UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA

Imunologia
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 2006

PROFª ÂNGELA DA COSTA PEREIRA PROFª INÊS APARECIDA TOZETTI PROFº ANDRÉ LUIS SOARES DA FONSECA

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SUMÁRIO
PARTE I

Técnicas de obtenção e conservação do material usado em Imunologia......................... Diluições......................................................................................................................... Cromatografia em Coluna................................................................................................ Eletroforese de proteínas................................................................................................. Princípio Teórico da Fixação de Complemento............................................................... Reação de Imunohemólise............................................................................................... Reação de Fixação do Complemento.............................................................................. Precipitação em meio semi-sólido................................................................................... Reação de Aglutinação.................................................................................................... Reação de Aglutinação Rápida para Pesquisa de Anticorpos Anti-Brucella................. Reação de Microaglutinação Passiva - Reação de VDRL............................................. Reação de Aglutinação indireta ou passiva Fator Reumatoide...................................... Imunohematologia Sistema ABO.................................................................................. Teste de Coombs Diagnostico da D.H.R.N................................................................... Reação de Inibição de Aglutinação Passiva.....................................................................
ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)………...........................

5 6 8 12 16 17 18 19 22 23 24 25 26 28 29 30 33

Reação de Imunofluorescência.........................................................................................

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PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Resistência Inespecífica................................................................................................ Células do Sistema Imune............................................................................................ Formação de Células T e B e Órgãos Linfóides........................................................... Antígeno....................................................................................................................... Imunoglobulinas (I)...................................................................................................... Imunoglobulinas (II).................................................................................................... Sistema Complemento................................................................................................. Fagocitose.................................................................................................................... Complexo Principal de Histocompatibilidade (CHP/MHC)......................................... Células Apresentadoras e de Antígeno e Mecanismo de Apresentação........................ Linfócitos T................................................................................................................... Linfócitos B e Resposta Primária e Secundária............................................................. Genética de Imunoglobulinas........................................................................................ Interação do Sistema Imune.......................................................................................... Tolerância Imunológica................................................................................................. Reações de Hipersensibilidade..................................................................................... Transplantes.................................................................................................................. Eletroforese................................................................................................................... 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 54 55

PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS E EXERCÍCIOS
Radioimunoensaio........................................................................................................... ELISA............................................................................................................................. Western blotting.............................................................................................................. Imunohistoquímica.......................................................................................................... Exercício sobre Resposta Imune às infecções.................................................................. Citometria de Fluxo......................................................................................................... Referências Bibliográficas............................................................................................... 57 58 59 60 61 62 65

Anexo Portaria 23 para normatização do diagnóstico sorológico da Brucelose............... 66

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4 PARTE I TÉCNICAS UTILIZADAS NAS AULAS PRÁTICAS 4 .

5 . As hemácias se sedimentarão pela centrifugação e o sobrenadante se constituirá em uma amostra de soro isenta de hemólise e pronta para ser utilizada nas reações. como fonte de material do indivíduo (seja o homem ou outro animal). Este sangue deve ser passado instantaneamente para um frasco. OBSERVAÇÕES IMPORTANTES . no campo ou no próprio laboratório. sem o fibrinogênio. se tiver que mandar o soro de uma cidade para outro centro. .Antes de se passar o sangue da seringa para o frasco. veterinário ou bioquímico na coleta de material. então. . se for necessário uma estocagem por mais dias.Em geladeira. Após a coleta. O processo de coagulação do sangue começará a se estabelecer. em grande parte. sem agitação alguma. O gelo deverá ficar dentro de um saco plástico para evitar penetração de água nos vidros com soro. Se necessário armazenar o soro. . deve-se conservá-lo diluído a 1:2 em glicerina ou tratá-lo com ázida sódica a 1% para inibição do crescimento de microrganismos e estocá-lo em freezer. tendo-se para isto. da boa condição em que essa material fonte se encontre à disposição do laboratório. Embora essas reações possam também ser feitas no líquor e ainda em células linfóides deste indivíduo. deve-se seguir o preparo e estocagem do material. o que decorrerá consequentemente da competência do médico. Se você precisar enviar a amostra do campo para a cidade procure antes retirar a fração líquida a partir do coágulo e enviá-la em um outro vidro bem tampado rotulado e acondicionado em caixa de isopor com gelo.Para se obter o soro. de 30 minutos à 1 hora após a punção.Você deverá também acondicionar em gelo. seja no consultório. se sua utilização for ocorrer nas primeiras 72 horas. coleta-se a fração líquida que se separou do coágulo . OBTENÇÃO DE SORO O soro é a fração líquida do sangue. odontólogo. CONSERVAÇÃO DO SORO . este último já deve estar completamente seco e rotulado com a especificação do indivíduo. mais freqüentemente o soro. .5 TÉCNICAS DE OBTENÇÃO E CONSERVAÇÃO DO MATERIAL USADO EM IMUNOLOGIA As reações imunológicas utilizadas em auxilio diagnóstico à clínica e na pesquisa experimental tem. Para obtê-lo colhemos uma amostra de 5 a 10 ml de sangue por punção intravenosa. o sucesso da reação dependerá. o cuidado de retirar a agulha da seringa. o sangue é colhido sem qualquer anticoagulante.O sangue colocado em frasco para a retração do coágulo deve ser mantido em repouso.O laboratório se encarregará de centrifugação.Em freezer. . A seguir essa fração líquida é submetida à centrifugação de 1500 RPM durante 5 minutos para separar o soro do resto das hemácias.

Em imunologia clínica o título indica a concentração de anticorpo no soro do paciente.1 ml + 2. na quantidade requerida para conseguir uma diluição determinada. As diluições podem ser representadas como 1:10. Isto é conseguido geralmente adicionando-se a uma solução que se pretende diluir um diluente tal como água.9 ml 1 ml da diluição 1/10 + 4 ml do diluente Diluição 1/100 1 ml + 99 ml ou 0. o título é 640 unidade/ml de soro.1 ml + 0.85%. TÉCNICAS GERAL DAS DILUIÇÕES Diluição em múltiplos de 10 Diluição a 1/10 1 ml + 9 ml ou 0. 0. por exemplo. pois há 0.5 ml de NaCl a 0.9 ml Diluição a 1/25 = 1 ml + 24ml ou 0.0 ml de solução. uma solução diluição 1/10 significa que uma unidade da solução concentrada foi diluída para um volume total de 10 unidades.5:1. Por exemplo. portanto uma diluição de 0. ou cloreto de sódio a 0. etc.6 DILUIÇÕES A diluição é o ato de tornar mais fraca uma dada solução. 1/50 etc. Portanto.1 ml + 1. uma unidade em um total de 10 unidades.1 ml + 4.0 ou 1:2.1 ml + 9. As diluições não devem ser interpretadas como significando uma unidade mais 10 unidades. que não contenha nenhuma das substâncias diluídas.4 ml Diluição a 1/20 = 1 ml + 19ml ou 0. Usualmente se expressam as diluições como uma unidade da solução original sobre o total de unidades da solução final.1 ml + 1. ficamos com uma diluição do soro a 1:2.5ml de soro. ou seja.5 ml de soro em um volume total de 1. se o último tubo que demonstra reação contém um volume de 1 ml e o soro neste tubo é uma parte em um total de 640 partes. Quando colocamos.9 ml 1 ml de 1/10 + 9 ml Diluição 1/500 1 ml 1/100 + 4 ml Diluição 1 /5000 1 ml 1/1000 + 4 ml Diluição 1/10000 1 ml 1/1000 + 9 ml DILUIÇÕES VARIADAS Diluição a 1/5 = 1 ml + 4ml Diluição a 1/15 = 1 ml + 14 ml ou 0.85% em um tubo e adicionamos a esta solução 0.4 ml 6 . 1:50.9 ml Diluição a 1/ 50 1 ml + 49 ml ou 0. O título de anticorpo de um soro é a diluição mais alta de soro que reage com o antígeno. ou 1/10.

As diluições obtidas serão: 1/4. 1/64. Com base no esquema abaixo. 1/16. homogeneizar.4ml. 3)Utilizando um volume de soro de 0.Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. 1/256. Exercício de Fixação: 1) Esquematize uma diluição 1/50 de uma solução previamente diluída a 1/10. tenha ocorrido a formação de um precipitado no fundo do tubo (como descrito abaixo na legenda). homogeneizar com o auxilio de uma pipeta.Distribuir nume série de tubos 3.5ml dessa amostra e diluindo até o 8º tubo. 6)Vamos imaginar que após a interação entre o antígeno e ao anticorpo.Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2. esquematize uma diluição na razão 3 até o 5º tubo. 4)Esquematize uma diluição 1/64 de uma solução previamente diluída a 1/8. 2 . quando esses estavam presentes em concentração suficiente. 1/1024.etc. 5)Esquematize uma diluição 1/625.Ao tubo 1 adicionar 1 ml da solução corante (a ser diluída). 2) Esquematize uma diluição na razão 2 de um soro. 4 . desprezando 1 ml do último tubo. Exemplo . utilizando inicialmente apenas o volume de 0. 3 .Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3.7 DILUIÇÕES SUCESSIVAS Nesta técnica se transfere sucessivamente volume determinado de um tubo para o tubo seguinte ao qual se adicionou uma certa quantidade de diluente. partindo de uma diluição 1/5. homogeneizar.0 ml do diluente em cada tubo. determine o título dessa reação: Não ocorreu interação Ocorreu interação Ag-AC 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 7 .Diluições sucessivas na razão igual a 4: 1 . 5 .

8 CROMATOGRAFIA EM COLUNA Técnicas cromatográficas são atualmente métodos amplamente empregados para o fracionamento de proteínas e isolamento de imunoglobulinas. cheia de um gel sintético. uma amostra é depositada no ápice de um cilindro ou coluna de vidro. As características físicas das moléculas de proteínas resultam em retenção destas na matriz do gel em graus diferentes. C = as moléculas negativamente carregadas. enquanto que as moléculas neutras passam entre as partículas carregadas e são eluidas. CROMATOGRAFIA POR TROCA IONICA A cromatografia por troca iônica separa as proteínas aproveitando a diferença de suas cargas elétricas. sendo usada para o fracionamento de moléculas negativamente carregadas. permite a separação das proteínas. na mistura protéica ligam-se à coluna e são retidas. No quadro a seguir temos exemplificado a molaridade de NaCl e pH requeridos para eluir as proteínas plasmáticas humanas da DEAE-celulose. Nestas técnicas. A dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose) é uma resina positivamente carregada. A unidade funcional do gel é um grupamento carregado preso em um suporte. B = a solução contendo moléculas negativamente carregadas e outras neutras é colocada na coluna. A troca do pH do tampão que passa através da coluna afeta a carga da molécula protéica. Pelo aumento da molaridade ou diminuição gradual do pH do tampão de eluição as proteínas são eluidas em função do número crescente de grupos carregados ligados ao gel. 8 . O aumento da molaridade do tampão fornece mais íons para competir com a proteína pela ligação ao gel. e a subsequente eluição. e flui através do gel. geralmente celulose. e é usada para o fracionamento de moléculas positivamente carregadas.  A  B  C PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA A = a camada da coluna é feita de uma matriz de partículas de celulose positivamente carregadas. sob condições apropriadas. A carboximetil-celulose (CM-celulose) é uma resina carregada negativamente.

albumina. Exemplificamos abaixo a separação de aminoácidos com a resina de troca iônica sob condições ácidas.0 transferrina. Utilizando-se de um tampão.8 IgG 0. IgA 0. os aminoácidos tornam-se carregados negativamente. refletindo as diferenças nas constantes de dissolução dos grupos ionizáveis da resina.045 7.0 α 2 globulina.5 SO3.9 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Molaridade de NaCl PH Proteínas eluidas -----------------------------------------------------------------------------------------------------------0. Os aminoácidos com carga positiva em um meio fortemente ácido ocuparão as posições do sódio de uma resina de troca catiônica.5 albumina. fibrinogênio 0.025 7.050 7. haptoglobina -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A cromatografia em DEAE . e serão eluidos da coluna trocando-se novamente os íons sódio.Na+ OH SO3.5 o aminoácido A também é eluido. ligando-se à carga negativa da resina. no pH 2. α 2 globulina. OH pH 2. No pH 3. os aminoácidos são eluidos de forma diferente.5 α2 globulina.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH SO3.0 SO3.0 (ambos aminoácidos A e B são adsorvidos).100 6.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A ELUÍDO pH 3.celulose é uma técnica excelente para o isolamento de IgG. Já no pH 4.5 apenas o aminoácido B é eluido.5 9 .Na+ SO3 Na + H3N + OH COOH AMINOÁCIDO B ELUÍDO pH 4. Aumentando-se o pH do tampão. O aminoácido A continua adsorvido à coluna. β globulina.080 6.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH H3N+ COOH AMINOÁCIDO B SO3. a qual pode ser obtida quase livre de todas as outras proteínas séricas. de modo que haja um aumento progressivo do pH. Os aminoácidos com a carga positiva trocam de posição com os cátions sódio da resina. β lipoproteína 0.

