados por elevações
predominantes na bilirrubina conjugada ou não-conjugada na
ausência de outros exames hepáticos anormais. Somente nesses
distúrbios o fracionamento da bilirrubina é clinicamente útil.
Ocasionalmente, os pacientes apresentam elevações isoladas
da concentração de bilirrubina. Na maioria dos casos, isso é
devido a distúrbios herdados do metabolismo da bilirrubina,
hiperbilirrubinemia familiar ou hemólise. U m algoritmo para
diferenciar as causas familiares de hiperbilirrubinemia é apresen-
tado na Figura 28-10.
tada que leva aa-dano cerebral permanente) durante o primeiro ano
de vida. A flebotomia e a plasmaferese reduzem a bilirrubina sérica,
mas a encefalopatia normalmente se desenvolve. O transplante
hepático precoce é a única terapia efetiva.
Síndrome de Crigler-Najjar (Tipo II)
Esse é um distúrbio autossômico dominante raro caracterizado
por uma deficiência parcial de UDP-glicuronosiltransferase. A
bilirrubina não-conjugada é normalmente de 5 a 20 m g / d L (85
a 340 jimol/L). Diferentemente da síndrome de Crigler-Najjar
tipo I, a tipo II responde notavelmente ao fenobarbital, e pode
esperar-se uma vida normal.

Distúrbios Herdados do Metabolismo da Bilirrubina Síndrome de Lucey-Discroll

Os distúrbios herdados do metabolismo da bilirrubina incluem as
síndromes de (1) Gilbert, (2) Crigler-Najjar (Tipo I), (3) Crigler-
Najjar (Tipo II), (4) Lucey-Discroll, (5) Dubin-Johnson e (6) Rotor.
Síndrome de Gilbert
A síndrome de Gilbert é uma doença benigna manifestada por
hiperbilirrubinemia não-conjugada moderada. Esta anormali-
dade, que afeta 3% a 5% da população, é provavelmente herdada
c o m o u m traço recessivo autossômico. A concentração sérica de
bilirrubina varia entre 1,5 e 3 m g / d L (26 e 51 jimol/L) e tende
a aumentar com o jejum. A síndrome de Gilbert se diferencia
facilmente da hepatite crônica pela ausência de anemia e bilirru-
bina na urina, e pelos testes normais de função hepática. N ã o é
necessário tratamento, mas os pacientes devem ser informados
que não têm doença hepática.
Síndrome de Crigler-Najjar (Tipo I)
A síndrome de Crigler-Najjar tipo I é uma doença rara causada
pela ausência completa de UDP-glicuronosiltransferase e manifes-
tada por concentrações muito altas de bilirrubina não-conjugada
(25 a 50 mg/dL). Ela é herdada como um traço recessivo autossô-
mico. A maioria dos pacientes morre de dano cerebral grave causado
por kemicterus (encefalopatia relacionada com a bilirrubina aumen-
A síndrome de Lucey-Discroll é uma forma familiar de hiperbi-
lirrubinemia não-conjugada causada por um inibidor circulante
de conjugação da bilirrubina. A hiperbilitrubinemia é moderada
e se mantém durante as primeiras 2 a 3 semanas de vida.
Síndromes de Dubin-Johnson e Rotor
A síndrome de Dubin-Jonhson é uma doença autossômica reces-
siva caracterizada por icterícia com bilirrubina conjugada predo-
minantemente elevada e uma elevação menos importante da
bilirrubina não-conjugada. A síndrome Rotor é similar à sín-
drome de Dubin-Johnson, mas sem pigmento negro no fígado.
As duas doenças são benignas.
Icterícia em Neonatos
Os distúrbios que causam icterícia em neonatos são classificados
c o m o hiperbilirrubinemia não-conjugada ou conjugada (Quadro
28-3).
Hiperbilirrubinemia Não-conjugada
A hiperbilirrubinemia não-conjugada representa um risco para
o desenvolvimento de IteTnicterus, especialmente em lactentes
prematuros e de baixo peso ao nascimento. O kemicterus refere-
se a uma síndrome neurológica que resulta em dano cerebral
 Hemoglobina, Ferra e Bilirrubina CAPÍTULO 2 8 537

Bilirrubina sérica aumentada isolada Q U A D R O 2 8 - 3 j Classificação Fisiológica da Icterícia

HIPERBILIRRUBINEMIA NÃO-CONJUGADA
Produção Aumentada de Bilirrubina Não-conjugada a partir do Heme
Exclusão de hemólise, fracionamento Hemólise
subseqüente da bilirrubina
Hereditária
Adquirida
Conjugada Eritropoiese ineficaz
Tumover (renovação) rápido da massa de RBC aumentada (nos neonatos)

Possibilidade das Entrega Diminuída de Bilirrubina Não-conjugada (no Plasma) para o

seguintes síndromes: síndromes de acordo com a Hepatócito
concentração de bilirrubina: Insuficiência cardíaca congestiva direita
Dubin-Johnson Gilbert, < 3 mg/dL Anastomose portocava

Rotor Crigler-Najjar, iipo I; > 25 mg/dL Captação Diminuída de Bilirrubina Não-conjugada através da Membrana
Crigler-Najjar, tipo II; 5 a 20 mc/dL do Hepatócito
Inibição Competitiva
Lucey-Discroll, transitoriamente - 5 mg/dL
•rogas
Outros
Figura 2 8 - 1 0 Algoritmo para diferenciar causas familiares de Síndrome de Gilbert
hiperbilirrubinemia. Sepse, jejum

d e v i d o à d e p o s i ç ã o de b i l i r r u b i n a n o gânglio basal n o s n ú c l e o s Armazenamento Diminuído de Bilirrubina Não-conjugada no Citossol

d o t r o n c o cerebral. Essa s í n d r o m e é p r e v e n i d a p o r f o t o t e r a p i a e (Proteínas YeZDiminuídas)
Inibição Competitiva
t r a n s f u s ã o e m lactentes c o m c o n c e n t r a ç õ e s elevadas de bilirru-
Febre
bina não-conjugada.
As causas de h i p e r b i l i r r u b i n e m i a n ã o - c o n j u g a d a n o n e o n a t o
Biotransformação Diminuída (Conjugação)
são a icterícia fisiológica d o recém-nascido, a d o e n ç a h e m o l í t i c a
icterícia neonatal (fisiológica)
devida à i n c o m p a t i b i l i d a d e R h ou A B O e a h i p e r b i l i r r u b i n e m i a
Inibição (drogas)
d o leite m a t e r n o .
Hereditária (Crigler-Najjar)
Icteríciã Fisiológica do Recém-nascido. O s lactentes f r e q ü e n t e - Tipo I (deficiência enzimática completa)
m e n t e tornam-se ictéricos e m p o u c o s dias após o n a s c i m e n t o , Tipo II (deficiência parcial)
u m a d o e n ç a c o n h e c i d a c o m o icterícia fisiológica do recém- Disfunção hepatocelular
nascido. As c o n c e n t r a ç õ e s d e b i l i r r u b i n a a l c a n ç a m u m pico Síndrome de Gilbert
d e n t r o de 3 a 5 dias após o n a s c i m e n t o e p e r m a n e c e m elevadas
p o r m e n o s de duas s e m a n a s . O s fatores q u e c o n t r i b u e m para a HIPERBILIRRUBINEMIA CONJUGADA (CQLESTASE)
icterícia fisiológica são (1) u m a carga de b i l i r r u b i n a a u m e n t a d a Secreção Diminuída de Bilirrubina Conjugada no Canalículo
n o recém-nascido p o r q u e as R B C s t ê m t e m p o de vida m e n o r , Doença hepatocelular
(2) c o n j u g a ç ã o d i m i n u í d a d a b i l i r r u b i n a devida a u m a falta rela- Hepatite
tiva d e glicuronosiltransferase {enzima c o n j u g a d o r a ) nos primei- Colesfase (intra-hepática)
ros dias após o n a s c i m e n t o e (3) exposição d o s bebês a m a m e n t a - Síndromes de Dubin-Johnson e Rotor
dos a i n i b id o r e s da c o n j u g a ç ã o da b i l i r r u b i n a presentes n o leite Drogas (estradiol)
materno.
A icterícia fisiológica d o recém-nascido é tratada com fotote- DRENAGEM DIMINUÍDA
Obstrução extra-hepáiica
rapia. O lactente é exposto à luz de a p r o x i m a d a m e n t e 4 5 0 n m ,
Cálculos
q u e t o r n a a b i l i r r u b i n a mais hidrossolúvel, e ela é, então, excre-
Carcinoma
tada n a bile. As t r a n s f u s õ e s são r a r a m e n t e necessárias.
Estenose
Doença Hemolítica. A d o e n ç a h e m o l í t i c a n o recém-nascido
Atresia
resulta de i n c o m p a t i b i l i d a d e m a t e r n o - f e t a l d o s fatores R h e s u s d o
Colangife escierosante
sangue. E m tais lactentes, o s a n g u e m a t e r n o Rh-negativo torna-se
Obstrução intra-hepática
sensibilizado p o r u m a gravidez a n t e r i o r d e u m feto Rh-positivo Drogas
ou p o r u m a t r a n s f u s ã o d e s a n g u e Rh-positivo. O lactente torna-se Granuloma
ictérico c o m b i l i r r u b i n a n ã o - c o n j u g a d a n o p r i m e i r o ou s e g u n d o Cirrose biliar primária
dia d e vida e é suscetível ao kemicterus. Estreitamento do dueto biliar
Hiperbilirrubinemia do Leite Materno. Este tipo de hiperbilirru- Tumores
b i n e m i a afeta cerca de 3 0 % dos recém-nascidos a l i m e n t a d o s c o m
leite m a t e r n o . A causa exata da icterícia é d e s c o n h e c i d a . A d o e n ç a
d u r a p o u c a s s e m a n a s e é tratada, se necessário, pela d e s c o n t i n u i -
dade do aleitamento.
A hiperbilirrubinemia conjugada é vista com bastante freqüência
n o recém-nascido como u m a complicação da nutrição parenteral.
Hiperbilirrubinemias Conjugadas
Estas síndromes são caracterizadas pela hiperbilirrubinemia n a qual Atresia Biliar
a bilirrubina conjugada excede 1,5 m g / d L (24 [imol/L) As mais A atresia biliar é u m a d o e n ç a n a qual os d u e t o s biliares n ã o se
i m p o r t a n t e s são a hepatite n e o n a t a l idiopática e a atresia biliar. desenvolvem o u se desenvolvem d e f o r m a a n o r m a l . N ã o t e n d o
538 PARTE IV Analitos

saída paTa o intestino, a bile é acumulada dentro do fígado e Acido glicurônico. ,Acido glicurônico
.O ii
eventualmente, escapa para o sangue, causando hiperbilirrubine- T ^C'
mia mista. Possíveis causas incluem (1) citomegalovírus, (2) reo- ÇHj U HÍ Cl!
!l I :i -
vírus III, (3) vírus Epstein-Barr. (4) vírus da rubéola, (5) deficiên- Me CH Me CH2 H2C Mc Me (' 11
cia de a.,-antitripsina, (6) síndrome de D o w n e (7) trissomia 17
o u 18.
A atresia biliar extra-hepática, mais c o m u m do que o tipo intra- 0-— V , / O
N
hepático, p o d e envolver toda o u parte da árvore biliar extra-hepá-
tica. Se a icterícia persiste além de 14 dias de idade, uma dosagem
A k
I
ii

da bilirrubina conjugada o u direta deve ser feita para excluir a Bilirrubina d üsctiivj ilíada
atresia biliar. Se ela está elevada, a deve ser feito o teste de bile s 0
- H03SV - <t1 V) — - =
n N . N®Cl
na urina. Se a cor não é verde n e m amarela, é provável que seja
\sE—/
atresia biliar. A identificação precoce dessa doença é essencial
Acido glicurônico Ácido sulfanílico diazotado
para saber se esses lactentes irão beneficiar-se da operação de tv, O
portoenterostomia, a qual deve ser realizada antes de 60 dias após
o nascimento. Se a portoenterostomia não for bem sucedida, o CH2 CH,
|
transplante de fígado é o tratamento escolhido. As crianças rara- Me C H ,
mente vivem além de 3 anos a m e n o s que a lesão seja corrigida
cirurgicamente.
SOjH
A atresia biliar mtm-hepáüca é caracterizada por uma ausência
de duetos biliares intra-hepáticos. A icterícia normalmente aparece
^nAcido glicurônico
nos primeiros dias de vida. A bilirrubina sérica é elevada e o
Azobilirrubina B (isômero I)
colesterol sérico pode estar alto e levar à formação de xantomas.
I
H,< CH-
H,C Me Me ( II
M e t o d o l o g i a Analítica LJ
Várias técnicas analíticas são usadas para dosar bilirrubina e
metabólitos n o soro e na urina. 1JOH;C

Bilirrubina Sérica Ácido <tilíaailic< > diB2t*ado

Bilirrubina c compostos relacionados são dosados nos fluidos
corporais pelo uso de uma variedade de métodos (1) espectrofo-
tométricos, (2) cromatográficos e (3) eletroforéticos por capilar. AuiUi: xlk .râtiia
O s intervalos de referência para bilirrubina e compostos relacio-
nados estão listados no Capítulo 45. HjÇ CH 2
H2Ç Mc Me CH
Métodos Diazo
O s métodos químicos mais amplamente usados para a dosagem j{ ~ \ ;> N—N—\JH J
IIO.S
de bilirrubina são aqueles baseados na reação diazo, primeira- \ = = / N' '»
mente descrita por Ehrlich, em 1883. Nessa reação, o ácido sul-
i
fanílico diazotizado—o reagente diazo—reage c o m a bilirrubina
Aiabilirrubina A (isômem II)
para produzir dois azodipirróis {Figura 28-11), os quais são roxo-
avermclhados e m pH neutro e azuis e m valores de p H baixos o u
Figura 28-11 A reação do glicuronídeo de bilirrubina com o ácido
altos. Mais tarde, descobriu-se que o álcool acelera a reação. A
sulfanílico diazotado para produzir os isômeros I e 11 da azobilirrubina
fração de bilirrubina que reage c o m o regente diazo na ausência
B. A bilirrubina não-conjugada reage da mesma forma para produzir os
de álcool é d e n o m i n a d a bilirrubina direta. A bilirrubina indi-
isômeros 1 e 11 da azobilirrubina A.
reta é considerada c o m o a diferença entre a bilinubina total
(encontrada após a adição de álcool à mistura de reação) e a
fração de bilirrubina direta. Todas as variações posteriores têm
usado u m dentre os vários "aceleradores" que facilitam a reação
da bilirrubina não-conjugada (indireta) com o reagente diazo.
Bilirrubina Total. O m é t o d o diazo descrito por Jendrassik e
Grof, e m 1938, e depois modificado por D o u m a s e colaborado- adicionado e a absorvância da azobilirrubina alcalina (cor azul-
res10 m e d e n o total as frações de bilirrubina (1) não-conjugada, esvetdeada) é medida a 5 9 8 n m . Em analisadores clínicos auto-
(2) monoconjugada, (3) desconjugada e (4) 5-bilirrubina n o soro. matizados, a adição de tartarato alcalino é omitida e a absorvân-
Esse m é t o d o tem sido "credenciado" pelo Clinicai Laboratory cia é medida a 5 3 0 n m . O m é t o d o é calibrado com soluções de
Standards Institute (CSLI) c o m o o método de referência para a concentrações de bilirrubina conhecidas preparadas pela adição
dosagem de bilirrubina total n o SOTO. Nesse procedimento, o soro de bilirrubina não-conjugada de pureza conhecida ao SOTO humano.
é adicionado a uma solução aquosa de cafeína, acetato de sódio Tal bilirrubina, Material de RefeTência-PadTão (SRM) No. 916, está
e benzoato de sódio (acelerador), que desloca a bilirrubina não- disponível no National Institute of Standards and Technology
conjugada de seus sítios de associação na albumina e facilita sua (NIST), Gaithersburg, M D .
reação com o ácido sulfanílico diazotizado. Após uma incubação Bilirrubina Direta. O s m o n o c o n j u g a d o s e diconjugados de bilir-
de 10 minutos à temperatura ambiente, o tartarato alcalino é rubina (principalmente glicuronídeos) e a S-bilirrubina, por serem
 Hemoglobina, Ferro e Bilirrubina
hidrossolúveis, reagem com o reagente diazo na ausência de u m
acelerador. U m m é t o d o confiável para a bilirrubina direta n ã o
deve medir qualquer bilirrubina não-conjugada. Para m a n t e r a
bilirrubina não-conjugada sem reagir é necessário usar u m p H
próximo a 1,0 (soro ou plasma diluídos com HC1 a 0,05 m o l / L ) .
A ditaurobilirrubina (bilirrubina conjugada com t a u r i n a e dispo-
nível c o m o sal dissódio), u m material sintético hidrossolúvel, é
usada pelos fabricantes de i n s t r u m e n t o s para calibrar os m é t o d o s
de bilirrubina direta. Está, t a m b é m , presente em material usado
para controle de qualidade e para testes de proficiência.
Espectrofotomelria Direta
Esse m é t o d o de dosagem baseia-se na absorção de luz pela bilir-
r u b i n a p r ó x i m o a 460 n m e é restrito principalmente a amostras
de sangue de recém-nascidos saudáveis nos quais a bilirrubina
não-conjugada é a espécie p r e d o m i n a n t e . A correção para oxie-
moglobina, invariavelmente presente em soros de neonatos, é
alcançada pela dosagem da absorvância em dois c o m p r i m e n t o s
de o n d a e pela resolução de u m sistema de duas equações simul-
tâneas t e n d o duas incógnitas. A concentração de bilirrubina na
amostra é calculada a partir de u m a equação simples.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Os métodos de H P L C r a p i d a m e n t e separam e quantificam as
quatro frações de bilirrubina ( Q u a d r o 28-2). A H P L C tem sido
útil n a detecção e separação das diversas frações de bilirrubina e
dos fotoisômeros produzidos d u r a n t e a fototerapia e m recém-nas-
cidos e, p o r t a n t o , na elucidação d o mecanismo pelo qual a foto-
terapia d i m i n u i a concentração de bilirrubina no sangue de neo-
natos. Existem vários métodos p o r H P L C , de variável complexi-
dade, para separar as frações de bilirrubina. U m m é t o d o por
H P L C simples e rápido usa u m a coluna Micronex RP-30, que n ã o
necessita de salting out de globulinas ou transformação química
dos conjugados de bilirrubina. Este m é t ô d o separa a bilirrubina
sérica e m (1) õ-bilirrubina, (2) bilirrubina desconjugada (y-bilirru-
bina), (3) bilirrubina m o n o c o n j u g a d a (p-bilirrubina), os (4) fotoi-
sômeros E,Z ou Z,E e (5) bilirrubina não-conjugada. A descoberta
da õ-bilirrubina solucionou o mistério das concentrações altas de
bilirrubina persistentes, a maioria reagindo diretamente, em
pacientes c o m icterícia obstrutiva mtra-hepática o u pós-hepática
muito t e m p o após a hepatite ter d i m i n u í d o ou a obstrução ter
sido Tesolvida. Ela é a fração que demora mais a desaparecer do
soro porque segue o catabolismo da albumina, a qual tem u m a
meía-vida de aproximadamente 19 dias.
A H P L C tem sido m u i t o útil na elucidação da natureza das
espécies de bilirrubina que ocorrem n a t u r a l m e n t e n o sangue ou
que são formadas d u r a n t e a fototerapia. Clinicamente, ela oferece
pouca, se alguma, ajuda ao médico n o diagnóstico diferencial de
icterícia p o r q u e o c o n h e c i m e n t o da porcentagem das frações
de bilirrubina n o sangue não tem valor diagnóstico.
Métodos Enzimáticos
Os m é t o d o s enzimáticos para bilirrubina total e direta e para
conjugados d e bilirrubina com ácido glicurônico são baseados na
oxidação de bilirrubina com bilirrubina oxidase a biliverdina com
oxigênio molecular. Próximo a p H 8, e na presença d e colato de
sódio e de dodecilsulfato de sódio, todas as quatro frações de
bilirrubina são oxidadas a biliverdina, que é, ainda, oxidada a
p r o d u t o s roxos e, por fim, incolores. A diminuição n a absorvân-
cia, a 4 2 5 ou 4 6 0 n m , é proporcional à concentração de bilirru-
bina total. O s resultados obtidos pelo m é t o d o da bilirrubina
CAPÍTULO 2 8 539
oxidase estão e m boa concordância com aqueles obtidos pelo
p r o c e d i m e n t o de Jendrassik-Grof. A bilirrubina direta é dosada
em p H 3,7 a 4,5, nessa faixa de p H , a enzima oxida conjugados
de bilirrubina e õ-bilirrubina, mas n ã o a bilirrubina não-conju-
gada. Em p H 10, a enzima oxida seletivamente os dois glicuroní-
deos; a õ-bilirrubina n ã o é oxidada de forma alguma e s o m e n t e
5 % da bilirrubina não-conjugada é dosada c o m o conjugados.
Dosagem Transcutânea da Bilirrubina
Essa abordagem não-invasiva para dosar bilirrubina foi introdu-
zida p o r Yamanouchi, e m 1980. O primeiro b i l í r r u b i n ô m e t r o
(icterômetto) era u m f o t ô m e t r o de reflectância, o qual usava dois
filtros para corrigir a cor da hemoglobina e exigia medidas e m
oito locais d o corpo. O s esforços para melhorar a precisão de tais
dosagens têm t i d o sucesso e levaram ao desenvolvimento de
aparelhos de eficiência aceitável. Em u m estudo, foi e n c o n t r a d o
que o aparelho BiliCtack (SpectR* Inc., Norcross, Ga.) garante
resultados que estão a ± 2 m g / d L daqueles obtidos por u m pro-
cedimento diazo. 31 O u t r o estudo e n c o n t r o u q u e o BiliCheck
subestimava o soro q u a n d o sua concentracão era > 10 m g / d L
(170 pmol/L). 1 1
Embora as dosagens transcutâneas de bilirrubina n ã o possam
substituir as determinações quantitativas laboratoriais, elas (1) íot-
necem informação instantânea, (2) reduzem a necessidade de deter-
minações de bilirrubina sérica, (3) p o u p a m lactentes do trauma
das picadas nos calcanhares e (4) são custo-efetivas Além disso,
elas são úteis em determinar se é necessário tirar sangue de u m
bebê ictérico para orientar o tratamento, tal como fototerapia ou
transfusão. U m a outra aplicação é predizer quais bebês necessita-
rão de a c o m p a n h a m e n t o de acordo com o n o m o g r a m a "hora-
especifico" de bilirrubina sérica. 6
Bilirrubina Urinária
C o m o s o m e n t e a bilirrubina conjugada é excretada na urina, sua
presença indica hiperbilirrubinemia conjugada. O m é t o d o mais
c o m u m e n t e usado para detectar bilirrubina na urina envolve o
uso de uma vareta impregnada com u m reagente diazo. O s
m é t o d o s de varetas detectam concentrações de bilirrubina tão
baixas q u a n t o 0,5 m g / d L .
U m a amostra fresca de urina é necessária p o r q u e a bilirru-
b i n a é instável q u a n d o exposta à luz e à temperatura ambiente,
e p o d e ser oxidada à biliverdina (a qual é diazo negativa) n o p H
n o r m a l m e n t e ácido da u r i n a . A tira reagente (Chemstrip, Roche
Diagnostics, Basel, Switzerland; Multistix, Siemens Diagnostics,
Tarrytown, N I ) é r a p i d a m e n t e imersa na amostra de urina, e a cor
é lida 60 segundos depois. O mecanismo de reação para a bilir-
rubina conjugada urinária é o m e s m o que o descrito n a Figura
28-11, exceto que o 2,6-diclorobenzeno-diazônio-tetrafluorobo-
rato (Chemstrip) e o sal 2,4-dicloroanilina diazónio (Multistix)
são os compostos diazo. Na prática, as varetas, as quais testam
u m a variedade de substâncias urinárias, são lidas por aparelhos
fotométricos (p. ex., Clinitek, Siemens Diagnostics, Tarrytown,
NI), que t a m b é m i m p r i m e m os resultados.
As tiras C h e m s t r i p e Multistix para a bilirrubina na urina são
testes altamente específicos e têm u m a baixa incidência de resul-
tados falso-positivos. E n t r e t a n t o , m e d i c a m e n t o s que colorem a
u r m a de vermelho ou q u e dão cor vermelha em meio ácido, tais
como a fenazopiridina, são conhecidos por produzirem leitura
falso-positiva. G r a n d e s quantidades de ácido ascórbico ou de
nitrito t a m b é m p i o r a m o limite d e detecção d o teste. N a prática,
a bilirrubina é r a r a m e n t e dosada na urma.
540 PARTE IV Analitos

