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Apostila de Aulas Pr_ticas Imuno

Apostila de Aulas Pr_ticas Imuno

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA

Imunologia
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 2006

PROFª ÂNGELA DA COSTA PEREIRA PROFª INÊS APARECIDA TOZETTI PROFº ANDRÉ LUIS SOARES DA FONSECA

2

SUMÁRIO
PARTE I

Técnicas de obtenção e conservação do material usado em Imunologia......................... Diluições......................................................................................................................... Cromatografia em Coluna................................................................................................ Eletroforese de proteínas................................................................................................. Princípio Teórico da Fixação de Complemento............................................................... Reação de Imunohemólise............................................................................................... Reação de Fixação do Complemento.............................................................................. Precipitação em meio semi-sólido................................................................................... Reação de Aglutinação.................................................................................................... Reação de Aglutinação Rápida para Pesquisa de Anticorpos Anti-Brucella................. Reação de Microaglutinação Passiva - Reação de VDRL............................................. Reação de Aglutinação indireta ou passiva Fator Reumatoide...................................... Imunohematologia Sistema ABO.................................................................................. Teste de Coombs Diagnostico da D.H.R.N................................................................... Reação de Inibição de Aglutinação Passiva.....................................................................
ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)………...........................

5 6 8 12 16 17 18 19 22 23 24 25 26 28 29 30 33

Reação de Imunofluorescência.........................................................................................

2

3

PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Resistência Inespecífica................................................................................................ Células do Sistema Imune............................................................................................ Formação de Células T e B e Órgãos Linfóides........................................................... Antígeno....................................................................................................................... Imunoglobulinas (I)...................................................................................................... Imunoglobulinas (II).................................................................................................... Sistema Complemento................................................................................................. Fagocitose.................................................................................................................... Complexo Principal de Histocompatibilidade (CHP/MHC)......................................... Células Apresentadoras e de Antígeno e Mecanismo de Apresentação........................ Linfócitos T................................................................................................................... Linfócitos B e Resposta Primária e Secundária............................................................. Genética de Imunoglobulinas........................................................................................ Interação do Sistema Imune.......................................................................................... Tolerância Imunológica................................................................................................. Reações de Hipersensibilidade..................................................................................... Transplantes.................................................................................................................. Eletroforese................................................................................................................... 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 54 55

PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS E EXERCÍCIOS
Radioimunoensaio........................................................................................................... ELISA............................................................................................................................. Western blotting.............................................................................................................. Imunohistoquímica.......................................................................................................... Exercício sobre Resposta Imune às infecções.................................................................. Citometria de Fluxo......................................................................................................... Referências Bibliográficas............................................................................................... 57 58 59 60 61 62 65

Anexo Portaria 23 para normatização do diagnóstico sorológico da Brucelose............... 66

3

4 PARTE I TÉCNICAS UTILIZADAS NAS AULAS PRÁTICAS 4 .

deve-se conservá-lo diluído a 1:2 em glicerina ou tratá-lo com ázida sódica a 1% para inibição do crescimento de microrganismos e estocá-lo em freezer. sem agitação alguma. Para obtê-lo colhemos uma amostra de 5 a 10 ml de sangue por punção intravenosa. este último já deve estar completamente seco e rotulado com a especificação do indivíduo.5 TÉCNICAS DE OBTENÇÃO E CONSERVAÇÃO DO MATERIAL USADO EM IMUNOLOGIA As reações imunológicas utilizadas em auxilio diagnóstico à clínica e na pesquisa experimental tem. se sua utilização for ocorrer nas primeiras 72 horas. o sangue é colhido sem qualquer anticoagulante. O gelo deverá ficar dentro de um saco plástico para evitar penetração de água nos vidros com soro. seja no consultório. deve-se seguir o preparo e estocagem do material. veterinário ou bioquímico na coleta de material. CONSERVAÇÃO DO SORO . . coleta-se a fração líquida que se separou do coágulo . . OBSERVAÇÕES IMPORTANTES .Você deverá também acondicionar em gelo. sem o fibrinogênio. Embora essas reações possam também ser feitas no líquor e ainda em células linfóides deste indivíduo. em grande parte. de 30 minutos à 1 hora após a punção.Para se obter o soro. no campo ou no próprio laboratório.Em geladeira. Após a coleta. então. Este sangue deve ser passado instantaneamente para um frasco. Se você precisar enviar a amostra do campo para a cidade procure antes retirar a fração líquida a partir do coágulo e enviá-la em um outro vidro bem tampado rotulado e acondicionado em caixa de isopor com gelo.O sangue colocado em frasco para a retração do coágulo deve ser mantido em repouso. se tiver que mandar o soro de uma cidade para outro centro. o sucesso da reação dependerá. o cuidado de retirar a agulha da seringa. odontólogo. . da boa condição em que essa material fonte se encontre à disposição do laboratório.O laboratório se encarregará de centrifugação. Se necessário armazenar o soro. . As hemácias se sedimentarão pela centrifugação e o sobrenadante se constituirá em uma amostra de soro isenta de hemólise e pronta para ser utilizada nas reações. A seguir essa fração líquida é submetida à centrifugação de 1500 RPM durante 5 minutos para separar o soro do resto das hemácias. O processo de coagulação do sangue começará a se estabelecer. .Antes de se passar o sangue da seringa para o frasco. se for necessário uma estocagem por mais dias.Em freezer. tendo-se para isto. OBTENÇÃO DE SORO O soro é a fração líquida do sangue. o que decorrerá consequentemente da competência do médico. 5 . como fonte de material do indivíduo (seja o homem ou outro animal). mais freqüentemente o soro.

ou 1/10. se o último tubo que demonstra reação contém um volume de 1 ml e o soro neste tubo é uma parte em um total de 640 partes.1 ml + 2.9 ml Diluição a 1/ 50 1 ml + 49 ml ou 0. uma solução diluição 1/10 significa que uma unidade da solução concentrada foi diluída para um volume total de 10 unidades. Usualmente se expressam as diluições como uma unidade da solução original sobre o total de unidades da solução final. 1:50.9 ml 1 ml da diluição 1/10 + 4 ml do diluente Diluição 1/100 1 ml + 99 ml ou 0. As diluições não devem ser interpretadas como significando uma unidade mais 10 unidades.6 DILUIÇÕES A diluição é o ato de tornar mais fraca uma dada solução. 1/50 etc. Isto é conseguido geralmente adicionando-se a uma solução que se pretende diluir um diluente tal como água. ficamos com uma diluição do soro a 1:2.1 ml + 9. ou seja.85% em um tubo e adicionamos a esta solução 0.1 ml + 1. etc.5 ml de NaCl a 0.85%. que não contenha nenhuma das substâncias diluídas. portanto uma diluição de 0. Quando colocamos. uma unidade em um total de 10 unidades.9 ml Diluição a 1/25 = 1 ml + 24ml ou 0.4 ml 6 . O título de anticorpo de um soro é a diluição mais alta de soro que reage com o antígeno.1 ml + 4. por exemplo. TÉCNICAS GERAL DAS DILUIÇÕES Diluição em múltiplos de 10 Diluição a 1/10 1 ml + 9 ml ou 0.9 ml 1 ml de 1/10 + 9 ml Diluição 1/500 1 ml 1/100 + 4 ml Diluição 1 /5000 1 ml 1/1000 + 4 ml Diluição 1/10000 1 ml 1/1000 + 9 ml DILUIÇÕES VARIADAS Diluição a 1/5 = 1 ml + 4ml Diluição a 1/15 = 1 ml + 14 ml ou 0. ou cloreto de sódio a 0. Portanto.5ml de soro.1 ml + 1. na quantidade requerida para conseguir uma diluição determinada. As diluições podem ser representadas como 1:10. Em imunologia clínica o título indica a concentração de anticorpo no soro do paciente.1 ml + 0. Por exemplo.5 ml de soro em um volume total de 1.4 ml Diluição a 1/20 = 1 ml + 19ml ou 0. 0. o título é 640 unidade/ml de soro. pois há 0.0 ml de solução.5:1.0 ou 1:2.

Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3.etc. 2 .Diluições sucessivas na razão igual a 4: 1 . Com base no esquema abaixo.Ao tubo 1 adicionar 1 ml da solução corante (a ser diluída).Distribuir nume série de tubos 3. partindo de uma diluição 1/5. 1/1024. homogeneizar. 5)Esquematize uma diluição 1/625.0 ml do diluente em cada tubo. 3)Utilizando um volume de soro de 0. 6)Vamos imaginar que após a interação entre o antígeno e ao anticorpo. Exemplo .Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2. As diluições obtidas serão: 1/4. tenha ocorrido a formação de um precipitado no fundo do tubo (como descrito abaixo na legenda).4ml. 4)Esquematize uma diluição 1/64 de uma solução previamente diluída a 1/8. 1/16. 2) Esquematize uma diluição na razão 2 de um soro.5ml dessa amostra e diluindo até o 8º tubo. quando esses estavam presentes em concentração suficiente. homogeneizar. utilizando inicialmente apenas o volume de 0. Exercício de Fixação: 1) Esquematize uma diluição 1/50 de uma solução previamente diluída a 1/10. esquematize uma diluição na razão 3 até o 5º tubo. homogeneizar com o auxilio de uma pipeta. desprezando 1 ml do último tubo.Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. 5 . 1/64. 1/256. 4 . 3 . determine o título dessa reação: Não ocorreu interação Ocorreu interação Ag-AC 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 7 .7 DILUIÇÕES SUCESSIVAS Nesta técnica se transfere sucessivamente volume determinado de um tubo para o tubo seguinte ao qual se adicionou uma certa quantidade de diluente.

CROMATOGRAFIA POR TROCA IONICA A cromatografia por troca iônica separa as proteínas aproveitando a diferença de suas cargas elétricas. Nestas técnicas. e flui através do gel. permite a separação das proteínas. O aumento da molaridade do tampão fornece mais íons para competir com a proteína pela ligação ao gel. geralmente celulose.  A  B  C PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA A = a camada da coluna é feita de uma matriz de partículas de celulose positivamente carregadas. sob condições apropriadas. Pelo aumento da molaridade ou diminuição gradual do pH do tampão de eluição as proteínas são eluidas em função do número crescente de grupos carregados ligados ao gel. e a subsequente eluição. A dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose) é uma resina positivamente carregada. sendo usada para o fracionamento de moléculas negativamente carregadas. 8 . cheia de um gel sintético. A troca do pH do tampão que passa através da coluna afeta a carga da molécula protéica. No quadro a seguir temos exemplificado a molaridade de NaCl e pH requeridos para eluir as proteínas plasmáticas humanas da DEAE-celulose. e é usada para o fracionamento de moléculas positivamente carregadas. uma amostra é depositada no ápice de um cilindro ou coluna de vidro. As características físicas das moléculas de proteínas resultam em retenção destas na matriz do gel em graus diferentes. C = as moléculas negativamente carregadas. na mistura protéica ligam-se à coluna e são retidas. enquanto que as moléculas neutras passam entre as partículas carregadas e são eluidas. A unidade funcional do gel é um grupamento carregado preso em um suporte. B = a solução contendo moléculas negativamente carregadas e outras neutras é colocada na coluna. A carboximetil-celulose (CM-celulose) é uma resina carregada negativamente.8 CROMATOGRAFIA EM COLUNA Técnicas cromatográficas são atualmente métodos amplamente empregados para o fracionamento de proteínas e isolamento de imunoglobulinas.

Exemplificamos abaixo a separação de aminoácidos com a resina de troca iônica sob condições ácidas. β globulina.5 9 . os aminoácidos são eluidos de forma diferente. albumina. no pH 2. ligando-se à carga negativa da resina. Aumentando-se o pH do tampão.5 α2 globulina. Utilizando-se de um tampão.0 SO3. β lipoproteína 0.Na+ SO3 Na + H3N + OH COOH AMINOÁCIDO B ELUÍDO pH 4. fibrinogênio 0.5 albumina. OH pH 2.0 transferrina. Os aminoácidos com carga positiva em um meio fortemente ácido ocuparão as posições do sódio de uma resina de troca catiônica. e serão eluidos da coluna trocando-se novamente os íons sódio.8 IgG 0. IgA 0.5 apenas o aminoácido B é eluido.050 7.080 6. a qual pode ser obtida quase livre de todas as outras proteínas séricas.0 α 2 globulina.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH SO3.5 SO3. haptoglobina -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A cromatografia em DEAE . de modo que haja um aumento progressivo do pH.celulose é uma técnica excelente para o isolamento de IgG. No pH 3.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A ELUÍDO pH 3. refletindo as diferenças nas constantes de dissolução dos grupos ionizáveis da resina.9 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Molaridade de NaCl PH Proteínas eluidas -----------------------------------------------------------------------------------------------------------0.Na+ OH SO3.025 7. α 2 globulina. O aminoácido A continua adsorvido à coluna.100 6.0 (ambos aminoácidos A e B são adsorvidos). Já no pH 4.5 o aminoácido A também é eluido.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH H3N+ COOH AMINOÁCIDO B SO3. os aminoácidos tornam-se carregados negativamente. Os aminoácidos com a carga positiva trocam de posição com os cátions sódio da resina.045 7.

