Márcio Meira

CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS

Importância da cultura de células

▪ Desenvolvimento de novos medicamentos;
▪ Preparação de vacinas, anticorpos, fatores de crescimento, coeficientes de
coagulação e proteínas;
▪ Investigação em diferentes áreas da Medicina, tais como clonagem, transplantes,
terapia génica;

CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS: POTENCIAIS APLICAÇÕES

O que são?
▪ O termo cultura de tecidos animais refere-se ao processo de extração de tecidos
ou órgãos de um animal, com consequente cultura num ambiente artificial capaz
de sustentar e proporcionar o crescimento dos mesmos;
▪ Este ambiente é, geralmente, criado num recipiente de plástico ou vidro com um
meio de cultura líquido ou semi-sólido capaz de fornecer todos os nutrientes
essenciais para a sobrevivência e crescimento do tecido ou órgão.

Tipos de cultura de tecidos

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Cultura de células animais

▪ A cultura de células pode também referir-se ao conjunto de técnicas que permitem

cultivar ou manter células isoladas fora do organismo onde existem, mantendo as
suas características. No entanto, os mecanismos de controlo da diferenciação
celular em Tecidos e em Culturas são diferentes;
▪ Assim, as células em cultura podem funcionar como um modelo de função
fisiológica contraditória, pois em cultura, podem perder algumas características.

Em cultura,
▪ Adesão célula-célula e célula-matriz parece ser diminuída;
▪ Diferenças nas características de um tecido in vivo, pois o meio nutricional e
hormonal está modificado;

CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS (Vantagens)

▪ Controlo do pH, temperatura, osmolalidade e dissolução de gases;

▪ Controlo a nível da concentração de hormonas e nutrientes;
▪ Regulação da matriz, interação célula-célula, difusão gasosa;
▪ Clonagem de células;
▪ Armazenamento dos stocks em nitrogénio líquido;
▪ Quantificação fácil e análise estatística mínima;
▪ Reduz volumes, acesso direto a células e baixo custo;
▪ Número de repetição pode ser aumentado substancialmente;

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CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS (Limitações)

TIPOS DE CULTURA CELULAR

Cultura primária - Cultura preparada diretamente de tecidos de um organismo, com ou

sem passo inicial de fracionamento das células;

Cultura secundária - Células cultivadas que foram retiradas de uma cultura primária e
que podem ser repetidamente subcultivadas desta forma (semanas ou meses);

PRINCÍPIOS BÁSICOS DA CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS

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Biossegurança
▪ Utilização de um conjunto de práticas que são implementadas para prevenir e
minimizar a exposição involuntária a agentes patogénicos e toxinas, ou à sua
libertação acidental.

Contaminações
▪ É um dos grandes problemas, uma vez que são meios muito ricos. Os principais
contaminantes são:
o Bactérias, Leveduras e fungos filamentosos, Protozoários, Vírus e
Micoplasma (são os menores procariontes existentes capazes de se
propagar livremente, com cerca de 0,3μm de diâmetro e forma de coccus);

Principais problemas associados aos Micoplasmas:

▪ Redução da velocidade de proliferação
▪ Aberrações cromossómicas
▪ Alteração do metabolismo
▪ Aglutinação de células em suspensão
▪ Resposta modificada a estímulos externos
▪ Alteração da eficiência de transfecção
Equipamento básico necessário num laboratório de cultura de células animais
▪ Câmara de fluxo laminar vertical para manipulação de material biológico;
▪ Incubadora com controlo de humidade e % de CO2;
▪ Microscópio invertido;
▪ Centrífuga;
▪ Contador de células;

CONDIÇÕES DE CULTURA

As condições de cultura devem ser capazes de reproduzir um microambiente capaz de

simular as condições fisiológicas de um organismo multicelular, nomeadamente:
▪ Requisitos nutricionais;
▪ Temperatura;
▪ Oxigénio;
▪ Dióxido de carbono;
▪ pH;
▪ Osmolaridade;

Nota: A escolha do meio de cultura depende do tipo celular que será cultivado, uma vez
que as exigências nutricionais das células aumentam com a complexidade das mesmas.

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MEIO DE CULTURA

Formulação líquida
▪ Praticamente pronta a usar - apenas adição de suplementos;
▪ Reduzido risco de contaminação;
▪ Custo mais elevado;

Formulação em pó
▪ A preparação é feita em laboratório;
▪ Maior risco de contaminação;
▪ Custo mais baixo;

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COMPOSIÇÃO DE UM MEIO DE CULTURA TÍPICO PARA CULTURA DE

CÉLULAS

Sais Inorgânicos - Equilíbrio osmótico das células e regulação do potencial de membrana

(Na+, K+, Ca2+);

Hidratos de carbono (fonte de C e energia) - Glicose e galactose e alguns com frutose

e maltose (1,0 – 4,5 g/L);

Vitaminas (principal fonte é o soro) - Percursores de inúmeros co-fatores sendo

essenciais para o crescimento e a proliferação celular (vitamina B7, B1, B2);
Alguns são ricos em vitamina A e vitamina E.

