UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA

Imunologia
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 2006

PROFª ÂNGELA DA COSTA PEREIRA PROFª INÊS APARECIDA TOZETTI PROFº ANDRÉ LUIS SOARES DA FONSECA

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SUMÁRIO
PARTE I

Técnicas de obtenção e conservação do material usado em Imunologia......................... Diluições......................................................................................................................... Cromatografia em Coluna................................................................................................ Eletroforese de proteínas................................................................................................. Princípio Teórico da Fixação de Complemento............................................................... Reação de Imunohemólise............................................................................................... Reação de Fixação do Complemento.............................................................................. Precipitação em meio semi-sólido................................................................................... Reação de Aglutinação.................................................................................................... Reação de Aglutinação Rápida para Pesquisa de Anticorpos Anti-Brucella................. Reação de Microaglutinação Passiva - Reação de VDRL............................................. Reação de Aglutinação indireta ou passiva Fator Reumatoide...................................... Imunohematologia Sistema ABO.................................................................................. Teste de Coombs Diagnostico da D.H.R.N................................................................... Reação de Inibição de Aglutinação Passiva.....................................................................
ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)………...........................

5 6 8 12 16 17 18 19 22 23 24 25 26 28 29 30 33

Reação de Imunofluorescência.........................................................................................

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PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Resistência Inespecífica................................................................................................ Células do Sistema Imune............................................................................................ Formação de Células T e B e Órgãos Linfóides........................................................... Antígeno....................................................................................................................... Imunoglobulinas (I)...................................................................................................... Imunoglobulinas (II).................................................................................................... Sistema Complemento................................................................................................. Fagocitose.................................................................................................................... Complexo Principal de Histocompatibilidade (CHP/MHC)......................................... Células Apresentadoras e de Antígeno e Mecanismo de Apresentação........................ Linfócitos T................................................................................................................... Linfócitos B e Resposta Primária e Secundária............................................................. Genética de Imunoglobulinas........................................................................................ Interação do Sistema Imune.......................................................................................... Tolerância Imunológica................................................................................................. Reações de Hipersensibilidade..................................................................................... Transplantes.................................................................................................................. Eletroforese................................................................................................................... 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 54 55

PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS E EXERCÍCIOS
Radioimunoensaio........................................................................................................... ELISA............................................................................................................................. Western blotting.............................................................................................................. Imunohistoquímica.......................................................................................................... Exercício sobre Resposta Imune às infecções.................................................................. Citometria de Fluxo......................................................................................................... Referências Bibliográficas............................................................................................... 57 58 59 60 61 62 65

Anexo Portaria 23 para normatização do diagnóstico sorológico da Brucelose............... 66

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4 PARTE I TÉCNICAS UTILIZADAS NAS AULAS PRÁTICAS 4 .

o que decorrerá consequentemente da competência do médico. sem agitação alguma. odontólogo. tendo-se para isto. o sucesso da reação dependerá. se for necessário uma estocagem por mais dias. da boa condição em que essa material fonte se encontre à disposição do laboratório. se sua utilização for ocorrer nas primeiras 72 horas. como fonte de material do indivíduo (seja o homem ou outro animal).5 TÉCNICAS DE OBTENÇÃO E CONSERVAÇÃO DO MATERIAL USADO EM IMUNOLOGIA As reações imunológicas utilizadas em auxilio diagnóstico à clínica e na pesquisa experimental tem. O processo de coagulação do sangue começará a se estabelecer. . A seguir essa fração líquida é submetida à centrifugação de 1500 RPM durante 5 minutos para separar o soro do resto das hemácias. deve-se conservá-lo diluído a 1:2 em glicerina ou tratá-lo com ázida sódica a 1% para inibição do crescimento de microrganismos e estocá-lo em freezer. se tiver que mandar o soro de uma cidade para outro centro. mais freqüentemente o soro. Embora essas reações possam também ser feitas no líquor e ainda em células linfóides deste indivíduo. este último já deve estar completamente seco e rotulado com a especificação do indivíduo. Após a coleta. . em grande parte.Em freezer. o sangue é colhido sem qualquer anticoagulante. veterinário ou bioquímico na coleta de material. sem o fibrinogênio. .Antes de se passar o sangue da seringa para o frasco.Você deverá também acondicionar em gelo. deve-se seguir o preparo e estocagem do material. . o cuidado de retirar a agulha da seringa. Para obtê-lo colhemos uma amostra de 5 a 10 ml de sangue por punção intravenosa. coleta-se a fração líquida que se separou do coágulo . O gelo deverá ficar dentro de um saco plástico para evitar penetração de água nos vidros com soro. então. OBSERVAÇÕES IMPORTANTES . CONSERVAÇÃO DO SORO .Em geladeira. de 30 minutos à 1 hora após a punção. 5 .O laboratório se encarregará de centrifugação. OBTENÇÃO DE SORO O soro é a fração líquida do sangue. As hemácias se sedimentarão pela centrifugação e o sobrenadante se constituirá em uma amostra de soro isenta de hemólise e pronta para ser utilizada nas reações.O sangue colocado em frasco para a retração do coágulo deve ser mantido em repouso. no campo ou no próprio laboratório. Este sangue deve ser passado instantaneamente para um frasco.Para se obter o soro. Se necessário armazenar o soro. seja no consultório. Se você precisar enviar a amostra do campo para a cidade procure antes retirar a fração líquida a partir do coágulo e enviá-la em um outro vidro bem tampado rotulado e acondicionado em caixa de isopor com gelo. .

Por exemplo. O título de anticorpo de um soro é a diluição mais alta de soro que reage com o antígeno. Portanto. 1/50 etc. 1:50.5 ml de soro em um volume total de 1.1 ml + 9. uma solução diluição 1/10 significa que uma unidade da solução concentrada foi diluída para um volume total de 10 unidades. que não contenha nenhuma das substâncias diluídas. TÉCNICAS GERAL DAS DILUIÇÕES Diluição em múltiplos de 10 Diluição a 1/10 1 ml + 9 ml ou 0. na quantidade requerida para conseguir uma diluição determinada. uma unidade em um total de 10 unidades. pois há 0. Quando colocamos.1 ml + 1. ou seja. ou cloreto de sódio a 0. Isto é conseguido geralmente adicionando-se a uma solução que se pretende diluir um diluente tal como água. o título é 640 unidade/ml de soro.9 ml 1 ml da diluição 1/10 + 4 ml do diluente Diluição 1/100 1 ml + 99 ml ou 0. Usualmente se expressam as diluições como uma unidade da solução original sobre o total de unidades da solução final.1 ml + 0.1 ml + 2. As diluições podem ser representadas como 1:10.85%. As diluições não devem ser interpretadas como significando uma unidade mais 10 unidades.0 ou 1:2. ou 1/10. portanto uma diluição de 0. Em imunologia clínica o título indica a concentração de anticorpo no soro do paciente.9 ml 1 ml de 1/10 + 9 ml Diluição 1/500 1 ml 1/100 + 4 ml Diluição 1 /5000 1 ml 1/1000 + 4 ml Diluição 1/10000 1 ml 1/1000 + 9 ml DILUIÇÕES VARIADAS Diluição a 1/5 = 1 ml + 4ml Diluição a 1/15 = 1 ml + 14 ml ou 0.1 ml + 4.5 ml de NaCl a 0.4 ml Diluição a 1/20 = 1 ml + 19ml ou 0.1 ml + 1.5:1. 0. se o último tubo que demonstra reação contém um volume de 1 ml e o soro neste tubo é uma parte em um total de 640 partes.5ml de soro.6 DILUIÇÕES A diluição é o ato de tornar mais fraca uma dada solução.85% em um tubo e adicionamos a esta solução 0. ficamos com uma diluição do soro a 1:2.9 ml Diluição a 1/25 = 1 ml + 24ml ou 0. etc.0 ml de solução.4 ml 6 .9 ml Diluição a 1/ 50 1 ml + 49 ml ou 0. por exemplo.

Exemplo . utilizando inicialmente apenas o volume de 0. 6)Vamos imaginar que após a interação entre o antígeno e ao anticorpo.Diluições sucessivas na razão igual a 4: 1 .Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3. determine o título dessa reação: Não ocorreu interação Ocorreu interação Ag-AC 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 7 . 3)Utilizando um volume de soro de 0. 1/64. homogeneizar. desprezando 1 ml do último tubo. tenha ocorrido a formação de um precipitado no fundo do tubo (como descrito abaixo na legenda). Exercício de Fixação: 1) Esquematize uma diluição 1/50 de uma solução previamente diluída a 1/10.7 DILUIÇÕES SUCESSIVAS Nesta técnica se transfere sucessivamente volume determinado de um tubo para o tubo seguinte ao qual se adicionou uma certa quantidade de diluente. 1/1024.0 ml do diluente em cada tubo. esquematize uma diluição na razão 3 até o 5º tubo.Distribuir nume série de tubos 3.Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2.4ml. 4 . 4)Esquematize uma diluição 1/64 de uma solução previamente diluída a 1/8. 5 . partindo de uma diluição 1/5. 2 . quando esses estavam presentes em concentração suficiente. 3 .etc.5ml dessa amostra e diluindo até o 8º tubo. homogeneizar com o auxilio de uma pipeta. 1/16. As diluições obtidas serão: 1/4. 5)Esquematize uma diluição 1/625. homogeneizar. Com base no esquema abaixo.Ao tubo 1 adicionar 1 ml da solução corante (a ser diluída).Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. 1/256. 2) Esquematize uma diluição na razão 2 de um soro.

8 CROMATOGRAFIA EM COLUNA Técnicas cromatográficas são atualmente métodos amplamente empregados para o fracionamento de proteínas e isolamento de imunoglobulinas. B = a solução contendo moléculas negativamente carregadas e outras neutras é colocada na coluna. A carboximetil-celulose (CM-celulose) é uma resina carregada negativamente. Pelo aumento da molaridade ou diminuição gradual do pH do tampão de eluição as proteínas são eluidas em função do número crescente de grupos carregados ligados ao gel. A troca do pH do tampão que passa através da coluna afeta a carga da molécula protéica. As características físicas das moléculas de proteínas resultam em retenção destas na matriz do gel em graus diferentes. 8 . No quadro a seguir temos exemplificado a molaridade de NaCl e pH requeridos para eluir as proteínas plasmáticas humanas da DEAE-celulose. cheia de um gel sintético. sendo usada para o fracionamento de moléculas negativamente carregadas. enquanto que as moléculas neutras passam entre as partículas carregadas e são eluidas. sob condições apropriadas. e é usada para o fracionamento de moléculas positivamente carregadas. A dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose) é uma resina positivamente carregada. O aumento da molaridade do tampão fornece mais íons para competir com a proteína pela ligação ao gel. e flui através do gel. C = as moléculas negativamente carregadas. na mistura protéica ligam-se à coluna e são retidas. CROMATOGRAFIA POR TROCA IONICA A cromatografia por troca iônica separa as proteínas aproveitando a diferença de suas cargas elétricas.  A  B  C PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA A = a camada da coluna é feita de uma matriz de partículas de celulose positivamente carregadas. permite a separação das proteínas. geralmente celulose. e a subsequente eluição. Nestas técnicas. A unidade funcional do gel é um grupamento carregado preso em um suporte. uma amostra é depositada no ápice de um cilindro ou coluna de vidro.

Já no pH 4. no pH 2.045 7.100 6. Exemplificamos abaixo a separação de aminoácidos com a resina de troca iônica sob condições ácidas.5 o aminoácido A também é eluido.5 apenas o aminoácido B é eluido. β globulina. IgA 0. O aminoácido A continua adsorvido à coluna.0 transferrina. refletindo as diferenças nas constantes de dissolução dos grupos ionizáveis da resina.5 albumina.5 SO3.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH SO3. Os aminoácidos com a carga positiva trocam de posição com os cátions sódio da resina. β lipoproteína 0.celulose é uma técnica excelente para o isolamento de IgG. de modo que haja um aumento progressivo do pH.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH H3N+ COOH AMINOÁCIDO B SO3. Aumentando-se o pH do tampão. albumina.Na+ OH SO3. e serão eluidos da coluna trocando-se novamente os íons sódio.080 6.0 α 2 globulina.Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A ELUÍDO pH 3.050 7.0 SO3. a qual pode ser obtida quase livre de todas as outras proteínas séricas. Os aminoácidos com carga positiva em um meio fortemente ácido ocuparão as posições do sódio de uma resina de troca catiônica. Utilizando-se de um tampão. ligando-se à carga negativa da resina.025 7.0 (ambos aminoácidos A e B são adsorvidos). haptoglobina -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A cromatografia em DEAE .5 α2 globulina.9 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Molaridade de NaCl PH Proteínas eluidas -----------------------------------------------------------------------------------------------------------0.Na+ SO3 Na + H3N + OH COOH AMINOÁCIDO B ELUÍDO pH 4. fibrinogênio 0. os aminoácidos são eluidos de forma diferente. OH pH 2.8 IgG 0. No pH 3. α 2 globulina.5 9 . os aminoácidos tornam-se carregados negativamente.

