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IMUNOHISTOQUMICA 1 frequncia

1. Imunohistoqumica e imunocitoqumica
Referem-se ao conjunto de tcnicas que utilizam a reao
antignio-anticorpo para a deteo e caracterizao de
molculas no seu local de origem
Tcnicas que utilizam anticorpos para identificar
estruturas tecidulares (antignios) in situ
Imunohistoqumica:

metodologias

que

utilizam

imuno-

ensaios para co-localizar um eptopo de interesse em cortes


de tecido contextualizao da presena de antignio
Tambm se englobam mtodos que recorrem a blocos
de clulas/ cogulos preparados a partir de materiais
citolgicos e hematolgicos
Obteno do material visa a co-localizao do
antignio em simultneo com a preservao da
arquitetura original do tecido
- Fixao (congelao/ formaldedo)
- Incluso (parafina)
- Microtomia (4 m)
- Montagem em lmina
Imunocitoqumica: metodologias que utilizam imuno-ensaios
para co-localizar um eptopo de interesse em esfregaos
citolgicos, preparaes citocentrifugadas (Cytospin) ou
preparaes em monocamada (ThinPrep)
O processamento diferente do utilizado em amostras
imunohistoqumicas, logo, os testes imunocitoqumicos
requerem diferentes tipos de controlo de qualidade
(controlos positivos e negativos apropriados).

Na prtica, estas tcnicas permitem a combinao de


marcadores e alvos, que sero as estruturas a identificar
A ligao Ac/Ag permite situar e identificar a presena de
certas substncias nas clulas e tecidos atravs da cor
que formada, associada ao complexo imune
A combinao de marcadores e a anticorpos no vai
provocar qualquer tipo de dano ligao Ac/Ag, que ir
posteriormente ser formada Acresce valor para
Anatomia Patolgica e investigao
Apesar de ser dos melhores recursos em termos de diagnstico
diferencial em AP, a imunohistoqumica ainda enfrenta
algumas

dificuldades,

nomeadamente

no

que

toca

determinadas particularidades de certas patologias e ainda a


algumas limitaes tcnicas
A

padronizao

da

imunohistoqumica

uma

necessidade
A qualidade da marcao depende de 4 fatores:
Qualidade dos anticorpos
Fase pr-analtica, i.e. fixao e processamento do tecido
Recuperao antignica de eptopos
Sensibilidade do sistema de deteo

1.1. Enquadramento histrico


A primeira tcnica de IHQ foi introduzida por Coons, Creech e
Jones (1941)
Conjugou-se um anticorpo com um corante fluorescente,
tendo sido depois utilizados para identificao de
antignios em cortes histolgicos

O primeiro composto a ser conjugado com um anticorpo foi o


isocianato de fluorescena, tendo mais tarde surgido o
isotiocianato de fluorescena (FITC), mais fcil de conjugar
(495 nm << 521 nm, propenso a fotodegradao)
Gradualmente,

passar-se

utilizar

novos

complexos

marcadores:
Compostos fluorescentes, como o isotiocianato de
fluorescena (FITC verde) e isotiocianato de rodamina
(TRITC vermelho)
Enzimas, como a peroxidase (HRP), fosfatase alcalina
e glucose oxidase
Metais pesados, como a ferritina e ouro coloidal
Compostos radioativos, como o trtio, 14C e 35S
No final das reaes enzimticas, o produto adquire
eletrodensidade; no entanto, os metais pesados j possuem
esta capacidade intrinsecamente e da poderem ser utilizados
em IHQ de microscopia eletrnica
J a marcao radioativa confere resultados que sero
visualizados por autoradiografia
Quanto aos mtodos utilizados em IHQ, de concluir que
existiu uma evoluo nos mesmos, assente na crescente
capacidade de ampliao das metodologias.
O primeiro mtodo a ser introduzido foi o mtodo direto
simples, tendo sido seguido pelos mtodos indiretos
De entre os indiretos (cronologicamente) constam:
- Simples
- Enzima anti-enzima (PAP peroxidase antiperoxidase e APAAP fosfatase alcalina antifosfatase alcalina)

- Avidina-Biotina

(ABC

Streptavidin-biotin

Complex e LSAB Labelled Streptavidin-biotin)


- Polmero (EPOS polmero direto e indireto)

1.2. Principais aplicaes


A IHQ est em permanente evoluo, na medida em que a
investigao se baseia em constante procura de novos
protocolos e reagentes. As principais aplicaes so:
Neoplasias
Diagnstico
- Diagnstico de neoplasias de baixa diferenciao
morfolgica
- Caracterizao de histognese e patognese
- Distino do caracter benigno/ maligno
- Caracterizao

da

origem

de

metstases

indiferenciadas
Prognstico
- Identificao da presena de recetores hormonais
- Caracterizao da expresso de proto-oncogenes
- Estudo de protenas supressoras de tumor
- Caracterizao da presena de indicadores de
proliferao celular
Ki67: protena expressa em clulas em mitose/ prmitose. Os tumores com maior ndice mittico e,
portanto, aqueles mais agressivos e propensos
evoluo/ malignizao, expressaro maiores nveis
de Ki67.

Indicao teraputica
- Quantificao da expresso de Her2/neu em
neoplasia mamria
Se a expresso de Her2 for baixa, no se prossegue
com a terapia Herceptin, uma vez que possui efeitos
bastante adversos e muito dispendiosa

Quantificam-se 4 estadios
0+

1+

2+

3+

Equvoco
No recebe terapia Herceptin

2 fase Hibridao in situ (quantificao gnica em vez


de proteica maior pormenor)

Doenas infeciosas
Caracterizao de agentes etiolgicos
Fenotipagem da reao inflamatria envolvente
Outras patologias
Caracterizao de subtipos de amiloidose
Caracterizao de produtos de secreo de clulas
- Enzimas
- Hormonas
1.3. Conceptualizao da IHQ pr-requisitos
A. Antignio disponvel (preservado ou recuperado)
O antignio deve permanecer insolvel, disponvel e no seu
local de origem
A insolubilidade implica a permanncia no local de
origem
Se

no

fosse

insolvel,

antignio

deixaria,

eventualmente, de ser reconhecido e consequentemente


marcado, dando origem a falsos negativos

Herceptin

O antignio deve ser reconhecido pelo anticorpo (com ou


sem mtodos de recuperao)
O antignio no dever ser alterado estruturalmente,
ainda que, por vezes, tal acontea, por exemplo,
decorrente da etapa da fixao em formol, em que so
estabelecidas pontes de metileno entre os aminocidos.
Para contrariar estas alteraes, so utilizadas tcnicas
de recuperao antignica do eptopo
- As tcnicas mais utilizadas so o aquecimento a
altas temperaturas em solues de recuperao
(micro-ondas,

banho-maria

termostatizado

panela de presso) e digesto enzimtica


As proteinases vo alterar a estrutura
proteica, na ordem dos aminocidos, que
sero (alguns) eliminados, o que altera de
novo a localizao das pontes de metileno,
que so arrastadas, voltando o antignio
conformao inicial
No entanto, perdido material proteico,
correndo-se o risco de se eliminar o prprio
eptopo ou at mesmo a totalidade da
protena antignica. Esta tcnica deve ser
utilizada somente em antignios resistentes
o suficiente.
B. Marcao especfica (mecanismo chave-fechadura)
O anticorpo dever ligar-se ao antignio pretendido
O anticorpo no se dever ligar a elementos estranhos, o
que se traduz numa marcao inespecfica de fundo.

