UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA

Imunologia
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 2006

PROFª ÂNGELA DA COSTA PEREIRA PROFª INÊS APARECIDA TOZETTI PROFº ANDRÉ LUIS SOARES DA FONSECA

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SUMÁRIO
PARTE I

Técnicas de obtenção e conservação do material usado em Imunologia......................... Diluições......................................................................................................................... Cromatografia em Coluna................................................................................................ Eletroforese de proteínas................................................................................................. Princípio Teórico da Fixação de Complemento............................................................... Reação de Imunohemólise............................................................................................... Reação de Fixação do Complemento.............................................................................. Precipitação em meio semi-sólido................................................................................... Reação de Aglutinação.................................................................................................... Reação de Aglutinação Rápida para Pesquisa de Anticorpos Anti-Brucella................. Reação de Microaglutinação Passiva - Reação de VDRL............................................. Reação de Aglutinação indireta ou passiva Fator Reumatoide...................................... Imunohematologia Sistema ABO.................................................................................. Teste de Coombs Diagnostico da D.H.R.N................................................................... Reação de Inibição de Aglutinação Passiva.....................................................................
ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)………...........................

5 6 8 12 16 17 18 19 22 23 24 25 26 28 29 30 33

Reação de Imunofluorescência.........................................................................................

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PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Resistência Inespecífica................................................................................................ Células do Sistema Imune............................................................................................ Formação de Células T e B e Órgãos Linfóides........................................................... Antígeno....................................................................................................................... Imunoglobulinas (I)...................................................................................................... Imunoglobulinas (II).................................................................................................... Sistema Complemento................................................................................................. Fagocitose.................................................................................................................... Complexo Principal de Histocompatibilidade (CHP/MHC)......................................... Células Apresentadoras e de Antígeno e Mecanismo de Apresentação........................ Linfócitos T................................................................................................................... Linfócitos B e Resposta Primária e Secundária............................................................. Genética de Imunoglobulinas........................................................................................ Interação do Sistema Imune.......................................................................................... Tolerância Imunológica................................................................................................. Reações de Hipersensibilidade..................................................................................... Transplantes.................................................................................................................. Eletroforese................................................................................................................... 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 54 55

PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS E EXERCÍCIOS
Radioimunoensaio........................................................................................................... ELISA............................................................................................................................. Western blotting.............................................................................................................. Imunohistoquímica.......................................................................................................... Exercício sobre Resposta Imune às infecções.................................................................. Citometria de Fluxo......................................................................................................... Referências Bibliográficas............................................................................................... 57 58 59 60 61 62 65

Anexo Portaria 23 para normatização do diagnóstico sorológico da Brucelose............... 66

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4 PARTE I TÉCNICAS UTILIZADAS NAS AULAS PRÁTICAS 4 .

Antes de se passar o sangue da seringa para o frasco. Após a coleta. Se necessário armazenar o soro. . da boa condição em que essa material fonte se encontre à disposição do laboratório. como fonte de material do indivíduo (seja o homem ou outro animal). O gelo deverá ficar dentro de um saco plástico para evitar penetração de água nos vidros com soro. deve-se seguir o preparo e estocagem do material. OBSERVAÇÕES IMPORTANTES . em grande parte.Em geladeira. Para obtê-lo colhemos uma amostra de 5 a 10 ml de sangue por punção intravenosa. o sangue é colhido sem qualquer anticoagulante. tendo-se para isto. se sua utilização for ocorrer nas primeiras 72 horas. . . Se você precisar enviar a amostra do campo para a cidade procure antes retirar a fração líquida a partir do coágulo e enviá-la em um outro vidro bem tampado rotulado e acondicionado em caixa de isopor com gelo.O sangue colocado em frasco para a retração do coágulo deve ser mantido em repouso. coleta-se a fração líquida que se separou do coágulo . O processo de coagulação do sangue começará a se estabelecer. se for necessário uma estocagem por mais dias. deve-se conservá-lo diluído a 1:2 em glicerina ou tratá-lo com ázida sódica a 1% para inibição do crescimento de microrganismos e estocá-lo em freezer. o cuidado de retirar a agulha da seringa. Embora essas reações possam também ser feitas no líquor e ainda em células linfóides deste indivíduo. 5 . CONSERVAÇÃO DO SORO . no campo ou no próprio laboratório. sem agitação alguma. Este sangue deve ser passado instantaneamente para um frasco. OBTENÇÃO DE SORO O soro é a fração líquida do sangue. então. As hemácias se sedimentarão pela centrifugação e o sobrenadante se constituirá em uma amostra de soro isenta de hemólise e pronta para ser utilizada nas reações.O laboratório se encarregará de centrifugação. o sucesso da reação dependerá. o que decorrerá consequentemente da competência do médico. de 30 minutos à 1 hora após a punção. A seguir essa fração líquida é submetida à centrifugação de 1500 RPM durante 5 minutos para separar o soro do resto das hemácias. sem o fibrinogênio. mais freqüentemente o soro.5 TÉCNICAS DE OBTENÇÃO E CONSERVAÇÃO DO MATERIAL USADO EM IMUNOLOGIA As reações imunológicas utilizadas em auxilio diagnóstico à clínica e na pesquisa experimental tem. .Você deverá também acondicionar em gelo. se tiver que mandar o soro de uma cidade para outro centro. veterinário ou bioquímico na coleta de material.Em freezer. . este último já deve estar completamente seco e rotulado com a especificação do indivíduo.Para se obter o soro. odontólogo. seja no consultório.

Quando colocamos. se o último tubo que demonstra reação contém um volume de 1 ml e o soro neste tubo é uma parte em um total de 640 partes. Em imunologia clínica o título indica a concentração de anticorpo no soro do paciente.1 ml + 2. 1:50. O título de anticorpo de um soro é a diluição mais alta de soro que reage com o antígeno.1 ml + 4.5ml de soro. etc. o título é 640 unidade/ml de soro. Portanto. ou seja. Usualmente se expressam as diluições como uma unidade da solução original sobre o total de unidades da solução final. pois há 0.9 ml Diluição a 1/ 50 1 ml + 49 ml ou 0.4 ml Diluição a 1/20 = 1 ml + 19ml ou 0. ficamos com uma diluição do soro a 1:2. As diluições não devem ser interpretadas como significando uma unidade mais 10 unidades.1 ml + 1. Isto é conseguido geralmente adicionando-se a uma solução que se pretende diluir um diluente tal como água.0 ou 1:2.1 ml + 1. uma unidade em um total de 10 unidades.1 ml + 9. por exemplo. 1/50 etc. 0.0 ml de solução. As diluições podem ser representadas como 1:10.6 DILUIÇÕES A diluição é o ato de tornar mais fraca uma dada solução.4 ml 6 .5:1. ou cloreto de sódio a 0. ou 1/10. uma solução diluição 1/10 significa que uma unidade da solução concentrada foi diluída para um volume total de 10 unidades.85% em um tubo e adicionamos a esta solução 0. portanto uma diluição de 0.1 ml + 0.9 ml 1 ml da diluição 1/10 + 4 ml do diluente Diluição 1/100 1 ml + 99 ml ou 0. TÉCNICAS GERAL DAS DILUIÇÕES Diluição em múltiplos de 10 Diluição a 1/10 1 ml + 9 ml ou 0.5 ml de NaCl a 0. Por exemplo.5 ml de soro em um volume total de 1. na quantidade requerida para conseguir uma diluição determinada. que não contenha nenhuma das substâncias diluídas.9 ml Diluição a 1/25 = 1 ml + 24ml ou 0.85%.9 ml 1 ml de 1/10 + 9 ml Diluição 1/500 1 ml 1/100 + 4 ml Diluição 1 /5000 1 ml 1/1000 + 4 ml Diluição 1/10000 1 ml 1/1000 + 9 ml DILUIÇÕES VARIADAS Diluição a 1/5 = 1 ml + 4ml Diluição a 1/15 = 1 ml + 14 ml ou 0.

homogeneizar com o auxilio de uma pipeta. 1/1024. Com base no esquema abaixo.Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2.0 ml do diluente em cada tubo.etc. 4 . Exercício de Fixação: 1) Esquematize uma diluição 1/50 de uma solução previamente diluída a 1/10.Diluições sucessivas na razão igual a 4: 1 . utilizando inicialmente apenas o volume de 0. tenha ocorrido a formação de um precipitado no fundo do tubo (como descrito abaixo na legenda).Ao tubo 1 adicionar 1 ml da solução corante (a ser diluída).Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. 4)Esquematize uma diluição 1/64 de uma solução previamente diluída a 1/8. 5)Esquematize uma diluição 1/625. partindo de uma diluição 1/5. determine o título dessa reação: Não ocorreu interação Ocorreu interação Ag-AC 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 7 . 1/16.Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3. quando esses estavam presentes em concentração suficiente. 3 . esquematize uma diluição na razão 3 até o 5º tubo. As diluições obtidas serão: 1/4.5ml dessa amostra e diluindo até o 8º tubo. Exemplo . 5 . 2) Esquematize uma diluição na razão 2 de um soro. 3)Utilizando um volume de soro de 0. 6)Vamos imaginar que após a interação entre o antígeno e ao anticorpo. 2 . homogeneizar. homogeneizar. desprezando 1 ml do último tubo.7 DILUIÇÕES SUCESSIVAS Nesta técnica se transfere sucessivamente volume determinado de um tubo para o tubo seguinte ao qual se adicionou uma certa quantidade de diluente.4ml.Distribuir nume série de tubos 3. 1/64. 1/256.

 A  B  C PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA A = a camada da coluna é feita de uma matriz de partículas de celulose positivamente carregadas. A troca do pH do tampão que passa através da coluna afeta a carga da molécula protéica. As características físicas das moléculas de proteínas resultam em retenção destas na matriz do gel em graus diferentes. O aumento da molaridade do tampão fornece mais íons para competir com a proteína pela ligação ao gel. A carboximetil-celulose (CM-celulose) é uma resina carregada negativamente. A unidade funcional do gel é um grupamento carregado preso em um suporte. cheia de um gel sintético. e a subsequente eluição. B = a solução contendo moléculas negativamente carregadas e outras neutras é colocada na coluna. Nestas técnicas. na mistura protéica ligam-se à coluna e são retidas. uma amostra é depositada no ápice de um cilindro ou coluna de vidro. enquanto que as moléculas neutras passam entre as partículas carregadas e são eluidas. geralmente celulose. No quadro a seguir temos exemplificado a molaridade de NaCl e pH requeridos para eluir as proteínas plasmáticas humanas da DEAE-celulose. e flui através do gel. CROMATOGRAFIA POR TROCA IONICA A cromatografia por troca iônica separa as proteínas aproveitando a diferença de suas cargas elétricas. sendo usada para o fracionamento de moléculas negativamente carregadas.8 CROMATOGRAFIA EM COLUNA Técnicas cromatográficas são atualmente métodos amplamente empregados para o fracionamento de proteínas e isolamento de imunoglobulinas. e é usada para o fracionamento de moléculas positivamente carregadas. Pelo aumento da molaridade ou diminuição gradual do pH do tampão de eluição as proteínas são eluidas em função do número crescente de grupos carregados ligados ao gel. sob condições apropriadas. 8 . permite a separação das proteínas. C = as moléculas negativamente carregadas. A dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose) é uma resina positivamente carregada.

