UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE MORFOFISIOLOGIA VETERINÁRIA
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA VETERINÁRIA
MESTRANDAS:VITÓRIA RODRIGUES, SAYONARA LEAL E
NATHALIA CASTELO BRANCO
PROFESSORA: DRA. MARIA DO SOCORRO PIRES E CRUZ

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – PRÁTICA DE ELISA

ELIANE BATISTA DE SOUSA MOURA

2024
TERESINA/PI
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO......................................................................................................... 2
2 MATERIAIS, REAGENTES E EQUIPAMENTOS.....................................................3
2.1 Procedimento.......................................................................................................3
3 RESULTADOS .........................................................................................................3
4 CONCLUSÃO...........................................................................................................6
REFERÊNCIAS........................................................................................................... 7
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1 INTRODUÇÃO

O ensaio ELISA é um método em que a interação antígeno-anticorpo é

acompanhada pela mensuração da atividade enzimática. Desempenha um papel
crucial no laboratório clínico, pois, além de possuir alta sensibilidade comparável à
do radioimunoensaio, apresenta as vantagens de utilizar reagentes estáveis, estar
isento das exigências de trabalhar com radioisótopos e poder ser adaptado tanto a
testes simples quanto a automação avançada. O teste pode ser aplicado com uma
variedade de sistemas de detecção, abrangendo desde leituras visuais até
fotométricas, com substratos coloridos, fluorescentes ou luminescentes, o que tem
contribuído para a ampliação de seus métodos e aplicações nos últimos anos.
O princípio fundamental da reação de ELISA envolve a fixação de um dos
reagentes em uma fase sólida, enquanto o outro reagente pode ser associado a
uma enzima, garantindo a preservação tanto da atividade enzimática quanto da
imunológica do anticorpo. A fase sólida pode ser composta por partículas de
agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno, entre outros materiais. Placas de
plástico são as mais amplamente utilizadas, pois possibilitam a realização de
múltiplos ensaios e facilitam a automação. Após cada etapa, como a sensibilização,
incubação com a amostra e com o conjugado, as cavidades das placas são lavadas
para eliminar o material não vinculado à fase sólida.
O teste identifica quantidades ínfimas de antígenos ou anticorpos, podendo
alcançar elevada acurácia quando os reagentes e os parâmetros do ensaio são
meticulosamente padronizados. A pureza do antígeno ou anticorpo na fase sólida
desempenha um papel crucial, pois qualquer material heterólogo concorrerá pelo
espaço na placa. Na detecção de antígenos, o anticorpo utilizado na sensibilização
deve possuir alta afinidade, podendo ser policlonal ou monoclonal. No caso da
pesquisa de anticorpos, é essencial que o antígeno esteja isento de impurezas,
sendo possível utilizar antígenos purificados por cromatografia de afinidade com
anticorpos monoclonais, peptídeos sintéticos ou peptídeos obtidos através de
tecnologia recombinante.
O ensaio imunoenzimático em fase sólida, fundamentado no princípio de
imunocaptura, destina-se à detecção qualitativa de anticorpos IgG contra
Leishmania em soro ou plasma de cães. Este método é desenvolvido em substrato
sólido, onde ocorre a imobilização de antígenos específicos de Leishmania. Durante
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o ensaio, os anticorpos IgG presentes na amostra capturam os antígenos, formando

um complexo imunológico que é posteriormente revelado por meio de uma enzima.
Falta colocar o objetivo do Relatório

2 MATERIAIS, REAGENTES E EQUIPAMENTOS

● Pipetas;
● Selador de placas;
● Placa sensibilizada – placa de poliestireno, dividida em 12 tiras de 8 poços
cada, impregnada com antígeno recombinante de L. infantum;
● Conjugado Concentrado (100X) – solução de anticorpo anti-IgG de cão ligado
a Peroxidase;
● Lavagem Concentrada (20X);
● Substrato TMB;
● Solução de Parada.

