Boa tarde hoje venho falar do meu estágio realizado no âmbito da valência de

imunohistoquímica, no Hospital Escolar Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária de

Lisboa sob a orientação da técnica sandra carvalho

A faculdade de medicina veterinária é considerada a instituição mais antiga do ensino de

ciências veterinárias em Portugal criada em 1830

Foi no Hospital escolar veterinário da faculdade onde realizei o meu estágio, este tem como
principais objetivos a formação dos seus estudantes com o intuito de contribuiR para o
progresso cientifico enquanto presta serviços qualificados à comunidade de modo a zelar pela
saúde e bem estar animal, em cooperação com outras instituições, como a ESTeSL.

E qual é a importância da imunohistoquimica na medicina veterinária? Para alem de ser um

método de diagnostico complementar essencial,

em medicina veterinária ao contrario do que acontece em medicina humana trabalha-se com

muitas espécies diferentes, e a padronização dos anticorpos e das técnicas ainda não se
encontra AFERIDA em muitos casos. Por este motivo um dos maiores obstáculos no uso da IHQ
na patologia veterinária prende-se com o facto da falta de anticorpos específicos para os
tecidos animais , por isso é recorrente em medicina veterinária utilizar-se anticorpos que
apresentam reações cruzadas entre antigénios humanos e animais. Por este motivo a IHQ na
medicina veterinária é um desafio, que requer um continuo estudo e adaptação dos seus
protocolos.

No serviço de Histopatologia do hospital de medicina veterinária realiza-se a

imunohistoquimica manualmente, sendo que apenas a recuperação antigénica de alta
temperatura é realizada recorrendo ao equipamento PT LINK DA DAKO

Os métodos imunohistoquimicos realizados durante o estagio foram o método LSAB-

LABELLED STREPTAVIDIN BIOTIN E O MÉTODO DE POLIMERO DE ESQUELETO INTERNO
INDIRETO - AMBOS são métodos imunoenzimáticos, pois recorrem ao uso de enzimas.

Este tipo de métodos, baseiam-se na reação entre uma enzima e o seu substrato resultando
na obtenção de um produto corado a partir de um cromogénio,. O método mais utilizado em
medicina veterinária é o método do polímero de dextrano, este possui um esqueleto que que
vai suportar o anticorpo secundário e a enzima. Neste método, após a adição do anticorpo
primário, é adicionado o polímero de dextrano marcado, seguido do cromogénio, DAB que vai
conferir cor à reação entre a enzima e o substrato

SEGUE-SE o meu cronograma das 4 semanas de estágio. Desde o inicio que fui introduzida na
rotina laboratorial, sendo que o meu estágio passou por todas as etapas da histopatologia e
não apenas pela imunohistoquimica, uma vez que esta técnica realizava-se apenas uma vez
por semana. Ainda assim tive a oportunidade de desenvolver algumas atividades que irei agora
apresentar.~

A primeira atividade, realizada na primeira semande estágio consistiu em avaliar qual a

influência de diferentes tipos de recuperação antigénica, sendo que os mais utilizados são a
digestão enzimática recorrendo à proteinase k e a recuperação de origem térmica por alta
temperatura, a 96ºC recorrendo ao PT LINK DA DAKO com os tampões de citrato ph 6.0 e tris-
edta ph9.0

O ANTICORPO utilizados foi o Anti- actina de musculo liso monoclonal já pre diluído, 4
em intestino de canídeo recorrendo à técnica de polímero indireto. Foram realizada 3 laminas
sendo a variável o tipo de recuperação antigénica e sanbendo que este anticorpo está aferido
para a utilização de tampão tris-edta ph 9.0

Relativamente aos resultados, recorrendo há proteinase K conseguimos ver que existiu

marcação especifica da actina em musculo liso e nas células endoteliais como era suposto no
entanto existe alguma marcação inespecífica nas células glandulares, a estrutura encontra-se
preservada e a intensidade da marcação é satisfatória

Relativamente a recuperação antigénica recorrendo a tampão citrato +h 6.0 também existiu

marcação especifica da actina no musculo liso e em comparação com a proteinase K esta é
mais intensa, não se observa marcação inespecífica e o contraste está satisfatório

Por fim recorrendo à recuperação antigencia com tampão tris edta 9.0, nas lavagens que se
seguiram à recuperação antigénica o corte saltou, sendo que toda a preservação morfológica
foi prejudicada sendo por isso inexistente, uma vez que este é o método de recuperação
antigénica standard para este anticorpo, o ocorrido pode justificar-se com o facto do corte ser
muito espesso e uma vez quê este tipo de recuperação antigénica é muito agressivo a adesão
da lamina não foi suificiente para aguentar o corte e a recuperação antigénica. E uma vez que
a morfologia não foi preservada não é possível validar a técnica

A segunda atividade realizada foi com base num desafio proposto, durante o meu estagio
decorreu a validação da técnica imunohistoquimica para o vírus RHDV2 responsável pela
doença hemorrágica viral em coelho ibérico, um problema que hoje se enfreta ao tentar
recuperar a espécie. O desafio surgiu por parte de um investigador que acompanhei durante a
minha primeira atividade e que realizou a técnica imunohistoquimica com o intuito de aferir a
mesma para a deteção deste vírus em amostras de fígado de coelho bravo que se sabiam
positivas. No entanto não foram obtidos resultados positivos.

