A. Apostila

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
CURSO DE AGRONOMIA
DEPARTAMENTO DE SOLOS
MICROBIOLOGIA DO
SOLO
(APOSTILA DIDÁTICA – AULAS PRÁTICAS)
Prof. Sandro José Giacomini

Prof. Celso Aita
Profª. Zaida Inês Antoniolli
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MICROBIOLOGIA DO SOLO
SUMÁRIO
1. NUTRIÇÃO E CULTIVO DE MICRORGANISMOS ................................................ 3
2. DISTRIBUIÇÃO DE MICRORGANISMOS ........................................................... 11
3. ENRIQUECIMENTO, ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DE CULTURAS

MICROBIANAS ............................................................................................................. 18
4. COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS PARA MICROSCOPIA ...................................... 22
5. TESTES BIOQUÍMICOS ...................................................................................... 25
6. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS ................................. 32
7. ATIVIDADE MICROBIANA DO SOLO. ................................................................. 40
8. BIOTRANSFORMAÇÕES DO NITROGÊNIO NO SOLO ..................................... 45
9. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS ............................................. 49
10. MICRORGANISMOS E A ESTABILIDADE DE AGREGADOS DO SOLO ........... 52
11. MICORRIZAS ....................................................................................................... 54

AULA PRÁTICA 1 – Nutrição e Cultivo de Microrganismos
Assim como todas as formas de vida, os microrganismos requerem certos

nutrientes e fatores físicos básicos para sustentar a vida. Microrganismos distintos
requerem diferentes conjuntos de nutrientes, sendo geralmente necessários sob uma
ou outra forma específica. Entender tais necessidades é fundamental para termos
sucesso no cultivo dos microrganismos em laboratório.
Necessidades nutricionais
No laboratório as necessidades nutricionais dos microrganismos são fornecidas através
de meios de cultura.
Meio de cultura:
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
______________________________________________
O uso de meios de cultura adequados é fundamental para possibilitarmos o
crescimento e a manutenção de microrganismos em laboratório a fim de realizar o
estudo desses organismos vivos.
Para que os microrganismos possam crescer a partir de um meio de cultura, o mesmo
deve fornecer três categorias fundamentais de nutrientes:
Fonte de energia
Fonte de componentes para fabricação de células
Fatores de crescimento (para alguns micróbios)
Existe uma infinidade de alimentos que podem suprir todos estes requisitos, mas nem
todos os microrganismos têm as mesmas exigências. A habilidade de um
microbiologista está na capacidade de seleção dos componentes próprios que farão um
meio de cultura adequado para um dado microrganismo.
A. FONTES DE ENERGIA:
· Compostos Orgânicos: açúcares, amido, proteínas, gorduras.
· Compostos Inorgânicos: NH4+, S, H2S, Fe++, H2
· Luz.
B. FONTE DE PRECURSORES CELULARES (CHONSP):

Formas como são absorvidos:
· Carbono - CO2 (autotróficos) ou compostos orgânicos (heterotróficos).
· Hidrogênio e Oxigênio - H2O e O2 do ar.
· Nitrogênio
- Orgânico: proteínas, aminoácidos
- Inorgânico: NH4+, NO3-.
· Enxofre
- Orgânico: aminoácidos (metionina, cisteína)
- Inorgânico: SO4--
· Fósforo - normalmente como fosfato inorgânico (PO4-)
· Outros: como íons Ca++, Mg++, K+, Fe++.
C. FATORES DE CRESCIMENTO
São substâncias que alguns microrganismos não conseguem sintetizar a partir de seus
nutrientes principais. Deverão ser introduzidos no meio de cultura, pois sua ausência limita o
crescimento de organismos que não conseguem sintetizá-los. Ex: vitaminas Tiamina, Biotina,
Piridoxina, Cobalamina, Ácido Nicotínico.
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além das necessidades de nutrientes os microrganismos para crecerem necessitam d

efonte de energia e elétrons.
Fonte de carbono, energia e elétrons
Fonte de Carbono Classe nutricional

CO2 Autotróficos
Carbono orgânico Heterotróficos
Fonte de energia
Luz Fototróficos
Compostos orgânicos e inorgânicos Quimiotróficos
Fonte de elétrons
Compostos inorgânicos Litotróficos
Compostos orgânicos Organotróficos
TÉCNICAS ASSÉPTICAS: conjunto de procedimentos
Na natureza os microrganismos existem como populações mistas e dentro dessas populações,

várias formas e tipos fisiológicos podem ser encontrados. Entretanto, para o estudo e
conhecimento de um microrganismo específico, precisamos trabalhar com CULTURAS PURAS
(espécie isolada) crescendo em ambientes livres de contaminação de outras formas de vida.
Somente através de TÉCNICAS ASSÉPTICAS conseguiremos estudar microrganismos
separadamente.
-
MEDIDAS DE ASSEPSIA (comumente utilizadas):
· Exclusão de propágulos do ar -
· Desinfecção -
· Flambagem -
MEIO DE CULTURA: Uma grande variedade de meios de cultura são empregados pelo
microbiologista para isolamento, crescimento e manutenção de CULTURAS PURAS.
Microrganismos são cultivados em água à qual nutrientes apropriados tenham sido
adicionados, normalmente em forma solúvel. A solução aquosa contendo tais nutrientes
necessários ao desenvolvimento do microrganismo é chamado de Meio de Cultura.
PRODUTOS COMUMENTE UTILIZADOS NA MONTAGEM DE MEIOS DE CULTURA:
· PEPTONAS:
· EXTRATOS:
· AGAR:
· ELEMENTOS TRAÇO:
MEIOS DE CULTURA
Devido à inexistência de um meio de cultura universal, a escolha do meio dependerá do

organismo com o qual estamos manipulando e do direcionamento do trabalho que estamos
executando. Existem livros com receitas para a preparação de meios de cultura para vários
grupos de microrganismos de interesse para a saúde pública, indústria de alimentos,
contaminação do ambiente, doenças em plantas e animais, etc...
Classificações:
Em um primeiro instante dividimos os meios de cultivo em:
· Definidos-
· Indefinidos-
A partir desta primeira classificação, dividimos os meios de cultura nas seguintes

categorias, de acordo com sua aplicação ou função:
I. Meios líquidos (sem ágar):

1. Naturais: (indefinidos): Animais - leite, sangue; Vegetais- suco de frutas, extrato de
levedura.
2. Artificiais/sintéticos: a-(definido): meios para nitrificadores, fixadores de nitrogênio,
Czapec-Pitt para fungos.
b- (Indefinido): caldo de carnes, caldo de peptona.
II. Meios sólidos: (com ágar-ágar, sílica-gel, gelatina, etc.)
III. Meios seletivos: A adição de certas substâncias químicas específicas ao ágar-nutritivo

previne o crescimento de um grupo de microrganismos sem agir sobre os outros.
Ex: A inclusão de Rosa Bengala ou estreptomicina no meio de cultura usado para os
fungos irá impedir o crescimento de bactérias.
Usando Nistatina no meio para bactérias, esta substância irá impedir o crescimento de
fungos.
IV. Meios diferenciais: A adição de certos reagentes ao meio pode distinguir os tipos de
bactérias. Por exemplo adicionando-se vermelho congo (substância química), no meio de
Rhizobium (Manitol Congo Vermelho Agar), as bactérias contaminantes do gênero
Agrobacterium podem assimilar a cor vermelha e as colônias de Rhizobium não (incolor).
Desse modo, pode-se estabelecer a distinção entre duas bactérias da mesma família.
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PREPARO DE MEIOS DE CULTURA:
Exemplo de preparação de um meio comum, para organismos aeróbicos, onde as

seguintes etapas devem ser seguidas:
1. Cada ingrediente é pesado e dissolvido no volume de água destilada, conforme a receita do

meio que desejamos preparar.
2. Determina-se o pH do meio fluido, ajustando-o se for necessário, de acordo com o indicado
na receita. Pode-se aferir o pH por meio de indicadores ou de um potenciômetro. Para elevar o
pH ou diminuí-lo , adiciona-se NaOH sol. 1N ou HCl sol. 1N, respectivamente. A reação deve
ser favorável aos microrganismos em estudo, seja ácida (fungos), básicas ou neutras
(bactérias, actinomicetos).
3. O meio é esterilizado em autoclave. Para preparação de meios sólidos, deve ser adicionado
o ágar, um substrato obtido a partir de algas marinhas (Gelidium spp.). O ágar suporta
perfeitamente a autoclavagem a 121oC. Os géis permanecem líquidos acima de mais ou
menos 45oC.
4. O meio é distribuído em recipientes adequados (tubos, frascos), cujas bocas são fechadas
com algodão e cobertas com papel.
5. Caso o meio não seja utilizado no momento, este deve ser armazenado ao abrigo de
contaminações e à temperatura baixa.
ESTERILIZAÇÃO
Esterilização é o processo de remoção ou morte de todas as formas de vida de um

material ou ambiente. É essencial em quase todos os trabalhos em microbiologia. O principal
objetivo na esterilização além de matar as formas de vida é causar o mínimo de danos ao
material que está sendo esterilizado. (Trocas químicas ou físicas nos componentes do meio ou
condições abióticas do meio).
ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a destruição total de todas as formas de vida de um
material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos.
DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos presentes

num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou
local.
ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto,

superfície ou local.
ANTI-SEPSSIA: Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas. Pode ser feita, por
exemplo, através do Clorexidine a 0,12% para anti-sepsia intra bucal.
LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de

desinfecção ou esterilização.
Processos de esterilização:
1) CALOR - a esterilização pelo calor é utilizada para materiais que não sofrem
alterações a altas temperaturas. O calor atua sobre os microrganismos coagulando e oxidando
suas proteínas.
1.1) CALOR SECO - O processo de oxidação das proteínas dos microrganismos(morte)

é resultante da condução do calor ao objeto contaminado. O equipamento utilizado para este
tipo de esterilização é o FORNO DE PASTEUR. Os materiais esterilizáveis são vidrarias
laboratoriais - PLACAS DE PETRI, TUBOS DE ENSAIO, PIPETAS, e materiais metálicos.
Placas e vidrarias devem permanecer no forno por 2 - 4 horas a uma temperatura de 160 - 180
°C.
1.2) CALOR ÚMIDO E PRESSÃO* - Apresenta maior poder de penetração no material

que o calor seco, portanto possui maior poder de esterilização.
* AUTOCLAVAGEM - O aparelho que usa o vapor de água sob pressão regulada,
chama-se AUTOCLAVE. Consiste, essencialmente, em uma câmara de vapor com parede
dupla, equipada com dispositivos que permitem o enchimento da câmara com vapor e sua
manutenção em determinadas temperaturas e pressão por qualquer período de tempo. Em sua
utilização, é absolutamente necessário que o ar existente na câmara seja completamente
substituído por vapor saturado. No entanto, não é a pressão que mata os microrganismos e
sim a temperatura elevada do vapor.
A autoclave é utilizada para esterilizar meios de cultura, tubos para diluição, água em
frascos, soluções, solo + água etc.... Geralmente o autoclave é operado numa pressão de 15
libras por polegada (1 atmosfera = 121oC ), durante 15 ou 20 minutos. Quando o volume de
materiala esterilizar for grande devemos aumentar o tempo de esterilização.
2) FILTRAÇÃO - Consiste na passagem de um fluido através de uma substância porosa

(filtro) com o fim de remover as partículas nele dispersas. Alguns produtos, particularmente os
LÍQUIDOS BIOLÓGICOS (algumas vitaminas , enzimas, antibióticos) são TERMOLÁBEIS, isto
é, são destruídos pelo calor. A opção válida, neste caso, é a esterilização por filtração. O
diâmetro dos poros varia, mas deve ser menor do que 0,45 micra, para evitar a passagem de
microrganismos.
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3) ESTERILIZAÇÃO GASOSA- Utilizada para materiais que não podem ser

esterilizados pelo calor nem pela filtração. A vantagem do método é a capacidade de
esterilizar a temperatura ambiente, entretanto apresenta um custo mais alto e requer um maior
tempo.
4) FLAMBAGEM:
5) IRRADIAÇÃO:
QUESTÕES PARA REVISÃO DOS CONHECIMENTOS - AULAS PRÁTICAS
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia deve
ser capaz de responder as seguintes questões:
1) Um meio chamado “Meio Ágar Nutritivo” contém, entre outras substâncias, o agar
cuja função é fornecer nutrientes aos microrganismos. Afirmação verdadeira ou
Falsa? Comente.
2) Diferencie os termos:
a) esterilização e desinfecção.
b) bactericida e bacteriostático.
3) ....................................... é um processo que mata todas as formas de vida

microbiana.
4) Um agente que mata todas as formas vegetativas de microrganismos mas não

necessariamente as formas esporuladas é denominado .................................... .
5) Afirmação verdadeira ou falsa:

( ) uma substância ou processo que mata ou inibe o desenvolvimento de
microrganismos é chamado de agente antimicrobiano.
( ) o sufixo -cida refere-se aos agentes que matam os microrganismos.
( ) o sufixo o sufixo –stático refere-se aos agentes que inibem os microrganismos.
( ) as bactérias na sua forma vegetativa são mais susceptíveis ao calor em relação
às suas formas esporuladas.
( ) o aparelho que utiliza vapor sob pressão é denominado Forno de Pasteur.
( ) o aparelho que utiliza calor seco é denominado autoclave.
( ) bactérias do gênero Bacillus são formadoras de endosporos o que lhes confere
grande resistência ao calor elevado. Células vegetativas deste Bacillus são
destruídas a 82o C.
( ) a exposição de materiais contaminados a água fervente é provável que
possibilite uma desinfecção mas não esterilização.
( ) a esterilização de pequenos objetos (tubos de ensaio contendo meio de cultura)
pela autoclavação pode ser realizado a 121oC por 15 minutos.
6) A esterilização de vidrarias de laboratório pelo calor seco requer uma temperatura

de pelo menos .............. oC por .............. minutos.
7) Qual método de esterilização é apropriado para:

a) bandeja com morangos?
b) Meio ágar nutriente?
c) Vidrarias?
d) Alça de platina?
e) Solução de vitaminas sensível ao calor?
f) Condimentos enlatados?
8) Três culturas bacterianas de Bacillus sp., Pseudomonas sp. e Clostridium foram

aquecidas em água fervente durante dez minutos. Provavelmente qual dos cultivos
está esterilizado? Porque para as demais isso é menos provável?
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9) Algumas bactérias podem viver com poucas substâncias ..................................
como seu único requerimento nutricional, enquanto outras bactérias requerem
substâncias .................................... complexas. (orgânicas/inorgânicas).
10) O crescimento de microrganismos em laboratório é denominado cultivo:

(a) in vitro; (b) in vivo; (c) in situ; (d) in utero.
11) Os principais elementos químicos para o crescimento celular incluem

..................................., ..............................., hidrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo.
12) Para que tipo de microrganismos os compostos orgânicos servem como uma fonte
de energia e como uma fonte de carbono na síntese das unidades estruturais?
(a) Autotróficos; (b) heterotróficos; (c) fixadoras de nitrogênio; (d) bactérias
halofílicas; (e) bactérias barofílicas.
13) Os ......................................são os organismos que fazem uso de dióxido de carbono

como sua fonte principal de carbono. (autotróficos / heterotróficos)
14) Qual dos seguintes itens representa mais precisamente a principal fonte de carbono
usada pelos heterotróficos?
(a) dióxido de carbono; (b) somente açúcar; (c) somente aminoácidos; (d)
compostos orgânicos; (e) compostos inorgânicos.
15) Indique se a afirmação é verdadeira ou falsa:

( ) O processo pelo qual algumas bactérias utilizam nitrogênio gasoso como uma
fonte de nitrogênio para a célula é chamado de fixação de nitrogênio.
( ) O processo de fixação de nitrogênio consiste na conversão de N2 a NH3.
16) O nitrogênio é um elemento essencial dos ................................., que são unidades

estruturais das proteínas.
17) Os ........................................... contam com os compostos químicos para obter

energia, enquanto os fototróficos dependem de ..................................... para obter
energia.
18) Se a composição química exata de um meio é conhecido, o meio pode ser descrito
como:
(a) complexo; (b) enriquecido; (c) seletivo; (d) quimicamente definido; (e)
diferencial.
1. DISTRIBUIÇÃO DE MICRORGANISMOS
Embora os microrganismos estejam presentes em todos os locais, não é fácil

demonstrar a sua presença por observação microscópica direta se estes não se encontrarem
em grandes números. Se um meio de cultura esterilizado for exposto ao ar ou inoculado com
amostra de materiais como solo, água e leite, os microrganismos adicionados juntos a estes
materiais, caso as condições de meio e incubação forem satisfatórias, poderão ser observados
macroscopicamente, pela formação de COLÔNIAS.
COLÔNIAS -
Para provar a hipótese de que microrganismos estão presentes em um ambiente

específico, é necessário que o material e equipamentos, inclusive os meios de cultura, estejam
esterilizados e também que TÉCNICAS ASSÉPTICAS (evitar contaminação) sejam
empregadas quando realizamos as inoculações e/ou transferências. O exercício ilustrará a
ampla distribuição microbiana e introduzirá o aluno aos procedimentos assépticos comuns, mas
de extrema importância para pessoas ligadas ao ramo microbiológico.
MATERIAL:
- Meios de cultura esterilizados. (Fórmulas estão no final deste capítulo).
- Placas de Petri esterilizadas
- Pipetas esterilizadas
- Tubo de ensaio com água esterilizados
- Amostra de solo, água, ar, etc.
PROCEDIMENTO;
Trabalhar em grupos. Discutir o procedimento entre o grupo, até entenderem o que
deve ser feito e os objetivos.
1. Desenrolar as placas de Petri. Não abrir para não contaminar. (abrir somente no momento
certo, ou seja, na hora de derramar o meio de cultura).
2. Rotular a placa com o nome do grupo, material inoculado, meio (use a placa que vai receber
o meio, ou seja, a parte de baixo da placa).
3. Colocar nas placas o material sendo analisado para presença de microrganismos. (use
técnicas assépticas). Espalhar a amostra para dispersar os micróbios.
4. Incubar as placas invertidas (de cabeça para baixo para evitar dessecamento).
5. Os microrganismos que aparecerem nestas placas serão observados na próxima aula.
* Controle: Pegar uma placa com meio de cultura e incubar. Esta placa não pode apresentar
microrganismos após a incubação, pois não foi colocado inóculo.
Meio de cultura para bactérias: Agar nutritivo

Composição:
- Peptona...............................................5g
- Extrato de carne..................................3g
- Glicose................................................5g
- Agar...................................................15g
- Água destilada.............................1000ml
Meio de cultura para fungos: BDA (batata-dextrose-ágar)

Composição:
- Batata...............................................200g
- Dextrose(açúcar)................................20g
- Agar....................................................15g
- Água............................. ...............1000ml
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Método para preparar um litro de meio de cultura (BDA):

1) Cozinhar 200g de batata em um litro de água até ponto de maionese;
2) Filtrar a batata e aproveitar o decoto completando com água até 1000ml;
3) Em um erlenmeyer de 2 litros colocar 20g de açúcar, 16g de agar e 50 mg de sulfato de
estreptomicina.
4) Colocar no erlenmeyer o decoto (água da batata) junto com o açúcar, agar e estreptomicina;
5) Misturar os componentes;
6) Esterilizar o meio em autoclave por 20 minutos;
7) Distribuir o meio autoclavado em placas de Petri previamente esterilizadas na câmara de fluxo.
Obs.: O meio deve ser distribuído a uma temperatura de aproximadamente 50-60oC.
O MUNDO DOS MICRÓBIOS: EXAME MICROSCÓPICO DE INFUSÕES DE FENO

O mundo microbiano contém uma vasta variedade de criaturas. O objetivo deste
experimento é introduzir o estudante à apreciação do tamanho, morfologia e ecologia de algas,
protozoários, fungos e bactérias. Micróbios são organismos de tamanho muito pequeno,
quando comparados a organismos visíveis a olho nu. São também em sua maioria
constituídos por uma só célula (unicelulares), não chegando a formarem tecidos diferenciados,
o que dificulta a sua observação, sendo a sua visualização somente possível com o uso de
microscópios. VOCÊ CONSEGUE IMAGINAR UM MICRORGANISMO? Apesar de seu
pequeno tamanho o observador nunca deve esquecer que micróbios são tridimensionais, ou
seja, possuem largura, comprimento e altura. As bactérias em forma de coccus, por exemplo,
são como uma bola de futebol em miniatura, a diferença é que na célula ao contrário do ar na
bola de futebol, nós temos água, e nesta água, estão dissolvidas muitas proteínas (com
funções enzimáticas ou não), o material genético (DNA) também está boiando neste líquido, os
ribossomos e outras estruturas necessárias ao crescimento celular estão todos dispersos neste
líquido celular. Apesar de seu pequeno tamanho são poderosos, por sintetizarem enzimas em
seu interior que permitem a decomposição e reciclagem de muitos elementos (C,H,O,N,P,S, e
muitos outros) que fazem parte de moléculas orgânicas como a celulose e lignina presentes em
todos os vegetais. Muitos tipos diferentes de microrganismos crescem e se multiplicam na
natureza quando existe disponibilidade adequada de alimentos e água e quando a temperatura
é apropriada.
Um grande número e tipos diferentes de microrganismos irão se desenvolver em uma
infusão de feno (grama cortada ou feno, colocados em água e deixando parado por um período
de tempo, podendo esta infusão ser colocada em presença de luz ou não). Certas bactérias
podem absorver as substâncias solúveis do feno enquanto outros podem participar na
decomposição ativa e solubilização das frações não solúveis, tais como proteínas grandes e
polissacarídeos, celulose e lignina. Conseqüentemente, o número e os tipos de organismos
presentes podem variar com diferentes infusões e tempo de incubação. A medida que as
populações de bactérias e leveduras (decompositores primários) aumentam, o número de
protozoários (consumidores primários) aumenta, pois estes se alimentam de bactérias.
O tipo de atividade metabólica (aeróbica, facultativa ou anaeróbica) de organismos
heterotróficos, particularmente de bactérias saprofíticas, continua até que todos os compostos
orgânicos sejam mineralizados. Neste meio tempo, se a infusão é deixada na luz, organismos
fotossintéticos, particularmente cianobactérias (“algas-verde-azuladas”) e clorophyta (algas
verdes) começam a se multiplicar rapidamente. Estes organismos são fotoautotróficos, pois
utilizam a luz como fonte de energia e usam o gás carbônico (CO2) do ambiente, como fonte de
carbono para fazer células, ao invés de carbono orgânico, tais como carboidratos e
aminoácidos. Conseqüentemente eles são considerados como produtores primários
(convertem CO2 para carbono orgânico). Eventualmente estes morrem e seu “tecido” é
decomposto, liberando material orgânico celular para bactérias heterotróficas e o ciclo
continua. Esta imensa e complicada cadeia alimentar, com produtores, decompositores e
consumidores, é chamado de ECOSSISTEMA.
Enquanto alguns micróbios na infusão de feno são imóveis, outros são ativamente
móveis. Eles possuem controle no seu movimento, facilitado por flagelos, cílios, e alguns
micróbios se movem por arraste. O flagelo e cílios de protozoários e algas eucarióticas podem
ser vistos em microscopia, mas os flagelos de bactérias não são visíveis uma vez que o seu
tamanho está bem abaixo do poder de resolução do microscópio comum.
Para estudar os micróbios presentes em uma infusão de feno é necessário fazer

montagens de lâminas úmidas. O procedimento para fazer estas preparações é bastante
simples:
Ø Use uma pipeta de Pasteur para pegar uma amostra de material das bordas da
superfície de folhas e talos e também do fundo do vidro com a infusão de feno.
Coloque uma gota do material coletado em uma lâmina de microscópio.
Ø Cubra a gota de material com uma lamínula evitando ao máximo deixar bolhas de ar
sob a lamínula. Se um excesso de fluído escapar pelas bordas da lamínula, este deverá
ser removido com o auxílio de papel absorvente. A lamínula pode ser selada com cera
ou vaselina para prevenir a evaporação de água e dessecação; a evaporação desigual
poderá causar movimentos de massas de células no campo visual durante a
microscopia.
Ø Examine a montagem úmida sucessivamente sob baixos e altos aumentos e se
disponível use a objetiva de imersão com óleo. Compare os tamanhos relativos e
diferentes formas de bactérias, algas e protozoários, etc... Consulte as ilustrações nas
páginas seguintes e tente identificar membros dos principais grupos de microrganismos.
Utilize as ilustrações fornecidas abaixo e tente identificar as criaturas que observares:

· Células grandes, não pigmentadas e com movimentos são normalmente protozoários.
· Células esverdeadas, com movimentos ou paradas são ou cianobactérias.
· Células grandes com núcleos visíveis e cloroplastos e flagelos são algas eucarióticas.
· Cianobactérias procarióticas podem ser verde azuladas, pretas rochas ou vermelhas e
são menores do que as algas. Muitas espécies de cianobactérias são filamentosas e
móveis por movimentos de arraste.
· Bactérias são células pequenas, sem cor, móveis ou estacionárias dependendo da espécie
e com várias morfologias e agrupamentos celulares. Nos agrupamentos cada célula é um
organismo independente.
· Fungos são os micróbios de mais fácil observação em ambientes terrestres embora
ocasionalmente poderão aparecer hifas e micélios na parte superior da infusão, pois são
microrganismos que crescem mais próximos à fonte de oxigênio.
· Organismos sem cor, grandes em tamanho, que exibem um grau de diferenciação em
tecidos são invertebrados microscópicos que podem aparecer na infusão. Eles
apresentam sistemas bem desenvolvidos, exemplificando, sistema digestivo, sistema
excretor e órgãos de reprodução todos em nível microscópico.
14
FIGURA 1. Morfologia e agrupamento de bactérias. Características morfológicas

celulares:
1. Célula vegetativa - formas:
2. Agrupamento de células
3. Esporângio - célula com esporos
4. Endósporos
a) forma:
b) Localização:
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Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia deve
ser capaz de responder as seguintes questões:
1) Por que adicionamos cada um dos ingredientes acima no meio?
2) Qual a função de cada componente?
3) A massa de células crescendo sobre uma superfície sólida e que se torna visível a
olho nu é denominada ............................................................
5) Um microrganismo foi isolado de um lago e há uma diferença de opinião entre os

integrantes do laboratório, se ele deve ser classificado com as algas ou com os
protozoários. Sabendo que um grupo de organismos apresenta um conjunto de
características comuns e outras particularidades que o distingue dos demais, como
você pode justificar os diferentes pontos de vista?
6) No cultivo de microrganismos pela técnica de “Spread Plate” ou placa derramada, o

meio de cultura previamente dissolvido em forno de microondas, água quente ou
autoclave deve ser vertido nas placas quando sua temperatura está entre 45 e
50oC. Por quê?
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2. ENRIQUECIMENTO, ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DE

