UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO-GROSSO

ICET – INSTUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DO ARAGUAIA
GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS

DILUIÇÃO E PLAQUEAMENTO DE ALIMENTOS

GIOVANNA LORENA FERREIRA CAMARGO
IZAURA PINHEIRO DE SOUZA RODRIGUES ORNELAS

BARRA DO GARÇAS, MT
2022
 GIOVANNA LORENA FERREIRA CAMARGO
IZAURA PINHEIRO DE SOUZA RODRIGUES ORNELAS

DILUIÇÃO E PLAQUEAMENTO DE ALIMENTOS

Relatório de aula prática

apresentado como requisito
parcial para a aprovação na
disciplina de Microbiologia Geral,
do curso de Engenharia de
Alimentos, UFMT/CUA. E
orientado pela Prof.ª Dra. Keily
Alves de Moura Oliveira.

BARRA DO GARÇAS, MT
2022
 1. INTRODUÇÃO GERAL

Em microbiologia, destaca-se muito sobre como algumas bactérias podem crescer bem em
qualquer meio de cultura, e já outras que requerem de técnicas e meios de culturas especiais.
Dessa forma, são utilizadas técnicas de inoculação e preparo de meio, com o intuito de definir
o tempo e tamanho de crescimento bacteriano. Para a observação de colônias isoladas, se faz
conveniente o uso de cultura sólida (Agar), para que seja possível isolar por completo as
colônias na placa de petri. Analogamente, para o cultivo de bactérias em meio líquido, é
apropriado à utilização de água peptonada, que é um meio de enriquecimento não seletivo,
rico em peptona de carne, cloreto de sódio e água, que quando diluído da maneira correta,
torna-se apropriado para o desenvolvimento de micro-organismos. (TORTORA, et al. 2012).

Para a medida de crescimento bacteriano são utilizadas diversas técnicas, onde alguns
métodos medem o número de células ou a massa total da população. A técnica mais popular
para medir colônias bacterianas é a contagem em placa, que é utilizada através das unidades
formadoras de colônias (UFC), e para isso se faz necessário o uso de diluições seriadas, que
basicamente consistem em ampliar o fator de diluição da amostra para obtenção do
crescimento de colônias na faixa desejada. (TORTORA, et al. 2012).

Em síntese, existem outros métodos que podem ser manipulados para a contagem de
bactérias, como a técnica de filtração, o método do número mais provável e a contagem
microscópica direta. (TORTORA, et al. 2012).

2. OBJETIVO

Realizar inoculação em meio de cultura líquido e sólido; verificar a presença ou ausência de

crescimento nos meios inoculados; classificar as bactérias quanto à tensão de oxigênio e
definir cultura pura e mista.

3. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS
 Placas de petri;
 Bastão de vidro;
 Pipeta graduada e pera de sucção;
 Proveta;
 Béquer;
 Erlenmeyers;
 Papel Kraft;
 Fita Crepe;
 Balança semi-analítica;
 Espátula;
 Bico de Bunsen;
 Tubos de ensaio com tampa;
 Capela.
 Pipeta automática;
 Ponteiras;
 Autoclave;
 Alça de platina;
 Alça de Drigalski;
 Faca.

3.1.1 REGENTES
 Água peptonada e Agar nutriente;
 Água destilada;
 Alimento manipulado ou industrializado.

4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1ª ETAPA – PREPARO DO AGAR E DA ÁGUA PEPTONADA

Na primeira etapa, realizou-se os cálculos de quantidade a seguir:

Para preparar 48mL de Agar  segundo instruções do fabricante são 20g de Agar para
1000mL

Ou seja,

20g-----------------1000mL 1000x = 20*48

x--------------------60mL x = 960/1000

x = 0,96g

Utilizando a balança semi-análitica, pesou-se 0,96g de Agar, e transferiu-se para um

Erlenmeyer de 250mL. Em seguida, utilizando a proveta mediu-se um volume de 48mL de
água destilada e adicionou-se novamente no Erlenmeyer, e para homogeneizar, utilizou-se o
bastão de vidro. Logo após, utilizando o papel Kraft e a fita crepe, isolou-se o bocal da
vidraria.

