Curso: Farmácia

Disciplina: VIROLOGIA

Tema: Cultivo e caracterização dos vírus

Diocreciano Bero
 Cultura celular

• Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células

isoladas fora do organismo original, mantendo suas características.

• A cultura celular pode-se ser realizada a partir de tecidos humanos,

animais ou vegetais.
 Isolamento e identificação de vírus

• Para demostrar que uma dada infecção tem etiologia viral, é de

fundamental importância comprovar-se laboratorialmente a presença
dos vírus no paciente infectado.
• As culturas de células amplificam a quantidade de vírus, facilitando sua
detecção e identificação.
• O isolamento viral apresenta vantagens e desvantagens comparando a
outros métodos de diagnóstico.
 Vantagens da cultura celular

Estratégia essencial no tratamento de algumas patologias, como as que

usam:
• Células tronco;
• Terapia gênica;
• Reposição tecidual;
• Produção de vacinas anti-virais;
• Ensaios de fármacos e cosméticos in vitro;
• Compreensaão de fenômenos de neoplasias.
 Desvantagens da cultura celular

• O sistema usado para o isolamento de certos vírus não está

disponível ou é muito complicado para rotina laboratorial;

• O tempo necessário para isolar certos vírus pode ser demorado, o

que não satisfaz a necessidade clínica.
Uma vez inoculados no sistema hospideiro susceptível, os vírus
provocam nesse sistema modificações fisiológicas que são
observadas como efeitos consequentes da biossíntese viral.

O fenômeno de alteração morfológica celular, denominado efeito

citopático (CPE – cytopathogenic effect).
 Métodos de propagação de vírus

• A propagação de vírus em um laboratório pode feita em sistemas

hospedeiros obrigatoriamente vivos, que podem ser representados por
animais de laboratório, ovos embrionados e/ou cultura de células.

Atenção: o isolamento de um vírus em determinado hospedeiro não

representa a confirmação de que aquele vírus é o agente etiológico da
doença actual.
 Propagação em animais de laboratório

• Não tem sido sido utilizada com frequência, devido ao advento das
culturas celulares, que fornecem uma opção mais simples e prática.

• O uso de camudongos, em geral esta limitado ao isolamento de

arbovírus, vírus da raiva e alguns coxsackievírus do grupo A.
 Inoculação de amostra em animal de laboratório

• Animais de grande porte não são utilizados rotineiramente para o isolamento

de vírus humanos.
• Primatas não humanos, especialmente chimpazés, são utilizados em alguns
laboratórios de pesquisa para o isolamento de vírus humano não-cultiváveis
em outros sistemas de hospdeiros.

• Algumas espécies de macacos também são utilizadas em testes de

neurovirulência de algumas vacinas, como a Sabin contra a poliomielite.
Exemplo

 Suspensão a 10% em Tris-Ca pH 8.0

 1 mL por dia, via oral
 3 dias consecutivos
 Amostras colhidas e analisadas por 30 dias
 Propagação em ovos embrionados

• Até a década 1950, os ovos embrionados constituíam o sistema

hospedeiro de escolha para a propagação de muitos vírus.

• Desde década 1950, a cultura célular foi utilizada amplamente.

• Entretanto, ovos embrionados continuam a ser usados, para o isolamento

de vírus aviários, da influenza, e produção de alguns tipos de vacinas.
 Propagação de vírus em cultura de células

O uso do cultivo celular para isolamento viral teve ínicio após quatro importantes
factos:
• 1. O emprego das técnicas assépticas cirúrgicas;
• 2. A descoberta dos antibióticos;
• 3. O desenvolvimento de um meio de cultura para manutenção de células in vitro;
• 4. Técnicas de cultura celular em monocamadas, por Gey, em 1930; e a demonstração
do cultivo de poliovírus e vacínia em cultura celular por Enders e Weller.
 Tipos de culturas celulares

As culturas de células rotineiramente utilizadas também podem ser

classificadas de acordo com o tipo de cultivo:

• Culturas de células primárias,

• Culturas celulares finitas (ou diplóides)
• Linhagens celulares contínuas,
• Culturas clonadas,
• Cepas celulares (oriunda de muitas espécies de animais).
 Culturas de células primárias

• Também chamadas de culturas finitas, originam-se de células recém

desagregadas de determinado tecido de um organismo (cinco a vinte ciclos
de divisão celular, após este período entram em senescência).

• Quando um cultivo primário é subcultivado (passagem), as células recebem o

nome de cultivo secundário.
 Culturas celulares finitas (ou diplóides)

• São estabelecidas a partir do subcultivo de célulares primárias,

geralmente derivadas de tecidos animais, e consistem em uma
população homogênea de um único tipo de célula (pode se dividir
até 100 vezes).

