FISH - Hibridização

in situ fluorescente
Professor: Hermínio Sobrinho
Alunos: Arthur Luiz de Oliveira, Iasmin Rodrigues de Santana e
Kamila Santana Costa
Sumário
1 Histórico

2 Metodologia

3 Interpretação de resultados

4 Fatores interferentes na técnica

5 Aplicações clínicas
6 Vantagens e desvantagens
Histórico
O QUE É A TÉNICA FISH?

Hibridação in situ por Fluorescência

Método histoquímico que permite a visualização,

identificação, enumeração e localização
simultânea de micro-organismos in situ.

Fonte: www.inopat.com.br/wp-content/uploads/2019/12/M-5090_Folder-ZytoLight-Hematology-Probe-Pool-01-2018.pdf
Histórico
QUANDO FOI DESENVOLVIDO?

Em 1969 Gall e Pardue desenvolveram a primeira técnica de hibridização

in situ utilizando sondas marcadas com radioisótopos.

Em 1980 Bauman desenvolveu a técnica fish (fluorescent in situ

hybridization), que proporcionou um aumento significativo da resolução,
rapidez e segurança.
Metodologia
Consiste na identificação e localização de ácidos
nucléicos alvo através da ligação complementar
de sondas marcadas com moléculas
fluorescentes (fluorocromos).

A lâmina produzida deve ser observada em

microscópio especial para fluorescência.

A maioria das aplicações da técnica de FISH tem

como alvo o RNA ribossomial.

Fonte: https://www.laboratoriociap.com.br/novo-
site/2019/04/26/nova-tecnica-molecular-
hibridizacao-in-situ/
Metodologia
PROCEDIMENTOS BÁSICOS
Fixação e permeabilização da amostra
Hibridização
Lavagem para remoção das sondas em
excesso
Detecção pela microscopia fluorescente

Fonte: https://www.researchgate.net/figure/Principais-etapas-
da-hibridizacao-fluorescente-in-situ_fig1_288516378
 Interpretação de resultados
FISH: Utiliza sondas de DNA marcadas com fluorescência para detectar
anomalias cromossômicas.
Tipos de sondas:
Sondas centroméricas (ou de seqüências repetitivas - CEP):
Constitui de DNA satélite que é complementar a estruturas específicas do
cromossomo como centrômeros e regiões heterocromáticas ou teloméricas
Sinais de hibridização muito brilhantes
Aplicadas para detectar ganhos e perdas de cromossomos inteiros
(aneuploidias)
Interpretação de resultados
Sondas locus-específicas (ou de seqüências únicas - LSI) :
Obtidas pela amplificação em sistemas microbiológicos ou pela técnica de
reação em cadeia da polimerase (PCR)
Utilizadas na identificação de genes específicos
Sinais menos intensos
Detecção de ganho ou perda parcial de regiões cromossômicas discretas
Interpretação de resultados
Sondas de cromossomos inteiros (pintura cromossômica - WCP).
Utilizados para "pintar" um cromossomo inteiro ou uma região
cromossômica
Úteis na caracterização de rearranjos cromossômicos
complexos.
Interpretação de resultados
SONDAS CENTROMÉRICAS X SONDAS DE CROMOSSOMO INTEIRO
Sondas centroméricas são úteis para a detecção de alterações
numéricas
Sondas de cromossomo inteiro ou pintura cromossômica são
eficientes para a detecção de alterações estruturais
Interpretação de resultados
Exemplo: Cariotipagem espectral :
24 sondas cromossomo-específicas.
A análise espectral não é dependente da intensidade do sinal, mas apenas
da imagem espectral criada pela marcação combinatória da sonda.
A cariotipagem espectral permite a detecção de rearranjos cromossômicos
estruturais, constitucionais ou adquiridos, aumentando a sensibilidade da
citogenética tumoral
Interpretação de resultados

Síndrome de Prader-
Willi/Angelman: Este
paciente tem uma
microdeleção na região de
15p13.

Fonte:
https://www.cibic.com.ar/laboratorios-
bioquimicos/hibridacion-in-situ-
fluorescente-fish/
Fatores interferentes na técnica
FALSO POSITIVO

Ocorre quando a substância alvo é autofluorescente.

Quando há falta de especificidade.

