Apostila de Processos Fermentativos

PROCESSOS
FERMENTATIVOS
ROTEIRO DE AULAS
PRÁ TICAS
Olga Martins Marques
Sara Horácio de Oliveira Maciel
SUMÁRIO
PRÁTICA 01: PREPARO DE INÓCULOS.................................................................3
PRÁTICA 02: CURVA DE CALIBRAÇÃO.................................................................6
PRÁTICA 03: CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO...................................9
PRÁTICA 04: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA (DETERMINAÇÕES DE BRIX E

pH)...............................................................................................................................12
PRÁTICA 05: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA (DETERMINAÇÕES DE

AÇÚCARES REDUTORES).......................................................................................17
PRÁTICA 06: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA (PREPARO DE MOSTO E

FERMENTAÇÃO)......................................................................................................22
PRÁTICA 07: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA PARA PRODUÇÃO DE

HIDROMEL................................................................................................................26
PRÁTICA 08: PRODUÇÃO DE VINHO TINTO......................................................30
PRÁTICA 09: FERMENTADOS DE FRUTAS........................................................33
PRÁTICA 10: PRODUÇÃO DE VINAGRE..............................................................35
PRÁTICA 11: FERMENTAÇÃO LÁTICA (PRODUÇÃO DE IOGURTE)............38
PRÁTICA 12: PRODUÇÃO DE PICLES..................................................................43
PRÁTICA 13: PRODUÇÃO DE BACITRACINA.....................................................46
PRÁTICA 14: PRODUÇÃO DE CELULASE POR FERMENTAÇÃO EM

ESTADO SÓLIDO......................................................................................................52
PRÁTICA 15: PRODUÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO..................................................56
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................59
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS
DEPTº DE ENGª QUÍMICA E QUÍMICA INDUSTRIAL
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
Roteiro de aulas PRÁTICAS DE processos

FERMENTAtivos
OLGA MARTINS MARQUES
SARA HORÁCIO DE OLIVEIRA MACIEL
RECIFE
2014
2
Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Engenharia Química
Laboratório de Microbiologia
PRÁTICA 01: PREPARO DE INÓCULOS
1. OBJETIVOS
 Preparar meios de cultura para o cultivo de inóculos;

 Propagar culturas de microrganismos em diferentes meios de cultivo;
2. PRINCÍPIOS
Denomina-se inóculo, pé-de-cuba ou pé de fermentação um volume de células

de concentração suficiente de micro-organismo capaz de garantir um processo
biotecnológico com rendimento satisfatório (Borzani,2001). Quando o processo é
uma fermentação os agentes responsáveis (microrganismos) devem fornecer os
melhores rendimentos em produtos.
O inóculo pode ser preparado a partir de uma cultura pura estoque, por
propagações sucessivas em volumes crescentes de meios líquidos com concentrações
de nutrientes gradativamente crescentes, para que haja uma melhor adaptação do
microrganismo às condições do final do processo. Deve-se salientar que a
temperatura, o oxigênio e o pH do meio também devem ser adequadas ao
desenvolvimento do microrganismo.
Outra forma de se obter um volume suficiente de células é pelo cultivo na
superfície de um meio solidificado contido em frascos com área plana (garrafa de
Roux, frasco de Kolle). Nesse caso é feita uma suspensão com a cultura pura e em
seguida realizada a transferência para a superfície do meio solidificado e após
incubação, a suspensão celular (inóculo), é obtida pela introdução de água na
superfície do meio e arraste das células com auxílio de pérolas de vidro.
Em algumas fermentações (de picles ou chucrutes etc) os agentes da
fermentação estão presentes na própria matéria-prima e assim a fase de preparo do
inóculo e sua propagação pode ser eliminada.
Os meios de cultura utilizados em fermentações normalmente são preparados
com uma matéria-prima principal que apresente baixo custo tais como: melaço, caldo-
de-cana, soro de leite ou outros que sejam adequadas ao metabolismo do micro-
organismo e à formação do produto desejado. Quando necessário, o mesmo é
complementado pela adição de nutrientes que são fontes de sais minerais.
Os meios preparados adequadamente podem ser usados na propagação de
inóculo ou para elaboração do produto desejado. Por exemplo, o meio produzido por
melaço ou caldo-de-cana pode ser empregado na propagação da Saccharomyces
cerevisiae e na produção de álcool etílico, enquanto que o meio produzido com de
leite pode ser utilizado na propagação de Lactobacillus e Streptococcus e para
produção de iogurtes. Já o meio preparado de soro de leite pode ser usado pelo
Bacillus subtilis e para produção de antibiótico e assim por diante.
3
Quando o meio é destinado ao inóculo deverá ser preparado com uma
concentração de nutriente baixa para favorecer o crescimento do micro-organismo.
Neste caso a esterilização se faz necessária. Já o meio destinado à fermentação para
elaboração do produto normalmente contém um teor maior de sólidos, para que no
final do processo se obtenha um elevado teor do produto.
3. MATERIAIS E REAGENTES
 Balanças; Potenciômetro; Béquer 2000ml; Tubos de Ensaio e Frascos de

