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21/03/2020 Reação em cadeia da polimerase (PCR) (artigo) | Khan Academy

Ciências · Biologia · Biotecnologia


· Métodos de análise do DNA

Reação em cadeia da
polimerase (PCR)
Uma técnica u lizada para amplificar, ou fazer muitas cópias
de, uma região de interesse específica do DNA.

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Pontos Principais:
A reação em cadeia da polimerase, ou PCR,
é uma técnica para fazer muitas cópias de
uma região específica do DNA, in vitro (em
um tubo de ensaio, ao invés de um
organismo).

A PCR depende de uma DNA polimerase


termoestável, a Taq polimerase, e requer
primers de DNA projetados especificamente
para a região de interesse do DNA .

Na PCR, a reação é repe da ciclicamente


através de uma série de alterações de
temperatura, o que possibilita a produção de
muitas cópias da região de interesse.
Você é um aluno ou
A PCR tem muitasprofessor?
aplicações prá cas e em
pesquisa. Ela é ro neiramente usada em
clonagens de DNA,Aluno
diagnós cosProfessor
médicos e
análises forenses de DNA.
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O que é PCR?
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma
técnica ro neira de laboratório usada para fazer
muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região
específica do DNA. Essa região do DNA pode ser
qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por
exemplo, pode haver um gene cuja função o
pesquisador queira compreender ou um
marcador gené co usado pelos cien stas
forenses para correlacionar o DNA da cena do
crime com os suspeitos.

Tipicamente, o obje vo da PCR é fabricar


quan dade suficiente da região de interesse do
DNA, de modo que essa possa ser analisada e
u lizada de alguma outra maneira. Por exemplo,
DNA amplificado por PCR pode ser enviado para
sequenciamento, visualizado por eletroforese em
gel, ou clonado em plasmídeo para futuros
experimentos.

A PCR é usada em muitas áreas da biologia e


medicina, incluindo pesquisa em biologia
molecular, diagnós cos médicos e mesmo alguns
ramos da ecologia.

Taq polimerase
Você édeum
Assim como a replicação aluno
DNA emou
um
professor?
organismo, a PCR requer uma enzima DNA
polimerase que faça novas fitas de DNA
Aluno
usando
Professor
as existentes como moldes. A DNA polimerase

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picamente usada na PCR é chamada de Taq


polimerase, em homenagem à bactéria resistente
ao calor da qual ela foi isolada (Thermus
aqua cus).

T. aqua cus vive em fontes termais e de água


quente. Sua DNA polimerase é bastante estável
ao calor e é mais a va à 70°C (temperatura em
que as DNA polimerases humanas ou de E. coli
seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor
torna a Taq polimerase ideal para PCRs. Como
veremos, a alta temperatura é usada
repe damente na PCR para desnaturar o DNA
molde, isto é, separar suas fitas.

Primers de PCR
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase
consegue fabricar DNA somente quando lhe é
dado um primer, uma sequência curta de
nucleo deos que fornece um ponto de par da
para a síntese de DNA. Em uma reação de PCR,
o pesquisador determina a região do DNA que
será copiada, ou amplificada, pelos primers que
ela ou ele escolher.

Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA


de fita simples, geralmente por volta de 20
aminoácidos de comprimento. Dois primers
Você é um aluno ou são
usados para cada reação de PCR, e eles são
professor?
projetados de modo que englobem a região de
interesse (região que deve ser copiada).
Aluno Isto é,
Professor
são dadas sequências que os farão se ligar a fitas
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opostas do DNA molde, bem nas extremidades


da região a ser copiada. Os primers se ligam ao
molde por pareamento de bases
complementares.

Quando os primers são ligados ao molde, eles


podem ser estendidos pela polimerase, e a
região que está entre eles será copiada.

[Diagrama mais detalhado mostrando a


direcionalidade do DNA e do primer]

Você é um aluno ou
professor?

