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NIH Public Access Autor

Manuscrito Mol Cancer Ther.
Manuscrito do autor; disponível no PMC 2009 em 8 de dezembro.
Publicado na forma final editada como:
Mol Câncer Ther. 2009 janeiro; 8(1): 232-239. doi:10.1158/1535-7163.MCT-08-0862.

Marcação óptica no infravermelho próximo ativável específica do alvo in vivo de

anticorpos monoclonais humanizados

Mikako Ogawa, Celeste AS Regino, Peter L Choyke e Hisataka Kobayashi

Programa de Imagem Molecular, Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, National Cancer
Instituto de Saúde

Abstrato
Imagens com anticorpos monoclonais marcados podem ser úteis na detecção, estadiamento e monitoramento
de tumores. Apesar de sua alta afinidade e especificidade, uma limitação crítica da imagem de anticorpos é o
alto sinal de fundo devido à depuração prolongada do sangue que reduz a razão tumor-fundo (TBR). Para
resolver esse problema, desenvolvemos uma sonda de imagem molecular que consiste em vários fluoróforos
autoextinguíveis (Cy5.5 ou Alexa680) conjugados a um anticorpo monoclonal (trastuzumab-Tra) para sintetizar Tra-
Cy5.5(SQ) ou Tra-Alexa680 (SQ) respectivamente. Este agente só se torna fluorescentemente “ativo” após a
internalização celular, mas é extinto no estado não ligado, levando a TBRs altos. A capacidade de extinção in vitro
para ambos os conjugados foi de aproximadamente 9 vezes. Experimentos de imagem in vivo foram realizados em
camundongos com xenoenxertos 3T3/HER2+ e Balb/3T3/ZsGreen/HER2-. Tra-Alexa680(SQ) produziu realce
específico nos tumores 3T3/HER2+, mas não nos tumores de controle HER2-. No entanto, Tra-Cy5.5(SQ) produziu
realce não específico em tumores 3T3/HER2+ e controle. Em conclusão, enquanto Cy5.5 produziu resultados não
específicos, bem como rápido acúmulo no fígado, a conjugação de múltiplas moléculas Alexa680 a um único
anticorpo monoclonal resultou em um agente óptico de infravermelho próximo (NIR) que ativou em tumores alvo
específicos com alta TBR com considerável potencial de tradução clínica.

Palavras-chave

imagem molecular; ativável; Câncer; próximo ao infravermelho; anticorpo humanizado

Pedidos de reimpressões: Hisataka Kobayashi, MD, Ph.D. Programa de Imagem Molecular, Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional
do Câncer, NIH, Edifício 10, Sala 1B40, MSC1088, Bethesda, MD 20892-1088. Telefone: 301-451-4220; Fax: 301-402-3191;
kobayash@mail.nih.gov.
Significado do trabalho:
Espera-se que a imagem com anticorpos monoclonais marcados seja útil na detecção e estadiamento de tumores e no monitoramento da terapia,
no entanto, até o momento, essa estratégia obteve sucesso limitado. Anticorpos humanizados, que são moléculas de IgG humanas enxertadas com
CDR específicas de antígeno, têm sido usados para terapia clínica do câncer porque induzem citotoxicidade celular dependente de antígeno com
toxicidade imunogênica mínima. Embora anticorpos monoclonais humanizados pareçam candidatos ideais como frações de direcionamento para
sondas de imagem molecular, pouco sucesso foi alcançado até o momento. Apesar de sua alta especificidade e afinidade, uma limitação crítica da
imagem de anticorpos humanizados é o alto sinal de fundo devido à depuração prolongada do sangue que reduz a razão tumor-fundo (TBR). Para
resolver esse problema, desenvolvemos um anticorpo monoclonal autoextinguível e ativável por fluorescência, baseado no anticorpo anti-HER2
humanizado, trastuzumab, que produz pouco sinal quando não ligado, mas é ativado após a internalização celular e a desativação levando a um
alto TBR. Nós validamos este sistema comparando-o com um anticorpo anti-CD25 humanizado similarmente marcado, daclizumab, para demonstrar
que este método é amplamente aplicável a uma ampla gama de anticorpos humanizados. Este sistema de imagem molecular baseado em anticorpos
autoextinguíveis, NIR e alvo específico, que emprega várias moléculas Alexa680, é uma tecnologia de plataforma potencial para detectar,
diagnosticar e caracterizar tumores in vivo , definindo sua expressão de antígeno de superfície com alto TBR.
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Introdução