Erlenmeyer de capacidade diversas; Bastão de vidro; Espátulas; Provetas 250ml;
Lâminas; Lamínulas; Microscópio; Câmara de Neubauer.
 Sacarose; Glicose; Lactose; Soro de leite;, (NH4)H2PO4; MgSO4; FeSO4.7H2O;
MnSO4. 7H2O; Solução 0,1N H2SO4; Solução 0,1N de NaOH
 Microrganismos: Levedura: Saccharomyces cerevisiae

Bactéria: Bacillus subtilis
 Meios de Cultura:
Meio 1 (CALDO NUTRITIVO COM GLICOSE)
Glicose ........................................................ 0,5%, 1,0%, 1,5%

Extrato de Carne............................................ 5,0g/L
Peptona bacteriológica
(NH4)H2PO4 ................................................. 1,0g/L
MgSO4......................................................... 0,5g/L
pH = 4,0 -5,0
Meio 2 (CALDO COM MELAÇO)
Melaço......................................................... 0,5%, 1,0%, 1,5%

NH4)H2PO4 .................................................. 1,0g/L
MgSO4......................................................... 0,5g/L
pH = 4,0 -5,0
Meio 3 (CALDO NUTRITIVO COM LACTOSE)

Lactose ............................................. 0,5%, 1,0%, 1,5%
K2HPO4 .......................................................... 0,5 g/L
K2PO4 ............................................................. 0,5 g/L
MgSO4. 7 H2O .............................................. 0,2 g/L
MnSO4. 7H2O................................................ 0,01 g/L
FeSO4. 7H2O.................................................. 0,01 g/L
pH = 4,0 -5,0
4
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
 Cada grupo deverá escolher um dos meios e preparar o inóculo de duas formas
distintas: em meio líquido e em meio solidificado.
 Pesar os sais e dissolver em 1L de água destilada.
 Ajustar o pH com uma solução a 0,1N de H2SO4 ou NaOH.
 Para o preparo do meio solidificado pesar 3,75g do carboidrato (glicose,
melaço ou lactose), 4 g de agar e solubilizar com 250mL da solução de sais.
Colocar em um frasco de Roux tamponado com algodão.
 Para os meios líquidos pesar a fonte de carbono (glicose, melaço ou lactose)
na concentração de 0,5% para os volume de 5mL, 1,0% para volume de 50mL
e 1,5% para o volume de 500mL de solução salina. Colocar os meios em
recipientes adequados.
 Esterilizar em autoclave a 121oC por 20 minutos.
 Depois de frio, inocular o microrganismo seguindo os esquemas apresentados
na Figura 1.
Figura 1: Esquema do preparo do inóculo (a) em meio líquido (b) em meio

solidificado
 Incubar na temperatura adequada ao crescimento do microrganismo.

