02/11/2023

Mitocôndria e bioenergética

Susana Cardoso

A mitocôndria humana

http://www.ieet.org/images/uploads/mtdna.jpg

- Dupla membrana
- Essencial na respiração celular e no metabolismo
- Essencial na morte celular programada (apoptose)
Susana Cardoso

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Transdutores de energia - Mitocôndria

Uma célula pode possuir apenas uma mitocôndria de

grandes dimensões ou várias (centenas) de pequenas
dimensões, dependendo da atividade metabólica da célula.
As mitocôndrias alteram de forma, dividem-se e
movimentam-se na célula.
As membranas da mitocôndria subdividem a mitocôndria
em vários espaços internos.
A membrana interna e matriz
da mitocôndria contem inúmeras
enzimas associadas a diversas
vias metabólicas.

Susana Cardoso

 respiração celular
 moléculas orgânicas são quebradas libertando energia que é
então transferida para formar ATP
 consiste na lise de moléculas orgânicas (glicose), na presença
de oxigénio libertando energia, CO2 e água, a energia é
armazenada em moléculas de adenosina trifosfato (ATP)
 quanto maior a atividade celular maior o número de mitocôndrias.

Susana Cardoso

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Susana Cardoso

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GLICÓLISE

Susana Cardoso

RESPIRAÇÃO CELULAR

Susana Cardoso S

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• ocorre na crista da mitocôndria, membrana interna

 NADH & FADH2

transportadores de e-  estão sob forma reduzida
 Cadeia transportadora de electrões
vão ceder os seus electrões a um conjunto de moléculas
estão localizadas na crista das mitocôndrias
conjunto de reações de oxidação-redução
O2 é o receptor final de electrões  forma-se H2O (6 moléculas)
O ADP é fosforilado  36 moléculas de ATP

Susana Cardoso

Proteínas transportadoras de eletrões

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Oxidação de NADH

Susana Cardoso

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Oxidação do FADH2

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Durante o transporte de electrões pela cadeia respiratória

da membrana mitocondrial interna o oxigénio molecular
pode ser reduzido, gerando espécies reativas de oxigénio
(ROS):

Essas espécies são altamente reativas com biomoléculas, e

no ambiente intracelular podem atacar ácidos nucleicos,
proteínas e lipidos.

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Drogas capazes de agir sobre os

complexos

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Mitocôndria

Funções bioenergéticas:
• Controla o potencial redox
• Controla a homeostase do cálcio
• Participa na regulação transcripcional
• Controla a apoptose

ALVO terapêutico contra o cancro

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Envelhecimento

• Declínio do metabolismo
mitocondrial (ATP)
• Aumento da produção de radicais livres
e ROS
• Diminuição da integridade funcional
da mitocôndria

• Provavelmente acumulação de
mutações no DNAmt

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Mitocôndria e envelhecimento

• O envelhecimento pode estar associado à

acumulação de lesões celulares decorrentes da
formação de ROS e do azoto formado através
do metabolismo mitocondrial.
• Com a progressão da idade, acumulam-se
proteínas, lipidos, carboidratos e DNA
oxidados em relação a organismos jovens, de
acordo com a teoria dos radicais livres.

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Mitocôndria
e
oncogénese

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Cancro
• Falha imunitária (do reconhecimento
self/non-self)

• Efeito Warburg: elevado uptake de glicose

na maioria dos cancros
As células tumorais mantêm taxas
glicoliticas elevadas provavelmente
devido a alterações da função
mitocondrial

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Mitocôndria e cancro
• MOMP (mitochondrial outer membrane3 processomarte
em
pelo qual
alular
a elel
passo
. no

permeabilization – importante na morte

início da

regulação da morte celular- quando

desregulada origina sobrexpressão da
BCL2(proteína anti-apoptótica)
• Alguns metabolitos mitocondriais são
suficientes para despoletar oncogénese
• Alguns circuitos mitocondriais adaptam-
se bioenergeticamente

23

Mecanismos básicos

1. ROS favorecem a acumulação de

mutações no DNA ativando vias
oncogénicas
2. Acumulação de metabolitos como efeitos

fumarato, succinato, 2-HG pode ter

efeitos transformadores wedo mecanismo !
e

3. Defeitos no MOMP originam

sobrevivência das células tumorais

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Metabolismo mitocondrial na
progressão tumoral
1. mitocondria é principal fonte de ATP para as células
tumorais
2. Céls. Tumorais em progressão apresentam maior
permeabilidade da membrana externa mitoc. (MOMP)
e uma permeabilidade transicional (MPT)
3. níveis suprafisiológicos de ROS favorecem a
mutagénese
4. diferentes linhas cels. malignas apresentam
diversificação metabólica
5. a cascata metastática assenta numa biogénese e
fosforilação oxidativa (OXPHOS) acompanhada de
disfunção mitocondrial atingindo a apoptose.

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Proliferação celular

Susana Cardoso

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Ciclo celular

Susana Cardoso

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Sinalização e regulação do ciclo celular

• A comunicação, que se inicia com ativação

por fatores de crescimento, é essencial
para a divisão celular. Os fatores de cresc.
são libertados para o espaço intercelular e
ligam a receptores específicos,
transmitindo um sinal de proliferação às
proteínas citoplasmáticas, gerando uma
via de ativação que termina com ativação
de fatores de transcrição nucleares.
Susana Cardoso

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Checkpoints

Susana Cardoso

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Proteínas reguladoras do ciclo celular –

reguladores positivos e reguladores negativos

Reguladores intracelulares
• Ciclinas –cdk (reg.positivos)
• Proteínas Rb e p53, p21 e p16 (reg. negativos)

Reguladores extracelulares
Fatores de crescimento (mitógenos)
EGF (epidermal growth factor)
PDGF (platelet-derived growth factor)
FGFs (fibroblast growth factors)
VEGF (vascular endothelial growth factor)

Células privadas de fatores de crescimento permanecem em G1

Susana Cardoso

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• Bagga, 2014
Susana Cardoso

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Ciclinas

• Aumentam em alturas de transição, quando necessárias

Susana Cardoso

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• Cdk são enzimas que fosforilam proteínas –alvo em

resíduos de serina e treonina e ligam a ciclinas.
• As vias de sinalização ativas em G1 são mediadas por
fatores de crescimento (PDGF, EGF IGF ) ou receptores
ligados a proteínas G. Os fatores de crescimento ativam
a via MAPK e os receptores ligados a proteínas G
ativam a síntese de IP3 com libertação de cálcio e
ativação dos MPFs (fatores promotores, formados por
ciclinas e cdk).
• Ambos os processos culminam com produção de
ciclinas e cdk .

