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1 INTRODUO A anlise do DNA e um dos maiores progressos tcnicos da Cincia (KOCH; ANDRADE, 2007). A capacidade de detectar e quantificar de forma rpida, simples, precisa e confiavel segmentos especficos de cidos nucleicos se torna fundamental para as pesquisas bsicas e para o diagnostico clinico. Entre os diversos tipos de ensaio, o que mais se aproxima desse conjunto de necessidades so os ensaios de hibridizao in vitro. Esses ensaios so baseados na capacidade de se determinar de maneira controlada e artificial o grau de complementaridade necessrio para formar duplex entre uma sonda e um determinado acido nucleico (sequencia alvo) (EA, 2004). As tcnicas de sourthern blot, northern blot e westhern blot se fundamentam na transferncia de fragmentos especficos de DNA, RNA e proteinas, respectivamente, de um determinado meio para uma membrana onde posteriormente so hibridizados com sondas especificas (EA, 2004). Supondo que voc deseje verificar o grau de parentesco entre indivduos a partir do DNA destes, uma estratgia seria isolar esses DNAs, fragmenta-lo com a mesma enzima de restrio de restrio e submeter o material fragmentado a eletroforese. Feita a eletroforese, o gel deve ser tratado com uma soluo alcalina, para que o material gentico nele contido seja desanelado. Em seguida, uma membrana de naylon ou celulose colocada sobre o gel para que nela seja aderida parte do material contido no gel, formando uma replica perfeita da eletroforese na membrana. Posteriormente a membrana deve ser incubada com a soluo que contenha as sondas complementares do DNA a regies de interesse do DNA. Levando em conta

que o material impregnado na membrana estava desnaturado e que as sondas so formadas por sequencias simples de DNA, se durante essa incubao o meio for favorvel as sondas se hibridizaro e as sequencias a que forem complementares. As sondas utilizadas devem ser marcadas com radioistopos, a membrana juntada a um filme de raio X em cmara escura. Devido a presena dos marcadores radioativos na sonda, o filme sensibilizadono local onde houve hibridizao, revelando assim o padro eletroferetico de cada individuo. Esses procedimentos vale tanto para DNA (sourthern blot) como para RNA (northern blot) que forem submetidos a eletroforese e que as sondas so sempre sequencias de DNA.

Figura 1 Representao de um Southern Blot realizado a partir de um gel de agarose.

O Western blot um mtodo para detectar protenas em um homogenato (clulas bem trituradas) ou um ex-trato de um tecido biolgico. Essa tcnica usa eletroforese em gel para separar as protenas desnaturadas por massa. As protenas so ento transferidas do gel para uma membrana (nitrocelulose), onde foram usados como sonda anticorpos especficos protena. Como um resultado, os pesquisadores podem examinar a quantidade de protena em uma dada amostra e comparar os nveis entre diversos grupos. As amostras so fervidas de um a cinco minutos em uma soluo tampo, contendo corante, um composto sulfuroso e um detergente conhecido como dodecil sulfato de sdio (SDS). A ebulinao e o detergente desnaturam a protena, desenovelando-a completamente. O SDS ento cerca a protena, deixando-a coberta por uma carga negativa, e o enxofre impede a formao de pontes de dissulfeto na protena (TOWBIN; STAEHELIN; GORDON, 1979). Eletroforese em gel As protenas da amostra so separadas de acordo com o peso molecular usando-se a eletroforese em gel. Gis tm vrias formulaes dependendo do laboratrio, peso molecular das protenas de interesse e tampes disponveis, os gis de poliacrilamida so os mais comuns. Desde que as protenas caminham apenas em uma direo ao longo do gel, as amostras so carregadas lado-a-lado em "poos" feitos no gel. As protenas so ento separadas por massa em "bandas" dentro de cada canaleta. Uma canaleta reservada para um "marcador", ou ladder, uma mistura disponvel

comercialmente de protenas de pesos moleculares conhecidos (TOWBIN; STAEHELIN; GORDON, 1979).