A imagem molecular com anticorpos tem o potencial não apenas de melhorar a detecção de tumores, mas
também de caracterizá-los por seus perfis de expressão na superfície celular (1,2). No entanto, a entrega de
anticorpos a um tumor depende da alta afinidade de ligação e da baixa taxa de desativação de anticorpos
para seus antígenos de superfície celular, bem como seu suprimento sanguíneo abundante (3,4) com
vasculatura tumoral permeável levando a permeabilidade e retenção aprimoradas (EPR ) (5,6) aumentando
assim o acúmulo de anticorpos. Uma vez que o efeito EPR depende apenas das características físicas das
macromoléculas injetadas e não das suas características de ligação, muitas vezes leva a uma captação não
específica do tumor. A fim de obter imagens de anticorpos específicos, é necessário tempo suficiente para
a depuração do anticorpo não ligado para reduzir o sinal de fundo, resultando em razões alvo para fundo
(TBR) favoráveis. Enquanto isso, os longos tempos de liberação de anticorpos tornam a imagem atrasada
uma necessidade, levantando questões práticas em relação à aceitação do paciente e do médico.
Portanto, a imagem molecular alvo-específica baseada em anticorpos in vivo é limitada pelo efeito EPR
e tempos de depuração prolongados, levando a TBR reduzido, o que diminui a sensibilidade e a
especificidade.

Anticorpos humanizados, que são moléculas de IgG humanas enxertadas com CDR específicas de
antígeno, têm sido usados para a terapia clínica do câncer porque produzem citotoxicidade celular
dependente de antígeno com toxicidade mínima devido à baixa imunogenicidade. Portanto, o anticorpo
humanizado é uma escolha realista como uma fração de direcionamento para sondas de imagem molecular.
No entanto, a imagem com anticorpos humanizados alcançou sucesso limitado. Apesar de seu acúmulo
altamente específico em tumores-alvo, uma limitação crítica da imagem de anticorpos humanizados é o alto
sinal de fundo devido à depuração sanguínea prolongada que reduz a razão tumor-fundo (TBR). Das
técnicas de imagem clinicamente disponíveis para marcação de anticorpos, apenas a tomografia por
emissão de pósitrons (PET) e a tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) têm sido
amplamente utilizadas in vivo e apenas com isótopos de vida longa. No entanto, como as sondas PET ou
SPECT emitem sinal constantemente (diminuindo em função da meia-vida do radioisótopo), o sinal
relacionado ao EPR e o sinal de fundo são bastante altos, especialmente quando são usados anticorpos
humanizados. Portanto, para otimizar a farmacocinética e a depuração, modificações genéticas ou
enzimáticas de anticorpos têm sido investigadas, porém, essas alterações podem reduzir o valor terapêutico
do anticorpo (2). Os anticorpos marcados opticamente, em teoria, sofrem das mesmas limitações que os
radioisótopos, no entanto, as sondas ópticas diferem porque podem ser ativadas ou ligadas apenas nas
células cancerígenas alvo em resposta a estímulos ambientais intracelulares específicos. Ao ativar o sinal
de fluorescência apenas dentro das células-alvo, o acúmulo não específico devido ao EPR e no pool de
sangue é minimizado.

Várias sondas ópticas ativáveis foram recentemente relatadas (7-11). Estes são amplamente baseados em
mecanismos de auto-extinção pelos quais a clivagem enzimática de fluoróforos mantidos em alinhamento
estérico próximo resulta em ativação fluorescente à medida que os fluoróforos se afastam um do outro.
Entre as várias opções para fluoróforos de imagem, as sondas de infravermelho próximo (NIR) têm a
vantagem de melhor penetração em profundidade no tecido e são passíveis de autoextinção (12).
Por exemplo, quando dois ou mais corantes Cy5.5 são conjugados com dendrímeros de poliamidoamina
de geração 6, que são semelhantes em diâmetro hidrodinâmico às moléculas de anticorpo, ocorre
autoextinção e o grau de autoextinção aumenta à medida que o número de corantes Cy5.5 aumenta ( 13).
No entanto, a conjugação de vários fluoróforos à mesma macromolécula corre o risco de alterar a
farmacocinética do conjugado. Relativamente poucos relatórios se concentram em sondas ópticas ativáveis
conjugadas com anticorpos.