Aminoácidos (essenciais e não essenciais) - Estimula o crescimento e prolonga a

viabilidade, a sua concentração determina a densidade máxima da cultura, uma vez que
esgotados as células não crescem mais. A GLUTAMINA é particularmente importante;

Sistemas Tampão - Regula o pH do meio de cultura (7 - 7,6)

Insulina - Regula o metabolismo e promove a sobrevivência das células;

Vermelho de fenol - Serve como um indicador de pH;

Proteínas e Péptidos (particularmente importantes em meios sem soro) - Mais

comuns albumina, transferrina, fibronectina, fetuína e são utilizados em substituição dos
que estão normalmente presentes no soro;

Ácidos Gordos e lípidos (particularmente importantes em meios sem soro) - O

colesterol e os esteroides são essenciais para células especializadas;

Oligoelementos (Zn2+, Cu2+, Se e intermediários do ciclo ácidos tricarboxílicos) - O

selénio ajuda a remover os radicais livres.

2-Mercaptoetanol - É usado para reduzir pontes dissulfeto, funciona como antioxidante

biológico;

Piruvato de Sódio - Fonte de energia para propagação de células;

BSA (albumina do soro bovino) - É um transportador para esteróides, ácidos gordos, e

hormonas da tiróide e estabiliza volume de fluído extracelular;

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MEIO DE CULTURA - SISTEMAS TAMPÃO

▪ No sistema de cultura de células, é importante o controlo do pH ótimo (7,0 -7,6),

utilizando para isso soluções-tampão e o suplemento do meio de cultura que
resiste às variações do pH, principalmente na fase lag do crescimento celular;
▪ Na fase lag do crescimento celular, ou em baixa densidade celular, a tensão de
CO2 deve ser mantida para controlo do pH e, por isso, as culturas são mantidas
em atmosfera de 5-10% de CO2;
▪ Assim, ao meio de cultura é necessário adicionar um sistema tampão para
compensar a evolução do CO2, libertado pelas células e pela produção de ácido
lático resultante do metabolismo da glucose;
▪ A sensibilidade da cultura pela solução-tampão varia, podendo até ser tóxica para
as células, assim a escolha da melhor solução-tampão e da sua concentração deve
ser criteriosa. Em situações em que o tampão bicarbonato não é adequado
podem ser utilizados:
o HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N.-(2-ácido etanosulfónico)
o PO4

▪ Ao meio de cultura é também adicionado um indicador de pH (ex. vermelho de

fenol - 2mg/L) cuja função é monitorizar constantemente o estado do pH em
culturas celulares pela mudança de cor e que facilita a observação de alterações
que possam ocorrer devido ao metabolismo celular.
Geralmente, o meio de cultura deve ser mudado quando a cor muda para amarelo
(meio ácido) ou púrpura (meio alcalino);

MEIO DE CULTURA - SUPLEMENTAÇÃO

▪ Apesar da sua constituição química, os meios de cultura base são nutricionalmente

insuficientes para cultura de células sendo necessário a sua suplementação.
▪ Os suplementos são, geralmente, aditivos complexos e indefinidos:
o Hormonas e fatores de crescimento;
o Proteínas e péptidos, nucleosídeos, lípidos e inibidores que podem ser
fornecidos por esse fluído animal;

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MEIO DE CULTURA - SORO

O soro é um suplemento COMPLEXO rico em proteínas, albumina, fatores de

crescimento e inibidores de crescimento.
▪ Como principais funções apresenta: proteção mecânica, capacidade tampão em
culturas com taxas de proliferação reduzidas e ligação e neutralização de toxinas.
Esta mistura estimula, também, o transporte da glicose, do fosfato e aminoácidos
e aumenta a permeabilidade das membranas.
▪ Os mais utilizados em cultura de células são os soros de origem bovina, de
cavalo e humano, sendo que o mais utilizado é o Soro Fetal Bovino por
apresentar menor concentração de Imunoglobulinas e elevada proporção de
fatores de crescimento em comparação ao dos bezerros, cavalos e humanos.

▪ As variações qualitativas e quantitativas dos componentes do soro podem

interferir no crescimento das células em cultura. Dessa forma, a capacidade de
possibilitar o crescimento celular deve ser avaliada para cada lote de soro
adquirido. Cada lote deve ter um certificado com todos os dados dos testes
bioquímicos e microbiológicos realizados, devendo ser testados para deteção de
bactérias, fungos, Micoplasma e agentes virais.
▪ O soro fetal deve ser estéril (inativado a 56 ºC por 30 minutos) para redução do
risco de contaminação, visto que alguns vírus são inativados por este processo.

