A. Nutrição e Cultivo de Microrganismos

Microbiologia do Solo – SOL1009
Programa aulas práticas

Semana 1 Nutrição e cultivo de microrganismos
Semana 2 Determinação do número de microrganismos
Semana 3 Isolamento e manutenção em culturas puras
Semana 4 Coloração de bactérias para microscopia
Semana 5 Testes Bioquímicos
Semana 6 Atividade microbiana do solo
Semana 7 Atividade microbiana do solo
Semana 8 Primeira Prova Prática (horário da teórica)
Semana 9 Microrganismos agregação do solo
Semana 10 Biotransformações do Nitrogênio do Solo
Semana 11 Biotransformações do Nitrogênio do Solo
Semana 12 Isolamento de bactérias diazotróficas
Semana 13 Micorrizas
Semana 14 Gases de efeito estufa – GEE (CO2, CH4 e N2O)
Semana 15 Segunda Prova Prática (horário da teórica)
Prof. Sandro Giacomini
Semana 16 Exame (horário da teórica)
sjagiacomini@ufsm.br
Título
Microbiologia do Solo
Aula Prática 1
Nutrição e Cultivo de Microrganismos
Prof. Sandro Giacomini
Cultivo de Microrganismos
Cultivo de Título
Microrganismos
Estima-se que o número de espécies de bactérias por grama de solo

varia entre 2.000 e 8,3 milhões (Ganset al., 2005; Schloss e Handelsman,
2006).
16SrRNA  26.140 a 53.433 sp em amostras de solo de quatro locais

(Roesch et al., 2007)
Grande diversidade estrutural
Qual a diversidade funcional?

Biologia molecular e cultivo de microrganismos em laboratório
Cultivo  escolha do meio e condições de incubação
MicrorganismosTítulo
x ambientes terrestres
Fotos internet
Cultivo de Título
Microrganismos
Cultivo de Título
Microrganismos
Necessidade de estudo em laboratório.....

* Cultivo = crescimento (nº)
* Culturas microbianas puras
- Conhecer a diversidade metabólica dos microrganismos auxiliando no

entendimento do papel que os mesmos desempenham no ambiente
Cultivo de Título
Microrganismos
Dois desenvolvimentos importantes foram necessários para a Microbiologia
evoluir como ciência.
- invenção de um microscópio sofisticado; Difco & BBL Manual (2009)
- método de cultivo dos microrganismos.
1860 - Pasteur foi o primeiro a usar um meio de cultura para

bactérias em crescimento no laboratório (cinzas de levedura, açúcar e sais de
amônio).
1881 - W. Hesse usou ágar como agente 1887 - Julius Richard Petri inventou a
solidificador dos meios de culturas. placa de Petri
Cultivo de Título
Microrganismos
O cultivo de microrganismos depende de uma série de fatores importantes:
• Nutrientes necessários devem estar disponíveis.

• Oxigênio ou outros gases devem estar disponíveis, conforme necessário;
• A umidade é necessária;
• O meio deve ter um pH adequado e estar sob temperatura adequada;
• O meio deve estar livre de compostos que possam interferir o crescimento;
• Ausência de microrganismos contaminantes.
Cultivo de Título
Microrganismos
De onde os microrganismos irão obter as substâncias

necessárias para o seu crescimento?
Meio de cultura:
Conjunto de nutrientes que satisfazem as exigências nutricionais e
ambientais de um grupo fisiológico.
Material nutriente/ solução nutritiva utilizada para promover o
crescimento dos microrganismos em condições de laboratório.
Os meios de cultura devem fornecer os seguintes requerimentos

microbianos mínimos:
•Fonte de energia
•Fonte de componentes para síntese celular
•Fatores de crescimento
Cultivo deTítulo
Cultivode Microrganismos
Microrganismos
•Fonte de energia
Cultivo de Título
Microrganismos
•Fonte de componentes para síntese celular
•Carbono: CO2 (autotróficos) ou compostos orgânicos (heterotróficos)
•Hidrogênio (H2O) e O2 (do ar)
•Nitrogênio orgânico (proteínas, aminoácido) e mineral (NH4+ e NO3-)
•Enxofre orgânico (aminoácidos) e inorgânico (SO4-)
• Fósforo (normalmente como PO4-)
•Outros : Ca, Mg, K, Fe e micronutrientes
CHONPS
Cultivo de Título
Microrganismos
Fatores orgânicos de crescimento
São compostos essenciais que o microrganismo não é capaz de

sintetizar (falta enzima para isso)
•Aminoácidos
•Purina e pirimidina (bases nitrogenada componentes dos ácidos
nucléicos - DNA, RNA)
•Vitaminas (biotina, ácido nicotínico, tiamina) – mais comumente
requerido
Título
Meios de Cultura - Componentes
•Produtos comumente utilizados na montagem de meios de cultura
Peptonas:
Mistura orgânica e inorgânica complexa obtida a partir da
hidrólise enzimática (enzimas proteolíticas) de tecido animal ou
vegetal, dessecado, macerado e embalado (proteínas --- digestão
----- pequenas cadeias de aminoácidos chamados de peptonas)
Fornece = peptídeos, aminoácidos, minerais, bases nitrogenadas,
vitaminas
Extratos (carne, plantas, leveduras):