α 2 globulina. Aumentando-se o pH do tampão.Na+ SO3 Na + H3N + OH COOH AMINOÁCIDO B ELUÍDO pH 4. no pH 2. Os aminoácidos com carga positiva em um meio fortemente ácido ocuparão as posições do sódio de uma resina de troca catiônica.0 transferrina. β lipoproteína 0. OH pH 2. haptoglobina -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A cromatografia em DEAE . os aminoácidos tornam-se carregados negativamente.Na+ OH SO3.0 α 2 globulina.5 α2 globulina. O aminoácido A continua adsorvido à coluna.5 SO3.100 6.025 7. de modo que haja um aumento progressivo do pH. IgA 0.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH SO3.5 9 . No pH 3.5 apenas o aminoácido B é eluido.8 IgG 0. Exemplificamos abaixo a separação de aminoácidos com a resina de troca iônica sob condições ácidas.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A ELUÍDO pH 3.5 o aminoácido A também é eluido. albumina. os aminoácidos são eluidos de forma diferente.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH H3N+ COOH AMINOÁCIDO B SO3.080 6.5 albumina. refletindo as diferenças nas constantes de dissolução dos grupos ionizáveis da resina.045 7. ligando-se à carga negativa da resina. a qual pode ser obtida quase livre de todas as outras proteínas séricas.0 SO3. Utilizando-se de um tampão.050 7. e serão eluidos da coluna trocando-se novamente os íons sódio.9 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Molaridade de NaCl PH Proteínas eluidas -----------------------------------------------------------------------------------------------------------0. fibrinogênio 0. Os aminoácidos com a carga positiva trocam de posição com os cátions sódio da resina.0 (ambos aminoácidos A e B são adsorvidos). Já no pH 4.celulose é uma técnica excelente para o isolamento de IgG. β globulina.

dependendo primariamente do tamanho e são separadas por um simples processo de peneiração. penetram no seu interior e ai são retidas. PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A . A B C 10 . não podendo penetrar nestes.) e grandes (. como dextran (Sephadex) .As moléculas entram e passam através da coluna em proporções diferentes. C .As moléculas maiores são eluidas. Por isso. A IgM pode ser facilmente separada de outras imonoglobulinas séricas por gel filtração. as moléculas protéicas mais volumosas que os poros das partículas. As partículas são porosas contendo microcanais. Assim. passam através do gel na fase liquida fora das partículas e são eluidas primeiro. as moléculas aprecem no eluente de coluna em ordem decrescente de tamanho. B .O círculo aberto (O) representa as partículas de dextran polimerizado sobre as quais um a mistura de moléculas protéicas pequenas (.) é depositada. enquanto as menores são retidas. cujos diâmetros permitem a passagem ou a retenção de moléculas de diferentes tamanhos. A gel filtração é largamente usada também para separar as cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas ou para isolar proteínas de Bence-Jones (cadeias leves) puras de urina de pacientes com mieloma múltiplo.10 CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A gel filtração separa as moléculas de acordo com o seu tamanho.. O solvente e as moléculas menores que os canais. A fase estacionária é mais comumente constituída de partículas hidrófilas tipo gel.

o qual desfaz as ligações antígeno-anticorpo. ou as moléculas de antígeno são insolubilizadas pela ligação cruzada com glutaraldeído. acoplando-se um anticorpo a uma matriz inerte. Um antígeno é acoplado à uma matriz insolúvel tal como a Sepharose. A ligação antígeno-anticorpo é uma das reações que podem ser aplicadas á cromatografia por afinidade.11 CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE A cromatografia por afinidade usa interações biológicas especificas reversível entre o material do gel e a substância a ser isolada. aqueles anticorpos especificos contra o antígeno são retidos pela ligação aos antígenos fixados ao gel. Quando a mistura de anticorpos de diferentes especificações é passada através da coluna. Uma técnica semelhante pode ser usada para purificar um antígeno. Estes anticorpos específicos podem ser recuperados pela lavagem da coluna com um tampão ácido. 11 .

4 Albumina α 1 . O espectro das proteínas séricas varia entre pH 4. Isto faz com que todas as proteínas se carreguem negativamente e migrem na mesma direção. Assim. elas podem separar-se em cinco grupos principais (por meio da eletroforese convencional de zona). beta(β) globulina e gama(γ) globulina.4 . se for negativa.5 a pH 6. Em circunstâncias opostas. a saber: albumina(fração mais rápida). globulina Alfa (α).12 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS Princípio: Chama-se eletroforese.2. apresentam ponto isoelétrico acima deste espectro.baseando-se na diferença de velocidade de migração das diversas proteínas. Esquema isoelétrico das proteínas séricas pH 4. estas possuem grupos amino e carboxílicos livres e devido a isso estão carregadas positiva ou negativamente em solução aquosa na dependência do pH do meio. com maior velocidade se distanciará dos componentes menos carregados de maneira que as partículas com pouca ou nenhuma carga permanecem relativamente estacionadas. em seguida a globulina Alfa (α). em uma dada proteína. o que é determinado pelo pH do meio onde a proteína é isoelétrica. migrará para o positivo ou ânodo.5. No caso das proteínas. ao fenômeno da migração de partículas eletricamente carregadas sob a influência de um solvente condutor (tampão). por outro lado.globulina α 2 . Conforme a velocidade de migração. resulta uma carga negativa. se a carga da superfície da partícula for positiva. a eletroforese é executada com um tampão de pH fora do espectro isoelétrico. Quando as cargas positivas e negativas se neutralizam. Quanto mais carregada a partícula. Algumas proteínas de localização intracelular. sua migração será para o pólo negativo ou cátodo.0. as partículas carregadas avançam para o eletrodo de carga contrária.5-8 β globulina β lipoproteína pH 6. Toda proteína tem seu “ponto isoelétrico”. Em geral as proteínas séricas são separadas em um pH que varia de 8.globulina Na maioria das vezes. As proteínas que tem pontos isoelétricos mais ácidos. pH 5.3 γ . Quando a soma das cargas positivas excede o número total de cargas negativas.6.globulina 12 . a proteína não tem carga e se denomina “isoelétrica”. Em meio alcalino se carregam eletronegativamente e quando submetidas a uma corrente elétrica migram para o ânodo com uma velocidade que guarda relação com o número de suas cargas. a molécula tem uma carga positiva. Assim.1. é possível a separação dos componentes protéicos do fluidos biológicos. estão altamente carregados e migram com maior rapidez.7 .8 a 9.

Na eletroforese do soro. região das α2globulinas. Devem ser feitos testes quantitativos específicos.globulinas e. Cadeias leves livres são prontamente detectáveis na urina quando presentes em quantidades aumentadas. bioquímicos ou imunológicos. Nestes distúrbios ocorre geralmente um pico protéico restrito eletroforeticamente na região de γ . ocasionalmente. como na proteinuria de Bence Jones do mieloma.globulinas. Uma diminuição na concentração de γ . tal como ocorre na hipogamaglobulinemia.13 APLICAÇÕES NA IMUNOLOGIA A eletroforese de zona é extremamente valiosa para o diagnóstico dos distúrbios paraprotéicos humanos tais como mieloma múltiplo e microglobulina de Waldenstron.globulinas do eletroforetograma. também pode ser detectada com esta técnica. a maioria das imunoglobulinas migra para a zona designada γ . Picos nestas regiões são também compatíveis com distúrbios paraproteinemicos que envolvem imunoglobulinas. 13 . mas também são encontradas quantidades significativas na zona de β . para a identificação da proteína em questão.globulinas.

Fazer a dosagem de proteínas totais da amostra de soro. retirar a fita e colocá-la em banho corante por 10 minutos. Tampa a cuba e ligar. papel de filtro. Só uma superfície da fita é penetrável.O. agitar para propiciar a descoloração da fita e transferir para outro banho descorante. Colocar as fitas de cellogel imersas em tampão de corrida por pelo menos 10 minutos.Fazer os. tubos de ensaio e etc. desligar a cuba. ajustando para 200 Volts. então. Repetir o processo até as partes sem proteína na fita ficarem brancas. 2. 4..036 (Veronal sódico 0. Método 1. 7. 5. cortar as frações coradas e introduzí-las em tubos de ensaio respectivamente marcados.6 forca iônica 0.Ler em espectrofotometro usando um comprimento de onda de 520nm. obtendo assim a densidade óptica da amostra (D. Agitar até a fita dissolver-se completamente. Retirar as fitas do tampão e secá-las com papel de filtro. essa é a face opaca.Para a determinação quantitativa das frações protéicas.Retirar as fitas do banho corante e transferir para um recipiente com a solução descorante.0 cm do polo negativo. Terminada a corrida. 12. uma leve aplicação do soro a cerca de 2. Colocá-las esticadas sobre o suporte da cuba. Fazer. 8. As tiras tem um angulo picotado. microaplicador. 9. 3. 6.14 TÉCNICA: ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE CELULOSE Material necessário • Fitas de acetato de celulose (CellogelR) • Tampão de corrida pH 8. visível depois de seca . 10.15) 14 . Lavar o microaplicador com água destilada e colocá-lo em contato com a amostra de soro.) 13. Preencher cada um dos compartimentos da cuba de eletroforese com tampão de corrida. deixar correndo a amostra por 35 minutos.04M) • Corante Ponceau`s • Solução descorante (Metanol a 50%) • Solução de eluição (ácido acético a 80%) • Fonte de continua para 200 volts • Cuba de eletroforese • Espectrofotometro Pipetas. Observar para que ambas as extremidades da fita estejam em contato com a solução tampão e o picote da fita na canaleta positiva. contendo 2 ml de solução de eluição. com a face absorvente voltada para cima (Obs. Fazer um tubo com um pedaço da fita sem proteína (branco) para zerar o aparelho. o qual deverá estar situado na posição inferior a direita do operador). cálculos conforme modelo da apostila (pag. 11.

....globulina γ...........3 10....O.... 3.............72 0.0 Valor absoluto g/100ml 4.. 0.......4 g/100 ml 0...8 4......553---------------.globulina α2...............67g/100ml Valores normais : Albumina...1 a 0....0 7.......91 7..x X = 0..1 12...034 0.2 g/100 ml 0.......18 : 100 = 4..................80% 0....6 g/100 ml 15 ..28 0... γ-globulina. divide-se por 100.......O...............globulina total D....67 0.15 CÁLCULOS Faz-se a leitura da densidade óptica de cada tubo...553 0.6 a 1...0 g/100 ml 0... Depois.........................................553 x 100 = 65.....10 g% Valor relativo (%) 0..6 a 5.085 0.5 a 1.....10 Proteína total = 7. FRAÇÕES Albumina α1.O.........841 EXEMPLO Valor relativo (%) 65... α1-globulina... β -globulina......80 x 7.. de cada fração pela soma-se das D..061 0..841----------------100% 0.......... e multiplica-se por 100.......10 = 467... para verificar o valor absoluto (g/100ml)....0 g/100 ml 0...841 Valor absoluto (g/100ml) 65...... α2-globulina.........globulina β .. Somam-se as densidades ópticas de cada fração e para obter-se o valor relativo em % divide-se a D....108 0...6 a 1...........9 100..52 0..

Se. Isto se consegue adicionando-se hemácias de carneiro sensibilizadas. e a adição subsequente do complemento acarretará rapidamente a bacteriólise. Quando ocorrer a união desses três elementos. este não poderá se fixar as bactérias e. Logo que se misturam os reagentes os eritrócitos formam uma suspensão vermelha opaca. formando sedimento vermelho. sem sedimento visível. e é portanto necessário adicionar um indicador. e outra sensível ao calor (termolábil). acontecerá uma das duas hipóteses: 1. Se. além das bactérias. Quando ocorre hemólise. o sistema hemolítico se completa e ocorrerá hemólise.Introdução: Em 1894. o complemento tiver sido ligado ao complexo Ag-Ac. o complemento estiver ausente. A bactéria que induziu a imunidade e contra a qual atividade era dirigida. por causa da liberação de hemoglobina das hemácias lisadas. Outras substâncias. Quando se mistura o soro desconhecido com um antígeno específico e o complemento. essa atividade desaparecia. 16 . imunes ou não (complemento). que mostrará o complemento que ainda permanece livre. que toma coloração vermelha transparente. diz-se que a bactéria está sensibilizada. ao contrário. O processo de hemólise. é facilmente visível a olho nu. Quando o soro da cobaia era aquecido. ocorrerá a união do anticorpo com a bactéria. ao contrário. podem agir como antígenos.Se o soro do doente não contiver o anticorpo especifico. presente no soro de quase todos os animais de sangue quente. antígeno da superfície bacterianaAnticorpo-complemento in vivo ou in vitro poderá haver bacteriólise. Antígenos solúveis também reagem com anticorpos específicos fixando o complemento. Em tal caso. quando cobaias restabelecidas de cólera eram infectadas com o vibrião colérico. Se não ocorre a hemólise. Se o anticorpo estiver ausente. pois não haverá complemento livre para se complexar aos eritrócitos sensibilizados.Se o paciente tiver a infecção em questão e se. Estudos posteriormente demonstraram que a atividade bacteriolítica se devia a duas substâncias encontradas no soro: uma resistente ao calor. seu soro tiver o anticorpo correspondente. mesmo existindo complemento em abundância. mas não haverá bacteriólise. o que serve para diagnosticar a infecção correspondente. é o ANTÍGENO. com sobrenadante claro e incolor. encontrada somente no sangue de animal imune (anticorpo). o complemento será ligado ou fixado ao complexo antígenoanticorpo específico e nenhum complemento será deixado livre.16 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO I . num tubo de ensaio. 2. portanto não as lisará. Pfeifer mostrou que. Se houver complemento livre. A aplicação da reação de fixação do complemento permite determinar a presença do anticorpo especifico no soro do paciente. não ocorrerá hemólise. o complemento permanecerá livre no líquido. quando se processa in vitro. por conseguinte. cuja destruição se denomina hemólise. a hemoglobina difundese no líquido. os glóbulos intactos depositam-se lentamente no fundo. Em nenhum dos casos haverá mudanças visíveis para relevar o que aconteceu. sobretudo os glóbulos vermelhos. seu soro possuía forte atividade bacteriolítica contra esse microorganismo.

9 ml no tubo 3 6 .Pipetas de 1 ml graduadas em 0.17 REAÇÃO IMUNOHEMÓLISE Quando injetamos hemácias de carneiro num coelho.1 ml de suspensão de hemácias nos 3 tubos 3 .Soro hemolítico (hemolisina) f . A reação de imune hemólise se verifica nas seguintes condições: Fresco + Suspensão de hemácias de carneiro + incubação a 37º C hemólise + Suspensão de hemácias de ausência de carneiro + incubação a 37ºC hemólise + Suspensão de hemácias de carneiro + Soro fresco de hemólise cobaia (complemento) + Incubação a 37ºC Soro de coelho imunizado contra hemácias de carneiro Inativado a 56ºC/30` Inativado a 56ºC/30` Nesta aula prática.Pipetar 0.3 tubos de ensaio c .Solução tampão com veronal Técnica: 1 .5 ml de complemento nos tubos 1 e 3 5 .Incubar em banho-maria a 37ºC. Os anticorpos encontrados no soro do coelho podem ser demonstrados pela reação de imunohemólise entre outras. 17 . os alunos executarão a reação de imuno-hemólise.3 ml no tubo 2 0.Pipetar 0.1 ml do soro hemolítico nos tubos 1 e 2 4 .Numerar os tubos 2 .Estante de metal b .Pipetar 0.Suspensão de hemácias de carneiro a 5% e . por 15 minutos.8 ml no tubo 1 1.Complemento g . com o objetivo de demonstrar que nesta reação participam três elementos distintos: ANTÍGENO = ANTICORPO = COMPLEMENTO Material: a .Pipetar solução fisiológica tamponada: (os respectivos valores em cada tubo) 0.1 d . este animal produz anticorpos anti-hemácias de carneiro.

