Índice

1. Introdução..................................................................................................................2

2. Objectivos..................................................................................................................3

2.1. Geral....................................................................................................................3

2.2. Específicos..........................................................................................................3

3. Metodologia de trabalho............................................................................................3

4. Identificação e Classificação dos Microrganismos....................................................4

4.1. Os seres vivos.....................................................................................................4

4.2. Célula..................................................................................................................5

4.3. Classificação dos 5 reinos...................................................................................5

4.4. Principais características dos grupos de microrganismos...................................6

5. Características Morfológica de coloração diferencial................................................7

6. A sorologia.................................................................................................................7

6.1. Indicação para a realização do exame sorológico...............................................8

7. A reação em cadeia da polimerase.............................................................................8

7.1. As etapas da reação em cadeia da polimerase (PCR).......................................10

7.2. Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da PCR....................11

8. Conclusão.................................................................................................................12

9. Referencias Bibliográficas.......................................................................................13

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1. Introdução
O presente trabalho é da cadeira de Microbiologia, que constitui um dos ramos
fundamentais das ciências básicas. O conhecimento e o estudo detalhado dos
microrganismos e de suas funções permitem estabelecer seu uso em aplicações muito
variadas, desde o campo médico, alimentar e ambiental, agrícola e industrial. Desse
modo, a microbiologia consolida-se como um dos pilares da biotecnologia.

Neste trabalho irei apresentar assuntos inerentes a Identificação e Classificação de

Micro-organismo, características Morfológicas da coloração diferencial, Sorologia e
Reacção de cadeia Polimerase, onde iremos detalhadamente como ocorre estes
processos.

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2. Objectivos
2.1. Geral:
 Falar em torno da Micro-organismo.

2.2. Específicos:
 Identificar e classificar o Micro-organismo;
 Caracterizar a morfologia da coloração diferencial;
 Analisar de como é feita a sorologia.

3. Metodologia de trabalho
A metodologia da pesquisa foi essencialmente qualitativa com base no enfoque
participativo, tendo em conta as seguintes abordagens e métodos: a pesquisa
bibliográfica e documental.

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4. Identificação e Classificação dos Microrganismos
A identificação e classificação dos organismos vivos são o principal objetivo nas
diferentes áreas da Biologia. As comparações das características de grande número de
microrganismos resultam, eventualmente, num sistema de agrupamento das espécies
semelhantes. Por fim, cria-se um grupo com características muito semelhantes, que é
considerado como uma espécie e recebe um nome específico. Uma cultura que consiste
em uma única espécie de microrganismo, independentemente do número de indivíduos,
é denominada de cultura axênica ou culturas puras. Se dois ou mais tipos (espécies)
crescem juntos, como normalmente ocorre na natureza, passam a constituir uma cultura
mista.
Antes de identificar e classificar um microrganismo, suas características devem ser
determinadas com detalhes como seguem: 1) Características culturais: exigências
nutricionais e atmosféricas ambientais; 2) Características morfológicas coloniais e
celulares; 3) Características metabólicas: envolve reações químicas vitais para sua
sobrevivência; 4) Características antigênicas: componentes especiais da célula que
fornecem evidências de semelhança entre as espécies; e 6) Características genéticas:
composição do ácido desoxirribonucléico (DNA). (PELCZAR, 1996).

4.1. Os seres vivos

Os seres vivos são constituídos de unidades microscópicas chamadas de células que
formam, em conjunto, estruturas organizadas. As células são compostas de núcleo e
citoplasma. Quando o núcleo celular é circundado por uma membrana nuclear ou
carioteca, os organismos que as possuem são chamados de eucarióticos, os que não
possuem células com carioteca são os procarióticos a exemplo das bactérias.
Baseado na maneira pela qual os organismos obtêm alimentos, Robert H. Whittaker
classificou os organismos vivos em 5 reinos: reino Monera, reino Protista, reino Planta
e, reino Animalia e reino Fungi. Os microrganismos pertencem a três dos cinco reinos:
as bactérias são do reino Monera, os protozoários e algas microscópicas são Protistas e
os fungos microscópicos como leveduras e bolores pertencem ao reino Fungi.

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4.2. Célula
A célula é uma estrutura típica microscópica comum a todos os seres vivos. Com os
avanços da microscopia eletrônica na década de 1940, foi possível a visualização de
muitas estruturas da célula que seria impossível no microscópio ótico.

