Bioensaios celulares:

Princípios e Aplicações
Letícia Veras Costa Lotufo
Laboratório de Oncologia Experimental
Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
UFC
lvcosta@secrel.com.br
 PROGRAMA:
•  11/02
– aula 1 - Princípios básicos – Ensaios de
citotoxicidade
– aula 2 –Alvos celulares - Ciclo celular
•  12/02
– aula 3 – Alvos celulares - Citoesqueleto
– aula 4 - Morte celular: apoptose versus
necrose
 Cultura de células
•  Cultura de células é o processo pelo qual células são
mantidas vivas e em crescimento fora de seu tecido
original em condições controladas

•  Usos:
–  biologia celular
–  farmacologia
–  bioengenharia
–  produção em larga escala de materiais biológicos
Aplicações do cultivo celular
Biologia

Síntese
de
 celular

proteínas

 Estudo
do

Escala
 câncer

comercial


Produção
de
 Cultura
de

Células
tronco

anticorpos
 células

monoclonais
 Porque
fazer?


Terapia
gênica
 Cultura

primária

Cultura
de

cels.

embrionárias

 Histórico
•  Descoberta:
–  1907: Ross Granville Harrison (Embriologista -
John Hopkins Medical School)
“…Ele dissecou o tubo medular de um
embrião de sapo de cerca de meio
centímetro e o mergulho em linfa fresca
de sapo, que logo coagulou.” (Peres &
Curi, 2005). Assim começou a cultura de
tecidos…

Trabalho publicado: Harrison, R.G.

Proceedings of the Society for
Experimental Biology and Medicine, 4:
140-13, 1907.
 Histórico:
•  Trecho do Trabalho de Harrison
(1907):
•  “Quando se tomam as precauções assépticas
adequadas, os tecidos sobrevivem nessas
condições por um semana e, em alguns casos,
foram mantios espécimes vivos durante
aproximadamente quatro semanas.”
 Histórico
•  Alexis Carrel (Rockefeller Institute for Medical
Research) – buscava formas de prolongar o tempo
de vida das células em cultura.
1912 – Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina

Descobriu que a troca de meio onde eram

mantidas as células favorecia o
prolongamento do tempo de vidadas células.

Carrel, A. Journal of Experimental Medicine,

15: 516-528, 1912.
 Histórico
•  George Gey (John Hopkins Medical
School) – 1952
– Henrietta Lacks –cancer de útero
– Células HeLa – crescimento
rápido
– Contaminação generalizada
 Histórico
•  Hayflick and Moorhead (1961)
•  25 linhagens de fibroblastos derivadas de
fetos
•  Características que distinguem as linhagens
•  Cultivo celular como uma importante
ferramenta para o entendimento de processos
biológico

Trabalho publicado: “The serial cultivation of human diploid cells

strains”. Experimental cell Research, 25(3): 585-621.
HARRY EAGLE (1955) -Nutrition
Needs
of
Mammalian
Cells
in
Tissue

Culture.
Science,
September
16,
1955,
122
(3168):
501–504

•  Realizou uma análise sistemática dos nutrientes necessários

ao crescimento de células animais em cultura;

•  Estudou o crescimento de duas linhagens de células:

•  células HeLa
•  células L

•  O meio em que cultivou estas células continha:

•  Mistura de sais
•  Carbohidratos
•  Aminoácidos
•  Vitaminas suplementadas com soro de proteínas
Aminoácidos Vitaminas Sais Outros Proteínas (necessárias em meios sem
soro, quimicamente definidos)
Arginina Biotina NaCl Glicose Insulina
Cistina Colina KCl Penicilina Transferrina
Glutamina Folato NaH2PO4 Estreptomicina Factores específicos de crescimento
Histidina Nicotinamida NaHCO3 Vermelho de fenol
Isoleucina Pantotenato CaCl2 Soro
Leucina Piridoxal MgCl2
Lisina Tiamina
Metionina Riboflavina
Fenilalanina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina

 
Algumas
células
não
crescem
nem
se
diferenciam
se
a
placa

não

estiver
coberta
com
componentes
específicos
da
matriz
extracelular


 Vantagens:
•  Estudo do comportamento da células em condições
controladas - sem a influência animal
•  Uniformidade da amostra
•  Reprodutibilidade dos experimentos
•  Exposição a fármacos em concentrações definidas
(Farmacocinética)
•  Redução da utilização de animais – Princípios éticos
(3Rs)
 Desvantagens:

•  Gasto elevado de material;

•  Condição de crescimento da cultura;

•  Instabilidade de cultura celular;

•  Perda de características;

•  Dificuldade de extrapolação para o modelo de

organismo intacto.
 Limitações:

•  Necessidade de operadores experientes (com

conhecimentos da técnica em condições assépticas,
etc);

•  Perda de características fenotípicas;

•  Necessidade do uso de marcadores devido à perda

de características fenotípicas;

•  Instabilidade das células (sobretudo em linhagens

celulares imortais).
 Inimigos da culturas de células:

•  -As células são muito vulneráveis a contaminações

– TÉCNICAS ASSÉPTICAS

•  Microorganismos crescem 10-50 vezes mais rápido

que as células de mamífero, e são mais tolerantes a
variações de temperatura, pH e disponibilidade de
nutrientes.