Neste estudo, sintetizamos e testamos uma sonda ativável autoextinguível conjugada a um anticorpo
monoclonal usando fluoróforos NIR à base de cianina, AlexaFluor 680 (Alexa680) e Cy5.5, conforme descrito
na figura suplementar 1. Neste estudo, empregamos trastuzumab, um humanizado

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anticorpo monoclonal IgG1 , que se liga ao receptor do fator de crescimento epidérmico humano
tipo 2 (HER2). Após a ligação ao HER2, o trastuzumab é gradualmente internalizado nas células-
alvo e, em seguida, sofre degradação no lisossomo (14). Dentro do lisossomo, o conjugado é
extinguido e a luz é emitida. Assim, o sinal é extinto enquanto o anticorpo-conjugado está fora da
célula, mas é ativado após ser internalizado intracelularmente.

Materiais e métodos
Reagentes
Trastuzumab (Tra), um anticorpo anti-HER-2 humanizado aprovado pela FDA, que possui
uma região de determinação complementar (CDR) contra HER-2 enxertada em uma
estrutura de IgG1 humana, foi adquirido da Genentech Inc. (South San Francisco, CA) . O éster
Cy5.5-NHS foi adquirido da GE Healthcare (Piscataway, NJ). O éster Alexa680-NHS foi adquirido da
Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA). O plasmídeo ZsGreen foi adquirido de Clontech Laboratories,
Inc. (Mountain View, CA). Todos os outros produtos químicos utilizados eram de grau reagente.

Análise estrutural de Cy5.5 e Alexa680

A estrutura química de Cy5.5 foi amplamente publicada (24). A estrutura do Alexa680 foi
determinada com análise espectroscópica de massa e RMN, conforme mostrado nos dados
suplementares e na figura 3,4.

Resumidamente, análises espectroscópicas de massa (MS e MS/MS) foram realizadas com sistemas
LCMS-IT-TOF (Shimadzu America Co., Columbia, MD). As análises de H- e C-NMR foram realizadas
com Gemini ou um espectrômetro Mercury 300 MHz (Varian, Palo Alto, CA). Ao resumir ambos os
resultados com a referência de um documento de patente (15), a estrutura do Alexa680 foi sugerida
conforme mostrado na figura suplementar 1.

Síntese de anticorpos conjugados Cy5.5 ou Alexa680

Para sintetizar o conjugado de controle "sempre ligado", trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) foi incubado
com Cy5.5-NHS (11 ÿg, 10 nmol, 5mM em DMSO) ou Alexa680-NHS (16 ÿg, 14 nmol, 5mM em
DMSO) em Na2HPO4 0,1 M (pH 8,5) à temperatura ambiente durante 30 min. A mistura foi purificada
com uma coluna Sephadex G50 (PD-10; GE Healthcare). A concentração de proteína foi determinada
com o kit de ensaio de proteína Coomassie Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) medindo a
absorção a 595 nm com um sistema UV-Vis (8453 Value UV-Visible Value System; Agilent
Technologies, Santa Clara, CA). A concentração de Cy5.5 ou Alexa680 foi medida por absorção
com o sistema UV-Vis para confirmar o número de moléculas de fluoróforo conjugadas a cada
molécula de trastuzumab. O número de Cy5.5 ou Alexa680 por anticorpo foi de aproximadamente 1
nestas sondas de controle. Os compostos resultantes Tra-Cy5.5 (ON) e Tra-Alexa680(ON) (a
designação “ON” indica que essas sondas estão sempre ativas) foram mantidos a 4°C no refrigerador
como uma solução estoque.

Para o conjugado autoextinguível, trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) foi incubado com Cy5.5-NHS (77
ÿg, 68 nmol, 5mM em DMSO) ou Alexa680-NHS (158 ÿg, 137 nmol, 5mM em DMSO) em 0,1 M
Na2HPO4 (pH 8,5) à temperatura ambiente durante 30 min. Em seguida, a mistura foi purificada e
as concentrações de proteína e Cy5.5 e Alexa680 foram determinadas como descrito acima. O
número de Cy5.5 ou Alexa680 por anticorpo foi de aproximadamente 7. Os conjugados resultantes
Tra Cy5.5(SQ) e Tra-Alexa680(SQ) (a designação "SQ" indica que esses compostos são
autoextinguíveis) foram mantidos a 4° C na geladeira como uma solução estoque.