 Após a incubação avaliar a concentração e a pureza do inóculo.
 Os microrganismos do frasco de Roux poderão ser removidos com água estéril
ou meio de cultura líquido.
5
PRÁTICA 02: CURVA DE CALIBRAÇÃO
1. OBJETIVOS
 Determinar uma curva de calibração para a determinação da concentração celular

de um micro-organismo por turbidimetria.
 Relacionar a turbidimetria com o peso seco.
2. PRINCÍPIOS
A partir do conhecimento da absorbância de uma amostra é possível

determinar a concentração celular de uma suspensão microbiana, pelo uso de uma
curva de calibração previamente determinada, com bastante confiabilidade. Através
de uma série de diluições convenientes dessa suspensão padrão são obtidas novas
suspensões de concentrações conhecidas. Finalmente, a turbidez provocada no meio
pelas diferentes suspensões de micro-organismo é medida através de um instrumento
adequado e os valores obtidos são relacionados com as respectivas concentrações por
intermédio de uma expressão matemática.
As diluições adequadas são obtidas através de tentativas de forma a abranger

um intervalo de concentrações que atenda as seguintes condições:
1a.) Deve haver uma correlação linear entre a concentração e o logaritmo da

transmitância e;
2a) Os valores das transmitâncias obtidas devem estar situadas na região de maior
sensibilidade na escala do instrumento utilizado.
 A partir da suspensão de micro-organismo previamente cultivada em meio

líquido, colocar cerca de 50 mL de meio em 4 tubos de Falcon e centrifugar a
7000 rpm por 5 minutos.
 Desprezar o líquido e transferir todo o conteúdo sólido dos 4 tubos para apenas
um tubo de Falcon e completar o volume para 50 mL com água destilada e em
seguida homogeneizar e centrifugar novamente para remover qualquer resquício
de meio de cultura.
6
 Desprezar novamente o líquido e completar o volume para 50mL com água
estéril.
 Remover 5 mL da suspensão microbiana com pipeta volumétrica e adicionar em 3

béqueres previamente tarados. Colocar os béqueres em estufa a 80-100ºC por 24
a 48 h ou até peso constante.
 Com o restante da suspensão microbiana, realizar uma diluição 1:50 e fazer leitura
da transmitância (a leitura deverá ser > 20%) com o espectrofotômetro calibrado
com água e ajustado o comprimento de onda para 610 nm. Em seguida faça uma
diluições uma 1:100 e faça a leitura da transmitância. Se o valor da transmitância
for elevado (próximo a 80%) utilize esse valor como a máxima diluição. Caso seja
inferior poderá realizar uma diluição ainda maior.
 Faça uma série de diluições (cerca de 6 diluições) com um conjunto de pipetas e

balões volumétricos de forma que as leituras de transmitância fiquem com
valores entre 30 e 80 %. Converter a leitura da transmitância para absorbância
usando a equação: Abs =- log (100/T).
 Realizar, pelo menos, duas leituras do valor da absorbância para cada

concentração. O espectrofotômetro deve ser calibrado antes de cada leitura, com
um “branco” de água destilada.
 Após 48 horas, remover os béqueres da estufa cuidadosamente com o auxílio de

uma pinça, deixar esfriar em dessecador e pesar (P). Determinar a concentração
inicial da amostra (X0), através da expressão:
X 0 = (P – T)/ V (g/mL)
Onde: P = peso da amostra + peso do béquer (g)

T = peso do béquer (g)
V = volume de suspensão microbiana (5mL)
 Determinar a concentração de cada amostra (Xi) com o auxílio da seguinte

expressão:
X0 . V0 = Xi . Vi
Onde: X0 = concentração da suspensão inicial (g/mL)

V 0 = volume removido da suspensão inicial (mL)
Xi = concentração da amostra (g/mL)
Vi= volume final (mL)
 Construir um gráfico, colocando no eixo das ordenadas os valores da

concentração Xi(g/l) e no eixo das abscissas os valores da absorbância (Abs) ou
densidade óptica (D.O).
 Fazer uma regressão linear com o auxílio de um programa de computador ou

utilizando o método dos mínimos quadrados.
7
 Calcular o coeficiente de correlação, r, e determinar o intervalo de concentrações,
X1 - X2, no qual a expressão é válida.
 Observação: A curva de calibração obtida pelos pontos descritos é válida apenas

para o micro-organismo utilizado na sua confecção.
8
PRÁTICA 03: CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO
1. OBJETIVOS
 Avaliar o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisae em diferentes meios

