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TSH

MTODO:
ELISA

FINALIDADE:
Teste de ELISA para a determinao quantitativa de Tirotropina (TSH) em soro
humano. Para uso profissional. Somente para uso diagnstico in vitro.

SIGNIFICADO CLNICO:
A Tirotropina (TSH) um hormnio glicoproteco de aproximadamente 28 kD,
secretado na glndula pituitria anterior. Ele considerado como o mais sensvel
indicador disponvel para o diagnstico do hipotireoidismo primrio e secundrio
(pituitrio) (1,2). Aumento na concentrao srica de TSH um indicador precoce e
sensvel do decrscimo da reserva na tireide e em associao com o decrscimo de
T4 diagnstico do hipotireoidismo primrio. O aumento previsto em TSH
demonstra o clssico sistema de feedback negativo entre as glndulas pituitria e
tireide. Em adio, a determinao de TSH utilizada para diferenciao de
hipotireoidismo secundrio e tercirio da doena primria da tireide. Em
hipotireoidismo secundrio e tercirio, concentraes de T4 esto geralmente baixas
e nveis de TSH esto geralmente baixos ou normais.

PRINCPIO:
O teste TSH ELISA se baseia na tcnica clssica de ELISA sandwich. Como um teste
de segunda gerao, ele faz uso de um anticorpo monoclonal anti-TSH altamente
especfico que cobre a superfcie das cavidades das tiras de microtitulao. Na
primeira etapa de incubao, amostras, calibradores ou controles, e enzima
conjugado (anticorpo anti-TSH peroxidase-marcado) so misturados para formar o
complexo sandwicch que ligado superfcie das cavidades pela interao com o
anticorpo imobilizado. No final da incubao, o excesso de enzima-conjugado
retirado por meio de lavagem. O reagente substrato adicionado (etapa 2) e a cor
resultante, que torna-se amarela aps a finalizao com a adio da Soluo STOP,
medida fotometricamente. A intensidade da cor diretamente proporcional
concentrao de TSH na amostra.
A absorbncia dos calibradores e amostras determinada usando-se uma leitora de
placas ou tiras de ELISA ou um sistema automatizado ELISA (Linha Humareader ou
ELYSIS da Human). A concentrao avaliada por meio de uma curva de calibrao
que estabelecida a partir dos calibradores fornecidos com o kit.

IDENTIFICAO E ARMAZENAMENTO:
Conservar entre 2-8C.

MIC 12 Tiras de Microtitulao (em suporte para tiras)
Tiras descartveis com 8 cavidades cobertas com anti-TSH (monoclonal
rato).
CAL 6 x 2 mL Calibradores de A - F _ Pronto para uso. Tampas
coloridas (A: branca, B: amarela, C: verde, D: vermelha, E: azul,
F: preta)
Calibradores (humanos) para TSH nas concentraes de 0,0 (A); 0,5 (B);
3,0 (C); 6,0 (D); 15,0 (E); 30,0 mUI/L (F) de TSH; sodium azide
0,95g/L. Conservantes.
Ver precaues.
CON 13 mL Enzima Conjugado _ tampa branca
pH 6,25 0,1
Pronto para uso, cor vermelha.
Anti-TSH (goat), HRP labelled. Conservantes.
WS 50 mL Soluo de lavagem _ tampa branca
pH 7,2 0,2
Concentrada para 1000 mL, Tris-Buffer 10 mmol/L, NaCl 8 g/L.
Conservantes.
SUB 13 mL Reagente Substrato _ tampa preta
pH 3,6 0,25
Pronto para uso
3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB) 1,2 mmol/L, Hidrogen Peroxide
6,0 mmol/L
STOP 15 mL Soluo Stop _ tampa vermelha
Sulphuric acid 0,5 mol/L
Tiras Adesivas
Conservantes: Concentrao total < 0,1%.

PADRONIZAO:
Os calibradores do kit foram padronizados contra o WHO 2
nd
IRP 80/558.

ESTABILIDADE:
Os reagentes so estveis at o vencimento da data de validade descrita em seus
rtulos individuais quando armazenados entre 2-8C. Depois de abertos os
reagentes devem ser armazenados entre 2 e 8C e usados dentro de 60 dias (ver
nota).