QUADRO PARA ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS: RESULTADO Reação Soro Controle do soro Testemunho do Ag Testemunho do C INTERPRETAÇÃO 18 . acrescentar 0.6 ml 0.Sistema hemolitico (hemácias de carneiro + hemolisina ) f .Agitar a estante e levá-la a incubação em geladeira 2-4ºC.Complemento c .5 ml 05 ml 0.Incubar em banho-maria a 37ºC durante 30 minutos.5 ml 0.Tubos de 12 x 75 mm h .18 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO Material: a .5 ml 4(testemunho do C`) - Complemento DH 50% 0. 3 . Pipetar os reagentes segundo o quadro abaixo: TUBOS Soro do Antígeno paciente (dose ótima) 1(reação) 0.2 ml 0.3 ml 0.5 ml 2(controle do soro) 0.1 ml 0.2ml 3(testemunho do ag) 0. a 37ºC por 15 minutos.Tampão e .Soros (já inativados ) d .Antígeno b .Pipetas de 1 ml em 0.5 ml tampão 0. 4 .8 ml 2 .Estante de metal g . por 18 horas e. a seguir.2 ml do sistema hemolítico (mistura de suspensão de hemácias + soro hemolitico a todos os tubos).No dia seguinte.1 Técnica: 1.

bem como na paracoccidioidomicose. poderá interferir na solubilidade das proteínas. Na imunodifusão radial dupla. na anemia infecciosa eqüina. a reação ocorre mais lentamente e a temperatura acima de 37ºC pode resultar na formação das linhas de precipitação. Outra grande importância é a de se poder saber se duas substâncias são imunológicamentes idênticas. A imunodifusão é usada também com finalidade diagnóstica. mas deve se esperar 40 a 48 horas para o resultado final. temperatura. b) Lâminas de microscopia.8 pode impedir a reação e dissociar complexos de Ag . como por exemplo. tempo e principalmente as concentrações relativas de antígenos e anticorpo.Ac . A temperatura deve ser constante e entre a 4ºC e 37ºC . Geralmente usam-se lâminas de microscopia revestidas com camada de gel de ágar a 1% em solução salina ou tamponada. sendo que. ocorre a reação de precipitação. Na temperatura mais baixa. na hepatite crônica ativa. A forca iônica maior ou menor do que a do tampão recomendado. Fatores que interferem na reação de precipitação são: pH. O complexo antígeno . em que em determinado ponto de ótima proporção dos reagentes ou próximos deste.5 pode ocorrer precipitação não específica e o pH acima de 8. forca iônica do tampão. A reação usualmente ocorre entre 16 a 24 horas. tais arcos podem fundir-se dando identidade total ou parcial (esporão) ou intercruzam-se. demonstrando independência imunológica total entre os reagentes pesquisados. Os reagentes difundem-se radialmente formando uma linha visível resultante da precipitação e somente na região onde os dois reagentes se encontram nas proporções adequadas.19 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO SEMI-SÓLIDO Imunodifusão radial dupla (reacão de Ouchterlony) Esta técnica pode ser definida como a difusão de antígenos e anticorpos homólogos um em direção ao outro num meio gelificado. O pH deve ser entre 6. c) Pipetas graduadas de 5 ml.8 pois em pH abaixo de 6. d) Tubos capilares. A principal aplicação desta técnica tem sido na identificação de antígenos e anticorpos em misturas desconhecidas (como os fluídos biológicos). e) Solução de antígeno de Paracoccidioide brasiliensis f) Solução de anticorpos antiantígeno de Paracoccidioidis brasiliensis (soro controle) g)Soro humano para o teste h) Furador i) Câmara úmida 19 . os reagentes são colocados em orifícios separados e opostos feitos no gel. parcialmente idênticas ou independentes.anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arcos de precipitação. MATERIAL a) Solução de agar a 1% em solução fisiológica.5 a 8.

4 .20 TÉCNICA: 1 . OA O1 O2 O3 OB O4 A – Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 1 . utilizando um furador.Deixar dentro da placa de Petri. os antígenos e anticorpos de acordo com o esquema. usando um capilar para cada amostra. por 5 minutos. em câmara úmida. Esperar esfriar. algodão úmido para manter a umidade.soro do paciente 1 2 – soro controle positivo B .Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 3 . ou de uma cuba apropriada.soro do paciente 2 20 . Levar à geladeira. de maneira uniforme sobre a lâmina.Colocar a lâmina com o gel sobre o modelo (gabarito) e fazer os orifícios nos pontos indicados. 3. 3 ml de ágar fundido em solução fisiológica. 2 .Aplicar. colocando. 5 .Aplicar. ao lado.Fazer a leitura após 24 ou 48 horas.soro controle positivo 4 .

esquematize. através de linhas. o resultado esperado na seguinte reação de imunodifusão radial dupla: B E A D C LEGENDA: A= Solução de anti-IgA das secreções B=Saliva humana C=Solução de anti-IgM D= Solução de cadeias pesadas α E=Solução de IgA sérica b) Através de seus conhecimentos sobre Imunoglobulinas justifique os resultados nos encontros das linhas: Entre B e C: ___________________________________________ Entre C e D: ___________________________________________ Entre D e E: ___________________________________________ Entre E e B: ____________________________________________ 21 .21 Após a leitura do resultado e interpretação faça o seguinte exercício para sua auto-avaliação: a) Utilizando os reagentes de acordo com a legenda abaixo.

para doença de chagas. uma vez que os eletrólitos vão neutralizar a carga elétrica da partícula que em pH neutro possuem carga livre ou resultante negativa .Reação de aglutinação direta para toxoplasmose.para monucleose. 11 . um título precisa diferir em pelo menos duas diluições (dois tubos) para ser diferente de qualquer titulo dado.Reação de aglutinação para lepstospirose.Reação de Coombs . 2 . OUTRAS APLICAÇÕES DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO 1 .5 ml ou em placas de microaglutinação com quantidade bem menores de reagentes. Os resultados são expressos geralmente em títulos isto é. Exemplo de reações de aglutinação empregadas com finalidade de diagnóstico: 1 . Após poucas horas de incubação.Reação de hemaglutinação indireta para toxoplasmose.para revelar anticorpos incompletos em várias doenças.22 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno faz parte da superfície de eritrócitos.para diagnóstico da artrite reumatóide. As reações de aglutinação requerem a presença de eletrólitos. 22 . etc.2 .Reação de aglutinação de Paul-Bunnell . 9 . Por causa da variabilidade intrínseca no sistema de teste. Na aglutinação indireta faz-se adsorsão passiva ou acoplamento químico de antígenos solúveis a eritrócitos ou outras partículas inertes. Em anti-soros com títulos aglutinantes altos.Davidson .Reação de Widal . Neutralizada esta força repulsiva.Reação de Waaller .para riquetsiose. um fenômeno de pro-zona pode obscurecer os resultados. Testes para detectar anticorpos especificos são realizados pela titulação de soros imunes em diluições seriadas (2x) na presença de uma quantidade constante de antígeno.Classificação de pneumococos e estreptococos.Reação de aglutinação para listeriose. 3 .0. 7 .para febre tifóide. O fenômeno de pro-zona produz reações de aglutinação falsamente negativas em concentrações altas de anticorpos. 5 .Rose .Classificação de Salmonellas. bactérias ou mesmo de partículas inertes (ex: látex) que foram recobertas por um antígeno. o inverso da maior diluição do soro na qual ocorre aglutinação. resultando em maior sensibilidade. formando um agregado nítido. 12 .Reação de aglutinação rápida e aglutinação lenta para brucelose. Os anticorpos adicionais a estas suspensões combinam com o antígeno localizado na superfície das partículas unindo-as entre si.Reação de inibição de hemaglutinação . Os testes de aglutinação indireta podem ser também realizados em tubos ou placas de microaglutinação. 10 . 3 . 8 . Muitos antígenos se acoplam espontaneamente com eritrócitos e formam reagentes estáveis para a detecção de anticorpos.Determinação dos grupos sangüíneos e fator Rh. bactérias e uma variedade de espécies microbianas podem ser diretamente aglutinadas por anticorpos séricos.Reação de Wiel-Felix . a aglutinação está completa e as partículas são examinadas diretamente ou microscopicamente para evidência dos grumos. Shigelas e colipatogênicos. as células se aproximam permitindo a formação de pontes moleculares. Os testes são feitos em pequenos tubos de ensaio em volumes de 0.Reação de crio-hemaglutininas para pneumonia atípica primária. 2 . No teste de aglutinação direta eritrócitos.para diagnóstico de várias viroses. 6 . 4 .

Reação positiva (+): presença de aglutinação. 23 . NOTA: O resultado encontrado é expresso por um título.(Cuidado para não encostar a pipeta com antígeno na fração de soro para não haver contaminação do antígeno). 1:50 .23 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM PLACA PARA PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-BRUCELA Objetivo: Demonstração da Aglutinação Direta da suspensão bacteriana de Brucella abortus por anticorpos anti-brucela presentes no soro. 02 . 03 . 1:200 . as primeiras diluições de soro mostram-se negativas e as últimas (maiores) diluições apresentam reação positiva. As diluições finais serão aproximadamente 1:25 . aglutinação direta). 05 . Reação negativa (-): não aglutinação. 0.01 e 0.Com uma pipeta específica para reação aglutinação direta para o diagnóstico da brucelose (Pipeta de Bang) ou com pipeta de 0.02. 0. estando em uma concentração celular de 11%. Por isso.05 ml até a diluição contendo 0. 1:100 . ao contrário do que comumente ocorre.08 ml de soro (ou seja. que é um evento em que o excesso de anticorpos presentes no soro teste faz com que a equivalência da interação Ag/Ac somente ocorra após altas diluições desse soro. Atenção: Em soros apresentando títulos altos de anticorpos pode ocorrer o fenômeno de pró-zona.Agitar a placa com suaves movimentos circulares de 15 a 20 vezes por 3 minutos.Misturar cada composição soro-antígeno com um bastão. previamente identificadas com a respectiva diluição).(Vide anexa no fim da apostila). 0. o inverso da maior diluição onde se identificou a reação (no caso. 1: 400.05 ml do soro teste depositando separadamente cada fração do material sobre uma série de quadrados numa placa de vidro específica para esta reação (ou pipetar individualmente cada uma das quantidades indicadas colocando-as em lâminas individuais de microscopia.5% e corada com verde brilhante e cristal violeta. O antígeno utilizado nessa reação foi preparado de acordo com técnica internacional recomendada pelo Ministério da Agricultura. em salina fenicada a 8. iniciando com a diluição contendo 0.04. Em face da importância da Brucelose com zoonose.Fazer a leitura observando a aglutinação com uma fonte de luz apropriada. TÉCNICA 01 .08.2 ml.Agitar o frasco do antígeno padronizado e colocar uma gota do antígeno de Brucela (30 µl) ao lado da fração de soro. o Conselho Federal de Medicina Veterinária editou portaria específica que orienta a realização e a interpretação das reações sorológicas para o diagnóstico da Brucelose Animal. 04 . no sentido da maior para a menor diluição). nas reações em que se visualizam a pró-zona. ou seja. pipetar 0.