REFERÊNCIAS 12. Fairbanks VF, Beutlei E. Iron metabolism. In: Beutler E, Lichtman MA,
Coller BS, Kipps T], Seligsohn U , eds. Williams hematology. New York
1. Berendt H L , Blakney GB, Clarke GM, Higgins TN. A case of p
McGraw-Hill, 2001:295-304.
tbalassemia major detected using H P L C in a child of Chinese ancestry
Clin Biochem 2000;33:311-13 13. Fairbanks VF, Brandhagen DJ. Disorders of iron storage and transport.
In: Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps TJ, Seligsohn U, eds
2. Berenstein LH, Kneifati-Hayek J, Riccioli A. Development a n d
Williams hematology. New York: McGraw-Hill, 2001:489-502.
validation of a beta thalassemia screening protocol. Clin C h e m 2004;51:
14. Higgins T, Beutler E, Doumas BT. Hemoglobin, iron, and bilirubin. In:
A177.
Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds Tietz textbook of clinicai
3. Beutler E. Disorders of iion metabolism In: Lichtman MA, Beutler E,
chemistry and molecular diagnostics. Philadelphia: Elsevier, 2006-
Kipps TJ, Seligsohn L), Kaushansky K, Prchal J, eds Williams
1165-208.
hematology. New York: McGraw-Hill, 2006:511-53.
15 Joutovsky A, Hadzi-Nesic J, Nardi MA. H P L C retention time as a
4- Beuder E, Felitti "V], Koziol JA, H o NI, Gelbart T. Penetrance of the
diagnostic tool for hemoglobin variants and hemoglobinopathies: a
845G—»A (C282Y) HFE hereditary haemochromatosis mutation in die
study of 60,000 samples in a clinicai diagnostic laboratory. Clin C h e m
U S A Lancet 2002;359:211-18.
2004;50:1736-47.
5. Beutler E. T h e HFE Cys282Tyr mutation as a necessaiy b u t not
16. Kakhlon O , Cabantchik Z1 T h e labile iron pool: characterizatíon,
sufficient cause of hereditary hemochromatosis. Blood 2003;101:3347-50
measurement, and participation in cellular processes. Free Radie Bi ol
6 Bhutani VK, Johnson L, Sivieri EM Predictive ability of predischarge
Med 2002;33-1037-46.
hour-specific serum bilirubin for subsequent significant
17. Lafferty JD, Ciowther MA, Ah MA, Levine ML. T h e evaluation of
hyperbihrubinemia in healthy term and near-term newbocns. Pedia trics
various mathematical R B C Índices and their efficiency in discriminating
1999,103:6-14
between thalassemic a n d non-thalassemic mícrocytosis. Am J Clin Path
7. Canais C, Remacha AF, Sarda MP, Piazuelo ]M, Royo MT, Romero MA.
1996;106:201-5.
Clinicai utility of the new Sysmex XE 2100 parameter—reticulocyte
18. Olynyk JK, Cullen D], Aquilia S, Rossi E, S u m m e m l l e L, Powell LW. A
hemoglobin equivalent—in the diagnosis of anemia. Haematologica
population-based study of the clinicai expression of the
2005;90:1133-4.
hemochromatosis gene. N Engl J Med 1999;341.718-24.
8. Cazzola M, May A, Bergamaschi G, Cerani P, Ferrillo S, Bishop DF.
19. O u C N , Rogneiud CL. Diagnosis of hemoglobinopathies:
Absent phenotypic expression of X-linked sideroblastic anemia in one of
electrophoresis vs. H P L C . Clin C h e m Acta 2001,313:187-94.
two brothers with a novel ALAS2 mutation. Blood 2002,100:4236-8.
20. Pietrangelo A Hereditary hemochromarasis-a new look at an old
9 Clarke G M , Higgins T N . Laboratory investigation of
disease. N Engl ] M e d 2004;350:2383-97-
hemoglobinopathies and dialassemias: review and update. Clin C h e m
21 Robertson A, Kazmjgrczak S, Vos P. Improved transou taneous
2000;46:1284-90.
bilirubinometry: comparison o f S p e c t R x BiliCheck and Minolra Jaundice
10. Dou mas BT, Poon PKC, Perry BW, et al. Candidate reference method
Meter |M 102 for estimating total serum bilirubin in a normal newborn
for deteTmination of total bilirubin m serum: Development and
validation. Clin C h e m 1985;31:1799-89 population. J Perinatol 2002;22:12-14
22. Sbayeghi M, Latunde-Dada G O , Oakhill JS, Laftah AH, Takeuchi K,
11. Engle W D , Jackson GL, Sendelbach D, M a n n i n g D, Fawley WTL
Assessment of a transcutarieous device in the evaluation of neonatal Halliday N, et al. Identification of an intestinal h e m e transporter. Celi
2005; 122:789-801.
hyperbilirubinemia m a primarily Hispanic population. Pediatrics
2002;110:61-7.
CAPÍTULO 2 9
Porfirinas e Doenças Associadas
ao Metabolismo das Porfirinas
Allan Deacon, B.S.C., Ph.D., F.R.C.Path., Sharon D. Whatley, Ph.D.,
OBJETIVOS
1. Definir os seguintes termos:
Porfirina
Porfobilinogênio
Porfiria
2. Descrever a via biossintética e as funções fisiológicas do heme.
3. Listar e descrever os sintomas das sete porfirias e os principais
intermediários com níveis aumentados associados a cada uma
delas.
4. Discutir a investigação laboratorial aplicada à clínica dos distúrbios
do metabolismo das porfirinas, incluindo os testes de rastreamento,
os métodos de análise e as possíveis interferências em cada um
deles.
5. Descrever os efeitos da toxicidade do chumbo na via biossintética
do heme.
PALAVRAS-CHAVE E D E F I N I Ç Õ E S
Porfirias Agudas: Doenças herdadas associadas à biossíntese d o
h e m e , caracterizadas p o r crises agudas causadas p o r
disfunções neuroviscerais; p o t e n c i a l m e n t e fatais;
diagnosticadas por níveis elevados de porfobilinogênio
(PBG) na urina.
Acido 5-Aminolevulínico (ALA): Precursor imediato do
porfobilinogênio; duas moléculas de ALA se c o m b i n a m
para formar u m a molécula de porfobilinogênio.
Coproporfirina: U m a porfirina c o m q u a t r o cadeias laterais d o
tipo metil e q u a t r o d o tipo ácido propiônico ligadas ao
suporte do tetrapirrol.
Porfirias Cutâneas: D o e n ç a s associadas à biossíntese do heme,
nas quais o acúmulo de porfirinas causa d a n o à pele
q u a n d o esta é exposta à luz solar.
Porfobilinogênio (PBG): Precursor imediato das porfirinas,
u m anel de pirrol com cadeias laterais do tipo acetil,
p r o p i o n i l e aminometil; q u a t r o moléculas de PBG se
c o n d e n s a m para f o r m a r u m a molécula de 1-
hidroximetilbilano, que é, então, convertido sucessivamente
a uroporfirinogênio-III, coproporfirinogênio-III,
protoporfirinogênio-IX, protoporfirma-IX e h e m e .
P o r f i r i n a s : Q u a l q u e r grupo de compostos c o n t e n d o a estrutura
de p o r f m a , q u a t r o anéis de pirrol ligados p o r pontes de
m e t e n o (ou pontes metênicas ou p o n t e s metenilas) e m u m a
configuração cíclica, a qual se ligam várias cadeias laterais.
Protoporfirina: U m a porfirina com quatro cadeias laterais do
tipo metil, duas do tipo vinil e duas do tipo ácido
propiônico ligadas ao s u p o r t e do tetrapirrol; o complexo
protoporfirma-lX-ferro, o heme, é o grupo prostético da
h e m o g l o b i n a , dos citocromos e de outras hemoproteínas.
Porfirias: U m grupo de doenças metabólicas principalmente
herdadas que resultam d e deficiências parciais das enzimas
e George H. Élder, M.D.
da biossíntese do heme, r e su l t a n d o em maior formação e
excreção de porfirinas, seus precursores, ou amhos.
Precursores de Porfirinas: A L A e PBG, os intermediários
biossintéticos, q u e são metabolizados a p o r f i r m o g ê n i o s e
porfirinas.
Uroporfirina: U m a p o r f i r i n a com q u a t r o cadeias laterais de
ácido acético e q u a t r o de ácido propiônico ligadas ao
suporte d o tetrapirrol.
Zinco-Protoporfirina (ZPP): U m s u b p r o d u t o normal, mas de
m e n o r importância, da biossíntese d o heme, e n c o n t r a d o
nos eritrócitos; q u a n d o o Fe(ll) disponível é insuficiente
para a biossíntese d o h e m e , mais ZPP é f o r m a d o .
A
s porfirias constituem u m g r u p o de doenças caracteriza-
das pela deficiência em u m a das enzimas da biossíntese
d o h e m e , o q u e resulta em s u p e r p r o d u ç ã o de intermedi-
ários da via.1 Estes intermediários são excretados em q u a n t i d a d e s
excessivas n a urina, nas fezes, ou em ambos. As conseqüências
clínicas d e p e n d e m da natureza dos precursores do h e m e q u e se
a c u m u l a m . Nas porfirias agudas, os precursores de porfirinas em
excesso (ácido 5-aminolevulínico [ALA] e porfobilinogênio
[PBG]) estão associados às crises agudas p o t e n c i a l m e n t e fatais
causadas por disfunções neuroviscerais, que são f r e q ü e n t e m e n t e
provocadas p o r u m a variedade de drogas c o m u m e n t e prescritas,
fatores h o r m o n a i s , álcool, jejum prolongado, estresse ou infec-
ção. Nas porfirias não-agudas e nas porfirias agudas em que a pele
p o d e ser afetada, o a c ú m u l o de porfirinas resulta em fotossensi-
bilização e lesões na pele. O diagnóstico d e p e n d e da investigação
laboratorial para d e m o n s t r a r o p a d r ã o de acúmulo do precursor
d o h e m e específico para cada tipo de porfiria e requer a análise
de amostras apropriadas para os metabólitos-chave u s a n d o
m é t o d o s suficientemente sensíveis e específicos.
O s avanços técnicos n a área de genética molecular possibili-
t a m investigar muitas porfirias ao nível molecular. E m b o r a n ã o
sejam essenciais para o diagnóstico de casos sintomáticos, estas
técnicas estão se t o m a n d o cada vez mais valiosas na investigação
de famílias com porfiria.
PORFIRINAS E QUÍMICA DO HEME
Antes de se discutirem a síntese das porfirinas e as doenças asso-
ciadas ao seu metabolismo, a estrutura, a n o m e n c l a t u r a e as carac-
terísticas químicas desse grupo d e compostos serão revisadas.
Estrutura e N o m e n c l a t u r a d a s Porfirinas
A estrutura básica das porfirinas consiste e m q u a t r o anéis m o n o -
pirrólicos ligados por pontes de m e t e n o (ou pontes metênicas ou
pontes metenilas) para f o r m a r u m anel tetrapirrólico (Figura 29-
1). M u i t o s compostos de p o r f i r i n a são conhecidos, mas apenas
u m n ú m e r o limitado é de interesse clínico. O s compostos de
541
542 PARTE IV Analitos

porfirina relevantes para as porfirias (Tabela 29-1) diferem nos
substituintes que ocupam as posições periféricas 1 a 8. Variação
na distribuição d o s m e s m o s substituintes nas posições periféricas
d o anel de tetrapirrol origina isômeros de porfirinas, que são
geralmente representados por algarismos romanos (isto é, I, II,
III etc.). A forma reduzida de uma porfirina é conhecida c o m o
porfirinogênio (Figura 29-1) e difere pela presença de seis hidrogê-
nios adicionais (quatro nas pontes de meteno e dois em nitrogênios
presentes nos anéis). O s porfirinogênios são instáveis in viera e
são e s p o n t a n e a m e n t e oxidados a suas porfirinas corresponden-
tes. Sob baixas tensões de oxigênio na célula, os porfirinogênios
são estáveis e formam os intermediários da via de síntese d o heme;
a aromatização da protoporfirina, na penúltima etapa da via,
requer uma enzima.
Quelação de Metais
O arranjo dos quatro átomos de nitrogênio n o centro do anel de
porfirina faz c o m que as porfirinas possam quelar vários íons
metálicos. A p r o t o p o r f i r i n a que c o n t é m ferro é conhecida c o m o
heme; o ferro-heme refere-se especificamente ao c o m p l e x o Fe2" e
o ferri-heme ao F e 3 \ O ferri-heme associado ao contra-íon cloreto
é c o n h e c i d o c o m o hemina, o u hematina q u a n d o o contra-íon é
hidróxido.
Propriedades Espectrais
As porfirinas são denominadas a partir da palavra grega para
"roxo" {parphyra), e sua cor está relacionada à estrutura d e dupla
ligação conjugada d o anel tetrapirrólico. Os porfirinogênios não
têm ligações duplas conjugadas e são, portanto, incolores. As
porfirinas possuem uma absorvância particularmente intensa
próximo a 4 0 0 nm, f r e q ü e n t e m e n t e d e n o m i n a d a banda Soret.
Q u a n d o expostas à luz na tegião de 4 0 0 nm, as porfirinas revelam
uma fluorescência vermelho-alaranjada característica na faixa de
5 5 0 a 6 5 0 n m . A absorvância e a fluorescência são alteradas pelos
substituintes ao redor do anel de porfirina e pelo metal ligante.
A quelação d o zinco altera o pico de fluorescência da protopor-
firina para comprimentos de onda mais curtos e reduz a intensi-
dade da fluorescência. A ligação forte d o ferro altera a natureza
da protoporfirina de tal forma que o h e m e não apresenta fluo-
rescência significante.
Solubilidade
As porfirinas são apenas levemente solúveis em água. As solubilida-
des diferentes de cada porfirina são importantes não somente para
o desenho dos métodos analíticos para sua extração e fraciona-
mento, mas também para a determinação da rota de sua excreção
do corpo. Em pH 7, os grupos carboxila se encontram ionizados e
a molécula tem uma carga líquida negativa. Abaixo de pH 2, os
nitrogênios pirrólicos e os grupos carboxila se tornam protonados,
de forma que a molécula apresenta uma carga líquida positiva.
Em p H fisiológico, a solubilidade de uma dada porfirina é
determinada pelo número de grupos carboxila substituintes. A
uroporfirina tem oito grupos carboxilato e é a porfirina mais
solúvel em m e i o aquoso. A protoporfirina tem somente dois grupos
carboxilato e é basicamente insolúvel em água, mas se dissolve
rapidamente em meios lipídicos e se liga prontamente às regiões
hidrofóbicas de proteínas, tais c o m o a albumina. A coproporfirina,
com quatro grupos carboxilato, tem solubilidade intermediária.

Precursores das Porfirinas

A L A e PBG são conhecidos c o m o precursores das porfirinas
(Figura 29-2). Algumas vezes, o ALA é chamado aminolevulinato
(para enfatizar sua natureza tônica em p H fisiológico). O PBG
contém u m único anel pirrol (ao contrário das porfirinas que
contêm quatro) e é freqüentemente denominado monopirroí. O
PBG polimeriza rapidamente, em particular a altas concentrações
em solução ácida, para formar principalmente o isômero I da uro-
porfirina. A m b o s ALA e PBG são altamente solúveis em água.
Porfirina Por fi rini nogênio
Biossíntese do Heme
Figura 2 9 - 1 Representações de porfirina e porfirinogênio. O
A estrutura complexa d o anel tetrapirrólico do heme é constru-
sistema de numeração e as denominações do anel são baseados no
ído de forma gradativa a partir dos precursores muito simples
sistema de Fischer.

TABELA 2 9 - 1 Substituintes ao Redor do Maerociclo das Porfirinas dc Importância Clínica

POSIÇÃO
Porfirina 1 2 3 4 5 6 7 8

Uroporfirira-I Cm Cgi cm Cet cm Cet Cm Ce,

Urcporfirina-lll Cm ^e! cm Ce< cm c« C(i cm
Porfirina heptacarhoxilato-lll cm Ca Cm Cel cm C* C„ Me
Porfirina tiexacarboxilato-lll Me Ce, cra Cel cm Cl, C(i Me
Porfirina pentacarboxilatc-lll Me Cg Me CEI cm Cel Cet Me
Coproporíirina-lll Me CE, Me C£, Me Cel c„ Me
Coproporfirina-I Me Cet Me Cet Me CBt Me Cet
Isocoproporfirina Me Et Me CEt c. Cet Cet Me
Desidroisocoproporfirina Me Vn Me Cet Cm Cet Cet Me
Deetilisocoproporfirina Me H Me Cet cm Cet CBt Me
Protoporfirina Me Vn Me Vn Me Cet Cet Me
Pemptoporfirina Me H Me Vn Me Cel Cít Me
Deuteroporfirina Me H Me H Me Cd c„ Me
Mesopcrfifina Me Et Me Et Me Cel Cel Me

C™. Mrimtmcri! (—CHjCOOH); C„, caibmieiil (-CH 2 CH ; COOH); Me, me til (-CH,); Et, etil (-CH 3 CH,); Vn, vinil (-CH-CH,).
 Porfirinas e Doenças Associadas ao Metabolismo das Porfirinas CAPÍTULO 2 9 543

Mitocôndria Citüssol
2 ALA
Succinil-CoA
Glicina
S—CoA
PBG

> + "iK. X .
UtJ <".w Cs»
o ruK \ '•'> Porfobilinogênio (PBG)
no N'
ALA sintasf

O
/
3 i>uc;
KQ A .NH; Hidroxiínetiibil/Jno
íiníasÊ (Também
O Ácido aminolevulinico espontâneo)
(AL/0
Vii Mv Ctl Cm
Cra^ "r^yf-LKl
\ -s-M N- J \ -.\'K 1 jfi _ f
f A X",1
.c • Heme tio— ' \ Hidroximerilbilano
/ s " ff
>-N N-\ /-Vir ItK—A

,Cc. Cu fct

Ferraquelatase
Urop orfiri n age nío- / JI
/
/ (Espontâneo,

Vn Mc
/ r.-A C*l Cm
M . - V n Crt->0 Y' Ca v-;
\=-'-v -HN J( \ .Mv hin j / v _NJr i ir\ .{/
f \

/ - MH M- -• ,>t-NH i:x - A--NH

Ca
Kí«"\ ,'v,^ / M< » Ctl •' j.>_ / C m
CJI Ce: c.ti Tj« Cie. ('.cr
Proroporfirina IX Uropoifirinogênio III Uroporfirinogênio I

Fmioporfi-rinogÊnlo Umporfirinogênio UVúfior/ ÍTEn ogéni o

oxidase descarboxílase descarbnxilasc
Vn Me iJcr Mc Cei
..VI Mj, a 'r;V r::" .y Cc; f»<C " ' Y ' ^V ::::N >- Ce '
VJÕJ ;rfi . •? Coproporfirinoginio % js|>t J{ i- -NH H J
\ oxidase
;ir RN- < ,í-x:t itN Vv-Ml
- IIK--Á
rt I : V
Kir Mv" > Mc
• ' \ Â y V M í
Cvl Ct* Cot Ccl Me Cel

Procoporfirinogênio IX C op t'up oi fí ri n o g ê 111 o III Coproporfirinogênio I

V
Figura 2 9 - 2 Via biossintétia de porfirinas e h e m e . C c t , - C H i C H ^ C O O H ,
C m , - C H j C O O H , Me, - C H , ; Vn, - C H = C H : .

