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Ensaio Clonogênico: Células Aderentes

Haloom Rafehi1,2, Christian Orlowski1,2,3, George T. Georgiadis1, Katherine Ververis1,4, Assam El-Osta2,3, Tom C. Karagiannis1,2
1Medicina Epigenômica, BakerIDI Heart and Diabetes Institute, The Alfred Medical Research and Education Precinct
2Departamento de Patologia, Universidade de Melbourne
3Epigenética em Saúde e Doença Humana, BakerIDI Heart and Diabetes Institute, The Alfred Medical Research and Education Precinct
4Departamento de Anatomia e Biologia Celular, Universidade de Melbourne

Correspondência para: Tom C. Karagiannis emtom.karagiannis@bakeridi.edu.au

URL:http://www.jove.com/details.php?id=2573
DOI: 10.3791/2573
Citação: Rafehi H., Orlowski C., Georgiadis GT, Ververis K., El-Osta A., Karagiannis TC (2011). Ensaio Clonogénico: Células Aderentes. Jove. 49.
http://www.jove.com/details.php?id=2573, doi: 10.3791/2573

Abstrato
O ensaio clonogênico (ou formador de colônias) foi estabelecido por mais de 50 anos; o artigo original descrevendo a técnica foi publicado em 19561. Além de
documentar o método, o estudo de referência inicial gerou a primeira curva de resposta à dose de radiação para células de mamíferos (HeLa) irradiadas com raios X em
cultura1. Basicamente, o ensaio clonogênico permite uma avaliação das diferenças na viabilidade reprodutiva (capacidade das células para produzir progênie; ou seja,
uma única célula para formar uma colônia de 50 ou mais células) entre células de controle não tratadas e células que foram submetidas a vários tratamentos, como
exposição à radiação ionizante, vários compostos químicos (por exemplo, agentes citotóxicos) ou em outros casos manipulação genética. O ensaio tornou-se a técnica
mais amplamente aceita em biologia da radiação e tem sido amplamente utilizado para avaliar a sensibilidade à radiação de diferentes linhagens celulares. Além disso, o
ensaio clonogênico é comumente usado para monitorar a eficácia de compostos modificadores de radiação e para determinar os efeitos de agentes citotóxicos e outros
agentes terapêuticos anticancerígenos na capacidade de formação de colônias, em diferentes linhas celulares.
Um experimento típico de sobrevivência clonogênica usando linhas de células aderentes envolve três componentes distintos, 1) tratamento da monocamada celular em frascos de
cultura de tecidos, 2) preparação de suspensões de células únicas e plaqueamento de um número apropriado de células em placas de Petri e 3) fixação e coloração de colônias após
um período de incubação relevante, que pode variar de 1-3 semanas, dependendo da linha celular. Aqui demonstramos o procedimento geral para realizar o ensaio clonogênico com
linhagens celulares aderentes com o uso de uma linhagem celular de queratinócitos humanos imortalizados (FEP-1811)2. Além disso, nossos objetivos são descrever características
comuns de ensaios clonogênicos, incluindo o cálculo da eficiência de plaqueamento e frações de sobrevivência após a exposição das células à radiação, e exemplificar a modificação
da resposta à radiação com o uso de uma formulação antioxidante natural.

Protocolo

1. Cultura de células e configuração experimental

1. Os queratinócitos humanos são mantidos como monocamadas em 75 cm2frascos de cultura de tecidos contendo 15 mL de meio de queratinócitos-SFM (K-SFM)
(GIBCO, meio sem soro) suplementado com L-glutamina (2 mM), fator de crescimento epidérmico (5 ng/mL), extrato de hipófise bovina (40 μg /mL) e gentamicina
20 mg/mL. As células são cultivadas em 5% de CO umidificado2ambiente a 37°C.
2. As células são semeadas em 12 x 25 cm2frascos de cultura de tecidos contendo 5 mL de meio K-SFM.

