UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO

BIOLOGIA
MOLECULAR

Departamento de Ciências Animais

Profa. Dra. Michele Silva
CULTURA DE CÉLULAS
 CULTURA DE CÉLULAS

VANTAGENS:
- Tendência atual de escolha p/ desenvolver pesquisas em biologia celular:
1. Controle das condições ambientais;

2. Obtenção em grande quantidade;

3. Cultivo de um único tipo celular (pureza);

4. Estudo de atividades fisiológicas normais ou alteradas;

5. Potencial de diferenciação celular;

6. Resposta a tratamento (com drogas, químicos, proteínas, bioativos...);

7. Análise independente, de parâmetros;

8. Execução de ↑ nº de testes em intervalos curtos de tempo;

9. Diminuição de testes in vivo; diminuição de gastos;

10. Desenvolvimento de terapia celular (implantes celulares)...

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DESVANTAGENS:
- É facilitadora em muitos aspectos, mas é limitante em relação à
experimentação animal:
1. Perda das características fenotípicas observadas em células in vivo;

2. Sistema biológico fora do ambiente natural;

3. Ausência de sinalizações importantes que ocorrem nos tecidos in vivo...

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PRODUÇÃO DE CULTURAS CELULARES:

Cultura Primária:

Preparadas diretamente a partir de células colhidas do tecido, sem a prévia proliferação in vitro;

Cultura Secundária:

Preparadas a partir de células colhidas de culturas primárias (subcultivos);

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PRODUÇÃO DE CULTURAS CELULARES:

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PRODUÇÃO DE CULTURA PRIMÁRIA CELULAR: Animais
1. Obtenção das células (em geral de tecido de embrião, fetal ou neonatal);

2. Dissociação tecidual c/ proteases: tripsina, colagenase);

3. Suspensão em salina (livre de Ca2+; c/ quelante EDTA) sob agitação leve;

4. Separação em tipos celulares conforme:

- Propriedades físicas (centrifugação diferencial)

- Propriedades adesivas (substrato)
- Propriedades bioespecíficas:
- uso de anticorpos ligados a matrizes;
- recuperação de células c/ o uso de enzimas degradativas
- uso de anticorpos marcados por fluorescência (FACS)

- Microdissecação por captura a laser (pulso de infravermelho)

5. Cultura primária celular: cultura em massa; ou cultura clonal.

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PRODUÇÃO DE CULTURA PRIMÁRIA CELULAR: Animais

Cultura em Massa:

Um nº celular ↑ é posto em placa de cultura, formando uma camada uniforme, aderida no fundo
da placa; as sobreviventes proliferam formando uma camada única.

Cultura Clonal:

Um nº celular ↓ é posto em placa de cultura, formando uma camada de células distantes entre si;
as sobreviventes proliferam formando colônias separadas (clones).
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PRODUÇÃO DE CULTURA PRIMÁRIA CELULAR: Animais

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PRODUÇÃO DE CULTURA SECUNDÁRIA CELULAR: Animais

- Obtenção das células (a partir de uma cultura prévia):

1. Obtenção das células a partir do descongelamento de cultivos prévios (congelados em tubos
em tanque de nitrogênio líquido a -196 °C);

2. Transferência das células para o meio de cultura, para a proliferação.

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PRODUÇÃO DE CULTURA CELULAR: Vegetais

1. Obtenção das células (geralmente de tecidos de embriões);

2. Dissociação do tecido (uso de enzima proteolítica: celulase);

3. Protoplastos são postos p/ crescer em meio definido quimicamente, formando 1 massa

celular indiferenciada (Calo), que pode ser induzida a desenvolver um Broto ou ser de novo
dissociada p/ proliferação de clones.
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REQUERIMENTOS DE MEIOS:
- Vários constituintes moleculares p/ garantir sobrevivência e proliferação
celular;

Componentes principais:
sais inorgânicos, vitaminas, aminoácidos, peptídeos e proteínas, carboidratos, lipídeos e ácidos
graxos, soro (ou proteínas definidas), tampões, antibióticos, indicador de pH;