C .) é depositada.O círculo aberto (O) representa as partículas de dextran polimerizado sobre as quais um a mistura de moléculas protéicas pequenas (. PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A . não podendo penetrar nestes. A fase estacionária é mais comumente constituída de partículas hidrófilas tipo gel.As moléculas entram e passam através da coluna em proporções diferentes.10 CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO A gel filtração separa as moléculas de acordo com o seu tamanho.) e grandes (. A gel filtração é largamente usada também para separar as cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas ou para isolar proteínas de Bence-Jones (cadeias leves) puras de urina de pacientes com mieloma múltiplo. enquanto as menores são retidas. A B C 10 .As moléculas maiores são eluidas. cujos diâmetros permitem a passagem ou a retenção de moléculas de diferentes tamanhos. Assim. A IgM pode ser facilmente separada de outras imonoglobulinas séricas por gel filtração. O solvente e as moléculas menores que os canais. B .. passam através do gel na fase liquida fora das partículas e são eluidas primeiro. como dextran (Sephadex) . as moléculas protéicas mais volumosas que os poros das partículas. Por isso. penetram no seu interior e ai são retidas. as moléculas aprecem no eluente de coluna em ordem decrescente de tamanho. dependendo primariamente do tamanho e são separadas por um simples processo de peneiração. As partículas são porosas contendo microcanais.

aqueles anticorpos especificos contra o antígeno são retidos pela ligação aos antígenos fixados ao gel. Uma técnica semelhante pode ser usada para purificar um antígeno. o qual desfaz as ligações antígeno-anticorpo. ou as moléculas de antígeno são insolubilizadas pela ligação cruzada com glutaraldeído. acoplando-se um anticorpo a uma matriz inerte. 11 . Um antígeno é acoplado à uma matriz insolúvel tal como a Sepharose. A ligação antígeno-anticorpo é uma das reações que podem ser aplicadas á cromatografia por afinidade.11 CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE A cromatografia por afinidade usa interações biológicas especificas reversível entre o material do gel e a substância a ser isolada. Quando a mistura de anticorpos de diferentes especificações é passada através da coluna. Estes anticorpos específicos podem ser recuperados pela lavagem da coluna com um tampão ácido.

globulina 12 . sua migração será para o pólo negativo ou cátodo. Quando as cargas positivas e negativas se neutralizam.4 . resulta uma carga negativa. O espectro das proteínas séricas varia entre pH 4. Assim.5-8 β globulina β lipoproteína pH 6.4 Albumina α 1 . globulina Alfa (α). No caso das proteínas. em uma dada proteína. é possível a separação dos componentes protéicos do fluidos biológicos. Quanto mais carregada a partícula.6. Esquema isoelétrico das proteínas séricas pH 4. a saber: albumina(fração mais rápida). Quando a soma das cargas positivas excede o número total de cargas negativas. as partículas carregadas avançam para o eletrodo de carga contrária. Em circunstâncias opostas.7 . apresentam ponto isoelétrico acima deste espectro.0. Toda proteína tem seu “ponto isoelétrico”. o que é determinado pelo pH do meio onde a proteína é isoelétrica. a proteína não tem carga e se denomina “isoelétrica”. se for negativa. pH 5. beta(β) globulina e gama(γ) globulina. migrará para o positivo ou ânodo. Assim. em seguida a globulina Alfa (α). Conforme a velocidade de migração. estas possuem grupos amino e carboxílicos livres e devido a isso estão carregadas positiva ou negativamente em solução aquosa na dependência do pH do meio.1. Isto faz com que todas as proteínas se carreguem negativamente e migrem na mesma direção.3 γ . As proteínas que tem pontos isoelétricos mais ácidos.5. Em meio alcalino se carregam eletronegativamente e quando submetidas a uma corrente elétrica migram para o ânodo com uma velocidade que guarda relação com o número de suas cargas.globulina α 2 . ao fenômeno da migração de partículas eletricamente carregadas sob a influência de um solvente condutor (tampão). a molécula tem uma carga positiva. a eletroforese é executada com um tampão de pH fora do espectro isoelétrico.12 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS Princípio: Chama-se eletroforese.8 a 9. Em geral as proteínas séricas são separadas em um pH que varia de 8. elas podem separar-se em cinco grupos principais (por meio da eletroforese convencional de zona).globulina Na maioria das vezes. por outro lado.2.5 a pH 6. estão altamente carregados e migram com maior rapidez.baseando-se na diferença de velocidade de migração das diversas proteínas. se a carga da superfície da partícula for positiva. Algumas proteínas de localização intracelular. com maior velocidade se distanciará dos componentes menos carregados de maneira que as partículas com pouca ou nenhuma carga permanecem relativamente estacionadas.

região das α2globulinas.globulinas. Devem ser feitos testes quantitativos específicos.globulinas e. Cadeias leves livres são prontamente detectáveis na urina quando presentes em quantidades aumentadas. como na proteinuria de Bence Jones do mieloma.13 APLICAÇÕES NA IMUNOLOGIA A eletroforese de zona é extremamente valiosa para o diagnóstico dos distúrbios paraprotéicos humanos tais como mieloma múltiplo e microglobulina de Waldenstron. ocasionalmente. Nestes distúrbios ocorre geralmente um pico protéico restrito eletroforeticamente na região de γ . Picos nestas regiões são também compatíveis com distúrbios paraproteinemicos que envolvem imunoglobulinas. Na eletroforese do soro. mas também são encontradas quantidades significativas na zona de β .globulinas.globulinas do eletroforetograma. para a identificação da proteína em questão. também pode ser detectada com esta técnica. bioquímicos ou imunológicos. tal como ocorre na hipogamaglobulinemia. 13 . a maioria das imunoglobulinas migra para a zona designada γ . Uma diminuição na concentração de γ .

visível depois de seca .0 cm do polo negativo. Agitar até a fita dissolver-se completamente. Repetir o processo até as partes sem proteína na fita ficarem brancas.Fazer os. Fazer a dosagem de proteínas totais da amostra de soro. Só uma superfície da fita é penetrável. 8. 4. cálculos conforme modelo da apostila (pag. Fazer.O. Terminada a corrida. 10. 9. 3. deixar correndo a amostra por 35 minutos.6 forca iônica 0. 11.15) 14 . tubos de ensaio e etc. com a face absorvente voltada para cima (Obs. desligar a cuba. o qual deverá estar situado na posição inferior a direita do operador). cortar as frações coradas e introduzí-las em tubos de ensaio respectivamente marcados..04M) • Corante Ponceau`s • Solução descorante (Metanol a 50%) • Solução de eluição (ácido acético a 80%) • Fonte de continua para 200 volts • Cuba de eletroforese • Espectrofotometro Pipetas. Colocar as fitas de cellogel imersas em tampão de corrida por pelo menos 10 minutos. retirar a fita e colocá-la em banho corante por 10 minutos. Retirar as fitas do tampão e secá-las com papel de filtro. 7. então.036 (Veronal sódico 0.) 13. papel de filtro. Fazer um tubo com um pedaço da fita sem proteína (branco) para zerar o aparelho. obtendo assim a densidade óptica da amostra (D. essa é a face opaca. Lavar o microaplicador com água destilada e colocá-lo em contato com a amostra de soro. microaplicador. 12. contendo 2 ml de solução de eluição. Observar para que ambas as extremidades da fita estejam em contato com a solução tampão e o picote da fita na canaleta positiva. Colocá-las esticadas sobre o suporte da cuba. 5. Método 1. agitar para propiciar a descoloração da fita e transferir para outro banho descorante. 6. Tampa a cuba e ligar.14 TÉCNICA: ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE CELULOSE Material necessário • Fitas de acetato de celulose (CellogelR) • Tampão de corrida pH 8. As tiras tem um angulo picotado.Para a determinação quantitativa das frações protéicas. uma leve aplicação do soro a cerca de 2. ajustando para 200 Volts. 2. Preencher cada um dos compartimentos da cuba de eletroforese com tampão de corrida.Retirar as fitas do banho corante e transferir para um recipiente com a solução descorante.Ler em espectrofotometro usando um comprimento de onda de 520nm.

.........91 7..72 0......18 : 100 = 4.... α1-globulina..........80 x 7..67g/100ml Valores normais : Albumina..1 a 0....10 g% Valor relativo (%) 0.............................6 a 5...0 g/100 ml 0..... de cada fração pela soma-se das D.O.....67 0.........553---------------.3 10......80% 0......841 EXEMPLO Valor relativo (%) 65. 0........15 CÁLCULOS Faz-se a leitura da densidade óptica de cada tubo.. divide-se por 100. β -globulina....0 7....globulina β .5 a 1...9 100... γ-globulina..........841 Valor absoluto (g/100ml) 65.. Somam-se as densidades ópticas de cada fração e para obter-se o valor relativo em % divide-se a D....6 a 1....108 0..... 3............0 Valor absoluto g/100ml 4..O....globulina α2.2 g/100 ml 0.....globulina total D.. α2-globulina.....x X = 0...........globulina γ........061 0.........6 g/100 ml 15 ..8 4...553 0..4 g/100 ml 0...................10 = 467..... Depois.6 a 1......10 Proteína total = 7...0 g/100 ml 0................553 x 100 = 65.......841----------------100% 0.........034 0. FRAÇÕES Albumina α1...O. e multiplica-se por 100..... para verificar o valor absoluto (g/100ml)..1 12.........28 0...52 0.085 0..

Quando ocorre hemólise. acontecerá uma das duas hipóteses: 1. Pfeifer mostrou que. Isto se consegue adicionando-se hemácias de carneiro sensibilizadas. Se. os glóbulos intactos depositam-se lentamente no fundo. mesmo existindo complemento em abundância. sem sedimento visível. seu soro tiver o anticorpo correspondente. quando cobaias restabelecidas de cólera eram infectadas com o vibrião colérico. formando sedimento vermelho. é o ANTÍGENO. sobretudo os glóbulos vermelhos. Se houver complemento livre. encontrada somente no sangue de animal imune (anticorpo). Se. Em tal caso. Quando o soro da cobaia era aquecido. o complemento tiver sido ligado ao complexo Ag-Ac. Logo que se misturam os reagentes os eritrócitos formam uma suspensão vermelha opaca.Introdução: Em 1894. antígeno da superfície bacterianaAnticorpo-complemento in vivo ou in vitro poderá haver bacteriólise. com sobrenadante claro e incolor. A bactéria que induziu a imunidade e contra a qual atividade era dirigida. seu soro possuía forte atividade bacteriolítica contra esse microorganismo. Antígenos solúveis também reagem com anticorpos específicos fixando o complemento.Se o paciente tiver a infecção em questão e se. Estudos posteriormente demonstraram que a atividade bacteriolítica se devia a duas substâncias encontradas no soro: uma resistente ao calor. Outras substâncias. e a adição subsequente do complemento acarretará rapidamente a bacteriólise. e outra sensível ao calor (termolábil). cuja destruição se denomina hemólise. ao contrário. pois não haverá complemento livre para se complexar aos eritrócitos sensibilizados. a hemoglobina difundese no líquido. além das bactérias. Em nenhum dos casos haverá mudanças visíveis para relevar o que aconteceu. este não poderá se fixar as bactérias e. por conseguinte.Se o soro do doente não contiver o anticorpo especifico. o complemento estiver ausente. não ocorrerá hemólise. imunes ou não (complemento). Quando ocorrer a união desses três elementos. Quando se mistura o soro desconhecido com um antígeno específico e o complemento. que toma coloração vermelha transparente. que mostrará o complemento que ainda permanece livre.16 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO I . mas não haverá bacteriólise. 16 . portanto não as lisará. presente no soro de quase todos os animais de sangue quente. por causa da liberação de hemoglobina das hemácias lisadas. é facilmente visível a olho nu. o sistema hemolítico se completa e ocorrerá hemólise. 2. essa atividade desaparecia. ao contrário. Se o anticorpo estiver ausente. num tubo de ensaio. ocorrerá a união do anticorpo com a bactéria. A aplicação da reação de fixação do complemento permite determinar a presença do anticorpo especifico no soro do paciente. diz-se que a bactéria está sensibilizada. e é portanto necessário adicionar um indicador. o complemento permanecerá livre no líquido. o complemento será ligado ou fixado ao complexo antígenoanticorpo específico e nenhum complemento será deixado livre. Se não ocorre a hemólise. o que serve para diagnosticar a infecção correspondente. quando se processa in vitro. podem agir como antígenos. O processo de hemólise.

com o objetivo de demonstrar que nesta reação participam três elementos distintos: ANTÍGENO = ANTICORPO = COMPLEMENTO Material: a .Pipetar 0. Os anticorpos encontrados no soro do coelho podem ser demonstrados pela reação de imunohemólise entre outras.Incubar em banho-maria a 37ºC. este animal produz anticorpos anti-hemácias de carneiro. por 15 minutos.Solução tampão com veronal Técnica: 1 .Pipetar solução fisiológica tamponada: (os respectivos valores em cada tubo) 0.1 ml do soro hemolítico nos tubos 1 e 2 4 .Estante de metal b .Pipetar 0.3 tubos de ensaio c . os alunos executarão a reação de imuno-hemólise.Complemento g .Suspensão de hemácias de carneiro a 5% e . A reação de imune hemólise se verifica nas seguintes condições: Fresco + Suspensão de hemácias de carneiro + incubação a 37º C hemólise + Suspensão de hemácias de ausência de carneiro + incubação a 37ºC hemólise + Suspensão de hemácias de carneiro + Soro fresco de hemólise cobaia (complemento) + Incubação a 37ºC Soro de coelho imunizado contra hemácias de carneiro Inativado a 56ºC/30` Inativado a 56ºC/30` Nesta aula prática.1 d .8 ml no tubo 1 1. 17 .1 ml de suspensão de hemácias nos 3 tubos 3 .Numerar os tubos 2 .5 ml de complemento nos tubos 1 e 3 5 .9 ml no tubo 3 6 .Pipetas de 1 ml graduadas em 0.3 ml no tubo 2 0.17 REAÇÃO IMUNOHEMÓLISE Quando injetamos hemácias de carneiro num coelho.Pipetar 0.Soro hemolítico (hemolisina) f .