de cultivo;
 Confeccionar a curva de crescimento utilizando o método turbidimétrico;
 Calcular o tempo de geração (G); a velocidade específica máxima de crescimento
(µmáx); a produtividade celular (PX) e o Coeficiente de conversão de substrato em
células (YS/X) em cada meio de cultivo.
2. PRINCÍPIOS
O crescimento microbiano pode ser definido em termos, tanto da massa, como

também do número de células. Em condições de crescimento exponencial, massa
celular e número de células permanecem proporcionais, embora a relação entre estes
dois valores possa variar em determinadas condições de cultivo. O crescimento de um
micro-organismo em diferentes meios de cultivo, por exemplo, pode ser avaliado pela
determinação da massa celular que, por sua vez, pode ser medida indiretamente pela
turvação de uma suspensão.
A evolução do crescimento pode ser avaliada utilizando um cultivo em
batelada em condições de incubação controladas. Com leituras da densidade óptica de
uma série de amostras retiradas a intervalos de tempo regulares, e com auxílio da
curva padrão de calibração, é possível confeccionar uma curva de crescimento
relacionando a concentração celular (ordenada) com o tempo de cultivo (abscissa).
Nesta curva são, então, identificadas as diferentes fases do crescimento microbiano.
Durante a fase exponencial de crescimento pode-se então determinar o tempo
de geração (G) e a velocidade específica máxima de crescimento (µMÁX.).
Pode-se ainda determinar a produtividade celular (Px) que é a relação entre a
variação da concentração celular pela variação do tempo de cultivo. Este valor
deverá ser determinado pela seguinte equação:
PX= (Xmáx - Xo)/(tf - to) )
Onde: Xo = Concentração celular inicial, (g/l)
9
Xmáx = concentração celular final , (g/l)
tf = tempo final, (h)
to = tempo inicial, (h)
- Micro-organismo: Saccharomyces cerevisiae

- Meios de cultura: CALDO MINERAL suplementado com 1% de açúcar (glicose ou
sacarose)
Caldo Mineral
K2HPO4 .......................................................... 0,5 g/L
K2PO4 ............................................................. 0,5 g/L
MgSO4. 7 H2O .............................................. 0,2 g/L
MnSO4. 7H2O................................................ 0,01 g/L
FeSO4. 7H2O.................................................. 0,01 g/L
pH = 4,5 -5,0
Equipamentos: Espectrofotômetro; Mesa agitadora (Shaker); Balança semi-analítica

- Diversos: Cubetas de espectrofotômetro, Tubos de ensaio estéreis, 2 frascos de
Erlenmeyers de 1000mL de capacidade, Pipetas de 10ml
 Preparar 1 litros de caldo mineral, distribuir 500ml em 2 frascos de Erlenmeyer

de 1000mL de capacidade. Adicionar no primeiro 5g de glicose e no segundo 5g
de sacarose homogeneizar e esterilizar a 121oC por 15 minutos. Deixar esfriar;
 Retirar uma amostra de 5-10mL de cada meio para servir como um branco;
 Colocar os frascos de Erlenmeyer na balança semi-analítica e inocular

esterilmente 0,2g a 0,4g do micro-organismo Saccharomyces cerevisiae (fermento
prensado) ou com 50mL de inóculo previamente cultivado.
 Retirar 3ml de amostra com uma pipeta estéril, imediatamente após a inoculação,
correspondente, ao tempo zero. Calibrar o espectrofotômetro a 610nm com o
“branco” (meio sem inóculo) e efetuar a leitura da absorbância (densidade
óptica). Anotar os resultados seguindo o modelo das Tabelas 1 e 2;
 Colocar os frascos de Erlenmeyer na mesa agitadora, tendo o cuidado de fixá-los

bem. Ligar a agitação a 200 rpm. Deixá-los sob agitação durante todo o cultivo;
 Retirar amostras de 3ml a intervalos de 1 hora, até que se observe um mínimo

