Fisiologia microbiana:

nutrição e crescimento

• Nutrição microbiana
– Componentes necessários às células
– Meios de cultura
– Condições ambientais

• Crescimento populacional
– Velocidade de crescimento
– Tempo de geração
– Medidas do crescimento
 NUTRIÇÃO MICROBIANA
Introdução

• De todos os organismos vivos, os microrganismos são os mais

versáteis e diversificados em suas exigências nutricionais.

• Alguns são tão exigentes quanto o homem e outros animais.

• Todos os organismos vivos compartilham algumas

necessidades nutricionais em comum:
- carbono
- nitrogênio
- água
 NUTRIÇÃO MICROBIANA

• Em algumas situações os microrganismos são estudados em

seu hábitat natural.
Ex.: Fendas termais, sistemas de tratamento de resíduos, solo

• Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e

bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório.

Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais

Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são
desconhecidas.
 NUTRIÇÃO MICROBIANA

Para o cultivo in vitro são utilizados meios de cultura que simulam

e até melhoram as condições naturais.
Os elementos químicos principais para o crescimento das células
incluem C, N, H, O, S e P e são denominados de macronutrientes.

• O carbono é um dos elementos mais importantes para o

crescimento microbiano – todos requerem carbono
• Os compostos orgânicos são os que contém carbono
• Exceção para o dióxido de carbono que é considerado como
inorgânico.
NUTRIÇÃO MICROBIANA

MACROnutrientes: necessários em grande quantidade. Tem papel importante na

estrutura e metabolismo.

MICROnutrientes: quantidades mínimas. Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas

Uma célula típica

P, S, K, Na ...
Matéria seca
Água
Componentes necessários às células

• Fonte de Carbono
Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos):
- Carboidratos
- Lipídeos
- Proteínas

Deles se obtém energia e unidades básicas para o crescimento celular.

Utilização de CO2 (microrganismos autotróficos)

É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia provém da
luz.
Componentes necessários às células

• Fonte de Nitrogênio

- É elemento mais abundante depois do C, cerca de 12%

(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)

► Moléculas orgânicas (aminoácidos, proteínas, etc.)

► Moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2)
Componentes necessários às células

• Hidrogênio
- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos
(água, sais e gases)

• Função do H:
– Manutenção do pH
– Formação de ligações de H entre moléculas
– Serve como uma fonte de energia nas reações de oxi-redução da respiração

• Oxigênio
- Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos,
nucleotídeos, glicerídeos ...)
- É obtido a partir das proteínas e gorduras.
► Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os
processos de geração de energia.
Componentes necessários às células

Outros macronutrientes:

• P – Sínese de ácidos nucléicos, ATP;

• S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas;
• K – Atividade de enzimas;
• Mg – Estabilidade dos ribossomos;
• Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de
endósporos;
• Na – Requerido por microrganismos marinhos;
• Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das
proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
Requisitos nutricionais - Micronutrientes

• Traços dos seguintes METAIS são necessários na composição de

um meio de cultura:

Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B

► Exercem função estrutural em várias enzimas

- Nem sempre sua adição é necessária

- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra
pura podem apresentar deficiências desses elementos.
Água e outros aditivos

• Água
- Componente absolutamente indispensável
(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)

► Laboratório: destilada, filtrada, deionizada

• Outros aditivos
Funções: aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a
espuma, provocar inibição, estabilizar o pH.

►Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos

Ex.: EDTA, ácido cítrico, polifosfatos
Outros aditivos

► Tampões
- Carbonato de cálcio
- Fosfatos
- Proteínas (peptona)

►Inibidores

Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger

Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico

Outros aditivos

►Indutores

- A maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.

Ex: celulose induz a celulase

pectina induz a pectinase
amido induz a amilase

►Antiespumantes

- Cultivos com aeração ocorre a produção de espuma

• Remoção de células, perda do produto, contaminação;

• Redução do volume do meio

• Um antiespumante reduz a tensão superficial das bolhas

(álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis, ... )

 MEIOS DE CULTURA

Soluções nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.

Classes Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água)

Complexos (utilizam hidrolisados – caseína, carne, soja, levedura)

Não existe um meio de cultura universal, mas

Existem vários tipos meios para diversas finalidades

Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de

suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e
proporção adequada.
MEIOS DE CULTURA
 MEIOS
MEIOS DE
DE CULTURA
CULTURA

• Como determinar uma composição inicial para um meio de cultivo:

Passo 1: utilizar dados da composição elementar

Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são

necessários de 1,3 g (13%) de N, ou 7,2 g de
(NH4)2SO4 (18% de N)

Obs.: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem Composição elementar média (% do peso seco)
introduzir o excesso de um deles.
Elemento Bactéria Fungo
Com relação ao carbono considerar também fração Carbono 52 51
para energia e manutenção (heterotróficos) hidrogênio 7 7
Nitrogênio 13 8,5
Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g
de glicose (40% de C) Fósforo 2,5 0,4-4,5

Enxofre 0,6 0,1-0,5

Fração para energia e manutenção (45%):
Potássio 2,5 0,2-2,5
YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose
Sódio 0,75 0,02-0,5
Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1 Cálcio 0,55 0,1-1,4