Agitar a estante e levá-la a incubação em geladeira 2-4ºC.5 ml 0.Tampão e .18 REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO Material: a .8 ml 2 .5 ml 05 ml 0. Pipetar os reagentes segundo o quadro abaixo: TUBOS Soro do Antígeno paciente (dose ótima) 1(reação) 0.5 ml 2(controle do soro) 0.2 ml do sistema hemolítico (mistura de suspensão de hemácias + soro hemolitico a todos os tubos).Soros (já inativados ) d .1 Técnica: 1. 3 .5 ml tampão 0. a 37ºC por 15 minutos.No dia seguinte.5 ml 4(testemunho do C`) - Complemento DH 50% 0.Sistema hemolitico (hemácias de carneiro + hemolisina ) f .3 ml 0.2 ml 0.Complemento c .Incubar em banho-maria a 37ºC durante 30 minutos.Estante de metal g .Tubos de 12 x 75 mm h .6 ml 0.Antígeno b . por 18 horas e. acrescentar 0. QUADRO PARA ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS: RESULTADO Reação Soro Controle do soro Testemunho do Ag Testemunho do C INTERPRETAÇÃO 18 .2ml 3(testemunho do ag) 0.Pipetas de 1 ml em 0. a seguir. 4 .1 ml 0.

d) Tubos capilares.Ac .5 pode ocorrer precipitação não específica e o pH acima de 8. como por exemplo. O pH deve ser entre 6. mas deve se esperar 40 a 48 horas para o resultado final. a reação ocorre mais lentamente e a temperatura acima de 37ºC pode resultar na formação das linhas de precipitação. sendo que.5 a 8. Na temperatura mais baixa. A principal aplicação desta técnica tem sido na identificação de antígenos e anticorpos em misturas desconhecidas (como os fluídos biológicos). e) Solução de antígeno de Paracoccidioide brasiliensis f) Solução de anticorpos antiantígeno de Paracoccidioidis brasiliensis (soro controle) g)Soro humano para o teste h) Furador i) Câmara úmida 19 . Os reagentes difundem-se radialmente formando uma linha visível resultante da precipitação e somente na região onde os dois reagentes se encontram nas proporções adequadas. Na imunodifusão radial dupla. O complexo antígeno .8 pode impedir a reação e dissociar complexos de Ag . poderá interferir na solubilidade das proteínas. MATERIAL a) Solução de agar a 1% em solução fisiológica. os reagentes são colocados em orifícios separados e opostos feitos no gel. c) Pipetas graduadas de 5 ml. demonstrando independência imunológica total entre os reagentes pesquisados. bem como na paracoccidioidomicose. em que em determinado ponto de ótima proporção dos reagentes ou próximos deste. ocorre a reação de precipitação. Geralmente usam-se lâminas de microscopia revestidas com camada de gel de ágar a 1% em solução salina ou tamponada. forca iônica do tampão. na hepatite crônica ativa.anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arcos de precipitação. A imunodifusão é usada também com finalidade diagnóstica. tais arcos podem fundir-se dando identidade total ou parcial (esporão) ou intercruzam-se.8 pois em pH abaixo de 6. tempo e principalmente as concentrações relativas de antígenos e anticorpo. parcialmente idênticas ou independentes. Outra grande importância é a de se poder saber se duas substâncias são imunológicamentes idênticas. A temperatura deve ser constante e entre a 4ºC e 37ºC . A forca iônica maior ou menor do que a do tampão recomendado.19 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO SEMI-SÓLIDO Imunodifusão radial dupla (reacão de Ouchterlony) Esta técnica pode ser definida como a difusão de antígenos e anticorpos homólogos um em direção ao outro num meio gelificado. A reação usualmente ocorre entre 16 a 24 horas. temperatura. b) Lâminas de microscopia. Fatores que interferem na reação de precipitação são: pH. na anemia infecciosa eqüina.

soro do paciente 1 2 – soro controle positivo B .Deixar dentro da placa de Petri.Fazer a leitura após 24 ou 48 horas. 5 .20 TÉCNICA: 1 . OA O1 O2 O3 OB O4 A – Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 1 . ao lado.soro do paciente 2 20 . algodão úmido para manter a umidade. 3. em câmara úmida. Esperar esfriar. ou de uma cuba apropriada.Aplicar. 4 .Colocar a lâmina com o gel sobre o modelo (gabarito) e fazer os orifícios nos pontos indicados. 3 ml de ágar fundido em solução fisiológica. usando um capilar para cada amostra. os antígenos e anticorpos de acordo com o esquema.Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) 3 . por 5 minutos. de maneira uniforme sobre a lâmina.soro controle positivo 4 . 2 . Levar à geladeira.Aplicar. utilizando um furador. colocando.

o resultado esperado na seguinte reação de imunodifusão radial dupla: B E A D C LEGENDA: A= Solução de anti-IgA das secreções B=Saliva humana C=Solução de anti-IgM D= Solução de cadeias pesadas α E=Solução de IgA sérica b) Através de seus conhecimentos sobre Imunoglobulinas justifique os resultados nos encontros das linhas: Entre B e C: ___________________________________________ Entre C e D: ___________________________________________ Entre D e E: ___________________________________________ Entre E e B: ____________________________________________ 21 . através de linhas. esquematize.21 Após a leitura do resultado e interpretação faça o seguinte exercício para sua auto-avaliação: a) Utilizando os reagentes de acordo com a legenda abaixo.

para monucleose.Classificação de pneumococos e estreptococos. Na aglutinação indireta faz-se adsorsão passiva ou acoplamento químico de antígenos solúveis a eritrócitos ou outras partículas inertes. Exemplo de reações de aglutinação empregadas com finalidade de diagnóstico: 1 . a aglutinação está completa e as partículas são examinadas diretamente ou microscopicamente para evidência dos grumos. 3 . 22 .para febre tifóide.Reação de crio-hemaglutininas para pneumonia atípica primária.22 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno faz parte da superfície de eritrócitos.Reação de aglutinação rápida e aglutinação lenta para brucelose.Classificação de Salmonellas. uma vez que os eletrólitos vão neutralizar a carga elétrica da partícula que em pH neutro possuem carga livre ou resultante negativa .5 ml ou em placas de microaglutinação com quantidade bem menores de reagentes.Reação de Coombs . As reações de aglutinação requerem a presença de eletrólitos. 4 .Reação de aglutinação para lepstospirose.Reação de Wiel-Felix .0. O fenômeno de pro-zona produz reações de aglutinação falsamente negativas em concentrações altas de anticorpos.Reação de hemaglutinação indireta para toxoplasmose. 7 .Reação de Widal .Determinação dos grupos sangüíneos e fator Rh. Testes para detectar anticorpos especificos são realizados pela titulação de soros imunes em diluições seriadas (2x) na presença de uma quantidade constante de antígeno. No teste de aglutinação direta eritrócitos.para diagnóstico de várias viroses. Em anti-soros com títulos aglutinantes altos.para diagnóstico da artrite reumatóide. Os testes são feitos em pequenos tubos de ensaio em volumes de 0. 11 . Muitos antígenos se acoplam espontaneamente com eritrócitos e formam reagentes estáveis para a detecção de anticorpos.Reação de Waaller . 6 . um fenômeno de pro-zona pode obscurecer os resultados. Após poucas horas de incubação. para doença de chagas. Os resultados são expressos geralmente em títulos isto é.Reação de aglutinação direta para toxoplasmose. resultando em maior sensibilidade. 12 .para riquetsiose.para revelar anticorpos incompletos em várias doenças.Reação de aglutinação de Paul-Bunnell . Os testes de aglutinação indireta podem ser também realizados em tubos ou placas de microaglutinação.Davidson . 2 . etc. Por causa da variabilidade intrínseca no sistema de teste. o inverso da maior diluição do soro na qual ocorre aglutinação.Rose . 8 .2 . Os anticorpos adicionais a estas suspensões combinam com o antígeno localizado na superfície das partículas unindo-as entre si. OUTRAS APLICAÇÕES DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO 1 . 10 . 3 .Reação de inibição de hemaglutinação . Shigelas e colipatogênicos.Reação de aglutinação para listeriose. 5 . Neutralizada esta força repulsiva. formando um agregado nítido. bactérias ou mesmo de partículas inertes (ex: látex) que foram recobertas por um antígeno. 2 . bactérias e uma variedade de espécies microbianas podem ser diretamente aglutinadas por anticorpos séricos. 9 . um título precisa diferir em pelo menos duas diluições (dois tubos) para ser diferente de qualquer titulo dado. as células se aproximam permitindo a formação de pontes moleculares.

Agitar o frasco do antígeno padronizado e colocar uma gota do antígeno de Brucela (30 µl) ao lado da fração de soro.(Vide anexa no fim da apostila). Atenção: Em soros apresentando títulos altos de anticorpos pode ocorrer o fenômeno de pró-zona.23 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM PLACA PARA PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-BRUCELA Objetivo: Demonstração da Aglutinação Direta da suspensão bacteriana de Brucella abortus por anticorpos anti-brucela presentes no soro. 03 . pipetar 0. o Conselho Federal de Medicina Veterinária editou portaria específica que orienta a realização e a interpretação das reações sorológicas para o diagnóstico da Brucelose Animal. aglutinação direta). NOTA: O resultado encontrado é expresso por um título. O antígeno utilizado nessa reação foi preparado de acordo com técnica internacional recomendada pelo Ministério da Agricultura. previamente identificadas com a respectiva diluição). Por isso.Misturar cada composição soro-antígeno com um bastão. o inverso da maior diluição onde se identificou a reação (no caso. Reação negativa (-): não aglutinação. no sentido da maior para a menor diluição). que é um evento em que o excesso de anticorpos presentes no soro teste faz com que a equivalência da interação Ag/Ac somente ocorra após altas diluições desse soro. nas reações em que se visualizam a pró-zona.2 ml. 1:50 . TÉCNICA 01 . ou seja. 1:100 . 05 . As diluições finais serão aproximadamente 1:25 .5% e corada com verde brilhante e cristal violeta.Fazer a leitura observando a aglutinação com uma fonte de luz apropriada.08. Em face da importância da Brucelose com zoonose. 04 . iniciando com a diluição contendo 0. 1: 400. 0.Agitar a placa com suaves movimentos circulares de 15 a 20 vezes por 3 minutos. 23 .04.01 e 0.Com uma pipeta específica para reação aglutinação direta para o diagnóstico da brucelose (Pipeta de Bang) ou com pipeta de 0.05 ml do soro teste depositando separadamente cada fração do material sobre uma série de quadrados numa placa de vidro específica para esta reação (ou pipetar individualmente cada uma das quantidades indicadas colocando-as em lâminas individuais de microscopia. 0.(Cuidado para não encostar a pipeta com antígeno na fração de soro para não haver contaminação do antígeno). estando em uma concentração celular de 11%. 1:200 . 02 .02.08 ml de soro (ou seja.05 ml até a diluição contendo 0. em salina fenicada a 8. 0. Reação positiva (+): presença de aglutinação. as primeiras diluições de soro mostram-se negativas e as últimas (maiores) diluições apresentam reação positiva. ao contrário do que comumente ocorre.

24 . 02 . 2 . Trata-se de um fosfolipídio.Partículas finamente dispersas . e à produção de anticorpos. que pode ser extraído em alto grau de pureza do coração de bovino e é denominado cardiolipina. 03 .Partículas agrupadas em pequenos grumos .D. Para tornar-se imunogênica a cardiolipina deve se ligar a uma proteína carreadora.soro fortemente reativo.R.soro fracamente reativo. TÉCNICA: 01 . Pacientes com sífilis desenvolvem uma resposta de anticorpos contra um hapteno ubiquitário que existe nos tecidos dos mamíferos. nos quais o hapteno é adsorvido a superfície de cristais de colesterol (reação de floculação de Kline. reforçada pela adição de doses adequadas de colesterol e de lecitina constitui excelente antígeno para a detecção da reagina sifilítica. Infecções pelo Treponema pallidum levam à liberação nos fluídos orgânicos de cardiolipina.Lâminas escavadas. seja em testes de aglutinação passiva. é um hapteno.Agitar. INTERPRETAÇÃO .Partículas agrupadas em grandes grumos . MATERIAL NECESSÁRIO: 1 . através de uma técnica de microaglutinação passiva feita em placa escavada. entretanto. A cardiolipina. durante 04 minutos.L. Cardiolipina sozinha.Leitura: A leitura deve ser feita imediatamente após a agitação observando ao microscópio de acordo com a intensidade da reação.. etc).Em cada escavação da placa colocar 01 gota (0. 3 . Anticorpos para antígenos cardiolipínicos são conhecidos como anticorpos de Wasserman ou reagínicos. ( a agitação pode ser manual).REAÇÃO DE VDRL (VENERAL DISEASES RESEARCH LABORATORY) A reação do VDRL é usada para o diagnóstico sorológico da sífilis.m.05 ml ) dos diferentes soros. 5 .Pipetas Pasteur.não reativo .p. isto é. .24 REAÇÃO DE MICROAGLUTINAÇÃO PASSIVA . V. 4 . a 180 r. no agitador próprio.0 ml (agulha sem bisel).Acrescentar a cada soro uma gota de suspensão antigênica com uma seringa de 1.Suspensão do antígeno. seja em testes de fixação do complemento (reação de Wasserman).Seringa de 1 ml sem o bisel (ponta). inativados a 56ºC durante 30 minutos. soros positivo e negativo. 04 . somente se liga a anticorpos. mas não estimula sua produção. a qual faz parte normalmente da membrana mitocondrial.Soros a testar. movimentos rotatórios da placa sobre a superfície da mesa com amplitude de mais ou menos 03 cm.