Todas as células se compõem de duas regiões internas principais conhecidas como

núcleo e citoplasma. O núcleo, que é circundado pelo citoplasma, contém todas as
informações genéticas do organismo, sendo responsável pela hereditariedade. O
citoplasma é a sede primária dos processos de síntese e o centro das atividades
funcionais em geral.
Em algumas células, o núcleo é circundado por uma membrana denominada de
membrana nuclear ou carioteca. Compreendem o grupo das eucarióticas, os
protozoários, os fungos, a maior parte das algas. Estas células se assemelham as dos
animais e plantas. Em contraste, as bactérias e o pequeno grupo de algas azul-verdes se
caracterizam por células menores procarióticas por não apresentarem membrana
nuclear.
Nas plantas e microrganismos, a parede celular é a única estrutura limitante. Seu único
papel parece ser o de proteção contra injúrias mecânicas e impedem, principalmente, a
ruptura osmótica quando a célula é colocada em ambiente com alto teor de água.
(PELCZAR, 1996).

4.3. Classificação dos 5 reinos

A classificação dos organismos, mais recente, proposta por Robert H. Whittaker em
1969, foi baseada a partir da maneira pela qual o organismo obtém nutrientes de sua
alimentação.
 Fotossíntese – processo pelo qual a luz fornece energia para converter o dióxido de
carbono em água e açúcares.
 Absorção – a captação de nutrientes químicos dissolvidos em água.
 Ingestão – entrada de partículas de alimentos não dissolvidas.
Nesse esquema de classificação, os procariotas que normalmente obtêm alimentos só
por absorção constituem o reino Monera. O reino Protista inclui os microrganismos
eucarióticos unicelulares, que representam os três tipos nutricionais: as algas são
fotossintéticas, os protozoários podem ingerir seu alimento e os fungos limosos somente

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absorvem os nutrientes. Os organismos eucarióticos superiores são colocados no reino
Planta e (plantas verdes fotossintéticas e algas superiores), Animalia (animais que
ingerem alimentos) e Fungi, organismos que têm parede celular, mas não apresentam o
pigmento clorofila encontrado em outras plantas para promover a fotossíntese, portanto
eles absorvem os nutrientes. Como pode se observar, os microrganismos pertencem a
três dos cinco reinos. (PELCZAR, 1996).

4.4. Principais características dos grupos de microrganismos

Protozoários – são microrganismos eucarióticos unicelulares. Como os animais
ingerem partículas alimentares, não apresentam parede celular rígida e não contêm
clorofila. Movem-se através de cílios, flagelos ou pseudópode. Estes microrganismos
são estudados na ciência da Parasitologia (estudo dos parasitas).
São amplamente distribuídos na natureza, principalmente, em ambientes aquáticos.
Muitos são nocivos ao homem como a ameba e a giárdia.

Algas – são semelhantes às plantas por possuírem clorofila que participa do processo de
fotossíntese e apresentam uma parede celular rígida. São eucariotas e podem ser
unicelulares ou multicelulares com vários metros de comprimento. Podem ser nocivas
por produzirem toxinas, obstruir caixas d’água ou crescerem em piscinas. Entretanto,
algumas espécies são usadas nas indústrias de alimentos, farmacêuticas, cosméticos e
para o uso em laboratório. As algas não são estudadas na Microbiologia de alimentos.

Fungos – podem ser unicelulares ou multicelulares. São eucariotas e possuem parede

celular rígida. Os fungos não ingerem alimentos e obtêm os nutrientes do ambiente
através de absorção.

Bactérias – são procariotas, carecem de membrana nuclear e outras estruturas celulares

organizadas observadas em eucariotas.

Vírus – representam o limite entre as formas vivas e as sem vida. Não são células como
as descritas anteriormente, contêm somente um tipo de ácido nucleico, RNA ou DNA
que é circundado por um envelope proteico ou capa. Devido à ausência de componentes
celulares necessários para o metabolismo ou reprodução independente, o vírus pode

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multiplicar-se somente dentro de células vivas, por isso não são considerados seres
vivos por não possuírem vida própria. (PELCZAR, 1996).