C. Anticorpo caracterizado
Devero ser conhecidos todos os elementos teciduais a que o
anticorpo se pode ligar, ou seja, todos os que despoletaro
resposta por parte do anticorpo
Dever ser conhecida toda a sequncia de ligao Ac/Ag
As caractersticas do anticorpo devero ser conhecidas
(espcie animal onde foi produzido, clonalidade, classe/
subclasse de imunoglobulina, especificidade, reatividade, qual
o antignio que o despoletou e condies de manuseamento)
D. Marcador visualizvel
Imprescindvel uma marcao estvel com intensidade
suficiente, que no suscite dvidas relativamente presena/
ausncia do antignio.
Para isto so utilizados marcadores
Enzimticos
Fluorescentes
Metlicos
Radioativos

2. Antignio e anticorpo
2.1. Antignio
Molcula com razovel dimenso i.e. protena, lpido, hidrato
de carbono ou cido nucleico
Uma vez introduzido num organismo induz resposta por
parte do sistema imunitrio, com produo de
anticorpos especficos para o mesmo
Cada antignio possui determinados radicais qumicos
que

promovem

produo

de

anticorpos

imunoglobulinas
Os antignios so reconhecidos devido sua estrutura
tridimensional, resultante da nuvem eletrnica e das afinidades
Ac/Ag
Cada antignio possui, superfcie, um ou mais locais
especficos de ligao ao anticorpo determinante
antignico ou eptopo constitudos por sequncias de
polissacridos ou protenas
Todas as molculas podem constituir potenciais antignios,
quando possuem um peso molecular superior a 8 kDa
J substncias de baixo peso molecular haptenos
podem ligar-se a molculas de peso superior, como
protenas, podendo assim desempenhar funes de
antignio
- Portanto, os haptenos, por si s no conseguem
estimular a produo de anticorpos especficos
mas, aps de combinarem a outras molculas de
peso molecular superior podero, posteriormente,

ligar-se

ao

anticorpo,

potenciando,

consequentemente, a sua produo


Conclui-se que a configurao (peso molecular) do
antignio mais importante do que a sua natureza
qumica.
2.2. Imunognio
um antignio, sinttico ou natural, utilizado para produzir
anticorpos em massa
Existem 2 grandes grupos:
Pptidos sintticos, que possuem uma sequncia de
aminocidos conhecida, o que se traduz numa vantagem.
No

entanto,

pode

no

ser

possvel

alcanar

laboratorialmente a conformao tridimensional da


protena nativa, o que se pode traduzir em falsos
negativos,

se

anticorpo

no

for

devidamente

caracterizado. Para alm disto, poder ser impossvel


recriar determinados antignios in vitro devido s
modificaes ps-traducionais, importantes para a
conformao final de um antignio in vivo.
Protenas purificadas, que no enfrentam estes
problemas. Porm, o processo de purificao difcil de
otimizar, podendo o produto final conter demasiadas
protenas contaminantes. Um outro problema prende-se
com a presena de outros eptopos que no so
especficos para a obteno do anticorpo pretendido.
2.3. Anticorpo
Molculas

de

natureza

proteica

que

so

produzidas

maioritariamente pelos plasmcitos em resposta presena


de material reconhecido como estranho antignio

Principal caracterstica: combinao com antignio


(material indutor) em condies fisiolgicas favorveis
sua ligao
O local de ligao ao antignio denomina-se partopo
A

presena

do

antignio

confirmada

aps

estabelecimento da ligao entre o seu eptopo com o


partopo do anticorpo
A sua especificidade diz respeito capacidade que o
anticorpo tem para reconhecer e estabelecer ligaes com
antignios individualizados e especficos.
Cada anticorpo tem, portanto, compatibilidade com um
antignio-alvo, ao qual responde a 100%
A especificidade do anticorpo depende da proximidade
e da complementaridade entre a clula-alvo
- Uma

alta

proximidade

complementaridade
entre

grupos

traduz-se

especficos

na
que

estabelecem ligaes fortes entre si por perfeita


correspondncia
A sua afinidade a caracterstica que define a fora de
ligao entre o anticorpo e um antignio-alvo
Depende,

portanto,

do

tipo

de

ligao

Ac/Ag

estabelecida
Existindo muita complementaridade Ac/Ag, qumica e
estruturalmente, surgir uma elevada fora de ligao e,
consequentemente, alta afinidade
- Existem substncias que mimetizam o antignioalvo mas que possuem menor complementaridade.
Sendo assim, o estabelecimento de ligaes entre
estas e o anticorpo no impossvel, mas ir

traduzir-se numa ligao mais fraca que pode,


ainda

assim,

gerar

falsos

positivos.

Estas

substncia tm de ser, assim, bloqueadas.


2.4. Foras de ligao entre antignio e anticorpo
Todas as foras de atrao entre antignio e anticorpo
possuem em comum a necessidade de proximidade entre os
mesmos para se criarem
Sendo assim, anticorpos mais prximos do antignio
ligar-se-o primeiro a este do que outros mais afastados
A soluo ser induzir o vortex
mixing,

que

consiste

na

aplicao de correntes de ar em
direes opostas sobre a lmina,
de maneira a que os anticorpos
sejam igualmente distribudos.
Individualmente, as foras de atrao no so muito robustas,
mas quando combinadas conseguem estabelecer ligaes
muito fortes
A contribuio de cada fora depende do tipo/
localizao de aminocidos que se encontram no
antignio/ anticorpo
2.4.1. Ligao eletrosttica ou inica
Baseada na interao eletrosttica entre dois ies carregadas
com cargas opostas
Na sua formao, um tomo doa um eletro, devido sua baixa
eletronegatividade, formando um io positivo ou catio (por
exemplo, Na+ doa um eletro a Cl-)
Assim, o elemento recetor adquire carga negativa,
tornando-se num anio

Os elementos podem assim estabelecer ligao inica


H

pores

mimetizam

do
as

tecido

que

cargas

antignicas, fazendo com que o


anticorpo tambm estabelea
ligaes com estas zonas de
imitao
- Estas ligaes inespecficas no seguem o
mecanismo chave-fechadura da ligao Ac/Ag,
mas tambm ocorrem, ainda que no de maneira
perfeita
- Ex.: reas de tecido necrosado atraem anticorpos
de maneira no especfica
Vamos, assim, encontrar marcao na zona de ligao
especfica Ac/Ag bem como na zona indiferenciada, o
que se traduz na gerao de falsos positivos
- Esta falsa ligao deve ser suprimida, para que no
sejam induzidos erros
- O objetivo ser combater ou dificultar a formao
de ligaes no especficas, o que feito atravs
da adio, ao meio de cultura, de um meio salino,
que forma um meio entrpico de cargas dispersas
- O anticorpo vai, assim, adquirir a capacidade de
quebra inica em soluo, tentando procurar
cargas que se encontram no meio, ficando
neutralizado/ bloqueado.

2.4.2. Pontes de hidrognio


Relativamente fracas e reversveis, formando-se entre dois
grupos hidroflicos, como OH, NH2 e COOH, dependendo da
proximidade entre as duas molculas que transportam estes
grupos
So condicionadas pela elevada eletronegatividade dos
elementos envolvidos, que aglomeram junto a si a nuvem
eletrnica da molcula a que pertencem, criando polos de
cargas contrrias que podem atrair molculas adjacentes no
mesmo estado
2.4.3. Ligaes hidrofbicas
Se dois grupos hidrfobos no polares de 2 protenas
(imunoglobulinas) se aproximarem o suficiente, de forma a
exclurem todas as molculas de gua existentes entre
elas, a superfcie em contato com a gua tende a reduzir-se e
as protenas adquirem um estado de energia mais baixo (menor
entropia) do que aquele que existia quando estavam
separadas, traduzindo-se numa atrao entre elas
As foras hidrofbicas contribuem em mais de 50% da fora
total da ligao Ac/Ag, logo a concentrao de detergente
(Triton, Tween 20), que bloqueia ligaes inespecficas, no
meio, bastante importante
2.4.4. Foras de Van der Waals
Ligadas a perturbaes temporrias da nuvem de eletres de
uma molcula, que podem formar um dipolo eltrico
Este, por sua vez, induz uma perturbao dipolar noutra
molcula adjacente, podendo assim os dois dipolos
estabelecer uma fora de atrao entre eles

