UNIVERSIDADE SANTO AMARO

FACULDADE DE MEDICINA
DISCIPLINA DE REGULAÇÃO ORGÂNICA II
BIOQUIMÍCA II
TURMA xx

Título da aula: ELETROFORESE – PROTEINOGRAMA E AVALIAÇÃO DA

HEMOSTASIA

Aluno 1
Aluno 2
Aluno 3

São Paulo
2023
1 INTRODUÇÃO

1.1 ELETROFORESE – PROTEINOGRAMA (PPT)

As proteínas plasmáticas totais, ou PPTs, referem-se a todas as proteínas do

sangue, isto é, proteínas presentes no plasma sanguíneo, onde cumprem diversas funções,
como por exemplo transporte, manutenção da pressão osmótica, tamponamento e
alterações de pH, imunidade, atividade enzimática, coagulação e fonte de aminoácidos.
(Marzzoco; Torres, 2015).

Sendo produzidas a grande maioria pelo fígado, as proteínas plasmáticas totais

podem ser divididas em duas principais categorias: as albuminas e as globulinas. A
albumina é a proteína que se encontra em maior quantidade no plasma e é
considerada como uma proteína transportadora inespecífica e tem um papel fundamental
na regulação da pressão coloidosmótica do sangue (Marzzoco; Torres, 2015).
Já as globulinas se subdividem em alfa 1, alfa2, beta e gama, as quais apresentam
diferentes funções como o transporte de lipídeos, bilirrubina, metais, hormônios e um
importante papel no controle da imunidade (imunoglobulinas). (Marzzoco; Torres, 2015).
Segundo Marzzoco e Torres (2015), essas proteínas são consideradas como marcadores
patológicos, pois além de apresentarem vários papéis biológicos como os citados
anteriormente, podem aparecer aumentadas em processos patológicos, algo que facilita e
norteia um possível diagnóstico, pois mudanças nas concentrações dessas proteínas
podem ser indicativos de problemas hepáticos, renais, inflamações, ou, distúrbios do
sistema imunológico.
Portanto, percebe-se a importância das proteínas plasmáticas no controle de
diversos processos do organismo bem como sua relevância para a análise de exames
laboratoriais e um possível diagnóstico (Marzzoco; Torres, 2015).

1.2 AVALIAÇÃO DE HEMOSTASIA

Conforme Marzzoco e Torres (2015), a hemostasia é o mecanismo biológico que

o organismo desenvolve para bloquear um sangramento ou uma hemorragia sempre que
um vaso sanguíneo é danificado ou rompido. Esse processo ocorre por meio de
sequências de etapas, as quais são a fase vaso plaquetária, fase de coagulação e fase de
fibrinólise.
 O sangue é composto por plasma, plaquetas, leucócitos e hemácias. No plasma se
encontram quase todos os fatores de coagulação que permitem a hemostasia, assim como
as plaquetas, consideradas como fragmentos de megacariócitos, que possuem um papel
fundamental na garantia desse processo homeostático biológico (Marzzoco e Torres,
2015).
Ao ocorrer uma lesão em um vaso, ocorre primeiramente uma vasoconstrição de reflexos
nervosos locais que diminuem o fluxo sanguíneo e logo após isso é formado um tampão
plaquetário solto que é a deposição apenas de plaquetas sobre a lesão, caso esta seja
grande esse tampão plaquetário solto é transformado em um tampão plaquetário firme e
resistente, comumente chamado de coágulo. (Marzzoco e Torres, 2015).
Essa fase de tornar o tampão mais resistente é conhecida como coagulação,
considerada como a etapa mais importante, é marcada por um processo de formação de
fibrinas, por meio de cascatas de fatores de coagulação, que vão aderir às plaquetas já
depositadas firmando-as e formando o coágulo propriamente dito. Após formado o
tampão hemostático definitivo, ocorrerá a restituição do vaso e simultaneamente o
coágulo será dissolvido por um processo de fibrinólise (Marzzoco e Torres, 2015).
O conhecimento da hemostasia é, portanto, muito importante pois distúrbios nesse
mecanismo biológico podem causar complicações graves como hemorragias ou
tromboses que podem acarretar sérios riscos à saúde.
2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS – ELETROFORESE: PROTEINOGRAMA

- Dosar as proteínas totais pelo método do Biureto;

- Separar as proteínas através da técnica da eletroforese;

- Calcular o valor da concentração das proteínas totais por eluição.