NOTA:
Os reagentes so estveis at a data de validade impressa no rtulo, quando
armazenados entre 2 e 8C, mesmo depois de abertos. Entretanto a contaminao
est diretamente relacionada com o nmero de vezes que os reagentes so abertos
e utilizados. O limite de 60 dias depois do primeiro uso por razes de segurana. O
manuseio cuidadoso dentro das Boas Prticas de Laboratrio oferece a oportunidade
de utilizao dos reagentes aps os 60 dias (Isto inclui: frascos bem tampados aps
o uso, tirar da geladeira somente o reagente que vai ser usado, solues estoque
devem ser colocadas de volta na geladeira quando no estiverem sendo usadas). Os
critrios de validao devero sempre ser encontrados.

TRANSPORTE:
O transporte do kit deve ser feito pela rota mais direta evitando-se as chegadas nos
finais de semana e feriados no local de destino. O kit no afetado pelo transporte
desde que seja entregue ao destinatrio no perodo mximo de 07 dias e em uma
temperatura de at 37C.


TERMOS E CONDIES DE GARANTIA:
O fabricante garante a qualidade do produto, se este for armazenado como descrito
acima e em sua embalagem original.

PREPARO DOS REAGENTES:
Todos os reagentes devem estar a temperatura ambiente (15 a 25 C) antes do uso.
Reagentes no utilizados devem ser sempre armazenados entre 2 e 8 C.

Soluo de Lavagem de Uso WASH
Diluir a Soluo de lavagem concentrada WS 1 + 20 mL com gua recm destilada
ou deionizada em um recipiente adequado. Ex.: 50 mL de WS + 1000 mL = 1050
mL. Estabilidade: At 60 dias entre 15 e 25 C.

Tiras de Microtitulao MIC
As tiras so lacradas em uma bolsa de alumnio com dessecante.
Antes de serem abertas, as tiras devem ficar a temperatura ambiente. As tiras no
utilizadas devem retornar para a bolsa plstica com o dessecante.
Manter o adesivo selante intacto. As tiras armazenadas desta maneira entre 2 e 8 C
podem ser usadas at o vencimento da data de validade impressa no rtulo de
caixa.
No tocar na borda superior ou no fundo das cavidades com os dedos.

AMOSTRA:
SORO.
No usar amostras altamente lipmicas ou hemolisadas.
Amostras podem ser armazenadas por 5 dias entre 2 e 8C, at 30 dias a - 20C.
Congelar e descongelar somente uma vez. Amostras descongeladas devem ser
homogeneizadas. Eliminar material em suspenso por centrifugao ou filtrao.

PRECAUES:
No ingerir ou aspirar os reagentes. Evitar contato com a pele e as mucosas.
O produto contm derivados de fluido humano e foi testado para a presena de
HBsAg e anticorpos HCV e HIV apresentando resultados negativos. Apesar de terem
sido utilizados testes validados com alto grau de confiabilidade, nenhum deles pode
assegurar que produtos que contenham derivados de fluidos humanos sejam
incapazes de provocar doenas. Portanto, os cuidados habituais de biossegurana
devem ser aplicados na manipulao desse produto.
Todo o material contendo amostras de pacientes ou controles deve ser inativado
por procedimentos validados (autoclavao ou tratamento qumico).
Para o descarte seguro dos reagentes e materiais biolgicos, sugerimos utilizar as
regulamentaes normativas locais, estaduais ou federais para a preservao
ambiental.
A Soluo Stop STOP contm cido sulfrico, manuse-la com cuidado porque
pode irritar os olhos e a pele. Em contato com os olhos enxaguar abundantemente e
contatar um mdico.

MATERIAL NECESSRIO E NO FORNECIDO:
Cronmetro
Pipetas e ponteiras
Leitora de ELISA
Lavadora de ELISA

PROCEDIMENTOS:
Seguir os procedimentos exatamente como descritos.

Importante:
P1. No misturar ou usar componentes com nmero de lote diferente. No trocar a
tampa dos frascos (risco de contaminao). No usar reagentes aps o vencimento
da data de validade.
P2. No usar reagentes que possam estar contaminados ou tenham a aparncia ou
cheiro diferente do usual.
P3. Marcar CAL, amostras e controles cuidadosamente na folha fornecida junto com
o kit.
P4. Selecionar o nmero necessrio de MIC, e coloca-las firmemente no suporte.
P5. Realizar duplicatas dos CAL, amostras e controles. Pipet-los no fundo da
cavidade.
P6. Adicionar sempre os reagentes na mesma ordem, cronometrando para
minimizar a diferena do tempo de reao entre as cavidades. Isto
importante para a reprodutibilidade dos resultados. A pipetagem das amostras no
deve exceder a 10 minutos. Se o tempo for superior a 10 minutos, pipetar os
calibradores nas posies indicadas na metade do tempo da pipetagem das
amostras. Se mais de 1 placa for utilizada, realizar uma curva para cada placa.
P7. Evitar/remover bolhas de ar antes das incubaes e leitura de absorbncia.
P8. A adio da SUB inicia uma reao cintica, que finalizada pela adio da
STOP. Evitar luz forte durante o desenvolvimento de cor.
P9. Aps cada etapa de pipetagem homogeneizar as cavidade por 20-30
segundos, sem deixar derramar seu contedo (aspirar e dispensar o contedo da
cavidade de 3 a 5 vezes utilizando a ponteira do ltimo reagente. Deve-se utilizar 1
ponteira para cada cavidade). Se possvel utilizar um mixer para placas de
microtitulao.