CULTURAS MICROBIANAS
Raramente um ambiente natural contém somente um tipo de microrganismo. Na

maioria dos casos, uma grande variedade de micróbios está presente, e é tarefa do
microbiologista, desenvolver métodos e procedimentos que irão permitir o isolamento de
culturas puras de microrganismos de interesse. Nos métodos de enriquecimento de culturas,
meios apropriados e condições de incubação, são utilizados os quais são seletivos para o
organismo desejado, e as quais são inibitórias ou contraseletivas, para micróbios indesejados.
Nos últimos 100 anos, muitos progressos foram feitos e temos uma grande variedade de meios
e condições de incubação que nos permitem isolar muitas populações de micróbios da
natureza. Inóculo - é a fonte de onde queremos isolar o microrganismo. Pode ser uma
amostra de alimento, uma amostra de solo, um tecido necrosado de plantas, um nódulo de
plantas, uma amostra de água etc. Dependendo do material que estamos trabalhando, e com
um conhecimento das populações que possivelmente estejam presentes neste habitat, teremos
uma idéia dos meios e das condições de incubação a serem usadas.
MÉTODO DAS ESTRIAS EM PLACAS
Para a separação de populações misturadas, em isolados simples ou culturas puras,

podemos utilizar o método das estrias. O primeiro passo para se ter sucesso, é selecionar o
meio de cultura mais apropriado para o crescimento do organismo sendo pesquisado. O
segundo passo, são as condições de incubação, por exemplo, escolha da temperatura correta,
presença ou ausência de oxigênio, atmosfera em que a placa vai ser incubada.
As seguintes etapas são utilizadas neste método:
1. Escolher, a colônia ou organismo a ser purificado.
2. Esterilizar a alça de platina na chama, até ficar vermelha.
3. Esperar alguns segundos para a platina esfriar
4. Retirar uma amostra da colônia.
5. Realizar a primeira estria na placa.
6. Esterilizar a alça de platina na chama até ficar vermelha.
7. Esperar alguns segundos para a platina esfriar.
8. Realizar a segunda estria na placa.
9. Esterilizar a alça de platina na chama até ficar vermelha.
10. Esperar alguns segundos para a platina esfriar.
11. Realizar a terceira estria na placa.
12. Incubar as placas até o aparecimento de colônias.

13. Uma nova purificação pode ser feita, após esta primeira purificação, para se ter certeza que
temos uma cultura pura, ou seja, uma cultura onde somente uma espécie de microrganismo
esteja presente.
MANUTENÇÃO DE CULTURAS PURAS EM LABORATÓRIO E EM BANCOS DE

CULTURAS
Meio de cultura sólido
Meio de cultura líquido
Culturas liofilizadas
Congelamento em glicerol (Freezer)
Temperatura (-20 0C)

Temperatura (-80 0C)
BANCOS DE CULTURAS
AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION (ATCC)

Maior coleção de isolados microbianos do mundo.
Inclui bactérias que causam doenças, patogenias de plantas etc... Qualquer bactéria isolada e
publicada em trabalho científico deve ser enviada uma amostra para este banco de culturas.
Tem ligação com o Manual de Bergey.
Alemanha
Comunidade Européia
MIRCEN (Microbial Resource Center)

Bancos de culturas de Rhizobium, patrocinados pela FAO.
4 no Mundo.
Em Porto Alegre, na FEPAGRO, está localizado o Banco para a América Latina.
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QUESTÕES PARA REVISÃO DOS CONHECIMENTOS
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia
deve ser capaz de responder as seguintes questões:
1. Qual o princípio do método das estrias? Qual sua utilidade?
2. O que é uma cultura pura?
3. Quais as aplicações ou usos para as seguintes técnicas de cultivo: placa

derramada (“pour plate”) e placa esparramada (“spread plate”)?
4. Os microrganismos, em ambientes naturais, usualmente ocorrem em culturas

..............................................
5. Antes de poder caracterizar e identificar uma espécie de microrganismo, ele

deve ser isolado como uma .............................................................
6. Uma cultura de microrganismos na qual todas as células derivaram de uma

mesma célula parental é denominada cultura
....................................................................... Como você poderia chegar a uma
cultura de células de bactérias fixadoras de N a partir de uma amostra de solo?
7. Qual a vantagem da forma de manutenção de microrganismos em meio de

cultura sólido em relação ao meio líquido?
8. Quais os problemas potenciais decorrentes da manutenção de microrganismos

na forma de meio de cultura líquido?
9. Um processo para manutenção de culturas que envolvem congelamento e

secagem da cultura é chamado de
...........................................................................
10. As culturas liofilizadas perdem gradativamente a viabilidade?
11. Quais as três condições do meio liofilizado que permitem a conservação da

viabilidade das células por longo período?
12. Qual a condição ambiente do meio de cultura de manutenção sólido e líquido

que permite a sobrevivência das células por 1 a 8 meses?
13. Qual a forma de manutenção de microrganismos adotada pelo ATCC? É esta

uma forma adequada para manutenção das características genéticas do
organismo?
14. Marque V ou F, e corrija se falsa:

(__) ATTC é uma organização com fins lucrativos que mantém uma coleção de
culturas de microrganismos apenas.
(__) ATTC é o maior banco de culturas de microrganismos no mundo.
(__) MIRCEN, instituição ligada a UNESCO, congrega vários centros de
conservação de microrganismos, inclusive a MIRCEN da FEPAGRO(Porto
Alegre) que abriga uma coleção de culturas de Rhizobium.
15. A liofilização é um método para caracterização dos microrganismos:

verdadeiro(v) ou falso(f)?
16. O que determina a escolha do método de manutenção de algum microrganismo?
17. Como se pode definir um meio de manutenção ideal?
18. Cite aplicações práticas dos cultivos de enriquecimento.

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3. COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS PARA MICROSCOPIA
As técnicas de microscopia permitem a visualização de células microbianas a partir de

uma amostra ambiental ou de uma cultura de microrganismos. Normalmente faz-se necessária
a aplicação de um corante às células para que estas possam ser visualizadas ao microscópio
óptico. A microscopia óptica é amplamente utilizada na pesquisa e ensino, possibilitando
grande diversidade de técnicas de observação, onde podemos destacar as de fluorescência,
bem como de campo escuro, contraste de fase, ultravioleta, etc..
PREPARO DO ESFREGAÇO PARA COLORAÇÃO

Preparações de bactérias para coloração são mais satisfatórias quando a amostra do
material é obtida do crescimento de organismos provenientes de superfícies de placas de Agar,
tubos ou de culturas líquidas emulsificadas até uma turbidez leve em água destilada ou água
de torneira esparramadas, em uma lâmina livre de gorduras.
PROCEDIMENTO:
Ø Coloque uma gota de água em uma lâmina limpa (livre de graxa). Com uma alça de platina
esterilizada transfira uma pequena amostra do crescimento para a gota de água e esfregue
a alça com a cultura em movimentos circulares até o material formar uma suspensão turva
homogênea.
Ø Espere até este filme microbiano secar naturalmente e fixe-o na lâmina por calor. Passe a
lâmina sobre um bico de bunsen várias vezes por 1 a 2 segundos (cuide para não aquecer
demais). Fixação deficiente (quando a cultura é lavada da superfície da lâmina, se
colocada sob torneira pingante). Fixação excessiva (as células romperão ou ficarão
distorcidas) não permite uma fácil observação. A seguir, deixe a lâmina esfriar e aplique o
corante.
COLORAÇÃO SIMPLES
O esfregaço é corado com solução de somente um corante (Ex: solução cristal violeta
1%; solução de azul de metileno 1%; solução de safranina, 0,5%, etc.) onde todas as células
adquirem a mesma coloração e não há diferenciação entre tipos de células ou estruturas
celulares.
TÉCNICA:
1. Prepare e fixe um esfregaço do organismo a ser corado (orientação anterior).
2. Cubra o esfregaço com solução corante e permita reagir por 1-2 minutos.
3. Lave o excesso da tintura com água pingante de torneira e seque em mata-borrão
(entre folhas de papel jornal).
4. Observe em microscópio (sem uso da lamínula).
5. Para usar a objetiva de 100X coloque uma gota de óleo de imersão sobre o material.
IMPORTANTE: Somente a objetiva de 100X foi fabricada para ser usada com óleo. Não
coloque óleo quando estiver usando as outras objetivas.
COLORAÇÃO DE GRAM
A coloração de Gram é uma das mais úteis colorações diferenciais em bacteriologia. O

efeito diferencial causado por esta coloração é acreditado ser causado por diferenças
fundamentais existentes na estrutura e composição química das paredes celulares bacterianas.
A cultura a ser corada por este princípio deve ser preferencialmente jovem (12-18 horas) e
obtida de crescimento em meio livre de açúcares (pode ser usado o meio Agar nutritivo).
Solução I: solução aquosa 1% cristal violeta.
Solução II: solução aquosa 2% iodina (Lugol).
Solução III: 2% acetona e álcool 95%.
Solução IV: 2,5% safranina em etanol (uma parte) e água (9 partes).
PROCEDIMENTO:
Ø Prepare e fixe um esfregaço de uma cultura jovem (12-18 horas), (de acordo com a
orientação anterior).
Ø Cubra o esfregaço com cristal violeta (solução I). Deixe a tintura reagir por 1 minuto. Lave o
excesso de tintura sob torneira pingante com uma quantidade mínima de água.
Ø Cubra o filme com iodina (Lugol) (solução II). Deixe reagir por 1 minuto. Lave o excesso de
tintura sob torneira pingante com uma quantidade mínima de água.
Ø As células bacterianas devem ser descoloridas com álcool (solução III) inclinando a lâmina
sobre a pia e pingando a solução III sobre o esfregaço até que os pingos saiam sem cor de
corante. Lave com água pingante de torneira.
Ø Cubra o esfregaço com safranina (solução IV) por 1 minuto (pode ser usada Fucsina no
lugar de safranina). Lave sob torneira e seque em mata-borrão (entre folhas de jornal).
Examine sob imersão (objetiva 100), sem o uso de lamínula com luz máxima para distinguir
cores. Células Gram positivas têm coloração azul e Gram negativas têm coloração
vermelha ou rosada. Resultados "confiáveis" podem ser obtidos durante o crescimento
ativo das culturas bacterianas (culturas jovens). Culturas velhas podem resultar em
dificuldades para quem estiver observando-as.
E Cada aluno poderá fazer uma lâmina e os outros (do grupo) utilizarem o mesmo material
para observação. Procurem fazer coloração com colônias que tenham características
diferentes. Observem a forma da bactéria e a sua coloração de Gram.
Forma da bactéria:
(_) bastonete
(_) coccus
(_) espirilo
(_) vibrio
Reação de gram:
(_) gram +
(_) gram -
Forma da bactéria:
(_) bastonete
(_) coccus
(_) espirilo
(_) vibrio
QUESTÕES
Reação de gram:PARA REVISÃO DOS CONHECIMENTOS
(_) gram +
(_) gram -
1. Qual a finalidade (objetivo) de corar microrganismos?
2. Qual o princípio da técnica da coloração de gram?
3. Na técnica de coloração de gram, por que algumas bactérias se coram de vermelho e outras de azul?
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4. Qual é a função do álcool e acetona como reagentes na técnica da coloração de gram?
4. TESTES BIOQUÍMICOS
Em bacteriologia, quando se deseja identificar uma bactéria isolada e de classificação

desconhecida, os seguintes procedimentos podem ser empregados:
Ø Caso o meio seja seletivo para um gênero específico, este pode ser isolado pela
seletividade da fonte de energia. Tomando-se como exemplo as bactérias nitrificadoras,
elas poderão ser isoladas utilizando-se um meio de cultura contendo somente NH4+ e uma
solução de sais. Já os fixadores assimbióticos de nitrogênio poderão ser isolados pelo
enriquecimento do meio com um composto carbonado (açúcar) e ausência completa de
qualquer fonte de nitrogênio.
Ø Quando vários grupos de bactérias podem crescer no meio sendo utilizado, a
caracterização de gêneros específicos pode ser efetuada, após o isolamento em cultura
pura, através de TESTES BIOQUÍMICOS. Estes testes avaliam respostas fisiológicas
características a cada grupo de bactérias.
TESTE DA CATALASE
A enzima catalase, presente em aeróbicos e anaeróbicos facultativos (exceto os ditos

aerotolerantes), catalisa a liberação de O2 a partir de peróxido de hidrogênio (H2O2). A
atividade desta enzima pode ser detectada adicionando-se pequenas quantidades de H2O2 à
cultura e observando a formação de bolhas de gás, indicativo da liberação de O2. A cultura
deve ser crescida em um TAI (tubo de agar inclinado) o qual tenha sido fortemente inoculado,
para que uma densa massa seja obtida. Coloque o tubo em ângulo inclinado e derrame 1 ml de
peróxido de hidrogênio a 3% sobre a massa de células. Observe a imediata formação de
bolhas de gás. A enzima está presente dentro das células em qualquer fase do crescimento e
não é uma enzima de função catabólica-anabólica, mas sim de proteção.
Um procedimento alternativo pode ser usado para testar catalase a partir de colônias
simples isoladas em placas de agar:
Ø Coloque uma gota de H2O2 a 30% sobre uma lâmina de microscópio limpa.
Ø Com uma alça de platina colete a massa celular da colônia a ser testada e emulsifique
na H2O2.
A formação imediata de bolhas é indicativo da presença da catalase.
TESTE PARA REDUÇÃO DE NITRATO (formação de nitrito e N2) - Respiração anaeróbica
Algumas bactérias (e somente bactérias) têm a habilidade de utilizar compostos

diferentes do oxigênio molecular como aceptor final de elétrons durante o metabolismo
oxidativo. Algumas espécies utilizam o nitrato (NO3-) reduzindo-o a nitrito (NO2-) ou a nitrogênio
molecular (N2), dependendo da espécie bacteriana.
Um meio (meio 4) contendo uma pequena quantidade de nitrato de potássio e um tubo
de Durham é inoculado com a bactéria teste. Após a incubação (24 - 48 horas), o teste para
nitrito é efetuado adicionando-se 5 gotas do reagente ácido acético sulfanílico e uma mesma
quantidade de gotas do reagente alfa naftilamina à cultura. Se nitrito estiver presente, uma cor
rosa-avermelhada aparecerá imediatamente. A presença de nitrogênio gasoso pode ser
detectada examinando-se o tubo de Durham.
A reação específica para a formação da cor (presença de nitrito) é a seguinte:
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NH2
N=N
NO2- + +
SO3 NH2 SO3H NH2
ácidoHsulfanílico α-naftilamina p-sulfobenzeno-azo-α-naftilamina

