Universidade Federal Fluminense

Instituto Biomédico

Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Virologia

Plano de aula prática de Cultivo celular, Isolamento de vírus em cultivo célula e

titulação de vírus.

Prof. Ana Pinto

Introdução

Os primeiros trabalhos utilizando cultura de tecidos data de 1907, com um experimento

desenhado para resolver uma controvérsia em neurobiologia. A hipótese examinada era
conhecida como doutrina do neurônio, que estabelece que cada fibra nervosa é o produto de
uma única célula nervosa e não da fusão de muitas células. Para testar esta controvérsia,
pequenos pedaços da medula espinhal foram colocados sobre fluidos de tecido coagulado em
uma câmara úmida e morna, e observados ao microscópio a intervalos regulares de tempo.
Após um ou mais dias, células nervosas individuais puderam ser vistas alongando-se para
dentro do coágulo. Assim a doutrina do neurônio foi confirmada, e as bases para a revolução
da cultura de células foram assentadas.
Os experimentos originais, em 1907, envolveram a cultura de fragmentos pequenos de
tecidos, ou explantes. Atualmente, culturas são mais comumente feitas a partir de suspensão
de células dissociadas de tecidos. Ao contrário das bactérias, a maioria das células de tecidos
não estão adaptadas para viverem em suspensão e necessitam de uma superfície sólida para
crescerem e dividirem-se. Entretanto, as células variam em seus requerimentos, e algumas não
crescerão ou se diferenciarão a menos que a placa seja coberta com componentes específicos
da matriz extracelular, tais como colágeno ou laminina.
Culturas preparadas diretamente de tecidos de um organismo, com ou sem um passo
inicial de fracionamento das células, são chamadas culturas primárias, e podem ser
repetidamente subcultivadas por semanas ou meses. Tais células apresentam freqüentemente
propriedades diferenciadas apropriadas a sua origem: fibroblastos continuam a secretar
colágeno; células derivadas de músculo esquelético embrionário fusionam-se para formar
fibras musculares gigantes, que contraem espontaneamente na placa de cultura; células
nervosas lançam axônios que são eletricamente excitáveis e fazem sinapse com outra célula
nervosa; e células epiteliais formam extensivas lâminas com muitas das propriedades do
epitélio de origem.
Até o início dos anos 70, cultura de tecidos era alguma coisa entre uma mistura de
ciência e bruxaria. Apesar de fluidos de grumos de tecidos terem sido substituídos por placas
com meios líquidos contendo quantidades específicas de moléculas pequenas, como sais,
glicose, aminoácidos e vitaminas, a maioria dos meios também incluía uma mistura
pobremente definida de macromoléculas, na forma de soro de cavalo ou soro fetal de bezerro
ou um extrato cru preparado de embriões de pinto. Tais meios são ainda hoje utilizados para a
maioria dos cultivos rotineiros de células, mas eles dificultam o conhecimento de quais
macromoléculas específicas são necessárias para cada tipo de célula se desenvolver e
funcionar normalmente.
Esta dificuldade levou ao desenvolvimento de vários meios sem soro, meios
quimicamente definidos contendo fatores de crescimento, que estimulam a proliferação
celular, e transferrina, que transporta ferro para dentro das células. Muitas das moléculas
sinalizadoras protéicas extracelulares, essenciais para a sobrevivência, desenvolvimento, e
proliferação de tipos específicos de células têm sido muito facilitada pela disponibilidade de
meios quimicamente definidos, sem soro.
A maioria das células de vertebrados morre após um número finito de divisões em
cultura. Células da pele humana, por exemplo, duram por vários meses em cultura, dividindo-
se apenas 50 a 100 vezes antes de morrerem. Tem sido sugerido que este limite de tempo de
vida está relacionado com o limite de tempo de vida do animal do qual a célula se derivou.
Entretanto, ocasionalmente, algumas células em cultura sofrerão uma mudança genética que
as tornem efetivamente imortais. Tais células se proliferarão indefinidamente e poderão ser
propagadas como uma linhagem de células.
As linhagens de células podem também ser preparadas a partir de células cancerígenas,
mas elas diferem de várias formas, daquelas preparadas a partir de células diplóides normais.
Por exemplo, as linhagens de células cancerígenas freqüentemente crescem sem se fixarem a
uma superfície, proliferam-se em densidades muito mais altas em placas de cultura.
Propriedades semelhantes podem ser experimentalmente induzidas em células normais,
quando transformadas por ação de um vírus indutor de tumor ou uma substância química. As