Determinação da capacidade de extinção in vitro

As habilidades de extinção de cada conjugado foram investigadas por desnaturalização com 5%
SDS e 2-mercaptoetanol (2-ME). Resumidamente, os conjugados foram incubados com 5% SDS e 1%

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2-ME em PBS a 95°C por 2 min. Como controle, as amostras foram incubadas em PBS. A intensidade
do sinal de fluorescência de cada amostra foi medida com um espectrômetro de fluorescência (Perkin-Elmer
LS55, Perkin-Elmer, Shelton, CT, EUA).

Medição da lipofilicidade de Cy5.5 e Alexa680

Para avaliar a lipofilicidade de Cy5.5 e Alexa680, o coeficiente de partição (logD) foi determinado.
Cinquenta nmol de Cy5.5-NHS ou Alexa680-NHS foram misturados com 1 mL de 1-octanol e tampão
fosfato 0,1 M (pH 5,2, 7,3 e 8,5) em um tubo de ensaio. Três tubos foram usados para cada condição. Os
tubos foram agitados intensamente (3 × 1 min) e incubados por 20 min à temperatura ambiente, e então todo
o processo foi repetido duas vezes para garantir que a reação atingisse o equilíbrio. Em seguida, alíquotas de
1 mL de cada fase foram coletadas e a concentração de Cy5.5-NHS ou Alexa680-NHS foi medida por
absorção com o sistema UV-Vis. As razões de distribuição foram determinadas como o valor logarítmico da
razão octanol-tampão (logD).

Cultura de células

Para estudos de direcionamento de HER2, foi utilizada a linhagem celular NIH3T3 (3T3/HER2+) transfectada
com o gene HER2 . Como controlo negativo, foi utilizada a linha celular Balb/3T3 transfectada com proteína
de fluorescência verde (Balb/3T3/ZsGreen, HER2 negativo). A linha celular Balb/3T3/ZsGreen não expressa
o receptor HER2. As linhagens celulares foram cultivadas em RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg,
MD) contendo 10% de soro fetal bovino (Life Technologies), 0,03% L de glutamina, 100 unidades/mL de
penicilina e 100 ÿg/mL de estreptomicina em 5% de CO2 a 37 °C.

Estudos de microscopia de fluorescência

3T3/HER2+ (1 × 104 ) foram plaqueados em um poço de cultura com fundo de vidro e incubados por 16 h.
Em seguida, Tra-Cy5.5 ou Tra-Alexa680 foi adicionado ao meio (30 ÿg/mL) e as células foram incubadas por
1 ou 8 horas. As células foram lavadas uma vez com PBS e a microscopia de fluorescência foi realizada
usando um microscópio Olympus BX51 (Olympus America, Inc., Melville, NY) equipado com os seguintes
filtros: comprimento de onda de excitação 590 a 650 nm, comprimento de onda de emissão 662,5 a 747,5
nm. Imagens de contraste de interferência diferencial de luz transmitida também foram adquiridas. Para
investigar a especificidade do receptor, os conjugados também foram incubados com células Balb/3T3 (HER2
negativo).

Modelo de tumor

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory
Animal Resources (1996), National Research Council, e aprovados pelo Animal Care and Use Committee
local. Ambas as linhas de células tumorais positivas e negativas para o receptor foram implantadas nos
camundongos. Para estudos de direcionamento de HER2, células 3T3/HER2+ (2 × 106 células em PBS)
foram injetadas subcutaneamente no dorso esquerdo dos camundongos e células Balb/3T3/ZsGreen (2 × 106
células em PBS) foram injetadas subcutaneamente no dorso direito . Para modelos de tumor ortotópico,
células 3T3/HER2+ (1 × 106 células em PBS) e células Balb/3T3/ZsGreen (1 × 106 células em PBS) foram
injetadas nas almofadas mamárias direita e esquerda do camundongo, respectivamente. Os experimentos
foram realizados em 5-8 dias após a injeção de células.