(vermelho)
Testes negativos sempre devem ser confirmados adicionando-se pequenas

quantidades de zinco em pó aos tubos. O zinco irá reduzir o nitrato a nitrito e a cor vermelha
aparecerá. Se isto não acontecer (ausência de cor vermelha), provavelmente todo o nitrato foi
reduzido a gás nitrogênio.
Reagentes:
a. Reagente ácido acético sulfanílico b. Reagente Alfa naftilamina
Ácido sulfanílico 8g Alfa naftilamina 6,3 g
Ácido acético glacial 286 g H2SO4 concentrado 10 ml
Água destilada . 714 ml Água destilada 1.250 ml
S CUIDADO: Alfa Naftilamina é carcinogênica
TESTE DE VOGES-PROSKAUER
Testa a produção de acetoína ou 2-3-butanediol

Durante o processo metabólico de degradação da glicose, certas espécies bacterianas
convertem produtos ácidos em produtos neutros como 2-3-butanediol ou acetoína (acetil-metil-
carbinol).
NADH NAD+ CH3
COOH COOH CO2
+
NAD NADH
H2
C6H12O6 C=O HCOH C=O
CH3COOH
CH3 CH3 HCOH
Piruvat Lactato
CH3
Aceteil metil carbim
(Acetoína)
A determinação destes produtos finais neutros de fermentação é importante para
diferenciar espécies produtoras de ácido (aquelas que produzem muito ácido e aquelas que
produzem pouco ácido).
Um meio contendo glicose + peptona (meio 3, MR - VP) é inoculado com a bactéria
teste até um bom crescimento ser obtido (no mínimo dois dias). Uma sub-amostra de 2,5 ml da
cultura é tratada com 0,6 ml de alfa naftol e 0,2 ml de KOH. Agitar para aeração. Se acetoína
ou 2-3-butanediol forem produzidos pela cultura bacteriana, a aeração na presença de álcali irá
produzir um diacetil o qual por sua vez reagirá com a peptona para produzir uma cor rosa-
avermelhada. O alfa naftol é adicionado para melhorar o aparecimento da cor. Espere pelo
menos 15 a 20 minutos antes de tomar a decisão quanto ao resultado do teste.
Reagentes:
a) alfa naftol: b) KOH
alfa naftol 50 g KOH 400g
etanol (95%) 1000 ml ml Água destilada 1000
As reações que resultam no desenvolvimento da cor rosa avermelhada são esquematizadas

abaixo:
CH3 CH3
HCOH C=O
HCOH
HCOH
CH3 CH3
2-3 butanediol acetoína
ar (agitação)
CH3
C=O + peptona + α naftol

diacetil (cor rosa avermelhada)
C=O
CH3
TESTE DO VERMELHO DE METILA

O mesmo meio de glicose + peptona (MR - VP) usado para o teste de Voges-Proskauer
pode ser usado para esse teste. O tubo é inoculado com a bactéria teste e incubado por no
mínimo dois dias. Após este período, 5 gotas de vermelho de metila são adicionadas a uma
alíquota de 2,5 ml da cultura. Não misture. Organismos produtores de alta acidez (pH inferior a
4,4) farão com que o vermelho de metila torne-se vermelho. Organismos que produzem
produtos neutros (como por exemplo acetoína) tornam o meio menos ácido, resultando num
teste negativo, de coloração alaranjada ou amarela. Esse teste deve ser lido após 20 minutos.
Reagentes:
Vermelho de Metila
Vermelho de metila 0.1 g
Etanol a 57% 500 ml
TESTES PARA ENZIMAS EXTRACELULARES (EXOENZIMAS)
Exoenzimas são liberadas por microrganismos nos meios de cultura e são

responsáveis pela conversão de compostos orgânicos com alto peso molecular (tais como
proteínas, amido e graxas) em pequenas unidades as quais podem ser transportadas para o
interior das células. Exoenzimas são hidrolíticas pelo fato de utilizarem água para quebrarem
compostos orgânicos complexos em subunidades pequenas.
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Para detectar a presença de enzimas extracelulares, uma placa de meio de cultura

contendo compostos orgânicos complexos é inoculada com uma estria simples central
usando a bactéria teste. Após o período de incubação, reagentes apropriados são adicionados
na placa para detectar o desaparecimento do composto orgânico na área circunvizinha ao
crescimento bacteriano. Um procedimento alternativo consiste em procurar pelo aparecimento
de certos subprodutos resultantes da quebra enzimática.
TESTE DA AMILASE (digestão do amido)
Após o período de incubação, as placas são inundadas com a iodina de Gram, a qual
reagirá com o amido não atacado desenvolvendo uma coloração azul. Bactérias amilase
positiva, apresentarão uma zona incolor próxima ao crescimento bacteriano nas placas.
TESTE DA CASEINASE (digestão da caseína)
Após o período de incubação, as placas são inundadas com HCl 1% o qual precipitará
qualquer caseína remanescente, deixando uma zona clara ao redor do crescimento bacteriano,
se caseinase for produzida.
TESTE DA GELATINASE (digestão da gelatina)
Após a incubação as placas são inundadas com uma solução constituída de 15 g de

HgCl2 + 20 ml de HCl conc. em 100 ml de H2O. A gelatina não hidrolisada irá formar um
precipitado. Gelatina hidrolisada ao redor do crescimento bacteriano formará uma zona clara.
Um procedimento alternativo envolve a inoculação em tubo com gelatina nutriente. Após
a incubação, o tubo é resfriado em um banho de gelo para solidificar a gelatina não hidrolisada.
Qualquer grau de liquefação notado após o resfriamento (um tubo não inoculado pode servir
como controle) é evidência de hidrólise da gelatina.
RELAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS NOS DIFERENTES TESTES

BIOQUÍMICOS
Meio 1: Agar nutritivo (Catalase) Meio 2: Nutritivo com amido-Agar

Peptona (Amilase)
5g Peptona
Extrato de carne 3g
3g Extrato de levedura
Agar 3g
15 g Amido solúvel
Água destilada 1000 2g
ml Agar
* Ajustar o pH em 6,8 16 g
Água destilada 1000
ml
KNO3
Meio 3: MR - MP 1g
(Vermelho de metila - Vogues Água destilada
Proskauer) 1000 ml
Peptona Agar
5g 1,7 g
Glicose Meio 5: Agar caseinato de sódio
5g (Caseinase)
NaCl Caseinato de sódio
5g 2g
Água destilada 1000 Extrato de levedura
ml 2g
S Para bactérias que não pertençam ao Glicose
gênero Bacillus trocar o NaCl pelo 1g
K2HPO4. Ajustar o pH do meio em 6.9 . K2HPO4
Esterilizar a 1210C durante 10 minutos. 0,2 g
MgSO4
0,2 g
FeSO4
Meio 4: Caldo - nitrato (Redução de traços
nitrato) Agar
Triptona 15 g
10 g Água destilada
Extrato de levedura 1000 ml
5g
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da

Agronomia deve ser capaz de responder as seguintes questões:
1) Relacione rotas catabólicas x organismos:
A) Glicólise, Ciclo de Krebs/Cadeia Respiratória com resp. aeróbica.
B)Glicólise, Ciclo de Krebs/Cadeia Respiratória com resp. anaeróbica.
C) Glicólise
( ) Microrganismos, plantas e animais.
( ) Algumas bactérias e fungos.
( ) Algumas bactérias.
2) Se um solo for submetido a uma condição de anaerobiose (imagine uma lavoura de arroz que
foi submetida a alagamento) que tipo de metabolismo irá predominar: respiração aeróbica,
anaeróbica ou fermentação? Justifique.
3) O tipo de metabolismo é determinado pelos fatores ambientais (presença/ausência de oxigênio
ou outros compostos oxidados) e pelas particularidades da espécie de microrganismo (fator
genético) que estiver no meio. Num meio livre de oxigênio, quando ocorre fermentação e
quando ocorre respiração anaeróbica?
4) Qual a diferença entre um microrganismo que faz respiração anaeróbica e outro que faz
fermentação quanto às rotas? Quais são os produtos finais? Qual das rotas é mais energética e
por quê?
5) Você aprendeu que o teste da catalase não é eficiente para diferenciar microrganismos que
cresceram nas placas de Petri, pois todos tinham a habilidade de crescer em meio aeróbico
(caso contrário não haveria crescimento). Você observou também que Pseudomonas
aeruginosa e Escherichia coli diferiram notadamente em termos de produção da enzima
catalase, sendo que a segunda produziu menos. Qual é a particularidade do metabolismo (fator
genético) desta espécie que possivelmente seja a causa desse comportamento?
6) Nas rotas de catabolismo (degradação) o O2, cuja presença no meio é indispensável para que
se processe a cadeia respiratória (aceptor final de e-), é também aceptor intermediário de e-
levando à formação de compostos tóxicos (e letais) à própria célula. Pergunta-se:
- Se microrganismos anaeróbios facultativos estiverem crescendo em meio aeróbico (com
oxigênio) haverá formação de produtos tóxicos derivados do oxigênio? E se estiverem
crescendo em um meio completamente anaeróbio (como as metanogênicas em um
biodigestor)?
- Fermentadores estritos como as bactérias metanogênicas não toleram a presença de
oxigênio no meio. Porque as bactérias do ácido láctico(fermentadoras) podem crescer em
meio com O2? Há um fator genético envolvido?
- Os aeróbicos e anaeróbicos facultativos produzem as seguintes enzimas detoxificantes:
...........................e ............................ .
- As bactérias do ácido láctico produzem as enzimas......................... e ....................... .
- Os anaeróbicos obrigatórios não possuem nenhuma enzima de proteção para os compostos
tóxicos derivados do oxigênio. Por quê?
7) O teste de Vermelho de Metila – Voges Proskauer é um teste típico para avaliar organismos
fermentadores. Que particularidade do metabolismo destes microrganismos que é avaliado
neste teste?
8) Somente bactérias apresentam a capacidade de fazer respiração anaeróbica. Nesse tipo de
metabolismo ao invés de o aceptor final de e- ser o O2, a célula bacteriana usa íons como NO3-
(nitrato), SO4-- (sulfato) ou Fe+++ (ferro oxidado) como aceptor. Se o aceptor for o nitrato ele será
reduzido a formas não assimiláveis pela planta. Pergunta-se:
- Qual é a importância agrícola e ambiental desse processo chamado denitrificação?
- As formas nitrogenadas de adubo mais comuns, são uréia ( CO(NH2)2 ), sulfato de
amônio, nitrato de potássio, nitrato de amônio, aquamônia e o “uran” (mistura de uréia,
nitrato de amônio e água). Qual destas formas você não pode recomendar para uma
lavoura de arroz irrigado por inundação, ou qualquer outra cultura que vegete em solo com
sítios de anaerobiose? Por quê?
9) Porque todos os microrganismos precisam produzir exoenzimas? Que enzimas são necessárias
degradar amido, celulose, lignina (alguns componentes de vegetais) e caseína?
32
5. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS
Praticamente qualquer trabalho em microbiologia requer métodos que avaliem o número

de microrganismos. Pode-se medir números de microrganismos ou massa celular. Os métodos
que medem número de microrganismos são mais úteis para organismos unicelulares como
bactérias e leveduras. Os métodos que medem massa celular podem ser empregados para
todos os tipos microbianos incluindo organismos filamentosos longos como fungos os quais
são difíceis de enumerarmos medindo-se número de células, embora a técnica que vamos
executar possa ser empregada.
O método mais comum para medirmos número de células é o Método das Placas de
Contagem ou Contagem de Colônias: Este método é baseado na relação teórica de que uma
célula bacteriana originará uma colônia (UFC) e pressupõe-se que o número de colônias que
desenvolveram na placa de Agar corresponderá a contagem original de bactérias.
Este método pode ser empregado para enumerar microrganismos presentes no leite,
águas poluídas, solo, alimentos em geral, etc. Utilizando-se técnicas assépticas, diluições
quantitativas do material sendo examinado, são realizadas em tubos de diluição esterilizados e
uma quantidade conhecida de cada diluição é colocada em placa de Petri com o meio de
cultura. A diluição preparada e colocada na placa depende do número esperado de
microrganismos na amostra e deve assegurar que uma das placas finais apresentará entre 30
e 300 colônias. O número de colônias nesta faixa dará uma aproximação mais correta da
população microbiana.
Após a incubação das placas e aparecimento das colônias, as colônias serão contadas
e será feita a média a qual será multiplicada pelo fator de diluição para obter-se o número de
microrganismos no material original diluído.
O meio de cultura pode ser adicionado na forma líquida após a adição da diluição ou em
placas de petri pré-solidificadas com o meio de cultura. As diluições podem ser realizadas em
água ou em uma solução salina esterilizada.
PROCEDIMENTO PARA A DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS

EM AMOSTRAS
Discutir o procedimento entre o grupo até entenderem o que deve ser feito.
1. Desenrolar as placas de petri. Não abrir para não contaminar.
2. Rotular as placas com o meio e o tipo de inóculo sendo usados, bem como a diluição que
será colocada na placa.
3. Pipetar 1 ml da diluição correspondente na placa, evitando ao máximo contaminação
pelo ar.
4. Colocar o meio correspondente, derretido em banho-maria, mas evite colocar quando
muito quente. Ideal 45 - 50 °C.
5. Girar as placas com o meio, lentamente em movimentos circulares para misturar a
amostra com o meio de cultura da melhor maneira possível.
6. Espere o Agar solidificar completamente, e incube as placas invertidas para evitar a
dessecação do meio e também auxiliar evitando contaminação pelo ar. Incubador a 30 °C.
MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS

MEIO PARA ACTINOMICETOS - AMIDO - CASEINA AGAR
(Kuster e Williams, 1964)
Amido
..............................................................................
10,00 g
Caseína (difco - livre de vitaminas)............................
0,30 g
KNO3
...............................................................................
2,00 g
NaCl
.................................................................................
2,00 g
K2HPO4
.............................................................................
2,00 g
MgSO4 . 7 H2O
................................................................. 0,05 g
CaCO3
.............................................................................
0,02 g
FeSO4 . 7 H2O
............................................................... 0,01 g
Agar
..................................................................................
16,00 g
H2O destilada ................................................................
1.000 ml
Nistatina ...................................... 50 microgramas/ml
(anti-fúngico)
pH = 7,0 - 7,2 Ajustar antes da esterilização. A nistatina é adicionada antes de verter o
meio nas placas e é indispensável quando se trabalhar com solos onde a população de
fungos é alta e pode comprometer a avaliação.
MEIO PARA FUNGOS
Martin's - Bengala Agar (Martin, 1950)
Glicose ...............................................
............................ 10,00 g
Peptona
............................................................................. 5,00
g
KH2PO4
............................................................................. 1,00
g
Rosa Bengala
(1%)............................................................ 3,3 ml
Agar
................................................................................
16,00 g
H2O destilada ...............................................................
1.000 ml
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Estreptomicina .......... 30,0 mg ou 0,3 ml p/ cada 100
ml do meio.
Todos os reagentes, exceto Rosa Bengala e Estreptomicina são dissolvidos em

água. A mistura é aquecida agitando até iniciar a fervura. A mistura é removida do
aquecedor e Rosa Bengala é adicionada. Após a autoclavagem e antes de colocar o
meio de cultura nas placas (+ ou - 48 °C) é adicionada a estreptomicina.
* Dissolver 1 g de sulfato de estreptomicina em 100 ml de água esterilizada e adicionar
0,3 ml para cada 100 ml do Meio Rosa Bengala antes de adicionar o meio às placas (+
ou - 48 C).
MEIO PARA BACTÉRIA
Hutchinson's Agar modificado (Bhat e Shetty, 1949)
Agar
...............................................................................
18,00 g
Glicose
...........................................................................
10,00 g
K2HPO4
............................................................................ 0,5
g
MgSO4 . 7 H2O
.............................................................. 0,2 g
Peptona
.......................................................................... 0,05
g
KNO3
..............................................................................
0,05 g
H2O destilada ............................................................
1000 ml
DICAS PARA RESOLVER PROBLEMAS EM DILUIÇÕES

1. Desenhe diagramas, eles ajudarão consideravelmente.
2. Respostas sempre devem ser dadas em bactérias, fungos e actinomicetes, por grama ou
mililitro do material sendo analisado. Ajuste os resultados se microrganismos por mais de uma
grama ou Mililitro estiver sendo requerido no problema.
ASSUMA QUE 1 ml de ÁGUA = 1 GRAMA.
3. Use as placas para contagem com número de colônias entre 30 e 300.
4. Com as repetições de placas da mesma diluição tome a média da contagem e coloque na
fórmula a seguir.
5. Use as duas fórmulas e nunca ocorrerão erros:
Ø FD= diluição inicial x diluição(ões) subseqüente(s) x quantidade colocada na placa
( FD = fator de diluição)
Ø Número de microrganismos por grama ou mililitro da amostra= 1/FD X número de

colônias contadas
PROBLEMAS
1. Análise da contaminação do leite. 10 mililitros de leite foram adicionados a 90 mililitros de

água esterilizada. Esta mistura foi posteriormente diluída por duas vezes 1:100. 0,1 ml da
diluição final foi colocada na placa e após a incubação 160 colônias apareceram na placa.
Qual a contagem de bactérias por mililitro de leite?
2. Você cultivou uma cultura bacteriana e queria saber quantas células de bactérias por
mililitro de meio cresceram no seu meio de cultura. 1 mililitro desta cultura bacteriana foi
pipetada para um tubo de ensaio contendo 9 ml de água esterilizada. 1 ml desta diluição foi
pipetado para um segundo tubo de ensaio contendo 9 ml de água esterilizada, e deste 0,1 ml
foi colocado numa placa. 30 ml de meio de cultura foram adicionados na placa e esta foi
incubada, sendo que 219 colônias apareceram após a incubação. Quantas bactérias por
mililitro estavam presentes na cultura original ?
3. Análise da contaminação de amostras de carne. 5 gramas de carne foram adicionadas a

45 ml de água esterilizada. Uma diluição adicional de 1:100 foi realizada e 0,1 ml desta foi
colocada na placa. Após a incubação 46 colônias foram contadas. Calcule o número de
bactérias por grama de carne.
4. Análise de alimentos. 2 gramas de salada de batatas foram colocadas em um liquidificador

contendo 18 ml de água esterilizada. 10 ml desta mistura foram então adicionados a 90 ml de
água esterilizada que estavam em um erlenmeyer. 0,1 ml desta mistura foi adicionado a 9,9 ml
de água esterilizada em um tubo de ensaio, e 0,1 ml desta diluição final colocou-se em uma
placa. Após a incubação 78 colônias foram contadas. Quantas bactérias estavam presentes
nas 2 gramas da amostra de salada de batatas ?
5. Análise de microrganismos do solo. 5 gramas de solo foram misturadas a 15 ml de

diluente. Quatro diluições sucessivas de 1:10 foram realizadas. 1 ml da amostra original e das
diluições subsequentes foram colocadas em placas de Petri individuais e o meio de cultura
adicionado. Após a incubação o seguinte dados foram obtidos:
1 ml da Amostra Número de colônias
Diluição inicial Muitas colônias (MC) ( + de 300)
Primeira diluição 1:10 MC
Segunda diluição 1:10 235
Terceira diluição 24
Quarta diluição 0
Calcule o número de bactérias por grama de solo.
6. Análise da microbiologia de um poluente ambiental. 9 gramas de esterco foram

misturados em um liqüidificador com 891 ml de água esterilizada. Três diluições sucessivas de
1:10 foram realizadas. Amostras triplicadas de 0,1 ml foram colocadas em diferentes placas.
Foram utilizadas todas as diluições para colocar nas placas. Após incubação foram obtidos os
seguintes resultados:
0,1 ml da amostra Número de colônias
Suspensão inicial MC
Primeira diluição 1:10 410/385/412
Segunda diluição 1:10 165/188/179
Terceira diluição 1:10 29/27/28
Calcule o número de bactérias por grama de esterco ?
7. Análise da microbiologia de alimentos. 8 gramas de salada de batatas foram maceradas

e diluídas em um liquidificador com 500 ml de água esterilizada. Três diluições sucessivas de
1:10 foram realizada. Amostras triplicadas de 0,01 ml de todas as diluições foram colocadas
em placas de petri e mostraram os seguintes resultados após a incubação:
Primeira diluição (inicial) MC (muitas colônias)
36
Segunda diluição MC
Terceira diluição 190/210/240
Quarta diluição 17/14/28
Calcule o número de bactérias que você ingeriria caso tivesse comido 130 gramas de
salada de batatas ?
8. 2 gramas de solo foram diluídas em 898 ml de água esterilizada. Três diluições sucessivas
de 1:100 foram realizadas e 0,01 ml da última diluição foi colocada em três diferentes placas de
Petri, sendo que 40 ml do meio de cultura foi adicionado em cada placa. Após a incubação
observou-se a presença de 38, 45, 53 em cada uma das placas, respectivamente. Qual o
número de bactérias na amostra ?
DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS PELA TÉCNICA DO NÚMERO

MAIS PROVÁVEL (NMP)
DESENHO EXPERIMENTAL PARA DETERMINAÇÕES PELO NMP

NPM ( NÚMERO MAIS PROVÁVEL) usando-se tabelas pré estabelecidas
ou contagem direta pelo número de colônias que aparecem nas placas.
AMOSTRA COLETADA E DILUIDA EXEMPLO: 10 gramas de solo em 90 ml de solução salina.
10 -1 Diluições em série 10 ml em 90 ml de solução salina
10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 10 9
1ml
TABELA PARA O NMP, PARA USO EM DILUIÇÕES DECIMAIS E CINCO TUBOS

POR DILUIÇÃO
Como exemplo considere uma diluição em série de 1/10, com 5 tubos incubados por
diluição dando os seguintes resultados positivos após a incubação: 5 na diluição 10-5, 5 na
diluição 10-6, 3 na diluição 10-7, 1 na diluição 10-8, 0 na diluição 10-9. Nesta série p1=5, p2=3,
p3=1. A tabela nos dá um valor de 1,1 na quantidade de inóculo aplicada na diluição 10-7. O
número de microrganismos da amostra original é de 11 milhões.
PROBLEMAS:
1. Você realizou uma determinação do NPM em amostras de carne de frango pelo método dos
tubos para avaliar a presença de coliformes fecais totais. O resultado foi o seguinte:
5 positivos na diluição 10 -4
Qual o número mais provável de coliformes totais na amostra?
2. Você realizou uma determinação do NPM em amostras de solo pelo método dos tubos para
avaliar a presença de bactérias denitrificadoras totais . O resultado foi o seguinte:
1 positivos na diluição 10 –7
0 positivos na diluição 10 –8
Qual o número mais provável de bactérias denitrificadoras totais na amostra?
38
1. Resultados da avaliação do número de coliformes fecais em uma amostra de

alimento pelo “método das placas de contagem”, mostraram alto grau de
contaminação (358.000 células/g de amostra). Considerando os problemas
envolvidos na técnica utilizada faça considerações com relação à confiabilidade
dos resultados. O método poderia estar superestimando o número deste grupo
de bactérias na amostra?
2. Você foi solicitado a fazer uma avaliação do número de fungos filamentosos

presentes em uma amostra de solo. O método das placas de contagem poderia
ser utilizado? Qual o grau de confiabilidade que se poderia ter a partir dos
resultados?
3. Considerando-se que no “método das placas de contagem” as estimativas de

recuperação de organismos de amostras ambientais giram em torno de 0,1 a
10% apenas, qual a aplicação prática do método e estudos na área agronômica?
4. Você como técnico contratado de uma empresa produtora de inoculantes é

designado a fazer uma avaliação do número de células viáveis no inoculante
produzido pela empresa. Partindo do conhecimento de que o número de células
de rizóbio presente gira em torno de 100 milhões por grama de inoculante,
esquematize o procedimento para a avaliação e calcule o número de diluições
necessárias para a avaliação pelo método das placas de contagem.
5. Quais as formas de se avaliar parâmetros ecológicos microbianos? (cite os três

comentados em aula).
6. Entre as formas de se avaliar número de microrganismos têm-se os métodos da

contagem direta ao microscópio e o método das placas de contagem. Discuta
suas principais limitações.
7. O princípio do método das placas de contagem é o de que uma colônia de

bactérias que se visualiza na placa de Petri foi originada de
................................................... presente no inóculo.
8. O método de contagem em placas é adequado para avaliar a ecologia de

microrganismos de áreas distintas? Justifique.
9. O método citado acima é adequado para determinar o número total de

microrganismos que ocorrem em um solo? Justifique.
10. Qual o procedimento que você adotou para limitar o crescimento de bactérias em
um meio para fungos e vice-versa?
RESULTADOS DOS CÁLCULOS:

Resolva todos os exercícios da apostila. Lembre-se sempre que o resultado
deve ser dado em no de propágulos (microrganismo em questão) por ml de inóculo ou
amostra. Use as duas fórmulas propostas para facilitar os cálculos, mas saiba
interpretá-las.
1) 1,6x108 ou 160 milhões/ml. 2) 219 mil células/ml. 3) 460.000 células/g. 4) 15,6x106
células na amostra. 5) 9,4x104 células/ml. 6) 1,7733x107 células/g de esterco. 7)
1,73x1010 células na amostra. 8) 4,06x1012 células na amostra.
40
6. ATIVIDADE MICROBIANA DO SOLO.
A atividade microbiana (decomposição de resíduos e crescimento microbiano) no solo é

dependente de várias propriedades como pH, umidade, temperatura e suprimento de oxigênio.
Para os organismos heterotróficos depende do suprimento e disponibilidade de compostos
orgânicos. Se todos estes fatores estiverem em condições ótimas, mas a única fonte de
alimento for o húmus, a atividade microbiana será mínima (embora não seja zero), e muitos
organismos estarão em nível de subsistência, talvez dormentes ou em formas esporuladas.
Húmus é um material de difícil decomposição, onde não existem mais compostos que sejam
fáceis de serem degradados para fornecimento de energia, mas pode suportar a sobrevivência
de alguns grupos de microrganismos no solo. Quando resíduos orgânicos frescos são
adicionados ao solo, fornecendo uma fonte prontamente utilizável de carbono e energia o
número de micróbios, bem como sua atividade aumenta rapidamente. A ação no solo pode
ser medida pela quantidade de dióxido de carbono (CO2) produzido pela respiração microbiana
(metabolismo respiratório, dissimilação respiratória). Em laboratório o CO2 evoluído pode ser
preso e medido. Soluções de álcali, tais como: NaOH, podem prontamente absorver CO2 gás,
fornecendo uma maneira conveniente, simples e barata de realizarmos uma avaliação
quantitativa da atividade microbiana.
O CO2 reage com o NaOH formando Na2CO3. Se uma quantidade conhecida de NaOH
for usada, a quantidade de hidróxido que não reagir pode ser determinada e teremos uma
quantificação da atividade microbiana.
As reações podem ser resumidas da seguinte maneira:
(1) M.O. (resíduos orgânicos) + O2 + Micróbios CO 2 (g) + outros produtos

