Western Blot - Definição, Princípio, Procedimento,

Resultados, Aplicações

Definição de Western Blot

Western blot, também conhecido como immunoblotting, é o processo de separar
proteínas e identificá-las em uma amostra biológica complexa.
 O uso de eletroforese em gel de poliacrilamida é um pré-requisito para o western
blotting, a fim de separar as proteínas antes de sua identificação.
 O processo de western blotting envolve a transferência de proteínas separadas
por SDS PAGE em uma membrana absorvente. As proteínas podem então ser
identificadas na membrana por diferentes meios.
 O Western blotting revolucionou o campo da imunologia com o uso de sondas de
anticorpos contra proteínas ligadas à membrana.
 A imunodetecção de proteínas tem uma ampla aplicação em bioquímica e outras
ciências, pois pode detectar e caracterizar uma infinidade de proteínas.
 A sensibilidade do processo depende da eficiência da retenção da transferência
de proteínas durante o processamento e a detecção final.
 Western blotting ou proteína blotting depende da especificidade da interação entre
a proteína de interesse e a sonda usada para a detecção da proteína.
 Ao contrário do Southern blotting que utiliza sondas de ácido nucléico
radiomarcadas, o Western blotting geralmente usa um segundo anticorpo marcado
com uma enzima.
 O Western blotting tem uma série de vantagens sobre outras técnicas
semelhantes, pois o processo requer apenas o uso de uma pequena quantidade
de reagentes e a mesma transferência de proteína pode ser usada para análises
múltiplas. 

Princípio do Western Blot

 O princípio do western blotting é a interação entre as proteínas e as sondas
utilizadas para a detecção das proteínas.
 As proteínas utilizadas para western blotting são separadas por eletroforese em
gel para obtê-las em uma matriz de gel.
 As proteínas são então transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou
fluoreto de polivinilideno (PVDF), onde são imobilizadas. A transferência da
proteína é conhecida como blotting.
 A proteína na membrana pode ser detectada pelo uso de um anticorpo primário
marcado com repórter direcionado contra a proteína ou um anticorpo secundário
marcado com repórter direcionado ao anticorpo primário.
 O repórter ou sonda presente no anticorpo pode ser uma enzima que produz uma
reação de cor ou um sinal luminescente no local de ligação antígeno-anticorpo
que produz um sinal fluorescente na presença de um substrato específico.
 O sinal ou cor gerado pela sonda requer um sistema de detecção apropriado para
o sinal ou intensidade gerada.

Requisitos para Western Blot

Eletroforese em Gel
 Gel (NuPAGE)
 Fonte de alimentação básica
 Tampão de amostra
 Bloco de aquecimento
 Tampão de redução de amostra
 Escada de proteína pré-corada
Transferência de Proteína
 Mini Trans-Blot que consiste em um tanque, tampa e um módulo de blot. O
conjunto é armazenado com gelo de resfriamento para que seja congelado
quando necessário.
 Papel de filtro de nitrocelulose de 0,45 µm
 Buffer de transferência NuPAGE
 Metanol
 Prato de pirex quadrado
 Placa de Petri descartável quadrada de plástico
 Lâmina de barbear e faca de gel
 Fonte de alimentação básica
Western Blotting
 Solução salina tamponada com Tris 10x com Tween 20 a 1%.
 Shaker
 10% de leite em pó desnatado em pó
 Placa de Petri descartável quadrada de plástico
 Bolsas plásticas
 Selador de calor de impulso
 Anticorpo primário
 Anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano contra a espécie
hospedeira do anticorpo primário.
 Substrato quimioluminescente
 Sistema de documentação de gel