Assim.O círculo aberto (O) representa as partículas de dextran polimerizado sobre as quais um a mistura de moléculas protéicas pequenas (. penetram no seu interior e ai são retidas. enquanto as menores são retidas. A IgM pode ser facilmente separada de outras imonoglobulinas séricas por gel filtração. dependendo primariamente do tamanho e são separadas por um simples processo de peneiração.) é depositada. B . PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A .As moléculas maiores são eluidas. A gel filtração é largamente usada também para separar as cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas ou para isolar proteínas de Bence-Jones (cadeias leves) puras de urina de pacientes com mieloma múltiplo. não podendo penetrar nestes. como dextran (Sephadex) .10 CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A gel filtração separa as moléculas de acordo com o seu tamanho. O solvente e as moléculas menores que os canais.. C . Por isso. A fase estacionária é mais comumente constituída de partículas hidrófilas tipo gel.As moléculas entram e passam através da coluna em proporções diferentes. cujos diâmetros permitem a passagem ou a retenção de moléculas de diferentes tamanhos. As partículas são porosas contendo microcanais.) e grandes (. as moléculas protéicas mais volumosas que os poros das partículas. as moléculas aprecem no eluente de coluna em ordem decrescente de tamanho. A B C 10 . passam através do gel na fase liquida fora das partículas e são eluidas primeiro.

Uma técnica semelhante pode ser usada para purificar um antígeno. aqueles anticorpos especificos contra o antígeno são retidos pela ligação aos antígenos fixados ao gel. Estes anticorpos específicos podem ser recuperados pela lavagem da coluna com um tampão ácido. acoplando-se um anticorpo a uma matriz inerte. ou as moléculas de antígeno são insolubilizadas pela ligação cruzada com glutaraldeído. 11 . Quando a mistura de anticorpos de diferentes especificações é passada através da coluna. A ligação antígeno-anticorpo é uma das reações que podem ser aplicadas á cromatografia por afinidade. o qual desfaz as ligações antígeno-anticorpo.11 CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE A cromatografia por afinidade usa interações biológicas especificas reversível entre o material do gel e a substância a ser isolada. Um antígeno é acoplado à uma matriz insolúvel tal como a Sepharose.

baseando-se na diferença de velocidade de migração das diversas proteínas.2.globulina 12 .8 a 9. estas possuem grupos amino e carboxílicos livres e devido a isso estão carregadas positiva ou negativamente em solução aquosa na dependência do pH do meio. a eletroforese é executada com um tampão de pH fora do espectro isoelétrico. Quando a soma das cargas positivas excede o número total de cargas negativas. se for negativa. sua migração será para o pólo negativo ou cátodo. em uma dada proteína. As proteínas que tem pontos isoelétricos mais ácidos.6. O espectro das proteínas séricas varia entre pH 4. No caso das proteínas.12 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS Princípio: Chama-se eletroforese. se a carga da superfície da partícula for positiva. elas podem separar-se em cinco grupos principais (por meio da eletroforese convencional de zona).5-8 β globulina β lipoproteína pH 6.5 a pH 6. Toda proteína tem seu “ponto isoelétrico”. Em meio alcalino se carregam eletronegativamente e quando submetidas a uma corrente elétrica migram para o ânodo com uma velocidade que guarda relação com o número de suas cargas. em seguida a globulina Alfa (α). pH 5.0. Assim.3 γ .1. Em circunstâncias opostas. por outro lado.globulina Na maioria das vezes. as partículas carregadas avançam para o eletrodo de carga contrária. o que é determinado pelo pH do meio onde a proteína é isoelétrica. a molécula tem uma carga positiva. Em geral as proteínas séricas são separadas em um pH que varia de 8. Quando as cargas positivas e negativas se neutralizam.5. Esquema isoelétrico das proteínas séricas pH 4.7 .4 . Quanto mais carregada a partícula. globulina Alfa (α). apresentam ponto isoelétrico acima deste espectro. é possível a separação dos componentes protéicos do fluidos biológicos. ao fenômeno da migração de partículas eletricamente carregadas sob a influência de um solvente condutor (tampão). estão altamente carregados e migram com maior rapidez. Isto faz com que todas as proteínas se carreguem negativamente e migrem na mesma direção. Algumas proteínas de localização intracelular. Assim.4 Albumina α 1 . a proteína não tem carga e se denomina “isoelétrica”. migrará para o positivo ou ânodo. Conforme a velocidade de migração. resulta uma carga negativa. beta(β) globulina e gama(γ) globulina. com maior velocidade se distanciará dos componentes menos carregados de maneira que as partículas com pouca ou nenhuma carga permanecem relativamente estacionadas. a saber: albumina(fração mais rápida).globulina α 2 .

Devem ser feitos testes quantitativos específicos. ocasionalmente. Na eletroforese do soro. tal como ocorre na hipogamaglobulinemia. a maioria das imunoglobulinas migra para a zona designada γ .globulinas e. para a identificação da proteína em questão. Picos nestas regiões são também compatíveis com distúrbios paraproteinemicos que envolvem imunoglobulinas. Nestes distúrbios ocorre geralmente um pico protéico restrito eletroforeticamente na região de γ . região das α2globulinas.globulinas. Uma diminuição na concentração de γ . mas também são encontradas quantidades significativas na zona de β . 13 .13 APLICAÇÕES NA IMUNOLOGIA A eletroforese de zona é extremamente valiosa para o diagnóstico dos distúrbios paraprotéicos humanos tais como mieloma múltiplo e microglobulina de Waldenstron. também pode ser detectada com esta técnica. bioquímicos ou imunológicos.globulinas. Cadeias leves livres são prontamente detectáveis na urina quando presentes em quantidades aumentadas. como na proteinuria de Bence Jones do mieloma.globulinas do eletroforetograma.

O. Preencher cada um dos compartimentos da cuba de eletroforese com tampão de corrida. Fazer um tubo com um pedaço da fita sem proteína (branco) para zerar o aparelho.) 13.. contendo 2 ml de solução de eluição. Tampa a cuba e ligar.Para a determinação quantitativa das frações protéicas. com a face absorvente voltada para cima (Obs. 8. 7. Método 1. então. Retirar as fitas do tampão e secá-las com papel de filtro. Repetir o processo até as partes sem proteína na fita ficarem brancas. o qual deverá estar situado na posição inferior a direita do operador).Ler em espectrofotometro usando um comprimento de onda de 520nm. papel de filtro. Agitar até a fita dissolver-se completamente.0 cm do polo negativo. obtendo assim a densidade óptica da amostra (D. 2. deixar correndo a amostra por 35 minutos. Fazer. cortar as frações coradas e introduzí-las em tubos de ensaio respectivamente marcados.04M) • Corante Ponceau`s • Solução descorante (Metanol a 50%) • Solução de eluição (ácido acético a 80%) • Fonte de continua para 200 volts • Cuba de eletroforese • Espectrofotometro Pipetas. 9.Retirar as fitas do banho corante e transferir para um recipiente com a solução descorante. cálculos conforme modelo da apostila (pag. 12. Fazer a dosagem de proteínas totais da amostra de soro. 6. essa é a face opaca. 11.6 forca iônica 0. ajustando para 200 Volts. As tiras tem um angulo picotado. Terminada a corrida. tubos de ensaio e etc. microaplicador. Colocar as fitas de cellogel imersas em tampão de corrida por pelo menos 10 minutos. 5. Colocá-las esticadas sobre o suporte da cuba. uma leve aplicação do soro a cerca de 2.036 (Veronal sódico 0. Só uma superfície da fita é penetrável. 10. agitar para propiciar a descoloração da fita e transferir para outro banho descorante. 4. Lavar o microaplicador com água destilada e colocá-lo em contato com a amostra de soro. desligar a cuba. 3. retirar a fita e colocá-la em banho corante por 10 minutos.14 TÉCNICA: ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE CELULOSE Material necessário • Fitas de acetato de celulose (CellogelR) • Tampão de corrida pH 8.15) 14 . visível depois de seca . Observar para que ambas as extremidades da fita estejam em contato com a solução tampão e o picote da fita na canaleta positiva.Fazer os.

553 0..globulina α2.10 = 467... β -globulina..1 a 0..........72 0...6 a 5.6 g/100 ml 15 ..3 10.0 g/100 ml 0..0 7........... Somam-se as densidades ópticas de cada fração e para obter-se o valor relativo em % divide-se a D..061 0.........80% 0....O.....034 0......6 a 1........085 0.. γ-globulina...28 0.......... α2-globulina......0 g/100 ml 0...9 100........6 a 1...........91 7...globulina β ..... 0......x X = 0.10 g% Valor relativo (%) 0..553---------------..52 0..O....... 3...1 12..8 4.... para verificar o valor absoluto (g/100ml).....67g/100ml Valores normais : Albumina... de cada fração pela soma-se das D. e multiplica-se por 100......4 g/100 ml 0........841 Valor absoluto (g/100ml) 65..2 g/100 ml 0..... FRAÇÕES Albumina α1.......... Depois.................841 EXEMPLO Valor relativo (%) 65.........80 x 7........108 0.. divide-se por 100..........globulina γ.......15 CÁLCULOS Faz-se a leitura da densidade óptica de cada tubo..globulina total D...67 0....841----------------100% 0..............18 : 100 = 4..553 x 100 = 65..... α1-globulina.....5 a 1....O.......0 Valor absoluto g/100ml 4........10 Proteína total = 7................

Quando o soro da cobaia era aquecido. a hemoglobina difundese no líquido. Logo que se misturam os reagentes os eritrócitos formam uma suspensão vermelha opaca. o complemento será ligado ou fixado ao complexo antígenoanticorpo específico e nenhum complemento será deixado livre. formando sedimento vermelho. sem sedimento visível. O processo de hemólise. não ocorrerá hemólise. antígeno da superfície bacterianaAnticorpo-complemento in vivo ou in vitro poderá haver bacteriólise. imunes ou não (complemento). pois não haverá complemento livre para se complexar aos eritrócitos sensibilizados. Em nenhum dos casos haverá mudanças visíveis para relevar o que aconteceu. 16 . 2.Se o soro do doente não contiver o anticorpo especifico. e outra sensível ao calor (termolábil). Pfeifer mostrou que. Estudos posteriormente demonstraram que a atividade bacteriolítica se devia a duas substâncias encontradas no soro: uma resistente ao calor. Se não ocorre a hemólise. Outras substâncias. presente no soro de quase todos os animais de sangue quente. e é portanto necessário adicionar um indicador. seu soro tiver o anticorpo correspondente. mas não haverá bacteriólise. mesmo existindo complemento em abundância. e a adição subsequente do complemento acarretará rapidamente a bacteriólise. ocorrerá a união do anticorpo com a bactéria. sobretudo os glóbulos vermelhos. o sistema hemolítico se completa e ocorrerá hemólise. Se.16 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO I . seu soro possuía forte atividade bacteriolítica contra esse microorganismo. Se houver complemento livre. encontrada somente no sangue de animal imune (anticorpo). Quando se mistura o soro desconhecido com um antígeno específico e o complemento. Quando ocorrer a união desses três elementos. por causa da liberação de hemoglobina das hemácias lisadas. é facilmente visível a olho nu. além das bactérias.Se o paciente tiver a infecção em questão e se. Se o anticorpo estiver ausente.Introdução: Em 1894. por conseguinte. ao contrário. Em tal caso. diz-se que a bactéria está sensibilizada. é o ANTÍGENO. Isto se consegue adicionando-se hemácias de carneiro sensibilizadas. essa atividade desaparecia. acontecerá uma das duas hipóteses: 1. Antígenos solúveis também reagem com anticorpos específicos fixando o complemento. o complemento estiver ausente. o complemento tiver sido ligado ao complexo Ag-Ac. o que serve para diagnosticar a infecção correspondente. num tubo de ensaio. quando cobaias restabelecidas de cólera eram infectadas com o vibrião colérico. que toma coloração vermelha transparente. podem agir como antígenos. portanto não as lisará. quando se processa in vitro. A bactéria que induziu a imunidade e contra a qual atividade era dirigida. Quando ocorre hemólise. os glóbulos intactos depositam-se lentamente no fundo. o complemento permanecerá livre no líquido. com sobrenadante claro e incolor. que mostrará o complemento que ainda permanece livre. cuja destruição se denomina hemólise. Se. este não poderá se fixar as bactérias e. A aplicação da reação de fixação do complemento permite determinar a presença do anticorpo especifico no soro do paciente. ao contrário.

1 ml de suspensão de hemácias nos 3 tubos 3 .Pipetar 0.5 ml de complemento nos tubos 1 e 3 5 .Pipetar 0. este animal produz anticorpos anti-hemácias de carneiro.8 ml no tubo 1 1.1 ml do soro hemolítico nos tubos 1 e 2 4 .3 tubos de ensaio c .1 d . Os anticorpos encontrados no soro do coelho podem ser demonstrados pela reação de imunohemólise entre outras.Soro hemolítico (hemolisina) f .Solução tampão com veronal Técnica: 1 .Estante de metal b . A reação de imune hemólise se verifica nas seguintes condições: Fresco + Suspensão de hemácias de carneiro + incubação a 37º C hemólise + Suspensão de hemácias de ausência de carneiro + incubação a 37ºC hemólise + Suspensão de hemácias de carneiro + Soro fresco de hemólise cobaia (complemento) + Incubação a 37ºC Soro de coelho imunizado contra hemácias de carneiro Inativado a 56ºC/30` Inativado a 56ºC/30` Nesta aula prática. por 15 minutos.Pipetar 0. 17 .Suspensão de hemácias de carneiro a 5% e .17 REAÇÃO IMUNOHEMÓLISE Quando injetamos hemácias de carneiro num coelho.9 ml no tubo 3 6 .Pipetar solução fisiológica tamponada: (os respectivos valores em cada tubo) 0. com o objetivo de demonstrar que nesta reação participam três elementos distintos: ANTÍGENO = ANTICORPO = COMPLEMENTO Material: a .Incubar em banho-maria a 37ºC.Complemento g . os alunos executarão a reação de imuno-hemólise.Pipetas de 1 ml graduadas em 0.Numerar os tubos 2 .3 ml no tubo 2 0.

