Orientação Tutorial 1— Microbiologia Geral II

Conceitos gerais sobre metodologias independentes de cultivo utilizadas em microbiologia

Nome: Francisca Barbosa da Costa
Turma: Microbiologia A
Data de entrega: 24 de março de 2020
Nova data de entrega: 6 de maio de 2020

Como avaliar a diversidade microbiana sem recorrer a métodos de cultivo?

Os microrganismos, minúsculos seres de características distintas das dos animais e plantas,

representam o objeto de estudo da Microbiologia, sendo de referir que a sua diversidade implica uma série de
complexos procedimentos interrelacionais. Neste âmbito, é pelo presente explorada a possibilidade de análise
alternativa aos métodos dependentes de cultivo dos microrganismos, podendo ser utilizados métodos
independentes de cultivo quando a pretensão for a de caracterizar uma comunidade, a nível molecular, com
base em amostras recolhidas diretamente do ambiente. E, dependente do objetivo da investigação,
diferenciam-se metodologias, podendo estas ser mais minuciosas (Targeted methods) ou generalizadas (Non-
targeted methods). (Nicolau, 2014)
Ora, os Targeted methods, determinam como moléculas alvo, os ácidos nucleicos, tendo como
técnicas associadas: a Polymerase chain reaction (PCR), a Fluorescence in situ hybridization (FISH), o
microarranjo de DNA, a Enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA), a Imunofluorescência
(imunomarcação fluorescente), a de separação imunomagnética e a Restriction fragment length
polymorphisms (RFLP), as quais poderão estar associadas quer à eletroforese em gel de gradiente
desnaturante (DGGE), quer à eletroforese em gel de gradiente de temperatura (TGGE). (Nicolau, 2014)
Por outro lado, os Non-targeted methods, têm como alvo de análise ou o conjunto de proteínas, ou de
moléculas de DNA ou de moléculas de RNA, podendo esta ser executada através de técnicas como: Next
Generation Sequencing (NGS), Higt Throughput Sequencing (HTS), o método de Sanger, o
pirosequenciamento, o Single molecule real time sequencing (SMRT), entre outros. (Munshi, 2012)

Refira-se que as investigações que recorrem a métodos independentes de cultivo, têm como finalidade
“avaliar a diversidade filogenética e a relação com diversidade de funções, identificar funções codificadas pela
comunidade e efeitos no ecossistema, avaliar a contribuição de elementos genéticos móveis para a plasticidade
da comunidade e explorar o potencial de aplicações tecnológicas” (Correia, 2012). Todavia, é pertinente
destacar que estas técnicas são sensíveis a pequenas diferenças nas sequências dos ácidos nucleicos e das
proteínas.
Neste seguimento, torna-se assim fundamental dispor de tecnologia bioinformática avançada,
adequada e assertiva para cada finalidade, assim como, assegurar a existência de técnicos profissionais que
interpretem corretamente os resultados obtidos, p.e. através de bases de dados como o BLAST, o GenBank,
o Oxford Nanopore, a Pacific Biosciences, a Ribosomal Database Project (RDP), ou a SILVA, garantindo
desse modo a possibilidade de comparação entre a similaridade de sequências biológicas primárias, de
aminoácidos ou de nucleotídeos.
Métodos dirigidos - Targeted methods
Deste tipo de método, considera-se relevante destacar como exemplos, os seguintes:

* A reação em cadeia pela polimerase, vulgo PCR, caracteriza-se por permitir a amplificação (criação
de múltiplas cópias) de DNA a partir de um gene. Este processo de replicação de DNA, é auxiliado pela
enzima Taq polimerase, oligonucleótidos iniciadores (primers), específicos para cada gene, dNTP´s e catiões
mono- e bivalentes, sendo o resultado analisado através de uma eletroforese em gel de agarose, ou em
poliacrilamida. (Torres & Haas, 2016)

* A técnica da imunofluorescência, que consiste no uso de moléculas-sinal conjugadas com anticorpos

para interagir com um determinado antigénio, sendo indicativo da sua presença, a produção de uma luz
fluorescente. Este ensaio é usado, p.e., para a deteção de protozoários parasitas como Giardia spp. e
Cryptosporidium spp., em amostras de água, ou ainda para o estudo de culturas mistas. (Nicolau, 2014)

* A técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) é utilizada para detetar e localizar a presença
de determinadas sequências de cromossomas, através de uma sonda, contendo um marcador fluorescente e a
sequência de DNA, que vai emparelhar/hibridizar, especificamente com o alvo. Pode esta ser aplicada para a
deteção e localização de alvos específicos de RNA em células circulantes, células tumorais ou amostras de
tecido. (Cortez, 2009)