2.5. Imunoglobulinas
Classe de protenas que possui atividade de anticorpo
Podem

ser

visualizadas

ao

ME,

demonstrando

conformao em Y
Cada imunoglobulina possui uma estrutura bsica constituda
por quatro cadeias proteicas: duas cadeias pesadas
idnticas e duas cadeias leves idnticas, unidas por
ligaes dissulfdicas que mantm a estabilidade do
anticorpo
Possuem ainda uma zona mvel hinge (dobradia)
que permite ao anticorpo uma mudana de ngulo de
orientao, de modo a existir uma maior
capacidade de ligao ao antignio
Nas cadeias pesadas e leves existem 3
zonas: zona constante, zona varivel e zona
hipervarivel
A zona constante da cadeia pesada determina o tipo de
cadeia pesada em questo e, portanto, a subclasse de
imunoglobulina
A zona constante da cadeia leve determina o tipo de
cadeia leve em questo
A zona varivel a zona de ligao ao antignio,
sendo

que

incluem

as

zonas

hipervariveis,

responsveis pela ligao altamente especfica ao


antignio
- A distribuio das zonas hipervariveis ocorre, na
cadeia pesada, entre os aa 31-37, 86-91 e 101-110
- J na cadeia leve, ocorre entre os aa 23-34, 50-56
e 89-97

As ligaes dissulfdicas estabelecem-se entre os aa 2298 (cadeia pesada) e 23-98 (cadeia leve)
permitida, assim, a organizao espacial da molcula
do anticorpo, de modo a formar reas especficas de
ligao expostas ao contato com o antignio
A enzima papana vai dividir a molcula em dois fragmentos
com capacidade de ligao ao antignio FAB (Fragment
Antigen Binding) e um fragmento sem esta capacidade Fc
(Fragment Crystallisable)
A molcula pode ainda ser quebrada pela enzima pepsina,
dando origem a dois fragmentos especficos: F(ab)2, com
capacidade de ligao ao antignio e cristalizao e a poro
pFc
A maioria dos anticorpos tratada com pepsina, de forma
a evitar reatividade cruzada com a poro pFc, que
reconhecida por alguns recetores das clulas humanas,
podendo originar falsos positivos
Por

reduo/

acidificao,

pode-se

dividir

uma

imunoglobulina nos constituintes bsicos (cadeias pesadas e


leves)
Acidificao/ reduo

Papana

Pepsina

Cadeias pesadas

Fab

F(ab)2

Cadeias leves

Fc

pFc

2.5.1. Cadeias leves


Existem cadeias leves kappa (k) e lambda (), sendo que cada
Ig apenas possui um dos tipos (65% - cadeias leves k)

A distribuio de cadeias leves difere em todas as classes e


subclasses de Igs, bem como em diferentes espcies animais.
2.5.2. Cadeias pesadas
As cadeias pesadas de cada Ig diferem nas propriedades
antignicas e estruturais, definindo a classe e subclasse de
cada Ig
Cadeia pesada (IgA)
Presente nas secrees sero-mucosas (saliva, lgrimas,
suor, corrimento nasal ou secrees gastro-intestinais),
onde possui funes de defesa contra microorganismos
Existe sob a forma de dmero estabilizado contra a
protelise por combinao com outra protena
componente secretor, sintetizado por clulas epiteliais,
que possui uma cadeia peptdica simples
A dimerizao feita por conjugao com a cadeia
proteica J
Possui

subclasses,

com

diferentes

ligaes

dissulfdicas: IgA1 e IgA2


Cadeia pesada (IgD)
ltima a ser descoberta
Possui menor capacidade de resistncia digesto
proteoltica, o que explica o seu curto tempo de vida no
plasma sanguneo
Encontra-se na superfcie de linfcitos, funcionando
como ativador/ inibidor
Cadeia pesada (IgE)
Existe em baixa proporo no organismo humano

Forma uma segunda barreira de defesa contra o ataque


de

microrganismos

nas

superfcies

externas

do

organismo
Presente em afees por parasitas, sendo responsvel
por alguns dos sintomas de alergia atpica reao
inflamatria
Cadeia pesada (IgG)
Ig que existe em maior quantidade e possui capacidade
de atravessar a barreira placentria, defendendo o feto
nas primeiras semanas de vida
a Ig com maior capacidade de difuso, sendo a primeira
responsvel pela neutralizao imediata das toxinas
bacterianas, pela promoo da fagocitose
4 subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) com cadeias
pesadas ligeiramente diferentes, na constituio por aa e
nas ligaes dissulfdicas
- Possuem diferentes concentraes serolgicas ao
longo da vida do ser humano
Cadeia pesada (IgM)
As IgM so polmeros de 5 unidades de anticorpos,
unidos por uma cadeia J
Existe principalmente na corrente sangunea, possuindo
principal apetncia para antignios com vrios eptopos
Alta capacidade citoltica e resposta rpida, estando
envolvida na resposta a bactermia

3. Soros policlonais e monoclonais


A

correta

realizao

das

tcnicas

IHQ

depende

fundamentalmente de reagentes adequados, destacando-se o


soro de anticorpos
Este obtido aps imunizao dos animais-alvo, dos
quais so posteriormente obtidos, por via direta ou
indireta, os anticorpos produzidos
Existem 2 tipos, que se distinguem pelo mtodo de produo

3.1. Soros policlonais


Possuem anticorpos produzidos por vrios plasmcitos,
reagindo assim com diversos eptopos de um antignio
O animal mais utilizado na sua produo o coelho, cujo
sistema imunitrio est bem documentado
Podem tambm ser utilizados cabra, porco ou ovelha
Etapas de produo de soros policlonais
1. Escolha do antignio. O antignio escolhido consoante a
sua relevncia
A Ck20 muito procurada a produo de anticorpo
anti-Ck20 elevada
2. Purificao

do

antignio. Eliminao

irrelevantes (contaminantes)
Precipitao
Centrifugao
Dilise
Cromatografia
Eletroforese

dos

elementos

3. Injeo do antignio no animal-alvo. As injees so


repetidas a intervalos regulares, de modo a manter a
concentrao de anticorpos especficos alta estimulao
mxima e continuada
O objetivo a obteno de reposta imunitria
4. Colheita de sangue do animal testado. So realizadas vrias
colheitas, periodicamente. O tempo de espera entre as
colheitas pode ditar a subclasse de Igs colhidas.
5. Separao dos elementos celulares do sangue. Procede-se
purificao da amostra, atravs de centrifugao
descartada a fase celular e mantida a fase lquida
6. Obteno do soro total (whole serum). Este composto por
plasma e soluo proteica (anticorpos + protenas
circulantes, como albumina e /-globulinas)
O problema deste soro a quantidade ainda relevante
de contaminantes, ainda que estes nem sempre
interfiram na tcnica
Em compensao, so o tipo de soro mais barato
7. Separao de outras protenas. Eliminam-se todas as
protenas que no sejam imunoglobulinas
Precipitao salina
Cromatografia por troca inica
8. Obteno da frao de Igs (Ig fraction). composta por
plasma e diversos anticorpos especficos e no
especficos.
No possui protenas circulantes, mas ainda possui
anticorpos no especficos para o antignio escolhido
um soro mais caro, mas mais puro

9. Separao de outros anticorpos. O objetivo a obteno de


um soro purificado com vrios anticorpos diferentes
dirigidos para os vrios eptopos do antignio
Cromatografia de afinidade
Tcnicas de absoro por fase slida ou lquida
10.

Obteno do soro de afinidade isolada (Affinity isolated

antibodies). composto por anticorpos especficos,


dirigidos a eptopos do antignio escolhido escolhido, e
vestgios de contaminantes.
So os soros mais caros mas tambm os mais puros
(melhor marcao)

A qualidade do soro fortemente condicionada pela eficincia


das tcnicas de purificao, logo este passo crucial na
obteno de reagentes de qualidade superior
o O uso de animais de laboratrio pouco expostos a
ambientes abertos altamente contaminados por
antignios facilita a obteno de soros com poucos
anticorpos previamente desenvolvidos contra outros
antignios
Os 3 tipos de soros obtidos diferenciam-se pela etapa de
seleo e purificao em que se encontram.

