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Instituto de Medicina Tradicional

Departamento de Estudos Superiores


Ano lectivo 2013/2014

CULTURA DE CLULAS E TECIDOS

Biotecnologia vegetal I

Docente: Fernando Pessoa


Discentes: Ana Rodrigues n6458
Andr Tam n 6507
Diana Mendes n6561

Naturopatia e Cincias Tradicionais Holsticas 3A

Histria e Fundamentos da Cultura de clulas e tecidos


Totipotncia celular
Desdiferenciao celular
Organognese

Condies de cultura e os seus efeitos fisiolgicos


Tipos de cultura e suas aplicaes
Morfognese directa e indirecta
Embriognese somtica directa e indirecta
Produo da semente artificial

Cultura de protoplastos e produo de hbridos somticos


Culturas in vitro de rgos, tecidos e clulas em suspenso
Cultura em clulas e engenharia gentica transformao de
plantas
Aplicaes produo de plantas melhoradas e sntese de novos
produtos
Aplicao da cultura de clulas vegetais em produo agrcola,
florestal e indstrias biotecnolgicas

Histria da cultura de clulas e tecidos


1838-1939 - Estabelecimento da teoria celular Schwann e Schleiden
1865- Leis da hereditariedade Mendel
1838 1870 -Teoria da evoluo + ensaios sobre fototropismo e seleco
artificial + estudos de florao- Darwin
1902 - Culturas de tecidos vegetais em condies laboratoriais - Haberlandt
1908 - Cultura de tecidos vegetais, culturas de segmentos caulinares de choupo
(formao de gemas e razes) - Simon
1922 - Culturas de razes de ervilheira e milho Kotte
1924 - Formao de calos em culturas de cenoura Blumenthal e Meyer

Histria da cultura de clulas e tecidos

1926 - Reconhecimento de que a auxina (cido-3-indol actico IAA) promove


divises celulares em tecidos vegetais Went

1936 Descoberta da importncia das auxinas em cultura vegetal - Skoog


1939 - Obteno de culturas in vitro de forma indefinida (Perodo observacional)
White, Gautheret e Nobcourt

1953 - DNA molcula da hereditariedade - Watson e Crick


1958 - Demonstrao da totipotncia das clulas vegetais Reinert , Steward et al.
1960 - Obteno de protoblastos atravs de processos enzimticos Cocking

1962 - Importncia de vrios elementos minerais e citocininas (meio de cultura MS)


Murashige e Skoog
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Fundamentos da cultura de clulas e tecidos

1
2

Totipotncia celular

Desdiferenciao celular

Organognese

Totipotncia celular

Capacidade que as clulas vegetais possuem


de, quando em cultura, darem origem a
novas plantas sem a interveno de um
processo de reproduo sexuada;
Base da reproduo assexuada das plantas;
Todas as clulas de um organismo provm de
uma clula ovo ou zigoto. Neste sentido
pode afirmar-se que o corpo de uma planta
um clone ou zigoto ( excepo dos
gametfitos).

Desdiferenciao celular

1 passo - cultura de um fragmento de uma folha ou de outro tipo de rgo


vegetal (explante) num meio de cultura adequado;
2 passo - a estrutura organizada da folha modificada, devido ao facto de
determinadas clulas sofrerem um processo de certa forma inverso da
diferenciao;
3 passo reverso do estado meristemtico, mitoses sucessivas;
4 passo - formao de um calo em que as clulas so relativamente uniformes
em termos morfolgicos dividindo-se mais ou menos activamente.

Desdiferenciao celular

Organognese

Processo pelo qual clulas e tecidos so induzidos a sofrer determinadas


modificaes que levam produo de uma estrutura unipolar, nomeadamente
um primrdio radicular ou caulinar (flores tambm podem ser formadas), cujo
sistema vascular est em conexo com tecidos de origem.
A organognese pode ser conseguida atravs da cultura dos mais variados tipos
de rgos vegetais sejam folhas, razes, caules, hipoctilos, ptalas e spalas.

Organognese

Organognese directa
Explante cultivado num meio de
cultura, formam-se meristemas
adventcios que se desenvolvem
em rebentos caulinares e que,
depois de enraizados, formam
novas plantas.

Organognese indirecta
Formao de um calo a partir
do qual se diferenciam gemas,
seguindo-se depois um
processo de enraizamento tal
como na organognese directa.

Organognese

Embora vrios factores possam influenciar a resposta organognica, desde h


muito que se conhece que este tipo de morfognese regulado por um balano
entre auxinas e citocininas;
Auxinas e citocininas so necessrias para que divises celulares e alongamento
ocorram;

A elevada relao auxina/citocinina favorece a formao de razes enquanto uma


situao inversa era responsvel pela formao de gemas caulinares;
Para alm das auxinas e citocininas verificou-se que outros compostos podem
tambm afectar a resposta organognica.