5. Características Morfológica de coloração diferencial

Coloração diferencial é um termo geral que pode se referir a um número variado de

processos específicos. Geralmente, é usado para descrever processos de coloração os
quais usam mais que um corante. Usando-se múltiplos corantes pode-se diferenciar
entre diferentes micro-organismos ou estruturas e componentes celulares de um mesmo
organismo ou de suas diferentes células.

Coloração diferencial também descreve processos médicos usados para detectar

anormalidades na proporção de diferentes células no sangue. O processo ou resultados
são chamados um diferencial "WBC" (do inglês white blood cells). Este teste é útil
porque muitas doenças alteram a proporção de certas células brancas do sangue
(leucócitos). Por análise destas diferenças em combinação com exame clínico e outros
testes de laboratório, profissionais de medicina podem diagnosticar doenças.

Um comumente reconhecível uso de coloração diferencial é a coloração de Gram. A

coloração de Gram usa dois corantes: violeta cristal e fucsina básica (o corante de
contraste) para diferenciar entre bactérias Gram positivas (grande camada
de peptidoglicano sobre outras superfícies da célula) e bactérias Gram negativas.
Técnicas mais complexas e adequadas de colorações diferenciais, em conjunto com
outras técnicas, são usadas para identificar micro-organismos patogênicos como por
exemplo o da lepra ou o da tuberculose.

Gram obteve, com a coloração realizada, uma melhor visualização das bactérias em
amostras de material infectado. Entretanto, observou que nem todas as bactérias
coravam com este método, o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um
contrastante. O cientista morreu sem que reconhecessem a importância de seu método.
Atualmente, esta técnica é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias,
sendo utilizada como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.
O método de Gram consiste em expor as bactérias à seguinte sequência:
Corante primário: violeta de cristal – Cora o citoplasma de púrpura, independente do
tipo de bactéria.

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Mordente: solução de iodo – Aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a
bactéria e forma com o corante um complexo insolúvel dentro da bactéria.
Agente descolorante: álcool, acetona ou ambos – Dissolvem lipídios.
Contrastante: safranina ou fucsina básica – Cora o citoplasma de vermelho.
Se ao fim desta sequência, a bactéria adquirir coloração púrpura, ela é classificada
como Gram positiva. Caso adquira coloração vermelha, sua classificação é de Gram
negativa.
Estudos de microscopia eletrônica e análises bioquímicas permitiram concluir que
a parede celular bacteriana é a estrutura responsável pelo diferente comportamento
das bactérias ao método de Gram.
As bactérias Gram positivas apresentam uma parede espessa, homogênea, geralmente
não estratificada e predominantemente constituída por peptidoglicano. Esta camada
espessa de peptidoglicano retém, no interior da bactéria, o complexo insolúvel que se
forma pela ação do mordente. Logo, estas bactérias não são descoradas, permanecendo
com a coloração conferida pelo corante primário (púrpura).
As bactérias Gram negativas apresentam uma parede estratificada constituída por uma
membrana externa e por uma camada mais interna que contém peptidoglicano; esta
camada é mais fina do que a camada encontrada nas bactérias Gram positivas.
Nas bactérias Gram negativas, então, o complexo insolúvel formado pela ação do
mordente é removido (a membrana externa é parcial ou totalmente solubilizada pelo
agente descolorante e a fina camada de peptidoglicano não retém corante o suficiente
para dar a coloração púrpura) e as bactérias ficam descoradas, corando de vermelho pela
ação do contrastante.
Vale comentar que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa corar
positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram-positiva pode corar
negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada (exemplo:
envelhecimento celular ou ação de lisozimas).
Além de serem classificadas em Gram positivas ou Gram negativas, as bactérias
também são organizadas observando-se seu formato.

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 Procedimento da actividade laboratorial

 Preparar e fixar esfregaço a partir da suspensão de E.coli e

B.subtilis seguindo as indicações dadas de 1 a 6.
 Colocar a lâmina sobre um suporte e inundar com solução
de Cristal Violeta e deixar actuar durante um minuto.
 Lavar com água como indicado em 8 e escorrer em papel absorvente.
 Inundar o esfregaço com solução de Lugol e deixar actuar durante 1 minuto.
 Lavar com água como indicado em 8 e escorrer em papel absorvente
 Descorar com álcool etílico a 96% durante 30 segundos, agitando suavemente.
 Lavar com água como indicado em 8 e escorrer em papel absorvente
 Corar com solução de Safranina durante 30 segundos.
 Lavar com água como indicado em 8 e escorrer em papel absorvente
 Observar ao microscópio com a objectiva de imersão.

