UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA

Imunologia
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 2006

PROFª ÂNGELA DA COSTA PEREIRA PROFª INÊS APARECIDA TOZETTI PROFº ANDRÉ LUIS SOARES DA FONSECA

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SUMÁRIO
PARTE I

Técnicas de obtenção e conservação do material usado em Imunologia......................... Diluições......................................................................................................................... Cromatografia em Coluna................................................................................................ Eletroforese de proteínas................................................................................................. Princípio Teórico da Fixação de Complemento............................................................... Reação de Imunohemólise............................................................................................... Reação de Fixação do Complemento.............................................................................. Precipitação em meio semi-sólido................................................................................... Reação de Aglutinação.................................................................................................... Reação de Aglutinação Rápida para Pesquisa de Anticorpos Anti-Brucella................. Reação de Microaglutinação Passiva - Reação de VDRL............................................. Reação de Aglutinação indireta ou passiva Fator Reumatoide...................................... Imunohematologia Sistema ABO.................................................................................. Teste de Coombs Diagnostico da D.H.R.N................................................................... Reação de Inibição de Aglutinação Passiva.....................................................................
ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)………...........................

5 6 8 12 16 17 18 19 22 23 24 25 26 28 29 30 33

Reação de Imunofluorescência.........................................................................................

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PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Resistência Inespecífica................................................................................................ Células do Sistema Imune............................................................................................ Formação de Células T e B e Órgãos Linfóides........................................................... Antígeno....................................................................................................................... Imunoglobulinas (I)...................................................................................................... Imunoglobulinas (II).................................................................................................... Sistema Complemento................................................................................................. Fagocitose.................................................................................................................... Complexo Principal de Histocompatibilidade (CHP/MHC)......................................... Células Apresentadoras e de Antígeno e Mecanismo de Apresentação........................ Linfócitos T................................................................................................................... Linfócitos B e Resposta Primária e Secundária............................................................. Genética de Imunoglobulinas........................................................................................ Interação do Sistema Imune.......................................................................................... Tolerância Imunológica................................................................................................. Reações de Hipersensibilidade..................................................................................... Transplantes.................................................................................................................. Eletroforese................................................................................................................... 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 54 55

PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS E EXERCÍCIOS
Radioimunoensaio........................................................................................................... ELISA............................................................................................................................. Western blotting.............................................................................................................. Imunohistoquímica.......................................................................................................... Exercício sobre Resposta Imune às infecções.................................................................. Citometria de Fluxo......................................................................................................... Referências Bibliográficas............................................................................................... 57 58 59 60 61 62 65

Anexo Portaria 23 para normatização do diagnóstico sorológico da Brucelose............... 66

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4 PARTE I TÉCNICAS UTILIZADAS NAS AULAS PRÁTICAS 4 .

Se necessário armazenar o soro. CONSERVAÇÃO DO SORO . de 30 minutos à 1 hora após a punção. Este sangue deve ser passado instantaneamente para um frasco.Antes de se passar o sangue da seringa para o frasco. As hemácias se sedimentarão pela centrifugação e o sobrenadante se constituirá em uma amostra de soro isenta de hemólise e pronta para ser utilizada nas reações. seja no consultório.O laboratório se encarregará de centrifugação. . como fonte de material do indivíduo (seja o homem ou outro animal). .Você deverá também acondicionar em gelo. se for necessário uma estocagem por mais dias. o cuidado de retirar a agulha da seringa. OBTENÇÃO DE SORO O soro é a fração líquida do sangue.Em freezer. este último já deve estar completamente seco e rotulado com a especificação do indivíduo. no campo ou no próprio laboratório. veterinário ou bioquímico na coleta de material. . sem agitação alguma.O sangue colocado em frasco para a retração do coágulo deve ser mantido em repouso. em grande parte. o que decorrerá consequentemente da competência do médico. deve-se conservá-lo diluído a 1:2 em glicerina ou tratá-lo com ázida sódica a 1% para inibição do crescimento de microrganismos e estocá-lo em freezer.Para se obter o soro. deve-se seguir o preparo e estocagem do material. OBSERVAÇÕES IMPORTANTES . Se você precisar enviar a amostra do campo para a cidade procure antes retirar a fração líquida a partir do coágulo e enviá-la em um outro vidro bem tampado rotulado e acondicionado em caixa de isopor com gelo. então. 5 .Em geladeira. O processo de coagulação do sangue começará a se estabelecer. Embora essas reações possam também ser feitas no líquor e ainda em células linfóides deste indivíduo. O gelo deverá ficar dentro de um saco plástico para evitar penetração de água nos vidros com soro. A seguir essa fração líquida é submetida à centrifugação de 1500 RPM durante 5 minutos para separar o soro do resto das hemácias. se sua utilização for ocorrer nas primeiras 72 horas. mais freqüentemente o soro.5 TÉCNICAS DE OBTENÇÃO E CONSERVAÇÃO DO MATERIAL USADO EM IMUNOLOGIA As reações imunológicas utilizadas em auxilio diagnóstico à clínica e na pesquisa experimental tem. coleta-se a fração líquida que se separou do coágulo . sem o fibrinogênio. . se tiver que mandar o soro de uma cidade para outro centro. tendo-se para isto. . Para obtê-lo colhemos uma amostra de 5 a 10 ml de sangue por punção intravenosa. o sucesso da reação dependerá. o sangue é colhido sem qualquer anticoagulante. da boa condição em que essa material fonte se encontre à disposição do laboratório. Após a coleta. odontólogo.

1/50 etc. por exemplo.9 ml Diluição a 1/25 = 1 ml + 24ml ou 0.1 ml + 1. As diluições não devem ser interpretadas como significando uma unidade mais 10 unidades. Portanto. 1:50.85% em um tubo e adicionamos a esta solução 0.1 ml + 9.5ml de soro. que não contenha nenhuma das substâncias diluídas. As diluições podem ser representadas como 1:10.6 DILUIÇÕES A diluição é o ato de tornar mais fraca uma dada solução. na quantidade requerida para conseguir uma diluição determinada. Quando colocamos. ou cloreto de sódio a 0. ou seja.1 ml + 0. ou 1/10. pois há 0. 0.85%. uma solução diluição 1/10 significa que uma unidade da solução concentrada foi diluída para um volume total de 10 unidades.4 ml 6 . Por exemplo.5 ml de soro em um volume total de 1. Usualmente se expressam as diluições como uma unidade da solução original sobre o total de unidades da solução final. uma unidade em um total de 10 unidades. etc.1 ml + 2. TÉCNICAS GERAL DAS DILUIÇÕES Diluição em múltiplos de 10 Diluição a 1/10 1 ml + 9 ml ou 0.5:1.4 ml Diluição a 1/20 = 1 ml + 19ml ou 0.9 ml 1 ml da diluição 1/10 + 4 ml do diluente Diluição 1/100 1 ml + 99 ml ou 0. Isto é conseguido geralmente adicionando-se a uma solução que se pretende diluir um diluente tal como água. se o último tubo que demonstra reação contém um volume de 1 ml e o soro neste tubo é uma parte em um total de 640 partes.0 ml de solução.9 ml 1 ml de 1/10 + 9 ml Diluição 1/500 1 ml 1/100 + 4 ml Diluição 1 /5000 1 ml 1/1000 + 4 ml Diluição 1/10000 1 ml 1/1000 + 9 ml DILUIÇÕES VARIADAS Diluição a 1/5 = 1 ml + 4ml Diluição a 1/15 = 1 ml + 14 ml ou 0.9 ml Diluição a 1/ 50 1 ml + 49 ml ou 0. ficamos com uma diluição do soro a 1:2. Em imunologia clínica o título indica a concentração de anticorpo no soro do paciente.0 ou 1:2. O título de anticorpo de um soro é a diluição mais alta de soro que reage com o antígeno. o título é 640 unidade/ml de soro.1 ml + 4.5 ml de NaCl a 0.1 ml + 1. portanto uma diluição de 0.

homogeneizar com o auxilio de uma pipeta.Distribuir nume série de tubos 3. 4 . utilizando inicialmente apenas o volume de 0. 2) Esquematize uma diluição na razão 2 de um soro. Exemplo .4ml.etc. quando esses estavam presentes em concentração suficiente. esquematize uma diluição na razão 3 até o 5º tubo.Ao tubo 1 adicionar 1 ml da solução corante (a ser diluída).5ml dessa amostra e diluindo até o 8º tubo. homogeneizar. Com base no esquema abaixo. 1/1024. desprezando 1 ml do último tubo. 3 . 5)Esquematize uma diluição 1/625. homogeneizar. 1/256. Exercício de Fixação: 1) Esquematize uma diluição 1/50 de uma solução previamente diluída a 1/10.0 ml do diluente em cada tubo.7 DILUIÇÕES SUCESSIVAS Nesta técnica se transfere sucessivamente volume determinado de um tubo para o tubo seguinte ao qual se adicionou uma certa quantidade de diluente.Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. determine o título dessa reação: Não ocorreu interação Ocorreu interação Ag-AC 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 7 .Diluições sucessivas na razão igual a 4: 1 .Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3. 4)Esquematize uma diluição 1/64 de uma solução previamente diluída a 1/8. As diluições obtidas serão: 1/4. 2 . 1/16. 3)Utilizando um volume de soro de 0. 1/64. partindo de uma diluição 1/5. 5 .Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2. 6)Vamos imaginar que após a interação entre o antígeno e ao anticorpo. tenha ocorrido a formação de um precipitado no fundo do tubo (como descrito abaixo na legenda).

8 . A carboximetil-celulose (CM-celulose) é uma resina carregada negativamente. As características físicas das moléculas de proteínas resultam em retenção destas na matriz do gel em graus diferentes.  A  B  C PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA A = a camada da coluna é feita de uma matriz de partículas de celulose positivamente carregadas. Nestas técnicas. O aumento da molaridade do tampão fornece mais íons para competir com a proteína pela ligação ao gel. CROMATOGRAFIA POR TROCA IONICA A cromatografia por troca iônica separa as proteínas aproveitando a diferença de suas cargas elétricas. e é usada para o fracionamento de moléculas positivamente carregadas. na mistura protéica ligam-se à coluna e são retidas. C = as moléculas negativamente carregadas. A dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose) é uma resina positivamente carregada. A unidade funcional do gel é um grupamento carregado preso em um suporte. e a subsequente eluição. enquanto que as moléculas neutras passam entre as partículas carregadas e são eluidas. sob condições apropriadas. A troca do pH do tampão que passa através da coluna afeta a carga da molécula protéica.8 CROMATOGRAFIA EM COLUNA Técnicas cromatográficas são atualmente métodos amplamente empregados para o fracionamento de proteínas e isolamento de imunoglobulinas. geralmente celulose. B = a solução contendo moléculas negativamente carregadas e outras neutras é colocada na coluna. sendo usada para o fracionamento de moléculas negativamente carregadas. No quadro a seguir temos exemplificado a molaridade de NaCl e pH requeridos para eluir as proteínas plasmáticas humanas da DEAE-celulose. Pelo aumento da molaridade ou diminuição gradual do pH do tampão de eluição as proteínas são eluidas em função do número crescente de grupos carregados ligados ao gel. cheia de um gel sintético. e flui através do gel. permite a separação das proteínas. uma amostra é depositada no ápice de um cilindro ou coluna de vidro.

5 o aminoácido A também é eluido.5 apenas o aminoácido B é eluido. no pH 2.0 transferrina. Utilizando-se de um tampão.5 SO3.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH SO3. os aminoácidos são eluidos de forma diferente. ligando-se à carga negativa da resina.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A ELUÍDO pH 3.025 7.0 (ambos aminoácidos A e B são adsorvidos).9 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Molaridade de NaCl PH Proteínas eluidas -----------------------------------------------------------------------------------------------------------0. Aumentando-se o pH do tampão. OH pH 2. Exemplificamos abaixo a separação de aminoácidos com a resina de troca iônica sob condições ácidas. Os aminoácidos com carga positiva em um meio fortemente ácido ocuparão as posições do sódio de uma resina de troca catiônica. No pH 3.080 6. β globulina.0 α 2 globulina. fibrinogênio 0. e serão eluidos da coluna trocando-se novamente os íons sódio.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH H3N+ COOH AMINOÁCIDO B SO3.5 9 . os aminoácidos tornam-se carregados negativamente.045 7. de modo que haja um aumento progressivo do pH.5 albumina.100 6.8 IgG 0. Os aminoácidos com a carga positiva trocam de posição com os cátions sódio da resina.celulose é uma técnica excelente para o isolamento de IgG.0 SO3. haptoglobina -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A cromatografia em DEAE .050 7. a qual pode ser obtida quase livre de todas as outras proteínas séricas.Na+ SO3 Na + H3N + OH COOH AMINOÁCIDO B ELUÍDO pH 4. IgA 0.Na+ OH SO3. O aminoácido A continua adsorvido à coluna. Já no pH 4. albumina.5 α2 globulina. β lipoproteína 0. α 2 globulina. refletindo as diferenças nas constantes de dissolução dos grupos ionizáveis da resina.

As moléculas entram e passam através da coluna em proporções diferentes.As moléculas maiores são eluidas. passam através do gel na fase liquida fora das partículas e são eluidas primeiro. Por isso. A IgM pode ser facilmente separada de outras imonoglobulinas séricas por gel filtração.10 CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A gel filtração separa as moléculas de acordo com o seu tamanho. PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A . enquanto as menores são retidas.. as moléculas aprecem no eluente de coluna em ordem decrescente de tamanho. As partículas são porosas contendo microcanais. penetram no seu interior e ai são retidas. A gel filtração é largamente usada também para separar as cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas ou para isolar proteínas de Bence-Jones (cadeias leves) puras de urina de pacientes com mieloma múltiplo. Assim. A fase estacionária é mais comumente constituída de partículas hidrófilas tipo gel. O solvente e as moléculas menores que os canais. B . cujos diâmetros permitem a passagem ou a retenção de moléculas de diferentes tamanhos. as moléculas protéicas mais volumosas que os poros das partículas. dependendo primariamente do tamanho e são separadas por um simples processo de peneiração.O círculo aberto (O) representa as partículas de dextran polimerizado sobre as quais um a mistura de moléculas protéicas pequenas (. como dextran (Sephadex) .) é depositada. A B C 10 . C . não podendo penetrar nestes.) e grandes (.

aqueles anticorpos especificos contra o antígeno são retidos pela ligação aos antígenos fixados ao gel. A ligação antígeno-anticorpo é uma das reações que podem ser aplicadas á cromatografia por afinidade. Quando a mistura de anticorpos de diferentes especificações é passada através da coluna. Estes anticorpos específicos podem ser recuperados pela lavagem da coluna com um tampão ácido. o qual desfaz as ligações antígeno-anticorpo. acoplando-se um anticorpo a uma matriz inerte. ou as moléculas de antígeno são insolubilizadas pela ligação cruzada com glutaraldeído. Um antígeno é acoplado à uma matriz insolúvel tal como a Sepharose.11 CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE A cromatografia por afinidade usa interações biológicas especificas reversível entre o material do gel e a substância a ser isolada. 11 . Uma técnica semelhante pode ser usada para purificar um antígeno.

a saber: albumina(fração mais rápida). As proteínas que tem pontos isoelétricos mais ácidos. Algumas proteínas de localização intracelular.7 . migrará para o positivo ou ânodo. apresentam ponto isoelétrico acima deste espectro. Isto faz com que todas as proteínas se carreguem negativamente e migrem na mesma direção. o que é determinado pelo pH do meio onde a proteína é isoelétrica. Em meio alcalino se carregam eletronegativamente e quando submetidas a uma corrente elétrica migram para o ânodo com uma velocidade que guarda relação com o número de suas cargas. é possível a separação dos componentes protéicos do fluidos biológicos. se for negativa. resulta uma carga negativa. elas podem separar-se em cinco grupos principais (por meio da eletroforese convencional de zona). Quando as cargas positivas e negativas se neutralizam. beta(β) globulina e gama(γ) globulina.globulina Na maioria das vezes. em seguida a globulina Alfa (α).6. No caso das proteínas.4 Albumina α 1 . em uma dada proteína. a proteína não tem carga e se denomina “isoelétrica”.5. Toda proteína tem seu “ponto isoelétrico”. a molécula tem uma carga positiva. ao fenômeno da migração de partículas eletricamente carregadas sob a influência de um solvente condutor (tampão). estas possuem grupos amino e carboxílicos livres e devido a isso estão carregadas positiva ou negativamente em solução aquosa na dependência do pH do meio. Assim.12 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS Princípio: Chama-se eletroforese. O espectro das proteínas séricas varia entre pH 4.1. Em circunstâncias opostas.5-8 β globulina β lipoproteína pH 6.globulina α 2 . sua migração será para o pólo negativo ou cátodo. com maior velocidade se distanciará dos componentes menos carregados de maneira que as partículas com pouca ou nenhuma carga permanecem relativamente estacionadas. por outro lado.baseando-se na diferença de velocidade de migração das diversas proteínas. Conforme a velocidade de migração. pH 5. Esquema isoelétrico das proteínas séricas pH 4.0. estão altamente carregados e migram com maior rapidez.3 γ .2. globulina Alfa (α).8 a 9.globulina 12 . Em geral as proteínas séricas são separadas em um pH que varia de 8. Quanto mais carregada a partícula. se a carga da superfície da partícula for positiva. as partículas carregadas avançam para o eletrodo de carga contrária.4 . a eletroforese é executada com um tampão de pH fora do espectro isoelétrico. Quando a soma das cargas positivas excede o número total de cargas negativas. Assim.5 a pH 6.

Na eletroforese do soro. mas também são encontradas quantidades significativas na zona de β .globulinas. Nestes distúrbios ocorre geralmente um pico protéico restrito eletroforeticamente na região de γ .globulinas e. para a identificação da proteína em questão. Cadeias leves livres são prontamente detectáveis na urina quando presentes em quantidades aumentadas.globulinas do eletroforetograma. também pode ser detectada com esta técnica. tal como ocorre na hipogamaglobulinemia. Uma diminuição na concentração de γ .13 APLICAÇÕES NA IMUNOLOGIA A eletroforese de zona é extremamente valiosa para o diagnóstico dos distúrbios paraprotéicos humanos tais como mieloma múltiplo e microglobulina de Waldenstron.globulinas. como na proteinuria de Bence Jones do mieloma. Devem ser feitos testes quantitativos específicos. a maioria das imunoglobulinas migra para a zona designada γ . bioquímicos ou imunológicos. ocasionalmente. região das α2globulinas. Picos nestas regiões são também compatíveis com distúrbios paraproteinemicos que envolvem imunoglobulinas. 13 .

essa é a face opaca. deixar correndo a amostra por 35 minutos. 8. Só uma superfície da fita é penetrável. 6. Agitar até a fita dissolver-se completamente. obtendo assim a densidade óptica da amostra (D. Lavar o microaplicador com água destilada e colocá-lo em contato com a amostra de soro. As tiras tem um angulo picotado.Retirar as fitas do banho corante e transferir para um recipiente com a solução descorante. contendo 2 ml de solução de eluição. retirar a fita e colocá-la em banho corante por 10 minutos. Fazer a dosagem de proteínas totais da amostra de soro. com a face absorvente voltada para cima (Obs.14 TÉCNICA: ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE CELULOSE Material necessário • Fitas de acetato de celulose (CellogelR) • Tampão de corrida pH 8. o qual deverá estar situado na posição inferior a direita do operador). 5. cálculos conforme modelo da apostila (pag. Observar para que ambas as extremidades da fita estejam em contato com a solução tampão e o picote da fita na canaleta positiva. Fazer. 10. Repetir o processo até as partes sem proteína na fita ficarem brancas.Fazer os. 4.. 3.) 13.6 forca iônica 0. Colocá-las esticadas sobre o suporte da cuba. Método 1. Tampa a cuba e ligar. 7. Colocar as fitas de cellogel imersas em tampão de corrida por pelo menos 10 minutos. tubos de ensaio e etc.0 cm do polo negativo. agitar para propiciar a descoloração da fita e transferir para outro banho descorante. 2.Para a determinação quantitativa das frações protéicas. 9. ajustando para 200 Volts. Fazer um tubo com um pedaço da fita sem proteína (branco) para zerar o aparelho. Terminada a corrida. então.036 (Veronal sódico 0. cortar as frações coradas e introduzí-las em tubos de ensaio respectivamente marcados. Preencher cada um dos compartimentos da cuba de eletroforese com tampão de corrida.04M) • Corante Ponceau`s • Solução descorante (Metanol a 50%) • Solução de eluição (ácido acético a 80%) • Fonte de continua para 200 volts • Cuba de eletroforese • Espectrofotometro Pipetas. 12. desligar a cuba. visível depois de seca .Ler em espectrofotometro usando um comprimento de onda de 520nm. 11. Retirar as fitas do tampão e secá-las com papel de filtro. uma leve aplicação do soro a cerca de 2. papel de filtro. microaplicador.15) 14 .O.

globulina β .. de cada fração pela soma-se das D..globulina γ....841 Valor absoluto (g/100ml) 65.5 a 1.6 g/100 ml 15 ........globulina α2..0 7...... 0.......9 100......... α2-globulina......2 g/100 ml 0.... divide-se por 100..... β -globulina.6 a 1................x X = 0.....80 x 7.........91 7.0 g/100 ml 0.............10 g% Valor relativo (%) 0.....67 0.....034 0...........O..52 0...................globulina total D.1 a 0..... para verificar o valor absoluto (g/100ml).....67g/100ml Valores normais : Albumina......841----------------100% 0...6 a 5...108 0.1 12........0 Valor absoluto g/100ml 4.6 a 1...... α1-globulina..4 g/100 ml 0..................553 x 100 = 65..3 10. e multiplica-se por 100.......... 3......72 0......10 = 467........8 4........ FRAÇÕES Albumina α1.........O....0 g/100 ml 0.....18 : 100 = 4.........553 0.553---------------.......... γ-globulina...28 0.80% 0..10 Proteína total = 7..15 CÁLCULOS Faz-se a leitura da densidade óptica de cada tubo....... Depois..841 EXEMPLO Valor relativo (%) 65....O.. Somam-se as densidades ópticas de cada fração e para obter-se o valor relativo em % divide-se a D.......061 0..085 0.

Se o paciente tiver a infecção em questão e se. este não poderá se fixar as bactérias e. Quando ocorrer a união desses três elementos. o complemento estiver ausente. Antígenos solúveis também reagem com anticorpos específicos fixando o complemento. mas não haverá bacteriólise. O processo de hemólise. Outras substâncias. quando cobaias restabelecidas de cólera eram infectadas com o vibrião colérico. o complemento permanecerá livre no líquido. que mostrará o complemento que ainda permanece livre. o complemento tiver sido ligado ao complexo Ag-Ac. o que serve para diagnosticar a infecção correspondente. 16 . e outra sensível ao calor (termolábil). Isto se consegue adicionando-se hemácias de carneiro sensibilizadas. encontrada somente no sangue de animal imune (anticorpo). Em nenhum dos casos haverá mudanças visíveis para relevar o que aconteceu.Introdução: Em 1894. sobretudo os glóbulos vermelhos. Logo que se misturam os reagentes os eritrócitos formam uma suspensão vermelha opaca.16 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO I . diz-se que a bactéria está sensibilizada. pois não haverá complemento livre para se complexar aos eritrócitos sensibilizados. Quando se mistura o soro desconhecido com um antígeno específico e o complemento. Quando ocorre hemólise. e a adição subsequente do complemento acarretará rapidamente a bacteriólise. a hemoglobina difundese no líquido. 2. seu soro tiver o anticorpo correspondente.Se o soro do doente não contiver o anticorpo especifico. seu soro possuía forte atividade bacteriolítica contra esse microorganismo. é facilmente visível a olho nu. não ocorrerá hemólise. ocorrerá a união do anticorpo com a bactéria. que toma coloração vermelha transparente. com sobrenadante claro e incolor. Se não ocorre a hemólise. antígeno da superfície bacterianaAnticorpo-complemento in vivo ou in vitro poderá haver bacteriólise. por causa da liberação de hemoglobina das hemácias lisadas. sem sedimento visível. mesmo existindo complemento em abundância. o complemento será ligado ou fixado ao complexo antígenoanticorpo específico e nenhum complemento será deixado livre. quando se processa in vitro. num tubo de ensaio. Quando o soro da cobaia era aquecido. Se o anticorpo estiver ausente. A bactéria que induziu a imunidade e contra a qual atividade era dirigida. portanto não as lisará. Se. por conseguinte. formando sedimento vermelho. Em tal caso. essa atividade desaparecia. os glóbulos intactos depositam-se lentamente no fundo. imunes ou não (complemento). ao contrário. A aplicação da reação de fixação do complemento permite determinar a presença do anticorpo especifico no soro do paciente. Se. o sistema hemolítico se completa e ocorrerá hemólise. Pfeifer mostrou que. é o ANTÍGENO. acontecerá uma das duas hipóteses: 1. Estudos posteriormente demonstraram que a atividade bacteriolítica se devia a duas substâncias encontradas no soro: uma resistente ao calor. e é portanto necessário adicionar um indicador. cuja destruição se denomina hemólise. além das bactérias. podem agir como antígenos. Se houver complemento livre. ao contrário. presente no soro de quase todos os animais de sangue quente.

3 tubos de ensaio c .Incubar em banho-maria a 37ºC. com o objetivo de demonstrar que nesta reação participam três elementos distintos: ANTÍGENO = ANTICORPO = COMPLEMENTO Material: a .Suspensão de hemácias de carneiro a 5% e . os alunos executarão a reação de imuno-hemólise.Soro hemolítico (hemolisina) f .17 REAÇÃO IMUNOHEMÓLISE Quando injetamos hemácias de carneiro num coelho.Solução tampão com veronal Técnica: 1 . A reação de imune hemólise se verifica nas seguintes condições: Fresco + Suspensão de hemácias de carneiro + incubação a 37º C hemólise + Suspensão de hemácias de ausência de carneiro + incubação a 37ºC hemólise + Suspensão de hemácias de carneiro + Soro fresco de hemólise cobaia (complemento) + Incubação a 37ºC Soro de coelho imunizado contra hemácias de carneiro Inativado a 56ºC/30` Inativado a 56ºC/30` Nesta aula prática.8 ml no tubo 1 1.9 ml no tubo 3 6 .1 d .Estante de metal b .Pipetar solução fisiológica tamponada: (os respectivos valores em cada tubo) 0.Pipetas de 1 ml graduadas em 0. por 15 minutos.1 ml do soro hemolítico nos tubos 1 e 2 4 .5 ml de complemento nos tubos 1 e 3 5 . 17 .Pipetar 0.Numerar os tubos 2 . Os anticorpos encontrados no soro do coelho podem ser demonstrados pela reação de imunohemólise entre outras.Pipetar 0.1 ml de suspensão de hemácias nos 3 tubos 3 . este animal produz anticorpos anti-hemácias de carneiro.Complemento g .Pipetar 0.3 ml no tubo 2 0.

a seguir.Estante de metal g .2 ml 0.No dia seguinte. QUADRO PARA ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS: RESULTADO Reação Soro Controle do soro Testemunho do Ag Testemunho do C INTERPRETAÇÃO 18 .Agitar a estante e levá-la a incubação em geladeira 2-4ºC. acrescentar 0.5 ml 0.5 ml 05 ml 0.5 ml 2(controle do soro) 0.Tampão e . 3 .6 ml 0.5 ml tampão 0.Pipetas de 1 ml em 0. 4 . por 18 horas e.Incubar em banho-maria a 37ºC durante 30 minutos.2 ml do sistema hemolítico (mistura de suspensão de hemácias + soro hemolitico a todos os tubos).3 ml 0.5 ml 4(testemunho do C`) - Complemento DH 50% 0.18 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO Material: a .Antígeno b .1 Técnica: 1.8 ml 2 .2ml 3(testemunho do ag) 0. a 37ºC por 15 minutos.1 ml 0.Sistema hemolitico (hemácias de carneiro + hemolisina ) f .Tubos de 12 x 75 mm h .Soros (já inativados ) d .Complemento c . Pipetar os reagentes segundo o quadro abaixo: TUBOS Soro do Antígeno paciente (dose ótima) 1(reação) 0.

parcialmente idênticas ou independentes. forca iônica do tampão. sendo que. mas deve se esperar 40 a 48 horas para o resultado final. Geralmente usam-se lâminas de microscopia revestidas com camada de gel de ágar a 1% em solução salina ou tamponada. a reação ocorre mais lentamente e a temperatura acima de 37ºC pode resultar na formação das linhas de precipitação.anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arcos de precipitação. Fatores que interferem na reação de precipitação são: pH. na hepatite crônica ativa. bem como na paracoccidioidomicose. c) Pipetas graduadas de 5 ml.5 a 8. poderá interferir na solubilidade das proteínas. MATERIAL a) Solução de agar a 1% em solução fisiológica.8 pois em pH abaixo de 6.8 pode impedir a reação e dissociar complexos de Ag . b) Lâminas de microscopia. A temperatura deve ser constante e entre a 4ºC e 37ºC . tais arcos podem fundir-se dando identidade total ou parcial (esporão) ou intercruzam-se. d) Tubos capilares. e) Solução de antígeno de Paracoccidioide brasiliensis f) Solução de anticorpos antiantígeno de Paracoccidioidis brasiliensis (soro controle) g)Soro humano para o teste h) Furador i) Câmara úmida 19 . A forca iônica maior ou menor do que a do tampão recomendado. A principal aplicação desta técnica tem sido na identificação de antígenos e anticorpos em misturas desconhecidas (como os fluídos biológicos). O complexo antígeno . demonstrando independência imunológica total entre os reagentes pesquisados. Na temperatura mais baixa. como por exemplo. A reação usualmente ocorre entre 16 a 24 horas. em que em determinado ponto de ótima proporção dos reagentes ou próximos deste.5 pode ocorrer precipitação não específica e o pH acima de 8. os reagentes são colocados em orifícios separados e opostos feitos no gel. Os reagentes difundem-se radialmente formando uma linha visível resultante da precipitação e somente na região onde os dois reagentes se encontram nas proporções adequadas. Outra grande importância é a de se poder saber se duas substâncias são imunológicamentes idênticas. na anemia infecciosa eqüina. O pH deve ser entre 6.19 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO SEMI-SÓLIDO Imunodifusão radial dupla (reacão de Ouchterlony) Esta técnica pode ser definida como a difusão de antígenos e anticorpos homólogos um em direção ao outro num meio gelificado. temperatura. tempo e principalmente as concentrações relativas de antígenos e anticorpo. A imunodifusão é usada também com finalidade diagnóstica. ocorre a reação de precipitação. Na imunodifusão radial dupla.Ac .

4 . de maneira uniforme sobre a lâmina. por 5 minutos.Aplicar.Deixar dentro da placa de Petri. OA O1 O2 O3 OB O4 A – Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 1 .Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 3 . 3 ml de ágar fundido em solução fisiológica. utilizando um furador. 5 . usando um capilar para cada amostra. em câmara úmida.Aplicar. Esperar esfriar. ou de uma cuba apropriada.20 TÉCNICA: 1 . colocando.soro controle positivo 4 . os antígenos e anticorpos de acordo com o esquema.Fazer a leitura após 24 ou 48 horas.soro do paciente 2 20 . algodão úmido para manter a umidade. ao lado. 3.soro do paciente 1 2 – soro controle positivo B . Levar à geladeira. 2 .Colocar a lâmina com o gel sobre o modelo (gabarito) e fazer os orifícios nos pontos indicados.

o resultado esperado na seguinte reação de imunodifusão radial dupla: B E A D C LEGENDA: A= Solução de anti-IgA das secreções B=Saliva humana C=Solução de anti-IgM D= Solução de cadeias pesadas α E=Solução de IgA sérica b) Através de seus conhecimentos sobre Imunoglobulinas justifique os resultados nos encontros das linhas: Entre B e C: ___________________________________________ Entre C e D: ___________________________________________ Entre D e E: ___________________________________________ Entre E e B: ____________________________________________ 21 . através de linhas. esquematize.21 Após a leitura do resultado e interpretação faça o seguinte exercício para sua auto-avaliação: a) Utilizando os reagentes de acordo com a legenda abaixo.

9 . Os resultados são expressos geralmente em títulos isto é. 12 .Rose . OUTRAS APLICAÇÕES DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO 1 . Exemplo de reações de aglutinação empregadas com finalidade de diagnóstico: 1 .Reação de aglutinação rápida e aglutinação lenta para brucelose. as células se aproximam permitindo a formação de pontes moleculares. Os anticorpos adicionais a estas suspensões combinam com o antígeno localizado na superfície das partículas unindo-as entre si. etc.Reação de crio-hemaglutininas para pneumonia atípica primária.Reação de aglutinação direta para toxoplasmose. Em anti-soros com títulos aglutinantes altos.Reação de hemaglutinação indireta para toxoplasmose. bactérias ou mesmo de partículas inertes (ex: látex) que foram recobertas por um antígeno. Neutralizada esta força repulsiva. um título precisa diferir em pelo menos duas diluições (dois tubos) para ser diferente de qualquer titulo dado. 2 . uma vez que os eletrólitos vão neutralizar a carga elétrica da partícula que em pH neutro possuem carga livre ou resultante negativa . 3 .Classificação de Salmonellas.Reação de Wiel-Felix .Reação de inibição de hemaglutinação .0.para revelar anticorpos incompletos em várias doenças.Davidson .Reação de Coombs .22 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno faz parte da superfície de eritrócitos. 5 . a aglutinação está completa e as partículas são examinadas diretamente ou microscopicamente para evidência dos grumos. Após poucas horas de incubação. Shigelas e colipatogênicos. O fenômeno de pro-zona produz reações de aglutinação falsamente negativas em concentrações altas de anticorpos. Muitos antígenos se acoplam espontaneamente com eritrócitos e formam reagentes estáveis para a detecção de anticorpos. um fenômeno de pro-zona pode obscurecer os resultados.5 ml ou em placas de microaglutinação com quantidade bem menores de reagentes. 2 .Reação de Waaller . resultando em maior sensibilidade. para doença de chagas.para diagnóstico de várias viroses. 22 .para monucleose. 7 . Os testes de aglutinação indireta podem ser também realizados em tubos ou placas de microaglutinação. 3 . formando um agregado nítido. As reações de aglutinação requerem a presença de eletrólitos.Reação de Widal .2 . o inverso da maior diluição do soro na qual ocorre aglutinação.Reação de aglutinação para lepstospirose. 8 . Os testes são feitos em pequenos tubos de ensaio em volumes de 0. 6 . 10 .Classificação de pneumococos e estreptococos.Determinação dos grupos sangüíneos e fator Rh.Reação de aglutinação de Paul-Bunnell . 11 .para febre tifóide. bactérias e uma variedade de espécies microbianas podem ser diretamente aglutinadas por anticorpos séricos. Por causa da variabilidade intrínseca no sistema de teste. 4 .Reação de aglutinação para listeriose.para riquetsiose.para diagnóstico da artrite reumatóide. Testes para detectar anticorpos especificos são realizados pela titulação de soros imunes em diluições seriadas (2x) na presença de uma quantidade constante de antígeno. No teste de aglutinação direta eritrócitos. Na aglutinação indireta faz-se adsorsão passiva ou acoplamento químico de antígenos solúveis a eritrócitos ou outras partículas inertes.

02.23 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM PLACA PARA PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-BRUCELA Objetivo: Demonstração da Aglutinação Direta da suspensão bacteriana de Brucella abortus por anticorpos anti-brucela presentes no soro. 1:100 .(Cuidado para não encostar a pipeta com antígeno na fração de soro para não haver contaminação do antígeno). estando em uma concentração celular de 11%.05 ml até a diluição contendo 0. 03 . em salina fenicada a 8. no sentido da maior para a menor diluição). As diluições finais serão aproximadamente 1:25 . aglutinação direta). O antígeno utilizado nessa reação foi preparado de acordo com técnica internacional recomendada pelo Ministério da Agricultura.5% e corada com verde brilhante e cristal violeta. 0. Por isso. o Conselho Federal de Medicina Veterinária editou portaria específica que orienta a realização e a interpretação das reações sorológicas para o diagnóstico da Brucelose Animal. ao contrário do que comumente ocorre. 05 . ou seja. 1:50 . nas reações em que se visualizam a pró-zona. Reação positiva (+): presença de aglutinação.Agitar o frasco do antígeno padronizado e colocar uma gota do antígeno de Brucela (30 µl) ao lado da fração de soro. 04 . Atenção: Em soros apresentando títulos altos de anticorpos pode ocorrer o fenômeno de pró-zona. NOTA: O resultado encontrado é expresso por um título. 0. Reação negativa (-): não aglutinação.08 ml de soro (ou seja. TÉCNICA 01 .08.01 e 0. o inverso da maior diluição onde se identificou a reação (no caso. Em face da importância da Brucelose com zoonose.Fazer a leitura observando a aglutinação com uma fonte de luz apropriada. 1: 400. 23 .(Vide anexa no fim da apostila). previamente identificadas com a respectiva diluição). iniciando com a diluição contendo 0.Com uma pipeta específica para reação aglutinação direta para o diagnóstico da brucelose (Pipeta de Bang) ou com pipeta de 0. as primeiras diluições de soro mostram-se negativas e as últimas (maiores) diluições apresentam reação positiva. 1:200 .Agitar a placa com suaves movimentos circulares de 15 a 20 vezes por 3 minutos.2 ml.Misturar cada composição soro-antígeno com um bastão.05 ml do soro teste depositando separadamente cada fração do material sobre uma série de quadrados numa placa de vidro específica para esta reação (ou pipetar individualmente cada uma das quantidades indicadas colocando-as em lâminas individuais de microscopia. 02 . 0.04. pipetar 0. que é um evento em que o excesso de anticorpos presentes no soro teste faz com que a equivalência da interação Ag/Ac somente ocorra após altas diluições desse soro.

seja em testes de fixação do complemento (reação de Wasserman). ( a agitação pode ser manual).Lâminas escavadas.. MATERIAL NECESSÁRIO: 1 . Cardiolipina sozinha. mas não estimula sua produção.Suspensão do antígeno. 4 . 2 . 03 . inativados a 56ºC durante 30 minutos.REAÇÃO DE VDRL (VENERAL DISEASES RESEARCH LABORATORY) A reação do VDRL é usada para o diagnóstico sorológico da sífilis. 5 . somente se liga a anticorpos. seja em testes de aglutinação passiva. 3 .Partículas agrupadas em pequenos grumos . reforçada pela adição de doses adequadas de colesterol e de lecitina constitui excelente antígeno para a detecção da reagina sifilítica. Infecções pelo Treponema pallidum levam à liberação nos fluídos orgânicos de cardiolipina. soros positivo e negativo. durante 04 minutos. nos quais o hapteno é adsorvido a superfície de cristais de colesterol (reação de floculação de Kline. que pode ser extraído em alto grau de pureza do coração de bovino e é denominado cardiolipina.05 ml ) dos diferentes soros. no agitador próprio.24 REAÇÃO DE MICROAGLUTINAÇÃO PASSIVA .R.não reativo . entretanto. Trata-se de um fosfolipídio. TÉCNICA: 01 . isto é. a 180 r.Leitura: A leitura deve ser feita imediatamente após a agitação observando ao microscópio de acordo com a intensidade da reação. movimentos rotatórios da placa sobre a superfície da mesa com amplitude de mais ou menos 03 cm. V. é um hapteno. . Anticorpos para antígenos cardiolipínicos são conhecidos como anticorpos de Wasserman ou reagínicos.p. através de uma técnica de microaglutinação passiva feita em placa escavada.m. e à produção de anticorpos.Em cada escavação da placa colocar 01 gota (0. Para tornar-se imunogênica a cardiolipina deve se ligar a uma proteína carreadora.Partículas agrupadas em grandes grumos .soro fracamente reativo.L. INTERPRETAÇÃO .Partículas finamente dispersas . 24 . a qual faz parte normalmente da membrana mitocondrial.soro fortemente reativo. 02 .0 ml (agulha sem bisel).Pipetas Pasteur.Soros a testar. etc).Seringa de 1 ml sem o bisel (ponta).Acrescentar a cada soro uma gota de suspensão antigênica com uma seringa de 1. 04 . A cardiolipina.Agitar.D. Pacientes com sífilis desenvolvem uma resposta de anticorpos contra um hapteno ubiquitário que existe nos tecidos dos mamíferos.

se encontra adsorvido a superfície de um suporte inerte de látex de poliestireno. POSITIVO: Aglutinação nítida que se apresenta macroscópicamente dentro de 2 minutos.Preparar uma diluição a 1/20 do soro.Colocar no círculo central da placa fornecida. Pode ser detectado por uma reação de aglutinação passiva ou indireta.05 ml do soro teste no tubo contendo o tampão e homogeneizar bem. 1 gota da diluição 1/20 do soro a testar. O fator reumatóide é considerado um anticorpo contra a IgG.Adicionar uma gota do reativo látex globulina. e observar macroscopicamente o resultado da reação por tempo não maior que 2 minutos. 02 . resultando numa aglutinação visível macroscópicamente.Agitar suavemente a placa com movimentos circulares. RESULTADO: NEGATIVO: Suspensão homogênea.Colocar no círculo à esquerda 01 (uma) gota do soro controle positivo e no círculo a direita 01 ( uma) gota do soro controle negativo. 03 . 05 . 04 . previamente agitado. IgG humana desnaturada pelo calor.Misturar e distribuir o conteúdo de cada círculo por toda sua área com um estilete. TÉCNICA: 01 . 06 . Usar um para cada círculo. a cada um dos círculos. como grumos visíveis 25 . onde o antígeno. pipetando 0.25 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA: Teste para a pesquisa do Fator Reumatóide Látex Princípio: O fator reumatóide é uma macroglobulina (IgM) que se encontra presente no soro de 85 a 90% dos pacientes com Artrite Reumatóide e em 3 a 5% dos indivíduos normais. Este antígeno reage imunológicamente com o anticorpo (fator reumatóide) presentes no soro.95 ml do tampão glicina e a seguir 0.

quer pelo plasma. AB e O. (REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA) MATERIAL: a) Sangue total.B. Landsteiner (1990) verificou que era regra todo indivíduo apresentar no seu plasma aglutininas contra os aglutinógenos que lhes eram estranhos: -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Aglutinógenos nas Aglutininas no hemácias Plasma -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A A Anti B B B Anti A O Anti A e Anti B AB A e B -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Isso torna possível a tipagem do sangue de um indivíduo dentro do sistema ABO quer pelas hemácias. TÉCNICA: Seguir o esquema que se segue 1 gota: sangue 1 gota: sangue Grupos - soro anti A soro anti B Misturar com o bordo de uma lâmina limpa. b) Soro anti A.TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTÍGENO NAS HEMÁCIAS. c) Soro anti B.Sistema ABO De acordo com a existência ou não dos aglutinógenos A e/ou B. nas hemácias.26 IMUNO-HEMATOLOGIA 1) Grupos sangüíneos . 1 . A leitura é feita por visualização da aglutinação: 26 . e) Lâminas de microscopia. os indivíduos da espécie humana podem ser divididos em 04 grupos: A. d) Pipetas Pasteur.

GRUPO SANGÜÍNEO . MATERIAL: a) Soro desconhecido. b) Hemácias A. c) Lâminas.Misturar com o bordo de uma lâmina limpa e efetuar a leitura pela presença ou não de aglutinação.27 - 2 . Sangue: 1 gota de sangue Soro: anti -D 27 . MATERIAL: a) Sangue total. TECNICA: A tipagem comumente é feita em lâmina usando-se como reagente soro anti .SISTEMA Rh De acordo com a existência ou não do antígeno D(Rh) nas hemácias os indivíduos da espécie humana são Rh+ (positivo) ou Rh . c) Hemácias B. d) Pipetas de Pasteur.(negativo). b) Soro anti D (Rh).D (Rh) observando-se a aglutinação ou não das hemácias a temperatura ambiente. O sistema Rh possui ainda outros antígenos.TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTICORPOS NO SORO. mas na prática transfusional apenas o antígeno D (Rh) é pesquisado por ser mais imunogênico. d) Pipetas Pasteur. Seguir o esquema 1 gota: soro 1 gota: soro 1 gota hemácia A 1 gota de hemácia B . e) Lâminas.

Teste de Coombs indireto é utilizado para o diagnóstico de anticorpos incompletos no soro de qualquer pessoa possivelmente sensibilizada por antígenos eritrocitários do sistema Rh (sensibilização pós-transfusional ou no decurso de gestação). INTERPRETAÇÃO 10 . Consiste na lavagem de hemácias já sensibilizadas.Após a última lavagem. TÉCNICA PARA O TESTE INDIRETO 01 . e incubar a 37ºC durante 15 minutos. A lavagem é feita para evitar a reação das proteínas livres.A cada um dos tubos acrescentar uma gota de suspensão de hemácias O Rh (+) 5%. 08 .28 TESTE DE COOMBS A prova de Coombs. também denominada prova de antiglobulina humana. em um 2º tubo colocar uma gota de soro controle positivo (marcar (+) no tubo).Colocar em um tubo de ensaio uma gota do soro a ser testado (marcar T no tubo).Aglutinação presente: Teste positivo Aglutinação ausente: Teste negativo 28 . decantar o sobrenadante por inversão do tubo.Agitar.Agitar suavemente para misturar e centrifugar imediatamente ( 01 minuto a 1000 r.R. para misturar.03 minutos). Em recém-nascido de mães sensibilizadas. 07 . ressuspender o sedimento de hemácias e repetir esta operação por mais 02 vezes. de crianças e adição de soro de Coombs.Preparar uma suspensão a 5% de hemácias O-Rh positivas.Adicionar 02 gotas de albumina bovina a 22% em cada tubo. 06 . 09 .Retirar o tubo do banho-maria e completar até 01 cm da borda com solução fisiológica ou PBS FOSFATO e centrifugar a 3000 rpm ( + ou .N. consiste no emprego do soro antigamaglobulina humana (soro de Coombs) para promover a aglutinação de hemácias previamente incubadas com anticorpos incompletos. invertendo o tubo e enxugando a borda do mesmo com papel absorvente.H.Adicionar ao sedimento de hemácias.p.m). 03 . O teste de Coombs direto é feito para diagnóstico da D. 02 gotas de soro de Coombs. em um 3º tubo colocar uma gota de soro controle negativo (marcar (-) no tubo). decantar completamente o sobrenadante. 05 . 02 . 04 .

onde não sofra vibrações. que os poços estão distribuídos formando linhas: linhas A. na placa. 8) Colocar 50µl de hemácia sensibilizada com o antígeno do vírus Hepatite B em todos os poços. colocar 50µl de tampão diluente em cada poço. 7) Agitar levemente a placa. A reação será realizada em placas de microaglutinação. 10) Ler a reação após 2 horas. a partir do 2º poço até o 11º poço dessa linha. 3) Homogeneizar o conteúdo do 1º poço e passar 50µl para o 2º poço . 29 . Esse tipo de placa presta-se a reações em que trabalhamos com pequenos volumes de reagentes. 2) Colocar 100 µl de soro humano no 1º poço. 1 A B C D E F G H 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PROCEDIMENTO 1) Utilizando a linha A. Com o objetivo de conduzir os alunos de graduação desta instituição para a compreensão de mais uma variação. proceder com esta diluição até o último poço (numero 11). 5) Agitar levemente a placa. 4) Desprezar 50µl do 11º poço (último). 6) Colocar 50µl de soro anti-antígeno Hbs em cada poço. Cada poço da placa de microaglutinação e reconhecido também por “well”. do 1º ao 11º poço. 9) Selar com fita Durex para que não haja evaporação dos reagentes e colocar a placa sobre uma superfície rígida. e a diluição dos soros e reagentes será feita através de pipetas automáticas. escolhemos fazer a pesquisa de antígenos do vírus da Hepatite B por tal método. à medida que autorizaram uma sensibilidade maior para a pesquisa daqueles reagentes. C etc. B.29 MÉTODO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA As variações sobre os métodos de aglutinação surgiram ampliando as possibilidades de diagnóstico e pesquisa de anticorpos e de antígenos. o método de Inibição da Aglutinação Passiva. Observe. homogeneizar novamente e passar 50 µl do 2º poço para o 3º .

O do controle positivo). O conjugado utilizado deverá ser específico para a estrutura capturada na placa. o peróxido de hidrogênio. materiais que possibilitam a ligação covalente de proteínas. gerando um complexo que na presença de um terceiro composto um doador de elétrons (cromógeno ) forma um polímero intensamente colorido. gelatina. A enzima peroxidase é muito utilizada para este teste. e reage especificamente com seu substrato. Vários métodos são realizados utilizando o principio do enzima-imunoensaio. cruzi PRIMEIRA AULA – SENSIBILIZAÇÃO E BLOQUEIO DA PLACA Material necessário: Placas de poliestireno Solução contendo antígenos de T.30 ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) Este teste foi desenvolvido em 1971 por Engvall e Perlmann como alternativa ao radioiumunoensaio. TÉCNICA DE ELISA INDIRETO PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-T.O da amostra/D. que poderá ser o antígeno ou mesmo uma classe de anticorpo em particular. entre eles os mais empregados são: • Método indireto: amplamente empregado para a pesquisa de anticorpos apresentando como vantagem a utilização de um único conjugado em diferentes sistemas. ao ser adicionado o substrato da enzima à reação. O princípio básico é a adsorção de um dos reagentes (antígeno ou o anticorpo) a uma fase sólida. cruzi Solução tamponada de Caseína a 1% Solução tampão para lavagem Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Estufa à 37°C 30 . tal como placas de poliestireno ou polivinil. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos. BSA) no diluente da amostra (bloqueio). Os conjugados devem ser preparados com anticorpos de alta afinidade. Independente do método escolhido para leitura é necessário determinar o limite de reatividade ou “cut-off” do teste. Anticorpos ou antígenos podem ser conjugados a enzimas de maneira que. é gerado um produto colorido que poderá ser observado a olho nu (ensaio qualitativo) ou ter sua densidade óptica medida por espectrofotometria (ensaio quantitativo). que pode ser obtido pela relação entre a coloração da amostra e a coloração do controle positivo (D. Tais placas contêm séries de poços onde serão depositados os reagentes. A adsorção não específica de componentes à placa pode ser reduzida incluindo-se uma proteína inerte (caseína. O cromógeno mais utilizado em ELISA é o OPD (ortofenileno diamina). preferencialmente monoclonais. podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados. • Método de captura: Um anticorpo específico é adsorvido à placa para reter o objeto da pesquisa.

Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. cada poço da placa. cruzi. Material necessário: Placas previamente sensibilizadas com antígenos de T. 3. cruzi e bloqueadas. Boqueio de placa previamente sensibilizada: 1. Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Soro Controle Positivo Soro Controle Negativo Soros testes Conjugado enzimático Solução reveladora (peróxido de hidrogênio+OPD) Metodologia: 1. desprezar a solução de antígenos de T. 4. Trabalhando com a placa previamente sensibilizada. Pipetar em duplicata (em dois poços consecutivos) 100µl dos soros controles e dos soros testes de acordo com o esquema abaixo: A: Controle negativo B: Controle negativo C: Controle positivo D: Controle Positivo E: Soro teste 1 E: Soro teste 2 F: Soro teste 3 G:Soro teste 4 31 . Pipetar 200µl de solução contendo antígenos de T.31 Metodologia: Sensibilização da placa: 1. 5. 2. 2. cruzi. Adicionar 200µl de solução de bloqueio (Caseína a 1%) a cada poço da placa e incubar overnight a 37°C. cada poço da placa. Inverter a placa e bater sobre papel de filtro para retirar o excesso de tampão. Incubar 2 horas à 37°C em estufa. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. SEGUNDA AULA – Detecção de anticorpos anti-T. cruzi em cada poço da placa de poliestireno.

8. Levar para incubação em estufa durante 15 minutos à 37º C.32 2. Inverter e bater a placa sobre superfície com papel de filtro. 11. Desprezar o conteúdo da placa e lavra três vezes com solução tampão. 7. Leitura visual de placa pronta 32 . Incubar a placa 30 minutos à 37ºC. Adicionar 100µl de conjugado a cada poço da placa. 6. 3. 10. 5. 9. Inverter e bater a placa. Lavar três vezes a placa com solução tampão. 4. Novamente incubar 15 minutos à 37ºC. Adicionar 100µl de solução reveladora (substrato+cromógeno) em cada poço.

A fluorescência é a emissão de luz de uma cor. resultando em fluorescência. em seguida emiti-la sob a forma de uma radiação de maior comprimento de onda. O comprimento da onda emitido (fluorescente) terá necessariamente menor energia. comprimento de onda. Os fluorocromos apresentam espectros de absorção e emissão característicos. As técnicas utilizadas para o estudo de imunofluorescência comportam duas modalidades principais: 33 . filtros de excitação para produzir um comprimento de onda capaz de causar ativação do fluorocromo e filtros para evitar a passagem pela ocular. C D A B ---------------__ _ _ _ _ _ _ __ Radiação de longos comprimentos de onda Radiação de curtos comprimentos de onda A . O isotiocianato de tetrametilrodamina. que tem a capacidade de absorver a energia luminosa. que emite cor vermelha. e emite sua cor verde característica a 517 nm.495 nm.Lâmpada de halogênio B .Filtros excitadores D . Os fluorocromos mais usados em laboratório clínico são a fluoresceína e a rodamina.33 REAÇÕES DE IMUNOFLUORÊSCÊNCIA FINALIDADE: Detecção de anticorpos ou de antígenos. Ambos os fluorocromos são empregados sob a forma isotiocianato. contendo uma fonte de luz excitadora de alta intensidade.Preparo fluorescente C . que se conjuga facilmente as proteínas em pH alcalino (acima de 9 ). armazená-la durante curto espaço de tempo (10-9 a 10-7 de segundos) para. É possível tornar visível a reação Ag-Ac marcando um dos reagentes com substâncias ditas fluorocromos. tem um máximo de absorção a 550 nm e emissão máxima a 580 nm. Para a observação microscópica da fluorescência é necessária uma adaptação do microscópio óptico comum. A absorção máxima do isotiocianato de fluoresceína é de 490 . enquanto uma substância é irradiada com luz de cor diferente.Filtros de barreiras Esquema do sistema óptico do microscópio de fluorescência. ou seja maior comprimento de onda do que o da luz incidente ou absorvida. isto é. de luz de baixo comprimento de onda.

34 . esquistossomose.baseia-se na detecção de anticorpos utilizando um antígeno conhecido e um soro anti-imunoglobulina humana. sorotipos de leptospiras. Sobre a preparação de antígeno fixado à lâmina. e a seguir.Imunofluorescência indireta . sífilis. trata-se com um anticorpo fluorescente com especificidade dirigida para os determinantes antigênicos do anticorpo ligado ao antígeno. antinucleoproteína. anticorpos antireóide. lava-se a preparação para remover todas proteínas (imunoglobulina) não fixadas pelo antígeno. anti HIV. após haver a reação Ag-Ac. aplica-se primeiro o anticorpo específico não fluorescente. doenças de Chagas. 2 . bacilo diftérico.34 1 . como estreptococos beta-hemolíticos do grupo A. Usa-se esta técnica na pesquisa de anticorpos circulantes no diagnóstico de: toxoplasmose. leptospirose.Imunofluorescência direta . anti-DNA. etc. etc. É o processo comumente usado para a identificação de microorganismos por imunofluorescência. marcado com fluoresceína. sorotipos de colibacilos enteropatogênicos.baseia-se na detecção de antígenos utilizando anticorpos específicos marcados com isotiocianato de fluoresceína.

em câmara úmida. diluído conforme seu título.Colocar no tubo 1/16 1. com objetiva de imersão. campo escuro. 3 . 1/4096.02 ml) das diluições dos soros em cada área das lâminas.Preparar diluições dos soros em solução salina tamponada pH 7.Observar os preparados ao microscópio de fluorescência. como demonstrado no esquema abaixo.02 ml).1 ml para o 3º tubo e assim sucessivamente. 1/256 . 10 minutos cada lavagem. 8 . TOXO 1/16 1/256 1/64 1/4096 1/1024 _ + 6 .35 TÉCNICA DA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA TOXOPLASMOSE 1 . 2 . homogeneizar bem e passar 0.2.Preparar diluições a 1/16 do soro controle positivo e do soro controle negativo. em cada área das lâminas.Pipetar no 1º tubo 0. 35 . 10 . homogeneizar bem e passar 0. secar como no indicado do item 8 e montá-las com glicerina alcalina e lamínula.Marcar as lâminas com os respectivos soros.5 ml de salina tamponada e 0.Incubar a 37ºC em câmara úmida. 7 . 11 . Nas reações negativas os toxoplasmas não apresentam fluorescência ou esta fica localizada apenas nas extremidades dos parasitas (coloração polar).Lavá-las 2 (duas) vezes em PBS.1 ml para o 2º tubo. 5 (cinco) minutos de cada vez. da seguinte maneira: a . na razão de 1/16 .Remover os soros de cada lâmina sob delicado jato de água e lavá-las por imersão por duas vezes em PBS.Enxugar o verso e as bordas das lâminas com papel absorvente e ao redor das áreas da reação. 1/64 . Secá-las com ar quente. 5 . ainda que de pequena intensidade. 12 . Como título tomar o inverso da maior diluição do soro para a qual se evidencia fluorescência em toda a periferia dos toxoplasmas.Secar bem as lâminas fixadas com antígeno.1 ml do soro. 9 . b . filtro excitador BG 12/2 mm ou KP 500 e filtro barreira 50.Depositar uma pequena gota do conjugado fluorescente liquido antiimunoglobulina humana (cerca de 0. por 30 minutos. 4 .3 ml nos demais tubos.Incubar novamente as lâminas a 37ºC por 30 minutos. 1/1024 .Depositar pequenas gotas (0.

que deverão ser feitos em casa.36 PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS Esta parte da apostila apresenta de forma sucinta os objetivos gerais e específicos de algumas unidades do nosso programa. esforçando-se para saber descrever com clareza sobre o que está sendo perguntado. Ao final de cada unidade e após os estudos. Tal seção tem como finalidade permitir ao aluno uma auto-avaliação sobre o tema tratado em sala de aula. os alunos deverão ter compreendido o assunto tratado se forem capazes de responder aos seguintes objetivos: 36 . Responda-os com cuidado e atenção. pesquise. discuta com os colegas ou procure os professores da disciplina. Se tiver dúvidas sobre qualquer uma das respostas.

37 UNIDADE: RESISTÊNCIA INESPECÍFICA Objetivos gerais e específicos: 1. 2. 3. Descrever os principais elementos da pele e de que forma atuam na resistência inespecífica. 4. Entender os fenômenos de defesa como mecanismos de adaptação às agressões do meio ambiente. Descrever os principais elementos da mucosa e de que forma atuam na resistência inespecífica. 5. Conceituar e diferenciar resistência inespecífica e específica. Citar os principais mecanismos de resistência inespecífica. 37 .

Diferenciar quanto a origem e função os linfócitos T e os linfócitos B. e. daqueles que atuam na defesa inespecifica.Diferenciar morfologicamente imunológica. d. cada célula que participa dos eventos da resposta c.38 UNIDADE: CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE Objetivos gerais e específicos: a .Diferenciar as células que atuam na defesa especifica.Definir a função da cada célula dentro da resposta imunológica. b. 38 .Reconhecer as células que participam da resposta e fenômenos imunológicos.

aos órgãos linfóides secundários.39 UNIDADES: FORMAÇÃO DE CÉLULAS T E B e ÓRGÃOS LINFÓIDES Objetivos gerais e específicos: 1) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides primários no sistema imunológico. 11) Reconhecer a principal via de acesso das “estruturas estranhas”. à partir da célula primitiva. 12) Explicar o tráfego de linfócitos no organismo. 3) Descrever as características histológicas e anatômicas dos órgãos linfóides primários e secundários. o fígado fetal e a medula óssea. 16) Justificar a proliferação celular nos órgãos linfóides primários. 2) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides secundários no sistema imunológico. 14) Reconhecer o papel das vênulas pós-capilares de endotélio alto nos linfonodos com relação ao tráfego de linfócitos. 5) Relacionar os passos envolvidos na formação de células T efetoras. 13) Explicar como os linfócitos efetores produzidos em um linfonodo têm acesso a um sítio de infecção em outra região ou tecido. considerando as fases de uma resposta imunológica. para o sistema imune. 7) Comparar e justificar os efeitos da timectomia neo-natal e na fase adulta. 15) Justificar a proliferação linfocitária nos órgãos linfóides secundários. 4) Relacionar funcionalmente a membrana do saco vitelino. 10) Justificar a hiperplasia de um órgão linfóide secundário. à partir da célula primitiva. 39 . 8) Reconhecer aspectos da adaptabilidade dos órgãos linfóides secundários para a fase de reconhecimento antigênico na resposta imune. 9) Explicar o centro germinativo nos linfonodos. 6) Relacionar os passos envolvidos na formação de plasmócitos secretores de anticorpos.

Exemplificar a situação em que uma substância apresenta antigenicidade e não apresenta imunogenicidade. Definir o termo imunogenicidade e antigenicidade. Explicar três formas de ação dos adjuvantes imunológicos. 4. Citar e explicar os fatores que contribuem para a imunogenicidade de uma molécula. 2. 10. 7. Justificar a diversidade de epítopos em uma determinada substância imunogênica. 11. 9. Conceituar “epítopo”. Explicar a condição para que haja formação de uma resposta imunológica para os haptenos. 3. entre antígenos. em geral . 8. Reconhecer a estrutura de um epítopo em uma molécula protéica. Conceituar e exemplificar “hapteno”. Citar os adjuvantes imunológicos mais empregados. Explicar os fenômenos de reatividade cruzada.40 UNIDADE: ANTÍGENOS Objetivos gerais e específicos: 1. 40 . 5. 6.

41 . c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina. d) Identificar na molécula as regiões Fab e Fc. h) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. b) Determinar a estrutura básica de uma molécula de imunogobulina. k) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM. i) Esquematizar o mecanismo de formação de IgAS desde sua síntese até sua chegada na secreções. g) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro. f) Definir sitio combinatório. o) Definir a imunoglobulina de maior peso molecular. qual a classe que desempenha este papel e a que se deve esta propriedade. e) Citar as diferentes classes de imunoglobulinas existentes. j) Determinar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. n) Relatar a importância da transferência placentária de imunoglobulina na espécie humana.41 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos I) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo imunoglobulinas. em relação as outras imunoglobulinas. l) Reconhecer a forma de participação da IgE nas reações alérgicas. m) Definir as imunoglobulinas que apresentam peça J e qual a função desta peça.

Domínios variáveis e constantes nas cadeias leves e pesadas 4. em imunoglobulinas. m) Identificar as sub-classes de IgG existentes. relação as outras 42 . q) Discriminar estruturalmente uma molécula de IgG e uma de IgAS. v) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM.Cadeia leve 3.42 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos II) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo Imunoglobulinas. r) Esquematizar o mecanismo de formação da IgAS desde sua síntese até sua chegada nas secreções. p) Reconhecer as subclasses existentes de IgA. n) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. b) Reconhecer a estrutura básica de uma molécula de imunoglobulina. w) Determinar estruturalmente a composição de uma IgD. x) Reconhecer a forma de participação de IgE nas reações alérgicas.Região carboxi-terminal l) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro. s) Explicar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. t) Determinar estruturalmente a composição de uma molécula de IgM. u) Determinar o peso molecular e quantidade relativa de IgM encontrada no soro. c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina. 1. f) Reconhecer as imunoglobulinas que apresentam subclasses e diferenciar estas subclasses de acordo com a nomeclatura vigente. o) Definir a propriedade de opsonização de que é dotada a IgG. i) Esquematizar uma molécula de IgG reconhecendo nela os seguintes tópicos. h) Conceituar idiótipos. e) Diferenciar os diversos isótipos de cadeias leves e de cadeias pesadas existentes. d) Identificar os fragmentos resultantes após a clivagem enzimática de uma molécula de imunoglobulina pela ação de pepsina e da papaína.Cadeia pesada 2. g) Conceituar e exemplificar alotipia em cadeias leves e pesadas.

Reconhecer as bases de um mecanismo homeostático em relação à ativação do sistema do complemento. clássica e efetora do sistema do complemento. Demonstrar como o sistema do complemento participa da eliminação de antígenos que não são celulares ou que não tem membrana exposta.43 UNIDADE: SISTEMA COMPLEMENTO Objetivos gerais e específicos: ♦ Descrever os efeitos biológicos surgidos pela ativação do Sistema do Complemento. ♦ Reconhecer o mecanismo de ativação da via alternativa e da via clássica do Sistema do Complemento. Justificar a ação lesiva do sistema do complemento para células do próprio hospedeiro. por que na maioria das células os mecanismos de lise pelo Complemento não são possíveis. ♦ Identificar a analogia entre as enzimas C4b2a e C 3bBb. Explicar o desenvolvimento de uma alça de amplificação na ativação da via alternativa. ♦ Justificar o papel inespecífico da ação do sistema do complemento. agregação plaquetária. ♦ Identificar os fatores ativadores da via clásssica e da via alternativa do Sistema do Complemento. Explicar a ausência da alça de amplificação da via alternativa nos processos fisiológicos de ativação do Sistema do Complemento. quimiotaxia para PMN e lise celular. produzidos pela ativação do Sistema do Complemento. ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ 43 . Explicar o mecanismo da ação dos fragmentos de ação biológica. ♦ Identificar a via alternativa. ♦ Justificar a participação de uma resposta imuno especifica na ativação do Sistema do Complemento. através dos textos bibliográficos. Justificar. nos fenômenos de aumento de permeabilidade capilar.

c) Identificar os principais fatores quimiotáticos para PMN e macrófagos. f) Explicar a importância do fenômeno da opsonização. 44 .44 UNIDADE: FAGOCITOSE Objetivos gerais e específicos: a) Definir fagocitose. b) Identificar as principais células que participam da resistência inespecífica. endocitose e exocitose. k) Caracterizar a via oxigênio dependente. h) Explicar a fase de englobamento realizada pelo fagócito i) Explicar a fase de digestão durante a fagocitose. n) Citar as principais enzimas que atuam a via oxigênio independente. d) Citar as principais substâncias que desempenham o papel de opsoninas. pinocitose. g) Caracterizar o sinal de ativação do fagócito no momento da opsonização. j) Definir as duas principais vias de destruição da partícula fagocitada. o) Relacione a fagocitose a mecanismos de resistência inespecífica. m) Caracterizar a via oxigênio independente. e) Definir opsonização. l) Citar os radicais livres produzidos na via oxigênio dependente e definir sua importância na destruição de estrutura fagocitada.

3) Denominar os produtos do CHP Humano. 7) Reconhecer na molécula de classe I. 4) Estabelecer a função dos antígenos de classe I e classe II. 9) Relacionar as moléculas de classe I e II do CHP com os antígenos exógenos e aqueles de síntese endógena. a região de ligação ao peptídeo. 6) Localizar as moléculas de classe I e de classe II nas diferentes populações celulares. 45 . 5) Esquematize as estruturas das moléculas de classe I e II.45 UNIDADE: Complexo de Histocompatibilidade Principal(CHP. no camundongo e no ser humano: 2) Citar quais são os produtos da decodificação do CHP. “MHC”) Objetivos gerais e específicos: 1) Definir o que é CHP e onde este se localiza. a região de ligação ao peptídeo. 8) Reconhecer na molécula de classe II. (Faça um desenho esquematizando as principais características de ambas).

uma molécula viral pode ser apresentada no contexto de moléculas de classe I do CHP: 6) Esquematizar como ocorre o processo de apresentação de antígenos no contexto de moléculas de classe II. 5) Definir em qual situação.γ na apresentação do antígeno. 9) Explicar porque a apresentação de antígenos externos se dá no contexto de moléculas de classeII. estabelecer de que forma o organismo reconhecerá que naquela célula está se desenvolvendo uma infecção e como esta será debelada. 3) Exemplificar qual é a molécula que poderia sugerir uma função de célula apresentadora de antígeno. 2) Definir as principais características quanto às estruturas de superfície celular e fagocitose de cada APC. 10) Definir qual o papel do INF. quais são as etapas que culminam com a apresentação de antígenos pelas células. 7) Numa infecção por um patógeno intracelular em uma célula cilíndrica do trato digestivo superior. 4) Descrever no macrófago. 46 . 8) Estabelecer onde ocorre a interação entre antígenos próprios e as moléculas do CHP e como ocorre este mecanismo.46 UNIDADE: Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) e mecanismos de Apresentação de Antígenos 1) Definir quais são as principais células apresentadoras de antígenos e onde elas se localizam.

9. 7. Definir estrutural e funcionalmente os principais marcadores de superfície dos linfócitos T 2. IL-12 47 .47 UNIDADE: Linfócitos T 1. 5. Reconhecer o mecanismo de interação da célula apresentadora de antígeno com os linfócitos T CD4+. Definir funcionalmente e quanto às células produtoras as seguintes citocinas: 10. IL-6 15. Reconhecer o mecanismo de interação na apresentação de Ag aos linfócitos T citotóxicos ou CD8+. IL-2 11. Definir como ocorre a ativação do repertório de células T citotóxicas (CTL). Definir e diferenciar linfócitos TH1 e TH2 8. IL-4 13. 6. 4. quanto a função e produtos das subpopulações TH1 e TH2. IL-5 14. Definir a etapa seguinte à ativação dos LT auxiliares. 3. Elaborar um quadro comparativo. IL-3 12. TNF 18. INF-γ 17. IL-10 16. Esquematizar as etapas de ativação dos linfócitos T auxiliares.

Definir o mecanismo do capuz ou “Capping” e citar a função do mesmo. Definir a primeira imunoglobulina a ser produzida em resposta a uma infecção. 10. 16. Explicar porque se pode dizer que um linfócito B é uma APC. Estabelecer a diferença que existe entre as fases das respostas primárias e secundária. Explicar porque a resposta secundária é a mais rápida do que a resposta primária. 3. Reconhecer os marcadores de superfície dos linfócitos B e função fisiológica dos mesmos. 17. Estabelecer as fases que precedem a interação entre linfócitos B e linfócitos T e o objetivo desta interação. Definir as fases de ativação dos linfócitos B. Estabelecer com relação ao comportamento de linfócitos B. 48 . Explicar a que se deve a maior produção de Ig durante uma resposta humoral secundária.48 UNIDADE: Linfócitos B e Resposta Humoral Primária e Secundária 1. 5. o que é esperado quando se imuniza artificialmente uma criança e porque. Definir mudança de classe ou “Switch”que ocorre durante a síntese de imunoglobulinas. Estabelecer a finalidade da ativação do repertório de linfócitos B. 2. Definir as principais interleucinas produzidas pelos linfócitos T que têm ação sobre linfócitos B e em que fase elas agem e de que forma. 15. 4. Definir o resultado final da ativação do repertório de linfócitos B. Identificar as fases da curva que representa uma resposta humoral e a característica de cada fase. 7. Diferenciar a ativação por antígenos timo-dependentes e timo-independentes. Definir a ontogenia dos linfócitos B no homem. 12. 13. 14. 11. 8. 9. 6.

15. Identifique a diferença na codificação genética entre imunoglobulina de membrana e imunoglobulina secretada. há variação na síntese da porção constante da cadeia pesada de imunoglubolinas e não ocorre o mesmo para a porção variável? 49 .49 UNIDADE: Genética das Imunoglobulinas Objetivos gerais e específicos: 1. Diferencie os rearranjos gênicos que existem nas cadeias leves e pesadas. 11. Explique as causas da grande variabilidade de sítios combinatórios das imunoglobulinas. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias pesadas das imunoglobulinas. Identifique a seqüência genética existente para a síntese das diferentes cadeias pesadas de imunoglubulinas. Responder: por ‘que. durante o “Swicth”. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves Kappa das imunoglobulinas. Conceitue “Fenômeno de Restrição Alélica”. Responda: é possível que um linfócito B apresente em sua superfície diferentes classes de imunoglobulinas ao mesmo tempo ? Em que situações? 12. 9. 2. Identifique o processo de “diversidade funcional por inserção”. Explicar por que uma célula que sofreu um “Switch” para a síntese de IgG não mais poderá voltar a sintetizar IgM. 6. 13. 14. Justifique a necessidade de haver imunoglobulinas de diferentes classes. Conceitue “Fenômeno de Restrição Isotípica”. 4. 5. 10. Diferencie o rearranjo gênico que existe durante a fase primordial e a fase tardia de síntese das imunoglobulinas. 7. 8. 3. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves lambda das imunoglobulinas. Defina intron e exon. 16.

Tente. é bem possível que você já possa prever como será. 50 . Portanto. identificar a cinética de uma infecção viral numa célula hepática e a resolução desta infecção pelo sistema imunológico. ou como deverá ser. utilizando todos os conceitos que você já aprendeu. realizando um esquema completo. a reação do organismo frente a alteração do padrão fisiológico do mesmo. então.50 INTERAÇÃO DO SISTEMA IMUNOLÓGICO Se você foi capaz de responder a estes questionários contendo os objetivos específicos já é capaz de compreender as diversas faces do sistema imune.

2. Explicar a participação da via oral na indução da tolerância. Reconhecer sua participação e importância no Sistema Imunológico. 6.51 UNIDADE Tolerância Imunológica Objetivos gerais e específicos: 1. 4. 5. Justificar o papel do contato de longa duração na duração de tolerância. 51 . 3. Explicar os mecanismos imunológicos pelos quais o sistema imunológico desenvolve tolerância aos antígenos próprios e não próprios. Explicar a importância da drenagem venosa na tolerância por via oral. Conhecer os fatores favorecedores da resposta ao tolerogênico. Conceituar “Tolerância imunológica”.

Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo III. 15. 12. 6. segundo Gel e Coombs 3. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo III. 11. Definir o que é uma reação de hipersensibilidade. 4. ação e efeito dos mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. 7. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo I. 52 . 17.52 UNIDADE HIPERSENSIBILIDADE 1. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo II. 21. 13. 9. Classificar as reações de hipersensibilidade quanto aos seus mediadores imunológicos. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo IV. Reconhecer a origem. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo III. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo III. 14. 19. 2. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo I. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo I. Reconhecer a propriedade hipersensibilidade tipo I. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo I. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo III. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo I. de imunoglobulina(s) envolvida(s) na mediação da 16. Relacionar as reações de hipersensibilidade da classificação de Gel e Coombs. 5. fundamental das imunoglobulinas mediadoras da 18. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo IV. 20. nos tipos imediatos e tardios. 10. Citar os mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade IV. 8. Identificar a(s) classe(s) hipersensibilidade tipo II.

32. 27. 28. 36. 53 . 25. Explicar as reações aceitas para a permanência de imunecomplexos circulantes o organismo. 33. Diferenciar o mecanismo de formação de edema na hipersensibilidade tipo I e III. reconhecendo os fatores liberados por células responsáveis. Justificar fenômenos hemorrágicos presentes na reação inflamatória por hipersensibilidade tipo III. Compreender a utilização de testes intradérmicos de hipersensibilidade tipo IV para avaliação de imunidade celular. Justificar a presença destas células no infiltrado . Explicar a reação de Arthus. Explicar o papel do sistema do complemento nas reações de hipersenbilidade tipo III. 23. Diferenciar a formação de uma reação de Arthus com uma reação tipo III sistêmica. 35. 29. 31. 24.53 22. Justificar o eritema que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilidade tipo IV. 39. 37. 26. Justificar uma neutropenia após a administração do antibiótico cloranfenicol. Descrever os principais mecanismos da lesão celular por hipersensibilidade tipo II. Justificar a induração que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilização tipo IV. 38. Reconhecer a localização do Ag na hipersensibilidade tipo II. Entender a origem da histamina e seu papel na hipersensibilidade tipo III. 40. 34. Justificar a isquêmia que pode acompanhar as reações de hipersensibilidade tipo III. Explicar o mecanismo da injúria tecidual pelo mecanismo de hipersensibilidade tipo IV. Identificar o principal mediador imune da reação inflamatória tipo IV na classificação de Gel e Coombs. 30. Justificar a escolha dos Ag em uso nos testes intradérmicos de avaliação de imunidade celular. Caracteritizar os tipos celulares predominantes no infiltrado inflamatório mediado por hipersensibilidade tipo IV.

Explicar os mecanismos de agressão às células enxertadas. Associar MHC e HLA. Relacionar estas estruturas moleculares e o MHC. 4. 3. Interpretar uma prova cruzada positiva. Justificar a importância da Prova Cruzada que antecede os transplantes. que são responsáveis pela indução da rejeição aos mesmos. Reconhecer os tipos de rejeição aos enxertos identificando os principais elementos da resposta imune. Citar os principais locus da região HLA. 9. 6. Conhecer a nomenclatura correspondente aos enxertos. Explicar a reação de Enxerto X Hospedeiro e justificar a sua presença nos transplantes de medula óssea. 13. Montar um exemplo de um perfil para a expressão fenotípica de todos esses locus em um indivíduo. 12. envolvidos. Citar as provas de seleção para doador vivo para os transplantes. 7. 10. 2.54 UNIDADE: TRANSPLANTES Objetivos gerais e específicos: 1. Reconhecer quais a estruturas moleculares das células de um enxerto. Justificar o valor da análise do perfil de HLA na seleção do doador vivo 11. 8. 5. 54 .

3. OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS: Ao final do exercício desta prática no laboratório o aluno deve estar apto a: 1.Justificar a importância do pH alcalino do tampão utilizado. 4.55 SUBUNIDADE: “ELETROFORESE DE PROTEÍNAS”. 55 .Explicar o princípio de uma eletroforese de proteínas. 5. 2.Fundamentar a razão de todas as proteínas migrarem em um único sentido.Reconhecer e explicar o fato das albuminas migrarem com maior velocidade. 6.Dar a definição de ponto Isoétrico de uma proteína e explicar sua participação no princípio desta técnica.Reconhecer o que atuou como suporte na corrida eletroforética realizada no laboratório.

56 PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS EXERCÍCIOS 56 .

laboratorial de termos adsorvidos.Realizou-se nova lavagem do sistema. Essa reação processa-se em tubos onde seguiu-se a metodologia abaixo.Ao tubo foi adicionado soro suspeito para o exame. 6. 8. 7. 2.A seguir procedeu-se a incubação a 37º C por 30 minutos.57 RIE (RADIOIMUNISAIO) Abaixo está representado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. 57 . 3. para assim recobrir os espaços não ocupados pelo anticorpo (bloqueio do tubo). 1. ao tubo. 5. PERGUNTA-SE a. 4.O que estava sendo pesquisado b. Após a leitura e compreensão responda o que se pede abaixo: METODOLOGIA: A cada tubo foi adsorvido previamente anticorpos anti-IgM humana. anticorpos anti-IgM e não anti-IgG. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da HEPATITE A. A adsorção se dá por ligações covalentes entre os anticorpos e o material do tubo (poliestireno). antígeno extraídos do vírus da Hepatite A. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina. uma condição favorecedora da interação Ag/Ac.Mediu-se a radiação do tubo.Adicionou-se então anticorpos anti-vírus da hepatite A. marcador com l125 (um isótopo radioativo cuja emissão de radiação pode ser medida em um cintilômetro).diga qual a importância clínico.Posteriormente realizou-se a lavagem do sistema.Seguiu-se nova etapa de lavagem.Adicionou-se a seguir.

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ELISA ( ENZIME LINKED IMUNOSORBENT ASSAY)
Abaixo está apresentado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS . Acompanhado será fornecido uma placa com 96 poços onde seguiu-se a metodologia abaixo. METODOLOGIA A cada poço foi adsorvido previamente antígenos extraídos dos vírus da AIDS. A adsorção se dá através de ligações covalentes entre os antígenos e o material da placa. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina, para assim recobrir os espaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da placa). 1- Foram adicionados aos poços 1 e 2 soros procedentes de dois pacientes suspeitos de terem anticorpos anti-HIV ( vírus da imunodeficiência humana causador da AIDS). 2- A placa foi levada a uma estufa a 37 ºC por 30 minutos, uma condição favorecedora da interação Ag/Ac. 3- A seguir esse poço foi lavado com uma solução tampão com finalidade de retirar moléculas livres. 4- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas. As moléculas desses anticorpos tinham, ligadas em si, no Fc, uma enzima (peroxidase) cujo substrato pode ser o peróxido de hidrogênio. Esse substrato ao sofrer a ação daquela enzima manifesta uma cor alaranjada que se revela quando se adiciona ao meio uma substância reveladora ( no caso o ortofenilenodiamino-OPD). A ligação da enzima ao anticorpo não altera as propriedades anticórpicas desse. Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 5- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 6- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 7- Logo após observou-se que a solução no poço 1 ficou alaranjada enquanto que no poço 2 não houve alteração. Responda: a- Esquematize os dois poços evidenciando as reações Ag/Ac que ocorrerem ou deixarem de ocorrer. b- Após a realização do item 3, esquematize o que permaneceu no poço 1. c- Como você interpreta o resultado visível nos poços 1 e 2 respectivamente?

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WESTERN BLOTTING
É um dos métodos mais utilizados para identificar proteínas reconhecidas por anticorpos, sendo designado também de immunoblotting, diferenciando-se do “Southern ou Northen blotting”, que se prestam a identificação de ácidos nucléicos. Abaixo está apresentado um exemplo de Western blotting que se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS. Leia com atenção e responda. 1- Para a realização de um Western blotting inicialmente as proteínas virais são separadas, de acordo com seu tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio - um detergente (SDS-PAGE). 2- Em seguida as proteínas fracionadas no gel são transferidas por corrente elétrica, para uma membrana de nitrocelulose que posteriormente será recortada em tiras. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina ou a caseína, para assim recobrir os pedaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da fita). 3- A cada tira é adicionado em recipiente apropriado soro de paciente suspeito de ter anticorpos anti-HIV. 4- Segue-se um período de incubação de 30 minutos a 37º C, e extensiva lavagem para a remoção das proteínas livres. 5- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas marcadas com uma enzima (peroxidade). Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 6- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 7- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 8- Em seguida observou-se que algumas fitas apresentavam bandas (faixas) coradas denotando reação, enquanto outras não se coraram. RESPONDA: 1- Poderíamos pesquisar subclasses de IgG, ou mesmos outro isótipo de imunoglobulinas? Como? 2- O que significa exatamente a presença de bandas coradas, com relação as possíveis interações ocorridas?

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IMUNOHISTOQUÍMICA
A aplicação da imunohistoquímica (IHQ) à rotina diagnóstica já é uma realidade em nosso meio. De modo genérico, podemos considerar como principais indicações para o exame: ♦ Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente diferenciadas ♦ Subtipagem de neoplasias ♦ Caracterização da origem de carcinomas. ♦ Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas ♦ Discriminação da natureza benigna X maligna de determinadas proliferações celulares. ♦ Avaliação prognóstica de neoplasias ♦ Identificação de agentes infecciosos. Como exemplo, temos representado abaixo uma reação de IHQ para a pesquisa de receptores de estrógeno em células de adenocarcinoma de mama, um fator prognóstico neste caso. 1- Para a realização reação de imunohistoquímica utilizamos cortes de tecido incluído em parafina com aproximadamente 3 µ de espessura, colocados em lâminas tratadas com silano ( silanizadas), para propiciar uma forte adesão do corte histológico à lâmina 2- Em seguida as lãminas são desparafinizadas, sendo deixadas na estufa à 60°C por 24 horas, no xilol à 60°C e no xilol a temperatura ambiente para desparafinização 3- Após a desparafinização as lâminas são levadas à uma sequência de banhos de álcool absoluto até 80% para hidratação. 9- Posteriormente segue-se a etapa conhecida como recuperação antigênica. Necessária para que se restabeleça a estrutura antigênica das proteínas estruturais, modificada pela ação do formol. Tal etapa poderá ser feita por dois métodos: Calor úmido: em solução tampão citrato de sódio pH 6,0 4M, em banho-maria, panela de pressão ou microondas por tempo determinado. Enzimático: tratamento do corte com proteinase K 10- Segue-se o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 11- Adição de anticorpo monoclonal de coelho específico, anti-receptor para estrógeno 12- Incubação por 30 minutos à 37°C e overnight na geladeira. 13- No dia seguinte etapa de lavagem com solução tampão 14- Adição de um anticorpo anti- anticorpo de coelho, marcado com estrepavidina, incubação à 37°C 15- Nova etapa de lavagem 16- Adição de complexo biotina-estreptoavidina complexada com, nova incubação à 37°C 17- Lavagem e adição de solução de Dab (Diaminobenzidina 60mg%) 18- Contra coloração com hematoxilina. 19- Observação no microscópio de núcleos corados de marrom. RESPONDA: Qual a finalidade das etapas de lavagem? Por que fazemos a recuperação antigênica? Como seria um resultado negativo?

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Sabendo-se que os vírus ao infectarem um organismo. descreva todos os prováveis eventos de uma resposta imunológica.61 EXERCÍCIO SOBRE RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO VIRAL E BACTERIANA 1. inserem seu genoma no genoma de uma célula do hospedeiro e que assim. através dos quais este hospedeiro reagirá à infecção viral. esta célula passa a ostentar em sua superfície. tal como uma do gênero Streptoccocus. 2. moléculas codificadas pelo genoma viral. 61 .Se em uma situação hipotética. nosso organismo for infectado por uma bactéria extracelular qualquer. qual seria a resposta esperada do sistema imune?. que possua em sua parede antígenos de natureza polissacarídica e glicoproteíca. que você conhece.

Desenvolvimento: A citometria de fluxo mede características corpóreas e químicas de células ou partículas que estão em suspensão uma a uma num determinado ponto. é também utilizada para identificar as sub-populações de linfócitos especifícos. medicina e outras. pode também estimar a distribuição das populações celulares ou fases do ciclo celular. G2 e M do ciclo celular. tais como botânica. estudos funcionais. granulosidade. pode processar milhares de células em alguns segundos. É uma técnica de medição das propriedades óticas da células individuais. forma e complexidade interna e. zoologia. em frente a um feixe laser com sensores para medir fluorescência e dispersão de luz. Essas células são rotuladas com uma “etiqueta” fluorescente. genética. Esta metodologia de análise é aplicável em diversas áreas de pesquisa. fração de crescimento e propriedades cinéticas. indicando fatores prognósticos e rumos terapêuticos. As células devem estar em uma suspensão de células simples com o mínimo de agregação (suspensão monodispersa). ou fixas com paraformaldeído. A linha simples de fluxo das células passa pelo raio laser do instrumento. e intensidade de fluorescência verde. Um citomêtro de fluxo pode medir estes parâmetros a uma taxa de milhares de células por minuto. análise de DNA. Contanto que diferentes tipos de células possam ser distintas por características estruturais quantitativas. As aplicações incluem: análise de fenótipo. E assim. registrar os parâmetros cinéticos do tumor a ploidia do tumor.62 CITOMETRIA DE FLUXO Pela acadêmica de Farmácia Daniela Silva Moreira Introdução: A citometria de fluxo consiste em um método laboratorial para definir o tamanho. cada célula fornece 5 números: tamanho. é claro qualquer componente da célula ou função que possam ser detectada por um composto fluorescente quando examinada. Permite o estudo da variabilidade genômica pelo perfil colorimétrico do conteúdo de DNA. seqüencialmente. Embora faça medidas em uma célula de cada vez. microbiologia. muito utilizado na classificação de leucemias. análise e classificação de cromossomo. As informações podem ser adquiridas na citometria de fluxo utilizando células vivas. para contagem de CD4 e CD8. classificação estéril. a fração de proliferação tumoral e a percentagem de células encontradas nas fases S e G1. a citometria de fluxo pode ser usada para a contagem de células de diferentes tipos em uma mistura. morfologia e outras características de uma população de células. em um fluxo contínuo passando uma de cada vez. 62 . Podemos obter medidas corpóreas das células como tamanho. vermelho e muito mais vermelho. ou partículas em geral.

gerados a partir da fluorescência. O CD4 é expresso na superfície de células (linfócitos) CD4+. CD4e CD8. dirigidas contra os marcadores de superfície CD4. a porcentagem de células positivas à citometria de fluxo. minimizando o erro. primeiro. o diferencial de glóbulos brancos. A energia da luz emitida pelo laser excita o corante fluorescente contido em cada célula. por sua vez é expresso na superfície dos linfócitos CD8+ e em algumas células NK. e assim determinar um tratamento para a doença. CD8 e CD3. utiliza uma técnica sofisticada de citometria de fluxo. Estes dados são em seguida registrados e mostrados na forma de histograma. é devido os níveis normais se alterarem nas imunodeficiências e em certas doenças. O CD8. e o número de células é calculado com base na intensidade da fluorescência . através da ligação de um anticorpo monoclonal específico para a população alvo.alvo. linfócitos B e os linfócitos NK. A população alvo colorida é. A importância clínica de se fazer citometria de fluxo para separar e contar o número de linfócitos T CD4+ e CD8+. o sistema óptico do laser detectores eletrônicos.63 -Técnica de Citometria de Fluxo A técnica de citometria automatizada de fluxo envolve. por sua vez atravessa um raio laser. a coloração da população de células-alvos com um corante fluorescente ( geralmente iodeto de propídio).Separação de linfócitos por citometria de fluxo: Os linfócitos são classificados em 3 sub-populações: linfócitos T. como por exemplo na infecção pelo HIV. que representa o perfil da população de células. conversores analógicos para digitais e computadores. fluxo este que. A cada sessão. E através desses níveis de linfócitos podemos indicar a progressão ou regressão de uma doença. estes histogramas. passada por um pequeno tubo que cria um fluxo de células únicas. O marcador CD3 é expresso na superfície de células “T” maduras ( CD4 e CD8). A metodologia mais atual para a contagem de CD4 e CD8 e para a identificação das sub-populações de linfócitos específicos. então. A utilização dos CD3 irá discriminar os linfócitos CD8+ das NK. conseguem identificar a tendência central de uma determinada população de células. baseada em anticorpos monoclonais marcados com substâncias fluorescentes. Os citômetros de fluxo envolvem fluidos sofisticados. A contagem absoluta das sub-populações de linfócitos é obtida a partir de 3 determinações sequenciais separadas: a contagem total dos glóbulos brancos do sangue total. em monócitos. Provoca-se uma excitação desses elementos fluorescentes com uma luz “laser”e a identificação ótica é feita de maneira automatizada pelo sistema . . marcado com o corante fluorescente. mas também. 100 microlitos de sangue total é investigado com anticorpos monoclonais específicos dirigidos contra os marcadores CD3. Embora não identifiquem células individuais. 63 . Os linfócitos T são ainda sub-classificados em duas sub-populações funcionais: os CD4 auxiliares e os CD8 citotóxicos.

uk/axp/facs/davies/flow.br/g 105.com .br/inform/ Cd4/Cd8 .criesp.capacity.icnet.it/apher/write/cytome. microbiologia.br/hot news . Renato CD4/CD8 → www.6.htm -www. pois é um teste simples.uronews. e assim direcionando os rumos terapêuticos. • Bibliografia: -Di Dio.med. Além de ser um método aplicável em diversas áreas. que permite a separação e contagem de células com excelente sensibilidade diagnóstica. identificação das sub-populações de linfócitos do sangue.htm -www.do.htm -Citometria de Fluxo → www.org. Permitindo o diagnóstico e prognóstico de diversas doenças.html -Citometria do DNA → www.64 Conclusão: Portanto a técnica de citometria de fluxo vem sendo muito utilizada.unipi.org. etc. também utilizado para determinar as fases do ciclo celular na fração de proliferação de tumores.br/citometria -www. como .html 64 .hcan. medicina e outras. determinar a quantidade de DNA numa população celular. usado na classificação de leucemias. genética.com.