Tecido animal ou vegetal submetido a fervura, dessecado,
macerado e embalado. Mesma constituição das peptonas sendo
importante fonte de vitamina B (leveduras).
Título
Agar:
Polissacarídeo complexo solúvel em água e ficocolóide obtido a partir de
algas marinhas (Gelidium spp). Agente solidificante.
Propriedades do Agar:
• Boa transparência em formas sólidas e gel que permite identificação das
colônias;
• Gelificação a 32-40 °C e fusão a aproximadamente 85 °C, uma propriedade
conhecida como histerese
• Livre de compostos metabolicamente úteis, como peptídeos, proteínas e
hidrocarbonetos fermentáveis
• Livre de substâncias tóxicas (inibidores bacterianos)
Quantidade utilizada = 1-2% (meios sólidos)
Sílica Gel – Solidificante inorgânico; livre de compostos orgânicos – usado

no isolamento das bactérias nitrificadoras
Título
Elementos traços (ferro, cobre, molibdênio e zinco):
Elementos exigidos em pequenas quantidades pelos

microrganismos.
São essenciais para a atividade de algumas enzimas, geralmente

como co-fatores
Produtos sintéticos: sais, glicose...
Título
Meios de Cultura - Classificação
Os meios podem ser líquidos, semi-sólidos ou sólidos.
Os líquidos são denominados de caldo nutriente (caldo nutritivo).

• promover o crescimento
• caracterização bioquímica (identificação bacteriana);
• microaerófilos;
Os sólidos recebem a denominação de agar nutriente

• enumeração de bactérias;
• utilizados em placas de Petri e em tubos;
•utilizados para obtenção e manutenção de culturas puras;
Duas grandes classes:

Meio de cultura definido
Meio de cultura indefinido
Título
Meio de cultura definido

É aquele em que a composição química exata é conhecida. São utilizados
compostos químicos altamente purificados.
Exemplo: Quantidade
Glicose 5,0 g
Fosfato de amônio monobásico (NH4H2PO4) 1,0 g
Cloreto de Sódio (NaCl) 5,0 g
Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) 0,2 g
Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) 1,0 g
Água 1 litro
Título
Meio de cultura indefinido (complexo)

A composição química exata não é conhecida
Exemplo: Quantidade
Peptona 5,0 g
Extrato de carne 3,0 g
Cloreto de sódio 8,0 g
Agar 15,0 g
Água 1 litro
Título
Em função da aplicação ou função os meios podem ser divididos em:

Meios seletivos
Meios diferenciais
Meios redutores
Meios de enriquecimento
Título
I. Meios seletivos:
Apresentam substâncias químicas que previnem o crescimento de um
grupo de microrganismos sem agir sobre os outros.
Ex: A inclusão de Rosa Bengala e estreptomicina no meio de cultura
usado para os fungos irá impedir o crescimento de bactérias.
II. Meios diferenciais:

A adição de certos reagentes ao meio pode distinguir os tipos de
bactérias.
Ex: Adicionando-se vermelho congo no meio de Rhizobium as bactérias

contaminantes podem assimilar a cor vermelha e as colônias de
Rhizobium não (incolor).
Meios
Cultivo de Título
de Cultura - Classificação
Microrganismos
III. Meios redutores
Meios e metodologia para o crescimento de anaeróbios
Adição de tioglicolato de sódio (combina-se com o O2 dissolvido)
Enzima oxirase reduz oxigênio (a placa de Petri torna-se uma

câmara anaeróbica selada).
VI. Meio de enriquecimento
Utilizado para o isolamento de bactérias em pequeno número que

estão junto com outras que estão em grande quantidade.
Título
Condições de incubação
Além dos nutrientes é preciso fornecer condições

ambientais favoráveis ao crescimento
Requerimento de fatores físicos e químicos
Fatores físicos: TºC e umidade
TºC = depende do tipo de microrganismo: psicrófilo, mesófilo, termófilo,

hipertermófilo.
H2O = é o solvente da vida (80-90% do conteúdo celular)
Título - Preparo
Meios de Cultura
•Preparo de meios de cultura
• Cada ingrediente é pesado e dissolvido no volume de água

destilada;
Título - Preparo
Meios de Cultura
• Determina-se o pH do meio fluido, ajustando-o se for