Preparar uma diluição a 1/20 do soro.Misturar e distribuir o conteúdo de cada círculo por toda sua área com um estilete. como grumos visíveis 25 . Este antígeno reage imunológicamente com o anticorpo (fator reumatóide) presentes no soro. pipetando 0. POSITIVO: Aglutinação nítida que se apresenta macroscópicamente dentro de 2 minutos. 02 .Adicionar uma gota do reativo látex globulina. se encontra adsorvido a superfície de um suporte inerte de látex de poliestireno. Pode ser detectado por uma reação de aglutinação passiva ou indireta.Colocar no círculo central da placa fornecida. e observar macroscopicamente o resultado da reação por tempo não maior que 2 minutos. RESULTADO: NEGATIVO: Suspensão homogênea.Colocar no círculo à esquerda 01 (uma) gota do soro controle positivo e no círculo a direita 01 ( uma) gota do soro controle negativo. O fator reumatóide é considerado um anticorpo contra a IgG. 04 . 03 . TÉCNICA: 01 . 05 . onde o antígeno.05 ml do soro teste no tubo contendo o tampão e homogeneizar bem. 06 .25 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA: Teste para a pesquisa do Fator Reumatóide Látex Princípio: O fator reumatóide é uma macroglobulina (IgM) que se encontra presente no soro de 85 a 90% dos pacientes com Artrite Reumatóide e em 3 a 5% dos indivíduos normais. previamente agitado. Usar um para cada círculo. resultando numa aglutinação visível macroscópicamente.Agitar suavemente a placa com movimentos circulares.95 ml do tampão glicina e a seguir 0. IgG humana desnaturada pelo calor. 1 gota da diluição 1/20 do soro a testar. a cada um dos círculos.

B. TÉCNICA: Seguir o esquema que se segue 1 gota: sangue 1 gota: sangue Grupos - soro anti A soro anti B Misturar com o bordo de uma lâmina limpa. c) Soro anti B. Landsteiner (1990) verificou que era regra todo indivíduo apresentar no seu plasma aglutininas contra os aglutinógenos que lhes eram estranhos: -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Aglutinógenos nas Aglutininas no hemácias Plasma -----------------------------------------------------------------------------------------------------------A A Anti B B B Anti A O Anti A e Anti B AB A e B -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Isso torna possível a tipagem do sangue de um indivíduo dentro do sistema ABO quer pelas hemácias.Sistema ABO De acordo com a existência ou não dos aglutinógenos A e/ou B. AB e O. d) Pipetas Pasteur. (REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA) MATERIAL: a) Sangue total. b) Soro anti A.TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTÍGENO NAS HEMÁCIAS. os indivíduos da espécie humana podem ser divididos em 04 grupos: A. 1 . A leitura é feita por visualização da aglutinação: 26 . quer pelo plasma. nas hemácias. e) Lâminas de microscopia.26 IMUNO-HEMATOLOGIA 1) Grupos sangüíneos .

D (Rh) observando-se a aglutinação ou não das hemácias a temperatura ambiente. Seguir o esquema 1 gota: soro 1 gota: soro 1 gota hemácia A 1 gota de hemácia B . c) Hemácias B. MATERIAL: a) Soro desconhecido.(negativo). c) Lâminas.Misturar com o bordo de uma lâmina limpa e efetuar a leitura pela presença ou não de aglutinação. b) Hemácias A. b) Soro anti D (Rh).SISTEMA Rh De acordo com a existência ou não do antígeno D(Rh) nas hemácias os indivíduos da espécie humana são Rh+ (positivo) ou Rh . e) Lâminas. Sangue: 1 gota de sangue Soro: anti -D 27 . d) Pipetas de Pasteur. TECNICA: A tipagem comumente é feita em lâmina usando-se como reagente soro anti . mas na prática transfusional apenas o antígeno D (Rh) é pesquisado por ser mais imunogênico. GRUPO SANGÜÍNEO . MATERIAL: a) Sangue total.27 - 2 . O sistema Rh possui ainda outros antígenos. d) Pipetas Pasteur.TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTICORPOS NO SORO.

Adicionar ao sedimento de hemácias. 05 . O teste de Coombs direto é feito para diagnóstico da D. 09 .p.Retirar o tubo do banho-maria e completar até 01 cm da borda com solução fisiológica ou PBS FOSFATO e centrifugar a 3000 rpm ( + ou .m). também denominada prova de antiglobulina humana.Aglutinação presente: Teste positivo Aglutinação ausente: Teste negativo 28 . de crianças e adição de soro de Coombs. Em recém-nascido de mães sensibilizadas.A cada um dos tubos acrescentar uma gota de suspensão de hemácias O Rh (+) 5%. 03 .Preparar uma suspensão a 5% de hemácias O-Rh positivas.Adicionar 02 gotas de albumina bovina a 22% em cada tubo. em um 3º tubo colocar uma gota de soro controle negativo (marcar (-) no tubo). consiste no emprego do soro antigamaglobulina humana (soro de Coombs) para promover a aglutinação de hemácias previamente incubadas com anticorpos incompletos. INTERPRETAÇÃO 10 . decantar completamente o sobrenadante.Agitar suavemente para misturar e centrifugar imediatamente ( 01 minuto a 1000 r.Colocar em um tubo de ensaio uma gota do soro a ser testado (marcar T no tubo).Agitar.H. 07 .N. 04 . 02 . em um 2º tubo colocar uma gota de soro controle positivo (marcar (+) no tubo).Após a última lavagem. Teste de Coombs indireto é utilizado para o diagnóstico de anticorpos incompletos no soro de qualquer pessoa possivelmente sensibilizada por antígenos eritrocitários do sistema Rh (sensibilização pós-transfusional ou no decurso de gestação). e incubar a 37ºC durante 15 minutos. Consiste na lavagem de hemácias já sensibilizadas. TÉCNICA PARA O TESTE INDIRETO 01 .28 TESTE DE COOMBS A prova de Coombs. ressuspender o sedimento de hemácias e repetir esta operação por mais 02 vezes.R.03 minutos). para misturar. 02 gotas de soro de Coombs. 08 . decantar o sobrenadante por inversão do tubo. invertendo o tubo e enxugando a borda do mesmo com papel absorvente. 06 . A lavagem é feita para evitar a reação das proteínas livres.

4) Desprezar 50µl do 11º poço (último). 10) Ler a reação após 2 horas. e a diluição dos soros e reagentes será feita através de pipetas automáticas. A reação será realizada em placas de microaglutinação. 8) Colocar 50µl de hemácia sensibilizada com o antígeno do vírus Hepatite B em todos os poços. C etc. escolhemos fazer a pesquisa de antígenos do vírus da Hepatite B por tal método. 6) Colocar 50µl de soro anti-antígeno Hbs em cada poço. à medida que autorizaram uma sensibilidade maior para a pesquisa daqueles reagentes. proceder com esta diluição até o último poço (numero 11). 3) Homogeneizar o conteúdo do 1º poço e passar 50µl para o 2º poço . Com o objetivo de conduzir os alunos de graduação desta instituição para a compreensão de mais uma variação. do 1º ao 11º poço. Cada poço da placa de microaglutinação e reconhecido também por “well”. na placa. onde não sofra vibrações. homogeneizar novamente e passar 50 µl do 2º poço para o 3º . B. Esse tipo de placa presta-se a reações em que trabalhamos com pequenos volumes de reagentes. Observe. que os poços estão distribuídos formando linhas: linhas A. 1 A B C D E F G H 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PROCEDIMENTO 1) Utilizando a linha A.29 MÉTODO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA As variações sobre os métodos de aglutinação surgiram ampliando as possibilidades de diagnóstico e pesquisa de anticorpos e de antígenos. colocar 50µl de tampão diluente em cada poço. o método de Inibição da Aglutinação Passiva. 7) Agitar levemente a placa. a partir do 2º poço até o 11º poço dessa linha. 9) Selar com fita Durex para que não haja evaporação dos reagentes e colocar a placa sobre uma superfície rígida. 5) Agitar levemente a placa. 29 . 2) Colocar 100 µl de soro humano no 1º poço.

30 ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) Este teste foi desenvolvido em 1971 por Engvall e Perlmann como alternativa ao radioiumunoensaio. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos. Anticorpos ou antígenos podem ser conjugados a enzimas de maneira que. é gerado um produto colorido que poderá ser observado a olho nu (ensaio qualitativo) ou ter sua densidade óptica medida por espectrofotometria (ensaio quantitativo). cruzi Solução tamponada de Caseína a 1% Solução tampão para lavagem Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Estufa à 37°C 30 .O do controle positivo). • Método de captura: Um anticorpo específico é adsorvido à placa para reter o objeto da pesquisa. Tais placas contêm séries de poços onde serão depositados os reagentes. gerando um complexo que na presença de um terceiro composto um doador de elétrons (cromógeno ) forma um polímero intensamente colorido. O cromógeno mais utilizado em ELISA é o OPD (ortofenileno diamina). que poderá ser o antígeno ou mesmo uma classe de anticorpo em particular. entre eles os mais empregados são: • Método indireto: amplamente empregado para a pesquisa de anticorpos apresentando como vantagem a utilização de um único conjugado em diferentes sistemas. BSA) no diluente da amostra (bloqueio). e reage especificamente com seu substrato. gelatina. O conjugado utilizado deverá ser específico para a estrutura capturada na placa. materiais que possibilitam a ligação covalente de proteínas. ao ser adicionado o substrato da enzima à reação. cruzi PRIMEIRA AULA – SENSIBILIZAÇÃO E BLOQUEIO DA PLACA Material necessário: Placas de poliestireno Solução contendo antígenos de T. Independente do método escolhido para leitura é necessário determinar o limite de reatividade ou “cut-off” do teste. o peróxido de hidrogênio. tal como placas de poliestireno ou polivinil. Vários métodos são realizados utilizando o principio do enzima-imunoensaio. preferencialmente monoclonais. Os conjugados devem ser preparados com anticorpos de alta afinidade. que pode ser obtido pela relação entre a coloração da amostra e a coloração do controle positivo (D. A adsorção não específica de componentes à placa pode ser reduzida incluindo-se uma proteína inerte (caseína. podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados.O da amostra/D. O princípio básico é a adsorção de um dos reagentes (antígeno ou o anticorpo) a uma fase sólida. A enzima peroxidase é muito utilizada para este teste. TÉCNICA DE ELISA INDIRETO PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-T.

Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. cruzi. Pipetar em duplicata (em dois poços consecutivos) 100µl dos soros controles e dos soros testes de acordo com o esquema abaixo: A: Controle negativo B: Controle negativo C: Controle positivo D: Controle Positivo E: Soro teste 1 E: Soro teste 2 F: Soro teste 3 G:Soro teste 4 31 . cruzi. cruzi e bloqueadas.31 Metodologia: Sensibilização da placa: 1. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur. cada poço da placa. Inverter a placa e bater sobre papel de filtro para retirar o excesso de tampão. Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Soro Controle Positivo Soro Controle Negativo Soros testes Conjugado enzimático Solução reveladora (peróxido de hidrogênio+OPD) Metodologia: 1. Pipetar 200µl de solução contendo antígenos de T. 3. cada poço da placa. Adicionar 200µl de solução de bloqueio (Caseína a 1%) a cada poço da placa e incubar overnight a 37°C. desprezar a solução de antígenos de T. Trabalhando com a placa previamente sensibilizada. Boqueio de placa previamente sensibilizada: 1. SEGUNDA AULA – Detecção de anticorpos anti-T. Incubar 2 horas à 37°C em estufa. 5. 2. cruzi em cada poço da placa de poliestireno. 2. 4. Material necessário: Placas previamente sensibilizadas com antígenos de T.

Inverter e bater a placa sobre superfície com papel de filtro. 3. 7. Novamente incubar 15 minutos à 37ºC. Leitura visual de placa pronta 32 . Levar para incubação em estufa durante 15 minutos à 37º C. 8. Adicionar 100µl de solução reveladora (substrato+cromógeno) em cada poço. Inverter e bater a placa. 6. 11. Desprezar o conteúdo da placa e lavra três vezes com solução tampão. 4. 5. Incubar a placa 30 minutos à 37ºC. 9. 10. Lavar três vezes a placa com solução tampão.32 2. Adicionar 100µl de conjugado a cada poço da placa.

isto é. Para a observação microscópica da fluorescência é necessária uma adaptação do microscópio óptico comum. que emite cor vermelha. que se conjuga facilmente as proteínas em pH alcalino (acima de 9 ). C D A B ---------------__ _ _ _ _ _ _ __ Radiação de longos comprimentos de onda Radiação de curtos comprimentos de onda A . ou seja maior comprimento de onda do que o da luz incidente ou absorvida. A fluorescência é a emissão de luz de uma cor. filtros de excitação para produzir um comprimento de onda capaz de causar ativação do fluorocromo e filtros para evitar a passagem pela ocular. resultando em fluorescência.495 nm. que tem a capacidade de absorver a energia luminosa. É possível tornar visível a reação Ag-Ac marcando um dos reagentes com substâncias ditas fluorocromos.Preparo fluorescente C . Os fluorocromos apresentam espectros de absorção e emissão característicos. em seguida emiti-la sob a forma de uma radiação de maior comprimento de onda. Ambos os fluorocromos são empregados sob a forma isotiocianato.Filtros de barreiras Esquema do sistema óptico do microscópio de fluorescência.Filtros excitadores D .33 REAÇÕES DE IMUNOFLUORÊSCÊNCIA FINALIDADE: Detecção de anticorpos ou de antígenos. O comprimento da onda emitido (fluorescente) terá necessariamente menor energia. e emite sua cor verde característica a 517 nm. O isotiocianato de tetrametilrodamina. As técnicas utilizadas para o estudo de imunofluorescência comportam duas modalidades principais: 33 . A absorção máxima do isotiocianato de fluoresceína é de 490 . Os fluorocromos mais usados em laboratório clínico são a fluoresceína e a rodamina. contendo uma fonte de luz excitadora de alta intensidade. de luz de baixo comprimento de onda.Lâmpada de halogênio B . armazená-la durante curto espaço de tempo (10-9 a 10-7 de segundos) para. tem um máximo de absorção a 550 nm e emissão máxima a 580 nm. comprimento de onda. enquanto uma substância é irradiada com luz de cor diferente.

sorotipos de leptospiras. trata-se com um anticorpo fluorescente com especificidade dirigida para os determinantes antigênicos do anticorpo ligado ao antígeno. 2 . sorotipos de colibacilos enteropatogênicos. esquistossomose. Sobre a preparação de antígeno fixado à lâmina. anti HIV. anti-DNA.baseia-se na detecção de anticorpos utilizando um antígeno conhecido e um soro anti-imunoglobulina humana.34 1 . doenças de Chagas. aplica-se primeiro o anticorpo específico não fluorescente. 34 . marcado com fluoresceína. Usa-se esta técnica na pesquisa de anticorpos circulantes no diagnóstico de: toxoplasmose. anticorpos antireóide. após haver a reação Ag-Ac. etc.Imunofluorescência indireta . lava-se a preparação para remover todas proteínas (imunoglobulina) não fixadas pelo antígeno. e a seguir. etc. como estreptococos beta-hemolíticos do grupo A. antinucleoproteína.Imunofluorescência direta . leptospirose.baseia-se na detecção de antígenos utilizando anticorpos específicos marcados com isotiocianato de fluoresceína. É o processo comumente usado para a identificação de microorganismos por imunofluorescência. bacilo diftérico. sífilis.

1 ml do soro. 1/64 .Preparar diluições a 1/16 do soro controle positivo e do soro controle negativo. homogeneizar bem e passar 0. 2 . 12 . secar como no indicado do item 8 e montá-las com glicerina alcalina e lamínula. 35 . da seguinte maneira: a . ainda que de pequena intensidade. campo escuro. Como título tomar o inverso da maior diluição do soro para a qual se evidencia fluorescência em toda a periferia dos toxoplasmas. diluído conforme seu título.02 ml).Marcar as lâminas com os respectivos soros. 10 minutos cada lavagem. homogeneizar bem e passar 0.Observar os preparados ao microscópio de fluorescência. 8 .Pipetar no 1º tubo 0. 1/256 .2. 10 . b .Incubar a 37ºC em câmara úmida.1 ml para o 2º tubo.3 ml nos demais tubos.02 ml) das diluições dos soros em cada área das lâminas.Lavá-las 2 (duas) vezes em PBS. Nas reações negativas os toxoplasmas não apresentam fluorescência ou esta fica localizada apenas nas extremidades dos parasitas (coloração polar). com objetiva de imersão. como demonstrado no esquema abaixo. na razão de 1/16 .Remover os soros de cada lâmina sob delicado jato de água e lavá-las por imersão por duas vezes em PBS.Enxugar o verso e as bordas das lâminas com papel absorvente e ao redor das áreas da reação. 4 . 3 .Secar bem as lâminas fixadas com antígeno. 5 . Secá-las com ar quente. 9 .Colocar no tubo 1/16 1. 7 . em cada área das lâminas.Depositar pequenas gotas (0. filtro excitador BG 12/2 mm ou KP 500 e filtro barreira 50. 1/1024 .Preparar diluições dos soros em solução salina tamponada pH 7. 1/4096.Incubar novamente as lâminas a 37ºC por 30 minutos.5 ml de salina tamponada e 0.Depositar uma pequena gota do conjugado fluorescente liquido antiimunoglobulina humana (cerca de 0. em câmara úmida. TOXO 1/16 1/256 1/64 1/4096 1/1024 _ + 6 . 11 . por 30 minutos.35 TÉCNICA DA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA TOXOPLASMOSE 1 . 5 (cinco) minutos de cada vez.1 ml para o 3º tubo e assim sucessivamente.

esforçando-se para saber descrever com clareza sobre o que está sendo perguntado. pesquise. Se tiver dúvidas sobre qualquer uma das respostas. Responda-os com cuidado e atenção.36 PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS Esta parte da apostila apresenta de forma sucinta os objetivos gerais e específicos de algumas unidades do nosso programa. Ao final de cada unidade e após os estudos. discuta com os colegas ou procure os professores da disciplina. Tal seção tem como finalidade permitir ao aluno uma auto-avaliação sobre o tema tratado em sala de aula. os alunos deverão ter compreendido o assunto tratado se forem capazes de responder aos seguintes objetivos: 36 . que deverão ser feitos em casa.

3. Citar os principais mecanismos de resistência inespecífica. 5. 2. Descrever os principais elementos da pele e de que forma atuam na resistência inespecífica. Descrever os principais elementos da mucosa e de que forma atuam na resistência inespecífica. 37 . Entender os fenômenos de defesa como mecanismos de adaptação às agressões do meio ambiente.37 UNIDADE: RESISTÊNCIA INESPECÍFICA Objetivos gerais e específicos: 1. 4. Conceituar e diferenciar resistência inespecífica e específica.

Definir a função da cada célula dentro da resposta imunológica. d.Diferenciar morfologicamente imunológica.Diferenciar quanto a origem e função os linfócitos T e os linfócitos B.Diferenciar as células que atuam na defesa especifica.38 UNIDADE: CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE Objetivos gerais e específicos: a . b. cada célula que participa dos eventos da resposta c. daqueles que atuam na defesa inespecifica. e. 38 .Reconhecer as células que participam da resposta e fenômenos imunológicos.

16) Justificar a proliferação celular nos órgãos linfóides primários. 10) Justificar a hiperplasia de um órgão linfóide secundário. 4) Relacionar funcionalmente a membrana do saco vitelino. 14) Reconhecer o papel das vênulas pós-capilares de endotélio alto nos linfonodos com relação ao tráfego de linfócitos. à partir da célula primitiva. 7) Comparar e justificar os efeitos da timectomia neo-natal e na fase adulta. 9) Explicar o centro germinativo nos linfonodos. 15) Justificar a proliferação linfocitária nos órgãos linfóides secundários.39 UNIDADES: FORMAÇÃO DE CÉLULAS T E B e ÓRGÃOS LINFÓIDES Objetivos gerais e específicos: 1) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides primários no sistema imunológico. o fígado fetal e a medula óssea. 5) Relacionar os passos envolvidos na formação de células T efetoras. aos órgãos linfóides secundários. 8) Reconhecer aspectos da adaptabilidade dos órgãos linfóides secundários para a fase de reconhecimento antigênico na resposta imune. considerando as fases de uma resposta imunológica. à partir da célula primitiva. para o sistema imune. 39 . 11) Reconhecer a principal via de acesso das “estruturas estranhas”. 3) Descrever as características histológicas e anatômicas dos órgãos linfóides primários e secundários. 6) Relacionar os passos envolvidos na formação de plasmócitos secretores de anticorpos. 13) Explicar como os linfócitos efetores produzidos em um linfonodo têm acesso a um sítio de infecção em outra região ou tecido. 12) Explicar o tráfego de linfócitos no organismo. 2) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides secundários no sistema imunológico.

Justificar a diversidade de epítopos em uma determinada substância imunogênica. Reconhecer a estrutura de um epítopo em uma molécula protéica. Exemplificar a situação em que uma substância apresenta antigenicidade e não apresenta imunogenicidade. Explicar três formas de ação dos adjuvantes imunológicos. Citar e explicar os fatores que contribuem para a imunogenicidade de uma molécula. Definir o termo imunogenicidade e antigenicidade. 7. em geral .40 UNIDADE: ANTÍGENOS Objetivos gerais e específicos: 1. 5. Conceituar e exemplificar “hapteno”. 11. 8. 4. 10. entre antígenos. Explicar os fenômenos de reatividade cruzada. 6. 2. Citar os adjuvantes imunológicos mais empregados. 3. 40 . 9. Conceituar “epítopo”. Explicar a condição para que haja formação de uma resposta imunológica para os haptenos.

g) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro.41 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos I) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo imunoglobulinas. m) Definir as imunoglobulinas que apresentam peça J e qual a função desta peça. b) Determinar a estrutura básica de uma molécula de imunogobulina. o) Definir a imunoglobulina de maior peso molecular. j) Determinar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. f) Definir sitio combinatório. i) Esquematizar o mecanismo de formação de IgAS desde sua síntese até sua chegada na secreções. 41 . em relação as outras imunoglobulinas. k) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM. d) Identificar na molécula as regiões Fab e Fc. n) Relatar a importância da transferência placentária de imunoglobulina na espécie humana. l) Reconhecer a forma de participação da IgE nas reações alérgicas. c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina. h) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. qual a classe que desempenha este papel e a que se deve esta propriedade. e) Citar as diferentes classes de imunoglobulinas existentes.

1. w) Determinar estruturalmente a composição de uma IgD.Cadeia leve 3. r) Esquematizar o mecanismo de formação da IgAS desde sua síntese até sua chegada nas secreções. d) Identificar os fragmentos resultantes após a clivagem enzimática de uma molécula de imunoglobulina pela ação de pepsina e da papaína. x) Reconhecer a forma de participação de IgE nas reações alérgicas.Domínios variáveis e constantes nas cadeias leves e pesadas 4. n) Definir as principais propriedades biológicas da IgG. s) Explicar a importância da IgAS na defesa local das mucosas. v) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM. p) Reconhecer as subclasses existentes de IgA. m) Identificar as sub-classes de IgG existentes. e) Diferenciar os diversos isótipos de cadeias leves e de cadeias pesadas existentes.42 UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos II) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo Imunoglobulinas.Região carboxi-terminal l) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro. relação as outras 42 . q) Discriminar estruturalmente uma molécula de IgG e uma de IgAS. t) Determinar estruturalmente a composição de uma molécula de IgM. b) Reconhecer a estrutura básica de uma molécula de imunoglobulina. h) Conceituar idiótipos. o) Definir a propriedade de opsonização de que é dotada a IgG.Cadeia pesada 2. c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina. g) Conceituar e exemplificar alotipia em cadeias leves e pesadas. f) Reconhecer as imunoglobulinas que apresentam subclasses e diferenciar estas subclasses de acordo com a nomeclatura vigente. u) Determinar o peso molecular e quantidade relativa de IgM encontrada no soro. i) Esquematizar uma molécula de IgG reconhecendo nela os seguintes tópicos. em imunoglobulinas.

♦ Justificar a participação de uma resposta imuno especifica na ativação do Sistema do Complemento. Explicar o mecanismo da ação dos fragmentos de ação biológica. clássica e efetora do sistema do complemento.43 UNIDADE: SISTEMA COMPLEMENTO Objetivos gerais e específicos: ♦ Descrever os efeitos biológicos surgidos pela ativação do Sistema do Complemento. agregação plaquetária. ♦ Identificar a analogia entre as enzimas C4b2a e C 3bBb. ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ 43 . quimiotaxia para PMN e lise celular. Reconhecer as bases de um mecanismo homeostático em relação à ativação do sistema do complemento. por que na maioria das células os mecanismos de lise pelo Complemento não são possíveis. Justificar. Demonstrar como o sistema do complemento participa da eliminação de antígenos que não são celulares ou que não tem membrana exposta. através dos textos bibliográficos. Explicar a ausência da alça de amplificação da via alternativa nos processos fisiológicos de ativação do Sistema do Complemento. nos fenômenos de aumento de permeabilidade capilar. produzidos pela ativação do Sistema do Complemento. ♦ Justificar o papel inespecífico da ação do sistema do complemento. Justificar a ação lesiva do sistema do complemento para células do próprio hospedeiro. ♦ Identificar os fatores ativadores da via clásssica e da via alternativa do Sistema do Complemento. ♦ Identificar a via alternativa. Explicar o desenvolvimento de uma alça de amplificação na ativação da via alternativa. ♦ Reconhecer o mecanismo de ativação da via alternativa e da via clássica do Sistema do Complemento.

o) Relacione a fagocitose a mecanismos de resistência inespecífica. m) Caracterizar a via oxigênio independente. j) Definir as duas principais vias de destruição da partícula fagocitada. k) Caracterizar a via oxigênio dependente. n) Citar as principais enzimas que atuam a via oxigênio independente. f) Explicar a importância do fenômeno da opsonização. g) Caracterizar o sinal de ativação do fagócito no momento da opsonização. c) Identificar os principais fatores quimiotáticos para PMN e macrófagos. pinocitose. h) Explicar a fase de englobamento realizada pelo fagócito i) Explicar a fase de digestão durante a fagocitose. 44 .44 UNIDADE: FAGOCITOSE Objetivos gerais e específicos: a) Definir fagocitose. d) Citar as principais substâncias que desempenham o papel de opsoninas. endocitose e exocitose. b) Identificar as principais células que participam da resistência inespecífica. e) Definir opsonização. l) Citar os radicais livres produzidos na via oxigênio dependente e definir sua importância na destruição de estrutura fagocitada.

4) Estabelecer a função dos antígenos de classe I e classe II. (Faça um desenho esquematizando as principais características de ambas). 8) Reconhecer na molécula de classe II. no camundongo e no ser humano: 2) Citar quais são os produtos da decodificação do CHP. 45 . “MHC”) Objetivos gerais e específicos: 1) Definir o que é CHP e onde este se localiza. a região de ligação ao peptídeo. 7) Reconhecer na molécula de classe I. 9) Relacionar as moléculas de classe I e II do CHP com os antígenos exógenos e aqueles de síntese endógena.45 UNIDADE: Complexo de Histocompatibilidade Principal(CHP. 6) Localizar as moléculas de classe I e de classe II nas diferentes populações celulares. a região de ligação ao peptídeo. 5) Esquematize as estruturas das moléculas de classe I e II. 3) Denominar os produtos do CHP Humano.

46 UNIDADE: Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) e mecanismos de Apresentação de Antígenos 1) Definir quais são as principais células apresentadoras de antígenos e onde elas se localizam. 5) Definir em qual situação. 2) Definir as principais características quanto às estruturas de superfície celular e fagocitose de cada APC. 4) Descrever no macrófago. 7) Numa infecção por um patógeno intracelular em uma célula cilíndrica do trato digestivo superior. 9) Explicar porque a apresentação de antígenos externos se dá no contexto de moléculas de classeII. 10) Definir qual o papel do INF. uma molécula viral pode ser apresentada no contexto de moléculas de classe I do CHP: 6) Esquematizar como ocorre o processo de apresentação de antígenos no contexto de moléculas de classe II. quais são as etapas que culminam com a apresentação de antígenos pelas células. 8) Estabelecer onde ocorre a interação entre antígenos próprios e as moléculas do CHP e como ocorre este mecanismo. 3) Exemplificar qual é a molécula que poderia sugerir uma função de célula apresentadora de antígeno. 46 . estabelecer de que forma o organismo reconhecerá que naquela célula está se desenvolvendo uma infecção e como esta será debelada.γ na apresentação do antígeno.

6. Elaborar um quadro comparativo. 4. TNF 18. Definir e diferenciar linfócitos TH1 e TH2 8. IL-5 14. Definir estrutural e funcionalmente os principais marcadores de superfície dos linfócitos T 2. IL-2 11. Definir como ocorre a ativação do repertório de células T citotóxicas (CTL). Esquematizar as etapas de ativação dos linfócitos T auxiliares. quanto a função e produtos das subpopulações TH1 e TH2.47 UNIDADE: Linfócitos T 1. IL-3 12. Reconhecer o mecanismo de interação na apresentação de Ag aos linfócitos T citotóxicos ou CD8+. 5. IL-12 47 . Definir a etapa seguinte à ativação dos LT auxiliares. 9. IL-4 13. Reconhecer o mecanismo de interação da célula apresentadora de antígeno com os linfócitos T CD4+. 3. Definir funcionalmente e quanto às células produtoras as seguintes citocinas: 10. INF-γ 17. 7. IL-6 15. IL-10 16.

48 .48 UNIDADE: Linfócitos B e Resposta Humoral Primária e Secundária 1. 15. 10. 3. 11. o que é esperado quando se imuniza artificialmente uma criança e porque. 13. Definir mudança de classe ou “Switch”que ocorre durante a síntese de imunoglobulinas. Estabelecer com relação ao comportamento de linfócitos B. 7. 8. Explicar porque a resposta secundária é a mais rápida do que a resposta primária. 9. Estabelecer a finalidade da ativação do repertório de linfócitos B. Definir as principais interleucinas produzidas pelos linfócitos T que têm ação sobre linfócitos B e em que fase elas agem e de que forma. 12. Explicar a que se deve a maior produção de Ig durante uma resposta humoral secundária. 4. 14. Estabelecer as fases que precedem a interação entre linfócitos B e linfócitos T e o objetivo desta interação. Definir a ontogenia dos linfócitos B no homem. 6. Estabelecer a diferença que existe entre as fases das respostas primárias e secundária. 5. Reconhecer os marcadores de superfície dos linfócitos B e função fisiológica dos mesmos. Explicar porque se pode dizer que um linfócito B é uma APC. 16. Diferenciar a ativação por antígenos timo-dependentes e timo-independentes. Definir o mecanismo do capuz ou “Capping” e citar a função do mesmo. Definir as fases de ativação dos linfócitos B. Identificar as fases da curva que representa uma resposta humoral e a característica de cada fase. Definir a primeira imunoglobulina a ser produzida em resposta a uma infecção. Definir o resultado final da ativação do repertório de linfócitos B. 2. 17.

Defina intron e exon. Justifique a necessidade de haver imunoglobulinas de diferentes classes. 8. 10. Conceitue “Fenômeno de Restrição Isotípica”. 11. 5. 6. Identifique o processo de “diversidade funcional por inserção”. Explique as causas da grande variabilidade de sítios combinatórios das imunoglobulinas. Responder: por ‘que. 16. 13. Identifique a seqüência genética existente para a síntese das diferentes cadeias pesadas de imunoglubulinas. 2. Explicar por que uma célula que sofreu um “Switch” para a síntese de IgG não mais poderá voltar a sintetizar IgM. há variação na síntese da porção constante da cadeia pesada de imunoglubolinas e não ocorre o mesmo para a porção variável? 49 . Responda: é possível que um linfócito B apresente em sua superfície diferentes classes de imunoglobulinas ao mesmo tempo ? Em que situações? 12. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias pesadas das imunoglobulinas. 14. 7. 3.49 UNIDADE: Genética das Imunoglobulinas Objetivos gerais e específicos: 1. Diferencie o rearranjo gênico que existe durante a fase primordial e a fase tardia de síntese das imunoglobulinas. 4. Conceitue “Fenômeno de Restrição Alélica”. 9. Identifique a diferença na codificação genética entre imunoglobulina de membrana e imunoglobulina secretada. Diferencie os rearranjos gênicos que existem nas cadeias leves e pesadas. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves Kappa das imunoglobulinas. 15. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves lambda das imunoglobulinas. durante o “Swicth”.

identificar a cinética de uma infecção viral numa célula hepática e a resolução desta infecção pelo sistema imunológico. então. utilizando todos os conceitos que você já aprendeu. 50 . é bem possível que você já possa prever como será. Portanto. Tente.50 INTERAÇÃO DO SISTEMA IMUNOLÓGICO Se você foi capaz de responder a estes questionários contendo os objetivos específicos já é capaz de compreender as diversas faces do sistema imune. ou como deverá ser. a reação do organismo frente a alteração do padrão fisiológico do mesmo. realizando um esquema completo.

3. Explicar a importância da drenagem venosa na tolerância por via oral. 6. Conceituar “Tolerância imunológica”.51 UNIDADE Tolerância Imunológica Objetivos gerais e específicos: 1. Justificar o papel do contato de longa duração na duração de tolerância. 5. 4. Reconhecer sua participação e importância no Sistema Imunológico. 51 . Explicar a participação da via oral na indução da tolerância. Explicar os mecanismos imunológicos pelos quais o sistema imunológico desenvolve tolerância aos antígenos próprios e não próprios. 2. Conhecer os fatores favorecedores da resposta ao tolerogênico.

Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo III. 4.52 UNIDADE HIPERSENSIBILIDADE 1. 7. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo IV. segundo Gel e Coombs 3. 9. 6. nos tipos imediatos e tardios. Citar os mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo III. Relacionar as reações de hipersensibilidade da classificação de Gel e Coombs. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade IV. 5. 12. 20. 2. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo I. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo I. Classificar as reações de hipersensibilidade quanto aos seus mediadores imunológicos. 17. 21. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo III. 10. de imunoglobulina(s) envolvida(s) na mediação da 16. 13. 19. Reconhecer a propriedade hipersensibilidade tipo I. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo III. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo III. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo II. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo I. Identificar a(s) classe(s) hipersensibilidade tipo II. 15. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo IV. fundamental das imunoglobulinas mediadoras da 18. Reconhecer a origem. 8. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada por uma reação de hipersensibilidade tipo I. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo I. Definir o que é uma reação de hipersensibilidade. 11. 52 . ação e efeito dos mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. 14.

Diferenciar a formação de uma reação de Arthus com uma reação tipo III sistêmica. 39. Explicar o mecanismo da injúria tecidual pelo mecanismo de hipersensibilidade tipo IV. Justificar uma neutropenia após a administração do antibiótico cloranfenicol. Justificar a presença destas células no infiltrado . Caracteritizar os tipos celulares predominantes no infiltrado inflamatório mediado por hipersensibilidade tipo IV. 27. 26. 28. 32. Entender a origem da histamina e seu papel na hipersensibilidade tipo III. 29. 34. Justificar a induração que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilização tipo IV. 38. Justificar a escolha dos Ag em uso nos testes intradérmicos de avaliação de imunidade celular. 25. Justificar fenômenos hemorrágicos presentes na reação inflamatória por hipersensibilidade tipo III. 37. Compreender a utilização de testes intradérmicos de hipersensibilidade tipo IV para avaliação de imunidade celular.53 22. Descrever os principais mecanismos da lesão celular por hipersensibilidade tipo II. 24. 31. Explicar o papel do sistema do complemento nas reações de hipersenbilidade tipo III. Diferenciar o mecanismo de formação de edema na hipersensibilidade tipo I e III. 53 . 36. Explicar as reações aceitas para a permanência de imunecomplexos circulantes o organismo. Identificar o principal mediador imune da reação inflamatória tipo IV na classificação de Gel e Coombs. reconhecendo os fatores liberados por células responsáveis. Explicar a reação de Arthus. 30. Reconhecer a localização do Ag na hipersensibilidade tipo II. Justificar a isquêmia que pode acompanhar as reações de hipersensibilidade tipo III. 40. 33. 35. 23. Justificar o eritema que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilidade tipo IV.

Relacionar estas estruturas moleculares e o MHC. 54 . 10.54 UNIDADE: TRANSPLANTES Objetivos gerais e específicos: 1. 13. 7. 4. que são responsáveis pela indução da rejeição aos mesmos. 2. 3. envolvidos. Montar um exemplo de um perfil para a expressão fenotípica de todos esses locus em um indivíduo. Explicar a reação de Enxerto X Hospedeiro e justificar a sua presença nos transplantes de medula óssea. Interpretar uma prova cruzada positiva. 5. 8. Citar os principais locus da região HLA. Reconhecer quais a estruturas moleculares das células de um enxerto. Explicar os mecanismos de agressão às células enxertadas. 9. Reconhecer os tipos de rejeição aos enxertos identificando os principais elementos da resposta imune. Justificar o valor da análise do perfil de HLA na seleção do doador vivo 11. Justificar a importância da Prova Cruzada que antecede os transplantes. 12. Conhecer a nomenclatura correspondente aos enxertos. 6. Associar MHC e HLA. Citar as provas de seleção para doador vivo para os transplantes.

Explicar o princípio de uma eletroforese de proteínas.Reconhecer e explicar o fato das albuminas migrarem com maior velocidade. 5.Reconhecer o que atuou como suporte na corrida eletroforética realizada no laboratório. OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS: Ao final do exercício desta prática no laboratório o aluno deve estar apto a: 1.Dar a definição de ponto Isoétrico de uma proteína e explicar sua participação no princípio desta técnica.55 SUBUNIDADE: “ELETROFORESE DE PROTEÍNAS”. 4. 2.Fundamentar a razão de todas as proteínas migrarem em um único sentido. 55 .Justificar a importância do pH alcalino do tampão utilizado. 3. 6.