de três valores idênticos, ou muito próximos, de densidade óptica (DO). Anotar os
resultados;
10
 Converter a Densidade Óptica (DO) em Concentração Celular X(g/L) utilizando a
curva de calibração determinada previamente;
 Construir um gráfico para cada meio de cultivo, colocando no eixo das ordenadas
os valores do tempo (h) e no eixo das abcissas concentração X (g/l);
 Calcular a velocidade específica máxima de crescimento (µ máx) o tempo de

geração (G) e a produtividade celular (Px) em cada meio de cultivo
 Comparar os resultados obtidos e tirar conclusões a respeito do meio mais

adequado ao crescimento
TABELA 1. RESULTADO DOS DADOS EXPERIMENTAIS
MEIO DE CULTIVO 1:
Tempo Densidade Óptica Concentração
(h) (DO) X(g/l)
0
0,5
1
1,5
2,0
2,5
3,0
TABELA 2. RESULTADO DOS DADOS EXPERIMENTAIS
MEIO DE CULTIVO 2:
Tempo Densidade Óptica Concentração
(h) (DO) X(g/l)
0
0,5
1
1,5
2,0
2,5
3,0

11
PRÁTICA 04: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
(DETERMINAÇÕES DE BRIX E pH)
1. OBJETIVOS:
 Determinar Brix, pH de uma matéria-prima açúcarada
2. PRINCÍPIOS
A produção de etanol a partir do processo fermentativo por ação de leveduras

tem sido explorada a partir do melaço, subproduto da indústria do açúcar ou
diretamente do caldo-de-cana. As determinações analíticas nas matérias-primas
açucaradas é a finalidade dessa prática. As análises do brix, pH são fundamentais para
o preparo dos mostos e a determinação dos açúcares redutores são necessárias para a
determinação do rendimento e eficiência do processo.
3. ANÁLISES NA MATÉRIA-PRIMA
3.1. CONCENTRAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS (º BRIX) – PELO

AREÔMETRO
A concentração de sólidos solúveis presentes numa amostra açucarada pode

ser expressa em percentagem em peso (ºBrix), correspondente a uma relação entre a
massa do soluto e a massa da solução.
O brix de uma amostra pode ser determinado pelo método refratométrico ou
pelo método aerométrico. Nossa prática se deterá ao aprendizado desse último. O
areômetro (densímetro) é o aparelho mais simples usado para se medir o grau brix,
sua escalas são bem variadas correspondendo a valores de 0 a 90 o Brix. Salienta-se,
no entanto, que as escalas mais utilizadas são as de 0 a 10 oBrix, de 10 a 20oC e de 20
a 20oC são muitas vezes conhecidos como sacarímetros ou brixômetro.
3.1.1. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
- Melaço; Caldo-de-cana
- Diversos: Béquer de 50ml e 500ml; Bastão de vidro; Proveta de 250 ml;
Areômetro de 10 a 20o Brix e de 20 a 30o Brix; Termômetro de 0 a 50oC
Balança semi-analítica
3.1.2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:
 Pesar 100 g de melaço num Béquer e realizar a diluição recomendada;

Equipe A: Fazer diluição de 1 : 3 para determinar o brix do melaço
12
Equipe B: Fazer diluição de 1: 4 para determinar o brix do melaço
OBS: O caldo de cana não precisa ser diluído.
 Dissolver completamente;
 Transferir a amostra (que poderá se também caldo de cana ou mostos açucarados)
para uma proveta;
 Deixar a solução em repouso por alguns minutos (5 minutos) para eliminar as
impurezas grosseiras. Filtrar caso haja uma grande concentração de sólidos em
suspensão
 Remover as espumas deixando o líquido transbordar um pouco;
 Imergir o areômetro (brixômetro) no líquido em análise;
 Efetuar a leitura do brix na haste do areômetro;
OBS.: Para a leitura correta, é necessário que o observador posicione sua vista
exatamente no ponto de encontro entre a haste contendo a escala e o líquido
examinado;
 Anotar o brix experimental;
 Imergir o termômetro e efetuar a leitura;
 Fazer a correção do brix observado para o brix a 20o C ( fT ) através Tabela 3.
.
Obs.: Caso a temperatura da leitura seja inferior a 20 oC, subtrair o número
encontrado na tabela do valor lido na haste. O procedimento inverso é feito
quando a temperatura de leitura for superior a 20oC.
 Calcular o brix real da amostra utilizando a fórmula:
Brix real = Brix experimental  fT fd
 Caso tiver sido realizada uma diluição, multiplicar o resultado obtido pelo fator de
diluição correspondente ( fd ).
TABELA 3: Tabela de correção da leitura do 0Brix em função da Temperatura (fT)
Temperatura 0C Subtrair da leitura
13
15 0,39
16 0,31
17 0,23
18 0,16
19 0,08
20 0,00
21 0,08
Temperatura 0C Adicionar à leitura
22 0,16
23 0,24
24 0,32
25 0,40
26 0,48
27 0,56
Discussão
1. Especificar as condições de trabalho e os resultados obtidos