Sugeri por isto algumas alterações à técnica como podemos observar no esquema.

Sabendo que os epitopos de vírus por norma são muito sensíveis a altas temperaturas, e uma
vez que a experiencia anterior onde não se obteve resultados utilizaou a recuperação
antigénica por alta temperatura, optei pela inibição deste passo, lamina 1 e 4 ou pela
utilização da digestão enzimática recorrendo à proteinase K. lamina 2 e 3

Fiz também variações no tempo de incubação do anticorpo primário, 1 h a overnight, lamina 3,

introduzi a utilização de ALBUMINA SÉRICA BOVINA no protocolo, lamina 5, alterei o momento
do bloqueio da peroxidase, lamina 6 e dilui o anticorpo em albumina sérica bovina, lamina 7

O anticorpo utilizado é uma pool de 3 anticorpos monoclonais em mouse do laboratório de

referência para o estudo da doença hemorrágica viral, com diluição de 1/500, cada lamina
apresntava 3 fragmentos, 2 de fígado positivos para o virus e um fragmento de rim negativo
para o vírus, o método utilizado foi o método LSAB com anticorpo secundario goat anti-mouse.

Sabe-se que o vírus afeta principalmente os hepatócitos causando necrose dos mesmos e pode
ainda estar presente em células de kupfer

Estes foram os resultados obtidos e como podemos ver em comparação estas 3 laminas a 3 é a
que apresenta mais marcação mais intensa, as laminas seguintes não apresentam
praticamente marcação relevante.
Concluiu-se que a melhor marcação obtida foi nas laminas em que se realizou a recuperação
antigénica com proteinase K, comparando as duas que passaram por este protocolo é possível
identificar que a incubação com anticorpo overnight é onde se verifica a melhor marcação do
vírus.

Como referi o vírus afeta diretamente o fígado causando necrose hepática e como podemos
observar na lamina 3 é precisamente nesta sona onde está presenta a marcação oque
corrobora os achados

Como se sabe existem outros pigmentos castanhos que podem interferir na deteção
imunohistoquimica e podendo influenciar resultados falsos postivos, como é o caso da
hemossiderina um pigmento resultante da degradação dos eritrócitos e acumulação de ferro
nomeadamente quando existe hemorragia, de modo a confirmar que esta marcação era de
facto especifica do vírus realizou-se a coloração de rotina HE na qual não foram encontrados
depósitos de hemossiderina.

Recorreu-se ainda ao controlo negativo em rim de coelho saudável para confirmar que a
imunomarcação era especifica do vírus.

Pode-se assim concluir que a imunomarcação foi bem sucedida recorrendo À recuperação
antigénica por digestão enzimática com proteinase K e com uma incução overnight do soro
primário, permitindo assim um avanço na validação da técnica de imunohistoquimica para o
vírus RHDV2

Por fim a ultima atividade que venho apresentar consiste em avaliar a influencia da alteração
do momento do bloqueio da peroxidase em baço felino. O anticorpo utilizado foi o anti-CD3
que é um anticorpo de membrana que deteta a presença de linfócitos T.

Foram realizadas 4 laminas

A lamina 1 com o bloqueio da peroxidase apos a recuperação antigénica e antes da incubação

do soro primário que corresponde à técnica standard,

A lamina 2 sem o bloqueio da peoxidade endógena

A lamina 3 com o bloqueio da peroxidase endógena apos incubação com o soro primário

Lamina 4 com o bloqueio da peroxidase endógena após aplicação do polimero

Estes foram os resultados obtidos como sabemos a peroxidase endógena é muito elevada em
tecidos ricos em sangue, como é o caso do baço e é muito fácil de detetar em vasos
sanguíneos, sendo essa a estrutura apresentada nos campos do microscopio.

Na lamina 1, técnica standard como podemos ver não existe presença de peroxidase
endógena, os linfócitos T apresentam uma marcação devidamente intensa e existe
preservação da morfologia

Na lamina 2 que não sofreo o bloqueio da peroxidase endógena é evidente a marcação

inespecífica do fundo QUE PODE MASCARAR a marcação especifica dos linfócitos T e induzir o
observador em erro.

Na lamina 3- a intensidade da marcação apresenta-se mais ligeira, o contraste é mais fraco e

denota-se uma tonalidade acizentada que pode sugerir perda de afinidade para com o tecido
Por fim a lamina 4 podemos verificar que não existe marcação especifica, tal poderá ser
justificado pela interferência do bloqueio da peroxidase endógena com os locais de ligação do
polímero ao cromogénio, uma vez que as lavagens após a aplicação da peroxidase endógena
não foram suficientes para remover esta substância e permitir a reação com o cromogenio

Células de kupfer endoteliais do fígado detetado em hepatócitos necrosados uma aposta na

imunohistoquimica é boa pois é mais barata e mais simples que a microscopia eletronica