) e grandes (.O círculo aberto (O) representa as partículas de dextran polimerizado sobre as quais um a mistura de moléculas protéicas pequenas (.10 CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A gel filtração separa as moléculas de acordo com o seu tamanho. enquanto as menores são retidas. como dextran (Sephadex) . A B C 10 . não podendo penetrar nestes. A gel filtração é largamente usada também para separar as cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas ou para isolar proteínas de Bence-Jones (cadeias leves) puras de urina de pacientes com mieloma múltiplo. as moléculas aprecem no eluente de coluna em ordem decrescente de tamanho. A fase estacionária é mais comumente constituída de partículas hidrófilas tipo gel. As partículas são porosas contendo microcanais. as moléculas protéicas mais volumosas que os poros das partículas. A IgM pode ser facilmente separada de outras imonoglobulinas séricas por gel filtração. O solvente e as moléculas menores que os canais. C . B . dependendo primariamente do tamanho e são separadas por um simples processo de peneiração.As moléculas maiores são eluidas. penetram no seu interior e ai são retidas. Por isso. passam através do gel na fase liquida fora das partículas e são eluidas primeiro.As moléculas entram e passam através da coluna em proporções diferentes. Assim.. cujos diâmetros permitem a passagem ou a retenção de moléculas de diferentes tamanhos. PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A .) é depositada.

o qual desfaz as ligações antígeno-anticorpo. Um antígeno é acoplado à uma matriz insolúvel tal como a Sepharose. aqueles anticorpos especificos contra o antígeno são retidos pela ligação aos antígenos fixados ao gel. Uma técnica semelhante pode ser usada para purificar um antígeno. acoplando-se um anticorpo a uma matriz inerte. Quando a mistura de anticorpos de diferentes especificações é passada através da coluna. A ligação antígeno-anticorpo é uma das reações que podem ser aplicadas á cromatografia por afinidade. Estes anticorpos específicos podem ser recuperados pela lavagem da coluna com um tampão ácido. 11 .11 CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE A cromatografia por afinidade usa interações biológicas especificas reversível entre o material do gel e a substância a ser isolada. ou as moléculas de antígeno são insolubilizadas pela ligação cruzada com glutaraldeído.

globulina 12 . com maior velocidade se distanciará dos componentes menos carregados de maneira que as partículas com pouca ou nenhuma carga permanecem relativamente estacionadas. Isto faz com que todas as proteínas se carreguem negativamente e migrem na mesma direção. No caso das proteínas. globulina Alfa (α). pH 5.2.3 γ .5-8 β globulina β lipoproteína pH 6. Assim.4 Albumina α 1 .0. a eletroforese é executada com um tampão de pH fora do espectro isoelétrico. O espectro das proteínas séricas varia entre pH 4.globulina α 2 . Toda proteína tem seu “ponto isoelétrico”. estão altamente carregados e migram com maior rapidez. As proteínas que tem pontos isoelétricos mais ácidos.7 . Em circunstâncias opostas. apresentam ponto isoelétrico acima deste espectro. elas podem separar-se em cinco grupos principais (por meio da eletroforese convencional de zona). Assim. a saber: albumina(fração mais rápida). se for negativa.12 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS Princípio: Chama-se eletroforese. beta(β) globulina e gama(γ) globulina. Quando a soma das cargas positivas excede o número total de cargas negativas. Algumas proteínas de localização intracelular. em uma dada proteína. Quanto mais carregada a partícula.globulina Na maioria das vezes. sua migração será para o pólo negativo ou cátodo. a proteína não tem carga e se denomina “isoelétrica”.5.5 a pH 6.6.4 . Conforme a velocidade de migração. é possível a separação dos componentes protéicos do fluidos biológicos. resulta uma carga negativa. Em geral as proteínas séricas são separadas em um pH que varia de 8. o que é determinado pelo pH do meio onde a proteína é isoelétrica. migrará para o positivo ou ânodo. a molécula tem uma carga positiva.8 a 9. se a carga da superfície da partícula for positiva. por outro lado. as partículas carregadas avançam para o eletrodo de carga contrária.1. ao fenômeno da migração de partículas eletricamente carregadas sob a influência de um solvente condutor (tampão). em seguida a globulina Alfa (α). Em meio alcalino se carregam eletronegativamente e quando submetidas a uma corrente elétrica migram para o ânodo com uma velocidade que guarda relação com o número de suas cargas. Quando as cargas positivas e negativas se neutralizam. Esquema isoelétrico das proteínas séricas pH 4.baseando-se na diferença de velocidade de migração das diversas proteínas. estas possuem grupos amino e carboxílicos livres e devido a isso estão carregadas positiva ou negativamente em solução aquosa na dependência do pH do meio.

como na proteinuria de Bence Jones do mieloma. tal como ocorre na hipogamaglobulinemia.13 APLICAÇÕES NA IMUNOLOGIA A eletroforese de zona é extremamente valiosa para o diagnóstico dos distúrbios paraprotéicos humanos tais como mieloma múltiplo e microglobulina de Waldenstron. ocasionalmente. bioquímicos ou imunológicos.globulinas. Devem ser feitos testes quantitativos específicos.globulinas do eletroforetograma. Na eletroforese do soro. a maioria das imunoglobulinas migra para a zona designada γ . mas também são encontradas quantidades significativas na zona de β .globulinas e. para a identificação da proteína em questão. Uma diminuição na concentração de γ . Cadeias leves livres são prontamente detectáveis na urina quando presentes em quantidades aumentadas.globulinas. 13 . região das α2globulinas. também pode ser detectada com esta técnica. Picos nestas regiões são também compatíveis com distúrbios paraproteinemicos que envolvem imunoglobulinas. Nestes distúrbios ocorre geralmente um pico protéico restrito eletroforeticamente na região de γ .

Lavar o microaplicador com água destilada e colocá-lo em contato com a amostra de soro. retirar a fita e colocá-la em banho corante por 10 minutos. tubos de ensaio e etc.14 TÉCNICA: ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE CELULOSE Material necessário • Fitas de acetato de celulose (CellogelR) • Tampão de corrida pH 8.Para a determinação quantitativa das frações protéicas. agitar para propiciar a descoloração da fita e transferir para outro banho descorante. cortar as frações coradas e introduzí-las em tubos de ensaio respectivamente marcados.. contendo 2 ml de solução de eluição. Método 1. desligar a cuba. uma leve aplicação do soro a cerca de 2.15) 14 . ajustando para 200 Volts. 5. deixar correndo a amostra por 35 minutos. As tiras tem um angulo picotado. Retirar as fitas do tampão e secá-las com papel de filtro.04M) • Corante Ponceau`s • Solução descorante (Metanol a 50%) • Solução de eluição (ácido acético a 80%) • Fonte de continua para 200 volts • Cuba de eletroforese • Espectrofotometro Pipetas.Retirar as fitas do banho corante e transferir para um recipiente com a solução descorante. Tampa a cuba e ligar. Só uma superfície da fita é penetrável.) 13. com a face absorvente voltada para cima (Obs. Fazer a dosagem de proteínas totais da amostra de soro. Colocá-las esticadas sobre o suporte da cuba. 11. Observar para que ambas as extremidades da fita estejam em contato com a solução tampão e o picote da fita na canaleta positiva. 4. 7. 9.6 forca iônica 0. 10. 12. Agitar até a fita dissolver-se completamente. Terminada a corrida.036 (Veronal sódico 0. visível depois de seca . Fazer um tubo com um pedaço da fita sem proteína (branco) para zerar o aparelho. cálculos conforme modelo da apostila (pag. Colocar as fitas de cellogel imersas em tampão de corrida por pelo menos 10 minutos. obtendo assim a densidade óptica da amostra (D. Fazer. 3. Repetir o processo até as partes sem proteína na fita ficarem brancas.0 cm do polo negativo.Fazer os. essa é a face opaca. então.O. 2. o qual deverá estar situado na posição inferior a direita do operador). 6.Ler em espectrofotometro usando um comprimento de onda de 520nm. Preencher cada um dos compartimentos da cuba de eletroforese com tampão de corrida. microaplicador. 8. papel de filtro.

...globulina α2.......globulina total D..... 0..........061 0.....80 x 7...............10 Proteína total = 7.x X = 0...91 7.10 g% Valor relativo (%) 0.4 g/100 ml 0......108 0.8 4..553---------------.034 0........... para verificar o valor absoluto (g/100ml).. γ-globulina.28 0.5 a 1..... FRAÇÕES Albumina α1.....6 a 5..O..........72 0..globulina γ............. divide-se por 100.....................10 = 467...1 12...67 0..18 : 100 = 4..553 x 100 = 65.....841 Valor absoluto (g/100ml) 65.. 3.. β -globulina..3 10.......... α1-globulina.....0 Valor absoluto g/100ml 4......... e multiplica-se por 100.............6 a 1......... Somam-se as densidades ópticas de cada fração e para obter-se o valor relativo em % divide-se a D....67g/100ml Valores normais : Albumina.........0 g/100 ml 0..........O..6 a 1........15 CÁLCULOS Faz-se a leitura da densidade óptica de cada tubo..1 a 0.....841 EXEMPLO Valor relativo (%) 65.O...0 7.........6 g/100 ml 15 ....80% 0...globulina β ..........841----------------100% 0......085 0.....0 g/100 ml 0... α2-globulina.... Depois........2 g/100 ml 0.553 0.....52 0..... de cada fração pela soma-se das D......9 100.

Se houver complemento livre. quando cobaias restabelecidas de cólera eram infectadas com o vibrião colérico. e é portanto necessário adicionar um indicador. essa atividade desaparecia. o complemento tiver sido ligado ao complexo Ag-Ac. Pfeifer mostrou que. ao contrário. por causa da liberação de hemoglobina das hemácias lisadas. seu soro possuía forte atividade bacteriolítica contra esse microorganismo. e a adição subsequente do complemento acarretará rapidamente a bacteriólise. Logo que se misturam os reagentes os eritrócitos formam uma suspensão vermelha opaca. Se. Quando se mistura o soro desconhecido com um antígeno específico e o complemento. o que serve para diagnosticar a infecção correspondente. Quando o soro da cobaia era aquecido. A bactéria que induziu a imunidade e contra a qual atividade era dirigida. é o ANTÍGENO.Se o soro do doente não contiver o anticorpo especifico. imunes ou não (complemento). A aplicação da reação de fixação do complemento permite determinar a presença do anticorpo especifico no soro do paciente. a hemoglobina difundese no líquido. e outra sensível ao calor (termolábil). formando sedimento vermelho. não ocorrerá hemólise. O processo de hemólise. mas não haverá bacteriólise. Se o anticorpo estiver ausente. que toma coloração vermelha transparente.Se o paciente tiver a infecção em questão e se. Quando ocorrer a união desses três elementos. ao contrário. Quando ocorre hemólise. o sistema hemolítico se completa e ocorrerá hemólise. podem agir como antígenos. o complemento será ligado ou fixado ao complexo antígenoanticorpo específico e nenhum complemento será deixado livre. 2. Isto se consegue adicionando-se hemácias de carneiro sensibilizadas. num tubo de ensaio. ocorrerá a união do anticorpo com a bactéria. presente no soro de quase todos os animais de sangue quente. o complemento permanecerá livre no líquido.Introdução: Em 1894. pois não haverá complemento livre para se complexar aos eritrócitos sensibilizados. encontrada somente no sangue de animal imune (anticorpo). por conseguinte. que mostrará o complemento que ainda permanece livre. cuja destruição se denomina hemólise. este não poderá se fixar as bactérias e. Em tal caso. portanto não as lisará. diz-se que a bactéria está sensibilizada. o complemento estiver ausente. com sobrenadante claro e incolor. sem sedimento visível. os glóbulos intactos depositam-se lentamente no fundo. é facilmente visível a olho nu.16 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO I . Se não ocorre a hemólise. seu soro tiver o anticorpo correspondente. mesmo existindo complemento em abundância. acontecerá uma das duas hipóteses: 1. Antígenos solúveis também reagem com anticorpos específicos fixando o complemento. quando se processa in vitro. Se. Estudos posteriormente demonstraram que a atividade bacteriolítica se devia a duas substâncias encontradas no soro: uma resistente ao calor. Em nenhum dos casos haverá mudanças visíveis para relevar o que aconteceu. sobretudo os glóbulos vermelhos. antígeno da superfície bacterianaAnticorpo-complemento in vivo ou in vitro poderá haver bacteriólise. 16 . Outras substâncias. além das bactérias.

este animal produz anticorpos anti-hemácias de carneiro.Estante de metal b . os alunos executarão a reação de imuno-hemólise.Pipetar 0.Solução tampão com veronal Técnica: 1 .Pipetar 0.3 tubos de ensaio c .Numerar os tubos 2 .1 ml de suspensão de hemácias nos 3 tubos 3 .Pipetas de 1 ml graduadas em 0.17 REAÇÃO IMUNOHEMÓLISE Quando injetamos hemácias de carneiro num coelho.Soro hemolítico (hemolisina) f .9 ml no tubo 3 6 . 17 . A reação de imune hemólise se verifica nas seguintes condições: Fresco + Suspensão de hemácias de carneiro + incubação a 37º C hemólise + Suspensão de hemácias de ausência de carneiro + incubação a 37ºC hemólise + Suspensão de hemácias de carneiro + Soro fresco de hemólise cobaia (complemento) + Incubação a 37ºC Soro de coelho imunizado contra hemácias de carneiro Inativado a 56ºC/30` Inativado a 56ºC/30` Nesta aula prática. Os anticorpos encontrados no soro do coelho podem ser demonstrados pela reação de imunohemólise entre outras.Incubar em banho-maria a 37ºC. por 15 minutos.Pipetar 0. com o objetivo de demonstrar que nesta reação participam três elementos distintos: ANTÍGENO = ANTICORPO = COMPLEMENTO Material: a .5 ml de complemento nos tubos 1 e 3 5 .Pipetar solução fisiológica tamponada: (os respectivos valores em cada tubo) 0.3 ml no tubo 2 0.1 d .Complemento g .1 ml do soro hemolítico nos tubos 1 e 2 4 .Suspensão de hemácias de carneiro a 5% e .8 ml no tubo 1 1.

