TECNICAS DE PCR

REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE

O QUE É POLIMERASE:
Polimerase é uma enzima que catalisa a reação de polimerização
de ácidos nucleicos a partir dos seus monômeros. As polimerases
mais comuns são a RNA polimerase e a DNA polimerase. Para a
duplicação celular acontecer, a DNA polimerase, permite a ligação
de nucleotídeos novos ao molde de DNA.
O QUE SÃO MONOMEROS :
Em química, um monômero ou monómero (do grego "mono", "um" e
"meros", "parte") é uma pequena molécula composta por um
único mero, que pode ligar-se a outros monômeros formando
moléculas maiores denominadas polímeros. Exemplos de
monômeros são os hidrocarbonetos, derivados do petróleo, dos
tipos alcanos e alcenos.
O QUE É A TECNICA PCR
é uma técnica da biologia molecular para amplificar uma única ou poucas
cópias de um pedaço de DNA e baseia-se no processo de replicação do DNA que
ocorre in vivo.
COMO ACONTECE:
Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser
repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas
análises. Com apenas um único fragmento de DNA é possível reproduzir milhões de
cópias.

Pontos Principais:
 A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para
fazer muitas cópias de uma região específica do DNA, in vitro (em um
tubo de ensaio, ao invés de um organismo).

 A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq

polimerase, e requer primers de DNA projetados especificamente
para a região de interesse do DNA .
 Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de
alterações de temperatura, o que possibilita a produção de muitas
cópias da região de interesse.

 A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é

rotineiramente usada em clonagens de DNA, diagnósticos médicos e
análises forenses de

 O que é PCR?
 A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica
rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias (milhões
ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do
DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por
exemplo, pode haver um gene cuja função o pesquisador queira
compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas
forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os
suspeitos.
 Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente
da região de interesse do DNA, de modo que essa possa ser
analisada e utilizada de alguma outra maneira. Por exemplo,
DNA amplificado por PCR pode ser enviado
para sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel,
ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos.
 A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina,
incluindo pesquisa em biologia molecular, diagnósticos médicos
e mesmo alguns ramos da ecologia.

Taq polimerase
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer
uma enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando as
existentes como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na
PCR é chamada de Taq polimerase, em homenagem à bactéria
resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).

T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA

polimerase é bastante estável ao calor e é mais ativa à 70 °\text
C70°C70, °, start text, C, end text (temperatura em que as DNA
polimerases humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa
estabilidade ao calor torna a Taq polimerase ideal para PCRs. Como
veremos, a alta temperatura é usada repetidamente na PCR
para desnaturar o DNA molde, isto é, separar suas fitas.

Primers de PCR
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar
DNA somente quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de
nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA.
Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA
que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele
escolher.

Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples,

geralmente por volta de 202020 nucleotídeos de comprimento. Dois
primers são usados para cada reação de PCR, e eles são projetados de
modo que englobem a região de interesse (região que deve ser
copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas
opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser
copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases
complementares.
 As etapas da PCR
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase,
primers, DNA molde e nucleotídeos (blocos que compõem o DNA).
Os ingredientes são reunidos em um tubo, juntamente com cofatores
de que a enzima precisa, e passam por repetidos ciclos de aquecimento
e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado.

As etapas básicas são:

1. Desnaturação (96 °\text C96°C96, °, start text, C, end text): Aquece

fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso
proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa.
2. Anelamento (555555 - 656565°\text C°C°, start text, C, end text):
Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas
sequências complementares no DNA molde de fita simples.

3. Extensão (72 °\text C72°C72, °, start text, C, end text): Eleva a

temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers,
sintetizando novas fitas de DNA.

Este ciclo se repete 252525 - 353535 vezes em uma reação típica de

PCR, que geralmente ocorre em 222 - 444 horas, dependendo do
comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a reação for
eficiente (funcionar bem), a região de interesse pode gerar de uma ou
poucas cópias até bilhões.

Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde
a cada vez. Ao invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de
molde na próxima rodada de síntese de DNA. Há muitas cópias dos
primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação,
então o número de moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar
a cada rodada do ciclo. Esse padrão de crescimento exponencial é
mostrado na imagem abaixo.

Uso da eletroforese em gel para visualizar

os resultados da PCR
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados
(tornam-se visíveis) através do uso da eletroforese em
gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA
são puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel, e
que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho. Um
padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho
dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.

Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no

gel, que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um
corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de PCR
produzindo um fragmento de 400400400 pares de bases (pb)
apareceria desta maneira no gel:

Coluna esquerda: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400,
500 pb.

Coluna direita: resultado da reação PCR, uma banda em 400pb.

Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de

interesse do DNA, não apenas uma ou algumas cópias. Como o DNA
é microscópico, muitas cópias têm de estar presentes antes que
possamos vê-las a olho nu. Isso é uma grande parte do porquê de a
PCR ser uma ferramenta importante: ela produz cópias suficientes de
uma sequência de DNA de modo que possamos ver ou manipular
aquela região de DNA.

Aplicações da PCR
Através da PCR, uma sequência de DNA pode ser amplificada
milhões ou bilhões de vezes, produzindo cópias suficientes de DNA
para serem analisadas por outras técnicas. Por exemplo, o DNA pode
ser visualizado por eletroforese em gel, enviado para sequenciamento,
ou digerido por enzimas de restrição e clonado em um plasmídeo.

A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e também tem

aplicações práticas em ciências forenses, testes genéticos e
diagnósticos. Por exemplo, a PCR é utilizada para amplificar genes
associados a desordens genéticas a partir do DNA de pacientes (ou do
DNA fetal, nos casos de teste pré-natal). A PCR também pode ser
utilizada para testar se há DNA bacteriano ou viral no corpo de um
paciente: se o patógeno estiver presente, pode ser possível amplificar
regiões de seu DNA a partir de uma amostra de sangue ou tecido.

Amostra-problema: A PCR nas ciências

forenses
Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências
forenses. Você acabou de receber uma amostra de DNA de um cabelo
deixado em uma cena de crime, juntamente com amostras de DNA de
três possíveis suspeitos. Seu trabalho é examinar um marcador
genético em particular e verificar se algum dos três suspeitos coincide
com o DNA do cabelo para esse marcador.
O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém uma
única repetição (região marrom abaixo), enquanto o outro contém
duas cópias da repetição. Em uma reação PCR com primers que atuam
na região de repetição, o primeiro alelo produz um fragmento de DNA
de 200200200 \text{bp}bpstart text, b, p, end text, enquanto o segundo
produz um fragmento de DNA de 300300300 \text{bp}bpstart text, b,
p, end text:

Marcador do alelo 1: primers que atuam na região de repetição

amplificam um fragmento de DNA de 200 pb

Marcador do alelo 2: primers que atuam na região de repetição

amplificam um fragmento de DNA de 300 pb

Você faz uma PCR nas quatro amostras de DNA e visualiza os

resultados por eletroforese em gel, como representado abaixo:

O gel tem cinco faixas:

Primeira faixa: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, e
500 pb.

Segunda faixa: DNA da cena do crime, banda de 200 pb.

Terceira faixa: DNA do suspeito #1, banda de 300 pb.

Quarta faixa: DNA do suspeito #2, bandas de 200 e 300 pb.

Quinta faixa: DNA do suspeito #3, banda de 200 pb.

O DNA de qual suspeito coincide com o DNA da cena do crime

para esse marcador?
Verificar

Mais sobre PCR e ciências forenses

Em testes forenses reais com o DNA da cena do crime, os técnicos
fariam uma análise conceitual similar à representada no exemplo
acima. Contudo, uma série de marcadores diferentes (não apenas o
único marcador do exemplo) seria comparada entre o DNA da cena do
crime e o DNA do suspeito.

