Imunologia Geral e

Laboratorial
Profa. Mila Muraro
Bióloga – Esp. em Análises Clinicas e Msc. Microbiologia e Imunologia
Atenção para os Anticorpos!

 Todas as imunoglobulinas são produzidas pelos linfócitos

B cada uma o seu tempo, o tipo de Imunoglobulina que
será produzida dependerá em grande parte do
microambiente que circula a célula, o tipo de Antígeno
e a forma como ele penetrou no organismo.

 São conhecidos 5 classes diferentes de Imunoglobulinas,

(IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) cada uma com características
próprias.
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pg
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Imunologia Clínica/Laboratorial

 Objetivo: pesquisa de antígenos, anticorpos ou

imunocomplexos.

 Rapidez, simplicidade de execução, possibilidade de

automação e baixo custo operacional.
Testes Sorológicos ou Imunoensaios

 Técnicas para a detecção e/ou quantificação de antígenos e

anticorpos, ou outras substâncias que desempenhem o papel de
antígeno no ensaio, tais como drogas, hormônios, DNA, RNA ou
citocinas, por exemplo.

 As técnicas sorológicas estão baseadas na capacidade dos

anticorpos em reconhecer antígenos em solução ou sobre
superfícies celulares, nas suas conformações naturais.
Conceitos Fundamentais

 Afinidade do Anticorpo - corresponde à ocupação de metade

dos sítios combinatórios dos anticorpos presentes

 Anticorpo de alta afinidade – estrutura com boa

complementaridade, que engloba praticamente toda a
molécula do hapteno.

 Anticorpo de baixa afinidade – só reconhecem uma pequena

porção do determinante antigênico, sendo pouco
complementares. Podem reagir com outras moléculas, gerando
as reações cruzadas.
Natureza das forças que atuam na
reação Antígeno-Anticorpo (Ag-Ac)

 Propriedade Hidrofóbica (cadeias laterais de valina, leucina e

fenilalanina)
 Forças de Coulomb (entre os grupos ionizados –NH3+ e – COO- das
cadeias laterias de proteínas)
 Pontes de Hidrogênio
 Forças de Van der Waals
Efeito/Fenômeno Prozona

 Precipitados já formados podem dissolver-se quando expostos a uma

quantidade excessiva de um dos reagentes, devido à reversibilidade
da ligação Ac-Ag

 O efeito PROZONA ocorre quando há excesso de anticorpos, o que

pode causar erros de interpretação dos resultados, sendo necessária a
titulação do Ac com quantidades fixas de Ag, para evitar tais erros.
AGLUTINAÇÃO

 É caracterizada pela formação de agregados visíveis como

resultado da interação de anticorpos específicos e partículas
insolúveis que contém determinantes antigênicos na superfície.

 Teste altamente sensível, utilizado no diagnóstico de vírus,

bactérias, protozoários e fungos; doenças autoimunes; detecção
de hormônios e tipagem de grupos sanguíneos.

 De fácil execução (leitura visual) e baixo custo, apresenta boa

especificidade e reprodutibilidade.
TESTE DE AGLUTINAÇÃO DIRETA
 Usam-se partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra ou
fragmentada
 Hemácias, bactérias, fungos e protozoários podem ser aglutinados
diretamente por Ac
Exemplos:
 Tipagem sanguínea AB0
 Toxoplasmose
 Salmoneloses (teste de Widal)
 Tripanossomíase
 Leptospirose
 Brucelose (teste de Wright)
 Ricketsioses (teste de Weil-Felix)
TESTE DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA

 (Ag + Partícula Inerte) + Ac = Aglutinação

 Partículas inertes:
Hemácias/látex/bentonita/sepharose/colódio/charcoal/leveduras.

 podem ser sensibilizadas por adsorção passiva (contato direto com o

antígeno solúvel), por adsorção via agente químico (ácido tânico e
cloreto de cromo), por conjugação do Ag (ligações químicas
covalentes).
AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX

 Partículas de látex são esferas de poliestireno utilizadas

como suporte na adsorção. Empregado na pesquisa de Ag
ou Ac, sendo a aplicação mais comum é na detecção de
fator reumatoide (FR), proteína C reativa (PCR), além do
ASLO (anti-estreptolisina O) e Waaler Rose.
AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX - FATOR REUMATÓIDE

 IgG adsorvida ao látex  haverá exposição dos determinantes que

reagem contra o FR, resultando em aglutinação.
 Se não houver aglutinação, resultado negativo.
AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX - PROTEÍNA C REATIVA:

 Detectada no soro de pacientes na fase aguda de algumas

doenças.