Susana Cardoso

33

• Ciclinas G1/S enviam cdks para alvos de

fase S (promovendo a replicação do
DNA), enquanto ciclinas M enviam cdks
para alvos da fase M (levando ao
rompimento da membrana nuclear)

Susana Cardoso

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Transição G1-S
• O complexo ciclina-cdk origina fosforilação da pRB,
inactivando-a. Desliga-se do S-MPF e ocorre
transição para a fase S. Quando desfosforilada a pRB
determina a paragem em G1. A proteína p53 regula a
ação da pRb mantendo-a desfosforilada.

Transição G2-M
• Para transição G2 para M é necessário ativação do
M-MPF.
• Se a replicação está completa, Cdk é ativada por
fosforilação e liga ciclina b mantendo o M-MPF ativo,
progredindo a mitose.
Susana Cardoso

35

P53
• Supressor tumoral
• Impede a transição G1-S mantendo a pRb
desfosforilada ( e, em consequência,
impede a transcrição do E2F)
• Influencia a p21, também supressora
tumoral
• Indutora de apoptose

Susana Cardoso

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pRB (retinoblastoma)

Susana Cardoso

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Senescência replicativa
• As células normais podem dividir-se um número limitado de
vezes;.
• evento geneticamente determinado que envolve vários genes.
• incapacidade das sequências terminais do DNA nos telómeros
de replicar em cada divisão celular.
• O resultado é um encurtamento progressivo dos telómeros até
que, finalmente, a célula não consegue dividir mais.
• As excepções a esta regra são células germinativas, células
estaminais e células transformadas, que muitas vezes
expressam a enzima telomerase, que é capaz de replicar as
sequências terminais do DNA no telómero e estender a vida útil
das células, infinitamente no caso de células germinativas e
algumas células tumorais.

Susana Cardoso

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Limite de Hayflick

https://itsaboutaging.files.wordpress.com/
Susana Cardoso

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 02/11/2023

Apoptose
Deriva do grego apo (de ou separado de) e ptosis (queda)
usado para as folhas a cair no outono

Susana Cardoso

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Morte celular
Os genes que controlam o tempo de vida ou programam a morte
celular, como o gene da telomerase, os genes envolvidos no processo
da apoptose e os genes de reparação do DNA também intervém
diretamente no processo de oncogénese.
Sabemos que todas as células carregam programas de controle do
seu tempo de vida. Entre estes mecanismos, o da apoptose prevê
rápida eliminação de células desnecessárias ou perigosas ao
organismo.

Indução da apoptose(fases):

 Interação do indutor com a célula

 Transdução do sinal de “morte”
 Fenómenos conducentes à apoptose

Susana Cardoso

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 02/11/2023

Apoptose vs necrose

Susana Cardoso

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NECROSE
APOPTOSE
 Edema
 Contração celular  Ruptura da membrana
 Vesiculação da membrana  Núcleo quase inalterado
 Condensação e  Alteração de organelos
fragmentação da cromatina  Lesão celular
 Corpos apoptóticos
 Sem alteração de organelos
 Sem reação inflamatória
 Sem rompimento
membrana

Susana Cardoso

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Desencadeantes de apoptose

Intrínsecos
• “Queda” de fatores de crescimento
• Hormonas
• Fatores de crescimento do tipo TNF
Extrínsecos
• Exposição a agentes do stress
• Exposição a radiações
• Exposição a citostáticos
• ROS
Susana Cardoso

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Vias apoptóticas (extrínseca e

intrínseca)

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Apoptose
A proteína p53 possui a capacidade de ativar as vias apoptóticas
extrínseca e intrínseca na célula.

via extrínseca existem sinais extracelulares, sendo ativada por

p53 pela indução de genes que codificam os receptores de
superfície (receptores de morte do tipo Faz-L e TNF).

via apoptótica intrínseca é comandada pela família de proteínas

Bcl-2, que dirige a libertação de citocromo c das mitocôndrias.

Ambas as vias induzem a morte celular por ativação de

caspases.
As duas vias ativam as caspases iniciadoras, que ativam as
caspases executoras, que então matam a célula degradando as
proteínas indiscriminadamente.
Alguns fatores, como os receptores Fas (First apoptosis signal) e
as caspases, promovem a apoptose, enquanto alguns membros
da família de proteínas Bcl-2/Bcl-XL inibem a apoptose.

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Via extrínseca

• A via de sinalização ativada a partir de

sinais extracelulares (por exemplo Fas –
por interação Fas-Fas ligando), cria um
complexo DISC que induz a alteração da
procaspase 8 em caspase 8 e de seguida,
ativa as killer caspases 3,6 e 7. Esta via
extrínseca acaba frequentemente por
ativar a via intrínseca.

Susana Cardoso

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Via intrínseca

• Esta via ocorre com a libertação de proteínas

mitocondriais para o citosol e com reguladores smac e
diablo que ativam a apoptose

• O citocromo c é crucial, sendo libertado por canais

formados por Bax e Bad ou por hiperpolarização da
membrana, ligando ao Apaf-1 (factor ativador das
proteases apoptoticas).Nas células normais o cit.c está no
espaço intermembranar e para a entrada em apoptose é
libertado para o citosol.

• O apoptossoma ativa a caspase 9 que ativará as 3,6 e7

(efetoras)
Susana Cardoso

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 02/11/2023

Inibição da apoptose

• Para que a Bcl2 tenha efeitos anti-apoptoticos,

tem que formar dímeros com a Bax.

• A Bad pode sequestrar a Bcl-2, libertando a Bax

que é transportada para a mitocôndria,
inserindo-se na membrana e assumindo efeito
apoptótico

Susana Cardoso

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Proteínas
Apoptoticas
• Bak, Bad, Bid, Bax
Anti-apoptoticas
• Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w,
• Regulação anti-apoptose:
IAPs (proteína inibidoras da apoptose) e
sinais de sobrevivência
Regulação pró-apoptose
Anti-IAPs
Susana Cardoso

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 02/11/2023

Desequilíbrio da apoptose

Susana Cardoso

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 22/11/2023

Célula Eucariota - Núcleo

Susana Cardoso

Célula animal – Núcleo

- É o organelo mais proeminente da célula (diâmetro ~ 5 m).
- Contem a maioria dos genes da célula.
(A mitocôndria (e os cloroplastos nas cél. Vegetais) podem conter alguns genes)
- O DNA do núcleo encontra-se condensado sob a forma de cromatina.
- Controla a síntese de proteínas no citoplasma através do envio de
molécula de RNAm (RNA mensageiro).