Ademais, os marcadores usados em análises forenses típicas não vêm

apenas em duas formas diferentes. Em vez disso, eles são
altamente polimórficos (poli = muitas, morfo = formas). Isto é, eles
vêm em muitos alelos que variam minimamente em comprimento.

O tipo mais comum de marcadores usado nas ciências forenses,

chamado microssatélites (STRs na sigla em inglês), consiste em
várias cópias da mesma sequência curta de nucleotídeos que se
repetem (tipicamente, 222 a 555 nucleotídeos de comprimento). Um
alelo de um STR pode ter 202020 repetições, enquanto outro pode
ter 181818 e um outro apenas 101010^11start superscript, 1, end
superscript.

Por meio do exame de múltiplos marcadores, cada um dos quais vem

em muitas formas de alelos, os cientistas forenses podem montar uma
"impressão digital" singular a partir de uma amostra de DNA. Em uma
análise típica de STR usando 131313 marcadores, as chances de um
falso positivo (duas pessoas tendo a mesma "impressão digital" de
DNA) são menores que 111 em 101010 \text{bilhões}bilho˜esstart
text, b, i, l, h, o, with, \~, on top, e, s, end text^11start superscript, 1,
end superscript!

Embora possamos pensar na evidência de DNA sendo usada para

condenar criminosos, ela tem tido um papel crucial na exoneração de
pessoas falsamente acusadas (incluindo algumas que estavam presas
há muitos anos). A análise forense também é usada para estabelecer
paternidade e identificar restos mortais de cenas de desastres.
Com o rápido avanço da Covid-19, cientistas do mundo todo dedicaram seus
esforços para o desenvolvimento de vacinas contra o vírus, além de
estabelecer testes que possibilitassem um rápido diagnóstico da doença. Com
isso, a população começou a ter um maior contato com informações e
terminologias que eram até então desconhecidas, como os exames de PCR.

Dentre os testes disponíveis para diagnóstico da Covid-19, o exame de PCR

foi, com toda a certeza, o mais comentado e divulgado pelos veículos de
imprensa e organizações da saúde. O exame PCR é um teste que serve para
diagnóstico de diversas doenças além da Covid-19 e na matéria de hoje
traremos informações valiosas a respeito desta tecnologia revolucionária de
diagnóstico molecular.

O que é o exame de PCR?

A técnica de PCR (ou Reação em Cadeia da Polimerase) é uma tecnologia que

consiste na amplificação de uma região específica de DNA. Ou seja, com essa
metodologia é possível produzir uma quantidade enorme de cópias de
pequenas porções do DNA que se deseja estudar. Assim, ainda que a
quantidade de DNA disponível na amostra seja muito pequena, a PCR torna
possível a análise do material.

A PCR se baseia em um processo natural das nossas células!

A PCR foi desenvolvida por cientistas tendo como base o processo de

replicação do DNA que ocorre normalmente nas células dos seres vivos. Para
tentar entender melhor esse conceito, imagine as células da sua pele. Essas
células estão em constante renovação, multiplicando-se em substituição a
outras que estão mortas. Esse é um processo chamado divisão celular, onde
uma célula entra em divisão formando outras duas novas iguais à de origem.

Mas para que esse processo ocorra, é preciso que o código genético da célula
inicial também seja duplicado. Assim, as novas células irão possuir o mesmo
código genético! Todo esse processo é chamado replicação do DNA e ocorre
antes da divisão celular propriamente dita. Mas não pense que a geração dessa
nova cópia de DNA seja algo simples. Na verdade, várias etapas são
necessárias com a participação de diversas estruturas celulares e enzimas,
como as DNA-polimerases.
A DNA-polimerase é o ponto-chave que une a técnica de PCR ao processo de
replicação que ocorra em nossas células. Nosso DNA é composto por uma
dupla fita que contém as informações genéticas de todo nosso corpo.
Basicamente, no processo de replicação essa dupla fita é separada dentro da
célula, produzindo duas fitas simples. Então, a enzima DNA-polimerase
“constrói” fitas complementares a cada uma das fitas simples, dando origem a
novas duas fitas duplas exatamente iguais. Agora, nossa célula está apta a se
dividir fisicamente, gerando duas células que compartilham do mesmo código
genético.