3.2. Soros monoclonais


Produto de um nico clone de plasmcitos imortalizados
sendo, como tal, uniforme em estrutura, especificidade e
afinidade, podendo ser produzido por tempo indeterminado

Os

anticorpos

de

um

certo

clone

so

imunoquimicamente idnticos (so rplicas uns dos


outros), reagindo com um determinado eptopo de um
antignio, contra o qual foram produzidos (aumento da
especificidade)
O animal mais utilizado para obteno de clones de anticorpos
o ratinho
Tambm se utiliza o coelho, por ter um sistema imunitrio
muito competente
A tcnica original de produo (1984 prmio Nobel da
medicina e fisiologia Jenre, Khler e Milstein) sofreu algumas
melhorias como a introduo de clulas modificadas por Vrus
de Epstein-Barr e tcnicas como repertoire cloning e Fab/phage
display
Etapas de produo de soros monoclonais
1. Escolha/ purificao do antignio. semelhana do que ocorre
com soros policlonais.
2. Imunizao de um animal de modo a serem produzidos
anticorpos para um determinado antignio que introduzido
por injees repetidas.
Processo pelo qual se obtm uma reposta imunolgica,
por parte de um ser vivo, para um determinado antignio,
implicando a produo de anticorpos para esse antignio,
pelos plasmcitos
A escolha do animal a ser imunizado condicionado
pelo tipo de clulas de mieloma a utilizar posteriormente,
pois sabe-se que a fuso de DNA entre espcies iguais
permite melhores resultados

A escolha da porta de entrada para a imunizao


definida pelas caractersticas de solubilidade do antignio

Se o antignio for solvel pode ser usada a

injeo endovenosa

Se o antignio for insolvel deve ser usada a

injeo

intra-peritoneal,

introdrmica

ou

intramuscular
A capacidade do antignio produzir uma resposta
imunolgica pode ser manipulada de modo a obter o
mximo de resposta com um mnimo de antignio

Podem adicionar-se determinados reagentes

ao antignio, como o hidrxido de alumnio, que


permitem a formao de um depsito localizado do
antignio

no

animal.

Este

depsito

vai,

consistentemente, induzir a resposta imunolgica,


sem que seja necessrio o uso de injees
repetidas.
H fatores que no podem ser controlados na
determinao da classe e afinidade dos anticorpos
produzidos

A presena de elevado teor em glcidos no

antignio tende a despoletar uma resposta sob a


forma de IgM
Podem, no entanto, ser usadas estratgias de modo a ser
produzido o tipo de Ig pretendido

Utilizao de uma nica injeo para produzir

a resposta imunitria, produzindo uma resposta sob


a forma de IgM

Se

forem

utilizadas

vrias

injees,

separadas por um espao de tempo longo, a


resposta tende a ser sob a forma de IgG. Estes
soros so mais procurados devido s menores
dimenses da molcula, o que possibilita uma
maior capacidade de difuso tecidual. Para alm
disso,

so

mais

facilmente

digeridos

pela

pepsina, de modo a ser eliminada a poro Fc que


pode originar falsas marcaes

Por vezes til possuir soros IgM para um

antignio, que pode ser utilizado em tcnicas de


dupla marcao simultaneamente com soros de
IgG para outro antignio
importante ter em conta que os anticorpos com maior
afinidade para o antignio so produzidos tardiamente
deve-se esperar algum tempo entre a primeira injeo
e a colheita de plasmcitos.
3. Colheita de plasmcitos no bao do animal individualizao.
Extrao da totalidade do bao.
4. Fuso dos plasmcitos (curto tempo de vida) com clulas de
mieloma (longo tempo de vida) formao do hibridoma.
Escolha das clulas de mieloma (malignizao de
plasmcitos) a utilizar: os mais utilizados so o
X63.Ag8.653 (Ag8) para ratinho e YB213.0Ag3 (Y0) para
ratazana, pois no produzem qualquer tipo de cadeia
permitem que todos os Ac produzidos aps a fuso sejam
do

tipo

imunizado

anteriormente

produzido

pelo

plasmcito

Mtodos de fuso entre plasmcitos e clulas de


mieloma (cultura celular): o mtodo mais utilizado o
polietileno glicol (PEG), como diminuidor da tenso
superficial entre as membranas celulares das clulas do
mieloma e as clulas do bao do animal utilizado
(linfcitos B)

Uma vez diminuda a tenso superficial, as

clulas fundem as suas membranas plasmticas e


nucleares e, numa posterior mitose, fundem o seu
DNA (dois ncleos separados por membrana
celular

evoluem

temporariamente

para

dois

ncleos

tetraploide,

juntos,

ocorrendo,

posteriormente, mistura de cromossomas. Por


ltimo, ocorre diviso celular, retornando a clula a
diploide)
A fuso resulta numa clula hbrida que mantm a
imortalidade de uma das clulas-me (do mieloma) e a
capacidade de produo de anticorpos especficos da
outra clula-me (plasmcitos)

A clula hbrida prolifera e d origem a clones

O hibridoma ir possuir plasmcitos que no

hibridam, clulas de mieloma que no hibridam e as


clulas hbridas (anticorpo especfico + produo
de anticorpos + imortalidade em cultura celular).
Apenas as ltimas so mantidas.

5. Colocao individual das clulas resultantes da fuso em


cultura de modo a poder recolher-se os anticorpos por elas
produzidos.
Seleo HAT: aps a juno, em meio de cultura, dos
grupos de clulas de mieloma e dos plasmcitos, so
aplicadas as tcnicas de fuso (PEG), dando origem aos
3 tipos de clulas. Estas sero triadas pela adio ao
meio de cultura de Hipoxantina, Aminopterina e
Timidina (HAT)

Os plasmcitos no hibridados apenas vo

sobreviver em cultura de tecidos durante cerca de


uma semana, pois possuem um nmero limitado
de ciclos de replicao

As clulas de mieloma no hibridadas

sero eliminadas, pois a aminopterina bloqueia a


sntese de dNTPs pela via de novo. A clula tenta
a via savage mas, sendo deficiente em enzima
HPGRT, no a consegue ativar e morre

As clulas hbridas conseguem sintetizar

dNTPs pela via savage pois possuem enzima


HPGRT e tm disponveis os percursores para esta
via

(hipoxantina

timidina).

Estas

clulas

sobrevivem porque a clula-me normal lhes


fornece capacidade de produo de HPGRT e o
mieloma imortaliza a sua linha celular.
6. Testes para os anticorpos em causa, no sentido de saber quais
as suas caractersticas. Verificam-se se os anticorpos
provenientes das clulas hbridas possuem afinidade para o
antignio escolhido (alguns sero descartados)

As clulas hbridas so testadas por etapas at se


individualizarem clones produtores de anticorpos
especficos para o antignio pretendido

Os testes podem ser feitos por IHQ, aplicando

os sobrenadantes, ricos em anticorpos, das


culturas onde repousam as clulas hbridas, como
soros

primrios

de

uma

tcnica

de

imunofluorescncia indireta

7. Manuteno

Procede-se, portanto, a uma seleo clonal


das

culturas

(clones)

que

demonstrem

caractersticas teis e destruio das restantes.


A partir do momento em que um sobrenadante de um
clone intensivamente testado e comprovada a sua
viabilidade, este pode ser utilizado nas tcnicas
correntes
A cultura pode ento produzir soro por muito tempo,
desde que mantida em boas condies
8. Recolha sistemtica dos anticorpos produzidos pelo clone, que
passam a constituir o soro monoclonal e que podem ser usados
em IHQ produo alargada de soro monoclonal.
O sobrenadante , portanto, regularmente recolhido e
comercializado pelo produtor
Existe ainda a hiptese de inocular o clone de clulas na
cavidade

abdominal

de

um

ratinho

recolher

regularmente o lquido asctico que se desenvolve, que


muito rico em anticorpos especficos
9. Purificao, digesto e conjugao de anticorpos. Os
anticorpos podem ainda sofrer alguns tratamentos na psproduo que contribuam para a sua eficincia tcnica

Remoo da poro pFc pela pepsina


Conjugao com molculas marcadoras
Armazenamento de anticorpos
Caso possuam conservantes qumicos especficos, os
soros podem ser conservados no frigorfico a 4 C
durante alguns anos
- O conservante antimicrobiano mais utilizado a
azida de sdio (sodium azide NaN3) a 0,020,05%
Soros sem conservantes podem ser conservados
durante vrios anos em cmaras frigorficas a -70 C
- Uma vez descongelados podero permanecer a 4
C somente durante alguns meses
- No recomendada a repetio de ciclos de
congelao-descongelao, que podem danificar
as estruturas proteicas irrecuperavelmente