6 ml 0.1 Técnica: 1. acrescentar 0. QUADRO PARA ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS: RESULTADO Reação Soro Controle do soro Testemunho do Ag Testemunho do C INTERPRETAÇÃO 18 .3 ml 0.Tampão e .2 ml do sistema hemolítico (mistura de suspensão de hemácias + soro hemolitico a todos os tubos).Complemento c .2 ml 0.2ml 3(testemunho do ag) 0.Soros (já inativados ) d .No dia seguinte. por 18 horas e.5 ml tampão 0.5 ml 4(testemunho do C`) - Complemento DH 50% 0. a seguir.Tubos de 12 x 75 mm h .Estante de metal g .Incubar em banho-maria a 37ºC durante 30 minutos.18 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO Material: a . 4 .Agitar a estante e levá-la a incubação em geladeira 2-4ºC. 3 . a 37ºC por 15 minutos.5 ml 05 ml 0.8 ml 2 . Pipetar os reagentes segundo o quadro abaixo: TUBOS Soro do Antígeno paciente (dose ótima) 1(reação) 0.5 ml 0.1 ml 0.Sistema hemolitico (hemácias de carneiro + hemolisina ) f .Antígeno b .5 ml 2(controle do soro) 0.Pipetas de 1 ml em 0.

Ac . como por exemplo. em que em determinado ponto de ótima proporção dos reagentes ou próximos deste.5 a 8. demonstrando independência imunológica total entre os reagentes pesquisados. na hepatite crônica ativa. Na temperatura mais baixa. forca iônica do tampão. A reação usualmente ocorre entre 16 a 24 horas. Outra grande importância é a de se poder saber se duas substâncias são imunológicamentes idênticas. tempo e principalmente as concentrações relativas de antígenos e anticorpo.8 pois em pH abaixo de 6. A imunodifusão é usada também com finalidade diagnóstica. c) Pipetas graduadas de 5 ml. temperatura.19 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO SEMI-SÓLIDO Imunodifusão radial dupla (reacão de Ouchterlony) Esta técnica pode ser definida como a difusão de antígenos e anticorpos homólogos um em direção ao outro num meio gelificado. d) Tubos capilares. poderá interferir na solubilidade das proteínas. MATERIAL a) Solução de agar a 1% em solução fisiológica. ocorre a reação de precipitação. Fatores que interferem na reação de precipitação são: pH. O complexo antígeno . A forca iônica maior ou menor do que a do tampão recomendado. O pH deve ser entre 6. Na imunodifusão radial dupla. parcialmente idênticas ou independentes. Os reagentes difundem-se radialmente formando uma linha visível resultante da precipitação e somente na região onde os dois reagentes se encontram nas proporções adequadas. b) Lâminas de microscopia. bem como na paracoccidioidomicose. na anemia infecciosa eqüina. A principal aplicação desta técnica tem sido na identificação de antígenos e anticorpos em misturas desconhecidas (como os fluídos biológicos). e) Solução de antígeno de Paracoccidioide brasiliensis f) Solução de anticorpos antiantígeno de Paracoccidioidis brasiliensis (soro controle) g)Soro humano para o teste h) Furador i) Câmara úmida 19 .anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arcos de precipitação. tais arcos podem fundir-se dando identidade total ou parcial (esporão) ou intercruzam-se. sendo que. Geralmente usam-se lâminas de microscopia revestidas com camada de gel de ágar a 1% em solução salina ou tamponada. A temperatura deve ser constante e entre a 4ºC e 37ºC . mas deve se esperar 40 a 48 horas para o resultado final. os reagentes são colocados em orifícios separados e opostos feitos no gel. a reação ocorre mais lentamente e a temperatura acima de 37ºC pode resultar na formação das linhas de precipitação.5 pode ocorrer precipitação não específica e o pH acima de 8.8 pode impedir a reação e dissociar complexos de Ag .

ao lado. algodão úmido para manter a umidade.soro controle positivo 4 .Colocar a lâmina com o gel sobre o modelo (gabarito) e fazer os orifícios nos pontos indicados.Aplicar.Deixar dentro da placa de Petri. os antígenos e anticorpos de acordo com o esquema. 3 ml de ágar fundido em solução fisiológica. Esperar esfriar. de maneira uniforme sobre a lâmina. 4 . 5 .Fazer a leitura após 24 ou 48 horas. OA O1 O2 O3 OB O4 A – Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 1 . ou de uma cuba apropriada. 2 . por 5 minutos. colocando.soro do paciente 1 2 – soro controle positivo B . 3. Levar à geladeira.Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 3 . utilizando um furador. em câmara úmida.20 TÉCNICA: 1 .Aplicar.soro do paciente 2 20 . usando um capilar para cada amostra.

esquematize. através de linhas.21 Após a leitura do resultado e interpretação faça o seguinte exercício para sua auto-avaliação: a) Utilizando os reagentes de acordo com a legenda abaixo. o resultado esperado na seguinte reação de imunodifusão radial dupla: B E A D C LEGENDA: A= Solução de anti-IgA das secreções B=Saliva humana C=Solução de anti-IgM D= Solução de cadeias pesadas α E=Solução de IgA sérica b) Através de seus conhecimentos sobre Imunoglobulinas justifique os resultados nos encontros das linhas: Entre B e C: ___________________________________________ Entre C e D: ___________________________________________ Entre D e E: ___________________________________________ Entre E e B: ____________________________________________ 21 .

As reações de aglutinação requerem a presença de eletrólitos.para diagnóstico da artrite reumatóide. as células se aproximam permitindo a formação de pontes moleculares. Em anti-soros com títulos aglutinantes altos. 8 . Após poucas horas de incubação.Reação de Widal . Neutralizada esta força repulsiva. 3 . para doença de chagas. No teste de aglutinação direta eritrócitos. 12 .Reação de aglutinação de Paul-Bunnell .Reação de aglutinação direta para toxoplasmose.5 ml ou em placas de microaglutinação com quantidade bem menores de reagentes.Classificação de pneumococos e estreptococos. um título precisa diferir em pelo menos duas diluições (dois tubos) para ser diferente de qualquer titulo dado. resultando em maior sensibilidade.22 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno faz parte da superfície de eritrócitos.para diagnóstico de várias viroses.Classificação de Salmonellas. 22 . Os anticorpos adicionais a estas suspensões combinam com o antígeno localizado na superfície das partículas unindo-as entre si. o inverso da maior diluição do soro na qual ocorre aglutinação.Reação de aglutinação rápida e aglutinação lenta para brucelose. Os testes de aglutinação indireta podem ser também realizados em tubos ou placas de microaglutinação. uma vez que os eletrólitos vão neutralizar a carga elétrica da partícula que em pH neutro possuem carga livre ou resultante negativa . 2 . etc.2 . Shigelas e colipatogênicos.Reação de Waaller .Reação de inibição de hemaglutinação .para riquetsiose. O fenômeno de pro-zona produz reações de aglutinação falsamente negativas em concentrações altas de anticorpos. 7 . 9 .Reação de crio-hemaglutininas para pneumonia atípica primária. 2 . 4 .Reação de Wiel-Felix . Na aglutinação indireta faz-se adsorsão passiva ou acoplamento químico de antígenos solúveis a eritrócitos ou outras partículas inertes. Muitos antígenos se acoplam espontaneamente com eritrócitos e formam reagentes estáveis para a detecção de anticorpos.Rose . 11 . a aglutinação está completa e as partículas são examinadas diretamente ou microscopicamente para evidência dos grumos. Testes para detectar anticorpos especificos são realizados pela titulação de soros imunes em diluições seriadas (2x) na presença de uma quantidade constante de antígeno. 10 . 3 .Reação de aglutinação para listeriose. Os testes são feitos em pequenos tubos de ensaio em volumes de 0. Os resultados são expressos geralmente em títulos isto é.Reação de Coombs .Determinação dos grupos sangüíneos e fator Rh.para febre tifóide.Reação de hemaglutinação indireta para toxoplasmose.Davidson . formando um agregado nítido. bactérias e uma variedade de espécies microbianas podem ser diretamente aglutinadas por anticorpos séricos.0. Exemplo de reações de aglutinação empregadas com finalidade de diagnóstico: 1 .para monucleose. Por causa da variabilidade intrínseca no sistema de teste.Reação de aglutinação para lepstospirose. 6 . um fenômeno de pro-zona pode obscurecer os resultados. bactérias ou mesmo de partículas inertes (ex: látex) que foram recobertas por um antígeno. OUTRAS APLICAÇÕES DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO 1 . 5 .para revelar anticorpos incompletos em várias doenças.

23 . o Conselho Federal de Medicina Veterinária editou portaria específica que orienta a realização e a interpretação das reações sorológicas para o diagnóstico da Brucelose Animal.(Vide anexa no fim da apostila).01 e 0. estando em uma concentração celular de 11%. pipetar 0.08. ou seja. Por isso.05 ml do soro teste depositando separadamente cada fração do material sobre uma série de quadrados numa placa de vidro específica para esta reação (ou pipetar individualmente cada uma das quantidades indicadas colocando-as em lâminas individuais de microscopia.2 ml. nas reações em que se visualizam a pró-zona.08 ml de soro (ou seja. 1:100 .Agitar o frasco do antígeno padronizado e colocar uma gota do antígeno de Brucela (30 µl) ao lado da fração de soro. Reação positiva (+): presença de aglutinação. em salina fenicada a 8. O antígeno utilizado nessa reação foi preparado de acordo com técnica internacional recomendada pelo Ministério da Agricultura. 04 . aglutinação direta). iniciando com a diluição contendo 0.04. 03 . 0. 05 . As diluições finais serão aproximadamente 1:25 . Atenção: Em soros apresentando títulos altos de anticorpos pode ocorrer o fenômeno de pró-zona. o inverso da maior diluição onde se identificou a reação (no caso. TÉCNICA 01 . 1:200 . 02 .5% e corada com verde brilhante e cristal violeta.02. NOTA: O resultado encontrado é expresso por um título.Fazer a leitura observando a aglutinação com uma fonte de luz apropriada. Em face da importância da Brucelose com zoonose.Misturar cada composição soro-antígeno com um bastão.23 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM PLACA PARA PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-BRUCELA Objetivo: Demonstração da Aglutinação Direta da suspensão bacteriana de Brucella abortus por anticorpos anti-brucela presentes no soro.Com uma pipeta específica para reação aglutinação direta para o diagnóstico da brucelose (Pipeta de Bang) ou com pipeta de 0. Reação negativa (-): não aglutinação. as primeiras diluições de soro mostram-se negativas e as últimas (maiores) diluições apresentam reação positiva. que é um evento em que o excesso de anticorpos presentes no soro teste faz com que a equivalência da interação Ag/Ac somente ocorra após altas diluições desse soro.(Cuidado para não encostar a pipeta com antígeno na fração de soro para não haver contaminação do antígeno).Agitar a placa com suaves movimentos circulares de 15 a 20 vezes por 3 minutos. previamente identificadas com a respectiva diluição). no sentido da maior para a menor diluição). 1:50 .05 ml até a diluição contendo 0. ao contrário do que comumente ocorre. 1: 400. 0. 0.

movimentos rotatórios da placa sobre a superfície da mesa com amplitude de mais ou menos 03 cm. Infecções pelo Treponema pallidum levam à liberação nos fluídos orgânicos de cardiolipina. 04 . Cardiolipina sozinha.Soros a testar. Anticorpos para antígenos cardiolipínicos são conhecidos como anticorpos de Wasserman ou reagínicos. . a 180 r. 02 .Acrescentar a cada soro uma gota de suspensão antigênica com uma seringa de 1.Pipetas Pasteur.24 REAÇÃO DE MICROAGLUTINAÇÃO PASSIVA .Seringa de 1 ml sem o bisel (ponta). mas não estimula sua produção.m.Partículas agrupadas em pequenos grumos . durante 04 minutos.0 ml (agulha sem bisel).p. através de uma técnica de microaglutinação passiva feita em placa escavada. 4 . INTERPRETAÇÃO .Leitura: A leitura deve ser feita imediatamente após a agitação observando ao microscópio de acordo com a intensidade da reação. no agitador próprio. isto é. Pacientes com sífilis desenvolvem uma resposta de anticorpos contra um hapteno ubiquitário que existe nos tecidos dos mamíferos. que pode ser extraído em alto grau de pureza do coração de bovino e é denominado cardiolipina. V.Partículas agrupadas em grandes grumos .. soros positivo e negativo. 2 .Em cada escavação da placa colocar 01 gota (0. a qual faz parte normalmente da membrana mitocondrial. TÉCNICA: 01 . seja em testes de fixação do complemento (reação de Wasserman). 5 .soro fortemente reativo.Suspensão do antígeno. etc).soro fracamente reativo. inativados a 56ºC durante 30 minutos. 3 . entretanto.R. MATERIAL NECESSÁRIO: 1 . Para tornar-se imunogênica a cardiolipina deve se ligar a uma proteína carreadora. 03 .05 ml ) dos diferentes soros.Lâminas escavadas. seja em testes de aglutinação passiva.REAÇÃO DE VDRL (VENERAL DISEASES RESEARCH LABORATORY) A reação do VDRL é usada para o diagnóstico sorológico da sífilis.D.Agitar.Partículas finamente dispersas . e à produção de anticorpos. reforçada pela adição de doses adequadas de colesterol e de lecitina constitui excelente antígeno para a detecção da reagina sifilítica. Trata-se de um fosfolipídio. nos quais o hapteno é adsorvido a superfície de cristais de colesterol (reação de floculação de Kline.não reativo . A cardiolipina. somente se liga a anticorpos. é um hapteno. 24 .L. ( a agitação pode ser manual).