* A técnica ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), deteta anticorpos específicos, sendo usada
como diagnóstico de doenças que induzem a produção de imunoglobulinas. Neste teste é efetuada a fixação de
um antigénio a uma superfície sólida, que se irá ligar a um anticorpo, que por sua vez é ligado a um marcador
enzimático, detetando-se assim a mudança de cor do substrato presente, em microplacas. (Nicolau, 2014)

Considera-se de relevante interesse para esta abordagem, a análise SWOT da técnica FISH infra exposta.
(Cortez, 2009)

Strenghts
independente da extração
de ácidos nucleicos
alta resolução, velocidade,
verossimilidade e
sensibilidade
deteção simultânea de
múltiplos alvos
Oportunities
caracteriza comunidades
microbianas complexas
automatização
análise comparativa

Weaknesses
autofluorescência dos
substratos
especificidade das sondas
heterogeneidade do rRNA
16S entre múltiplas cópias
da mesma espécie
Threats
requer dados de referência
estudo continuo para
determinar condições de
especificidade de cada
sonda
custos associados

É, ainda, de destacar a técnica denominada de PCR cuja metodologia pode ser desenvolvida de modo
convencional, em tempo real ou multiplex, sendo por isso a mais utilizada no âmbito da biologia molecular,
uma vez que possibilita uma panóplia de variantes, como o PCR-SSCP (Single-Strand-Conformation
Polymorphism), o RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), o AFLP (Amplified Fragment Lengh
Polymorphism), ou ainda o ARDRA (Amplified Ribossomal DNA Restriction Analysis). (Munshi, 2012)

Refira-se que na técnica PCR convencional, são utilizados fragmentos de DNA com no máximo 2000 pb,
o que torna esta variante menos específica dada a sua baixa precisão no apuramento dos resultados, baixa
sensibilidade, e com um maior risco de contaminação, por efeito do gel utilizado.

Porém, na técnica PCR de tempo real, são utilizados fragmentos de 300 pb (ou menos), os quais são
monitorizados por uma sonda fluorescente, sendo assim possível acompanhar a amplificação em tempo real, e
prescindir de uma eletroforese. Esta representa, por isso, uma alternativa ao PCR convencional, uma vez que é
bastante mais sensível, específica e rápida, apesar dos equipamentos utilizados, requererem uma maior
sofisticação e, por inerência, um maior custo.

Já na técnica PCR multiplex, várias regiões do DNA são amplificadas simultaneamente, e no mesmo
recipiente, uma vez que são utilizados vários pares de primers, específicos para cada locus a ser identificado.
No que concerne à temperatura de annealing dos diferentes primers, esta deve ser muito próxima, e os
amplicons produzidos, devem apresentar tamanhos distintos, a fim de permitir a sua visualização na
eletroforese em gel, o que não sendo possível, torna-se necessária a utilização de corantes fluorescentes nos
iniciadores. Efetivamente, esta técnica apresenta alta especificidade e rapidez na obtenção de resultados, uma
maior economia de reagentes, sendo por isso comumente aplicada nos laboratórios forenses, p.e., para
amplificar amostras de DNA degradadas. (Torres & Haas, 2016)

Aludir que, no âmbito da microbiologia, a técnica PCR, com o auxílio do genotyping, viabiliza o estudo
de organismos como Mycobacterium tuberculosis. Já na área da virologia, esta técnica é utilizada não só para
detetar, antecipadamente, a infeção pelo HIV (mesmo antes da formação dos anticorpos), como também, para
analisar as amostras de sangue recolhidas para uma doação. Na medicina, possibilita a monitorização dos
tecidos após transplantes (de órgãos ou medula), a realização de inúmeros testes forenses, deteção de agentes
patogénicos ou mutações, ou ainda, proceder a ensaios de clonagem. (Cortez, 2009)

Métodos não-dirigidos - Non-targeted methods

Deste tipo de método, considera-se relevante destacar como exemplos, os seguintes:
* A abordagem metagenomics, a qual incide no estudo de todo o material genético (DNA),
diretamente extraído de amostras ambientais. Isto é, baseia-se no sequenciamento de regiões conservadas do
genoma (usando o gene 16S rRNA) a fim de possibilitar a identificação dos géneros numa amostra natural.
(Correia, et al, 2012)

* A abordagem metaproteomics, analisa, não só todas as proteínas obtidas diretamente a partir de

amostras ambientais, como também permite a classificação de proteínas e genes enquadrados em
comunidades de seres vivos, onde a divisão entre espécie e género não é tão linear como em comunidades
mais simples. Aqui, são aplicadas técnicas de cromatografia líquida em gel, e de espectrometria de massa,
encontrando-se na atualidade a serem desenvolvidas investigações que correlacionem o proteoma bacteriano à
saúde humana.

* A abordagem metatranscriptomics, focaliza-se na diversidade dos genes ativos de uma comunidade,

a fim de quantificar os seus níveis de expressão, monitorizando-os para percecionar como esses níveis se
alteram em diferentes condições (fisiológicas e patológicas). Para isso, é necessário recolher várias amostras,
com posterior extração de RNA, enriquecimento de mRNA (descartando o tRNA e o rRNA), síntese de cDNA
para sequenciamento e processamento, culminando o processo com a interpretação de resultados, através de
um pipeline.