linhagens de células transformadas resultantes, de modo recíproco, podem freqüentemente
causar tumores se injetadas em um animal suscetível. Tanto as linhagens de células
transformadas quanto as de células não-transformadas são extremamente úteis na pesquisa
celular, como fonte de grandes quantidades de células de um tipo uniforme, especialmente por
poderem ser estocadas em nitrogênio líquido a -196oC, por um período indefinido e
continuarem viáveis, quando descongeladas. No entanto, é importante lembrar que as células,
em ambos os tipos de linhagens celulares, quase sempre diferem de forma importante, de seus
progenitores, nos tecidos das quais elas são originárias.
Apesar de todas as células em uma linhagem celular serem bastante similares, elas
freqüentemente não são idênticas. A uniformidade genética de uma linhagem de célula pode
ser melhorada pela clonagem celular, em que uma única célula é isolada e se prolifera para
formar uma colônia. Um clone é qualquer uma destas coleções de células, as quais são todas
descendentes de uma única célula ancestral. Uma das utilidades mais importantes de
clonagem celular é o isolamento de linhagens de células mutantes com defeitos em genes
específicos. O estudo de células defectivas em uma determinada proteína revela,
freqüentemente, um pouco da função desta proteína nas células normais.
Os vírus são parasitos intracelulares obrigatórios e requerem células vivas (sistemas
hospedeiros) para sua replicação. Os sistemas celulares mais utilizados para isolamento de
vírus são: as culturas de células in vitro, os ovos embrionados de galinha e os animais de
laboratório.
Se um espécime clínico contendo determinado vírus for inoculado em um hospedeiro
não susceptível a este vírus é muito provável que o isolamento fracasse e um resultado
negativo seja dado erroneamente, portanto a escolha da célula depende do tipo de vírus a ser
isolado. Ex. para isolamento de poliovírus as células mais indicadas são as culturas primárias
ou células de linhagens diplóides de rim de macaco verde (GMK) ou rim de Macaca mulata
(LLC-MK). Para isolamento de adenovírus células de carcinoma epitelial humano (HEP-
2_HEK293 (rim de embrião humano), para isolamento de sarampo e Herpesvírus a linhagem
celular mais indicada é VERO (rim de macaco verde).
Os vírus quando inoculados em cultivo celular iniciam a sua replicação após a
penetração. A replicação viral poderá provocar ou não alterações na fisiologia e morfologia da
célula infectada. Tais alterações podem ser visualizadas por microscopia óptica. As alterações
morfológicas que ocorrem nas células em cultura quando infectadas por vírus são
denominadas de efeito citopático (CPE).
A infecciosidade de um vírus depende de fatores como: proporção de partículas
completas ou infectantes (virion), da suscetibilidade (relacionada a presença de receptores) e
permissibilidade (relacionada aos maquinário celular interno para replicação do vírus) da
célula hospedeira. As células suscetíveis podem ser infectadas por uma, duas, cinco, dez
partículas de vírus ou não serem infectadas. A infecção da célula depende da proporção entre
a quantidade de partículas virais integras (virion) presente em um inoculo e a quantidade de
células infectadas. Esta relação é denominada de multiplicidade de infecção ou MOI.
 Uma MOI indica que a célula foi infectada por uma partícula viral (virion) ou uma dose
infectante. Em geral quanto maior for o MOI mais intenso é o efeito citopático observado,
mas nem sempre uma MOI alta resulta em grande produção de novas partículas virais.
Se uma amostra clínica contiver um título baixo de vírus o isolamento deste só será
possível quando se utiliza um tipo de cultivo celular mais sensível. Cumpre-se ressaltar que
nenhum sistema de isolamento será eficaz se a espécime clinico não for colhido, transportado
armazenado e processado de forma adequada.
Os espécimes devem ser colhidos na fase aguda da infecção e a escolha da amostra deve
ser apropriada: Fezes para vírus entéricos, aspirado nasal para vírus respiratórios, sangue para
vírus de transmissão sanguínea, etc. As amostras coletadas em swabs devem ser ressuspensas
em salina tamponada ou meio de cultivo, transportadas para o laboratório em ambiente
refrigerado e assim mantidas até o processamento da amostra para inoculação no sistema
hospedeiro adequado.
O processamento das amostras inclui uma fase de clarificação por centrifugação, para
remoção de resto celular e descontaminação com agentes antimicrobianos contra bactérias,
fungos.