Pipetas de 1 ml em 0.2ml 3(testemunho do ag) 0.1 Técnica: 1.Estante de metal g .5 ml 0.2 ml do sistema hemolítico (mistura de suspensão de hemácias + soro hemolitico a todos os tubos).18 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO Material: a .Agitar a estante e levá-la a incubação em geladeira 2-4ºC.No dia seguinte. acrescentar 0.5 ml 2(controle do soro) 0. 3 .3 ml 0. por 18 horas e.6 ml 0.Antígeno b . QUADRO PARA ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS: RESULTADO Reação Soro Controle do soro Testemunho do Ag Testemunho do C INTERPRETAÇÃO 18 .Tampão e .5 ml 05 ml 0. a 37ºC por 15 minutos.2 ml 0.Soros (já inativados ) d .1 ml 0.5 ml 4(testemunho do C`) - Complemento DH 50% 0. a seguir. 4 .5 ml tampão 0.Incubar em banho-maria a 37ºC durante 30 minutos. Pipetar os reagentes segundo o quadro abaixo: TUBOS Soro do Antígeno paciente (dose ótima) 1(reação) 0.Tubos de 12 x 75 mm h .8 ml 2 .Sistema hemolitico (hemácias de carneiro + hemolisina ) f .Complemento c .

b) Lâminas de microscopia. MATERIAL a) Solução de agar a 1% em solução fisiológica.5 pode ocorrer precipitação não específica e o pH acima de 8. Os reagentes difundem-se radialmente formando uma linha visível resultante da precipitação e somente na região onde os dois reagentes se encontram nas proporções adequadas. c) Pipetas graduadas de 5 ml. sendo que. em que em determinado ponto de ótima proporção dos reagentes ou próximos deste. A temperatura deve ser constante e entre a 4ºC e 37ºC . bem como na paracoccidioidomicose. Na temperatura mais baixa.5 a 8. forca iônica do tampão. O complexo antígeno .anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arcos de precipitação. e) Solução de antígeno de Paracoccidioide brasiliensis f) Solução de anticorpos antiantígeno de Paracoccidioidis brasiliensis (soro controle) g)Soro humano para o teste h) Furador i) Câmara úmida 19 . A reação usualmente ocorre entre 16 a 24 horas. como por exemplo. demonstrando independência imunológica total entre os reagentes pesquisados. A forca iônica maior ou menor do que a do tampão recomendado. Na imunodifusão radial dupla. tais arcos podem fundir-se dando identidade total ou parcial (esporão) ou intercruzam-se. na hepatite crônica ativa. Geralmente usam-se lâminas de microscopia revestidas com camada de gel de ágar a 1% em solução salina ou tamponada. os reagentes são colocados em orifícios separados e opostos feitos no gel. Outra grande importância é a de se poder saber se duas substâncias são imunológicamentes idênticas. O pH deve ser entre 6. temperatura. ocorre a reação de precipitação.8 pode impedir a reação e dissociar complexos de Ag .8 pois em pH abaixo de 6. A imunodifusão é usada também com finalidade diagnóstica. a reação ocorre mais lentamente e a temperatura acima de 37ºC pode resultar na formação das linhas de precipitação. poderá interferir na solubilidade das proteínas. parcialmente idênticas ou independentes. mas deve se esperar 40 a 48 horas para o resultado final. na anemia infecciosa eqüina.Ac . tempo e principalmente as concentrações relativas de antígenos e anticorpo. d) Tubos capilares. A principal aplicação desta técnica tem sido na identificação de antígenos e anticorpos em misturas desconhecidas (como os fluídos biológicos).19 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO SEMI-SÓLIDO Imunodifusão radial dupla (reacão de Ouchterlony) Esta técnica pode ser definida como a difusão de antígenos e anticorpos homólogos um em direção ao outro num meio gelificado. Fatores que interferem na reação de precipitação são: pH.

ou de uma cuba apropriada. 2 .Deixar dentro da placa de Petri. 4 .Fazer a leitura após 24 ou 48 horas. em câmara úmida. os antígenos e anticorpos de acordo com o esquema.Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 3 . colocando. 5 .20 TÉCNICA: 1 . algodão úmido para manter a umidade. OA O1 O2 O3 OB O4 A – Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 1 .Aplicar.soro controle positivo 4 . 3 ml de ágar fundido em solução fisiológica. ao lado.Aplicar. Esperar esfriar. Levar à geladeira.soro do paciente 1 2 – soro controle positivo B . 3.Colocar a lâmina com o gel sobre o modelo (gabarito) e fazer os orifícios nos pontos indicados.soro do paciente 2 20 . utilizando um furador. por 5 minutos. de maneira uniforme sobre a lâmina. usando um capilar para cada amostra.

através de linhas. esquematize.21 Após a leitura do resultado e interpretação faça o seguinte exercício para sua auto-avaliação: a) Utilizando os reagentes de acordo com a legenda abaixo. o resultado esperado na seguinte reação de imunodifusão radial dupla: B E A D C LEGENDA: A= Solução de anti-IgA das secreções B=Saliva humana C=Solução de anti-IgM D= Solução de cadeias pesadas α E=Solução de IgA sérica b) Através de seus conhecimentos sobre Imunoglobulinas justifique os resultados nos encontros das linhas: Entre B e C: ___________________________________________ Entre C e D: ___________________________________________ Entre D e E: ___________________________________________ Entre E e B: ____________________________________________ 21 .

Reação de Wiel-Felix .Reação de inibição de hemaglutinação .para revelar anticorpos incompletos em várias doenças. Exemplo de reações de aglutinação empregadas com finalidade de diagnóstico: 1 .Reação de Coombs .para diagnóstico de várias viroses.para monucleose. 5 . Os testes são feitos em pequenos tubos de ensaio em volumes de 0. 6 .Reação de crio-hemaglutininas para pneumonia atípica primária.Rose . Shigelas e colipatogênicos. 7 . Testes para detectar anticorpos especificos são realizados pela titulação de soros imunes em diluições seriadas (2x) na presença de uma quantidade constante de antígeno.Reação de hemaglutinação indireta para toxoplasmose. 2 .0.Classificação de pneumococos e estreptococos. Os testes de aglutinação indireta podem ser também realizados em tubos ou placas de microaglutinação.Reação de aglutinação para lepstospirose.22 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno faz parte da superfície de eritrócitos. Neutralizada esta força repulsiva. 4 . 3 .para diagnóstico da artrite reumatóide. 3 .Reação de aglutinação direta para toxoplasmose.Reação de aglutinação para listeriose.Determinação dos grupos sangüíneos e fator Rh. uma vez que os eletrólitos vão neutralizar a carga elétrica da partícula que em pH neutro possuem carga livre ou resultante negativa . As reações de aglutinação requerem a presença de eletrólitos. o inverso da maior diluição do soro na qual ocorre aglutinação. Em anti-soros com títulos aglutinantes altos.para febre tifóide. as células se aproximam permitindo a formação de pontes moleculares. formando um agregado nítido.Classificação de Salmonellas.Davidson . Muitos antígenos se acoplam espontaneamente com eritrócitos e formam reagentes estáveis para a detecção de anticorpos.Reação de aglutinação rápida e aglutinação lenta para brucelose. Após poucas horas de incubação. Os resultados são expressos geralmente em títulos isto é. um fenômeno de pro-zona pode obscurecer os resultados. Na aglutinação indireta faz-se adsorsão passiva ou acoplamento químico de antígenos solúveis a eritrócitos ou outras partículas inertes.5 ml ou em placas de microaglutinação com quantidade bem menores de reagentes. 2 .Reação de aglutinação de Paul-Bunnell . 12 . 10 .Reação de Waaller . Por causa da variabilidade intrínseca no sistema de teste.Reação de Widal . etc. 9 . bactérias e uma variedade de espécies microbianas podem ser diretamente aglutinadas por anticorpos séricos. 22 . Os anticorpos adicionais a estas suspensões combinam com o antígeno localizado na superfície das partículas unindo-as entre si.para riquetsiose. um título precisa diferir em pelo menos duas diluições (dois tubos) para ser diferente de qualquer titulo dado. No teste de aglutinação direta eritrócitos. 8 . resultando em maior sensibilidade. para doença de chagas. OUTRAS APLICAÇÕES DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO 1 .2 . 11 . O fenômeno de pro-zona produz reações de aglutinação falsamente negativas em concentrações altas de anticorpos. bactérias ou mesmo de partículas inertes (ex: látex) que foram recobertas por um antígeno. a aglutinação está completa e as partículas são examinadas diretamente ou microscopicamente para evidência dos grumos.

05 ml do soro teste depositando separadamente cada fração do material sobre uma série de quadrados numa placa de vidro específica para esta reação (ou pipetar individualmente cada uma das quantidades indicadas colocando-as em lâminas individuais de microscopia.5% e corada com verde brilhante e cristal violeta. 04 . iniciando com a diluição contendo 0. Por isso. 0.08.01 e 0. pipetar 0.04. previamente identificadas com a respectiva diluição). nas reações em que se visualizam a pró-zona.Agitar a placa com suaves movimentos circulares de 15 a 20 vezes por 3 minutos.Com uma pipeta específica para reação aglutinação direta para o diagnóstico da brucelose (Pipeta de Bang) ou com pipeta de 0.(Cuidado para não encostar a pipeta com antígeno na fração de soro para não haver contaminação do antígeno).08 ml de soro (ou seja. ao contrário do que comumente ocorre. O antígeno utilizado nessa reação foi preparado de acordo com técnica internacional recomendada pelo Ministério da Agricultura. que é um evento em que o excesso de anticorpos presentes no soro teste faz com que a equivalência da interação Ag/Ac somente ocorra após altas diluições desse soro.Fazer a leitura observando a aglutinação com uma fonte de luz apropriada. aglutinação direta). 03 .(Vide anexa no fim da apostila). ou seja. no sentido da maior para a menor diluição). o inverso da maior diluição onde se identificou a reação (no caso. 1:100 .Misturar cada composição soro-antígeno com um bastão. 23 .05 ml até a diluição contendo 0.23 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM PLACA PARA PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-BRUCELA Objetivo: Demonstração da Aglutinação Direta da suspensão bacteriana de Brucella abortus por anticorpos anti-brucela presentes no soro.Agitar o frasco do antígeno padronizado e colocar uma gota do antígeno de Brucela (30 µl) ao lado da fração de soro. TÉCNICA 01 . 0. o Conselho Federal de Medicina Veterinária editou portaria específica que orienta a realização e a interpretação das reações sorológicas para o diagnóstico da Brucelose Animal. 1: 400. 02 . 0. as primeiras diluições de soro mostram-se negativas e as últimas (maiores) diluições apresentam reação positiva. 1:50 .2 ml. As diluições finais serão aproximadamente 1:25 . Atenção: Em soros apresentando títulos altos de anticorpos pode ocorrer o fenômeno de pró-zona. NOTA: O resultado encontrado é expresso por um título. em salina fenicada a 8. Reação negativa (-): não aglutinação. 05 . 1:200 . estando em uma concentração celular de 11%.02. Reação positiva (+): presença de aglutinação. Em face da importância da Brucelose com zoonose.

Para tornar-se imunogênica a cardiolipina deve se ligar a uma proteína carreadora.R.24 REAÇÃO DE MICROAGLUTINAÇÃO PASSIVA .Leitura: A leitura deve ser feita imediatamente após a agitação observando ao microscópio de acordo com a intensidade da reação. inativados a 56ºC durante 30 minutos. seja em testes de aglutinação passiva. nos quais o hapteno é adsorvido a superfície de cristais de colesterol (reação de floculação de Kline.D. INTERPRETAÇÃO . que pode ser extraído em alto grau de pureza do coração de bovino e é denominado cardiolipina.05 ml ) dos diferentes soros. somente se liga a anticorpos. 3 . 24 . a 180 r.Pipetas Pasteur. Infecções pelo Treponema pallidum levam à liberação nos fluídos orgânicos de cardiolipina.soro fracamente reativo. isto é. . TÉCNICA: 01 .Partículas finamente dispersas . 2 .Acrescentar a cada soro uma gota de suspensão antigênica com uma seringa de 1. entretanto.L.Seringa de 1 ml sem o bisel (ponta). etc). A cardiolipina.0 ml (agulha sem bisel). Trata-se de um fosfolipídio. MATERIAL NECESSÁRIO: 1 . no agitador próprio. reforçada pela adição de doses adequadas de colesterol e de lecitina constitui excelente antígeno para a detecção da reagina sifilítica. 02 .m. 5 .p. mas não estimula sua produção.Suspensão do antígeno. 04 . através de uma técnica de microaglutinação passiva feita em placa escavada. é um hapteno.Partículas agrupadas em pequenos grumos . V.Agitar. durante 04 minutos.Lâminas escavadas.Em cada escavação da placa colocar 01 gota (0. a qual faz parte normalmente da membrana mitocondrial.soro fortemente reativo.não reativo . Cardiolipina sozinha. Anticorpos para antígenos cardiolipínicos são conhecidos como anticorpos de Wasserman ou reagínicos. movimentos rotatórios da placa sobre a superfície da mesa com amplitude de mais ou menos 03 cm. seja em testes de fixação do complemento (reação de Wasserman).. e à produção de anticorpos.Soros a testar.REAÇÃO DE VDRL (VENERAL DISEASES RESEARCH LABORATORY) A reação do VDRL é usada para o diagnóstico sorológico da sífilis. 4 . soros positivo e negativo. 03 .Partículas agrupadas em grandes grumos . Pacientes com sífilis desenvolvem uma resposta de anticorpos contra um hapteno ubiquitário que existe nos tecidos dos mamíferos. ( a agitação pode ser manual).