 É detectada sua presença com partículas de látex

contendo anticorpos anti-proteína C reativa.

 Pode ocorrer normalmente no organismo da pessoa; é

necessário fazer diluições, para evitar o efeito prozona.
 Floculação – VDRL (Veneral Disease
Research Laboratory)

 Emprega cristais de colesterol que são sensibilizados com lecitina e cardiolipina

bovina, para pesquisa de anticorpos para a sífilis.

 Detecta Ac anti-fosfolipídicos que se formam no hospedeiro, como resposta ao material

de natureza lipídica, liberado pelas células lesadas no início da infecção e ao material
lipídico do próprio treponema.

 Leitura, após agitação, será positiva se ocorrer a formação de flóculos.

 Demanda diluição (liberação do valor titulado e efeito prozona).

Floculação – leitura do resultado é
sempre por microscopia
Placa escavada (vidro)
Reações de Imunofluorescência
Reações de Imunofluorescência

 Baseia-se na visualização do reconhecimento entre Ag e Ac.

 Utiliza-se neste caso um corante fluorescente (fluoresceína ou

rodamina B)para observar esta reação.

 Existem dois tipos de reações utilizadas na rotina laboratorial, para

pesquisa de Ag que é a imunofluorescência direta (menos comum) e
para pesquisa de Ac a imunofluorescência indireta que é a mais
comum e utilizada com maior frequência.
Uso clínico

 Toxoplasmose
 Leishmaniose
 Doença de Chagas
 Sífilis (FTA-Abs)
 HTLV
 HIV
 Algumas doenças autoimunes
Materiais Necessários

 Corante fluorescente/fluoresceína
 Microscópio de Fluorescência/Luz U.V.
Reação de Imunofluorescência Direta
(RIFD)
 É utilizada para a pesquisa dos Ags presentes na amostra.

 Énecessário ter um conjugado para cada Ag diferente.

 Em relação ao método indireto, a reação direta é menos específica

(principalmente devido ao tipo de amostra que utiliza) e, para a sua
interpretação, é necessária grande experiência e conhecimento da
morfologia da amostra.
Etapas de Montagem da Amostra

 A amostra (geralmente secreções) é colhida em lâmina de microscopia e fixada por

metanol.

 A seguir, é colocado um conjugado formado por um Ac monoclonal produzido contra o

Ag que se quer identificar ligado ao corante fluorescente.

 Após período de incubação para que ocorra a reação, a lâmina é lavada e montada
com glicerina e lamínula, e observada em microscópio de fluorescência.
Reação de Imunofluorescência Direta
(RIFD)
 É utilizada para pesquisa de Ac presente na amostra

 O tipo de amostra mais utilizado é o soro.

 O conjugado é constituído de uma imunoglobulina animal anti-Ig

humana ligado a um corante fluorescente.

 É uma reação muito mais específica e estável do que a

imunofluorescência direta.
 Ensaios Imunoenzimáticos (EIA)
 Este teste é baseado também na utilização de um marcador ligado a
imunoglobulina, e neste caso o marcador é uma enzima.

 A visualização do resultado também se baseia na mudança de coloração,

esta mudança é avaliada em um equipamento que transforma a
intensidade de cor em valores numéricos e desta forma é possível
observar de forma mais segura a diferença entre amostras positivas e
amostras negativas.

 De uma maneira geral, quanto mais intensa a cor maior a positividade, se

a cor for muito clara ou próxima do incolor, a amostra será considerada
negativa.
Uso Clínico
 Hepatites (A, B, C, D, E)
 HIV
 HTLV
 Rubéola
 CMV
 Dengue
 Mononucleose
 Sífilis
 Doença de Chagas
 Toxoplasmose
 Dosagem de hormônios
 Dosagem de enzimas
Tipos de ELISA (Enzime Linked
Imunnosorbent Assay)
Ensaios Imunoenzináticos
Teste de Western Blott (WB):
 Também é um teste imunoenzimático, realizado num membrana
de nitrocelulose e com gel de poliacrilamida (eletroforese).

 Sobre esta membrana, são depositados Ags nativos (naturais) do

micro-organismo e estes Ags são colocados para reagir com as
amostras de soro.