Da mesma maneira, para preparar duas soluções de água peptonada com volumes distintos, de
22,5mL e 30mL  segundo instruções do fabricante são 20g de água peptonada para
1000mL.

Ou seja,

Para 22,5mL

20g-----------------------1000mL 1000x = 20*22,5

x-------------------------22,5mL x = 450/1000

x = 0,45g

Para 30mL

20g-----------------------1000mL 1000x = 20*30

x-------------------------30mL x = 600/1000

x = 0,60g

Utilizando a balança semi-analítica, pesou-se 0,45g de água peptonada, e transferiu-se para

um Erlenmeyer. Em seguida, utilizando a proveta mediu-se um volume de 22,5mL de água
destilada e adicionou-se novamente no Erlenmeyer, e para homogeneizar, utilizou-se o bastão
de vidro. Logo após, utilizando o papel Kraft e a fita crepe, isolou-se o bocal da vidraria.

Dessa mesma forma, utilizando a balança semi-analítica, pesou-se 0,60g de água peptonada, e
transferiu-se para um béquer. Em seguida, utilizando a proveta mediu-se um volume de 30mL
de água destilada e adicionou-se novamente no béquer, e para homogeneizar, utilizou-se o
bastão de vidro. Logo após, utilizando a pipeta graduada com a pera de sucção, mediu-se um
volume de 0,9mL para cada um dos 2 (dois) tubos de ensaio com tampa.

2ª ETAPA – LEVAR PARA A AUTOCLAVE

Para a segunda etapa, levou-se os Erlenmeyers (um contendo Agar e o outro água peptonada)
já devidamente com o bocal isolado e os 2 (dois) tubos de ensaio com tampa para a autoclave,
afim de obter a esterilização do meio. Após, realizou-se o fechamento da tampa da autoclave,
fechou-se a saída de ar e ligou-se a aparelhagem de esterilização no máximo. Em seguida,
aguardou-se a autoclave atingir 120°C e colocou-se no mínimo. Logo em seguida,
cronometrou-se 15 minutos para depois abrir, e com o devido cuidado recolheu-se apenas o
Erlenmeyer de contendo água peptonada e os 2 (dois) tubos de ensaio com tampa, o
Erlenmeyer de com a solução do Agar foi deixado dentro da autoclave aberta para impedir
que o Ágar não se solidificasse antes da distribuição nas placas de petri.

3ª ETAPA – IDENTIFICAR AS PLACAS DE PETRI E OS TUBOS DE ENSAIO COM

TAMPA

Para a terceira etapa, realizou-se a identificação de 3 (três) placas de petri e dos (dois) tubos
de ensaio com tampa da seguinte forma:

E nas demais placas e nos tubos de ensaio com tampa foram identificadas com graus de
diluição e as iniciais das integrantes do grupo IG.

Placa 3 – 10-1

Placa 4 – 10-2

Placa 5 – 10-3

Tubo 1 – 10-2

Tubo 2 – 10-3
Fotografia das identificações das placas realizadas em laboratório.

4ª ETAPA – REALIZAR A DISTRIBUIÇÃO UNIFORME DO AGAR ENTRE AS

PLACAS DE PETRI

Para a quarta etapa, levou-se para a capela o Erlenmeyer contendo o Agar e as 3 (três) placas
de petri para a capela, para que fosse realizado a distribuição. Logo em seguida, ligou-se o
bico de Bunsen, e com muito cuidado, transferiu-se o conteúdo do Erlenmeyer para as placas
de petri de forma uniforme. Em sequência, colocou-se as placas de petri em local fresco para
que ocorresse à solidificação do Agar.

5ª ETAPA – REALIZAR A DILUIÇÃO DO ALIMENTO MANIPULADO OU

INDUSTRIALIZADO ESCOLHIDO

Para a quinta etapa, levou-se para a capela o Erlenmeyer contendo água peptonada e o
alimento industrializado escolhido pelas integrantes do grupo, onde foi selecionada uma fatia
de mortadela da marca Seara. Logo em seguida, com o auxílio de uma faca, cortou-se em
pequenos pedaços uma quantidade de 2,5g do alimento, e colocou-se no Erlenmeyer mexendo
a vidraria por 10 segundos para que fosse realizada a diluição.