6. A sorologia
A sorologia é um conceito utilizado especialmente no campo da medicina que se refere
a um exame de laboratório efetuado para comprovar a presença de anticorpos no
sangue, ou seja, determinar concretamente sua presença. É justamente através da
extração de sangue no paciente que, em seguida, sua mostra é analisada para determinar
de maneira eficiente a presença ou não de bactérias no organismo.
O exame sorológico também pode ser usado para identificar a presença (ou revela a
ausência) de anticorpos relacionados a um patógeno no sangue do paciente e a presença
do próprio patógeno (vírus, bactéria, protozoário, etc).

O exame também pode ser usado para o:

 Diagnóstico de doenças autoimunes: a doença celíaca, por exemplo, que tem entre
suas características a intolerância ao glúten.
 Diagnóstico de deficiências imunológicas: a Amaglobulinemia ligada ao cromossomo
X (doença de Bruton).

Os exames sorológicos estão se tornando cada vez mais refinados e com uma execução
simples.

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 Mas, para garantir a qualidade dos resultados são necessários rigorosos controles e
cuidadosa interpretação.

Além disso, os exames sorológicos são utilizados com sucesso na pesquisa de

anticorpos.

Se tornando auxiliares importantes em processos que visam um diagnóstico individual e

de pesquisa epidemiológica. (TORTORA, 2000).

6.1. Indicação para a realização do exame sorológico

O principal uso do exame sorológico é para indicar se o organismo já teve contato com
algum dos determinados agente infecciosos:

 Vírus HIV (causador da AIDS);

 Arbovírus do gênero Flavivirus (causador da Dengue);
 Vírus RNA do gênero Lyssavirus (causador da Raiva);
 Vírus HSV-2 do tipo 2 (causador da Herpes Simples);
 Protozoários parasitas do gênero Leishmania (causadores da Leishmaniose);
 Protozoário Toxoplasma gondii (causador da Toxoplasmose).

O exame sorológico identifica infecções e doenças tais como:

O exame sorológico é fundamental para saber o modo como o organismo de um

paciente pode reagir diante de uma infecção ou se há algum agente patogênico.

Caso seja comprovada uma infecção, os agentes patogênicos estimulam a geração de

anticorpos e após o exame de sangue poderá ser identificado esses agentes.

Sem dúvidas, hoje em dia, a sorologia se destaca como um excelente e fiel método na
hora de detectar doenças infecciosas como o vírus da:

 Aids;
 Hepatite;
 Rubéola;
 Toxoplasmose;
 Sarampo e entre outros.

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E dessa forma, a sorologia ajuda a prevenir o contágio dessas doenças às pessoas
próximas ou do seu entorno.

7. A reação em cadeia da polimerase

A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias
de uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um
organismo). Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador.
Por exemplo, pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um
marcador genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do
crime com os suspeitos.

Tipicamente, o objetivo da reação em cadeia da polimerase é fabricar quantidade

suficiente da região de interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e
utilizada de alguma outra maneira. Por exemplo, DNA amplificado por reação em
cadeia da polimerase pode ser enviado para sequenciamento, visualizado
por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos.

A reação em cadeia da polimerase é usada em muitas áreas da biologia e medicina,

incluindo pesquisa em biologia molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos
da ecologia. (TORTORA, 2000).

Taq polimerase
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA
polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA
polimerase tipicamente usada na PCR é chamada de Taqpolimerase, em homenagem à
bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).

T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante
estável ao calor e é mais ativa à 70°C (temperatura em que as DNA polimerases
humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq
polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a alta temperatura é usada repetidamente
na PCR para desnaturar o DNA molde, isto é, separar suas fitas.

Primers de PCR

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Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente
quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de núcleotídeos que fornece um
ponto de partida para a síntese de DNA. Em uma reação de PCR, o pesquisador
determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou
ele escolher.

Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta
de 202020 aminoácidos de comprimento. Dois primers são usados para cada reação de
PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de interesse (região que
deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do
DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os primers se ligam ao
molde por pareamento de bases complementares.