- Apresenta nucléolo
Região composta por DNA e
proteínas e dedicada à síntese de
ribossomas.

Susana Cardoso

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Envelope/invólucro Nuclear
- O núcleo está envolvido por um envelope nuclear
(membrana dupla com espaço intermembranar de 20 a 40
nm).
- O envelope nuclear contem poros com cerca de 100 nm de
diâmetro, que regulam a entra e saída de certas partículas
e macromoléculas.

Susana Cardoso

ÁCIDOS NUCLEICOS

São polímeros de nucleótidos

Os nucleótidos são compostos por:

 1 pentose (desoxirribose ou ribose)

 1 base nitrogenada
 1 grupo fosfato

Os nucleótidos são de 2 tipos:

 desoxirribonucleótidos (com desoxirribose)

 ribonucleótidos (com ribose)
Susana Cardoso

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PENTOSE

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BASE

2 anéis heterocíclicos
Purinas
Pirimidinas

Susana Cardoso
1 anel heterocíclico

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FORMAÇÃO

Susana Cardoso

FORMAÇÃO

 A pentose liga-se pelo carbono 1 ao

azoto da base azotada
 A pentose liga-se pelo carbono 5 a
um grupo trifosfato

Susana Cardoso

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FORM AÇÃO

Nomenclatura
simplificada: A, T,
G, C e U (RNA)

Susana Cardoso
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FORMAÇÃO

 Os carbonos 5 e 3 de
nucleótidos adjacentes
unem-se por uma ponte
fosfodiester

 As bases ficam exteriores

ao esqueleto carbonatado

Susana Cardoso

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FORMAÇÃO

Numa cadeia de DNA

há dois terminais
livres:
 O grupo
(fosfato) 5’ do
nucleótido
inicial

 O grupo
(hidroxilo) 3’ do
nucleótido final

Susana Cardoso

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FORMAÇÃO A síntese das cadeias de DNA

dá-se no sentido de 5’ para 3’.

Convencionou-se que as
cadeias poli-nucleotideas se
escrevem 5’- 3’.

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 22/11/2023

FORMAÇÃO

 Em 1953 Watson & Crick

demonstram que o DNA é uma
dupla hélice, com as cadeias de
DNA em orientação
antiparalela, com as bases
emparelhadas

 As bases estão orientadas para o

interior da hélice e o esqueleto
carbonado para o exterior.
Susana Cardoso

13

Duas cadeias polinucleotídicas antiparalelas complementares.

Estabilizado por ligações não-covalentes.
As duas cadeias são mantidas unidas por pontes de hidrogénio entre as
purinas e as pirimidinas.
Interacções hidrofóbicas fazem com que as bases fiquem para o interior.
À superfície, entre os açucares e fosfatos estabelecem-se ligações
fosfodiester, formam-se ligações com moléculas de água.
A dupla hélice, porque liga bases de diferentes tamanhos torna-se mais
estável.

ESTABILIDADE:
Se desligassem, as purinas e as pirimidinas contactavam mais com a água, o que
seria desfavorável.

As cadeias duplas contêm grande número de ligações fracas, não-covalentes,

que têm a tendência a quebrar em grupo…Mas, quando quebram, existem
habitualmente ligações de H, adjacentes, que compensam. A cadeia é mais
vulnerável quando a quebra de ligações ocorre na extremidade.
A vulnerabilidade aumenta com a temperatura e com o pH.

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FORMAÇÃO

Observação inicial de que o número de A(s) era igual ao

número de T(s), assim como o número de C(s) era o mesmo
que o número de G(s).
A emparelha com T
C emparelha com G
No RNA o T é substituído por U, logo U emparelha com A.
Susana Cardoso

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FORMAÇÃO

• Determinadas ligações entre nucleótidos não são

viáveis.

Susana Cardoso

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ESTRUTURA
No sulco maior (major groove) os grupos dos nucleótidos estão
mais expostos do que no sulco menor (minor groove).

Susana Cardoso

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ESTRUTURA

 A maioria do DNA das células

encontra-se com “direcção/volta
para a direita” (forma B).
 Há outra forma do DNA (forma Z)
onde a hélice tem “direcção/volta
para a esquerda”.

Susana Cardoso

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FORMAS ALTERNATIVAS DE DNA

Susana Cardoso

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DNA – B : enrolamento
para a direita, mais
usual nas células,
completa uma volta a
cada 10 pb; Mais longa
mas mais estreita.

DNA – A: enrolamento
para a direita; enrola a
cada 11 pb; mais curta
e grossa.

DNA – Z: enrolamento
para a esquerda, a
cada 12 pb, aspecto de
zig-zag, ainda mais
longa e muito fina.

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DNA-A DNA – B DNA - Z

Quando há pouca água
disponível para interagir com a
dupla hélice, o DNA assume a
conformação A-DNA.

O DNA, em solução com altas

concentrações de catiões,
assume a conformação Z-DNA.

Em eucariotas o DNA tende a

assumir a conformação Z-DNA
devido a metilação do DNA.

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Estrutura do DNA Temperatura de

desnaturação

Susana Cardoso

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 22/11/2023

RNA
O RNA é semelhante ao DNA,
apenas com algumas diferenças:

 o açúcar presente é a ribose;

 a base timina é substituída pela base
uracilo;
 apresenta-se quase sempre em
cadeia simples.

 O RNA é sintetizado utilizando como

modelo uma cadeia de DNA (cadeia
molde), num processo chamado
transcrição.
Susana Cardoso

23

Estrutura do RNA
 O RNA embora se apresente quase
exclusivamente em cadeia simples, pode
formar estruturas complexas.
 Zonas da cadeia que se encontrem
próximas e sejam complementares
podem estabelecer ligações entre si.