Nota: O soro é obtido a partir do plasma em condições assépticas e estéreis.

VANTAGENS DO USO DO SORO

▪ Contém vários fatores de crescimento e hormonas que estimulam o crescimento e
funções celulares;
▪ Ajuda na fixação das células (formação da monocamada);
▪ Atua como um fator de propagação;
▪ Atua como sistema tampão, ajudando a manter o pH do meio de cultura;
▪ Funciona como uma proteína de ligação;
▪ Minimiza danos mecânicos ou danos causados pela viscosidade;

DESVANTAGENS DO USO DO SORO

▪ Produto derivado de animais (levanta questões éticas);
▪ Composição não definida e com variabilidade lote a lote;
▪ Antes da sua utilização é necessário fazer testes para verificar a sua qualidade;
▪ Pode conter alguns dos fatores inibidores de crescimento;
▪ Aumenta o risco de contaminações;
▪ Grande possibilidade de apresentar agentes contaminantes, nomeadamente
micoplasmas, vírus e priões;
▪ Presença do soro no meio pode interferir na purificação e isolamento de produtos
na cultura de células;
▪ Custo e disponibilidade do produto;

RAZÕES PARA SE UTILIZAR UM MEIO DE CULTURA SEM SORO

▪ Sistema mais definido;

▪ Consistência no desempenho sem alteração das funções celulares;
▪ Controlo da proliferação e diferenciação celular;
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▪ Possibilidade de utilização em determinadas aplicações industrias e clínicas;

DESVANTAGENS DE SE UTILIZAR UM MEIO DE CULTURA SEM SORO

▪ Multiplicidade de meios de cultura (cada linha celular tem necessidades

nutricionais diferentes e, portanto, serão necessários muitos meios de cultura
diferentes);
▪ Seletividade (a presença de determinados constituintes do soro promove alguma
seleção de sub-linhagens em linhas celulares);
▪ Pureza dos reagentes (a remoção do soro requer maior grau de pureza da água e
dos reagentes, uma vez que é retirada a ação protetora e detoxifying que algumas
proteínas do soro apresentam);
▪ Proliferação celular (o crescimento celular é mais lento em meio de cultura sem
soro e menos gerações são produzidas em linhas celulares finitas;

PREPARAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO
▪ Autoclave;
▪ Processo de filtração - passagem de líquidos por membranas filtrantes com
pequenos poros que impedem a passagem de microrganismos.

ARMAZENAMENTO
▪ As soluções salinas, água e alguns reagentes podem ser mantidos à temperatura
ambiente;
▪ Os meios de cultura podem ser armazenados durante cerca de 6-9 meses a 4 °C
antes de ser adicionada a glutamina;
▪ Após adição de glutamina, soro ou antibióticos, o meio de cultura não deve ser
armazenado por mais de 2-3 semanas;
▪ Meios de cultura com componentes lábeis devem ser utilizados até 3 semanas após
preparação ou armazenados a -20 °C;
▪ Soro, soluções tripsina e glutamina devem ser mantidos a -70 °C;
▪ Os meios de cultura armazenados podem sofrer precipitação. Nesta situação pode
agitar-se ou aquecer-se para re-dissolução. Não havendo re-dissolução pode
significar que houve alteração química de algum constituinte (ex. reações entre o
fosfato e iões metálicos);
▪ A luz fluorescente pode também deteriorar alguns constituintes (riboflavina,
triptofano, tirosina). Assim, é recomendável que as garrafas com meio de cultura
não estejam expostas mais do que umas horas à luz fluorescente;

MEIO DE CULTURA - RESUMO

▪ Água: desionizada + destilada + filtração (isenta de contaminantes minerais,

orgânicos e biológicos);
▪ Solução salina: Sais inorgânicos (meio de cultura isotónico e isoosmótico);
▪ Solução-tampão: Bicarbonato de sódio (mais comum);
▪ Indicador de pH: vermelho de fenol;
▪ Fontes de energia: Glucose (mais comum) e aminoácidos essenciais (ex:
arginina, isoleucina, metionina, glutamine)
▪ Soro;
▪ Vitaminas;
▪ Ácidos gordos e lípidos; Proteínas e péptidos;
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▪ Oligoelementos;
▪ Hormonas e fatores de crescimento;
▪ Antibióticos/Antimicóticos: Penicilina + estreptomicina; Gentamicina;
Fungizone;

