Universidade Federal do Ceará

Centro de Ciências
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Cultura de Tecidos e Biofábricas
Estudo Dirigido – AP1

Meios Nutritivos

1) Quais são os componentes básicos do meio nutritivo? Quais sãos as funções de

cada componente? Pesquise as diferenças na composição nutricional das
seguintes formulações: meio de Murashige & Skoog (MS), “Wood Plant Medium”
(WPM), meio B5 (Gamborg).

Sabe-se que o sucesso da cultura de tecidos vegetais é essencialmente influenciado

pela natureza do meio de cultura utilizado, sendo que os meios artificiais devem
suprir nutrientes necessários para o crescimento e desenvolvimento dos tecidos e
órgãos vegetais.

Componentes básicos do meio nutritivo e suas respectivas funções:

a) Fonte orgânica de carbono (carboidratos):

▪ As células, tecidos e plântulas cultivadas in vitro não encontram

condições adequadas de iluminação e concentração de CO2 e, às
vezes, não apresentam teores de clorofila suficientes para realizar
fotossíntese, ou seja, são praticamente heterotróficas;

▪ Fornecem energia metabólica e esqueletos de carbono para a

biossíntese de todos os compostos orgânicos necessários para o
crescimento das células, como aminoácidos, proteínas e
polissacarídeos estruturais.

▪ A sacarose é o carboidrato mais utilizado nos meios de cultivo (de 2 a

3% p/v, ocasionalmente até 6%), sendo que é totalmente ou
parcialmente hidrolisada na autoclavagem em glicose e frutose →
concentração de sacarose é um fator importante no crescimento ótimo

▪ No processo de esterilização, o açúcar pode sofrer a reação de

Maillard (coloração amarelo-escura ao meio), na qual há uma reação
entre açúcares e peptídeos forçada por altas temperaturas, formando
5-hidroximetil-furfuraldeído;

▪ Outros carboidratos utilizados: glucose, maltose, galactose e sorbitol.

b) Macronutrientes:

• São elementos minerais exigidos em maiores quantidades para o

 crescimento de plantas, fornecidos aos meios de cultura em
quantidades milimolares (mM) na forma de sais de nitrogênio (N),
potássio (K), fósforo (P), cálcio (Ca), enxofre (S) e magnésio (Mg);

• Esses macronutrientes apresentam diferentes formas de absorção

pelas células vegetais:

→ Cátions (Ca2+, Mg2+ e K+);

→ Nitrogênio (N): na forma catiônica (amônio, NH4+) ou aniônica

(nitrito, NO2-, e nitrato, NO3-);

→ Fósforo (P): na forma de íons fosfato (HPO4-2 e H2PO4-);

→ Enxofre (S): na forma de íon sulfato (SO4-2)

c) Micronutrientes:

▪ São elementos requeridos em menores quantidades pelas células

vegetais, em concentrações micromolares (µM) e geralmente
funcionam como cofatores enzimáticos;

▪ Zinco (Zn), ferro (Fe), cobre (Cu), manganês (Mn), molibdênio (Mo),
cobalto (Co) e iodo (I);

▪ Selênio (Se), níquel (Ni) e silício

▪ Observação: o ferro (Fe) pertence a uma faixa intermediária entre os

macro e micronutrientes, pois normalmente é exigido em
concentrações menores que as do macronutrientes, mas superiores
às dos micronutrientes. Além disso, é o único elemento mineral
essencial que não é absorvido como íon livre do meio (quelato de
ferro com, ou seja, FeEDTA - absorvido facilmente pelas células).

Elemento Função

Componente de proteínas, ácidos nucleicos e

Nitrogênio (N)
algumas coenzimas; macronutrientes

Potássio (K) Regulação osmótica; principal cátion inorgânico

Síntese de parede celular, função de membrana,

Cálcio (Ca)
sinalizador celular

Magnésio (Mg) Cofator de enzimas, componente da clorofila

Componente dos ácidos nucleicos; transferência de

Fósforo (P)
energia (ATP), componente de intermediários da
 respiração e fotossíntese

Cloro (Cl) Requerido para a fotossíntese

Transferência de elétrons; componente dos

Ferro (Fe)
citocromos

Manganês (Mn) Cofator enzimático

Cobalto (Co) Componente de algumas vitaminas

Cofator enzimático; participa de reações de

Cobre (Cu)
transferência de elétrons

Zinco (Zn) Cofator enzimático; Biossíntese de clorofila

Cofator enzimático; componente da nitrato redutase

Molibdênio (Mo) (importante na absorção de fonte de nitrogênio
inorgânico)

d) Fatores de crescimento e vitaminas:

▪ As vitaminas atuam como coenzimas, exercendo papeis essenciais

para que as enzimas possam catalisar reações importantes dentro do
metabolismo primário da célula.

▪ As vitaminas usadas em cultura de tecidos pertencem ao grupo das

hidrossolúveis ou grupo B (tiamina – B1; riboflavina – B2; piridoxina –
B6; ácido pantotênico; niacina; ácido fólico; ácido ascórbico; biotina e
cobalamina)

▪ O efeito benéfico da inclusão de determinada vitamina no meio

nutritivo dependerá, em grande parte, da capacidade de biossíntese
de cada um nos tecidos ou órgãos cultivados;

▪ Os fatores de crescimento são moléculas essenciais ao

funcionamento correto do metabolismo celular, mas não são
sintetizados pelo próprio organismo;

▪ Tiamina (B1): atua na descarboxilação de α-cetoácidos;

▪ Ácido nicotínico (B3): reações de oxirredução;

▪ Piridoxina (B6): transferência de grupos amino;

▪ Biotina: transferência de CO2

▪ Ácido pantotênico: transferência de grupos acila;

 ▪ Mio-inositol: Possui função na síntese de membrana (é incorporado na
síntese de fosfolipídeos) e parede celular. Não é um requerimento
absoluto, no entanto é considerado um estimulador de processos de
crescimento in vitro e pode servir como fonte de carbono; sofre
conjugação com auxinas (auxina-inositol, inativo como regulador de
crescimento).