Aluno Professor

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As etapas da PCR
Os principais ingredientes de uma reação PCR
são a Taq polimerase, primers, DNA molde e
nucleo deos (blocos que compõem o DNA). Os
ingredientes são reunidos em um tubo,
juntamente com cofatores de que a enzima
precisa, e passam por repe dos ciclos de
aquecimento e resfriamento que permitem que o
DNA seja sinte zado.

As etapas básicas são:

1. Desnaturação (96°C): Aquece fortemente a


reação para separar, ou desnaturar, as fitas
de DNA. Isso proporciona um molde de fita
simples para a próxima etapa.

2. Anelamento (55 - 65°C): Resfria a reação


para que os primers possam se ligar às suas
sequências complementares no DNA molde
de fita simples.

3. Extensão (72°C): Eleva a temperatura da


reação para que a Taq polimerase estenda os
primers, sinte zando novas fitas de DNA.

Ciências Biologia
Biotecnologia Métodos de
análise do DNA
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Métodos de análise do DNA
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Reação em cadeia da
Aluno Professor
polimerase (PCR)

El t f l
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Eletroforese em gel

Reação em cadeia da
polimerase (PCR)

Eletroforese em gel

Sequenciamento de DNA

Pra car: Métodos de


análise do DNA

Próxima lição
Células-tronco

Este ciclo se repete 25 - 35 vezes em uma reação


pica de PCR, que geralmente ocorre em 2 - 4
horas, dependendo do comprimento da região
de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente
(funcionar bem), a região de interesse pode gerar
de uma ou poucas cópias até bilhões.

Isso porque não é apenas o DNA original que é


u lizado como molde a cada vez. Ao invés, o
novo DNA feito em uma rodada pode servir de
molde na próxima rodada de síntese de DNA. Há
muitas cópias dos primers e muitas moléculas de
Taq polimerase flutuando pela reação, então o
número de moléculas de DNA pode
Você é um aluno ou
aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo.
professor?
Esse padrão de crescimento exponencial é
mostrado na imagem abaixo.
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Uso da eletroforese em gel para


visualizar os resultados da PCR
Os resultados de uma reação PCR são
geralmente visualizados (tornam-se visíveis)
através do uso da eletroforese em gel.
Eletroforese em gel é uma técnica na qual
fragmentos de DNA são puxados por uma
corrente elétrica através de uma matriz de gel, e
que separa os fragmentos de DNA de acordo
com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA,
é picamente incluído para que o tamanho dos
fragmentos nas amostras da PCR possa ser
determinado.

Fragmentos de DNA de mesmo comprimento


formam uma "banda" no gel, que pode ser vista a
olho nu se o gel for pigmentado com um corante
que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de
PCR produzindo um fragmento de 400 pares de
bases (pb) apareceria desta maneira no gel:
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Aluno Professor

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Uma banda de DNA contém muitas e muitas


cópias da região de interesse do DNA, não
apenas uma ou algumas cópias. Como o DNA é
microscópico, muitas cópias têm de estar
presentes antes que possamos vê-las a olho nu.
Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser
uma ferramenta importante: ela produz cópias
suficientes de uma sequência de DNA de modo
que possamos ver ou manipular aquela região de
DNA.

Aplicações da PCR
Através da PCR, uma sequência de DNA pode
ser amplificada milhões ou bilhões de vezes,
produzindo cópias suficientes de DNA para
serem analisadas por outras técnicas. Por
exemplo, o DNA pode ser visualizado por
eletroforese em gel, enviado para
sequenciamento, ou digerido por enzimas de
Você é um aluno ou
restrição e clonado em um plasmídeo.
professor?

A PCR é usada em muitos laboratórios


Aluno de
Professor
pesquisa e também tem aplicações prá cas em

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ciências forenses, testes gené cos e


diagnós cos. Por exemplo, a PCR é u lizada para
amplificar genes associados a desordens
gené cas a par r do DNA de pacientes (ou do
DNA fetal, nos casos de teste pré-natal). A PCR
também pode ser u lizada para testar se há
DNA bacteriano ou viral no corpo de um
paciente: se o patógeno es ver presente, pode
ser possível amplificar regiões de seu DNA a
par r de uma amostra de sangue ou tecido.