1 gota da diluição 1/20 do soro a testar.Colocar no círculo à esquerda 01 (uma) gota do soro controle positivo e no círculo a direita 01 ( uma) gota do soro controle negativo. Este antígeno reage imunológicamente com o anticorpo (fator reumatóide) presentes no soro.Colocar no círculo central da placa fornecida. como grumos visíveis 25 .25 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA: Teste para a pesquisa do Fator Reumatóide Látex Princípio: O fator reumatóide é uma macroglobulina (IgM) que se encontra presente no soro de 85 a 90% dos pacientes com Artrite Reumatóide e em 3 a 5% dos indivíduos normais. se encontra adsorvido a superfície de um suporte inerte de látex de poliestireno. e observar macroscopicamente o resultado da reação por tempo não maior que 2 minutos.Adicionar uma gota do reativo látex globulina. onde o antígeno. 02 . 06 . POSITIVO: Aglutinação nítida que se apresenta macroscópicamente dentro de 2 minutos. RESULTADO: NEGATIVO: Suspensão homogênea. pipetando 0. TÉCNICA: 01 .Agitar suavemente a placa com movimentos circulares.05 ml do soro teste no tubo contendo o tampão e homogeneizar bem.95 ml do tampão glicina e a seguir 0.Preparar uma diluição a 1/20 do soro. 04 . Usar um para cada círculo. a cada um dos círculos. O fator reumatóide é considerado um anticorpo contra a IgG. resultando numa aglutinação visível macroscópicamente. IgG humana desnaturada pelo calor. 03 .Misturar e distribuir o conteúdo de cada círculo por toda sua área com um estilete. Pode ser detectado por uma reação de aglutinação passiva ou indireta. 05 . previamente agitado.

b) Soro anti A. c) Soro anti B. os indivíduos da espécie humana podem ser divididos em 04 grupos: A. quer pelo plasma.26 IMUNO-HEMATOLOGIA 1) Grupos sangüíneos . A leitura é feita por visualização da aglutinação: 26 . Landsteiner (1990) verificou que era regra todo indivíduo apresentar no seu plasma aglutininas contra os aglutinógenos que lhes eram estranhos: -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Aglutinógenos nas Aglutininas no hemácias Plasma -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A A Anti B B B Anti A O Anti A e Anti B AB A e B -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Isso torna possível a tipagem do sangue de um indivíduo dentro do sistema ABO quer pelas hemácias. 1 .TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTÍGENO NAS HEMÁCIAS. AB e O.Sistema ABO De acordo com a existência ou não dos aglutinógenos A e/ou B. TÉCNICA: Seguir o esquema que se segue 1 gota: sangue 1 gota: sangue Grupos - soro anti A soro anti B Misturar com o bordo de uma lâmina limpa. e) Lâminas de microscopia. nas hemácias.B. (REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA) MATERIAL: a) Sangue total. d) Pipetas Pasteur.

27 - 2 . mas na prática transfusional apenas o antígeno D (Rh) é pesquisado por ser mais imunogênico.(negativo). O sistema Rh possui ainda outros antígenos. Sangue: 1 gota de sangue Soro: anti -D 27 . b) Hemácias A. d) Pipetas de Pasteur. MATERIAL: a) Soro desconhecido. TECNICA: A tipagem comumente é feita em lâmina usando-se como reagente soro anti . d) Pipetas Pasteur. MATERIAL: a) Sangue total. Seguir o esquema 1 gota: soro 1 gota: soro 1 gota hemácia A 1 gota de hemácia B .D (Rh) observando-se a aglutinação ou não das hemácias a temperatura ambiente. b) Soro anti D (Rh).TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTICORPOS NO SORO. e) Lâminas.Misturar com o bordo de uma lâmina limpa e efetuar a leitura pela presença ou não de aglutinação. c) Hemácias B. c) Lâminas.SISTEMA Rh De acordo com a existência ou não do antígeno D(Rh) nas hemácias os indivíduos da espécie humana são Rh+ (positivo) ou Rh . GRUPO SANGÜÍNEO .

Agitar suavemente para misturar e centrifugar imediatamente ( 01 minuto a 1000 r. para misturar. em um 2º tubo colocar uma gota de soro controle positivo (marcar (+) no tubo). e incubar a 37ºC durante 15 minutos. TÉCNICA PARA O TESTE INDIRETO 01 .R. Consiste na lavagem de hemácias já sensibilizadas.Agitar. 02 . Em recém-nascido de mães sensibilizadas. também denominada prova de antiglobulina humana. 02 gotas de soro de Coombs. 05 . decantar o sobrenadante por inversão do tubo. O teste de Coombs direto é feito para diagnóstico da D. A lavagem é feita para evitar a reação das proteínas livres. 03 .Preparar uma suspensão a 5% de hemácias O-Rh positivas. 04 .Retirar o tubo do banho-maria e completar até 01 cm da borda com solução fisiológica ou PBS FOSFATO e centrifugar a 3000 rpm ( + ou .Adicionar 02 gotas de albumina bovina a 22% em cada tubo. em um 3º tubo colocar uma gota de soro controle negativo (marcar (-) no tubo). consiste no emprego do soro antigamaglobulina humana (soro de Coombs) para promover a aglutinação de hemácias previamente incubadas com anticorpos incompletos.p. INTERPRETAÇÃO 10 .28 TESTE DE COOMBS A prova de Coombs.Aglutinação presente: Teste positivo Aglutinação ausente: Teste negativo 28 . ressuspender o sedimento de hemácias e repetir esta operação por mais 02 vezes.N. 07 .Após a última lavagem.m). Teste de Coombs indireto é utilizado para o diagnóstico de anticorpos incompletos no soro de qualquer pessoa possivelmente sensibilizada por antígenos eritrocitários do sistema Rh (sensibilização pós-transfusional ou no decurso de gestação).Adicionar ao sedimento de hemácias. de crianças e adição de soro de Coombs. 09 .03 minutos).Colocar em um tubo de ensaio uma gota do soro a ser testado (marcar T no tubo). 06 .A cada um dos tubos acrescentar uma gota de suspensão de hemácias O Rh (+) 5%. decantar completamente o sobrenadante.H. invertendo o tubo e enxugando a borda do mesmo com papel absorvente. 08 .

10) Ler a reação após 2 horas. Cada poço da placa de microaglutinação e reconhecido também por “well”. B. onde não sofra vibrações. 7) Agitar levemente a placa. do 1º ao 11º poço.29 MÉTODO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA As variações sobre os métodos de aglutinação surgiram ampliando as possibilidades de diagnóstico e pesquisa de anticorpos e de antígenos. 8) Colocar 50µl de hemácia sensibilizada com o antígeno do vírus Hepatite B em todos os poços. escolhemos fazer a pesquisa de antígenos do vírus da Hepatite B por tal método. a partir do 2º poço até o 11º poço dessa linha. na placa. colocar 50µl de tampão diluente em cada poço. 3) Homogeneizar o conteúdo do 1º poço e passar 50µl para o 2º poço . 2) Colocar 100 µl de soro humano no 1º poço. 29 . o método de Inibição da Aglutinação Passiva. 9) Selar com fita Durex para que não haja evaporação dos reagentes e colocar a placa sobre uma superfície rígida. 5) Agitar levemente a placa. Com o objetivo de conduzir os alunos de graduação desta instituição para a compreensão de mais uma variação. proceder com esta diluição até o último poço (numero 11). e a diluição dos soros e reagentes será feita através de pipetas automáticas. A reação será realizada em placas de microaglutinação. homogeneizar novamente e passar 50 µl do 2º poço para o 3º . que os poços estão distribuídos formando linhas: linhas A. C etc. 1 A B C D E F G H 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PROCEDIMENTO 1) Utilizando a linha A. 4) Desprezar 50µl do 11º poço (último). à medida que autorizaram uma sensibilidade maior para a pesquisa daqueles reagentes. 6) Colocar 50µl de soro anti-antígeno Hbs em cada poço. Observe. Esse tipo de placa presta-se a reações em que trabalhamos com pequenos volumes de reagentes.

é gerado um produto colorido que poderá ser observado a olho nu (ensaio qualitativo) ou ter sua densidade óptica medida por espectrofotometria (ensaio quantitativo). e reage especificamente com seu substrato.O da amostra/D. que poderá ser o antígeno ou mesmo uma classe de anticorpo em particular. Anticorpos ou antígenos podem ser conjugados a enzimas de maneira que. cruzi PRIMEIRA AULA – SENSIBILIZAÇÃO E BLOQUEIO DA PLACA Material necessário: Placas de poliestireno Solução contendo antígenos de T. A adsorção não específica de componentes à placa pode ser reduzida incluindo-se uma proteína inerte (caseína. Independente do método escolhido para leitura é necessário determinar o limite de reatividade ou “cut-off” do teste. materiais que possibilitam a ligação covalente de proteínas. O princípio básico é a adsorção de um dos reagentes (antígeno ou o anticorpo) a uma fase sólida. tal como placas de poliestireno ou polivinil. O cromógeno mais utilizado em ELISA é o OPD (ortofenileno diamina). cruzi Solução tamponada de Caseína a 1% Solução tampão para lavagem Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Estufa à 37°C 30 . gelatina. • Método de captura: Um anticorpo específico é adsorvido à placa para reter o objeto da pesquisa.O do controle positivo). podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados. que pode ser obtido pela relação entre a coloração da amostra e a coloração do controle positivo (D. Vários métodos são realizados utilizando o principio do enzima-imunoensaio.30 ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) Este teste foi desenvolvido em 1971 por Engvall e Perlmann como alternativa ao radioiumunoensaio. preferencialmente monoclonais. entre eles os mais empregados são: • Método indireto: amplamente empregado para a pesquisa de anticorpos apresentando como vantagem a utilização de um único conjugado em diferentes sistemas. ao ser adicionado o substrato da enzima à reação. o peróxido de hidrogênio. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos. Tais placas contêm séries de poços onde serão depositados os reagentes. BSA) no diluente da amostra (bloqueio). gerando um complexo que na presença de um terceiro composto um doador de elétrons (cromógeno ) forma um polímero intensamente colorido. O conjugado utilizado deverá ser específico para a estrutura capturada na placa. A enzima peroxidase é muito utilizada para este teste. TÉCNICA DE ELISA INDIRETO PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-T. Os conjugados devem ser preparados com anticorpos de alta afinidade.

Pipetar 200µl de solução contendo antígenos de T. cruzi. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. cruzi em cada poço da placa de poliestireno. Pipetar em duplicata (em dois poços consecutivos) 100µl dos soros controles e dos soros testes de acordo com o esquema abaixo: A: Controle negativo B: Controle negativo C: Controle positivo D: Controle Positivo E: Soro teste 1 E: Soro teste 2 F: Soro teste 3 G:Soro teste 4 31 . cruzi. Material necessário: Placas previamente sensibilizadas com antígenos de T. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. 3. 2. desprezar a solução de antígenos de T. cada poço da placa. cruzi e bloqueadas. Boqueio de placa previamente sensibilizada: 1. 2. Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Soro Controle Positivo Soro Controle Negativo Soros testes Conjugado enzimático Solução reveladora (peróxido de hidrogênio+OPD) Metodologia: 1. Incubar 2 horas à 37°C em estufa. Adicionar 200µl de solução de bloqueio (Caseína a 1%) a cada poço da placa e incubar overnight a 37°C. Inverter a placa e bater sobre papel de filtro para retirar o excesso de tampão. cada poço da placa. 4. Trabalhando com a placa previamente sensibilizada. 5. SEGUNDA AULA – Detecção de anticorpos anti-T.31 Metodologia: Sensibilização da placa: 1.