succinihcoenzima A (CoA) e glicma (Figura 29-2).' A via está
presente em todas as células nucleadas, e estima-se que a síntese
diária de h e m e em h u m a n o s é de 5 a 8 m m o l / k g de peso do
corpo. A via é compartimentalizada com algumas etapas ocor-
r e n d o na m i t o c ô n d r i a e outras n o citoplasma. Pouco se sabe
sobre o transporte dos intermediários através da m e m b r a n a
mitocondrial, e n e n h u m defeito n o transporte foi relatado até
o m o m e n t o nas porfirias.
5-Aminolevulinato Sintase (EC 2.3.1.37% ALAS
O ALAS é a enzima inicial da via e catalisa a formação de A L A
a partir de succinil-CoA e glicina. A enzima é mitocondrial e
requer piridoxal fosfato c o m o co-fator, que forma u m a base de
Schiff com o grupo a m i n o da glicma na superfície da enzima.
O carbânion da base de Schiff desloca a C o A d o succmil-CoA,
com a formação do ácido a-ammo-f3-cetoadípico, que é, então,
descarboxilado a ALA. A atividade de ALAS é limitante da taxa
de sintese de h e m e desde que a capacidade catalítica das outras
enzimas da via esteja n o r m a l .
Ácido 5-Aminolevulinico Desidratase (EC 4.2.1.24),
ALAD
O A L A D ( t a m b é m conhecido c o m o porfobilinogênio sintase) é
u m a enzima citoplasmática q u e catalisa a formação do PBG
544 PARTE IV Analitos
monopirrólico a partir de duas moléculas de A I A , c o m a elimi-
nação de duas moléculas de água. A enzima requer íons de zinco
c o m o co-fator e grupos sulfidrila reduzidas no sítio ativo, sendo,
portanto, suscetível à inibição por chumbo.
Hidroximetilbilano Sintase (EC 2.5.1.61), HMBS
A H M B S (também conhecida c o m o PBG desaminase) é uma
enzima cito plasmática que catalisa a formação de uma molécula
do tetTapirrol linear 1-hidroximetilbilano (HMB; t a m b é m deno-
m i n a d o pré-uroporfirínogênio) a partir de quatro moléculas de
PBG, com a liberação de quatro moléculas de amónia. A e m i m a
é suscetível à inibição alostérica por intermediários de etapas
posteriores da via biossintética d o heme, especialmente copropor-
firinogênio-III e protoporfirinogênio-IX. 1 3
Uroporfirinogênio-Hl Sintase (EC 4.2.1.75), UROS
A U R O S é uma enzima citoplasmática que rearranja e torna
cíclico o H M B para formar o uroporfirinogênio-III. Cada anel de
pirrol de H M B contém u m substituinte metilcarboxilato e u m
etilcarboxilato, que estão na mesma orientação. Pela rotação de
n e n h u m , um, ou dois anéis pirrólicos alternados o u adjacentes,
é possível chegaT aos quatro diferentes isômeros. A l é m de fechar
a estrutura de anel, a enzima Toda o anel D via u m intermediário
espirano, produzindo o isômero tipo III - esta rotação é vital
porque somente o isômero tipo III contribui para a biossíntese de
heme. O H M B é instável, e, nas porfirias em que o excesso de
H M B se acumula, a ciclização ocorre não enzimaticamente com
a formação d o isômero tipo I. Normalmente, apenas quantidades
mínimas de uroporfirinogênio-I são formadas.
Uroporfirinogênio Descarboxilase (EC 4.1.1.37),
UROD
Esta é a última enzima citoplasmática da via e catalisa a descarbo-
xilação dcs quatro grupos carboximetil para formar o coproporfi-
rinogênio tetracarboxílico. A enzima usa ambos os isômeros I e
III de uroporfirinogênio c o m o substrato. A descarboxilação se
inicia n o anel D e procede gradualmente através dos anéis A, B
e C, c o m a formação dos intermediários heptacarboxilato, hexa-
carboxilato e pentacarboxilato em um único sítio ativo. A defici-
ência de U R O D causa acúmulo destes intermediários além de seu
substrato, uroporfirinogênio. Hm altas concentrações de subs-
trato, a descaTboxilação ocorre por u m mecanismo aleatório.
Coproporfirinogênio Oxida se (EC 1.3.3.3), CPO
A C P O está situada n o espaço intermembranas da mitocôndria
e catalisa a descarboxilação oxidaliva seqüencial dos grupos 2- e
4-carboxietil a grupos vinil para produzir o protoporfirinogênio-
IX mais lipofílico, c o m a formação de um intermediário tricar-
boxílico, o harderoporfirinogênio. O oxigénio é necessário c o m o
oxidante. A enzima requer grupos sulfidrila para sua atividade, o
que a torna alvo da inibição por metais. A enzima é específica
para o isômero tipo III, assim o metabolismo da série 1 das por-
firinas não ocorre além do coproporfirinogênio-I. O produto da
enzima difere do substrato pelo fato de a substituição de dois dos
grupos carboxietil por grupos vinil introduzir u m terceiro substi-
tuinte na molécula. Portanto o n ú m e r o de possíveis formas iso-
méricas aumenta e, por convenção, o sistema de numeração
muda, de forma que o isômero III se torna o isômero IX. N o s
estados de deficiência de U R O D , u m dos grupos etilcarboxilato
do porfirinogênio pentacarboxilato acumulado é descarboxilado
por u m mecanismo desconhecido para formar as séries de isoco-
proporfirina das porfirinas.
Pro topo rfirin ogênio Oxida se (EC 1.3.3.4), PPOX
A PPOX é uma flavoproteína localizada na membrana mitocon-
drial interna e catalisa a remoção de seis hidrogênios (quatro das
pontes de meteno e dois dos nitrogênios d o anel) para formar a
protoporfirina-IX. A oxidação não-enzimática também ocorre m
nitro. C o n t u d o , sob a tensão de oxigênio da célula, a PPOX é
essencial para a oxidação ocorrer. A protoporfirina produzida é
a única porfirina que funciona na via d o heme. Outras porfirinas
são produzidas por oxidação não-enzimática e representam por-
firinogênios que escaparam irreversivelmente da via.
Ferroquelatase (EC 4.39.1.1), FECH
A F E C H (também d e n o m i n a d a h e m e sintase) é uma proteína
ferro-enxofre localizada na membrana mitocondrial interna. Esta
enzima insere íon ferroso na protoporfirina para formar heme.
Durante este processo, dois hidrogênios são retirados dos nitro-
gênios do anel. Outros metais n o estado divalente também
atuarão c o m o substrato, produzindo o quelato correspondente
(p. ex., incorporação de Zn 24 na protoporfirina para produzir
zinco-protoporfirina [ZPP]). N o s estados de deficiência de ferro,
Zn 2+ compete com sucesso c o m o Fe 2+ nos eritTÓcitos em forma-
ção, de forma que a concentração de zinco-protoporfirina nos
eritrócitos aumenta. Além disso, outras porfirinas dicarboxílicas
também servirão c o m o substratos (p. ex., mesoporfirina).
Função do Heme
O h e m e funciona c o m o u m grupo prostético e m várias proteínas,
nas quais, d e p e n d e n d o de sua função, o ferro muda livremente
entre os estados de valência V e 3T. D e 70% a 8 0 % da síntese
de h e m e ocorre na medula óssea e aproximadamente u m p o u c o
mais de 15% no fígado. As proteínas que c o n t ê m h e m e partici-
pam dc u m a variedade de reações ledox, incluindo:
1. Transporte de oxigênio (pela h emoglob in a no sangue) e arma-
zenamento (pela mioglobina n o músculo)
2. Respiração mitocondrial (pelos citocromos bi, cL e a3)
3. Destruição enzimática de peróxidos (pela catalase e peroxi-
dase)
4. Metabolismo de drogas (pelas oxidases de função mista d o
citocromo P-450 microssômico)
5. Dessaturação de ácidos graxos (pelo citocromo bs microssô-
mico)
6. Metabolismo do triptofano (pela triptofano oxigenase)
Reações d o óxido nítrico (NO) são freqüentemente mediadas
pela reação do h e m e com N O e m enzimas-controle, tais c o m o
guanilato ciclase.
Outros derivados tetrapirrólicos que ocorrem naturalmente
incluem a vitamina B 12 e a clorofila, cada uma das quais contendo,
respectivamente, u m átomo de cobalto o u magnésio quclado.
Excreção de Precursores do Heme
Normalmente, apenas quantidades insignificantes dos precurso-
res se acumulam n o corpo. A rota de excreção d e p e n d e grande-
mente da solubilidade. O s precursores de porfirinas A L A e PBG
são hidrossolúveis e são excretados quase exclusivamente na
urina. O uroporfirinogênio, com oito grupos carboxilato, é pron-
tamente solúvel em água e também é excretado via rim. O último
intermediário da via, a protoporfirina (e também o protoporfiri-
nogênio), que tem s o m e n t e dois grupos carboxilato, é insolúvel
e m água e é excretado nas fezes via trato biliar. As outras porfi-
rinas são de solubilidade intermediária e aparecem tanto na urina
c o m o nas fezes. O coproporfirinogênio-I é retirado e excretado
pelo fígado preferencialmente e m relação ao isômero III, de
forma que o coproporfirinogênio-I predomina nas fezes e o
coproporfirinogênio-III, na urina. Todos os porfirinogênios na
 Porfirinas e Doenças Associadas ao Metabolismo das Porfirinas
u r i n a ou nas fezes são l e n t a m e n t e o x i d a d o s às p o r f i r i n a s corres-
pondentes.
U m a vez n o i n t e s t i n o , as p o r f i r i n a s são suscetíveis à m o d i f i -
cação pela m i c r o b i o t a intestinal. O s dois g r u p o s vinil da proto-
p o r f i r i n a são reduzidos a g r u p o s etil, h i d r a t a d o s a g r u p o s h i d r o -
xietil, ou r e m o v i d o s , o r i g i n a n d o u m a v a r i e d a d e de p o r f i r i n a s
s e c u n d á r i a s . A m i c r o b i o t a intestinal p o d e t a m b é m metabolizar
o h e m e (se d e o r i g e m a l i m e n t a r , c o m o c o m p o n e n t e s d e células
esfoliadas da m u c o s a intestinal, ou de s a n g r a m e n t o gastrointes-
tinal) para p r o d u z i r u m a v a r i e d a d e de p o r f i r i n a s dicarboxílicas.
A l é m disso, algumas bactérias são capazes de síntese de novo d e
porfirinas.
Regulação da Biossíntese do Heme
O s u p r i m e n t o de h e m e e m t o d o s os tecidos é c o n t r o l a d o pela
atividade d e A L A S m i t o c o n d r i a l , a p r i m e i r a enzima d a via.
Existem duas isoformas de A L A S . A i s o f o r m a u b í q u a , A L A S 1 ,
é codificada p o r u m gene d o c r o m o s s o m o 3 p 2 1 e expressa e m
t o d o s os tecidos. P o r q u e t e m u m a meia-vida d e a p e n a s aproxi-
m a d a m e n t e u m a hoxa, m u d a n ç a s e m sua taxa d e síntese p r o d u -
zem alterações a c u r t o p r a z o n a c o n c e n t r a ç ã o d a e n z i m a e n a
atividade celular de ALAS. A síntese de A L A S 1 está sob c o n t r o l e
de "feedback" negativo pelo h e m e . N o fígado, m a s n ã o n a m a i o r i a
dos o u t r o s tecidos, A L A S 1 é i n d u z i d a p o r u m a g r a n d e g a m a de
drogas e p r o d u t o s q u í m i c o s q u e i n d u z e m as oxidases d e p e n d e n -
tes de citocTomo m i c r o s s ô m i c o P-450 (CYFs). P r o v a v e l m e n t e
este efeito é m e d i a d o p r i n c i p a l m e n t e pela ativação t r a n s c r i c i o n a l
direta por receptores n u c l e a r e s de resposta a droga, e m vez de
seT pela depleção de u m a m i s t u r a r e g u l a d o r a d e h e m e intracelu-
lar c o m o c o n s e q ü ê n c i a d o u s o d e h e m e para a m o n t a g e m d e
CYP. A i n d u ç ã o d e A L A S 1 é i m p e d i d a pelo h e m e , q u e atua
desestabilizando o ácido r i b o n u c l é i c o m e n s a g e i r o ( m R N A ) d e
A L A S 1 , b l o q u e a n d o a e n t r a d a d e p r é - A L A S l n a m i t o c ô n d r i a e,
possivelmente, i n i b i n d o sua transcrição.
A i s o f o r m a eritróide, ALAS2, é c o d i f i c a d a p o r u m gene d o
c r o m o s s o m o Xq21-22 e é expressa s o n t e n t e nas células eritróides.
S u a atividade é regulada p o r dois m e c a n i s m o s distintos. A trans-
crição é a u m e n t a d a d u r a n t e a diferenciação eritróide pela ação
d e fatores de transcrição eritróide-específicos, e as c o n c e n t r a ç õ e s
de m R N A são reguladas p o r ferro. A deficiência de ferro n a s
células eritróides p r o m o v e a ligação específica d e p r o t e í n a s regu-
ladoras d e ferro a e l e m e n t o s de resposta ao ferro n a região 5'
TABELA 2 9 - 2 I Os Principais Tipos de Porfiria Humana
Enzima
Doença defeituosa
PORFIRIAS AGUDAS
Porfiria de deficiência de ALA desidratase (ALADP) ALAD
Porfiria intermitente aguda (AIP) HMBS
Coproporfiria hereditária (HCP) CPO
Porfiria variegata (VP) PPOX
PORFIRIAS NÃO-AGUDAS
Porfiria eritropoiética congênita (CEP) UROS
Porfiria cutanea tarda (PCT) UROD
Pratoporfiria eritropoiética (EPP) FECH
(principalmente AD)
AR, ãuiossõmím recessiuo; AD, autossômico dominante.
* Prevalência estimada da doença clinicamente evideme no Reino Unido,
f
Lesões de pele. e crises neuroviscerais podem ocorrer isoladamente ou ao ttiísmo tempo.
frágil, bclha.
CAPÍTULO 2 9 S4S
n ã o traduzida ( U T R ) d o m R N A de A L A S 2 , c o m c o n s e q ü e n t e
inibição da tradução.
AS PRINCIPAIS DOENÇAS ASSOCIADAS ÀS
PORFIRINAS
A s porfirias c o n s t i t u e m u m g r u p o d e d o e n ç a s m e t a b ó l i c a s q u e
r e s u l t a m de deficiências parciais das enzimas da biossíntese d o
h e m e 1 (Tabela 29-2). T o d a s são h e r d a d a s e m p a d r õ e s m o n o g ê n i -
cos, c o m exceção de algumas f o r m a s d e p o r f i r i a cutanea tarda
(PCT) e de tipos raros d e p o r f i r i a eritropoiética. U m n ú m e r o
g r a n d e de m u t a ç õ e s d o t i p o doença-específica já foi i d e n t i f i c a d o
e m cada u m d o s genes q u e c o d i f i c a m as enzimas defeituosas
(www.hgmd.cf.ac.uk). C a d a tipo de p o r f i r i a é d e f i n i d o pela asso-
ciação d e características clínicas típicas c o m u m p a d r ã o especí-
fico d e a c ú m u l o de p r e c u r s o r e s d o h e m e , q u e reflete u m a m a i o r
f o r m a ç ã o de substratos p a r a a e n z i m a d e f i c i e n t e n a q u e l e t i p o de
p o r f i r i a (Tabela 29-3).
A s porfirias são caracterizadas c l i n i c a m e n t e p o r duas carac-
terísticas principais; lesões d e pele e m áreas expostas ao sol e
crises neuroviscerais agudas, c o m p r e e n d e n d o t i p i c a m e n t e d o r
a b d o m i n a l , n e u r o p a t i a periférica e d i s t ú r b i o m e n t a l . As lesões
de pele são causadas p o r f o t o d a n o catalisado p o r p o r f i r i n a s , e m
q u e o oxigênio singlete é o p r i n c i p a l m e d i a d o r . Crises agudas
estão associadas ao a u m e n t o da f o r m a ç ã o d e A L A a p a r t i r da
atividade i n d u z i d a de A L A S 1 hepática e deficiência parcial d o
h e m e h e p á t i c o , f r e q u e n t e m e n t e e m resposta à i n d u ç ã o de CYPs
hepáticos p o r drogas e o u t r o s fatores. A relação e n t r e essas alte-
rações b i o q u í m i c a s e a d i s f u n ç ã o n e u r o n a l q u e f u n d a m e n t a
todas as características clínicas da crise a g u d a n ã o é c o n h e c i d a .
N a Tabela 29-2, as p o r f i r i a s são divididas e m p o r f i r i a s agudas,
n a s quais o c o r r e m as crises neuroviscerais agudas, e as p o r f i r i a s
não-agudas.
Porfirias Agudas
O defeito h e r d a d o e m cada u m a das porfirias agudas a u t o s s ô m i -
cas d o m i n a n t e s [porfiria i n t e r m i t e n t e aguda (AIP), p o r f i r i a varie-
gata (VP) e c o p r o p o r f i r i a h e r e d i t á r i a ( H C P ) ] é u m a m u t a ç ã o q u e
leva à inativação total o u quase total de u m dos pares d e alelos
q u e c o d i f i c a m a enzima cuja deficiência parcial causa a d o e n ç a .
A s atividades enzimáticas são, p o r t a n t o , quase n o r m a i s e m t o d o s
os tecidos e m q u e elas são expressas, r e f l e t i n d o a atividade d o
gene n o r m a l sobre a d o alelo m u t a n t e . O f o r n e c i m e n t o d e h e m e
Crises Lesões
Prevalência * Neuroviscerais de pele Herança
muito rara + - AR
1-2:100.000 + - AD
1-2:1.000.000 + + t,t AD
1:250.000 +u AD
1:1.000.000 - +* AR
1:25.000 - +* Complexa (20% AD)
1:130.000 - Complexa
546 PARTE IV Analitos

TABELA 2 9 - 3 As Porfirias: Padrões de Superprodução dos Precursores do H e m e durante a Fase Clinicamente Evidente da
Doença
Pico de Emissão
PBG/ALA Porfirinas nos de Fluorescência
Porfiria na Urina Porfirinas na Urina Porfirinas nas Fezes Eritrócitos do Plasma

ALADP ALA Copro-lll Não aumentada Zn-proto -

AIP PBG > ALA Principalmente uropnrlírina Normal nu leve aumento Não aumentada 615 a 620 nmb
a partir de PBG de Copro, P roto3
CEP Não aumentada Uro-I, Copro-I Copro-I Zn-proto, Prato, 615 a 620 nm
Copro-I, üro-l
PCT Não aumentada Uro, Heptac Isocopro, Heptac Não aumentada 615 a 620 nm
d
HCP PBG > ALA Copro-lll, uroportirína a Copro-lll Mão aumentada 615 a 620 nmb
partir de PBG
VP PBG > ALAd Copro-lll, uroportirína a Proto-lX > Copro-lll, Não aumentada 624 a 628 nm
partir de PBG X-porfirina
EPP Não aumentada Não aumentada ± Preto® Proto 626 a 634 nm'

"A porfirina total pode estar aumentada por ~ausa da presença de uToporfirina em excesso.
h
Nem sempre aumentada durante a crise agu la.
'0uiras porfirinas meüIÍZÍTLaxiLa [OJMbsti íwídíU estão aumentadas em uma menor extensão; urofwr/ÍTTna é uma mistura tios isfimerots dos tipos I e 111; porfirina
hepiacaThaxilata è
tmncijjãimente do tipo ilJ.
''PBG e ALA podem estar normais quando há apenas lesões de pele
"Nd o aumentada em afrroxitnadamente 40% dos pacienta.
'Protofor/irina ligada à globina (se acorre liemólije na üTnasüraJ tem um pica em 626 a 628nm.