Magnésio 0,25 0,1-0,5

Cloro 0,5 -
.... E assim por diante. Ferro 0,1 0,15

Relação C:N média 4:1 6:1

Passo 2: otimização
Relação C:N:P:S 85:23:4:1
 Condições ambientais

 Temperatura
 oxigênio
 pH
 Radiação eletromagnética
 Pressão atmosférica, hidrostática e osmótica
Efeito da temperatura no crescimento microbiano
 Efeito do oxigênio no crescimento microbiano

Meio gelatinoso com

indicador redox:
Rosa quando oxidado
Incolor quando reduzido

Durante as reações de redução do O 2 são

formados vários intermediários tóxicos.
Ex: H2O2, OH°, O2-
Os microrganismos aeróbios e
facultativos utilizam enzimas como a
catalase para destruir as formas tóxicas Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio
aerotolerante
 Sistema para cultivo de
anaeróbios

Sistema para cultivo de

aeróbios
CRESCIMENTO MICROBIANO
• Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de
células
• Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão

Varia de minutos até dias

Depende muito das condições
ambientais

Escherichia Coli - 20 minutos

Pisolithus microcarpus – 2,5 dias
O padrão de crescimento é o exponencial

9000

8000

7000

6000

5000
células

4000

3000

2000

1000

0
0 50 100 150 200 250 300
minutos
Tratando-se bactérias, algas unicelulares e leveduras que se multiplicam por divisão binária, temos:

21 > 22 > 23> 24 N = N0 .2n

Onde N = n° microrganismos ao fim de n divisões
N0 é o número inicial

O número de gerações será: n = 3,3(logN - logN0 )

A velocidade exponencial de crescimento (R) é expressa pelo número de divisões no tempo:

n
R=
t - t0

1 t - t0
A recíproca de R é o tempo de geração: G= =
R n

Essas equações não se aplicam a microrganismos filamentosos.

Assim, é mais conveniente aplicar-se uma equação mais geral, onde se considera a variação da
massa (X), em função do tempo como sendo proporcional a concentração de biomassa presente:

dX
X
dt
• Velocidade específica de crescimento:

Num cultivo batelada ocorre o aumento da concentração da biomassa

Assim, é necessário definir uma velocidade de crescimento que considere a
quantidade de biomassa presente.

dX dX 1 dX
X  .X =
dt dt X dt

A integração dessa equação diferencial fornece a equação algébrica do crescimento

exponencial da biomassa:
μ (t-t )
X = X0i e M i

Ou escrita de outra forma: lnX = μM .t + lnX0i

ln2
• Tempo de duplicação: considerando que X = 2.X0i, resulta: G=
μM
O estudo cinético de um cultivo microbiano consiste da análise da evolução
dos valores de concentração de um ou mais componentes do sistema, em
função do tempo de cultivo.

► microrganismo, nutrientes, metabólitos

9,0 10 9,0
8,5 14 8,5
9
8,0 8,0
7,5 12 8
7,5
7,0 7 7,0
10
6,5
6 6,5
6,0
CP (mg.L )

8 6,0
-1

5,5 5
S (g.L )
-1

X (g.L )
5,5

-1
5,0
6 4 5,0

pH
4,5
4,0 3 4,5
4
3,5 4,0
2
3,0 2 3,5
1
2,5 3,0
2,0 0 0 2,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tempo (dia)
 O ciclo de crescimento
• A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma
população microbiana
• O crescimento de microrganismos em um recipiente fechado (batelada) apresenta
um ciclo típico com todas as fases de crescimento.
1) Fase Lag
Período de adaptação da cultura
• Mudança de meio, preparação do complexo enzimático
• Reparação das células com danos.

2) Fase exponencial
Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo.
• A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as
velocidades de crescimento são bastante variáveis:
- Procarióticos – crescem mais rapidamente que os eucarióticos
- Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores
3) Fase estacionária:
Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial
não pode ocorrer indefinidamente.
• Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos.

Divisão = morte → crescimento líquido nulo

• Ainda pode ocorrer: metabolismo energético e produção de metabólitos
secundários

4) Fase de morte (declínio):

• A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as

células ao processo de morte.

- A morte celular é acompanhada da lise celular

 MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO

• Podem ser realizadas pelos seguintes métodos:

1) Peso seco total das próprias células – filtração, secagem e pesagem

2) Peso de algum componente celular – extração, secagem e pesagem

3) Variação no número de células

a) contagem de células totais
b) contagem de células viáveis

a) Contagem de células totais (contagem microscópica direta)

Utilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada)

Ex.: Câmara de Neubauer
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem direta

• Vantagens: método rápido e fácil

Não distingue as células vivas das mortas

Pode-se omitir células pequenas
• Desvantagens
Células móveis precisam ser imobilizadas
Entre outras.
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem indireta

b) Contagem de células viáveis:

Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.

• Diluição das suspensões celulares
Amostras concentradas precisam ser diluídas

Razões:
Erros devido à junção de células na colônia
Restrições podem fazer células viáveis não
originar colônias

São empregadas várias diluições decimais porque é

difícil prever o número de viáveis.
É contada a placa com 30 a 300 colônias
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Outros métodos:

Turbidimetria
As células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio

Pode ser medida com um espectrofotômetro

•O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrão

•Turbidez X quantidade de células
Contagem eletrônica