A replicação do DNA simulada em laboratório

Pensando em todo esse processo natural, os cientistas descobriam que é

possível realizar essa replicação do DNA em laboratório. Mas para isso
ocorrer, é necessário simular os eventos que ocorrem na célula de forma
bastante fidedigna. Para isso, utiliza-se na PCR um aparelho chamado
termociclador, no qual a amostra a ser analisada passa por vários estágios com
elevadas temperaturas. Isso é necessário para separar a dupla fita de DNA e
também porque a enzima DNA-polimerase precisa de temperaturas
específicas para ser efetiva no processo de geração de cópias. São realizados
vários ciclos de oscilação de temperatura, que variam de 50°C a 95°C.

Além do termociclador, são incorporadas na amostra todas as substâncias

necessárias para que a reação ocorra, incluindo os chamados “primers”. Os
primers são sequências complementares a regiões específicas do DNA que se
deseja identificar e que indicam o local correto onde a DNA-polimerase deve
atuar produzindo as cópias. Lembre-se que em muitos exames laboratoriais, o
objetivo é replicar apenas pequenas porções de interesse do DNA, e não o
código genético completo. Com todo esse ambiente controlado, o resultado é a
geração de milhões de cópias do fragmento do código genético, possibilitando
a posterior análise do patologista.

PCR em tempo real (qPCR)

A PCR em Tempo Real é uma variação da técnica de PCR, a qual permite que
a amplificação e detecção dos fragmentos ocorram simultaneamente.
O resultado é visualizado em tempo real durante o processo, com a vantagem
de conseguir gerar resultados quantitativos com maior precisão.
Para que seja possível quantificar, nessa variação da técnica é utilizada uma
sonda fluorescente na reação. Assim, à medida que a porção do DNA é
copiada, a sonda vai emitindo uma fluorescência que é captada por um
equipamento. A depender da intensidade da fluorescência, consegue-se
mensurar se o gene de estudo está com sua expressão elevada ou não.

Diagnóstico molecular e o exame de PCR

A técnica de PCR pode ser utilizada para diagnóstico de diversas doenças.

Como mencionamos anteriormente, este teste está sendo muito utilizado para
diagnóstico da Covid-19, pois possibilita identificar a presença do código
genético do vírus (RNA) em amostras nasais dos pacientes com suspeita da
doença de forma muito precisa. Além disso, outras doenças causadas por
microrganismos (vírus ou bactérias) podem ser diagnosticadas pelo exame de
PCR, como a Dengue, Clamídia e HPV.

Na oncologia, a PCR auxilia na identificação de células que apresentam

sequências gênicas características de um determinado tipo de câncer. Desse
modo, é possível identificar a origem do câncer, assim como realizar o
monitoramento em pacientes já diagnosticados. Doenças que possuem origem
genética também podem ser identificadas por meio da PCR, como a fibrose
cística e a trombofilia, por exemplo. Neste caso, é possível detectar mutações
específicas no DNA do paciente que levam ao desenvolvimento da patologia.

No Grupo Diagnose, contamos com a técnica de PCR e qPCR para uma ampla
variedade de patologias, sempre para garantir os melhores e mais confiáveis
diagnósticos.

Lembrete: Somente realize exames após avaliação e indicação médica.

Nós, do Grupo Diagnose, assumimos o compromisso de deixá-los sempre

bem-informados e atualizados, trazendo conteúdos relevantes e de
qualidade para você.

Conheça os princípios da técnica de

PCR e suas etapas
Publicado em: 04/04/2018
 luchschen / iStock / Getty Images Plus A técnica de PCR tem a função de ampliar uma área
específica do DNA e desenvolver outras moléculas semelhantes.