Utilizando a pipeta automática após encaixar a ponteira, colocou-se 1mL da diluição no tubo
de ensaio com tampa identificado como 10-2. Semelhantemente, fazendo-se o uso da pipeta
automática, transferiu-se 1mL da diluição 10-2 para o tubo de ensaio com diluição 10-3.

6ª ETAPA – REALIZAR A INOCULAÇÃO DA DILUIÇÃO NAS PLACAS 10 -1/10-2 E

10-3 (SEMEADURA EM PLACA POUR-PLATE)

Para a sexta etapa, foi realizada a inoculação das diluições do Erlenmeyer, dos tubos de ensaio
10-2 e 10-3
Na placa 10-1, utilizando uma alça de platina, mergulhou-se a mesma dentro do Erlenmeyer, e
com cuidado passou-se a alça sobre o Agar contido na placa 10 -1. Em seguida, usou-se a alça
de drigalski para espalhar bem a amostra sobre o Agar, tanto na vertical, como na horizontal.
Da mesma maneira, fazendo-se o uso da alça de platina, mergulhou-se a mesma no tubo de
ensaio 10-2, e levemente passou-se a alça sobre o Agar contido na placa 10-2, e utilizando
novamente a alça de drigalski espalhou-se bem a amostra sobre o Agar. Por fim, o mesmo
processo foi utilizado para inocular a amostra do tubo de ensaio identificado com 10 -3 que
continha à diluição 10-3, na placa 10-3.

7ª ETAPA – LEVAR PARA ESTUFA E AGUARDAR UM CRESCIMENTO DE 48H

Para a sétima etapa desta prática, após a inoculação das diluições, levou-se as 3 (placas) para
estufa de incubação, e colocou-se as mesmas com a tampa virada para baixo.

5. RESULTADO E DISCUSSÃO

Utilizando a técnica de semeadura pour-plate, analisou-se uma amostra de salame

industrializado, o resultado encontrado foi positivo para microrganismos aeróbios mesófilos.
Segundo Goulart (2020), “A contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos, é um
instrumento indicador de qualidade de baixo custo e fácil utilização que auxilia no
entendimento das condições da matéria prima, condições de processamento e conservação dos
alimentos.”

Aeróbios mesófilos compreende um grupo de microrganismos que tem em comum a

temperatura ideal de crescimento entre 20 a 45°C e estão presentes nos mais variados
ambientes inclusive em alimentos e na microbiota dos animais. Amostras de alimentos
analisadas e que apresentem uma elevada população de micro-organismos aeróbios mesófilos,
indica a necessidade de adotar boas práticas de manipulação e conservação para evitar a
contaminação dos alimentos.

Para realizar a análise do salame, 3 placas preparadas foram inoculadas com amostra de
salame utilizando a metodologia das diluições seriadas
10-1 10-2 10-3

Após 48h foi observada o crescimento de colônias bacterianas e fungos nas 3 placas.

A Placa inoculada com a diluição 10-1 foi a que ocorreu o maior crescimento microbiano, a
placa com diluição em 10-3 foi a que teve o menor crescimento de bactérias e fungos, para
fazer a leitura (contagem das colônias bacterianas presente) a placa escolhida foi a que
continha a concentração 10-2, entre as 3 placas foi a que continha o n° de bactérias ideal para a
contagem adequada - 236 colônias bacterianas, a primeira placa estava com uma quantidade
elevada de colônias ( superior a 250) e a 3º placa com uma quantidade inferior (abaixo de 25).

Foi realizado o cálculo para determinar a Unidade Formadora de Colônia – UFC da amostra
do salame.

