MARÇO 2024

BIOLOGIA MOLECULAR

TÉCNICA DE

WESTERN
BLOT
Departamento de Biologia Molecular

Presented by Artur Junior

 Introdução
A Técnica consiste na detecção de proteínas
específicas em uma amostra. O processo de
separação de proteínas presentes será
realizado com base no seu tamanho molecular
através de eletroforese em gel, e posterior
transferência proteica para uma membrana .
 Objetivos
Detecção e identificação de

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Diagnóstico de doenças, onde é
proteínas específicas, em uma
utilizado na detecção de anticorpos
amostra complexa, permitindo a
ou presença de proteínas virais
expressão de proteínas de interesse
específicas.
na pesquisar.
Quantificação de proteínas, a partir de Monitoramento de tratamentos

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dados quantitativos sobre a proteína
específica, pode ser realizado a sua
quantificação baseado em padrões de
controle conhecidos.
terapêuticos, observando a
expressão de biomarcadores ou
proteínas alvo em resposta ao
tratamento.
 ETAPAS
01. Preparação da Amostra 04. Incubação de Anticorpos Primários

02. Eletroforese ( SDS-PAGE) 05. Incubação de Anticorpos Secundários

03. Transferência para membrana 06. Detecção

 Preparação de Amostras
SELEÇÃO DE AMOSTRA QUANTIFICAÇÃO
Método de BRADFORD\LOWRY:
Pode ser tecidos, células, fluídos
Baseado na mudança de cor do
biológicos ou qualquer fonte de
corante COOMASSIE BLUE G-250
proteínas.

LISE DAS PROTEÍNAS

São utilizados solução tampão
para a lise das células, onde TRITON X-100
contém detergentes, que irão TWEEN 80
romper as membranas celulares e NONIDET P-40
liberar as proteínas, como também
pode ser utilizados inibidores de
proteases para evitar a
degradação proteica.
 Quantificação de Proteínas
Método de Brandford
É baseado na mudança de Absorbância entre 595 mm
cor do corante á 600 mm.
COOMASSIE BRILLIANT
BLUE G-250.

Onde tem a variação da

cor vermelha para azul,
indicando a presença de
proteínas.
 Eletroforese SDS - PAGE
É Utilizada para separar O detergente de SDS- ( Utilização de outros
proteínas em uma Sodium dodecyl sulfate : detergentes : beta
amostrar homogênea. irá mascarar as cargas mercaptethanol,
íntrínsecas, permitindo bromophenol blue e
É realizado o preparo do glicerol.
que migrem em direção
gel de SDS-poliacrilamida,
ao polo positivo, do campo
na qual poderão migrar
magnético.
através da matriz.
Eletroforese SDS - PAGE
Transferência para membrana
Transferência da proteína do gel para membrana
de nitrocelulose, onde os anticorpos irão se ligar;

Tipos de membrana utilizada : Nitrocelulose, nylon

e PVDF.
Transferência para membrana
Transferência elétrica é a técnica mais utilizada
para a transferência de proteínas.
 Bloqueio
Durante o processo de transferência, ocorre a Diminuem os ruídos no resultado
ligação de proteínas inespecíficas para o interesse final, e garante de resultados mais
da pesquisar. confiáveis.
Onde é usada uma solução que irá bloquear, os
sítios de ligação inespecíficos na embrana, sem
prejudicar as proteínas de interesses já
imobilizadas.

.Substâncias utilizadas : Albumina Sérica bovina (

BSA), Leite desnatado em pó e gelatina.

Etapa realizada antes de adição dos anticorpos

específicos, fazendo que se liguem só as proteínas
de interesse.
 Anticorpo Primário
Para visualizar a proteína será necessário utilizar
um anticorpo específico que irá se ligar ao epítopo
da proteína formando o complexo antígeno-
anticorpo.
Será o anticorpo primário que pode ser
monoclonal, ou policlonal detectando uma
proteína específica.

É realizada a lavagem da membrana após o

processo, para retirar o anticorpo que não se ligou
a proteína especifica, com uma solução tampão.
 Anticorpo Secundário
Após lavagem, é incubada com um anticorpo
secundário. É um anticorpo anti-IgG, ou seja,
anticorpo que reconhece anticorpo.
Este anticorpo irá apresentar modificações que
garantam identificar a proteína de interesse.

1. Conjugação de anticorpo com enzima;

2. Associação do anticorpo ao fluoróforo;
 Anticorpo Secundário
1. Conjugação de anticorpo com enzima;
 Anticorpo Secundário
2. Associação do anticorpo ao fluoróforo;
 Detecção
Detecção Fluorescente;

Detecção Quimioluminescente;
 Análise dos Resutados
É realizada pela densitometria, visando avaliar
a presença de proteínas, intensidade da
banda formada,tamanho da banda,
quantificando os resultados .
UFPE, 2024

CONTATO
artur.junior@ufpe.br

Artur Junior de Moura Silva