Dentro do conjunto de atividades biotecnológicas está o trabalho de manipulação

de moléculas de DNA a partir da reação com enzimas de restrição. A análise
desse trabalho molecular permite que os cientistas compreendam melhor esse
processo, conhecido como técnica de PCR (reação em cadeia de polimerase).

O estudo surgiu na década de 80 por Kary Banks Mullis, uma biotecnóloga que
realizou uma síntese a partir de enzimas de restrição com ácidos nucleicos
copiados para garantir uma fragmentação do DNA. O propósito central da
técnica de PCR é justamente ampliar uma área específica do DNA e desenvolver
outras moléculas semelhantes somente com o uso de uma composição como
cobaia. Essa amplificação é chamada assim porque as enzimas de restrição são as
polimerases.

Mas para que a técnica de PCR funcione, é preciso seguir alguns passos para que
as cópias apresentem uma sequência correta de acordo com a especificação.
Entenda melhor a seguir:

Etapas da PCR
Extração

O primeiro passo é pegar o material genético a ser utilizado, que no caso é o

DNA. Ele não pode ser alterado e nem contaminado por algum outro reagente
que cause um resultado diferente do que se espera da combinação final. Essa
extração vai ser aquecida a ponto de ser desnaturada juntamente com a região
que precisa ser amplificada.

Desnaturação

A desnaturação é dividida em duas partes. Para que essa etapa da técnica de PCR
funcione, o manipulador deve adicionar uma base nitrogenada composta por um
três fosfato, os oligonucleotídeos (conhecidos como primers, que são as fitas do
DNA A,T, C e G) e a polimerase que será usada para promover a reação. A
mistura deve ser feita para que o DNA consiga se adequar à consistência e
absorva adequadamente as informações genéticas dos outros três materiais.

Em seguida, o manipulador deve pôr a mistura em um aparelho

chamado termociclador. Esse aparelho vai promover variações de temperatura
específicas na solução tampão em que se encontra o DNA e a mistura. Essa
instabilidade na temperatura ajuda a transformar as fitas de DNA em uma única
estrutura, em caráter desnaturado. O aquecimento vem primeiro, com
temperatura máxima de 95° para que as fitas se separem. Depois vem o
resfriamento, com o termociclador apresentando uma temperatura de 50°. E aí
entra a fase de anelamento.

Anelamento

Das etapas da PCR, o anelamento é a que vai ocorrer a união das fitas de DNA
(primers) em cada lado complementar. A partir daí, o trabalho de amplificação
começa, uma vez que o molde da nova molécula cresce por conta da combinação
dessas complementações. O anelamento ocorre durante o resfriamento no
termociclador e, após esse período, o aparelho volta a se aquecer para que a
polimerase atue na composição.

Polimerização

É a extensão definitiva do DNA. Na técnica de PCR, essa fase já apresenta a

polimerase adicionando as bases nitrogenadas. Para que essa extensão ganhe
força e consiga reproduzir uma nova molécula, a mistura precisa estar aquecida a
uma temperatura de no máximo 72°.

Para se chegar a uma amplificação com nível considerável, são necessárias várias
repetições desse processo, com até 30 ciclos refeitos para que a nova molécula se
estruture corretamente.
PCR, qPCR, RT-qPCR… Sopa de
letrinhas científica?
16 de março de 2021
#Ciência et al. (Especiais temáticos repletos de informações científicas)
O que são essas siglas e quais as diferenças entre as várias
técnicas de PCR? E o que elas têm a ver com a COVID-19?

DESTAQUES:
– Siglas como PCR, qPCR, RT-PCR e similares estão presentes na mídia, mas é importante saber o q
elas significam;
– A técnica de PCR foi criada em 1983 e rendeu um prêmio Nobel em 1993;
– Essas técnicas permitem a identificação de qualquer fragmento de material genético escolhido, a p
da produção de grandes volumes desse fragmento;
– A qPCR permite a avaliação da quantidade de material genético sendo produzida em tempo real, co
uso de sondas fluorescentes;
 – A RT-PCR é utilizada quando o material de interesse é o RNA, e não o DNA;
– Essas técnicas podem ser usadas para o diagnóstico preciso de doenças como COVID-19.