Susana Cardoso

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 22/11/2023

Estrutura do RNA

Susana Cardoso

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Tipos de RNA

 Tipos de RNA:
 mRNA - mensageiro;
 rRNA - ribossomal;
 tRNA – transferência;
 snRNA – pequenos
nucleares;
 snoRNA – pequenos
nucleolares

Susana Cardoso

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Tipos de RNA

 RNA mensageiro ( 5%) – transporta a informação genética

do DNA até aos ribossomas onde ocorre a tradução;

 RNA ribossomal ( 85%) – está associado a proteínas,

constituindo os ribossomas;

 RNA transferência ( 10%) – transporta os aminoácidos e

assegura a sua correta inserção

• snRNA – pequenos RNA’s nucleares;

• snoRNA – pequenos RNA’s nucleolares.

Susana Cardoso

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- DNA plasmídico
DNA circular
- DNA mt

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DNA circular - plasmídico

DNA plasmídico/Plasmideos (procariontes)

São moléculas circulares de DNA de cadeia dupla, que

estão separadas do DNA cromossómico.

Susana Cardoso

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DNA plasmídico
É frequente encontrar
diferentes formas quando
se observa D N A plasmídico.

Susana Cardoso

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 22/11/2023

DNA plasmídico

Conformações do DNA plasmídico

– observação

 Linear
 Circular com uma cadeia cortada
 Circular relaxado
 Super-enrolado

Susana Cardoso

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Susana Cardoso

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DNA mitocondrial

 possuem o seu próprio genoma (mtDNA) ,

distinto do DNA nuclear.

 DNA mitocondrial é uma molécula circular, de

cerca de 16.500 pares de bases, que codifica
para 13 proteínas, 22 tRNAs e 2 rRNAs.

 Todas as 13 proteínas codificadas pelo mtDNA

são componentes de 4 dos 5 complexos do
sistema de fosforilação oxidativa.

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DNA
mitocondrial

Susana Cardoso

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DNAmt

http://acbjournal.org/ArticleImage/

• Região codificante:
Região não-codificante: • - 13 OXPHOS genes
- D-loop • - 22 tRNAs
• - 2 rRNAs

35

Gene(s)

 segmento de DNA que contém informação necessária para

que ocorra a síntese de um produto funcional (proteína(s) ou
RNA);
 determina as características de uma espécie, como um todo, e
do individuo em particular.

região codificante
região não codificante (nos eucariotas)

Uma grande porção dos genes presentes nos

genomas dos eucariotas não codificam qualquer
mRNA, ou outro tipo de RNA.
Susana Cardoso

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Genético depende da informação

presente no gene(s) para se
manifestar.

características inscritas nos

Hereditário genes, transmitidas de pais
para filhos.

característica presente no
momento do nascimento, não
Congénito necessariamente transmitida
pelos progenitores.

37

Gene(s)
Genes duplicados

• Pensa-se que a duplicação

de genes tem um papel
determinante na evolução
dos organismos.

• Os genomas de plantas
são os que mais sofrem
duplicação.

Susana Cardoso

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 22/11/2023

Gene(s)
 Os dois genes que se geram após
um processo de duplicação
chamam-se parólogos, normalmente
dando origem a proteínas com estrutura
e/ou função diferente.

Ortólogos – genes que codificam para

proteínas com funções semelhantes,
mas que estão em espécies diferentes.
Terão sido gerados por processos de
especiação.

Susana Cardoso

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Código Genético

Susana Cardoso

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 22/11/2023

Genoma

Intrões
 DNA não funcional, presente dentro dos genes
 raros em procariotas, abundam em eucariotas
Exões
• regiões dos genes que efectivamente codificam para um
produto

Susana Cardoso

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Genoma
Expressão genética
• processo de tradução da informação
contida no D N A para proteína.

Genoma
• Conjunto de toda a informação genética de um organismo
nos eucariotas o genoma está dividido em
cromossomas
 Nuclear
 de organelos

Susana Cardoso

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 22/11/2023

Organização do DNA genómico

1 cromossoma 1 molécula de DNA

O comprimento do ácido nucleico é muito superior ao do
compartimento que o contém.
Susana Cardoso

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Organização do DNA - eucariotas

Cromatina = DNA + proteínas

Susana Cardoso

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 22/11/2023

Organização do DNA - eucariotas

Cromatina = DNA + proteínas

Heterocromatina
 DNA altamente
compactado (grande parte
é inerte)

Eucromatina
 DNA menos empacotado
(maioritariamente activo)

Susana Cardoso

45

Cromatina

Durante a mitose a cromatina é compactada originando

os visíveis cromossomas interfásicos

Proteínas associadas ao DNA

 histónicas
 não histónicas

A unidade básica de organização da cromatina é o nucleossoma.

Susana Cardoso

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 22/11/2023

Nucleossoma:
octamero de histonas:
2 x (H2A, H2B, H3 e H4),
e histona H1.

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H2A
H2B
H3
H4

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 22/11/2023

Histonas

Susana Cardoso

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Nucleossomas

Fibras de 30 nm
Empacotamento de nucleossomas

Enrolamento de 6 nucleossomas, com ajuda

da histona H1, obtendo-se uma estrutura compacta
denominada solenoide.
Susana Cardoso

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 22/11/2023

Nucleossomas

Susana Cardoso

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Nucleossomas

Fibras de 10 nm

Fibras de 30 nm

Susana Cardoso

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 22/11/2023

Histonas
As histonas são proteínas com sequências muito
conservadas entre os eucariotas.

As histonas são proteínas com carácter básico

(carga +), que interagem com o DNA (carga -).

Susana Cardoso

53

Histonas

 As histonas podem ser modificadas nas suas caudas

terminais de aminoácidos, provocando alterações na
função das histonas.

Susana Cardoso

54

27
 22/11/2023

Histonas - caudas
Caudas terminais das histonas:

 permitem a ligação entre nucleossomas;

 atraem proteínas que interagem com o
DNA, para realizarem as actividades necessárias (ex.
reparação, transcrição);
 são modificadas e “des-modificadas”, permitindo
que a cromatina tenha uma estrutura dinâmica;
 pensa-se terem um papel importante no mecanismo de formação da
heterocromatina.

Susana Cardoso

55

Histonas - caudas
A modificação das extremidades amina das histonas origina
locais de ligação para outras proteínas.