+ Micróbios
(2) CO2(g) + H2O (líquida) H2CO3
(3) H2CO3 + 2NaOH Na2CO3 + 2H2 O ( l )
g= gás l= líquido.
O NaOH que não reagir pode ser medido por titulação com uma solução de HCl de
concentração conhecida. Entretanto, o Na2CO3 interfere nesta titulação (ou seja, não é um
composto estável) e precisa ser eliminado. Se adicionarmos BaCl2, este reagirá com o Na2CO3
formando um composto insolúvel, BaCO3, o qual precipita.
(4) Na2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2NaCl
Lembrem-se que se outro aceptor de elétrons estiver disponível (como por exemplo o
nitrato), poderemos ter oxidação completa de resíduos orgânicos mesmo na ausência de
oxigênio.
Efeitos da composição do material em decomposição, no teor de nitrogênio mineral do

solo.
O balanço do nitrogênio no solo, ao qual matéria orgânica fresca tenha sido adicionada,
será afetado em maior ou menor grau dependendo da composição da matéria orgânica e da
sua relação C/N. Alta relação C/N no material orgânico sendo adicionado, e uma constituição
química de fácil decomposição resultará na imobilização do nitrogênio (incorporação nos
"tecidos" nitrogenados dos microrganismos, principalmente proteínas e aminoácidos), enquanto
que a mineralização seria uma conseqüência de uma baixa relação C/N e rápida taxa de
decomposição dos compostos (resíduos) sendo adicionados.
O curso destes eventos também pode ser influenciado pelo teor de umidade do solo. A
umidade do solo pode determinar se condições aeróbicas ou anaeróbicas irão prevalecer, e
com isto o tipo de metabolismo energético a ser utilizado pelos microrganismos. Anaerobiose
pode ser dita limitar a atividade microbiana (pois quase exclusivamente bactérias fermentam e
exclusivamente bactérias realizam respiração anaeróbica) e pode também resultar em
denitrificação se nitrato estiver no ambiente. Neste exercício, tipos diferentes de material
orgânico, bem como a influência do teor de oxigênio serão analisados.
Várias fontes orgânicas - glicose, palha de gramíneas, palha de leguminosas que
variam na relação C/N e na facilidade de decomposição serão usadas. A umidade será variada
para controlar a disponibilidade de oxigênio.
Este tipo de experimento é utilizado quando se deseja estudar o efeito de diferentes
aditivos (ou resíduos) na atividade microbiana do solo ou deseja-se conhecer a taxa de
decomposição do aditivo.
Exemplos de unidades experimentais utilizadas neste tipo de experimento:
1. UNIDADE A - COM SUPRIMENTO CONTÍNUO DE O2.
2. UNIDADE B - SEM SUPRIMENTO DE O2
MATERIAL
1. Frascos
2. Solo Unidade de Mapeamento São Pedro
3. Aditivos Orgânicos: esterco, palha e restos de resíduos orgânicos, glicose, peptona etc.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 100 gramas de solo seco ao ar e colocar na unidade experimental (frasco 500 ml)
2. Colocar o aditivo orgânico (tratamento) no frasco e misturar bem com uma espátula.
3. Adicionar a quantidade de H2O equivalente ao tratamento ( capacidade de campo ou
alagado).
4. Preparar o frasco receptor de CO2 (becker de 50 ml) com 10 ml de NaOH 1 mol L-1 e
colocar dentro da unidade experimental
5. Vedar o frasco hermeticamente (verificar se a borracha está vedando bem a tampa para não
perdermos gás carbônico, às vezes a borracha torce, cuidado).
Não esquecer de identificar a unidade experimental, com nome, turma e tratamento.

42
TRATAMENTOS:
T1. Solo seco ao ar.

T2. Solo úmido (80% da capacidade de campo)
T3. Solo saturado
T4. Solo úmido + 125 mg de glicose.
T5. Solo úmido + 120 mg palha de leguminosa
T6. Solo úmido + 120 mg de palha de gramínea
T7. Solo seco ao ar + 120 mg de palha de gramínea
T8. Solo saturado + 120 mg de palha de gramínea.
T9. Solo saturado + 120 mg de palha de gramínea + 50 mg de N-NO3-
T10. Prova em branco (sem solo)
Composição de alguns substratos orgânicos
SUBSTRATO Fórmula química %C %N RELAÇÃO C/N
Glicose C6H12O6 40 0
Palha de gramínea C53H80O40N (97%)+ 42 1 42
inorg.
Palha de leguminosa C17,5H25012,5 N 42 3 14
(97%)+inorg
Bactéria C4H7O1,5N (96%)+ 50 14 4
inorg.
A quantidade de carbono adicionada com a glicose, a gramínea e a leguminosa é

aproximadamente a mesma.
INCUBAÇÃO E ANÁLISE: Os frascos permanecerão incubados a 25 oC durante uma semana.

Ao final deste período será efetuada a titulação do excesso de NaOH com HCl.
PROCEDIMENTO PARA A TITULAÇÃO:

1. Remover com cuidado o frasco coletor de CO2
2. Adicionar 3 ml de BaCl2 1 mol L-1
3. Adicionar 3 gotas de fenolftaleína como indicador da titulação (fenolftaleína 1 g em 100 ml
de álcool a 95%)
4. Titular com HCl 1 mol L-1.
5. Preparar uma prova em branco (mesma quantidade de NaOH, ou seja, 10 ml)
6. Calcular mg de CO2 evoluído e gramas do material decomposto para cada tratamento.
CÁLCULOS:
CO2 evoluído (mg):
CO2 evoluído = (VB - VT )NE
VB = Volume (mililitros) de ácido necessários para titular o NaOH na prova em
branco.
Vt = Volume de ácido necessário para titular o NaOH do tratamento.
N = Normalidade do ácido.
E = Peso equivalente CO2 (12+16.2) = 44/2 = 22.
RESUMO DOS TRATAMENTOS
TRATAMENTOS gasto CO2 Veloc. C-CO2 C- C-

HCl total Mineralizaçã total adiciona mineraliza
(ml) (mg) o (mg) do do (%)
(mg (mg)
deCO2/h)
T1. Solo seco ao ar
T2. Solo úmido (80% cc)
T3. Solo saturado
T4. Solo úmido + 125 mg de
glicose
palha leguminosa
palha gramínea
T7. Solo seco ao ar + 125 mg de
palha gramínea
T8 Solo saturado + 125 mg de
palha de gramíneas
T9 Solo saturado + 125 mg de
palha de gramíneas + 50 mg
KNO3
T10. Prova em branco (sem
solo).
Data e hora da incubação:

Data e hora da titulação:
RESULTADOS: Você deverá ter certeza que entende, e pode responder as seguintes
questões sobre o experimento realizado.
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia deve ser capaz
de responder as seguintes questões:
1) A técnica de Medição do CO2 ou Respiração Basal apresenta-se como uma das formas de se
avaliar parâmetros ecológicos microbianos. Nesta técnica proposta por Stotzki (1957), a
quantidade de CO2 liberado no processo de decomposição de materiais orgânicos é reflexo das
condições bióticas e abióticas do meio. Dentre os fatores abióticos, o teor de água apresenta-se
como um dos mais variáveis. De que maneira ele pode influenciar a atividade de microrganismos
e a velocidade de decomposição de um material orgânico?
2) De que maneira a relação C/N do material adicionado afeta o processo de

mineralização da matéria orgânica?
3) Com base nos resultados obtidos no experimento desenvolvido em aula, responda as questões
abaixo:
a) Como se pode avaliar se o fator umidade do solo afetou a decomposição da matéria
orgânica?
44
b) Quando da adição de um resíduo orgânico ao solo, espera-se normalmente um
incremento nos valores de respiração. A adição de palhadas de leguminosas e
gramíneas resultou nesse efeito?
c) Apesar de a quantidade de C adicionado ao solo no tratamento 3 (T3) ser semelhante ao
adicionado em T4, verificamos uma maior velocidade de decomposição no primeiro.
Porque isso ocorreu?
d) Em T6 observamos uma taxa de decomposição dos resíduos orgânicos maior que em
T5. No seu entendimento, esse resultado é justificável? Por quê?
e) Porque em ambientes alagados é de se esperar uma menor decomposição dos
resíduos?
7. BIOTRANSFORMAÇÕES DO NITROGÊNIO NO SOLO
Entre os elementos que compõem os sistemas biológicos, o nitrogênio é aquele que

apresenta o ciclo biogeoquímico mais complexo. Isso em função da diversidade de
transformações que o N está e a importância do mesmo no metabolismo celular, e a existência
do nitrogênio em diversas formas. No solo o nitrogênio encontra-se principalmente na forma
orgânica o qual é composto pelo N da biomassa microbiana; nitrogênio mineral que representa
apenas 2 a 5% do N do solo (NH4+, NO2- e NO3-) o qual é a forma assimilável pelas plantas e
os microrganismos; e nitrogênio gasoso (N2, NH3, NOx).
No solo, a maioria das transformações do nitrogênio são controladas pelos microrganismos,

através dos processos de mineralização, imobilização, nitrificação e desnitrificação os quais
controlam a quantidade de N mineral no solo. Assim a medida dos teores de N mineral do solo
um pode nos fornecer informações de qual processo de transformação de N predominou neste
solo.
Na maioria dos solos, o nitrogênio mineral representa uma fração inferior a 2 % dos teores de
nitrogênio total. A maior quantidade de nitrogênio no solo está na forma orgânica, ou seja
ligado as moléculas orgânicas, normalmente em grupos amínicos. A técnica para
determinação de nitrogênio total do solo é parecida com esta que foi descrita para tecido
vegetal.
O N mineral se encontra na forma de NH4+ (íon amônio), NO3- (nitrato) e NO2- (nitrito).
Geralmente o NO2- ocorre em quantidades muito pequenas.
A determinação dos teores de N mineral do solo é de particular interesse para a
microbiologia, quando se quer avaliar no solo alguns processos envolvendo o ciclo do N, tais
como: amonificação, imobilização, nitrificação e desnitrificação.
A determinação dos teores de N mineral do solo é de particular interesse para a

microbiologia, quando se quer avaliar no solo alguns processos envolvendo o ciclo do N, tais
como: amonificação, imobilização, nitrificação e desnitrificação.
Determinação dos teores de nitrogênio mineral do solo.
A determinação do N mineral do solo (NH4+ + NO2- + NO3-) é realizada em três etapas

distintas: 1) extração do N mineral do solo; 2) destilação através do método de KJELDHAL; e 3)
titulação.
Extração
A extração do N mineral (NH4+, NO2- e NO3-) no solo é realizada com uma solução de
cloreto de potássio (KCl) 1 mol L-1. Os íons K+ irão tomar o lugar do íon amônio (NH4+) que está
nos sítios de troca do solo e serão liberados para a solução. O nitrato (NO3-) e o nitrito (NO2-)
são solúveis em água e facilmente passaram para o extrato.
Procedimento para extração:
a) Pesar 10 g de solo (sem secar) e colocar em frasco para extração

b) Adicionar 100 ml de KCl 1 mol L-1.
c) Agitar durante 30 minutos.
d) Deixar decantar por 30 minutos (após este passo o íon amônio está em solução).
46
Destilação
Após a extração, o N mineral presente no extrato é recuperado por destilação

(MÉTODO DE KJELDHAL). Através da destilação é possível recuperar conjuntamente as três
formas de N mineral (NH4+ + NO2- + NO3-) ou recuperar separadamente o NH4+ do NO2- + NO3-.
A seguir são apresentadas as reações envolvidas na destilação é apresentado vamos

o meio é alcalinizado e onde o N mineral é a liberação de NH3 é obtida pela
alcalinização do extrato com óxido de magnésio (MgO)..
MgO + H2O -------------> Mg++ + 2OH- (este processo produz OH, e eleva o pH do meio)
NH4+ (na solução do solo) + OH- ------------> NH3 (volátil) + H2O
NH3 + H3BO3 ------------------------> NH4H2BO3 (borato de amônio)
Após a destilação do NH3 (o vapor expulsa a amônia volátil) teremos que extrair o NO3-
eNO2- (que não são afetados pelas reações anteriores ). Adiciona-se a liga Devarda (50% Cu,
45% Al e 5% Zn) para reduzir NO3- e NO2- a NH4+, o qual é a seguir destilado como NH3
devido ao pH do meio ainda estar alcalino.
Procedimento para destilação:
a) Pipetar uma alíquota de 20 ml do extrato (sobrenadante) para um tubo de destilação.