PROCEDIMENTO DE LAVAGEM:
O Procedimento de lavagem crtico. Como em qualquer teste de microtitulao
sensvel, leituras inconsistentes podem ser obtidas devido a lavagem inadequada.
Entretanto, importante aspirar completamente as cavidades antes de adicionar a
Soluo de lavagem ou reagentes lquidos. Lavagem insuficiente resulta em pouca
preciso ou absorbncias falsamente elevadas.

L1: Aspirar o contedo das cavidades, adicionar a Soluo de Lavagem WS, aspirar
novamente o contedo das cavidades aps 30 segundos de tempo de espera.
Repetir a lavagem 4 vezes.
L2: No caso de lavadoras automticas, realizar um prime com a soluo de lavagem
(WS) e lavar as tiras 5 vezes. Verificar se a lavadora encheu todas as cavidades
completamente e aspirar aps 30 segundos eficientemente (lquido remanescente
deve ser < 15 L).
L3: Aps a lavagem, remover o lquido remanescente batendo a placa invertida em
um papel absorvente.
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ESQUEMA DE PIPETAGEM:
Todos os reagentes devem estar a temperatura ambiente (15 a 25C) antes
do uso.
CAVIDADE ( L)
ETAPA1
A1...D2
Calibradores
E2
Amostras
CAL A-F, em duplicata
Amostras, Controles, em duplicata
CON
50
---
100
---
50
100
Homogeneizar. Cobrir as MIC com a tira adesiva.
Incubar 60 minutos entre 20-25C
Lavar 5 vezes como descrito em Procedimento de Lavagem
WASH 300 300
ETAPA 2
SUB 100 100
Incubar 15 minutos entre 20-25C (ver p8)
STOP 100 100
Homogeneizar cuidadosamente
Medir a absorbncia em 450 nm o mais rpido possvel ou no mximo dentro
de 30 minutos aps o trmino da reao. Utilizar como comprimento de
onda de referncia 630-690 nm (se disponvel).

VALIDAO DO TESTE:
Os resultados dos testes so vlidos desde que os seguintes critrios sejam
encontrados:
A mdia da absorbncia [OD] de CAL F 1,2.
A diferena entre as duplicatas de CAL F no deve exceder 10%.

CLCULO:
Plotar as absorbncias medidas contra as concentraes de CAL em um grfico
linear. A interpolao apropriada dos pontos de medio plotados resulta em uma
curva de calibrao, onde a concentrao do analito de cada amostra pode ser
determinada.
Para o clculo das concentraes do analito, selecionar a opo de curva apropriada
e validada (recomendao: ponto a ponto).

CONTROLE DE QUALIDADE
Boas prticas de laboratrio exigem controles a serem testados com cada curva de
calibrao. Um nmero significativo de controles deve ser executado para
estabelecer os valores mdios e limites aceitveis para garantir um desempenho
adequado. Amostras de controle de qualidade devem ser executadas de acordo com
as regulamentaes locais. Os resultados devem estar dentro das faixas
estabelecidas.

INTERPRETAO DOS RESULTADOS:
A concentrao srica total de TSH dependente de uma multiplicidade de fatores:
funo da glndula do hipotlamo, funo da glndula tireide, e a sensibilidade da
pituitria para TRH. Assim, a concentrao isolada de tirotropina no suficiente
para avaliar o estado clnico. O TSH pode estar elevado por interveno
farmacolgica. Domperidona, amiodazona, iodo, fenobarbital e fenitona causam
aumento no nvel de TSH. Um decrscimo em TSH foi relatado com a administrao
de propanolol, metimazol, dopamina e D-tiroxina. Variaes genticas ou
degradaes de TSH intacto em subunidades podem afetar as ligaes
caractersticas de anticorpos e influenciar no resultado final.

