Testes imunoensaios começaram a ser utilizados como tecnologia padrão na medicina

laboratorial. E cada vez esses testes ficam mais automatizados, porém a manipulação humana
ainda é um ponto indispensável na fase analítica e pós-analítica, principalmente para o
processo de validação dos resultados. O processo de validação de resultados é vital na
prevenção de erros e interpretação de resultados.
Reações de precipitação, levam em consideração uma gama de fatores físico-químicos e
imunológicos de interferência na reação, porém a formação de imunocomplexos antígeno-
anticorpo, como suas determinadas concentrações, são as partes mais importantes. É uma
reação reversível e obedece a uma constante de associação (Ka). Quando as quantidades de
antígeno e anticorpo são equivalentes há formação máxima de precipitado, quando um dos
reagentes está em excesso, entramos na pró-zona (excesso de anticorpo) ou na pós-zona
(excesso de antígeno). Devido a reversibilidade da reação, o excesso de um reagente pode
causar á dissociação do precipitado, gerando uma interpretação e um resultado errados.
Dentre as reações de precipitação estão dois testes, o de imunodifusão radial dupla e o teste
de imunodifusão radial simples.
Reações de separação eletroforética são testes onde partículas carregadas sofrem migração
em um solvente condutor sob a influência de um campo elétrico. E o movimento das
moléculas no campo elétrico depende principalmente da carga, que é determinada pelo pH do
suporte. Com a ionização das moléculas de proteínas, elas migram ao eletrodo com a carga
oposta. Sendo assim adotada para separação em métodos como imunoeletroforese e
imunofixação. Porém a imunofixação deve ser feita caso um pico de proteínas séricas é
encontrado na eletroforese ou quando há suspeita de gamopatia monoclonal.
Reações de dispersão da luz que utilizam soluções coloidais, pois tem a característica de
dispersão da luz. Quando um feixe de luz atravessa um meio contendo partículas, ele é
dispersado para todas as direções graças ao efeito Tyndall, que também não altera o
comprimento de onda da luz e indefere do tipo de partícula analisada. Entre os testes estão o
teste nefelométrico que é totalmente automatizado e mede a intensidade de luz dispersa e o
teste de turbidimetria que está sujeito às mesmas condições que o teste nefelométrico, porém
ele mede a absorbância da luz transmitida e não a intensidade de luz dispersa.
Reações de aglutinação acontecem quando o anticorpo reage com um antígeno multivalente
em uma partícula insolúvel, que pode ser um antígeno insolúvel nativo, antígenos expressos
por células (Ex: antígenos eritrocitários) ou partículas cobertas com antígenos (Ex: partícula
de Látex). Estes testes têm boa sensibilidade e podem ser analisadas por inspeção visual,
porém as reações de aglutinação podem dar resultados falso-positivos devido à sua baixa
inespecificidade de aglutinação. Entre esses testes incluem reação de aglutinação direta,
reação de aglutinação passiva ou indireta, reação de inibição de aglutinação, teste de
aglutinação do látex, teste de aglutinação de cristais de colesterol e o teste de Co aglutinação.
Estes testes podem ser utilizados respectivamente para alguns tipos de exames, exemplos:
tipagem sanguínea, teste de sorologia variada, presença de hormônio da gonadotrofina
crônica (hCG) como teste de gravidez, detecção de fator reumatoide IgM, dirigido contra
isotipos de IgG, IgA, Igm ou IgE, pesquisa de anticorpos cardiolipídicos da sífilis ou
presença de auto-anticorpo da síndrome anti-fosfolípide primária ou secundária associado ao
lúpus eritematoso sistêmico, reação antígeno-anticorpo com partículas de Staphylococcus
aureus.
Ensaios líticos consistem em dois testes. O primeiro se chama reação de fixação do
complemento e se baseia na realização da detecção de um anticorpo específico no soro do
paciente utilizando antígeno, complemento que é ativado separadamente e eritrócitos. Caso
haja presença de anticorpo na amostra, irá se ligar ao antígeno específico. O segundo teste se
chama ensaio de neutralização, é semelhante ao primeiro, mas é aplicável somente onde o
anticorpo a ser medido é dirigido contra hemolisina (toxina bacteriana capaz de lisar
diretamente os eritrócitos).
Ensaios com marcadores fluorescentes usam fluorocromo (ou fluoróforo) que é uma
substância que absorve luz de comprimento de onda menor e emite luz de comprimento de
onda maior quando excitado. O intervalo de tempo entre a absorção de energia e a emissão da
fluorescência é muito curto. Dentro desta reação estão os testes fluorescentes homogêneos de
modulação direta e testes fluorescentes heterogêneos, que abrange os testes: reação de
imunofluorescência direta, reação de imunofluorescência indireta, citometria de fluxo e
ensaios de citometria de fluxo baseado em partículas multiplex.
Temos também:
Ensaios imunohistoquímicos, consistem em 2 testes, o de imunoperoxidase que é semelhante
á o ensaio de imunofluorescência indireta onde a presença do anticorpo é identificada
visualmente no substrato antigênico. Porém a imunoperoxidase indireta o conjugado é
marcado com uma enzima (principalmente peroxidase), que reage com seu substrato
produzindo um composto que pode ser visto em um microscópio ótico. O segundo teste é o
de imunocitoquímica que envolve a avaliação microscópica computadorizada após ensaio de
imunofluorescência ou imunoistoquímica em material de biópsia. Onde há aumento da
especificidade, devido a remoção da subjetividade do observador, podendo ser realizada a
avaliação quantitativa através da análise de cor, intensidade e concentração.