Transferncia A fim de fazer as protenas acessveis deteco do anticorpo, elas so movidas do gel para uma membrana de nitrocelulose. A membrana colocada face-a-face com o gel, e uma corrente eltrica aplicada entre grandes placas de cada lado, ento as protenas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantm a mesma disposio que continham no gel. Como resultado desse processo de "borramento" (blotting em Ingls), as protenas so expostas a uma fina camada para deteco. A ligao das protenas membrana baseada tanto em interaes hidrofbicas quanto em interaes de cargas entre a membrana e as protenas (TOWBIN; STAEHELIN; GORDON, 1979). Bloqueio Desde que a membrana escolhida por sua habilidade de ligar protenas, passos precisam ser feitos para impedir as interaes no especficas entre a membrana e o anticorpo usado para a deteco da protena alvo. O bloqueio da ligao no especfica alcanado pondo-se a membrana em uma soluo diluda de uma protena - tipicamente albumina de soro bovino (BSA) ou leite seco desnatado, com uma pequena quantidade de detergente como Tween 20 (TOWBIN; STAEHELIN; GORDON, 1979). Deteco Durante o processo de deteco testa-se a membrana com anticorpos da protena de interesse, e se liga eles com uma enzima reveladora, a qual leva a uma mudana de cor ou sinal fotomtrico. Por uma variedade de razes, isto tradicionalmente toma lugar em processo de dois passos, embora existam

mtodos de deteco de um passo disponveis para certas aplicaes (TOWBIN; STAEHELIN; GORDON, 1979). Mtodo de dois passos

Anticorpo primrio Anticorpos so gerados quando uma espcie hospedeira ou uma cultura

de clulas imunes so expostos protena de interesse (ou a uma parte dela). Normalmente uma parte da resposta imune colhida e usada como ferramenta de deteco especfica e sensvel que se liga protena diretamente - por isso anticorpo primrio (UK., 1970). Depois de bloqueada a membrana, uma soluo diluda do anticorpo primrio (geralmente entre 0,5 e 5 microgramas/mL) encubada com a membrana sobre leve agitao. Tipicamente, a soluo composta de uma soluo salina tamponada, e s vezes com BSA ou leite em p. A soluo de anticorpos e a membrana podem ser seladas e incubadas juntas de 30 minutos a uma noite. Tambm podem ser incubadas em diferentes temperaturas, com temperaturas mais altas sendo associadas com mais ligaes, tanto especficas protena alvo (o sinal) e no especficas (o rudo) (UK., 1970).

Anticorpo secundrio Depois de se enxaguar a membrana para remover o anticorpo primrio no

ligado, ela exposta a outro anticorpo, direcionado a pores espciesespecficas do anticorpo primrio. Este conhecido como anticorpo secundrio. Ele geralmente ligado a biotina ou a uma enzima reveladora como por exemplo fosfatase alcalina. Esse passo confere a vantagem de que

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vrios

anticorpos

secundrios

se

ligaro

um

anticorpo

primrio,

providenciando um sinal intensificado (UK., 1970). Mais comumente, uma peroxidase - ligada secundariamente usada em conjuno com um agente quimioluminescente, e a reao

produz fluorescncia proporcionalmente quantidade de protena. Um filme fotogrfico colocado contra a membrana, e exposta luz da reao criada a imagem dos anticorpos ligados ao blot (UK., 1970). Uma terceira alternativa usar um marcador radioativo acoplada ao anticorpo secundrio (UK., 1970). Anlise Depois das sondas no ligadas serem lavadas, o Western blot est pronto para a deteco das sondas marcadas e ligadas protena de interesse. Em termos prticos, nem todos os Westerns blots revelam protenas em apenas uma banda da membrana. Aproximaes de tamanho so tomadas pela comparao das bandas coloridas quelas do marcador ou ladder carregado durante a eletroforese (WN. 1981). Deteco colorimtrica - Quimioluminescncia Os mtodos de deteco quimioluminescentes dependem da incubao do Western blot com um substrato que fluoresce quando exposto enzima reveladora no anticorpo secundrio. A luz ento detectada por um filme fotogrfico. A imagem analisada por densitometria, a qual avalia a quantidade de protena colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade ptica. Novos softwares permitem uma anlise mais alm da informao como a anlise do peso molecular se padres apropriados forem usados. A deteco

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de quimioluminescncia ampliada considerada entre os mtodos mais sensveis para anlise em blot (WN. 1981).

Figura 2 Eletrotransferncia (western blotting). A sequncia de montagem do sanduche de transferncia. B Colocao do sistema da cuba e preenchimento com tampo de transferncia.

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OBJETIVO

Aula expositiva com discusso da tcnica de Southern Blot.

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3 MATERIAIS E MTODOS

3.1 Materiais para a Southern Blot

SOLUES:

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3.2 Mtodos

1 DIA Digerir 10mL do DNA genmico 2 DIA 1. Eletroforese em gel de agarose 0,8% (70 mA / 60 volts) 2. Fotografar o gel com a rgua 3. Transferir o gel para um recipiente, cobrir com a soluo de despurinao e agitar. Observar a mudana de cor do azul de bromofenol para amarelo (aproximadamente 10 - 12 min.) 4. Lavar o gel com gua destilada 5. Cobrir o gel com a soluo de desnaturao e agitar. Aps o azul de bromofenol retornar a cor azul, incubar por 25 minutos. 6. Lavar o gel com gua destilada. 7. Cobrir o gel com a soluo de neutralizao. Agitar por 30 minutos. 8. Montar o aparato de transferncia (SSC 20X no reservatrio e SSC 10X no papel).

