UNIVERSIDADE FEDERAL DE GÓIAS

BIOQUÍMICA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GÓIAS - UFG

Maickon Douglas - 201905272

 Atividade II

1. Quinases formam uma classe muito importante e abundante de enzimas, que se

caracterizam por catalisar a transferência de um grupo fosfato de alta energia para uma
outra substância receptora. Explique essa classe de enzimas.
Definição-

Eventos de fosforilação são essenciais para um grande número de processos celulares.

Esses eventos são catalisados por enzimas conhecidas como quinases. As proteínas
quinases (PKs) possuem a função de transferir grupos fosfatos das moléculas de
adenosina trifosfato (ATP), e em casos excepcionais de guanosina de trifosfato (GTP)
para proteínas alvos, alterando suas atividades como resultado (SCOTT & PAWSON,
2009; TURNHAM & SCOTT, 2016). A fosforilação de uma proteína alvo leva a ativação
de vias de transdução de sinais que desempenham um papel importante na maioria dos
processos biológicos (HORNBECK et al., 2012). A transdução de sinais é o processo
pelo qual sinais extracelulares e intracelulares são enviados para toda a célula e para o
núcleo. Dessa forma, as PKs desempenham um papel crucial nas vias de sinalização
intracelulares que regulam o crescimento, diferenciação, desenvolvimento, adesão,
funções e morte célula (GONZALEZ DE CASTRO et al., 2013). Uma série de respostas
celulares mediadas por receptores e vias metabólicas podem ser ativadas e desativadas
pelas PKs ou fosfatases (enzimas que removem grupos fosfato) intracelulares. As PKs
e as fosfatases, por sua vez, são reguladas por sinais bioquímicos extrínsecos, tais
como hormônios e fatores de crescimento. As PKs compõem a maior família de
proteínas dos seres eucariontes e, estima-se que no genoma humano existam cerca de
duas mil PKs. Essas proteínas foram primeiramente descrita em 1959 por Edwin Krebs
e Edmond Fischer e, desde então, diversas pesquisas visando compreender a
importância e o mecanismo de ação dessas proteínas tem sido realizadas (JHOTI &
LEACH, 2007; CHEN et al., 2015).

Devido à organização celular diferenciada, as PTks são divididas em proteínas tirosina

quinases receptoras (RTKs) e proteínas tirosina quinases não receptoras (NRTKs).
Exemplos de RTKs são o receptor de insulina e receptores de fatores de crescimento.
Enquanto que as NRTKs são representadas pelas proteínas Btk, Syk,Fak e Src
(OLIVEIRA & MANO, 2014). As RTKs compartilham uma organização estrutural comum:
um domínio N terminal extracelular de ligação ao ligante, uma única αhélice
transmembrana e um domínio citosólico C terminal com atividade tirosina quinase
(HERBST, 2004; ROSKOSKI-JUNIOR, 2015). Até agora, mais de 50 RTKs foram
identificadas, sendo a maioria constituída de polipeptídicos únicos, embora o receptor
de insulina e alguns receptores semelhantes sejam dímeros constituídos de cadeias
polipeptídicas (CHEN et al., 2016). A ativação inicia com a ligação de ligantes aos
domínios extracelulares desses receptores que, por sua vez, ativa seus domínios
citosólicos quinase, resultando tanto em fosforilação dos próprios receptores como das
proteínas-alvo intracelulares que propagam o sinal iniciado pela ligação do ligante
(GOTINK & VERHEUL, 2010). Devido à importância biológica das RTKs nos processos
de sinalização celular, a sua atividade catalítica deve ser controlada rigorosamente.
Alguns dos processos de regulação dessas proteínas são realizados pelo domínio
quinase, pois o estado de fosforilação controla a atividade quinase diretamente
(MOROTTI et al., 2013). As NRTKs tem localização citoplasmática e apresentam grande
variabilidade estrutural. Possuem um domínio quinase e frequentemente vários
domínios sinalizadores adicionais ou domínio de interação proteína-proteína. Os
domínios de interação proteína-proteína mais conhecidos são: SH2 (domínio de
homologia a src 2), SH3 (domínio de homologia a src 3) e PH (domínio de homologia
com a pleckstrina) (BAIRD et al., 2005; SETTE et al., 2012).
2. Como se pode dosar uma enzima? Em que a dosagem de uma enzima difere da
dosagem de uma substância qualquer? Como determinar a atividade enzimática de uma
enzima?