2. Na determinação do grau brix do melaço:
(i) Qual o efeito da diluição ?
(ii) Por que é necessário fazer a correção da temperatura?
(iii) Como a temperatura pode influenciar essa determinação analítica?
3.2. DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE REFRAÇÃO E BRIX PELO

REFRATÔMETRO
3.2.1. MATERIAIS: Refratômetro de bancada; algodão; água destilada; papel

absorvente.
3.2.2. METODOLOGIA:
 Calibrar o instrumento com uma amostra padrão de superfície polida. Colocar a

amostra padrão de superfície polida em cima do prisma. Observar se as faixas
clara/escura no telescópio estão ou não entre as linhas, e se não estiverem, ajustar
o parafuso (ajuste grosso).
 Também se pode calibrar o equipamento com água destilada. Colocar algumas
gotas de água destilada sobre o prisma de medição e observar se as faixas
clara/escura no telescópio estão ou não entre as linhas, e se não estiverem, ajustar
14
o parafuso (ajuste grosso), verificar a calibração do equipamento com a
temperatura da água e o respectivo índice de refração (Tabela 4).
 Lavar o prisma com água destilada, e secá-lo com papel absorvente;
 Colocar 1-2 gotas da amostra problema diretamente sobre o prisma;
 Realizar a rotação do prisma (ajustar o parafuso) até que o raio crítico esteja
centrado no “X” do visor (Figura 2). Se a linha divisória entre os campos claro e
escuro estiver colorida, o prisma de Amici (compensador) é girado até que
apareça uma linha divisória nítida de cores.
 Fazer a leitura (a 200C, caso contrário fazer a correção segundo tabelas da
literatura para o produto).
 Após cada determinação deve-se limpar os prismas com água destilada e algodão,
e depois de estarem limpos deve-se enxugá-los com papel absorvente, sempre
cuidando para não causar ranhuras nos prismas.
Figura 2: Forma de ajuste do visor (a) Errado (b) Certo
3.3. DETERMINAÇÃO DO pH COM POTENCIÔMETRO
 Antes da determinação do pH pelo potenciômetro, o mesmo deve ser aferido com

soluções tampão de pH 7,0 e 4,0;
 Usar a solução 1+1 preparada para a determinação areométrica;
Obs.: O pH em amostras de caldo de cana ou mostos pode ser determinado
diretamente sem necessitar diluição.
 Transferir 50ml da solução para um Béquer;
 Imergir o eletrodo na amostra, cobrindo a membrana;
 Fazer leitura do pH;
 Voltar o botão para a posição neutra;
 Retirar o eletrodo e lavar com água destilada.
TABELA 4: Índices de refração em função da temperatura para água destilada
Temperatura Índice de Refração

10 1,33369
11 1,33364
12 1,33358
15
13 1,33352
14 1,33346
15 1,33339
16 1,33331
17 1,33324
18 1,33316
19 1,33307
20 1,33299
21 1,33290
22 1,33280
23 1,33271
24 1,33261
25 1,33250
26 1,33240
27 1,33229
28 1,33217
29 1,33206
30 1,33194
31 1,33182
32 1,33170
33 1,33157
34 1,33144
35 1,33131
36 1,33117
37 1,33104
38 1,33090
39 1,33075
40 1,33061
16