56 PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS EXERCÍCIOS 56 .

3. Essa reação processa-se em tubos onde seguiu-se a metodologia abaixo.O que estava sendo pesquisado b.laboratorial de termos adsorvidos.diga qual a importância clínico. para assim recobrir os espaços não ocupados pelo anticorpo (bloqueio do tubo).Posteriormente realizou-se a lavagem do sistema. Após a leitura e compreensão responda o que se pede abaixo: METODOLOGIA: A cada tubo foi adsorvido previamente anticorpos anti-IgM humana. 5. A adsorção se dá por ligações covalentes entre os anticorpos e o material do tubo (poliestireno). marcador com l125 (um isótopo radioativo cuja emissão de radiação pode ser medida em um cintilômetro). 8. 57 . 2. anticorpos anti-IgM e não anti-IgG. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina. antígeno extraídos do vírus da Hepatite A.Mediu-se a radiação do tubo. 7. PERGUNTA-SE a.Seguiu-se nova etapa de lavagem. 1.A seguir procedeu-se a incubação a 37º C por 30 minutos.Adicionou-se a seguir. 6. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da HEPATITE A.57 RIE (RADIOIMUNISAIO) Abaixo está representado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender.Realizou-se nova lavagem do sistema. ao tubo.Adicionou-se então anticorpos anti-vírus da hepatite A.Ao tubo foi adicionado soro suspeito para o exame. uma condição favorecedora da interação Ag/Ac. 4.

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ELISA ( ENZIME LINKED IMUNOSORBENT ASSAY)
Abaixo está apresentado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS . Acompanhado será fornecido uma placa com 96 poços onde seguiu-se a metodologia abaixo. METODOLOGIA A cada poço foi adsorvido previamente antígenos extraídos dos vírus da AIDS. A adsorção se dá através de ligações covalentes entre os antígenos e o material da placa. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina, para assim recobrir os espaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da placa). 1- Foram adicionados aos poços 1 e 2 soros procedentes de dois pacientes suspeitos de terem anticorpos anti-HIV ( vírus da imunodeficiência humana causador da AIDS). 2- A placa foi levada a uma estufa a 37 ºC por 30 minutos, uma condição favorecedora da interação Ag/Ac. 3- A seguir esse poço foi lavado com uma solução tampão com finalidade de retirar moléculas livres. 4- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas. As moléculas desses anticorpos tinham, ligadas em si, no Fc, uma enzima (peroxidase) cujo substrato pode ser o peróxido de hidrogênio. Esse substrato ao sofrer a ação daquela enzima manifesta uma cor alaranjada que se revela quando se adiciona ao meio uma substância reveladora ( no caso o ortofenilenodiamino-OPD). A ligação da enzima ao anticorpo não altera as propriedades anticórpicas desse. Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 5- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 6- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 7- Logo após observou-se que a solução no poço 1 ficou alaranjada enquanto que no poço 2 não houve alteração. Responda: a- Esquematize os dois poços evidenciando as reações Ag/Ac que ocorrerem ou deixarem de ocorrer. b- Após a realização do item 3, esquematize o que permaneceu no poço 1. c- Como você interpreta o resultado visível nos poços 1 e 2 respectivamente?

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WESTERN BLOTTING
É um dos métodos mais utilizados para identificar proteínas reconhecidas por anticorpos, sendo designado também de immunoblotting, diferenciando-se do “Southern ou Northen blotting”, que se prestam a identificação de ácidos nucléicos. Abaixo está apresentado um exemplo de Western blotting que se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS. Leia com atenção e responda. 1- Para a realização de um Western blotting inicialmente as proteínas virais são separadas, de acordo com seu tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio - um detergente (SDS-PAGE). 2- Em seguida as proteínas fracionadas no gel são transferidas por corrente elétrica, para uma membrana de nitrocelulose que posteriormente será recortada em tiras. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina ou a caseína, para assim recobrir os pedaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da fita). 3- A cada tira é adicionado em recipiente apropriado soro de paciente suspeito de ter anticorpos anti-HIV. 4- Segue-se um período de incubação de 30 minutos a 37º C, e extensiva lavagem para a remoção das proteínas livres. 5- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas marcadas com uma enzima (peroxidade). Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado. 6- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 7- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 8- Em seguida observou-se que algumas fitas apresentavam bandas (faixas) coradas denotando reação, enquanto outras não se coraram. RESPONDA: 1- Poderíamos pesquisar subclasses de IgG, ou mesmos outro isótipo de imunoglobulinas? Como? 2- O que significa exatamente a presença de bandas coradas, com relação as possíveis interações ocorridas?

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IMUNOHISTOQUÍMICA
A aplicação da imunohistoquímica (IHQ) à rotina diagnóstica já é uma realidade em nosso meio. De modo genérico, podemos considerar como principais indicações para o exame: ♦ Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente diferenciadas ♦ Subtipagem de neoplasias ♦ Caracterização da origem de carcinomas. ♦ Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas ♦ Discriminação da natureza benigna X maligna de determinadas proliferações celulares. ♦ Avaliação prognóstica de neoplasias ♦ Identificação de agentes infecciosos. Como exemplo, temos representado abaixo uma reação de IHQ para a pesquisa de receptores de estrógeno em células de adenocarcinoma de mama, um fator prognóstico neste caso. 1- Para a realização reação de imunohistoquímica utilizamos cortes de tecido incluído em parafina com aproximadamente 3 µ de espessura, colocados em lâminas tratadas com silano ( silanizadas), para propiciar uma forte adesão do corte histológico à lâmina 2- Em seguida as lãminas são desparafinizadas, sendo deixadas na estufa à 60°C por 24 horas, no xilol à 60°C e no xilol a temperatura ambiente para desparafinização 3- Após a desparafinização as lâminas são levadas à uma sequência de banhos de álcool absoluto até 80% para hidratação. 9- Posteriormente segue-se a etapa conhecida como recuperação antigênica. Necessária para que se restabeleça a estrutura antigênica das proteínas estruturais, modificada pela ação do formol. Tal etapa poderá ser feita por dois métodos: Calor úmido: em solução tampão citrato de sódio pH 6,0 4M, em banho-maria, panela de pressão ou microondas por tempo determinado. Enzimático: tratamento do corte com proteinase K 10- Segue-se o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 11- Adição de anticorpo monoclonal de coelho específico, anti-receptor para estrógeno 12- Incubação por 30 minutos à 37°C e overnight na geladeira. 13- No dia seguinte etapa de lavagem com solução tampão 14- Adição de um anticorpo anti- anticorpo de coelho, marcado com estrepavidina, incubação à 37°C 15- Nova etapa de lavagem 16- Adição de complexo biotina-estreptoavidina complexada com, nova incubação à 37°C 17- Lavagem e adição de solução de Dab (Diaminobenzidina 60mg%) 18- Contra coloração com hematoxilina. 19- Observação no microscópio de núcleos corados de marrom. RESPONDA: Qual a finalidade das etapas de lavagem? Por que fazemos a recuperação antigênica? Como seria um resultado negativo?

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61 .61 EXERCÍCIO SOBRE RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO VIRAL E BACTERIANA 1. descreva todos os prováveis eventos de uma resposta imunológica. esta célula passa a ostentar em sua superfície. tal como uma do gênero Streptoccocus. nosso organismo for infectado por uma bactéria extracelular qualquer. que possua em sua parede antígenos de natureza polissacarídica e glicoproteíca. moléculas codificadas pelo genoma viral. através dos quais este hospedeiro reagirá à infecção viral. 2. que você conhece.Se em uma situação hipotética.Sabendo-se que os vírus ao infectarem um organismo. qual seria a resposta esperada do sistema imune?. inserem seu genoma no genoma de uma célula do hospedeiro e que assim.

fração de crescimento e propriedades cinéticas. Essas células são rotuladas com uma “etiqueta” fluorescente. pode processar milhares de células em alguns segundos. indicando fatores prognósticos e rumos terapêuticos. vermelho e muito mais vermelho. e intensidade de fluorescência verde. 62 . morfologia e outras características de uma população de células. em um fluxo contínuo passando uma de cada vez. Embora faça medidas em uma célula de cada vez. G2 e M do ciclo celular. classificação estéril. a citometria de fluxo pode ser usada para a contagem de células de diferentes tipos em uma mistura. seqüencialmente. Contanto que diferentes tipos de células possam ser distintas por características estruturais quantitativas. estudos funcionais. cada célula fornece 5 números: tamanho. medicina e outras. análise de DNA. pode também estimar a distribuição das populações celulares ou fases do ciclo celular. Permite o estudo da variabilidade genômica pelo perfil colorimétrico do conteúdo de DNA. em frente a um feixe laser com sensores para medir fluorescência e dispersão de luz. registrar os parâmetros cinéticos do tumor a ploidia do tumor.62 CITOMETRIA DE FLUXO Pela acadêmica de Farmácia Daniela Silva Moreira Introdução: A citometria de fluxo consiste em um método laboratorial para definir o tamanho. As células devem estar em uma suspensão de células simples com o mínimo de agregação (suspensão monodispersa). Um citomêtro de fluxo pode medir estes parâmetros a uma taxa de milhares de células por minuto. ou fixas com paraformaldeído. É uma técnica de medição das propriedades óticas da células individuais. Desenvolvimento: A citometria de fluxo mede características corpóreas e químicas de células ou partículas que estão em suspensão uma a uma num determinado ponto. A linha simples de fluxo das células passa pelo raio laser do instrumento. forma e complexidade interna e. Esta metodologia de análise é aplicável em diversas áreas de pesquisa. microbiologia. análise e classificação de cromossomo. As informações podem ser adquiridas na citometria de fluxo utilizando células vivas. é claro qualquer componente da célula ou função que possam ser detectada por um composto fluorescente quando examinada. muito utilizado na classificação de leucemias. granulosidade. tais como botânica. Podemos obter medidas corpóreas das células como tamanho. a fração de proliferação tumoral e a percentagem de células encontradas nas fases S e G1. genética. é também utilizada para identificar as sub-populações de linfócitos especifícos. ou partículas em geral. zoologia. E assim. As aplicações incluem: análise de fenótipo. para contagem de CD4 e CD8.

que representa o perfil da população de células. A utilização dos CD3 irá discriminar os linfócitos CD8+ das NK. O marcador CD3 é expresso na superfície de células “T” maduras ( CD4 e CD8). A cada sessão. como por exemplo na infecção pelo HIV. gerados a partir da fluorescência. a porcentagem de células positivas à citometria de fluxo. minimizando o erro. linfócitos B e os linfócitos NK. a coloração da população de células-alvos com um corante fluorescente ( geralmente iodeto de propídio). por sua vez atravessa um raio laser. o sistema óptico do laser detectores eletrônicos. A população alvo colorida é. A energia da luz emitida pelo laser excita o corante fluorescente contido em cada célula. baseada em anticorpos monoclonais marcados com substâncias fluorescentes. CD4e CD8. fluxo este que. Os linfócitos T são ainda sub-classificados em duas sub-populações funcionais: os CD4 auxiliares e os CD8 citotóxicos. A metodologia mais atual para a contagem de CD4 e CD8 e para a identificação das sub-populações de linfócitos específicos. Embora não identifiquem células individuais. A importância clínica de se fazer citometria de fluxo para separar e contar o número de linfócitos T CD4+ e CD8+. O CD8.alvo. conseguem identificar a tendência central de uma determinada população de células. e o número de células é calculado com base na intensidade da fluorescência . em monócitos. passada por um pequeno tubo que cria um fluxo de células únicas. 63 . Provoca-se uma excitação desses elementos fluorescentes com uma luz “laser”e a identificação ótica é feita de maneira automatizada pelo sistema .63 -Técnica de Citometria de Fluxo A técnica de citometria automatizada de fluxo envolve. através da ligação de um anticorpo monoclonal específico para a população alvo. A contagem absoluta das sub-populações de linfócitos é obtida a partir de 3 determinações sequenciais separadas: a contagem total dos glóbulos brancos do sangue total. estes histogramas. CD8 e CD3. é devido os níveis normais se alterarem nas imunodeficiências e em certas doenças.Separação de linfócitos por citometria de fluxo: Os linfócitos são classificados em 3 sub-populações: linfócitos T. e assim determinar um tratamento para a doença. conversores analógicos para digitais e computadores. o diferencial de glóbulos brancos. primeiro. marcado com o corante fluorescente. O CD4 é expresso na superfície de células (linfócitos) CD4+. E através desses níveis de linfócitos podemos indicar a progressão ou regressão de uma doença. por sua vez é expresso na superfície dos linfócitos CD8+ e em algumas células NK. . 100 microlitos de sangue total é investigado com anticorpos monoclonais específicos dirigidos contra os marcadores CD3. dirigidas contra os marcadores de superfície CD4. Estes dados são em seguida registrados e mostrados na forma de histograma. mas também. utiliza uma técnica sofisticada de citometria de fluxo. então. Os citômetros de fluxo envolvem fluidos sofisticados.

que permite a separação e contagem de células com excelente sensibilidade diagnóstica.hcan.unipi.br/citometria -www. identificação das sub-populações de linfócitos do sangue.htm -Citometria de Fluxo → www.do. Permitindo o diagnóstico e prognóstico de diversas doenças. e assim direcionando os rumos terapêuticos. • Bibliografia: -Di Dio.br/hot news .capacity. genética.html -Citometria do DNA → www. Renato CD4/CD8 → www.org. também utilizado para determinar as fases do ciclo celular na fração de proliferação de tumores. medicina e outras.htm -www. usado na classificação de leucemias. como .it/apher/write/cytome.uk/axp/facs/davies/flow.uronews.64 Conclusão: Portanto a técnica de citometria de fluxo vem sendo muito utilizada. pois é um teste simples.br/g 105.med. Além de ser um método aplicável em diversas áreas. microbiologia.com.icnet.criesp.htm -www. determinar a quantidade de DNA numa população celular.6. etc.html 64 .com .org.br/inform/ Cd4/Cd8 .