32 2. 8. Novamente incubar 15 minutos à 37ºC. Incubar a placa 30 minutos à 37ºC. 9. Inverter e bater a placa sobre superfície com papel de filtro. Lavar três vezes a placa com solução tampão. 11. Levar para incubação em estufa durante 15 minutos à 37º C. Leitura visual de placa pronta 32 . 7. 10. Desprezar o conteúdo da placa e lavra três vezes com solução tampão. Adicionar 100µl de solução reveladora (substrato+cromógeno) em cada poço. 5. 6. Inverter e bater a placa. 3. 4. Adicionar 100µl de conjugado a cada poço da placa.

armazená-la durante curto espaço de tempo (10-9 a 10-7 de segundos) para.Filtros de barreiras Esquema do sistema óptico do microscópio de fluorescência. O isotiocianato de tetrametilrodamina. A absorção máxima do isotiocianato de fluoresceína é de 490 . que se conjuga facilmente as proteínas em pH alcalino (acima de 9 ). filtros de excitação para produzir um comprimento de onda capaz de causar ativação do fluorocromo e filtros para evitar a passagem pela ocular. em seguida emiti-la sob a forma de uma radiação de maior comprimento de onda. que emite cor vermelha. Os fluorocromos mais usados em laboratório clínico são a fluoresceína e a rodamina.Preparo fluorescente C .33 REAÇÕES DE IMUNOFLUORÊSCÊNCIA FINALIDADE: Detecção de anticorpos ou de antígenos. Para a observação microscópica da fluorescência é necessária uma adaptação do microscópio óptico comum. Os fluorocromos apresentam espectros de absorção e emissão característicos. e emite sua cor verde característica a 517 nm. C D A B ---------------__ _ _ _ _ _ _ __ Radiação de longos comprimentos de onda Radiação de curtos comprimentos de onda A .Lâmpada de halogênio B . contendo uma fonte de luz excitadora de alta intensidade. comprimento de onda. A fluorescência é a emissão de luz de uma cor. ou seja maior comprimento de onda do que o da luz incidente ou absorvida. resultando em fluorescência. isto é.Filtros excitadores D .495 nm. de luz de baixo comprimento de onda. tem um máximo de absorção a 550 nm e emissão máxima a 580 nm. O comprimento da onda emitido (fluorescente) terá necessariamente menor energia. enquanto uma substância é irradiada com luz de cor diferente. que tem a capacidade de absorver a energia luminosa. Ambos os fluorocromos são empregados sob a forma isotiocianato. As técnicas utilizadas para o estudo de imunofluorescência comportam duas modalidades principais: 33 . É possível tornar visível a reação Ag-Ac marcando um dos reagentes com substâncias ditas fluorocromos.

Usa-se esta técnica na pesquisa de anticorpos circulantes no diagnóstico de: toxoplasmose. aplica-se primeiro o anticorpo específico não fluorescente.Imunofluorescência indireta . anti-DNA.34 1 .baseia-se na detecção de antígenos utilizando anticorpos específicos marcados com isotiocianato de fluoresceína. anti HIV. sífilis. doenças de Chagas. anticorpos antireóide. marcado com fluoresceína. sorotipos de leptospiras. antinucleoproteína. lava-se a preparação para remover todas proteínas (imunoglobulina) não fixadas pelo antígeno. como estreptococos beta-hemolíticos do grupo A. bacilo diftérico. É o processo comumente usado para a identificação de microorganismos por imunofluorescência.Imunofluorescência direta . etc. após haver a reação Ag-Ac. esquistossomose. sorotipos de colibacilos enteropatogênicos. Sobre a preparação de antígeno fixado à lâmina. etc. e a seguir. 2 . leptospirose. 34 . trata-se com um anticorpo fluorescente com especificidade dirigida para os determinantes antigênicos do anticorpo ligado ao antígeno.baseia-se na detecção de anticorpos utilizando um antígeno conhecido e um soro anti-imunoglobulina humana.

ainda que de pequena intensidade. 1/64 . Secá-las com ar quente. b . 9 .1 ml do soro.2. 3 .Colocar no tubo 1/16 1.Remover os soros de cada lâmina sob delicado jato de água e lavá-las por imersão por duas vezes em PBS. homogeneizar bem e passar 0.1 ml para o 2º tubo.Enxugar o verso e as bordas das lâminas com papel absorvente e ao redor das áreas da reação.02 ml) das diluições dos soros em cada área das lâminas.Preparar diluições dos soros em solução salina tamponada pH 7. TOXO 1/16 1/256 1/64 1/4096 1/1024 _ + 6 .5 ml de salina tamponada e 0. da seguinte maneira: a . 5 . Nas reações negativas os toxoplasmas não apresentam fluorescência ou esta fica localizada apenas nas extremidades dos parasitas (coloração polar).Incubar a 37ºC em câmara úmida. 10 .02 ml). na razão de 1/16 . em cada área das lâminas. com objetiva de imersão. por 30 minutos. campo escuro. 7 . homogeneizar bem e passar 0. 10 minutos cada lavagem.Depositar pequenas gotas (0.1 ml para o 3º tubo e assim sucessivamente. 4 .Pipetar no 1º tubo 0.Marcar as lâminas com os respectivos soros. 1/4096. como demonstrado no esquema abaixo.3 ml nos demais tubos. Como título tomar o inverso da maior diluição do soro para a qual se evidencia fluorescência em toda a periferia dos toxoplasmas.Lavá-las 2 (duas) vezes em PBS. 1/1024 . diluído conforme seu título. 5 (cinco) minutos de cada vez.Preparar diluições a 1/16 do soro controle positivo e do soro controle negativo.35 TÉCNICA DA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA TOXOPLASMOSE 1 . 8 . 12 . 1/256 . em câmara úmida. filtro excitador BG 12/2 mm ou KP 500 e filtro barreira 50. 35 . 11 . 2 .Depositar uma pequena gota do conjugado fluorescente liquido antiimunoglobulina humana (cerca de 0.Secar bem as lâminas fixadas com antígeno. secar como no indicado do item 8 e montá-las com glicerina alcalina e lamínula.Observar os preparados ao microscópio de fluorescência.Incubar novamente as lâminas a 37ºC por 30 minutos.

Ao final de cada unidade e após os estudos. discuta com os colegas ou procure os professores da disciplina. Responda-os com cuidado e atenção. os alunos deverão ter compreendido o assunto tratado se forem capazes de responder aos seguintes objetivos: 36 . pesquise. Tal seção tem como finalidade permitir ao aluno uma auto-avaliação sobre o tema tratado em sala de aula. Se tiver dúvidas sobre qualquer uma das respostas. esforçando-se para saber descrever com clareza sobre o que está sendo perguntado.36 PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS Esta parte da apostila apresenta de forma sucinta os objetivos gerais e específicos de algumas unidades do nosso programa. que deverão ser feitos em casa.

4. 3. 5.37 UNIDADE: RESISTÊNCIA INESPECÍFICA Objetivos gerais e específicos: 1. Descrever os principais elementos da mucosa e de que forma atuam na resistência inespecífica. Entender os fenômenos de defesa como mecanismos de adaptação às agressões do meio ambiente. 37 . Descrever os principais elementos da pele e de que forma atuam na resistência inespecífica. Conceituar e diferenciar resistência inespecífica e específica. 2. Citar os principais mecanismos de resistência inespecífica.

b.Diferenciar as células que atuam na defesa especifica. d.Reconhecer as células que participam da resposta e fenômenos imunológicos.Definir a função da cada célula dentro da resposta imunológica. 38 . daqueles que atuam na defesa inespecifica.38 UNIDADE: CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE Objetivos gerais e específicos: a .Diferenciar quanto a origem e função os linfócitos T e os linfócitos B.Diferenciar morfologicamente imunológica. cada célula que participa dos eventos da resposta c. e.

15) Justificar a proliferação linfocitária nos órgãos linfóides secundários. 12) Explicar o tráfego de linfócitos no organismo. à partir da célula primitiva. 9) Explicar o centro germinativo nos linfonodos. 16) Justificar a proliferação celular nos órgãos linfóides primários. 10) Justificar a hiperplasia de um órgão linfóide secundário. 8) Reconhecer aspectos da adaptabilidade dos órgãos linfóides secundários para a fase de reconhecimento antigênico na resposta imune. 14) Reconhecer o papel das vênulas pós-capilares de endotélio alto nos linfonodos com relação ao tráfego de linfócitos.39 UNIDADES: FORMAÇÃO DE CÉLULAS T E B e ÓRGÃOS LINFÓIDES Objetivos gerais e específicos: 1) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides primários no sistema imunológico. 13) Explicar como os linfócitos efetores produzidos em um linfonodo têm acesso a um sítio de infecção em outra região ou tecido. o fígado fetal e a medula óssea. 2) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides secundários no sistema imunológico. 39 . para o sistema imune. 11) Reconhecer a principal via de acesso das “estruturas estranhas”. 6) Relacionar os passos envolvidos na formação de plasmócitos secretores de anticorpos. 7) Comparar e justificar os efeitos da timectomia neo-natal e na fase adulta. considerando as fases de uma resposta imunológica. 3) Descrever as características histológicas e anatômicas dos órgãos linfóides primários e secundários. 5) Relacionar os passos envolvidos na formação de células T efetoras. à partir da célula primitiva. 4) Relacionar funcionalmente a membrana do saco vitelino. aos órgãos linfóides secundários.

em geral . Citar e explicar os fatores que contribuem para a imunogenicidade de uma molécula. Reconhecer a estrutura de um epítopo em uma molécula protéica. 5. 6. Exemplificar a situação em que uma substância apresenta antigenicidade e não apresenta imunogenicidade.40 UNIDADE: ANTÍGENOS Objetivos gerais e específicos: 1. Explicar os fenômenos de reatividade cruzada. 2. 7. Conceituar e exemplificar “hapteno”. Explicar três formas de ação dos adjuvantes imunológicos. 40 . 4. Conceituar “epítopo”. 9. Citar os adjuvantes imunológicos mais empregados. 10. 11. Definir o termo imunogenicidade e antigenicidade. 8. Explicar a condição para que haja formação de uma resposta imunológica para os haptenos. 3. Justificar a diversidade de epítopos em uma determinada substância imunogênica. entre antígenos.

l) Reconhecer a forma de participação da IgE nas reações alérgicas. 41 . qual a classe que desempenha este papel e a que se deve esta propriedade. b) Determinar a estrutura básica de uma molécula de imunogobulina. i) Esquematizar o mecanismo de formação de IgAS desde sua síntese até sua chegada na secreções. e) Citar as diferentes classes de imunoglobulinas existentes. o) Definir a imunoglobulina de maior peso molecular. g) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro. k) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM. em relação as outras imunoglobulinas. n) Relatar a importância da transferência placentária de imunoglobulina na espécie humana. d) Identificar na molécula as regiões Fab e Fc. j) Determinar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. f) Definir sitio combinatório. h) Definir as principais propriedades biológicas da IgG.41 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos I) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo imunoglobulinas. m) Definir as imunoglobulinas que apresentam peça J e qual a função desta peça. c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina.

Domínios variáveis e constantes nas cadeias leves e pesadas 4. s) Explicar a importância da IgAS na defesa local das mucosas.Cadeia pesada 2. h) Conceituar idiótipos. e) Diferenciar os diversos isótipos de cadeias leves e de cadeias pesadas existentes. r) Esquematizar o mecanismo de formação da IgAS desde sua síntese até sua chegada nas secreções. p) Reconhecer as subclasses existentes de IgA. c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina. n) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. w) Determinar estruturalmente a composição de uma IgD. f) Reconhecer as imunoglobulinas que apresentam subclasses e diferenciar estas subclasses de acordo com a nomeclatura vigente.Cadeia leve 3. em imunoglobulinas. i) Esquematizar uma molécula de IgG reconhecendo nela os seguintes tópicos. 1. relação as outras 42 . x) Reconhecer a forma de participação de IgE nas reações alérgicas. t) Determinar estruturalmente a composição de uma molécula de IgM. q) Discriminar estruturalmente uma molécula de IgG e uma de IgAS. g) Conceituar e exemplificar alotipia em cadeias leves e pesadas. o) Definir a propriedade de opsonização de que é dotada a IgG. v) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM.Região carboxi-terminal l) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro.42 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos II) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo Imunoglobulinas. d) Identificar os fragmentos resultantes após a clivagem enzimática de uma molécula de imunoglobulina pela ação de pepsina e da papaína. m) Identificar as sub-classes de IgG existentes. u) Determinar o peso molecular e quantidade relativa de IgM encontrada no soro. b) Reconhecer a estrutura básica de uma molécula de imunoglobulina.