Lisinas
- metilação e acetilação

Argininas
- metilação
Histidinas
- metilação e fosforilação

Serinas
- fosforilação

Susana Cardoso

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28
 22/11/2023

Histonas - caudas
 Acetil-transferases
 - enzimas que catalisam a acetilação de resíduos de lisina

 Deacetilases
 enzimas que removem os grupos acetilo das lisinas

 Metil-transferases
- enzimas que metilam os resíduos lisina ou arginina

 Como algumas destas modificações alteram a carga das

histonas, o processo é temporário e está associado a
mudanças na estrutura da cromatina (replicação e
transcrição).

Ex. As histonas são metiladas durante a formação dos nucleossomas

Susana Cardoso

57

Histonas - caudas
A modificação das extremidades amina das histonas origina alterações
na sua funcionalidade.

Histona H3 Histona H4

K – lisina
S – serina
R - arginina

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29
 22/11/2023

Organização da Cromatina

Susana Cardoso

59

Cromossomas

Durante a divisão celular são visíveis, no núcleo das

células eucariotas, estruturas compactas de material
genético (DNA) - Cromossomas

Centrómero

Telómero

Susana Cardoso

60

30
 22/11/2023

Cromossomas
Cariótipo – número, forma, tamanho,
dos cromossomas metafásicos,
característicos de uma espécie

Cromossoma eucariótico para

ser funcional tem de possuir:
 origens de replicação
 centrómero
 telómeros

Susana Cardoso

61

Cariótipo

Susana Cardoso

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31
 22/11/2023

Estudo dos Cromossomas

Coloração com Giemsa (G-banding)
corante utilizado nos estudos com cromossomas, que gera:

• Bandas G elevado conteúdo deA+ T

• Bandas R elevado conteúdo de G+ C

O estudos do padrão de bandas característico de um cariótipo, permite

identificar deleções, translocações, anomalias várias.

63

Estrutura do Cromossoma Eucariótico

Par de cromatídeos

2 braços:
curto
Centrómero longo

Telómero

Cromatina = DNA + proteínas histonas

outras proteínas
Susana Cardoso

64

32
 22/11/2023

Estrutura do Cromossoma Eucariótico

 Os cromossomas, na sua estrutura mais

conhecida, são apenas visíveis por um curto
período de tempo, durante a divisão celular.
 Nesta fase podem ser vistos como uma
estrutura compacta.

Cromatídeos
 são cromossomas irmãos, que foram
produzidos anteriormente, na replicação, e que
ainda se encontram unidos nesta fase da
mitose.

Susana Cardoso

65

Estrutura do Cromossoma Eucariótico

Centrómero
permite que cada cópia do cromossoma seja “puxada” para a
célula-filha quando se dá a divisão celular

Para que cada célula-filha tenha uma cópia de cada

cromossoma, estes são duplicados na interfase do ciclo celular.

Susana Cardoso

66

33
 22/11/2023

Estrutura do Cromossoma Eucariótico

Centrómero

Metacêntrico

Acrocêntrico

Telocêntrico

CEN – regiões de DNA centromérico

Susana Cardoso

67

Cromossoma Eucariótico
• Cada cromatídeo é puxado por microtúbulos para o pólo oposto.
• A opor-se a esta força motriz estão proteínas – coesinas- que
ligam os cromatídeos entre si

• A separação ocorre à medidaque a célula passa

da metafase para a telofase.
• A separação começa na zona dos centrómeros, e
termina na anafase quando as coesinas são degradadas.

Susana Cardoso

68

34
 22/11/2023

Cromossoma Eucariótico

Coesinas
responsáveis por manter os
cromatídeos unidos.

Condensinas
com gasto de energia (ATP)
condensam os cromossomas interfásicos

Susana Cardoso

69

Cromossoma Eucariótico

 O centrómero identifica-se por uma sequência de DNA que liga

proteínas específicas.
 As proteínas que se ligam ao centrómero não estabelecem
ligação directa ao microtúbulo, mas indicam o local onde se irão
ligar as proteínas que fazem esta ligação.
Susana Cardoso

70

35
 22/11/2023

Cromossoma Eucariótico

Cromossomas homólogos – cromossomas que

se encontram emparelhados durante a meiose.
Susana Cardoso

71

Técnicas básicas usadas em Biologia

molecular e Engenharia genética

72

36
 22/11/2023

73

PCR (polymerase chain reaction –

polimerização em cadeia)
Permite a amplificação de genes in vitro.

É necessário:
•DNA ou RNA (cDNA recorrendo à transcriptase reversa)
•“primers” – pequenas sequências que delimitam a zona. Oligonucleótido
complementar que serve de ponto de partida para que esta seja copiada por
uma polimerase.
•DNA polimerase (habitualmente Taq polimerase, obtida a partir do
Thermus aquaticus, que suporta elevadas temperaturas)
•Termociclador
•Solução de reação com nucleótidos, …

RT – PCR reverse-transcription polymerase chain reaction

74

37
 22/11/2023

Cada ciclo completo de

amplificação consiste na
desnaturação da dupla cadeia de
DNA a uma temperatura
próxima da ebulição de modo a
obter cadeias monocatenares
(simples), ligação dos “primers”
e replicação da cadeia modelo
por extensão dos primers,
mediada pela polimerase.
O número de ciclos determina a
quantidade de DNA obtido.
A especificidade da PCR é dada
pelos primers, pelo que não é
necessário isolar o DNA que
interessa, de outros DNA.

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Amplificar quantidades de DNA muito

reduzidas

termocicladores

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 22/11/2023

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 22/11/2023

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 22/11/2023

PCR

Número de ciclos
Maior número de
ciclos origina maior
quantidade de DNA

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Eletroforese em gel

A técnica de eletroforese baseia-se no facto de partículas eletricamente

carregadas se moverem num campo elétrico.

Geis de agarose e acrilamida e bis-acrilamida polimerizada, com

propriedades quimicamente inertes, e com poros de tamanho variável servem
de “suporte” para o processo de eletroforese.

Para além da carga elétrica, a migração de DNA pode ser influenciada pelo peso
molecular: fragmentos lineares de DNA em cadeia dupla migram através duma
matriz de gel a velocidades inversamente proporcionais ao log10 do número de
pares de bases devido a um maior atrito com a matriz devido ao maior tamanho.
Também a concentração da agarose influencia a migração, já que o aumento da
concentração da agarose leva a uma migração eletroforética mais lenta.