Estudos de imagem espectrais in vivo

Tra-Cy5.5(ON), Tra-Cy5.5(SQ), Tra-Alexa680(ON) ou Tra-Alexa680(SQ) (50 ÿg / 100 ÿL PBS) foram

injetados através da veia da cauda em camundongos portadores de tumor (3T3/HER2+ e Balb/3T3/ZsGreen
HER2-). Os camundongos foram anestesiados com pentobarbital de sódio a 10% administrado por via
intraperitoneal com butilbrometo de escopolamina a 0,1%, em seguida, imagens de fluorescência espectral
foram obtidas usando o Maestro In Vivo Imaging System (CRi Inc., Woburn, MA) usando dois conjuntos de
filtros dois dias após a injeção do conjugado. Os conjuntos de filtros vermelhos profundos foram usados para criar a imagem Cy5.5

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ou fluorescência Alexa680 e os conjuntos de filtros azuis foram usados para fluorescência ZsGreen. Os
conjuntos de filtros vermelhos profundos usam um filtro passa-banda de 642 a 680 nm (excitação) e um filtro
passa-longa acima de 702 nm (emissão), os conjuntos de filtros azuis usam um filtro passa-banda de 437 a 476
nm (excitação) e um filtro passa-longa acima de 493 nm (emissão). O filtro de emissão ajustável foi
automaticamente escalonado em incrementos de 10 nm de 650 a 950 nm para os conjuntos de filtros vermelhos
profundos e de 500 a 800 nm para os conjuntos de filtros azuis enquanto a câmera capturava imagens em cada
intervalo de comprimento de onda com exposição constante. As imagens de fluorescência espectrais consistindo
de espectros de autofluorescência e os espectros de Cy5.5, Alexa680 e ZsGreen que foram então não
misturados com base em seus padrões espectrais usando software comercial (software Maestro, CRi, Inc.,
Woburn, MA). Os camundongos foram sacrificados com dióxido de carbono imediatamente após a conclusão da
imagem. Em seguida, os tumores foram ressecados e imagens ex vivo foram feitas usando as mesmas configurações do Maestro.

Resultados

Estruturas químicas de Cy5.5 e Alexa680 indicam diferenças na ligação a proteínas não específicas

As estruturas químicas de Alexa680 e Cy5.5 com base em resultados publicados anteriormente (15) e nossa
própria análise (consulte Dados de suporte e método para NMR e espectroscopia de massa, conforme mostrado
nas figuras suplementares 2-4) são mostradas na figura suplementar 1. Em resumo , Alexa680 é menor com
menos anéis aromáticos que Cy5.5. Além disso, embora Cy5.5 seja carregado negativamente, Alexa680 tem
carga neutra. A partir dessas estruturas químicas, prevê-se que Alexa680 seja menos lipofílico e carregado com
menor ligação a proteínas não específicas do que Cy5.5.

A lipofilicidade de Cy5.5 é maior que a de Alexa680 Os coeficientes de

partição de Cy5.5 e Alexa680 foram obtidos para determinar sua lipofilicidade que pode alterar a farmacocinética
do anticorpo conjugado. Os valores logD resultantes (valores mais altos indicando maior lipofilicidade) são
mostrados na Tabela 1. Conforme previsto a partir das estruturas químicas, a lipofilicidade de Cy5.5 foi maior
que Alexa680 para todos os valores de pH e foi independente do pH, enquanto a lipofilicidade de Alexa680 foi
pH dependente. Portanto, seria previsto que Cy5.5 alterasse mais fortemente a farmacocinética por ligação não
específica a proteínas.

A capacidade de extinção de ambos os conjugados anticorpo-fluoróforo é alta

A capacidade de têmpera foi medida pela adição de 5% de SDS e 2-ME. A interação molecular pode ser
dissociada com SDS e as cadeias pesada e leve de IgG podem ser separadas uma da outra com tratamento
com 2-ME. As capacidades de extinção foram 9 vezes, 2 vezes, 8 vezes e 2 vezes para Tra-Cy5.5(SQ), Tra-
Cy5.5(ON), Tra-Alexa680(SQ) e Tra-Alexa680(ON ), respectivamente.

A microscopia de fluorescência demonstra ativação fluorescente em células-alvo

Estudos de microscopia de fluorescência foram realizados para visualizar o local de ligação celular e o
comportamento do anticorpo marcado com fluorescência in vitro. Todos os conjugados de trastuzumab
investigados mostraram sinal fluorescente na superfície das células 3T3/HER2+ 1h após a incubação (Figura 2A).
A fluorescência foi observada dentro da célula após 8 horas de incubação para todos os conjugados, e os
pontos fluorescentes eram mais brilhantes para os conjugados auto-extinguíveis do que os conjugados sempre
ligados que não eram auto-extinguíveis (Figura 2A). As imagens microscópicas também foram obtidas usando
células Balb/3T3 negativas para HER2 (Figura 2B). Tra-Alexa680(ON), Tra-Alexa680(SQ) e Tra Cy5.5(ON) não
mostraram sinal fluorescente demonstrando assim sua especificidade para tumores que expressam HER2. No
entanto, Tra-Cy5.5(SQ) demonstrou fluorescência não específica dentro de células Balb/3T3 negativas para
HER2 após 8h de incubação, provavelmente devido à ligação não específica de proteínas. Esses achados estão
bem correlacionados e apoiados pela análise FACS mostrada na figura suplementar 5.