Obs; A água e o soro são fatores importantíssimos para cultivo celular devem ser de boa
qualidade.

Fiquem atentos: A tripsina e o soro fetal bovino devem ser certificados, pois podem carrear
micoplasma.

O soro pode conter vírus adventícios como o vírus da diarréia viral de bovino que faz
infecção persistente em bovino

Considere todo material biológico como passível de estar contaminada mesmo a célula linda
que você considera como livre de contaminantes.

Manipule tudo sempre mesmo água estéril observando as normas de biossegurança assim
você evitará contaminar o material e se contaminar também.

CULTIVO CELULAR COMO SISTEMA HOSPEDEIRO PARA PRODUÇÃO DE

VÍRUS
Material utilizado

Culturas de células:
Vero
MDBK ATCC(CCL-22)
RK-13
MA-104
Garrafas
Tubos para cultivo celular em vidro ou plástico, placas e garrafas.
Frascos de descarte contendo Hipoclorito de sódio 5% preparado conforme POP 06 de
preparo de soluções ou frascos de descarte sem hipoclorito para posterior autoclavação.
Pipetas 50 µL, 100 µL e ou multicanal.
Ponteiras de 50 µL.
Ponteiras de 100 µL.
Meio de crescimento = Meio Mínimo Essencial preparado conforme POP n.º1 de preparo de
meios de cultivo, contendo fungizona (2,5µg/mL) penicilina 200UI/ML e estreptomicina
200mg/mL ou gentamicina (50µg/mL), suplementado com 3-10% de soro fetal bovino.
Meio de manutenção = Meio Mínimo Essencial contendo fungizona (2,5µg/mL) penicilina
200UI/ML e estreptomicina 200mg/mL ou gentamicina (50µg/mL) suplementado com 2% de
soro fetal bovino.
Garrafas contendo cultivo celular de 24 ou 48 horas
Tripsina 0,25% contendo EDTA 0,2% preparada conforme POP nº 3 de preparo de soluções
Garrafas contendo cultivo de células infectadas
Placas contendo cultivo de células infectadas para corar com cristal violeta
Jarras com hipoclorito para desprezar material
Álcool 70% preparado conforme POP nº 5.

Amostra clinica: Fezes, Liquor, secreções diversas, Soro, tecidos etc.

METODOLOGIA
Passagem de células

• Garrafa de 75cm2 contendo cultivo celular

• Desprezar o meio de cultivo
• Lavar as células com 5 mL tripsina (POP nº 3) e adicionar mais 5 mL de tripsina
• Observar às células no microscópio até as células começarem arredondar
• Descartar toda tripsina e manter a garrafa na estufa a 37°C até liberação total das
células.
• Ressuspender as células em 10 ml de meio MEM sem soro homogeneizar com leves
pancadinhas na garrafa para evitar formação de grumos celular.
• Contar total de células em 10 mL (Garrafa de 75cm2) câmara de Neubauer ≈ 1x106
células.
• Diluir para volume final de 100 mL e teremos 104 células/mL
• Adicionar (meio de crescimento) contendo 3-10% de soro fetal bovino.
• Incubar a 37°C por 24 ou 48 h
• Inocular o vírus ou amostra clínica (OBS. no caso de amostra clínica tratar com
antibióticos e antifúngicos na concentração de 10x a quantidade utilizada no meio de
cultura).

INOCULAÇÃO DA AMOSTRA

• Desprezar o meio da garrafa de cultivo celular

• Inocular 0,2mL de suspensão viral em cada fraco (isolamento deve ser em tubo de
cultivo celular)
• Incubar por uma hora a 37°C para que ocorra interação do virion com os receptores
na membrana celular. A cada 15 minutos movimentar a garrafa para espalhar o
inóculo sobre o tapete de células caso não tenha estufa com agitador para garrafas e
ou placas.
• Após adsorção adicionar meio de manutenção contendo 2% de soro fetal bovino (5
mL em garrafa de e 1,5 - 2ml em tubo)
• Observar o cultivo diariamente por sete dias para visualização de CPE que pode ser
ou não do vírus.
Obs. Identificação de vírus: Efeito citopático não caracteriza vírus.

NÃO ESQUEÇAM CPE (Efeito citopático não identifica vírus)

AUSÊNCIA DE CPE (Não significa que a cultura está negativa) existe vírus que não
são citopáticos

COM CPE OU SEM CPE TEM QUE IDENTIFICAR O VÍRUS.

• Microscopia eletrônica (identifica a família)

• Métodos Clássicos de Identifica os vírus por testes sorológicos utilizando
anticorpos padrão específicos (Reação de Inibição da Hemaglutinação
Imunofluorescência, ELISA, Soroneutralização etc.)
• Métodos Moleculares = Reação em cadeia pela polimerase, sequenciamento,
Hibridização in situ etc.).
TITULAÇÃO DE AMOSTRA DE VÍRUS EM MICRO PLACAS PELO MÉTODO
DE REED MÜCHEN

Material:
• Placa para microtécnica em placa de 96 orifícios
• Meio com 5%-10% de soro fetal bovino (MEM 5% SFB)
• Placas de petri estéril
• Pipetador multicanal
• Pipetador monocanal
• Garrafas com cultivo
• Solução de tripsina com ou sem EDTA

Método:
• Descongelar a amostra de vírus a ser titulada e mantê-la no gelo;

• Preparar tubos eppendorf identificando-os: -1, -2, -3, -4, -5, -6, –7-8, -9, -10, -11 -12
• Colocar 900 μL de MEM sem soro em cada tubo;
• Transferir 100 μL da amostra do vírus para o frasco –1 descartando a ponteiras (a
ponteira que toca uma diluição não deve tocar a próxima);
• Trocar de ponteira e homogeneizar a mistura.
• Transferir 100 μL para o frasco –2. Repetir até a última diluição
• Adicionar 100 μL em cada orifício placa de 96 orifícios contendo células, 100 μL de
cada diluição, de –10 até –1 (Começar da mais diluída para mais concentrada).
• O décimo segundo tubo (-12) será utilizado para controle de células só conterá meio
de cultivo sem soro
• Para a titulação pelo Reed Müchen fazer oito repetições de cada diluição
• Incubar a placa a 37 °C durante 48 a 72 horas, observando até aparecimento de efeito
citopático em microscópio óptico.
• Completar a tabela abaixo e fazer os cálculos.
Distância proporcional = Percentagem acima de 50% - 50%
%acima de 50% - % abaixo de 50

D.P. = 70 - 50 = 20 / 52 = 0,384 ≈ 0,4

70 - 18

Log da diluição acima de 50% = log 10 -6 = - 6 log 10 = - 6 x 1 = - 6

Log do fator de diluição = log 10-1 = - 1 log 10 = -1 x 1 = -1

Dose infectante 50% = (log da diluição acima de 50%) + (D.P x Log do fator de diluição)

Log da DI50%= -6 + (0,4 x-1)= - 6 - 0.4 = -6,4

Dose infectante 50% (ID50) = corresponde à diluição de 10-6,4

TCID50% é o título. Como a reação foi realizada com 100µL, ou seja, 1/10 do mL
para multiplica pelo fator de diluição.