82

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 22/11/2023

83

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 22/11/2023

Eletroforese de DNA em gel de agarose: variação da

concentração de agarose e determinação do tamanho dos
fragmentos

https://www.youtube.com/watch?v=vq759wKCCUQ

https://www.youtube.com/watch?v=TIZRGt3YAug

85

86

43
 22/11/2023

DNA fingerprinting
• Análise forense/testes de paternidade

87

Coloração com brometo de etídio

Outros corantes:
GelRed, RedSafe

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44
 22/11/2023

89

1.Observe utilizando um trans-iluminador

2.Faça um gráfico da distância percorrida por cada uma
das bandas do ladder em função do seu tamanho e
um outro gráfico da distância percorrida em função
do log do seu tamanho.
3.Calcule, utilizando o ladder como referência, o
tamanho dos fragmentos.

90

45
 22/11/2023

91

Mapa de
Restrição

92

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 22/11/2023

Mapa de
restrição de
um plasmídeo

www.biorede.pt

93

Um Plasmídeo (ex.pBR322) é uma molécula de DNA

circular, existente em bactérias. Possui replicação
independente e sequências variadas consoante o
tipo de plasmídeo.

Para detetar diferenças na sequência de bases,

recorre-se a enzimas de restrição – endonucleases.
A função biológica destas enzimas é proteger o
genoma de infeção por DNA estranho. Estas enzimas
clivam o dsDNA em sequências determinadas
(exemplos na tabela). Os fragmentos originados
terão tamanho diferente com diferente número de pb.
Se existirem na molécula vários desses locais, a
enzima clivará em todos eles.
94

47
 22/11/2023

Nome Origem Sequência de

reconhecimento

(5’-3’)
BamHI Bacillus amyloliquefaciens G*GATCC
EcoRI Escherichia coli G*AATTC
EcoRV Escherichia coli GAT*ATC
HaeIII Haemophilus aegyptius GG*CC
HindIII Haemophilus influenzae A*AGCTT
XbaI Xanthomonas badrii T*CTAGA

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 29/11/2023

21

Mapa de
Restrição

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 29/11/2023

Blotting

• Southern blotting (ADN)

• Northern blotting (ARN)
• Western blotting (proteínas)

23

Southern blotting
• E. M. Southern (1975)
• Permite identificar um fragmento em particular,
contendo o gene de interesse.
• Os fragmentos de DNA são separados por
eletroforese.
• Os fragmentos são desnaturados e transferidos
para uma membrana carregada positivamente –
blot.

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 29/11/2023

Southern blotting

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26

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 29/11/2023

Animação:
• http://highered.mcgraw-
hill.com/olc/dl/120078/bio_g.swf

27

Northern blotting
Para detetar uma molécula de RNA de uma mistura.

O RNA separado eletroforeticamente é “blotted” numa

membrana, tal como no southern blotting)

Explora, tal como no Southern Blotting a capacidade dos

ácidos nucleicos de ligarem as cadeias complementares.

28

14
 29/11/2023

Western blotting
•Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida

•Separação e caracterização de proteínas

•Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação

•Transferência para membrana por força elétrica

•Proteína alvo é identificada por anticorpo mono ou
policlonal

•Revelação do sistema com anticorpo secundário

fluorescente ou radioativo

29

Estudos citogenéticos
• Recorre-se a células provenientes de vários
tecidos, por ex. linfócitos do sangue periférico,
células de descamação das mucosas, fibroblastos
de biópsias de pele ou células da medula óssea.
• Para DPN (diagnóstico pré-natal): células do líquido
amniótico, sangue do cordão umbilical ou
fibroblastos das vilosidades coriónicas.
• Post-mortem: possível a partir do tecido
cartilagíneo.

30

15
 29/11/2023

FISH (hibridização in situ com fluorescência)

• Desnaturação do DNA
• Sondas de DNA específicas marcadas

• A coloração fluorescente dos cromossomas pode

ser realizada com várias sondas dando a cada
cromossoma um espectro de cores diferente.
• Pode ser usada, por exemplo, para detetar um
locus específico ou a presença/ausência de alelos.

31

32

16
 29/11/2023

telómeros (verde),

FISH para diagnóstico de SMD/LMA

(leucemias): o sinal verde corresponde ao
centrómero do cromossoma 5 e o vermelho, à
região q34, que se encontra deletada num
dos cromossomas.

33

Azul –Cromossoma X
Rosa –Cromossoma Y

34

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 29/11/2023

Polimorfismos moleculares(mutações em regiões

não codificantes ou reguladoras)

RFLP; VNTR

35

RFLPs (restrictrion fragment length polimorfism)

Pais
• A técnica de RFLP (restriction fragment length
Filhos
polymorphisms), ou “restrição enzimática”
encontra inúmeras aplicações no diagnostico
de doenças genéticas, sequenciação de
genomas e criminologia forense, entre outras
áreas.
• Este método baseia-se nos polimorfismos
naturais existentes entre indivíduos da mesma
espécie, que resulta na produção de
fragmentos de DNA de diferentes tamanhos,
marcadores RFLP. Genótipos
• A análise por RFLP envolve as utilização de
várias técnicas: 1) digestão do DNA por
enzimas de restrição, 2) electroforese, 3)
southern blotting, 4) marcação radioativa, e 5)
autoradiografia.

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18
 29/11/2023

Watson

37

VNTRs
variable number tandem repeat

Repetições moleculares consecutivas de sequências em nº

variável

São polimorfismos de comprimento que resultam da

repetição sequencial de um mesmo conjunto de bases.

Podem ser:

Minissatélites (mais extensos e densos)

Microsatélites (STR – short tandem repeats)

38

19
 29/11/2023

Sequenciadores automáticos

39

Microarrays (chip de DNA ou microarranjos)

Recorre à hibridação
Southern blotting em lâmina
Chips de genes
Pode incluir mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas

Os chips de DNA são amostras colocadas em pontos microscópicos ligados a uma

lâmina de vidro.
O DNA é tratado e desidratado para fixar ao vidro.
Sondas ligam ao DNA e permitem a visualização ao microscópio de fluorescência.

Numa placa de suporte dispõem-se pontos separados, sendo adsorvidas sondas

de DNA para detetar mutações. O DNA é fragmentado e marcado com sondas
fluorescentes.
Quando a sequência de um fragmento é complementar da sonda de um local,
verifica-se hibridação. Os restantes fragmentos são arrastados pela solução de
lavagem

40

20
 29/11/2023

41

-Hibridação
do DNA em
teste com
disposições
ordenadas de
nucleotidos
em chip de
silicone.