TÉCNICA: 01 .Preparar uma diluição a 1/20 do soro.Colocar no círculo central da placa fornecida. pipetando 0. a cada um dos círculos. 06 .25 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA: Teste para a pesquisa do Fator Reumatóide Látex Princípio: O fator reumatóide é uma macroglobulina (IgM) que se encontra presente no soro de 85 a 90% dos pacientes com Artrite Reumatóide e em 3 a 5% dos indivíduos normais.Colocar no círculo à esquerda 01 (uma) gota do soro controle positivo e no círculo a direita 01 ( uma) gota do soro controle negativo.05 ml do soro teste no tubo contendo o tampão e homogeneizar bem. e observar macroscopicamente o resultado da reação por tempo não maior que 2 minutos. onde o antígeno. Usar um para cada círculo. O fator reumatóide é considerado um anticorpo contra a IgG. como grumos visíveis 25 . Pode ser detectado por uma reação de aglutinação passiva ou indireta. resultando numa aglutinação visível macroscópicamente.Agitar suavemente a placa com movimentos circulares. 1 gota da diluição 1/20 do soro a testar. IgG humana desnaturada pelo calor.95 ml do tampão glicina e a seguir 0. previamente agitado.Misturar e distribuir o conteúdo de cada círculo por toda sua área com um estilete. Este antígeno reage imunológicamente com o anticorpo (fator reumatóide) presentes no soro. 05 . 02 .Adicionar uma gota do reativo látex globulina. 04 . RESULTADO: NEGATIVO: Suspensão homogênea. se encontra adsorvido a superfície de um suporte inerte de látex de poliestireno. POSITIVO: Aglutinação nítida que se apresenta macroscópicamente dentro de 2 minutos. 03 .

nas hemácias. c) Soro anti B.TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTÍGENO NAS HEMÁCIAS.Sistema ABO De acordo com a existência ou não dos aglutinógenos A e/ou B.B. AB e O. (REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA) MATERIAL: a) Sangue total. b) Soro anti A. e) Lâminas de microscopia. os indivíduos da espécie humana podem ser divididos em 04 grupos: A. Landsteiner (1990) verificou que era regra todo indivíduo apresentar no seu plasma aglutininas contra os aglutinógenos que lhes eram estranhos: -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Aglutinógenos nas Aglutininas no hemácias Plasma -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A A Anti B B B Anti A O Anti A e Anti B AB A e B -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Isso torna possível a tipagem do sangue de um indivíduo dentro do sistema ABO quer pelas hemácias. A leitura é feita por visualização da aglutinação: 26 . 1 .26 IMUNO-HEMATOLOGIA 1) Grupos sangüíneos . quer pelo plasma. TÉCNICA: Seguir o esquema que se segue 1 gota: sangue 1 gota: sangue Grupos - soro anti A soro anti B Misturar com o bordo de uma lâmina limpa. d) Pipetas Pasteur.

O sistema Rh possui ainda outros antígenos.SISTEMA Rh De acordo com a existência ou não do antígeno D(Rh) nas hemácias os indivíduos da espécie humana são Rh+ (positivo) ou Rh .27 - 2 . TECNICA: A tipagem comumente é feita em lâmina usando-se como reagente soro anti . c) Hemácias B.Misturar com o bordo de uma lâmina limpa e efetuar a leitura pela presença ou não de aglutinação. b) Hemácias A. MATERIAL: a) Sangue total. Seguir o esquema 1 gota: soro 1 gota: soro 1 gota hemácia A 1 gota de hemácia B .D (Rh) observando-se a aglutinação ou não das hemácias a temperatura ambiente. c) Lâminas. d) Pipetas Pasteur. GRUPO SANGÜÍNEO . d) Pipetas de Pasteur. e) Lâminas.TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTICORPOS NO SORO. MATERIAL: a) Soro desconhecido. mas na prática transfusional apenas o antígeno D (Rh) é pesquisado por ser mais imunogênico.(negativo). b) Soro anti D (Rh). Sangue: 1 gota de sangue Soro: anti -D 27 .

Adicionar 02 gotas de albumina bovina a 22% em cada tubo.m). 02 gotas de soro de Coombs. TÉCNICA PARA O TESTE INDIRETO 01 .H.Adicionar ao sedimento de hemácias. 06 . 02 . 05 . em um 3º tubo colocar uma gota de soro controle negativo (marcar (-) no tubo). 08 . Em recém-nascido de mães sensibilizadas.R. de crianças e adição de soro de Coombs.p. 04 . consiste no emprego do soro antigamaglobulina humana (soro de Coombs) para promover a aglutinação de hemácias previamente incubadas com anticorpos incompletos. A lavagem é feita para evitar a reação das proteínas livres.28 TESTE DE COOMBS A prova de Coombs. invertendo o tubo e enxugando a borda do mesmo com papel absorvente. 09 .Após a última lavagem. em um 2º tubo colocar uma gota de soro controle positivo (marcar (+) no tubo).Agitar suavemente para misturar e centrifugar imediatamente ( 01 minuto a 1000 r. também denominada prova de antiglobulina humana.Aglutinação presente: Teste positivo Aglutinação ausente: Teste negativo 28 . decantar completamente o sobrenadante. 07 . ressuspender o sedimento de hemácias e repetir esta operação por mais 02 vezes. e incubar a 37ºC durante 15 minutos.N.Preparar uma suspensão a 5% de hemácias O-Rh positivas. O teste de Coombs direto é feito para diagnóstico da D.A cada um dos tubos acrescentar uma gota de suspensão de hemácias O Rh (+) 5%.Retirar o tubo do banho-maria e completar até 01 cm da borda com solução fisiológica ou PBS FOSFATO e centrifugar a 3000 rpm ( + ou . para misturar. 03 . INTERPRETAÇÃO 10 .Agitar. Teste de Coombs indireto é utilizado para o diagnóstico de anticorpos incompletos no soro de qualquer pessoa possivelmente sensibilizada por antígenos eritrocitários do sistema Rh (sensibilização pós-transfusional ou no decurso de gestação). decantar o sobrenadante por inversão do tubo.03 minutos).Colocar em um tubo de ensaio uma gota do soro a ser testado (marcar T no tubo). Consiste na lavagem de hemácias já sensibilizadas.

5) Agitar levemente a placa. 8) Colocar 50µl de hemácia sensibilizada com o antígeno do vírus Hepatite B em todos os poços. 6) Colocar 50µl de soro anti-antígeno Hbs em cada poço. C etc. Cada poço da placa de microaglutinação e reconhecido também por “well”. 1 A B C D E F G H 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PROCEDIMENTO 1) Utilizando a linha A. à medida que autorizaram uma sensibilidade maior para a pesquisa daqueles reagentes. do 1º ao 11º poço. 7) Agitar levemente a placa. B. A reação será realizada em placas de microaglutinação. proceder com esta diluição até o último poço (numero 11). 10) Ler a reação após 2 horas. Esse tipo de placa presta-se a reações em que trabalhamos com pequenos volumes de reagentes. colocar 50µl de tampão diluente em cada poço. o método de Inibição da Aglutinação Passiva. 29 . Observe. que os poços estão distribuídos formando linhas: linhas A. homogeneizar novamente e passar 50 µl do 2º poço para o 3º . 3) Homogeneizar o conteúdo do 1º poço e passar 50µl para o 2º poço . onde não sofra vibrações. 4) Desprezar 50µl do 11º poço (último). 9) Selar com fita Durex para que não haja evaporação dos reagentes e colocar a placa sobre uma superfície rígida. e a diluição dos soros e reagentes será feita através de pipetas automáticas. na placa. a partir do 2º poço até o 11º poço dessa linha. Com o objetivo de conduzir os alunos de graduação desta instituição para a compreensão de mais uma variação. escolhemos fazer a pesquisa de antígenos do vírus da Hepatite B por tal método. 2) Colocar 100 µl de soro humano no 1º poço.29 MÉTODO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA As variações sobre os métodos de aglutinação surgiram ampliando as possibilidades de diagnóstico e pesquisa de anticorpos e de antígenos.

tal como placas de poliestireno ou polivinil. que poderá ser o antígeno ou mesmo uma classe de anticorpo em particular. cruzi PRIMEIRA AULA – SENSIBILIZAÇÃO E BLOQUEIO DA PLACA Material necessário: Placas de poliestireno Solução contendo antígenos de T.O da amostra/D. Os conjugados devem ser preparados com anticorpos de alta afinidade. podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados. gelatina. • Método de captura: Um anticorpo específico é adsorvido à placa para reter o objeto da pesquisa. gerando um complexo que na presença de um terceiro composto um doador de elétrons (cromógeno ) forma um polímero intensamente colorido. materiais que possibilitam a ligação covalente de proteínas. cruzi Solução tamponada de Caseína a 1% Solução tampão para lavagem Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Estufa à 37°C 30 . entre eles os mais empregados são: • Método indireto: amplamente empregado para a pesquisa de anticorpos apresentando como vantagem a utilização de um único conjugado em diferentes sistemas. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos. preferencialmente monoclonais. Vários métodos são realizados utilizando o principio do enzima-imunoensaio. O cromógeno mais utilizado em ELISA é o OPD (ortofenileno diamina). que pode ser obtido pela relação entre a coloração da amostra e a coloração do controle positivo (D. BSA) no diluente da amostra (bloqueio). Anticorpos ou antígenos podem ser conjugados a enzimas de maneira que. e reage especificamente com seu substrato.30 ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) Este teste foi desenvolvido em 1971 por Engvall e Perlmann como alternativa ao radioiumunoensaio. O conjugado utilizado deverá ser específico para a estrutura capturada na placa. Independente do método escolhido para leitura é necessário determinar o limite de reatividade ou “cut-off” do teste. o peróxido de hidrogênio. O princípio básico é a adsorção de um dos reagentes (antígeno ou o anticorpo) a uma fase sólida.O do controle positivo). ao ser adicionado o substrato da enzima à reação. TÉCNICA DE ELISA INDIRETO PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-T. é gerado um produto colorido que poderá ser observado a olho nu (ensaio qualitativo) ou ter sua densidade óptica medida por espectrofotometria (ensaio quantitativo). A adsorção não específica de componentes à placa pode ser reduzida incluindo-se uma proteína inerte (caseína. A enzima peroxidase é muito utilizada para este teste. Tais placas contêm séries de poços onde serão depositados os reagentes.

2. 3. Trabalhando com a placa previamente sensibilizada. cruzi e bloqueadas. cruzi. 4. Boqueio de placa previamente sensibilizada: 1. 5. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. cada poço da placa. cruzi em cada poço da placa de poliestireno. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. Pipetar em duplicata (em dois poços consecutivos) 100µl dos soros controles e dos soros testes de acordo com o esquema abaixo: A: Controle negativo B: Controle negativo C: Controle positivo D: Controle Positivo E: Soro teste 1 E: Soro teste 2 F: Soro teste 3 G:Soro teste 4 31 . 2. cada poço da placa. Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Soro Controle Positivo Soro Controle Negativo Soros testes Conjugado enzimático Solução reveladora (peróxido de hidrogênio+OPD) Metodologia: 1. Incubar 2 horas à 37°C em estufa. Pipetar 200µl de solução contendo antígenos de T. cruzi.31 Metodologia: Sensibilização da placa: 1. Adicionar 200µl de solução de bloqueio (Caseína a 1%) a cada poço da placa e incubar overnight a 37°C. Inverter a placa e bater sobre papel de filtro para retirar o excesso de tampão. desprezar a solução de antígenos de T. Material necessário: Placas previamente sensibilizadas com antígenos de T. SEGUNDA AULA – Detecção de anticorpos anti-T.

3.32 2. Inverter e bater a placa sobre superfície com papel de filtro. Adicionar 100µl de conjugado a cada poço da placa. Inverter e bater a placa. 10. Novamente incubar 15 minutos à 37ºC. 4. 8. Incubar a placa 30 minutos à 37ºC. 11. Desprezar o conteúdo da placa e lavra três vezes com solução tampão. Leitura visual de placa pronta 32 . 9. 7. Levar para incubação em estufa durante 15 minutos à 37º C. 6. Adicionar 100µl de solução reveladora (substrato+cromógeno) em cada poço. 5. Lavar três vezes a placa com solução tampão.