Demonstrar como o sistema do complemento participa da eliminação de antígenos que não são celulares ou que não tem membrana exposta. Explicar o desenvolvimento de uma alça de amplificação na ativação da via alternativa. Explicar o mecanismo da ação dos fragmentos de ação biológica. Explicar a ausência da alça de amplificação da via alternativa nos processos fisiológicos de ativação do Sistema do Complemento. nos fenômenos de aumento de permeabilidade capilar. Justificar. ♦ Identificar a analogia entre as enzimas C4b2a e C 3bBb. ♦ Justificar a participação de uma resposta imuno especifica na ativação do Sistema do Complemento. através dos textos bibliográficos. agregação plaquetária. ♦ Identificar os fatores ativadores da via clásssica e da via alternativa do Sistema do Complemento. ♦ Identificar a via alternativa. clássica e efetora do sistema do complemento. ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ 43 . produzidos pela ativação do Sistema do Complemento. ♦ Reconhecer o mecanismo de ativação da via alternativa e da via clássica do Sistema do Complemento. por que na maioria das células os mecanismos de lise pelo Complemento não são possíveis. Justificar a ação lesiva do sistema do complemento para células do próprio hospedeiro. ♦ Justificar o papel inespecífico da ação do sistema do complemento. quimiotaxia para PMN e lise celular.43 UNIDADE: SISTEMA COMPLEMENTO Objetivos gerais e específicos: ♦ Descrever os efeitos biológicos surgidos pela ativação do Sistema do Complemento. Reconhecer as bases de um mecanismo homeostático em relação à ativação do sistema do complemento.

pinocitose. o) Relacione a fagocitose a mecanismos de resistência inespecífica. n) Citar as principais enzimas que atuam a via oxigênio independente. h) Explicar a fase de englobamento realizada pelo fagócito i) Explicar a fase de digestão durante a fagocitose. l) Citar os radicais livres produzidos na via oxigênio dependente e definir sua importância na destruição de estrutura fagocitada. f) Explicar a importância do fenômeno da opsonização. j) Definir as duas principais vias de destruição da partícula fagocitada. d) Citar as principais substâncias que desempenham o papel de opsoninas. m) Caracterizar a via oxigênio independente. g) Caracterizar o sinal de ativação do fagócito no momento da opsonização. endocitose e exocitose. k) Caracterizar a via oxigênio dependente. c) Identificar os principais fatores quimiotáticos para PMN e macrófagos.44 UNIDADE: FAGOCITOSE Objetivos gerais e específicos: a) Definir fagocitose. 44 . e) Definir opsonização. b) Identificar as principais células que participam da resistência inespecífica.

9) Relacionar as moléculas de classe I e II do CHP com os antígenos exógenos e aqueles de síntese endógena. a região de ligação ao peptídeo. 4) Estabelecer a função dos antígenos de classe I e classe II. (Faça um desenho esquematizando as principais características de ambas). 7) Reconhecer na molécula de classe I. 45 . no camundongo e no ser humano: 2) Citar quais são os produtos da decodificação do CHP. 3) Denominar os produtos do CHP Humano. 8) Reconhecer na molécula de classe II. 5) Esquematize as estruturas das moléculas de classe I e II. 6) Localizar as moléculas de classe I e de classe II nas diferentes populações celulares.45 UNIDADE: Complexo de Histocompatibilidade Principal(CHP. a região de ligação ao peptídeo. “MHC”) Objetivos gerais e específicos: 1) Definir o que é CHP e onde este se localiza.

10) Definir qual o papel do INF.46 UNIDADE: Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) e mecanismos de Apresentação de Antígenos 1) Definir quais são as principais células apresentadoras de antígenos e onde elas se localizam. 4) Descrever no macrófago. 3) Exemplificar qual é a molécula que poderia sugerir uma função de célula apresentadora de antígeno. 9) Explicar porque a apresentação de antígenos externos se dá no contexto de moléculas de classeII.γ na apresentação do antígeno. 8) Estabelecer onde ocorre a interação entre antígenos próprios e as moléculas do CHP e como ocorre este mecanismo. 7) Numa infecção por um patógeno intracelular em uma célula cilíndrica do trato digestivo superior. 46 . uma molécula viral pode ser apresentada no contexto de moléculas de classe I do CHP: 6) Esquematizar como ocorre o processo de apresentação de antígenos no contexto de moléculas de classe II. quais são as etapas que culminam com a apresentação de antígenos pelas células. 5) Definir em qual situação. 2) Definir as principais características quanto às estruturas de superfície celular e fagocitose de cada APC. estabelecer de que forma o organismo reconhecerá que naquela célula está se desenvolvendo uma infecção e como esta será debelada.

IL-12 47 . TNF 18. 3. quanto a função e produtos das subpopulações TH1 e TH2.47 UNIDADE: Linfócitos T 1. IL-6 15. Definir funcionalmente e quanto às células produtoras as seguintes citocinas: 10. Definir a etapa seguinte à ativação dos LT auxiliares. IL-5 14. 6. IL-2 11. 4. IL-4 13. 9. Elaborar um quadro comparativo. 5. Reconhecer o mecanismo de interação na apresentação de Ag aos linfócitos T citotóxicos ou CD8+. Definir estrutural e funcionalmente os principais marcadores de superfície dos linfócitos T 2. Definir e diferenciar linfócitos TH1 e TH2 8. Esquematizar as etapas de ativação dos linfócitos T auxiliares. Definir como ocorre a ativação do repertório de células T citotóxicas (CTL). IL-10 16. 7. Reconhecer o mecanismo de interação da célula apresentadora de antígeno com os linfócitos T CD4+. INF-γ 17. IL-3 12.

Explicar porque se pode dizer que um linfócito B é uma APC. Diferenciar a ativação por antígenos timo-dependentes e timo-independentes. Identificar as fases da curva que representa uma resposta humoral e a característica de cada fase. 2. Explicar a que se deve a maior produção de Ig durante uma resposta humoral secundária. Estabelecer com relação ao comportamento de linfócitos B. 3. o que é esperado quando se imuniza artificialmente uma criança e porque. Definir o mecanismo do capuz ou “Capping” e citar a função do mesmo. Definir as fases de ativação dos linfócitos B. 10. 14. 13. Estabelecer a finalidade da ativação do repertório de linfócitos B. Estabelecer a diferença que existe entre as fases das respostas primárias e secundária. Definir mudança de classe ou “Switch”que ocorre durante a síntese de imunoglobulinas. Definir as principais interleucinas produzidas pelos linfócitos T que têm ação sobre linfócitos B e em que fase elas agem e de que forma. Definir o resultado final da ativação do repertório de linfócitos B. 6. 4. 11. 16. Estabelecer as fases que precedem a interação entre linfócitos B e linfócitos T e o objetivo desta interação. 9. 17.48 UNIDADE: Linfócitos B e Resposta Humoral Primária e Secundária 1. 5. Reconhecer os marcadores de superfície dos linfócitos B e função fisiológica dos mesmos. Definir a primeira imunoglobulina a ser produzida em resposta a uma infecção. 15. 8. 7. 12. 48 . Definir a ontogenia dos linfócitos B no homem. Explicar porque a resposta secundária é a mais rápida do que a resposta primária.

16. durante o “Swicth”. 8. 11. Defina intron e exon. 5. há variação na síntese da porção constante da cadeia pesada de imunoglubolinas e não ocorre o mesmo para a porção variável? 49 . Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias pesadas das imunoglobulinas. Conceitue “Fenômeno de Restrição Isotípica”. 15. Identifique o processo de “diversidade funcional por inserção”. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves Kappa das imunoglobulinas. Responder: por ‘que. 13. 9. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves lambda das imunoglobulinas. 2. Diferencie os rearranjos gênicos que existem nas cadeias leves e pesadas. Responda: é possível que um linfócito B apresente em sua superfície diferentes classes de imunoglobulinas ao mesmo tempo ? Em que situações? 12. 6. 7.49 UNIDADE: Genética das Imunoglobulinas Objetivos gerais e específicos: 1. Identifique a diferença na codificação genética entre imunoglobulina de membrana e imunoglobulina secretada. 10. Explicar por que uma célula que sofreu um “Switch” para a síntese de IgG não mais poderá voltar a sintetizar IgM. Justifique a necessidade de haver imunoglobulinas de diferentes classes. Explique as causas da grande variabilidade de sítios combinatórios das imunoglobulinas. Diferencie o rearranjo gênico que existe durante a fase primordial e a fase tardia de síntese das imunoglobulinas. Conceitue “Fenômeno de Restrição Alélica”. Identifique a seqüência genética existente para a síntese das diferentes cadeias pesadas de imunoglubulinas. 14. 3. 4.

50 INTERAÇÃO DO SISTEMA IMUNOLÓGICO Se você foi capaz de responder a estes questionários contendo os objetivos específicos já é capaz de compreender as diversas faces do sistema imune. a reação do organismo frente a alteração do padrão fisiológico do mesmo. então. realizando um esquema completo. 50 . utilizando todos os conceitos que você já aprendeu. identificar a cinética de uma infecção viral numa célula hepática e a resolução desta infecção pelo sistema imunológico. Tente. é bem possível que você já possa prever como será. Portanto. ou como deverá ser.

51 . Conceituar “Tolerância imunológica”. Explicar a importância da drenagem venosa na tolerância por via oral. 6. 2. Conhecer os fatores favorecedores da resposta ao tolerogênico. Explicar os mecanismos imunológicos pelos quais o sistema imunológico desenvolve tolerância aos antígenos próprios e não próprios. Justificar o papel do contato de longa duração na duração de tolerância. Reconhecer sua participação e importância no Sistema Imunológico. 4.51 UNIDADE Tolerância Imunológica Objetivos gerais e específicos: 1. Explicar a participação da via oral na indução da tolerância. 3. 5.

Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo III. nos tipos imediatos e tardios. Reconhecer a origem. 15. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade IV. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo I. 13. fundamental das imunoglobulinas mediadoras da 18. 8. 11. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo I. de imunoglobulina(s) envolvida(s) na mediação da 16. 9. 5. Reconhecer a propriedade hipersensibilidade tipo I. 20. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo I. 52 . Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo III. 6. Citar os mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I.52 UNIDADE HIPERSENSIBILIDADE 1. ação e efeito dos mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo I. 2. segundo Gel e Coombs 3. Classificar as reações de hipersensibilidade quanto aos seus mediadores imunológicos. 17. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo II. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo III. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo IV. 7. Relacionar as reações de hipersensibilidade da classificação de Gel e Coombs. 12. 21. Identificar a(s) classe(s) hipersensibilidade tipo II. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo III. 4. 10. 19. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo I. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo IV. 14. Definir o que é uma reação de hipersensibilidade. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo III.

24. Explicar o mecanismo da injúria tecidual pelo mecanismo de hipersensibilidade tipo IV. reconhecendo os fatores liberados por células responsáveis. 23. 33. Justificar o eritema que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilidade tipo IV. Diferenciar o mecanismo de formação de edema na hipersensibilidade tipo I e III. Descrever os principais mecanismos da lesão celular por hipersensibilidade tipo II. 29. Entender a origem da histamina e seu papel na hipersensibilidade tipo III. Justificar a presença destas células no infiltrado . 25. Reconhecer a localização do Ag na hipersensibilidade tipo II. Identificar o principal mediador imune da reação inflamatória tipo IV na classificação de Gel e Coombs. Compreender a utilização de testes intradérmicos de hipersensibilidade tipo IV para avaliação de imunidade celular. 35. Justificar a induração que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilização tipo IV. 26. 36. Caracteritizar os tipos celulares predominantes no infiltrado inflamatório mediado por hipersensibilidade tipo IV. Justificar uma neutropenia após a administração do antibiótico cloranfenicol. 30. 40. 34. 28. Explicar a reação de Arthus. 37. 27. Justificar a isquêmia que pode acompanhar as reações de hipersensibilidade tipo III. 31. Diferenciar a formação de uma reação de Arthus com uma reação tipo III sistêmica. Explicar as reações aceitas para a permanência de imunecomplexos circulantes o organismo. Justificar fenômenos hemorrágicos presentes na reação inflamatória por hipersensibilidade tipo III. Justificar a escolha dos Ag em uso nos testes intradérmicos de avaliação de imunidade celular. 53 . 39. 38. 32. Explicar o papel do sistema do complemento nas reações de hipersenbilidade tipo III.53 22.

13. que são responsáveis pela indução da rejeição aos mesmos. Interpretar uma prova cruzada positiva. 5. Citar as provas de seleção para doador vivo para os transplantes. 8. 54 . Reconhecer os tipos de rejeição aos enxertos identificando os principais elementos da resposta imune. 6. Explicar a reação de Enxerto X Hospedeiro e justificar a sua presença nos transplantes de medula óssea. Associar MHC e HLA. Conhecer a nomenclatura correspondente aos enxertos. Relacionar estas estruturas moleculares e o MHC. 2. Justificar a importância da Prova Cruzada que antecede os transplantes. Montar um exemplo de um perfil para a expressão fenotípica de todos esses locus em um indivíduo. Explicar os mecanismos de agressão às células enxertadas.54 UNIDADE: TRANSPLANTES Objetivos gerais e específicos: 1. Citar os principais locus da região HLA. 12. 10. 4. Justificar o valor da análise do perfil de HLA na seleção do doador vivo 11. Reconhecer quais a estruturas moleculares das células de um enxerto. 7. envolvidos. 9. 3.

OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS: Ao final do exercício desta prática no laboratório o aluno deve estar apto a: 1.Dar a definição de ponto Isoétrico de uma proteína e explicar sua participação no princípio desta técnica. 4. 5. 2.Reconhecer o que atuou como suporte na corrida eletroforética realizada no laboratório.55 SUBUNIDADE: “ELETROFORESE DE PROTEÍNAS”. 55 .Explicar o princípio de uma eletroforese de proteínas.Reconhecer e explicar o fato das albuminas migrarem com maior velocidade.Fundamentar a razão de todas as proteínas migrarem em um único sentido. 3.Justificar a importância do pH alcalino do tampão utilizado. 6.