MEIO DE CULTURA - CRITÉRIOS PARA SELEÇÃO

▪ A escolha do meio de cultura é de extrema importância e pode traduzir o sucesso

ou não dos protocolos de cultura de células animais;
▪ A seleção do meio de cultura depende:
o Tipo de células a cultivar;
o Objetivo da cultura;
o Recursos disponíveis no laboratório;
▪ Diferentes tipos celulares possuem requisitos de crescimento altamente
específicos, portanto, o meio de cultura mais adequado para cada tipo de célula
deve ser determinado experimentalmente;

CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS - CRESCIMENTO

Fase Lag - não há divisão celular. As células adaptam-se às condições de cultura e a

duração desta fase irá depender da fase de crescimento em que a linha celular se
encontrava aquando da subcultura assim como da concentração do inóculo;

Fase crescimento logarítmico (Log) – proliferação celular ativa com aumento

exponencial da densidade celular. Fase em que a população celular é considerada o mais
viável, sendo esta a recomendável para avaliar as funções celulares. Cada linha celular
apresenta diferentes cinéticas de proliferação celular durante a fase log, daí ser a melhor
fase para determinar o tempo de duplicação da população.

Fase estacionária (plateau) – a proliferação celular diminui devido ao aumento da

confluência celular. Nesta fase o nº de células na fase ativa do ciclo celular desce para
cerca de 0-10%.

Fase de declínio - predomina a morte celular e ocorre uma redução do nº de células

viáveis. A morte celular não é devida à redução dos suplementos nutricionais, mas sim
ao ciclo celular;

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TIPOS DE CULTURA CELULAR

Cultura primária - Cultura preparada diretamente de tecidos de um organismo, com ou

sem passo inicial de fracionamento das células;

Cultura secundária - Células cultivadas que foram retiradas de uma cultura primária e
que podem ser repetidamente subcultivadas desta forma (semanas ou meses);

Linhas celulares contínuas (células que se podem dividir indefinidamente);

o Vantagem:
▪ Pode ser propagada in vitro por tempo indeterminado (não sofre
senescência);
o Desvantagem:
▪ As células não possuem todas as suas características originais;

Linhas celulares transformadas (células com características tumorais/ cancerígenas);

o Vantagem:
▪ Quantidade de células praticamente ilimitado;
o Desvantagem:
▪ As células mantêm poucas características do tecido de origem;

CULTURA CELULAR PRIMÁRIA - PROCEDIMENTO MAIS COMUM

É obtida a partir dos tecidos extraídos diretamente do animal e envolve:

▪ A dissociação em células isoladas por disrupção mecânica ou enzimática;

▪ A seleção de passos de isolamento das células de interesse a partir de uma
população heterogénea;
▪ O crescimento em meio artificial favorável;

Aspetos importantes a considerar antes de se iniciar uma Cultura Primária:

▪ Tipo de tecido de origem, idade e espécie;

▪ Meio de dissociação e enzimas;
▪ Estratégia de separação celular;
▪ Condições de cultura (concentração celular, meio de cultura basal, suplementos,
temperatura e atmosfera gasosa)

Tipo de tecido de origem

1. Tecidos embriogénicos são melhores do que tecidos adultos: melhor

desagregação, mais células viáveis e melhor taxa de proliferação;
2. Tecidos animais mais “velhos” contêm mais tecido conjuntivo: dificulta a
dissociação e a cultura;

CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS - PROCEDIMENTO

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 Márcio Meira

1º - Rompimento da matriz extracelular e as junções intercelulares que mantêm as

células unidas (dissociação mecânica; enzimas proteolíticas);
2º - As células são separadas, tendo em conta o tamanho e densidade por
centrifugação fracionada;
3º - Dissociação
▪ Método mecânico Originar uma suspensão celular
▪ Método enzimático

Dissociação mecânica
▪ Cortar o tecido finamente com um instrumento afiado de forma a minimizar
os danos no tecido (a);
▪ Passar as células através de uma peneira (b);
▪ Passar as células através de uma malha;
▪ Pipetagem vigorosa (d);

Dissociação enzimática (é a mais utilizada, e a enzima mais utilizada é a tripsina)

▪ Crucial em tecido conjuntivo;
▪ Utilização de preparações enzimáticas e/ou enzimas isoladas;
▪ As preparações de enzimas são menos tóxicas e mais específicas, mas não são tão
eficientes na dissociação;
▪ As enzimas deverão ser, posteriormente, removidas por centrifugação

A adição de enzimas digestivas (enzimas proteolíticas), como é o caso da tripsina e da

colagenase, vão fragmentar o tecido e clivar as ligações entre as células. Desta forma,
cria-se uma suspensão de células únicas que é depois colocada num frasco de cultura com
meio de cultura adequado para crescimento e divisão celular.