SOROS MONOCLONAIS

SOROS MONOCLONAIS VS SOROS POLICLONAIS


Vantagens

Desvantagens

Maior especificidade e afinidade

Maior custo relativo

Determinao de um s eptopo de um

Eptopo detetvel destrudo (fixao) implica

antignio

negatividade mesmo que exista Ag

Maior homogeneidade

Maior dificuldade na obteno de grandes

Ausncia de anticorpos no especficos

quantidades

Menor variabilidade de lote para lote

Existncia de outros Ags com o eptopo


selecionado (se o soro no for produzido
contra um eptopo especfico do Ag que se

Maior facilidade de caracterizao

quer detetar e se existirem outros Ags com


esse eptopo, no haver especificidade)

Menor especificidade relativa

SOROS POLICLONAIS

Capacidade para detetar um antignio


Maior variabilidade de lote para lote

mesmo na ausncia de vrios dos eptopos

Determinao de vrios eptopos que podem


Menor custo relativo

pertencer a vrios antignios


Menor homogeneidade
Possibilidade de presena de anticorpos no

Maior facilidade na obteno de grandes

especficos

quantidades

Maior dificuldade de caracterizao por se


tratar de uma mistura

3.3. Manipulao de soros


Para se conseguir o mximo de qualidade nas marcaes de
IHQ importante que, na utilizao dos soros, se sigam as
regras de manuseamento e armazenamento que so
indicadas pelo fabricante na literatura que os acompanha
Os soros podem ser apresentados de vrias maneiras:
Lquido concentrado
Lquido pr-diludo (mais barato)
Liofilizado (freeze drying) processo especial de
desidratao que preserva as protenas e estrutura
celular.

Realiza-se

uma

congelao

posterior

aquecimento em vcuo, permitindo a sublimao e


consequente manuteno das qualidades iniciais.
Receo dos soros
Assim que se recebe um soro no laboratrio, muito
importante que se proceda ao seu armazenamento, de
acordo com as normas do fabricante

- Normalmente indicado o seu armazenamento, no


frigorifico, a 4C
Cada soro dever ser registado, indicando
- Lote
- Data de validade
- Data de receo
- Nmero da nota de encomenda
Estas informaes so teis para controlo e em casos
de posterior reclamao
Armazenamento e conservao
Frascos contentores: polipropileno, policarbonato ou
vidro borossilicado baixa capacidade de absoro de
protenas
- Tambm til usar frascos transparentes pois
permitem rpida inspeo
Temperatura: o fator mais determinante no que toca
conservao de anticorpos. Todas as indicaes dos
fabricantes devero ser seguidas criteriosamente em
relao a esta condicionante
- Os frigorficos e arcas congeladoras devem ter
indicao digital da temperatura de devem ser
monitorizados

regularmente

para

prevenir

eventuais flutuaes
- Dever existir um sistema de back-up para
compensar eventuais falhas de energia
- de evitar congelar/ descongelar diariamente
soros que requerem congelao, mantendo-se uma
pequena quantidade de soro a 4 C para usos de
curta durao

Manipulao diria: o tratamento adequado dos soros


durante a sua utilizao previne a sua deteriorao ou
contaminao
- Deve manter-se o reagente afastado do calor e da
luz solar direta, para alm de se proceder sua
rpida devoluo do local de armazenamento aps
utilizao
- importante utilizarem-se pontas descartveis
para recolha de soros

3.4. Azida de sdio


Utilizado como conservante dos reagentes usados em IHQ
Altamente txico na forma pura
- As concentraes utilizadas nos reagentes IHQ (15
mmol/L)

so

extremamente

baixas

e,

consequentemente, apresentam pouco risco


- Em situaes de elevada concentrao do produto,
embora no sendo perigosa, a azida de sdio pode
reagir com as canalizaes de chumbo e cobre,
formando depsitos de azidas metlicas altamente
explosivas
Ao se eliminarem soros de IHQ deve-se
adicionar gua abundante, para evitar a
acumulao de azidas metlicas

4. Imunofluorescncia
Mtodos de IHQ (Coons, 1941) que utilizam molculas
fluorescentes

como

substncias

propiciadoras

da

visualizao do antignio
Exigem a utilizao de um microscpio especial para a
visualizao das marcaes, com uma lmpada que
emite radiao com comprimento de onda no campo dos
UV, de 480-590 nm
- Existem vrios tipos de lmpadas que podem emitir
em vrios comprimentos de onda, dentro do campo
350 nm< < 700 nm
So tcnicas aplicveis tanto em diagnstico como
investigao
A

principal

desvantagem

prende-se

na

difcil

contextualizao do antignio no tecido, uma vez que a sua


visualizao apenas possvel em fundo escuro
As pores de tecido que no possuam afinidade para o
anticorpo desejado no vo ser marcadas, ou seja, as
estruturas celulares no vo ser distinguidas
Mtodos de uso limitado no diagnstico de rotina, pois as
molculas fluorescentes perdem atividade com o passar do
tempo, no permitindo a conservao das lminas em arquivo
importante fotografar
A fluorescncia primria ou autofluorescncia aquela que
certos tecidos ou rgos apresentam sem que seja necessria
a sua modificao (lmina elstica das artrias)

As

tcnicas

de

imunofluorescncia

vo

induzir

fluorescncia em amostras que no possuam esta


capacidade fluorescncia secundria marcando,
com fluorocromos, anticorpos dirigidos contra antignios
tecidulares
As tcnicas de imunofluorescncia realizam-se quase sempre
com tecido congelado, uma vez que o processo de fixao
com formaldedo e a incluso em parafina alteram a arquitetura
estrutural

dos

tecidos, provocando

um

aumento

dos

fenmenos de autofluorescncia e o bloqueio de alguns


determinantes antignicos
Este problema ultrapassvel e existe a possibilidade de
aplicar tcnicas de imunofluorescncia em tecidos
fixados e includos
4.1. Fluorocromos
Substncias que tm a propriedade de absorver altas fontes de
energia, precedentes da radiao UV e do espetro de luz visvel
Quando so iluminados, h uma libertao gradual de
energia que se prolonga mesmo sem a fonte luminosa
fosforescncia
Os fluorocromos mais utilizados so a fluorescncia e a
rodamina
A fluorescena usa-se quase sempre sob a forma de
isotiocianato (FITC), que absorve a luz azul e emite
fluorescncia verde
A rodamina usa-se na forma de isotiocianato de
tetrametilrodamina (TRITC), absorvendo luz ver de e
emitindo fluorescncia vermelha

Composto

Forma ativa

absorvido

emitido

Tonalidade

Fluorescena

FITC

480-500

510-530

Verde

Rodamina

TRITC

510-530

560-590

Vermelho

Texas Red

Texas Red

580-590

600-620

Avermelhado

Um fluorocromo dever possuir certas caractersticas


No dever interferir com a relao Ac/Ag
O ser armazenamento dever ser estvel
Dever encontrar-se disponvel na sua forma purificada
A sua emisso dever ser mxima no espetro do visvel
O comprimento de onda da luz absorvida e da luz emitida
devem ser muito diferentes para que possam diferenciarse facilmente
Os fluorocromos podem ligar-se de forma covalente aos
anticorpos sem alterar as suas propriedades e estes ligam-se
depois aos antignios
Assim, os fluorocromos ligados a anticorpos especficos
constituem um meio til para visualizar zonas onde
ocorra a reao Ac/Ag
Tambm podem marcar-se os anticorpos especficos
com fluorocromos distintos realizando marcao mltipla
Unio dos fluorocromos a anticorpos
O tipo de ligao depende do tipo de fluorocromo
- O FITC e o TRITC associam-se ao anticorpo
atravs de ligaes covalentes com os grupos
amina e carboxilo dos anticorpos
- Esta ligao deve ser feita em pH alcalino e devem
usar-se

molculas

purificadas

para

que

os

fluorocromos no se liguem a outras protenas e


originem falsas marcaes

4.2. Microscpio de fluorescncia


Constitudo por:
Filtros primrios ou de excitao, que selecionam o
comprimento de onda que vai incidir na amostra
Filtros secundrios ou de emisso, que seleciona os
comprimentos de onda emitidos dentro do espetro de luz
visvel, deixando passar apenas a luz emitida por uma
substncia fluorescente
Fonte de luz UV e visvel
- Pode ser uma lmpada de vapor de mercrio a alta
presso ou uma lmpada halogenada de quartzo
A primeira produz mais energia e prefervel
quando se pretende uma imunofluorescncia
de baixa intensidade
, no entanto, dispendiosa, h risco de
exploso e perde a intensidade com o tempo
Existem 2 tipos de microscpio de fluorescncia: o de
transmisso e o de luz de incidncia