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O conjugado anticorpo-Alexa680 auto-extinguido mostrou alta razão tumor-fundo durante a imagem de

fluorescência in vivo, enquanto os conjugados Cy5.5 não

Os resultados da imagem com conjugados de trastuzumab em camundongos portadores de tumor 3T3/

HER2+ (HER2 positivo) e Balb/3T3/ZsGreen (HER2 negativo) estão resumidos na Figura 3. Na imagem
de corpo inteiro (Figura 3A), o tumor alvo (3T3 /HER2+) foi grandemente aprimorado com Tra-
Alexa680(SQ) e enquanto o tumor de controle (Balb/3T3/ZsGreen) foi minimamente aprimorado. Com
Tra-Alexa680(ON), o sinal NIR pode ser detectado não apenas no tumor alvo, mas também no tumor de
controle, embora o sinal tenha sido maior no tumor alvo. O sinal NIR também foi mostrado ao redor do
tumor de controle com Tra-Alexa680(ON). Por outro lado, o tumor alvo não pôde ser claramente
visualizado com Tra-Cy5.5(SQ), e o sinal NIR foi maior para o tumor de controle incluindo as regiões
periféricas indicando ligação não específica. Alto sinal NIR foi observado tanto no tumor alvo quanto no
controle com Tra-Cy5.5 (ON). Os tumores ressecados também mostraram a vantagem de Tra-
Alexa680(SQ), ou seja, o NIR do anticorpo marcado nos tumores HER2+ não se sobrepôs ao sinal de
fluorescência ZsGreen proveniente dos tumores HER2 (Figura 3B). Com o trastuzumab conjugado com
Cy5.5, o sinal NIR alto pode ser visto no tumor não-alvo. Além disso, as imagens abdominais de corpo
inteiro demonstraram fundo reduzido para Tra-Alexa680(SQ), mas alta captação hepática com Tra-Cy5.5
(ON) provavelmente relacionada à lipofilicidade deste último (Figura 4). Resultados semelhantes foram
obtidos com o modelo ortotrópico do coxim mamário (Figura 5).

Discussão
As barreiras fundamentais para a imagem óptica no tecido são alta dispersão de luz,
autofluorescência, alta absorção pela hemoglobina e outras macromoléculas e penetração de
profundidade reduzida com comprimento de onda decrescente. Uma solução para esses problemas é
usar uma fonte de fluorescência muito brilhante, como pontos quânticos (16-18) ou proteínas de
fluorescência de alta eficiência (19). Na realidade, mesmo uma única célula marcada com proteínas de
fluorescência poderia ser rastreada mesmo in vivo (20,21). No entanto, os tamanhos físicos dessas fontes
de fluorescência de alta eficiência influenciam fortemente a biodistribuição do agente. Como resultado, é
difícil usar esses agentes como sondas de imagem molecular fluorescentes injetáveis, especialmente em
conjunto com anticorpos, que são moléculas grandes. Portanto, fluoróforos orgânicos menores continuam
sendo a escolha preferida como marcadores para sondas de imagem molecular óptica intravenosa. Entre
os muitos fluoróforos orgânicos disponíveis, os corantes NIR são frequentemente selecionados devido às
vantagens de autofluorescência reduzida e melhor penetração no tecido em comparação com os corantes
visíveis (12).