▪ Aminoácidos utilizados como fatores de crescimento (glicina, arginina,

asparagina, ácido aspártico, alanina, ácido glutâmico);

▪ Glicina: utilizada como fonte de nitrogênio orgânico.

e) Reguladores de crescimento (RCs):

▪ Compostos sintéticos que têm sua função semelhante ao dos

hormônios, ou seja, induzir respostas fisiológicas (indução de raízes,
brotos, alongamento de entrenós);

▪ Hormônios e RCs atuam em baixíssimas concentrações, na ordem de

mg (miligramas) ou µM (micromolares);

▪ Auxinas e citocininas, em formas naturais ou sintéticas (RC), fazem

parte do grupo de hormônios mais utilizados;

▪ Giberelinas são usadas ocasionalmente, mas etileno e ácido abscísico

são de uso muito raro.

f) Água:

▪ Solvente universal, com caráter bipolar, indispensável para dissolver

sais e formar solução;

▪ Corresponde a 95% do meio de cultura;

▪ Pode ser destilada, bidestilada e deionizada;

▪ Água destilada deve ser preferencialmente armazenada em frascos de

polietileno.

Meio White (1951):

▪ Foi utilizado durante anos como meio básico para a cultura de grande
variedade de tecidos de diferentes espécies;

▪ A mudança de padrão, ao longo de anos após seu estabelecimento,

seguiu as tentativas de otimizar o crescimento de calos in vitro;

Meio de Murashige & Skoog (MS, 1962):

 ▪ Universalmente usado, especialmente para morfogênese, cultura de
meristemas e regeneração de plantas;

▪ Caracteriza-se pela elevada concentração de sais minerais;

Meio B5 (Gamborg):

▪ Contém quantidades mais baixas de sais minerais do que o meio MS;

▪ Essas menores concentrações parecem ser preferidas pelas células de

determinadas espécies.

Wood Plant Medium (WPM/Lloyd & Mc Cown, 1981):

▪ Amplamente utilizado para propagação de arbustos e árvores, em

laboratórios comerciais;

▪ Apresenta as mesmas concentrações de NO3- e NH4+ que o meio

Anderson, além de mais potássio e alto nível de íons sulfato.

2) Como selecionar a formulação nutritiva adequada para uma determinada

espécie vegetal?

A escolha de um meio nutritivo, em geral, é baseada na literatura, na experiência

com cada espécie vegetal ou por tentativa e erro, além do explante utilizado. Quando
o requerimento de uma espécie vegetal não é conhecido, o meio nutritivo de escolha
é, em geral, o MS. Entretanto, é possível determinar experimentalmente as
concentrações adequadas de nutrientes no meio variando quatro grupos de
compostos em três concentrações (baixa, média e alta):

a) Açúcar (geralmente sacarose): 1 – 2 – 4%

b) Macronutrientes do meio MS: ¼, ½, concentração original;

c) Auxinas: 0,01 – 0,5 – 5,0 mg/L

d) Citocininas: 0,01 – 0,5 – 5,0 mg/L

Assim, a partir dos experimentos, será possível obter 34 = 81 combinações

diferentes de meios, permitindo escolher o mais adequado à espécie em estudo.

3) Por que a sacarose é a fonte de carbono mais empregada em meios de

cultura? Qual a faixa de concentração de sacarose em geral utilizada nos meios
nutritivos?

A sacarose é o carboidrato mais utilizado nos meios de cultivo na porcentagem de

3% p/v, mas pode variar de 2 a 3% p/v, ocasionalmente até 6%. Abaixo dessas
faixas, pode ocorrer clorose nas culturas e, acima dela, pode-se incorrer em
problemas de excessivo potencial osmótico do meio, provocando a deterioração das
 culturas. Esse carboidrato é considerado a melhor fonte para a diferenciação celular
e o desenvolvimento das microplantas. A sacarose é, ainda, o açúcar mais comum
encontrado na seiva do floema da maioria dos explantes sendo, assim, a principal
fonte de carbono utilizada em cultura de tecidos. Sacarose ou frutose raramente são
incluídas no meio.

4) Qual a importância do agente gelificante no meio de cultura? Pesquise sobre

agentes gelificantes alternativos ao ágar.

Importância: O agente solidificante tem a função de solidificar o meio de cultura

sólido, dando-o consistência, de forma a funcionar como suporte ao crescimento dos
explantes vegetais in vitro.

Ágar: Os meios sólidos ou semi-sólidos, tradicionalmente, são solidificados com

ágar, um polissacarídeo de alto peso molecular, extraído de algas marinhas, que
consiste em uma mistura de agarose (polímero linear) e agaropectina (ramificada e
sulfatada). É normalmente utilizado em uma concentração que varia de 0,5 a 0,7%,
sendo que o pH afeta a estabilidade do meio (solidificação dificultada em pH abaixo
de 4,0); a concentração do ágar é um fator importante, visto que, em níveis mais
altos, ele pode afetar a disponibilidade e a difusão dos ingredientes.

Fatores que afetam a consistência do meio de cultivo in vitro:

▪ Concentração do ágar utilizada (0,5 a 0,7%);

▪ pH do meio de cultivo;

▪ Concentração de sais minerais (menor concentração de sal > menos sólido);

▪ Presença de determinadas substâncias (como carvão ativado).

Vantagens do uso do ágar:

▪ Solúvel em água;

▪ Funde-se a 100 °C;

▪ Permanece semi-sólido à temperatura ambiente;

▪ Produto relativamente inerte;

Alternativas ao uso do ágar:

a) Amido de milho;

b) Gelrite: gomas obtidas de bactérias altamente puro e transparente quando

solidificado; são polissacarídeos de ácido glucurônico, ramnose e glicose; não
são tóxicas e apresentam resistência à degradação enzimática.

c) Pontes de papel ou suportes de espuma de plástico utilizados em meios

 líquidos;

d) Polpa ou massa parenquimática de maçã (subproduto da extração do

suco de maçã);

5) O que são misturas complexas e quais suas vantagens e desvantagens quando

suplementadas ao meio de cultura? Cite exemplos de misturas complexas.