4º - Separação
▪ Centrifugação por gradiente de densidade (método mais utilizado);
▪ Marcação específica das células com anticorpos acoplados a um corante
fluorescente;
▪ Separação das células marcadas das não marcadas através de um separador de
células ativado por fluorescência;
▪ Ligação de suspensões celulares magnetizadas com anticorpos;

A eficácia da separação celular é medida por:

▪ Grau de pureza;
▪ Rendimento;
▪ Viabilidade;

5º Cultura
▪ O crescimento celular e a diferenciação nas culturas primárias dependem de:
o Natureza e biologia da célula;
o Ambiente da cultura;
▪ Natureza do substrato onde crescem as células;
▪ Constituição do meio de cultura;
▪ Interações entre célula-célula e célula-matriz;

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Concentração celular
▪ Superior à utilizada nas sub-culturas, visto que a proporção de células do tecido
que sobrevivem na cultura primária é, geralmente, baixa;
▪ Elevada densidade celular promove a diferenciação celular;
▪ Em excesso pode comprometer o sucesso da cultura devido a limitação de
superfície e nutrientes, assim como inibição pelo contacto célula-célula;

> diferenciação < taxa de crescimento

< diferenciação > taxa de crescimento

Meio de cultura
▪ Um meio de cultura rico (Ham’s F12) pode ser mais eficaz do que um meio de
cultura simples, como o Eagle’s MEM;
▪ Utilização de soro (mistura de vários fatores que promovem o crescimento); o
FBS (soro fetal bovino) é o que apresenta melhores resultados;
▪ A sobrevivência de algumas células depende da necessidade de nutrientes e/ou
fatores de crescimento específicos;
▪ Meios de cultura seletivos podem melhorar o isolamento de determinados tipos
de células;

Monitorização dos Parâmetros físico-químicos ao longo da cultura

▪ Oxigénio
o Concentração do ar 21%;
o Células realizam principalmente glicólise;
o Formação de radicais livres

▪ Temperatura
o Ótima 37°C (devem evitar-se variações bruscas);

▪ Osmolaridade
o Manutenção da pressão osmótica (260 to 320 mOsm/kg);

▪ pH
o 7.2 - 7.4 (sistema tampão);

Algum tempo após o estabelecimento das culturas primárias:

▪ As células com capacidade de proliferar aumentam em número;
▪ As que não sobrevivem às condições de cultura morrem:
▪ Outras sobrevivem, mas não proliferam;

Assim que toda a camada de substrato da cultura for ocupada e as células confluírem,
estabelecendo contacto umas com as outras, surge a necessidade de proceder a subculturas
sucessivas.

6º Sub-cultura
É necessária de forma a fornecer periodicamente novos nutrientes, tal como espaço para
o crescimento contínuo das células.

A frequência da sub-cultura e a densidade do inóculo varia e é dependente de cada linha

celular:

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▪ Linhas celulares que se dividem rapidamente (HeLa, VERO) – sub-cultivadas 1x

por semana com substituição de meio de cultura a meio;
▪ Fibroblastos HELcells – sub-cultivadas a cada 10-14 dias

7º Avaliação do crescimento/número de células

A contagem do número de células pode ser necessária no início, durante e no final dos
ensaio; sendo por vezes necessária a monitorização diária de forma a estimar a densidade
ótima de crescimento celular para as sub-culturas.

Existem dois métodos para determinar o crescimento celular (número de células):

▪ Diretos
o Câmara de contagem;
o Contador eletrónico de partícula;
▪ Indiretos
o medição de parâmetros como conteúdo em DNA ou proteína;

8º Determinação da viabilidade celular

Quando as células são isoladas de tecidos ou as monocamadas confluentes são
subcultivadas é necessário determinar a proporção entre células viáveis e células não
viáveis. Maioritariamente, esta determinação é feita com base na avaliação da
permeabilidade da membrana (se uma célula apresenta uma membrana permeável
pressupõe que tenha ocorrido uma lesão grande e irreversível).

FATORES QUE AFETAM A PROLIFERAÇÃO CELULAR

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 Márcio Meira

▪ Promoção da proliferação celular

o Baixa densidade celular;
o Fatores ambientais como os fatores de crescimento;

▪ Inibição da proliferação celular

o Elevada densidade celular;
o Inibição de contacto: contacto celular;
o Fatores ambientais;

FATORES QUE AFETAM A DIFERENCIAÇÃO CELULAR

A diferenciação celular é muito importante para o desempenho das funções celulares

e é influenciada por:
▪ Elevada densidade celular;
▪ Interações célula-célula e célula-matriz;
▪ Indutores (hidrocortisona, retinoide, matriz);