Condies de Cultura e os seus efeitos fisiolgicos


O meio nutritivo composto por componentes
essenciais e opcionais

Essenciais
- Sais inorgnicos;
- Hidratos de carbono;

Opcionais

- Vitaminas;

- Azoto orgnico;

- Reguladores de crescimento;

- Aminocidos;

- gua.

- Substncias complexas.

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MACRONUTRIENTES: N, K, P, Ca, S, Mg
(So usados em quantidades milimolares)
Para a grande maioria dos propsitos da cultura in vitro o meio dever conter pelo
menos entre 25 a 60 mM de azoto inorgnico.
As clulas podem crescer com nitrato(NO3 -) como nica fonte de azoto, no entanto
geralmente observa-se um efeito benfico se for incorporado amnio(NH4 +) 25 40 mM

As clulas vegetais podem ainda utilizar outras fontes de azoto: -Ureia, Glutamina,
Casena hidrolisada.
K - 20 mM ou mais, podendo ser adicionado na forma de nitrato (KNO3), cloreto (KCl)
ou fosfato (KH2PO4)
P
Mg
S
Ca

A adio de sulfato de magnsio (MgSO4.7H2O), satisfaz normalmente tanto as


necessidades de magnsio como de enxofre.
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MICRONUTRIENTES: Fe, Mn, Zn, Bo, Cu, Co e Mo


(So usados em quantidades micromolares)
Fe - O Ferro normalmente utilizado sob a forma de quelato (FeEDTA) e
importante para a formao dos percursores da clorofila.
Cu e Zn - So importantes na oxidao dos compostos fenlicos
B - necessrio para manter a actividade meristemtica, estando envolvido na
sntese das bases azotadas, especialmente o uracilo.
Co - Componente essencial da vitamina B12
Relao com a actividade dos reguladores de crescimento
Zn - Auxinas : O zinco, est directamente relacionado com a sntese do
triptofano, precursor do IAA.

B - Auxinas/Citocininas: Uma carncia em Boro, aumenta o balano


auxina/citocinina, uma vez que a sntese de citocininas reduzida em casos de
carncia deste elemento.
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HIDRATOS DE CARBONO

Amido

Glucose

Frutose
Maltose

Galactose

Sacarose
2-5%

Devido reduzida ou nula capacidade fotossinttica dos explantes


cultivados in vitro, os hidratos de carbono so a fonte de energia dos
tecidos e funcionam ainda como um regulador do potencial osmtico
do meio de cultura

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VITAMINAS
Naturalmente, as plantas sintetizam as vitaminas necessrias para o

crescimento e desenvolvimento. No entanto, em cultura in vitro


algumas vitaminas podero vir a ser limitantes.

Tiamina (B1)

a nica vitamina totalmente indispensvel


para o crescimento das clulas vegetais.

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cido nicotnico(B3)
e Piridoxina (B6)

AUXINAS
Locais de Sntese: Embries, folhas jovens, meristemas dos gomos apicais
Actividade: Estimulam o alongamento celular; esto envolvidas no fototropismo,
dominncia apical e diferenciao celular; estimulam a sntese de etileno, o
desenvolvimento do fruto e a produo de razes adventcias.

IAA cido indol-3-actico.


IBA cido indol-3-butrico.
NAA cido -naftaleno actico.
2,4-D cido 2,4 Diclorofenoxi-actico

Transporte Polar; -Dos pices para a base


Metabolismo Varia com o tipo de auxina: IAA>IBA>NAA>2,4 D
Degradao Luz e Calor

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CITOCININAS
Local de sntese: Razes

Transporte: Da base para o topo

ACTIVIDADE:
Estimulam a rebentao axilar, quebrando a dominncia apical
Normalmente inibem a formao de razes, podendo estimul-la quando utilizadas
em concentraes muito baixas, nas primeiras 72horas aps o corte do explante
Retardam o envelhecimento foliar
BAP (BA) - 6-benzilaminopurina (benziladenina)
2iP - 2-isopentiladenina
Zeatina
Cinetina
TDZ - tidiazuro

GIBERELINAS
Locais de produo: Meristemas dos gomos apicais e das razes, folhas jovens e
embries
Actividade: Promovem o alongamento caulinar, estimulam o abrolhamento e
florao em plantas perenes.
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Mais de 100 formas, sendo a GA3 a mais conhecida.