UFC/ml = (nº de colônias)/alíquota x fator de diluição

UFC/ml = 236/1ml x 102

Valor encontrado: UFC/ml = 2,36 x 10 4 ufc/ml

A instrução normativa 161 da ANVISA (2022), estabelece os padrões de identidade e

qualidade dos alimentos, visando a segurança alimentar para o consumidor. Não foi possível
fazer uma comparação dos microrganismos encontrados na amostra e a quantidade
considerada segura permitida pela ANVISA porque a normativa estabelece parâmetros
comparativos apenas para algumas bactérias que causam patogenia e são deterioradoras. A
análise feita na amostra observou apenas a análise quantitativa não ocorrendo uma análise
específica sobre qual microrganismo estaria presente nas amostras.

Tabela ANVISA microrganismo n c m M

n - Número de amostras analisadas
c - Quantidade de amostras permitidas fora dos padrões
m - Valor mínimo permitido
M - Valor máximo permitido

Dois estudos de presença de aeróbios mesófilos em salames identificaram valores variados em

diferentes amostras, um estudo feito por Casaril, e col. (2017) analisou 12 amostras de salame
colonial produzidos no sudoeste do Paraná e outro estudo feito por Silva e col. (2016)
analisou 5 marcas de salame de supermercados e feiras na cidade de alfenas/MG, os
resultados encontrados nas amostras analisadas foram os demonstrados nas imagens abaixo.

Resultados encontrados por Silva e col(2016) Resultados encontrados por Casaril e col(2017)

Comparando-se os resultados encontrado na análise de salame desta pesquisa com os obtidos nos
outros dois estudos, verificou-se que as contagens de micro-organismos mesofilos aeróbios
encontrado na amostra de 2,36 x 10 4 ufc/ml está abaixo da maioria das análises feitas pelos
dois estudos, apenas 2 amostras do primeiro estudo ficaram com valores abaixo do
encontrado, sendo elas 2,14 x 10 3 e 1,10 x 10 4.

Dessa forma, em comparação com outras análises, a contagem de unidades formadoras de colônia
(UFC) da amostra analisada, apresenta uma quantidade menor de contaminação, indicando que o
alimento está mais adequado para o consumo que os demais alimentos analisados nas outras
pesquisas.
 6. CONCLUSÃO

A contagem bacteriana de padrão em placas permitiu analisar a contaminação da amostra de

salame comercial por microrganismos aeróbios mesófilos, o resultado encontrado quando
comparado a outras análises indica que o produto está adequado para o consumo Humano.

7. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

Anvisa. Instrução Normativa n° 161, de 01 de julho de 2022. Ministério da Saúde - MS.

Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa.

CASARIL, K.B.P.B; BENTO, C.B.P; HENNING, K.; PEREIRA, M.; DIAS, V.A. Qualidade
Microbiológica de Salames e Queijos Coloniais Produzidos e Comercializados na Região
Sudoeste do Paraná. Revista Brasileira de Agropecuária Sustentável (RBAS), v.7, n.2,
p.75-85, Junho, 2017.

FERREIRA, L.C. Contagem de Microrganismos. Yutube, 27 de jan de 2021.

GOULART, T.; RODRIGUES, N. L.; FINGER, R. B. I.; SOUZA, T. L.; COSTA, F. P.;
ROSA GONÇALVES, C. Avaliação da Contagem Total de Microrganismos Mesófilos
Aeróbios em Carne Moída Comercializada em Supermercados de Itaqui/RS. Anais do Salão
Internacional de Ensino, Pesquisa e Extensão, v. 5, n. 2, 14 fev. 2020.

HAOACK, A. FAVERO, D.M. DALANHOL, K.C.F. LIMA, K.P. Quantificação de Aeróbios

Mesófilos Presentes em Amostras de Carne Bovina Moída Comercializadas em Palmas.
Revista Mundi Meio Ambiente e Agrárias ISSN 2525-4790. 2018.

PIRES, C. Contagem Microbiana. Youtube, 12 de jun de 2021.

SILVA, J.G.S; SANTOS, L.R.A; FIORINI,J.E; OLIVEIRA, N.M.S; Avaliação
Microbiológica de Salames Industrializados e Artesanais Comercializados na Cidade de
Alfenas – MG. Higiene Alimentar - Vol.30 - nº 254/255 - Março/Abril de 2016.

TORTORA, G.J. ; FUNKE, B.R.; CASE,C.L. Microbiologia. 12° ed. Porto alegre: Artmed,
2017.