5 .Soros a testar.05 ml ) dos diferentes soros.Partículas agrupadas em pequenos grumos . movimentos rotatórios da placa sobre a superfície da mesa com amplitude de mais ou menos 03 cm.p. soros positivo e negativo.soro fracamente reativo.Lâminas escavadas. durante 04 minutos.soro fortemente reativo. TÉCNICA: 01 . no agitador próprio. a 180 r. e à produção de anticorpos. . 03 . Para tornar-se imunogênica a cardiolipina deve se ligar a uma proteína carreadora.R.não reativo .0 ml (agulha sem bisel).Acrescentar a cada soro uma gota de suspensão antigênica com uma seringa de 1. etc). a qual faz parte normalmente da membrana mitocondrial.Pipetas Pasteur. 4 . 24 . 3 . MATERIAL NECESSÁRIO: 1 . é um hapteno.. Cardiolipina sozinha. Infecções pelo Treponema pallidum levam à liberação nos fluídos orgânicos de cardiolipina. 04 .Seringa de 1 ml sem o bisel (ponta). ( a agitação pode ser manual).Suspensão do antígeno.Partículas finamente dispersas .Em cada escavação da placa colocar 01 gota (0. Pacientes com sífilis desenvolvem uma resposta de anticorpos contra um hapteno ubiquitário que existe nos tecidos dos mamíferos.24 REAÇÃO DE MICROAGLUTINAÇÃO PASSIVA . INTERPRETAÇÃO .REAÇÃO DE VDRL (VENERAL DISEASES RESEARCH LABORATORY) A reação do VDRL é usada para o diagnóstico sorológico da sífilis. inativados a 56ºC durante 30 minutos. A cardiolipina. através de uma técnica de microaglutinação passiva feita em placa escavada. Trata-se de um fosfolipídio.L. que pode ser extraído em alto grau de pureza do coração de bovino e é denominado cardiolipina. seja em testes de aglutinação passiva. 2 . mas não estimula sua produção. 02 .m. reforçada pela adição de doses adequadas de colesterol e de lecitina constitui excelente antígeno para a detecção da reagina sifilítica. somente se liga a anticorpos.Leitura: A leitura deve ser feita imediatamente após a agitação observando ao microscópio de acordo com a intensidade da reação. seja em testes de fixação do complemento (reação de Wasserman).Partículas agrupadas em grandes grumos . nos quais o hapteno é adsorvido a superfície de cristais de colesterol (reação de floculação de Kline. V. Anticorpos para antígenos cardiolipínicos são conhecidos como anticorpos de Wasserman ou reagínicos. entretanto.D.Agitar. isto é.

como grumos visíveis 25 .Adicionar uma gota do reativo látex globulina.25 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA: Teste para a pesquisa do Fator Reumatóide Látex Princípio: O fator reumatóide é uma macroglobulina (IgM) que se encontra presente no soro de 85 a 90% dos pacientes com Artrite Reumatóide e em 3 a 5% dos indivíduos normais. se encontra adsorvido a superfície de um suporte inerte de látex de poliestireno. 03 . Pode ser detectado por uma reação de aglutinação passiva ou indireta. POSITIVO: Aglutinação nítida que se apresenta macroscópicamente dentro de 2 minutos. onde o antígeno. IgG humana desnaturada pelo calor. pipetando 0. 05 . Usar um para cada círculo. resultando numa aglutinação visível macroscópicamente. a cada um dos círculos. O fator reumatóide é considerado um anticorpo contra a IgG.Agitar suavemente a placa com movimentos circulares.Preparar uma diluição a 1/20 do soro. 06 . e observar macroscopicamente o resultado da reação por tempo não maior que 2 minutos. previamente agitado. 02 . 1 gota da diluição 1/20 do soro a testar. 04 .Colocar no círculo central da placa fornecida.05 ml do soro teste no tubo contendo o tampão e homogeneizar bem.95 ml do tampão glicina e a seguir 0.Misturar e distribuir o conteúdo de cada círculo por toda sua área com um estilete. RESULTADO: NEGATIVO: Suspensão homogênea. Este antígeno reage imunológicamente com o anticorpo (fator reumatóide) presentes no soro.Colocar no círculo à esquerda 01 (uma) gota do soro controle positivo e no círculo a direita 01 ( uma) gota do soro controle negativo. TÉCNICA: 01 .

B. os indivíduos da espécie humana podem ser divididos em 04 grupos: A. AB e O.Sistema ABO De acordo com a existência ou não dos aglutinógenos A e/ou B. e) Lâminas de microscopia.26 IMUNO-HEMATOLOGIA 1) Grupos sangüíneos . quer pelo plasma. b) Soro anti A. Landsteiner (1990) verificou que era regra todo indivíduo apresentar no seu plasma aglutininas contra os aglutinógenos que lhes eram estranhos: -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Aglutinógenos nas Aglutininas no hemácias Plasma -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A A Anti B B B Anti A O Anti A e Anti B AB A e B -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Isso torna possível a tipagem do sangue de um indivíduo dentro do sistema ABO quer pelas hemácias. d) Pipetas Pasteur. (REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA) MATERIAL: a) Sangue total. TÉCNICA: Seguir o esquema que se segue 1 gota: sangue 1 gota: sangue Grupos - soro anti A soro anti B Misturar com o bordo de uma lâmina limpa. 1 . A leitura é feita por visualização da aglutinação: 26 . nas hemácias. c) Soro anti B.TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTÍGENO NAS HEMÁCIAS.

Sangue: 1 gota de sangue Soro: anti -D 27 . MATERIAL: a) Soro desconhecido.27 - 2 . GRUPO SANGÜÍNEO . mas na prática transfusional apenas o antígeno D (Rh) é pesquisado por ser mais imunogênico.SISTEMA Rh De acordo com a existência ou não do antígeno D(Rh) nas hemácias os indivíduos da espécie humana são Rh+ (positivo) ou Rh .(negativo).Misturar com o bordo de uma lâmina limpa e efetuar a leitura pela presença ou não de aglutinação. TECNICA: A tipagem comumente é feita em lâmina usando-se como reagente soro anti . d) Pipetas Pasteur. MATERIAL: a) Sangue total. Seguir o esquema 1 gota: soro 1 gota: soro 1 gota hemácia A 1 gota de hemácia B . d) Pipetas de Pasteur. c) Hemácias B. O sistema Rh possui ainda outros antígenos. e) Lâminas.D (Rh) observando-se a aglutinação ou não das hemácias a temperatura ambiente.TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTICORPOS NO SORO. c) Lâminas. b) Hemácias A. b) Soro anti D (Rh).

consiste no emprego do soro antigamaglobulina humana (soro de Coombs) para promover a aglutinação de hemácias previamente incubadas com anticorpos incompletos.Adicionar 02 gotas de albumina bovina a 22% em cada tubo.Colocar em um tubo de ensaio uma gota do soro a ser testado (marcar T no tubo). em um 2º tubo colocar uma gota de soro controle positivo (marcar (+) no tubo).Adicionar ao sedimento de hemácias. 04 . em um 3º tubo colocar uma gota de soro controle negativo (marcar (-) no tubo).Após a última lavagem. decantar o sobrenadante por inversão do tubo. O teste de Coombs direto é feito para diagnóstico da D. ressuspender o sedimento de hemácias e repetir esta operação por mais 02 vezes. 03 .03 minutos).28 TESTE DE COOMBS A prova de Coombs. INTERPRETAÇÃO 10 .m).A cada um dos tubos acrescentar uma gota de suspensão de hemácias O Rh (+) 5%. Teste de Coombs indireto é utilizado para o diagnóstico de anticorpos incompletos no soro de qualquer pessoa possivelmente sensibilizada por antígenos eritrocitários do sistema Rh (sensibilização pós-transfusional ou no decurso de gestação).R. 02 gotas de soro de Coombs.N.Aglutinação presente: Teste positivo Aglutinação ausente: Teste negativo 28 . 05 .Agitar. de crianças e adição de soro de Coombs.Agitar suavemente para misturar e centrifugar imediatamente ( 01 minuto a 1000 r. invertendo o tubo e enxugando a borda do mesmo com papel absorvente.Preparar uma suspensão a 5% de hemácias O-Rh positivas. 09 . TÉCNICA PARA O TESTE INDIRETO 01 .Retirar o tubo do banho-maria e completar até 01 cm da borda com solução fisiológica ou PBS FOSFATO e centrifugar a 3000 rpm ( + ou . também denominada prova de antiglobulina humana. e incubar a 37ºC durante 15 minutos. para misturar. 02 .p. Em recém-nascido de mães sensibilizadas. 07 . 06 . Consiste na lavagem de hemácias já sensibilizadas. A lavagem é feita para evitar a reação das proteínas livres. decantar completamente o sobrenadante.H. 08 .

29 MÉTODO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA As variações sobre os métodos de aglutinação surgiram ampliando as possibilidades de diagnóstico e pesquisa de anticorpos e de antígenos. colocar 50µl de tampão diluente em cada poço. B. escolhemos fazer a pesquisa de antígenos do vírus da Hepatite B por tal método. 5) Agitar levemente a placa. a partir do 2º poço até o 11º poço dessa linha. proceder com esta diluição até o último poço (numero 11). que os poços estão distribuídos formando linhas: linhas A. na placa. A reação será realizada em placas de microaglutinação. 10) Ler a reação após 2 horas. 4) Desprezar 50µl do 11º poço (último). onde não sofra vibrações. 9) Selar com fita Durex para que não haja evaporação dos reagentes e colocar a placa sobre uma superfície rígida. homogeneizar novamente e passar 50 µl do 2º poço para o 3º . 7) Agitar levemente a placa. e a diluição dos soros e reagentes será feita através de pipetas automáticas. do 1º ao 11º poço. o método de Inibição da Aglutinação Passiva. à medida que autorizaram uma sensibilidade maior para a pesquisa daqueles reagentes. Cada poço da placa de microaglutinação e reconhecido também por “well”. 8) Colocar 50µl de hemácia sensibilizada com o antígeno do vírus Hepatite B em todos os poços. 6) Colocar 50µl de soro anti-antígeno Hbs em cada poço. 2) Colocar 100 µl de soro humano no 1º poço. 1 A B C D E F G H 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PROCEDIMENTO 1) Utilizando a linha A. Esse tipo de placa presta-se a reações em que trabalhamos com pequenos volumes de reagentes. 3) Homogeneizar o conteúdo do 1º poço e passar 50µl para o 2º poço . C etc. Observe. 29 . Com o objetivo de conduzir os alunos de graduação desta instituição para a compreensão de mais uma variação.

Os conjugados devem ser preparados com anticorpos de alta afinidade. Vários métodos são realizados utilizando o principio do enzima-imunoensaio. entre eles os mais empregados são: • Método indireto: amplamente empregado para a pesquisa de anticorpos apresentando como vantagem a utilização de um único conjugado em diferentes sistemas. o peróxido de hidrogênio. ao ser adicionado o substrato da enzima à reação.30 ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) Este teste foi desenvolvido em 1971 por Engvall e Perlmann como alternativa ao radioiumunoensaio. • Método de captura: Um anticorpo específico é adsorvido à placa para reter o objeto da pesquisa. Anticorpos ou antígenos podem ser conjugados a enzimas de maneira que. materiais que possibilitam a ligação covalente de proteínas. BSA) no diluente da amostra (bloqueio). que poderá ser o antígeno ou mesmo uma classe de anticorpo em particular. A enzima peroxidase é muito utilizada para este teste. gerando um complexo que na presença de um terceiro composto um doador de elétrons (cromógeno ) forma um polímero intensamente colorido. que pode ser obtido pela relação entre a coloração da amostra e a coloração do controle positivo (D. O princípio básico é a adsorção de um dos reagentes (antígeno ou o anticorpo) a uma fase sólida. cruzi PRIMEIRA AULA – SENSIBILIZAÇÃO E BLOQUEIO DA PLACA Material necessário: Placas de poliestireno Solução contendo antígenos de T. cruzi Solução tamponada de Caseína a 1% Solução tampão para lavagem Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Estufa à 37°C 30 . gelatina. TÉCNICA DE ELISA INDIRETO PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-T. tal como placas de poliestireno ou polivinil. A adsorção não específica de componentes à placa pode ser reduzida incluindo-se uma proteína inerte (caseína.O do controle positivo). é gerado um produto colorido que poderá ser observado a olho nu (ensaio qualitativo) ou ter sua densidade óptica medida por espectrofotometria (ensaio quantitativo). O cromógeno mais utilizado em ELISA é o OPD (ortofenileno diamina). preferencialmente monoclonais.O da amostra/D. O conjugado utilizado deverá ser específico para a estrutura capturada na placa. e reage especificamente com seu substrato. Tais placas contêm séries de poços onde serão depositados os reagentes. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos. podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados. Independente do método escolhido para leitura é necessário determinar o limite de reatividade ou “cut-off” do teste.

cada poço da placa. cruzi e bloqueadas. cruzi em cada poço da placa de poliestireno.31 Metodologia: Sensibilização da placa: 1. Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Soro Controle Positivo Soro Controle Negativo Soros testes Conjugado enzimático Solução reveladora (peróxido de hidrogênio+OPD) Metodologia: 1. Pipetar 200µl de solução contendo antígenos de T. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. Incubar 2 horas à 37°C em estufa. Boqueio de placa previamente sensibilizada: 1. cruzi. SEGUNDA AULA – Detecção de anticorpos anti-T. 5. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. cada poço da placa. 2. Material necessário: Placas previamente sensibilizadas com antígenos de T. desprezar a solução de antígenos de T. Inverter a placa e bater sobre papel de filtro para retirar o excesso de tampão. cruzi. 2. Pipetar em duplicata (em dois poços consecutivos) 100µl dos soros controles e dos soros testes de acordo com o esquema abaixo: A: Controle negativo B: Controle negativo C: Controle positivo D: Controle Positivo E: Soro teste 1 E: Soro teste 2 F: Soro teste 3 G:Soro teste 4 31 . 3. Trabalhando com a placa previamente sensibilizada. Adicionar 200µl de solução de bloqueio (Caseína a 1%) a cada poço da placa e incubar overnight a 37°C. 4.

11. Desprezar o conteúdo da placa e lavra três vezes com solução tampão. Adicionar 100µl de conjugado a cada poço da placa. Inverter e bater a placa. Lavar três vezes a placa com solução tampão. Novamente incubar 15 minutos à 37ºC. 7. Inverter e bater a placa sobre superfície com papel de filtro. 5.32 2. Levar para incubação em estufa durante 15 minutos à 37º C. 10. 6. Leitura visual de placa pronta 32 . Incubar a placa 30 minutos à 37ºC. Adicionar 100µl de solução reveladora (substrato+cromógeno) em cada poço. 9. 4. 8. 3.