Ultimamente, nos mais diversos meios de comunicação, popularizaram-se as

discussões a respeito de técnicas e metodologias científicas utilizadas para o
diagnóstico da COVID-19, como a RT-qPCR (do inglês Reverse Transcriptase
Quantitative PCR), o método mais eficaz para se diagnosticar um paciente.
Esse teste ficou conhecido como “o teste do cotonete no nariz”, mas você já se
perguntou como ele funciona? Como e quando surgiu essa metodologia
científica tão avançada? Você sabia que existem ainda outras variantes desta
técnica, chamadas de PCR, qPCR ou até mesmo RT-PCR? Mas, além das
letras na sigla, quais as verdadeiras diferenças por trás de cada uma dessas
técnicas?
Esse texto busca trazer essas respostas para você, que está cheio de dúvidas a
respeito dessas interessantes – e extremamente versáteis – ferramentas das
ciências biológicas. Essas metodologias são geralmente aplicadas na
identificação de seres vivos a níveis bastante específicos, e para esclarecer
melhor todas essas perguntas, vamos explicar a técnica juntamente com a sua
história.
Em 1983 aconteceu uma das mais significativas descobertas do século XX: o
cientista Dr. Kary B. Mullis desenvolveu a Reação em Cadeia da Polimerase, ou
PCR (do nome em inglês Polymerase Chain Reaction). Essa técnica tornou
possível obter muitas cópias de um mesmo fragmento de material genético,
possibilitando, portanto, a obtenção de grandes quantidades de uma amostra
genética específica.
As aplicações para essa técnica são extremamente diversas, podendo ser
utilizada em diagnósticos de doenças, identificação de seres vivos ao nível de
espécie e até mesmo como uma forma de evidência em casos policiais (área
forense), visto que a técnica possibilita a produção de fragmentos do DNA de
interesse partindo de quantidades de amostras muito pequenas, usando a
enzima DNA polimerase, a mesma que participa da replicação do material
genético nas células. Esta enzima se liga a um pequeno fragmento (o iniciador,
ou primer, em inglês), desenhado especialmente para se acoplar ao DNA alvo,
e produz uma sequência complementar ao fragmento de DNA de interesse,
escolhido antes do início da análise.
O primeiro estudo detalhando a metodologia da técnica foi publicado no periódico
científico Science, no ano de 1985, revolucionando a ciência e as possibilidades
de descobertas ao se trabalhar com o DNA. Porém, essa metodologia ainda
apresentava uma série de desafios, visto que é composta de 3 etapas.
Reação em cadeia da polimerase explicada passo a passo. Imagem: modificada de
https://www.biomedicinapadrao.com.br