TÍTULO É O INVERSO DA DILUIÇÃO

TCID 50% = 10-6,4 x10-1 = 1x 10-7,4 (multiplica por -1) donde o Titulo é 107,4
PREPARO DE AGAROSE 2% PARA TITULAÇÃO DE AMOSTRA VIRUS POR
ENSAIO DE PLACAS DE LISE (PFU)
• Dissolver 2.0 g de Agarose pura em 100 mL de H2O destilada deionizada estéril.
• Esterilizar por autoclavação e estocar a 4°C.

TITULAÇÃO PELO MÉTODO DE ENSAIO DE PLACAS DE LISE (PFU)

• Aproximadamente 24 ou 48 h antes da titulação, preparar as placas de 06, 12 ou 24

orifícios com densidade de células de 1 x 104 células por orifício.
• Preparar diluições das suspensões das amostras de vírus como se segue:
• Preparar diluições seriadas a base 10 a partir de 10-1 (100 µl da amostra estoque mais
900 µl meio de cultivo estéril sem soro) até 10-11.
• Retirar as placas contendo cultivo celular da estufa, observar se as monocamadas
contem em torno de 90% de confluência.
• Remover o meio de crescimento e adicionar 0.1 mL(100 µl) de cada diluição do vírus
tendo cuidado de não descolar as células.
• Cobrir e incubar as placas por 1h. a 37°C em atmosfera de 5% de CO 2 para adsorção
dos vírus.
• Durante este período de incubação prepare o meio de cobertura
• Solubilize a agarose 2% mantenha em banho maria 44°C.
• Coloque garrafa contendo 50-100 ml de meio de crescimento 2x em banho maria a
44°C.
• Dilua o meio ½ em agarose 2% (Exemplo 45 mL de meio de crescimento mais 45 ml
de agarose).
• Homogeneíze.
 • Após este período descarte o inoculo das placas
• Adicione gentilmente de 0,5 a 2 ml do meio de cobertura
• Mantenha as placas à temperatura ambiente, por 15 minutos para solidificar a agarose
e incube a 37°C em ambiente de umidade e CO2 (5%) por 72 horas.

PREPARO DE SOLUÇÃO DE CRISTAL VIOLETA PARA ENSAIO DE PLACAS

• Formaldeído 5%
• Preparar cristal violeta 0,2% em formaldeído 5%

COLORAÇÃO DAS PLACAS

• Adicione a 0,5 ou 1 mL de solução de cristal violeta, incubar a 37°C 12 horas ou

durante uma noite para inativar o vírus, fixar e corar as células a temperatura
ambiente.
• Remova o corante
• Descarte a agarose
• Conte as placas de lise
• Calcule o título da suspensão de vírus
• O título do vírus é a medida da quantidade de atividade biológica do vírus que é
expressa como unidade formadora de placa (P.F.U) por mL.
• Para calcular o título do vírus conta-se o número de placas isoladas e utiliza-se a
seguinte formula para determinar o título em P.F.U/mL na amostra estoque do vírus.

