Western Blot

1. Introdução
A técnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon
1984) também pode ser denominada protein immunoblot e consiste na detecção de
proteínas específicas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a
elaboração dessa técnica pode ser resumida em cinco etapas: (1) extração e quantificação
das proteínas; (2) fracionamento das proteínas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3)
transferências dessas proteínas para uma membrana; (4) incubação da membrana com um
anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada; e (5) revelação dessa
membrana para análise dos dados.

2. Extração e quantificação de proteínas

Para realização dos experimentos de western blotting é necessário, inicialmente,
realizar a extração e a quantificação das proteínas. Diversos métodos espectroscópicos são
utilizados para quantificar proteínas em uma solução. O ensaio de Bradford é o mais
utilizado e apresenta diversas vantagens em relação aos demais, como rapidez, não exige
aquecimento e alta sensibilidade para baixas concentrações de proteínas. O método de
Bradford se baseia na mudança de cor do corante Coomassie Blue G-250 em solução ácida
(cor avermelhada) para cor azulada na presença de proteínas. As interações hidrofóbicas e
iônicas estabilizam o complexo proteína-corante. Para quantificar a concentração de
proteínas na amostra deve-se fazer uma curva de padronização com concentrações
conhecidas de uma proteína (comumente se utiliza soroalbumina bovina, BSA) versus
absorbância em 595 nm (comprimento de onda que o complexo proteína-corante absorve).
A partir dessa curva obtém-se a equação de ajuste linear na qual é possível substituir os
valores médios de absorbâncias das amostras, obtendo-se assim os valores da
concentração das proteínas. É importante ressaltar, que para uma maior confiabilidade dos
resultados, o coeficiente de correlação linear deve ser maior que 0,98.

3. Fracionamento de proteínas
Para separar as proteínas de uma amostra homogênea, a técnica mais utilizada é a
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de
SDS-poliacrilamida, que será uma matriz inerte através da qual as proteínas poderão
migrar. O gel é preparado pela polimerização de monômeros de acrilamida e o tamanho dos
poros do gel pode ser ajustado variando a concentração da acrilamida adicionada para
retardar a migração da sua proteína de interesse. As proteínas podem possuir cargas
positivas ou negativas, dependendo das cargas dos aminoácidos que as compõem. É
utilizado, então, o SDS (sodium dodecyl sulfate), um poderoso detergente carregado
negativamente, que se liga nas regiões hidrofóbicas das moléculas de proteínas
mascarando a carga intrínseca, e permitindo que as proteínas migrem em direção ao polo
positivo em um campo elétrico. Além disso, o SDS quebra as ligações não covalentes das
proteínas, fazendo com que elas voltem a sua estrutura primária, liberadas da associação
com outros monômeros ou outras proteínas e moléculas de lipídeos. Além disso, usa-se,
geralmente, um agente redutor tal como o β-mercaptoetanol, que quebra as ligações
dissulfito (S-S) dos resíduos de cisteína que promovem a ligação de proteínas a outros
monômeros, outras proteínas ou mesmo a estrutura terciária da mesma proteína, mantendo
assim, as proteínas separadas e linearizadas (Figura 1a). A partir dessas condições,
proteínas de um mesmo tamanho tendem a correr em um gel de poliacrilamida, na
presença de um campo elétrico com as mesmas velocidades, uma vez que (1) suas
estruturas nativas encontram-se completamente desnaturadas devido ao SDS e ao β-
mercaptoetanol fazendo com que suas formas sejam as mesmas e, (2) elas se ligam na
mesma quantidade de SDS e portanto tem a mesma quantidade de cargas negativas
(Figura 1b, c).