São meios quimicamente indefinidos os quais não se conhece a composição química

exata. Atualmente, existe forte tendência de se utilizar meios de composição
definida, visto que misturas complexas podem ter uma composição variável de uma
fonte ou lote para outro, o que dificulta a reprodução dos resultados. Uma das
vantagens de se utilizar misturas complexas é o baixo custo de obtenção desses
materiais.

Exemplos:

▪ Hidrolisado de caseína (50 a 500 mg/L);

▪ Água de coco (5 a 20% v/v);

▪ Extrato de malte (400 a 500 mg/L);

▪ Extrato de levedura (100 a 500 mg/L)

6) Como preparar 50 mL de uma solução-estoque de picloram 2 mM, sabendo que

a sua massa molar é 241,5?

Passos:

a) Converter o valor de 2 mM em mg/L. Para isso, basta aplicar na fórmula

(mg/L)/MM = mM;

b) Isso dará um valor de 483 mg/L; isso significa que em 1000 Ml (ou seja, em
uma solução de 1 L, haverá um total de 483 mg do composto);

c) Dessa forma, basta calcular quantos mg são necessários para se ter a

mesma concentração em 50 m L de solução
Resposta: Basta diluir 24,15 mg (ou 0,02415 g) em 50 mL de H2O destilada em um
balão volumétrico.

Hormônios e Reguladores de Crescimento

1) Quais são as classes dos fitohormônios e quais são seus precursores

biossintéticos? Dentre essas classes, cite aquelas que são mais empregadas no
processo de micropropagação.
 Mais empregadas no processo de micropropagação: auxinas, citocininas e ocasionalmente
giberelinas.

2) Qual a função das Auxinas? Cite duas auxinas naturais e duas sintéticas.

Funções:

▪ Divisão, crescimento e diferenciação celular;

▪ Desenvolvimento do eixo caulinar;

▪ Quebra da dominância apical;

▪ Crescimento de gemas axilares;

▪ Desenvolvimento radicular;

▪ Desenvolvimento de flores e frutos;

▪ Abscisão foliar.

Auxinas naturais: ácido indol-3-acético (AIA), ácido fenilacético, ácido indol-3-butírico (IBA)

Auxinas sintéticas: ácido α-naftalenoacético (ANA), ácido 2,4-diclorofenóxiacético(2,4-D), 2,4,5-

triclorofenóxiacético (2,4,5-T), picloram

3) Qual a função das Citocininas? Cite duas citocininas naturais e duas sintéticas.

Muitos estudos têm mostrado que as citocininas controlam vários aspectos do

desenvolvimento vegetal, incluindo:

▪ O controle da divisão celular é de considerável significância para o

crescimento e desenvolvimento da planta e foi graças a este efeito que se
identificou esta classe de fitohormônios

▪ Induzir a divisão celular em calos, na presença de auxinas;

▪ Promover a formação de parte aérea ou raízes em cultura de tecidos, quando

aplicada em proporção adequada com auxinas;
 ▪ Retardar a senescência de folhas;

▪ Promover a expansão de cotilédones em dicotiledôneas

Citocininas naturais: zeatina, 6-(y-y-dimetilamino)purina (2-iP), dihidrozeatina e a isopentenil

adenina.

Citocininas sintéticas: thidiazuron (TDZ), 6-benzilaminopurina (BAP), cinetina (CIN)

4) Explique como o balanço Auxina-Citocinina interfere na organogênese.

A proporção ou balanço auxina/citocinina em meio de cultura, há muito, é aceita como

determinante para a resposta organogênica. Altas razões auxina/citocinina geralmente induzem à
formação de raiz, enquanto baixas proporções induzem à formação de brotos. Em meios com
razões intermediárias de auxina/citocinina ocorre proliferação celular desorganizada, como calos
(TAKAHASHI, 2002).

5) Como as poliaminas são empregadas no cultivo in vitro de tecidos vegetais?

As poliaminas são policátions encontrados em células animais e vegetais, como as putrescinas, as

espermidinas e esperminas, estando envolvidas na divisão e alongamento celulares, enraizamento
e formação de tubérculos, iniciação floral, maturação de frutos e de grão de pólen.

As poliaminas vêm sendo utilizadas como reguladores vegetais, buscando-se sempre obter
diversos tipos de respostas, tais como embriogênese (YADAV & RAJAM, 1997), enraizamento
(RUGINI, 1992), formação de prococormos (SAIPRASAD et al., 2004), entre outros. Além de as
poliaminas demonstrarem efeitos durante os eventos organogenéticos (TANG et al., 2004), são
atribuídos a estas substâncias efeitos antioxidantes, exercendo proteção às células, incluindo
membranas, ácidos nucléicos e ácidos graxos polinsaturados de danos oxidativos (LOVAAS,
 1997). Segundo LOVAAS (1997), as poliaminas atuam como quelantes de metais, diminuindo sua
ação oxidativa nas células.

A oxidação de tecidos vegetais cultivados in vitro é um fenômeno observado em diversas espécies,

ocorrendo também com freqüência em calos (TANG et al., 2004). Foi relatado que a peroxidase
(EC 1.11.1.7) apresenta alterações na atividade em tecidos que mostram algum tipo de
escurecimento (LAUKKANEN et al., 2000). Já as poliaminas exercem efeito protetor e, quando
usadas exogenamente, tendem a induzir menor taxa de oxidação, promovendo uma diminuição na
atividade da peroxidase (TANG et al., 2004).

6) De que forma a liberação de etileno afeta o cultivo in vitro de tecidos vegetais?

Cite inibidores da síntese e da ação do etileno.