Neste estudo, investigamos dois tipos de fluoróforos NIR ligados ao anticorpo monoclonal,
trastuzumb: Cy5.5 e Alexa680. Trastuzumabe é um anticorpo monoclonal humanizado enxertado com
região determinante complementar (CDR) ( subclasse IgG1), que se liga ao receptor do fator de
crescimento epidérmico humano tipo 2 (HER2) expresso na superfície celular de alguns tumores e o
anticorpo tem sido altamente bem sucedido no tratamento de pacientes com cânceres de mama que
amplificaram a expressão de HER2. Uma vez que o anticorpo humanizado é feito usando a estrutura de
IgG1 humana e enxertando 12 sequências CDR, a vantagem de usar a mesma subclasse de anticorpo
humanizado é que >98% das sequências de proteínas têm homologia, mesmo quando o antígeno alvo
do anticorpo é alterado de HER2 a outras moléculas alvo específicas do câncer.
Portanto, seria de esperar que as características ópticas do conjugado de anticorpo fossem as
mesmas, independentemente do antígeno usado. Isso foi demonstrado quando a eficiência de
autoextinção do conjugado foi idêntica, quando trocamos o anticorpo de trastuzumabe para daclizumabe
(Dac), que também é um anticorpo monoclonal humanizado enxertado com CDR ( subclasse IgG1)
visando CD25 (receptor IL-2 ÿ subunidade). De fato, a química idêntica foi usada ressaltando a
flexibilidade do conceito. As capacidades de têmpera foram de 12 vezes, 2 vezes, 10 vezes e 1 vezes

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para Dac-Cy5.5(SQ), Dac-Cy5.5(ON), Dac-Alexa680(SQ) e Dac-Alexa680(ON), respectivamente.

As características farmacocinéticas dos anticorpos humanizados, com tempos de depuração tipicamente

medidos em semanas, são bem compatíveis com o sistema de auto-extinção descrito aqui (22).
O anticorpo humanizado circulante prolongado é vantajoso do ponto de vista terapêutico devido à
entrega contínua da droga ao tumor alvo, no entanto, isso se torna uma desvantagem ao tentar obter
imagens com o mesmo anticorpo marcado com radioisótopos ou fluoróforos “sempre ativados”. Ao
empregar uma estratégia ativável de autoextinção, o agente circulante não ligado produz um sinal mínimo,
enquanto o agente ligado é ativado após a internalização, levando a um alto sinal dos tumores alvo.

A extinção foi alcançada conjugando um grande número (~7) de Cy5.5 e Alexa680 para cada anticorpo. A
microscopia in vitro revelou que a fluorescência aumentou acentuadamente após 8 horas de incubação
devido à internalização (Figura 2). O efeito de extinção e o aumento da fluorescência após a internalização
também foram mostrados para Tra-Alexa680(SQ) com estudos de citometria de fluxo FACS (figura
suplementar 5). Entre esses conjugados, o mais bem-sucedido para imagens in vivo foi o Tra-Alexa680(SQ)
(Figura 3). A fluorescência de fundo do pool de sangue com este agente foi baixa em comparação com
Tra-Alexa680(ON) (Figura 4). Em contraste, Tra-Alexa680 (ON) resultou em sinal de tumor não alvo, bem
como tumor alvo. Embora o rico suprimento sanguíneo e o efeito EPR possam causar essa fluorescência
não específica com um agente, que está sempre ligado (ou seja, sempre fluoresce), os conjugados
autoextintos foram capazes de ativar apenas dentro das células tumorais, aproveitando assim o efeito
EPR sem sofrer as consequências de uma possível absorção não específica. Os achados idênticos foram
observados, quando o sistema tumoral direcionado ao daclizumab CD25 foi empregado (Figura 2
complementar).

Tra-Cy5.5(SQ) foi menos bem sucedido como um agente de imagem específico do tumor. A multiplicidade
de moléculas Cy5.5 alterou a biodistribuição e farmacocinética do anticorpo. Por exemplo, como mostrado
na Figura 4, a fluorescência foi detectada no fígado imediatamente após a injeção iv de Tra Cy5.5(SQ).
Em comparação, a fluorescência no fígado foi substancialmente menor para Tra Alexa680(SQ) e mesmo
Tra-Cy5.5(ON). A rápida absorção pelo fígado pode sequestrar Tra Cy5.5(SQ) e impedir que ele se ligue
ao receptor HER2 no tumor. A lipofilicidade e a carga de Cy5.5 provavelmente resultam em sua captação
e metabolismo no fígado. Uma vez que a lipofilicidade foi maior para Cy5.5 do que Alexa680 (Tabela 1), a
farmacocinética pode ser amplamente afetada pelo próprio fluoróforo conjugado devido ao grande número
de moléculas de fluoróforo em um único anticorpo. O acúmulo mínimo de fígado com Tra-Cy5.5(ON)
suporta esta hipótese.

Além disso, sabe-se que a ligação não específica à proteína plasmática aumenta com a lipofilicidade (23).
Em estudos microscópicos, Tra-Cy5.5(SQ) mostrou captação não específica para células Balb/3T3
negativas para HER2. A ligação proteica não específica de Cy5.5 pode estar relacionada à sua lipofilicidade,
embora outros fatores (por exemplo, carga, peso molecular) também possam afetar a ligação.