Tipos de culturas e as suas Aplicaes


1. Cultura de rgos
Cultura de meristemas (obteno de plantas isentas de vrus, conservao
de germoplasma)
Micropropagao (multiplicao em larga escala, seleco clonal,
conservao de germoplasma)
Culturas de anteras plen e vulos (obteno de mutantes e plantas
haplides)
2. Cultura de callus: (seleco de variaes somaclonais e mutantes, organognese
e embriognese somtica)
3. Cultura de clulas isoladas em suspenso:(seleco de mutantes e produo
de metabolitos secundrios)
4. Cultura de protoplastos:(seleco de mutantes, obteno de hbridos
somticos e engenharia gentica)

Reaces do explante em cultura


Proliferao de gomos axilares
Organognese sobre fragmentos de folhas caules ou razes
Formao e desenvolvimento de embries somticos
Produo de plantas haplides por cultura de anteras ou plen
Fuso de protoplastos e produo de hbridos somticos

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Morfognese
a aquisio de forma dum orgo ou duma planta;
Como as clulas vegetais esto fixas umas em relao s outras devido lamela
mdia, a morfognese das plantas essencialmente feita em funo dos planos
de diviso das clulas e da direco do crescimento celular.
Neste processo, tm ainda influncia as substncias nutritivas de carcter
metablico e plstico, as hormonas, as auxinas e as condies ambientais.
A morfognese est ligada ao mecanismo de crescimento vegetal.

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Morfognese
(Existncia da etapa de calo)

Indireta

Direta

Organognese
(Brotos, razes e flores)

Embriognese
(Embries somticos)

Diferena que existe entre os dois tipos de morfognese: a presena ou no


da etapa de calo, ou seja, aglomerado de clulas indiferenciadas em mitoses
sucessivas.
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Concentraes relativas de Auxina/Citocinina na


Morfognese
Auxina

Citocinina
enraizamento

Alto

Baixo
calos monocotiledneas
embriognese

0=

(incio)

=0

razes de calos
calos dicotiledneas
gemas adventcias
proliferao de gemas axilares

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Embriognese Somtica
Processo in vivo ou in vitro atravs do qual clulas vegetais somticas sob condies
ambientais apropriadas reprogramam o seu programa ontognico somtico actual
para estabeler um programa ontognico embriognico, a partir do qual a clula
somtica reprogramada se ir rediferenciar em embrio somtico, que aps
adequado desenvolvimento embriognico dar origem a uma planta completa.

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Direta

- Os embries somticos desenvolvem-se


directamente na superfcie do tecido organizado
(explante).

Embriognese
Somtica

Indireta

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- Os embries desenvolvem-se a partir de


material indiferenciado (callus/calli) obtido a
partir do tecido organizado (explante).

Utilizao do sistema modelo da embriognese somtica em


cenoura

Seces do escape floral


ou do pecolo da folha

Inoculao em
meio de cultura
suplementado
com auxina

Desenvolvimento e
multiplicao de callus/calli
em meio de cultura com
auxina
Regenerao da planta
em meio sem reguladores
de crescimento

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Produo da semente artificial

Semente artificial anloga semente verdadeira ou botnica, e


consiste num embrio somtico envolto por uma ou mais
camadas de compostos artificiais, formando uma cpsula.

possibilitam o armazenamento por um longo perodo e auxiliam


durante a germinao e desenvolvimento da plntula.

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Sementes artificiais so uma aplicao prtica da embriognese


somtica.

Apesar dos resultados positivos obtidos atravs da investigao intensiva que a


produo de sementes sintticas alvo, a implementao prtica desta tecnologia
no tem tido grande impacto na agricultura, devido s seguintes razes:

- As tcnicas de produo de sementes artificiais actuais obtm um reduzido


nmero de micropropgulos viveis;
- O elevado nmero de embries anmalos obtidos e o elevado nvel de
assincronia na diferenciao dos embries nos sistemas de produo em
larga escala um factor limitante automatizao do processo de encapsulao;

- A maturao incompleta dos embries somticos torna-os ineficientes para a


germinao e converso em plantas normais;
- A falta de dormncia e de tolerncia ao stress dos embries somticos reduz o
tempo que as sementes artificiais podem estar em armazm;

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- O reduzido nmero de embries somticos maduros aparentemente normais que


se converte em plantas normais tm limitado o desenvolvimento comercial das
sementes artificiais, o que por sua vez tm afectado negativamente o
desenvolvimento da tcnica.