O etileno pode ser produzido pelo explante cultivado in vitro, influenciando a

morfogênese das plantas em muitos aspectos, de forma a promover a oxidação
fenólica, a queda foliar e vitrificação (hiperhidricidade) dos explantes. Por isso, não é
um hormônio comumente utilizado em cultura de tecidos vegetais. Em muitas
espécies, a síntese de etileno é induzida por auxina.

Inibidores da síntese do etileno: aminoetoxi-vini-glicina (AVG), ácido salicílico,

cloreto de cobalto

Inibidores da ação do etileno: nitrato de prata (AgNO3), tiossulfato de prata

(Ag2S2O3), CO2 e 2,5-norbonadieno.

Micropropagação, Orgânogenese, Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas

1) Quais são os estágios da micropropagação?

Estágios da Micropropagação segundo Murashig (1974):

a) Estágio I: seleção de explantes, desinfestação e cultivo em meio nutritivo sob

condições assépticas;

b) Estágio II: multiplicação dos propágulos mediante sucessivas subculturas em

meio próprio para a multiplicação dos explantes vegetais;

c) Estágio III: transferência das partes aéreas produzidas para meio de

enraizamento e subsequente transplantio das plantas obtidas para substrato
ou solo (aclimatação).

Etapas da Micropropagação segundo Debergh e Maene (1981):

a) Etapa 0: seleção da plana matriz e preparação da fonte de explantes (esse

estágio é citado às vezes, correspondendo ao tratamento dado a uma planta-
 matriz, de onde são retirados os explantes);

b) Etapa I: estabelecimento de uma cultura asséptica;

c) Etapa II: produção de propágulos (multiplicação);

d) Etapa III: preparação para crescimento no ambiente natural

IIIa: alongamento das gemas ou brotos;

IIIb: enraizamento dos brotos in vitro ou extra vitrum

e) Etapa IV: transferência para o ambiente natural

2) Cite exemplos de explantes empregados no cultivo in vitro. Que fatores devem

ser levados em conta ao selecionar o tipo de explante que será usado na
micropropagação?

Formas pelas quais pode ser realizada micropropagação (sistemas de

micropropagação):

a) Multiplicação por meio da proliferação de gemas axilares (presentes nos

segmentos nodais das plantas);

b) Multiplicação por meio da indução de gemas adventícias por organogênese

(direta ou indireta, passando pela fase de calo);

c) Multiplicação por meio de embriogênese somática.

Exemplos de explantes:

▪ Fragmentos de raízes, hipocótilos, epicótilos, cotilédones, flores e folhas,

grãos de pólen, embriões, óvulos, nós, gemas axilares ou apicais.

▪ Posição do explante na planta → influencia o crescimento e

desenvolvimento in vitro após isolamento do explante

▪ Teste de viabilidade do explante → análise com 2,3,5-trifeniltetrazólio → cor

avermelhada → explante viável

Iniciação e estabelecimento das culturas: a iniciação e o estabelecimento das

culturas in vitro inicia-se com a seleção dos explantes mais adequados para a
micropropagação e termina com a obtenção de cultura livre de contaminantes
visíveis e suficientemente adaptadas às condições in vitro. Os principais aspectos a
serem considerados nessa fase inicial são:

a) Condição da planta matriz;

b) Descontaminação
 c) Manejo dos explantes iniciais

Seleção da planta matriz para retirada de explantes

Para seleção da planta matriz a ser utilizada para a retirada de explantes, devem
ser considerados alguns fatores como:

a) Genótipo da planta:

▪ Grande variação da capacidade regenerativa no reino vegetal; cada

espécie apresenta características genéticas únicas, o que define
necessidades únicas para seu cultivo in vitro;

▪ Dicotiledôneas apresentam maior capacidade de regeneração do

que monocotiledôneas;

▪ Gimnospermas apresentam capacidade limitada de regeneração.

b) Idade da planta matriz

▪ Tecidos embriogênicos apresentam alta capacidade de regeneração;

▪ Plantas mais velhas → menor capacidade de regeneração

▪ Partes juvenis → preferencialmente usadas

c) Idade do tecido ou órgão

▪ Explantes coletados de regiões meristemáticas juvenis

▪ Retirada de explantes → deve ser feita de preferência a partir de

brotações novas formadas durante a fase ativa de crescimento da
planta

▪ Tecidos novos e tenros (não lenhosos) → mais apropriados para

manipulação in vitro

d) Estado fisiológico

▪ Grande influência na divisão celular e regeneração;

▪ Estado nutricional → plantas bem nutridas, sem sintomas de

deficiência nutricional ou hídrica, fornecem explantes melhores;

▪ Explantes retirados da fase vegetativa → regeneram prontamente in

vitro

e) Estado fitossanitário

▪ Desinfestação: remoção de contaminantes existentes na superfície

dos explantes oriundos de material de campo ou de casa de
 vegetação

▪ Condição fitossanitária → determina a facilidade em

descontaminar o explante durante o isolamento

▪ Microrganismos endógenos → não são expostos aos agentes

desinfestantes → devem ser controlados na planta matriz

Seleção e coleta dos explantes finais:

▪ Nível de diferenciação do tecido utilizado → gemas apicais

geralmente apresentam maior capacidade de crescimento do que gemas
axilares (dominância apical); devido pequeno número de gemas apicais,
pode ser necessário o uso de gemas axilares.

▪ Finalidade de micropropagação → o tamanho do explante depende da

sua finalidade → ex: limpeza clonal → quanto menor o explante isolado,
maior a chance de sucesso → o tamanho também determina suas
possibilidades de sobrevivência e capacidade de crescimento

3) Discorra sobre a importância da desinfestação de explantes na

micropropagação. Quais são os agentes de desinfestação mais usados?

Importância: a desinfestação dos explantes utilizados para a micropropagação é

uma etapa essencial para materiais vindo do campo ou de casas de vegetação, visto
que a retirada superficial de contaminantes, como microrganismos, dos explantes, é
necessária para o crescimento e desenvolvimento adequados do material vegetal em
condições assépticas/estéreis, evitando a contaminação do meio nutritivo durante o
processo de micropropagação in vitro.