FORMULA PARA CALCULO DO TITULO DE AMOSTRA DE VÍRUS EM P.F.U/ML

TÍTULO = Nº DE PLACAS DE LISE

DxV

D = fator de diluição (maior diluição em que se observou formação de placas)

V= Volume da diluição utilizado no experimento

Exemplo

Quantidade de placas contadas = 50

Diluição onde foram contadas as placas é o fator de diluição = 10-5

V= Volume utilizado no experimento 200 μL

Título = 50 = 2.5 x 107 p.f.u. /0,2 mL multiplica por 5 para ter P.F.U/ mL

0,00001 x 0,2 mL

METODOLOGIAS PARA ESTUDO DE CITOTOXIDADE IN VITRO

ENSAIOS COLORIMÉTRICOS PARA DETERMINAÇÃO DE CITOTOXICIDADE

Os ensaios colorimétricos de avaliação de citotoxidade in vitro ganharam local de destaque no
campo da pesquisa em função da restrição do uso de animais de laboratório. Várias
metodologias são utilizadas e dentre os métodos descritos atualmente em uso no campo da
pesquisa utilizaremos três.
A avaliação citotóxica será realizada em cultivo de células MDBK em placa de 96 orifícios
crescidas em confluência de 100%.

PROCEDIMENTOS PARA AVALIAÇÃO DE CITOTOXIDADE DE UMA

SUBSTÂNCIA EM CULTIVO CELULAR

Materiais necessários
• Meio de cultivo 1x
• Pipeta de 200 µL
• Ponteiras de 200 µL
• Frasco para descarte estéril.
• Gaze estéril
• Placas de 96 poços com cultivo de células MDBK, Vero, RK-13 e MA-104 com 24 h
ou 48 h de crescimento. (Observação o procedimento é para ser realizado com uma
célula por vez de acordo com o experimento de cada um).
• Extratos frações de extratos e substâncias purificadas previamente diluídas em
concentrações para estoque em DMSO

Preparo das placas de 96 poços

• Garrafas de cultivo celular de 75 cm3 com 24 ou 48 h de crescimento
• Descartar o meio de cultivo das garrafas no frasco de descarte.
• Lavar as células com aproximadamente 2 mL de tripsina/EDTA descartar e adicionar
mais 3 mL de tripsina/EDTA.
• Observar no microscópio o arredondamento das células.
 • Descartar toda tripsina, colocar a garrafa na estufa a 37ºC para total individualização
celular.
• Adicionar aproximadamente 3 mL de meio sem soro na(s) garrafa(s) bater suavemente
na(s) garrafa(s) com as mãos para liberar as células e evitar formação de grumos.
• Adicionar meio sem soro para completar 10 mL, contar as células e diluir com meio
contendo 3-10% com soro fetal bovino de modo conter 4x104 células/mL.
• Passar 10 mL para outra garrafa de 75 cm3 e colocar na estufa.
• Homogeneizar e transferir parte da suspensão celular para placa de petri.
• Preparar placas de 96 cavidades com 200 µL/poço de suspenção de células MDBK,
Vero, RK-13 e MA-104 (4x104 células/mL) com pipeta multicanal.

DETERMINAÇÃO DA CITOTOXICIDADE

• Preparar soluções dos extratos ou frações de extratos de modo conter 3,125 µg; 6,25
µg; 12,5 µg; 25 µg; 50 µg e 100 µg em 200 µL.
• Preparar soluções de substâncias purificadas 3,125 µM; 6,25 µM; 12,5 µM; 25 µM; 50
µM; 500 µM e 1000 µM em 200 µL em meio sem soro.
• Descartar o meio de cultivo das placas de 96 cavidades contendo células MDBK,
VERO, MA-104, RK-13 (4x104 células/mL) com 24 ou 48 h de crescimento.
• Secar as placas com gaze estéril se necessário.
• Adicionar às placas 200 µL de concentrações diferentes dos extratos, frações dos
extratos ou substâncias purificadas em triplicata.
• Deixar em cada placa seis cavidades para controle de células que será o 100% de
viabilidade e ou 0% de toxicidade.
• Reincubar às placas por mais 72 h a temperatura de 37ºC em ambiente de 5% CO2.