FALSO NEGATIVO
Ocorre quando há penetração insuficiente da sonda no interior da substância alvo
(depende da estrutura da parede celular).
Quando há baixa quantidade de rRNA disponível para anelamento.

Fonte: www.werfen.com/pt/pt-pt/oncologia-e-citogenetica/sonda-fish
Outros fatores de interferência

Contaminação cruzada

Armazenamento e manuseio

Técnica inadequada
Aplicações clínicas
Identificação de cromossomopatias
Diagnóstico pré-natal
Diagnóstico de leucemias
Pesquisa básica (detecção de
alterações cromossômicas em
células tumorais e estudos de
expressão gênica)
Mapeamento genético
Toxicologia molecular
Monitoramento pós-transplante
Detecção de micro-organismos em
ambientes complexos
Reconhecimento de doenças virais
Aplicações clínicas
LEUCEMIAS
Sucesso na detecção de rearranjos cromossômicos
específicos;
Importância para o monitoramento da eficácia da terapia;
Combinação das técnicas de citogenética clássica e
molecular proporciona resultados mais precisos e com
maior rapidez;
Por ser um método quantitativo, permite inclusive a
detecção de doença residual mínima.
Aplicações clínicas
GENE HER2 NO CÂNCER DE MAMA
Técnica de FISH é a mais precisa e confiável para a
pesquisa da amplificação desse gene;
Melhor correlação com o prognóstico e resposta à
terapêutica;
A demonstração da superexpressão ou da amplificação é
essencial para a utilização da terapia com o anticorpo
monoclonal anti-HER2 (significativos benefícios clínicos).
Aplicações clínicas
AVALIAÇÃO FISH DOS TUMORES MAMÁRIOS

Figura 1: Imagem da FISH em célula tumoral Figura 2: Imagem da FISH em célula tumoral
mamária da amostra 76, utilizando sonda CEP 8 mamária da amostra 93, utilizando sonda CEP 11
(verde) e CEP 17 (vermelha), aumento 1000X. (verde) e CEP 17 (vermelha), aumento 1000X

Fonte: https://repositorio.ufsc.br/bitstream/handle/123456789/132329/20092-
CarolinaEFoppa.pdf?sequence=1&isAllowed=y
Vantagens
Identifica anormalidades e permite resolução visual.
Identifica rearranjos cromossômicos que envolvem regiões de difícil avaliação
ou de difícil interpretação.
Alta sensibilidade e especificidade.
Permite avaliar as regiões discretas do genoma.
Segurança.
Rapidez .
Avaliação simultânea de diversas sondas
Obtenção de informações genômicas em núcleos interfásicos
Desvantagens
Alto custo dos insumos e equipamentos
Restrita às anormalidades que possuem sondas disponíveis
Apenas uma ou poucas anormalidades podem ser acessadas
simultaneamente
Os dados citogenéticos podem ser obtidos apenas para cromossomos-alvo
Altamente sensitivo para ganhos, mas menos sensitivo para detecção de
perda cromossômica ou deleção
Requer microscopia de fluorescência e um sistema de análise de imagem
Referências
GUEDES, Roberto. Fig 1. ResearchGate, jan. 2021. Disponível em
https://www.researchgate.net/figure/Principais-etapas-da-hibridizacao-fluorescente-in-
situ_fig1_288516378. Acesso em: 14 mai. 2022

Neves, S.M.N. e Guedes, R.M.C.Hibridização in situ fluorescente: princípios básicos e

perspectivas para o diagnóstico de doenças infecciosas em medicina veterinária. Arquivos
do Instituto Biológico. 2012, v. 79, n. 4, pp. 627-632. Disponível em: <>. Epub 03 Jun 2013.
ISSN 1808-1657.

Técnicas citogenéticas e moleculares para o diagnóstico de doenças genéticas - Prof. Dr.

MichelNaslavsky. Disponível em:
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4618132/mod_resource/content/1/6-
Tecnicas.pdf
Referências
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). Disponível em:
https://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situhybridization-fish-32

Hibridização in situ. Fonte medicina diagnóstica, 2018. Disponível em:

https://fontemd.com/exames/hibridizacao-in-situ/

“Técnica de Hibridização in situ e suas aplicações na rotina diagnóstica”.Disponível em :

https://www.sbhistotecnologia.bio.br/v2/painel/arquivos2/palestra_00000026_012.p df
Obrigado!!