C D A B ---------------__ _ _ _ _ _ _ __ Radiação de longos comprimentos de onda Radiação de curtos comprimentos de onda A . ou seja maior comprimento de onda do que o da luz incidente ou absorvida.495 nm.33 REAÇÕES DE IMUNOFLUORÊSCÊNCIA FINALIDADE: Detecção de anticorpos ou de antígenos. enquanto uma substância é irradiada com luz de cor diferente. Os fluorocromos apresentam espectros de absorção e emissão característicos. resultando em fluorescência. armazená-la durante curto espaço de tempo (10-9 a 10-7 de segundos) para. O isotiocianato de tetrametilrodamina. O comprimento da onda emitido (fluorescente) terá necessariamente menor energia. em seguida emiti-la sob a forma de uma radiação de maior comprimento de onda. comprimento de onda. e emite sua cor verde característica a 517 nm. filtros de excitação para produzir um comprimento de onda capaz de causar ativação do fluorocromo e filtros para evitar a passagem pela ocular. Para a observação microscópica da fluorescência é necessária uma adaptação do microscópio óptico comum. que se conjuga facilmente as proteínas em pH alcalino (acima de 9 ). isto é.Filtros de barreiras Esquema do sistema óptico do microscópio de fluorescência. de luz de baixo comprimento de onda. Ambos os fluorocromos são empregados sob a forma isotiocianato. As técnicas utilizadas para o estudo de imunofluorescência comportam duas modalidades principais: 33 . que emite cor vermelha. A fluorescência é a emissão de luz de uma cor.Filtros excitadores D . É possível tornar visível a reação Ag-Ac marcando um dos reagentes com substâncias ditas fluorocromos. contendo uma fonte de luz excitadora de alta intensidade. tem um máximo de absorção a 550 nm e emissão máxima a 580 nm. A absorção máxima do isotiocianato de fluoresceína é de 490 . que tem a capacidade de absorver a energia luminosa. Os fluorocromos mais usados em laboratório clínico são a fluoresceína e a rodamina.Lâmpada de halogênio B .Preparo fluorescente C .

2 . É o processo comumente usado para a identificação de microorganismos por imunofluorescência. anti-DNA. Usa-se esta técnica na pesquisa de anticorpos circulantes no diagnóstico de: toxoplasmose.Imunofluorescência indireta . sífilis. trata-se com um anticorpo fluorescente com especificidade dirigida para os determinantes antigênicos do anticorpo ligado ao antígeno. Sobre a preparação de antígeno fixado à lâmina. após haver a reação Ag-Ac.baseia-se na detecção de anticorpos utilizando um antígeno conhecido e um soro anti-imunoglobulina humana. etc. antinucleoproteína. lava-se a preparação para remover todas proteínas (imunoglobulina) não fixadas pelo antígeno.baseia-se na detecção de antígenos utilizando anticorpos específicos marcados com isotiocianato de fluoresceína. aplica-se primeiro o anticorpo específico não fluorescente. sorotipos de colibacilos enteropatogênicos. etc. e a seguir. como estreptococos beta-hemolíticos do grupo A. esquistossomose.Imunofluorescência direta . anti HIV. anticorpos antireóide. marcado com fluoresceína. bacilo diftérico. doenças de Chagas. 34 . sorotipos de leptospiras.34 1 . leptospirose.

Secá-las com ar quente.3 ml nos demais tubos. campo escuro.2. ainda que de pequena intensidade.35 TÉCNICA DA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA TOXOPLASMOSE 1 . 1/4096. 5 . 1/256 .02 ml). diluído conforme seu título. 5 (cinco) minutos de cada vez.1 ml para o 2º tubo. como demonstrado no esquema abaixo.5 ml de salina tamponada e 0.Remover os soros de cada lâmina sob delicado jato de água e lavá-las por imersão por duas vezes em PBS. 35 . 10 minutos cada lavagem.Depositar uma pequena gota do conjugado fluorescente liquido antiimunoglobulina humana (cerca de 0. 8 . Nas reações negativas os toxoplasmas não apresentam fluorescência ou esta fica localizada apenas nas extremidades dos parasitas (coloração polar). 3 .Colocar no tubo 1/16 1.Incubar novamente as lâminas a 37ºC por 30 minutos. 11 . Como título tomar o inverso da maior diluição do soro para a qual se evidencia fluorescência em toda a periferia dos toxoplasmas. b . em cada área das lâminas. com objetiva de imersão.1 ml do soro. homogeneizar bem e passar 0.1 ml para o 3º tubo e assim sucessivamente.Depositar pequenas gotas (0.Preparar diluições dos soros em solução salina tamponada pH 7. da seguinte maneira: a . homogeneizar bem e passar 0. 7 .Marcar as lâminas com os respectivos soros. em câmara úmida. 10 . TOXO 1/16 1/256 1/64 1/4096 1/1024 _ + 6 .Observar os preparados ao microscópio de fluorescência. 1/64 .Incubar a 37ºC em câmara úmida. 4 . 1/1024 .Secar bem as lâminas fixadas com antígeno. filtro excitador BG 12/2 mm ou KP 500 e filtro barreira 50.Pipetar no 1º tubo 0. na razão de 1/16 .Enxugar o verso e as bordas das lâminas com papel absorvente e ao redor das áreas da reação. 12 . secar como no indicado do item 8 e montá-las com glicerina alcalina e lamínula.02 ml) das diluições dos soros em cada área das lâminas. 2 . 9 .Lavá-las 2 (duas) vezes em PBS. por 30 minutos.Preparar diluições a 1/16 do soro controle positivo e do soro controle negativo.

Tal seção tem como finalidade permitir ao aluno uma auto-avaliação sobre o tema tratado em sala de aula. pesquise. os alunos deverão ter compreendido o assunto tratado se forem capazes de responder aos seguintes objetivos: 36 .36 PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS Esta parte da apostila apresenta de forma sucinta os objetivos gerais e específicos de algumas unidades do nosso programa. Se tiver dúvidas sobre qualquer uma das respostas. discuta com os colegas ou procure os professores da disciplina. Ao final de cada unidade e após os estudos. esforçando-se para saber descrever com clareza sobre o que está sendo perguntado. Responda-os com cuidado e atenção. que deverão ser feitos em casa.

2. 3. Conceituar e diferenciar resistência inespecífica e específica. 5. Citar os principais mecanismos de resistência inespecífica.37 UNIDADE: RESISTÊNCIA INESPECÍFICA Objetivos gerais e específicos: 1. Entender os fenômenos de defesa como mecanismos de adaptação às agressões do meio ambiente. Descrever os principais elementos da mucosa e de que forma atuam na resistência inespecífica. 37 . 4. Descrever os principais elementos da pele e de que forma atuam na resistência inespecífica.

Diferenciar as células que atuam na defesa especifica.Diferenciar morfologicamente imunológica.Reconhecer as células que participam da resposta e fenômenos imunológicos.Definir a função da cada célula dentro da resposta imunológica. e. d. cada célula que participa dos eventos da resposta c.Diferenciar quanto a origem e função os linfócitos T e os linfócitos B. b. daqueles que atuam na defesa inespecifica. 38 .38 UNIDADE: CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE Objetivos gerais e específicos: a .

8) Reconhecer aspectos da adaptabilidade dos órgãos linfóides secundários para a fase de reconhecimento antigênico na resposta imune. à partir da célula primitiva. 7) Comparar e justificar os efeitos da timectomia neo-natal e na fase adulta. 15) Justificar a proliferação linfocitária nos órgãos linfóides secundários. para o sistema imune. 9) Explicar o centro germinativo nos linfonodos. 2) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides secundários no sistema imunológico. 14) Reconhecer o papel das vênulas pós-capilares de endotélio alto nos linfonodos com relação ao tráfego de linfócitos. 12) Explicar o tráfego de linfócitos no organismo. o fígado fetal e a medula óssea. à partir da célula primitiva.39 UNIDADES: FORMAÇÃO DE CÉLULAS T E B e ÓRGÃOS LINFÓIDES Objetivos gerais e específicos: 1) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides primários no sistema imunológico. 11) Reconhecer a principal via de acesso das “estruturas estranhas”. 5) Relacionar os passos envolvidos na formação de células T efetoras. 16) Justificar a proliferação celular nos órgãos linfóides primários. aos órgãos linfóides secundários. 13) Explicar como os linfócitos efetores produzidos em um linfonodo têm acesso a um sítio de infecção em outra região ou tecido. considerando as fases de uma resposta imunológica. 6) Relacionar os passos envolvidos na formação de plasmócitos secretores de anticorpos. 39 . 10) Justificar a hiperplasia de um órgão linfóide secundário. 3) Descrever as características histológicas e anatômicas dos órgãos linfóides primários e secundários. 4) Relacionar funcionalmente a membrana do saco vitelino.

em geral . Exemplificar a situação em que uma substância apresenta antigenicidade e não apresenta imunogenicidade. 5. Definir o termo imunogenicidade e antigenicidade. 10. 9. 3. 6. Justificar a diversidade de epítopos em uma determinada substância imunogênica. Explicar os fenômenos de reatividade cruzada.40 UNIDADE: ANTÍGENOS Objetivos gerais e específicos: 1. 4. Explicar a condição para que haja formação de uma resposta imunológica para os haptenos. Explicar três formas de ação dos adjuvantes imunológicos. Reconhecer a estrutura de um epítopo em uma molécula protéica. 40 . 7. 2. Conceituar “epítopo”. Citar e explicar os fatores que contribuem para a imunogenicidade de uma molécula. 11. 8. Conceituar e exemplificar “hapteno”. Citar os adjuvantes imunológicos mais empregados. entre antígenos.

o) Definir a imunoglobulina de maior peso molecular. h) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. em relação as outras imunoglobulinas. j) Determinar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. f) Definir sitio combinatório. k) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM. g) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro. l) Reconhecer a forma de participação da IgE nas reações alérgicas. 41 . c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina. d) Identificar na molécula as regiões Fab e Fc. i) Esquematizar o mecanismo de formação de IgAS desde sua síntese até sua chegada na secreções. b) Determinar a estrutura básica de uma molécula de imunogobulina. n) Relatar a importância da transferência placentária de imunoglobulina na espécie humana.41 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos I) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo imunoglobulinas. e) Citar as diferentes classes de imunoglobulinas existentes. qual a classe que desempenha este papel e a que se deve esta propriedade. m) Definir as imunoglobulinas que apresentam peça J e qual a função desta peça.

c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina. f) Reconhecer as imunoglobulinas que apresentam subclasses e diferenciar estas subclasses de acordo com a nomeclatura vigente. em imunoglobulinas.42 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos II) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo Imunoglobulinas. h) Conceituar idiótipos.Região carboxi-terminal l) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro. b) Reconhecer a estrutura básica de uma molécula de imunoglobulina. t) Determinar estruturalmente a composição de uma molécula de IgM. w) Determinar estruturalmente a composição de uma IgD. g) Conceituar e exemplificar alotipia em cadeias leves e pesadas. p) Reconhecer as subclasses existentes de IgA.Cadeia pesada 2. m) Identificar as sub-classes de IgG existentes. x) Reconhecer a forma de participação de IgE nas reações alérgicas. relação as outras 42 . o) Definir a propriedade de opsonização de que é dotada a IgG. v) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM. n) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. q) Discriminar estruturalmente uma molécula de IgG e uma de IgAS.Domínios variáveis e constantes nas cadeias leves e pesadas 4. d) Identificar os fragmentos resultantes após a clivagem enzimática de uma molécula de imunoglobulina pela ação de pepsina e da papaína. s) Explicar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. u) Determinar o peso molecular e quantidade relativa de IgM encontrada no soro. 1. i) Esquematizar uma molécula de IgG reconhecendo nela os seguintes tópicos.Cadeia leve 3. e) Diferenciar os diversos isótipos de cadeias leves e de cadeias pesadas existentes. r) Esquematizar o mecanismo de formação da IgAS desde sua síntese até sua chegada nas secreções.