mantido e m quantidades normais ou próximas d o normal pela
maior expressão de ALAS, c o m u m conseqüente a u m e n t o da
concentração de substrato da enzima defeituosa. Essas mudanças
compensatórias variam entre tecidos, sendo ruais proeminentes
n o fígado e imperceptível na maioria dos outros órgãos, e entre
indivíduos. Portanto, em todas as porfirias agudas autossômicas
dominantes, alguns indivíduos não mostram evidências de super-
produção de precursores do heme, enquanto outros têm a doença
manifestada bioquicamente c o m ou sem sintomas clínicos. A
baixa penetrância clínica é uma característica relevante de todas
as porfirias agudas autossômicas dominantes. Estudos de famílias
indicam que aproximadamente 8 0 % dos indivíduos afetados são
assintomáticos ao longo da vida. Complicações a longo prazo de
porfiria aguda incluem doença renal crônica, hipertensão e car-
cinoma hepatocelular. 1
E m AIP, o principal defeito é uma deficiência de HMBS, a qual
Tesulta em acúmulo de seu substrato PBG (e em menor extensão
de ALA). Em V P e HCP, as deficiências herdadas de enzimas de
etapas posteriores da via levam ao acúmulo de porfirinogênies, que
são potentes inibidores alostéricos de HMBS 1 1 e levam ao acúmulo
secundário de PBG (e ALA). N a doença recessiva muito rara,
ALADP, uma deficiência herdada de A L A D resulta em acúmulo
de ALA e coproporfirina-III, mas não de PBG.
As crises agudas neuroviscerais, potencialmente fatais, que
ocorrem em AIP, VP e H C P são clinicamente idênticas. 10 Crises
agudas são mais c o m u n s em mulheres, com a primeira ocorrência
geralmente entre 15 e 4 0 anos, e são muitos raras antes da puber-
dade.
As crises agudas quase sempre começam com dor abdominal,
que rapidamente se torna muito forte, mas não é acompanhada
por peritonismo ou outros sinais de uma condição cirúrgica
aguda A dor pode ocorrer também nas costas e nas coxas,
p o d e n d o ocasionalmente ser mais forte nestas regiões. Sintomas
de neuropatia autonômica, tais c o m o vômito, constipação, taqui'
cardia e hipertensão, são freqüentes. As convulsões, quando
ocorrem, são muitas vezes causadas por hiponatremia. A dor pode
desaparecer dentro "3e poucos dias, mas, em casos graves, uma
neuropatia motora predominante se desenvolve e pode progredir
para quadriparesia flácida. D o r e vômito persistentes p o d e m levar
à perda de peso e à má nutrição. A fase aguda pode ser acompa-
nhada por confusão mental c o m alterações abruptas de humor,
alucinações e outros traços psicóticos. Entretanto, essas perturba-
ções mentais desaparecem com remissão. A doença psiquiátrica
persistente não é uma característica das porfirias agudas, embora
alguns pacientes possam apresentar ansiedade ou depressão leves.
A dor abdominal geralmente desaparece dentro de duas semanas,
mas a recuperação da neuropatia pode levar muitos meses e nem
sempre é completa. A maioria dos pacientes tem uma ou poucas
crises seguidas de recuperação completa e remissão prolongada,
A p r o x i m a d a m e n t e 5 % têm crises agudas repetidas que, e m mulhe-
res, p o d e m ocorrer n o período pré-menstrual.
Fatores desencadeantes p o d e m ser identificados e m quase
dois terços dos pacientes que têm crises agudas. Os mais impor-
tantes são as drogas, álcool, especialmente quando o c o n s u m o é
excessivo, o ciclo menstrual, gravidez, restrição calórica, infecção
e estresse. As drogas que provocam crises agudas incluem barbi-
turatos, sulfonamidas, progesteronas e a maioria dos anticonvul-
sivos, mas muitas outras estão envolvidas na precipitação de crises
agudas 1 (www.porphyria-europe.com). Muitos desses fatores desen-
cadeantes induzem CYPs hepáticos.
Lesões de pele similares às de P C T e de outras porfirias que
se manifestam com bolhas estão presentes e m aproximadamente
8 0 % de pacientes com VP clinicamente manifestada (Tabela 29-
2). Aproximadamente 6 0 % dos pacientes com esta condição têm
apenas lesões de pele. A pele é mais raramente afetada em HCP;
lesões de pele sem uma crise aguda são i n c o m u n s e são geral-
mente provocadas por colestase intercorrente.
Porfirias Não-agudas
Estas se enquadram em duas categorias, d e p e n d e n d o se os
pacientes têm lesões de pele c o m bolhas o u fotossensibilidade
aguda.
 Porfirinas e Doenças Associadas ao Metabolismo das Porfirinas
Porfirias Não-agudas com Lesões de Pele com
Bolhas
Estas incluem a P C T e a porfiria eritropoiética congênita (CEP).
A l é m disso, nas porfirias agudas, V P e H C P , p o d e m ocorrer lesões
de pele idênticas. Lesões n a pele exposta ao sol, p a r t i c u l a r m e n t e
a dos dorsos das mãos, d o antebraço e d a face, estão presentes e m
todos os pacientes. O a u m e n t o da fragilidade mecânica da pele,
com t r a u m a trivial levando a feridas e bolhas subepidérmicas,
ocorre e m p r a t i c a m e n t e t o d o s os pacientes. A hipertricose n a face
e a p i g m e n t a ç ã o n ã o u n i f o r m e são t a m b é m c o m u n s . As feridas e
bolhas cicatrizam l e n t a m e n t e , d e i x a n d o cicatrizes atróficas, acnes
e áreas desptgmentadas. A C E P é u m a condição t a r a que ocorre
geralmente n a primeira infância e é transmitida e m u m p a d r ã o
recessivo autossômico. As lesões de pele se assemelham às da PCT,
V P e H C P , mas são mais graves e persistem d u r a n t e a vida. C o m
a idade, a cicatrização progressiva, p a r t i c u l a r m e n t e se as feridas se
t o r n a m infectadas, e as alterações atróficas levam à f o t o m u t i l a ç ã o
c o m erosões das falanges terminais, à destruição das orelhas, d o
nariz e da pálpebra, e à alopecia. O a c ú m u l o de p o r f i r i n a s n o s
ossos é visível c o m o a eritrodontia; dentes vermelho-amarronzados
que a p r e s e n t a m fluorescência vermelha e m luz ultravioleta A
(UVA). A a n e m i a hemolítica c o m esplenpmegalia é c o m u m n a
CEP. A hemólise p o d e ser t o t a l m e n t e c o m p e n s a d a ou leve, mas,
e m alguns pacientes, a a n e m i a é grave o bastante para requerer
transfusões repetidas
A P C T , a mais c o m u m d e todas as porfirias, g e r a l m e n t e
ocorre d u r a n t e a q u i n t a e sexta décadas, e a m a i o r i a d o s pacien-
tes a p r e s e n t a evidências de d a n o d o s h e p a t ó c i t o s , g e r a l m e n t e
sem i m p o r t â n c i a , e alguns graus d e siderose h e p á t i c a . A P C T
resulta de u m a d i m i n u i ç ã o da atividade d e U R O D n o fígado, o
q u e leva à s u p e r p r o d u ç ã o de u r o p o r f i n n o g ê n i o e o u t r o s porfiri-
n o g ê n i o s carboximetil-substituídos. D o i s principais tipos d e
P C T p o d e m ser i d e n t i f i c a d o s pela d o s a g e m d a atividade de
U R O D n o fígado e e m tecido extra-hepático, ou pela análise d o
gene U R O D . A p r o x i m a d a m e n t e 8 0 % d o s pacientes t ê m a f o r m a
esporádica (tipo I) de PCT, n a qual o •defeito d a e n z i m a está
restrito ao fígado e o gene UROD parece ser n o r m a l . O restante
tem a P C T familiar (tipo II). Nesta f o r m a , a m u t a ç ã o d o gene
UROD leva à atividade parcial de U R O D e m t o d o s os tecidos,
a qual é herdada em u m padrão d o m i n a n t e autossômico. E m
a m b o s os tipos, a P C T c l i n i c a m e n t e evidente é f o r t e m e n t e asso-
ciada ao a b u s o de álcool, estrógenos, infecção c o m vírus hepa-
totrópicos, p a r t i c u l a r m e n t e o d a h e p a t i t e C ( H C V ) , e s t o q u e de
ferro h e p á t i c o a u m e n t a d o e m u t a ç õ e s n o gene da h e m o c r o m a -
tose (HFE)."5 A P C T p o d e t a m b é m ser causada pela exposição a
certos h i d r o c a r b o n e t o s a r o m á t i c o s polialogenados, tais c o m o
h e x a c l o r o b e n z e n o e 2,3,7,8-tetraclodibenzo-f>-dioxina.
Porfirias Não-agudas com Fotossensibilidade
Aguda
A porfiria eritropoiética (EPP) é caracterizada pela fotossensibi-
lidade aguda p o r t o d a a vida, c a u s a d a p e l o a c ú m u l o da proto-
porfirina-IX n a pele. 1 ' 1 A ausência d a pele frágil, b o l h a s subepi-
d é r m i c a s e hipertricose a d i s t i n g u e c l i n i c a m e n t e de todas as
o u t r a s porfirias c u t â n e a s . O s pacientes a p r e s e n t a m fotossensibi-
lidade aguda n o r m a l m e n t e c o m idade e n t r e u m e seis anos, e
a m b o s os sexos são i g u a l m e n t e a f e t a d o s Q u a n d o u m a criança
de u m a família d e E P P a t m g e a idade de 14 anos, o risco de
desenvolver fotossensibilidade aguda se torna m u i t o m e n o r . O
início da fotossensibilidade d u r a n t e a vida a d u l t a é m u i t o raro,
a m a i o r i a dos casos t e m sido associada à mielodisplasia e é
causada p o r m u t a ç õ e s somáticas a d q u i r i d a s d o gene F E C H e m
células h e m a t o p o é t i c a s .
CAPÍTULO 2 9 547
A exposição ao Sol é seguida, g e r a l m e n t e d e n t r o de 5 a 30
m i n u t o s , p o r u m a sensação b a s t a n t e dolorosa, de q u e i m a ç ã o ,
picada e c o m i c h ã o da pele, n a m a i o r p a r t e das vezes n a face e
n o s d o r s o s das mãos. O s s i n t o m a s persistem p o r várias h o r a s ou
o c a s i o n a l m e n t e dias, e n ã o são aliviados pela p r o t e ç ã o da pele
c o n t r a a luz. O s pacientes t i p i c a m e n t e p r o c u r a m alívio mergu-
l h a n d o as m ã o s em água ou c o b r i n d o a pele c o m toalhas ú m i d a s .
C r i a n ç a s m e n o r e s p o d e m se t o r n a r m u i t o aflitas p o r causa da
dor. A pele p o d e parecer n o r m a l d u r a n t e t o d o o t e m p o , e m b o r a
se a p r e s e n t e f r e q ü e n t e m e n t e c o m eritema, q u e p o d e ser seguido
de i n c h a ç ã o e d e m a tosa c o m crostas. Essas alterações g e r a l m e n t e
d i m i n u e m d e n t r o de p o u c a s h o r a s , de f o r m a q u e q u a n d o a
criança chega ao m é d i c o n ã o existe n a d a para ser visto e o epi-
s ó d i o p o d e ser c o n s i d e r a d o m e r a m e n t e c o m o u m a q u e i m a d u r a
grave pelo sol. O s episódios r e c o r r e n t e s levam a m u d a n ç a s crô-
nicas da pele q u e , e m geral, são p e q u e n a s e difíceis d e se detec-
tar. As lesões típicas são cicatrizes lineares superficiais sobre a
base d o nariz e e m q u a l q u e r o u t r o lugar d a face, e n q u a n t o a pele
p o d e se t o r n a r mais espessa e pálida e s p e c i a l m e n t e s o b r e as
articulações d o s dedos. O s s i n t o m a s t e n d e m a se t o r n a r mais
graves d u r a n t e a primavera e verão, e p o d e m m e l h o r a r d u r a n t e
a gravidez.
A complicação mais grave da E P P é a d o e n ç a hepática progres-
siva, que é causada pelo a c ú m u l o de p r o t o p o r f i r i n a n o fígado. 14
A p r o x i m a d a m e n t e 15% dos pacientes têm testes b i o q u í m i c o s de
f u n ç ã o hepática a n o r m a i s , p a r t i c u l a r m e n t e aspartato a n u n o t r a n s -
ferase a u m e n t a d a , mas s o m e n t e cerca de 2 % dos pacientes desen-
volvem d o e n ç a hepática. A EPP p o d e t a m b é m a u m e n t a r o risco
de colelitíase, c o m a f o r m a ç ã o d e cálculo biliar s e n d o p r o m o v i d a
p o r altas concentrações d e p r o t o p o r f i r i n a n a bile.
A p r i n c i p a l a n o r m a l i d a d e b i o q u í m i c a na E P P é a d i m i n u i ç ã o
d a atividade d e F E C H . E m b o r a esta r e d u ç ã o esteja p r e s e n t e e m
todos os tecidos, o excesso de p r o t o p o r f i r i n a é f o r m a d o princi-
p a l m e n t e e m células eritróides. O m o d o de h e r a n ç a da E P P é
complexo, m a s t e m sido esclarecido r e c e n t e m e n t e pelos e s t u d o s
moleculares e enzimáticos de famílias. 7
ANORMALIDADES DO METABOLISMO DE
PORFIRINAS NÃO CAUSADOS POR
PORFIRIA
A s a n o r m a l i d a d e s d o m e t a b o l i s m o o u d a excreção d e p o r f i r i n a s ,
o u a m b o s , p o d e m ocorrer n a ausência de p o r f i r i a . O u t r a s
d o e n ç a s precisam ser c o n s i d e r a d a s q u a n d o se i n t e r p r e t a m os
d a d o s de pacientes n o s quais h á a suspeita de porfiria.
Envenenamento pelo Chumbo
A exposição ao c h u m b o a u m e n t a a excreção u r i n á r i a de A L A e
c o p r o p o r f i r i n a - I I I e causa o a c ú m u l o de ZPP n o s eritrócitos. O
teste definitivo p a r a o e n v e n e n a m e n t o pelo c h u m b o é a m e d i ç ã o
d o c h u m b o s a n g u í n e o , mas o c a s i o n a l m e n t e a exposição ao
c h u m b o é responsável pelos s i n t o m a s similares aos d a p o r f i r i a e
p o d e ser u m a c h a d o i n e s p e r a d o q u a n d o se investigam pacientes
c o m suspeita de p o r f i r i a .
A excreção a u m e n t a d a d e A L A é s e c u n d á r i a e m relação à
inibição d e A L A D causada p e l o c h u m b o d e s l o c a n d o o zinco
de seu c e n t r o catalítico. O c h u m b o t a m b é m leva ao a u m e n t o de
excreção d e c o p r o p o r f i r m o g ê n i o - I I I pela u r m a . A C P O r e q u e r
g r u p o s sulfídrilas p a r a sua atividade e, p o r t a n t o , é potencial-
m e n t e u m alvo para a inibição pelo c h u m b o . C o n t u d o , se a
c o p r o p o r f i n n ú r i a i n d u z i d a pelo c h u m b o é c a u s a d a pela inibição
desta enzima, e n t ã o n ã o está claro p o r que a excreção fecal de
c o p r o p o r f i r i n a n ã o é a u m e n t a d a . As c o n c e n t r a ç õ e s a u m e n t a d a s
de ZPP n o s eritrócitos associadas à exposição ao c h u m b o n ã o
são, p r o v a v e l m e n t e , causadas pela inibição d e F E C H p o r q u e a
548 PARTE IV Analitos
inibição desta enzima requer concentrações de c h u m b o mais
elevadas do q u e aquelas geralmente encontradas após a exposição
ao chumbo. A hipótese atual é que a exposição ao c h u m b o cria
uma deficiência de ferro intracelular (talvez por afetar o trans-
porte de ferro para o interior da célula o u a inibição da ferro-
redutase), de forma que o zinco substitui o ferro c o m o substrato
da FECH. U m a vez formada, a ZPP do eritrócito permanece
elevada durante o t e m p o de vida dos eritrócitos. C o m o a meia-
vida de u m eritrócito é mais longa do que a do c h u m b o sanguí-
neo, o m o n i t o r a m e n t o de trabalhadores expostos ao c h u m b o
requer a análise tanto d o c h u m b o sanguíneo total c o m o de ZPP.
A medição d e ZPP também apresenta a vantagem d e não existir
interferência da contaminação de c h u m b o via pele quando a
amostra de sangue é coletada, especialmente se u m a amostra de
ponta de d e d o é utilizada.
Outras Exposições Tóxicas
Coproporfirinúria secundária também pode ser causada pelos efeitos
tóxicos de álcool, arsênico, outros metais pesados e várias drogas.
Tirosinemia Hereditária Tipo I
A succinilacetona, que se acumula nesta doença, tem uma seme-
lhança estrutural c o m A I A e é, portanto, u m inibidor competi-
tivo de A L A D . C o n s e q ü e n t e m e n t e , ALA se acumula e o excesso
é excretado pela urina. Pacientes c o m tirosinemia hereditária
sofrem de crises neurológicas muito similares a crises de porfiria
aguda.
Doenças Renais
A função glomerular comprometida reduz o clareamento das
porfirinas hidrossolúveis normalmente excretadas na urina. A l é m
d o mais, estas porfirinas são pobremente clareadas por diálise e,
c o m o conseqüência, as porfirinas plasmáticas se encontram
aumentadas na doença renal em sua fase final. M e s m o na ausên-
cia de evidência bioquímica de porfiria, os problemas dermato-
lógicos c o m u m e n t e afetam os pacientes de diálise e freqüente-
mente compartilham características c o m u n s com os de P C T
(melanose, elastose actínica, fragilidade e bolhas). A s concentra-
ções de porfirina plasmática encontradas e m pacientes de diálise
são geralmente muito maiores d o que o normal, mas raramente
se aproximam daquelas encontradas e m pacientes c o m lesões
ativas de pele causadas por PCT. N o entanto, o ternio "porfiria
associada à diálise" tem sido empregado para estes pacientes,
embora seja improvável que as porfirinas aumentadas sejam res-
ponsáveis pelas lesões de pele. A P C T genuína pode ocorrer em
pacientes de diálise, e alguns dos casos de porfiria associada à
diálise descritos na literatura não foram adequadamente investi-
gados para excluir a PCT. Estes pacientes são geralmente anúri-
cos, e, sem o benefício de análise urinária, a avaliação cuidadosa
das porfirinas plasmáticas e fecais é necessária para distinguir
pseudoporfiria de P C T e porfirias agudas em que as lesões de
pele possam ocorrer.
Doenças Hepatobiliares
N a icterícia obstrutiva, icterícia colestática, hepatite e cirrose,
existe uma excreção urinária aumentada predominantemente de
copropOTÍirina-I, porque a doença hepática causa u m desvio da
secreção de coproporfirina-I da rota biliar para a Tenal.
Na síndrome de Dubin-Johnson, ocorre u m a u m e n t o na
excreção urinária de coproporfirina-I e uma excreção reduzida de
coproporfirina-III. N a síndrome de Rotor, a excreção urinária de
coproporfirina-I é aumentada com excreção normal de copropor-
firina-III, e na doença de Gilbert ocorre o a u m e n t o da excreção
urinária de ambos os isômeros.
Doenças Hematológicas
N a anemia ferropriva, o zinco atua c o m o u m substrato alternativo
da FECH, levando ao aumento de ZPP. O aumento da protopor-
firina nos eritrócitos (principalmente ZPP) pode também ocorrer
nas anemias sideroblásticas, megaloblásticas e hemolíticas.
Dieta, Bactéria e Sangramento
Gastrointestinal
A fração de porfirinas dicarboxílicas das fezes contém protopor-
firina e outras porfirinas dicarboxílicas derivadas dela pela
Tedução bacteriana o u pela remoção de grupos laterais vinil.
Protoporfirinas adicionais e outras porfirinas dicarboxílicas
p o d e m ser formadas pela ação da microbiota intestinal sobre
hemoproteínas derivadas da dieta ou de hemorragia gastrointes-
tinal. M e s m o o sangramento gastrointestinal sem importância,
particularmente se ocorrer na parte superior do intestino, que
pode não originar e m u m teste de sangue oculto positivo, pode
aumentar muito a concentração de porfirinas dicarboxílicas nas
fezes. A confusão c o m EPP pode ocorrer quando a deficiência
de ferro associada aumenta a porfirina total n o eritrócito, e lesões
de pele de algumas outras causas estão presentes, ou c o m VP,
q u a n d o doença hepática coexistente causa coproporfirinúria. A
porfiria pode ser excluída quando n e n h u m a fluorescência de
porfirina é detectável na espectroscopia de fluorescência d o
plasma. As porfirinas p o d e m também vir diretamente da dieta.
Pseudoporfiria
O ternio "pseudoporfiria" foi originalmente aplicado a pacientes
com lesões *de pele similares às da P C T nos quais n e n h u m a
anormalidade de acúmulo ou de excreção de porfirinas podia s e r ^
demonstrada. 8 Muitas drogas são fotossensibilizadores potentes e
p o d e m produzir lesões similares às de porfiria.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE
PORFIRIAS
Existem muitas situações clínicas que se beneficiam do teste labo-
ratorial de porfirinas e seus precursores. Estas incluem pacientes
c o m sintomas de porfiria aguda e lesões cutâneas típicas, tanto
quanto os parentes de pacientes portadores de porfiria.
Pacientes com Sintomas de Porfiria
A s características clínicas das porfirias não são suficientemente
especificas para permitir seu diagnóstico sem a investigação labo-
ratorial. Em pacientes c o m sintomas atuais causados por porfiria,
é sempre possível demonstrar a produção excessiva de precursores
de heme. O diagnóstico depende de demonstrar padrões especí-
ficos de superprodução de precursores de h e m e (Tabela 29-3) e
geralmente é direto, desde que amostras apropriadas sejam exa-
minadas quanto aos intermediários relevantes usando técnicas
suficientemente sensíveis. 2,3 Os estudos de D N A e de enzima n ã o
fornecem informação sobre a atividade da doença, sendo rara-
mente necessários para confirmar o diagnóstico de porfiria clini-
camente evidente, e são principalmente utilizados em estudos de
famílias.
Pacientes com Sintomas Neuroviscerais Agudos
U m a análise essencial em pacientes c o m suspeita de porfiria
aguda é u m teste suficientemente sensível d o excesso de PBG na
urina. 2,5 Falha em diagnosticar corretamente uma crise de porfi-
ria aguda não s o m e n t e atrasa o tratamento apropriado, mas p o d e
levar t a m b é m a uma cirurgia desnecessária ou à administração
de drogas porfirinogênicas. U m a dessas intervenções médicas de
risco p o d e ainda agravar a crise c o m conseqüências potencial-
mente fatais. Em contrapartida, u m diagnóstico falso de porfiria
 Porfirinas e Doenças Associadas ao Metabolismo das Porfirinas
p o d e ser igualmente grave por retardar a cirurgia vital ou outro
t r a t a m e n t o e p o d e r t a m b é m levar ao uso i n a p r o p r i a d o de anal-
gésico (p. ex., opiatos) e d e p e n d ê n c i a .
D u r a n t e u m a crise, a excreção de P B G é m u i t o elevada e o
a u m e n t o é geralmente 10 vezes o limite máximo de referência.
PBG normal, n o m o m e n t o em que os sintomas estão presentes,
exclui todas as porfirias agudas, exceto a m u i t o rara ALADP,
c o m o causa. Hm AIP, o P B G n o r m a l m e n t e permanece elevado
por semanas ou m e s m o meses após u m a crise. C o n t u d o , em V P
ou HCP, o PBG p o d e r a p i d a m e n t e voltar ao n o r m a l (algumas
vezes em dias), logo que a crise começa a diminuir. Portanto, se
u m a crise suspeita está e n t r a n d o em remissão, ou a suspeita
clínica de porfiria aguda persiste, a análise de porfirinas plasmá-
ticas e fecais, c o m m edição de ALA, se esses forem normais, é
aconselhável m e s m o que a excreção de PBG seja normal. O PBG
a u m e n t a d o na u r i n a requer avaliação cuidadosa; embora o
paciente claramente tenha u m a porfiria aguda, a doença p o d e
não ser a causa dos sintomas atuais. Alguns pacientes com AIP
têm taxas de excreção de PBG m u i t o altas em ausência de sin-
tomas e existe u m a correlação pobre entre o PBG urinário e os
sintomas, sem o m í n i m o acima dos quais os sintomas aparecem.
A excreção dé PBG a u m e n t a d u r a n t e u m a crise aguda, mas a
detecção desta m u d a n ç a requer informações sobre a excreção
basal d o paciente. Q u a n t o maior a excreção de P B G na urina,
maior a probabilidade de q u e a porfiria seja responsável pelos
sintomas; entretanto, o diagnóstico final deve sempre ser feito
com bases clinicas.
Caso seja e n c o n t r a d o PBG elevado n a urina p o r um teste de
rastreamento qualitativo/semiquantitativo, este achado deverá,
então, ser c o n f i r m a d o por u m m é t o d o quantitativo especifico 12
para eliminar a possibilidade de u m resultado falso-positivo. A
m e l h o r forma de se realizar este teste é utilizando a amostra
original de urina (armazenada preferencialmente congelada),
p o r q u e , n o m o m e n t o em que u m a nova amostra é obtida, o PBG
^Çode ter voltado ao n o r m a l .
A forma de lidar com a crise é a m e s m a i n d e p e n d e n t e m e n t e
d o tipo de porfiria, p o r t a n t o investigações posteriores n ã o se
m o s t r a m urgentes. A diferenciação entre as porfirias agudas é
essencial para a seleção de testes apropriados para os estudos de
famílias; a ausência de lesões de pele n ã o exclui VP ou H C P
(Tabela 29-2). Se a p o r f i r i n a fecal total é normal, pode-se, então,
excluir V P e HCP, e o paciente deve ter AIP. A análise da ativi-
dade de H M B S nos erirrócitos não é essencial e pode levar a
erros. Se a porfirina fecal total é elevada, as porfirinas devem ser
fracionadas pela técnica de cromatografia líquida de alto desem-
p e n h o (HPLC), capaz de separar isômeros de coproporfirina. 1 1
Em HCP, a coproporfirina-III é m u i t o elevada e a protoporfirina-
IX é p o u c o elevada ou normal. Em VP, a protoporfirina-lX (e
outras porfirinas dicarboxilato) é elevada e existe u m a u m e n t o
m e n o r da coproporfirina (com p r e d o m i n â n c i a do isômero tipo
III) (Tabela 29-3). E i m p o r t a n t e lembrar que a protoporfirina-IX
e outras porfirinas dicarboxilato p o d e m a u m e n t a r pela ação da
microbiota intestinal sobre o h e m e (se o h e m e é de origem ali-
m e n t a r ou resultado de s a n g r a m e n t o gastrointestinal). Portanto,
se o p a d r ã o de p o r f i r i n a fecal sugere VP, o plasma deve ser
e x a m i n a d o p o r espectroscopia de fluorescência para a fluores-
cência característica máxima em 624 a 6 2 8 n m (Tabela 29-3). 9
Algumas vezes é solicitado ao laboratório que seja feito u m
diagnóstico retrospectivo de porfiria após o paciente ter se recu-
perado de u m a crise, ou e m relação à causa de u m a doença
neuropsiquiátrica crônica algum tempo depois da crise da
doença. A primeira etapa é quantificar o PBG urinário: testes
de rastreamento são m u i t o insensíveis para este fim. A porfirina
fecal é m e d i d a (para excluir H C P ) e a espectroscopia de fluores-
CAPÍTULO 2 9 549
cência do plasma é realizada (para excluir VP). Se todos estes
testes são negativos, é m u i t o improvável que os sintomas sejam
ou t e n h a m sido causados por porfiria. N o e n t a n t o , é difícil
excluir a porfiria após longos períodos (ou seja, vários anos) de
remissão clínica. D e p e n d e n d o d o grau de suspeita clinica, os
estudos de enzima e D N A p o d e m continuar, mas freqüente-
m e n t e n ã o são recompensadores
Pacientes com Sintomas Cutâneos
As lesões de pele das porfirias cutâneas são sempre acompanha-
das por s u p e r p r o d u ç ã o de porfirinas. O c a m i n h o da investigação
deve ser ditado pela apresentação clinica (Tabela 29-2).
Pacientes com Bolhas, Fragilidade e Cicatrizes
Existem quatro porfirias principais, nas quais ocorrem lesões de
pele clinicamente indistinguíveis de pele frágil e bolhas (Tabela
29-2). Porfirinas urinária e fecal totais devem ser medidas por u m
m é t o d o espectrofotométrico 2 1 ou fluorimétrico 2 com sensibili-
dade suficiente, e as porfirinas plasmáticas devem ser determina-
das por espectroscopia de fluorescência 9 Na prática, a análise
fecal é geralmente desnecessária p o r q u e as duas porfirias associa-
das a bolhas mais comunas, P C T e VP, p o d e m ser identificadas
pela análise de urina e plasma (Tabela 29-3). Se esses testes são
normais, a porfiria é então excluída como causa de quaisquer
lesões de pele ativas. Q u a l q u e r a u m e n t o de porfirina urinária ou
fecal total deve ser posteriormente investigado pela determinação
de porfirinas individuais u s a n d o u m a técnica capaz de resolver
todas as porfirinas de interesse clinico, incluindo isômeros. 1 O
padrão observado em cada u m a dessas porfirias é único.
Pacientes com Fotossensibilidade Aguda
E m caso de suspeita de EPP, a investigação essencial é a me d iç ã o
de p o r f i r i n a no sangue (ou eritrócito), u s a n d o u m m é t o d o flu-
orimétrico sensível. O s testes de r a st r e a m e n t o através de extração
d o sangue com solvente ou de microscopia de fluorescência dos
entrócitos n ã o são confiáveis e n ã o deveriam ser utilizados. Se
a concentração de p o r f i r i n a n o eritrócito/sangue está d e n t r o dos
limites de referência, a EPP está excluída, Se a concentração é
alta, o a u m e n t o p o d e ser causado pela p r o t o p o r f i r i n a livre, c o m o
em EPP, ou pela ZPP, como na deficiência de ferro e n o envene-
n a m e n t o por c h u m b o . Distinguir as protoporfirinas requer
extração c o m solvente neutro, tais com o etanol, 6 para evitar a
desmetalação causada por ácidos fortes, seguida de espectrosco-
pia de fluorescência ou H P L C para diferenciar p r o t o p o r f i r i n a
livre de ZPP (máximo de emissão de fluorescência em 630 e 587
n m , respectivamente). A dosagem de p r o t o p o r f i r i n a fecal n ã o é
i m p o r t a n t e para o diagnóstico de EPP, p o r q u e os a u m e n t o s
p o d e m ser causados pela ação da microbiota intestinal sobre o
h e m e da dieta ou d o s a n g r a m e n t o gastrointestinal.
Parentes de Pacientes com Porfiria
Rastrear m e m b r o s de u m a família para identificar indivíduos
assintomáticos que t e n h a m h e r d a d o AIP, V P ou H C P e estão,
p o r t a n t o , sob risco de crises agudas é parte essencial do cuidado
das famílias com estas doenças. O rastreamento p o d e ser reali-
zado pela m e d i ç ã o de metabólitos, ensaios enzimáticos, análise
d o D N A , ou u m a c o m b i n a ç ã o dessas abordagens. A determina-
ção de metabólitos é simples, mas tem pouca sensibilidade; além
disso, esses testes são quase sempre normais antes da p u b e r d a d e
e, p o r t a n t o , não são adequados para a investigação de crianças.
A medição da atividade da enzima defeituosa é mais sensível,
mais t a n t o a sensibilidade q u a n t o à especificidade são limitadas
pela sobreposição entre atividades na doença e na população
n o r m a l . A detecção de mutação pela análise d o D N A é específica
550 PARTE IV Analitos
e mais sensível d o que os métodos bioquímicos. Ela está, por-
tanto, substituindo rapidamente outros métodos, particular-
mente porque tem uma vantagem adicional de possibilitar que a
doença assintomática seja excluída com certeza. Entretanto,
d e p e n d e da identificação anterior de uma mutação doença-espe-
cífica na família sob investigação. E m aproximadamente 5% das
famílias nas quais uma mutação não p o d e ser identificada, o
rastreamento d o gene, usando polimorfismos de um único nucle-
otideo (SNPs) intragênico, p o d e set útil, mas requer pelo m e n o s
dois membros da família inequivocadamente afetadas.
A investigação de famílias tem u m a função mais limitada n o
c u i d a d o clínico d e o u t r a s porfirias. E m PCT, a f o r m a familiar
a u t o s s ô m i c a d o m i n a n t e p o d e ser i d e n t i f i c a d a pela análise de
U R O D n o eritrócito ou por análise m u t a c i o n a l , mas n ã o existe
n e n h u m a evidência até o m o m e n t o de que os e s t u d o s de família
sejam necessários a m e n o s q u e solicitado p o r parentes ansiosos.
N o entanto, pacientes de descendência d o Norte Europeu devem
ser testados para a mutação C 2 8 2 Y do gene da hemocromatose
(HFE). A hemocromatose deve ser considerada nas famílias que
têm u m membro homozigoto para C 2 8 2 Y (Capitulo 2 8 ) .
Em EPP, testar pais não afetados quanto à presença d o alelo
IVS3-48C de baixa expressão de FECH é útil para avaliar o risco
de futuros filhos terem a doença clinicamente evidente. A análise
mutacional d o gene FECH pode ser necessária para o aconselha-
m e n t o genético de algumas famílias.'
MÉTODOS ANALÍTICOS
O s métodos analíticos usados para diagnosticar e monitorar por-
firias estão descritos resumidamente aqui. As descrições comple-
tas podem ser encontradas no Tietz Textbook of Clinicai CJiímijtT^
and Molecular Diagnostics, 4 a edição.
Coleta e Estabilidade das Amostras
Todas as amostras devem ser protegidas da luz; as concentrações
de porfirina urinária p o d e m diminuir em até 5 0 % se mantidas
na luz por 24 horas. As porfirinas urinárias e o PBG são mais
bem analisados em amostras frescas, coletadas no inicio da
manhã (10 a 2 0 mL) e sem conservantes. Urina diluída (creati'
nina <4 m m o l / L [45 mg/dL]) não é adequada para análise.
A coleta n o período de 24 horas oferece pouca vantagem,
atrasa o diagnóstico e aumenta o risco de coleta incompleta
durante o período especificado. PBG e porfirinas são estáveis na
urina por até 4 8 horas n o escuro a 4 D C , e por pelo m e n o s u m
mês a - 2 0 ° C . Amostras para a avaliação de A L A devem ser ime-
diatamente refrigeradas. Amostras de urina p o d e m ser estocadas
a 4 ° C no escuro por pelo menos duas semanas sem perda signi-
ficante de ALA, e amostras congeladas são estáveis por semanas.
Enquanto PBG é mais estável em torno de p H 8 a 9, A L A é mais
estável em torno de p H 3 a 4, embora ambientes mais ácidos
reduzam a estabilidade de ALA.
C e r c a d e 5 a 10 g de peso ú m i d o de fezes é a d e q u a d o p a r a
as medições de porfirina. As mudanças de concentração impor-
tantes para o diagnóstico são improváveis de ocorrerem dentro
de 36 horas à temperatura ambiente e as amostras são estáveis
por muitos meses a - 2 0 ° C .
Sangue, anticoagulado c o m ácido etilenodiaminotetracético
(EDTA), não apresenta perda de protoporfirina por até 8 dias à
temperatura ambiente, e por pelo m e n o s 8 semanas a 4 ° C no
escuro.
E u m b o m costume tratar todas as amostras recebidas
de pacientes com suspeita de porfiria associada a bolhas c o m o de
"alto risco", porque existe uma maior freqüência de infecção com
vírus hepatotrópicos, particularmente HCV, e m PCT.
Métodos para os Metabólitos
O s m é t o d o s para os metabólitos incluem os destinados a A L A e
PBG.
Porfobilinogênio
A maioria dos m é t o d o s para PBG se baseia n a reação do reagente
de Ehrlich (4~dimetilammobenzaldeido e m solução ácida) com o
carbono a - m e t e n o do anel pirrol para formar u m produto colo-
rido descrito de diversas maneiras c o m o "vermelho-rosado" ou
"magenta", que tem u m espectro de absorção característico c o m
u m pico a 5 5 3 n m e u m ombro a 5 4 0 nm. As porfirinas não
c o n t ê m n e n h u m h i d r o g ê n i o a - m e t e n o e, p o r t a n t o , não reagem.
Algumas outras substâncias na u r i n a reagem c o m o reagente,
originando p r o d u t o s vermelhos, em especial o urobilinogênio,
inibem a reação, ou são elas mesmas pigmentadas, mascarando,
portanto, o cromógeno vermelho. Todas as interferências preci-
sam ser removidas. Isto é mais b e m alcançado pela cromatografia
de troca iônica (primeiramente descrita por Mauzerall e
Granick 12 ), mas métodos para a quantificaçao precisa de PBG
baseados neste procedimento são demorados. M é t o d o s mais sen-
síveis baseados e m H P L C e espectrometria de massas (MS) estão
disponíveis.
Testes de rastreamento qualitativos, nos quais a urina reage
diretamente com o reagente de Ehrlich e é avaliada visualmente
pela formação d o cromógeno vermelho (p. ex., os testes de
Watson-Schwartz e Hoesch), são convenientes, mas têm sido cri-
ticados pelas baixas sensibilidade e especificidade, m e s m o que a
extração c o m solvente tenha sido utilizada para separar o com-
posto PBG-Ehrlich do complexo urobilinogênio-Ehrlich. O
m é t o d o de Mauzerall e Granick foi modificâno na tentativa de
criar uma alternativa que seja aceitável para fins de rastreamento.
Buttery e Stuart"1 evitaram o uso de colunas, empregando u m
tratamento com resina e m batelada, e compararam visualmente
a cor final com a de u m padrão substituto. Blake et al2 elimina-
ram as etapas de centrifugação, usando seringas preenchidas com
resina c o m filtros separáveis, e compararam a cor final com uma
variedade de padrões artificiais. Essas modificações reduziram o
tempo necessário para realizar o teste para 10 minutos e produ-
ziram um resultado semiquantitativo. U m kit comercial baseado
n o m é t o d o de Blake está disponível (Trace PBG Kit; Alpha
Laboratories, Eastleigh, Hampshire, U K ) e parece ser mais sensí-
vel e especifico para o rastreamento inicial do que os procedi-
mentos qualitativos c o m extração com solvente. Se o teste de
rastreamento qualitativo é usado, é essencial incluir controles
apropriados e confirmar todos os testes positivos usando u m
m é t o d o quantitativo específico.
Ácido 5-Aminolevulínico
A L A p o d e ser medido diretamente, mas é mais c o m u m e n t e
convertido e m um pirrol reativo com Ehrlich pela condensação
com u m reagente, tal c o m o acetilacetona, após a separação de
PBG por cromatografia de troca aniônica e m dois estágios. U m
m é t o d o de medição de PBG e ALA, baseado no método de
Mauzerall e Granick, 12 está disponível comercialmente (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, Calif).
Análise de Porfirina na Urina e nas Fezes
O s métodos de fracionamento de porfirina são complexos, demo-
rados e não estão disponíveis e m todo laboratório. Por esta razão,
os testes de rastreamento qualitativos simples são freqüentemente
usados para excluir a maioria das amostras que não requer inves-
tigação posterior das poucas que justificam fracionamento das
porfirinas individuais. O s testes de rastreamento nos quais os
extratos de urina ou fezes são examinados visualmente pela flu-
 Porfirinas e Doenças Associadas ao Metabolismo das Porfirinas
orescência vermelha-rosada típica das porfirinas não têm sensi-
bilidad e e não devem ser urilizados. O s métodos baseadas em
varredura espectrofotométrica de extratos de urina acidificada
ou dc fezes quanto à presença da banda Soret são recomendados
e geram informações semiquantitativas. 5 O s métodos fluorimé-
tricos quantitativos estão t a m b é m disponíveis. 2
Todos os métodos de fracionamento de porfirinas são base-
ados nas solubilidades diferentes das porfirinas individuais,
devido aos seus (^substituintes diferentes e, em menor grau, à
sua posição ao redor do macrociclo. Portanto, os métodos
incluem extração diferencial com solventes, cromatogr afias e m
papel e de camada fina, e HPLC. O s métodos de extração com
solvente geram apenas informações limitadas e, algumas vezes,
equivocadas, e não deveriam ser utilizados. HPLC de fase reversa11
é o m é t o d o escolhido atualmente e separa todas as porfirinas de
interesse clinico, incluindo isômeros e quelatos de metal sem a
necessidade de metilação prévia.
Análise de Porfirinas no Sangue
Todos os m é t o d o s descritos a seguir requerem u m espectrofluo-
rímetro instalado c o m u m fotomultiplicador sensível vermelho.
Se este equipamento não estiver disponível no local, as amostras
devem ser entregues a u m laboratório especializado porque as
medições no eritrócito e n o plasma são raramente necessárias
para a avaliação imediata de pacientes gravemente doentes.
O método mais simples para a porfirina do sangue total ou
do eritrócito é o descrito por Piomelli e modificado por Blake
et al1 As porfirinas são extraídas e a hemoglobina e outras pro-
teínas são precipitadas ao se misturar o sangue diluído com uma
mistura de ácido dieril éter acético. As porfirinas são então
reextraidas e m ácido clorídrico e medidas fluorimetricamente
(Figura 29-3). Este m é t o d o tem a desvantagem de que as condi-
ções ácidas resultam e m liberação do zinco da ZPP e é, portanto,
uma medida da protoporfirina total. Para preservar o zinco
quelado, são necessárias coi^jições de extração neutras ou
básicas. As células diluídas são misturadas com etanol, o qual
precipita a hemoglobina c outras proteínas e extrai as porfirinas
Normal
7r~Proto
Prcxo
ZfT Proto
56C 571! Si» 61G 63C 550 570 560
Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)
Figura 2 9 - 3 Espectro de emissão de fluorescência (excitação em 405 nm) dos extTatos etanóhcos dos
erkrócitos de um individuo normal e de pacientes envenenados por chumbo e protoporfiria eritropoiética (EPP).
Note que escalas diferentes são usadas.
CAPÍTULO 2 9 551
sem dissociar o heme da hemoglobina. 6 O extrato é rastreado
e m u m espectrofluorímetro para distinguir os máximos de
emissão da protoporfirina e d o zinco quelado (Figura 29-3).
Análise de Porfirinas no Plasma
As porfirinas do plasma p o d e m ser determinadas por espectros-
copia de fluorescência do plasma diluído e m salina 9 ou extratos
desproteinizados, o u por HPLC. O primeiro desses métodos tem
as vantagens de ser simples e incluir porfirinas que estão ligadas
covalentemente a proteínas plasmáticas. As porfirinas em p H
neutro apresentam fluorescência na região de 610 a 6 4 0 nm; o
comprimento de onda da emissão máxima depende principal-
mente da estrutura da porfirina, mas é t a m b é m influenciado
pela natureza do complexo porfirina-proteína. Este m é t o d o é útil
c o m o uma primeira investigação quando há a suspeita de porfi-
ria cutânea.
Medição de Enzimas
A análise das enzimas individuais da via biossintética d o h e m e
raramente é solicitada para a investigação de pacientes com
sintomas de porfiria. C o n t u d o , a medição das atividades enzi-
máticas é útil para os estudos de família quando a mutação
individual não p o d e ser identificada o u a análise de D N A não
está disponível, e para a identificação de subtipos, tais c o m o a
AIP não eritróide e as formas "homozigóticas" de porfirias domi-
nantes aucossômicas. O s erirrócitos são uma fonte conveniente
de enzimas cito plasmáticas (ALAD, H M B S , U R O S e U R O D ) ,
mas a análise das enzimas mitocondriais (CPO, PPOX e FECH)
requer células nucleadas, tais c o m o linfócitos o u fibroblastos e m
cultura. As análises das enzimas que usam porfirinogênios c o m o
substratos são tecnicamente difíceis porque o substrato é instá-
vel, tem de ser preparado in sim e, particularmente com proto-
porfinogênio, sofre oxidação não-enzimática durante o teste.
Análise de DNA
O rastreamento de famílias quanto a porfirias pela análise de
D N A é u m processo em duas etapas. Primeiramente, a mutação
EPP D e f i c i ê n c i a d c forro
610 íiSíl JKI 5*í 3C-0 S» 630 650
Comprimento de onda (nm)
552 PARTE IV Analitos