PROCEDIMENTOS PARA REVELAÇÃO DO ENSAIO DE CITOTOXIDADE

MÉTODO D0 CRISTAL VIOLETA

• Preparar solução de cristal violeta 0,5 % em solução de ácido acético 30%

• Descartar os sobrenadantes de todas as placas e adicionar 100 μL de cristal violeta
0,5% em ácido acético a 30%, em todas as cavidades.
• Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos
• Descartar e lavar as placas em água corrente de baixa pressão.
 • Colocar as placas em estufa para secar.
• Adicionar 100 μL de metanol PA.
• Homogeneizar agitando a placa com movimento rotatório suavemente
• Ler a densidade ótica (DO) em leitora de ELISA 620 nm e calcular a citotoxidade por
regressão linear

PROCEDIMENTO PARA REVELAÇÃO DO ENSAIO DE CITOTOXIDADE

MÉTODO DO MTT (3-{4,5-dimetiltiazol-2il}-2,5-difenilbrometo de tetrazolio)

• Preparar MTT de modo a conter 1mg/mL em meio de cultivo sem soro.

• Descartar o sobrenadante de todas as placas e adicionar 100 µL de solução de MTT
(1mg/mL) em todas as cavidades.
• Incubar por 3 h a temperatura de 37ºC em ambiente de 5% CO2.
• Descartar o MTT
• Adicionar 100 µL de DMSO PA (Sigma ou MERCK). Homogeneizar e deixar por 15
min a temperatura ambiente.
• Ler a densidade ótica (DO) em leitora de ELISA em 540 nm e calcular a citotoxidade
por regressão linear.

PROCEDIMENTOS PARA REVELAÇÃO DO ENSAIO DE CITOTOXIDADE PELO

MÉTODO DO VERMELHO NEUTRO

• Descartar os sobrenadantes de todas as placas e adicionar 100 μL de vermelho neutro

0,01%, em todas as cavidades.
• Reincubar a 37ºC por 3 horas para penetração do corante nas células vivas.
• Descartar o corante.
• Adicionar 100 μL de solução a 4% de formaldeído em PBS (NaCl 130 mM; KCl 2
mM; Na2HPO4 2H2O 6 mM; K2HPO4 1mM, pH7,2) por 5 minutos para fixar as
células à placa.
• Extrair o corante com 100 μL de uma solução de ácido acético 1% em metanol 50%.
• Ler a densidade ótica (DO) em leitora de ELISA 490 nm
• Calcular a citotoxidade por regressão linear.
ESQUEMA DA PLACA DE 96 POÇOS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

H
REED MUECHEN
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Culture of animal cells. A manual of basic technique. 1994. Ian Freshney, R. Third
edtion
2. PEREIRA, José Miguel Azevedo. Práticas de Virologia. Faculdade de Farmácia da
Universidade de Lisboa, 2008. 3ª edição

3. AZEVEDO, F. A. A toxicologia e o futuro. Revista Intertox de Toxicologia, Risco

Ambiental e Sociedade, Salvador, v.3, n.3, outubro, 2010
4. Ciapetti, G.; Granchi, D.; Verri, E.; Savarino, L.; Cavedagna, D.; Pizzoferrato,
A. Biomaterials, v. 17, p. 1259-1264, 1996.
5. Griffon, G.; Merlin, L.L.; Marchal, C. Comparison of sulforhodamine B, tetrazolium
and clonogenic assays for in vitro radiosensitivity testing in human ovarian cell lines,
Anti-Cancer Drugs (1995) 6, 115-123.
6. PETROIANU, A. Aspectos Éticos na Pesquisa em Animais. Belo Horizonte, 1996.
7. Disponível em
<http://www.medicina.ufmg.br/cememor/arquivos/aspectosEticosAnimais.pdf. Acesso
em 21/06/2014.
8. Fautz, R. B. Husein and C. Hechenberger, Application of the Neutral Red assay to
monolayer cultures of primary hepatocytes : rapid colorimetric viability determination
for the uncheduled DNA synthesis test (UDS), Mutation Research (1991) 253, 173-
179
9. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival. J Immunol
Methods. 1983; 65:55-63.