b) Ajustar no condensador do destilador de Kjeldhal, um Erlenmeyer de 50 ml contendo 5
ml do indicador ácido bórico.
c) Adicionar 0,2 g de MgO no tubo de destilação contendo os 20 ml do extrato.
d) Conectar imediatamente o frasco no destilador e iniciar a destilação.
e) Recolher + ou - 35 ml do destilado no Erlenmeyer contendo 5 ml do indicador ácido
bórico. O destilado contém o NH4 + presente na alíquota destilada.
g) Adicionar 0,2 g de liga Devarda no frasco de destilação onde já foi extraído o NH4 +
h) Reiniciar a destilação.
i) Recolher 35 ml do destilado no frasco de Erlenmeyer contendo indicador ácido bórico. O
destilado contém o NH3, proveniente do NO-3 e NO-2 que estavam na alíquota antes da
destilação.
DETERMINAÇÃO:
f) Titular o destilado com H2SO4 0,005 N até a viragem (a solução com o indicador muda de cor
roxa para verde).
j) Titular o destilado com H2SO4 0,005 N até a viragem.
Caso deseje determinar conjuntamente NH4+ + NO3- e NO2-, basta adicionar juntos MgO e liga
Devarda na alíquota de 20 ml do extrato e efetuar a destilação.
CÁLCULO:
Nitrogênio mineral (ppm) = (A - B) x 70
S
A = gasto de H2SO4 para titular a amostra
B = gasto de H2SO4 para titular a prova em branco (20 ml de KCl 1 N)
S = peso da amostra em gramas (2 gramas no caso específico)
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia deve ser capaz
de responder as seguintes questões:
1) O elemento nitrogênio tem, sem dúvida, o comportamento mais dinâmico entre os elementos
nutrientes de plantas. No ambiente solo, aproximadamente 95% do N está na fração orgânica e 5%
nas suas várias formas minerais. Como você vê o papel dos microrganismos no ciclo do elemento na
natureza?
2) Dentre as várias formas de N mineral no ambiente do solo, quais constituem-se em formas

potencialmente passíveis de perdas do sistema solo-planta?
3) O processo de nitrificação ocorre por ação de bactérias quimiotróficas. Que argumentos você
utilizaria para justificar o processo como sendo benéfico ou como indesejável?
4) O equilíbrio entre as formas de amônia (gás) e amônio (íon nutriente) é regulado pelo pH do solo.
Com a elevação do pH as perdas de N na forma de gás são potencializadas. Considerando-se que o
processo de hidrólise da uréia gera hidroxilas (OH-), seria lógico fazer aplicação localizada desse
adubo (como na linha de semeadura), visando menores perdas?
5) As principais formas nitrogenadas de adubo são uréia CO(NH2)2, sulfato de

amônio, nitrato de potássio, nitrato de amônio, aquamônia e o “uran” (mistura de
uréia, nitrato de amônio e água). Qual destas formas você não pode recomendar
para uma lavoura de arroz irrigado por inundação, ou qualquer outra cultura que
vegete em solo com sítios de anaerobiose? Porque?
6) Em um cultivo de arroz no sistema convencional a área será alagada aos 25 dias da

semeadura. Em que momento você recomenda fazer a adubação nitrogenada? Que
forma de adubo nitrogenado utilizará? Justifique.
7) (QUESTÃO DO PROVÃO–MEC 2001) (assinale correta) O nitrogênio é um

nutriente consumido em grandes quantidades pela maioria das culturas e sofre
diversas transformações biogeoquímicas no solo, dentre elas
a) a mineralização, que consiste na transformação de N mineral em substâncias
orgânicas, como as proteínas, o que melhora a qualidade dos produtos
agrícolas.
b) a denitrificação, que constitui um processo de perda de nitrogênio na forma de
gás e ocorre em condições anaeróbicas.
c) a imobilização microbiana, que corresponde à transformação de amônia em
nitrato, que é a forma assimilável de N pelas gramíneas.
d) a nitrozação, que corresponde ao aumento no nível de nitrato no solo, após a
aplicação de material orgânico com relação C/N elevada (maior que 60).
e) a lixiviação, que é baixa nos solos bem drenados, devido à forte fixação nas
argilas, o que dificulta sua assimilação pelas culturas.
RESULTADOS
GASTO DE H2SO4
N-NINERAL N-MINERAL
TRATAMENTOS 0,005 N N-ADICIONADO
(ppm) (mg/100g de solo)
(ml) (mg/100g de solo)
NH4+ NO3- + NO2- NH4+ NO3- + NO2- NH4+ NO3- + NO2- -----------
T1. 100g solo úmido (80 % cc)
T2. 100 g solo úmido + 0,04 g (NH4)2SO4
T3. 100 g solo esterilizado úmido + 0,04 g (NH4)2SO4
T4. 100 g solo úmido + 0,04 g (NH4)2SO4 + 0,4 g glicose
T5. 100 g solo alagado + 0,35 g KNO3 + 0,4 g glicose
T6. 100g solo úmido + 0,375 g de palha ervilhaca
T7. 100g solo úmido + 0,375 g palha aveia
T8. 100g solo úmido + 0,375 g palha aveia + 0,04 g (NH4)2SO4
Prova em branco
8. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS
As bactérias diazotroficas (di= dois; azote= nitrogênio; trophs= comida: fixadores de N2) são
microrganismos que podem utilizar o N2 atmosférico como fonte de N para o crescimento e são
responsáveis pelo processo de fixação biológica de N (FBN).
Diazotrofos simbióticos
A capacidade de fixar nitrogênio simbioticamente é encontrada em vários grupos de
microrganismos e, em alguns casos, observa-se a formação de estruturas diferenciadas. O
isolamento de bactérias do gênero Rhizobium de nódulos de leguminosas não é tarefa difícil.
Nosso interesse é retirar do interior dos nódulos as bactérias que causam a formação deste
nódulo. Devemos selecionar nódulos grandes e sadios, de preferência que apresentam cor
interna vermelha (devido a Leghemoglobina que transporta o oxigênio).
O processo de isolamento baseia-se na desinfecção do exterior do nódulo (a
desinfecção serve para retirarmos organismos contaminantes que estão aderidos à superfície
externa do nódulo e que podem atrapalhar o nosso trabalho) com uma solução desinfetante.
Logo após, maceramos os nódulos para estourar as células da planta que contém o rizóbio.
Colocamos o meio de cultura mais adequado, incubamos e esperamos o aparecimento de
colônias da bactéria sobre o Agar.
Meio de cultura (MANITOL AGAR VERMELHO CONGO)

Este meio é recomendado por pesquisadores para o isolamento de bactérias do grupo rizóbio.
Manitol.............................................................. 10,0g
Fosfato bipotássico (K2HPO4).......................... 0,5g
Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O)..............., 0,2g
Cloreto de sódio (NaCl)..................................., 0,1g
Extrato de levedura (yeast extract)................... 2,5g
Agar.................................................................. 16,0g
H2O destilada (completar a ...)......................... 1.000 ml
Vermelho Congo (1g: 400ml H2O).................. 20 ml
PROCEDIMENTO:
1. Remover nódulos das raízes, deixando pequena porção da raiz ainda aderida ao nódulo.
Lavar bem com água para tirar todo o solo e ao máximo os contaminantes como esporos de
fungos, bactérias, etc.
2. Desinfecção: colocar o nódulo no fundo de uma placa de porcelana ou placa de Petri e

cobrir com solução desinfetante. Solução a ou b.
a. Clorox 10% por 10 minutos. (Q’Boa produto 10% comercial).
b. Álcool 70% por 30 segundos.
Lavar os nódulos após a desinfecção com H2O esterilizada 7 vezes para remover todo o
desinfetante (porque quando estouramos o nódulo, o desinfetante que restar poderá destruir
as bactérias).
3. Maceração: com o auxílio de um bastão de vidro (flambado), macerar os nódulos até

formar um caldo leitoso. (Esta mistura contém material do tecido vegetal, líquido do
citoplasma e tudo o que estava dissolvido nele, bem como as bactérias rizóbio que estavam
dentro das células da planta).
4. Colocar algumas gotas de caldo leitoso em placas de Petri esterilizadas.

Use a alça de platina esterilizada para esta transferência.
Após verter o meio de cultura líquida (45oC) nas placas, agitar com movimentos
circulares horizontais para misturar bem o meio com as bactérias (cuidado para não
respingar meio na tampa de placa de Petri).
50
5. Incubação: espere até o Agar solidificar e incube as placas invertidas a 28oC.
6. Examinar após uma semana observando as características das colônias.
7. Após a incubação as colônias de Rhizobium apresentam-se gomosas e de coloração

branca. Outras bactérias que podem estar contaminando o trabalho normalmente absorvem
o corante e formam colônias vermelhas. O teste de coloração de Gram pode ser realizado
para uma primeira análise pois as bactérias rizóbio são Gram negativos e têm a forma de
bastonete.
OBSERVAÇÃO: o passo 4 pode ser feito de outra maneira, ou seja, podemos através do
método das estrias, utilizar placas pré-solidificadas de agar meio de cultura para fazer
isolamento.
* Na prática, após o aparecimento das colônias, realiza-se a repicagem em placas pré-

solidificadas por duas ou três vezes transferindo-se então a cultura para tubos de agar
inclinado (com o meio de cultura) e temos então nossa cultura estoque para testes de eficiência
em fixação de nitrogênio.
Algumas estirpes de Rhizobium preferem glicose ao açúcar manitol e o pesquisador
poderá fazer modificações.
Outros meios de cultura são usados por alguns pesquisadores e podem ser
encontrados na literatura.
Além dos Diazotrofos simbióticos, existem os diazotrofos de vida livre e associativos
Diazotrofos de vida livre

Com a exceção das bactérias fotossintéticas e cianobactérias que fixam
nitrogênio, a maioria das bactérias diazotróficas de vida livre são heterotróficas
requerendo ecossistemas capazes de prover uma fonte de carbono utilizável,
necessário para a fixação de nitrogênio.
Diazotrofos associativos
Dentro deste grupo podemos dividir os diazotrofos em dois grupos: endofíticos
facultativos (podem colonizar tanto a rizosfera como o interior das raízes) e os endofíticos
obrigatórios (colonizam o interior das raízes). A bactéria Acetobacter diazotrophicus é um
exemplo de bactéria endofítica obrigatória. Sua ocorrência é bastante restrita e tem sido
encontrada em associação, principalmente, com plantas que se propagam vegetativamente
como a cana-de-açúcar, batata-doce e capim Camerrom.
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia deve ser capaz de
responder as seguintes questões:
1. Como se pode entender o processo de FBN como sendo uma alternativa para a
manutenção da sustentabilidade dos agroecossistemas? (redução do consumo
de combustíveis fósseis, fonte de energia, produto final, poluição por amônia,
nitrato e óxido nitroso).
2. A bactéria rizóbio necessita de oxigênio para realizar o processo de respiração

aeróbica dos compostos orgânicos fornecidos pela planta e, assim, gerar a
energia necessária ao seu crescimento e, principalmente, ao processo de
redução de nitrogênio a amônia (FBN). Nesse processo, a bactéria faz uso de um
complexo enzimático (nitrogenase), que por sua vez é inativado quando entra em
contato com o oxigênio. Como a bactéria faz para resolver esse problema,
quando em simbiose com leguminosas?
3. Verificou-se no rótulo de um inoculante comercial para soja a indicação da

presença de duas estirpes bacterianas de Bradyrhizobium japonicum. Qual a
necessidade de um inoculante conter 2 ou várias estirpes de uma mesma
espécie?
4. Em busca de maior praticidade ao agricultor, uma empresa oferece sementes de

trevo prontas para a semeadura, ou seja, previamente inoculadas. Você, como
profissional, estabelece alguma restrição ao seu uso?
5. Como fazer uma avaliação a campo da viabilidade de fixação de N dos nódulos?
6. Em meio de cultura para diazotróficas podem ser suprimidas todas as fontes de

N fixado?
52
9. MICRORGANISMOS E A ESTABILIDADE DE AGREGADOS DO
SOLO
Os agregados do solo, compostos de partículas primárias, unidas por agentes
cimentantes, constituem as unidades básicas da estrutura do solo.
A taxa de infiltração de água no solo, a penetração das raízes, a facilidade com que
ocorrem as trocas gasosas e a resistência à erosão estão relacionados a uma boa estruturação
do solo que por sua vez depende de uma boa agregação e da estabilidade dos agregados em
água.
Vários fatores estão envolvidos na formação dos agregados no solo, bem como na sua
estabilidade. Os principais dizem respeito à atividade da população microbiana do solo.
Dois mecanismos têm sido sugeridos para explicar o envolvimento dos microrganismos
na formação dos agregados e na sua estabilidade: em primeiro lugar está a ação mecânica
resultante da produção do micélio, principalmente por fungos, atuando no sentido de agrupar
as partículas do solo em agregados; em segundo lugar está a produção de agentes
cimentantes (polissacarídeos e substâncias mucilaginosas), especialmente por bactérias, que
contribuem principalmente no aumento da estabilidade dos agregados em água.
Os actinomicetos, por produzirem micélio e também produtos metabólicos com ação
cimentante, desempenham um papel intermediário entre fungos e bactérias.
A intensidade com que os microrganismos atuam na agregação do solo está na
dependência da facilidade com que ocorre a decomposição do material orgânico adicionado ao
solo.
TRATAMENTOS:
- T1 - 30 g de solo seco ao ar.

- T2 - 30 g de solo seco ao ar + 0,3g de glicose.
- T3 - 30 g de solo seco ao ar + 0,3g de palha de aveia.
- T4 - 30 g de solo seco ao ar + 0,3g de palha de ervilhaca.
PROCEDIMENTO:
1. Moer em um Ghral cada amostra de solo com o respectivo tratamento.