q u e causa a porfiria n a família investigada precisa ser identificada 5. Deacon AC, Élder G H . ACP Best Practice N o 165. Front line tests
p e l a a n á l i s e d o DN1A d e u m m e m b r o d a f a m í l i a e m q u e o diag- for the investigation of suspected porphyria ] Clin Pathol 2001;54:
n ó s t i c o d e u m t i p o e s p e c í f i c o d e p o r f i r i a foi c o n f i r m a d o e r r o n e - 500-7.
a m e n t e . S e g u n d o , os parentes d o paciente são rastreados para a 6. Garden ]S, Mitchell D G , Jackson KW. Improved e th anui extraction

mutação. A primeira parte deste processo é a mais complexa. procedure for determining zinc p r o t o p o r p h y i i n in whole blood. Clin
C h e m 1977;23-264-9.
C o m o a m a i o r i a das m u t a ç õ e s está restrira a u m a ou a p o u c a s
7. Gouya L, Marun-Schmitt C, Robreau AM, Austerlitz F, Da Silva V,
famílias, a identificação de u m a m u t a ç ã o e m u m a nova família
Brun P et ai Contributiori of a single núcleo ride polymorphísm to the
q u a s e s e m p r e r e q u e r p e l o m e n o s a a n á l i s e d e t o d o s os é x o n s , c o m
genetic predisposition for erythropoietic protoporphyria. Am J H u m
suas seqüências m t r ô n i c a s f l a n q u e a d o r a s , e da região p r o m o t o r a .
Genet 2006;78:2-14
S o m e n t e n o s p a í s e s o n d e as m u t a ç õ e s q u e o r i g i n a r a m as p o r f i r i a s
8. Green J], Manders SM Pseudoporphyria. J A m Acad Dermatol
p r e d o m i n a m , c o m o c o m VP, na Á f r i c a d o Sul, e AIP, n a Suécia,
2001-44 100-8
0 teste inicial para u m a ú n i c a m u t a ç ã o vale à p e n a . T é c m c a s - 9. Hift R, Davidson BP, van der H o o f t C, Meissner D M , Meissner PN.
p a d r ã o d e análise de m u t a ç ã o são empregadas. Plasma fluorescence scanning and fecal porphyrin analysis for the
diagnosis of variegate porphyria: precise determina ti on of sensitívity and
REFERÊNCIAS specifieity with determination of protopOTphyrínogen oxidase mutations
as a reference standard. Clin C h e m 2004;50.915-23.
1 Anderson KE, Sassa S, Bishop D, Desmck RJ. Disorders of h e m e
10. K a u p p i n e n R. Porphyrias. Lancet 2005,365:241-52.
biosynchcsis. X-linked sideroblastic anemia and the porphyrías. In:
11 Lim CK, Peters TJ. U r i n e and faecal porphyrin profiles by reversed-phase
Scriver C R , Beaudet AL, Sly W S , Valle D, eds. T h e metabolic a n d
H P L C in the porphyrías. Clin C h i m Acta 1984,139:55-63.
molecular basis of inhcrited disease, 8th ed. New York- McGraw-Hill,
12. Mauzerall D, Granick S. T h e occurrence anel determination of 5-
2000. 2961-3062.
aminolaevuliníc acid and porphobilinogen in urine J Biol C h e m
2. Blake D, Poulos V, Rossi R Diagnosis of porphyria—recommended
1956;219:435-46.
mefhods for per ip hei al laboratories. Clinicai Biochem Rev
1.3. Meissner P, Adams P, Kirsch R. AJlosteric inhihition of h uma ti
1992,13(suppl l) : Sl-24.
lymphoblast and purified PBG-deaminase by protoporphyrinogen and
3. Bulaj ZJ, Phillips JD, Ajioka RS, Frankilin MR, Griffen LM, Guinee D],
coproporphyrinogen. J Clin Invest 1991;91:1436-44-
et al Hemochromatosis genes and other factors contriburing to the
14- Todd D], Eryrhropoietic protoporphyria. Br J Dermacol 1994,131:
parbogenesis of porphyria cutanea tarda. Blood 2000,95:1565-71.
751-66
4. Buttery JE, Sruart S Measuremenc of porphobilinogen in urine by a
simple resín metbod with use of a surro gate standard. Clin C h e m
1991;37:2133-6.
%
CAPÍTULO 3 0

Drogas Terapêuticas
Thomas P. Moyer, Ph.D., e Gwendolyn A. McMillin, Ph.D.*

OBJETIVOS B l o q u e a d o r de C a n a l de Cálcio: U m dos grupos de drogas que

1. Definir os seguintes termos:
índice terapêutico
Mecanismo de ação
Pico e vale da concentração da droga
Estado de equilíbrio (sfeady-s/a/e)
Farmacodinâmica
Farmacogenética
Farmacocinética
Dose-resposta
Meia-vida da droga
Biadisponibilidade
Metabolismo de primeira passagem
2. Listar e descrever os cinco fatores que afetam a farmacocinética
das drogas.
3. Estabelecer métodos de análise para a monitoração a avaliação das
concentrações de drogas terapêuticas.
4. Listar os métodos de análise disponíveis para avaliar a
concentração terapêutica da droga. **
5. Listar cinco drogas antiepilépticas, seus usos específicos, s e u s
metabólitos ativos (se aplicável) e o nome comercial de cada uma.
6. Listar cinco drogas de ação cardiológica, seus usos específicos,
s e u s metabólitos ativos (se aplicável) e o nome comercial de cada
uma.
7. Listar cinco antidepressivos e seus modos de ação.
8. Explicar o uso clínico dc lítio,
9. Explicar o uso clínico das drogas imunossupressoras e dos
antibióticos e descrever seus modos de ação.
10. Identificar possíveis interações medicamentosas quando conhecidas
a s informações apropriadas.
PALAVRAS-CHAVE E DEFINIÇÕES
A c i d o G a m a A m i n o b u t í r i c o (GABA): A m i n o á c i d o que serve
c o m o neurotransmissor inibitório n o sistema nervoso
central
Agentes A n t i a r r í t m i c o s : Agentes utilizados n o t r a t a m e n t o ou
prevenção de arritmias cardíacas. Agentes antiarrítmicos são
f r e q ü e n t e m e n t e classificados em quatro grupos principais,
de acordo com seu m e c a n i s m o de ação. bloqueadores de
canais de sódio, bloqueadores (3-adrenérgicos, prolongadores
da repolarização, ou bloqueadores de canais de cálcio.
A n t i e p i l é p t i c o : Substancia para prevenir ou suavizar crises
convulsivas.
B e t a b l o q u e a d o r : Droga que induz o bloqueio adrenérgico dos
receptores (31 ou p2-adrenérgicos ou de ambos.
*Os autores agradecidamente reconhecem as contribuições dos Drs. Bonny L
Bukaveckas, Mark W. Linder c Leslie M Shaw, nas quais se baseiam partes deste
Capítulo.
inibem a entrada de cálcio para dentro das células ou inibe
a mobilização de cálcio a partir do a r m a z e n a m e n t o
intracelular, resultando n a lentificação da c o n d u ç ã o
atrioventricular e sinoatrial e relaxamento do m ú s c u l o liso
arterial e d o músculo cardíaco; utilizados n o t r a t a m e n t o da
angina, arritmias cardíacas e hipertensão.
C i t o c r o m o P 4 5 0 : T e r m o genérico para enzimas oxídativas de
f u n ç ã o mista, importantes na fisiologia de animais, plantas
e bactérias.
D r o g a G e n é r i c a : M e d i c a m e n t o n ã o protegido por p a t e n t e
T a m b é m é o n o m e específico em oposição ao n o m e
comercial patenteado.
Efeito de P r i m e i r a Passagemi Metabolismo extensivo d e u m a
droga com alta taxa de extração hepática antes de atingir a
circulação sistêmica.
Farmacocinética: Atividade ou destino das drogas n o c o r p o
dentro de u m período de tempo, incluindo processos de
absorção, distribuição, localização em tecidos,
biotransformação e excreção
F a r m a c o d i n â m i c a : Estudo dos efeitos bioquímicos e
fisiológicos das drogas e seus mecanismos de ação,
incluindo as correlações entre as ações e os efeitos da droga
e sua estrutura química; t a m b é m estuda esses efeitos na
ação de uma droga particular.
Farmacogenéticai Estudo da influência da variação genética na
resposta da droga em pacientes, pela correlação entre a
expressão de u m gene ou polimorfismos de u m ú n i c o
nucleotídeo e a eficácia ou toxicidade de u m a droga.
F a r m a c o g e n ô m i c a : Relação e correlação entre a variação
genética e a resposta ou toxicidade associada a u m a terapia
medicamentosa {farmacologia e toxicologia).
Farmacologia: Todo o c o n h e c i m e n t o sobre agentes químicos e
seus efeitos em processos ativos.
I m u n o f i l i n a : T e r m o genérico para u m a proteína intracelular
que se liga a drogas imunossupressoras c o m o ciclosporma,
FK 506 e rapamicma.
I m u n o s s u p r e s s o r : Agente capaz de suprimir respostas imunes.
I n d u ç ã o Enzimática: A u m e n t o da síntese de u m a enzima em
resposta a u m i n d u t o r ou o u t r o estímulo
Interações M e d i c a m e n t o s a s : Efeitos de u m a droga n a absorção
intestinal, metabolismo ou ação de outra droga.
Meia-vida da D r o g a : Tempo requerido para que m e t a d e da
droga administrada seja metabolizada e eliminada.
M o n i t o r a ç ã o da D r o g a : Estudo dos efeitos de u m a substância
química administrada em u m indivíduo.
Relação Dose-resposta: Relação entre a dose da droga
administrada e a resposta d o organismo à droga.
X e n o b i ó t i c o s : Substância química estranha ao sistema
biológico.
554 PARTE IV Analitos
O manejo terapêutico de drogas (TDM) é uma atividade
clínica multidisciplinar iniciada pela solicitação d o
médico ao laboratório para quantificar a concentração
da droga n o f l u i d o biológico. Esses valores são utilizados para (1)
avaliar a adequação da terapêutica, (2) avaliar sua eficácia, ou (3)
elucidar a causa da toxicidade induzida pela droga.
Para ser efetivo, o T D M requer a aquisição de uma amostra
válida seguida da determinação da concentração da droga em
tempo adequado, e interpretação dos resultados no contexto da
relação dose-resposta, tempo da última dose, e presença de outra
droga. Os resultados devem ser apresentados e comparados com
valores de referência para que sejam corretamente interpretados.
O c o n h e c i m e n t o do impacto da genética na distribuição da
droga se desenvolveu rapidamente nos anos de 1990 e continua
a se desenvolver nos anos de 2000. Esse campo de c o n h e c i m e n t o
e sua relação c o m a distribuição da droga tornou-se c o n h e c i d o
c o m o farmacogenômica. O T D M e a farmacogenômica são dis-
ciplinas altamente relacionadas e utilizadas em conjunto para
esclarecer a posição global da farmacocmética de u m paciente.
Os conceitos básicos da farmacogenômica que estão relacionados
à interpretação dos resultados d o T D M estão inclusos neste
capítulo. Revisões realizadas por 0 ' K a n e et al.10 e Weinshilboum 1 4
e o website oferecido por Flockhart 4 são boas fontes de informa-
ção adicional.
CONCEITOS BÁSICOS
A Figura 30-1 ilustra a relação conceituai entre a farmacodinâ-
mica e farmacocinética. A primeira está relacionada à concentra-
ção da droga n o local de ação para se observar a magnitude do
efeito 2 . Earmacocínética diz respeito à dose, intervalo entre doses
e roteiro de administração (regra) para a concentração de droga
n o sangue.
O efeito farmacológico da droga é gerado pela interação
direta da droga com u m receptor que controla uma função espe-
cífica ou por alteração mediada pela droga n o processo fisiológico
que controla essa função. Isto é c o n h e c i d o c o m o mecanismo de
ação. Em determinado tecido, o local no qual a droga age para
iniciar eventos levando a u m efeito biológico especifico é chamado
de sítio de ação da droga. Para a maioria das drogas, a intensidade
e a duração d o efeito farmacológico observado são proporcionais
à concentração da droga n o receptor, prognosticado pela farma-
cocinética.
Mecanismo de Ação
O mecanismo às ação de uma droga é o processo bioquímico ou
físico que ocorre n o local da ação para produzir o efeito farma-
cológico. A ação da droga n o r m a l m e n t e é mediada por u m recep-
tor. Enzimas celulares e proteínas estruturais ou transportadoras
são exemplos importantes de receptores de drogas. Macromolé-
culas não-protéicfis também podem se ligar a drogas, resultando
e m alteração das funções celulares controladas pela permeabili-
dade da membrana ou pela transcrição do D N A . Algumas drogas
Figura 30-1 Relação conceituai entre a fatmacodinâmica e a farmacocinética.
são similares quimicamente a substâncias endógenas naturais
importantes e p o d e m competir pelos sítios de ligação. A l é m
disso, algumas drogas bloqueiam (1) a formação, (2) a liberação,
(3) a absorção o u (4) o transporte de substâncias essenciais.
Outras produzem u m efeito pela interação c o m moléculas relati-
vamente pequenas paTa formar complexos que ativamente se
ligam a receptores.
Apesar de serem desconhecidas as exatas interações molecu-
lares que descrevem o m e c a n i s m o de ação de diversas drogas,
modelos teóricos têm sido desenvolvidos para explicá-las. U m
conceito postula que as drogas se ligam a receptores macromole-
culares intracelulares através de pontes iónicas, de pontes de
hidrogênio e de forças de van der Walls. Esse m o d e l o teórico
ainda postula que se o complexo droga-receptor for suficiente-
mente estável e capaz de modificar o sistema-alvo, uma resposta
farmacológica observável irá ocorrer. C o m o a Figura 30-2 ilustra,
a resposta é dose-dependente até o máximo efeito ser alcançado.
O platô pode ser devido à saturação do receptor o u sobrecarga
d o processo de transporte.
A utilidade de se monitorar a concentração da droga está
baseada n o princípio de que a resposta farmacológica se correla-
ciona c o m a concentração da droga n o local de ação (receptor).
Estudos têm demonstrado que, para diversas drogas, existe uma
forte correlação entre a concentração sérica da droga e o efeito
farmacológico observado. A l é m disso, anos relacionando as con-
centrações sanguíneas com os efeitos das drogas, têm demons-
trado a utilidade clínica da informação da concentração da droga.
N o entanto, deve-se ter em mente que a concentração sérica da
droga não é necessariamente igual à concentração n o receptor,
mas apenas a reflete. \
Para os estudos de farmacocinética, é aceito que mudanças
na concentração da droga n o sangue (ou sérica) versus o tempo
são proporcionais às mudanças na concentração local d o receptor
o u d o tecido corporal. Essa hipótese é algumas vezes d e n o m i n a d a
propriedade da homogeneidade cinética e é aplicável a todos os
m o d e l o s farmacocinéticos nas fases de pós-absorção e pós-distri-
buição d o tempo de curso. A Figura 30-3 ilustra essa propriedade
para u m composto hipotético. Concentrações paralelas (log C)
são esperacias no sangue, n o receptor e n o tecido c o m o passar
d o tempo. A Figura 30-3 é hipotética; a concentração absoluta
de uma droga e m vários tecidos é altamente variável de droga
pata droga.
A propriedade da h o m o g e n e i d a d e cinética é uma suposição
importante n o T D M , pois é a base na qual todos os valores de
concentrações terapêuticas e tóxicas de referência são estabeleci-
dos. A variação das concentrações mensuráveis e m conjunto
define a faixa terapêutica (Figura 30-4) que representa a relação
entre a concentração mínima efetiva (MEC) e a concentração tóxica
mínima (MTC). N u m ciclo de dosagem ótimo, a concentração
sanguínea no vale (concentração mínima atingida logo antes da
próxima dose) não deve cair abaixo da MEC, e o £>ico da concen-
tração sanguínea não deve subir mais d o que a MTC. Isso noTmal-