Considera-se de relevante interesse para esta abordagem, a análise SWOT da abordagem metagenomics infra
exposta. (Correia, et al, 2012)

Strenghts
sequenciação de todo o
genoma
independente do cultivo de
microrganismos
execução de várias análises
bioinformáticas através do
mesmo conjunto de dados
Oportunities
prever a abundância de
genes funcionais numa
comunidade
elaboração de um perfil
metabólico
monitorização do
surgimento de variantes
microbianas patogénicas

Weaknesses
muitas tecnologias não têm a
capacidade de "ler" toda a
quantidade de dados
resultados dependem do
protocolo de extração dos
ácidos nucleicos
pool genético pode não ser
representativo
Threats
aprimoramento contínuo das
tecnologias de
sequenciamento
especificidade de
patogénicos alvo
ocorrência de genes ou
mutações de resistência

O ênfase dado à abordagem metagenomics, relaciona-se com o fato de protagonizar um crescimento

exponencial no que concerne aos avanços da tecnologia, existindo na atualidade, uma célere produção de uma
extensa quantidade de dados, como resultado da grande sensibilidade e desempenho de sequenciadores - Higt
Throughput Sequencing-HTS, o que potencia estudos quantitativos e qualitativos com considerável
assertividade. (Munshi, 2012)

Deve ainda ser aludido que o termo metagenomics, criado por Jo Handelsman, é utilizado quer a nível
ambiental, quer de comunidades de seres vivos, para aplicação de técnicas de biologia molecular que
possibilitem a análise e caracterização de comunidades microbianas, diretamente do ambiente natural,
independente da contenção subjacente ao isolamento, o cultivo de microrganismos.

Em suma, julga-se ser de preponderante importância, para efeitos de uma análise metagenómica,
verossímil com a realidade, executar com rigor, etapas como: sampling de amostras biológicas, sequencing,
sequence read and processing, assembling, gene prediction, binning e, por último, functional annotation. Um
processo que deve contemplar o recurso a uma plataforma de alto desempenho, adequada para o efeito, a fim
de potenciar, não só o aprimoramento do conhecimento filogenético e biotecnológico dos microrganismos,
como também, a identificação de “clusters génicos funcionais, que possam codificar enzimas microbianas de
interesse tecnológico, como lipases, despolimerases ou hidrolases para polímeros complexos”. (Duarte, 2014)

Esta abordagem permitiu percecionar que uma das problemáticas com que os bioinformáticos se
deparam, que é a colossal quantidade de dados que os sequenciamentos com a tecnologia de HTS geram, e
que inerentemente necessita de ser armazenada, processada e interpretada. Assim, o aperfeiçoamento do
software HTS exponencia a viabilidade na produção de grandes quantidades de dados, possibilitando a
exploração dessas informações genómicas, por uma mais ampla e diversificada classe de investigadores.
Referências:
- Correia, A., Alves, A., Henriques, I. (2012) Métodos de estudo de comunidades bacterianas:
diversidade filogenética e molecular, resistoma e elementos genéticos móveis, Universidade de
Aveiro
https://spmicrobiologia.files.wordpress.com/2012/12/2012127-12a1.pdf acedido em 9 de março de 2020

- Cortez, M. (2009) Abordagem molecular na resolução de problemas com biocorrosão,

Universidade de Aveiro
https://ria.ua.pt/bitstream/10773/845/1/2009001157.pdf acedido em 11 de março de 2020

- Duarte, E., Brendel, M., Loguercio, L. (2014) Sequenciamento de Segunda Geração: Implicações
nos Estudos Metagenômicos, Universidade estadual de Santa Cruz
http://www.uesc.br/genetica/temalivre_resumoelizabeth.pdf acedido em 9 de março de 2020

- Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. (2004) Microbiology de Brock, consultado em 11 de março de
2020

- Munshi, A. (2012) DNA sequencing – methods and applications, Intechopen

http://library.umac.mo/ebooks/b28050393.pdf acedido em 12 março de 2020

- Nicolau, P. B. (2014) Métodos em microbiologia ambiental, Universidade Aberta

https://repositorioaberto.uab.pt/bitstream/10400.2/6136/1/UT3_metodos_em_micro_ambiental.pdf acedido em 13 de
março de 2020

- Torres, A.C., Haas, D.J. (2016) Aplicações das técnicas de PCR no diagnóstico de doenças
infecciosas dos animais, revista científica de medicina veterinária
http://faef.revista.inf.br/imagens_arquivos/arquivos_destaque/5D3Iu05EHeEnqPl_2017-1-12-8-29-47.pdf acedido em 12
de março de 2020