Explicar o desenvolvimento de uma alça de amplificação na ativação da via alternativa. ♦ Justificar o papel inespecífico da ação do sistema do complemento. produzidos pela ativação do Sistema do Complemento. ♦ Identificar a analogia entre as enzimas C4b2a e C 3bBb. clássica e efetora do sistema do complemento. ♦ Justificar a participação de uma resposta imuno especifica na ativação do Sistema do Complemento. Explicar a ausência da alça de amplificação da via alternativa nos processos fisiológicos de ativação do Sistema do Complemento. por que na maioria das células os mecanismos de lise pelo Complemento não são possíveis. ♦ Reconhecer o mecanismo de ativação da via alternativa e da via clássica do Sistema do Complemento. ♦ Identificar os fatores ativadores da via clásssica e da via alternativa do Sistema do Complemento. Justificar.43 UNIDADE: SISTEMA COMPLEMENTO Objetivos gerais e específicos: ♦ Descrever os efeitos biológicos surgidos pela ativação do Sistema do Complemento. ♦ Identificar a via alternativa. nos fenômenos de aumento de permeabilidade capilar. Demonstrar como o sistema do complemento participa da eliminação de antígenos que não são celulares ou que não tem membrana exposta. através dos textos bibliográficos. Explicar o mecanismo da ação dos fragmentos de ação biológica. Justificar a ação lesiva do sistema do complemento para células do próprio hospedeiro. Reconhecer as bases de um mecanismo homeostático em relação à ativação do sistema do complemento. agregação plaquetária. ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ 43 . quimiotaxia para PMN e lise celular.

e) Definir opsonização. l) Citar os radicais livres produzidos na via oxigênio dependente e definir sua importância na destruição de estrutura fagocitada. m) Caracterizar a via oxigênio independente. c) Identificar os principais fatores quimiotáticos para PMN e macrófagos. b) Identificar as principais células que participam da resistência inespecífica. o) Relacione a fagocitose a mecanismos de resistência inespecífica. h) Explicar a fase de englobamento realizada pelo fagócito i) Explicar a fase de digestão durante a fagocitose. endocitose e exocitose. g) Caracterizar o sinal de ativação do fagócito no momento da opsonização. k) Caracterizar a via oxigênio dependente. d) Citar as principais substâncias que desempenham o papel de opsoninas. pinocitose. j) Definir as duas principais vias de destruição da partícula fagocitada.44 UNIDADE: FAGOCITOSE Objetivos gerais e específicos: a) Definir fagocitose. f) Explicar a importância do fenômeno da opsonização. n) Citar as principais enzimas que atuam a via oxigênio independente. 44 .

9) Relacionar as moléculas de classe I e II do CHP com os antígenos exógenos e aqueles de síntese endógena. (Faça um desenho esquematizando as principais características de ambas). a região de ligação ao peptídeo.45 UNIDADE: Complexo de Histocompatibilidade Principal(CHP. 6) Localizar as moléculas de classe I e de classe II nas diferentes populações celulares. 45 . a região de ligação ao peptídeo. no camundongo e no ser humano: 2) Citar quais são os produtos da decodificação do CHP. 3) Denominar os produtos do CHP Humano. 8) Reconhecer na molécula de classe II. 4) Estabelecer a função dos antígenos de classe I e classe II. 5) Esquematize as estruturas das moléculas de classe I e II. 7) Reconhecer na molécula de classe I. “MHC”) Objetivos gerais e específicos: 1) Definir o que é CHP e onde este se localiza.

quais são as etapas que culminam com a apresentação de antígenos pelas células. 5) Definir em qual situação. 46 . 7) Numa infecção por um patógeno intracelular em uma célula cilíndrica do trato digestivo superior. 10) Definir qual o papel do INF. 4) Descrever no macrófago. 8) Estabelecer onde ocorre a interação entre antígenos próprios e as moléculas do CHP e como ocorre este mecanismo. uma molécula viral pode ser apresentada no contexto de moléculas de classe I do CHP: 6) Esquematizar como ocorre o processo de apresentação de antígenos no contexto de moléculas de classe II. estabelecer de que forma o organismo reconhecerá que naquela célula está se desenvolvendo uma infecção e como esta será debelada.46 UNIDADE: Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) e mecanismos de Apresentação de Antígenos 1) Definir quais são as principais células apresentadoras de antígenos e onde elas se localizam. 2) Definir as principais características quanto às estruturas de superfície celular e fagocitose de cada APC. 3) Exemplificar qual é a molécula que poderia sugerir uma função de célula apresentadora de antígeno. 9) Explicar porque a apresentação de antígenos externos se dá no contexto de moléculas de classeII.γ na apresentação do antígeno.

Definir funcionalmente e quanto às células produtoras as seguintes citocinas: 10. Definir e diferenciar linfócitos TH1 e TH2 8. IL-2 11. Reconhecer o mecanismo de interação da célula apresentadora de antígeno com os linfócitos T CD4+. quanto a função e produtos das subpopulações TH1 e TH2. Definir estrutural e funcionalmente os principais marcadores de superfície dos linfócitos T 2. INF-γ 17. 6. IL-4 13.47 UNIDADE: Linfócitos T 1. Definir a etapa seguinte à ativação dos LT auxiliares. IL-6 15. Reconhecer o mecanismo de interação na apresentação de Ag aos linfócitos T citotóxicos ou CD8+. TNF 18. Elaborar um quadro comparativo. IL-3 12. IL-12 47 . IL-10 16. 9. Esquematizar as etapas de ativação dos linfócitos T auxiliares. 4. IL-5 14. 7. Definir como ocorre a ativação do repertório de células T citotóxicas (CTL). 5. 3.

Reconhecer os marcadores de superfície dos linfócitos B e função fisiológica dos mesmos. Estabelecer a diferença que existe entre as fases das respostas primárias e secundária. Explicar a que se deve a maior produção de Ig durante uma resposta humoral secundária. 8. Definir a ontogenia dos linfócitos B no homem. 5. 2. Definir a primeira imunoglobulina a ser produzida em resposta a uma infecção. 7. Estabelecer as fases que precedem a interação entre linfócitos B e linfócitos T e o objetivo desta interação. 48 . Estabelecer com relação ao comportamento de linfócitos B. 10. o que é esperado quando se imuniza artificialmente uma criança e porque. 3. 16. 17. 12. Definir as fases de ativação dos linfócitos B.48 UNIDADE: Linfócitos B e Resposta Humoral Primária e Secundária 1. 15. 4. 9. 11. Identificar as fases da curva que representa uma resposta humoral e a característica de cada fase. 6. Explicar porque se pode dizer que um linfócito B é uma APC. Definir o mecanismo do capuz ou “Capping” e citar a função do mesmo. Diferenciar a ativação por antígenos timo-dependentes e timo-independentes. Estabelecer a finalidade da ativação do repertório de linfócitos B. Explicar porque a resposta secundária é a mais rápida do que a resposta primária. 14. Definir as principais interleucinas produzidas pelos linfócitos T que têm ação sobre linfócitos B e em que fase elas agem e de que forma. Definir o resultado final da ativação do repertório de linfócitos B. 13. Definir mudança de classe ou “Switch”que ocorre durante a síntese de imunoglobulinas.

Conceitue “Fenômeno de Restrição Isotípica”. 14. Defina intron e exon. durante o “Swicth”. 3. Identifique o processo de “diversidade funcional por inserção”. 8.49 UNIDADE: Genética das Imunoglobulinas Objetivos gerais e específicos: 1. 5. 6. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves Kappa das imunoglobulinas. 10. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves lambda das imunoglobulinas. Responder: por ‘que. 2. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias pesadas das imunoglobulinas. Explique as causas da grande variabilidade de sítios combinatórios das imunoglobulinas. 15. Diferencie o rearranjo gênico que existe durante a fase primordial e a fase tardia de síntese das imunoglobulinas. há variação na síntese da porção constante da cadeia pesada de imunoglubolinas e não ocorre o mesmo para a porção variável? 49 . 13. Responda: é possível que um linfócito B apresente em sua superfície diferentes classes de imunoglobulinas ao mesmo tempo ? Em que situações? 12. Explicar por que uma célula que sofreu um “Switch” para a síntese de IgG não mais poderá voltar a sintetizar IgM. Diferencie os rearranjos gênicos que existem nas cadeias leves e pesadas. Identifique a diferença na codificação genética entre imunoglobulina de membrana e imunoglobulina secretada. 9. Identifique a seqüência genética existente para a síntese das diferentes cadeias pesadas de imunoglubulinas. 11. Conceitue “Fenômeno de Restrição Alélica”. 4. 16. 7. Justifique a necessidade de haver imunoglobulinas de diferentes classes.

Tente. realizando um esquema completo. utilizando todos os conceitos que você já aprendeu. 50 . então. Portanto. ou como deverá ser. identificar a cinética de uma infecção viral numa célula hepática e a resolução desta infecção pelo sistema imunológico.50 INTERAÇÃO DO SISTEMA IMUNOLÓGICO Se você foi capaz de responder a estes questionários contendo os objetivos específicos já é capaz de compreender as diversas faces do sistema imune. a reação do organismo frente a alteração do padrão fisiológico do mesmo. é bem possível que você já possa prever como será.

Reconhecer sua participação e importância no Sistema Imunológico. 5. Explicar a importância da drenagem venosa na tolerância por via oral. 2. Justificar o papel do contato de longa duração na duração de tolerância.51 UNIDADE Tolerância Imunológica Objetivos gerais e específicos: 1. Conhecer os fatores favorecedores da resposta ao tolerogênico. 4. Explicar os mecanismos imunológicos pelos quais o sistema imunológico desenvolve tolerância aos antígenos próprios e não próprios. 6. 3. 51 . Explicar a participação da via oral na indução da tolerância. Conceituar “Tolerância imunológica”.

Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo IV. de imunoglobulina(s) envolvida(s) na mediação da 16. Citar os mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo I. 20. Identificar a(s) classe(s) hipersensibilidade tipo II. Reconhecer a origem. ação e efeito dos mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo I. 52 . 17. fundamental das imunoglobulinas mediadoras da 18. 6. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo III. nos tipos imediatos e tardios. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo IV. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo I. 4. 21. segundo Gel e Coombs 3. 9. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo II. 2. Classificar as reações de hipersensibilidade quanto aos seus mediadores imunológicos. 12. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo III. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo I. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo I. Definir o que é uma reação de hipersensibilidade. 8.52 UNIDADE HIPERSENSIBILIDADE 1. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo III. Reconhecer a propriedade hipersensibilidade tipo I. 7. 5. 19. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo III. 14. 13. 10. 15. 11. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo III. Relacionar as reações de hipersensibilidade da classificação de Gel e Coombs. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade IV.

reconhecendo os fatores liberados por células responsáveis. 37. 32. Entender a origem da histamina e seu papel na hipersensibilidade tipo III. Reconhecer a localização do Ag na hipersensibilidade tipo II. Explicar o papel do sistema do complemento nas reações de hipersenbilidade tipo III. 40. 27. 39. Justificar a presença destas células no infiltrado . 33. 29. 30. 36. Caracteritizar os tipos celulares predominantes no infiltrado inflamatório mediado por hipersensibilidade tipo IV. Explicar a reação de Arthus.53 22. 38. Descrever os principais mecanismos da lesão celular por hipersensibilidade tipo II. 28. Justificar a isquêmia que pode acompanhar as reações de hipersensibilidade tipo III. Identificar o principal mediador imune da reação inflamatória tipo IV na classificação de Gel e Coombs. 24. Diferenciar a formação de uma reação de Arthus com uma reação tipo III sistêmica. Justificar a induração que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilização tipo IV. Explicar as reações aceitas para a permanência de imunecomplexos circulantes o organismo. 53 . Compreender a utilização de testes intradérmicos de hipersensibilidade tipo IV para avaliação de imunidade celular. Justificar a escolha dos Ag em uso nos testes intradérmicos de avaliação de imunidade celular. 23. Diferenciar o mecanismo de formação de edema na hipersensibilidade tipo I e III. Justificar o eritema que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilidade tipo IV. 26. 31. Justificar fenômenos hemorrágicos presentes na reação inflamatória por hipersensibilidade tipo III. 34. 25. 35. Explicar o mecanismo da injúria tecidual pelo mecanismo de hipersensibilidade tipo IV. Justificar uma neutropenia após a administração do antibiótico cloranfenicol.

8. Reconhecer os tipos de rejeição aos enxertos identificando os principais elementos da resposta imune. Montar um exemplo de um perfil para a expressão fenotípica de todos esses locus em um indivíduo. 54 . envolvidos. 9. 3. 6. Explicar a reação de Enxerto X Hospedeiro e justificar a sua presença nos transplantes de medula óssea. Citar as provas de seleção para doador vivo para os transplantes. 2.54 UNIDADE: TRANSPLANTES Objetivos gerais e específicos: 1. 4. Interpretar uma prova cruzada positiva. 10. Conhecer a nomenclatura correspondente aos enxertos. Reconhecer quais a estruturas moleculares das células de um enxerto. 12. Explicar os mecanismos de agressão às células enxertadas. Relacionar estas estruturas moleculares e o MHC. 13. Citar os principais locus da região HLA. Justificar a importância da Prova Cruzada que antecede os transplantes. Associar MHC e HLA. 7. Justificar o valor da análise do perfil de HLA na seleção do doador vivo 11. que são responsáveis pela indução da rejeição aos mesmos. 5.

Fundamentar a razão de todas as proteínas migrarem em um único sentido.55 SUBUNIDADE: “ELETROFORESE DE PROTEÍNAS”.Reconhecer o que atuou como suporte na corrida eletroforética realizada no laboratório. 5.Dar a definição de ponto Isoétrico de uma proteína e explicar sua participação no princípio desta técnica.Reconhecer e explicar o fato das albuminas migrarem com maior velocidade. 55 .Justificar a importância do pH alcalino do tampão utilizado. 4. OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS: Ao final do exercício desta prática no laboratório o aluno deve estar apto a: 1. 6. 2.Explicar o princípio de uma eletroforese de proteínas. 3.

