Biotecnologia e Produção de Alimentos

TÉCNICAS DE
BIOLOGIA
MOLECULAR
Profª Haline Santiago
Métodos de purificação
de ácidos nucleicos
kits comerciais;
sensibilidade de detecção
diferente
Considerar:

• Origem ;
• Quantidade disponível;
• Método de preparação das
amostras;
• A intenção de uso do DNA;
• A simplicidade do Protocolo;
• Habilidade de automatizar a
extração
 EXTRAÇÃO E SUAS ETAPAS

01 02 03
LISE CELULAR REMOÇÃO DOS LIPÍDEOS REMOÇÃO DAS PROTEÍNAS
Rompimento da célula por Uso de detergentes / desnaturação proteica e
métodos químicos ou físicos centrifugação separação por meio de
centrifugação e
filtração.

04 05
REMOÇÃO DO RNA EXTRAÇÃO DO ÁCIDO NUCLEICO
Opcional; adição de Extraídos com fenol,
enzima RNAse ultracentrifugação ou métodos
cromatográficos e diluídos em etanol
 Separação eletroforética
e hibridização de ácidos
nucleicos
Aplicada às moléculas de DNA e/ou
RNA já extraídas* e separadas do conteúdo celular;

Separação de moléculas carregadas = passagem de

um campo elétrico;

*ENZIMA: ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO

 A técnica de eletroforese
é utilizada na investigação de enzimas,
hemoglobinas, DNA e proteínas;

Macromoléculas são submetidas a

um campo elétrico, na qual
migram para um polo positivo ou
negativo de acordo com a sua
carga

Os fragmentos de DNA
apresentam tamanhos diferentes.
A técnica de separação dos
fragmentos de DNA comumente
utilizada é a eletroforese através de
géis de agarose.
 HIBRIDIZAÇÃO DOS
POLÍMEROS DE NUCLEOTÍDEOS

Consiste em utilizar
uma fita simples para localizar um gene ou
molécula = liga-se com áreas marcadas

A molécula então passa por hibridização,

que consiste em ser adicionada de
nucleotídeos complementares à fita.
 Southern-blot
fragmentos de DNA, obtidos por endonucleases de
restrição e separados por eletroforese,
são imobilizados em uma membrana de nitrocelulose ou
náilon; uma sonda de DNA radioativa, contendo
a sequência de interesse, é hibridizada com o DNA
imobilizado na membrana que contém sequência
complementar a ela; em seguida,
a membrana é lavada para a retirada das sondas não
hibridizadas e exposta a um filme radiográfico para
detectar a radioatividade,
e só serão detectadas sondas hibridizadas pela sequência
específica do fragmento de DNA que se deseja
identificar
 Enzimas utilizadas na
manipulação in vitro de
ácidos nucleicos
Endonucleases de restrição : são capazes de
identificar determinada sequência de
nucleotídeos e agir sobre ela.

DNA ligase: reconstrói as ligações

Reação em cadeia da
polimerase – PCR
Amplificar a sequência = Aumentar a quantidade

TRÊS ETAPAS (20x a 30x):

1. Aquecimento : separação da fita dupla

2. ANELAMENTO = hibridizado por
incubação meio excesso oligonucleotídeos
= fita molde
3. DNA polimerase adiciona as bases
complementares = nova fita / duplicação
 O QUE SIGNIFICA O
EXAME RT-PCR PARA
COVID – 19?
 SEQUENCIAMENTO DE DNA

“por que conhecer a sequência completa

de bilhões de bases nitrogenadas do DNA de um
organismo?”

Dificuldade: obtenção de contigs

Método de Sanger, metodologia enzimática utilizada no Projeto do Genoma
Humano;
Consiste na detecção das bases nitrogenadas
adicionadas à fita molde de DNA pelo sinal
que emitem, luminescência ou fluorescência,
por exemplo, sendo registradas em picos que as
diferem entre si.
SEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNA
 Caso Prático em Sala de Aula

Médicos ginecologistas indicam às suas pacientes a realização do exame

Papanicolau pelo menos uma vez ao ano, que ocorre por meio da coleta
de material do colo do útero e tem, entre outros objetivos, identificar a
presença ou não do vírus HPV, causador do câncer de útero.
O diagnóstico precoce é muito importante para que o tratamento seja
bem-sucedido e controle os estágios mais graves da doença. Então, o
material amostrado é enviado ao laboratório de análise
e fica o seguinte questionamento: qual a metodologia o laboratório
pode utilizar na identificação da presença desse vírus?