FISH

(FLUORESCENT IN SITU
HYBRIDIZATION)
Pontifícia Universidade Católica de Goiás
Disciplina: Citologia
Professor: Hermínio Sobrinho
Alunos: Lívia Naves Parreira, Pabulo Henrique Marques de Sousa e Víttor
Augusto Carvalho Peres
 Sumário
• Histórico
• Metodologia
• Interpretação de resultados
• Fatores interferentes na técnica
• Aplicações clínicas
• Vantagens e Desvantagens
 Histórico
• Primeira técnica: marcadores naturais ou sintéticos;
• Em 1969, Gall e Pardue desenvolveram a primeira técnica de
hibridização in situ;
• A introdução da FISH, primeiramente desenvolvida por
Bauman et al. ocorreu em 1980;
• Tecnologia aplicada tanto na biologia quanto na
citogenética.
 Metodologia
• A técnica consiste na identificação e localização de ácidos
nucléicos alvo (sequências de DNA ou RNA);
• A lâmina produzida deve ser observada em microscópio
especial para fluorescência;
• A maioria das aplicações da FISH tem como alvo o RNA
ribossomal.
Fonte: https://www.onconews.com.br/site/atualizacao-cientifica/drops-de-
gen%C3%B4mica/6114-entendendo-a-t%C3%A9cnica-fish.html
Fonte: https://www.scielo.br/j/aib/a/rQfs49x8J3zb8NK5M67sbFb/?lang=pt&format=pdf
 Interpretação de resultados
• O anelamento da sonda com a sequência alvo, para a visualização em
microscópio epifluorescente. Entende-se por sonda, uma sequência
de oligonucleotídeos complementares e específicos marcados com
substâncias fluorescentes os quais se anelarão ao alvo.
• Os principais tipos de sondas de DNA utilizadas na técnica de FISH
são: as sondas de sequência de DNA repetitivo, as sondas de
cromossomos inteiros (WCP – whole chromosome painting) e as
sondas de sequência única.
Fonte: Cláudio C. Silva/UCG LaGene
Fonte: https://www.cibic.com.ar/laboratorios-bioquimicos/hibridacion-in-situ-fluorescente-fish/
 Fluorocromos

FITC FluoXE TRITC

TexasRed Cy3 Cy5

 Fatores interferentes
• A presença de citoplasma;
• Vestígios de parafina em lâminas de amostras FFPE;
• Erros na fixação do material;
• Uso de jarros de porcelana nas lavagens;
• Fotodegradação;
• Temperatura;
• Calibração dos equipamentos.
 Falso-positivo
• Micro-organismos ou substâncias alvos apresentam
autofluorescência.
• Tecidos contendo elastina e colágeno como também
eritrócitos ou eosinófilos podem apresentar certa
autofluorescência.
 Falso-negativo
• Penetração insuficiente da sonda no interior do micro-
organismo.
• Baixa quantidade de RNA disponível para anelamento.
 Aplicações clínicas
• Doenças cromossômicas;
• Diagnóstico de câncer;
• Doenças virais;
• Monitoramento pré-natal;
• Monitoramento pós-transplante;
• Detecção de microorganismos;
• Genômica comparativa.
 Vantagens
• Alta sensibilidade e especificidade
• Não necessidade de cultivo in vitru
• Sequências de ácidos nucleicos são analisadas no interior das células
• Reação rápida comparada com outros métodos
• Análise em diferentes fases de crescimento celular
 Desvantagens
• Necessidade de equipamentos modernos e dispendiosos, como
microscópio de filtro epifluorescentes
• São necessárias sondas específicas
• Alto custo, ferramentas de registro de imagem
• Casos em que os micro-organismos ou substâncias alvo são
autofluorescentes
 Referências Bibliográficas

• NEVES, S.M.N; GUEDES, R.M.C.. Hibridização in situ fluorescente: princípios

básicos e perspectivas para o diagnóstico de doenças infecciosas em
medicina veterinária. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.79, n.4, p.627-632,
out./dez., 2012. Disponível em:
https://www.scielo.br/j/aib/a/rQfs49x8J3zb8NK5M67sbFb/?lang=pt&form
at=pdf
• Hibridização in situ. Disponível em:
https://fontemd.com/exames/hibridizacao-in-situ
• Técnica de Hibridização in situ e suas aplicações na rotina diagnóstica. XX
Congresso Brasileiro de Histotecnologia. Belo Horizonte, 2017. Disponível
em:
https://www.sbhistotecnologia.bio.br/v2/painel/arquivos2/palestra_00000
026_012.pdf
 Referências Bibliográficas
• Hibridación in situ Fluorescente (FISH). Disponível em:
https://www.cibic.com.ar/laboratorios-bioquimicos/hibridacion-in-
situ-fluorescente-fish/