56 PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS EXERCÍCIOS 56 .

1. Essa reação processa-se em tubos onde seguiu-se a metodologia abaixo.Mediu-se a radiação do tubo.diga qual a importância clínico.Ao tubo foi adicionado soro suspeito para o exame.O que estava sendo pesquisado b. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina. PERGUNTA-SE a. antígeno extraídos do vírus da Hepatite A. uma condição favorecedora da interação Ag/Ac. 57 .A seguir procedeu-se a incubação a 37º C por 30 minutos. A adsorção se dá por ligações covalentes entre os anticorpos e o material do tubo (poliestireno).Adicionou-se a seguir.57 RIE (RADIOIMUNISAIO) Abaixo está representado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. 6. 7. para assim recobrir os espaços não ocupados pelo anticorpo (bloqueio do tubo). anticorpos anti-IgM e não anti-IgG.Realizou-se nova lavagem do sistema.laboratorial de termos adsorvidos. ao tubo. 2.Posteriormente realizou-se a lavagem do sistema. 4. 5. marcador com l125 (um isótopo radioativo cuja emissão de radiação pode ser medida em um cintilômetro). 8. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da HEPATITE A. Após a leitura e compreensão responda o que se pede abaixo: METODOLOGIA: A cada tubo foi adsorvido previamente anticorpos anti-IgM humana.Seguiu-se nova etapa de lavagem.Adicionou-se então anticorpos anti-vírus da hepatite A. 3.

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ELISA ( ENZIME LINKED IMUNOSORBENT ASSAY)
Abaixo está apresentado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS . Acompanhado será fornecido uma placa com 96 poços onde seguiu-se a metodologia abaixo. METODOLOGIA A cada poço foi adsorvido previamente antígenos extraídos dos vírus da AIDS. A adsorção se dá através de ligações covalentes entre os antígenos e o material da placa. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina, para assim recobrir os espaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da placa). 1- Foram adicionados aos poços 1 e 2 soros procedentes de dois pacientes suspeitos de terem anticorpos anti-HIV ( vírus da imunodeficiência humana causador da AIDS). 2- A placa foi levada a uma estufa a 37 ºC por 30 minutos, uma condição favorecedora da interação Ag/Ac. 3- A seguir esse poço foi lavado com uma solução tampão com finalidade de retirar moléculas livres. 4- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas. As moléculas desses anticorpos tinham, ligadas em si, no Fc, uma enzima (peroxidase) cujo substrato pode ser o peróxido de hidrogênio. Esse substrato ao sofrer a ação daquela enzima manifesta uma cor alaranjada que se revela quando se adiciona ao meio uma substância reveladora ( no caso o ortofenilenodiamino-OPD). A ligação da enzima ao anticorpo não altera as propriedades anticórpicas desse. Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 5- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 6- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 7- Logo após observou-se que a solução no poço 1 ficou alaranjada enquanto que no poço 2 não houve alteração. Responda: a- Esquematize os dois poços evidenciando as reações Ag/Ac que ocorrerem ou deixarem de ocorrer. b- Após a realização do item 3, esquematize o que permaneceu no poço 1. c- Como você interpreta o resultado visível nos poços 1 e 2 respectivamente?

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WESTERN BLOTTING
É um dos métodos mais utilizados para identificar proteínas reconhecidas por anticorpos, sendo designado também de immunoblotting, diferenciando-se do “Southern ou Northen blotting”, que se prestam a identificação de ácidos nucléicos. Abaixo está apresentado um exemplo de Western blotting que se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS. Leia com atenção e responda. 1- Para a realização de um Western blotting inicialmente as proteínas virais são separadas, de acordo com seu tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio - um detergente (SDS-PAGE). 2- Em seguida as proteínas fracionadas no gel são transferidas por corrente elétrica, para uma membrana de nitrocelulose que posteriormente será recortada em tiras. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina ou a caseína, para assim recobrir os pedaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da fita). 3- A cada tira é adicionado em recipiente apropriado soro de paciente suspeito de ter anticorpos anti-HIV. 4- Segue-se um período de incubação de 30 minutos a 37º C, e extensiva lavagem para a remoção das proteínas livres. 5- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas marcadas com uma enzima (peroxidade). Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 6- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 7- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 8- Em seguida observou-se que algumas fitas apresentavam bandas (faixas) coradas denotando reação, enquanto outras não se coraram. RESPONDA: 1- Poderíamos pesquisar subclasses de IgG, ou mesmos outro isótipo de imunoglobulinas? Como? 2- O que significa exatamente a presença de bandas coradas, com relação as possíveis interações ocorridas?

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IMUNOHISTOQUÍMICA
A aplicação da imunohistoquímica (IHQ) à rotina diagnóstica já é uma realidade em nosso meio. De modo genérico, podemos considerar como principais indicações para o exame: ♦ Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente diferenciadas ♦ Subtipagem de neoplasias ♦ Caracterização da origem de carcinomas. ♦ Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas ♦ Discriminação da natureza benigna X maligna de determinadas proliferações celulares. ♦ Avaliação prognóstica de neoplasias ♦ Identificação de agentes infecciosos. Como exemplo, temos representado abaixo uma reação de IHQ para a pesquisa de receptores de estrógeno em células de adenocarcinoma de mama, um fator prognóstico neste caso. 1- Para a realização reação de imunohistoquímica utilizamos cortes de tecido incluído em parafina com aproximadamente 3 µ de espessura, colocados em lâminas tratadas com silano ( silanizadas), para propiciar uma forte adesão do corte histológico à lâmina 2- Em seguida as lãminas são desparafinizadas, sendo deixadas na estufa à 60°C por 24 horas, no xilol à 60°C e no xilol a temperatura ambiente para desparafinização 3- Após a desparafinização as lâminas são levadas à uma sequência de banhos de álcool absoluto até 80% para hidratação. 9- Posteriormente segue-se a etapa conhecida como recuperação antigênica. Necessária para que se restabeleça a estrutura antigênica das proteínas estruturais, modificada pela ação do formol. Tal etapa poderá ser feita por dois métodos: Calor úmido: em solução tampão citrato de sódio pH 6,0 4M, em banho-maria, panela de pressão ou microondas por tempo determinado. Enzimático: tratamento do corte com proteinase K 10- Segue-se o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 11- Adição de anticorpo monoclonal de coelho específico, anti-receptor para estrógeno 12- Incubação por 30 minutos à 37°C e overnight na geladeira. 13- No dia seguinte etapa de lavagem com solução tampão 14- Adição de um anticorpo anti- anticorpo de coelho, marcado com estrepavidina, incubação à 37°C 15- Nova etapa de lavagem 16- Adição de complexo biotina-estreptoavidina complexada com, nova incubação à 37°C 17- Lavagem e adição de solução de Dab (Diaminobenzidina 60mg%) 18- Contra coloração com hematoxilina. 19- Observação no microscópio de núcleos corados de marrom. RESPONDA: Qual a finalidade das etapas de lavagem? Por que fazemos a recuperação antigênica? Como seria um resultado negativo?

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esta célula passa a ostentar em sua superfície. nosso organismo for infectado por uma bactéria extracelular qualquer. 61 . 2. moléculas codificadas pelo genoma viral. através dos quais este hospedeiro reagirá à infecção viral. que possua em sua parede antígenos de natureza polissacarídica e glicoproteíca. descreva todos os prováveis eventos de uma resposta imunológica. qual seria a resposta esperada do sistema imune?.Sabendo-se que os vírus ao infectarem um organismo. inserem seu genoma no genoma de uma célula do hospedeiro e que assim.61 EXERCÍCIO SOBRE RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO VIRAL E BACTERIANA 1.Se em uma situação hipotética. tal como uma do gênero Streptoccocus. que você conhece.

G2 e M do ciclo celular. cada célula fornece 5 números: tamanho. E assim. é claro qualquer componente da célula ou função que possam ser detectada por um composto fluorescente quando examinada. genética. é também utilizada para identificar as sub-populações de linfócitos especifícos. Contanto que diferentes tipos de células possam ser distintas por características estruturais quantitativas. registrar os parâmetros cinéticos do tumor a ploidia do tumor. pode processar milhares de células em alguns segundos. e intensidade de fluorescência verde. em frente a um feixe laser com sensores para medir fluorescência e dispersão de luz. As células devem estar em uma suspensão de células simples com o mínimo de agregação (suspensão monodispersa). medicina e outras. ou fixas com paraformaldeído. A linha simples de fluxo das células passa pelo raio laser do instrumento. fração de crescimento e propriedades cinéticas. tais como botânica. vermelho e muito mais vermelho. para contagem de CD4 e CD8. Esta metodologia de análise é aplicável em diversas áreas de pesquisa. classificação estéril. análise e classificação de cromossomo. Um citomêtro de fluxo pode medir estes parâmetros a uma taxa de milhares de células por minuto. análise de DNA.62 CITOMETRIA DE FLUXO Pela acadêmica de Farmácia Daniela Silva Moreira Introdução: A citometria de fluxo consiste em um método laboratorial para definir o tamanho. morfologia e outras características de uma população de células. É uma técnica de medição das propriedades óticas da células individuais. indicando fatores prognósticos e rumos terapêuticos. Podemos obter medidas corpóreas das células como tamanho. a citometria de fluxo pode ser usada para a contagem de células de diferentes tipos em uma mistura. em um fluxo contínuo passando uma de cada vez. Embora faça medidas em uma célula de cada vez. pode também estimar a distribuição das populações celulares ou fases do ciclo celular. As informações podem ser adquiridas na citometria de fluxo utilizando células vivas. seqüencialmente. Permite o estudo da variabilidade genômica pelo perfil colorimétrico do conteúdo de DNA. zoologia. a fração de proliferação tumoral e a percentagem de células encontradas nas fases S e G1. forma e complexidade interna e. 62 . muito utilizado na classificação de leucemias. microbiologia. Essas células são rotuladas com uma “etiqueta” fluorescente. ou partículas em geral. estudos funcionais. granulosidade. Desenvolvimento: A citometria de fluxo mede características corpóreas e químicas de células ou partículas que estão em suspensão uma a uma num determinado ponto. As aplicações incluem: análise de fenótipo.

Estes dados são em seguida registrados e mostrados na forma de histograma. A contagem absoluta das sub-populações de linfócitos é obtida a partir de 3 determinações sequenciais separadas: a contagem total dos glóbulos brancos do sangue total. gerados a partir da fluorescência. A energia da luz emitida pelo laser excita o corante fluorescente contido em cada célula. A utilização dos CD3 irá discriminar os linfócitos CD8+ das NK. CD8 e CD3. como por exemplo na infecção pelo HIV. através da ligação de um anticorpo monoclonal específico para a população alvo. A cada sessão. primeiro. Embora não identifiquem células individuais. . é devido os níveis normais se alterarem nas imunodeficiências e em certas doenças. o diferencial de glóbulos brancos. a porcentagem de células positivas à citometria de fluxo. em monócitos. marcado com o corante fluorescente. e assim determinar um tratamento para a doença. conversores analógicos para digitais e computadores. A metodologia mais atual para a contagem de CD4 e CD8 e para a identificação das sub-populações de linfócitos específicos. O marcador CD3 é expresso na superfície de células “T” maduras ( CD4 e CD8). CD4e CD8. 63 . então. o sistema óptico do laser detectores eletrônicos. fluxo este que. A importância clínica de se fazer citometria de fluxo para separar e contar o número de linfócitos T CD4+ e CD8+. passada por um pequeno tubo que cria um fluxo de células únicas. O CD8. utiliza uma técnica sofisticada de citometria de fluxo. A população alvo colorida é. minimizando o erro.alvo. por sua vez é expresso na superfície dos linfócitos CD8+ e em algumas células NK. 100 microlitos de sangue total é investigado com anticorpos monoclonais específicos dirigidos contra os marcadores CD3. dirigidas contra os marcadores de superfície CD4. estes histogramas. a coloração da população de células-alvos com um corante fluorescente ( geralmente iodeto de propídio). conseguem identificar a tendência central de uma determinada população de células. E através desses níveis de linfócitos podemos indicar a progressão ou regressão de uma doença. baseada em anticorpos monoclonais marcados com substâncias fluorescentes. Os citômetros de fluxo envolvem fluidos sofisticados. Os linfócitos T são ainda sub-classificados em duas sub-populações funcionais: os CD4 auxiliares e os CD8 citotóxicos. e o número de células é calculado com base na intensidade da fluorescência . Provoca-se uma excitação desses elementos fluorescentes com uma luz “laser”e a identificação ótica é feita de maneira automatizada pelo sistema . por sua vez atravessa um raio laser.63 -Técnica de Citometria de Fluxo A técnica de citometria automatizada de fluxo envolve. que representa o perfil da população de células.Separação de linfócitos por citometria de fluxo: Os linfócitos são classificados em 3 sub-populações: linfócitos T. mas também. O CD4 é expresso na superfície de células (linfócitos) CD4+. linfócitos B e os linfócitos NK.

