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Imunologia 2 parte

Aplicaes prticas (alguns exemplos)


Tcnicas laboratoriais para diagnstico e
monitorizao
da doena alrgica
das imunodeficincias primrias:
Testes que avaliam os componentes
humoral e celular do SI
Tcnicas que avaliam as protenas antignicas
(alergenos) na doena alrgica

Imunologia 2 parte
Avaliao da resposta humoral:
Doseamento de imunoglobulinas
IgE total e IgE especficas
IgG e subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4
IgA
Interaco
IgM
antignio-anticorpo

Avaliao da resposta celular:

Subpopulaes linfocitrias
Proliferao linfocitria (TTL)
Basotest
CAST

Anticorpos
monoclonais
Imunofluorescncia

Interaco antignio-anticorpo
Base dos mtodos imunoqumicos para
quantificao de Ag/Ac.
Baseia-se na lei de aco das massas em
que o Ag livre e o Ac livre interagem
reversivelmente para formar complexo ag-ac.
Constante de equilbrio ou afinidade - Ka
Ka=k1/k2= (Ag-Ac)/(Ag)(Ac)

Aumento das concentraes de antignio


adicionadas a uma quantidade fixa de
anticorpo
Curva de precipitao

Anticorpos monoclonais
Anticorpos produzidos apenas por um
clone de clulas
Especificidade
Reprodutibilidade

Identificao e doseamentos
Diagnstico
Humoral
Fenotipagem celular / contagem
Quantificao de protenas em amostras
Teraputica
Anti-neoplsica
Anti-inflamatria
Outras

Imunofluorescncia directa e indirecta


Extensivamente utilizada para
deteco de anticorpos e
antignios

Anticorpos

protenas estveis, facilmente


marcadas com radioistopos,
enzimas e fluorocromos

Avaliao da resposta humoral:


1 Immunoassay:
RIA radioimmunoassay
Berson and Yalow
Prmio Nobel da Medicina, 1960

Immunometric assays

enzime-coupled (detection) antibody


solid-phase (capture) antibody
Minimiza as ligaes no especficas
pelas lavagens consecutivas e
maximiza a especificidade pela
utilizao dos anticorpos de captura e
deteco especficos para a
molcula em estudo

UniCAP

Avaliao da resposta humoral:


Testes Laboratoriais IgE
Teste

O que mede

Cut-off

IgE Total

Totalidade da IgE srica

Varia com a idade

IgE Especfica Rast


Multi-Rast
Phadiatop

Totalidade da IgE especfica a


um alergnio
IgE especfica a cinco
alergnios do mesmo grupo
IgE especfica a alergnios de
grupos diferentes

>0,35KUa/l
>0,35KUa/l
Sim / No

IgE Total

IgE Especfica
Rast
Ac anti-IgE
marcado
IgE srica

Fase slida com Ac anti-IgE

ImunoCAP

Phadiatop

Multi-Rast

ImunoCAP

IgE TOTAL

IgE TOTAL

Tcnicas que avaliam as protenas antignicas


(alergenos) na doena alrgica
Amostras separadas em gel

Transferncia para membrana de


nitrocelulose

Incubao com anticorpo especifico

Conjugao com marcador


radioactivo
para deteco do anticorpo

Bandas com anticorpo so visveis


aps
radiografia

Rabo de Gato
Phleum Pratense

Extraco

Rabo de Gato
Phleum Pratense

Extraco

Padro proteico de doentes alrgicos por immunobloting

Evoluo no diagnstico em alergologia

Clin Exp. Allergy 2003; 7-13

Tecnologia de DNA recombinante


Caracteriza alergenos importantes
a nvel molecular
Diagnstico baseado nos extractos
Identifica a fonte alergnica
No revela as molculas relevantes
para expresso da doena

Os alergenos major das fontes


alergnicas mais frequentes
foram identificadas e produzidas
de forma recombinante
Ex. plenes, caros, epitlios,
fungos e venenos

Clin Exp. Allergy 2003; 7-13

Alergnios recombinantes - tcnica


mRNA
extraction

poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)

cDNA synthesis, cloning and


selection of cDNA clones encoding
individual allergenic proteins

Allergy-eliciting
biological material

Extraction,
Immobilization
on solid phase

Production of recombinant allergens,


Immobilization on solid phase

Standard Allergen
ImmunoCAP
Pharmacia-Diagnostics

Recombinant Allergen
ImmunoCAP

Standardization and
research reagents

3
7

3 8
7 18

3 12
7 27

4 5
9 11

3 9 5 6 10 11 7 6 5 6 6 13 1 4 5 7 15 6
7 20 11 1 3 22 24 16 1 3 11 13 13 29 3 1 11 16 33 1 3