33 REAÇÕES DE IMUNOFLUORÊSCÊNCIA FINALIDADE: Detecção de anticorpos ou de antígenos. O isotiocianato de tetrametilrodamina. que emite cor vermelha.495 nm. As técnicas utilizadas para o estudo de imunofluorescência comportam duas modalidades principais: 33 .Lâmpada de halogênio B . e emite sua cor verde característica a 517 nm. enquanto uma substância é irradiada com luz de cor diferente. que se conjuga facilmente as proteínas em pH alcalino (acima de 9 ). que tem a capacidade de absorver a energia luminosa. resultando em fluorescência. isto é.Filtros de barreiras Esquema do sistema óptico do microscópio de fluorescência. O comprimento da onda emitido (fluorescente) terá necessariamente menor energia. armazená-la durante curto espaço de tempo (10-9 a 10-7 de segundos) para. Para a observação microscópica da fluorescência é necessária uma adaptação do microscópio óptico comum. É possível tornar visível a reação Ag-Ac marcando um dos reagentes com substâncias ditas fluorocromos. Ambos os fluorocromos são empregados sob a forma isotiocianato. C D A B ---------------__ _ _ _ _ _ _ __ Radiação de longos comprimentos de onda Radiação de curtos comprimentos de onda A . em seguida emiti-la sob a forma de uma radiação de maior comprimento de onda. ou seja maior comprimento de onda do que o da luz incidente ou absorvida. A absorção máxima do isotiocianato de fluoresceína é de 490 .Filtros excitadores D . comprimento de onda. A fluorescência é a emissão de luz de uma cor. tem um máximo de absorção a 550 nm e emissão máxima a 580 nm. Os fluorocromos mais usados em laboratório clínico são a fluoresceína e a rodamina. Os fluorocromos apresentam espectros de absorção e emissão característicos. filtros de excitação para produzir um comprimento de onda capaz de causar ativação do fluorocromo e filtros para evitar a passagem pela ocular.Preparo fluorescente C . contendo uma fonte de luz excitadora de alta intensidade. de luz de baixo comprimento de onda.

anti HIV. lava-se a preparação para remover todas proteínas (imunoglobulina) não fixadas pelo antígeno. É o processo comumente usado para a identificação de microorganismos por imunofluorescência.Imunofluorescência indireta . etc. sorotipos de leptospiras. esquistossomose. anticorpos antireóide. marcado com fluoresceína. bacilo diftérico. sorotipos de colibacilos enteropatogênicos. trata-se com um anticorpo fluorescente com especificidade dirigida para os determinantes antigênicos do anticorpo ligado ao antígeno. aplica-se primeiro o anticorpo específico não fluorescente. e a seguir. como estreptococos beta-hemolíticos do grupo A.baseia-se na detecção de anticorpos utilizando um antígeno conhecido e um soro anti-imunoglobulina humana. anti-DNA. leptospirose. 2 . etc. 34 .34 1 . após haver a reação Ag-Ac. Usa-se esta técnica na pesquisa de anticorpos circulantes no diagnóstico de: toxoplasmose. doenças de Chagas.Imunofluorescência direta . sífilis. antinucleoproteína. Sobre a preparação de antígeno fixado à lâmina.baseia-se na detecção de antígenos utilizando anticorpos específicos marcados com isotiocianato de fluoresceína.

12 .Pipetar no 1º tubo 0. Secá-las com ar quente. homogeneizar bem e passar 0. 1/64 .5 ml de salina tamponada e 0. diluído conforme seu título. da seguinte maneira: a .Marcar as lâminas com os respectivos soros.1 ml para o 3º tubo e assim sucessivamente.Lavá-las 2 (duas) vezes em PBS.Incubar a 37ºC em câmara úmida. 5 (cinco) minutos de cada vez. 2 .35 TÉCNICA DA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA TOXOPLASMOSE 1 . secar como no indicado do item 8 e montá-las com glicerina alcalina e lamínula. 5 . 1/4096. filtro excitador BG 12/2 mm ou KP 500 e filtro barreira 50. b .02 ml). homogeneizar bem e passar 0. 8 .Colocar no tubo 1/16 1.1 ml para o 2º tubo. 11 . por 30 minutos. 3 .Depositar pequenas gotas (0. como demonstrado no esquema abaixo. campo escuro. 1/256 . 4 . 7 .Remover os soros de cada lâmina sob delicado jato de água e lavá-las por imersão por duas vezes em PBS. na razão de 1/16 .Depositar uma pequena gota do conjugado fluorescente liquido antiimunoglobulina humana (cerca de 0.Observar os preparados ao microscópio de fluorescência.Preparar diluições dos soros em solução salina tamponada pH 7.02 ml) das diluições dos soros em cada área das lâminas. com objetiva de imersão.Enxugar o verso e as bordas das lâminas com papel absorvente e ao redor das áreas da reação.3 ml nos demais tubos. 10 . TOXO 1/16 1/256 1/64 1/4096 1/1024 _ + 6 .2.Preparar diluições a 1/16 do soro controle positivo e do soro controle negativo.1 ml do soro. 10 minutos cada lavagem.Secar bem as lâminas fixadas com antígeno. em cada área das lâminas. 35 . Nas reações negativas os toxoplasmas não apresentam fluorescência ou esta fica localizada apenas nas extremidades dos parasitas (coloração polar). em câmara úmida. Como título tomar o inverso da maior diluição do soro para a qual se evidencia fluorescência em toda a periferia dos toxoplasmas.Incubar novamente as lâminas a 37ºC por 30 minutos. ainda que de pequena intensidade. 9 . 1/1024 .

Ao final de cada unidade e após os estudos. esforçando-se para saber descrever com clareza sobre o que está sendo perguntado. Responda-os com cuidado e atenção. pesquise.36 PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS Esta parte da apostila apresenta de forma sucinta os objetivos gerais e específicos de algumas unidades do nosso programa. Tal seção tem como finalidade permitir ao aluno uma auto-avaliação sobre o tema tratado em sala de aula. Se tiver dúvidas sobre qualquer uma das respostas. discuta com os colegas ou procure os professores da disciplina. os alunos deverão ter compreendido o assunto tratado se forem capazes de responder aos seguintes objetivos: 36 . que deverão ser feitos em casa.

3. Entender os fenômenos de defesa como mecanismos de adaptação às agressões do meio ambiente.37 UNIDADE: RESISTÊNCIA INESPECÍFICA Objetivos gerais e específicos: 1. 37 . Conceituar e diferenciar resistência inespecífica e específica. 5. 4. 2. Descrever os principais elementos da pele e de que forma atuam na resistência inespecífica. Citar os principais mecanismos de resistência inespecífica. Descrever os principais elementos da mucosa e de que forma atuam na resistência inespecífica.

Definir a função da cada célula dentro da resposta imunológica.Diferenciar as células que atuam na defesa especifica. daqueles que atuam na defesa inespecifica. e. d.Reconhecer as células que participam da resposta e fenômenos imunológicos. cada célula que participa dos eventos da resposta c.38 UNIDADE: CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE Objetivos gerais e específicos: a .Diferenciar morfologicamente imunológica. 38 . b.Diferenciar quanto a origem e função os linfócitos T e os linfócitos B.

39 . 9) Explicar o centro germinativo nos linfonodos. 15) Justificar a proliferação linfocitária nos órgãos linfóides secundários. 10) Justificar a hiperplasia de um órgão linfóide secundário. o fígado fetal e a medula óssea.39 UNIDADES: FORMAÇÃO DE CÉLULAS T E B e ÓRGÃOS LINFÓIDES Objetivos gerais e específicos: 1) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides primários no sistema imunológico. 14) Reconhecer o papel das vênulas pós-capilares de endotélio alto nos linfonodos com relação ao tráfego de linfócitos. 2) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides secundários no sistema imunológico. aos órgãos linfóides secundários. à partir da célula primitiva. 11) Reconhecer a principal via de acesso das “estruturas estranhas”. 12) Explicar o tráfego de linfócitos no organismo. 8) Reconhecer aspectos da adaptabilidade dos órgãos linfóides secundários para a fase de reconhecimento antigênico na resposta imune. 6) Relacionar os passos envolvidos na formação de plasmócitos secretores de anticorpos. à partir da célula primitiva. considerando as fases de uma resposta imunológica. 4) Relacionar funcionalmente a membrana do saco vitelino. 7) Comparar e justificar os efeitos da timectomia neo-natal e na fase adulta. 13) Explicar como os linfócitos efetores produzidos em um linfonodo têm acesso a um sítio de infecção em outra região ou tecido. 5) Relacionar os passos envolvidos na formação de células T efetoras. para o sistema imune. 16) Justificar a proliferação celular nos órgãos linfóides primários. 3) Descrever as características histológicas e anatômicas dos órgãos linfóides primários e secundários.

Citar os adjuvantes imunológicos mais empregados. 7. entre antígenos. 3. Definir o termo imunogenicidade e antigenicidade. 40 . Conceituar e exemplificar “hapteno”. 2. Explicar três formas de ação dos adjuvantes imunológicos. Exemplificar a situação em que uma substância apresenta antigenicidade e não apresenta imunogenicidade. 11. Justificar a diversidade de epítopos em uma determinada substância imunogênica. 9. 4. Explicar os fenômenos de reatividade cruzada. em geral . Explicar a condição para que haja formação de uma resposta imunológica para os haptenos.40 UNIDADE: ANTÍGENOS Objetivos gerais e específicos: 1. 5. 8. 10. Citar e explicar os fatores que contribuem para a imunogenicidade de uma molécula. 6. Conceituar “epítopo”. Reconhecer a estrutura de um epítopo em uma molécula protéica.

g) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro.41 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos I) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo imunoglobulinas. d) Identificar na molécula as regiões Fab e Fc. qual a classe que desempenha este papel e a que se deve esta propriedade. o) Definir a imunoglobulina de maior peso molecular. k) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM. i) Esquematizar o mecanismo de formação de IgAS desde sua síntese até sua chegada na secreções. m) Definir as imunoglobulinas que apresentam peça J e qual a função desta peça. f) Definir sitio combinatório. b) Determinar a estrutura básica de uma molécula de imunogobulina. e) Citar as diferentes classes de imunoglobulinas existentes. em relação as outras imunoglobulinas. l) Reconhecer a forma de participação da IgE nas reações alérgicas. j) Determinar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. h) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. n) Relatar a importância da transferência placentária de imunoglobulina na espécie humana. c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina. 41 .

e) Diferenciar os diversos isótipos de cadeias leves e de cadeias pesadas existentes. d) Identificar os fragmentos resultantes após a clivagem enzimática de uma molécula de imunoglobulina pela ação de pepsina e da papaína. relação as outras 42 . t) Determinar estruturalmente a composição de uma molécula de IgM. m) Identificar as sub-classes de IgG existentes.Cadeia leve 3. c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina. g) Conceituar e exemplificar alotipia em cadeias leves e pesadas. q) Discriminar estruturalmente uma molécula de IgG e uma de IgAS. w) Determinar estruturalmente a composição de uma IgD. h) Conceituar idiótipos.Domínios variáveis e constantes nas cadeias leves e pesadas 4. v) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM. i) Esquematizar uma molécula de IgG reconhecendo nela os seguintes tópicos. x) Reconhecer a forma de participação de IgE nas reações alérgicas. em imunoglobulinas. 1. b) Reconhecer a estrutura básica de uma molécula de imunoglobulina. f) Reconhecer as imunoglobulinas que apresentam subclasses e diferenciar estas subclasses de acordo com a nomeclatura vigente.Cadeia pesada 2. r) Esquematizar o mecanismo de formação da IgAS desde sua síntese até sua chegada nas secreções. s) Explicar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. u) Determinar o peso molecular e quantidade relativa de IgM encontrada no soro.Região carboxi-terminal l) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro. n) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. p) Reconhecer as subclasses existentes de IgA. o) Definir a propriedade de opsonização de que é dotada a IgG.42 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos II) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo Imunoglobulinas.

clássica e efetora do sistema do complemento. Justificar a ação lesiva do sistema do complemento para células do próprio hospedeiro. ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ 43 . Justificar. ♦ Identificar a analogia entre as enzimas C4b2a e C 3bBb. produzidos pela ativação do Sistema do Complemento. ♦ Identificar a via alternativa. ♦ Reconhecer o mecanismo de ativação da via alternativa e da via clássica do Sistema do Complemento. através dos textos bibliográficos. Explicar a ausência da alça de amplificação da via alternativa nos processos fisiológicos de ativação do Sistema do Complemento. quimiotaxia para PMN e lise celular. Explicar o desenvolvimento de uma alça de amplificação na ativação da via alternativa. ♦ Justificar a participação de uma resposta imuno especifica na ativação do Sistema do Complemento. agregação plaquetária. ♦ Identificar os fatores ativadores da via clásssica e da via alternativa do Sistema do Complemento. nos fenômenos de aumento de permeabilidade capilar. Reconhecer as bases de um mecanismo homeostático em relação à ativação do sistema do complemento. Explicar o mecanismo da ação dos fragmentos de ação biológica.43 UNIDADE: SISTEMA COMPLEMENTO Objetivos gerais e específicos: ♦ Descrever os efeitos biológicos surgidos pela ativação do Sistema do Complemento. por que na maioria das células os mecanismos de lise pelo Complemento não são possíveis. ♦ Justificar o papel inespecífico da ação do sistema do complemento. Demonstrar como o sistema do complemento participa da eliminação de antígenos que não são celulares ou que não tem membrana exposta.