4.3. Microscopia de imunofluorescncia no diagnstico


Principalmente usada no diagnstico de doenas glomerulares
do rim
Existem glomerulopatias que se podem apresentar com
imunofluorescncia negativa (doenas glomerulares no
imuno-mediadas)

Porm, a maioria possui imunofluorescncia positiva para


anticorpos anti-IgA, IgG, IgM ou complementos C1, C3 ou
C4, que pode ter padro linear ou granular
- Padro fortemente linear doena glomerular por
anticorpos

anti-membrana

basal

glomerular

(quando associada componente pulmonar


designada Doena de Goodpasture)
- Padro granular glomerulopatia de IgA

5. Mtodos imunohistoqumicos
Na qualidade de protenas, os anticorpos no possuem cor
prpria nem outra forma de serem visualizados nas
preparaes histolgicas e citolgicas
Foi necessrio encontrar uma maneira de lhes conferir
uma

maneira

de

serem

observveis quando

se

encontram ligados aos antignios que se querem detetar


em AP
Existem diversos mtodos aplicveis a IHQ, sendo o
denominador comum a procura de uma ampliao de sinal
mais potente
Objetivo comum: associar o mximo de molculas
visualizveis ao complexo imune
Ao longo do tempo tm sido desenvolvidas tcnicas para
aumentar o sinal que est associado ao antignio tecidual
Algumas no singraram e nunca obtiveram uma
expresso relevante

Outras tiveram muita aplicabilidade no seu tempo mas


foram ultrapassadas e no so praticamente utilizadas
nos dias de hoje

5.1. Mtodo direto


utilizado somente um anticorpo primrio, que possui o
marcador
O anticorpo que possui o marcador liga-se diretamente
ao antignio

1 marcador para 1 antignio

Apenas

se

aplica

um

reagente ao antignio (2 em 1
anticorpo + marcador)
Vantagens
Simplicidade e rapidez
Desvantagens
Pouca ampliao de sinal, pois somente existe uma
molcula de marcador por molcula de antignio
- O alvo diminuto, logo tambm so utilizadas
poucas quantidades de anticorpo. No entanto,
devem ser usadas altas quantidades de marcador
para se evidenciar o alvo marcao ampliativa
Elevada quantidade relativa de falsos negativos
Mtodo dispendioso, pois obriga existncia de
anticorpos primrios com marcador

5.2. Mtodos indiretos


5.2.1. Simples
So usados 2 tipos de anticorpos
Primrio, dirigido contra o antignio que se quer detetar
Secundrio, dirigido contra as imunoglobulinas da
espcie animal em que foi produzido o anticorpo primrio
e que possui a molcula marcadora
- O anticorpo primrio assume o papel de antignio
face ao anticorpo secundrio

Em 3D (na realidade), como a

copa de uma rvore o ratio marcador/


antignio aumenta (ampliao)

Podem

ser

utilizados

como

anticorpos secundrios os Rabbit antimouse Igs (RAM), se o anticorpo primrio for produzido em
ratinho ou os Swine anti-rabbit (SAR), se forem produzidos em
coelho
Vantagens
Mais sensvel que o mtodo direto, pois h maior nmero
de molculas de marcador por cada molcula de
antignio (3D)
Maior versatilidade, pois basta possuir o anticorpo
secundrio marcado e no necessrio que os primrios
estejam marcados
Mais econmico
- Apesar de se terem 2 anticorpos, apenas um deles
vai possuir marcador. No mtodo direto, todas as
molculas de anticorpo primrio tero que estar
marcadas.

Desvantagens
Mais demorado e complexo

5.2.2. Mtodo peroxidase anti-peroxidase (PAP)


Utilizados 3 tipos de reagentes:
Anticorpo primrio, dirigido contra o antignio que se
quer detetar
Anticorpo secundrio ou de ponte, dirigido contra as
imunoglobulinas da espcie animal em que foi produzido
o anticorpo primrio
- Depende apenas da espcie do anticorpo primrio
e no do n de antignios a evidenciar
Complexo peroxidase anti-peroxidase (PAP)
Para que o anticorpo secundrio possa fazer a ponte entre o
primrio e a PAP, este ltimo dever ser produzido na mesma
espcie animal do anticorpo primrio
As duas pores Fab do antignio secundrio vo ligarse simultaneamente s pores Fc do antignio primrio
e do PAP (logo, estes tero de ser produzidos na mesma
espcie)
A copa da rvore aumenta, logo a
marcao ampliada
A tcnica pode ser manipulada se forem
adicionados mais anticorpos de ponte
(mas PAP = antignio primrio, sempre)
Marcador: HRP. Pode ser adicionada
DAB, cujo produto da reao com a HRP
atua como revelador

O anticorpo secundrio dever ser aplicado em excesso, de


modo a manter uma poro Fab ligada ao anticorpo primrio e
outra poro livre para se poder ligar ao complexo PAP
Obstculo: peroxidase endgena, que tambm se poder
ligar ao anticorpo secundrio, dando origem a falsos positivos
A peroxidase endgena dever ser bloqueada atravs da
adio de perxido de hidrognio (H2O2)
Vantagens:
Maior sensibilidade
No utiliza anticorpos marcados
Permite o aumento das diluies do anticorpo primrio e
consequentemente a diminuio da marcao de fundo
(inespecficas)
Desvantagens:
Mais demorado e complexo

5.2.3. Mtodo APAAP (Alkaline phosphatase anti-alkaline


phosphatase)
Mtodo semelhante ao PAP, mas que utiliza como marcador a
fosfatase alcalina
Bastante utilizado em situaes que, pela sua natureza,
impeam/

dificultem

utilizao

dos

mtodos

de

imunoperoxidase, como em lminas de imunocitoqumica


(amostras citolgicas), ricas em eritrcitos
Os eritrcitos so ricos em peroxidase endgena;
partida, esta poderia ser bloqueada com a adio de H2O2
No entanto, amostras citolgicas so muito frgeis ao
do perxido de hidrognio, logo este no pode ser
utilizado, surgindo, como alternativa, o mtodo APAAP

O marcador, neste caso, a fosfatase

alcalina

Caso se pretenda utilizar revelador,

devem ser adicionados outros compostos que


reagiro com a fosfatase

5.3. Mtodos de avidina-biotina


Enquadramento histrico
Heggeness e Ash (1977) iniciaram a aplicao do sitema
avidina-biotina (grande afinidade) em IHQ, em mtodos
de imunofluorescncia
Em 1981, foi introduzido o Complexo Avidina-Biotina
(ABC)
- Surgiram, ento, algumas inovaes, como a
utilizao da streptavidina, a tcnica de Labelled
Avidin-Biotin (LAB) e a tcnica de Labelled
Streptavidin-Biotin (LSAB)
Todos estes mtodos se baseiam em 4 princpios gerais
A extraordinria afinidade entre a avidina e a biotina, que
se ligam espontaneamente, formando um complexo
praticamente indissocivel
A possibilidade de ligao entre a biotina e outras
molculas, como enzimas e anticorpos (biotinilao)
Possibilidade de se marcar a avidina com uma
variedade de substncias como enzimas, metais pesados
ou fluorocromos
Possibilidade da utilizao da avidina como ponte entre
duas molculas biotiniladas (anticorpo e enzima)