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21
 29/11/2023

DNA recombinante (rDNA)

•Descoberto com o auxílio de bactérias e bacteriófagos (vírus que atacam as
bactérias) – introduzia-se DNA nas células do microorganismo, que se replicava e
era transmitido às células filhas.
•A extração implica a extração de DNA do dador e a obtenção de um DNA vetor
que transportará o DNA para o recetor.

43

DNAr (DNA recombinante)

• A tecnologia do DNA recombinante baseia-se na combinação de dois
ou mais segmentos de DNA com origens diferentes.

• A tecnologia do DNA recombinante tem inúmeras e importantes

aplicações na ciências da vida e da saúde.

Exemplo:
Produção de Insulina recombinante
1. O gene correspondente à expressão da proteína insulina, nas células produtoras de insulina
(Pâncreas), foi identificado no cromossoma humano.
2. O gene da insulina foi “cortado” com as enzimas de restrição apropriadas e submetido a um
processo de clonagem (aumento do número de cópias iguais do DNA).
3. O gene da insulina foi posteriormente inserido, ou recombinado, num plasmídeo circular
bacteriano (a maioria das bactérias apresenta o seu DNA na forma de um plasmídeo
circular.)
4. O plasmídeo com DNA recombinante é inserido novamente nas bactérias.
5. As bactérias com DNA recombinante vão passar a produzir insulina juntamente com as
restantes proteínas das suas células.

44

22
 29/11/2023

45

Endonucleases de Restrição

•São enzimas, descobertas em bactérias, que clivam o DNA estranho (exemplo: DNA
viral) assim que ele entra no citoplasma, impedindo a infeção.
•Estas enzimas podem reconhecer sequências específicas de DNA e clivar num local
pretendido- zonas de restrição. Assim, utilizam-se para fragmentar o DNA. Os
fragmentos contêm cadeia dupla com uma extensão de cadeia simples, em cada
extremidade – extremidades coesivas. Para ligar os fragmentos pode utilizar-se a
ligase.

Em Resumo…
1.DNA do plasmídeo aberta por enzimas de restrição
2.Com enzima de restrição do mesmo tipo, abre-se o DNA dador, isolando o
gene pretendido
3.O gene é inserido no plasmídeo, juntamente com ligases
4.Forma-se DNA recombinante pela fusão dos fragmentos
5.O plasmídeo recombinante pode inserir-se em bactérias hospedeiras
6.O gene é lido, originando a proteína desejada.

46

23
 29/11/2023

DNA complementar (cDNA)

•Para clonar um segmento genómico é necessário uma
sequência de DNA. Pode partir-se de RNA,
convertendo-o em cDNA, mediante a utilização de
transcriptase reversa (isolada a partir de vírus).

•A partir da cadeia simples obtém-se a cadeia

complementar através da ação da polimerase do DNA.

Algumas utilizações:
Produção de insulina
Produção de fatores de coagulação
Hormonas de crescimento

47

Watson,

48

24
 29/11/2023

Edição de genes – Sistema CRISPR

49

CRISPR
• Mecanismo de defesa encontrado em
bactérias
• As sequências específicas entre as repetições
correspondiam a DNA de vírus
• Atuava em associação com uma proteína Cas
capaz de cortar o DNA e eliminar vírus
• A CRISPR funciona como uma “galeria” de
sequências procuradas

50

25
 29/11/2023

Cas
• Recorre-se sobretudo à Cas de Streptococcus
pyogenes encontrada em infeções da garganta por
ex..

• A Cas corta o DNA segundo a informação

existente na CRISPR

• Em biotecnologia há que saber como

passar a informação à Cas – RNA guia /
sgRNA

51

52

26
 29/11/2023

53

Figure 1: The CRISPR/Cas9-mediated gene disturbance: A single guide RNA (sgRNA), consisting
of a (crRNA) sequence that is specific to the DNA target, and a (tracrRNA) sequence that interacts
with the Cas9 protein, binds to a recombinant form of Cas9 protein that has DNA endonuclease
activity. The resulting complex will cause target-specific double-stranded DNA cleavage. The site
where cleavage occurs will be fixed by the non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair
pathway, an error-prone process that may result in insertions/deletions (INDELs) that may
disrupt gene function(Barrangou, 2015).

54

27
 29/11/2023

PROTEÍNAS

55

Focagem isoeléctrica
• As proteínas podem ainda ser separadas electroforeticamente por focagem
isoeléctrica, com base no seu conteúdo em resíduos de aminoácidos ionizáveis,
isto é, de acordo com o seu ponto isoeléctrico (pI).
• O ponto isoeléctrico (pI) de uma proteína corresponde ao valor de pH a que a
proteína apresenta carga global zero.
• A valores de pH superiores ao pI, a proteína apresenta carga eléctrica negativa
e a valores inferiores apresenta carga eléctrica positiva.

56

56

28
 29/11/2023

Ponto isoeléctrico (pI) (aminoácidos)

• O estado de ionização dos aminoácidos varia com o pH.
• Em solução ácida, por exemplo a pH 1, o grupo carboxilo está protonado (-COOH) e o
grupo amina está ionizado (-NH3+).
• Em solução alcalina, por exemplo a pH 11, o grupo carboxilo está ionizado(-COO-), e o
grupo amina está desionizado (-NH2).

[H+]

H+ H+
+ + - -
3 3

Forma Forma
Forma predominante
predominante a predominante
pH 1 a pH 7 (Zwiteriónica) a pH 11
pH

57

57

Focagem isoeléctrica (FI)

• Na técnica de focagem isoeléctrica, as moléculas migram no gel na direcção do pólo positivo ou
negativo, de acordo com a sua carga global negativa ou positiva, respectivamente, e param no ponto
em que a sua carga global é zero (ponto isoeléctrico).

Resultado da
Massa molecular kDa

análise por FI:

Cada ponto
representa uma
proteína diferente
da bactéria
Escherichia coli.

pH
Resultado de uma electroforese a duas dimensões, em que as
proteínas foram inicialmente separadas de acordo com a sua
massa molecular e posteriormente de acordo com o seu pI .