Ensaios com marcadores radioativos como o radioimunoensaio são testes radioativos que
utilizam um reagente marcado, antígeno ou anticorpo para quantificar o antígeno ou o
anticorpo da amostra. O composto desconhecido pode ser determinado pela medida da
radioatividade emitida. O método in vitro chamado “raioallergosorbent test” detecta
anticorpos IgE (ou IgG) alérgeno-específicos.
Nos ensaios luminescentes temos os ensaios quimioluminescentes e
eletroquimioluminescência. O primeiro é baseado na emissão de luz produzida em algumas
reações químicas de oxidação, incluídos agentes quimioluminescentes derivados
biologicamente. A emissão de luz pode ser mensurada utilizando luminômentros com tubos
fotomultiplicadores e são altamente sensíveis. Já o segundo também chamado de
quimiluminescência eletrogerada envolve reações de transferência de um elétron na
superfície de um eletrodo com geração de composto instável que está excitado e que emite
um fóton de luz. Este teste pode ser usado em análise de DNA, dosagem de hormônios,
marcadores tumorais entre outros.
Ensaios com marcadores enzimáticos, o enzimaimunoensaio é o termo genérico para muitos
testes que permitem ensaios quali- e quantitativos, para detecção tanto de antígenos quanto de
anticorpos. Estes testes usam o produto da mudança de cor devido a interação da enzima com
seu substrato para medir a reação entre antígeno anticorpo. Este termo abrange os testes:
 1. “Enzyme multipled immunossay technique” (EMIT): é um teste homogêneo de fase
única em que o antígeno que vai ser medido compete com o antígeno marcado com
enzima, por um número limitado de anticorpos. Já o anticorpo reagente tem a
capacidade de bloquear a atividade enzimática ao ligar-se ao antígeno marcado,
impedindo assim a formação do produto quando o substrato é adicionado. O antígeno
marcado livre reage com o substrato e forma um produto corado equivalente à
concentração de antígeno presente na amostra.
2. “Enzyme linked immunosorbent assay” (ELISA) trata de uma técnica sensível,
heterogênea de múltiplas fases para quantificação de antígenos ou anticorpos. Onde
um dos reagentes e imobilizado na fase sólida, enquanto outro pode ser ligado a uma
enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do
anticorpo, que pode ser indireto, sanduiche ou competitivo.
3. ELISA com captura de IgM: é um teste desenvolvidos para sanar o problema da
interferência do fator reumatoide na presença de anticorpos IgG específicos. Consiste
em anticorpos anti-IgM adsorvidos à fase sólida, capazes de fixar todos os anticorpos
de isótipo IgM da amostra do paciente. Após, o antígeno é adicionado, ligando-se ao
anticorpo específico da amostra anteriormente imobilizado. Em seguida um segundo
anticorpo anti-antígeno marcado com a enzima é adicionado e o substrato forma um
produto corado de intensidade proporcional à concentração de IgM específico
presente na amostra.
4. Enzimaimunoensaio com Micropartículas (MEIA): é uma técnica em que o suporte
sólido consiste de pequenas micropartículas em suspensão líquida.
Marcadores enzimáticos também tem o procedimento de Western Blotting. Que é um
procedimento em que as proteínas são separadas pelo tamanho por eletroforese e, após a
separação, transferidas para uma membrana de nitrocelulose onde ficam imobilizadas. A
membrana é utilizada como suporte sólido para um ensaio imunoenzimático, semelhante ao
de imunoperoxidase.
Com testes de sorologia podemos também avaliar imunidade celular e funções fagocíticas.
Que são aspectos importantes da função imunológica, como a resposta imune celular e as
funções de quimiotaxia e explosão oxidativa de células fagocíticas.
Entre as análises de avaliação celular estão: avaliação da função das células T, que se divide
em:
-Contagem absoluta de linfócitos.
-Contagem das subpopulações de linfócitos.
-Análise funcional dos linfócitos (a citometria de fluxo na avaliação da ativação e
proliferação dos linfócitos).
-Teste cutâneo de hipersensibilidade tardia (DHT).
-Produção de citocinas.
-Ensaios de citotoxicidade.
Em relação a avaliação das funções fagocíticas: oxidação e quimiotaxia podemos mostrar
alguns exemplos da aplicação clínica dos testes de avaliação de imunidade celular, como:
 -Indicações clínicas para os ensaios de avaliação da função fagocítica, Ex: como
auxiliar à terapia pós-radiação e quimioterapia para doenças malignas, ou no tratamento da
imunodeficiência adquirida, porém novos testes de laboratório são necessários para avaliar a
eficácia do tratamento.
-Procedimentos laboratoriais:
-Isolamento de neutrófilos e monócitos.
-Ensaio de atividade microbiana.
-Ensaio de quimiotaxia.
-Ensaio na lâmina do NBT (nitroblue tetrazolium).
-Ensaio com a diclorofluoresceína.
-Imunofenotipagem.

Ainda podemos medir a dosagem de citocinas intracelulares. As citocinas são polipeptídios

secretados por uma variedade de células em resposta a vários estímulos, mediando efeitos
autócrinos, parácrinos e endócrinos, que são pleiotrópicos e redundantes. As citocinas
imunologicamente relevantes são aquelas formadas por células imunes (monocinas e
linfocinas) e/ou influenciam a sua função. A princípio as citocinas são detectáveis em três
níveis:
1. Pelo uso da reação em cadeia da polimerase (PCR), a expressão do RNA mensageiro dos
genes das citocinas pode ser detectada e, com novas técnicas, até mesmo quantificada.
2. Através de bioensaios e enzimaimunoensaios podemos estimar a síntese de proteínas. A
detecção da produção intracelular de citocinas pode ser avaliada através da técnica
imunocitológica ou imunoistológica.
3. Detecção da formação de citocinas pela análise dos produtos da atividade das citocinas.