Efskc máximo
(log) D o s e
F i g u r a 3 0 - 2 A curva logarítmica de relação causa-efeito. O platô
(efeito máximo) é devido à saturação nos receptores.
Figura 3 0 - 3 Propriedade de homogeneidade^ínética
Concentrações sanguíneas se correlacionam com a concentração no
tecido e n o receptor, mas podem não ser iguais.
m e n t e é a t i n g i d o a d m i m s t r a n d o - s e a droga u m a vez a cada meia-
vida, r e p r e s e n t a d o p e l o 1 n a Figura 30-4. Diversos regimes de
a d m i n i s t r a ç ã o da droga a t i n g e m o estado de equilíbrio da concen-
tração sérica d a droga c o n s i s t e n t e m e n t e m a i o r que M E C e m e n o r
q u e M C T d e n t r o d a faixa terapêutica. O estado de equilíbrio é
o p o n t o n o qual a c o n c e n t r a ç ã o da droga n o c o r p o está e m
equilíbrio com a taxa de dose a d m i n i s t r a d a e a taxa d e elimina-
ção. C o n c e n t r a ç õ e s s a n g u í n e a s m a i o r e s d o que a M T C colocam
o p a c i e n t e e m risco para a toxicidade; c o n c e n t r a ç õ e s abaixo da
M E C o colocam e m risco p a r a o d i s t ú r b i o que a droga suposta-
m e n t e estaria t r a t a n d o . A M T C e a M E C são referências úteis
n a terapia; este c o n c e i t o está i n c o r p o r a d o e m tabelas que serão
a p r e s e n t a d a s p o s t e r i o r m e n t e n e s t e capitulo, r e s u m i n d o os d a d o s
de cada droga especifica. As doses d e v e m ser p l a n e j a d a s de m o d o
a atingir as c o n c e n t r a ç õ e s terapêuticas, e devem ser m o n i t o r a d a s
para guiar ajustes n a dose, caso sejam necessários. A m e n o r
diferença e n t r e M E C e M T C , o menor índice terapêutico e o
mais provável T D M serão necessários. O conceito-chave que deve
ser l e m b r a d o é que a M E C e a M T C d e f i n e m a faixa terapêutica
para a m a i o r i a das drogas.
Distribuição da Droga
Vários fatores p o d e m ter p r o f u n d a i n f l u ê n c i a n a f a r m a c o c i n é t i c a
d a droga e, c o n s e q ü e n t e m e n t e , n a resposta farmacológica d o
Drogas Terapêuticas CAPÍTULO 3 0 555
Fa x a MTC
/ Cmax í 4
t&rapèiJtics
r
f \ ' N
\ T
MEC
Fstado do
ccuilibiiu
Tempo (t)
F i g u r a 3 0 - 4 As concentrações de pico, média e de vale a u m e n t a m
com múltiplas doses idênticas administradas a cada meia-vida, até que se
atinja o estado de equilíbrio. Para a maioria das drogas, isso leva de
cinco a sete meias-vidas. "No estado de equilíbrio, as concentrações de
pico e de vale ótimas são menores que as da T C M e maiores que as da
MEC. A faixa de valores entre a T C M e a M E C é chamada de "faixa
terapêutica" Cmáx ss e Cmin ss são as concentrações n o estado de
equilíbrio máximas e mínimas; C, a concentração média n o estado de
equilíbrio; T, o intervalo de dosagem; D, a dose; MTC, concentração
tóxica mínima; MEC, concentração efetiva mínima. (Modificado de
Gilman AG, G o o d m a n E, Gilman A, eds. T h e pharmacological basis of
therapeutics, 6th Ed New York- Macmillan, 1980 Reproduzido com a
permissão da McGraw-Hill Companies.)
p a c i e n t e ( Q u a d r o 30-1). Por exemplo, a c o n s i d e r a ç ã o da história
d o paciente, c o m ê n f a s e p a r t i c u l a r n o seu e s t a d o fisiopatológico
e terapia m e d i c a m e n t o s a associada, é essencial n a iniciação da
terapia c o m a droga e T D M . O u t r o s fatores i m p o r t a n t e s i n c l u e m
c o m o a droga é (1) absorvida, (2) distribuída, (3) metabolizada,
(4) r e m o v i d a pelo fígado, (5) b i o t r a n s f o r m a d a e (6) excretada.
Absorção
A m a i o r i a das drogas a d m i n i s t r a d a s c o n t i n u a m e n t e a pacientes
p o r longos p e r í o d o s de t e m p o é prescrita p o r via extravascular.
A p e s a r de as vias i n t r a m u s c u l a r e s e s u b c u t â n e a s serem utilizadas,
a via oral é a p r i n c i p a l via para a d m i n i s t r a ç ã o d a m a i o r i a das
doses extravasculares. O processo de absorção d e p e n d e (1) da
dissociação da droga n a sua f o r m a de a d m i n i s t r a ç ã o , (2) da sua
dissolução n o f l u i d o gastrointestinal e, depois, (3) da sua d i f u s ã o
através d a m e m b r a n a biológica a t i n g i n d o a circulação s a n g u í n e a .
A taxa e extensão de absorção da droga p o d e m variar considera-
v e l m e n t e d e p e n d e n d o d a p r ó p r i a n a t u r e z a d a droga, da matriz
n a qual é a p r e s e n t a d a , e d o m e i o fisiológico (p. ex., p H , motili-
d a d e gastrointestinal e vascularização).
A fração da droga q u e é absorvida para a circulação sistêmica
é referida c o m o biodisponibilidade A b i o d i s p o n i b i h d a d e de u m a
d e t e r m i n a d a droga é n o r m a l m e n t e calculada pela c o m p a r a ç ã o ,
para u m m e s m o o b j e t o d e e s t u d o , e n t r e a área n a c u r v a concen-
t r a ç ã o - t e m p o n o p l a s m a para doses equivalentes n a s f o r m a s intra-
venosa e oral. Para ser útil, a b i o d i s p o n i b i l i d a d e da droga deve
ser g r a n d e o suficiente de m o d o q u e o c o m p o n e n t e ativo passe
e m q u a n t i d a d e suficiente e n o t e m p o d e s e j a d o d o i n t e s t i n o para
a circulação sistêmica. A b i o d i s p o n i b i l i d a d e p a r a drogas adminis-
556 PARTE IV Analitos

QUADRO 30-1 Fatores que Influenciam a Distribuição da resultando em u m a hiodisponibilidade muito baixa. Esse fenô-
Droga em Seres Humanos m e n o é chamado de efeito de primeira passagem.
A l é m da extensão da absorção, também é importante a taxa
FATORES DEMOGRÁFICOS de absorção. A absorção de uma droga é, de forma geral, consi-
Faixa etária (prematuros, recém-nascidos, crianças, pré-adolescentes, ado-
derada c o m o um processo de primeira ordem, e a constante da
lescentes, adultos, idosos)
taxa de absorção é normalmente maior que a constante da taxa
Peso
de eliminação. Ao manipular formulações para produzir produ-
Sexo
tos de liberação sustentada ou "lenta", a taxa de absorção apa-
Raça
rente de muitas drogas acaba s e n d o controlada. Por exemplo,
Constituição genética
formulações que geram liberação sustentada permitem que
FATORES RELACIONADOS A DOENÇAS drogas tomadas por via oral possam ser administradas menos
Doença hepática (cirrose, hepatite, colestase)
vezes ao dia. Outras condições que influenciam a taxa de absor-
Doença renal ção da droga incluem (1) motilidade gastrointestinal alterada, (2)
Distúrbios de tireóide (hipo ou hipertireoidismo] doenças do estômago e do intestino, (3) infecções gastrointesti-
Doenças cardiovasculares (insuficiência cardíaca, arritmias) nais, (4) radiação, (5) comida e (6) interação c o m outras substân-
Distúrbios ou doenças gastrointestinais (doença celíaca ou síndromes de má cias n o trato gastrointestinal. E preciso ter atenção particular-
absorção, úlcera péptica, colite) m e n t e ao se administrar drogas em conjunto quando elas afetam
Câncer a absorção intestinal, c o m o antiácidos, caulim, sucralfato, coles-
Cirurgia tiramina e medicações anti-úlcera, além da co-administração de
Queimaduras morfina, que diminui a motilidade intestinal.
Estado nutricional (estados caquáticos ou anoréticos)
Distribuição
FATORES EXTRACORPÓREOS A p ó s u m a droga ter entrado n o compartimento vascular, ela
Hemodiálise
interage com vários constituintes do sangue e é transportada
Diálise peritoneal
através de vários processos para diferentes órgãos e tecidos. A
Bypass cardiopulmonar
totalidade desse processo é conhecida c o m o distribuição. Os
Hipotermia ou hipertermia
fatores que determinam as características da distribuição de uma
droga são (1) ligação da droga aos c o m p o n e n t e s sanguíneos, (2)
FATORES QUÍMICOS E AMBIENTAIS INFLUENCIANDO:
Absorção da Droga ligação a receptores fixos, (3) passagem da droga através de mem-
Comida ou drogas administradas conjuntamente afetam a taxa de absorção branas e (4) habilitlhde de se dissolver em estruturas lipídicas. O
peso molecular, o pJC, a solubilidade lipídica e outras proprieda-
Distribuição da Droga des físicas e químicas da droga também são importantes determi-
Administração conjunta de drogas que afetam a I gação a proteínas plasmáti- nantes da distribuição.
cas ou receptores teciduais U m a vez que a droga tenha entrado na circulação sistêmica,
ela se distribui e se equilibra com diversos c o m p o n e n t e s do
Metabolismo da Droga sangue. U m dos grupos com maior significado clínico são as
Ingesta alimentar (carboidratos, proteínas, lipídios) competindo em sistemas proteínas plasmáticas. Existe u m equilíbrio entre drogas em sua
de metaholização forma livre e sua forma ligada a proteínas. Acredita-se, cm geral,
Administração conjunta de uma droga que induz metabolismo enzimático (p. que apenas a fração livre da droga fica disponível para distribuição
ex., fenobarbital) e eliminação. Além disso, apenas a droga livre é disponível para
Administração conjunta de uma droga que inibe o metabolismo enzimático atravessar as membranas celulares ou para interagir com recepto-
(p. ex., cimetidina] res de forma a desencadear respostas biológicas. Sendo assim, as
mudanças nas características de ligação protéica de uma droga têm
Excreção da Droga
profunda influência na distribuição e eliminação da mesma e na
Administração conjunta de uma droga que compete pelas vias de secreção
maneira em que suas concentrações n o estado de equilíbrio são
tubular renal (p. ex., probenicida, penicilina)
interpretadas. Cada droga tem suas próprias características de
Mudanças no fluxo urinário
ligação protéica que dependem de suas propriedades físicas e
Administração conjunta de compostos que aumentam a reabsorção tubular
químicas Por exemplo, drogas de caráter ácido tipicamente se
(p. ex,, bicarbonato de sódio ou fenobarbital)
ligam à albumina, e drogas de caráter básico se ligam às globulinas,
particularmente à glicoproteína ácida ai (AAG). Algumas drogas
se ligam tanto à albumina quanto às globulinas.
D e p e n d e n d o de sua afinidade pelas proteínas plasmáticas,
tradas oralmente é tipicamente maior que 70%. U m a exceção uma droga pode tanto ficar fortemente quanto fracamente ligada.
seria um caso na qual a luz d o trato gastrointestinal seja o local U m a droga com ligação protéica fraca se solta quando outra c e
de ação da droga (p. ex., antibióticos usados para esterilizar o maior afinidade chega ao local. Por exemplo, a fenitoína e o ácido
intestino). Nessa situação, a baixa biodisponibiíidade seria então valpróico competcm entre si pela ligação com a albumina. C o m o
considerada vantajosa. o ácido valpróico está presente em concentrações mais altas, sua
Algumas drogas são rápida e completamente absorvidas, mas massa causa um significativo deslocamento na fenitoína, de sua
têm baixa biodisponibiíidade para a circulação sistêmica. Isto é forma ligada a proteínas, para sua forma livre. A ligação protéica de
verdade para as drogas com alta taxa de extração hepática. Após a uma droga também d e p e n d e de características físicas das proteí-
administração oral, as drogas que são absorvidas na luz d o intes- nas plasmáticas, da presença ou ausência de ácidos graxos, bem
tino delgado são transportadas pela veia porta diretamente ao c o m o de outras drogas n o sangue. Em algumas situações, os
fígado. U m a droga c o m alta taxa de extração hepática será muito ácidos graxos deslocam a droga de seus locais de ligação protéica.
metabolizada pelo fígado antes de atingir a circulação sistêmica, E importante reconhecer que, m e s m o que a concentração total

de u m a droga permaneça a mesma, o deslocamento dela de seus
locais de ligação protéica eleva as concentrações de droga livre e
p o d e m levar à toxicidade clínica.
Qualquer coisa que altere a concentração da fração livre de
droga n o plasma, em última análise, altera a quantidade de droga
disponível para entrar nos tecidos e interagir com sistemas recep-
tores específicos. Algumas doenças p o d e m alterar a concentração
livre de drogas. Por exemplo, a composição do plasma pode ser
alterada por (1) um a u m e n t o de compostos nitrogenados não-
piotéicos na uremia, (2) distúrbios eletrolíticos e ácido-básicos e
(3) u m a diminuição na albumina; nessas condições, as concen-
trações de droga livre ficam f r e q u e n t e m e n t e elevadas. O s pacien-
tes p o d e m ter efeitos adversos que são u m a conseqüência direta
d o a u m e n t o na concentração de droga livre. Se a concentração
total da droga n o plasma for monitorada nesses pacientes, pouca
m u d a n ç a pode ser notada porque a concentração total perma-
nece inalterada ou até mesmo diminui, e n q u a n t o a fração livre
pode a u m e n t a r de forma significativa. Alterações na concentra-
ção de droga livre n ã o são detectáveis p o r q u e a concentração da
droga p o d e n ã o estar muito diferente daquela observada em
indivíduos saudáveis. Por exemplo, a fenitoína está 9 0 % ligada e
10% na forma livre em indivíduos saudáveis. Em pacientes com
uremia, 2 0 % a 3 0 % da concentração plasmática de fenitoína
pode ser na sua forma livre. Se considerarmos u m a pessoa sau-
dável que tem concentração total de fenitoína de 15 p g / m L , a
concentração de fenitoína livre é cerca de 1,5 p g / m L . Em u m
paciente urêmico que tem uma concentração total de 15 p g / m L ,
a concentração da droga em sua forma livre pode ser de 4,5
p g / m L . U m a concentração de fenitoína livre de pg/mL é
suficiente para desencadear efeitos colaterais graves, incluindo
letargia e a u m e n t o da freqüência de convulsões. Dessa forma, em
pacientes urêmicos é interessante quantificar as concentrações de
fenitoína livre e ajustar a dose da medicação para manter sua
concentração em aproximadamente 2,0 p g / m L .
As alterações de concentrações protéicas em resposta ao
estresse agudo também alteram a concentração livre de drogas.
Por exemplo, após u m infarto agudo d o miocárdio, há u m rápido
a u m e n t o na concentração de AAG. A lidocaína é usada para
controlar arritmias causadas pelo infarto, mas essa droga tem
caráter básico e tem alta afinidade de ligação pela AAG. Doses
inicialmente adequadas de lidocaína para controle de arritmias
imediatamente após o infarto se tornam ineficientes 48 a 72
horas depois, porque as altas concentrações de AAG que ocorrem
após o infarto d i m i n u e m a disponibilidade da droga aos tecidos.
A arritmia reaparece, e como a concentração de lidocaína neces-
sária para controle chega a níveis tóxicos, a dose de lidocaína é
diminuída q u a n d o , na realidade, deveria ser a u m e n t a d a para
m a n t e r u m a concentração considerada ótima.
Algumas drogas apresentam saturação dos locais de ligação
protéica disponíveis n o plasma em concentrações consideradas
ótimas. Por exemplo, a ligação da disopiramida é concentração-
d e p e n d e n t e e varia m u i t o de paciente para paciente. C o n s e q ü e n -
temente, sua concentração total e as respostas clínicas observadas
t a m b é m são variáveis.
Qualquer mudança n o estado fisiológico normal pode alterar
a concentração de droga livre, levando a mudanças na distribui-
ção entre o plasma e os tecidos. Pacientes geriátricos muitas vezes
têm h i p o a l b u m m e m i a com u m a intensa diminuição dos sítios
de ligação protéica das drogas. Nos idosos, os sinais clássicos de
intoxicação por u m medicamento n o r m a l m e n t e n ã o são aparen-
tes; por outro lado, os sintomas clínicos de intoxicação acabam
se manifestando com perda de f u n ç ã o cognitiva - particular-
m e n t e confusão mental. Pacientes idosos podem ser considera-
dos senis quando, na realidade, é o a u m e n t o da concentração
Drogas Terapêuticas CAPÍTULO 3 0 557
livre de uma droga que está alterando suas capacidades cogniti-
vas. A redução da dose do m e d i c a m e n t o de forma a diminuir
suas concentrações pode resultar em melhoras cognitivas dramá-
ticas nesses pacientes.
Estimar a concentração da forma livre da droga continuará
sendo de interesse com o T D M . Técnicas de ultrafiltração são
úteis em satisfazer essa necessidade. Entretanto, deve-se lembrar
que medidas laboratoriais apenas estimam as concentrações na
circulação sanguínea. Qualquer artefato na coleta, no processa-
m e n t o e na estocagem d o sangue irá modificar o equilíbrio de
dissociação de algumas drogas. A despeito dessas possíveis falhas,
as medidas da forma livre da droga pela ultrafiltração são supe-
riores às medidas feitas na saliva. Poucas drogas mostram uma
forte correlação entre a concentração salivar e a concentração
plasmática. Além disso, é difícil coletar saliva de pacientes grave-
m e n t e doentes, como aqueles em UTIs.
Metabolismo
O fígado é o principal órgão responsável pelo metabolismo de
medicamentos. Ele cunveite drogas lipofílicas não-polares a
formas mais polares e hidrossolúveis, u s a n d o reações de fase I ou
fase II (Figura 30-5). As reações de fase I modificam a estrutura
química através de oxidação, redução ou hidrólise. As reações de
fase II conjugam a droga (glicuronidação ou sulfatação) em
formas hidrossolúveis. Essas reações são realizadas n u m a fração
microssômicas dos hepatócitos, onde as reações químicas ambien-
tais, bem como endógenas bioquímicos (xenobióticos) também
são processados pelos mesmos mecanismos.
O papel do T D M se torna particularmente importante para
drogas que passam pelo metabolismo hepático ou gastrointesti-
nal. A ampla variabilidade da taxa metabólica de qualquer droga
existe não só em diferentes pacientes como t a m b é m n o mesmo
paciente em diferentes m o m e n t o s e circunstâncias. Essa variabi-
lidade se deve a diversos fatores (Quadro 30-1).
r
Xenobiótico Absorvido
<1
Fase I •« Metabolismo Fase II
(CYP) (Conjungaçces)
• hidrólise • glicuranídeo
• oxidação • acetato
• desalquilação • glutaticna
• desidrogenação • sulfato
• redução • metionina
• desaminação
• dessulfuração
Eliminação
Figura 3 0 - 5 E s q u e m a s i m p l i f i c a d o das reações m e t a b ó l i c a s
primárias associadas c o m a m e t a b o l i z a ç ã o de x e n o b i ó t i c o s em seres
h u m a n o s . O s x e n o b i ó t i c o s a b s o r v i d o s (drogas o u o u t r o s c o m p o s t o s
exógenos) p o d e m ser e l i m i n a d o s s e m b i o t r a n s f o r m a ç ã o o u ser
t r a n s f o r m a d o s e m u m m e t a b ó l i t o através das reações d e Fase 1 e / o u de
Fase II. O m e t a b ó l i t o p o d e ser n o v a m e n t e m e t a b o l i z a d o pelas Fase I o u
II antes d e ser e l i m i n a d o . As reações d e Fase I são p r i m a r i a m e n t e
oxidativas e são mais c o m u m e n t e m e d i d a s pelas isoenzimas d o
c i t o c r o m o P^Q. AS reações d e Fase II envolvem a c o n j u g a ç ã o p a t a
f o r m a r g l i c u r o n í d e o s , acetatos e o u t r o s a d u t o s .
558 PARTE IV Analitos
A bio transformação das drogas p o d e produzir metabólitos,
que são farmacologicamente ativos. Nessas situações, o metabó-
lito também deve ser m e d i d o , pois contribui com o efeito da
droga n o paciente. A primidona e a procainamida são exemplos
dessas drogas. Se o mecabólito é inativo, não precisa ser medido,
mas devem-se tomar medidas para garantir que ele não interfira
e m u m processo de análise.
A c i t o c r o m o P 4 5 0 oxidase (abrevia-se CYP e m m a m í f e r o s /
plantas; e P^50 para bactérias) é u m importante elemento na
modificação química o u na degradação de produtos c o m o drogas
e compostos endógenos. O s genes da CYP atualmente são
medidos e usados na farmacogenética.
Citocromo P 450
O termo CYP é usado de forma genérica para funções mistas de
enzimas oxidattvas (EC 1.14) são importantes na fisiologia de animais,
plantas e bactérias.15 As CYPs metabolizam milhares de compostos
endógenos e exógenos. Muitas irão metabolizar múltiplos substratos,
e outras catalisarão diversas reações. N o fígado, esses substratos
incluem drogas e compostos tóxicos, bem como produtos do meta-
bolismo, como a bilirrubina.
N o metabolismo das drogas, as CYPs são importantes ele-
m e n t o s da fase I do metabolismo de mamíferos. Muitas drogas
p o d e m diminuir ou aumentar a atividade de várias isozimas CYP
em u m f e n ô m e n o c o n h e c i d o c o m o i n d u ç ã o e inibição enzimá-
tica. Essa é a maior fonte de interações medicamentosas adversas
(ADIs), porque as mudanças na atividade da enzima p o d e m
afetar o metabolismo e o clearance de várias drogas.
O s genes que codificam essas enzimas, b e m c o m o elas pró-
prias, são designados através da abreviação CYP, seguida de um
numeral arábico que mdica a família de genes, uma letra maiús-
cula que indica a subfamília, e outro número para o gene espe-
cífico. A convenção é usar itálico q u a n d o se refere a u m gene.
Por exemplo, CYP2EJ é o gene que codifica u m a enzima de
m e s m o n o m e - que é u m a das enzimas envolvidas n o metabo-
lismo d o paracetamol (acetaminofeno). O citocromo CYP1-3 é
u m dos envolvidos c o m o metabolismo de drogas, e a maioria
das oxidações de fármacos em h u m a n o s se deve a isoenzímas
CYP c o m o (1) CYP1A2, (2) CYP2B6, (3) C Y P 2 C 9 , (4) C Y P 2 C 1 9 ,
(5) C Y P 2 D 6 , (6) CYP2E1 e (7) CYP3A4-
Farmacogenética
A farmacogenética é o estudo da influência da variação genética
na resposta de pacientes às drogas, por m e i o da correlação da
expressão de u m gene o u d o polimorfismo de u m ú n i c o núcleo-
tídeo c o m a eficácia o u toxicidade de uma medicação. O objetivo
primário da farmacogenética é prognosticar c o m o os indivíduos
responderão à ação das drogas e outros xenobióticos bioativos ou
potencialmente tóxicos, c o m base em certas características gené-
ticas. A farmacogenética também ajuda a explicar por que as
reações adversas à medicação (ADR) ocorrem. O s testes de far-
macogenética na prática clínica analisam a genética do paciente
(genótipo) de forma a prognosticar diferenças farmacocinéticas
ou farmacodinámicas de medicações e outros compostos exóge-
nos. O s testes clínicos de farmacogenética resultam primaria-
m e n t e na seleção de medicações e de sua dosagem. Diretrizes
sobre dosagens específicas baseadas e m informações da farmaco-
genética estão se desenvolvendo de forma a dar suporte ao resul-
tado de testes n o manejo terapêutico de medicações.
As aplicações clínicas dos testes farmacogenéticos são listadas
n o Quadro 30-2. O s detalhes de cada u m foram previamente
publicados. 7 Espera-se que esses testes, e outros futuros testes
baseados no genótipo, levem a mudanças na formulação de
drogas, novos testes, e melhoras na farmacoterapia dos pacientes.
Testes pré-terapêuticos p o d e m reduzir os custos de saúde pública
prevenindo hospitalizações o u os cuidados adicionais relaciona-
dos c o m às A D R s , ao reduzir medicações desnecessárias e melho-
rar a aceitação, mas devem ser considerados uma ferramenta
complementar ao T D M e outros testes laboratoriais.
Excreção
A excreção de drogas o u produtos químicos do corpo ocorre
através das vias (1) biliar, (2) intestinal, (3) pulmonar o u (4) renal.
Apesar de cada uma delas representar u m possível mecanismo de
eliminação de drogas, a excreção renal é a maioT via de elimina-
ção da maioria das drogas e metabólitos hipossoíúveis, o que é
importante para o T D M . Alterações na função renal p o d e m ter
u m importante efeito na excreção e na meia-vida destes compos-
tos ou de seus metabólitos ativos; uma diminuição da função
renal causa aumento da concentração sérica e a u m e n t o na res-
posta farmacológica.
Utilidade Clínica
O T D M t e m maior validade quando a droga em questão é admi-
nistrada por u m longo período de t e m p o e t e m u m índice tera-
pêutico estreito. U m n ú m e r o de vantagens ocorre pelo uso do
T D M , o que inclui:
1. Pode-se diagnosticar não-adesão.
2. Pacientes que sofrem mudanças na apresentação da droga
p o d e m ser reconhecidos.
3. Regimes terapêuticos p o d e m ser ajustados durante períodos
de m u d a n ç a fisiológica continua.
4- Concentrações basais associadas a u m a resposta terapêutica
ótima p o d e m ser identificadas.
5. O regime de dosagem mais apropriado da droga p o d e ser
mantido para u m paciente e m particular.
METODOLOGIA ANALÍTICA
A evolução dp T D M tem sido facilitada pelo desenvolvimento de
técnicas analíticas específicas, sensíveis e rápidas. 9
Técnicas Analíticas
Técnicas analíticas que são utilizadas para medir drogas terapêu-
ticas incluem o imunoensaio e técnicas instrumentais, c o m o os
procedimentos croma to gráficos e eletroforéticos, e as também
chamadas "técnicas hifenadas", nas quais os cromatógrafos são
associados a u m espectrõmetro de massa.
Imunoensaio
Historicamente, as técnicas de radioimunoensaio (RIA) foram
usadas para quantificar as concentrações de drogas em volumes de
microlitro de plasma com concentrações de nanogramas por mili-
litro. Entretanto, poucas RIAs são agora usadas para o T D M .
A proliferação d o T D M a todos os laboratórios e médicos
foi alcancada com o desenvolvimento de imunoensaios não-iso-
QUADRO 30-2 Aplicações Clínicas dos Tesles
Farmacogenéticos
Tiopurina S-metiliransferase (7PJW7]
Citocromo P„so 2D6 (CYP2D6)
Citocromo P W 2C19 {CYP2C19}
Citocromo P4S0 2C9 {CYP2C9\
N-acetil transíerases (NAT1 e NAT2\