•  Microorganismos desenvolvem resistência aos

antibióticos
Fatores que aumentam a
probabilidade de contaminação:
•  Descongelamento do nitrogênio líquido
•  Utilização de enzimas para obtenção de culturas
primárias
•  Culturas primárias podm vir contaminadas por
microorganismos
•  Diluição excessiva das células
Equipamentos necessários:
Câmara de de fluxo laminar – sistema que permite
remoção de partíclas do ar, proteção contra
contaminação cruzada
Fluxos laminares
Equipamentos necessários:
Incubadora
•  Manutenção da temperatura a 37°C
•  5% de CO2 mantém pH do meio
 Técnicas Básicas:
•  Aquisição das linhagens
– Linhagens permanentes e cultura primária
•  Congelamento e descongelamento
– N2 líquido
– Uso de crioprotetor – DMSO
•  Manutenção das células
– Meio de cultura, Temperatura, pH,
Umidade
 Linhagens permanentes

(imortais ou transformadas)
•  Capacidade ilimitada de crescimento
em cultura
•  Origem:
– Derivadas de células tumorais
– Transfecção com oncogenes
– Carcinógeno
 Cultura primária
•  Preparadas diretamente das células
obtidas de um tecido de um
organismo, com ou sem etapa inicial
de desagregação
•  Crescimento finito em cultura
•  Podem ou não proliferar
Evolução de uma linhagem
celular
Subcultivo ou Repicagem

Transferência
do
conteúdo
de
um
frasco
para
dois
novos

frascos

–
troca
de
meio

Células
aderidas
–
necessidade
de
um
agente
desagregador


(tripsina)

 Contagem de células
  Exclusão
por
azul
de
tripan
 Câmara
de
Neubauer


  Determinar
o
número
de
células

(viáveis):


No.
de
células
viávéis
x
104
cels./mL

No.
de
quadrantes


volume/quadrante
=
1mm
x
1mm
x
0,1mm

Viabilidade celular - Exclusão por
Azul de Tripan
Tripan Amostra Contagem

Inviável

Azul de Tripan

Viável
 Cinética de crescimento celular

•  Condições para crescimento:

–  alimento
–  estímulo
–  ambiente
plateau


número
de
células


declínio

fase
log


fase
lag


tempo

 Avaliação da citotoxicidade
•  Citotoxicidade é a capacidade de se ser tóxico à células

•  Métodos colorimétricos ou fluororimétricos:

–  MTT / XTT
–  SRB
–  Alamar Blue
–  Calceína AM
–  EthD

•  Citostático x citotóxico

•  Tempo e concentração
Exigências de um teste de
citoxicidade in vitro:
- Rápido
 Sensível
 Confiável
 Seguro
 Eficiente
 Custo-benefício
 Princípios do método:
•  O MTT (ou XTT) são metabolizados pelas
células viáveis pruduzindo formazan – Leitura
colorimétrica
•   no. células viáveis –  metabolização
 coloração
•  Não é um bom método para discriminar entre
atividade citostática e citocida
•  XTT e MTT –possuem solulibidade diferente
•  MTT-metabolização mais eficiente
 Doadores
de
e‐


Succinato

NADH2

NADPH

+

FADH


Citoplasma


meio
extra‐celular

Berridge
&
Tan,
1993

Avaliação da atividade antiproliferativa em
células tumorais


Formazam
 0h
 24h
 48h
 72h


Incubação
das
células
 Leitura
da

com
as
amostras












 absorbância

(fator
de
diluição
2)

>
[

]
=
100
mcg/mL

 branco


C
‐


diluição
(1/2)


100
mcg/mL

Valores
de
absorbância


0
1,56
 3,13
 6,25
 12,5
 25
 50
 100


[
mcg/mL]

 Princípios do método
•  Alamar blue – convertido na forma
reduzida pelas enzimas mitocondriais
•  Forma reduzida – detecção colorimétrica
e fluororimétrica
•  Reagente estável, solúvel em água,
•  Minimamente tóxico – permite
monitoramente contínuo das culturas
 
Redução
do
AB
reduzido
em
um
produto
não
fluorescente



Hidroresofurin

Azul
 Róseo
 Incolor


 
Alamar
Blue
fluoresce
dentro
da
célula



ALAMAR
BLUE
é
reduzido
em
resposta
a
uma
‘redução
química’
do
meio

devido
ao
crescimento
celular
ou
por
ação
de
enzimas
mitocondriais.