CLASSIFICAÇÃO DAS CULTURAS QUANTO AO TEMPO DE CULTURA

O processo de cultura celular inicia-se, como anteriormente referido, com a cultura

primária de células. Após se atingir a confluência, as células são sub-cultivadas de forma
rotineira sequencialmente até se estabelecer uma linha celular contínua.
Durante este processo de cultura e subculturas, vários fatores podem regular o sucesso do
procedimento, uma vez que são necessários para as atividades metabólicas, de
crescimento e proliferação celular
▪ Nutrientes;
▪ Suplementos;
▪ Fatores de crescimento;
▪ Sistemas tampão;
▪ pH;
▪ Oxigenação/CO2;
▪ Osmolaridade

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 Márcio Meira

LINHAS CELULARES CONTÍNUAS

▪ Células derivadas de culturas primárias ou linhagens celulares, que se podem

dividir indefinidamente (“imortalizadas”);
▪ Células que foram retiradas de tecidos animais, e que foram modificadas de modo
a poderem proliferar indefinidamente;
o Vantagem
▪ Pode ser propagada in vitro por tempo indeterminado (não sofre
senescência);
o Desvantagem
▪ As células não possuem todas as suas características originais

LINHAS CELULARES TRANSFORMADAS

▪ Células com características tumorais/ cancerígenas.

▪ Cultura preparada diretamente de tecidos de um organismo, com ou sem passo
inicial de fracionamento das células;
o Vantagens
▪ Quantidade de células praticamente ilimitado;
o Desvantagem
▪ As células mantêm poucas características do tecido de origem;

A transformação está associada à instabilidade genética e com três grandes classes de

alterações fenotípicas:
1. Imortalização (aquisição de um tempo de vida indeterminado), no entanto, pode
ser conseguido sem que haja malignidade ou controlo do crescimento “aberrante”;
2. Controlo de crescimento “aberrante” (perda de inibição de contacto celular,
limitações de densidade da proliferação celular, dependência de adesão);
3. Malignidade (evidenciado pelo crescimento de tumores invasivos in vivo);

As alterações nas linhas celulares transformadas afetam o controlo do ciclo celular,

ocorrendo a desativação dos mecanismos de morte celular
▪ Morfologia alterada
▪ Alta taxa de crescimento
▪ Menor dependência de soro e de ancoragem
▪ Aumento da variação cromossómica entre células

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CÉLULAS ESTAMINAIS

Células estaminais são, por definição, células que se podem diferenciar em diversas
linhagens celulares, tendo igualmente a capacidade de se auto-renovar, dividindo-se
indefinidamente.

Células indiferenciadas ou com baixo grau de diferenciação e de alto grau de

imutabilidade que apresentam três características fundamentais:
▪ Capacidade de proliferação e divisão, podendo manter-se indiferenciadas ao longo
do tempo;
▪ Capacidade de autorrenovação, originando células indiferenciadas idênticas a si
próprias;
▪ Originam células filhas que se diferenciam, sob influência do microambiente em
que estão inseridas, e constituem as células dos tecidos/órgãos

As células estaminais podem ser classificadas:

▪ Origem em células estaminais embrionárias ou células estaminais adultas;
▪ Potencialidade em células estaminais totipotentes, pluripotentes ou multipotentes.

CÉLULAS ESTAMINAIS TOTIPOTENTES

Células que possuem a máxima capacidade de diferenciação, isto é, são células capazes
de se dividir e produzir todas as células do organismo (células do embrião recém-
formado). O ovo fertilizado é a célula estaminal com maior potencial de diferenciação
bem como os blastómeros que são as células que constituem a mórula, sendo também
estas duas as únicas células totipotentes.

CÉLULAS ESTAMINAIS PLURIPOTENTES

Células com a capacidade de se diferenciar em células que derivam das diferentes

camadas embrionárias que são a mesoderme (origina músculos, ossos, sangue e sistema
urogenital), endoderme (origina o trato gastrointestinal e pulmões) e ectoderme (origina
os tecidos epidérmicos e sistema nervoso), estas camadas germinativas provêm do botão
embrionário.

Estas células estaminais embrionárias podem dar origem a qualquer tipo de célula fetal
ou adulta, mas não podem por si próprias desenvolver-se num organismo fetal ou adulto
porque não possuem a capacidade de criar tecido extraembrionário, como a placenta.