Aplicações
A PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA
disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das
principais aplicações da PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA
retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo que contenham bulbo, gotas
de sangue ou saliva, pedaços de pelo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA
deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método
de impressão digital genética. A PCR também é rotineiramente utilizada em
procedimentos científicos de biologia molecular como amplificação para gerar
mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para
clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizada para
identificação de patógenos que estão presentes em amostras, como por exemplo a
identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do
papiloma humano e seus genótipos, HIV Vírus da Hepatite B. etc A PCR também é
utilizada na paleontologia para o sequenciamento gênico de animais pré-históricos.
Também é muito utilizada na identificação de micro-organismos, tendo em vista que
apenas 1% dos micro-organismos são cultiváveis e podendo ser isolados. A PCR é o
primeiro passo para o posterior sequenciamento. Após obter as sequências geradas pelos
equipamentos, pode-se consultar bases de dados na internet para tentar localizar suas
possíveis origens, sendo bactérias, archeas ou etc. (TORTORA, 2000).

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7.1. As etapas da reação em cadeia da polimerase (PCR)
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA
molde e nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são reunidos em
um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e passam por repetidos
ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado.

As etapas básicas são:

As etapas individuais comuns à maioria dos métodos de PCR são as seguintes:

1. Inicialização: este passo é necessário apenas para polimerases de DNA que

requerem ativação de calor por PCR de inicialização a quente. Consiste em aquecer
a câmara de reação a uma temperatura de 94– 96 °C, ou 98 °C, se forem utilizadas
polimerases extremamente termostáticas, que é então mantida durante 1-10 minutos.
2. Desnaturação: Este passo é o primeiro evento regular dos ciclos e consiste em
aquecer a câmara de reação a 94 – 98 °C por 20 a 30 segundos. Isso faz com que a
fusão do DNA, ou a desnaturação, do modelo de DNA de cadeia dupla rompa as
ligações de hidrogênio entre bases complementares, produzindo duas moléculas de
DNA de cadeia simples.
3. Anelamento: no próximo passo, a temperatura de reação é reduzida para 50-65 °C
durante 20-40 segundos, permitindo o anelamento dos iniciadores para cada um dos
modelos de DNA de cadeia simples. Dois iniciadores diferentes são tipicamente
incluídos na mistura de reação: um para cada um dos dois complementos de cadeia
simples contendo a região alvo. Os primers são sequências de cadeia simples, mas
são muito menores do que o comprimento da região alvo, complementando apenas
sequências muito pequenas na extremidade 3 'de cada vertente. É fundamental
determinar uma temperatura adequada para o passo de recozimento porque a
eficiência e a especificidade são fortemente afetadas pela temperatura de
recozimento. Esta temperatura deve ser suficientemente baixa para permitir a
hibridação do iniciador à cadeia, mas suficientemente alta para que a hibridação seja
específica, isto é, o iniciador deve unir-se apenas a uma parte perfeitamente
complementar da corda e em nenhum outro lugar. Se a temperatura for muito baixa,
o iniciador pode se ligar de forma imperfeita. Se for muito alto, o iniciador pode não
se ligar. Uma temperatura de recozimento típica é de cerca de 3 –5 °C abaixo da
Tm dos iniciadores utilizados. As ligações estáveis de hidrogênio entre bases

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 complementares são formadas apenas quando a sequência iniciadora se aproxima
muito da sequência do modelo. Durante este passo, a polimerase se liga ao híbrido
molde-iniciador e começa a formação de DNA.
4. Extensão / alongamento: (72°C): Eleva a temperatura da reação para que
a Taqpolimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA. A
temperatura neste passo depende da DNA polimerase utilizada; a temperatura de
atividade ideal para a polimerase de DNA termoestável da polimerase Taq (Thermus
aquaticus) é de aproximadamente 75–80 °C, embora uma temperatura de 72 °C seja
comumente usado com esta enzima. Neste passo, a DNA polimerase sintetiza uma
nova cadeia de DNA complementar à cadeia de matriz de DNA por adição de
dNTPs livres a partir da mistura de reação que são complementares ao modelo na
direção 5' a 3', condensando o grupo 5'-fosfato dos dNTPs com o grupo 3'-hidroxi
no final da cadeia de DNA nascente (alongada). O tempo preciso necessário para o
alongamento depende tanto da polimerase de DNA utilizada quanto do comprimento
da região alvo de DNA para amplificar. Como regra geral, na sua temperatura ideal,
a maioria das polimerases de DNA polimerizam mil bases por minuto. Em
condições ideais (isto é, se não houver limitações devido a substratos ou reagentes
limitantes), em cada etapa de extensão / alongamento, o número de sequências alvo
de DNA é duplicado. Com cada ciclo sucessivo, os fios originais do modelo mais
todas as vertentes recém-geradas tornam-se fios de modelo para a próxima rodada
de alongamento, levando a amplificação exponencial (geométrica) da região
específica do alvo de DNA.