2. Transferir o solo tratado e moído para um erlenmeyer de 250ml seco.
3. Inclinar o erlenmeyer para que o solo fique reunido em um dos cantos.
4. Com uma pipeta adiciona-se 3 - 5 gotas de água na superfície do solo.
5. Colocar o erlenmeyer em posição vertical e girar rapidamente fazendo circunferências
em um círculo imaginário de 25 cm de diâmetro. Continuar com o movimento até que
pequenos agregados artificiais se produzam nas áreas úmidas do solo.
6. Transferir o conteúdo do erlenmeyer (com cuidado para não romper os agregados) para
uma folha de papel.
7. Separar cuidadosamente os agregados que tenham em torno de 10 mm de diâmetro.
8. Os agregados com mais de 10 mm de diâmetro deverão ser reduzidos com auxílio de
uma pinça.
9. Retorne o solo que não formou agregado ao erlenmeyer e repita o processo até obter
mais ou menos 20 agregados em boas condições.
10. Os 20 agregados são distribuídos em duas placas de Petri abertas e levados à estufa a
28oC em ambiente úmido por 7 dias.
ANÁLISE:
No final do período de incubação os agregados deverão ser retirados das placas e

colocados sobre a folha de papel absorvente para secar ao ar.
A resistência dos agregados será determinada utilizando-se o método de Mc CALLA
que consiste no seguinte:
a) Colocar o agregado a ser testado sobre uma peneira de malha quadrada de 2mm de
abertura e deixar cair sobre o agregado gotas de água de aproximadamente 4mm de
diâmetro de uma altura de 50 cm.
b) Considera-se que o agregado é destruído no momento em que rompe-se e passa
pela peneira.
c) Anota-se o número de gotas necessárias para tal.
c) Repete-se o procedimento para 5 - 10 agregados, fazendo-se a média para o
número de gotas gastas em cada tratamento.
Tabela: Resistência dos agregados à ação do impacto de gotas d’água segundo Mc CALLA.
REPETIÇÕES MÉDI
TRATAMENTO
1 2 3 4 5 A
T1 – 30 g de solo seco ao ar.
T2 – 30 g de solo seco ao ar + 0,3g de glicose.
T3 – 30 g de solo seco ao ar + 0,3g de palha de aveia.
T4 – 30 g de solo seco ao ar + 0,3g de palha de

ervilhaca.
Após a aula e o estudo da apostila didática, você como futuro profissional da Agronomia deve ser capaz de
responder as seguintes questões:
1. Como microrganismos podem interferir na estabilização de agregados?
2. Sabendo que o efeito de estabilização de agregados pela ação de

microrganismos é efêmero, como interferir no ecossistema solo - planta em
busca de manutenção de um solo com agregados estáveis ao impacto da gota
da chuva e à ação da água inerte?
3. A intensidade do processo estabilização de agregados está relacionada ao tipo

de resíduo orgânico adicionado ao solo? Como explicar o efeito?
54
10. MICORRIZAS
Micorriza é a associação mutualística (simbiótica) entre a raiz de uma planta e fungo.

Normalmente, as plantas apresentam essa associação, com exceção de algumas poucas
famílias (Cruciferas, Juncaceae). As vantagens desta simbiose para o hospedeiro resultam de
melhoria no estado nutricional da planta, melhor utilização e conservação de nutrientes no
sistema, redução de perdas por estresses de natureza biótica (pragas e doenças) ou abiótica
(desbalanço nutricional, déficit hídrico). Os benefícios no aumento do crescimento da planta
são devidos à grande capacidade de absorção de nutrientes do solo, principalmente aqueles
que movimentam-se por difusão, portanto de baixa mobilidade, como por exemplo o fósforo,
cobre e zinco. Assim, esta associação é essencial para plantas que se encontram em solos de
baixa fertilidade ou aquelas com sistema radicular pouco desenvolvido.
Objetivo
Observar as características macroscópicas e microscópicas de diferentes tipos de
micorrizas.
ECTOMICORRIZAS
Observação de Ectomicorrizas
Materiais raízes de Eucalyptus sp e Pinus sp.
Colocar as raízes em placas de petri e colocar água no seu interior. Com auxílio de uma
pinça e um estilete, separar pedaços de radicelas com cerca de 1 cm, que se apresentem
bifurcadas na extremidade (em Pinus sp.), mais grossas e de cor amarelo-alaranjado (em
Eucalyptus sp.). Com as raízes totalmente imersas na água observar à lupa, iniciando com a
menor objetiva e aumentando a ampliação.
Tentar definir as seguintes características das micorrizas: cor, forma, presença ou
ausência de rizomorfas, tipo de manto (liso, com hifas aderidas).
Desenhar:
Posteriormente, fazer uma preparação deste material (entre lâmina e lamínula) e observar ao
microscópio para caracterização do fungo que produz o manto.
ENDOMICORRIZAS
Coleta, amostragem e armazenamento de propágulos de endomicorrizas
· COLETA
Os fungos endomicorrízicos produzem micélio e esporos no solo, mais especificamente
na região da rizosfera. Algumas espécies podem esporular internamente nas raízes, tornando
importante a coleta de solo e raízes. As raízes são usadas também para a quantificação da
colonização radicular. O solo mais raízes para análise de fungos de endomicorrizas é coletado
no campo com enxadão, trado ou anéis cilíndricos de metal, na profundidade que se tenha todo
o crescimento radicular da planta ou a maior parte do crescimento radicular. O volume da
subamostra depende do objetivo do trabalho. Normalmente no laboratório usa-se 50 ml de solo
para determinar a densidade de esporos e 1 g de raízes para a avaliação da colonização
radicular. Além dessas análises sugere-se que a quantidade de solo coletado possibilite análise
química do solo e sua utilização como inóculo em vasos de cultivo e multiplicação. Após a
coleta o material deve ser armazenado em sacos plásticos resistentes e identificados e
transportados à sombra, evitando o aquecimento da amostra, pois temperaturas superiores a
50º C inviabilizam os propágulos e secam as raízes.
Para amostragem em vasos de cultivo, coleta-se o substrato em diversos pontos, com
espátula ou cilindros de metal, evitando-se danificar o sistema radicular da planta hospedeira.
Os orifícios abertos devem ser preenchidos com solo desinfestado, irrigando-se o vaso a
seguir. Os equipamentos utilizados para a coleta devem ser limpos, para evitar contaminações.
· AMOSTRAGEM
A amostragem de solo é de fundamental importância para o estudo das micorrizas, por
isso, é importante observar as variações nas características físicas, químicas e biológicas do
solo, tais como umidade, pH, e desenvolvimento radicular que alteram a população destes
microrganismos. O sistema radicular e o solo rizosférico de culturas anuais podem ser
facilmente amostrados, uma vez que o crescimento das raízes destas plantas é bem
distribuído no solo. Em plantas perenes, o sistema radicular é maior e apresenta grande
variabilidade espacial, o que dificulta a amostragem.
· ARMAZENAMENTO
Para a avaliação da colonização micorrízica as raízes devem ser separadas do solo por
peneiramento malha 2 mm), lavadas em água e armazenadas em frascos contendo solução de
FAA (13 mL de formol + 5mL ácido acético + 200 ml de etanol 50%) ou etanol 50%.
Amostras contendo solo, esporos e fragmentos de hifas podem ser armazenadas em
sacos plásticos, sob refrigeração (4 a 6° C) e baixa umidade (5 a 10%). Isto poderá manter a
viabilidade dos esporos por aproximadamente cinco anos.
Métodos como a liofilização ou armazenamento de esporos em solução antibiótica
podem ser utilizados.
· CONTAGEM DE ESPOROS
Contagem direta de esporos oriundos de amostras de campo:
1) Utilizar 25 ou 50 g dependendo do solo. Três repetições no mínimo, representativas da
área de campo, oriundas de uma amostra composta.
2) Colocar a amostra em um litro de água, mexendo bem a fim de formar uma solução
homogênea do material.
3) Deixar que o solo decante por alguns minutos, solo seco por uma hora.
4) Passar a suspensão em peneiras de 710 e 25 microns.
5) Lavar na peneira até retirar o máximo de solo.
6) Centrifugar o material por 15 segundos.
7) Desprezar o sobrenadante.
8) Centrifugar novamente com sucrose (75% - 750 g de açúcar e adicionar água até
completar 1 litro), por 20 segundos.
56
9) Manter o sobrenadante sobre peneira e lavar com bastante água, a fim de retirar toda a
sucrose.
10) Coletar os esporos em placa de Petri.
· AVALIAÇÃO DA COLONIZAÇÃO MICORRÍZICA (Phillips e Hayman, 1970)

1) Lavar as raízes em água.
2) Colocar as raízes em frascos de vidro, identificando o frasco e cobrir as raízes com solução
de 10% de KOH. Para raízes mais grossas com 2 mm ou mais velhas de plantas perenes,
deixar descolorir mais de 1 hora em 10% KOH a 90°C.
3) Os frascos são deixados em banho-maria ou forno a uma temperatura de 65 - 80°C por 1 -
6 horas. O tempo dependerá da idade e tipo de raízes.
4) Remover o KOH.
5) Lavar duas vezes com água.
6) Lavar uma vez com solução de HCl 0.1N.
7) Corar em banho Maria durante 5 a 10 minutos em solução de lactoglicerol e trypan blue
0,05%.
8) Remover o excesso de corante e armazenar em solução de lactoglicerol.
9) Avaliar ao microscópio hifas externas com esporos, hifas longitudinais, arbúsculos e
vesículas.

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

Prof. Sandro José Giacomini

1. NUTRIÇÃO E CULTIVO DE MICRORGANISMOS ................................................ 3

2. DISTRIBUIÇÃO DE MICRORGANISMOS ........................................................... 11

3. ENRIQUECIMENTO, ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DE CULTURAS

4. COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS PARA MICROSCOPIA ...................................... 22

5. TESTES BIOQUÍMICOS ...................................................................................... 25

6. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS ................................. 32

7. ATIVIDADE MICROBIANA DO SOLO. ................................................................. 40

8. BIOTRANSFORMAÇÕES DO NITROGÊNIO NO SOLO ..................................... 45

9. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS ............................................. 49

10. MICRORGANISMOS E A ESTABILIDADE DE AGREGADOS DO SOLO ........... 52

11. MICORRIZAS ....................................................................................................... 54

AULA PRÁTICA 1 – Nutrição e Cultivo de Microrganismos

Assim como todas as formas de vida, os microrganismos requerem certos

B. FONTE DE PRECURSORES CELULARES (CHONSP):

além das necessidades de nutrientes os microrganismos para crecerem necessitam d

Fonte de carbono, energia e elétrons

Fonte de Carbono Classe nutricional

TÉCNICAS ASSÉPTICAS: conjunto de procedimentos

Na natureza os microrganismos existem como populações mistas e dentro dessas populações,

MEDIDAS DE ASSEPSIA (comumente utilizadas):

PRODUTOS COMUMENTE UTILIZADOS NA MONTAGEM DE MEIOS DE CULTURA:

Devido à inexistência de um meio de cultura universal, a escolha do meio dependerá do

A partir desta primeira classificação, dividimos os meios de cultura nas seguintes

I. Meios líquidos (sem ágar):

II. Meios sólidos: (com ágar-ágar, sílica-gel, gelatina, etc.)

III. Meios seletivos: A adição de certas substâncias químicas específicas ao ágar-nutritivo

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA:

Exemplo de preparação de um meio comum, para organismos aeróbicos, onde as

1. Cada ingrediente é pesado e dissolvido no volume de água destilada, conforme a receita do

Esterilização é o processo de remoção ou morte de todas as formas de vida de um

DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos presentes

ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto,

LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de

1.1) CALOR SECO - O processo de oxidação das proteínas dos microrganismos(morte)

1.2) CALOR ÚMIDO E PRESSÃO* - Apresenta maior poder de penetração no material

2) FILTRAÇÃO - Consiste na passagem de um fluido através de uma substância porosa

3) ESTERILIZAÇÃO GASOSA- Utilizada para materiais que não podem ser

QUESTÕES PARA REVISÃO DOS CONHECIMENTOS - AULAS PRÁTICAS

3) ....................................... é um processo que mata todas as formas de vida

4) Um agente que mata todas as formas vegetativas de microrganismos mas não

5) Afirmação verdadeira ou falsa:

6) A esterilização de vidrarias de laboratório pelo calor seco requer uma temperatura

7) Qual método de esterilização é apropriado para:

8) Três culturas bacterianas de Bacillus sp., Pseudomonas sp. e Clostridium foram

10) O crescimento de microrganismos em laboratório é denominado cultivo:

11) Os principais elementos químicos para o crescimento celular incluem

13) Os ......................................são os organismos que fazem uso de dióxido de carbono

15) Indique se a afirmação é verdadeira ou falsa:

16) O nitrogênio é um elemento essencial dos ................................., que são unidades

17) Os ........................................... contam com os compostos químicos para obter

Embora os microrganismos estejam presentes em todos os locais, não é fácil

Para provar a hipótese de que microrganismos estão presentes em um ambiente

Meio de cultura para bactérias: Agar nutritivo

Meio de cultura para fungos: BDA (batata-dextrose-ágar)

Método para preparar um litro de meio de cultura (BDA):

O MUNDO DOS MICRÓBIOS: EXAME MICROSCÓPICO DE INFUSÕES DE FENO

Para estudar os micróbios presentes em uma infusão de feno é necessário fazer

Utilize as ilustrações fornecidas abaixo e tente identificar as criaturas que observares:

FIGURA 1. Morfologia e agrupamento de bactérias. Características morfológicas

1. Célula vegetativa - formas:

3. Esporângio - célula com esporos