Maior dificuldade: obtenção de tecido descontaminado sem conduzi-lo a morte

quando isolado.

Agentes desinfestantes:

▪ Álcool (etanol) 70%

▪ Hipoclorito de sódio (NaClO) – 1 a 1,5% de cloro ativo

▪ Hipoclorito de cálcio [Ca(ClO)2] – 35-100 g/L por 5 a 30 min; deve ser filtrado
e não armazenado; indicado para plantas sensíveis ao uso de alvejantes;

▪ Cloreto de mercúrio (HgCl2) – 0,01 a 0,05% por 2 a 12 min; altamente tóxico;

▪ Plant Preservative Mixture (PPM): biocida estável em alta temperatura; amplo

espectro de componentes; pode afetar o ciclo de Krebs e a CTE nos
microrganismos;
 ▪ Peróxido de hidrogênio (H2O2): 3 a 12%; 5 a 30 min

▪ Ácidos ou bases concentradas (como o ácido clorídrico);

▪ Outros tipos de álcoois (isopropanol);

▪ Bases quartenárias (como triquartenários de amônio)

▪ Algumas gotas de detergentes são comumente adicionadas às soluções a

base de cloro para melhorar o contato das soluções com os tecidos (Tween
20 é comumente utilizado → diminuição da tensão superficial)

▪ Pré-lavagem dos explantes com água corrente;

▪ Imersão do tecido por alguns segundos em álcool 70% (com água

autoclavada).

Substâncias utilizadas para controle de contaminação endógena

▪ Fungicidas: Benlate, também chamado de Benomyl

▪ Antibióticos: utilizados para o controle de contaminações bacterianas

endógenas, que frequentemente representam sério problema no
estabelecimento de culturas → claforam (cefotaxima sóica), estreptomicina,
timetina, canamicina, carbenicilina, rifampicina, tetraciclina

4) Luz, temperatura, pH e concentração de gases são fatores físicos que

influenciam na micropropagação. Qual a importância de cada um?

Esses fatores físicos influenciam uma série de processos, como absorção de água,
evaporação, fotossíntese, respiração, crescimento e desenvolvimento.

Luz: em um laboratório de cultura de tecidos, é necessário cuidar da energia

radiante para promover um bom desenvolvimento do material vegetal. Em
relação à luz, existem três características principais que devem ser observadas

a) Fotoperíodo:

▪ O fotoperíodo é a duração do dia em relação à noite em um tempo de

24 horas. Fotoperiodismo é a reação da planta a esse tempo.

▪ O fotoperíodo de plantas cultivadas in vitro tende a ser de dias longos

(16 horas de luz por 8h de escuro, ou seja, 16/8) para evitar a indução
de dormência.

▪ Outros fotoperíodos são: 12h luz/12h escuro e 14h luz/10h escuro.

b) Irradiância

▪ Para a grande maioria das espécies, a incubação inicial na luz, com

intensidade de 20 a 70 mmol.m-2.s-1 é satisfatória.

▪ A irradiância normalmente utilizada é de 30 µmol m-2s-1), visto que

 essa quantidade é suficiente para os requerimentos normais de
carbono das plantas, já que a outra parte é complementada pela
sacarose do meio.

▪ A energia emitida nessa radiância deve conter radiação

fotossinteticamente ativa (PAR), correspondente à faixa de 400 nm a
700 nm, comprimentos de onda mais efetivos para a fotossíntese.

▪ A luz é fornecida por lâmpadas fluorescentes tipo branca fria ou gro-

lux ou, ainda, combinando as duas para fornecer um espectro de luz
mais amplo.

c) Composição espectral:

▪ A energia emitida em determinada irradiância deve conter radiação

fotossinteticamente ativa, correspondente à faixa de 400 a 700 nm,
comprimentos de onda luminosos mais efetivos para a fotossíntese.

▪ Os fótons emitidos na região ultravioleta são mais energéticos do que

os da região vermelha (quanto maior a energia, menor o comprimento
de onda);

▪ Diferentes comprimentos de onda podem favorecer ou desfavorecer

respostas morfogenéticas;

▪ A luz da região azul pode estimular um tipo de organogênese

(raiz/brotos) e a luz vermelha outro tipo.

Temperatura:

▪ A temperatura é um fator ambiental que regula o crescimento das plantas, o

que corre de diferentes maneiras e depende do tipo de planta, ou seja, se ela
é de clima temperado ou tropical.

▪ No entanto, na cultura in vitro, essas diferenças são minimizadas, já que as

condições experimentais são padronizadas nos laboratórios.

▪ A maior parte das culturas cresce satisfatoriamente em temperaturas que

variam de 23 a 27 °C e, portanto, é necessário um sistema de refrigeração
com controle automático de temperatura para reduzir ao mínimo essas
variações entre dia e a noite.

▪ Algumas espécies são favorecidas com incubação inicial em temperaturas

baixas, o que pode contribuir para quebrar a dormência das gemas.

pH: o pH do meio pode afetar a absorção de nutrientes pela planta, bem como a
disponibilidade de determinado nutriente presente no meio.

Concentração de Gases (O2 e CO2): a concentração desses gases no meio pode

afetar significativamente as taxas respiratórias, o que afeta diretamente o
 crescimento e o desenvolvimento vegetal.

5) Em caso de detecção de oxidação dos tecidos cultivados in vitro, aponte

alternativas para reduzir esse processo.

Oxidação fenólica: é um problema comumente encontrado durante o isolamento de

explantes, visto que compostos fenólicos são liberados por células danificadas
durante o corte do tecido desejado. Os produtos da oxidação são tóxicos ao resto do
explante e se difundem no meio de cultura, escurecendo-o.