• Vantagens: as culturas bem caracterizadas e padronizadas, a

produção pode ser baseada num sistema de banco de células.
 Linhagens celulares contínuas

Permanentes ou imortais consistem em um único tipo celular e têm a

capacidade ilimitada de crescimento em cultura.

Estas linhagens são derivadas dos seguintes métodos:

a) Cultivo primário de células de tumor humano ou animal;

b) Transformação de uma célula normal apresentando um tempo de vida

finito, com um oncogene viral;

c) Transformação de uma célula normal através de um agente químico.

 Culturas clonadas

• Têm origem na selecção clonal, que é o abastecimento de uma

população de células derivadas de uma única célula.

• Os clones podem ser derivados de uma linhagem de células

contínuas ou primárias.
 Cepas celulares

• O termo cepas celulares é usado para descrever a população de

células subcultivadas selecionadas com base na expressão de
propriedades específicas, características funcionais ou marcadores.

Os factores fundamentais para a escolha da linhagem celular para

o isolamento viral são:
Permissividade celular
Velocidade de replicação.
 Evidência de propagação viral

• Observação do efeito citopático (CPE)

O efeito citopático, se refere a alterações na morfologia em células
individuais ou grupos de células induzidas pela infecção viral, as
quais são observadas ao microscópio.
• Nas últimas décadas, foram desenvolvidos vários sistemas para
acelerar a evidenciação do isolamento viral em cultura de celular,
como é o caso do:
• sistema de shell vial
• linhagens celulares geneticamente modificadas
• culturas de células mistas
 Sistema de shell vial

• Gleaves e colaboradores em 1984.

• O método utiliza centrifugação em baixa velocidade para favorecer a infecção
das culturas de células MRC-5, seguido por incubação para amplificação de
proteínas específicas do vírus.

• A detecção dessas proteínas é realizada por ensaio de Imunoflorescência (IF).

Linhagens celulares geneticamente modificadas

• Stabell & Olivo (1992).

• Esta linhagem celular está disponível comercialmente como parte de

um kit para diagnóstico denominado ELVIS (enzyme-linked virus-induced
system).

• O resultado está disponível em 24hr após a inoculação da amostra por

centrifugação em baixa velocidade.
 Culturas de células mistas

• Sistema desenvolvido para acelerar a propagação viral.

• Neste sistema, a monocamada celular é preparada a partir de uma
mistura de células, que é usada em combinação com a inoculação da
amostra por centrifugação em baixa velocidade, o que favorece a
infecção.
• A replicação do vírus na cultura amplifica o sinal, e a IF facilita a
detecção rápida da progação.
 Purificação e concentração de vírus

• A purificação é obtida através de cromatografia ou centrifugação

através de gradientes de densidade.

• Vírus envelopados podem ser purificados através da velocidade de

sedimentação em gradientes de sacarose. Os vírus não
envelopados, podem ser purificados pela centrifugação em
gradientes de cloreto de césio.
• Após a adaptação e propagação inicial, os vírus podem ser separados
dos debris celulares e purificados.

• O passo inicial desse processo é uma centrifugação diferencial (baixa

velocidade) (~ 2000 x g) que é utilizada para remoção dos debris
celulares.

• A centrifugação a alta velocidade (40 000 a 80 000 x g) tem por

objectivo reduzir o volume da amostra, em alguns casos em que
deseja reduzir o volume ainda mais pode ser feita uma concentração
por diálise e precipitação com metanol ou polietilenoglicol realizada a
baixa temperatura (-70°C).
 Criopreservação

• Nitrogenio líquido;
• Niveis de energia cinetica baixos a
• -196°C que não permitem os movimentos moleculares.
• Alta viabilidade >=90%;
• De preferencia em fase exponencial;
• Agentes crioprotetores:
Soro;
DMSO;
Glicerol.
 Contagem de células

• Geralmente, antes da utilização das células para a montagem de um

exprimento, é realizada a contagem destas células.
• A câmera de Neubauer é o método mais utilizado; além de ser
simples, barato e antigo.
• A contagem directa e indirecta.
Contagem directa e indirecta de partículas víricas

Contagem directa de vírus

• A contagem do número de partículas víricas possui importância na pesquisa e
produção de vacinas.
• A microscopia eletrônica é usada para contagem de partículas víricas em
soluções livres de vírus. Um determinado volume de amostra é examinado e os
vírus são contados.
• Esse número é então empregado para se fazer uma estimação do número total
de partículas na amostra. Uma limitação desse método é que capsídeos vazios,
partículas não infecciosas, são contadas.
Contagem indirecta de vírus
Os métodos de contagem indirectos utilizam factores associados com a
infectividade (actividade biológica). Os três principais métodos utilizados
para a determinação da concentração viral são: provas de hemaglutinação,
prova de formação de placas e o método da diluição limitante.