necessário. Para elevar o pH ou diminuí-lo , adiciona-se NaOH
sol. 1N ou HCl sol. 1N, respectivamente;
Título - Preparo
Meios de Cultura
• O meio é distribuído em recipientes adequados (tubos, frascos),

cujas bocas são fechadas com algodão e cobertas com papel
ou papel alumínio.
Título - Preparo
Meios de Cultura
• O meio é esterilizado em autoclave. Para preparação de meios

sólidos, deve ser adicionado o ágar. Os géis permanecem
líquidos acima de mais ou menos 45ºC.
Título - Preparo
Meios de Cultura
Título - Preparo
Meios de Cultura
Título - Preparo
Meios de Cultura
• Caso o meio não seja utilizado no momento, este deve ser

armazenado ao abrigo de contaminações e à temperatura baixa.
• Uso do meio após solidificar
Cultivo de Título
microrganismos
Colônias de bactérias Colônias de fungos
Fotos internet
Cultivo de Título
Microrganismos
Requer técnicas assépticas:
Conjunto de procedimentos utilizados para impedir a contaminação

durante a manipulação de culturas e de meios de culturas estéreis
Estabelecimento de condições assépticas:
 Eliminação de correntes de ar – evitar a poeira suspensa no ar

 Limpar as superfícies de trabalho
 Realizar os procedimentos de manuseio em câmeras assépticas;
 Quando possível trabalhar próximo ao bico de bünsen
CâmaraTítulo
fluxo laminar
Câmara fluxo laminar com uma fonte radiação UV (lâmpada

vapor de mercúrio). “lâmpada germicida”
Cultivo de Título
Microrganismos
Ação biocida de concentrações de etanol em solução aquosa
contra Streptococcus pyogenese
Desnatura proteínas e dissolve lipídeos de membrana
Concentração Tempo (s)
% 10 20 30 40 50
100 - - - - -
95 + + + + +
90 + + + + +
80 + + + + +
70 + + + + +
60 + + + + +
50 - - + + +
40 - - - - -
- = ausência de ação biocida
+ = ação biocidaCultivo de Microrganismos
Título
Esterilização
Títulomicrobiana
Taxa de morte
Processos Título
de Esterilização
Métodos Físicos
• Calor
– Úmido
– Seco
• Filtração
• Radiação (raio X)
• Gás
• Flambagem
Título– Calor
Esterilização
• Utilizado para materiais que não sofrem alterações a altas
temperaturas.
• O calor atua sobre os microrganismos coagulando e oxidando suas
proteínas e lesionando os ácidos nucléicos DNA e RNA
Cultivo de Título
Microrganismos
Calor úmido:
O equipamento mais utilizado é a Autoclave
Os materiais esterilizáveis são: meios de cultura, tubos para diluição,
água em frascos, soluções, solo + água etc....
Cultivo de Título
Esterilização
Microrganismos
– Calor Úmido
Geralmente a autoclave é operada

numa pressão de 15 libras por
polegada (1 atmosfera = 121ºC )
O ar existente na câmara deve ser

completamente substituído por vapor
saturado.
Não é a pressão que mata os

microrganismos e sim a temperatura
elevada do vapor.
Título
Esterilização – Calor Úmido
O efeito do tamanho do recipiente sobre os tempos de esterilização

em autoclave para soluções líquidas
Tamanho do recipiente Volume Líquido Tempo de esterilização

(mL) (min)
Tubo de ensaio: 18 x 150 mm 10 15
Frasco Erlenmeyer: 125 mL 95 15
Frasco Erlenmeyer: 2.000 mL 1.500 30
Frasco Erlenmeyer: 9.000 mL 6.750 70
Título
Cuidados no uso da autoclave
•Evitar o preenchimento dos recipientes acima de 2/3 de sua capacidade

(normalmente 75%)
•Fechar os frascos com algodão ou com folha de alumínio – evitar a vedação
pois pode provocar explosões
•Não encher a autoclave com materiais que exijam diferentes tempos de
esterilização
•Não abrir a autoclave rapidamente (com pressão) – líquidos podem ser
derramados;
Título
AUTOCLAVE:
•Eficaz e baixo custo e requer períodos relativamente curtos para destruição
dos microrganismos;
•A esterilização é mais eficaz quando o microrganismo entra em contato com o
vapor diretamente (usar pequenos volumes)
•Verificar as propriedades de sensibilidade ao calor das substâncias a serem
esterilizadas
Título
Esterilização – Calor Seco
Calor seco:
O equipamento utilizado é o Forno de Pasteur.
Os materiais esterilizáveis são: vidraria laboratorial e materiais

metálicos.
Pode-se esterilizar pó e substâncias viscosas não aquosas;
Placas e vidrarias devem permanecer no forno por 2 - 4 horas a uma

temperatura de 160 - 180 C.
Título
Esterilização – Filtração
Recomendada para produtos
TERMOLÁBEIS (algumas vitaminas ,
enzimas, antibióticos)
O diâmetro dos poros varia, mas deve

evitar a passagem de microrganismos.
Recomendado = menor que 0,22 µm
Micrografia eletrônica de varredura de bactérias e algas

aquáticas retidas em um filtro Nucleopore (5 µm)
Cultivo de Título
Esterilização
Microrganismos
– Filtração
Cultivo de Título
Esterilização
Microrganismos
– Filtração
Título
Membrana filtrante convencional Filtro Nucleopore