VALORES ESPERADOS:
Resultados a partir de estudos com uma populao eutireide:
Faixa normal: 0,3 4,0 mUI/L de TSH.
Cada laboratrio deve estabelecer seu prprio valor esperado utilizando
equipamentos, mtodos de coleta de sangue e tcnicas de teste comumente usadas
num laboratrio.

REPETIBILIDADE:
N Mdia (mUI/L) DP (U/mL) % CV
12 0,36 0,02 5,56
12 1,34 0,037 2,76
12 12,9 0,38 2,97
12 28,4 1,09 3,85

REPRODUTIBILIDADE:
N Mdia (mUI/L) DP (U/mL) % CV
12 0,36 0,016 4,58
12 1,34 0,04 3,32
12 12,7 0,59 4,68
12 27,2 1,62 5,9

SENSIBILIDADE ANALTICA:
A sensibilidade analtica de 0,03 mUI/L de TSH.

ESPECIFICIDADE ANALTICA:
A especificidade analtica do TSH foi verificada testando substancias potenciais
reao cruzada. Estas substncias foram adicionadas a um soro de matriz normal
com vrias concentraes e suas respectivas doses respostas foram comparadas
com aquelas com tirotropina purificada.


Substncia Reatividade Cruzada, %
TSH 100
Gonadotrofina Corinica (hCG) < 0,01
Hormnio Folculo Estimulante (FSH) < 0,01
Hormnio Luteinizante < 0,01

SUBSTNCIDAS INTERFERENTES:
Substncias Concentraes
cido Acetilsaliclico 0,5 mg/mL
cido Ascrbico 0,4 mg/mL
Bilirrubina 0,3 mg/mL
Glicose 5 mg/L
Hemoglobina 12 mg/mL
Triglicrides 12 mg/mL
Fenilbutazona 0,17 mg/mL
Fenitoina 0,04 mg/mL
cido Saliclico 1 mg/mL

Nenhum interferente foi observado nas concentraes das amostras mostradas
acima. A recuperao da concentrao inicial de TSH (0,25; 1,15; 3; 7,5 e 15
mUI/mL) para as substncias testadas foi de 100%.

COMPARAO DE MTODOS - EXATIDO:
TSH foi comparado com um mtodo ELISA clssico e outro de quimioluminescncia.
Um total de 128 amostras foram utilizadas. As amostras foram provenientes de um
grupo de 69 hipertireoidiano, 47 eutiroidiano e 12 hipotireodianos.
Os resultados foram avaliados por uma analise de regresso no paramtrica de
acordo com Passing & Bablok:

Mtodo de Quimioluminescncia
Y = 0,0000 + 1,0000 X
A= 0,0000 (-0,0103 a 0,0166)
B= 1,0000 (0,9474 a 1,0301)

Mtodo de ELISA Clssico
Y = 0,0000 + 1,0746 X
A= 0,0000 (-0,0103 a 0,0166)
B= 1,0746 (1,0438 a 1,1581)
Os resultados demonstram que existe apenas um bias insignificante entre os
mtodos avaliados.

APRESENTAO:
Referncia N. testes
54030 96

DEPARTAMENTO DE SERVIOS ASSOCIADOS:
Para esclarecimentos de dvidas do consumidor quanto ao produto:
Telefax (31) 3067-6400 E-mail: invitroms@invitro.com.br
N. DO LOTE, DATA DE FABRICAO, DATA DE VALIDADE VIDE RTULO DO
PRODUTO.

BIBLIOGRAFIA:
1. Barker, S.B., Determination of Protein Bound Iodine, Journal Biological Chemistry
173, 175 (1948).
2. Chopra, I.J. et al., A Radioimmunoassay of Triiodothyronine, J. Clinical Endocrinol.
33, 865 (1971).
3. Young, D.S. et al., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, Clinical
Chemistry 21, 3660 (1975)
4. Sterling, L., Diagnosis and treatment of Thyroid Disease, Cleveland CRC Press,
p.19 - 51 (1975).
5. Demers L. M. et al., NACB Laboratory Medicine Practice Guidelines, Laboratory
Support for the Diagnosis of Thyroid Disease 13, 33 (2002)
6. Kratzsch J. et al., Clinical Chemistry 51, 1480 (2005)

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Reg. M.S. 10303460181

SIGNIFICADO DOS SMBOLOS UTILIZADOS NOS RTULOS DO PRODUTO


O contedo suficiente para <n> testes



Data limite de utilizao



Limite de temperatura (conservar a)



Nmero do Catlogo



Consultar Instruo de Uso



Nmero do lote



Produto Diagnstico In Vitro



Data de Fabricao