As suspensões de células únicas são preparadas por tripsinização. As células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato e incubadas com uma solução de tripsina/
EDTA a 0,05% durante 5-10 minutos. Quando as células começam a ficar arredondadas e ~30% são destacadas, 3 volumes de meio Eagle modificado de Dulbecco contendo 10% de
soro bovino fetal são adicionados para neutralizar a tripsina. As células são destacadas por pipetagem para cima e para baixo (20 vezes). As células são contadas usando um
hemocitômetro.

Números de células apropriados são semeados de acordo com o tempo de duplicação da linha celular (aproximadamente 20 horas para queratinócitos humanos
FEP-1811). O objetivo é atingir ~90% de confluência (~106células por frasco) no dia do experimento.

Um experimento composto por 12 frascos é ideal para um único ensaio clonogênico (seis controles não irradiados e seis frascos irradiados), que pode ser
concluído em aproximadamente quatro horas.

2. Tratamento e Irradiação

1. Trate as células por um tempo apropriado com um composto modificador de radiação relevante e exponha as células à radiação ionizante, seja radiação γ ou
raios-X.

Normalmente, seis frascos servem como controles de eficiência de plaqueamento (não tratados) e apenas de drogas. Os outros seis frascos são irradiados.

Neste exemplo, os queratinócitos humanos são tratados com várias concentrações de Cinnulin PF (CPF; Integrity Nutraceuticals International, Spring Hill, TN, EUA; dados
representativos para 20 μg/mL são mostrados abaixo), uma formulação antioxidante natural solúvel em água, por 1 hora a 37°C. As células são irradiadas com 4 Gy
usando um137Fonte de Cs (irradiador Gammacell 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá; 1,6 Gy/min).

3. Revestimento

1. Após o tratamento, as suspensões de células individuais são obtidas conforme descrito anteriormente.
2. O número de células em cada amostra é contado cuidadosamente usando um hemocitômetro e diluído de forma que números de células apropriados sejam semeados em placas
de Petri (cinco réplicas de cada uma em placas de 15 mm).

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A eficiência de plaqueamento e/ou fração sobrevivente deve ser antecipada ao decidir o número de células a serem semeadas por placa. O
objetivo é atingir um intervalo de 20 a 150 colônias.

As placas de Petri são dispostas em uma caixa de clonagem plástica umidificada e incubadas em 5% de CO2ambiente a 37°C para formação de colônias.

O tempo de incubação para a formação de colônias varia de 1 a 3 semanas para diferentes linhagens celulares; aceita-se que o tempo deva ser equivalente a pelo menos seis divisões
celulares. Neste exemplo, as placas de controle para queratinócitos humanos requerem oito dias para formar clones suficientemente grandes consistindo de 50 ou mais células.

4. Colônias de Fixação e Coloração

Conclua as etapas a seguir em uma capela de exaustão.

1. Remova cuidadosamente a mídia de cada uma das placas por aspiração.

2. Lave cada placa com 5 mL de soro fisiológico 0,9%.
3. Fixe as colônias com 5 mL de solução de formalina tamponada neutra a 10% por 15 a 30 minutos.
4. Corar com 5 mL de cristal violeta a 0,01% (p/v) em dH2O por 30-60 minutos.
5. Lave o excesso de cristal violeta com dH2O e deixe a loiça secar.

5. Contagem de colônias

estereomicroscópio

1. As colônias contendo mais de 50 células individuais são contadas usando um estereomicroscópio.

Imagem digital e contagem usando software de imagem

1. As imagens digitais das colônias são obtidas usando uma câmera ou dispositivo de digitalização
2. As colônias são contadas usando pacotes de software de análise de imagem, conforme descrito abaixo.

Contagem de células usando ImageJ (Fiji versão 1.44a)

1. Abra o arquivo de imagem em Fiji, vá para Arquivo -> Abrir.

2. Se necessário, converta a imagem para o formato de 8 bits, vá para Imagem -> Ajustar...-> Limiar.
3. Ajuste o limite para reduzir os níveis de fundo não específico para que apenas as colônias sejam detectadas.
4. Conte as colônias usando o seguinte: vá para Process -> Binary -> Find maxima.

Para este formato de imagem, a tolerância ao ruído pode ser definida como 0. Certifique-se de que a opção de fundo claro esteja marcada e visualize os máximos detectados para verificar se
todas as colônias de células foram registradas corretamente.