Além de ser um método aplicável em diversas áreas. etc.unipi.uronews.64 Conclusão: Portanto a técnica de citometria de fluxo vem sendo muito utilizada. e assim direcionando os rumos terapêuticos.com.html 64 . genética. • Bibliografia: -Di Dio. pois é um teste simples. usado na classificação de leucemias.it/apher/write/cytome.do. microbiologia. medicina e outras.htm -Citometria de Fluxo → www.br/g 105. Renato CD4/CD8 → www. também utilizado para determinar as fases do ciclo celular na fração de proliferação de tumores.br/hot news .criesp. Permitindo o diagnóstico e prognóstico de diversas doenças.capacity.htm -www. determinar a quantidade de DNA numa população celular.br/citometria -www.uk/axp/facs/davies/flow.icnet.hcan.html -Citometria do DNA → www. como .org.br/inform/ Cd4/Cd8 . identificação das sub-populações de linfócitos do sangue.com . que permite a separação e contagem de células com excelente sensibilidade diagnóstica.6.htm -www.med.org.

. .. Imunologia Básica e Aplicada. Ano VI. HOXTER. STITES.V. 1989. V. H. D. Vol. C. BACCHI. . . Edição Extra. Editora Guanabara. VAZ. VASSALO. Rio de Janeiro. J. J.. Revista LAES. VOOS. C.. Rio de Janeiro.: Algumas técnicas foram obtidas a partir dos Kits reagentes. P. J. CALICH. Manual de Imunohistoquímica. Obs. I.Editora Guanabara. W. O. 65 . São Paulo 1999. Imunologia Básica e Clínica. CALDWELL. Ano IX. L. H. nº 52:08-26 ALVES. 1980. 4ª edição. L. 2ª ed. 2ª edição. MOTA.. A. Revista LAES.65 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIER. SILVA. F. A. D. Imunologia Básica 2000. V. Aplicações Clínicas da Imunoeletroforese. II:46-60. Eletroforese. maio/85. FUNDENBERG. E. WELLS. A. G. C.

Art. Como provas especiais. no uso de suas atribuições. UI: Unidades internacionais 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Art. 86. do Regulamento do Serviço de Defesa Sanitária Animal. 4º. Aprovar as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal. O diagnóstico de rotina da Brucelose em bovinos será realizado através das provas de soroaglutinação rápida ou lenta. poderão ser utilizadas as provas de fixação do complemento. tendo em vista o disposto no art.548. em amostras compostas. 2º. A prova de sêmen-plasma-aglutinação será utilizada em reprodutores dos Centros de Inseminação Artificial e além da prova de soroaglutinação. 3º. respectivamente. 66 . anexas à presente Portaria. DE 20 DE JANEIRO DE 1976 Aprova as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal O MINISTRO DE ESTADO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO. Art. 1º. de 03 de julho de 1934 e considerando a necessidade de atualizar a legislação existente sobre profilaxia da Brucelose. redução pelo mercapto-etanol.66 Anexo CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA PORTARIA N.º 23 Ministério da Agricultura e do Abastecimento PORTARIA nº 23. Revogar as Portarias Ministeriais números 486 e 222. prova do antígeno tamponado acidificado (prova do cartão . precipitação pelo rivanol. +: Aglutinação completa. será utilizada para determinação da taxa de prevalência da Brucelose em rebanhos leiteiros."card test") e prova individual do anel do leite. Art. A prova do anel no leite. de 22 de abril de 1958 e 5 de março de 1969. cuja interpretação obedecerá aos quadros a seguir: Bovinos não vacinados ou vacinados com idade superior a 8 meses 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + + + 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Positiva Positiva Bovinos de 30 meses ou mais. 1º. vacinados entre 3 e 8 meses de idade 1/25 1/50 (25 UI/ml) (50 UI/ml) I + + I + + + + + + + + + + Convenções: I: Aglutinação incompleta. resolve: Art. em provas de rotina no caso de rebanhos-problema. assinadas pelo Diretor Geral do Departamento Nacional de Produção Animal.DO DIAGNÓSTICO Art. 2º. visando dirimir eventuais dúvidas. NORMAS PARA A PROFILAXIA DA BRUCELOSE ANIMAL CAPÍTULO I . aprovado pelo Decreto nº 24.

que serão fornecidas pela unidade de controle. 11. marcar as bezerras vacinadas. isolar os animais reagentes. dos protocolos.DOS ANIMAIS REAGENTES Art. a vacinação será realizada apenas uma vez. CAPÍTULO III . CAPÍTULO IV . 13. 6º. 12. 10. no lado esquerdo da cara. 15. Art. A aplicação da vacina da amostra 19. a 2ª ao serviço veterinário oficial e a 3ª ao emitente. considerando a porcentagem de incidência da doença e as condições locais. 14. após a liberação da partida correspondente. a critério da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. anexos fetais. no lado esquerdo da cara. cabendo ao órgão local do Ministério da Agricultura o acompanhamento e controle da produção. Art. Art. Excluem-se da marcação. mediante requerimento do proprietário e autorização expressa do responsável pelo programa de combate à Brucelose na respectiva Unidade da Federação. admitindo-se a vacina líquida até o aparelhamento dos laboratórios produtores. Os frascos de vacina levarão etiquetas oficiais. não poderão ser objeto de comércio. não se admitindo vacinação de machos. Cada partida de vacina produzida será oficialmente controlada. Os bovinos positivos ou suspeitos de Brucelose. até que cessem os corrimentos vaginais. aceitando as condições estabelecidas. no lado direito da cara. abortus.DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE VACINAS Art. somente uma vez. c. vacinar somente bezerras entre 3 e 8 meses de idade. será efetuada sob a responsabilidade de médico veterinário. com vacina viva. Art. b. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetro) de diâmetro conforme Anexo 1. leite. b. observando-se as seguintes condições: a. com ferro candente. poderão ser realizados exames bacteriológicos de fetos abortados. b. emitir atestado de vacinação. constantes do Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA). quando devidamente identificada. CAPÍTULO II . enterrar o feto e seus anexos. observando-se os seguintes critérios. conforme modelo do anexo 2.DA VACINAÇÃO DE FÊMEAS ADULTAS Art. 67 . 16. Recomenda-se o sacrifício dos bovinos com reação positiva. os sacrifício será realizado em matadouro sob inspeção federal e o julgamento efetuado de acordo com as disposições em vigor. sêmen e outros materiais possivelmente infetados. 9º. elaborada com a amostra 19 de Br. Art. A vacinação de fêmeas adultas com a amostra 19 poderá ser autorizada em propriedades onde estiverem ocorrendo surtos de abortos brucélicos.DA VACINAÇÃO DE BEZERRAS Art. do estoque de vacina. Os animais que revelarem reação positiva serão marcados a ferro candente. controlada pelo órgão oficial competente.67 Art. destinando-se a 1ª ao proprietário. A vacina com a amostra 19 será produzida por laboratórios autorizados. bem como a coleta de amostras das partidas produzidas. observandose o seguinte critério: a. Art. Nos casos em que não seja possível o sacrifício. c. de forma a permitir a adoção das medidas previstas no RIISPOA. com um V. aplicando rigorosos cuidados higiênicos complementares. o proprietário dos animais deverá assinar termo de compromisso. Como necessário. conforme Anexo 1. o Serviço de Inspeção Federal no estabelecimento onde será realizado o sacrifício deverá ser notificado com antecedência. salvo quando comprovadamente destinadas ao abate ou a instituições científicas. desinfetando os locais contaminados. CAPÍTULO V . 8º. Art. as fêmeas vacinadas com a idade superior a 8 (oito) meses. A imunização dos bovinos contra a Brucelose será levada a efeito pela vacinação de bezerras. as bezerras destinadas ao Registro Genealógico. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetros) de diâmetro. isolar as vacas reagentes por ocasião do parto. em cada propriedade afetada. acompanhado do algarismo final do ano da vacinação. A vacina com a amostra 19 será apresentada sob a forma liofilizada. quando observado aborto. em 3 (três) vias. serão identificadas com ferro candente. 7º. c. b. a. 5º. observando-se a legislação federal específica e de acordo com as técnicas recomendadas pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. recomenda-se a adoção das seguintes providências: a.

inclusive pelo Registro Genealógico. sendo que a interpretação das mesmas obedecerá o critério constante dos quadros a seguir: b. será efetuado pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. diagnósticos da situação. sendo neste caso. quando os reprodutores apresentarem resultados negativos atestados acompanharão os animais. CAPÍTULO VIII . lenta e do anel no leite. devendo o mencionado produto ser fornecido somente a médicos veterinários. prova rápida.DO REGISTRO GENEALÓGICO. 26. sêmen e produtos derivados reger-se-á pela legislação específica vigente. dependerá da apresentação de: a. Os antígenos para diagnóstico da Brucelose. Art.DA PROFILAXIA DA BRUCELOSE SUÍNA Art. 27. através de exame dos rebanhos em áreas de suinocultura mais expressiva. A comercialização da vacina será objeto de fiscalização oficial e sua aquisição e aplicação sob responsabilidade de médico veterinário. 19. são considerados negativos os rebanhos que não apresentarem qualquer animal com aglutinação superior a 1:100 . CAPÍTULO VI ."card test"). d. CAPÍTULO VII .DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE ANTÍGENOS Art. 25. 22.Incompleta. Art. As condições que uma propriedade deve preencher para ser considerada livre de Brucelose serão estabelecidas através de instrução da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. para obtenção do Certificado de Propriedade Livre de Brucelose. Art. utilizando-se as provas de soroaglutinação rápida e lenta ou a prova com antígeno acidificado tamponado (prova do cartão . serão produzidos por um só laboratório oficial. vacinadas entre 3 e 8 meses de idade. estando as bezerras e novilhas devidamente marcadas e identificadas. ou atestado negativo para Brucelose. 28. Art. Os animais da propriedade serão identificados por tatuagem ou outra forma. atestado de vacinação contra a Brucelose.68 Art. os animais são classificados somente em positivos e negativos. e. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta. 17. Art. Não será exigido atestado negativo para fêmeas bovinas com idade inferior a 30 (trinta) meses. A profilaxia da Brucelose suína será baseada na adoção das seguintes medidas: a. utilizando-se a prova de antígeno acidificado temponado (card test). A produção de antígenos para diagnóstico de Brucelose pelos demais laboratórios oficiais poderá continuar até a instalação e o funcionamento do laboratório central do Ministério da Agricultura. obedecendo as técnicas de produção e controle recomendadas pela Organização Mundial da Saúde. 23. DAS EXPOSIÇÕES E FEIRAS AGROPECUÁRIAS Art. para fins de trânsito interestadual. CAPÍTULO IX . admitindo-se o título máximo aglutinante até 1:50 para fêmeas bovinas com idade superior a 30 (trinta) meses. considera-se com infetado o rebanho no qual forem identificados um ou mais suínos com aglutinação completa na diluição de 1:100. CAPÍTULO X . também não é admitida a classificação de suínos suspeitos. realizadas nos suínos com idade superior a 6 (seis) meses. Art. positivos os animais com títulos iguais ou superiores a 1:25. 24. quando acompanhadas de atestado de vacinação contra a Brucelose. para fêmeas bovinas até 30 (trinta) meses de idade. O controle da distribuição de antígenos para diagnóstico de Brucelose. b. 21. O trânsito internacional de bovinos. Art. Somente será fornecido certificado de inspeção sanitária animal. vacinadas na idade recomendada. Os criadores poderão inscrever-se um esquema voluntário. O atestado de exame negativo para Brucelose será válido por 60 (sessenta) dias. 18. 29. A inscrição de bovinos no Registro Genealógico e a participação dos mesmos em Exposições e Feiras Agropecuárias. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta.DO CONTROLE DE TRÂNSITO Art.DA CERTIFICAÇÃO DE PROPRIEDADE LIVRE Art. Suínos procedentes de rebanhos negativos 1/25 (25 UI/ml) I + 1/50 (50 UI/ml) 1/100 (100 UI/ml) Interpretação Negativa Negativa 68 . submetida cada partida a controle oficial. 20. c. a contar da data da realização do respectivo exame.

até que sejam estabelecidos novos modelos. 32.DAS DISPOSIÇÕES GERAIS Art. quando o título não ultrapassar de 1:25. parcialmente testados ou desconhecidos 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + 1/100 (100 UI/ml) I + Interpretação Negativa Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Art. a. 34. 31. serão precedidas provas de fixação do complemento. Art. reação positiva. A interpretação dos resultados das provas sorológicas de aglutinação para ovinos e caprinos. além das soroaglutinações rápida e lenta. 30. considerados os antecedentes clínicos e epidemiológicos. quando o título for de 1:50 ou maior. c. JOSÉ PEDRO GONZALES Diretor Geral do DNPA 69 . b. A profilaxia da Brucelose ovina e caprina será baseada na adoção das seguintes medidas. Art. especialmente dos reprodutores utilizados. obedecerá o seguinte critério: a. reação suspeita.69 + + + + I + + + I + Negativa Negativa Negativa Positiva Suínos procedentes de rebanhos positivos. b. levantamento da prevalência da doença nas áreas de criação. CAPÍTULO XII . 33. positivos retestados. Nos casos positivos e suspeitos. vigilância severa e permanente das importações de ovinos e/caprinos. Parágrafo único. CAPÍTULO XI . A presença de suínos infetados numa criação justifica o sacrifício do rebanho. controle rigoroso de plantéis indenes. A Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura baixará instruções complementares permanecendo em uso os atuais formulários para exames de Brucelose e vacinação. Os casos omissos e as dúvidas suscitadas na execução e interpretação destas normas serão resolvidos pelo Diretor da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura.DA BRUCELOSE OVINA E CAPRINA Art.

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