Em conclusão, demonstramos com sucesso uma sonda de imagem molecular NIR ativável
direcionada a anticorpos baseada em auto-extinção. A alta capacidade de extinção do Tra-Alexa680 (SQ)
e a baixa ligação não específica derivada de seu caráter mais hidrofílico levam a um alto TBR nos modelos
de xenoenxerto e ortotópico de câncer. Anticorpos humanizados conjugados com Alexa680 autoextinguível
podem criar imagens de HER2 e CD25 in vivo sem as desvantagens típicas da imagem de anticorpos.
Essa tecnologia poderia ser aplicada universalmente a anticorpos humanizados de uma classe similar
(IgG1).

Mol Câncer Ther. Manuscrito do autor; disponível no PMC 2009 em 8 de dezembro.

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Material suplementar
Consulte a versão da Web no PubMed Central para obter material suplementar.

Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer. Agradecemos
aos Drs. Masatoshi Takahashi e Masayuki Nishimura da Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Columbia, MD, por sua grande ajuda nas várias análises
de espectroscopia de massa de corantes de fluorescência.

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Figura 1.
O esquema de um sistema de ativação auto-extinguível. A, a sonda “activável”, Tra-Cy5.5(SQ)
ou Tra-Alexa680(SQ) é auto-extinguível fora da célula e não tem fluorescência. Quando
se liga ao HER2 e é internalizado, é catabolizado dentro do endossomo/lisossomo e
apagado. Como resultado, o sinal de fluorescência aparece dentro da célula. B, a sonda "sempre ligada",
Tra-Cy5.5(ON) ou Tra-Alexa680(ON) tem fluorescência fora e dentro da célula.

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Figura 2.
Estudos de microscopia de fluorescência. A, células 3T3/HER2+ foram incubadas com conjugados de
trastuzumab Cy5.5 ou Alexa680 por 1 hora ou 8 horas. O sinal fluorescente estava na superfície do
célula após 1 hora de incubação. O sinal fluorescente mais alto foi detectado por auto-extinção
conjugados após internalização nas células após 8 horas de incubação. B, Os conjugados foram
incubadas com células Balb/3T3 (HER2 negativas). Apenas Tra-Cy5.5(SQ) apresentou
sinal dentro da célula após uma incubação de 8 horas.

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Figura 3.
Imagens de fluorescência in vivo (A) e ex vivo com camundongos portadores de tumor dois dias após a injeção.
Os conjugados de Trastuzumab-Cy5.5 ou Alexa680 foram injetados por via intravenosa em camundongos portadores
Tumores 3T3/HER2+ (esquerda) e Balb/3T3/ZsGreen (direita). Imagens do espectro Cy5.5 ou Alexa680
mostra a imagem específica do alvo com Tra-Alexa680(SQ). Em contraste, o sinal Cy5.5 foi baixo em
o tumor alvo (3T3/HER2+) para Tra-Cy5.5(SQ).

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Figura 4.
Imagens de espectro supino Cy5.5 ou Alexa680 do conjugado trastuzumab-Cy5.5 ou Alexa680
camundongos portadores de tumor injetados dois dias após a injeção. UMA; Tra-Cy5.5(SQ), B; Tra-Cy5,5
(ON), C; Tra-Alexa680(SQ), D; Tra-Alexa680(ON). Tra-Cy5.5(SQ) mostrou alta captação hepática.
O plano de fundo era bastante baixo para Tra-Alexa680(SQ).

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Figura 5.
Imagens de fluorescência in vivo com camundongos portadores de tumor ortotópico (mama). As imagens foram
obtido dois dias após a injeção dos conjugados de trastuzumab-Cy5.5 ou Alexa680. O alvo
tumor (3T3/HER2+) foi fotografado especificamente com baixo fundo com Tra-Alexa680(SQ).

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tabela 1
Coeficiente de partição de Cy5.5 e Alexa680 (logD) em vários pH.

pH 5,2 pH 7,3 pH 8,5

Ci5,5 -1,07 ± 0,06 -0,98 ± 0,14 -1,06 ± 0,02

Alexa680 -1,91 ± 0,03 -1,72 ± 0,04 -1,42 ± 0,14

Cada valor representa a média ± SD de três experimentos.

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