t ó p i c o s ( C a p í t u l o 10). N u m e r o s o s sistemas e v o l u í r a m de f o r m a
a dar m a r g e m a essa tecnologia t a n t o n o l a b o r a t ó r i o clínico c o m o
n o c o n s u l t ó r i o m é d i c o ( C a p í t u l o s 11 e 12).
Métodos Instrumentais
A c r o m a t o g r a f i a de gás-líquido ( G L C ) p e r m i t e a separação da
droga d e seus metabólitos, b e m c o m o a d i f e r e n c i a ç ã o c o m drogas
a d m i n i s t r a d a s c o n j u n t a m e n t e e c o m p o s t o s e n d ó g e n o s . A técnica
tem a h a b i l i d a d e de separar e q u a n t i f i c a r diversas drogas d e n t r o
de u m a d a d a classe d e m e d i c a m e n t o s . As d e s v a n t a g e n s da G L C
i n c l u e m a n e c e s s i d a d e de (1) u m g r a n d e v o l u m e de amostras,
para ser capaz de m e d i r as c o n c e n t r a ç õ e s biológicas e (2) deriva-
ção q u í m i c a para garantir q u e o m a t e r i a l a n a l i s a d o t e n h a a vola-
tilidade pié-requisitada. O s avanços n o d e s e n v o l v i m e n t o d e
detectores d e e s p e c t r o m e t r i a d e massa, c r o m a t o g r a f i a gasosa
espectrometria massa (GC-MS) e o uso de colunas capilares têm
a u m e n t a d o a sensibilidade dos i n s t r u m e n t o s a u m a extensão e m que
a análise d e drogas a t u a l m e n t e é feita de f o r m a rotineira e m volumes
de amostras n a o r d e m de microlitros ((iL).
A c r o m a t o g r a f i a l í q u i d a de alta performance ( H P L C ) oferece
versatilidade c o m a p r e p a r a ç ã o de a m o s t r a s m í n i m a s . Suas espe-
cificidade e sensibilidade, as necessidades relativas d e p e q u e n a s
a m o s t r a s e a facilidade de o p e r a ç ã o t o r n a m a H P L C u m a alter-
n a t i v a prática à G L C . A H P L C t a m b é m se a d a p t o u à quantifica-
ção s i m u l t â n e a de u m a a m p l a v a r i e d a d e d e drogas e seus meta-
bólitos. A eletroforese capilar, u m a t é c n i c a r e l a t i v a m e n t e nova
( C a p í t u l o 6), t a m b é m v e m s e n d o utilizada p a r a m e d i r u m a varie-
d a d e d e drogas.
A c o m b i n a ç ã o d a H P L C c o m espectrómetros massa, cro-
matografia líquida-espectrometria de m a s s a / e s p e c t r o m e t r i a de
massa ( L C - M S / M S ) r e v o l u c i o n o u a a b o r d a g e m analítica para o
T D M . Essa tecnologia p e r m i t e a análise direta de a m o s t r a s bioló-
gicas m í n i m a s , c o m altas sensibilidade, especificidade e precisão.
Assuntos Analíticos de Interesse
A s s u n t o s analíticos d e c o n t í n u o interesse p a r a o serviço d o T D M
incluem:
1. M é t o d o s de análise u s a d o s p a r a T D M devem ser r e p r o d u t í -
veis e precisos. T o d o s os l a b o r a t ó r i o s clínicos c o m o serviço
d e T D M d e v e m estar a t i v a m e n t e envolvidos c o m u m c o n t r o l e
i n t e r n o de q u a l i d a d e e u m p r o g r a m a de p r o f i c i ê n c i a externa.
A l é m disso, o v o l u m e de a m o s t r a s e as análises ao l o n g o d o
t e m p o devem ser se le c ionados d o m é t o d o analítico mais apro-
priado.
2. C a d a l a b o r a t ó r i o deve i n f o r m a r o profissional d e s a ú d e sobre
os intervalos de c o n c e n t r a ç ã o tóxica e terapêutica, o m é t o d o
analítico ( q u a n d o a p r o p r i a d o ) , os valores ativos, o v o l u m e de
a m o s t r a necessário e as especificações d e t u b o s de coleta.
3. Diretrizes devem estar disponíveis p a r a a coleta ideal de amos-
tras e m u m i n d i v í d u o r e c e b e n d o u m a m e d i c a ç ã o q u e precisa
ser m o n i t o r a d a . O e s t a d o d e equilíbrio e n t r e as c o n c e n t r a -
ções é o mais desejável; e n t r e t a n t o , o u t r o s p a r â m e t r o s p o d e m
ser a p r o p r i a d o s , d e p e n d e n d o das p r o p r i e d a d e s d a droga ou
das necessidades i n d i v i d u a i s d o p a c i e n t e .
4. A h o r a e a data da coleta d e u m a a m o s t r a , b e m c o m o da
ú l t i m a dose d e m e d i c a m e n t o , d e v e m ser a n o t a d a s . Para
avaliar as c o n d i ç õ e s do e s t a d o d e equilíbrio, o t e m p o e m q u e
u m p a c i e n t e está e m u m d e t e r m i n a d o e s q u e m a de trata-
m e n t o deve ser c o n h e c i d o . As c o n d i ç õ e s in uitro q u e afetam
a estabilidade d a droga n a a m o s t r a (p. ex., p e n i c i l i n a , hepa-
r i n a e aminoglicosídeos), o u a especificidade d o teste (p. ex.,
p r e s e n ç a de h e m ó l i s e ) d e v e m ser c o n s i d e r a d a s n a m a n i p u l a -
ç ã o da a m o s t r a .
Drogas Terapêuticas CAPÍTULO 3 0 559
5. C o m o os l a u d o s d o l a b o r a t ó r i o são p a n e d o p r o n t u á r i o d o
p a c i e n t e , é útil f o r n e c e r este l a u d o n u m f o r m a t o q u e incor-
p o r e todos os d a d o s necessários para a i n t e r p r e t a ç ã o (p. ex.,
f o r m u l a ç ã o d a droga, f r e q ü ê n c i a e q u a n t i d a d e , c o n c e n t r a ç ã o
plasmática, h o r a da dose, i n t e r v a l o d a dose e o u t r a s drogas
administradas em conjunto).
GRUPOS ESPECÍFICOS DE DROGAS
Drogas que são r o t i n e i r a m e n t e m o n i t o r a d a s são classificadas pela
sua característica t e r a p ê u t i c a (p. ex., antibióticos, c o n t r o l e d e epi-
lepsia, m a n e j o d a f u n ç ã o cardíaca ou respiratória, supressão d a
resposta i m u n e ) . U m m é t o d o analítico p a r a a droga de u m g r u p o
é m u i t a s vezes aplicável a outras drogas d o m e s m o grupo. A dis-
cussão q u e se segue é organizada de a c o r d o c o m classificações já
reconhecidas. N o t e q u e algumas drogas, c o m o os salicilatos e o
n i t r o p r u s s i a t o (que são avaliados pela q u a n t i f i c a ç ã o de tiocia-
nato), são discutidas n o C a p í t u l o 31.
Drogas Antiepilépticas
Diferentes drogas a n t i e p i l é p t i c a s são usadas para tratar convul-
sões (Tabela 30-1). A p e n a s poucas das mais c o m u m e n t e prescritas
são discutidas aqui. O f e n o b a r b i t a l , a f e n i t o í n a e o ácido valpróico
são n o r m a l m e n t e q u a n t i f i c a d o s p o r i m u n o e n s a i o . O u t r a s drogas
antiepilépticas são n o r m a l m e n t e q u a n t i f i c a d a s por técnicas c o m o
H P L C ou H P L C c o m b i n a d a c o m espectrometria de massa.
Felbamato
O f e l b a m a t o (Felbato!) f o i a p r o v a d o c o m o terapia p r i m á r i a o u
a d j u n t a para tratar c o n v u l s õ e s parciais. Seu u s o é l i m i t a d o aos
pacientes que n ã o r e s p o n d e m a outras drogas, p o r q u e o felba-
m a t o p o d e gerar g r a n d e risco de a n e m i a aplásica e insuficiência
hepática que não é relacionada c o m a concentração n o sangue.
D u a s vezes p o r s e m a n a , devem-se m o n i t o r a r a c o n c e n t r a ç ã o san-
guínea, as t r a n s a m i n a s e s e as b i l i r r u b i n a s d e f o r m a a detectar
p r e c o c e m e n t e os efeitos colaterais. O f e l b a m a t o é particular-
m e n t e eficiente n o c o n t r o l e d a s í n d r o m e d e L e n n o x - G a s t a u t .
O f e l b a m a t o é c o m p l e t a m e n t e a b s o r v i d o d o trato gastrointes-
tinal. Cerca de 3 0 % da droga se liga e m p r o t e í n a s plasmáticas, e
a c o n c e n t r a ç ã o s a n g u í n e a ó t i m a da droga varia d e 4 0 a 120 p g /
m L . Ela é e l i m i n a d a p e l o m e t a b o l i s m o h e p á t i c o ( C Y P 2 D 6 ) , c o m
sua meia-vida v a r i a n d o d e 14 a 21 h o r a s . O f e l b a m a t o satura o
m e t a b o l i s m o q u a n d o sua c o n c e n t r a ç ã o ultrapassa 120 p g / m L ;
nessa c o n c e n t r a ç ã o , o m e t a b o l i s m o converte de p r i m e i r a o r d e m
para o r d e m zero.
Gabapentina
A g a b a p e n t i n a (Neurontín) é u m a n á l o g o d o á c i d o g a m a - a m i n o -
b u t í r i c o (GABA), que p r o m o v e a liberação d e G A B A . ( G A B A é
u m p o t e n t e i n i b i d o r pré-sináptico e pós-sináptico n o sistema
n e r v o s o central.) A g a b a p e n t i n a n ã o interage d i r e t a m e n t e c o m o
r e c e p t o r G A B A e t a m b é m n ã o i m b e a ácido glutâmico-descarbo-
xilase, a e n z i m a q u e n o r m a l m e n t e c o n t r o l a a c o n c e n t r a ç ã o celular
d e G A B A . A g a b a p e n t i n a se m o s t r a efetiva p a r a o t r a t a m e n t o de
convulsões parciais resistentes.
A absorção oral d a droga é c o m p l e t a . A g a b a p e n t i n a se liga
a j^roteínas plasmáticas e m u m a taxa de 10%, e sua meia-vida d e
e l i m i n a ç ã o é d e 5 a 9 h o r a s . A c o n c e n t r a ç ã o t e r a p ê u t i c a efetiva
d a g a b a p e n t i n a é e n t r e 2 e 12 p g / m L . O s efeitos colaterais obser-
v a d o s e m adultos, e m c o n c e n t r a ç õ e s m a i o r e s q u e 12 p g / m L , são
s o n o l ê n c i a , ataxia, v e r t i g e m e fadiga. A droga n ã o passa p e l o
m e t a b o l i s m o h e p á t i c o e n ã o ativa n e n h u m a e n z i m a d o m e t a b o -
lismo, o q u e faz c o m q u e n ã o afete as c o n c e n t r a ç õ e s d e o u t r a s
drogas a d m i n i s t r a d a s c o n j u n t a m e n t e . Q u a n d o a d m i n i s t r a d a
560 PARTE IV Analitos

TABELA 3 0 - 1 Parâmetros Farmacocinéticos de Drogas Antiepiléptícas

Concentração
Efetiva Concentração Volume de
Mínima Tóxica Mínima Meia-vida Distribuição Biodisponi- Ligação Enzimas
(MEC) (MTC) Média Médio biíidade Protéica Importantes
Droga (jig/mL) (jig/mL) <h) (L/kg) Oral Média (%) Média {%) que Metabolizam

Felbamato 40 120 14-21 0,8 90 25 CYP2D6

Gabapentina 2 12 5-9 0,8 60 0 CYP2D6
Lamotrigina 1 8 20-30 1,2 98 60 CVP2C19, UGT
Levetiracetam 3 63 7 100 CYP2C19
MHC - metabólito 6-10 8-10 0,8 UGT
da oxicarbazepina
Fenobarbital 15 (criança) 35 (criança) 70 (criança) 1,0 90 40-60 CYP2C19, CYP2C9, UGT
20 (adulto) 40 (adulto) 90 (adulto)
Fenitoína 10 (livre: 1,0) 20 (livre: 2,0) -20 0,6 90 90 CYP2C9, CYP2C19, UGT
Tiagabina 0,005 0,52 7-9 96 CYP2C19
Topiramato 2 12 18-23 CYP2C19
Ácido valpróico 50 (livre: 5) 100 (livre: 10) 12-16 (adulto) 0,2 100 93 CYP2C19
8 (criança)
Zonisamida 10 30 50-70 1,4 50 50 CYP2C19

N A , N ã o ajpliodvel.

com antiácidos, a a b s o r ç ã o da g a b a p e n t i n a d i m i n u i e m aproxi- O levetiracetam é 1 0 0 % b i o d i s p o n í v e l . U m a vez absorvido,

madamente 20%.
Lamotrigina
A l a m o t r i g i n a n ã o é u m a n á l o g o G A B A , m a s se liga ao receptor
G A B A e é c o n s i d e r a d a u m a g o n i s t a gabaérgico. A l a m o t r i g i n a
age c o m o a f e n i t o í n a e a c a r b a m a z e p i n a , b l o q u e a n d o disparos
n e u r o n a i s repetitivos i n d u z i d o s pela despolarização de n e u r ô n i o s
d a m e d u l a espinal. A U.S. F o o d a n d D r u g A d m i n i s t r a t i o n (FDA)
a p r o v o u a l a m o t r i g i n a c o m o terapia a d j u v a n t e de convulsões
parciais.
A l a m o t r i g i n a tem tolerância satisfatória e é c o m p l e t a m e n t e
absorvida n o trato gastrointestinal após a d m i n i s t r a ç ã o oral.
C e r c a d e 6 0 % de l a m o t r i g i n a a p r o t e í n a s plasmáticas. A m e l h o r
resposta o c o r r e q u a n d o a c o n c e n t r a ç ã o s a n g u í n e a n o vale está
e n t r e 1 e 2 pg/mL., c o m a c o n c e n t r a ç ã o de pico v a r i a n d o e n t r e
5 a 8 p g / m L . A meia-vida varia e n t r e 2 0 e 3 0 h o r a s . A e l i m i n a ç ã o
ocorre através d o m e t a b o l i s m o d a u r i d i n a difosfato-glicoronosil-
transferase ( U G T ) ; o m e t a b ó l i t o é o éster g l i c u r o n í d e o . A admi-
nistração e m c o n j u n t o c o m drogas i n d u t o r a s d a C Y P 2 C 1 9 , c o m o
o f e n o b a r b i t a l , a f e n i t o í n a ou a c a r b a m a z e p i n a , resulta e m dimi-
n u i ç ã o da c o n c e n t r a ç ã o de l a m o t r i g i n a - a u m e n t o s n a d o s a g e m
d e cerca de 3 0 % são necessários para m a n t e r as c o n c e n t r a ç õ e s
s a n g u í n e a s a d e q u a d a s . A l a m o t r i g i n a é u m p o t e n t e i n i b i d o r da
d i i d r o f o l a t o r e d u t a s e . A s c o n c e n t r a ç õ e s d e folato d i m i n u e m
q u a n d o a droga é a d m i n i s t r a d a . Se n ã o h o u v e r c o m p l e m e n t a ç ã o
d e folato, p o d e m surgir rash e a n e m i a m e s m o q u a n d o as concen-
trações de l a m o t r i g i n a estão e m níveis terapêuticos. A droga
t a m b é m se associa c o m o a p a r e c i m e n t o da s í n d r o m e d e Stevens-
J o h n s o n e m a p r o x i m a d a m e n t e 1 % d o s pacientes. Este efeito
colateral n ã o se relaciona c o m a c o n c e n t r a ç ã o da droga. O s sinais
d e intoxicação q u e o c o r r e m q u a n d o a c o n c e n t r a ç ã o excede 10
p g / m L i n c l u e m (1) t o n t u r a , (2) ataxia, (3) d i p l o p i a , (4) visão
t u r v a , (5) náuseas e (6) v ô m i t o s .
Levetiracetam
O levetiracetam foi a p r o v a d o c o m o terapia a d j u n t a n o trata-
m e n t o de convulsões d e início parcial e m a d u l t o s c o m epilepsia.
m e n o s de 10% se liga a p r o t e í n a s e seu v o l u m e d e distribuição
( q u a n t i d a d e da d i s t r i b u i ç ã o n o c o r p o ) é de 1 L / k g . A p ó s u m a
dose otal, ele alcança c o n c e n t r a ç ã o m á x i m a e m 1 h o r a . A meia-
vida é de a p r o x i m a d a m e n t e 7 + 1 horas e o clearance r e n a l é de
0 , 9 6 m L / m i n / k g . C e r c a d e 2 4 % da droga passa p o r m e t a b o l i s m o
h e p á t i c o via C Y P 2 C 1 9 , a t i n g i n d o a f o r m a m e t a b ó l i c a d e ácido
carboxílico. O levetiracetam é excretado p r e d o m i n a n t e m e n t e
pela f u n ç ã o renal. U m a r e d u ç ã o de 4 0 % n a excreção de levetira-
cetam é esperada se o clearance de c r e a t i n i n a for m e n o r q u e 3 0
m L / m i n . C r i a n ç a s n a pré-adolescência excretam a droga 4 0 %
mais r á p i d o que os adultos. N ã o h á interações f a r m a c o c i n é t i c a s
e n t r e o levetiracetam e outras drogas para epilepsia.
E m adultos, a c o n c e n t r a ç ã o m á x i m a n o s a n g u e se correla-
c i o n a c o m a dose. O valor m í n i m o de c o n c e n t r a ç ã o para c o n t r o l e
de convulsões é de 3 p g / m L . A c o n c e n t r a ç ã o de pico t e r a p ê u t i c o ,
q u e é de 10 a 63 p g / m L , o c o r r e 1 h o r a após a dose. As concen-
trações terapêuticas d e vale e x a t a m e n t e a n t e s da p r ó x i m a dose
devem variar de 3 a 34 p g / m L .
O s efeitos tóxicos c o n h e c i d o s associados ao levetiracetam
i n c l u e m (1) d i m i n u i ç ã o dos eritrócitos e d o h e m a t ó c r i t o , (2)
d i m i n u i ç ã o d a c o n t a g e m de n e u t r ó f i l o s , (3) s o n o l ê n c i a , (4)
astenia e (5) t o n t u r a . A toxicidade p o d e ser associada às concen-
trações s a n g u í n e a s n a dose t e r a p ê u t i c a . A a d m i n i s t r a ç ã o con-
j u n t a c o m cimecidina irá interferir c o m os testes, p r o d u z i n d o u m
falso a u m e n t o na m e d i d a d e levetiracetam.
Oxicarbazepina
A oxicarbazepina ( O C B Z ) a p r o v a d a c o m o t e r a p i a de convulsões
parciais c o m ou s e m generalização s e c u n d á r i a e m a d u l t o s , e
c o m o terapia a d j u v a n t e para c o n v u l s õ e s d e início parcial e m
crianças e n t r e 4 e 16 a n o s . A O C B Z é u m a pró-droga q u e é q u a s e
i m e d i a t a e c o m p l e t a m e n t e m e t a b o l i z a d a e m 10-hidróxi-10,ll-
diidrocarbamazepina, conhecida como monoidroxicarbamaze-
p i n a ( M H C ) , o m e t a b ó l i t o responsável p e l o efeito t e r a p ê u t i c o
d a droga. A e n z i m a r e d u t a s e catalisa a conversão d a O C B Z a
M H C . A M H C sofre u m a c o n j u g a ç ã o c o m o g í i c u r ô n i o f o r m a d o
pela ação d a U G T . A M H C i n d u z de f o r m a seletiva a C Y P 3 A 4 ,

e n z i m a responsável p e l o m e t a b o l i s m o de estrógenos, i m u n o s s u -
pressores e b l o q u e a d o r e s de canais d e cálcio d i i d r o p i r i d í n i c o s .
A c a r b a m a z e p i n a ativa a U G T , a u m e n t a n d o a taxa d e m e t a b o -
lização d a M H C .
O m e t a b o l i s m o da O C B Z é extenso. C e r c a d e 9 6 % d a dose
é excretada n a u r i n a n a f o r m a de metabólitos, m e n o s de 1 %
c o m o a droga p u r a , e até 2 7 % c o m o M H C livre. A m a i o r p a r t e
da dose é r e c u p e r a d a c o m o o éster glicuronídeo, t a n t o da O C B Z
c o m o d a M H C , e m taxas a p r o x i m a d a s de 9 % e de 4 9 % respec-
t i v a m e n t e . O v o l u m e de d i s t r i b u i ç ã o a p a r e n t e da M H C é de 0,8
L / k g . A p r o x i m a d a m e n t e 4 0 % d a M H C se liga a p r o t e í n a s séricas,
p r i n c i p a l m e n t e à a l b u m i n a . A meia-vida d e e l i m i n a ç ã o é d e 1 a
2,5 h o r a s para a O C B Z e d e 8 a 10 h o r a s para a M H C . Esta
ú l t i m a m o s t r a u m a u m e n t o l i n e a r e p r o p o r c i o n a l à dose (baseado
n a dose d o O C B Z ) e m u m a taxa que varia d e 3 0 0 a 2 . 7 0 0 m g /
dia. U m a vez q u e a M H C é excretada p r e d o m i n a n t e m e n t e pelos
rins, a d o s a g e m diária de O C B Z d a d a a pacientes c o m clearance
de c r e a t i n i n a m e n o r q u e 30 m L / m i n deve ser m e t a d e d a q u e l a
d a d a a pacientes c o m f u n ç ã o r e n a l n o r m a l
N o estado de equilíbrio, as c o n c e n t r a ç õ e s de M H C n o vale
e m u m a a m o s t r a coletada e x a t a m e n t e antes d a p r ó x i m a dose se
c o r r e l a c i o n a m c o m a dose de O C B Z . O m o n i t o r a m e n t o d o vale
é r e c o m e n d a d o para avaliar a a d e s ã o ou a a d e q u a ç ã o da dose. A
resposta ó t i m a à O C B Z ocorre q u a n d o as c o n c e n t r a ç õ e s de vale
de M H C estão e n t r e 6 e 10 p g / m L . O pico d e c o n c e n t r a ç ã o
plasmática de M H C ocorre e n t r e 4 a 6 h o r a s após a dose. C o m o
a c a r b a m a z e p i n a ativa a U G T , os pacientes q u e t o m a m esta droga
j u n t a m e n t e c o m O C B Z têm níveis significantes d e r e d u ç ã o n a
c o n c e n t r a ç ã o de M H C . O s efeitos tóxicos associados c o m O C B Z
i n c l u e m h i p o n a t r e m i a , v e r t i g e m , sonolência, d i p l o p i a , fadiga,
n á u s e a , vômitos, ataxia, alteração visual, d o r a b d o m i n a l , t r e m o r ,
dispepsia e alteração d a m a r c h a . Essa toxicidade p o d e ser obser-
vada e m c o n c e n t r a ç õ e s terapêuticas. C o n c e n t r a ç ã o de s ó d i o
abaixo de 1 2 5 m m o l / L e d i m i n u i ç ã o da tiroxina (T 4 ) são vistas
e m pacientes tratados c o m O C B Z .
Fenobarbital
O f e n o b a r b i t a l é u s a d o n o t r a t a m e n t o de t o d o s os tipos d e con-
vulsões, exceto n o t r a t a m e n t o de ausências, e é c o n h e c i d o p o r
diversos n o m e s comerciais, a l é m de ser e n c o n t r a d o e m c o m b i n a -
ção c o m diversas drogas. E u s a d o n o t r a t a m e n t o d e convulsões
tônico-clônicas generalizadas, convulsões parciais, m o t o r a s focais,
de l o b o t e m p o r a l e até m e s m o convulsões febris. T a m b é m se sabe
q u e reduz a transmissão sináptica, r e s u l t a n d o em excitabilidade
d i m i n u í d a de toda a célula n e r v o s a , i n d u z i n d o sedação. O feno-
b a r b i t a l potencializa a inibição sináptica p o r m e i o da ativação d o
receptor GABAA, a u m e n t a n d o a d u r a ç ã o d o f l u x o de cloro n a
sinapse. Isso a u m e n t a o limiar convulsivo e inibe a d i s s e m i n a ç ã o
d e descargas d o foco epiléptico.
A a b s o r ç ã o oral de f e n o b a r b i t a l é lenta, mas c o m p l e t a . O
t e m p o p a r a se alcançar o pico d e c o n c e n t r a ç ã o plasmática é d e
4 a 10 h o r a s após a dose. O f e n o b a r b i t a l liga-se a p r o t e í n a s plas-
máticas e m u m a taxa d e 4 0 % a 6 0 % . A C Y P 2 C 1 9 é a p r i m e i r a
e n z i m a h e p á t i c a envolvida n o m e t a b o l i s m o , p r o d u z i n d o u m a
meia-vida d e e l i m i n a ç ã o d e 7 0 a 100 h o r a s . O m e t a b o l i s m o é
i d a d e - d e p e n d e n t e (crianças ~ 70 horas; pacientes geriátricos -
100 horas). C o m o o m e t a b o l i s m o h e p á t i c o é o p r i m e i r o agente
de eliminação, u m a f u n ç ã o h e p á t i c a p r e j u d i c a d a implica p r o l o n -
g a m e n t o d a meia-vida.
A c o n c e n t r a ç ã o t e r a p ê u t i c a ó t i m a de f e n o b a r b i t a l é e n t r e 15
a 40 p g / m L . O p r i n c i p a l efeito colateral o b s e r v a d o e m a d u l t o s
c o m c o n c e n t r a ç ã o plasmática m a i o r que 4 0 p g / m L é sedação,
apesar d e o p a c i e n t e desenvolver tolerância c o m a terapia
crônica.
Drogas Terapêuticas CAPÍTULO 3 0 561
O f e n o b a r b i t a l é m e t a b o l i z a d o pela C Y P 2 C 1 9 e m f-hidroxi-
f e n o b a r b i t a l , q u e é a m p l a m e n t e excretado c o m o g l i c u r o n í d e o
(pela U G T ) . Q u a n d o h á d i m i n u i ç ã o d a f u n ç ã o hepática e r e n a l ,
os pacientes p a s s a m p o r m e n o r taxa d e m e t a b o h z a ç ã o da droga.
O álcool, a c a r b a m a z e p i n a , o u t r o s b a r b i t ú r i c o s e a r i f a m p i c i n a
i n d u z e m enzimas oxidativas ( C Y P 2 C 1 9 e 2C9); essa i n d u ç ã o
resulta e m (1) a u m e n t o d o m e t a b o l i s m o d a f e n i t o í n a , (2) r e d u ç ã o
d a c o n c e n t r a ç ã o sérica d e f e n o b a r b i t a l e (3) u m a r e d u ç ã o d o
efeito f a r m a c o l ó g i c o . M u i t a s o u t r a s drogas são afetadas pela
i n d u ç ã o enzimática. Drogas c o m o (1) cloranfenicol, (2) cimeti-
d i n a , (3) dissulfiram, (4) isoniazida, (5) o m e p r a z o l e (6) topira-
m a t o t a m b é m competem com o metabolismo do fenobarbital. A
eliminação do fenobarbital pode diminuir na presença de ácido
valpróico e salicilatos se o c o r r e r d i m i n u i ç ã o d o p H u r m á r i o .
D u r a n t e a a d m i n i s t r a ç ã o crônica t a n t o de ácido valpróico q u a n t o
de salicilatos, a c o n c e n t r a ç ã o de f e n o b a r b i t a l p o d e a u m e n t a r e m
10% a 2 0 % , e u m ajuste n a d o s a g e m p o d e ser necessário para
evitar a intoxicação. O f e n o b a r b i t a l i n d u z enzimas oxidativas de
f u n ç ã o mista (CYP2B6), r e s u l t a n d o e m a u m e n t o d o m e t a b o -
lismo de o u t r o s x e n o b i ó t i c o s a p ó s a p r o x i m a d a m e n t e 1 a 2
s e m a n a s de terapia.
D e v i d o à longa meia-vida de e l i m i n a ç ã o d o f e n o b a r b i t a l , as
c o n c e n t r a ç õ e s s a n g u í n e a s n ã o se m o d i f i c a m r a p i d a m e n t e . Dessa
f o r m a , u m a a m o s t r a coletada t a r d i a m e n t e e n t r e os intervalos das
doses ( n o vale) é representativa d o efeito total. Resultados d e
a m o s t r a s coletadas e n t r e 2 e 4 h o r a s após a dose p o d e m ser
e n g a n o s o s p o r q u e p o d e m ser coletadas n o pico de c o n c e n t r a ç ã o
q u a n d o , na verdade, estão p r e c e d e n d o o p i c o real.
Fenitoína
A f e n i t o í n a ( d i f e n i l i d a n t o í n a ) , m a i s c o m u m e n t e disponível c o m o
Dilãntina, m a s t a m b é m disponível c o m o d r o g a genérica, é usada
n o t r a t a m e n t o de (1) convulsões tônico-clônicas generalizadas
p r i m á r i a s ou secundárias, (2) convulsões parciais ou parciais com-
plexas, e (3) n o status epilepíicus. A droga n ã o é eficiente p a r a
tratar crises de ausência. A f e n i t o í n a age m o d u l a n d o os canais
de s ó d i o sinápticos ao p r o l o n g a r a inativação, o q u e r e d u z a
h a b i l i d a d e d o n e u r ô n i o e m r e s p o n d e r a altas f r e q ü ê n c i a s de
disparo. O efeito fisiológico dessa ação é reduzir a transmissão
sináptica central, a j u d a n d o n o c o n t r o l e da excitabilidade n e u r o -
nal anormal.
A f e n i t o í n a n ã o é p r o n t a m e n t e disponível e m soluções aquosas.
Q u a n d o administrada de forma intramuscular, a maior parte da
dose precipita n o local da aplicação e é absorvida d e í o r m a vaga-
rosa. U m a pró-droga c h a m a d a d e f o s f e n i t o í n a (Cereiryx) p e r m i t e
a i n j e ç ã o i n t r a m u s c u l a r d e f e n i t o í n a e a u m e n t a a s ol ubi l i dade
e m m e i o a q u o s o para a aplicação i n t r a m u s c u l a r . A p ó s a injeção,
ela é r a p i d a m e n t e c o n v e r t i d a a f e n i t o í n a . A absorção oral d a
f e n i t o í n a é vagarosa e m u i t a s vezes i n c o m p l e t a . Variações n a
p r e p a r a ç ã o da droga f o r a m responsabilizadas pela baixa biodis-
p o n i b i l i d a d e . U m a vez absorvida, a droga se liga f o r t e m e n t e a
p r o t e í n a s ( 9 0 % a 9 5 % ) . C o m o t o d a s as drogas, os efeitos farma-
cológicos d a f e n i t o í n a são d i r e t a m e n t e r e l a c i o n a d o s à q u a n t i d a d e
de f o r m a livre presente. A p e n a s a f e n i t o í n a livre é capaz de cruzar
m e m b r a n a s celulares e interagir b i o l o g i c a m e n t e e m i m p o r t a n t e s
locais de ligação. O grau de ligação às p r o t e í n a s p o d e ser r e d u z i d o
pela presença d e o u t r a s drogas, a n e m i a e h í p o a l b u m i n e m i a , o
q u e ocorre c o m f r e q ü ê n c i a n o s idosos. Nessas condições, observa-
se u m a u m e n t o d o efeito c o m a m e s m a c o n c e n t r a ç ã o de droga
a p r e s e n t a d a e m pacientes n o r m a i s .
A c o n c e n t r a ç ã o terapêutica ideal para c o n t r o l e d e convulsões
s e m efeitos colaterais é d e 10 a 2 0 p g / m L . E m u m g r a n d e e s t u d o
p o p u l a c i o n a l , u m a taxa de resposta d e 5 0 % foi o b s e r v a d a e m
pacientes com c o n c e n t r a ç õ e s plasmáticas m a i o r e s que 10 p g / m T .
562 PARTE IV Analitos
e 86% de supressão da atividade convulsiva e m concentrações
acima de 15 pg/mL. 9 Essas concentrações também servem c o m o
diretrizes q u a n d o a droga é usada c o m o agente antiarrítmico
cardíaco. Concentrações de fenitoína livre de 1 a 2 p g / m L são
adequadas. Concentrações totais de fenitoína q u e excedem 20
p g / m L não melhoram o controle das convulsões e são associadas
a nistagmo e ataxia. Concentrações plasmáticas da droga acima
de 35 p g / m L foram relacionadas ao desencadeamento de ativi-
dade convulsiva. U m efeito colateral da fenitoína que não é
relacionado à concentração é o desenvolvimento de hiperplasia
gengival.
A fenitoína é metabolizada por enzimas de hidroxilação
mictossômicas hepáticas, chamadas de C Y P 2 C 1 9 e CYP2C9.
Aproximadamente 90% do metabolismo é mediado pela CYP2C9.
O principal metabólito é a 5-(/>hidroxifenil)-5-fenilidantoína, que
é excretada c o m o éster glicuronídeo (pela U G T ) . Outros meta-
bólitos menores têm importância clínica mínima. O metabo-
lismo hepático da fenitoína p o d e apresentar-se saturado m e s m o
na faixa terapêutica. U m a vez que o metabolismo esteja saturado,
pequenos aumentos na dose geram grandes mudanças na con-
centração. Esse f e n ô m e n o explica parcialmente a grande variação
de dose entre pacientes que é necessária paia atingir o efeito
terapêutico. Devido a esse f e n ô m e n o de saturação, a cinética de
primeira o r d e m não se aplica à fenitoína em concentrações que
ultrapassam 5 p g / m L .
O m o m e n t o para coletar a amostra é determinado pela neces-
sidade de monitoramento. Se u m paciente apresenta qualquer
sintoma de intoxicação, interessa saber o pico de concentração.
Essa amostra deve ser coletada 4 a 5 horas após a dose, m e s m o
que o pico d e concentração seja demorado e ultrapasse 8 horas
se a droga for dada junto c o m alimentação ou drogas que aumen-
tam a acidez estomacal. Se a principal questão for a terapia ade-
quada, então a concentração n o vale é mais útil. Essa amostra
deve ser coletada exatamente antes de a próxima dose ser dada.
Várias interações medicamentosas resultam e m alterações da
disponibilidade de fenitoína. Álcool, carbamazepina, outros bar-
bitúricos e rifampicina induzem C Y P 2 C 1 9 e C Y P 2 C 9 . Essa
indução resulta em (1) a u m e n t o d o metabolismo da íeuiLoína,
(2) diminuição da concentração sérica da fenitoína livre e total e
(3) redução d o efeito farmacológico. Drogas c o m o cloranfenicol,
cimetidina, dissulfiram, isoniazida, omeprazol e ropiramato com-
petem c o m o metabolismo da fenitoína, resultando em u m
a u m e n t o das concentrações livre e total da droga c o m o melhora
d o efeito farmacológico. Os salicilatos, o ácido valpróico, a fenil-
butazona, o sulfisoxazol e a sulfoniluréias c o m p e t e m c o m a feni-
toína pelos locais de ligação protéica. O resultado final é a dimi-
nuição da concentração sérica de fenitoína, enquanto que a
concentração livre e o efeito farmacológico permanecem os
mesmos. O interesse em monitorar a concentração de fenitoína
livre é e m resposta a essas alterações nos locais d e ligação pro-
téica.
Tiagabina
A tiagabina é indicada c o m o terapia adjunta e m adultos e crian-
ças para o tratamento de convulsões parciais. E freqüentemente
administrada a pacientes recebendo pelo m e n o s mais uma droga
antiepiléptica. A tiagabina é u m bloqueador seletivo d o G A B A
n o n e u r ô n i o pré-sináptico. A tiagabina reconhece e se liga aos
locais associados de a captação do G A B A . Por m e i o dessa ação,
a tiagabina bloqueia a captação nos neurônios pré-sinápticos,
permitindo q u e mais G A B A esteja disponível para se ligar a
receptores na superfície das células pós-sinápticas.
A tiagabina tem uma meia-vida de 7 a 9 horas. E m pacientes
recebendo drogas antiepilépticas indutoras de CYP3A4, a meia-
vida diminui para 4 a 7 horas. A fenitoína, o fenobarbital e a
carbamazepina são indutores dessa enzima. O ácido valpróico e
a gabapentina não o são. A tiagabina não é considerada u m
indutor de CYP3A4.
A tiagabina alcança pico de concentração plasmática de apro-
ximadamente 45 minutos após uma dose oral. Pacientes pediá-
tricos alcançam o pico de concentração e m aproximadamente 2,4
horas. A tiagabina é b e m absorvida, sendo que o alimento
diminui a taxa de absorção s e m alterar a quantidade absorvida
(dietas ricas em gordura prolongam o pico sérico de concentração
em 2,5 horas). A tiagabina é 9 5 % absorvida, com biodisponibi-
íidade oral de 90%. A farmacocinética da tiagabina é linear na
dose típica de 2 a 24 mg. Cerca de 96% da droga se liga a prote-
ínas plasmáticas, principalmente à albumina e à A A G . A admi-
nistração conjunta c o m ácido valpróico reduz a ligação protéica
a 94%, aumentando a fração livre de tiagabina e m 40%.
As concentrações séricas de tiagabina n o vale variam d e 5 a
35 n g / m L na maioria dos pacientes recebendo doses terapêuticas
e são proporcionais à dose. U m a única dose de 4 m g adminis-
trada em crianças produz pico de concentração plasmática que
varia de 5 2 a 108 n g / m L . N o estado de equilíbrio, u m adulto
recebendo 4 0 m g / d i a terá u m pico de concentração na faixa de
110 a 2 6 0 n g / m L , e em u m adulto recebendo 8 0 mg por dia
espera-se u m pico d e concentração plasmática na faixa de 2 2 0 a
5 2 0 n g / m L . Concentrações séricas maiores que 8 0 0 n g / m L
indicam dose excessiva associada a efeitos adversos, c o m o astenia,
ataxia, dificuldade d e concentração e depressão.
Topiramato
O topiramato é uma droga antiepiléptica de largo espectro. Tem
atividade bloqueadora em canais de sódio e potencializa a ativi-
dade d o GABA, além de potencializar a inibição dos receptores
de glutamato. Devido à sua ação variada, o topiramato bloqueia
a difusão da convulsão mais d o que o a u m e n t o d o potencial
convulsivo.
O ropiramato é administrado rotineiramente por via oral, é
absorvido rapidamente e p o u c o metabolizado. Sua disponibili-
dade é afetada pela C Y P 2 C 1 9 . As concentrações séricas de outros
anticonvulsivantes n ã o são afetadas pela administração concomi-
tante d o topiramato. Exceção se faz em pacientes recebendo
fenitoína, que passam a ter níveis plasmáticos aumentados dessa
droga após a adição d e topiramato. A administração conjunta de
fenitoína o u carbamazepina diminui as concentrações séricas de
topiramato. Mudanças nas doses de fenitoína ou carbamazepina
(p. ex., aumento o u retirada) para pacientes estabilizados c o m o
uso de topiramato p o d e m precisar de ajustes na dose dessa droga.
Assim c o m o outras drogas anticonvulsivantes eliminadas por via
renal, pacientes c o m função renal alterada apresentam diminui-
ção do clearance renal.
A concentração d e pico do topiramato é alcançada de 2 a 3
horas após a dose. Concentrações de pico na faixa de 9 a 12
p g / m L indicam que a dose é apropriada para se atingir uma
ótima atividade antiepiléptica. A concentração mínima, atingida
exatamente antes a próxima dose, deve ser maior que 2 p g / m L ,
para garantir uma adequada proteção contra convulsões. C o n -
centrações menores que 2 p g / m L indicam que a dose o u é
subótima o u administrada com baixa freqüência.
Ácido Valpróico
O ácido valpróico é usado para o tratamento de c o n v u l s õ e s d o
tipo ausência. T a m b é m se mostrou útil contra convulsões par-
ciais e tônico-clônicas q u a n d o usado e m c o n j u n t o c o m outros

agentes, c o m o fenobarbital ou fenitoína. A droga inibe a
e n z i m a G A B A - t r a n s a m i n a s e , r e s u l t a n d o e m u m a u m e n t o da
concentração de G A B A n o cérebro. O ácido valpróico t a m b é m
m o d u l a os canais d e s ó d i o s i n á p t i c o s ao p r o l o n g a r a i n a t i v a ç ã o ,
q u e r e d u z a h a b i l i d a d e d o n e u r ô n i o e m r e s p o n d e r a altas fre-
q ü ê n c i a s . Essa ação gera a t i v i d a d e c o n t r a c o n v u l s õ e s t ô n i c o -
clônicas.
O ácido valpróico é r a p i d a m e n t e e quase c o m p l e t a m e n t e
a b s o r v i d o após a a d m i n i s t r a ç ã o oral. O s picos de c o n c e n t r a ç ã o
o c o r r e m entre 1 e 4 h o r a s após a d o s e oral. O p r i n c i p a l m e t a b ó -
lito, o ácido 2-n-propil-3-cetopentanóico, é criado pela ação da
C Y P 2 C 1 9 e t e m atividade a n t i c o n v u l s i v a n t e c o m p a r á v e l à d o
ácido valpróico. A p e s a r de esse m e t a b ó l i t o n ã o se a c u m u l a r n o
p l a s m a , o i s ô m e r o da enzima c i t o c r o m o exata envolvida n o meta-
b o l i s m o a m d a n ã o foi identificada. A meia-vida d e u m a dose
ú n i c a é d e 16 h o r a s e m a d u l t o s saudáveis, mas d i m i n u i para 12
h o r a s na terapia c r ô n i c a e p o d e ser t ã o c u r t a q u a n t o 8 horas e m
crianças. E m n e o n a t o s e na d o e n ç a h e p á t i c a , q u a n d o o m e t a b o -
lismo está reduzido, a meia-vida se p r o l o n g a . O ácido valpróico
t e m alta taxa d e ligação pTOtéica (93%). E m algumas circunstân-
cias, q u a n d o a c o m p e t i ç ã o pela ligação a protéica a u m e n t a , c o m o
na u r e m i a , na cirrose e n o u s o c o n c o m i t a n t e d e medicações, a
p o r c e n t a g e m d e ácido valpróico livre a u m e n t a .
A c o n c e n t r a ç ã o m í n i m a p a r a efeito t e r a p ê u t i c o de ácido val-
p r ó i c o é d e 5 0 p g / m L . C o n c e n t r a ç õ e s q u e ultrapassam 100 p g /
m L são associadas a toxicidade h e p á t i c a e encefalopatia tóxica
aguda. T e m sido o b s e r v a d o o a c ú m u l o de glicina e m pacientes
q u e p a s s a m p o r t r a t a m e n t o c o m ácido valpróico.
O clearance de ácido valpróico é r á p i d o , o q u e leva a u m
d i l e m a na dosagem. A dose deve ser a d e q u a d a p a r a gerar u m a
c o n c e n t r a ç ã o plasmática m a i o r q u e 4 0 p g / m L , e n q u a n t o se evita
u m a c o n c e n t r a ç ã o q u e exceda 100 p g / m L . A a m o s t r a ideal para
m o n i t o r a r a c o n c e n t r a ç ã o é a q u e l a c o l h i d a e x a t a m e n t e antes da
p r ó x i m a dose, n o r m a l m e n t e logo cedo, p a r a c o n f i r m a r q u e u m a
dose a d e q u a d a foi prescrita n o p e r í o d o anterior. A dosagem é
u m p r o b l e m a particular e m crianças q u e d o r m e m p o r mais
t e m p o d o q u e a meia-vida c o m p l e t a da droga.
O ácido valpróico m o d u l a a ação de várias o u t r a s drogas
antiepilépticas. Ele inibe o cleatance não-renal d o f e n o b a r b i t a l ,
r e s u l t a n d o e m elevadas c o n c e n t r a ç õ e s dessa droga. Ele c o m p e t e
com a f e n i t o í n a p o r locais de ligação protéica. A s c o n c e n t r a ç õ e s
d e f e n i t o í n a livre p e r m a n e c e m a p r o x i m a d a m e n t e as m e s m a s , m a s
a f e n i t o í n a total n o p l a s m a d i m i n u i . C o m o a c o n c e n t r a ç ã o de
f e n i t o í n a livre p e r m a n e c e a m e s m a , o efeito f a r m a c o l ó g i c o se
m a n t é m . O u t r a s drogas antiepilépticas q u e i n d u z e m enzimas
hepáticas oxidativas a u m e n t a m o m e t a b o l i s m o d o ácido val-
próico-, esse a u m e n t o r e q u e r u m a d o s e mais alta para m a n t e r a
c o n c e n t r a ç ã o terapêutica efetiva.
Zonisamida
A z o n i s a m i d a é u m b l o q u e a d o r d e canais de s ó d i o e cálcio.
Drogas Terapêuticas CAPÍTULO 3 0 563
Drogas com Ação Cardiológica
O s p a r â m e t r o s f a r m a c o c i n é t i c o s da digoxina e o u t r a s drogas c o m
ação cardiológica estão r e s u m i d o s na Tabela 30-2. A digoxina, a
d i s o p i r a m i d a , a lidocaína, a p r o c a i n a m i d a e a q u i n i d m a são
n o r m a l m e n t e m e d i d a s p o r i m u n o e n s a i o . Para q u a n t i f i c a r o u t r a s
drogas d e ação cardiológica, usa-se a H P L C .
Amiodarona
A a m i o d a r o n a é usada p a r a c o n t r o l a r t a q u i a r r i t m i a s supraventri-
culares e ventriculares. Essa droga é interessante c o m o s u b s t i t u t a
de o u t r o s a n t i a r r í t m i c o s classe I c o m o p r o c a i n a m i d a ou quini-
dina, pois t e m u m a meia-vida longa (45 dias). A c o n c e n t r a ç ã o
sérica efetiva dessa droga é m e d i d a 24 h o r a s d e p o i s de u m a ú n i c a
dose diária. Ela varia de 1 a 2 p g / m L . A droga é i n d i c a d a p a r a
c o n t r o l e d e taquicardias ventriculares e fibrilação resistente a
o u t r a s f o r m a s de terapia. A a m i o d a r o n a é e x t e n s a m e n t e m e t a b o -
lizada pelo sistema C Y P 3 A 4 - S e u m e t a b o l i s m o é a f e t a d o de
f o r m a significativa pela a d m i n i s t r a ç ã o c o n j u n t a c o m carbamaze-
p i n a , e r i r r o m i c i n a , f e n i t o í n a , r i f a m p i c i n a e erva-de-São J o ã o .
A l é m disso, a p r e s e n ç a de a m i o d a r o n a p r o l o n g a r á o m e t a b o -
lismo de diversas drogas, i n c l u i n d o ciclosporina, digoxina, ini-
b i d o r e s de protease, sirolimus, t a c r o l i m u s e vera pam i l . A c o n -
c e n t r a ç ã o de n o r a m i o d a r o n a , u m m e t a b ó l i t o e q u i v a l e n t e , é
t i p i c a m e n t e à da a m i o d a r o n a n o e s t a d o d e equilíbrio, e a l g u m a s
vezes é m o n i t o r a d a j u n t o c o m a d r o g a de base.
A a m i o d a r o n a é u m a n á l o g o e s t r u t u r a l da tiroxina, e m u i t o
da sua toxicidade é r e l a c i o n a d a às interações q u e o c o r r e m n o s
receptores de h o r m ô n i o s da t i r e ó i d e . A fibrose p u l m o n a r é u m
evento f r e q u e n t e adverso r e l a c i o n a d o à dose, e c o n c e n t r a ç õ e s da
droga m e n o r e s q u e 2 0 0 m g / d i a e u m a m a n u t e n ç ã o d o p i c o de
c o n c e n t r a ç ã o m e n o r d o q u e 2 p g / m L a j u d a m a prevenir esse
efeito colateral q u e a m e a ç a a vida.
Digoxina
A digoxina é u m f á r m a c o d o g r u p o dos glicosídeos cardíacos
extraído das p l a n t a s "digitais" (p. ex., Digitítíis lanata). Ela res-
t a u r a a força de c o n t r a ç ã o cardíaca n a insuficiência cardíaca
congestiva e t a m b é m é usada n o m a n e j o d e taquicardias supra-
v e n t n c u l a r e s . A droga se liga a s u b u n i d a d e a da N a ' / K + - A T P a s e
n a face extracelular, i n i b i n d o t a n t o o e f l u x o celular d e N a +
q u a n t o o i n f l u x o celular de K + n a célula miocárdica. Isso r e d u z
o g r a d i e n t e s ó d i o / p o t á s s i o n a s fibras d e P u r k i n j e atriais, juncio-
nais e ventriculares, r e s u l t a n d o e m d i m i n u i ç ã o d o p o t e n c i a l
t r a n s m e m b r a n a . Postula-se q u e a inibição da N a M C - A T P a s e
a u m e n t a o m o v i m e n t o d o s í o n s cálcio para a célula, m e l h o r a n d o
a d i s p o n i b i l i d a d e d o íon cálcio e m e l h o r a n d o a c o n t r a t i l i d a d e
cardíaca.
E m baixas c o n c e n t r a ç õ e s , a digoxina t o r n a o átrio m e n o s
excitável eletricamente. C o n c e n t r a ç õ e s m o d e r a d a s de digoxina
são necessárias p a r a reduzir a taxa de despolarização nas fibras
c o n d u t o r a s q u e d e s p o l a r i z a m e s p o n t a n e a m e n t e (fibras d e Pur-
kinje), e c o n c e n t r a ç