56 PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS EXERCÍCIOS 56 .

antígeno extraídos do vírus da Hepatite A.Posteriormente realizou-se a lavagem do sistema. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina. para assim recobrir os espaços não ocupados pelo anticorpo (bloqueio do tubo). 6. marcador com l125 (um isótopo radioativo cuja emissão de radiação pode ser medida em um cintilômetro).Mediu-se a radiação do tubo.laboratorial de termos adsorvidos. anticorpos anti-IgM e não anti-IgG. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da HEPATITE A. 7. PERGUNTA-SE a.O que estava sendo pesquisado b. 8.A seguir procedeu-se a incubação a 37º C por 30 minutos. 4.Seguiu-se nova etapa de lavagem. 2. 57 .diga qual a importância clínico.Realizou-se nova lavagem do sistema. 1. Após a leitura e compreensão responda o que se pede abaixo: METODOLOGIA: A cada tubo foi adsorvido previamente anticorpos anti-IgM humana. A adsorção se dá por ligações covalentes entre os anticorpos e o material do tubo (poliestireno).Adicionou-se então anticorpos anti-vírus da hepatite A. 3.57 RIE (RADIOIMUNISAIO) Abaixo está representado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender.Ao tubo foi adicionado soro suspeito para o exame.Adicionou-se a seguir. 5. ao tubo. uma condição favorecedora da interação Ag/Ac. Essa reação processa-se em tubos onde seguiu-se a metodologia abaixo.

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ELISA ( ENZIME LINKED IMUNOSORBENT ASSAY)
Abaixo está apresentado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS . Acompanhado será fornecido uma placa com 96 poços onde seguiu-se a metodologia abaixo. METODOLOGIA A cada poço foi adsorvido previamente antígenos extraídos dos vírus da AIDS. A adsorção se dá através de ligações covalentes entre os antígenos e o material da placa. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina, para assim recobrir os espaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da placa). 1- Foram adicionados aos poços 1 e 2 soros procedentes de dois pacientes suspeitos de terem anticorpos anti-HIV ( vírus da imunodeficiência humana causador da AIDS). 2- A placa foi levada a uma estufa a 37 ºC por 30 minutos, uma condição favorecedora da interação Ag/Ac. 3- A seguir esse poço foi lavado com uma solução tampão com finalidade de retirar moléculas livres. 4- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas. As moléculas desses anticorpos tinham, ligadas em si, no Fc, uma enzima (peroxidase) cujo substrato pode ser o peróxido de hidrogênio. Esse substrato ao sofrer a ação daquela enzima manifesta uma cor alaranjada que se revela quando se adiciona ao meio uma substância reveladora ( no caso o ortofenilenodiamino-OPD). A ligação da enzima ao anticorpo não altera as propriedades anticórpicas desse. Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 5- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 6- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 7- Logo após observou-se que a solução no poço 1 ficou alaranjada enquanto que no poço 2 não houve alteração. Responda: a- Esquematize os dois poços evidenciando as reações Ag/Ac que ocorrerem ou deixarem de ocorrer. b- Após a realização do item 3, esquematize o que permaneceu no poço 1. c- Como você interpreta o resultado visível nos poços 1 e 2 respectivamente?

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WESTERN BLOTTING
É um dos métodos mais utilizados para identificar proteínas reconhecidas por anticorpos, sendo designado também de immunoblotting, diferenciando-se do “Southern ou Northen blotting”, que se prestam a identificação de ácidos nucléicos. Abaixo está apresentado um exemplo de Western blotting que se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS. Leia com atenção e responda. 1- Para a realização de um Western blotting inicialmente as proteínas virais são separadas, de acordo com seu tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio - um detergente (SDS-PAGE). 2- Em seguida as proteínas fracionadas no gel são transferidas por corrente elétrica, para uma membrana de nitrocelulose que posteriormente será recortada em tiras. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina ou a caseína, para assim recobrir os pedaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da fita). 3- A cada tira é adicionado em recipiente apropriado soro de paciente suspeito de ter anticorpos anti-HIV. 4- Segue-se um período de incubação de 30 minutos a 37º C, e extensiva lavagem para a remoção das proteínas livres. 5- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas marcadas com uma enzima (peroxidade). Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 6- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 7- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 8- Em seguida observou-se que algumas fitas apresentavam bandas (faixas) coradas denotando reação, enquanto outras não se coraram. RESPONDA: 1- Poderíamos pesquisar subclasses de IgG, ou mesmos outro isótipo de imunoglobulinas? Como? 2- O que significa exatamente a presença de bandas coradas, com relação as possíveis interações ocorridas?

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IMUNOHISTOQUÍMICA
A aplicação da imunohistoquímica (IHQ) à rotina diagnóstica já é uma realidade em nosso meio. De modo genérico, podemos considerar como principais indicações para o exame: ♦ Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente diferenciadas ♦ Subtipagem de neoplasias ♦ Caracterização da origem de carcinomas. ♦ Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas ♦ Discriminação da natureza benigna X maligna de determinadas proliferações celulares. ♦ Avaliação prognóstica de neoplasias ♦ Identificação de agentes infecciosos. Como exemplo, temos representado abaixo uma reação de IHQ para a pesquisa de receptores de estrógeno em células de adenocarcinoma de mama, um fator prognóstico neste caso. 1- Para a realização reação de imunohistoquímica utilizamos cortes de tecido incluído em parafina com aproximadamente 3 µ de espessura, colocados em lâminas tratadas com silano ( silanizadas), para propiciar uma forte adesão do corte histológico à lâmina 2- Em seguida as lãminas são desparafinizadas, sendo deixadas na estufa à 60°C por 24 horas, no xilol à 60°C e no xilol a temperatura ambiente para desparafinização 3- Após a desparafinização as lâminas são levadas à uma sequência de banhos de álcool absoluto até 80% para hidratação. 9- Posteriormente segue-se a etapa conhecida como recuperação antigênica. Necessária para que se restabeleça a estrutura antigênica das proteínas estruturais, modificada pela ação do formol. Tal etapa poderá ser feita por dois métodos: Calor úmido: em solução tampão citrato de sódio pH 6,0 4M, em banho-maria, panela de pressão ou microondas por tempo determinado. Enzimático: tratamento do corte com proteinase K 10- Segue-se o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 11- Adição de anticorpo monoclonal de coelho específico, anti-receptor para estrógeno 12- Incubação por 30 minutos à 37°C e overnight na geladeira. 13- No dia seguinte etapa de lavagem com solução tampão 14- Adição de um anticorpo anti- anticorpo de coelho, marcado com estrepavidina, incubação à 37°C 15- Nova etapa de lavagem 16- Adição de complexo biotina-estreptoavidina complexada com, nova incubação à 37°C 17- Lavagem e adição de solução de Dab (Diaminobenzidina 60mg%) 18- Contra coloração com hematoxilina. 19- Observação no microscópio de núcleos corados de marrom. RESPONDA: Qual a finalidade das etapas de lavagem? Por que fazemos a recuperação antigênica? Como seria um resultado negativo?

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61 EXERCÍCIO SOBRE RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO VIRAL E BACTERIANA 1. 61 .Sabendo-se que os vírus ao infectarem um organismo. descreva todos os prováveis eventos de uma resposta imunológica. que possua em sua parede antígenos de natureza polissacarídica e glicoproteíca. através dos quais este hospedeiro reagirá à infecção viral.Se em uma situação hipotética. que você conhece. qual seria a resposta esperada do sistema imune?. tal como uma do gênero Streptoccocus. esta célula passa a ostentar em sua superfície. moléculas codificadas pelo genoma viral. inserem seu genoma no genoma de uma célula do hospedeiro e que assim. 2. nosso organismo for infectado por uma bactéria extracelular qualquer.

Esta metodologia de análise é aplicável em diversas áreas de pesquisa. morfologia e outras características de uma população de células. granulosidade. estudos funcionais. cada célula fornece 5 números: tamanho. 62 . É uma técnica de medição das propriedades óticas da células individuais. é também utilizada para identificar as sub-populações de linfócitos especifícos. forma e complexidade interna e. Permite o estudo da variabilidade genômica pelo perfil colorimétrico do conteúdo de DNA.62 CITOMETRIA DE FLUXO Pela acadêmica de Farmácia Daniela Silva Moreira Introdução: A citometria de fluxo consiste em um método laboratorial para definir o tamanho. Podemos obter medidas corpóreas das células como tamanho. Contanto que diferentes tipos de células possam ser distintas por características estruturais quantitativas. zoologia. indicando fatores prognósticos e rumos terapêuticos. genética. Desenvolvimento: A citometria de fluxo mede características corpóreas e químicas de células ou partículas que estão em suspensão uma a uma num determinado ponto. e intensidade de fluorescência verde. vermelho e muito mais vermelho. Embora faça medidas em uma célula de cada vez. medicina e outras. a citometria de fluxo pode ser usada para a contagem de células de diferentes tipos em uma mistura. registrar os parâmetros cinéticos do tumor a ploidia do tumor. é claro qualquer componente da célula ou função que possam ser detectada por um composto fluorescente quando examinada. pode processar milhares de células em alguns segundos. E assim. ou fixas com paraformaldeído. G2 e M do ciclo celular. microbiologia. Um citomêtro de fluxo pode medir estes parâmetros a uma taxa de milhares de células por minuto. fração de crescimento e propriedades cinéticas. pode também estimar a distribuição das populações celulares ou fases do ciclo celular. Essas células são rotuladas com uma “etiqueta” fluorescente. para contagem de CD4 e CD8. análise e classificação de cromossomo. em um fluxo contínuo passando uma de cada vez. As informações podem ser adquiridas na citometria de fluxo utilizando células vivas. ou partículas em geral. A linha simples de fluxo das células passa pelo raio laser do instrumento. a fração de proliferação tumoral e a percentagem de células encontradas nas fases S e G1. em frente a um feixe laser com sensores para medir fluorescência e dispersão de luz. As células devem estar em uma suspensão de células simples com o mínimo de agregação (suspensão monodispersa). análise de DNA. tais como botânica. classificação estéril. muito utilizado na classificação de leucemias. seqüencialmente. As aplicações incluem: análise de fenótipo.

100 microlitos de sangue total é investigado com anticorpos monoclonais específicos dirigidos contra os marcadores CD3. por sua vez é expresso na superfície dos linfócitos CD8+ e em algumas células NK. e o número de células é calculado com base na intensidade da fluorescência . E através desses níveis de linfócitos podemos indicar a progressão ou regressão de uma doença. dirigidas contra os marcadores de superfície CD4. A cada sessão. O CD8. baseada em anticorpos monoclonais marcados com substâncias fluorescentes. O marcador CD3 é expresso na superfície de células “T” maduras ( CD4 e CD8). gerados a partir da fluorescência. A metodologia mais atual para a contagem de CD4 e CD8 e para a identificação das sub-populações de linfócitos específicos. . linfócitos B e os linfócitos NK. fluxo este que. a porcentagem de células positivas à citometria de fluxo. o sistema óptico do laser detectores eletrônicos. e assim determinar um tratamento para a doença. 63 . que representa o perfil da população de células. mas também. O CD4 é expresso na superfície de células (linfócitos) CD4+. A energia da luz emitida pelo laser excita o corante fluorescente contido em cada célula. Provoca-se uma excitação desses elementos fluorescentes com uma luz “laser”e a identificação ótica é feita de maneira automatizada pelo sistema . então. como por exemplo na infecção pelo HIV. A contagem absoluta das sub-populações de linfócitos é obtida a partir de 3 determinações sequenciais separadas: a contagem total dos glóbulos brancos do sangue total. CD8 e CD3. é devido os níveis normais se alterarem nas imunodeficiências e em certas doenças. em monócitos. utiliza uma técnica sofisticada de citometria de fluxo. o diferencial de glóbulos brancos. passada por um pequeno tubo que cria um fluxo de células únicas.alvo. conseguem identificar a tendência central de uma determinada população de células. estes histogramas. Os linfócitos T são ainda sub-classificados em duas sub-populações funcionais: os CD4 auxiliares e os CD8 citotóxicos. marcado com o corante fluorescente. Embora não identifiquem células individuais.Separação de linfócitos por citometria de fluxo: Os linfócitos são classificados em 3 sub-populações: linfócitos T. Os citômetros de fluxo envolvem fluidos sofisticados. conversores analógicos para digitais e computadores. através da ligação de um anticorpo monoclonal específico para a população alvo. A importância clínica de se fazer citometria de fluxo para separar e contar o número de linfócitos T CD4+ e CD8+. a coloração da população de células-alvos com um corante fluorescente ( geralmente iodeto de propídio). A utilização dos CD3 irá discriminar os linfócitos CD8+ das NK. primeiro. minimizando o erro.63 -Técnica de Citometria de Fluxo A técnica de citometria automatizada de fluxo envolve. Estes dados são em seguida registrados e mostrados na forma de histograma. por sua vez atravessa um raio laser. CD4e CD8. A população alvo colorida é.

br/citometria -www. medicina e outras.6.med. pois é um teste simples.hcan.icnet. Renato CD4/CD8 → www. genética.com .criesp.com.org. determinar a quantidade de DNA numa população celular.it/apher/write/cytome.capacity. também utilizado para determinar as fases do ciclo celular na fração de proliferação de tumores. que permite a separação e contagem de células com excelente sensibilidade diagnóstica.do. Além de ser um método aplicável em diversas áreas. usado na classificação de leucemias.64 Conclusão: Portanto a técnica de citometria de fluxo vem sendo muito utilizada.br/hot news . etc.uk/axp/facs/davies/flow.html 64 . e assim direcionando os rumos terapêuticos.htm -Citometria de Fluxo → www. identificação das sub-populações de linfócitos do sangue.html -Citometria do DNA → www.htm -www. microbiologia.br/g 105. como . • Bibliografia: -Di Dio.org.br/inform/ Cd4/Cd8 . Permitindo o diagnóstico e prognóstico de diversas doenças.unipi.htm -www.uronews.