Principais caractersticas da avidina


Glicoprotena bsica de 67 kDa, presente
em grandes quantidades na clara do ovo
Quatro

subunidades,

cada

uma

constituda por uma cadeia polipeptdica simples de


128 aminocidos
Estrutura

terciria:

formao

de

bolsas, cada uma correspondente a


cada uma das subunidades, que tm
capacidade de se ligar a uma molcula de
biotina
Desvantagem: presena de resduos oligossacridos na
estrutura, que induzem a ligao da avidina a estruturas
tecidulares de carga eltrica negativa, o que provoca o
aparecimento de marcao inespecfica de fundo
(aumento de falsos positivos)
Principais caractersticas da streptavidina
Protena de 60 kDa , extrada da cultura de Streptomyces
avidinii, no possuindo resduos oligossacridos
Igual em tudo o resto
Possui maior afinidade para a biotina conjugada
Principais caractersticas da biotina
Vitamina H
Protena muito simples, de 255 da, existente em grande
quantidade na gema de ovo
A sua simplicidade permite a sua ligao a cada uma das
bolsas que existem na molcula de avidina para o qual
especfica

5.3.1. Biotinilao
Processo pelo qual a biotina conjugada com uma
variedade de molculas, como enzimas, cidos nucleicos ou
anticorpos
o O pequeno tamanho da molcula permite a sua ligao a
estas estruturas, sem que ocorram alteraes ao nvel
das suas caractersticas imunolgicas ou fsicas
o Pode at ser efetuada a mltipla biotinilao do mesmo
anticorpo, sem que surjam alteraes imunolgicas
- Surge a possibilidade de revestir um anticorpo/
enzima com um grande nmero de molculas de
biotina, que se comportam, por sua vez, como
locais de adeso avidina (ponte)
- O nmero mximo de molculas de biotina que se
pode ligar a um anticorpo de 150
Este processo implica a passagem da biotina para a sua forma
ativa, permitindo a ligao do seu grupo carboxilo com o
grupo amina da molcula a ser biotinilada
Pode ser ainda aplicado a cidos nucleicos para a utilizao
em ISH (in situ hibridation)

5.3.2. Bloqueio da biotina endgena


A biotina existe naturalmente em alguns rgos humanos
Para evitar que esta forma endgena se ligue avidina
utilizada em IHQ, criando falsos positivos ou fundo
inespecfico, feito o seu bloqueio
- aplicada, no incio da tcnica, avidina livre que
se ir ligar biotina endgena, bloqueando-a

- De seguida aplicada biotina livre que se ir ligar


aos pontos ativos livres da avidina previamente
aplicada, bloqueando-os
Assim, no local onde existia uma molcula de biotina
endgena, passa a existir um complexo avidina-biotina
completamente desativado

O bloqueio dever ser feito antes da tcnica, ou acabamos por


bloquear tambm a biotina ligada ao anticorpo, dando origem a
falsos negativos

5.3.3. Marcao da avidina


Pode ser marcada com vrias molculas
Fluorocromos: rodamina (TRITC) ou fluorescena
(FITC)
- Existe ligao via derivados do isotiocianato
Enzimas: HRP, fosfatase alcalina ou -galactosidade
- Usado um reagente de brao duplo (glutaraldedo)
Ferritina ou ouro coloidal
- Para a ferritina usado o glutaraldedo
- O ouro coloidal liga-se atravs de ligaes
eletrostticas no covalentes

5.3.4. Tcnicas imunohistoqumicas de avidina-biotina


No necessria a utilizao de processamento ou fixao
especial, o que permite a sua aplicao na rotina hospitalar
As tcnicas mais conhecidas so a Streptavidin-Biotin
Complex (streptABC) e a Labelled streptavidin-biotin
(LSAB)
Vantagens:
Alta sensibilidade
- Possibilidade de biotinilao de um anticorpo com
cerca de 150 molculas de biotina permite uma
ampliao do sinal
- No mtodo ABC, a avidina e a biotina com o
marcador possuem uma grande capacidade de
formar uma rede interligada que atinge grandes
propores
Alta versatilidade
- A alta polivalncia do processo de biotinilao
permite a utilizao das tcnicas da avidina-biotina
em diversas situaes, como a IHQ, hibridao in
situ ou citoqumica de afinidade (ME ou ME)
Desvantagens
Ligao da avidina a estruturas tecidulares carregadas
negativamente

(suplantada

com

adio

da

streptavidina)
Ligao da avidina/ streptavidina biotina endgena (rim,
fgado e mama)

Tcnica ABC/ streptABC


4 passos
1. Aplicao do anticorpo primrio contra o antignio
pretendido
2. Aplicao do anticorpo secundrio biotinilado
dirigido contra o anticorpo primrio
3. Aplicao do complexo ABC/ streptABC, marcado
com

substncia

propiciadora

de

visualizao,

normalmente HRP
4. Revelao (quando necessrio) e visualizao
A preparao do complexo streptABC feita 1-4 horas
antes da sua aplicao
misturada streptavidina e biotina marcada com HRP de
modo a que haja ligao entre elas
- O conjunto marcador + biotina pr-fabricado,
uma vez que, naturalmente, no tm afinidade um
para o outro
- As propores adicionadas devem facultar a
existncia de uma zona livre na streptavidina e 3
ocupadas com biotina marcada
A incubao depois feita na lmina

Tcnica LAB/ LSAB


3 passos:
1. Aplicao

do

anticorpo

primrio contra o antignio


pretendido
2. Aplicao

do

anticorpo

secundrio
dirigido

biotinilado

contra

anticorpo

primrio
3. Aplicao

da

avidina/

streptavidina marcada com HRP


Tcnica LAB tem muito mais marcao inespecfica
Caso

distncia
entre a biotina
e o seu local
de ligao
avidina

seja

muito grande,
esta mesma pode ser encurtada com a adio da
estrutura inerte spacer arm
StreptABC vs LSAB
A tcnica de LSAB mais forte do que streptABC
- A LSAB mais ampliativa e gera melhor sinal de
marco; porm, no se sabe porqu ao certo.
Vrias hipteses:
O novelo do complexo streptABC acaba por
bloquear as enzimas, impedindo-as de

reagir com o substrato e, consequentemente,


no produzir marcao
O complexo streptABC acaba por se tornar
to pesado que chega a t a separar o
antignio secundrio do primrio

5.3.5. Aplicaes prticas


Alta sensibilidade permitem a deteo de pequenas
quantidades de antignio, que podem existir normalmente ou
como consequncia da fixao e processamento
Permitem ainda a diminuio do fundo por aumento
da diluio dos anticorpos primrios, o que acaba por
diminuir os custos
A alta sensibilidade pode, no entanto, ter consequncias
negativas, como

ampliao

do

sinal

de

pequenas

quantidades de biotina endgena ou a ampliao do sinal de


pequenas

quantidades

de

anticorpo

primrio

ligado

inespecificamente
Estes mtodos facultam uma diminuio dos tempos de
incubao, tornando a tcnica mais rpida

5.4. Mtodos de polmero


So os mtodos com maior sucesso, podendo ser de
esqueleto interno ou de micropolmeros de enzimas
Vantagens:
Atravs da utilizao de polmeros, existe a possibilidade
de conjugar grandes quantidades de marcador a
anticorpos, emergindo uma capacidade superior de

amplificao, pois conseguem-se concentrar bastantes


molculas marcadoras (enzimas) por antignio
- Estando presente um grande nmero de enzimas
no polmero, maior quantidade de cromognio
ser precipitada, o que resulta numa marcao
mais

intensa

brilhante,

aumentando

sensibilidade do mtodo, permitindo detetar at as


quantidades mais nfimas de antignio
Estes mtodos permitem ainda diminuir os custos com
anticorpos primrios, pois facultam o aumento das suas
diluies de trabalho sem comprometer a intensidade
das marcaes
- Com o aumento das diluies diminuem fortemente
as

marcaes

inespecficas

provocadas

por

marcaes cruzadas
O facto de estes mtodos no possurem (strept)avidina
ou biotina torna desnecessria a utilizao de agentes
bloqueadores
Permitem ainda a utilizao de recuperao antignica
mais vigorosa sem o receio de evidenciar biotina
endgena
Tratam-se ainda de ensaios com simplicidade e
rapidez, feitos em poucas etapas
- Tornam, assim, menos provvel a variabilidade
interlaboratorial, aumentando a reprodutibilidade
e

facilidade

da

padronizao,

diminuindo,

portanto, fatores de erro, equvocos e repeties


- Para reforar esta tendncia, os reagentes so
habitualmente fornecidos em formato lquido,

pronto a aplicar, com protena estabilizadora e


conservante
Estas caractersticas aumentam a qualidade e garantem
a diminuio dos custos de trabalho e do tempo
tcnico
Na prtica, so mtodos muito teis, especialmente
quando so necessrios resultados muito rpidos
- Podem ser aplicados rotineiramente, para avaliar,
em exame intraoperatrio, as margens de
cirurgias um melanoma, atravs da cirurgia
microgrfica de Mohs, detetando melancitos por
via do antignio MART-1/ MelanA
- Surgem benefcios para o doente e equipas de
cirurgia e patologia, com todas as consequncias
respeitantes a mortalidade, morbilidade e qualidade
de vida