Procedimento de Western Blot

O processo de Western blotting consiste nas seguintes etapas;
1. Preparação da amostra
 As amostras mais comumente usadas para western blot são lisados celulares que
são coletados pelo processo de extração.
 A extração pode ser realizada por diferentes meios, como destruição mecânica,
extração química ou o uso de enzimas.
 A extração costuma ser realizada em temperatura fria na presença de inibidores
de protease, a fim de evitar a desnaturação das proteínas.
2. Eletroforese em Gel
 A amostra de proteína é diluída com o tampão de amostra e é aquecida e agitada
durante 10 minutos a 70 ° C.
 A amostra é então centrifugada a 5000g.
 A caixa de gel é removida da bolsa e colocada no tanque tampão contra a
vedação de borracha com as paredes do gel voltadas para o interior do
reservatório do tanque.
 O tampão em execução é derramado no reservatório superior, garantindo que
nenhum vazamento ocorra no tanque inferior.
 Cada um dos poços é então carregado com um volume igual de amostra
desnaturada por calor e uma das pistas é reservada para a escada de proteína.
 A tampa é colocada no tanque e conectada à fonte de alimentação.
 O funcionamento pode ser executado em constante de 200 V por 50 minutos.
3. Transferência de proteína
 O tampão de transferência é preparado adicionando metanol a 10% ao tampão.
 O caso de transferência é tomado e colocado para fora. Em seguida, é coberto
com um buffer de transferência.
 Uma esponja de espuma é retirada e colocada no verso, sobre a qual passa o
papel de filtro. Eles devem ser colocados para garantir que ambos estejam
molhados e ligeiramente submersos.
 O gel é retirado do tanque e colocado sobre o papel de filtro úmido. 
 A membrana de nitrocelulose é umedecida com o tampão de transferência e
colocada no topo do gel de forma que não haja bolhas entre o gel e a membrana.
 A caixa de transferência é colocada no tanque de transferência, que é
posteriormente preenchido com tampão de transferência.
 O tanque é então conectado à alimentação de 100 V por 1 hora.
 Assim que a transferência estiver concluída, o estojo de transferência é removido
e a membrana de nitrocelulose é removida do gel.
4. Imunodetecção
 A membrana é lavada com solução salina tamponada com Tris por 5 minutos em
uma placa de Petri.
 O leite em pó desnatado a 10% é misturado ao tampão Tris e a membrana é
coberta com a mistura por 30 minutos em temperatura ambiente.
 A membrana é lavada com o tampão Tris para remover qualquer excesso de
mistura remanescente na membrana.
 Com a ajuda da pinça, a membrana é transferida para uma nova placa de Petri, na
qual o anticorpo primário é adicionado.
 A membrana com o anticorpo é incubada durante 3 horas à temperatura
ambiente. A membrana é lavada após incubação com o tampão Tris.
 A membrana é transferida novamente para uma nova placa de Petri, onde um
anticorpo secundário conjugado com HRP é adicionado. A membrana é incubada
durante 1 hora. A concentração de anticorpos secundários freqüentemente
permanece em 1 µg / ml, mas isso também depende da diluição.
 A membrana é lavada novamente com tampão Tris para remover o excesso de
anticorpos da superfície.
 A membrana é incubada com o substrato por 5 minutos, e a observação é feita.

Western Blot. Criado com BioRender.com

Interpretação do resultado do Western Blot

 O resultado do western blotting depende do tipo de sondas usadas durante o
processo.
 Se um anticorpo secundário conjugado com enzima for usado, a reação entre o
substrato e a enzima produz uma cor.
 O corante solúvel é convertido em uma forma insolúvel, resultando em uma cor
diferente na membrana.
 Para impedir o desenvolvimento de uma mancha, o corante é removido lavando a
membrana.
 Os níveis de proteína podem então ser avaliados por espectrofotometria.

Aplicações de Western Blot

1. O Western blotting é um excelente método com alta sensibilidade para detectar
uma determinada proteína mesmo em pequena quantidade.
2. O Western blotting tem sido usado no diagnóstico clínico de diferentes doenças. O
teste confirmatório para HIV envolve um western blot, detectando anticorpos anti-
HIV no soro.
3. A técnica tem sido usada para quantificar proteínas e outros produtos gênicos em
estudos de expressão gênica.
4. Uma vez que o Western blotting detecta as proteínas por seu tamanho e
capacidade de se ligar ao anticorpo, é apropriado para avaliar as expressões da
proteína nas células e posterior análise das frações da proteína durante a
purificação da proteína.
5. O Western blotting também é usado para a análise de diferentes biomarcadores,
como fatores de crescimento, citocinas e hormônios.

Limitações do Western Blot

1. Por ser um processo muito sensível, qualquer desequilíbrio no processo pode
afetar o resultado de todo o processo.
2. Em alguns casos, nenhuma banda ou bandas errôneas podem ser observadas
devido à transferência insuficiente das proteínas.
3. O teste só pode ser usado como um teste semiquantitativo, pois a estimativa nem
sempre é precisa.
4. O processo é demorado e complexo, portanto, só pode ser executado por pessoal
bem treinado.
5. O Western blotting só pode ser realizado para proteínas se os anticorpos
primários para as proteínas estiverem disponíveis.
6. Alguns anticorpos podem exibir efeitos fora do alvo ao interagir com mais de uma
proteína na amostra.
7. A técnica é um processo caro com o custo de anticorpos e métodos de detecção
caros.
8. Proteínas pequenas podem não ser retidas pela membrana, enquanto proteínas
maiores são difíceis de transferir para a membrana.

Referências
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confiança na precisão dos western blots.” Revisão de especialistas em
proteômica  vol. 11,5 (2014): 549-60. doi: 10.1586 / 14789450.2014.939635
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problemas.” Jornal norte-americano de ciências médicas  vol. 4,9 (2012): 429-
34. doi: 10.4103 / 1947-2714.100998
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4. Kurien BT, Scofield RH. Western blotting: uma introdução. Methods Mol
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26043986; PMCID: PMC7304528.

Origens
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 https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nlanda-
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 https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/protein-biology/protein-
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 http://www.fao.org/3/Y5013E/y5013e07.htm - 1%
 https://bio.libretexts.org/Courses/University_of_California_Davis/BIS_2A
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 https://www.onlinebiologynotes.com/western-blotting-technique-principle-
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