Figura 3 Esquema representativo de montagem do sistema de southern blot

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3 DIA 1. Preparar a soluo de Pr-hibridizao (NaCl 0,5M, 5% ECL blocking mix in ECL hybridization solution). Para 25mL (0,73g NaCl, 1,25g blocking mix em 25mL de soluo de hibridizao) 2. Remova a membrana cuidadosamente, marcando as canaletas com lpis. 3. Lavar a membrana com SSC 6X e incubar a 80C por 2 horas. 4. Pr-hibridizar a membrana por 1 hora a 42C 5. Preparo da sonda: diluir o DNA para 10ng/L (volume total=25mL); deixar por 5 min. a 96C e colocar imediatamente no gelo por 5 min.; spin down; adicionar 25mL de DNA labelling reagent e homogeneizar lentamente; adicionar 25mL de soluo de glutaraldedo; centrifugar rapidamente; incubar por 10 min. a 37C (incubar por 20 min. se a sonda for menor que 300bp); - colocar no gelo at o momento do uso 6. Adicionar a sonda membrana 7. Hibridizar por 12 a 16 horas a 42C 4 DIA 1. Remover a membrana da soluo de hibridizao. 2. Lavar a membrana por 20 min. com tampo de lavagem primrio a 42C. Descartar a soluo e lavar por 2 vezes, com o mesmo tampo, por 10 min, a 42C. 3. Lavar a membrana por 2 vezes com SSC 20X a temperatura ambiente por 5 min. 4. Colocar a membrana em uma placa de vidro e aplicar ECL detection solution 5. Expor ao filme autorradiogrfico.

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4 RESULTADOS E DISCUSSO

A realizao da tcnica no foi possvel devido a falta dos materiais.

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5 CONCLUSO Uma das mais comuns aplicaes da tcnica de southern a deteco de DNAs polimrficos derivados do surgimento ou da perda de sitos de restrio na molcula de DNA; possvel tambm por esse meio verificar-se alteraes como translocaes, delees e inseres de trechos de DNA. Dependendo da amostra original e da estringncia do ensaio, a hibridizao e membrana podem fornecer diversas informaes a respeito de uma determinada amostra como o tamanho e a posio ou quantidade de sequncias alvo. O fato de ser facilmente executvel torna esse tipo de ensaio bastante atrativo tanto para aplicao em pesquisas como para o diagnstico clnico. O fato de poder detectar colnias de microrganismos tornou a tcnica uma importante ferramenta para a avaliao de clones bacterianos ou de fagos recombinantes ou para a construo de bibliotecas de DNA ou cDNA (biblioteca genmica). O northern blot uma tcnica que nos permite verificar se h ou no a transcrio de molculas de interesse, tendo em vista que permite a verificao da quantificao de RNA numa amostra. Uma forma alternativa nesse caso seria construir cDNAs a partir desse RNA e utilizar southern blot, mas seja qual for a estratgia adotada ensaios realizados a partir de RNA normalmente se relacionam com investigaes que buscam o quanto um determinado gene transcrito. A aplicabilidade da tcnica de western blot a deteco de protenas de uma determinada amostra e serve como teste confirmatrio dos resultados obtidos em testes imunoenzimaticos (EA, 2004).

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6 REFERNCIAS

EA, Lilian Pinero. Biologia molecular: Guia prtico e didtico. Rio de Janeiro: Revinter, 2004. 269 p. HTOWBIN; STAEHELIN, T; GORDON, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Pnas, Usa, p. 4350-4354. 12 jun. 1979. Disponvel em:

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC411572/?tool=pubmed>. Acesso em: 01 jun. 2012. KOCH, Analara; ANDRADE, Fabiana Michelsen de. A utilizao de tcnicas de biologia molecular na gentica forense: uma reviso. Rio Grande do Sul, n. , p.17-23, 18 out. 2007. UK., Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, Usa, p. 680-685. 15 jul. 1970. Disponvel em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5432063?dopt=Abstract>. Acesso em: 01 jun. 2012. WN., Burnette. Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem, San Diego, p. 195-203. 02 abr. 1981. Disponvel em:

<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003269781902815>. Acesso em: 01 jun. 2012.