Soluções viáveis:

▪ Lavagem, em água corrente, dos explantes coletados antes da desinfestação,

auxiliando a lixiviação de compostos fenólicos;

▪ Utilização de substâncias antioxidantes, como o ácido ascórbico, ácido

cítrico, PVP (polivinilpirrolidone) e carvão ativado (no meio ou na forma de
banho);

▪ Incubação inicial dos explantes no escuro ou sob intensidade luminosa

reduzida;

▪ Utilização de meios básicos mais diluídos e redução da concentração de

fitorreguladores (sobretudo citocininas);

▪ Transferência frequentes dos explantes, eliminando as porções escuras de

tecido, ou renovação de meio, no caso de meio líquido.

6) Em que fase da micropropagação a suplementação exógena de giberelina pode

ser requerida?

Giberelina, na forma de ácido giberélico (GA3), pode ser útil para induzir
alongamento de partes aéreas na fase de multiplicação da propagação in vitro. Sua
inclusão é pouco frequente em meios de cultivo in vitro devido a um suprimento
endógeno eficiente.

O mais conhecimento efeito desse grupo de hormônios, o alongamento de partes

aéreas, pode ser explorado in vitro. Quando as partes aéreas produzidas não estão
em condições de ser individualizadas para a próxima etapa da micropropagação (o
enraizamento), devido ao seu tamanho, o cultivo na presença de GA3 pode provocar
o alongamento e ser útil nessa individualização. Nessa fase, geralmente, não se
consegue estimular uma resposta uniforme de alongamento em todas as partes
aéreas.

Além do aspecto de eficiência, a fase de alongamento é antieconômica por

demandar mão-de-obra adicional que não resulta em multiplicação, e sim num
simples ajuste das culturas. Assim, na determinação de um protocolo de
 micropropagação, os esforços devem ser concentrados na otimização do balanço de
citocinina e auxina, a fim de produzir partes aéreas suficientemente alongadas para
passagem direta da fase de multiplicação para o enraizamento.

7) De que forma a vitrificação e a variação somaclonal podem comprometer o

processo de micropropagação?

Vitrificação:

▪ Alguns genótipos de plantas podem apresentar distúrbios fisiológicos ou

morfológicos, conhecidos como vitrificação ou hiperhidricidade.

▪ Os explantes vitrificados caracterizam-se por apresentarem folhas

translúcidas, túrgidas e com aspecto encharcado, apresentando brotações
malformadas e alongadas, de modo que se cultivados em meio de
enraizamento apresentam baixo percentual.

▪ Adicionalmente, plantas vitrificadas não sobrevivem ao transplante para o

solo porque, dentre outros fatores, possuem menor teor de massa seca que
as normais e são menos lignificadas.

▪ Sendo assim, este fenômeno pode causar perdas significativas no processo

de propagação in vitro, inviabilizando um programa comercial de produção de
mudas (Hazarika, 2006)

Causas da vitrificação:

▪ Altas concentrações de citocinina no meio de cultura

▪ Baixa concentração do agente solidificante,

▪ Excesso de fatores nutricionais e baixa densidade de fluxo luminoso.

▪ Ocorre com maior frequência em meio líquido ou com baixa concentração de

ágar, com altas concentrações de íons de amônia e elevadas concentrações
de citocinina.

Variação somaclonal:

▪ Variação somaclonal é uma variação fenotípica de origem genética, ou seja,

uma variação cromossômica que se torna herdável nas gerações seguintes,
ou epigenética, que é uma variação transitória devido ao estresse fisiológico
que o material sofre, quando submetido ao cultivo in vitro, variações essas
existentes entre somaclones (soma = vegetativo; clone = cópia idêntica).

▪ A maior utilidade de qualquer sistema de micropropagação pode ser limitada

devido à ocorrência de mudanças genéticas ainda não completamente
 elucidadas e que induz a geração de variações somaclonais.

▪ Em um programa de micropropagação de porta- enxertos, é de suma

importância para a produção de materiais de matrizes, o controle das
variações somaclonais de qualquer natureza, sendo externas ou internas na
planta.

▪ Caso seu surgimento não seja detectado na fase inicial de ocorrência, a

variação pode ser multiplicada rapidamente e ocasionar à perda das
características desejáveis das plantas matrizes nas novas plantas
multiplicadas in vitro.

▪ Além disso, esta instabilidade genética pode ser um risco associado à

aplicação de técnicas de cultivo in vitro para a conservação e intercâmbio de
germoplasma.

Soluções viáveis:

▪ Acompanhamento e monitoramento de plantas matrizes, verificando

rotineiramente o ambiente e as condições as quais elas são mantidas;

▪ Uso de marcadores morfológicos para acompanhar a ocorrência ou não de

variação somaclonal que possa surgir ao longo do desenvolvimento da planta
matriz;

▪ Dar preferência a métodos de propagação que não passem pelo estágio de

calos, como a organogênese direta;

▪ A forma mais eficiente e precisa de identificar e monitorar essas variações

genéticas em uma cultivar é pelo uso de marcadores moleculares e/ou
citometria de fluxo.

8) Conceitue totipotência, competência celular e determinação celular.

Totipotência ou totipotencialidade: totipotência é a capacidade da célula de sofrer divisão e gerar

um organismo completo; totipotencialidade é o potencial de uma célula vegetal para reproduzir um
organismo inteiro.

Competência celular: capacidade das células de reagirem a sinais (como reguladores de

crescimento) específicos de desenvolvimento. Diz respeito à capacidade das células em expressar um
potencial inerente.

Determinação celular: processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma célula torna-se
limitado a uma rota específica. A determinação celular diz respeito a uma canalização progressiva no
desenvolvimento.

Crescimento: termo quantitativo, relacionado a mudanças de tamanho e/ou massa. Em muitos

estudos é importante medir o crescimento e, teoricamente, isto pode ser feito acompanhando-se o
aumento em volume, massa, número de células, quantidade de protoplasto, além do aumento em
complexidade. No entanto, em plantas, o crescimento é avaliado principalmente por aumento em
tamanho ou em massa.