2.1 Procedimento

Foram pipetados 100μl de conjugado devidamente diluído em cada cavidade,

incluindo a cavidade branca. Em seguida, realizou-se uma homogeneização suave
por 10 segundos. As cavidades foram vedadas com seladores de placa e incubadas
por 30 minutos à temperatura ambiente.
Após a etapa de lavagem, adicionou-se 100μl de substrato TMB em cada
microcavidade, seguido de uma homogeneização delicada por 3 segundos, e as
cavidades foram novamente cobertas com seladores de placa. Decorridos 10
minutos de incubação à temperatura ambiente, removeu-se o selador das
microcavidades e pipetou-se 100μl da solução de parada em cada uma delas,
realizando uma homogeneização por 3 segundos.

3 RESULTADOS
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Figura 1: Diluído as amostras adicionando 15μl em 300μl de diluente,

homogeneizando.

Pipetado 100μl de controle positivo, controle negativo e as amostras diluídas

nas microcavidades previamente determinadas, foi homogeneizado por dez
segundos, sendo cobertos pelo selador de placa e incubado por 30 minutos em
temperatura ambiente.

Figura 2: Amostras diluídas nas microcavidades previamente.

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Figura 3: Pipetado 100μl conjugado previamente e toda a microcavidade.

Durante dez segundos no processo de homogeneização, as placas foram

cobertas com o selador de placa, incubado por trinta minutos em temperatura
ambiente. Por diante, pipetando 100μl de substrato em todas as microcavidades,
homogeneizando por três segundos e cobrindo com o selador.

Figura 4

Figura 4: Amostras das soluções paradas nas microcavidades efetuando a leitura

das absorbâncias em fito duplo 450nm/630nm em até 10 minutos.
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Mediante ao procedimento realizado das amostras o teste de Elisa identificou

os seguintes resultados para a interação de antígenos-anticorpos, além da mudança
de coloração de azul para amarelo:
● A: positivo
● B: negativo
● C: positivo
● D: negativo
● E: negativo
● F: negativo

A mudança de coloração das amostras de azul para amarelo no teste de

ELISA indica interações antígeno-anticorpo positivas. Esse fenômeno evidencia a
formação do complexo imunológico entre os antígenos presentes nas amostras e os
anticorpos específicos utilizados no ensaio. A transição para a coloração amarela
sinaliza uma reação positiva, sugerindo a presença do antígeno de interesse nas
amostras testadas. Por outro lado, amostras que mantiveram a coloração azul
indicam interações antígeno-anticorpo negativas, sugerindo a ausência do antígeno
alvo nessas amostras. Em resumo, a observação da mudança de cor permite a
identificação qualitativa de resultados positivos e negativos no teste de ELISA,
fornecendo informações cruciais sobre a presença ou ausência de determinado
antígeno nas amostras analisadas.

4 CONCLUSÃO

A prática do teste de ELISA proporcionou resultados valiosos na detecção de

interações antígeno-anticorpo. A observação das mudanças de coloração nas
amostras indicou a presença ou ausência do antígeno de interesse, permitindo uma
análise qualitativa dos resultados. As amostras que apresentaram uma transição de
cor indicaram reações positivas, sugerindo a presença do antígeno alvo. Por outro
lado, amostras que mantiveram a coloração original denotaram reações negativas,
indicando a ausência do antígeno. Esses resultados são fundamentais para o
diagnóstico e monitoramento de diversas condições, destacando a eficácia do teste
de ELISA como uma ferramenta sensível e específica na identificação de
substâncias específicas em amostras biológicas.
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REFERÊNCIAS

FERREIRA, Paulo RB et al. Teste de ELISA indireto para diagnóstico sorológico de

leishmaniose visceral em canídeos silvestres. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.
33, p. 528-534, 2013.

SILVA, Marcos Vinícius da et al. Teste imunoenzimático (ELISA) para detecção de

anticorpos circulantes da classe IgM na leptospirose humana. Revista do Instituto
de Medicina Tropical de São Paulo, v. 30, p. 95-100, 1988.