CÉLULAS ESTAMINAIS MULTIPOTENTES

Células limitadas na sua capacidade de diferenciação e são designadas de acordo com o

órgão do qual provêm, originando exclusivamente as células daquele órgão. São células
que estão presentes no indivíduo adulto.
Nos casos em que o tecido é constituído por uma única linhagem diferenciada, as células
estaminais que mantêm essa linhagem são designadas de unipotentes

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Em resumo:

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 Márcio Meira

CÉLULAS ESTAMINAIS EMBRIONÁRIAS

▪ São isoladas diretamente do embrião na fase inicial do seu desenvolvimento
(retiradas da massa interna do blastocisto que se forma entre o 4º e 6º dia do
desenvolvimento embrionário);
▪ Possuem uma grande capacidade de autorrenovação indefinida devido à alta
expressão da telomerase;
▪ Podem dar origem a qualquer célula do corpo humano, sendo consideradas
pluripotentes, com a exceção dos tecidos extraembrionários.
▪ As suas características permitem que mesmo após estarem um tempo indefinido
in vitro possam dar origem a descendência;

Vantagens
▪ Possuem maior capacidade de diferenciação e plasticidade que as células
estaminais adultas;
▪ São mais fáceis de identificar e isolar, uma vez que existem em maior número;

Desvantagens
▪ Apresentam maior tendência para a formação de tumores no local alvo ou
perifericamente sob a forma de metástases;
▪ O seu uso também é limitado devido às dificuldades em conduzir a sua
diferenciação para o tipo celular pretendido;

AS CÉLULAS ESTAMINAIS ADULTAS

▪ São células isoladas após o nascimento e que são responsáveis pela renovação
celular bem como o crescimento e respetiva reparação dos tecidos desde o
nascimento até à vida adulta;
▪ Encontram-se presentes nos órgãos e tecidos fetais e adultos;
▪ Têm várias origens: desde o sangue do cordão umbilical, placenta, tecido adiposo,
medula óssea, sangue periférico e tecidos maduros;
▪ O seu potencial de diferenciação é menor que o das células estaminais
embrionárias, sendo consideradas multipotentes.

Vantagens
▪ São menos propensas à formação de tumores, uma vez que possuem uma menor
plasticidade e menor capacidade de proliferação devido ao facto de já estarem
programadas para originar células diferenciadas.
▪ As células estaminais adultas podem ser reprogramadas para voltarem a ser
pluripotentes, através da transferência de um núcleo adulto para um citoplasma de
um oócito ou pela fusão com uma célula pluripotente;

Desvantagens
▪ Menor capacidade de proliferação;
▪ Possibilidade de conter um maior número de erros genéticos devido a possíveis
exposições a agentes mutagénicos ou erros durante a replicação;
▪ São de difícil identificação e isolamento

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CÉLULAS ESTAMINAIS PLURIPOTENTES INDUZIDAS (IPSC)

▪ São células somáticas que por indução/expressão forçada de certos genes (fatores
de transcrição) essenciais adquirem características das células estaminais
embrionárias (autorrenovação e pluripotência);
▪ As iPSC possuem propriedades de auto-renovação e de pluripotência semelhantes
às células estaminais embrionárias e foram já diferenciadas in vitro com sucesso
em vários tipos celulares;

REPROGRAMAÇÃO NUCLEAR
A reprogramação nuclear pode ser definida como o processo que permite que o estado de
diferenciação de uma célula possa ser mudado para outro e apresenta-se como uma
técnica de interesse por três razões:
1. Uma vez identificada a reprogramação, poderá compreender-se como a
diferenciação celular e a expressão de genes especializados são mantidos;
2. Poderá vir a ser útil na terapia de regeneração, onde as células e tecidos
defeituosos serão substituídos por outros normais;
3. Espera-se que possa permitir estudar a natureza das doenças e descobrir novos
fármacos. Através da reprogramação nuclear as células têm a capacidade de dar
origem a um tipo celular para o qual não estavam inicialmente programadas;

A reprogramação de células somáticas pode ser induzida por diferentes métodos:

1. Transferência nuclear de células somáticas (SCNT: somatic cell nuclear transfer);
2. Fusão celular;
3. Utilização de fatores de transcrição específicos (método mais recente);

Devido à capacidade de renovação ilimitada sem perderem as suas características e por

serem diferenciáveis, em teoria, em qualquer tipo celular, as iPSCs são consideradas uma
fonte ideal para diferentes aplicações terapêuticas:
1. Criação de modelos de doença para estudar os respetivos mecanismos;
2. “Screening” de fármacos em tipos celulares específicos, como os cardiomiócitos,
hepatócitos, neurónios, entre outros;
3. Produção de células e tecidos para transplante em diversas patologias.

O facto da reprogramação de iPSC permitir a obtenção de células com as propriedades

únicas das células estaminais embrionárias, a partir de células diferenciadas adultas do
próprio paciente, estas são promissoras para futuras terapias celulares.