 Caso a amostra seja positiva, os Acs presentes irão se ligar ao Ag

e, mais tarde, o conjugado irá se ligar a estes Acs.

 A presença do conjugado é revelada pela adição do substrato e

consequente mudança de cor.
Teste de Western Blott (WB):

 Utilizado somente em casos de confirmação de diagnóstico

sorológico por se tratar de um teste com maior especificidade e
alto custo

 Extremamente específico e é um teste fácil de realizar e

interpretar

 Seus resultados podem permanecer registrados e documentados

por um longo período de tempo.
Imunoeletroforese (Grabar e Williams)
ou Eletroforese de Proteínas
 É a combinação de eletroforese e imunodifusão dupla radial em gel de ágar.
 Realiza-se em dois tempos:

 1) Separação eletroforética, que permite a discriminação dos componentes da

mistura de antígenos por suas diferenças de cargas elétrica;

 2) Difusão desses componentes contra um anti-soro específico para esses

antígenos.
Imunoeletroforese (Grabar e Williams)
ou Eletroforese de Proteínas
 Assim, esse método permite a caracterização de uma substância,
simultaneamente, por 3 parâmetros:

 características eletroforéticas,
 difusibilidade,
 especificidade imunoquímica.
Imunoeletroforese (Grabar e Williams)
ou Eletroforese de Proteínas
 Alto poder reprodutivo, e permite distinguir até 30 componentes no soro
sanguíneo.
 Dois a cinco mililitros de soro são aplicados num poço de gel de ágar; com a
passagem de uma corrente elétrica, as proteínas do gel tendem a se separar,
de acordo com seu tamanho e cargas elétricas, nos 5 componentes básicos da
eletroforese de Tiselius:
 *Albumina
 *Alfa 1
 *Alfa 2
 *Beta
 *Gamaglobulina
Imunoeletroforese (Grabar e Williams)
ou Eletroforese de Proteínas
 Em função de seus coeficientes de difusão, e da sua concentração,
cada componente difunde-se, encontrando um anticorpo que lhe
corresponde - forma-se um precipitado em forma de ARCO, de maior
ou menor curvatura, dependendo da dispersão do antígeno, e cuja
intensidade é função da concentração do antígeno, mas tem certa
relação com a proporção Ag/Ac - numa eletroforese de
imunoglobulinas, no soro humano, as Ig's migram para o PÓLO
NEGATIVO, sendo isso explicado pelo fenômeno da ELETROSMOSE, que
é o TRANSPORTE DA ÁGUA LIGADA AOS ÍONS no sentido do polo
negativo.
O perfil eletroforético

 Com seu pico característico das proteínas homogêneas, deve sempre

acompanhar a interpretação da imunoeletroforese.

 Serve ao diagnóstico de índices de Ac (IgA, IgG e IgM) aumentados em

patologias como toxoplasmose, paracoccidiomicoses, infecções agudas,
helmintíases, esquistossomoses, tuberculose e processos variados
inflamatórios.

 Permite o estudo comparativo dos soros e fluidos corporais (N e P) como LCR,

urina, suor, saliva, muco nasal, líquido amniótico e ascítico, com finalidade
de diagnóstico ou especulativa.
Citometria de Fluxo

 Análise rápida, quantitativa e multiparamétrica de uma célula individual,

viva ou morta, entre diversas outras em uma população celular,
permitindo a caracterização, quantificação e seleção dessas células.

 Aplicações do método: análise quantitativa e separação de células,

investigação da expressão de moléculas intracelulares ou de membranas,
em populações celulares heterogêneas, substâncias marcadas com
FLUOROCROMOS (associados, em geral, a anticorpos monoclonais) são
usadas como marcadores das moléculas investigadas (e a análise é feita
com base na INTENSIDADE da fluorescência)
Citometria de Fluxo

 Técnica que exige um profissional bem treinado para executar:

tratamento das células com os marcadores fluorescentes.

 As células marcadas são postas numa câmara de fluxo contínuo onde

fluem em meio líquido, sendo alinhadas em fila única por uma
corrente de pressão de modo a passarem, uma a uma, por uma fonte
de excitação luminosa; os raios de luz são emitidos em todas as
direções , de maneira que cada célula é vasculhada individualmente;
as medidas da luz fluorescente emitidas pelos fluorocromos permitem
a quantificação de características antigênicas, bioquímicas, e
biofísicas.