A)

Provocamos hemólise in vitro em coletas independentes de adultos em nosso

laboratório, através da transferência abrupta do volume coletado e sem estar o bisel
da agulha em contato com a parede do tubo (o oposto do orientado em boas práticas
de coleta laboratorial). Verificamos que a elevação provocada com a hemólise não foi
suficiente para explicar uma elevação tão importante como aquela verificada no caso
2. Na primeira amostra independente testada os valores de CPK subiram de 64 para
87 U/L quando o tubo sofreu hemólise. Na segunda amostra houve elevação de 145
para 181 U/L. Tais valores podem ser ainda maiores caso as amostras permaneçam à
espera de processamento por algumas horas, o que não é incomum em laboratórios
de patologia clínica com grandes rotinas.

Portanto, retrospectivamente, temos dificuldade em identificar qual o principal

problema indutor dos erros verificados nos resultados de dois laboratórios distintos e
de diferentes áreas geográficas do país. Pela magnitude das alterações,
principalmente no segundo caso, entendemos ter havido mais de um fator de erro
envolvido: punções repetidas no mesmo braço contra o esforço muscular da criança
(provocado pelo medo na coleta), garroteamento prolongado, ocorrência de hemólise
e provável atividade física prévia à coleta.

A partir desses fatos, reforçamos a necessidade de avaliar estas possibilidades com o

laboratório de confiança do clínico, quando em presença de pacientes com dosagens
elevadas de enzimas musculares sem um quadro clínico compatível. Em ambas as
crianças já havia sido feito o diagnóstico de PM e prescrita corticoterapia em doses
imunossupressoras, que apenas não foi seguida pela suspeição dos pais quanto ao
diagnóstico.

Indicamos, em situações similares, a avaliação do procedimento da coleta pela

anamnese com os pais, contato com o responsável técnico pelo laboratório de
patologia clínica e repetição da avaliação laboratorial em condições ideais.
Ressalvamos que o diagnóstico reumatológico é eminentemente clínico e que o
diagnóstico de polimiosite juvenil não deve ser feito em bases puramente laboratoriais
na ausência de quadro clínico compatível, princípio não adotado ao ser indicada
corticoterapia em doses elevadas nos dois casos. Em outras palavras, tratou-se de
exames e não de pacientes.

Desta forma, ressaltamos alguns princípios de coleta para enzimas musculares:

1. evitar atividades físicas extenuantes nas 24 horas antes da coleta;

2. observar quatro horas de jejum antes da coleta;
3. usar garrote por tempo não superior a três minutos(5),
4. nas coletas feitas com seringa e agulha, o sangue deverá ser transferido
delicadamente para evitar hemólise, com o bisel da agulha em contato com a
parede do tubo;
5. evitar consumo de álcool durante as 24 horas anteriores à coleta;
 6. suspender drogas que possam interferir na análise dos resultados 24 horas
antes da coleta (veja lista acima);
7. considerar que cirurgias e biópsias podem levar a resultados alterados;
8. medicações intramusculares devem ser suspensas
9. efetuar nova coleta caso haja hemólise;
10. processar rapidamente as amostras, após a coleta.

B)

As enzimas agem como catalisadoras nas reações em que participam, diferente de

outras substâncias. Sendo assim as concentrações das enzimas agem de forma
diferente nas reações, sendo que em quantidade mais abundante cumprem sua
função de forma mais eficaz.

C) A concentração de atividade enzimática (U/mL) em uma amostra pode ser

determinada a partir da velocidade da reação catalisada pela enzima em análise.
Antes de iniciar a explicação da estratégia usada neste cálculo deve ser lembrado que
por definição 1 unidade (1U) de atividade enzimática corresponde à quantidade de
enzima que catalisa uma reação com velocidade de formação de 1 micromol de
produto por minuto. Neste método propomos uma estratégia para avaliação da
concentração de atividade enzimática que se baseia na determinação da velocidade
de uma reação através da quantificação de produto em diferentes tempos de reação.
Nesta estratégia são preparados 4 tubos de ensaio idênticos contendo substrato e
solução com enzima. Os 4 tubos são simultaneamente incubados a 30°C e a reação é
interrompida em cada um dos tubos em tempos diferentes através da desnaturação da
enzima. Ao final, o produto da reação é detectado através de espectrofotometria nos 4
tubos. Os valores de absorbância são convertidos em mols através de uma curva-
padrão apropriada para o produto detectado. A partir dos dados de tempo de
incubação versus mols de produto é construído um gráfico, o qual deve ser linear se o
produto não estiver sendo “esgotado” ou a enzima não estiver se inativando durante o
ensaio. A inclinação da reta (por exemplo: mols/min) corresponde à velocidade da
reação e pode ser diretamente convertida em unidades de atividade enzimática. A
concentração de atividade enzimática (U/mL) da amostra é calculada levando em
consideração o volume de amostra utilizado em um tubo de ensaio e a diluição prévia
(antes da amostra ser adicionada em um dos 4 tubos de ensaio), segundo descrito no
exemplo abaixo.