58

58

29
 29/11/2023

Cromatografia
• Os principais métodos cromatográficos incluem a cromatografia líquida, a
cromatografia gasosa, a cromatografia em papel e em camada fina.
Entre os vários tipos de cromatografia líquida é possível encontrar:

 Cromatografia de exclusão molecular

Separação em coluna cromatográfica com base
nos diferentes tamanhos das biomoléculas.
 Cromatografia de troca iónica
Separação em coluna cromatográfica com base
na diferente carga global das biomoléculas.
 Cromatografia de fase reversa
Separação em coluna cromatográfica com base
nas diferentes afinidades das biomoléculas por
solventes orgânicos hidrofóbicos.
 Cromatografia de afinidade
Separação em coluna cromatográfica com base
nas diferentes afinidades específicas entre
biomoléculas (ex: anticorpo-antigénio, enzima-
substrato).

59

59

Cromatografia de exclusão molecular

Esquema da coluna de cromatografia Resultados
de exclusão molecular (também Cromatograma
(Gráfico da absorvância versus
designada de filtração em gel) Volume de eluição (Ve))

Mistura inicial
de moléculas
com diferentes
tamanhos

Resina ou matriz
cromatográfica

Determinação do
Moléculas pequenas
tamanho das
ficam retidas e são biomoléculas por
eluídas no final intrapolação na recta
de calibração
Moléculas grandes
são excluídas e
eluídas no início

60

60

30
 06/12/2023

ELETROFORESE

1
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2
 06/12/2023

3
 06/12/2023

pb

Outro ensaio (só para visualizar excel)

4
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Mapa de
restrição
de um
plasmídeo

www.biorede.pt

10

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 06/12/2023

Um Plasmídeo (ex.pBR322) é uma molécula de DNA

circular, existente em bactérias. Possui replicação
independente e sequências variadas consoante o
tipo de plasmídeo.

Para detetar diferenças na sequência de bases,

recorre-se a enzimas de restrição – endonucleases.
A função biológica destas enzimas é proteger o
genoma de infeção por DNA estranho. Estas enzimas
clivam o dsDNA em sequências determinadas
(exemplos na tabela). Os fragmentos originados
terão tamanho diferente com diferente número de pb.
Se existirem na molécula vários desses locais, a
enzima clivará em todos eles.
11

Nome Origem Sequência de

reconhecimento (5’-
3’)
BamHI Bacillus amyloliquefaciens G*GATCC
EcoRI Escherichia coli G*AATTC
EcoRV Escherichia coli GAT*ATC
HaeIII Haemophilus aegyptius GG*CC
HindIII Haemophilus influenzae A*AGCTT
XbaI Xanthomonas badrii T*CTAGA

12

6
 06/12/2023

Procedimento:
•Dna plasmídico (pUC18 e pGBKT7))
•Enzimas de restrição A e B (EcoRI e HindIII por exemplo)
•Tampão 10x adequado às enzimas 1,5µl
•Água até 15 µl
•Marcador de pesos moleculares (eletroforese)
•Preparar as soluções nos microtubos, segundo o quadro
seguinte.
•No tubo C realizar-se-á a digestão dupla, recorrendo à
combinação das duas enzimas.

Tubo plasmídeo Enzima(s) Tampão 10x água

A 2µl A 2µl 1,5 µl 9,5µl
B 2µl B 2µl 1,5 µl 9,5µl
C 2µl A+B 2µl+2µl 1,5 µl 7,5µl

•Incubar os tubos a 37ºc durante cerca de 60 minutos.

13

• Incubar os tubos a 37ºc durante cerca de 60 minutos.

• Elaborar uma eletroforese em gel de agarose 1%. Carregar

as amostras no gel, acrescentando um marcador 1kb
ladder.

• Correr a eletroforese para separar os fragmentos.

• A digestão do DNA originará várias bandas na eletroforese.

Contar o número de fragmentos e calcular o tamanho (por
comparação com o ladder), para a digestão simples (A e B)
e para a digestão dupla (C). A soma dos pb dos vários
fragmentos originados pela digestão em cada tubo, será
coincidente e corresponderá ao total de pb existentes no
plasmídeo.

14

7
 06/12/2023

• Construir o mapa de restrição por combinação dos dados

obtidos pela digestão simples, procurando a compatibilização
com os dados da digestão dupla. A sobreposição dos dados
originará regiões que deverão corresponder ao número de
fragmentos total. Identificar e assinalar os locais de restrição de
cada enzima.

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16

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 06/12/2023

EcoRI

17

pGBkT7 pUC18
HindIII EcoRI EcoRI EcoRI HindIII EcoRI
+ +
Hind III HindIII
1,5 cm 1,3 cm 1,1 cm 2,7 cm 2,5 cm 2,5 cm
1,7 cm 1,6 cm Falta um
2 cm 3 cm demasiadame
(pouco 4 cm nte pequeno
visível) (2 últimos pouco
visíveis)

18

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19

pUC18 pGBkT7
2,5kb 4 kb 3 kb
2,7kb 2,5kb 5kb
1kb
0,5 kb

20

10
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https://youtu.be/8FqMUF96cPE

https://youtu.be/uNvF9ZBufTk

https://youtu.be/fJzGGHBRwFc

21

22

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 06/12/2023

Bioinformática e bases de dados

Estudos in silico

23

Nebcutter/Genbank/ClinVar….
24

12
 06/12/2023

• Exercicios

25

Considere o seguinte fragmento de um gene, que inclui uma mutação conhecida:

Normal:
AAGGAAAGTTAGAGTTTGCCTAAATATATCCTAGGATACAGATCGCCGGATAAGCTAGCTAGCTATCG
Mutado:
AAGGAAAGTTAGAGTTTGCCTAAATATATCATAGGATACAGATCGCCGGATAAGCTAGCTAGCTATCG

Para realizar um teste de diagnóstico desta mutação por PCR-RFLPs,

1. Quais das seguintes enzimas seriam capazes de diagnosticar a mutação? Justifique.

A: CTA*GGA
B: TANCC*T
C: TC*ATAG
D: T*ATATC
E: TCNTA*G

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 06/12/2023

• Supondo que apenas tem disponível a

enzima F, cuja sequência de reconhecimento
é: A*TCCTA,
• qual o padrão que esperaria obter ao
analisar os elementos da família
representada.
• (Considere os indivíduos representados a
preto como homozigóticos para a mutação e
os brancos homozigóticos para o alelo
“normal”.)

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