II:46-60. SILVA.V. Ano VI. Imunologia Básica e Aplicada. CALDWELL. Imunologia Básica 2000. Manual de Imunohistoquímica. D. Vol. G. VASSALO.65 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIER. Rio de Janeiro. 1989. H. . Rio de Janeiro. São Paulo 1999. D. 2ª edição. A. H..: Algumas técnicas foram obtidas a partir dos Kits reagentes. STITES. WELLS. Revista LAES. V. Edição Extra. F.. C. Revista LAES.. nº 52:08-26 ALVES. VAZ. Obs. 1980.. MOTA. . J. A. FUNDENBERG. P. V. Eletroforese. Aplicações Clínicas da Imunoeletroforese. J. C. I. O..Editora Guanabara. 65 . Imunologia Básica e Clínica. C. L. L. Ano IX. A. W. J. HOXTER. Editora Guanabara. BACCHI. VOOS. 2ª ed. CALICH. 4ª edição. E. maio/85. .

O diagnóstico de rotina da Brucelose em bovinos será realizado através das provas de soroaglutinação rápida ou lenta. aprovado pelo Decreto nº 24. de 03 de julho de 1934 e considerando a necessidade de atualizar a legislação existente sobre profilaxia da Brucelose. 3º. anexas à presente Portaria. precipitação pelo rivanol. prova do antígeno tamponado acidificado (prova do cartão . assinadas pelo Diretor Geral do Departamento Nacional de Produção Animal.DO DIAGNÓSTICO Art. DE 20 DE JANEIRO DE 1976 Aprova as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal O MINISTRO DE ESTADO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO. 4º. vacinados entre 3 e 8 meses de idade 1/25 1/50 (25 UI/ml) (50 UI/ml) I + + I + + + + + + + + + + Convenções: I: Aglutinação incompleta.548. do Regulamento do Serviço de Defesa Sanitária Animal. 2º. será utilizada para determinação da taxa de prevalência da Brucelose em rebanhos leiteiros. em provas de rotina no caso de rebanhos-problema. resolve: Art. Revogar as Portarias Ministeriais números 486 e 222. Como provas especiais."card test") e prova individual do anel do leite. tendo em vista o disposto no art. 1º. no uso de suas atribuições. A prova de sêmen-plasma-aglutinação será utilizada em reprodutores dos Centros de Inseminação Artificial e além da prova de soroaglutinação. cuja interpretação obedecerá aos quadros a seguir: Bovinos não vacinados ou vacinados com idade superior a 8 meses 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + + + 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Positiva Positiva Bovinos de 30 meses ou mais. Aprovar as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal. A prova do anel no leite. UI: Unidades internacionais 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Art. 86. Art. em amostras compostas. 66 . redução pelo mercapto-etanol. 1º. NORMAS PARA A PROFILAXIA DA BRUCELOSE ANIMAL CAPÍTULO I .º 23 Ministério da Agricultura e do Abastecimento PORTARIA nº 23. de 22 de abril de 1958 e 5 de março de 1969. Art. +: Aglutinação completa. Art. visando dirimir eventuais dúvidas.66 Anexo CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA PORTARIA N. poderão ser utilizadas as provas de fixação do complemento. 2º. respectivamente.

não se admitindo vacinação de machos. Como necessário. bem como a coleta de amostras das partidas produzidas. Excluem-se da marcação. aplicando rigorosos cuidados higiênicos complementares. conforme Anexo 1. acompanhado do algarismo final do ano da vacinação. com vacina viva. 67 . 13. não poderão ser objeto de comércio. Art. Art. emitir atestado de vacinação. no lado direito da cara. cabendo ao órgão local do Ministério da Agricultura o acompanhamento e controle da produção. abortus. que serão fornecidas pela unidade de controle. 6º. em 3 (três) vias. somente uma vez. 16. CAPÍTULO V . leite. CAPÍTULO II . com um V. de forma a permitir a adoção das medidas previstas no RIISPOA. Art. observando-se os seguintes critérios. poderão ser realizados exames bacteriológicos de fetos abortados. sêmen e outros materiais possivelmente infetados. anexos fetais.DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE VACINAS Art. isolar as vacas reagentes por ocasião do parto. Os animais que revelarem reação positiva serão marcados a ferro candente. 12. 8º. desinfetando os locais contaminados. 15. o proprietário dos animais deverá assinar termo de compromisso. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetros) de diâmetro. elaborada com a amostra 19 de Br. os sacrifício será realizado em matadouro sob inspeção federal e o julgamento efetuado de acordo com as disposições em vigor. Os bovinos positivos ou suspeitos de Brucelose. isolar os animais reagentes. controlada pelo órgão oficial competente. após a liberação da partida correspondente.DA VACINAÇÃO DE FÊMEAS ADULTAS Art. observandose o seguinte critério: a. CAPÍTULO IV . c. o Serviço de Inspeção Federal no estabelecimento onde será realizado o sacrifício deverá ser notificado com antecedência. observando-se as seguintes condições: a. 10. 11.67 Art. a critério da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. Art. vacinar somente bezerras entre 3 e 8 meses de idade. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetro) de diâmetro conforme Anexo 1. do estoque de vacina. a. em cada propriedade afetada. A vacina com a amostra 19 será produzida por laboratórios autorizados. 14. quando observado aborto. no lado esquerdo da cara. b. 9º. A aplicação da vacina da amostra 19. c. recomenda-se a adoção das seguintes providências: a. a vacinação será realizada apenas uma vez. b. marcar as bezerras vacinadas. serão identificadas com ferro candente. b. mediante requerimento do proprietário e autorização expressa do responsável pelo programa de combate à Brucelose na respectiva Unidade da Federação. as bezerras destinadas ao Registro Genealógico. A vacinação de fêmeas adultas com a amostra 19 poderá ser autorizada em propriedades onde estiverem ocorrendo surtos de abortos brucélicos. até que cessem os corrimentos vaginais. A imunização dos bovinos contra a Brucelose será levada a efeito pela vacinação de bezerras. 5º. b. A vacina com a amostra 19 será apresentada sob a forma liofilizada. Os frascos de vacina levarão etiquetas oficiais. Cada partida de vacina produzida será oficialmente controlada. 7º. admitindo-se a vacina líquida até o aparelhamento dos laboratórios produtores. as fêmeas vacinadas com a idade superior a 8 (oito) meses. quando devidamente identificada. aceitando as condições estabelecidas. com ferro candente. Art. CAPÍTULO III . no lado esquerdo da cara. salvo quando comprovadamente destinadas ao abate ou a instituições científicas. Recomenda-se o sacrifício dos bovinos com reação positiva. c. destinando-se a 1ª ao proprietário. será efetuada sob a responsabilidade de médico veterinário.DOS ANIMAIS REAGENTES Art. constantes do Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA). dos protocolos. enterrar o feto e seus anexos. conforme modelo do anexo 2. Art. observando-se a legislação federal específica e de acordo com as técnicas recomendadas pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. a 2ª ao serviço veterinário oficial e a 3ª ao emitente. Nos casos em que não seja possível o sacrifício. considerando a porcentagem de incidência da doença e as condições locais. Art.DA VACINAÇÃO DE BEZERRAS Art.

Os criadores poderão inscrever-se um esquema voluntário. 20. 24. Art. positivos os animais com títulos iguais ou superiores a 1:25.68 Art. prova rápida. 25. Art. lenta e do anel no leite. devendo o mencionado produto ser fornecido somente a médicos veterinários. 29. O trânsito internacional de bovinos. 28. A produção de antígenos para diagnóstico de Brucelose pelos demais laboratórios oficiais poderá continuar até a instalação e o funcionamento do laboratório central do Ministério da Agricultura. ou atestado negativo para Brucelose. também não é admitida a classificação de suínos suspeitos. Os animais da propriedade serão identificados por tatuagem ou outra forma. submetida cada partida a controle oficial. quando acompanhadas de atestado de vacinação contra a Brucelose. CAPÍTULO VII . realizadas nos suínos com idade superior a 6 (seis) meses. dependerá da apresentação de: a. vacinadas na idade recomendada. sendo neste caso. b. Os antígenos para diagnóstico da Brucelose.Incompleta. diagnósticos da situação.DA CERTIFICAÇÃO DE PROPRIEDADE LIVRE Art. para obtenção do Certificado de Propriedade Livre de Brucelose. admitindo-se o título máximo aglutinante até 1:50 para fêmeas bovinas com idade superior a 30 (trinta) meses. utilizando-se a prova de antígeno acidificado temponado (card test). Art. O atestado de exame negativo para Brucelose será válido por 60 (sessenta) dias. quando os reprodutores apresentarem resultados negativos atestados acompanharão os animais. 26. os animais são classificados somente em positivos e negativos. A profilaxia da Brucelose suína será baseada na adoção das seguintes medidas: a. DAS EXPOSIÇÕES E FEIRAS AGROPECUÁRIAS Art. 21. obedecendo as técnicas de produção e controle recomendadas pela Organização Mundial da Saúde. 27. A inscrição de bovinos no Registro Genealógico e a participação dos mesmos em Exposições e Feiras Agropecuárias. sêmen e produtos derivados reger-se-á pela legislação específica vigente. c. através de exame dos rebanhos em áreas de suinocultura mais expressiva. atestado de vacinação contra a Brucelose. a contar da data da realização do respectivo exame. inclusive pelo Registro Genealógico. d.DO REGISTRO GENEALÓGICO. Art. utilizando-se as provas de soroaglutinação rápida e lenta ou a prova com antígeno acidificado tamponado (prova do cartão . CAPÍTULO IX . CAPÍTULO VIII . O controle da distribuição de antígenos para diagnóstico de Brucelose.DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE ANTÍGENOS Art. serão produzidos por um só laboratório oficial. 19. CAPÍTULO VI . nas provas de soroaglutinação rápida e lenta. As condições que uma propriedade deve preencher para ser considerada livre de Brucelose serão estabelecidas através de instrução da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. Não será exigido atestado negativo para fêmeas bovinas com idade inferior a 30 (trinta) meses. para fêmeas bovinas até 30 (trinta) meses de idade. 23. são considerados negativos os rebanhos que não apresentarem qualquer animal com aglutinação superior a 1:100 . Art. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta."card test"). Art. para fins de trânsito interestadual. considera-se com infetado o rebanho no qual forem identificados um ou mais suínos com aglutinação completa na diluição de 1:100.DO CONTROLE DE TRÂNSITO Art. A comercialização da vacina será objeto de fiscalização oficial e sua aquisição e aplicação sob responsabilidade de médico veterinário. vacinadas entre 3 e 8 meses de idade. Somente será fornecido certificado de inspeção sanitária animal. estando as bezerras e novilhas devidamente marcadas e identificadas. 22. CAPÍTULO X . será efetuado pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. 18. e. Suínos procedentes de rebanhos negativos 1/25 (25 UI/ml) I + 1/50 (50 UI/ml) 1/100 (100 UI/ml) Interpretação Negativa Negativa 68 . Art. sendo que a interpretação das mesmas obedecerá o critério constante dos quadros a seguir: b.DA PROFILAXIA DA BRUCELOSE SUÍNA Art. 17.

DAS DISPOSIÇÕES GERAIS Art. A profilaxia da Brucelose ovina e caprina será baseada na adoção das seguintes medidas.69 + + + + I + + + I + Negativa Negativa Negativa Positiva Suínos procedentes de rebanhos positivos. quando o título for de 1:50 ou maior. controle rigoroso de plantéis indenes. b. além das soroaglutinações rápida e lenta. positivos retestados. b. até que sejam estabelecidos novos modelos. CAPÍTULO XI . JOSÉ PEDRO GONZALES Diretor Geral do DNPA 69 . CAPÍTULO XII . especialmente dos reprodutores utilizados. a. 33. 32. c.DA BRUCELOSE OVINA E CAPRINA Art. reação positiva. A interpretação dos resultados das provas sorológicas de aglutinação para ovinos e caprinos. vigilância severa e permanente das importações de ovinos e/caprinos. Parágrafo único. A presença de suínos infetados numa criação justifica o sacrifício do rebanho. quando o título não ultrapassar de 1:25. serão precedidas provas de fixação do complemento. levantamento da prevalência da doença nas áreas de criação. parcialmente testados ou desconhecidos 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + 1/100 (100 UI/ml) I + Interpretação Negativa Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Art. Os casos omissos e as dúvidas suscitadas na execução e interpretação destas normas serão resolvidos pelo Diretor da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. reação suspeita. Art. considerados os antecedentes clínicos e epidemiológicos. 30. Art. Nos casos positivos e suspeitos. 31. obedecerá o seguinte critério: a. A Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura baixará instruções complementares permanecendo em uso os atuais formulários para exames de Brucelose e vacinação. 34.

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