1989. HOXTER. II:46-60. G. SILVA. J.Editora Guanabara. L. A. J. Ano IX. E. H. VAZ. 4ª edição. Edição Extra. L. FUNDENBERG. BACCHI. F. nº 52:08-26 ALVES. . .. Obs.. Imunologia Básica e Aplicada. A. Imunologia Básica 2000. H. VASSALO. D. Aplicações Clínicas da Imunoeletroforese. V. C. WELLS. A. Revista LAES. maio/85. V. VOOS. Rio de Janeiro. 65 .65 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIER. C. Rio de Janeiro. 2ª ed. J.. P.. CALICH. Eletroforese. D.V. Vol.: Algumas técnicas foram obtidas a partir dos Kits reagentes. Imunologia Básica e Clínica. STITES. 2ª edição. .. MOTA. 1980. C. São Paulo 1999. Manual de Imunohistoquímica. CALDWELL. O. W. Revista LAES. Editora Guanabara. Ano VI. I.

prova do antígeno tamponado acidificado (prova do cartão .DO DIAGNÓSTICO Art. A prova de sêmen-plasma-aglutinação será utilizada em reprodutores dos Centros de Inseminação Artificial e além da prova de soroaglutinação. 2º. Art. será utilizada para determinação da taxa de prevalência da Brucelose em rebanhos leiteiros. DE 20 DE JANEIRO DE 1976 Aprova as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal O MINISTRO DE ESTADO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO. tendo em vista o disposto no art. A prova do anel no leite. UI: Unidades internacionais 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Art. O diagnóstico de rotina da Brucelose em bovinos será realizado através das provas de soroaglutinação rápida ou lenta. resolve: Art. anexas à presente Portaria.º 23 Ministério da Agricultura e do Abastecimento PORTARIA nº 23. precipitação pelo rivanol. NORMAS PARA A PROFILAXIA DA BRUCELOSE ANIMAL CAPÍTULO I . aprovado pelo Decreto nº 24. 4º. Como provas especiais. cuja interpretação obedecerá aos quadros a seguir: Bovinos não vacinados ou vacinados com idade superior a 8 meses 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + + + 1/100 (100 UI/ml) I + + + 1/200 (200 UI/ml) I + Interpretação Negativa Negativa Negativa Suspeita Suspeita Suspeita Positiva Positiva Positiva Bovinos de 30 meses ou mais. 1º. Art. respectivamente. Revogar as Portarias Ministeriais números 486 e 222. de 22 de abril de 1958 e 5 de março de 1969. Art. de 03 de julho de 1934 e considerando a necessidade de atualizar a legislação existente sobre profilaxia da Brucelose. 2º. 3º. redução pelo mercapto-etanol. no uso de suas atribuições. visando dirimir eventuais dúvidas. do Regulamento do Serviço de Defesa Sanitária Animal. vacinados entre 3 e 8 meses de idade 1/25 1/50 (25 UI/ml) (50 UI/ml) I + + I + + + + + + + + + + Convenções: I: Aglutinação incompleta. +: Aglutinação completa. assinadas pelo Diretor Geral do Departamento Nacional de Produção Animal. 86. 1º. em amostras compostas. 66 .66 Anexo CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA PORTARIA N. poderão ser utilizadas as provas de fixação do complemento. em provas de rotina no caso de rebanhos-problema."card test") e prova individual do anel do leite. Aprovar as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal.548.

serão identificadas com ferro candente. Art. elaborada com a amostra 19 de Br. desinfetando os locais contaminados. cabendo ao órgão local do Ministério da Agricultura o acompanhamento e controle da produção. b. acompanhado do algarismo final do ano da vacinação. quando devidamente identificada. com um V. marcar as bezerras vacinadas. A vacinação de fêmeas adultas com a amostra 19 poderá ser autorizada em propriedades onde estiverem ocorrendo surtos de abortos brucélicos. dos protocolos. mediante requerimento do proprietário e autorização expressa do responsável pelo programa de combate à Brucelose na respectiva Unidade da Federação. CAPÍTULO V . isolar as vacas reagentes por ocasião do parto. 14. b. a vacinação será realizada apenas uma vez.DOS ANIMAIS REAGENTES Art. as bezerras destinadas ao Registro Genealógico. abortus. c. em 3 (três) vias.67 Art. A vacina com a amostra 19 será produzida por laboratórios autorizados. A vacina com a amostra 19 será apresentada sob a forma liofilizada. c.DA VACINAÇÃO DE BEZERRAS Art. não poderão ser objeto de comércio. a critério da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. que serão fornecidas pela unidade de controle. 15. vacinar somente bezerras entre 3 e 8 meses de idade. sêmen e outros materiais possivelmente infetados. CAPÍTULO II . somente uma vez. 12. Art. Art. Excluem-se da marcação. observando-se os seguintes critérios. 13. as fêmeas vacinadas com a idade superior a 8 (oito) meses. Os animais que revelarem reação positiva serão marcados a ferro candente. constantes do Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA). CAPÍTULO III . com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetro) de diâmetro conforme Anexo 1.DA VACINAÇÃO DE FÊMEAS ADULTAS Art. do estoque de vacina. 9º. 8º. Art. Art. isolar os animais reagentes. no lado esquerdo da cara. a 2ª ao serviço veterinário oficial e a 3ª ao emitente. o Serviço de Inspeção Federal no estabelecimento onde será realizado o sacrifício deverá ser notificado com antecedência. 11. A aplicação da vacina da amostra 19. admitindo-se a vacina líquida até o aparelhamento dos laboratórios produtores. salvo quando comprovadamente destinadas ao abate ou a instituições científicas. recomenda-se a adoção das seguintes providências: a. até que cessem os corrimentos vaginais. não se admitindo vacinação de machos. 67 . Recomenda-se o sacrifício dos bovinos com reação positiva. Art. considerando a porcentagem de incidência da doença e as condições locais. leite. o proprietário dos animais deverá assinar termo de compromisso. no lado direito da cara. 5º. aceitando as condições estabelecidas. a. Os bovinos positivos ou suspeitos de Brucelose. b. enterrar o feto e seus anexos. conforme modelo do anexo 2. será efetuada sob a responsabilidade de médico veterinário. Art. b. 16. Como necessário. Cada partida de vacina produzida será oficialmente controlada. com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetros) de diâmetro. bem como a coleta de amostras das partidas produzidas. A imunização dos bovinos contra a Brucelose será levada a efeito pela vacinação de bezerras. Nos casos em que não seja possível o sacrifício. CAPÍTULO IV . observando-se a legislação federal específica e de acordo com as técnicas recomendadas pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. observandose o seguinte critério: a. c. observando-se as seguintes condições: a. em cada propriedade afetada. os sacrifício será realizado em matadouro sob inspeção federal e o julgamento efetuado de acordo com as disposições em vigor. 7º. quando observado aborto. poderão ser realizados exames bacteriológicos de fetos abortados. destinando-se a 1ª ao proprietário. controlada pelo órgão oficial competente. de forma a permitir a adoção das medidas previstas no RIISPOA. anexos fetais. 10. no lado esquerdo da cara. após a liberação da partida correspondente. 6º. Os frascos de vacina levarão etiquetas oficiais. aplicando rigorosos cuidados higiênicos complementares. conforme Anexo 1. emitir atestado de vacinação. com vacina viva.DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE VACINAS Art. com ferro candente.

ou atestado negativo para Brucelose. positivos os animais com títulos iguais ou superiores a 1:25. 26. 17. sendo neste caso. para obtenção do Certificado de Propriedade Livre de Brucelose. também não é admitida a classificação de suínos suspeitos. dependerá da apresentação de: a. Art. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta. Não será exigido atestado negativo para fêmeas bovinas com idade inferior a 30 (trinta) meses.DO REGISTRO GENEALÓGICO. diagnósticos da situação. A profilaxia da Brucelose suína será baseada na adoção das seguintes medidas: a. CAPÍTULO X . A comercialização da vacina será objeto de fiscalização oficial e sua aquisição e aplicação sob responsabilidade de médico veterinário. 27. CAPÍTULO VIII . para fins de trânsito interestadual. vacinadas na idade recomendada. admitindo-se o título máximo aglutinante até 1:50 para fêmeas bovinas com idade superior a 30 (trinta) meses. 28. Art. submetida cada partida a controle oficial. 20. CAPÍTULO VII . lenta e do anel no leite. serão produzidos por um só laboratório oficial. 23. e. 18. Suínos procedentes de rebanhos negativos 1/25 (25 UI/ml) I + 1/50 (50 UI/ml) 1/100 (100 UI/ml) Interpretação Negativa Negativa 68 . os animais são classificados somente em positivos e negativos. são considerados negativos os rebanhos que não apresentarem qualquer animal com aglutinação superior a 1:100 . obedecendo as técnicas de produção e controle recomendadas pela Organização Mundial da Saúde. Art.DO CONTROLE DE TRÂNSITO Art. sendo que a interpretação das mesmas obedecerá o critério constante dos quadros a seguir: b. CAPÍTULO IX . Os antígenos para diagnóstico da Brucelose. 21.Incompleta. Somente será fornecido certificado de inspeção sanitária animal. Os criadores poderão inscrever-se um esquema voluntário. 25. A produção de antígenos para diagnóstico de Brucelose pelos demais laboratórios oficiais poderá continuar até a instalação e o funcionamento do laboratório central do Ministério da Agricultura. utilizando-se as provas de soroaglutinação rápida e lenta ou a prova com antígeno acidificado tamponado (prova do cartão .DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE ANTÍGENOS Art. 24. c. será efetuado pelo órgão competente do Ministério da Agricultura. Art. b. sêmen e produtos derivados reger-se-á pela legislação específica vigente. realizadas nos suínos com idade superior a 6 (seis) meses. CAPÍTULO VI . Os animais da propriedade serão identificados por tatuagem ou outra forma."card test"). através de exame dos rebanhos em áreas de suinocultura mais expressiva. Art. vacinadas entre 3 e 8 meses de idade. devendo o mencionado produto ser fornecido somente a médicos veterinários.68 Art. Art. d. Art. O controle da distribuição de antígenos para diagnóstico de Brucelose. quando acompanhadas de atestado de vacinação contra a Brucelose.DA CERTIFICAÇÃO DE PROPRIEDADE LIVRE Art. considera-se com infetado o rebanho no qual forem identificados um ou mais suínos com aglutinação completa na diluição de 1:100. 22. quando os reprodutores apresentarem resultados negativos atestados acompanharão os animais. O trânsito internacional de bovinos. atestado de vacinação contra a Brucelose.DA PROFILAXIA DA BRUCELOSE SUÍNA Art. prova rápida. As condições que uma propriedade deve preencher para ser considerada livre de Brucelose serão estabelecidas através de instrução da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. 19. a contar da data da realização do respectivo exame. utilizando-se a prova de antígeno acidificado temponado (card test). 29. para fêmeas bovinas até 30 (trinta) meses de idade. A inscrição de bovinos no Registro Genealógico e a participação dos mesmos em Exposições e Feiras Agropecuárias. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta. O atestado de exame negativo para Brucelose será válido por 60 (sessenta) dias. inclusive pelo Registro Genealógico. DAS EXPOSIÇÕES E FEIRAS AGROPECUÁRIAS Art. estando as bezerras e novilhas devidamente marcadas e identificadas.

Nos casos positivos e suspeitos. 30. serão precedidas provas de fixação do complemento. especialmente dos reprodutores utilizados. a. controle rigoroso de plantéis indenes. 33. considerados os antecedentes clínicos e epidemiológicos. 32. quando o título não ultrapassar de 1:25. positivos retestados. reação suspeita. Parágrafo único. Art. Os casos omissos e as dúvidas suscitadas na execução e interpretação destas normas serão resolvidos pelo Diretor da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura. Art. A interpretação dos resultados das provas sorológicas de aglutinação para ovinos e caprinos. b. CAPÍTULO XI . 31. JOSÉ PEDRO GONZALES Diretor Geral do DNPA 69 . reação positiva. CAPÍTULO XII . além das soroaglutinações rápida e lenta. A Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura baixará instruções complementares permanecendo em uso os atuais formulários para exames de Brucelose e vacinação. obedecerá o seguinte critério: a.69 + + + + I + + + I + Negativa Negativa Negativa Positiva Suínos procedentes de rebanhos positivos. vigilância severa e permanente das importações de ovinos e/caprinos. 34. A presença de suínos infetados numa criação justifica o sacrifício do rebanho. A profilaxia da Brucelose ovina e caprina será baseada na adoção das seguintes medidas. b. levantamento da prevalência da doença nas áreas de criação. até que sejam estabelecidos novos modelos. quando o título for de 1:50 ou maior. c.DA BRUCELOSE OVINA E CAPRINA Art. parcialmente testados ou desconhecidos 1/25 (25 UI/ml) I + + + + + 1/50 (50 UI/ml) I + + + 1/100 (100 UI/ml) I + Interpretação Negativa Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Art.DAS DISPOSIÇÕES GERAIS Art.