. P. CALICH. Rio de Janeiro.Editora Guanabara. F. D. L. Imunologia Básica e Aplicada. Rio de Janeiro. . WELLS. Imunologia Básica e Clínica. 65 . São Paulo 1999. II:46-60. Aplicações Clínicas da Imunoeletroforese. O. 2ª ed. nº 52:08-26 ALVES. Ano VI. I. . VOOS. . A.65 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIER. MOTA. J. Vol. 4ª edição. G. C. D. Edição Extra. V. 2ª edição. C. L. Revista LAES. J. Obs.. VAZ. STITES. Eletroforese.. SILVA. BACCHI.. 1989. VASSALO. HOXTER. maio/85.: Algumas técnicas foram obtidas a partir dos Kits reagentes. E. Manual de Imunohistoquímica. H. Ano IX. Editora Guanabara. C. CALDWELL. W. A. A. FUNDENBERG. 1980.V.. J. Imunologia Básica 2000. V. H. Revista LAES.

DO DIAGNÓSTICO Art. de 03 de julho de 1934 e considerando a necessidade de atualizar a legislação existente sobre profilaxia da Brucelose. 1º.º 23 Ministério da Agricultura e do Abastecimento PORTARIA nº 23. O diagnóstico de rotina da Brucelose em bovinos será realizado através das provas de soroaglutinação rápida ou lenta. A prova de sêmen-plasma-aglutinação será utilizada em reprodutores dos Centros de Inseminação Artificial e além da prova de soroaglutinação. 86. 2º. em provas de rotina no caso de rebanhos-problema. 4º. 66 . 3º. Art."card test") e prova individual do anel do leite. 1º. respectivamente. visando dirimir eventuais dúvidas. assinadas pelo Diretor Geral do Departamento Nacional de Produção Animal. tendo em vista o disposto no art. Como provas especiais. 2º. NORMAS PARA A PROFILAXIA DA BRUCELOSE ANIMAL CAPÍTULO I . DE 20 DE JANEIRO DE 1976 Aprova as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal O MINISTRO DE ESTADO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO. em amostras compostas. vacinados entre 3 e 8 meses de idade 1/25 1/50 (25 UI/ml) (50 UI/ml) I + + I + + + + + + + + + + Convenções: I: Aglutinação incompleta. do Regulamento do Serviço de Defesa Sanitária Animal. no uso de suas atribuições. anexas à presente Portaria. UI: Unidades internacionais 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Art. precipitação pelo rivanol. resolve: Art. será utilizada para determinação da taxa de prevalência da Brucelose em rebanhos leiteiros. aprovado pelo Decreto nº 24. de 22 de abril de 1958 e 5 de março de 1969. Aprovar as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal. poderão ser utilizadas as provas de fixação do complemento. prova do antígeno tamponado acidificado (prova do cartão . Revogar as Portarias Ministeriais números 486 e 222.66 Anexo CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA PORTARIA N. Art. +: Aglutinação completa. Art.548. cuja interpretação obedecerá aos quadros a seguir: Bovinos não vacinados ou vacinados com idade superior a 8 meses 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + + + 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Positiva Positiva Bovinos de 30 meses ou mais. redução pelo mercapto-etanol. A prova do anel no leite.

b. em 3 (três) vias. será efetuada sob a responsabilidade de médico veterinário. que serão fornecidas pela unidade de controle. quando observado aborto. Art. 16.DA VACINAÇÃO DE BEZERRAS Art. 10. A imunização dos bovinos contra a Brucelose será levada a efeito pela vacinação de bezerras. CAPÍTULO III . leite. 14. no lado esquerdo da cara. a vacinação será realizada apenas uma vez. conforme Anexo 1. vacinar somente bezerras entre 3 e 8 meses de idade. observandose o seguinte critério: a. Os bovinos positivos ou suspeitos de Brucelose. anexos fetais. 11. somente uma vez. após a liberação da partida correspondente. Cada partida de vacina produzida será oficialmente controlada. no lado esquerdo da cara. 8º. salvo quando comprovadamente destinadas ao abate ou a instituições científicas. recomenda-se a adoção das seguintes providências: a. até que cessem os corrimentos vaginais. CAPÍTULO II . c. em cada propriedade afetada. não se admitindo vacinação de machos. os sacrifício será realizado em matadouro sob inspeção federal e o julgamento efetuado de acordo com as disposições em vigor. admitindo-se a vacina líquida até o aparelhamento dos laboratórios produtores. com ferro candente. controlada pelo órgão oficial competente. abortus. emitir atestado de vacinação. sêmen e outros materiais possivelmente infetados. do estoque de vacina. 5º. 12. A aplicação da vacina da amostra 19. conforme modelo do anexo 2. o proprietário dos animais deverá assinar termo de compromisso. c.DOS ANIMAIS REAGENTES Art. c. A vacinação de fêmeas adultas com a amostra 19 poderá ser autorizada em propriedades onde estiverem ocorrendo surtos de abortos brucélicos. as bezerras destinadas ao Registro Genealógico. destinando-se a 1ª ao proprietário. o Serviço de Inspeção Federal no estabelecimento onde será realizado o sacrifício deverá ser notificado com antecedência. mediante requerimento do proprietário e autorização expressa do responsável pelo programa de combate à Brucelose na respectiva Unidade da Federação. observando-se os seguintes critérios. Art. as fêmeas vacinadas com a idade superior a 8 (oito) meses. de forma a permitir a adoção das medidas previstas no RIISPOA. Como necessário. acompanhado do algarismo final do ano da vacinação. aplicando rigorosos cuidados higiênicos complementares. Art. Art. A vacina com a amostra 19 será apresentada sob a forma liofilizada. b. não poderão ser objeto de comércio. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetro) de diâmetro conforme Anexo 1. isolar os animais reagentes. observando-se a legislação federal específica e de acordo com as técnicas recomendadas pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. enterrar o feto e seus anexos. elaborada com a amostra 19 de Br. b. considerando a porcentagem de incidência da doença e as condições locais. observando-se as seguintes condições: a. dos protocolos. b. quando devidamente identificada. Os animais que revelarem reação positiva serão marcados a ferro candente. Art. Recomenda-se o sacrifício dos bovinos com reação positiva. Art. 67 . A vacina com a amostra 19 será produzida por laboratórios autorizados.DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE VACINAS Art. bem como a coleta de amostras das partidas produzidas. a. 9º. aceitando as condições estabelecidas. 13. Nos casos em que não seja possível o sacrifício. desinfetando os locais contaminados. a critério da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. no lado direito da cara.67 Art. a 2ª ao serviço veterinário oficial e a 3ª ao emitente.DA VACINAÇÃO DE FÊMEAS ADULTAS Art. serão identificadas com ferro candente. com um V. 6º. Art. Excluem-se da marcação. poderão ser realizados exames bacteriológicos de fetos abortados. 15. cabendo ao órgão local do Ministério da Agricultura o acompanhamento e controle da produção. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetros) de diâmetro. constantes do Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA). 7º. isolar as vacas reagentes por ocasião do parto. com vacina viva. marcar as bezerras vacinadas. CAPÍTULO V . Os frascos de vacina levarão etiquetas oficiais. CAPÍTULO IV .

sendo neste caso.68 Art. 26. e. CAPÍTULO VIII . A produção de antígenos para diagnóstico de Brucelose pelos demais laboratórios oficiais poderá continuar até a instalação e o funcionamento do laboratório central do Ministério da Agricultura. prova rápida. obedecendo as técnicas de produção e controle recomendadas pela Organização Mundial da Saúde. Art. 21. A profilaxia da Brucelose suína será baseada na adoção das seguintes medidas: a. Os animais da propriedade serão identificados por tatuagem ou outra forma. Não será exigido atestado negativo para fêmeas bovinas com idade inferior a 30 (trinta) meses. 25. admitindo-se o título máximo aglutinante até 1:50 para fêmeas bovinas com idade superior a 30 (trinta) meses. DAS EXPOSIÇÕES E FEIRAS AGROPECUÁRIAS Art.DA PROFILAXIA DA BRUCELOSE SUÍNA Art. Os antígenos para diagnóstico da Brucelose.DA CERTIFICAÇÃO DE PROPRIEDADE LIVRE Art. Art. 20. são considerados negativos os rebanhos que não apresentarem qualquer animal com aglutinação superior a 1:100 .DO CONTROLE DE TRÂNSITO Art. a contar da data da realização do respectivo exame. quando os reprodutores apresentarem resultados negativos atestados acompanharão os animais. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta. 19. para obtenção do Certificado de Propriedade Livre de Brucelose. para fêmeas bovinas até 30 (trinta) meses de idade. ou atestado negativo para Brucelose. serão produzidos por um só laboratório oficial. lenta e do anel no leite. Art. 23. para fins de trânsito interestadual. b. 29. Art. CAPÍTULO X . quando acompanhadas de atestado de vacinação contra a Brucelose. 22.DO REGISTRO GENEALÓGICO. Somente será fornecido certificado de inspeção sanitária animal. CAPÍTULO IX . os animais são classificados somente em positivos e negativos. Art. d. estando as bezerras e novilhas devidamente marcadas e identificadas. também não é admitida a classificação de suínos suspeitos. vacinadas na idade recomendada. Os criadores poderão inscrever-se um esquema voluntário. realizadas nos suínos com idade superior a 6 (seis) meses. O atestado de exame negativo para Brucelose será válido por 60 (sessenta) dias. sendo que a interpretação das mesmas obedecerá o critério constante dos quadros a seguir: b. 17. utilizando-se a prova de antígeno acidificado temponado (card test). O controle da distribuição de antígenos para diagnóstico de Brucelose. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta. Art. inclusive pelo Registro Genealógico. positivos os animais com títulos iguais ou superiores a 1:25. será efetuado pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. As condições que uma propriedade deve preencher para ser considerada livre de Brucelose serão estabelecidas através de instrução da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. vacinadas entre 3 e 8 meses de idade. considera-se com infetado o rebanho no qual forem identificados um ou mais suínos com aglutinação completa na diluição de 1:100. atestado de vacinação contra a Brucelose. c.Incompleta. 27."card test"). devendo o mencionado produto ser fornecido somente a médicos veterinários. diagnósticos da situação. dependerá da apresentação de: a. O trânsito internacional de bovinos. sêmen e produtos derivados reger-se-á pela legislação específica vigente. A inscrição de bovinos no Registro Genealógico e a participação dos mesmos em Exposições e Feiras Agropecuárias. CAPÍTULO VII . Art. através de exame dos rebanhos em áreas de suinocultura mais expressiva. submetida cada partida a controle oficial. A comercialização da vacina será objeto de fiscalização oficial e sua aquisição e aplicação sob responsabilidade de médico veterinário. 18.DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE ANTÍGENOS Art. 24. 28. Suínos procedentes de rebanhos negativos 1/25 (25 UI/ml) I + 1/50 (50 UI/ml) 1/100 (100 UI/ml) Interpretação Negativa Negativa 68 . utilizando-se as provas de soroaglutinação rápida e lenta ou a prova com antígeno acidificado tamponado (prova do cartão . CAPÍTULO VI .

DA BRUCELOSE OVINA E CAPRINA Art. quando o título não ultrapassar de 1:25. parcialmente testados ou desconhecidos 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + 1/100 (100 UI/ml) I + Interpretação Negativa Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Art. 33. CAPÍTULO XII . positivos retestados. a. CAPÍTULO XI . Art. 31. vigilância severa e permanente das importações de ovinos e/caprinos. A profilaxia da Brucelose ovina e caprina será baseada na adoção das seguintes medidas. c. A interpretação dos resultados das provas sorológicas de aglutinação para ovinos e caprinos. b. 30. b. Nos casos positivos e suspeitos. A presença de suínos infetados numa criação justifica o sacrifício do rebanho. especialmente dos reprodutores utilizados. JOSÉ PEDRO GONZALES Diretor Geral do DNPA 69 . serão precedidas provas de fixação do complemento. Art. obedecerá o seguinte critério: a. A Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura baixará instruções complementares permanecendo em uso os atuais formulários para exames de Brucelose e vacinação. levantamento da prevalência da doença nas áreas de criação.DAS DISPOSIÇÕES GERAIS Art. além das soroaglutinações rápida e lenta. considerados os antecedentes clínicos e epidemiológicos.69 + + + + I + + + I + Negativa Negativa Negativa Positiva Suínos procedentes de rebanhos positivos. quando o título for de 1:50 ou maior. Os casos omissos e as dúvidas suscitadas na execução e interpretação destas normas serão resolvidos pelo Diretor da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. reação suspeita. até que sejam estabelecidos novos modelos. controle rigoroso de plantéis indenes. 34. reação positiva. Parágrafo único. 32.

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