A realização de 20 a 40 ciclos promove a amplificação da região que se pretende

analisar, seja ela de um gene humano específico, de microrganismos ou
basicamente de qualquer material genético que se deseja multiplicar para se
analisar posteriormente.
Em 1986, foi descoberta a Taq DNA polimerase, da bactéria Thermus
aquaticus, um organismo adaptado a viver em temperaturas de até 100ºC. Usar
a enzima dessa bactéria permitia que a reação fosse realizada sem interrupções,
visto que antes dessa descoberta eram utilizadas polimerases de bactérias
comuns, Escherichia coli, as quais precisavam ser adicionadas novamente a
cada um dos ciclos realizados, visto que essas desnaturam junto das duplas fita
de DNA no passo de desnaturação (ver figura), que eleva as amostras até 98ºC.
No ano de 1987, a técnica foi patenteada e no mesmo ano foram criados os
aparelhos termocicladores, permitindo a automatização desse processo e
aumentando a sua praticidade. Tamanho foi o impacto da técnica de PCR que,
em 1993, o Dr. Kary B. Mullis foi premiado com o Nobel de Química por sua
invenção. A partir desse ponto, começaram a surgir diversas variações da
técnica e aplicações das mais diversas formas; e é nesse contexto que surge a
análise tão utilizada hoje em dia nos diagnósticos de COVID-19, a RT-qPCR.
Certo, mas o que significam todas essas letras adicionadas antes de PCR? Muita
calma… Vamos chegar lá!
Em 1991, foi desenvolvido o método de teste TaqMan, o que marcou o início da
era das PCRs Quantitativas, também conhecidas como PCR em tempo real, ou
até mesmo qPCR. Porém, essa técnica começou a ser mais explorada somente
a partir de 2003, com a criação de aparelhos e materiais específicos para realizar
essa análise de forma mais efetiva.
Essa metodologia se parece muito com a PCR original, porém com a diferença
que são adicionadas sondas fluorescentes de DNA junto das amostras, as quais
emitem fluorescência a cada ciclo realizado pelo aparelho. Portanto, durante a
amplificação do material genético, a sua quantidade é medida pela quantidade
de fluorescência emitida pelo produto a cada ciclo. Isso é possível somente com
a utilização de um sistema de equipamentos com monitoramento da
fluorescência emitida, possibilitando uma quantificação mais exata de quanto
material genético existia na amostra inicial, abrindo ainda mais opções e
oportunidades de análises a serem feitas.
Já explicamos, portanto, sobre a PCR e a qPCR, porém de onde vem o “RT”, da
RT-PCR e RT-qPCR? Essas siglas costumam confundir até mesmo pessoas
experientes na área. Ao contrário do que se pensa, o RT não vem de Real Time.
RT, nesse caso, diz respeito a uma metodologia com uso de uma Transcriptase
Reversa (no inglês Reverse Transcriptase).
A Transcriptase Reversa é uma enzima comumente encontrada em vírus, como
os retrovírus (incluindo HIV, causador de AIDS; e o vírus da hepatite B). A enzima
desempenha a atividade de Transcrição Reversa, responsável pela síntese de
um DNA complementar a partir de um RNA molde. Nos vírus citados, por
exemplo, essa enzima é importante durante o ciclo de replicação deles. O
emprego da Transcriptase Reversa na biologia molecular, incluindo a reação de
RT-qPCR, é muito importante quando se deseja partir de uma amostra inicial de
RNA.
Enfim, chegamos nos testes de COVID-19. Como muitos já devem saber, o
SARS-CoV-2 é um vírus que tem como base de seu material genético não o
DNA, mas sim o RNA. Portanto, torna-se necessário que esse material genético
em forma de RNA seja transformado em DNA, antes de ser realizada a PCR em
tempo real para o diagnóstico. Sem esse passo inicial realizado pela
Transcriptase Reversa não haveria nenhum DNA na amostra, apenas RNA, e
nada seria amplificado pela DNA polimerase, impossibilitando a detecção do
vírus. Portanto, a RT-qPCR é muito importante para identificar se o Coronavírus
está presente ou não e qual a quantidade inicial dele nas amostras
de swab nasal e da faringe.
É válido lembrar que muitos outros testes que utilizam metodologias diferentes
também são muito úteis na luta contra o Corona vírus, como os testes que
procuram por anticorpos específicos para o vírus em amostras de sangue.
Porém, esses testes possuem uma sensibilidade menor, e, portanto, não são tão
confiáveis quanto o teste que utiliza a RT-qPCR. Além disso, é válido dizer que
os testes que buscam por anticorpos são mais eficazes em mostrar pessoas que
já tiveram a doença no passado, e não pessoas que estão com a doença no
momento da realização do teste, o que torna os testes por RT-qPCR essenciais
em estratégias públicas para detecção, tratamento e isolamento de pessoas que
estão doentes e que seriam possíveis transmissores da doença.
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