5.4.1. Polmero de esqueleto interno


Recorrem a uma macromolcula constituda por um esqueleto
central de grandes dimenses, ao qual esto acopladas
grandes quantidades de anticorpos e molculas marcadoras
(enzimas)
As

principais

utilizadas

como

molculas
esqueleto

interno so os dextranos, que


atuam

como

plataforma

de

ligao de molculas estruturais

Tratam-se de polissacridos hidroflicos, de elevado


peso molecular (500 kDa), alta hidrossolubilidade e baixa
toxicidade/ imunogeneicidade
So bioquimicamente inertes, devido sua rara ligao
poli-(-D-1,6-glucose), que os torna resistentes
clivagem por glucosidades endgenas celulares

comercializado

sob

forma

de

aglomerados

polimricos extremamente flexveis, que em soluo se


transformam em espirais muito expansveis
Facilmente solvel em gua e eletrlitos, constituindo
solues incolores, transparentes e altamente estveis
O pH no afeta significativamente a sua solubilidade e
possvel dissolve-lo em sulfeto de metilo, formamida,
etilenoglicol e glicerol
- , no entanto, insolvel em etanol, Isopropanol,
acetona e 2-propanona
Podem ser esterilizados em autoclave e so estveis por
muitos anos, devendo ser conservados a temperaturas
constantes
pH ideal de armazenamento: 6-7
- estvel

temperatura

ambiente

por longos

perodos na faixa de pH 4-10


Aplicaes:
- Farmacutica (preparaes parentricas)
- Solues de uso oftlmico
- Cremes e pomadas
Formados a partir da sacarose durante o crescimento de
bactrias Leuconostoc, Streptococcus e Lactobacillus
(famlia Lactobacillacea)

- A maioria sintetizada pela bactria Leuconostoc


mesenteroides
Biodegradao realizada por dextranases, produzidas
por alguns fungos (Penicillium e Verticillium)
- Produtos de degradao so essencialmente
acares de baixo peso molecular (glicose ou
isomaltose)
- Dextranoses

extracelulares

produzidas

por

Lactobacillus, Cellvibrio, Cytophaga e Bacillus spp


Atinge grandes dimenses e engloba cerca de 100
molculas de HRP e at 20 anticorpos secundrios do
tipo cabra anti-ratinho ou cabra anti-coelho
Polmero de esqueleto interno direto
Utiliza-se somente um polmero que constitudo pelo
esqueleto de dextrano, ao qual esto acoplados
anticorpos primrios e molculas marcadoras HRP
Por possuir um s passo, trata-se de um mtodo
extremamente

rpido

fcil,

evidenciando

diminuio de fatores de erro


Possui, no entanto, pouco poder de amplificao

tambm

relativamente
dispendioso
existem

e
poucos

anticorpos
primrios
comercializados
desta forma

uma

A tcnica pode no funcionar, uma vez que, nos tecidos,


o antignio nem sempre est depositado em superfcies
planas e, sendo a molcula muito grande, no conseguir
penetrar no tecido e, consequentemente, reconhecer o
antignio (aumento de falsos negativos)
O principal polmero deste tipo a ser comercializado foi o
Enhanced Polymer One-Step Staining (EPOS
Polmero Amplificativo de 1 s passo), da Dako
(Bisgaard, 1993)
Polmero de esqueleto interno indireto
Aplica-se um anticorpo primrio dirigido contra o
antignio pretendido e, posteriormente, aplica-se um
polmero

ao

qual

esto

acoplados

anticorpos

secundrios e molculas marcadoras HRP


Por s possuir 2 passos, rpido e fcil, evidenciando
uma diminuio de fatores de erro
muito ampliativo, deslocando muitas molculas
marcadoras por molcula de antignio
Diminuta taxa de
falsos negativos
Relativamente
dispendioso
Molcula
grandes
dimenses
Principais:
EnVISION,
Picture

de

5.4.2. Micropolmeros de enzimas (ImmPRESS, Novolink)


A utilizao de polmeros aumenta drasticamente o nmero de
enzimas que podem ser conjugadas com anticorpo
No incio da comercializao, os produtos conjugados
possuam tamanho muito elevado e a densidade de
enzima por unidade de superfcie no assumia uma
proporo eficiente para esse tamanho
Seria, ento, desejvel obter um complexo Ac/ enzima
mais compacto, com um elevado nmero de molculas
de enzima ligado a cada anticorpo, garantindo um
aumento mnimo de tamanho molecular
Foram feitas experincias que procuravam combinar pequenas
molculas de estrutura linear ou minimamente ramificada, de
forma a polimerizar anticorpo e enzimas, constituindo um
complexo muito compacto
A polimerizao de molculas orgnicas monomricas
pode ser feita com recurso ao cido acrlico e ao cido
bisacrlico
Criaram-se

complexos

de

elevado

nvel

de

polimerizao, que no perdem o seu poder de reao


e penetrabilidade pois o rcio de polimerizao, apesar
de elevado, no se torna incomportvel pois
condicionado pelo facto da HRP apenas possuir um
grupo amina facilmente acessvel
Os micropolmeros de enzimas apostam no pequeno porte e
na elevada concentrao funcional
Embora o produto final desta conjugao seja um
complexo heterogneo com diferentes tamanhos
moleculares, formas e rcio enzima/Ac, a experincia

prtica sugere que o conhecimento da relao exata


entre anticorpo e enzima, de forma molecular ou do
tamanho, no fundamental para o seu melhor
desempenho
A imunomarcao proporcionada por estes reagentes
de

elevada

qualidade,

independentemente

dos

antignios serem de membrana, citoplasma ou ncleo


Esta abordagem evita os problemas decorrentes do uso de
dextrano/ outras macromolculas como esqueleto
O micropolmero com uma alta densidade de enzima
muito ativa acoplada a um anticorpo secundrio gera um
reagente que supera a interferncia estrica que advm
do enorme volume ocupado pelo
polmero
Proporciona

ainda

maior

acessibilidade ao antignio, pois a


pequena

dimenso

reagentes

permite

difuso

aos

dos
uma

pontos-alvo

seus
melhor
e

uma

reduo de ligaes no-especficas


Sistemas de dois e trs passos
No sistema de 2 passos ocorre a incubao do anticorpo
primrio e posteriormente do polmero
- Para a deteo de alguns antignios a intensidade
da imunomarcao ficava diminuda e assumiuse que isso seria devido a problemas de
penetrao
provavelmente

do
do

polmero
resultado

nos
do

tecidos,

impedimento

espacial provocado pelo elevado peso molecular


dos conjugados polimricos
Para tentar ultrapassar este problema foram criados os
sistemas de 3 passos, nos quais includa a aplicao
de

um

anticorpo

extra

ativador entre o primrio e o


polmero,
capacidade

que
de

aumenta
deteo

a
do

sistema e a sua sensibilidade


- Este 2 anticorpo permitir
o aumento da superfcie de
ligao para o polmero,
que colocado posteriori
O anticorpo ativador permitir, em 3D, aumentar todo o
complexo, que est ligado ao tecido, facilitando a ligao
do polmero nas situaes em que o antignio se
encontra na profundidade tridimensional do tecido