44 UNIDADE: FAGOCITOSE Objetivos gerais e específicos: a) Definir fagocitose. d) Citar as principais substâncias que desempenham o papel de opsoninas. b) Identificar as principais células que participam da resistência inespecífica. g) Caracterizar o sinal de ativação do fagócito no momento da opsonização. j) Definir as duas principais vias de destruição da partícula fagocitada. k) Caracterizar a via oxigênio dependente. f) Explicar a importância do fenômeno da opsonização. 44 . e) Definir opsonização. c) Identificar os principais fatores quimiotáticos para PMN e macrófagos. l) Citar os radicais livres produzidos na via oxigênio dependente e definir sua importância na destruição de estrutura fagocitada. m) Caracterizar a via oxigênio independente. n) Citar as principais enzimas que atuam a via oxigênio independente. pinocitose. endocitose e exocitose. o) Relacione a fagocitose a mecanismos de resistência inespecífica. h) Explicar a fase de englobamento realizada pelo fagócito i) Explicar a fase de digestão durante a fagocitose.

3) Denominar os produtos do CHP Humano.45 UNIDADE: Complexo de Histocompatibilidade Principal(CHP. 9) Relacionar as moléculas de classe I e II do CHP com os antígenos exógenos e aqueles de síntese endógena. 7) Reconhecer na molécula de classe I. “MHC”) Objetivos gerais e específicos: 1) Definir o que é CHP e onde este se localiza. 5) Esquematize as estruturas das moléculas de classe I e II. a região de ligação ao peptídeo. (Faça um desenho esquematizando as principais características de ambas). a região de ligação ao peptídeo. no camundongo e no ser humano: 2) Citar quais são os produtos da decodificação do CHP. 45 . 8) Reconhecer na molécula de classe II. 4) Estabelecer a função dos antígenos de classe I e classe II. 6) Localizar as moléculas de classe I e de classe II nas diferentes populações celulares.

7) Numa infecção por um patógeno intracelular em uma célula cilíndrica do trato digestivo superior. 46 . 3) Exemplificar qual é a molécula que poderia sugerir uma função de célula apresentadora de antígeno. 8) Estabelecer onde ocorre a interação entre antígenos próprios e as moléculas do CHP e como ocorre este mecanismo. quais são as etapas que culminam com a apresentação de antígenos pelas células. 4) Descrever no macrófago. estabelecer de que forma o organismo reconhecerá que naquela célula está se desenvolvendo uma infecção e como esta será debelada. 9) Explicar porque a apresentação de antígenos externos se dá no contexto de moléculas de classeII. 2) Definir as principais características quanto às estruturas de superfície celular e fagocitose de cada APC. 5) Definir em qual situação. uma molécula viral pode ser apresentada no contexto de moléculas de classe I do CHP: 6) Esquematizar como ocorre o processo de apresentação de antígenos no contexto de moléculas de classe II.γ na apresentação do antígeno.46 UNIDADE: Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) e mecanismos de Apresentação de Antígenos 1) Definir quais são as principais células apresentadoras de antígenos e onde elas se localizam. 10) Definir qual o papel do INF.

Definir a etapa seguinte à ativação dos LT auxiliares. IL-3 12. IL-2 11. Reconhecer o mecanismo de interação na apresentação de Ag aos linfócitos T citotóxicos ou CD8+. IL-10 16. 3. Elaborar um quadro comparativo. Reconhecer o mecanismo de interação da célula apresentadora de antígeno com os linfócitos T CD4+. Definir como ocorre a ativação do repertório de células T citotóxicas (CTL). IL-5 14. TNF 18. Definir e diferenciar linfócitos TH1 e TH2 8. INF-γ 17. Definir estrutural e funcionalmente os principais marcadores de superfície dos linfócitos T 2.47 UNIDADE: Linfócitos T 1. Definir funcionalmente e quanto às células produtoras as seguintes citocinas: 10. quanto a função e produtos das subpopulações TH1 e TH2. IL-4 13. 7. 4. 9. IL-12 47 . Esquematizar as etapas de ativação dos linfócitos T auxiliares. 5. IL-6 15. 6.

Definir a ontogenia dos linfócitos B no homem. 48 . 17. Diferenciar a ativação por antígenos timo-dependentes e timo-independentes. Explicar porque se pode dizer que um linfócito B é uma APC. Definir a primeira imunoglobulina a ser produzida em resposta a uma infecção. 14. Estabelecer com relação ao comportamento de linfócitos B. 2. 6. Definir as fases de ativação dos linfócitos B. Identificar as fases da curva que representa uma resposta humoral e a característica de cada fase. 16. 9. Explicar porque a resposta secundária é a mais rápida do que a resposta primária. Estabelecer a finalidade da ativação do repertório de linfócitos B.48 UNIDADE: Linfócitos B e Resposta Humoral Primária e Secundária 1. Reconhecer os marcadores de superfície dos linfócitos B e função fisiológica dos mesmos. 4. o que é esperado quando se imuniza artificialmente uma criança e porque. Estabelecer as fases que precedem a interação entre linfócitos B e linfócitos T e o objetivo desta interação. 11. 5. 8. 10. 15. Explicar a que se deve a maior produção de Ig durante uma resposta humoral secundária. Definir mudança de classe ou “Switch”que ocorre durante a síntese de imunoglobulinas. 12. Estabelecer a diferença que existe entre as fases das respostas primárias e secundária. 3. Definir as principais interleucinas produzidas pelos linfócitos T que têm ação sobre linfócitos B e em que fase elas agem e de que forma. 13. Definir o mecanismo do capuz ou “Capping” e citar a função do mesmo. 7. Definir o resultado final da ativação do repertório de linfócitos B.

7. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias pesadas das imunoglobulinas. há variação na síntese da porção constante da cadeia pesada de imunoglubolinas e não ocorre o mesmo para a porção variável? 49 . Conceitue “Fenômeno de Restrição Alélica”.49 UNIDADE: Genética das Imunoglobulinas Objetivos gerais e específicos: 1. durante o “Swicth”. 13. 4. Justifique a necessidade de haver imunoglobulinas de diferentes classes. Responda: é possível que um linfócito B apresente em sua superfície diferentes classes de imunoglobulinas ao mesmo tempo ? Em que situações? 12. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves lambda das imunoglobulinas. Identifique a seqüência genética existente para a síntese das diferentes cadeias pesadas de imunoglubulinas. Explicar por que uma célula que sofreu um “Switch” para a síntese de IgG não mais poderá voltar a sintetizar IgM. Diferencie o rearranjo gênico que existe durante a fase primordial e a fase tardia de síntese das imunoglobulinas. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves Kappa das imunoglobulinas. 5. 3. 6. 16. Responder: por ‘que. 8. 15. 14. Defina intron e exon. 2. 10. Explique as causas da grande variabilidade de sítios combinatórios das imunoglobulinas. Diferencie os rearranjos gênicos que existem nas cadeias leves e pesadas. 11. Conceitue “Fenômeno de Restrição Isotípica”. 9. Identifique a diferença na codificação genética entre imunoglobulina de membrana e imunoglobulina secretada. Identifique o processo de “diversidade funcional por inserção”.

50 . utilizando todos os conceitos que você já aprendeu. Tente. é bem possível que você já possa prever como será. então. identificar a cinética de uma infecção viral numa célula hepática e a resolução desta infecção pelo sistema imunológico. realizando um esquema completo. Portanto. ou como deverá ser. a reação do organismo frente a alteração do padrão fisiológico do mesmo.50 INTERAÇÃO DO SISTEMA IMUNOLÓGICO Se você foi capaz de responder a estes questionários contendo os objetivos específicos já é capaz de compreender as diversas faces do sistema imune.

4. Justificar o papel do contato de longa duração na duração de tolerância. Explicar a participação da via oral na indução da tolerância. 6. Conhecer os fatores favorecedores da resposta ao tolerogênico. 51 .51 UNIDADE Tolerância Imunológica Objetivos gerais e específicos: 1. 3. Conceituar “Tolerância imunológica”. Explicar os mecanismos imunológicos pelos quais o sistema imunológico desenvolve tolerância aos antígenos próprios e não próprios. 5. 2. Reconhecer sua participação e importância no Sistema Imunológico. Explicar a importância da drenagem venosa na tolerância por via oral.

5. segundo Gel e Coombs 3. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo I. Citar os mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo IV. 7. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo III. 52 . 12. 20. 8. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo III. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo II. 19. 13. 11. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade IV. Reconhecer a propriedade hipersensibilidade tipo I. 14. Classificar as reações de hipersensibilidade quanto aos seus mediadores imunológicos. 10. 4. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo I. 17. 15. Relacionar as reações de hipersensibilidade da classificação de Gel e Coombs. ação e efeito dos mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. 21. 6. Identificar a(s) classe(s) hipersensibilidade tipo II. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo IV. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo I. 9. Definir o que é uma reação de hipersensibilidade. fundamental das imunoglobulinas mediadoras da 18. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo III. 2. nos tipos imediatos e tardios. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo III. Reconhecer a origem. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo III. de imunoglobulina(s) envolvida(s) na mediação da 16.52 UNIDADE HIPERSENSIBILIDADE 1. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo I. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo I.

38. Identificar o principal mediador imune da reação inflamatória tipo IV na classificação de Gel e Coombs. Justificar fenômenos hemorrágicos presentes na reação inflamatória por hipersensibilidade tipo III. 24. Justificar o eritema que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilidade tipo IV. 37. Entender a origem da histamina e seu papel na hipersensibilidade tipo III. Justificar a isquêmia que pode acompanhar as reações de hipersensibilidade tipo III. Descrever os principais mecanismos da lesão celular por hipersensibilidade tipo II. Explicar o papel do sistema do complemento nas reações de hipersenbilidade tipo III. Explicar o mecanismo da injúria tecidual pelo mecanismo de hipersensibilidade tipo IV. 29. 31. 30. Justificar uma neutropenia após a administração do antibiótico cloranfenicol. Compreender a utilização de testes intradérmicos de hipersensibilidade tipo IV para avaliação de imunidade celular. Explicar a reação de Arthus. 35. 32. 26. Justificar a induração que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilização tipo IV. 36. Justificar a escolha dos Ag em uso nos testes intradérmicos de avaliação de imunidade celular. Justificar a presença destas células no infiltrado . Caracteritizar os tipos celulares predominantes no infiltrado inflamatório mediado por hipersensibilidade tipo IV. 53 . Diferenciar a formação de uma reação de Arthus com uma reação tipo III sistêmica. Diferenciar o mecanismo de formação de edema na hipersensibilidade tipo I e III. Explicar as reações aceitas para a permanência de imunecomplexos circulantes o organismo.53 22. 39. 25. 28. 40. 23. reconhecendo os fatores liberados por células responsáveis. 34. Reconhecer a localização do Ag na hipersensibilidade tipo II. 33. 27.

10. 2. 7. Conhecer a nomenclatura correspondente aos enxertos. Citar os principais locus da região HLA. Explicar a reação de Enxerto X Hospedeiro e justificar a sua presença nos transplantes de medula óssea. 8. Reconhecer os tipos de rejeição aos enxertos identificando os principais elementos da resposta imune.54 UNIDADE: TRANSPLANTES Objetivos gerais e específicos: 1. 9. 12. Interpretar uma prova cruzada positiva. Associar MHC e HLA. Montar um exemplo de um perfil para a expressão fenotípica de todos esses locus em um indivíduo. 13. Justificar a importância da Prova Cruzada que antecede os transplantes. Justificar o valor da análise do perfil de HLA na seleção do doador vivo 11. 54 . 3. 6. Reconhecer quais a estruturas moleculares das células de um enxerto. envolvidos. que são responsáveis pela indução da rejeição aos mesmos. Citar as provas de seleção para doador vivo para os transplantes. Explicar os mecanismos de agressão às células enxertadas. 4. 5. Relacionar estas estruturas moleculares e o MHC.

Reconhecer e explicar o fato das albuminas migrarem com maior velocidade.Reconhecer o que atuou como suporte na corrida eletroforética realizada no laboratório.Fundamentar a razão de todas as proteínas migrarem em um único sentido. 3. 2.55 SUBUNIDADE: “ELETROFORESE DE PROTEÍNAS”. OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS: Ao final do exercício desta prática no laboratório o aluno deve estar apto a: 1. 4.Dar a definição de ponto Isoétrico de uma proteína e explicar sua participação no princípio desta técnica. 5. 55 .Explicar o princípio de uma eletroforese de proteínas.Justificar a importância do pH alcalino do tampão utilizado. 6.

