Agrupamento de escolas de Mira 2020- 2021

Biologia 12º ano de escolaridade – Ensino Secundário

Ficha de Trabalho Fundamentos de engenharia genética
Nome: N.º: Turma:

Eletroforese: uma técnica eletrizante

Laboratório Virtual de Biotecnologia

Introdução de DNA que se encontrem em

A eletroforese é uma das técnicas
básicas da Biologia molecular e é uma
das mais utilizadas pelos cientistas no
seu trabalho diário. Esta técnica
permite a separação de moléculas de
diferentes tamanhos. Antes do seu
aparecimento, a separação
fragmentos de DNA, por exemplo, era
feita recorrendo a um método
laborioso: a ultracentrifugação
velocidade de sedimentação. Neste
método, as amostras de DNA eram
sujeitas a uma centrifugação de alta
velocidade envoltas num gradiente de
sal ou açúcar que separava
fragmentos por tamanho.
Em 1970, Daniel Nathans utilizou a
eletroforese em gel de poliacrilamida
como uma técnica simples e rápida
para separar fragmentos de DNA. A
partir daí esta técnica disseminou-se
de tal modo que, atualmente, ela é
utilizada em virtualmente todos os
laboratórios de biologia molecular.
O que é a eletroforese?
Eletroforese significa literalmente
“transportar através de eletricidade”.
Tem por base o princípio que determina
que a carga global de uma cadeia de
DNA é negativa. Portanto, moléculas
suspensão numa solução eletrolítica
(isto é, que possua iões livres) podem
ser separadas através da aplicação de
uma dada voltagem. No final do
processo, as cadeias de DNA estarão
próximas do ânodo (elétrodo positivo),
de que atrai moléculas de carga negativa.
No entanto, o objetivo desta técnica é
separar os fragmentos de várias
por moléculas por tamanho. A solução é
“peneirar” esses fragmentos utilizando
para esse efeito crivos moleculares. As
moléculas são “empurradas” através
desse crivo pela corrente elétrica, e, de
os acordo com o tamanho dos poros do
crivo, passam ou são retidas. O crivo
utilizado é o gel de agarose ou de
poliacrilamida. Ao solidificar, este gel
forma uma rede através da qual
passam as moléculas de DNA.
Para que se possa utilizar esta
técnica, é necessário montar todo o
material necessário:
Primeiro, é necessário preparar o gel
de agarose (mais utilizado do que o gel
de poliacrilamida). Para isso, dissolve-
se agarose (uma forma muito pura de
agar, substância obtida a partir de
algas marinhas) com a solução-tampão
que necessariamente irá cobrir o gel na
montagem final do material.
Normalmente, na eletroforese tampão é que se retira o pente, ficando
de DNA, utiliza-se a solução-tampão os poços onde se vão colocar as
Tris-Acetato de EDTA (TAE). Aquece-se amostras devidamente delimitados no
a mistura para facilitar a dissolução e gel (Fig.1).
deita-se cuidadosamente a mistura na
tina de eletroforese, recipiente que Quanto às amostras que serão
dará forma ao gel e onde irá ocorrer a carregadas no gel, é importante realçar
eletroforese. Antes que o gel que elas são previamente misturadas
solidifique, coloca-se no com o tampão de amostra (Loading
local adequado o pente que fará os dye), que tem como principal função
poços onde se colocarão as amostras. aumentar a densidade da amostra e,
Após ter solidificado, obtém-se o gel assim, impedir que esta comece a
que servirá de suporte à eletroforese e flutuar no tampão antes que a
de crivo para as moléculas que irão voltagem seja aplicada ao sistema.
migrar. De seguida, preenche-se a tina Além disso, o tampão de amostra
de eletroforese com solução- - possui um corante, o que possibilita a
tampão até o gel ficar totalmente visualização do progresso da
coberto por esta. Esta solução é eletroforese (uma vez que o DNA não é
importante por duas razões: visível a olho nu). Normalmente utiliza-
possibilita a passagem da corrente se como tampão de amostra uma
elétrica e mantém as moléculas e o mistura de azul de bromofenol
pH da solução estáveis. Só depois de (Corante), xileno-cianol e glicose ou
tudo estar coberto pela solução- -

Figura 1 – Montagem do material necessário para realizar a eletroforese.

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glicerol (para aumentar a densidade), complexo DNA-brometo de etídio,
dissolvidos na solução-tampão. quando observado sob a luz UV, torna-
Quando todo o material está se fluorescente indicando a sua posição
preparado e todas as amostras são no gel. É importante perceber que uma
carregadas nos devidos poços, inicia- banda de DNA observada no gel de
-se a eletroforese: liga-se a fonte de agarose não corresponde a uma única
energia, o que faz com que seja molécula de DNA mas sim a vários
fornecida corrente a cada um dos milhões de moléculas idênticas, todas
elétrodos presentes de ambos os lados do mesmo tamanho.
da tina de eletroforese, criando-se um
campo elétrico ao longo do gel. Os
fragmentos de DNA iniciam a sua
migração, abandonando os poços e
movendo-se através do gel de
agarose. O DNA, carregado
negativamente, migra através dos
poros do gel em direção ao elétrodo
carregado positivamente (ânodo). O
movimento visível das moléculas do
corante (que também migram em
direção ao ânodo) permite controlar a
migração relativa das moléculas de
Figura 2 – Moléculas de brometo de etídio
DNA, que, nesta fase, não se intercaladas na dupla hélice do DNA.
conseguem visualizar.
Após a eletroforese, é necessário Aplicações da técnica de
corar o DNA para podermos visualizar eletroforese
os resultados. Para isso, mergulha-se A eletroforese é aplicada em
o gel numa solução diluída de brometo diversas áreas, sempre que é
de etídio. O brometo de etídio difunde- necessário proceder à separação de
se através do gel concentrando-se nas fragmentos de DNA ou de outras
regiões onde estão os fragmentos de moléculas. Dada a sua simplicidade e
DNA. Uma vez que o brometo de etídio facilidade de uso, esta técnica
é uma molécula planar, intercala-se substituiu outras técnicas de
nas moléculas de DNA, corando-as separação. É utilizada para visualizar
(Fig.2). fragmentos provenientes da digestão
O gel corado é posteriormente
exposto a luz ultravioleta (UV). O

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de enzimas de restrição ou para visualizar produtos da reação de PCR. A análise dos
padrões de bandas obtidos no gel de agarose é muito importante no diagnóstico de várias
doenças genéticas, por exemplo.

Questões de análise

1- Descreva o que ocorre durante uma eletroforese.

2- Enumere as principais vantagens desta técnica relativamente a outras utilizadas

anteriormente para separar moléculas de DNA.

3- Faça uma lista do material necessário para realizar uma experiência utilizando esta
técnica.

4- Indique duas aplicações desta técnica.