+ comum (acetato de celulose) (policarbonato)
Cultivo de Título
Esterilização
Microrganismos
– Filtração
Escherichia coli (poro 0,2 µm)
Título
Título
Esterilização – Gasosa
Utilizada para materiais que não podem ser

esterilizados pelo calor nem pela filtração.
A vantagem do método é a
capacidade de esterilizar a
temperatura ambiente, entretanto
apresenta um custo mais alto e
requer um maior tempo.
Utiliza o óxido de etileno.
Título
Esterilização – Flambagem
Utiliza o fogo na esterilização.
O caso mais comum é a

esterilização da alça de platina

A. Nutrição e Cultivo de Microrganismos

Enviado por

Dados do documento

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

A. Nutrição e Cultivo de Microrganismos

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Microbiologia do Solo – SOL1009

Programa aulas práticas

Prof. Sandro Giacomini

Estima-se que o número de espécies de bactérias por grama de solo

16SrRNA  26.140 a 53.433 sp em amostras de solo de quatro locais

Qual a diversidade funcional?

Cultivo  escolha do meio e condições de incubação

Necessidade de estudo em laboratório.....

- Conhecer a diversidade metabólica dos microrganismos auxiliando no

1860 - Pasteur foi o primeiro a usar um meio de cultura para

O cultivo de microrganismos depende de uma série de fatores importantes:

• Nutrientes necessários devem estar disponíveis.

De onde os microrganismos irão obter as substâncias

Os meios de cultura devem fornecer os seguintes requerimentos

•Fonte de componentes para síntese celular

•Carbono: CO2 (autotróficos) ou compostos orgânicos (heterotróficos)

•Hidrogênio (H2O) e O2 (do ar)

•Nitrogênio orgânico (proteínas, aminoácido) e mineral (NH4+ e NO3-)

•Enxofre orgânico (aminoácidos) e inorgânico (SO4-)

• Fósforo (normalmente como PO4-)

•Outros : Ca, Mg, K, Fe e micronutrientes

Fatores orgânicos de crescimento

São compostos essenciais que o microrganismo não é capaz de

Extratos (carne, plantas, leveduras):

Quantidade utilizada = 1-2% (meios sólidos)

Sílica Gel – Solidificante inorgânico; livre de compostos orgânicos – usado

Elementos traços (ferro, cobre, molibdênio e zinco):

Elementos exigidos em pequenas quantidades pelos

São essenciais para a atividade de algumas enzimas, geralmente

Produtos sintéticos: sais, glicose...

Os líquidos são denominados de caldo nutriente (caldo nutritivo).

Os sólidos recebem a denominação de agar nutriente

Duas grandes classes:

Meio de cultura definido

Meio de cultura indefinido (complexo)

Em função da aplicação ou função os meios podem ser divididos em:

II. Meios diferenciais:

Ex: Adicionando-se vermelho congo no meio de Rhizobium as bactérias

Adição de tioglicolato de sódio (combina-se com o O2 dissolvido)

Enzima oxirase reduz oxigênio (a placa de Petri torna-se uma

VI. Meio de enriquecimento

Utilizado para o isolamento de bactérias em pequeno número que

Além dos nutrientes é preciso fornecer condições

Requerimento de fatores físicos e químicos

Fatores físicos: TºC e umidade

TºC = depende do tipo de microrganismo: psicrófilo, mesófilo, termófilo,

H2O = é o solvente da vida (80-90% do conteúdo celular)

•Preparo de meios de cultura

• Cada ingrediente é pesado e dissolvido no volume de água

•Preparo de meios de cultura

• Determina-se o pH do meio fluido, ajustando-o se for

•Preparo de meios de cultura

• O meio é distribuído em recipientes adequados (tubos, frascos),

•Preparo de meios de cultura

• O meio é esterilizado em autoclave. Para preparação de meios

•Preparo de meios de cultura

• Caso o meio não seja utilizado no momento, este deve ser

• Uso do meio após solidificar

Colônias de bactérias Colônias de fungos

Requer técnicas assépticas:

Conjunto de procedimentos utilizados para impedir a contaminação

Estabelecimento de condições assépticas:

 Eliminação de correntes de ar – evitar a poeira suspensa no ar

Câmara fluxo laminar com uma fonte radiação UV (lâmpada