56 PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS EXERCÍCIOS 56 .

laboratorial de termos adsorvidos.Adicionou-se a seguir. marcador com l125 (um isótopo radioativo cuja emissão de radiação pode ser medida em um cintilômetro). 7.O que estava sendo pesquisado b. 5. Essa reação processa-se em tubos onde seguiu-se a metodologia abaixo. A adsorção se dá por ligações covalentes entre os anticorpos e o material do tubo (poliestireno). anticorpos anti-IgM e não anti-IgG.Adicionou-se então anticorpos anti-vírus da hepatite A. para assim recobrir os espaços não ocupados pelo anticorpo (bloqueio do tubo). 1. antígeno extraídos do vírus da Hepatite A.Posteriormente realizou-se a lavagem do sistema. 57 .57 RIE (RADIOIMUNISAIO) Abaixo está representado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender.Mediu-se a radiação do tubo. 3. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da HEPATITE A.A seguir procedeu-se a incubação a 37º C por 30 minutos. ao tubo. 2. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina. 4. uma condição favorecedora da interação Ag/Ac.Realizou-se nova lavagem do sistema. 6.diga qual a importância clínico. Após a leitura e compreensão responda o que se pede abaixo: METODOLOGIA: A cada tubo foi adsorvido previamente anticorpos anti-IgM humana. 8.Ao tubo foi adicionado soro suspeito para o exame.Seguiu-se nova etapa de lavagem. PERGUNTA-SE a.

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ELISA ( ENZIME LINKED IMUNOSORBENT ASSAY)
Abaixo está apresentado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS . Acompanhado será fornecido uma placa com 96 poços onde seguiu-se a metodologia abaixo. METODOLOGIA A cada poço foi adsorvido previamente antígenos extraídos dos vírus da AIDS. A adsorção se dá através de ligações covalentes entre os antígenos e o material da placa. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina, para assim recobrir os espaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da placa). 1- Foram adicionados aos poços 1 e 2 soros procedentes de dois pacientes suspeitos de terem anticorpos anti-HIV ( vírus da imunodeficiência humana causador da AIDS). 2- A placa foi levada a uma estufa a 37 ºC por 30 minutos, uma condição favorecedora da interação Ag/Ac. 3- A seguir esse poço foi lavado com uma solução tampão com finalidade de retirar moléculas livres. 4- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas. As moléculas desses anticorpos tinham, ligadas em si, no Fc, uma enzima (peroxidase) cujo substrato pode ser o peróxido de hidrogênio. Esse substrato ao sofrer a ação daquela enzima manifesta uma cor alaranjada que se revela quando se adiciona ao meio uma substância reveladora ( no caso o ortofenilenodiamino-OPD). A ligação da enzima ao anticorpo não altera as propriedades anticórpicas desse. Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 5- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 6- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 7- Logo após observou-se que a solução no poço 1 ficou alaranjada enquanto que no poço 2 não houve alteração. Responda: a- Esquematize os dois poços evidenciando as reações Ag/Ac que ocorrerem ou deixarem de ocorrer. b- Após a realização do item 3, esquematize o que permaneceu no poço 1. c- Como você interpreta o resultado visível nos poços 1 e 2 respectivamente?

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WESTERN BLOTTING
É um dos métodos mais utilizados para identificar proteínas reconhecidas por anticorpos, sendo designado também de immunoblotting, diferenciando-se do “Southern ou Northen blotting”, que se prestam a identificação de ácidos nucléicos. Abaixo está apresentado um exemplo de Western blotting que se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS. Leia com atenção e responda. 1- Para a realização de um Western blotting inicialmente as proteínas virais são separadas, de acordo com seu tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio - um detergente (SDS-PAGE). 2- Em seguida as proteínas fracionadas no gel são transferidas por corrente elétrica, para uma membrana de nitrocelulose que posteriormente será recortada em tiras. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina ou a caseína, para assim recobrir os pedaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da fita). 3- A cada tira é adicionado em recipiente apropriado soro de paciente suspeito de ter anticorpos anti-HIV. 4- Segue-se um período de incubação de 30 minutos a 37º C, e extensiva lavagem para a remoção das proteínas livres. 5- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas marcadas com uma enzima (peroxidade). Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 6- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 7- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 8- Em seguida observou-se que algumas fitas apresentavam bandas (faixas) coradas denotando reação, enquanto outras não se coraram. RESPONDA: 1- Poderíamos pesquisar subclasses de IgG, ou mesmos outro isótipo de imunoglobulinas? Como? 2- O que significa exatamente a presença de bandas coradas, com relação as possíveis interações ocorridas?

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IMUNOHISTOQUÍMICA
A aplicação da imunohistoquímica (IHQ) à rotina diagnóstica já é uma realidade em nosso meio. De modo genérico, podemos considerar como principais indicações para o exame: ♦ Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente diferenciadas ♦ Subtipagem de neoplasias ♦ Caracterização da origem de carcinomas. ♦ Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas ♦ Discriminação da natureza benigna X maligna de determinadas proliferações celulares. ♦ Avaliação prognóstica de neoplasias ♦ Identificação de agentes infecciosos. Como exemplo, temos representado abaixo uma reação de IHQ para a pesquisa de receptores de estrógeno em células de adenocarcinoma de mama, um fator prognóstico neste caso. 1- Para a realização reação de imunohistoquímica utilizamos cortes de tecido incluído em parafina com aproximadamente 3 µ de espessura, colocados em lâminas tratadas com silano ( silanizadas), para propiciar uma forte adesão do corte histológico à lâmina 2- Em seguida as lãminas são desparafinizadas, sendo deixadas na estufa à 60°C por 24 horas, no xilol à 60°C e no xilol a temperatura ambiente para desparafinização 3- Após a desparafinização as lâminas são levadas à uma sequência de banhos de álcool absoluto até 80% para hidratação. 9- Posteriormente segue-se a etapa conhecida como recuperação antigênica. Necessária para que se restabeleça a estrutura antigênica das proteínas estruturais, modificada pela ação do formol. Tal etapa poderá ser feita por dois métodos: Calor úmido: em solução tampão citrato de sódio pH 6,0 4M, em banho-maria, panela de pressão ou microondas por tempo determinado. Enzimático: tratamento do corte com proteinase K 10- Segue-se o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 11- Adição de anticorpo monoclonal de coelho específico, anti-receptor para estrógeno 12- Incubação por 30 minutos à 37°C e overnight na geladeira. 13- No dia seguinte etapa de lavagem com solução tampão 14- Adição de um anticorpo anti- anticorpo de coelho, marcado com estrepavidina, incubação à 37°C 15- Nova etapa de lavagem 16- Adição de complexo biotina-estreptoavidina complexada com, nova incubação à 37°C 17- Lavagem e adição de solução de Dab (Diaminobenzidina 60mg%) 18- Contra coloração com hematoxilina. 19- Observação no microscópio de núcleos corados de marrom. RESPONDA: Qual a finalidade das etapas de lavagem? Por que fazemos a recuperação antigênica? Como seria um resultado negativo?

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moléculas codificadas pelo genoma viral. que possua em sua parede antígenos de natureza polissacarídica e glicoproteíca.Se em uma situação hipotética. esta célula passa a ostentar em sua superfície.Sabendo-se que os vírus ao infectarem um organismo. inserem seu genoma no genoma de uma célula do hospedeiro e que assim.61 EXERCÍCIO SOBRE RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO VIRAL E BACTERIANA 1. descreva todos os prováveis eventos de uma resposta imunológica. que você conhece. 2. através dos quais este hospedeiro reagirá à infecção viral. nosso organismo for infectado por uma bactéria extracelular qualquer. qual seria a resposta esperada do sistema imune?. 61 . tal como uma do gênero Streptoccocus.

microbiologia. para contagem de CD4 e CD8. Podemos obter medidas corpóreas das células como tamanho. E assim. A linha simples de fluxo das células passa pelo raio laser do instrumento. 62 . registrar os parâmetros cinéticos do tumor a ploidia do tumor. fração de crescimento e propriedades cinéticas. Contanto que diferentes tipos de células possam ser distintas por características estruturais quantitativas. Desenvolvimento: A citometria de fluxo mede características corpóreas e químicas de células ou partículas que estão em suspensão uma a uma num determinado ponto. Essas células são rotuladas com uma “etiqueta” fluorescente. G2 e M do ciclo celular. Permite o estudo da variabilidade genômica pelo perfil colorimétrico do conteúdo de DNA. granulosidade. morfologia e outras características de uma população de células. análise e classificação de cromossomo. vermelho e muito mais vermelho. é também utilizada para identificar as sub-populações de linfócitos especifícos. estudos funcionais.62 CITOMETRIA DE FLUXO Pela acadêmica de Farmácia Daniela Silva Moreira Introdução: A citometria de fluxo consiste em um método laboratorial para definir o tamanho. As células devem estar em uma suspensão de células simples com o mínimo de agregação (suspensão monodispersa). em um fluxo contínuo passando uma de cada vez. indicando fatores prognósticos e rumos terapêuticos. a citometria de fluxo pode ser usada para a contagem de células de diferentes tipos em uma mistura. É uma técnica de medição das propriedades óticas da células individuais. e intensidade de fluorescência verde. As informações podem ser adquiridas na citometria de fluxo utilizando células vivas. muito utilizado na classificação de leucemias. a fração de proliferação tumoral e a percentagem de células encontradas nas fases S e G1. As aplicações incluem: análise de fenótipo. análise de DNA. seqüencialmente. em frente a um feixe laser com sensores para medir fluorescência e dispersão de luz. genética. pode também estimar a distribuição das populações celulares ou fases do ciclo celular. medicina e outras. forma e complexidade interna e. tais como botânica. Um citomêtro de fluxo pode medir estes parâmetros a uma taxa de milhares de células por minuto. ou fixas com paraformaldeído. ou partículas em geral. classificação estéril. Esta metodologia de análise é aplicável em diversas áreas de pesquisa. pode processar milhares de células em alguns segundos. é claro qualquer componente da célula ou função que possam ser detectada por um composto fluorescente quando examinada. cada célula fornece 5 números: tamanho. Embora faça medidas em uma célula de cada vez. zoologia.

63 . O CD8. então. O marcador CD3 é expresso na superfície de células “T” maduras ( CD4 e CD8). A utilização dos CD3 irá discriminar os linfócitos CD8+ das NK. e o número de células é calculado com base na intensidade da fluorescência . é devido os níveis normais se alterarem nas imunodeficiências e em certas doenças. O CD4 é expresso na superfície de células (linfócitos) CD4+.63 -Técnica de Citometria de Fluxo A técnica de citometria automatizada de fluxo envolve. Provoca-se uma excitação desses elementos fluorescentes com uma luz “laser”e a identificação ótica é feita de maneira automatizada pelo sistema . CD4e CD8.Separação de linfócitos por citometria de fluxo: Os linfócitos são classificados em 3 sub-populações: linfócitos T. em monócitos. Os linfócitos T são ainda sub-classificados em duas sub-populações funcionais: os CD4 auxiliares e os CD8 citotóxicos. marcado com o corante fluorescente. como por exemplo na infecção pelo HIV. o diferencial de glóbulos brancos. Estes dados são em seguida registrados e mostrados na forma de histograma. minimizando o erro. baseada em anticorpos monoclonais marcados com substâncias fluorescentes. através da ligação de um anticorpo monoclonal específico para a população alvo. passada por um pequeno tubo que cria um fluxo de células únicas. Embora não identifiquem células individuais. A contagem absoluta das sub-populações de linfócitos é obtida a partir de 3 determinações sequenciais separadas: a contagem total dos glóbulos brancos do sangue total. a coloração da população de células-alvos com um corante fluorescente ( geralmente iodeto de propídio). .alvo. e assim determinar um tratamento para a doença. A cada sessão. A importância clínica de se fazer citometria de fluxo para separar e contar o número de linfócitos T CD4+ e CD8+. 100 microlitos de sangue total é investigado com anticorpos monoclonais específicos dirigidos contra os marcadores CD3. linfócitos B e os linfócitos NK. dirigidas contra os marcadores de superfície CD4. a porcentagem de células positivas à citometria de fluxo. conversores analógicos para digitais e computadores. E através desses níveis de linfócitos podemos indicar a progressão ou regressão de uma doença. gerados a partir da fluorescência. por sua vez é expresso na superfície dos linfócitos CD8+ e em algumas células NK. conseguem identificar a tendência central de uma determinada população de células. A população alvo colorida é. A energia da luz emitida pelo laser excita o corante fluorescente contido em cada célula. estes histogramas. por sua vez atravessa um raio laser. Os citômetros de fluxo envolvem fluidos sofisticados. primeiro. CD8 e CD3. utiliza uma técnica sofisticada de citometria de fluxo. A metodologia mais atual para a contagem de CD4 e CD8 e para a identificação das sub-populações de linfócitos específicos. que representa o perfil da população de células. fluxo este que. mas também. o sistema óptico do laser detectores eletrônicos.

e assim direcionando os rumos terapêuticos.icnet.br/hot news . como .uronews. etc.it/apher/write/cytome.org.org. usado na classificação de leucemias. que permite a separação e contagem de células com excelente sensibilidade diagnóstica.br/citometria -www.med.htm -www. determinar a quantidade de DNA numa população celular.criesp.do. medicina e outras. Além de ser um método aplicável em diversas áreas.com . identificação das sub-populações de linfócitos do sangue.hcan.capacity. Renato CD4/CD8 → www. Permitindo o diagnóstico e prognóstico de diversas doenças.html 64 .unipi. • Bibliografia: -Di Dio.htm -Citometria de Fluxo → www. pois é um teste simples.6.uk/axp/facs/davies/flow.htm -www.com. genética.html -Citometria do DNA → www.64 Conclusão: Portanto a técnica de citometria de fluxo vem sendo muito utilizada. também utilizado para determinar as fases do ciclo celular na fração de proliferação de tumores.br/g 105. microbiologia.br/inform/ Cd4/Cd8 .