2.2 OBJETIVOS – AVALIAÇÃO HEMOSTÁTICA

- Determinar o tempo de sangramento;

- Informar o tempo de coagulação.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ELETROFORESE: PROTEINOGRAMA

3.1.1 Dosagem de Proteínas Totais (método do Biureto):

A dosagem teve como objetivo medir as proteínas totais presentes na circulação

sanguínea do indivíduo. Os materiais utilizados foram: 3 tubos de ensaio, solução padrão,
soro, reativo do biureto e pipetas.

Procedimentos:
Os três tubos de ensaio foram separados e identificados em:
1. Branco: colocou-se 3,0 mL de reativo de Biureto;
2. Padrão: colocou-se 50 μL de solução padrão e 3,0 mL de reativo de Biureto;
3. Amostra: colocou-se 50 μL de soro e 3,0 mL de reativo de
Biureto.

Quantidades expressas na seguinte tabela:

Tubos Branco Padrão Amostra
Sol. Padrão - 50 μL -
Soro - - 50 μL
Reativo do Biureto 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL
Tabela 1: volumes pipetados para os reagente utilizados em cada tubo de ensaio.

Após isso, homogeneizou-se as soluções presentes nos tubos de ensaio, levando-

as ao banho-maria em 37°C durante 10 minutos e foi feito a leitura da dosagem das
proteínas em 510 nm no espectrofotômetro, logo depois de zerar o aparelho com o
Branco.

Cálculo:
Proteínas g/dL = Absorbância da amostra X 4
Absorbância do padrão

Valor referência: 6,0 - 8,0 g/dL.

3.1.2 Eletroforese:
Para separar as proteínas totais, foi utilizada a técnica da eletroforese. Os
materiais utilizados foram: solução tampão Tris, solução corante, solução descorante,
solução para eluição, cuba de eletroforese, papel de filtro, 2 fitas de acetato de celulose e
transformador (campo eletromagnético).

As soluções que são utilizadas no procedimento são compostas por:

1. Solução Tampão Tris: possui um pH igual à 9,5;
2. Solução Corante: Amido Black (Negro de Amido), que é composto por 2g de
amido em 1 litro de ac. Acético a 5%;

3. Solução Descorante: 140 mL de Metanol + 140 mL de H2O + 20 mL de ac. Acético;

4. Solução para eluição: ac. Acético 80%.

Procedimentos:

A solução Tampão Tris foi colocada na cuba de eletroforese para mergulhar as

fitas de acetato de celulose. Após 10 minutos, as fitas foram retiradas da cuba e o excesso
da solução foi retirada com auxílio do papel filtro para serem colocadas no suporte da
cuba e assim receber o soro. Para fazer a separação das proteínas, foi necessário utilizar o
transformador com campo eletromagnético por 30 minutos. Logo, as fitas foram
mergulhadas em uma cuba com corante por 3 minutos e depois descoradas em solução
descorante, sendo agitada em outra cuba para fazer a recortar cada proteína.

3.1.3 Eluição:
Para realizar a leitura das Absorbâncias de cada fração proteica identificada no
procedimento anterior, foi utilizada a técnica de eluição. Os materiais utilizados foram:
frações proteicas, tubos de ensaio, solução para eluição, pipeta e espectrômetro.

Procedimentos:

As frações de cada fração proteica identificada e recortada foi colocada em tubos de

ensaio com 2,0 mL de solução para eluição, após isso, foram colocadas no
espectrofotômetro em 540nm para realizar a leitura das absorbâncias. Logo, foi feito os
cálculos de cada fração e a concentração de cada uma em g/dL.
Valores de referência:
Valor absoluto (g/dL) Valor percentual (%)

Proteínas plasmáticas 6,0 a 8,0 g/dL 100%

Albumina 3,7 a 4,6 g/dL 52 a 65%

α1 Globulina 0,2 a 0,4 g/dL 2,5 a 5,0%

α2 Globulina 0,4 a 0,6 g/dL 7,0 a 13%

β Globulina 0,7 a 0,9 g/dL 8,0 a 14%

𝜸 Globulina 1,0 a 1,5 g/dL 12 a 22%

Tabela 2: Valores de refrencia para as proteínas quantifucadas.

3.2 AVALIAÇÃO HEMOSTÁTICA

3.2.1 Determinação do tempo de sangramento: Método de Duke

Os materiais utilizados para a determinação do tempo de sangramento foram:
papel filtro, lanceta, algodão, álcool 70% e cronômetro.

Procedimentos:

Inicialmente, foi realizada a assepsia com o álcool 70% e algodão no canto do

dedo do paciente, que não estava em jejum, pois não era necessário. Após isso, foi
realizada uma incisão profunda no local com lanceta descartável junto com o
acionamento do cronômetro.