Amostra-problema: A PCR nas


ciências forenses
Suponha que você esteja trabalhando em um
laboratório de ciências forenses. Você acabou de
receber uma amostra de DNA de um cabelo
deixado em uma cena de crime, juntamente com
amostras de DNA de três possíveis suspeitos.
Seu trabalho é examinar um marcador gené co
em par cular e verificar se algum dos três
suspeitos coincide com o DNA do cabelo para
esse marcador.

O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um


deles contém uma única repe ção (região
marrom abaixo), enquanto o outro contém duas
cópias da repe ção. Em uma reação PCR com
primers que atuam Você
na região
é umde repeoução, o
aluno
primeiro alelo produz um fragmento de DNA de
professor?
200 bp, enquanto o segundo produz um
fragmento de DNA de 300 bp:
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Você faz uma PCR nas quatro amostras de DNA


e visualiza os resultados por eletroforese em gel,
como representado abaixo:

O DNA de qual suspeito coincide com o DNA


da cena do crime para esse marcador?

Escolha 1 resposta:

Suspeito 1

Suspeito 2

Suspeito 3

Nenhum dos suspeitos


Você é um aluno ou
professor?
[Dica]
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Verificar

Mais sobre PCR e ciências


forenses
Em testes forenses reais com o DNA da cena do
crime, os técnicos fariam uma análise conceitual
similar à representada no exemplo acima.
Contudo, uma série de marcadores diferentes
(não apenas o único marcador do exemplo) seria
comparada entre o DNA da cena do crime e o
DNA do suspeito.

Ademais, os marcadores usados em análises


forenses picas não vêm apenas em duas formas
diferentes. Em vez disso, eles são altamente
polimórficos (poli = muitas, morfo = formas). Isto
é, eles vêm em muitos alelos que variam
minimamente em comprimento.

O po mais comum de marcadores usado nas


ciências forenses, chamado microssatélites
(STRs na sigla em inglês), consiste em várias
cópias da mesma sequência curta de
nucleo deos que se repetem ( picamente, 2 a 5
nucleo deos de comprimento). Um alelo de um
STR pode ter 20 repe ções, enquanto outro
pode ter 18 e um outro apenas 101 .
Você é um aluno ou
professor?
Por meio do exame de múl plos marcadores,
cada um dos quais vem em muitas formas de
Aluno Professor
alelos, os cien stas forenses podem montar uma

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"impressão digital" singular a par r de uma


amostra de DNA. Em uma análise pica de STR
usando 13 marcadores, as chances de um falso
posi vo (duas pessoas tendo a mesma
"impressão digital" de DNA) são menores que 1
em 10 bilhões1 !

Embora possamos pensar na evidência de DNA


sendo usada para condenar criminosos, ela tem
do um papel crucial na exoneração de pessoas
falsamente acusadas (incluindo algumas que
estavam presas há muitos anos). A análise
forense também é usada para estabelecer
paternidade e iden ficar restos mortais de cenas
de desastres.

[Créditos e referências]

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luxeredias há um ano
more
Aluno Professor
Oi! Há um erro na seção "Primers de PCR":

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No período onde se lê:


"Os primers de PCR são pedaços curtos de
DNA de fita simples, geralmente por volta de
20 AMINOÁCIDOS de comprimento"

Não são aminoácidos e sim NUCLEOTÍDEOS

Obrigado!
Votar
(14 Vo
Responder • Comentar votos)
a
con
favor

há 5
m…
mariaauxiliadoradonofrio meses

Qual a temperatura ideal para se obter a


produção de muitas cópias.
Votar
(1 Vot
Responder • Comentar voto)
a
cont
favor

há 4
m…
Kennedy Barbosa meses

Olá, boa noite. A quan dade vai


depender do tempo que a PCR
demorará.

A temperatura segue um padrão:

- Rompimento das ponte de


hidrogênio= 94°C
- Anelamento preferencial dos
iniciadores= 50 - 60°C
- Extensão da DNA Polimerase=
72°C
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a
contra
favor

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Academy. Você é um aluno ou
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Eletroforese em gel Eletroforese em gel

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