1. Meios contendo soro

+ simples, contendo sais, glicose, vitaminas, aminoácidos, antibióticos e soro (equino, fetal
bovino, extrato de embriões...) de composição macromolecular não bem definida em quantidade
e qualidade;

2. Meios Artificiais (sem soro)

de composição química definida, complexa (hormônios, fatores de crescimento, nutrientes,
vitaminas, proteínas purificadas com funções específicas).
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REQUERIMENTOS DE MEIOS:

Meios Contendo Soro (ou não):

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REQUERIMENTOS DE MEIOS:

Meios Artificiais (sem soro):

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REQUERIMENTOS DE MEIOS:
- Além nutrientes, a maioria das células exigem superfícies apropriadas p/
aderir e crescer;

Substratos Sólidos – células normais

Células normais secretam moléculas p/ adesão ao substrato (colágeno, fibronectina, laminina);
- Plástico ou vidro;
- P/ algumas: cobertura prévia dos substratos c/ componentes de matriz extracelular;

Suspensão
Células cancerosas em geral não requerem substratos;
- Meios de cultivo;
- Podem proliferar em suspensão sem aderir a um substrato.
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FORMAS DE CULTIVO:
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ORIGEM DAS LINHAGENS CELULARES:

- Células normais se dividem em nº limitado (50-100x), depois entram em
senescência celular;

Linhagens Celulares
Quando células em cultivo apresentam modificações genéticas que as permitem proliferar por
tempo indefinido; formam tumores malignos, se injetadas num organismo.

A probabilidade de uma célula normal em cultura tornar-se linhagem

celular, depende do organismo de origem:
- Células de camundongos apresentam alta taxa de transformação;
- Células humanas raramente se transformam; linhagens derivam de tumores ou de indução.

Linhagens celulares: uniformes, estocáveis por tempo indefinido, viáveis

após descongelamento...
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CULTURAS PRIMÁRIAS X LINHAGENS CELULARES:

Cultura Primária
Células obtidas diretamente do tecido;
São culturas heterólogas, com características mais próximas às condições in vivo;
Apresentam o ciclo celular regulado;
Mantidas em cultura por período curto;
Mais suscetíveis ao desenvolvimento de contaminações.

Linhagens Celulares
Células obtidas apartir de cultura primária;
São imortalizadas (alteradas geneticamente);
Apresentam crescimento rápido e contínuo;
Proliferação ilimitada ou limitada a um longo período em cultivo;
Escapam da morte celular (por serem imortais).
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ORIGEM DAS LINHAGENS CELULARES:

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MANIPULAÇÃO:
- Soluções estéreis, controle de temperatura, umidade, níveis de CO2 e pH

Congelamento lento, em presença de crioprotetor:

- Células em fase exponencial de crescimento e com elevada viabilidade.

Descongelamento rápido
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MANIPULAÇÃO:
- Soluções estéreis, controle de temperatura, umidade, níveis de CO2 e pH

Equipamentos necessários:
- Centrífuga; microscópio; câmara de fluxo laminar; incubadora de CO2; mesa agitadora...
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APLICAÇÕES:
1. Cultivo de tecidos e órgãos embrionários;

2. Terapia gênica;

3. Desenvolv. de tecnologia p/ regeneração tecidual e engenharia de tecidos (células-tronco);

4. Produção de vegetais (melhorados ou não) a partir de células totipotentes;

5. Produção de hibridomas e seu uso para produzir anticorpos monoclonais;

6. Estudo / análise bioquímica do metabolismo de diferentes tipos celulares;

7. Análise de clones celulares defectivos em genes específicos;

8. Análise de efeitos sobre células (por adição/remoção de hormônios, fatores de crescimento);

9. Estudo das interações entre o mesmo tipo celular ou tipos diferentes;

10. Estudo das relações entre células e patógenos;

11. Diagnóstico de doenças causadas por anomalias cromossomais;

12. Estudos de imunologia e produção de vacinas;

13. Testes de fármacos e cosméticos;

14. Determinação de condições gerais mínimas p/ sobrevivência e proliferação...

... e muito mais...

FIM!