Exemplo:

Tubo Substrato amostra exp tempo de incubação(min) absorvância micromols

1 0,1 ml 0,1ml 5 0,1 0,5

2 0,1 ml 0,1ml 10 0,2 1

3 0,1 ml 0,1 ml 15 0,3 1,5

4 0,1 ml 0,1 ml 20 0,4 2

Suponha que antes de ser adicionada nestes tubos de ensaio esta amostra tenha sido
diluída 5x. Esta amostra contém a enzima.

Os valores de absorbância foram convertidos em micromols utilizando-se uma curva

padrão apropriada para o produto formado nesta reação.
Todos os quatro tubos foram previamente preparados no gelo e levados para o banho-
maria a 30°C simultaneamente. Após 5 minutos a reação no tubo nº 1 foi interrompida.
A reação nos demais tubos foi interrompida nos tempos indicados.

A inclinação (0,1 micromols/min) é a velocidade da reação e corresponde à atividade

enzimática presente em cada um dos tubos. Note que a obtenção de uma reta indica
que a velocidade é igual em todos os tubos, independentemente do tempo de
incubação. Logo, qualquer um dos tubos contém a mesma quantidade de atividade
enzimática (0,1 U). Sabendo que cada um dos tubos recebeu 0,1 mL de amostra com
enzima, conclui-se que a solução inicial contendo a enzima apresenta a concentração
de 1U/mL (0,1 U / 0,1 mL). Um erro comum é considerar que 0,1 U de enzima está
presente na somatória dos 4 tubos simplesmente porque foram usados 4 tubos no
ensaio. Supondo que antes de ser adicionada em cada um dos tubos de ensaio a
solução contendo enzima foi diluída 5 vezes (1:4), conclui-se que a solução original
continha 5U/mL (1 U/mL x 5).

3. As vitaminas são compostos orgânicos que funcionam como coenzimas, ou seja,

atuam juntamente com as enzimas envolvidas no metabolismo celular. Mencione
algumas vitaminas (4), indicando a importante atividade celular dependentes desses
nutrientes.

A (retinol)
Fonte: Hortaliças de coloração verde-escuro; vegetais de coloração alaranjada; leite e
derivados; e fígado.
Funções no organismo: Apresenta importante papel na visão, atua na manutenção de
tecidos epiteliais e imunidade.
Problemas de saúde resultantes da falta: Problemas de visão, alterações na pele e
alteração na imunidade
D (calciferol)
Fonte: Leite e derivados; salmão; e gemas de ovo.

Funções no organismo: Participa da absorção e utilização de dois sais importantes: o

cálcio e o fósforo.

Problemas de saúde resultantes da falta: Raquitismo (problema de saúde que

desencadeia amolecimento e fragilidade de ossos e, em crianças, causa deformações
ósseas) e osteoporose

E (tocoferol)
Fonte: Óleos vegetais; nozes; e sementes.

Funções no organismo: Atua como antioxidante.

Problemas de saúde resultantes da falta: Problemas no sistema nervoso

K (filoquinona)

Fonte: Hortaliças verdes; também é produzida por bactérias presentes no intestino.

Funções no organismo: Possui importante papel na coagulação sanguínea.

Problemas de saúde resultantes da falta: Alterações na coagulação sanguínea

Referências

http://www2.iq.usp.br/docente/srmarana/bioquimica%20experimental/guia1.pdf

http://www2.iq.usp.br/docente/henning/apostila.pdf

https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0482-50042004000300008&l

https://brasilescola.uol.com.br/biologia/vitaminas.htm

https://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima