UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA

Imunologia
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 2006

PROFª ÂNGELA DA COSTA PEREIRA PROFª INÊS APARECIDA TOZETTI PROFº ANDRÉ LUIS SOARES DA FONSECA

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SUMÁRIO
PARTE I

Técnicas de obtenção e conservação do material usado em Imunologia......................... Diluições......................................................................................................................... Cromatografia em Coluna................................................................................................ Eletroforese de proteínas................................................................................................. Princípio Teórico da Fixação de Complemento............................................................... Reação de Imunohemólise............................................................................................... Reação de Fixação do Complemento.............................................................................. Precipitação em meio semi-sólido................................................................................... Reação de Aglutinação.................................................................................................... Reação de Aglutinação Rápida para Pesquisa de Anticorpos Anti-Brucella................. Reação de Microaglutinação Passiva - Reação de VDRL............................................. Reação de Aglutinação indireta ou passiva Fator Reumatoide...................................... Imunohematologia Sistema ABO.................................................................................. Teste de Coombs Diagnostico da D.H.R.N................................................................... Reação de Inibição de Aglutinação Passiva.....................................................................
ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)………...........................

5 6 8 12 16 17 18 19 22 23 24 25 26 28 29 30 33

Reação de Imunofluorescência.........................................................................................

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PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Resistência Inespecífica................................................................................................ Células do Sistema Imune............................................................................................ Formação de Células T e B e Órgãos Linfóides........................................................... Antígeno....................................................................................................................... Imunoglobulinas (I)...................................................................................................... Imunoglobulinas (II).................................................................................................... Sistema Complemento................................................................................................. Fagocitose.................................................................................................................... Complexo Principal de Histocompatibilidade (CHP/MHC)......................................... Células Apresentadoras e de Antígeno e Mecanismo de Apresentação........................ Linfócitos T................................................................................................................... Linfócitos B e Resposta Primária e Secundária............................................................. Genética de Imunoglobulinas........................................................................................ Interação do Sistema Imune.......................................................................................... Tolerância Imunológica................................................................................................. Reações de Hipersensibilidade..................................................................................... Transplantes.................................................................................................................. Eletroforese................................................................................................................... 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 54 55

PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS E EXERCÍCIOS
Radioimunoensaio........................................................................................................... ELISA............................................................................................................................. Western blotting.............................................................................................................. Imunohistoquímica.......................................................................................................... Exercício sobre Resposta Imune às infecções.................................................................. Citometria de Fluxo......................................................................................................... Referências Bibliográficas............................................................................................... 57 58 59 60 61 62 65

Anexo Portaria 23 para normatização do diagnóstico sorológico da Brucelose............... 66

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4 PARTE I TÉCNICAS UTILIZADAS NAS AULAS PRÁTICAS 4 .

Para obtê-lo colhemos uma amostra de 5 a 10 ml de sangue por punção intravenosa. de 30 minutos à 1 hora após a punção. Após a coleta. Embora essas reações possam também ser feitas no líquor e ainda em células linfóides deste indivíduo.Você deverá também acondicionar em gelo. Este sangue deve ser passado instantaneamente para um frasco. . o sucesso da reação dependerá. então. o que decorrerá consequentemente da competência do médico. OBTENÇÃO DE SORO O soro é a fração líquida do sangue.Antes de se passar o sangue da seringa para o frasco. As hemácias se sedimentarão pela centrifugação e o sobrenadante se constituirá em uma amostra de soro isenta de hemólise e pronta para ser utilizada nas reações.5 TÉCNICAS DE OBTENÇÃO E CONSERVAÇÃO DO MATERIAL USADO EM IMUNOLOGIA As reações imunológicas utilizadas em auxilio diagnóstico à clínica e na pesquisa experimental tem. mais freqüentemente o soro. . . deve-se seguir o preparo e estocagem do material. . o sangue é colhido sem qualquer anticoagulante. OBSERVAÇÕES IMPORTANTES . este último já deve estar completamente seco e rotulado com a especificação do indivíduo.O laboratório se encarregará de centrifugação. Se você precisar enviar a amostra do campo para a cidade procure antes retirar a fração líquida a partir do coágulo e enviá-la em um outro vidro bem tampado rotulado e acondicionado em caixa de isopor com gelo. em grande parte. veterinário ou bioquímico na coleta de material. coleta-se a fração líquida que se separou do coágulo . O gelo deverá ficar dentro de um saco plástico para evitar penetração de água nos vidros com soro. A seguir essa fração líquida é submetida à centrifugação de 1500 RPM durante 5 minutos para separar o soro do resto das hemácias. odontólogo. o cuidado de retirar a agulha da seringa.O sangue colocado em frasco para a retração do coágulo deve ser mantido em repouso.Em geladeira. .Para se obter o soro.Em freezer. como fonte de material do indivíduo (seja o homem ou outro animal). O processo de coagulação do sangue começará a se estabelecer. se sua utilização for ocorrer nas primeiras 72 horas. seja no consultório. tendo-se para isto. deve-se conservá-lo diluído a 1:2 em glicerina ou tratá-lo com ázida sódica a 1% para inibição do crescimento de microrganismos e estocá-lo em freezer. CONSERVAÇÃO DO SORO . Se necessário armazenar o soro. sem agitação alguma. 5 . se tiver que mandar o soro de uma cidade para outro centro. se for necessário uma estocagem por mais dias. no campo ou no próprio laboratório. da boa condição em que essa material fonte se encontre à disposição do laboratório. sem o fibrinogênio.

Quando colocamos.5:1. Em imunologia clínica o título indica a concentração de anticorpo no soro do paciente. Portanto.1 ml + 2. Isto é conseguido geralmente adicionando-se a uma solução que se pretende diluir um diluente tal como água.4 ml Diluição a 1/20 = 1 ml + 19ml ou 0. As diluições podem ser representadas como 1:10. se o último tubo que demonstra reação contém um volume de 1 ml e o soro neste tubo é uma parte em um total de 640 partes. portanto uma diluição de 0.9 ml 1 ml de 1/10 + 9 ml Diluição 1/500 1 ml 1/100 + 4 ml Diluição 1 /5000 1 ml 1/1000 + 4 ml Diluição 1/10000 1 ml 1/1000 + 9 ml DILUIÇÕES VARIADAS Diluição a 1/5 = 1 ml + 4ml Diluição a 1/15 = 1 ml + 14 ml ou 0. As diluições não devem ser interpretadas como significando uma unidade mais 10 unidades. 0. na quantidade requerida para conseguir uma diluição determinada.0 ml de solução. 1:50. ou seja.9 ml Diluição a 1/25 = 1 ml + 24ml ou 0. uma unidade em um total de 10 unidades. ou cloreto de sódio a 0.9 ml Diluição a 1/ 50 1 ml + 49 ml ou 0. Por exemplo. etc.1 ml + 1. pois há 0. o título é 640 unidade/ml de soro. 1/50 etc. O título de anticorpo de um soro é a diluição mais alta de soro que reage com o antígeno.0 ou 1:2. que não contenha nenhuma das substâncias diluídas.1 ml + 4.4 ml 6 .1 ml + 1. ficamos com uma diluição do soro a 1:2. TÉCNICAS GERAL DAS DILUIÇÕES Diluição em múltiplos de 10 Diluição a 1/10 1 ml + 9 ml ou 0.5 ml de NaCl a 0.1 ml + 9.9 ml 1 ml da diluição 1/10 + 4 ml do diluente Diluição 1/100 1 ml + 99 ml ou 0.85% em um tubo e adicionamos a esta solução 0.1 ml + 0. Usualmente se expressam as diluições como uma unidade da solução original sobre o total de unidades da solução final.6 DILUIÇÕES A diluição é o ato de tornar mais fraca uma dada solução. uma solução diluição 1/10 significa que uma unidade da solução concentrada foi diluída para um volume total de 10 unidades. ou 1/10.85%. por exemplo.5 ml de soro em um volume total de 1.5ml de soro.

determine o título dessa reação: Não ocorreu interação Ocorreu interação Ag-AC 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 7 . 3 . 6)Vamos imaginar que após a interação entre o antígeno e ao anticorpo.etc. Com base no esquema abaixo.Diluições sucessivas na razão igual a 4: 1 .5ml dessa amostra e diluindo até o 8º tubo.Distribuir nume série de tubos 3.Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3. 2) Esquematize uma diluição na razão 2 de um soro. 5)Esquematize uma diluição 1/625.Ao tubo 1 adicionar 1 ml da solução corante (a ser diluída). homogeneizar. 3)Utilizando um volume de soro de 0. partindo de uma diluição 1/5. homogeneizar com o auxilio de uma pipeta.Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. 1/16. esquematize uma diluição na razão 3 até o 5º tubo.4ml. 1/64. desprezando 1 ml do último tubo. 5 . tenha ocorrido a formação de um precipitado no fundo do tubo (como descrito abaixo na legenda). homogeneizar.Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2. quando esses estavam presentes em concentração suficiente.0 ml do diluente em cada tubo. 1/256. 4 . 1/1024. As diluições obtidas serão: 1/4. 2 . Exemplo . 4)Esquematize uma diluição 1/64 de uma solução previamente diluída a 1/8. utilizando inicialmente apenas o volume de 0.7 DILUIÇÕES SUCESSIVAS Nesta técnica se transfere sucessivamente volume determinado de um tubo para o tubo seguinte ao qual se adicionou uma certa quantidade de diluente. Exercício de Fixação: 1) Esquematize uma diluição 1/50 de uma solução previamente diluída a 1/10.

No quadro a seguir temos exemplificado a molaridade de NaCl e pH requeridos para eluir as proteínas plasmáticas humanas da DEAE-celulose. 8 . Pelo aumento da molaridade ou diminuição gradual do pH do tampão de eluição as proteínas são eluidas em função do número crescente de grupos carregados ligados ao gel. A dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose) é uma resina positivamente carregada. sob condições apropriadas. e é usada para o fracionamento de moléculas positivamente carregadas. cheia de um gel sintético. A troca do pH do tampão que passa através da coluna afeta a carga da molécula protéica. uma amostra é depositada no ápice de um cilindro ou coluna de vidro. As características físicas das moléculas de proteínas resultam em retenção destas na matriz do gel em graus diferentes. sendo usada para o fracionamento de moléculas negativamente carregadas. enquanto que as moléculas neutras passam entre as partículas carregadas e são eluidas. permite a separação das proteínas. Nestas técnicas. A carboximetil-celulose (CM-celulose) é uma resina carregada negativamente. geralmente celulose. CROMATOGRAFIA POR TROCA IONICA A cromatografia por troca iônica separa as proteínas aproveitando a diferença de suas cargas elétricas. e flui através do gel.8 CROMATOGRAFIA EM COLUNA Técnicas cromatográficas são atualmente métodos amplamente empregados para o fracionamento de proteínas e isolamento de imunoglobulinas. B = a solução contendo moléculas negativamente carregadas e outras neutras é colocada na coluna. e a subsequente eluição. C = as moléculas negativamente carregadas.  A  B  C PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA A = a camada da coluna é feita de uma matriz de partículas de celulose positivamente carregadas. O aumento da molaridade do tampão fornece mais íons para competir com a proteína pela ligação ao gel. A unidade funcional do gel é um grupamento carregado preso em um suporte. na mistura protéica ligam-se à coluna e são retidas.

5 9 . a qual pode ser obtida quase livre de todas as outras proteínas séricas.9 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Molaridade de NaCl PH Proteínas eluidas -----------------------------------------------------------------------------------------------------------0.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH SO3.0 α 2 globulina. Aumentando-se o pH do tampão. OH pH 2.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A ELUÍDO pH 3.5 albumina.5 o aminoácido A também é eluido. os aminoácidos tornam-se carregados negativamente.5 α2 globulina.0 SO3. Já no pH 4. refletindo as diferenças nas constantes de dissolução dos grupos ionizáveis da resina. β globulina. albumina.080 6.Na+ OH SO3.025 7.5 SO3. β lipoproteína 0. IgA 0. Os aminoácidos com a carga positiva trocam de posição com os cátions sódio da resina. Exemplificamos abaixo a separação de aminoácidos com a resina de troca iônica sob condições ácidas. e serão eluidos da coluna trocando-se novamente os íons sódio.100 6.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH H3N+ COOH AMINOÁCIDO B SO3. ligando-se à carga negativa da resina. Os aminoácidos com carga positiva em um meio fortemente ácido ocuparão as posições do sódio de uma resina de troca catiônica.celulose é uma técnica excelente para o isolamento de IgG. Utilizando-se de um tampão. fibrinogênio 0. os aminoácidos são eluidos de forma diferente. O aminoácido A continua adsorvido à coluna. no pH 2.8 IgG 0.5 apenas o aminoácido B é eluido. de modo que haja um aumento progressivo do pH. haptoglobina -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A cromatografia em DEAE . α 2 globulina.0 (ambos aminoácidos A e B são adsorvidos).050 7.045 7.0 transferrina.Na+ SO3 Na + H3N + OH COOH AMINOÁCIDO B ELUÍDO pH 4. No pH 3.

PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A . cujos diâmetros permitem a passagem ou a retenção de moléculas de diferentes tamanhos. penetram no seu interior e ai são retidas.As moléculas maiores são eluidas. B . O solvente e as moléculas menores que os canais. passam através do gel na fase liquida fora das partículas e são eluidas primeiro. C . enquanto as menores são retidas. Por isso. A fase estacionária é mais comumente constituída de partículas hidrófilas tipo gel.As moléculas entram e passam através da coluna em proporções diferentes. As partículas são porosas contendo microcanais. A B C 10 .O círculo aberto (O) representa as partículas de dextran polimerizado sobre as quais um a mistura de moléculas protéicas pequenas (. dependendo primariamente do tamanho e são separadas por um simples processo de peneiração. as moléculas aprecem no eluente de coluna em ordem decrescente de tamanho..10 CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A gel filtração separa as moléculas de acordo com o seu tamanho. como dextran (Sephadex) .) é depositada. A IgM pode ser facilmente separada de outras imonoglobulinas séricas por gel filtração. as moléculas protéicas mais volumosas que os poros das partículas. não podendo penetrar nestes.) e grandes (. A gel filtração é largamente usada também para separar as cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas ou para isolar proteínas de Bence-Jones (cadeias leves) puras de urina de pacientes com mieloma múltiplo. Assim.

Estes anticorpos específicos podem ser recuperados pela lavagem da coluna com um tampão ácido. Quando a mistura de anticorpos de diferentes especificações é passada através da coluna.11 CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE A cromatografia por afinidade usa interações biológicas especificas reversível entre o material do gel e a substância a ser isolada. 11 . Um antígeno é acoplado à uma matriz insolúvel tal como a Sepharose. aqueles anticorpos especificos contra o antígeno são retidos pela ligação aos antígenos fixados ao gel. ou as moléculas de antígeno são insolubilizadas pela ligação cruzada com glutaraldeído. acoplando-se um anticorpo a uma matriz inerte. A ligação antígeno-anticorpo é uma das reações que podem ser aplicadas á cromatografia por afinidade. o qual desfaz as ligações antígeno-anticorpo. Uma técnica semelhante pode ser usada para purificar um antígeno.

com maior velocidade se distanciará dos componentes menos carregados de maneira que as partículas com pouca ou nenhuma carga permanecem relativamente estacionadas.globulina Na maioria das vezes. Conforme a velocidade de migração.baseando-se na diferença de velocidade de migração das diversas proteínas. Isto faz com que todas as proteínas se carreguem negativamente e migrem na mesma direção.globulina 12 . é possível a separação dos componentes protéicos do fluidos biológicos. ao fenômeno da migração de partículas eletricamente carregadas sob a influência de um solvente condutor (tampão). O espectro das proteínas séricas varia entre pH 4.0. por outro lado.5 a pH 6. Quando as cargas positivas e negativas se neutralizam. se a carga da superfície da partícula for positiva. globulina Alfa (α).5.8 a 9. estas possuem grupos amino e carboxílicos livres e devido a isso estão carregadas positiva ou negativamente em solução aquosa na dependência do pH do meio.3 γ . a saber: albumina(fração mais rápida). em seguida a globulina Alfa (α).6. Assim. em uma dada proteína. o que é determinado pelo pH do meio onde a proteína é isoelétrica.globulina α 2 . migrará para o positivo ou ânodo.4 . Em circunstâncias opostas. As proteínas que tem pontos isoelétricos mais ácidos. Em meio alcalino se carregam eletronegativamente e quando submetidas a uma corrente elétrica migram para o ânodo com uma velocidade que guarda relação com o número de suas cargas. Em geral as proteínas séricas são separadas em um pH que varia de 8. Algumas proteínas de localização intracelular. Quando a soma das cargas positivas excede o número total de cargas negativas. No caso das proteínas. estão altamente carregados e migram com maior rapidez. Assim.1.7 . resulta uma carga negativa. sua migração será para o pólo negativo ou cátodo. Quanto mais carregada a partícula. Toda proteína tem seu “ponto isoelétrico”.12 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS Princípio: Chama-se eletroforese. a proteína não tem carga e se denomina “isoelétrica”. Esquema isoelétrico das proteínas séricas pH 4. apresentam ponto isoelétrico acima deste espectro. a molécula tem uma carga positiva.2.5-8 β globulina β lipoproteína pH 6. a eletroforese é executada com um tampão de pH fora do espectro isoelétrico. beta(β) globulina e gama(γ) globulina. as partículas carregadas avançam para o eletrodo de carga contrária. pH 5.4 Albumina α 1 . se for negativa. elas podem separar-se em cinco grupos principais (por meio da eletroforese convencional de zona).

ocasionalmente.globulinas. mas também são encontradas quantidades significativas na zona de β . Devem ser feitos testes quantitativos específicos. também pode ser detectada com esta técnica.globulinas. a maioria das imunoglobulinas migra para a zona designada γ . Na eletroforese do soro. Cadeias leves livres são prontamente detectáveis na urina quando presentes em quantidades aumentadas. Nestes distúrbios ocorre geralmente um pico protéico restrito eletroforeticamente na região de γ .globulinas do eletroforetograma. para a identificação da proteína em questão. bioquímicos ou imunológicos. como na proteinuria de Bence Jones do mieloma. Uma diminuição na concentração de γ .13 APLICAÇÕES NA IMUNOLOGIA A eletroforese de zona é extremamente valiosa para o diagnóstico dos distúrbios paraprotéicos humanos tais como mieloma múltiplo e microglobulina de Waldenstron. Picos nestas regiões são também compatíveis com distúrbios paraproteinemicos que envolvem imunoglobulinas.globulinas e. tal como ocorre na hipogamaglobulinemia. região das α2globulinas. 13 .

com a face absorvente voltada para cima (Obs. papel de filtro.O. Preencher cada um dos compartimentos da cuba de eletroforese com tampão de corrida. Agitar até a fita dissolver-se completamente. visível depois de seca . o qual deverá estar situado na posição inferior a direita do operador). 8. uma leve aplicação do soro a cerca de 2. Fazer a dosagem de proteínas totais da amostra de soro. obtendo assim a densidade óptica da amostra (D. 2.14 TÉCNICA: ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE CELULOSE Material necessário • Fitas de acetato de celulose (CellogelR) • Tampão de corrida pH 8. retirar a fita e colocá-la em banho corante por 10 minutos. Terminada a corrida.. Só uma superfície da fita é penetrável. essa é a face opaca. tubos de ensaio e etc. 11. ajustando para 200 Volts. Colocá-las esticadas sobre o suporte da cuba.Para a determinação quantitativa das frações protéicas. Lavar o microaplicador com água destilada e colocá-lo em contato com a amostra de soro. desligar a cuba. As tiras tem um angulo picotado.0 cm do polo negativo. 6. Fazer um tubo com um pedaço da fita sem proteína (branco) para zerar o aparelho.) 13. Observar para que ambas as extremidades da fita estejam em contato com a solução tampão e o picote da fita na canaleta positiva. cortar as frações coradas e introduzí-las em tubos de ensaio respectivamente marcados.Fazer os.Ler em espectrofotometro usando um comprimento de onda de 520nm. microaplicador. 12.Retirar as fitas do banho corante e transferir para um recipiente com a solução descorante. 3. Fazer. Repetir o processo até as partes sem proteína na fita ficarem brancas.6 forca iônica 0. Tampa a cuba e ligar. 10.036 (Veronal sódico 0. 9. 5.04M) • Corante Ponceau`s • Solução descorante (Metanol a 50%) • Solução de eluição (ácido acético a 80%) • Fonte de continua para 200 volts • Cuba de eletroforese • Espectrofotometro Pipetas. agitar para propiciar a descoloração da fita e transferir para outro banho descorante. Retirar as fitas do tampão e secá-las com papel de filtro. Colocar as fitas de cellogel imersas em tampão de corrida por pelo menos 10 minutos.15) 14 . deixar correndo a amostra por 35 minutos. cálculos conforme modelo da apostila (pag. 4. contendo 2 ml de solução de eluição. Método 1. então. 7.

....1 12....globulina α2.....4 g/100 ml 0.0 Valor absoluto g/100ml 4..................034 0....... e multiplica-se por 100.9 100......... 3... 0.........15 CÁLCULOS Faz-se a leitura da densidade óptica de cada tubo... FRAÇÕES Albumina α1...... de cada fração pela soma-se das D............8 4..0 7.....10 Proteína total = 7. Somam-se as densidades ópticas de cada fração e para obter-se o valor relativo em % divide-se a D.67g/100ml Valores normais : Albumina..72 0...O..............67 0.........1 a 0..................globulina total D.....O.91 7.6 a 5.....5 a 1..x X = 0...... β -globulina.....6 a 1...............80 x 7....841 EXEMPLO Valor relativo (%) 65. α1-globulina...... α2-globulina..........10 = 467....O......6 g/100 ml 15 ....globulina β .globulina γ..2 g/100 ml 0. divide-se por 100..............0 g/100 ml 0... Depois...553 x 100 = 65.085 0.841 Valor absoluto (g/100ml) 65.......553---------------...108 0... γ-globulina...28 0....6 a 1......3 10.....80% 0...553 0. para verificar o valor absoluto (g/100ml)..........841----------------100% 0.52 0....10 g% Valor relativo (%) 0.......0 g/100 ml 0......18 : 100 = 4............061 0..

não ocorrerá hemólise. seu soro possuía forte atividade bacteriolítica contra esse microorganismo. diz-se que a bactéria está sensibilizada. o complemento permanecerá livre no líquido. Se o anticorpo estiver ausente. essa atividade desaparecia. Quando o soro da cobaia era aquecido. o que serve para diagnosticar a infecção correspondente. a hemoglobina difundese no líquido. 16 . cuja destruição se denomina hemólise. que toma coloração vermelha transparente. mas não haverá bacteriólise. O processo de hemólise. Isto se consegue adicionando-se hemácias de carneiro sensibilizadas. mesmo existindo complemento em abundância. o complemento será ligado ou fixado ao complexo antígenoanticorpo específico e nenhum complemento será deixado livre. Estudos posteriormente demonstraram que a atividade bacteriolítica se devia a duas substâncias encontradas no soro: uma resistente ao calor. Em tal caso. Se. Antígenos solúveis também reagem com anticorpos específicos fixando o complemento. A bactéria que induziu a imunidade e contra a qual atividade era dirigida. e a adição subsequente do complemento acarretará rapidamente a bacteriólise. encontrada somente no sangue de animal imune (anticorpo). Quando ocorrer a união desses três elementos. e é portanto necessário adicionar um indicador. Em nenhum dos casos haverá mudanças visíveis para relevar o que aconteceu. que mostrará o complemento que ainda permanece livre. formando sedimento vermelho. sobretudo os glóbulos vermelhos. 2. presente no soro de quase todos os animais de sangue quente. é facilmente visível a olho nu. Quando se mistura o soro desconhecido com um antígeno específico e o complemento. A aplicação da reação de fixação do complemento permite determinar a presença do anticorpo especifico no soro do paciente. antígeno da superfície bacterianaAnticorpo-complemento in vivo ou in vitro poderá haver bacteriólise. Pfeifer mostrou que. os glóbulos intactos depositam-se lentamente no fundo. Logo que se misturam os reagentes os eritrócitos formam uma suspensão vermelha opaca. ocorrerá a união do anticorpo com a bactéria. é o ANTÍGENO.Introdução: Em 1894. além das bactérias. Quando ocorre hemólise. o sistema hemolítico se completa e ocorrerá hemólise. Se. o complemento estiver ausente. seu soro tiver o anticorpo correspondente. portanto não as lisará. num tubo de ensaio. imunes ou não (complemento). ao contrário. quando se processa in vitro. com sobrenadante claro e incolor. por causa da liberação de hemoglobina das hemácias lisadas. quando cobaias restabelecidas de cólera eram infectadas com o vibrião colérico. ao contrário.Se o soro do doente não contiver o anticorpo especifico. podem agir como antígenos. pois não haverá complemento livre para se complexar aos eritrócitos sensibilizados. o complemento tiver sido ligado ao complexo Ag-Ac.Se o paciente tiver a infecção em questão e se. por conseguinte.16 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO I . acontecerá uma das duas hipóteses: 1. sem sedimento visível. este não poderá se fixar as bactérias e. Se não ocorre a hemólise. Outras substâncias. e outra sensível ao calor (termolábil). Se houver complemento livre.

Os anticorpos encontrados no soro do coelho podem ser demonstrados pela reação de imunohemólise entre outras.Estante de metal b .Suspensão de hemácias de carneiro a 5% e .Pipetar solução fisiológica tamponada: (os respectivos valores em cada tubo) 0. os alunos executarão a reação de imuno-hemólise. por 15 minutos.Soro hemolítico (hemolisina) f .Solução tampão com veronal Técnica: 1 .Numerar os tubos 2 . este animal produz anticorpos anti-hemácias de carneiro.3 ml no tubo 2 0. com o objetivo de demonstrar que nesta reação participam três elementos distintos: ANTÍGENO = ANTICORPO = COMPLEMENTO Material: a .9 ml no tubo 3 6 .1 d .5 ml de complemento nos tubos 1 e 3 5 . 17 .Incubar em banho-maria a 37ºC.1 ml de suspensão de hemácias nos 3 tubos 3 .Pipetar 0.Complemento g .8 ml no tubo 1 1.Pipetar 0.Pipetas de 1 ml graduadas em 0.3 tubos de ensaio c . A reação de imune hemólise se verifica nas seguintes condições: Fresco + Suspensão de hemácias de carneiro + incubação a 37º C hemólise + Suspensão de hemácias de ausência de carneiro + incubação a 37ºC hemólise + Suspensão de hemácias de carneiro + Soro fresco de hemólise cobaia (complemento) + Incubação a 37ºC Soro de coelho imunizado contra hemácias de carneiro Inativado a 56ºC/30` Inativado a 56ºC/30` Nesta aula prática.1 ml do soro hemolítico nos tubos 1 e 2 4 .17 REAÇÃO IMUNOHEMÓLISE Quando injetamos hemácias de carneiro num coelho.Pipetar 0.

Pipetar os reagentes segundo o quadro abaixo: TUBOS Soro do Antígeno paciente (dose ótima) 1(reação) 0.Incubar em banho-maria a 37ºC durante 30 minutos.Tampão e . QUADRO PARA ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS: RESULTADO Reação Soro Controle do soro Testemunho do Ag Testemunho do C INTERPRETAÇÃO 18 .Agitar a estante e levá-la a incubação em geladeira 2-4ºC.Tubos de 12 x 75 mm h .8 ml 2 .5 ml 05 ml 0.Complemento c .5 ml 2(controle do soro) 0. a 37ºC por 15 minutos.5 ml tampão 0.1 Técnica: 1.Soros (já inativados ) d .6 ml 0.18 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO Material: a . 4 .2 ml do sistema hemolítico (mistura de suspensão de hemácias + soro hemolitico a todos os tubos). 3 . acrescentar 0.Sistema hemolitico (hemácias de carneiro + hemolisina ) f .3 ml 0.5 ml 0.Antígeno b .1 ml 0. a seguir.5 ml 4(testemunho do C`) - Complemento DH 50% 0.Pipetas de 1 ml em 0.Estante de metal g .No dia seguinte.2 ml 0.2ml 3(testemunho do ag) 0. por 18 horas e.

Na temperatura mais baixa. Geralmente usam-se lâminas de microscopia revestidas com camada de gel de ágar a 1% em solução salina ou tamponada. A temperatura deve ser constante e entre a 4ºC e 37ºC . d) Tubos capilares. O complexo antígeno . poderá interferir na solubilidade das proteínas. e) Solução de antígeno de Paracoccidioide brasiliensis f) Solução de anticorpos antiantígeno de Paracoccidioidis brasiliensis (soro controle) g)Soro humano para o teste h) Furador i) Câmara úmida 19 . Fatores que interferem na reação de precipitação são: pH.anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arcos de precipitação.8 pode impedir a reação e dissociar complexos de Ag . MATERIAL a) Solução de agar a 1% em solução fisiológica. na anemia infecciosa eqüina. na hepatite crônica ativa. demonstrando independência imunológica total entre os reagentes pesquisados. A imunodifusão é usada também com finalidade diagnóstica. a reação ocorre mais lentamente e a temperatura acima de 37ºC pode resultar na formação das linhas de precipitação.Ac . tais arcos podem fundir-se dando identidade total ou parcial (esporão) ou intercruzam-se. O pH deve ser entre 6. Na imunodifusão radial dupla. A principal aplicação desta técnica tem sido na identificação de antígenos e anticorpos em misturas desconhecidas (como os fluídos biológicos). b) Lâminas de microscopia.19 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO SEMI-SÓLIDO Imunodifusão radial dupla (reacão de Ouchterlony) Esta técnica pode ser definida como a difusão de antígenos e anticorpos homólogos um em direção ao outro num meio gelificado. c) Pipetas graduadas de 5 ml. tempo e principalmente as concentrações relativas de antígenos e anticorpo. Outra grande importância é a de se poder saber se duas substâncias são imunológicamentes idênticas. ocorre a reação de precipitação.5 a 8. sendo que. em que em determinado ponto de ótima proporção dos reagentes ou próximos deste. como por exemplo. A reação usualmente ocorre entre 16 a 24 horas. Os reagentes difundem-se radialmente formando uma linha visível resultante da precipitação e somente na região onde os dois reagentes se encontram nas proporções adequadas. bem como na paracoccidioidomicose. os reagentes são colocados em orifícios separados e opostos feitos no gel. forca iônica do tampão. mas deve se esperar 40 a 48 horas para o resultado final. parcialmente idênticas ou independentes. temperatura. A forca iônica maior ou menor do que a do tampão recomendado.8 pois em pH abaixo de 6.5 pode ocorrer precipitação não específica e o pH acima de 8.

Aplicar.Colocar a lâmina com o gel sobre o modelo (gabarito) e fazer os orifícios nos pontos indicados. Levar à geladeira. ou de uma cuba apropriada. por 5 minutos.Deixar dentro da placa de Petri. OA O1 O2 O3 OB O4 A – Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 1 . colocando. Esperar esfriar.Fazer a leitura após 24 ou 48 horas. 3.soro do paciente 2 20 . em câmara úmida. 2 . de maneira uniforme sobre a lâmina. algodão úmido para manter a umidade.soro do paciente 1 2 – soro controle positivo B . 3 ml de ágar fundido em solução fisiológica.Aplicar. 5 . ao lado. 4 . utilizando um furador. usando um capilar para cada amostra. os antígenos e anticorpos de acordo com o esquema.20 TÉCNICA: 1 .soro controle positivo 4 .Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 3 .

através de linhas.21 Após a leitura do resultado e interpretação faça o seguinte exercício para sua auto-avaliação: a) Utilizando os reagentes de acordo com a legenda abaixo. esquematize. o resultado esperado na seguinte reação de imunodifusão radial dupla: B E A D C LEGENDA: A= Solução de anti-IgA das secreções B=Saliva humana C=Solução de anti-IgM D= Solução de cadeias pesadas α E=Solução de IgA sérica b) Através de seus conhecimentos sobre Imunoglobulinas justifique os resultados nos encontros das linhas: Entre B e C: ___________________________________________ Entre C e D: ___________________________________________ Entre D e E: ___________________________________________ Entre E e B: ____________________________________________ 21 .

7 .5 ml ou em placas de microaglutinação com quantidade bem menores de reagentes. No teste de aglutinação direta eritrócitos. 11 . resultando em maior sensibilidade. Em anti-soros com títulos aglutinantes altos. As reações de aglutinação requerem a presença de eletrólitos. Os testes de aglutinação indireta podem ser também realizados em tubos ou placas de microaglutinação. para doença de chagas. uma vez que os eletrólitos vão neutralizar a carga elétrica da partícula que em pH neutro possuem carga livre ou resultante negativa . bactérias ou mesmo de partículas inertes (ex: látex) que foram recobertas por um antígeno. 22 . 3 .Reação de aglutinação direta para toxoplasmose. Por causa da variabilidade intrínseca no sistema de teste.Davidson .Reação de inibição de hemaglutinação . Na aglutinação indireta faz-se adsorsão passiva ou acoplamento químico de antígenos solúveis a eritrócitos ou outras partículas inertes.Reação de aglutinação rápida e aglutinação lenta para brucelose.Reação de aglutinação para lepstospirose.para revelar anticorpos incompletos em várias doenças.Reação de aglutinação para listeriose. bactérias e uma variedade de espécies microbianas podem ser diretamente aglutinadas por anticorpos séricos. 8 . 2 . Após poucas horas de incubação.Reação de Waaller . as células se aproximam permitindo a formação de pontes moleculares.para diagnóstico de várias viroses. 10 .0.22 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno faz parte da superfície de eritrócitos. Neutralizada esta força repulsiva. 3 . etc. O fenômeno de pro-zona produz reações de aglutinação falsamente negativas em concentrações altas de anticorpos.Reação de hemaglutinação indireta para toxoplasmose.Reação de Coombs .Rose . a aglutinação está completa e as partículas são examinadas diretamente ou microscopicamente para evidência dos grumos. 4 . um fenômeno de pro-zona pode obscurecer os resultados.Reação de crio-hemaglutininas para pneumonia atípica primária. Exemplo de reações de aglutinação empregadas com finalidade de diagnóstico: 1 .Determinação dos grupos sangüíneos e fator Rh. 6 . 2 .para monucleose. Os anticorpos adicionais a estas suspensões combinam com o antígeno localizado na superfície das partículas unindo-as entre si. Muitos antígenos se acoplam espontaneamente com eritrócitos e formam reagentes estáveis para a detecção de anticorpos. Shigelas e colipatogênicos.Classificação de pneumococos e estreptococos.Reação de Wiel-Felix .para diagnóstico da artrite reumatóide.Classificação de Salmonellas. 9 . 12 . um título precisa diferir em pelo menos duas diluições (dois tubos) para ser diferente de qualquer titulo dado. Testes para detectar anticorpos especificos são realizados pela titulação de soros imunes em diluições seriadas (2x) na presença de uma quantidade constante de antígeno.para febre tifóide. OUTRAS APLICAÇÕES DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO 1 . Os resultados são expressos geralmente em títulos isto é. formando um agregado nítido.Reação de Widal .para riquetsiose.Reação de aglutinação de Paul-Bunnell . 5 . Os testes são feitos em pequenos tubos de ensaio em volumes de 0.2 . o inverso da maior diluição do soro na qual ocorre aglutinação.

0.Misturar cada composição soro-antígeno com um bastão.05 ml do soro teste depositando separadamente cada fração do material sobre uma série de quadrados numa placa de vidro específica para esta reação (ou pipetar individualmente cada uma das quantidades indicadas colocando-as em lâminas individuais de microscopia. 1:200 . O antígeno utilizado nessa reação foi preparado de acordo com técnica internacional recomendada pelo Ministério da Agricultura. Reação negativa (-): não aglutinação. aglutinação direta). Reação positiva (+): presença de aglutinação. 23 . ao contrário do que comumente ocorre.(Vide anexa no fim da apostila). 02 . 1:100 .04. As diluições finais serão aproximadamente 1:25 . Atenção: Em soros apresentando títulos altos de anticorpos pode ocorrer o fenômeno de pró-zona. Por isso. previamente identificadas com a respectiva diluição). 0.08.Fazer a leitura observando a aglutinação com uma fonte de luz apropriada. o Conselho Federal de Medicina Veterinária editou portaria específica que orienta a realização e a interpretação das reações sorológicas para o diagnóstico da Brucelose Animal.01 e 0.05 ml até a diluição contendo 0. 03 . em salina fenicada a 8. iniciando com a diluição contendo 0.5% e corada com verde brilhante e cristal violeta. pipetar 0. TÉCNICA 01 .08 ml de soro (ou seja. 0. ou seja.Com uma pipeta específica para reação aglutinação direta para o diagnóstico da brucelose (Pipeta de Bang) ou com pipeta de 0.(Cuidado para não encostar a pipeta com antígeno na fração de soro para não haver contaminação do antígeno).Agitar o frasco do antígeno padronizado e colocar uma gota do antígeno de Brucela (30 µl) ao lado da fração de soro.2 ml. 05 . que é um evento em que o excesso de anticorpos presentes no soro teste faz com que a equivalência da interação Ag/Ac somente ocorra após altas diluições desse soro.23 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM PLACA PARA PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-BRUCELA Objetivo: Demonstração da Aglutinação Direta da suspensão bacteriana de Brucella abortus por anticorpos anti-brucela presentes no soro. 1: 400. nas reações em que se visualizam a pró-zona. no sentido da maior para a menor diluição). as primeiras diluições de soro mostram-se negativas e as últimas (maiores) diluições apresentam reação positiva. Em face da importância da Brucelose com zoonose. o inverso da maior diluição onde se identificou a reação (no caso.Agitar a placa com suaves movimentos circulares de 15 a 20 vezes por 3 minutos. 04 .02. NOTA: O resultado encontrado é expresso por um título. 1:50 . estando em uma concentração celular de 11%.

soro fortemente reativo. isto é. a qual faz parte normalmente da membrana mitocondrial. 4 . 3 .soro fracamente reativo. inativados a 56ºC durante 30 minutos. A cardiolipina. mas não estimula sua produção..24 REAÇÃO DE MICROAGLUTINAÇÃO PASSIVA .Soros a testar. soros positivo e negativo.Suspensão do antígeno.L. através de uma técnica de microaglutinação passiva feita em placa escavada. ( a agitação pode ser manual). TÉCNICA: 01 .não reativo . entretanto.Acrescentar a cada soro uma gota de suspensão antigênica com uma seringa de 1. seja em testes de fixação do complemento (reação de Wasserman). 5 . etc).05 ml ) dos diferentes soros.Seringa de 1 ml sem o bisel (ponta). seja em testes de aglutinação passiva.Partículas agrupadas em pequenos grumos .Em cada escavação da placa colocar 01 gota (0. Trata-se de um fosfolipídio.REAÇÃO DE VDRL (VENERAL DISEASES RESEARCH LABORATORY) A reação do VDRL é usada para o diagnóstico sorológico da sífilis.R. 24 . 03 . é um hapteno. somente se liga a anticorpos. Cardiolipina sozinha. durante 04 minutos.Partículas agrupadas em grandes grumos . nos quais o hapteno é adsorvido a superfície de cristais de colesterol (reação de floculação de Kline.p. 04 . Anticorpos para antígenos cardiolipínicos são conhecidos como anticorpos de Wasserman ou reagínicos. reforçada pela adição de doses adequadas de colesterol e de lecitina constitui excelente antígeno para a detecção da reagina sifilítica. no agitador próprio.Pipetas Pasteur.Leitura: A leitura deve ser feita imediatamente após a agitação observando ao microscópio de acordo com a intensidade da reação.Lâminas escavadas. 2 . a 180 r. Infecções pelo Treponema pallidum levam à liberação nos fluídos orgânicos de cardiolipina. e à produção de anticorpos.D. V. .Partículas finamente dispersas . movimentos rotatórios da placa sobre a superfície da mesa com amplitude de mais ou menos 03 cm. 02 . INTERPRETAÇÃO .m. Pacientes com sífilis desenvolvem uma resposta de anticorpos contra um hapteno ubiquitário que existe nos tecidos dos mamíferos. MATERIAL NECESSÁRIO: 1 .Agitar.0 ml (agulha sem bisel). Para tornar-se imunogênica a cardiolipina deve se ligar a uma proteína carreadora. que pode ser extraído em alto grau de pureza do coração de bovino e é denominado cardiolipina.

IgG humana desnaturada pelo calor. onde o antígeno.Agitar suavemente a placa com movimentos circulares. 02 .Misturar e distribuir o conteúdo de cada círculo por toda sua área com um estilete.05 ml do soro teste no tubo contendo o tampão e homogeneizar bem. pipetando 0. 1 gota da diluição 1/20 do soro a testar.95 ml do tampão glicina e a seguir 0. a cada um dos círculos. 03 . 04 . previamente agitado. 05 . como grumos visíveis 25 .Preparar uma diluição a 1/20 do soro. O fator reumatóide é considerado um anticorpo contra a IgG.25 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA: Teste para a pesquisa do Fator Reumatóide Látex Princípio: O fator reumatóide é uma macroglobulina (IgM) que se encontra presente no soro de 85 a 90% dos pacientes com Artrite Reumatóide e em 3 a 5% dos indivíduos normais. RESULTADO: NEGATIVO: Suspensão homogênea. 06 .Colocar no círculo à esquerda 01 (uma) gota do soro controle positivo e no círculo a direita 01 ( uma) gota do soro controle negativo. POSITIVO: Aglutinação nítida que se apresenta macroscópicamente dentro de 2 minutos.Colocar no círculo central da placa fornecida. resultando numa aglutinação visível macroscópicamente. TÉCNICA: 01 . Usar um para cada círculo. Este antígeno reage imunológicamente com o anticorpo (fator reumatóide) presentes no soro.Adicionar uma gota do reativo látex globulina. e observar macroscopicamente o resultado da reação por tempo não maior que 2 minutos. Pode ser detectado por uma reação de aglutinação passiva ou indireta. se encontra adsorvido a superfície de um suporte inerte de látex de poliestireno.

Landsteiner (1990) verificou que era regra todo indivíduo apresentar no seu plasma aglutininas contra os aglutinógenos que lhes eram estranhos: -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Aglutinógenos nas Aglutininas no hemácias Plasma -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A A Anti B B B Anti A O Anti A e Anti B AB A e B -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Isso torna possível a tipagem do sangue de um indivíduo dentro do sistema ABO quer pelas hemácias. A leitura é feita por visualização da aglutinação: 26 . 1 . TÉCNICA: Seguir o esquema que se segue 1 gota: sangue 1 gota: sangue Grupos - soro anti A soro anti B Misturar com o bordo de uma lâmina limpa.B. AB e O.Sistema ABO De acordo com a existência ou não dos aglutinógenos A e/ou B. e) Lâminas de microscopia.26 IMUNO-HEMATOLOGIA 1) Grupos sangüíneos . nas hemácias. os indivíduos da espécie humana podem ser divididos em 04 grupos: A. c) Soro anti B.TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTÍGENO NAS HEMÁCIAS. (REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA) MATERIAL: a) Sangue total. d) Pipetas Pasteur. quer pelo plasma. b) Soro anti A.

TECNICA: A tipagem comumente é feita em lâmina usando-se como reagente soro anti . c) Hemácias B. d) Pipetas Pasteur. b) Hemácias A. c) Lâminas.TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTICORPOS NO SORO. b) Soro anti D (Rh). GRUPO SANGÜÍNEO .SISTEMA Rh De acordo com a existência ou não do antígeno D(Rh) nas hemácias os indivíduos da espécie humana são Rh+ (positivo) ou Rh .D (Rh) observando-se a aglutinação ou não das hemácias a temperatura ambiente. e) Lâminas. Sangue: 1 gota de sangue Soro: anti -D 27 . Seguir o esquema 1 gota: soro 1 gota: soro 1 gota hemácia A 1 gota de hemácia B . mas na prática transfusional apenas o antígeno D (Rh) é pesquisado por ser mais imunogênico.Misturar com o bordo de uma lâmina limpa e efetuar a leitura pela presença ou não de aglutinação. d) Pipetas de Pasteur. MATERIAL: a) Soro desconhecido. MATERIAL: a) Sangue total.(negativo).27 - 2 . O sistema Rh possui ainda outros antígenos.

para misturar.Adicionar ao sedimento de hemácias. em um 2º tubo colocar uma gota de soro controle positivo (marcar (+) no tubo).Adicionar 02 gotas de albumina bovina a 22% em cada tubo.28 TESTE DE COOMBS A prova de Coombs. invertendo o tubo e enxugando a borda do mesmo com papel absorvente. 03 . O teste de Coombs direto é feito para diagnóstico da D.H.p. TÉCNICA PARA O TESTE INDIRETO 01 . e incubar a 37ºC durante 15 minutos. Consiste na lavagem de hemácias já sensibilizadas. 05 .Após a última lavagem.Retirar o tubo do banho-maria e completar até 01 cm da borda com solução fisiológica ou PBS FOSFATO e centrifugar a 3000 rpm ( + ou .A cada um dos tubos acrescentar uma gota de suspensão de hemácias O Rh (+) 5%.N. A lavagem é feita para evitar a reação das proteínas livres.R.Agitar suavemente para misturar e centrifugar imediatamente ( 01 minuto a 1000 r.Colocar em um tubo de ensaio uma gota do soro a ser testado (marcar T no tubo). Em recém-nascido de mães sensibilizadas. 08 . 02 . em um 3º tubo colocar uma gota de soro controle negativo (marcar (-) no tubo). consiste no emprego do soro antigamaglobulina humana (soro de Coombs) para promover a aglutinação de hemácias previamente incubadas com anticorpos incompletos. INTERPRETAÇÃO 10 .m). decantar o sobrenadante por inversão do tubo.Aglutinação presente: Teste positivo Aglutinação ausente: Teste negativo 28 . 06 . 07 . decantar completamente o sobrenadante. 02 gotas de soro de Coombs. ressuspender o sedimento de hemácias e repetir esta operação por mais 02 vezes. Teste de Coombs indireto é utilizado para o diagnóstico de anticorpos incompletos no soro de qualquer pessoa possivelmente sensibilizada por antígenos eritrocitários do sistema Rh (sensibilização pós-transfusional ou no decurso de gestação).03 minutos). de crianças e adição de soro de Coombs.Preparar uma suspensão a 5% de hemácias O-Rh positivas.Agitar. também denominada prova de antiglobulina humana. 09 . 04 .

colocar 50µl de tampão diluente em cada poço. proceder com esta diluição até o último poço (numero 11). 4) Desprezar 50µl do 11º poço (último). escolhemos fazer a pesquisa de antígenos do vírus da Hepatite B por tal método. A reação será realizada em placas de microaglutinação. 5) Agitar levemente a placa. Observe. na placa. 1 A B C D E F G H 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PROCEDIMENTO 1) Utilizando a linha A. 7) Agitar levemente a placa. onde não sofra vibrações. 8) Colocar 50µl de hemácia sensibilizada com o antígeno do vírus Hepatite B em todos os poços. a partir do 2º poço até o 11º poço dessa linha. o método de Inibição da Aglutinação Passiva. 10) Ler a reação após 2 horas. e a diluição dos soros e reagentes será feita através de pipetas automáticas. 3) Homogeneizar o conteúdo do 1º poço e passar 50µl para o 2º poço . homogeneizar novamente e passar 50 µl do 2º poço para o 3º . que os poços estão distribuídos formando linhas: linhas A. B. C etc. 29 . 6) Colocar 50µl de soro anti-antígeno Hbs em cada poço. 9) Selar com fita Durex para que não haja evaporação dos reagentes e colocar a placa sobre uma superfície rígida. Cada poço da placa de microaglutinação e reconhecido também por “well”.29 MÉTODO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA As variações sobre os métodos de aglutinação surgiram ampliando as possibilidades de diagnóstico e pesquisa de anticorpos e de antígenos. Esse tipo de placa presta-se a reações em que trabalhamos com pequenos volumes de reagentes. 2) Colocar 100 µl de soro humano no 1º poço. Com o objetivo de conduzir os alunos de graduação desta instituição para a compreensão de mais uma variação. à medida que autorizaram uma sensibilidade maior para a pesquisa daqueles reagentes. do 1º ao 11º poço.

o peróxido de hidrogênio. é gerado um produto colorido que poderá ser observado a olho nu (ensaio qualitativo) ou ter sua densidade óptica medida por espectrofotometria (ensaio quantitativo). O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos. Independente do método escolhido para leitura é necessário determinar o limite de reatividade ou “cut-off” do teste. A enzima peroxidase é muito utilizada para este teste. Os conjugados devem ser preparados com anticorpos de alta afinidade. Anticorpos ou antígenos podem ser conjugados a enzimas de maneira que.O do controle positivo). Vários métodos são realizados utilizando o principio do enzima-imunoensaio.O da amostra/D.30 ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) Este teste foi desenvolvido em 1971 por Engvall e Perlmann como alternativa ao radioiumunoensaio. cruzi PRIMEIRA AULA – SENSIBILIZAÇÃO E BLOQUEIO DA PLACA Material necessário: Placas de poliestireno Solução contendo antígenos de T. gerando um complexo que na presença de um terceiro composto um doador de elétrons (cromógeno ) forma um polímero intensamente colorido. TÉCNICA DE ELISA INDIRETO PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-T. podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados. ao ser adicionado o substrato da enzima à reação. preferencialmente monoclonais. O conjugado utilizado deverá ser específico para a estrutura capturada na placa. materiais que possibilitam a ligação covalente de proteínas. tal como placas de poliestireno ou polivinil. cruzi Solução tamponada de Caseína a 1% Solução tampão para lavagem Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Estufa à 37°C 30 . A adsorção não específica de componentes à placa pode ser reduzida incluindo-se uma proteína inerte (caseína. que poderá ser o antígeno ou mesmo uma classe de anticorpo em particular. O princípio básico é a adsorção de um dos reagentes (antígeno ou o anticorpo) a uma fase sólida. gelatina. e reage especificamente com seu substrato. O cromógeno mais utilizado em ELISA é o OPD (ortofenileno diamina). que pode ser obtido pela relação entre a coloração da amostra e a coloração do controle positivo (D. entre eles os mais empregados são: • Método indireto: amplamente empregado para a pesquisa de anticorpos apresentando como vantagem a utilização de um único conjugado em diferentes sistemas. Tais placas contêm séries de poços onde serão depositados os reagentes. BSA) no diluente da amostra (bloqueio). • Método de captura: Um anticorpo específico é adsorvido à placa para reter o objeto da pesquisa.

Trabalhando com a placa previamente sensibilizada. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur.31 Metodologia: Sensibilização da placa: 1. cada poço da placa. 3. 4. cruzi em cada poço da placa de poliestireno. Boqueio de placa previamente sensibilizada: 1. Pipetar 200µl de solução contendo antígenos de T. Incubar 2 horas à 37°C em estufa. 5. 2. desprezar a solução de antígenos de T. cruzi. cruzi. Material necessário: Placas previamente sensibilizadas com antígenos de T. Pipetar em duplicata (em dois poços consecutivos) 100µl dos soros controles e dos soros testes de acordo com o esquema abaixo: A: Controle negativo B: Controle negativo C: Controle positivo D: Controle Positivo E: Soro teste 1 E: Soro teste 2 F: Soro teste 3 G:Soro teste 4 31 . SEGUNDA AULA – Detecção de anticorpos anti-T. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. Adicionar 200µl de solução de bloqueio (Caseína a 1%) a cada poço da placa e incubar overnight a 37°C. cada poço da placa. Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Soro Controle Positivo Soro Controle Negativo Soros testes Conjugado enzimático Solução reveladora (peróxido de hidrogênio+OPD) Metodologia: 1. cruzi e bloqueadas. 2. Inverter a placa e bater sobre papel de filtro para retirar o excesso de tampão.

5. Inverter e bater a placa. 7. Adicionar 100µl de solução reveladora (substrato+cromógeno) em cada poço.32 2. Inverter e bater a placa sobre superfície com papel de filtro. 6. Adicionar 100µl de conjugado a cada poço da placa. Incubar a placa 30 minutos à 37ºC. 8. 9. 10. Leitura visual de placa pronta 32 . Levar para incubação em estufa durante 15 minutos à 37º C. 11. Lavar três vezes a placa com solução tampão. 4. Desprezar o conteúdo da placa e lavra três vezes com solução tampão. 3. Novamente incubar 15 minutos à 37ºC.

em seguida emiti-la sob a forma de uma radiação de maior comprimento de onda. Para a observação microscópica da fluorescência é necessária uma adaptação do microscópio óptico comum. C D A B ---------------__ _ _ _ _ _ _ __ Radiação de longos comprimentos de onda Radiação de curtos comprimentos de onda A .Filtros excitadores D . comprimento de onda. A fluorescência é a emissão de luz de uma cor. ou seja maior comprimento de onda do que o da luz incidente ou absorvida. O comprimento da onda emitido (fluorescente) terá necessariamente menor energia.33 REAÇÕES DE IMUNOFLUORÊSCÊNCIA FINALIDADE: Detecção de anticorpos ou de antígenos. enquanto uma substância é irradiada com luz de cor diferente. Os fluorocromos mais usados em laboratório clínico são a fluoresceína e a rodamina.Filtros de barreiras Esquema do sistema óptico do microscópio de fluorescência. É possível tornar visível a reação Ag-Ac marcando um dos reagentes com substâncias ditas fluorocromos. e emite sua cor verde característica a 517 nm. isto é. contendo uma fonte de luz excitadora de alta intensidade. Os fluorocromos apresentam espectros de absorção e emissão característicos.495 nm. A absorção máxima do isotiocianato de fluoresceína é de 490 . As técnicas utilizadas para o estudo de imunofluorescência comportam duas modalidades principais: 33 . tem um máximo de absorção a 550 nm e emissão máxima a 580 nm. armazená-la durante curto espaço de tempo (10-9 a 10-7 de segundos) para.Preparo fluorescente C . Ambos os fluorocromos são empregados sob a forma isotiocianato.Lâmpada de halogênio B . resultando em fluorescência. filtros de excitação para produzir um comprimento de onda capaz de causar ativação do fluorocromo e filtros para evitar a passagem pela ocular. que tem a capacidade de absorver a energia luminosa. de luz de baixo comprimento de onda. que emite cor vermelha. O isotiocianato de tetrametilrodamina. que se conjuga facilmente as proteínas em pH alcalino (acima de 9 ).

Sobre a preparação de antígeno fixado à lâmina. anti-DNA. lava-se a preparação para remover todas proteínas (imunoglobulina) não fixadas pelo antígeno. após haver a reação Ag-Ac. anticorpos antireóide. anti HIV. como estreptococos beta-hemolíticos do grupo A. doenças de Chagas.34 1 . 34 . antinucleoproteína. aplica-se primeiro o anticorpo específico não fluorescente. É o processo comumente usado para a identificação de microorganismos por imunofluorescência. etc. Usa-se esta técnica na pesquisa de anticorpos circulantes no diagnóstico de: toxoplasmose.baseia-se na detecção de antígenos utilizando anticorpos específicos marcados com isotiocianato de fluoresceína. esquistossomose. sífilis. sorotipos de leptospiras. bacilo diftérico. leptospirose. marcado com fluoresceína. trata-se com um anticorpo fluorescente com especificidade dirigida para os determinantes antigênicos do anticorpo ligado ao antígeno.baseia-se na detecção de anticorpos utilizando um antígeno conhecido e um soro anti-imunoglobulina humana.Imunofluorescência indireta .Imunofluorescência direta . e a seguir. etc. sorotipos de colibacilos enteropatogênicos. 2 .

Secar bem as lâminas fixadas com antígeno. por 30 minutos. 2 .5 ml de salina tamponada e 0.Incubar a 37ºC em câmara úmida. na razão de 1/16 . em cada área das lâminas. Nas reações negativas os toxoplasmas não apresentam fluorescência ou esta fica localizada apenas nas extremidades dos parasitas (coloração polar).Enxugar o verso e as bordas das lâminas com papel absorvente e ao redor das áreas da reação. 10 minutos cada lavagem. filtro excitador BG 12/2 mm ou KP 500 e filtro barreira 50. 5 (cinco) minutos de cada vez. 9 . 1/4096. Secá-las com ar quente.Incubar novamente as lâminas a 37ºC por 30 minutos.Preparar diluições a 1/16 do soro controle positivo e do soro controle negativo.35 TÉCNICA DA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA TOXOPLASMOSE 1 .Preparar diluições dos soros em solução salina tamponada pH 7. da seguinte maneira: a . 1/64 . 10 . 5 .Observar os preparados ao microscópio de fluorescência. 1/1024 . b . homogeneizar bem e passar 0.Colocar no tubo 1/16 1. diluído conforme seu título.02 ml).1 ml para o 2º tubo.Marcar as lâminas com os respectivos soros.Depositar pequenas gotas (0. 8 . secar como no indicado do item 8 e montá-las com glicerina alcalina e lamínula. TOXO 1/16 1/256 1/64 1/4096 1/1024 _ + 6 . 1/256 . 7 .Remover os soros de cada lâmina sob delicado jato de água e lavá-las por imersão por duas vezes em PBS.1 ml para o 3º tubo e assim sucessivamente.Pipetar no 1º tubo 0.2.Depositar uma pequena gota do conjugado fluorescente liquido antiimunoglobulina humana (cerca de 0. com objetiva de imersão. em câmara úmida. 3 . 35 . 12 .1 ml do soro. ainda que de pequena intensidade.3 ml nos demais tubos. 11 . como demonstrado no esquema abaixo. campo escuro. homogeneizar bem e passar 0.Lavá-las 2 (duas) vezes em PBS. 4 .02 ml) das diluições dos soros em cada área das lâminas. Como título tomar o inverso da maior diluição do soro para a qual se evidencia fluorescência em toda a periferia dos toxoplasmas.

que deverão ser feitos em casa. Tal seção tem como finalidade permitir ao aluno uma auto-avaliação sobre o tema tratado em sala de aula. Ao final de cada unidade e após os estudos.36 PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS Esta parte da apostila apresenta de forma sucinta os objetivos gerais e específicos de algumas unidades do nosso programa. esforçando-se para saber descrever com clareza sobre o que está sendo perguntado. discuta com os colegas ou procure os professores da disciplina. Responda-os com cuidado e atenção. os alunos deverão ter compreendido o assunto tratado se forem capazes de responder aos seguintes objetivos: 36 . pesquise. Se tiver dúvidas sobre qualquer uma das respostas.

5. Entender os fenômenos de defesa como mecanismos de adaptação às agressões do meio ambiente.37 UNIDADE: RESISTÊNCIA INESPECÍFICA Objetivos gerais e específicos: 1. 37 . Descrever os principais elementos da pele e de que forma atuam na resistência inespecífica. 4. 3. Conceituar e diferenciar resistência inespecífica e específica. Descrever os principais elementos da mucosa e de que forma atuam na resistência inespecífica. 2. Citar os principais mecanismos de resistência inespecífica.

Diferenciar morfologicamente imunológica. b. daqueles que atuam na defesa inespecifica.Definir a função da cada célula dentro da resposta imunológica.Diferenciar as células que atuam na defesa especifica.Diferenciar quanto a origem e função os linfócitos T e os linfócitos B. e. 38 . d.Reconhecer as células que participam da resposta e fenômenos imunológicos. cada célula que participa dos eventos da resposta c.38 UNIDADE: CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE Objetivos gerais e específicos: a .

15) Justificar a proliferação linfocitária nos órgãos linfóides secundários. 7) Comparar e justificar os efeitos da timectomia neo-natal e na fase adulta. 39 . 2) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides secundários no sistema imunológico. aos órgãos linfóides secundários. 12) Explicar o tráfego de linfócitos no organismo. considerando as fases de uma resposta imunológica. para o sistema imune. o fígado fetal e a medula óssea. 4) Relacionar funcionalmente a membrana do saco vitelino. à partir da célula primitiva. 9) Explicar o centro germinativo nos linfonodos.39 UNIDADES: FORMAÇÃO DE CÉLULAS T E B e ÓRGÃOS LINFÓIDES Objetivos gerais e específicos: 1) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides primários no sistema imunológico. 14) Reconhecer o papel das vênulas pós-capilares de endotélio alto nos linfonodos com relação ao tráfego de linfócitos. 5) Relacionar os passos envolvidos na formação de células T efetoras. à partir da célula primitiva. 13) Explicar como os linfócitos efetores produzidos em um linfonodo têm acesso a um sítio de infecção em outra região ou tecido. 10) Justificar a hiperplasia de um órgão linfóide secundário. 16) Justificar a proliferação celular nos órgãos linfóides primários. 3) Descrever as características histológicas e anatômicas dos órgãos linfóides primários e secundários. 11) Reconhecer a principal via de acesso das “estruturas estranhas”. 8) Reconhecer aspectos da adaptabilidade dos órgãos linfóides secundários para a fase de reconhecimento antigênico na resposta imune. 6) Relacionar os passos envolvidos na formação de plasmócitos secretores de anticorpos.

11. Conceituar “epítopo”. 7. 5. Conceituar e exemplificar “hapteno”. 40 . Justificar a diversidade de epítopos em uma determinada substância imunogênica.40 UNIDADE: ANTÍGENOS Objetivos gerais e específicos: 1. 8. 3. 10. 9. Explicar a condição para que haja formação de uma resposta imunológica para os haptenos. em geral . 2. Reconhecer a estrutura de um epítopo em uma molécula protéica. Explicar três formas de ação dos adjuvantes imunológicos. 4. Explicar os fenômenos de reatividade cruzada. entre antígenos. Citar e explicar os fatores que contribuem para a imunogenicidade de uma molécula. 6. Exemplificar a situação em que uma substância apresenta antigenicidade e não apresenta imunogenicidade. Citar os adjuvantes imunológicos mais empregados. Definir o termo imunogenicidade e antigenicidade.

b) Determinar a estrutura básica de uma molécula de imunogobulina. d) Identificar na molécula as regiões Fab e Fc. c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina. g) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro. j) Determinar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. m) Definir as imunoglobulinas que apresentam peça J e qual a função desta peça. h) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. o) Definir a imunoglobulina de maior peso molecular. f) Definir sitio combinatório. e) Citar as diferentes classes de imunoglobulinas existentes. 41 . i) Esquematizar o mecanismo de formação de IgAS desde sua síntese até sua chegada na secreções. l) Reconhecer a forma de participação da IgE nas reações alérgicas. k) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM.41 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos I) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo imunoglobulinas. n) Relatar a importância da transferência placentária de imunoglobulina na espécie humana. qual a classe que desempenha este papel e a que se deve esta propriedade. em relação as outras imunoglobulinas.

o) Definir a propriedade de opsonização de que é dotada a IgG. q) Discriminar estruturalmente uma molécula de IgG e uma de IgAS. f) Reconhecer as imunoglobulinas que apresentam subclasses e diferenciar estas subclasses de acordo com a nomeclatura vigente. c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina.Cadeia leve 3. m) Identificar as sub-classes de IgG existentes. s) Explicar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. relação as outras 42 . e) Diferenciar os diversos isótipos de cadeias leves e de cadeias pesadas existentes. g) Conceituar e exemplificar alotipia em cadeias leves e pesadas. x) Reconhecer a forma de participação de IgE nas reações alérgicas.42 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos II) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo Imunoglobulinas. v) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM. em imunoglobulinas.Região carboxi-terminal l) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro.Domínios variáveis e constantes nas cadeias leves e pesadas 4. d) Identificar os fragmentos resultantes após a clivagem enzimática de uma molécula de imunoglobulina pela ação de pepsina e da papaína. p) Reconhecer as subclasses existentes de IgA. 1. w) Determinar estruturalmente a composição de uma IgD. u) Determinar o peso molecular e quantidade relativa de IgM encontrada no soro. h) Conceituar idiótipos. n) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. t) Determinar estruturalmente a composição de uma molécula de IgM. b) Reconhecer a estrutura básica de uma molécula de imunoglobulina. i) Esquematizar uma molécula de IgG reconhecendo nela os seguintes tópicos.Cadeia pesada 2. r) Esquematizar o mecanismo de formação da IgAS desde sua síntese até sua chegada nas secreções.

quimiotaxia para PMN e lise celular. nos fenômenos de aumento de permeabilidade capilar. ♦ Reconhecer o mecanismo de ativação da via alternativa e da via clássica do Sistema do Complemento. ♦ Justificar o papel inespecífico da ação do sistema do complemento. através dos textos bibliográficos. agregação plaquetária. Explicar o mecanismo da ação dos fragmentos de ação biológica.43 UNIDADE: SISTEMA COMPLEMENTO Objetivos gerais e específicos: ♦ Descrever os efeitos biológicos surgidos pela ativação do Sistema do Complemento. Justificar a ação lesiva do sistema do complemento para células do próprio hospedeiro. ♦ Identificar a via alternativa. ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ 43 . ♦ Justificar a participação de uma resposta imuno especifica na ativação do Sistema do Complemento. ♦ Identificar os fatores ativadores da via clásssica e da via alternativa do Sistema do Complemento. produzidos pela ativação do Sistema do Complemento. Explicar a ausência da alça de amplificação da via alternativa nos processos fisiológicos de ativação do Sistema do Complemento. por que na maioria das células os mecanismos de lise pelo Complemento não são possíveis. Reconhecer as bases de um mecanismo homeostático em relação à ativação do sistema do complemento. Justificar. ♦ Identificar a analogia entre as enzimas C4b2a e C 3bBb. Demonstrar como o sistema do complemento participa da eliminação de antígenos que não são celulares ou que não tem membrana exposta. clássica e efetora do sistema do complemento. Explicar o desenvolvimento de uma alça de amplificação na ativação da via alternativa.

o) Relacione a fagocitose a mecanismos de resistência inespecífica. g) Caracterizar o sinal de ativação do fagócito no momento da opsonização. j) Definir as duas principais vias de destruição da partícula fagocitada. l) Citar os radicais livres produzidos na via oxigênio dependente e definir sua importância na destruição de estrutura fagocitada. endocitose e exocitose. h) Explicar a fase de englobamento realizada pelo fagócito i) Explicar a fase de digestão durante a fagocitose. b) Identificar as principais células que participam da resistência inespecífica. f) Explicar a importância do fenômeno da opsonização. 44 . c) Identificar os principais fatores quimiotáticos para PMN e macrófagos.44 UNIDADE: FAGOCITOSE Objetivos gerais e específicos: a) Definir fagocitose. k) Caracterizar a via oxigênio dependente. e) Definir opsonização. pinocitose. m) Caracterizar a via oxigênio independente. d) Citar as principais substâncias que desempenham o papel de opsoninas. n) Citar as principais enzimas que atuam a via oxigênio independente.

45 UNIDADE: Complexo de Histocompatibilidade Principal(CHP. 8) Reconhecer na molécula de classe II. “MHC”) Objetivos gerais e específicos: 1) Definir o que é CHP e onde este se localiza. 9) Relacionar as moléculas de classe I e II do CHP com os antígenos exógenos e aqueles de síntese endógena. a região de ligação ao peptídeo. 5) Esquematize as estruturas das moléculas de classe I e II. 7) Reconhecer na molécula de classe I. (Faça um desenho esquematizando as principais características de ambas). 4) Estabelecer a função dos antígenos de classe I e classe II. 3) Denominar os produtos do CHP Humano. 45 . no camundongo e no ser humano: 2) Citar quais são os produtos da decodificação do CHP. 6) Localizar as moléculas de classe I e de classe II nas diferentes populações celulares. a região de ligação ao peptídeo.

estabelecer de que forma o organismo reconhecerá que naquela célula está se desenvolvendo uma infecção e como esta será debelada. quais são as etapas que culminam com a apresentação de antígenos pelas células. 10) Definir qual o papel do INF. 7) Numa infecção por um patógeno intracelular em uma célula cilíndrica do trato digestivo superior. 4) Descrever no macrófago. 8) Estabelecer onde ocorre a interação entre antígenos próprios e as moléculas do CHP e como ocorre este mecanismo. 5) Definir em qual situação.γ na apresentação do antígeno. 46 . uma molécula viral pode ser apresentada no contexto de moléculas de classe I do CHP: 6) Esquematizar como ocorre o processo de apresentação de antígenos no contexto de moléculas de classe II.46 UNIDADE: Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) e mecanismos de Apresentação de Antígenos 1) Definir quais são as principais células apresentadoras de antígenos e onde elas se localizam. 9) Explicar porque a apresentação de antígenos externos se dá no contexto de moléculas de classeII. 3) Exemplificar qual é a molécula que poderia sugerir uma função de célula apresentadora de antígeno. 2) Definir as principais características quanto às estruturas de superfície celular e fagocitose de cada APC.

Reconhecer o mecanismo de interação na apresentação de Ag aos linfócitos T citotóxicos ou CD8+. Elaborar um quadro comparativo. IL-5 14. IL-4 13. Definir estrutural e funcionalmente os principais marcadores de superfície dos linfócitos T 2. IL-2 11. IL-12 47 . Reconhecer o mecanismo de interação da célula apresentadora de antígeno com os linfócitos T CD4+. INF-γ 17. IL-10 16. Esquematizar as etapas de ativação dos linfócitos T auxiliares. quanto a função e produtos das subpopulações TH1 e TH2. TNF 18. Definir e diferenciar linfócitos TH1 e TH2 8. Definir funcionalmente e quanto às células produtoras as seguintes citocinas: 10. 9. IL-6 15. 5. 4. Definir a etapa seguinte à ativação dos LT auxiliares. 3. IL-3 12. Definir como ocorre a ativação do repertório de células T citotóxicas (CTL). 6. 7.47 UNIDADE: Linfócitos T 1.

13. Definir a primeira imunoglobulina a ser produzida em resposta a uma infecção. 11. 2. 48 . Definir a ontogenia dos linfócitos B no homem. Estabelecer a finalidade da ativação do repertório de linfócitos B. 6. 12. 10. 4. Definir o mecanismo do capuz ou “Capping” e citar a função do mesmo. Definir o resultado final da ativação do repertório de linfócitos B. Explicar porque se pode dizer que um linfócito B é uma APC. 7. Estabelecer com relação ao comportamento de linfócitos B. Definir as fases de ativação dos linfócitos B. Diferenciar a ativação por antígenos timo-dependentes e timo-independentes. Estabelecer a diferença que existe entre as fases das respostas primárias e secundária. Reconhecer os marcadores de superfície dos linfócitos B e função fisiológica dos mesmos. 15.48 UNIDADE: Linfócitos B e Resposta Humoral Primária e Secundária 1. Definir as principais interleucinas produzidas pelos linfócitos T que têm ação sobre linfócitos B e em que fase elas agem e de que forma. 17. 16. 8. Explicar a que se deve a maior produção de Ig durante uma resposta humoral secundária. 5. 9. Definir mudança de classe ou “Switch”que ocorre durante a síntese de imunoglobulinas. 3. Identificar as fases da curva que representa uma resposta humoral e a característica de cada fase. Explicar porque a resposta secundária é a mais rápida do que a resposta primária. 14. o que é esperado quando se imuniza artificialmente uma criança e porque. Estabelecer as fases que precedem a interação entre linfócitos B e linfócitos T e o objetivo desta interação.

8.49 UNIDADE: Genética das Imunoglobulinas Objetivos gerais e específicos: 1. Justifique a necessidade de haver imunoglobulinas de diferentes classes. Identifique o processo de “diversidade funcional por inserção”. 4. 9. 11. Conceitue “Fenômeno de Restrição Alélica”. Identifique a diferença na codificação genética entre imunoglobulina de membrana e imunoglobulina secretada. 16. Diferencie os rearranjos gênicos que existem nas cadeias leves e pesadas. Diferencie o rearranjo gênico que existe durante a fase primordial e a fase tardia de síntese das imunoglobulinas. Responda: é possível que um linfócito B apresente em sua superfície diferentes classes de imunoglobulinas ao mesmo tempo ? Em que situações? 12. 7. Conceitue “Fenômeno de Restrição Isotípica”. Identifique a seqüência genética existente para a síntese das diferentes cadeias pesadas de imunoglubulinas. 5. 14. 10. Explicar por que uma célula que sofreu um “Switch” para a síntese de IgG não mais poderá voltar a sintetizar IgM. Explique as causas da grande variabilidade de sítios combinatórios das imunoglobulinas. durante o “Swicth”. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias pesadas das imunoglobulinas. Defina intron e exon. Responder: por ‘que. há variação na síntese da porção constante da cadeia pesada de imunoglubolinas e não ocorre o mesmo para a porção variável? 49 . 13. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves Kappa das imunoglobulinas. 15. 6. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves lambda das imunoglobulinas. 2. 3.

ou como deverá ser. realizando um esquema completo. Tente. a reação do organismo frente a alteração do padrão fisiológico do mesmo. Portanto. é bem possível que você já possa prever como será. 50 . então.50 INTERAÇÃO DO SISTEMA IMUNOLÓGICO Se você foi capaz de responder a estes questionários contendo os objetivos específicos já é capaz de compreender as diversas faces do sistema imune. identificar a cinética de uma infecção viral numa célula hepática e a resolução desta infecção pelo sistema imunológico. utilizando todos os conceitos que você já aprendeu.

Justificar o papel do contato de longa duração na duração de tolerância. Conceituar “Tolerância imunológica”. Conhecer os fatores favorecedores da resposta ao tolerogênico. Explicar os mecanismos imunológicos pelos quais o sistema imunológico desenvolve tolerância aos antígenos próprios e não próprios. Reconhecer sua participação e importância no Sistema Imunológico. Explicar a importância da drenagem venosa na tolerância por via oral. 5. 51 . Explicar a participação da via oral na indução da tolerância. 4.51 UNIDADE Tolerância Imunológica Objetivos gerais e específicos: 1. 2. 6. 3.

52 . nos tipos imediatos e tardios. 2. 7. ação e efeito dos mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo III. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo I. 20. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade IV. de imunoglobulina(s) envolvida(s) na mediação da 16. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo III. Reconhecer a origem. 8. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo I. 14. 12. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo III. Identificar a(s) classe(s) hipersensibilidade tipo II. segundo Gel e Coombs 3. Definir o que é uma reação de hipersensibilidade.52 UNIDADE HIPERSENSIBILIDADE 1. 4. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo IV. 6. Citar os mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo III. 15. 11. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo I. 13. 19. 21. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo II. 5. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo IV. 9. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo I. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo I. Reconhecer a propriedade hipersensibilidade tipo I. fundamental das imunoglobulinas mediadoras da 18. 17. Classificar as reações de hipersensibilidade quanto aos seus mediadores imunológicos. Relacionar as reações de hipersensibilidade da classificação de Gel e Coombs. 10. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo III.

Justificar o eritema que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilidade tipo IV. 34. Justificar a induração que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilização tipo IV. 40. Justificar a presença destas células no infiltrado . 39. Justificar fenômenos hemorrágicos presentes na reação inflamatória por hipersensibilidade tipo III. 26. 31. reconhecendo os fatores liberados por células responsáveis. Diferenciar a formação de uma reação de Arthus com uma reação tipo III sistêmica. 38. 23. Caracteritizar os tipos celulares predominantes no infiltrado inflamatório mediado por hipersensibilidade tipo IV. Compreender a utilização de testes intradérmicos de hipersensibilidade tipo IV para avaliação de imunidade celular. Explicar as reações aceitas para a permanência de imunecomplexos circulantes o organismo. Entender a origem da histamina e seu papel na hipersensibilidade tipo III. 36. Reconhecer a localização do Ag na hipersensibilidade tipo II. 53 . Justificar a isquêmia que pode acompanhar as reações de hipersensibilidade tipo III. Identificar o principal mediador imune da reação inflamatória tipo IV na classificação de Gel e Coombs. 37. 25. 28. Descrever os principais mecanismos da lesão celular por hipersensibilidade tipo II. 32.53 22. 24. Explicar o mecanismo da injúria tecidual pelo mecanismo de hipersensibilidade tipo IV. 35. 29. Diferenciar o mecanismo de formação de edema na hipersensibilidade tipo I e III. 30. Justificar uma neutropenia após a administração do antibiótico cloranfenicol. 33. Explicar a reação de Arthus. 27. Explicar o papel do sistema do complemento nas reações de hipersenbilidade tipo III. Justificar a escolha dos Ag em uso nos testes intradérmicos de avaliação de imunidade celular.

10. Conhecer a nomenclatura correspondente aos enxertos. 7. 5. 8. 13. Justificar o valor da análise do perfil de HLA na seleção do doador vivo 11. Justificar a importância da Prova Cruzada que antecede os transplantes. Reconhecer quais a estruturas moleculares das células de um enxerto. 9. Relacionar estas estruturas moleculares e o MHC.54 UNIDADE: TRANSPLANTES Objetivos gerais e específicos: 1. 2. Montar um exemplo de um perfil para a expressão fenotípica de todos esses locus em um indivíduo. Explicar a reação de Enxerto X Hospedeiro e justificar a sua presença nos transplantes de medula óssea. 4. Citar as provas de seleção para doador vivo para os transplantes. Interpretar uma prova cruzada positiva. 12. Reconhecer os tipos de rejeição aos enxertos identificando os principais elementos da resposta imune. 54 . Citar os principais locus da região HLA. Associar MHC e HLA. Explicar os mecanismos de agressão às células enxertadas. 6. que são responsáveis pela indução da rejeição aos mesmos. envolvidos. 3.

Reconhecer e explicar o fato das albuminas migrarem com maior velocidade.Reconhecer o que atuou como suporte na corrida eletroforética realizada no laboratório. 3. 2.Fundamentar a razão de todas as proteínas migrarem em um único sentido. 55 .Justificar a importância do pH alcalino do tampão utilizado.55 SUBUNIDADE: “ELETROFORESE DE PROTEÍNAS”. 6. 5.Explicar o princípio de uma eletroforese de proteínas. 4.Dar a definição de ponto Isoétrico de uma proteína e explicar sua participação no princípio desta técnica. OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS: Ao final do exercício desta prática no laboratório o aluno deve estar apto a: 1.

56 PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS EXERCÍCIOS 56 .

Adicionou-se então anticorpos anti-vírus da hepatite A.Posteriormente realizou-se a lavagem do sistema. 7. anticorpos anti-IgM e não anti-IgG. ao tubo. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina. Essa reação processa-se em tubos onde seguiu-se a metodologia abaixo.Realizou-se nova lavagem do sistema. 6. 3.O que estava sendo pesquisado b.diga qual a importância clínico. 4.57 RIE (RADIOIMUNISAIO) Abaixo está representado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. 8.A seguir procedeu-se a incubação a 37º C por 30 minutos. marcador com l125 (um isótopo radioativo cuja emissão de radiação pode ser medida em um cintilômetro).Mediu-se a radiação do tubo. 2. uma condição favorecedora da interação Ag/Ac. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da HEPATITE A. para assim recobrir os espaços não ocupados pelo anticorpo (bloqueio do tubo).Adicionou-se a seguir. 1.laboratorial de termos adsorvidos.Ao tubo foi adicionado soro suspeito para o exame. PERGUNTA-SE a. 5. 57 . A adsorção se dá por ligações covalentes entre os anticorpos e o material do tubo (poliestireno). antígeno extraídos do vírus da Hepatite A.Seguiu-se nova etapa de lavagem. Após a leitura e compreensão responda o que se pede abaixo: METODOLOGIA: A cada tubo foi adsorvido previamente anticorpos anti-IgM humana.

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ELISA ( ENZIME LINKED IMUNOSORBENT ASSAY)
Abaixo está apresentado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS . Acompanhado será fornecido uma placa com 96 poços onde seguiu-se a metodologia abaixo. METODOLOGIA A cada poço foi adsorvido previamente antígenos extraídos dos vírus da AIDS. A adsorção se dá através de ligações covalentes entre os antígenos e o material da placa. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina, para assim recobrir os espaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da placa). 1- Foram adicionados aos poços 1 e 2 soros procedentes de dois pacientes suspeitos de terem anticorpos anti-HIV ( vírus da imunodeficiência humana causador da AIDS). 2- A placa foi levada a uma estufa a 37 ºC por 30 minutos, uma condição favorecedora da interação Ag/Ac. 3- A seguir esse poço foi lavado com uma solução tampão com finalidade de retirar moléculas livres. 4- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas. As moléculas desses anticorpos tinham, ligadas em si, no Fc, uma enzima (peroxidase) cujo substrato pode ser o peróxido de hidrogênio. Esse substrato ao sofrer a ação daquela enzima manifesta uma cor alaranjada que se revela quando se adiciona ao meio uma substância reveladora ( no caso o ortofenilenodiamino-OPD). A ligação da enzima ao anticorpo não altera as propriedades anticórpicas desse. Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 5- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 6- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 7- Logo após observou-se que a solução no poço 1 ficou alaranjada enquanto que no poço 2 não houve alteração. Responda: a- Esquematize os dois poços evidenciando as reações Ag/Ac que ocorrerem ou deixarem de ocorrer. b- Após a realização do item 3, esquematize o que permaneceu no poço 1. c- Como você interpreta o resultado visível nos poços 1 e 2 respectivamente?

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WESTERN BLOTTING
É um dos métodos mais utilizados para identificar proteínas reconhecidas por anticorpos, sendo designado também de immunoblotting, diferenciando-se do “Southern ou Northen blotting”, que se prestam a identificação de ácidos nucléicos. Abaixo está apresentado um exemplo de Western blotting que se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS. Leia com atenção e responda. 1- Para a realização de um Western blotting inicialmente as proteínas virais são separadas, de acordo com seu tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio - um detergente (SDS-PAGE). 2- Em seguida as proteínas fracionadas no gel são transferidas por corrente elétrica, para uma membrana de nitrocelulose que posteriormente será recortada em tiras. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina ou a caseína, para assim recobrir os pedaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da fita). 3- A cada tira é adicionado em recipiente apropriado soro de paciente suspeito de ter anticorpos anti-HIV. 4- Segue-se um período de incubação de 30 minutos a 37º C, e extensiva lavagem para a remoção das proteínas livres. 5- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas marcadas com uma enzima (peroxidade). Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 6- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 7- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 8- Em seguida observou-se que algumas fitas apresentavam bandas (faixas) coradas denotando reação, enquanto outras não se coraram. RESPONDA: 1- Poderíamos pesquisar subclasses de IgG, ou mesmos outro isótipo de imunoglobulinas? Como? 2- O que significa exatamente a presença de bandas coradas, com relação as possíveis interações ocorridas?

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IMUNOHISTOQUÍMICA
A aplicação da imunohistoquímica (IHQ) à rotina diagnóstica já é uma realidade em nosso meio. De modo genérico, podemos considerar como principais indicações para o exame: ♦ Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente diferenciadas ♦ Subtipagem de neoplasias ♦ Caracterização da origem de carcinomas. ♦ Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas ♦ Discriminação da natureza benigna X maligna de determinadas proliferações celulares. ♦ Avaliação prognóstica de neoplasias ♦ Identificação de agentes infecciosos. Como exemplo, temos representado abaixo uma reação de IHQ para a pesquisa de receptores de estrógeno em células de adenocarcinoma de mama, um fator prognóstico neste caso. 1- Para a realização reação de imunohistoquímica utilizamos cortes de tecido incluído em parafina com aproximadamente 3 µ de espessura, colocados em lâminas tratadas com silano ( silanizadas), para propiciar uma forte adesão do corte histológico à lâmina 2- Em seguida as lãminas são desparafinizadas, sendo deixadas na estufa à 60°C por 24 horas, no xilol à 60°C e no xilol a temperatura ambiente para desparafinização 3- Após a desparafinização as lâminas são levadas à uma sequência de banhos de álcool absoluto até 80% para hidratação. 9- Posteriormente segue-se a etapa conhecida como recuperação antigênica. Necessária para que se restabeleça a estrutura antigênica das proteínas estruturais, modificada pela ação do formol. Tal etapa poderá ser feita por dois métodos: Calor úmido: em solução tampão citrato de sódio pH 6,0 4M, em banho-maria, panela de pressão ou microondas por tempo determinado. Enzimático: tratamento do corte com proteinase K 10- Segue-se o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 11- Adição de anticorpo monoclonal de coelho específico, anti-receptor para estrógeno 12- Incubação por 30 minutos à 37°C e overnight na geladeira. 13- No dia seguinte etapa de lavagem com solução tampão 14- Adição de um anticorpo anti- anticorpo de coelho, marcado com estrepavidina, incubação à 37°C 15- Nova etapa de lavagem 16- Adição de complexo biotina-estreptoavidina complexada com, nova incubação à 37°C 17- Lavagem e adição de solução de Dab (Diaminobenzidina 60mg%) 18- Contra coloração com hematoxilina. 19- Observação no microscópio de núcleos corados de marrom. RESPONDA: Qual a finalidade das etapas de lavagem? Por que fazemos a recuperação antigênica? Como seria um resultado negativo?

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qual seria a resposta esperada do sistema imune?. nosso organismo for infectado por uma bactéria extracelular qualquer. esta célula passa a ostentar em sua superfície. 61 .Se em uma situação hipotética. descreva todos os prováveis eventos de uma resposta imunológica.61 EXERCÍCIO SOBRE RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO VIRAL E BACTERIANA 1. que você conhece. moléculas codificadas pelo genoma viral. inserem seu genoma no genoma de uma célula do hospedeiro e que assim. 2. através dos quais este hospedeiro reagirá à infecção viral. que possua em sua parede antígenos de natureza polissacarídica e glicoproteíca. tal como uma do gênero Streptoccocus.Sabendo-se que os vírus ao infectarem um organismo.

Contanto que diferentes tipos de células possam ser distintas por características estruturais quantitativas. E assim. pode também estimar a distribuição das populações celulares ou fases do ciclo celular. muito utilizado na classificação de leucemias. tais como botânica. Podemos obter medidas corpóreas das células como tamanho. microbiologia. fração de crescimento e propriedades cinéticas. estudos funcionais. para contagem de CD4 e CD8. a fração de proliferação tumoral e a percentagem de células encontradas nas fases S e G1. Permite o estudo da variabilidade genômica pelo perfil colorimétrico do conteúdo de DNA. A linha simples de fluxo das células passa pelo raio laser do instrumento. cada célula fornece 5 números: tamanho. 62 . vermelho e muito mais vermelho. Essas células são rotuladas com uma “etiqueta” fluorescente. Desenvolvimento: A citometria de fluxo mede características corpóreas e químicas de células ou partículas que estão em suspensão uma a uma num determinado ponto. é claro qualquer componente da célula ou função que possam ser detectada por um composto fluorescente quando examinada. análise de DNA. Embora faça medidas em uma célula de cada vez. zoologia. Um citomêtro de fluxo pode medir estes parâmetros a uma taxa de milhares de células por minuto. ou partículas em geral. ou fixas com paraformaldeído. registrar os parâmetros cinéticos do tumor a ploidia do tumor. medicina e outras. em um fluxo contínuo passando uma de cada vez. classificação estéril. análise e classificação de cromossomo. seqüencialmente. a citometria de fluxo pode ser usada para a contagem de células de diferentes tipos em uma mistura. As células devem estar em uma suspensão de células simples com o mínimo de agregação (suspensão monodispersa). As informações podem ser adquiridas na citometria de fluxo utilizando células vivas. genética.62 CITOMETRIA DE FLUXO Pela acadêmica de Farmácia Daniela Silva Moreira Introdução: A citometria de fluxo consiste em um método laboratorial para definir o tamanho. indicando fatores prognósticos e rumos terapêuticos. Esta metodologia de análise é aplicável em diversas áreas de pesquisa. morfologia e outras características de uma população de células. As aplicações incluem: análise de fenótipo. pode processar milhares de células em alguns segundos. granulosidade. forma e complexidade interna e. em frente a um feixe laser com sensores para medir fluorescência e dispersão de luz. G2 e M do ciclo celular. e intensidade de fluorescência verde. é também utilizada para identificar as sub-populações de linfócitos especifícos. É uma técnica de medição das propriedades óticas da células individuais.

estes histogramas. O CD4 é expresso na superfície de células (linfócitos) CD4+. A população alvo colorida é.alvo. e assim determinar um tratamento para a doença. conversores analógicos para digitais e computadores. Estes dados são em seguida registrados e mostrados na forma de histograma. Os citômetros de fluxo envolvem fluidos sofisticados. marcado com o corante fluorescente. a porcentagem de células positivas à citometria de fluxo. e o número de células é calculado com base na intensidade da fluorescência . em monócitos. A contagem absoluta das sub-populações de linfócitos é obtida a partir de 3 determinações sequenciais separadas: a contagem total dos glóbulos brancos do sangue total. a coloração da população de células-alvos com um corante fluorescente ( geralmente iodeto de propídio). então. CD4e CD8. passada por um pequeno tubo que cria um fluxo de células únicas. linfócitos B e os linfócitos NK. A importância clínica de se fazer citometria de fluxo para separar e contar o número de linfócitos T CD4+ e CD8+. baseada em anticorpos monoclonais marcados com substâncias fluorescentes. é devido os níveis normais se alterarem nas imunodeficiências e em certas doenças. E através desses níveis de linfócitos podemos indicar a progressão ou regressão de uma doença. . Provoca-se uma excitação desses elementos fluorescentes com uma luz “laser”e a identificação ótica é feita de maneira automatizada pelo sistema . minimizando o erro. gerados a partir da fluorescência.63 -Técnica de Citometria de Fluxo A técnica de citometria automatizada de fluxo envolve. conseguem identificar a tendência central de uma determinada população de células. dirigidas contra os marcadores de superfície CD4. A utilização dos CD3 irá discriminar os linfócitos CD8+ das NK. primeiro. A metodologia mais atual para a contagem de CD4 e CD8 e para a identificação das sub-populações de linfócitos específicos. A cada sessão. O CD8. Os linfócitos T são ainda sub-classificados em duas sub-populações funcionais: os CD4 auxiliares e os CD8 citotóxicos. Embora não identifiquem células individuais. o sistema óptico do laser detectores eletrônicos. o diferencial de glóbulos brancos. fluxo este que. 100 microlitos de sangue total é investigado com anticorpos monoclonais específicos dirigidos contra os marcadores CD3. 63 . O marcador CD3 é expresso na superfície de células “T” maduras ( CD4 e CD8). que representa o perfil da população de células. por sua vez é expresso na superfície dos linfócitos CD8+ e em algumas células NK. utiliza uma técnica sofisticada de citometria de fluxo. CD8 e CD3. A energia da luz emitida pelo laser excita o corante fluorescente contido em cada célula. mas também. como por exemplo na infecção pelo HIV. através da ligação de um anticorpo monoclonal específico para a população alvo.Separação de linfócitos por citometria de fluxo: Os linfócitos são classificados em 3 sub-populações: linfócitos T. por sua vez atravessa um raio laser.

que permite a separação e contagem de células com excelente sensibilidade diagnóstica. determinar a quantidade de DNA numa população celular. Além de ser um método aplicável em diversas áreas.html 64 .capacity. Renato CD4/CD8 → www. genética.htm -www.uronews. como .uk/axp/facs/davies/flow.it/apher/write/cytome.br/inform/ Cd4/Cd8 .do. • Bibliografia: -Di Dio.6. e assim direcionando os rumos terapêuticos.med.htm -www.com . microbiologia. usado na classificação de leucemias.hcan.icnet. Permitindo o diagnóstico e prognóstico de diversas doenças.htm -Citometria de Fluxo → www.64 Conclusão: Portanto a técnica de citometria de fluxo vem sendo muito utilizada.criesp.unipi.html -Citometria do DNA → www. também utilizado para determinar as fases do ciclo celular na fração de proliferação de tumores.org. pois é um teste simples.com.br/g 105. etc.br/hot news .org. identificação das sub-populações de linfócitos do sangue. medicina e outras.br/citometria -www.

Editora Guanabara. G. VOOS.65 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIER. J. V. 65 . D. 1989. 2ª edição. Aplicações Clínicas da Imunoeletroforese. Eletroforese. MOTA. SILVA. Ano VI. São Paulo 1999. E. A. . Imunologia Básica 2000. A. FUNDENBERG. Revista LAES. V. II:46-60. BACCHI. VASSALO. 1980.. Rio de Janeiro. J. Edição Extra. C. Imunologia Básica e Clínica.: Algumas técnicas foram obtidas a partir dos Kits reagentes. C. CALDWELL. L. H. Imunologia Básica e Aplicada. CALICH. O.Editora Guanabara. L.. F. STITES. Rio de Janeiro.. Ano IX. . D. nº 52:08-26 ALVES. Manual de Imunohistoquímica. VAZ. . WELLS.. Vol. J. H. C. Obs. W. P.. I. maio/85.V. HOXTER. 2ª ed. 4ª edição. Revista LAES. A.

1º. A prova do anel no leite. redução pelo mercapto-etanol. 3º. assinadas pelo Diretor Geral do Departamento Nacional de Produção Animal. em provas de rotina no caso de rebanhos-problema. cuja interpretação obedecerá aos quadros a seguir: Bovinos não vacinados ou vacinados com idade superior a 8 meses 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + + + 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Positiva Positiva Bovinos de 30 meses ou mais.º 23 Ministério da Agricultura e do Abastecimento PORTARIA nº 23. Art. +: Aglutinação completa. resolve: Art. 2º. do Regulamento do Serviço de Defesa Sanitária Animal. vacinados entre 3 e 8 meses de idade 1/25 1/50 (25 UI/ml) (50 UI/ml) I + + I + + + + + + + + + + Convenções: I: Aglutinação incompleta. 4º.66 Anexo CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA PORTARIA N. Art. 66 ."card test") e prova individual do anel do leite. no uso de suas atribuições. poderão ser utilizadas as provas de fixação do complemento.548. Revogar as Portarias Ministeriais números 486 e 222. será utilizada para determinação da taxa de prevalência da Brucelose em rebanhos leiteiros. A prova de sêmen-plasma-aglutinação será utilizada em reprodutores dos Centros de Inseminação Artificial e além da prova de soroaglutinação. 1º. de 22 de abril de 1958 e 5 de março de 1969.DO DIAGNÓSTICO Art. NORMAS PARA A PROFILAXIA DA BRUCELOSE ANIMAL CAPÍTULO I . respectivamente. anexas à presente Portaria. DE 20 DE JANEIRO DE 1976 Aprova as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal O MINISTRO DE ESTADO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO. O diagnóstico de rotina da Brucelose em bovinos será realizado através das provas de soroaglutinação rápida ou lenta. aprovado pelo Decreto nº 24. visando dirimir eventuais dúvidas. Como provas especiais. Art. em amostras compostas. prova do antígeno tamponado acidificado (prova do cartão . Aprovar as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal. precipitação pelo rivanol. tendo em vista o disposto no art. 2º. UI: Unidades internacionais 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Art. de 03 de julho de 1934 e considerando a necessidade de atualizar a legislação existente sobre profilaxia da Brucelose. 86.

as fêmeas vacinadas com a idade superior a 8 (oito) meses. aceitando as condições estabelecidas. poderão ser realizados exames bacteriológicos de fetos abortados. 9º. abortus. no lado direito da cara. 6º. conforme modelo do anexo 2. CAPÍTULO V . c. Art. Art. as bezerras destinadas ao Registro Genealógico. Os frascos de vacina levarão etiquetas oficiais. a. CAPÍTULO III . cabendo ao órgão local do Ministério da Agricultura o acompanhamento e controle da produção. 14. A vacina com a amostra 19 será produzida por laboratórios autorizados.DA VACINAÇÃO DE BEZERRAS Art. admitindo-se a vacina líquida até o aparelhamento dos laboratórios produtores. dos protocolos. Excluem-se da marcação. serão identificadas com ferro candente. b. observando-se as seguintes condições: a. Art. após a liberação da partida correspondente. A vacina com a amostra 19 será apresentada sob a forma liofilizada.67 Art. sêmen e outros materiais possivelmente infetados. isolar os animais reagentes. do estoque de vacina. considerando a porcentagem de incidência da doença e as condições locais. leite. destinando-se a 1ª ao proprietário. o proprietário dos animais deverá assinar termo de compromisso. em cada propriedade afetada. anexos fetais. no lado esquerdo da cara. 11. A imunização dos bovinos contra a Brucelose será levada a efeito pela vacinação de bezerras. desinfetando os locais contaminados. CAPÍTULO IV . Art. c. enterrar o feto e seus anexos. a critério da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. a 2ª ao serviço veterinário oficial e a 3ª ao emitente. recomenda-se a adoção das seguintes providências: a. somente uma vez. vacinar somente bezerras entre 3 e 8 meses de idade. Como necessário.DA VACINAÇÃO DE FÊMEAS ADULTAS Art. Nos casos em que não seja possível o sacrifício. Art. CAPÍTULO II . em 3 (três) vias. será efetuada sob a responsabilidade de médico veterinário. A aplicação da vacina da amostra 19. observandose o seguinte critério: a. Art. acompanhado do algarismo final do ano da vacinação. observando-se os seguintes critérios. no lado esquerdo da cara. aplicando rigorosos cuidados higiênicos complementares. A vacinação de fêmeas adultas com a amostra 19 poderá ser autorizada em propriedades onde estiverem ocorrendo surtos de abortos brucélicos. elaborada com a amostra 19 de Br. b. 12. 16. quando observado aborto. bem como a coleta de amostras das partidas produzidas. mediante requerimento do proprietário e autorização expressa do responsável pelo programa de combate à Brucelose na respectiva Unidade da Federação.DOS ANIMAIS REAGENTES Art. até que cessem os corrimentos vaginais. c. o Serviço de Inspeção Federal no estabelecimento onde será realizado o sacrifício deverá ser notificado com antecedência. conforme Anexo 1. quando devidamente identificada. 13.DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE VACINAS Art. b. Art. a vacinação será realizada apenas uma vez. que serão fornecidas pela unidade de controle. constantes do Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA). Cada partida de vacina produzida será oficialmente controlada. os sacrifício será realizado em matadouro sob inspeção federal e o julgamento efetuado de acordo com as disposições em vigor. salvo quando comprovadamente destinadas ao abate ou a instituições científicas. 5º. 8º. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetros) de diâmetro. com ferro candente. com vacina viva. com um V. observando-se a legislação federal específica e de acordo com as técnicas recomendadas pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. b. isolar as vacas reagentes por ocasião do parto. não poderão ser objeto de comércio. Recomenda-se o sacrifício dos bovinos com reação positiva. de forma a permitir a adoção das medidas previstas no RIISPOA. não se admitindo vacinação de machos. Os bovinos positivos ou suspeitos de Brucelose. controlada pelo órgão oficial competente. 67 . marcar as bezerras vacinadas. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetro) de diâmetro conforme Anexo 1. 15. Os animais que revelarem reação positiva serão marcados a ferro candente. 7º. emitir atestado de vacinação. 10.

utilizando-se a prova de antígeno acidificado temponado (card test). através de exame dos rebanhos em áreas de suinocultura mais expressiva. os animais são classificados somente em positivos e negativos.DO CONTROLE DE TRÂNSITO Art.DA CERTIFICAÇÃO DE PROPRIEDADE LIVRE Art. CAPÍTULO X .DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE ANTÍGENOS Art. O trânsito internacional de bovinos. quando acompanhadas de atestado de vacinação contra a Brucelose. Art. vacinadas na idade recomendada. CAPÍTULO VII . são considerados negativos os rebanhos que não apresentarem qualquer animal com aglutinação superior a 1:100 . para fins de trânsito interestadual. 17. admitindo-se o título máximo aglutinante até 1:50 para fêmeas bovinas com idade superior a 30 (trinta) meses. 27. 18. dependerá da apresentação de: a. a contar da data da realização do respectivo exame. será efetuado pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. A comercialização da vacina será objeto de fiscalização oficial e sua aquisição e aplicação sob responsabilidade de médico veterinário. 26. inclusive pelo Registro Genealógico. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta.Incompleta. lenta e do anel no leite. para obtenção do Certificado de Propriedade Livre de Brucelose. sendo neste caso.DA PROFILAXIA DA BRUCELOSE SUÍNA Art. Suínos procedentes de rebanhos negativos 1/25 (25 UI/ml) I + 1/50 (50 UI/ml) 1/100 (100 UI/ml) Interpretação Negativa Negativa 68 . devendo o mencionado produto ser fornecido somente a médicos veterinários. submetida cada partida a controle oficial. 20. A profilaxia da Brucelose suína será baseada na adoção das seguintes medidas: a. ou atestado negativo para Brucelose. CAPÍTULO IX . sendo que a interpretação das mesmas obedecerá o critério constante dos quadros a seguir: b. b. Os criadores poderão inscrever-se um esquema voluntário. positivos os animais com títulos iguais ou superiores a 1:25. O atestado de exame negativo para Brucelose será válido por 60 (sessenta) dias.68 Art. utilizando-se as provas de soroaglutinação rápida e lenta ou a prova com antígeno acidificado tamponado (prova do cartão . 28. Art. Somente será fornecido certificado de inspeção sanitária animal. c. CAPÍTULO VI . 25. quando os reprodutores apresentarem resultados negativos atestados acompanharão os animais. realizadas nos suínos com idade superior a 6 (seis) meses. 23. também não é admitida a classificação de suínos suspeitos. Art. O controle da distribuição de antígenos para diagnóstico de Brucelose. Art. Os animais da propriedade serão identificados por tatuagem ou outra forma. estando as bezerras e novilhas devidamente marcadas e identificadas. CAPÍTULO VIII . para fêmeas bovinas até 30 (trinta) meses de idade. atestado de vacinação contra a Brucelose. prova rápida. Os antígenos para diagnóstico da Brucelose. Art. obedecendo as técnicas de produção e controle recomendadas pela Organização Mundial da Saúde. As condições que uma propriedade deve preencher para ser considerada livre de Brucelose serão estabelecidas através de instrução da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. 21. A produção de antígenos para diagnóstico de Brucelose pelos demais laboratórios oficiais poderá continuar até a instalação e o funcionamento do laboratório central do Ministério da Agricultura. e. A inscrição de bovinos no Registro Genealógico e a participação dos mesmos em Exposições e Feiras Agropecuárias."card test"). 19. considera-se com infetado o rebanho no qual forem identificados um ou mais suínos com aglutinação completa na diluição de 1:100. Art. serão produzidos por um só laboratório oficial. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta. DAS EXPOSIÇÕES E FEIRAS AGROPECUÁRIAS Art. diagnósticos da situação. vacinadas entre 3 e 8 meses de idade. Art.DO REGISTRO GENEALÓGICO. Não será exigido atestado negativo para fêmeas bovinas com idade inferior a 30 (trinta) meses. 22. d. 24. 29. sêmen e produtos derivados reger-se-á pela legislação específica vigente.

quando o título não ultrapassar de 1:25. Art. c. Art. quando o título for de 1:50 ou maior. b. b. positivos retestados. considerados os antecedentes clínicos e epidemiológicos. Parágrafo único. Os casos omissos e as dúvidas suscitadas na execução e interpretação destas normas serão resolvidos pelo Diretor da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. serão precedidas provas de fixação do complemento. vigilância severa e permanente das importações de ovinos e/caprinos. 32. especialmente dos reprodutores utilizados. CAPÍTULO XII .DA BRUCELOSE OVINA E CAPRINA Art. parcialmente testados ou desconhecidos 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + 1/100 (100 UI/ml) I + Interpretação Negativa Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Art. até que sejam estabelecidos novos modelos. 33. 34. reação positiva.69 + + + + I + + + I + Negativa Negativa Negativa Positiva Suínos procedentes de rebanhos positivos. além das soroaglutinações rápida e lenta. a. A presença de suínos infetados numa criação justifica o sacrifício do rebanho. obedecerá o seguinte critério: a. 31. CAPÍTULO XI . A Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura baixará instruções complementares permanecendo em uso os atuais formulários para exames de Brucelose e vacinação. levantamento da prevalência da doença nas áreas de criação. JOSÉ PEDRO GONZALES Diretor Geral do DNPA 69 . reação suspeita. 30. A profilaxia da Brucelose ovina e caprina será baseada na adoção das seguintes medidas. Nos casos positivos e suspeitos. A interpretação dos resultados das provas sorológicas de aglutinação para ovinos e caprinos. controle rigoroso de plantéis indenes.DAS DISPOSIÇÕES GERAIS Art.

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