Diferenciação: é um termo qualitativo, que reflete um processo de especialização celular. A

diferenciação ocorre quando uma célula em divisão produz duas novas células que serão destinadas a
assumir diferentes características anatômicas e diferentes funções.

Desdiferenciação: Em muitos casos, uma célula madura (diferenciada ou especializada), poderá ser
estimulada a funcionar como uma célula meristemática. Isto é conhecido como desdiferenciação. Em
cultura de tecidos, uma célula madura poderá originar uma planta inteira. Esta habilidade para
desdiferenciar-se demonstra que células diferenciadas (maduras) retém toda a informação genética
requerida para o desenvolvimento de uma planta inteira, uma propriedade conhecida como
totipotência. Isto é bastante útil na cultura de tecidos e permite a obtenção dos clones.

Desenvolvimento (crescimento + diferenciação): deve ser aplicado num sentido mais amplo,
significando a soma dos processos de crescimento e diferenciação. Ele refere-se ao conjunto de
mudanças que um organismo experimenta ao longo de seu ciclo, desde a germinação da semente,
passando pela maturação e florescimento e, finalmente, chegando à senescência. O termo
desenvolvimento aplica-se também para células, tecidos e órgãos. O desenvolvimento também se
manifesta em nível subcelular e bioquímico, tais como ocorre quando folhas mantidas no escuro são
transferidas para a luz (neste caso desenvolvem-se os cloroplastos e as enzimas da fotossíntese
tornam-se ativas).

Morfogênese: integração entre o crescimento (mudanças quantitativas) e diferenciação (alterações

qualitativas) mediada por divisão e especialização celular. Refere-se à aparência ou desenvolvimento
estrutural da planta (formação dos diferentes órgãos).

9) Faça a distinção entre organogênese e embriogênese somática. Os dois processos podem

ocorrer de forma direta ou indireta. Qual a implicação desse fato para o cultivo in vitro de
tecidos vegetais?

Organogênese ou Morfogênese

Definição: é a criação de uma nova organização celular nos tecidos e o surgimento de novos
órgãos, onde antes eles não existiam, os quais são chamados de “adventícios”. Assim, tecidos ou
órgãos que possuem a capacidade para morfogênese são conhecidos como morfogênicos ou
organogênicos. A cauligênese (brotos), a rizogênese (raízes) e a embriogênese (embriões
somáticos) são os tipos de organogênese mais importante para a multiplicação vegetal.

▪ Organogênese direta: é a formação de meristemas/meristemoides (de forma adventícia)

diretamente a partir de células diferenciadas de um tecido vegetal, sem a proliferação de
calos.

▪ Organogênese indireta: é a formação de meristemas/meristemoides (de forma adventícia)

indiretamente a partir de células indiferenciadas ou desorganizadas (calos) ou ainda de
 culturas de células em suspensão. Dessa forma, a organogênese indireta depende da
proliferação de calos.

- Muitas vezes, não é possível fazer uma clara distinção entre essas formas, uma vez que é comum
a ocorrência simultânea dos dois tipos de organogênese em um mesmo explante;

- Dessa forma, pode-se dizer, resumidamente, que os estágios da organogênese são:

1) competência celular;

2) células competentes passam à condição de determinadas, ou seja, comprometidas a

seguirem um novo programa genético particular de desenvolvimento morfogênico, sendo que
essa programação pode ser direta ou indireta;

3) o último estágio é aquele em que as células ou tecidos tornam-se morfologicamente

diferenciadas de acordo com o programa previamente assumido;

- O controle do tipo de organogênese depende do balanço de hormônios exógenos, mas somente

na fase de indução;

- A adequada combinação de auxina e de citocinina exógena pode interferir no balanço interno das
citocininas endógenas e desencadear uma resposta de indução de novos meristemas e brotos

Organogênese e balanço hormonal

▪ Raízes são rotineiramente induzidas em resposta à aplicação de auxinas dentro de

estratégias de regeneração de plantas → fluxo de auxina é determinante da canalização da
diferenciação de tecidos vasculares;

▪ A adequada combinação auxina-citocinina pode interferir no balanço interno das citocininas

endógenas → indução de novos meristemas de brotos

▪ Presença constante ou excessiva de citocininas e de auxinas → pode desequilibrar

exageradamente o balanço hormonal endógeno dos explantes → inibição das respostas
desejadas

▪ O balanço hormonal endógeno dos explantes também pode ser afetado pela osmolaridade
do meio e pela fonte de carbono disponível

Embriogênese somática

Definição: A embriogênese somática é o processo pelo qual células haploides ou somáticas

desenvolvem-se por meio de diferentes estágios embriogênicos, sendo um exemplo substancial da
totipotencialidade da célula vegetal que pode implicar na regeneração de uma planta inteira. Em
outras palavras, corresponde ao início da formação do embrião e ao seu desenvolvimento a partir
de células diferentes dos gametas que formam o zigoto em um processo de reprodução normal.

▪ Direta (ESD): implica a existência de células somáticas competentes e/ou pré-embrionárias

que são capazes de empreender a via embriogênica do explante primário, podendo
 constituir-se em embriões com pouca reprogramação em relação à modalidade indireta. Em
outras palavras, o embrião somático origina-se diretamente do explante sem passar pela
fase de calo.

▪ Indireta (ESI): a ESI derivada de células de um órgão implica, por sua vez, em sucessivas
desdiferenciações celulares e em reorganização da sua fisiologia, de seu metabolismo e de
sua expressão
 gênica na constituição do embrião. Em outras palavras, a embriogênese
somática indireta se desenvolve a partir de células de calos.

10) Embriogênese somática é o processo pelo qual células somáticas

desenvolvem-se por meio de diferentes estágios embriogênicos. Cite e
caracterize esses estágios.