Os processos de desnaturação, anelamento e alongamento constituem um único ciclo.

São necessários vários ciclos para amplificar o alvo de DNA para milhões de cópias. A
fórmula usada para calcular o número de cópias de DNA formadas após um
determinado número de ciclos é 2 n, onde n é o número de ciclos. Assim, um conjunto de
reação para 30 ciclos resulta em 230, ou 1.073.741.824 cópias da região original do alvo
de cadeia dupla.

Alongamento final: Este único passo é opcional, mas é realizado a uma temperatura de
70–74 °C (a faixa de temperatura necessária para a atividade ideal da maioria das
polimerases utilizadas na PCR) durante 5–15 minutos após o último ciclo de PCR para
garantir que qualquer DNA de cadeia simples restante seja completamente alongado.

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Suporte final: o passo final arrefece a câmara de reação a 4–15 °C por tempo
indeterminado e pode ser empregado para o armazenamento a curto prazo dos produtos
de PCR.

Procedimentos
A reação em cadeia da polimerase é um método muito sensível de análise e por isso é
realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou
tornar errôneo o resultado. O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos
da replicação in vitro. Os cientistas então simplificaram ao máximo o processo de
polimerização das moléculas. A maquinaria para separar as fitas sense e anti-sense são
muito complexas na célula, no lugar utiliza-se a mudança de temperatura. Os ciclos são
pensados para disponibilizar o sítio alvo para a ligação dos primers, funcionamento da
polimerase e início de um novo ciclo. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material
genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem
danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar
com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras
aplicações.

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como
pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases
nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers (também chamados de
oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima Taq-polimerase em uma solução tampão.
Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-
estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser
amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96 °C por pouco tempo para

que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra das pontes de
hidrogênio). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C dependendo
da quantidade de citosina (C) e guanina (G) encontrada no primer, para que os primers
se anelem (emparelham) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do
ciclo a temperatura é elevada a 72 °C para que a enzima possa funcionar sintetizando a
nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são
realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial.
O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou
de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.

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Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel,
assim poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado. (TORTORA, 2000).

7.2. Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da PCR

Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis)
através do uso da eletroforese em gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual
fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de
gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho. Um padrão, ou
escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho dos fragmentos nas
amostras da PCR possa ser determinado.

Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser
vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA.

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8. Conclusão
Findo o trabalho conclui-se antes da existência do microrganismos ser conhecida todos
os organismos eram agrupados no reino animal e reino vegetal, actualmente apos a
descoberta de organismos microspicos um novo sistema de classificações e fez
necessário uma nova forma de agrupamento.

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9. Referencias Bibliográficas
JAY, J. M. Microbiologia de alimentos. São Paulo: Artmed, 2005.

PELCZAR, Michael J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, G. Microbiologia dos conceitos e

aplicações. São Paulo: Macron Books, 1966. v 1 e 2.

HOITMAN, J.; TRAVASSOS, L. J. Tratado de microbiologia. São Paulo:

Manole,1971. v 1.

TORTORA, Gerard J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 6. ed. Porto Alegre:
Artmed, 2000.

TRABULSI, L. R.; TOLEDO, M. R. F. Microbiologia. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 1991.

FORSYTLE, S. J. Microbiologia da segurança alimentar. São Paulo: Artmed, 2002.

SILVA JÚNIOR, E. A. Manual de controle higiênico sanitário em alimentos. São

Paulo: Varela, 2001.

DAVIS. B. D. Microbiologia, fisiologia bacteriana. São Paulo: Edart, 1973. v 1.

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