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 Márcio Meira

SCREENING DE FÁRMACOS

A tecnologia das iPSCs:

▪ poderá replicar os tipos celulares específicos das doenças e permitir a realização
de testes e ensaios, de modo a escolher o fármaco com a maior eficácia e menor
toxicidade;
▪ pode ajudar na redução do número de animais sacrificados durante a fase de
avaliação e desenvolvimento de novos fármacos;

O uso da tecnologia das iPSCs como plataforma para a descoberta de novos

fármacos requer a combinação de diversas fases:
▪ Recrutamento de um grupo de doentes;
▪ Obtenção de iPSCs e armazenagem em biobancos;
▪ Diferenciação das iPSCs derivadas dos doentes nas células que são afectadas pela
doença em estudo;
▪ Descoberta do fenótipo da doença;
▪ Preparação de todas as condições do ensaio de acordo com o fenótipo da doença;

TERAPIA CELULAR
▪ A criação de iPSCs específicas de doentes tem sido motivada pela possibilidade
de obter células e tecidos imuno-compatíveis para transplante autólogo. Um dos
propósitos mais promissores das iPSCs é a sua possível aplicação em medicina
regenerativa.
▪ Um dos objetivos desta tecnologia passa por substituir as zonas lesadas de um
determinado órgão alvo, para que possa retomar o seu funcionamento normal e
permanente, sem desencadear resposta imunitária e sem possibilidade de se
desenvolverem doenças secundárias (por exemplo, tumores) a partir das células
inoculadas.

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 Márcio Meira

CÉLULAS ESTAMINAIS – TERAPIA

▪ Para utilização de células estaminais em terapia celular, é necessária a expansão

de um grande número de células em cultura;

▪ As células estaminais embrionárias, adultas e fetais e as iPS derivadas de

células somáticas têm a capacidade de proliferar e de se auto-renovar em cultura;
▪ As células estaminais embrionárias são as que proliferam melhor em cultura e
que dão origem a todos os tipos de células derivados das três camadas
germinativas do embrião;
▪ As células estaminais fetais, assim como as adultas podem ser usadas para fins
terapêuticos autólogos quando derivadas e usadas no próprio paciente. Estas
células adultas também podem servir para terapias de outros pacientes, neste caso
sendo para transplantes alogénicos;
▪ No entanto, a capacidade de proliferação em cultura destas células fetais e adultas
é variável e mais limitada do que a capacidade das células estaminais
embrionárias;

▪ Depois da expansão das células estaminais em cultura, é preciso gerar tipos

específicos de células diferenciadas, tais como células musculares cardíacas,
células do sangue ou células nervosas, através de, por exemplo, protocolos que
modificam as condições de cultura e a composição química dos meios de cultura;

▪ Uma vez diferenciadas (ou mediante a estrutura que estas células que formam)
poderiam ser transplantadas nos pacientes de maneira autóloga ou alogénica para
substituir, reparar ou melhorar as funções de tecidos ou órgãos danificados;

CÉLULAS ESTAMINAIS – EXEMPLOS DE APLICAÇÕES

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 Márcio Meira

ORGANOIDES

A Biologia moderna permitiu um grande avanço no conhecimento sobre a forma como

nos mamíferos se desenvolvem indivíduos adultos complexos, a partir de uma única
célula totipotente.
▪ Durante as últimas 3 décadas foi possível obter células estaminais embionárias
(ESCs) a partir do epiblasto e cultivá-las de forma contínua in vitro.
▪ Mais recentemente, células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) foram
“criadas” a partir de praticamente todos os tipos de células maduras do ser
Humano.
▪ Estes avanços permitiram a diferenciação de várias populações de células
estaminais pluripotentes (PSC) em células somáticas derivadas in vitro.
▪ Recentemente, as células estaminais adultas, residentes nos tecidos (AdSCs)
atraíram, também, muita atenção devido à sua capacidade de auto-renovação e
diferenciação em tipos de células presentes nos tecidos adultos mantendo a sua
estabilidade genética.

O desenvolvimento recente de sistemas de cultura tridimensional (3D) tornou possível

recapitular parcialmente a complexidade da organogénese de mamíferos in vitro e
também permitiu a criação de tecidos transplantáveis.

Organoides são sistemas 3D de cultura in vitro derivados de células-tronco auto-

organizadas. Eles podem expressar a arquitetura in vivo, funcionalidade e autenticidade
genética do tecido original.

Os organoides podem ser desenvolvidos a partir de células-tronco pluripotentes e células-

tronco adultas. Organoides foram estabelecidos para múltiplos órgãos, incluindo
intestino, rim, cérebro, fígado, estômago, pâncreas, ovário e pulmão.
Os genes podem ser manipulados dentro de organoides usando tecnologias moleculares
e isso pode permitir a modelagem de doenças e a terapia genética direcionada.

O recente desenvolvimento de organoides derivados de pacientes humanos permitiu a

modelagem de doenças com precisão, destacando seu grande potencial em aplicações
biomédicas, medicina translacional e terapia personalizada. À luz das recentes
descobertas usando organoides ... aplicação de organoides no estudo do câncer e doenças
hereditárias, bem como no exame das interações célula-microrganismo hospedeiro”

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