4
9

2 7 3 9 4 , 1 /1 5

45

1 2 8 1 6 , 1 /2 0

43 44

2 7 3 6 6 , 1 /1 5

2 8 5 3 7 , 1 /1 3

41 42

2 7 6 6 4 , 1 /1 3

40

2 7 8 2 1 , 1 /1 2

39

2 7 8 4 7 , 1 /1 1

2 0 2 0 4 , 1 /1 0

37 38

1 5 1 4 5 , 1 /1 0

36

2 7 2 6 7 , 1 /8

35

2 1 7 5 7 , 1 /8

2 7 7 3 0 , 1 /7

33 34

2 5 5 8 2 , 1 /7

32

2 5 9 8 6 , 1 /5

1 8 0 1 3 , 1 /5

1 5 8 3 9 , 1 /5

28 29 30

1 4 3 4 7 , 1 /5

27

1 4 3 3 0 , 1 /5

1 1 5 6 8 , 1 /5

9 7 1 3 , 1 /5

24 25 26

2 7 4 1 6 , 1 /4

23

2 3 3 6 6 ,l 1 /4

2 8 5 4 3 , 1 /3

2 7 0 6 4 , 1 /3

4
9

20 21 22

2 5 5 8 5 , 1 /3

3
7

19

2 3 3 6 4 , 1 /3

16 17 18

2 0 2 2 8 , 1 /3

M a tc h
N am e
236
210
181
176
168
157
147
126
120
117
115
104
100
8 7 ,2
83
80
77
7 3 ,8
72
6 8 ,6
6 3 ,1
5 6 ,4
5 4 ,1
53
45
43
39
3 8 ,1
3 5 ,7
3 3 ,6
32
29
2 7 ,3
2 5 ,4
23
2 2 ,4
2 1 ,3
1 8 ,8
17
1 6 ,3
15
14
1 2 ,8
12
10
co unt 1 2 6 9 11 11 5 5 14 9 7 5 12
%
2 7 13 20 24 2 4 11 11 31 2 0 16 11 27

15

27266,

12 13 14

26589,

11

23991,

10

23365,

25730

2 0 111 ,

23474

15173,

27361

14338,

23471

18674

28538,

Phl p1
Phl p5

27703,

Rabo de Gato
Phleum Pratense

15174

2 7 6 1 3 , 1 /4

A l l e r g o g r a m g 61 A 12
L ane
N am e->

20097

Allergograma (Phleum pratense)

4 7 5 7 6
9 16 11 16 13

Diagnstico in vitro de alergia


alergnios recombinantes

Diagnstico in vitro da alergia (Presente)

Valenta,R. et all, Clinical Experimental Allergy, 1999, vol 29, 896-904


GAILL-2003

Diagnstico in vitro de alergia


alergnios recombinantes
kUA /l

kUA /l

kUA /l

kUA /l

kUA /l

kUA /l

kUA /l

kUA /l

kUA /l

Valenta,R. et all, Clinical Experimental Allergy, 1999, vol 29, 896-904


GAILL-2003

MICROARRAY de alergnos: tcnica


Cada placa apresenta 800 de spots
para diferentes alergenos
At 12 soros diferentes podem ser testados
simultaneamente, com 15L de soro diludo
IgE detectada com anti-IgE marcada
com fluorocromo
Microarray scanner

Microarray software analysis

Perfil de reactividade do
doente atpico
Clin Exp. Allergy 2003; 7-13

9600 ELISAs em 2 horas

Imunologia 2 parte
Avaliao da resposta humoral:
Doseamento de imunoglobulinas
Interaco
antignio-anticorpo

Avaliao da resposta celular:

Subpopulaes linfocitrias
Proliferao linfocitria (TTL)
Basotest
CAST

Anticorpos
monoclonais
Imunofluorescncia

Citometria de
fluxo

Avaliao da resposta celular:


Leuccitos do sangue perifrico

Neutrofilo

Eosinfilo

Basfilo

Moncito

Linfcito

Plasmcito

Avaliao da resposta celular:


Subpopulaes linfocitrias citometria de fluxo

Avaliao da resposta celular:


Subpopulaes linfocitrias citometria de fluxo

Avaliao da resposta celular:


Subpopulaes linfocitrias citometria de fluxo

Avaliao da resposta celular:


Subpopulaes linfocitrias citometria de fluxo

Avaliao da resposta celular:


Subpopulaes linfocitrias citometria de fluxo

Avaliao da resposta celular:


Subpopulaes linfocitrias citometria de fluxo

M1
M2

Estudo da proliferao linfocitria:


Teste de transformao linfocitria (TTL)
Deteco de linfcitos sensibilizados a um antignio, avaliando a
sua resposta proliferativa quando em presena desse antignio
Aplicaes:
Avaliao da resposta imunitria a um antignio
Estudo de imunodeficincias
Mitognios
Candida albicans

Avaliao de reaces de hipersensibilidade


Frmacos

Estudo da proliferao linfocitria:


Teste de transformao linfocitria (TTL)
Tcnica:

Separao de clulas mononucleadas (gradiente de densidade - ficoll)


Distribuio por poos
Estimulao com o antignio em estudo (frmacos vrias concentraes)
Controlos positivo e negativo
Cultura vrios dias
Adio de radionuclido (timidina tritiada)

Avaliao da resposta proliferativa


incorporao do radionuclido (contador de cintilaes)
Clculo do indice de estimulao razo entre a resposta das culturas
estimuladas e no estimuladas (controlo negativo)

TESTE DE ACTIVAO DE BASFILOS

marcador directo de
activao celular

CD 63 / CD 203c
Dupla marcao
Anti-IgE/CD203c

Aps exposio
ao alergeno a expresso
aumenta at 300%

marcador indirecto
de libertao de histamina

Apresenta boa sensibilidade e especificidade

TESTE DE ACTIVAO DE BASFILOS


CITOMETRIA DE FLUXO
Apreciao de reaces IgE mediadas
Determinao da percentagem de
basfilos activados
Estimulao in vitro com alergnios
especficos
Boa correlao com outros testes in
vitro e in vivo
Sangue heparinizado, CN e CP,
incubao com o alergeno (diferentes
concentraes), incubao com ac
monoclonais, leitura no citmetro

SPAIC-OUTUBRO /2003

TESTE DE ACTIVAO DE BASFILOS

TESTE DE ACTIVAO DE BASFILOS


Limitaes
Utilizao de frmacos em forma injectvel ou liofilizados solveis em
soluo tampo

sempre necessria a correlao com os dados clnicos para uma


interpretao correcta dos resultados e apreciao critica e
objectiva dos mesmos
Pode ser til como diagnstico complementar em doentes com
histria de HS a frmacos
Poder ser uma alternativa a provas de provocao

SPAIC-OUTUBRO /2003

TESTE CELULAR DE ESTIMULAO


ANTIGNICA - CAST
So quantificados os sulfidoleucotrienos: LTC4, LTD4, LTE4 nos
leuccitos aps contacto destes com o alergnio
A libertao destes mediadores pode ser devida a mecanismos
mediados ou no por IgE

Disponvel para
Antibiticos:

Penicilina, Ampicilina /Amoxicilina


Cefalosporina, Cefuroxime
Trimethoprim, Sulfametoxazol
Tetraciclina
Ciprofloxacina

Analgsicos:
Aspirina, Diclofenac, Ibuprofeno, Indometacina
Paracetamol, Metamizol

Anestsicos
Miorelaxantes

Cellular Antigen Stimulation Test


1. Antigen Stimulation

sLT

sLT
A

Transfer leukocytes, centrifuge,


remove/discard upper phase
+ stimulation buffer (IL-3)

Dextran sedimentation
and 90 minutes incubation

Whole-blood
EDTA

sLT

A
A

Supernatants can be harvested,


after centrifugation store at
- 20 C until ELISA test

Leukocyte suspension,
+
antigen
(40 min incubation)

+
Antigen

Cellular Antigen Stimulation Test


2. ELISA-Procedure
Enzym
sLT sLT

Enzym
sLT

2 h incubation,
wash 3 times
Supernatant
+
monoclonal antibody

+
substrate

Enzym Color

Reading at
405 nm

sLT

+
stop-solution

30 min incubation,
wash 3 times

Imunologia 2 parte
Avaliao da resposta humoral:
Doseamento de imunoglobulinas
IgE total e IgE especficas

Interaco
antignio-anticorpo

Tcnicas que avaliam as protenas


antignicas (alergenos) na doena alrgica

Anticorpos
monoclonais

Avaliao da resposta celular:

Imunofluorescncia

Subpopulaes linfocitrias
Proliferao linfocitria (TTL)
Basotest
CAST

Citometria de
fluxo