 
Removeram
“meio
reduzido”
(cultura
de
24‐48h)
>>>
+
AB/24h












































































>>>
AB
estável
e
não
produziu
fluorescência


 
Meio
com
células
mostrou
altos
valores
de
fluorescência
(~47RFU)

 
Fluorescência
própria
das
células
~
5RFU


Presença
de
células
é
essencial
para
redução
do
AB

 
Alamar
Blue
fluoresce
dentro
da
célula



‐ 
Fluorescência
primária
no
citoplasma

Assim...
AB
captado
>>
Reduzido
no

citoplasma
>>
Excretado
para
o
meio


Citoplasma
com
fluorescência
constante



Pontos
brilhantes
(mitocôndrias???)


Núcleos
fluorescentes


 RESAZURINA

RESOFURINA

HIDRORESOFURINA


Çélulas
viáveis
 Células
mortas


Sinal
fraco
 Alto
sinal
de
fluorescência



ALAMAR
BLUE
depende
do
“status”
de
oxi‐redução



Presença
de
células
>>>
Redução
do
meio
ou
do
AB




Fluorescência
encontrada
no
núcleo
e
citoplasma



Diaforases:
Resazurina
>>>>>>>>>>>
Resofurina



Células
de
mamíferos,
bactérias
(mitocôndrias
ou
citoplasma)

PRECAUÇÕES
IMPORTANTES:


‐ 
Observar
reatividade
cruzada
do
AB
com
compostos
testados

‐ 
Otimizar
culturas
celulares
>>>
Evitar
redução
excessiva
do
AB


VANTAGENS:


‐ 
Melhor
para
determinar
pontos
específicos
de
viabilidade
(CI50)

‐ 
Menos
laborioso

‐ 
Mais
barato
que
a
maioria
dos
outros
testes
por
HTS



















5g
de
resazurina
‐
400L
de
solução




















Conc.
final
de
10%
no
meio
de
cultura

 Teste de citotoxicidade in vitro
Ensaio do alamar blue

Contagem


Cultura
de
células


Células
plaqueadas
e
drogas
diluídas

usando
o
HTS
(High
throughput
screening)



Incubação
com
as

Alamar
Blue

 amostras


Absorbância
em
570nm

e
595nm

 
LOE


Resultados
 SULFORODAMINA B

Descrito por Skehan et al., 1990. New colorimetric
cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. J.
Natl. Cancer Inst. 82(13): 1107-1112.
 Princípio do método
•  Corante róseo carregado negativamente
(aminoxantina) tomado por aminoácidos básicos

•   no. de células -  tomada do corante

•  Método sensível e rápido – utiliza menos células

•  Permite descriminar atividade citostática de

citocida
Método
10% TCA

0,4% SRB

1% AA

Absorbância
 Placa TimeZero
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br

Cell 1 Cell 2 Cell 2

tz – TimeZero br – Branco

Placa Test/Drug (uma para cada cell)

t t t c t t t c t t t
t t t c t t t c t t t
t t t c t t t c t t t
t t t c t t t c t t t
t t t c t t t c t t t
t t t c t t t c t t t
t t t s t t t s t t t ds
t t t s t t t s t t t ds

Test 1 Test 2 Drug

D – Drug t – Test c – Control
S – Standard ds – Drug-Standard.
Controle

Resultados
Atividade
citostática

0
a
100%


Placa
tempo
zero


GI50

Atividade
citocida

0
a
‐100%


Controle‐positivo

Alguns trabalhos
comparativos…
 Objetivos
•  Comparar a performance do Alamar blue e
do MTT como teste de citoxicidade

•  117 compostos testados em HepG2

Resultados
Resultados
 Conclusões
•  Os ensaios são comparáveis

•  Ambos são baseados em transformações

enzimáticos – falsos positivos ou negativos

•  Importância da observação morfológica

para confirmação da citotoxicidade
Alguns trabalhos
comparativos…
 Objetivos
•  Comparação SRB e MTT
•  2 linhagens HT29 (cancer coloretal) e
11B (carcinoma de células
esquamosas)
•  6 substâncias com # mecanismos
• 
Resultados
 Conclusões
•  SRB – melhor linearidade

•  Resultados comparáveis

•  SRB – placas podem ser guardadas por

várias semanas
Até já…