A gota de sangue que foi formada no local da incisão, foi limpada a cada 30
segundos com papel filtro, evitando com que o mesmo entrasse em contato com a pele e
retirasse o trombo plaquetário que estava sendo formado. O cronômetro foi parado assim
que o sangue parou de fluir.

Valores de referência: 1 a 6 minutos

3.2.2 Tempo de coagulação:

Os materiais utilizados para a determinação do tempo de coagulação foram:
lâmina de vidro para microscópio, lanceta, algodão, álcool 70% e cronômetro.
Procedimentos:

Com a lanceta descartável, foi realizada uma punção na polpa digital com o
objetivo de colocar 2 gotas de sangue sobre a lâmina. Após isso, foi acionado o
cronômetro e com o auxílio da lanceta, foi sendo verificado o tempo da formação das
fibras de fibrina.

Valores de referência: 5 a 8 minutos.

4 RESULTADOS

4.1 ELETROFORESE: PROTEINOGRAMA

Eletroforese de Proteínas
Separação e dosagem de cada fração de proteína
Valores de referência Valor absoluto (g/dL) Valor percentual (%)
Proteínas plasmáticas 6a8 100
Albumina 3,7 a 4,6 52 a 65
Alfa 1 Globulina 0,2 a 0,4 2,5 a 5,0
Alfa 2 Globulina 0,4 a 0,6 7,0 a 13
Beta Globulina 0,7 a 0,9 8,0 a 14
Gama Globulina 1,0 a 1,5 12 a 22
Tabela 4: Valores de referência.

Resultados obtidos
Fração Abs % Valor absoluto (g/dL)
Albumina 0,206 23 1,71
Alfa 1 0,152 17 1,26
Alfa 2 0,128 13 0,96
Beta 0,186 19 1,41
Gama 0,260 28 2,08
Total 0,932 100 7,45
Tabela 4: Valores encontrados em aula.

Portanto, o valor obtido na Albumina está abaixo do esperado, os valores de Alfa

1 Globulina, Beta Globulina e Gama Globulina estão acima dos valores esperados e o
valor de Alfa 2 Globulina está dentro dos valores de referência.
(a) (b)

Gráficos de concentração (%) de frações de proteínas referencia (a) e valores encontrados em

aula (b).

Cálculo de dosagem de proteínas totais (PPT)

Valores de referência: 6 a 8g/dL

Logo, o resultado obtido está dentro dos parâmetros de referência.

4.2 AVALIAÇÃO DE HEMOSTASIA

Determinação do tempo de sangramento – Método de Duke
Tempo de referência: 1 a 6 minutos.

Resultado obtido a partir de amostra coletada em aula = 0,36 segundos. Logo, o

resultado obtido está abaixo dos valores identificados como normais.

Tempo de coagulação sanguínea – Método de Lee-White

Tempo de referência : 5 a 8 minutos.
Resultado obtido a partir de amostra coletada em aula = 4 minutos e 30 segundos. Logo, o
resultado obtido está abaixo dos valores identificados como normais.
5 DISCUSSÃO

5.1 ELETROFORESE: PROTEINOGRAMA (PPT)

A medida das proteínas totais reflete o estado nutricional e pode ser usada na
triagem e no diagnóstico de doenças renais, doenças hepáticas e muitos outros distúrbios.
Quando o resultado é anormal, outros exames devem ser realizados para identificar as
proteínas alteradas e para pesquisar a causa (Sampaio, 2012).

Pode-se observar que amostra de dosagem de proteínas totais em análise, teve

resultado de 7,45g/dL, com base no cálculo utilizando a os dados da “amostra”, 0,233
proteínas totais e no “padrão” 0,125 nos resultados desse trabalho em questão.

Com o isso, entende-se que o valor está dentro do intervalo de referência em

estudo descritivo, que é entre 6-8 g/dL. O processo de eletroforese, que consistiu em um
teste laboratorial que separou e quantificou as frações da proteína total denominadas,
Albumina, Alfa 1, Alfa 2, Beta 1, Beta 2 e Gama.

5.2 AVALIAÇÃO DA HEMOSTASIA

A avaliação da hemostasia primária, pelo método de Duke, é realizada através da

análise das plaquetas, considerando aspectos como contagem, morfologia, volume, curva
de agregação e avaliação genética. Para conduzir a investigação diagnóstica da
hemostasia secundária, é necessário avaliar a cascata de coagulação e a degradação da
fibrina, (Sabin, 2022).

Para o experimento, foi feita uma punção com lanceta descartável, na polpa
digital, limpou-se a gota de sangue que se formou no local da incisão a cada 30 segundos
com papel de filtro e evitou-se que o mesmo entrasse em contato com pele e removesse o
trombo plaquetário que estava se formando.