O fenômeno da ES, sob condições de cultivo in vitro, produz as mesmas etapas de

desenvolvimento dos embriões zigóticos, como os seguintes estágios de
desenvolvimento:

▪ Globular

▪ Coração/Cordiforme

▪ Torpedo

▪ Amadurecimento/Cotiledonar

11) Quais são as etapas de regeneração via embriogênese somática? Em que

condições experimentais a embriogênese somática é induzida? Explique que
mecanismo moleculares estão associados à indução da embriogênese somática.

Etapas de regeneração da ES:

1. Iniciação de culturas embriogênicas → cultivo dos explantes em meio

suplementado com reguladores de crescimento (auxina e citocinina);

2. Proliferação de culturas embriogênicas → meio semi-sólido ou líquido

suplementado com reguladores de crescimento;

3. Pré-maturação de embriões somáticos → meio sem reguladores de

crescimento → inibe a proliferação e estimula a formação dos embriões
somáticos;

4. Maturação do ES → cultivo em meio com ABA e/ou potencial osmótico

reduzido;

5. Desenvolvimento das plantas → meio sem reguladores de crescimento

10) Descreva um método para obtenção de sementes sintéticas.
Quais as vantagens e desvantagens dessas sementes?

Sementes sintéticas: tratam-se de embriões somáticos, brotos

ou outros tecidos artificialmente encapsulados, que possam ser
utilizados para o cultivo in vitro ou ex vitro.

Desenvolvimento de sementes sintéticas: é uma modalidade de

cultura de tecidos de plantas que consiste em encapsular
embriões somáticos, ápices caulinares ou gemas axilares.

Método de obtenção: a produção de sementes sintéticas

combina os benefícios da propagação clonal com o
armazenamento de sementes. Diversos estudos utilizam o
encapsulamento de explantes durante a fase de propagação
clonal, para o armazenamento a curto prazo. Essa tecnologia de
encapsulamento tem como foco o fornecimento de
germopplasma e estudos analíticos variados.

Procedimento:

Produção das sementes

Pode-se isolar embriões somáticos de calos de determinadas

espécies com o uso de agulhas em câmara de fluxo laminar e,
posteriormente, transferir esses embriões para uma matriz de
alginato de sódio. Posteriormente, deve-se retirar esses
embriões para goteja-los em solução de cloreto de cálcio, na
qual devem permanecer (20 min) para complexação. Depois,
deve-se imergir essas estruturas em água destilada estéril para
retirar o excesso de cloreto de cálcio e depositar as sementes
sintéticas em placa de petri a uma determinada temperatura por
7 dias.

Regeneração dos embriões somáticos encapsulados

Depois do período de armazenamento, deve-se imergir as

unidades em solução de nitrato de potássio para
descomplexação das cáspsulas e, posteriormente, lavar as
sementes em água destilada estéril. Pode-se inocular essas
 estruturas em meio MSN, as quais serão mantidas sob
fotoperíodo de 12h e temperatura de 27 °C em sala de cultura
para a regeneração.

Vantagens:

▪ Propagação rápida de clones selecionados;

▪ Uniformidade genética das plantas;

▪ Transferência direta para o campo sem ter que passar por fase
de transplantio e aclimatação;

▪ Facilidade de transporte;

▪ Redução de espaço para armazenamento;

▪ Redução de custos na propagação vegetativa de linhagens

superiores.

Exercícios da Parte Prática

1) Sabendo que uma solução estoque de BAP possui a

molaridade 1mM, qual a concentração comum dessa
solução em mg/mL? R: 0,2253 mg/mL

2) Para preparar 30 mL uma solução estoque de ANA a 0,002M,

quantos miligramas do regulador de crescimento serão
necessários? Sabendo-se que se trata de uma auxina, como
você prepararia essa solução? Se a solução estoque a ser
preparada fosse de uma citocinina, o que seria alterado
nesse processo? R: 11,172 mg de ANA; Após a pesagem do
regulador, deve-se dissolver a auxina em etanol (álcool) ou em
uma base, como o NaOH e, em seguida, deve-se aquecer
levemente e completar o volume com água destilada estéril. O
mesmo procedimento deve ser seguido para preparo de solução
de citocinina, com exceção de que a citocinina deve ser
dissolvida em ácido, como HCl.

3) Para a obtenção de plantas de alface in vitro utilizando-se

 cotilédones como explantes é necessário preparar um meio
nutritivo Murashige e Skoog com 3% de sacarose e 0,8% de
ágar, suplementado com 0,54 µM de ANA e 0,44 µM de BAP.
Na preparação de 600 mL desse meio nutritivo, quantos
gramas de sacarose e de ágar deverão ser adicionados?
Utilizando-se as soluções estoque descritas nos itens
anteriores, quantos mililitros de cada solução de
reguladores de crescimento serão necessários nesse
preparo? R: 18g de sacarose; 4,8g de ágar; 162 microlitros de
ANA

4) O cultivo de explantes foliares de noni em meio MS

suplementado com 5,0 mg/L de BAP, 1,0mg/L de Kn e 1,0
mg/L de IBA resultou em uma alta frequência de formação
de calos e um elevado número de brotamentos. Qual a
concentração molar de cada um desses componentes no
meio nutritivo? R: BAP: 22,19 µM; Kn: 4,64 µM; IBA: 4,92 µM

5) Para a desisfestação superficial de explantes radiculares de

cenoura, é necessário preparar duas soluções utilizando
água destilada estéril: etanol 70% e hipoclorito de sódio com
1% de cloro ativo. Quantos mililitros de etanol e de
hipoclorito serão necessários no preparo de 400 mL de cada
uma dessas soluções, assumindo que o teor de cloro ativo
do hipoclorito de sódio P.A. seja 3%. R: 280 ml de etanol;
133,3 ml de hipoclorito de sódio

6) A sacarose é a fonte de carbono mais utilizada em meios

nutritivos para cultura de tecidos vegetais. Se em um meio
nutritivo esse açúcar está presente a 0,0730 M, qual a sua
concentração em ppm? R: 24,99 x 10-3 ppm