Hemaglutinação
A prova de hemaglutinação é baseada na propriedade que muitos vírus
envelopados têm de aglutinar eritrócitos. A hemaglutinação é o resultado
da ligação de várias partículas víricas à superfície do eritrócito.
Unidade formadora de placas

Esta prova baseia-se na inoculação de células susceptíveis com uma amostra do vírus e
através da sua actividade biológica pode-se estimar a quantidade de partículas. Nesse
procedimento, diluições seriadas na base dez do vírus a ser testado são inoculadas em
camadas celulares.

Após o período de incubação que permite o vírus adsorver nas células, e os vírus
citopáticos, as células infectadas serão destruídas formando um área clara indicando a
morte celular após a um período de incubação que pode variar entre 24 - 72 horas.

O cálculo do número de placas baseia-se na contagem do número de placas

observadas, no fator de diluição e no volume de amostra usada para, resultando em
Unidade Formadora de Placas por mililitro de amostra.
 Visualização de vírus

•A visualização
de partículas
víricas somente
pode ser feita
com o uso de
microscópio
eletrônico.
 Propagação viral

• Para o isolamento, caracterização, identificação e produção de vacinas uma

considerável quantidade de partículas víricas é geralmente necessária. Isso
pode ser obtido pela através de técnicas de propagação.

• Cultura de células e tecidos

• A cultura de tecidos refere-se ao crescimento e manutenção de tecidos vivos

in vitro. Existem dois tipos básicos: cultivo de explante e cultivo celular.
 Cultivo de explantes são pequenos fragmentos de
tecidos oriundos do hospedeiro e mantidos em cultivo.

Cultivo celular é resultado da dissociação do tecido em células

individuais seguido de sua manutenção em cultivo.
Cultivos de explante
• Cultivos de explante são úteis para isolamento viral e são necessários para o
isolamento de alguns coronavírus.

Cultivo celular primário

• Cultivo de células primárias são originados de tecidos frescos que foram submetidos
ao tratamento com enzimas (tripsina ou outras proteases) para a individualização das
células. Como resultado, esse tipo de cultivo muitas vezes é composto de vários tipos
celulares.

• Nas condições in vitro, os cultivos primários raramente se dividem ou então o fazem a

uma freqüência muito baixa, isso é denominado como limite de Hayflick Cultivos
primários raramente sobrevivem a 20 passagens in vitro.
 Infectividade e armazenamento

• Infectividade
Habilidade que o vírus tem de infectar uma célula hospedeira.

• A temperatura exterior à célula hospedeira afecta directamente a capacidade do

vírus manter a sua infectividade, particularmente nos casos do vírus
envelopados.
• Os vírus não possuem actividade metabólica própria, a infectividade é a maneira
de avaliar a integridade da partícula após a exposição a determinadas
temperaturas.
 Alguns parâmetros são considerados críticos:

• à 60°C, a infectividade irá diminuir rapidamente em segundos.

• à 37°C, a infectividade irá diminuir em minutos.
• à 20°C, infectividade irá diminuir em horas.
• a infectividade, à temperaturas acima citadas, irá influenciar a transmissão pelo contacto
directo (à 37°C) e pelos fomites (à 20°C).

• à 4°C, a infectividade nos tecidos é mantida por dias.

• Temperaturas abaixo da temperatura de congelamento são usadas para
armazenamento de vírus durante prolongados períodos. Nesse caso é
importante manter a formação de cristais de gelo à níveis mínimos.
• Deve ser considerado que a resistência e labilidade varia muito entre os vírus.
Alguns são capazes de resistir por horas, dias, ou até meses em condições
ambientais, enquanto outros são inactivados em minutos sob condições
semelhantes.
 Três métodos principais de conservação dos vírus são:
• Congelamento à -70°C com ou sem criopreservantes.
• Congelamento à -196°C nitrogênio líquido, para armazenamento por um longo
período de tempo.
• Liofilização ou congelamento a seco, podendo ser armazenadas a temperatura
ambiente ou congeladores convencionais.
 Diferentes métodos usados para caracterização

• Sensibilidade a solventes lipídicos

• Identificação do ácido nucléico
• Análise por enzimas de restrição
• Hemadsorção
• Métodos imunológicos
Obrigado pela atenção!