Quando o sangue deixou de fluir, o cronômetro foi pausado. O tempo estimado

para a coagulação de pessoas em condições normais de coagulação está no intervalo de 1
a 6 minutos. No experimento do grupo em questão, o tempo de coagulação determinou-
se em 36,7 s, o que determina que o tempo de coagulação do indivíduo 1 está fora do
intervalo estimado, estando em um tempo muito rápido, podendo apresentar um quadro
de sangramento anormal.

A coagulação excessiva (trombofilia), pode ser um provável diagnóstico para o

indivíduo 1. Esse quadro ocorre quando o sangue coagula muito facilmente ou
excessivamente. Distúrbios hereditários e adquiridos podem aumentar a coagulação do
sangue. Os coágulos fazem os braços ou as pernas incharem. (Moake, 2021).

Além desse teste laboratorial supracitado, um outro método de constar a

coagulação sanguínea é o tempo de coagulação chamado de método de Lee-White; que
mede o tempo necessário para que o sangue coagule, esse exame é útil na avaliação da
via intrínseca da coagulação. Para isto, foram coletadas duas gotas de sangue por meio de
uma punção com lanceta descartável, na polpa digital. No momento em que o sangue foi
depositado em uma lâmina, cronômetro foi disparado. (Macedo et. al., 2017)

De trinta em trinta segundos com o auxílio da lanceta, buscou-se constatar a

formação das fibras de fibrina. Os valores considerados normais estão no intervalo de 5
a 8 minutos. O indivíduo 2, teve seu tempo de coagulação por via intrínseca em 4
minutos e 30 segundos, estando dentro, portanto, dos parâmetros de coagulação
previstos, o que permite avaliar que o corpo do indivíduo 2 possui condições de estancar
um sangramento. (Lâmina, s.d.).
6 CONCLUSÃO

Isso posto, conclui-se que pudemos observar em aula experimental os seguintes

resultados apresentados em tabela e gráfico na sessão de resultados, os testes de
Eletroforese de proteína, tempo de coagulação, tempo de sangramento.

Os dados bioquímicos apresentados encaixam-se dentro de limítrofe do aceitável

para pacientes saudáveis em tempo de coagulação e tempo de sangramento. Porém o teste
bioquímico de eletroforese de proteína, certamente, houve alteração, podendo ser
considerado por motivos de manipulação de íons, temperatura ou coloração.
REFERÊNCIAS

MACEDO, M. S., VIAES, E.D., MARCUSSO, P.F. Técnicas de avaliação da hemostasia

em felinos. v.4. Revista de Ciência Veterinária e Saúde Pública. UEM, Umuarama, 2017.
Disponível em:
https://periodicos.uem.br/ojs/index.php/RevCiVet/article/download/39821/pdf/ Acesso
em: 06 de set 2023.

MARZZOCO, Anita; TORRES, Bayardo B. Bioquímica Básica. 4ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2015.

MOAKE, J.L. Coagulação excessiva. Manual MSD, 2021. Disponível em:

https://www.msdmanuals.com/pt-br/casa/dist%C3%BArbios-do-sangue/coagula
%C3%A7%C3%A3o-excessiva/coagula%C3%A7%C3%A3o-excessiva Acesso em: 06
de set 2023.

SAMPAIO, Lílian Ramos, et al. “Avaliação Bioquímica Do Estado Nutricional.”

Avaliação Nutricional, 2012. Disponível em:
https://doi.org/10.7476/9788523218744.0005<. Acesso em: 6 de set 2023.
 APÊNDICES
APÊNDICE 1- Bancada com equipamentos a serem utilizados em ambos
experimentos.

APÊNDICE 2 - Soluções utilizadas em experimento 1 (PPT);

APÊNDICE 3 - Soluções utilizadas na eletroforese de proteínas;

APÊNDICE 4 - Pipetagem da solução;

APÊNDICE 5 - Soluções cor, padrão e amostra em tubos de ensaio;

APÊNDICE 6 - Soluções em banho morno por 10 minutos;

APÊNDICE 7 - Eletroforese em solução tampão para deslocamento iônico;

APÊNDICE 8 - Fitas em corante amido Black para visualizar a curva de diferenciação

das proteínas;

APÊNDICE 9 - Fita contendo resultado obtido da eletroforese;

APÊNDICE 10 - Coleta de sangue para teste de tempo de coagulação e tempo de
sangramento;

APÊNDICE 11 – Amostra de sangue coletado para teste de tempo de coagulação em

vidro de relógio

APÊNDICE 12 - Tempo de coagulação 4 minutos e 36 segundos.