(DETERMINAÇÕES DE AÇÚCARES REDUTORES)
1. OBJETIVOS
 Determinar os Açúcares Redutores pelo Método de Eynon-Lane
2. PRINCÍPIOS
Os açúcares redutores de uma amostra açucarada podem ser determinados pelo

método volumétrico da dupla redução de Eynon-Lane.
Essa determinação baseia-se na redução do íon cúprico em cuproso pelo grupo
redutor do açúcar e também na redução do indicador utilizado (azul de metileno), que
na ausência de Cu++ livre, reduz-se ficando descorada. A mistura de soluções de
Fehling-Soxlet - conhecida como licor de Fehling - é titulada pela solução açucarada.
A redução é constatada pela formação de óxido cuproso (coloração vermelho-tijolo)
quando se faz reagir o licor de Fehling com os açúcares redutores da amostra.
Esse método é adequado para avaliar os açúcares existentes em caldo-de-cana ou
em melaço. Neste último as impurezas podem interferir no ponto de virada do
indicador, logo pode-se clarificar a amostra para facilitar a titulação.
3. DEFINIÇÕES TÉCNICAS
AÇÚCARES REDUTORES SIMPLES (ARS): correspondem à concentração de

glicose e frutose existentes na matéria-prima na forma redutora.
AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS (ART): correspondem ao teor de glicose e

frutose existente na amostra, mais aqueles que são originados da hidrólise da
sacarose.
ART = ARS + S
Obs.: Para hidrolizar a sacarose pode-se usar ácido clorídrico ou a enzima invertase.
H2O
SACAROSE  GLICOSE + FRUTOSE
H+
17
AÇÚCARES REDUTORES INFERMENTESCÍVEIS (ARI): são substâncias de
caráter redutor, mas que não são convertidas em álcool ou seja, não fermentam. São
constituídos por complexos de glicose e frutose com aminoácidos e/ou derivados.
AÇÚCARES REDUTORES FERMENTESCÍVEIS (ARF): presentes numa amostra

correspondem aos redutores totais menos os redutores infermentescíveis.
ARF = ART - ARI
 Melaço; Soluções de Fehling A e B*; soluções de HCl (1:1); soluções de NaOH

(1N); azul de metileno a 1%; solução de fenolftaleína a 1%;
 Bequer; balão volumétrico de 500ml; balão de fundo chato 250ml; bastão de
vidro; funil; frascos de Erlenmeyer de 250ml (6); proveta de 50ml; pérolas de
vidro; garra; pipetas volumétricas de 5ml (2) e 10ml (1); bureta de Mohr (50ml);
bico de Bunsen; Tela de amianto; tripé de ferro; balança de precisão; banho-maria
com controle de temperatura, termômetro.
* Solução A: Dissolver 34,639g sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) em água diluir para

500ml
Solução B: Dissolver 173g de sal de Rochelle (tartarato de sódio e potássio) e 50g
de NaOH em água, diluir para 500ml e deixar em repouso dois dias.
Azul de metileno: Dissolver 1g de azul de metileno em água destilada e completar

para 1000ml.
5.1. TRATAMENTO DAS AMOSTRAS AÇÚCARADAS
a) Açúcares Redutores Simples (ARS): correspondem aos açúcares existentes na

matéria prima, que se encontram na forma fermentescível, tais como glicose e
frutose.
 Pesar quantitativamente 4g de melaço em Béquer numa balança analítica;

 Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 500ml usando água
destilada. Completar o volume.
 Colocar esta solução na bureta e para titular usando o método de Eynon-Lane.
b) Açúcares Redutores Totais (ART): correspondem a soma dos ARS com os

açúcares que fermentam após hidrólise (sacarificação).
 Pesar quantitativamente 2g de melaço em Béquer numa balança analítica
18
 Transferir a amostra para uma balão de fundo chato diluindo com 50 ml de água
destilada;
 Adicionar 10 ml de ácido clorídrico (1:1) ou 5ml de HCl concentrado;
 Levar a um banho-maria à temperatura de 68-70oC (temperatura interna) por 15
minutos;
 Deixar esfriar e transferir a amostra para um balão volumétrico de 500ml;
Obs.: O termômetro deverá também ser levado para dentro do balão volumétrico.
 Adicionar 2 a 3 gotas do indicador fenolftaleína a 1%;
 Neutralizar cuidadosamente com hidróxido de sódio (1N) agitando
constantemente;
 Completar a solução para 500ml.
 Colocar esta solução na bureta e titular usando o método de Eynon-Lane.
c) Açúcar Redutor Infermentescível (ARI): corresponde aos açúcares existentes na

matéria prima que se encontram complexados com aminoácidos.
 Pesar 50,0g de melaço;