A técnica de SDS-PAGE é largamente utilizada, pois é capaz de separar todos os

tipos de proteínas, mesmo aquelas que são normalmente insolúveis em água (como por
exemplo muitas proteínas de membranas). Além disso, como as proteínas são separadas
por tamanho, é possível estimar o peso molecular e a composição das subunidades da
proteína. Essas proteínas podem ser visualizadas diretamente no SDS-PAGE por coloração
direta do gel, por corantes como o Comassie-Blue ou por tratamentos com nitrato de prata.
O nitrato de prata é um dos métodos mais sensíveis de detecção, que permite a
visualização de proteínas de até 10ng, enquanto que a coloração por Coomassie-Blue
detecta proteínas de até 300ng. A Figura 2 representa proteínas coradas com Coomassie-
Blue e com Nitrato de Prata.

4) Transferência para membrana

Embora seja essencialmente uma técnica analítica, o SDS-PAGE somente não
permite a análise de proteínas individuais e separadas. Para que isso seja possível é
necessário utilizar anticorpos específicos para a proteína desejada, mas antes, é preciso
que essas proteínas estejam em um suporte sólido, como membranas de nitrocelulose,
PVDF ou de catiônicas de nylon. Essa transferência das proteínas do gel para a membrana
inicialmente era feita por meio da capilaridade, mas atualmente usa-se a transferência
eletroforética que é muito mais rápida e eficiente (Figura 3).
 Existem três tipos de membranas usadas para western blotting: de nitrocelulose,
nylon ou PVDF (polyvinylidene fluoride). Diferentes proteínas podem se ligar com eficiências
diferentes nessas membranas, e particulares epítopos antigênicos podem ser melhor
preservados em um tipo em relação a outro. Os detalhes de cada tipo de membrana podem
ser visualizados na Tabela 2.
 Depois de terminado o tempo de aplicação da corrente elétrica, usa-se um corante
denominado Ponceau S para confirmar a transferência das proteínas para a membrana, e
verificar se essa transferência ocorreu de maneira igual para todas as amostras. Em caso
afirmativo, pode ser dada continuidade ao experimento de western blotting.

5) Detecção da proteína específica

Para visualizar uma proteína de interesse é utilizado um anticorpo específico que vai
reagir com um epítopo da proteína, formando um complexo anticorpo-antígeno. Esse
anticorpo é denominado anticorpo primário, pode ser policlonal (reconhece mais de um
epítopo) ou monoclonal (reconhece apenas um epítopo da proteína de interesse) e é
produzido geralmente em camundongo ou em coelho. Além disso, esse anticorpo não
possui nenhum tipo de radiomarcação, ou conjugação com alguma enzima. A incubação da
membrana com o anticorpo primário geralmente ocorre overnight a 4ºC e, depois disso, a
membrana é lavada intensamente com tampão de lavagem para retirar todo o anticorpo que
não está especificamente ligado à proteína de interesse.

Depois da lavagem, a membrana é incubada com um anticorpo secundário. Esse

anticorpo é um anti-IgG, ou seja, é um anticorpo que reconhece um anticorpo. Por exemplo,
se foi utilizado um anticorpo primário anti uma proteína de interesse, produzido em
camundongo, será utilizado um anticorpo secundário anti-IgG de camundongo, que
reconhecerá qualquer anticorpo produzido em camundongo. Esse anticorpo secundário
possui alguma modificação que permitirá a visualização da proteína de interesse. As
principais modificações utilizadas atualmente são (Figura 4):

a) Conjugação do anticorpo com uma enzima: tais como peroxidade ou fosfatase

alcalina. Neste caso, no momento da revelação da membrana, adiciona-se um substrato
dessa enzima. Nos locais onde essa enzima está presente (apenas nos locais onde tem o
anticorpo primário, ou seja, na proteína específica), ocorrerá a reação e a formação do
produto dessa reação. É utilizado um filme, e aparecerá a marcação nas regiões em que
ocorreu essa reação, permitindo localizar a proteína de interesse.
 b) Associação do anticorpo com um fluoróforo: que será posteriormente excitado
com um laser de comprimento de onda específico para esse fluoróforo, e então as regiões
onde o anticorpo se ligou serão evidenciadas.