Cultura de protoplastos e produo de hbridos


somticos

Protoplastos Clulas vegetais desprovidas de parede celular;

Para a produo de um cultura de protoplastos necessrio que estes passem por


trs fases:
Isolamento dos protoplastos;
Mecnica;
Enzimtica;
Purificao;
Testes de viabilidade;
A cultura de protoplastos, por sua vez, pode ser realizada por diversos mtodos:

Cultura em suspenso (Suspension Culture);


Mtodo da gota suspensa (Hanging Drop Method);
Mtodo da adio da agar (Agar Planting Method);
Tcnica de Micro Cultura (Micro Culture Technique);

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Imagem 1 (Isolao Mecnica)

Imagem 2 (Isolao Enzimtica)

Imagem 3 (Populao de
protoplastos purps)
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A fuso dos protoplastos vai dar origem a hbridos somticos:

Absoro de DNA Mediada por PEG;


Eletroporao de Protoplastos.

Aps a hibridao somtica so formados dois tipos de clulas:

Hbridos somticos;
Heterocaricitos;

necessrio ento realizar uma seleo, que pode ser feita segundo 4
formas diferentes:

Colocao ds clulas obtidas num meio de cultura, onde apenas os hbridos


somticos iro crescer;
Seleo complementar dos hbridos somticos num determinado meio de cultura;
Morfologia da planta aps regenerao;
Isolao mecnica atravs da visualizao e identificao dos hbridos somticos.
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Imagem 1 (Hibridao somtica)

Imagem 2 (Hibridao somtica)


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Imagem 3 (Hibridao somtica)

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Culturas in vitro de rgos, tecidos, e clulas em


suspenso
Cultura in vitro - cultivo de sementes, embries ou fragmentos de tecido
vegetal sob condies asspticas, em meios nutritivos adequados,
dispondo de luz, temperatura e humidade controladas, com o objectivo de
obter uma rpida multiplicao de plantas, isentas de pragas e doenas.

Cultura de clulas em suspenso tcnicas de induo, propagao e


manuteno de clulas numa forma de suspenso em meio lquido de
cultura.(http://www.cenargen.embrapa.br/clp/publicacoes/2006/bpd/bpd
126.pdf)

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Cultura em clulas e engenharia gentica transformao de plantas


A cultura em um conjunto de tcnicas utilizadas para manter ou aumentar o
nmero de clulas de plantas, tecidos ou rgos em condies estreis num
meio de cultura com condies controladas (in vitro);
A cultura em clulas tem como base o tecido caloso, que por sua vez se baseia
num explante, e a caracterstica de totipotncia presente em muitas clulas
vegetais;

A tcnica mais utilizada na cultura em clulas a micropropagao, que possui


4 fases:

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Estabelecimento;
Multiplicao;
Pr-transferncia;
Transferncia da cultura.

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Imagem 1
(Micropropagao)

Aplicaes produo de plantas melhoradas e


sntese de novos produtos

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Banana, na ndia, frica e Brasil;


Ginseng Americano e Siberiano;
Planta do tabaco;
Cenoura, Beterraba;
Caf;
Orqudeas e outras plantas de jardim;

Novos frutos, como o caso do Limo-cravo (Citrus limonia);

Aplicao da cultura de clulas vegetais em produo


agrcola, florestal e industrias biotecnolgicas

Aumento da produo sem grandes custos;


Plantas resistentes/tolerantes a herbicidas;
Plantas resistentes a determinados microrganismos;
Produo de plantas durante todo o ano;

Conservao de espcies de plantas raras ou ameaadas;


Rpida reflorestao de uma rea afectada por um incndio;
Criao de um nmero ilimitado de novas plantas com determinadas
caractersticas para a realizao de estudos;

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Bibliografia
CANHOTO, J.M., Biotecnologia vegetal: Da clonagem de plantas transformao
gentica, Coimbra, Imprensa da Universidade de Coimbra (2010), ISBN: 978-98926-0065-9

Sitegrafia
http://bioscipub.com/journals/bbb/pdf/279-288.pdf
http://en.wikipedia.org/wiki/Micropropagation
http://www.ehow.com/about_6624562_role-tissue-culture-agriculture.html
http://en.wikipedia.org/wiki/Plant_tissue_culture
http://ruisoares65.pbworks.com/w/page/24326057/Tecido%20Caloso
http://ruisoares65.pbworks.com/w/page/24326154/Explante
http://ruisoares65.pbworks.com/w/page/24175978/Micropropaga%C3%A7%C3%A3o
www.researchgate.net
http://www.cenargen.embrapa.br/clp/publicacoes/2006/bpd/bpd126.pdf
http://banana.aatf-africa.org/news/media/increasing-banana-yields-using-tissueculture-method
http://pt.wikipedia.org/wiki/Lim%C3%A3o-cravo
http://www.lfdgv.ufsc.br/Apostila.htm