Discussão
Neste exemplo, os queratinócitos FEP-1811 humanos foram tratados com várias concentrações de até 100 μg/mL de CPF; os dados são mostrados para 20 μg/mL CPF por 1 hora a
37°C. Após o tratamento, as células foram irradiadas com 4 Gy usando um137Fonte de Cs (irradiador Gammacell 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá; 1,6 Gy/min). Para os
tratamentos de controle não tratado e apenas com droga, 100 células foram semeadas em cada placa de Petri e 1000 células por placa foram semeadas para as amostras irradiadas.
Conforme indicado na tabela acima, as colônias foram contadas usando um estereomicroscópio ou imagens digitais (Fig. 1) foram tiradas para contagem usando o ImageJ. A
contagem média de colônias para as cinco placas foi usada para calcular a eficiência do plaqueamento e a fração sobrevivente. Os dados indicaram um efeito protetor contra radiação
(fator de proteção ~3) com a formulação antioxidante natural.

Resultados representativos

Tratamento Método de contagem Célula banhada 1 2 3 4 5 Eficiência de chapeamento1 sobrevivendo

Fração2
Células não tratadas Manual 100 19 22 38 14 20 0,23 1
(estereomicroscópio)

Manual 100 22 23 34 15 22 0,23 1

(imagem digital)

Encontrar Máximos 100 23 21 33 14 21 0,22 1

(Fiji)

CPF 20mM Manual 100 18 11 21 15 11 0,15 0,66

(estereomicroscópio)

Manual 100 19 11 23 16 8 0,15 0,67

(imagem digital)

Encontrar Máximos 100 17 11 22 17 8 0,15 0,65

(Fiji)

4 Gy Manual 1000 39 27 28 44 28 0,03 0,14

(estereomicroscópio)

Manual 1000 42 33 31 42 31 0,04 0,16

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(imagem digital)

Encontrar Máximos 1000 42 35 30 43 31 0,04 0,16

(Fiji)

20 mM CPF + 4 Gy Manual 1000 115 105 98 108 101 0,11 0,47

(estereomicroscópio)

Manual 1000 117 102 104 103 99 0,11 0,45

(imagem digital)

Encontrar Máximos 1000 121 102 104 102 97 0,11 0,47

(Fiji)

1Eficiência de plaqueamento = número de colônias contadas / número de células plaqueadas

2Fração sobrevivente = (número de colônias contadas/número de células plaqueadas)/eficiência de plaqueamento

Tabela 1.Cálculo da eficiência e sobrevivência do plaqueamento e comparação das contagens de colônias usando vários métodos

Figura 1.Imagem digital mostrando colônias produzidas por queratinócitos humanos, FEP-1811, após plaqueamento de 1.000 células e oito dias de incubação. (A) As
células foram irradiadas com 4 Gy e (B) as células foram tratadas com 20 μg/mL de CPF por 1 hora a 37°C antes da irradiação com 4 Gy. Um efeito protetor contra
radiação com a formulação antioxidante natural é evidente.

Divulgações
Nenhum conflito de interesses declarado.

Reconhecimentos
O apoio do Instituto Australiano de Ciência e Engenharia Nuclear é reconhecido. A TCK foi galardoada com os prémios AINSE. O Laboratório de Medicina
Epigenômica é apoiado pelo Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (566559). O RH é apoiado por uma pós-graduação australiana e
pelos prêmios Bright Spark da BakerIDI. Este trabalho é financiado pelo CRC para Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), estabelecido e apoiado
pelo programa de Centros de Pesquisa Cooperativa do governo australiano. CO recebeu um prêmio australiano de pós-graduação e uma bolsa suplementar
CRC-BID.

Referências

1. Puck, TT & Marcus, PI, Ação de raios-x em células de mamíferos. J Exp Med 103 (5), 653-666 (1956).
2. Hurlin, PJe outros, Progressão de queratinócitos humanos imortalizados pelo papilomavírus humano tipo 18 para um fenótipo maligno. Proc Natl Acad
Sci USA 88 (2), 570-574 (1991).

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