. L. Revista LAES. V. CALICH. BACCHI. Vol. C. Manual de Imunohistoquímica. A. H. P. . WELLS. Eletroforese. 2ª edição. V.V. I. Imunologia Básica 2000. 1989. Imunologia Básica e Clínica. STITES. W.Editora Guanabara. L. VOOS.. nº 52:08-26 ALVES. Rio de Janeiro. maio/85. F. G. São Paulo 1999. SILVA. Imunologia Básica e Aplicada. J. II:46-60.. Aplicações Clínicas da Imunoeletroforese. O. Ano VI. FUNDENBERG. . CALDWELL. D. VASSALO. J. MOTA.65 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIER. H. 65 . HOXTER. 2ª ed. Ano IX. C. A. Revista LAES. J. D.. E. . A. Rio de Janeiro. 4ª edição. Edição Extra. Obs.: Algumas técnicas foram obtidas a partir dos Kits reagentes. 1980. VAZ. Editora Guanabara. C..

redução pelo mercapto-etanol. Como provas especiais. 66 .DO DIAGNÓSTICO Art. DE 20 DE JANEIRO DE 1976 Aprova as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal O MINISTRO DE ESTADO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO. resolve: Art. Aprovar as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal. no uso de suas atribuições. Art. de 22 de abril de 1958 e 5 de março de 1969. vacinados entre 3 e 8 meses de idade 1/25 1/50 (25 UI/ml) (50 UI/ml) I + + I + + + + + + + + + + Convenções: I: Aglutinação incompleta. em amostras compostas. assinadas pelo Diretor Geral do Departamento Nacional de Produção Animal. poderão ser utilizadas as provas de fixação do complemento. prova do antígeno tamponado acidificado (prova do cartão . UI: Unidades internacionais 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Art. +: Aglutinação completa. 86. O diagnóstico de rotina da Brucelose em bovinos será realizado através das provas de soroaglutinação rápida ou lenta. visando dirimir eventuais dúvidas. do Regulamento do Serviço de Defesa Sanitária Animal. aprovado pelo Decreto nº 24. 3º. tendo em vista o disposto no art. Art."card test") e prova individual do anel do leite. Art. anexas à presente Portaria. A prova do anel no leite. A prova de sêmen-plasma-aglutinação será utilizada em reprodutores dos Centros de Inseminação Artificial e além da prova de soroaglutinação.548. 2º. precipitação pelo rivanol. NORMAS PARA A PROFILAXIA DA BRUCELOSE ANIMAL CAPÍTULO I . 4º. de 03 de julho de 1934 e considerando a necessidade de atualizar a legislação existente sobre profilaxia da Brucelose. em provas de rotina no caso de rebanhos-problema. será utilizada para determinação da taxa de prevalência da Brucelose em rebanhos leiteiros. 1º. 2º. 1º. respectivamente. Revogar as Portarias Ministeriais números 486 e 222. cuja interpretação obedecerá aos quadros a seguir: Bovinos não vacinados ou vacinados com idade superior a 8 meses 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + + + 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Positiva Positiva Bovinos de 30 meses ou mais.º 23 Ministério da Agricultura e do Abastecimento PORTARIA nº 23.66 Anexo CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA PORTARIA N.

no lado esquerdo da cara. em 3 (três) vias. Recomenda-se o sacrifício dos bovinos com reação positiva. mediante requerimento do proprietário e autorização expressa do responsável pelo programa de combate à Brucelose na respectiva Unidade da Federação. anexos fetais. 12. será efetuada sob a responsabilidade de médico veterinário. em cada propriedade afetada. elaborada com a amostra 19 de Br. 7º. a critério da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. CAPÍTULO II . os sacrifício será realizado em matadouro sob inspeção federal e o julgamento efetuado de acordo com as disposições em vigor. Art. Nos casos em que não seja possível o sacrifício. admitindo-se a vacina líquida até o aparelhamento dos laboratórios produtores. observando-se a legislação federal específica e de acordo com as técnicas recomendadas pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. o Serviço de Inspeção Federal no estabelecimento onde será realizado o sacrifício deverá ser notificado com antecedência. com vacina viva. recomenda-se a adoção das seguintes providências: a. A vacinação de fêmeas adultas com a amostra 19 poderá ser autorizada em propriedades onde estiverem ocorrendo surtos de abortos brucélicos. CAPÍTULO V . somente uma vez. de forma a permitir a adoção das medidas previstas no RIISPOA. vacinar somente bezerras entre 3 e 8 meses de idade. leite. 8º. Art. o proprietário dos animais deverá assinar termo de compromisso. não poderão ser objeto de comércio. A vacina com a amostra 19 será apresentada sob a forma liofilizada. 6º. observando-se as seguintes condições: a.DA VACINAÇÃO DE BEZERRAS Art. Excluem-se da marcação. aplicando rigorosos cuidados higiênicos complementares. Art. bem como a coleta de amostras das partidas produzidas. a vacinação será realizada apenas uma vez. b. enterrar o feto e seus anexos. Art. Art. a. dos protocolos. Art. A vacina com a amostra 19 será produzida por laboratórios autorizados.67 Art. 67 . b. destinando-se a 1ª ao proprietário. no lado direito da cara. CAPÍTULO IV . 11. b. a 2ª ao serviço veterinário oficial e a 3ª ao emitente. conforme Anexo 1.DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE VACINAS Art. 15. 16. desinfetando os locais contaminados. marcar as bezerras vacinadas. quando observado aborto. constantes do Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA). considerando a porcentagem de incidência da doença e as condições locais. que serão fornecidas pela unidade de controle. A imunização dos bovinos contra a Brucelose será levada a efeito pela vacinação de bezerras. Os frascos de vacina levarão etiquetas oficiais. com ferro candente. 5º. Cada partida de vacina produzida será oficialmente controlada. isolar as vacas reagentes por ocasião do parto. Os bovinos positivos ou suspeitos de Brucelose. do estoque de vacina. sêmen e outros materiais possivelmente infetados. isolar os animais reagentes. com um V. emitir atestado de vacinação. CAPÍTULO III . c. as bezerras destinadas ao Registro Genealógico. cabendo ao órgão local do Ministério da Agricultura o acompanhamento e controle da produção. conforme modelo do anexo 2. abortus.DA VACINAÇÃO DE FÊMEAS ADULTAS Art. 9º. controlada pelo órgão oficial competente.DOS ANIMAIS REAGENTES Art. observando-se os seguintes critérios. no lado esquerdo da cara. 10. após a liberação da partida correspondente. Art. aceitando as condições estabelecidas. as fêmeas vacinadas com a idade superior a 8 (oito) meses. b. Como necessário. quando devidamente identificada. acompanhado do algarismo final do ano da vacinação. 14. poderão ser realizados exames bacteriológicos de fetos abortados. 13. c. até que cessem os corrimentos vaginais. serão identificadas com ferro candente. não se admitindo vacinação de machos. c. salvo quando comprovadamente destinadas ao abate ou a instituições científicas. A aplicação da vacina da amostra 19. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetro) de diâmetro conforme Anexo 1. Os animais que revelarem reação positiva serão marcados a ferro candente. observandose o seguinte critério: a. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetros) de diâmetro.

CAPÍTULO VI . nas provas de soroaglutinação rápida e lenta. 24. 20. A inscrição de bovinos no Registro Genealógico e a participação dos mesmos em Exposições e Feiras Agropecuárias. considera-se com infetado o rebanho no qual forem identificados um ou mais suínos com aglutinação completa na diluição de 1:100. obedecendo as técnicas de produção e controle recomendadas pela Organização Mundial da Saúde. Suínos procedentes de rebanhos negativos 1/25 (25 UI/ml) I + 1/50 (50 UI/ml) 1/100 (100 UI/ml) Interpretação Negativa Negativa 68 . positivos os animais com títulos iguais ou superiores a 1:25. ou atestado negativo para Brucelose. será efetuado pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. Os animais da propriedade serão identificados por tatuagem ou outra forma. O controle da distribuição de antígenos para diagnóstico de Brucelose. O trânsito internacional de bovinos. Art. vacinadas na idade recomendada. A profilaxia da Brucelose suína será baseada na adoção das seguintes medidas: a. submetida cada partida a controle oficial. também não é admitida a classificação de suínos suspeitos. serão produzidos por um só laboratório oficial. através de exame dos rebanhos em áreas de suinocultura mais expressiva. sendo que a interpretação das mesmas obedecerá o critério constante dos quadros a seguir: b. As condições que uma propriedade deve preencher para ser considerada livre de Brucelose serão estabelecidas através de instrução da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. dependerá da apresentação de: a. e. utilizando-se a prova de antígeno acidificado temponado (card test).68 Art. Os antígenos para diagnóstico da Brucelose. A comercialização da vacina será objeto de fiscalização oficial e sua aquisição e aplicação sob responsabilidade de médico veterinário. DAS EXPOSIÇÕES E FEIRAS AGROPECUÁRIAS Art. O atestado de exame negativo para Brucelose será válido por 60 (sessenta) dias. sendo neste caso. A produção de antígenos para diagnóstico de Brucelose pelos demais laboratórios oficiais poderá continuar até a instalação e o funcionamento do laboratório central do Ministério da Agricultura. 28. admitindo-se o título máximo aglutinante até 1:50 para fêmeas bovinas com idade superior a 30 (trinta) meses. Art.DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE ANTÍGENOS Art. prova rápida. devendo o mencionado produto ser fornecido somente a médicos veterinários. b.DO CONTROLE DE TRÂNSITO Art. 18.DO REGISTRO GENEALÓGICO. atestado de vacinação contra a Brucelose. Não será exigido atestado negativo para fêmeas bovinas com idade inferior a 30 (trinta) meses. 25. quando acompanhadas de atestado de vacinação contra a Brucelose. Art. Art. estando as bezerras e novilhas devidamente marcadas e identificadas. vacinadas entre 3 e 8 meses de idade. 21. 22. Os criadores poderão inscrever-se um esquema voluntário.DA CERTIFICAÇÃO DE PROPRIEDADE LIVRE Art. para fins de trânsito interestadual. os animais são classificados somente em positivos e negativos. para fêmeas bovinas até 30 (trinta) meses de idade. CAPÍTULO X . para obtenção do Certificado de Propriedade Livre de Brucelose. CAPÍTULO VIII .Incompleta. sêmen e produtos derivados reger-se-á pela legislação específica vigente. CAPÍTULO IX . inclusive pelo Registro Genealógico. 23. c. diagnósticos da situação. 17. 26. Art.DA PROFILAXIA DA BRUCELOSE SUÍNA Art. 19. d. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta. são considerados negativos os rebanhos que não apresentarem qualquer animal com aglutinação superior a 1:100 . 29. realizadas nos suínos com idade superior a 6 (seis) meses. a contar da data da realização do respectivo exame. Art. CAPÍTULO VII . Somente será fornecido certificado de inspeção sanitária animal. 27. Art. quando os reprodutores apresentarem resultados negativos atestados acompanharão os animais. lenta e do anel no leite. utilizando-se as provas de soroaglutinação rápida e lenta ou a prova com antígeno acidificado tamponado (prova do cartão ."card test").

b.69 + + + + I + + + I + Negativa Negativa Negativa Positiva Suínos procedentes de rebanhos positivos. a. 33. JOSÉ PEDRO GONZALES Diretor Geral do DNPA 69 . A profilaxia da Brucelose ovina e caprina será baseada na adoção das seguintes medidas. A presença de suínos infetados numa criação justifica o sacrifício do rebanho.DA BRUCELOSE OVINA E CAPRINA Art. quando o título for de 1:50 ou maior. levantamento da prevalência da doença nas áreas de criação. A Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura baixará instruções complementares permanecendo em uso os atuais formulários para exames de Brucelose e vacinação. controle rigoroso de plantéis indenes. reação positiva. obedecerá o seguinte critério: a. 32. Nos casos positivos e suspeitos. além das soroaglutinações rápida e lenta. Art. especialmente dos reprodutores utilizados. parcialmente testados ou desconhecidos 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + 1/100 (100 UI/ml) I + Interpretação Negativa Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Art. A interpretação dos resultados das provas sorológicas de aglutinação para ovinos e caprinos. CAPÍTULO XII . 31. serão precedidas provas de fixação do complemento. considerados os antecedentes clínicos e epidemiológicos.DAS DISPOSIÇÕES GERAIS Art. Os casos omissos e as dúvidas suscitadas na execução e interpretação destas normas serão resolvidos pelo Diretor da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. quando o título não ultrapassar de 1:25. vigilância severa e permanente das importações de ovinos e/caprinos. Art. Parágrafo único. reação suspeita. 30. CAPÍTULO XI . b. até que sejam estabelecidos novos modelos. 34. c. positivos retestados.

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