 Dissolver a amostra em 200ml de água;
 Adicionar à solução 0,3g de KH2PO4 e 0,3g de (NH4)2SO4;
 Adicionar 5g de levedura prensada (fermento) dissolvida em 50ml de água;
 Homogeneizar suavemente;
 Deixar fermentar a 30oC durante no mínimo 36 horas;
 Filtrar à vácuo ou centrifugar;
 Lavar 2 vezes o sedimento com água;
 Transferir os sobrenadante para balão volumétrico de 500ml;
 Fazer aferição do balão;
 Usar essa solução para titular usando o método de Eynon-Lane.
Usar 4ml de Licor de Fehling (2ml de A + 2ml deB);
 Anotar os volumes gastos (V2 e V3)
5.2. MÉTODO DE EYNON-LANE
 Adicionar 5 ml da solução A e 5ml da solução B (Licor de Fehling) em um frasco

de Erlenmeyer e agitar bastante. Adicionar 50ml de água;
Obs.: Deve-se acrescentar a solução A sobre a solução B.
 Juntar algumas pérolas de vidro;
 Aquecer até ebulição durante 2 minutos;
 Colocar 2 a 3 gotas da solução de azul de metileno a 1% e esperar 20 segundos;
 Titular com a solução açucarada da bureta até obter uma coloração ligeiramente
avermelhada;
 Anotar o volume da solução consumida na titulação (V1);
19
 Repetir (mais duas vezes), acrescentando a frio um volume da solução a ser
analisada, menor do que o volume gasto na primeira titulação e anotar os volumes
gastos (V2 e V3);
 Determinar a média V dos volumes gastos nas duas titulações.
 Obs.: A diferença entre as titulações não deve ser maior que 0,20ml, caso
contrário deve-se refazer a titulação.
6. CÁLCULOS DOS AÇÚCARES REDUTORES EM MELAÇO
a) AÇÚCARES REDUTORES SIMPLES (ARS)
4 g de melaço ......... 500ml

M .......... V (média dos volumes gastos)
M (massa de melaço)....... 0,05 (fator do licor de Fehling)

100 ...................... ARS
ARS (%) = 625/V
b) AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS (ART)
2 g de melaço ............... 500ml

M ................. V (média dos volumes gastos)
Vx 2 V
M =  = 
500 250
M (massa de melaço) .............. 0,05 (fator do licor de Fehling)

100 ...............………..... ART
ART (%) =1250/V
c) AÇÚCARES REDUTORES INFERMENTESCÍVEIS (ARI)
50 g de melaço .................. 500ml

M .................... V (média dos volumes gastos)
M = 50V/500 = V/10
V/10 ............... 0,02 (fator do licor de Fehling)

100 ................ ARI
ARI (%) = 20/V
7. DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES PELO MÉTODO DO DNS
20
Os açúcares redutores das amostras podem ser determinados pelo método do DNS.
Este método consiste na redução, em meio alcalino, do ácido 3,5 – dinitrossalicílico
em ácido 3- amino-5-nitrossalícilico por ação dos açúcares redutores, dando origem a
um composto acastanhado que obedece a lei de Lambert-Beer, ou seja, a
transmitância é proporcional à concentração da substância dissolvida, neste caso, os
açúcares redutores.
a) Procedimento Experimental
 Transferir 1mL da amostra para um tubo de ensaio;

 Adicionar 0,5mL de HCl 2N;
 Aquecer em banho-maria a 68°C por 15min;
 Neutralizar com 0,5mL de NaOH 2N utilizando fenolftaleína como indicador;
 Aferir o volume à diluição desejada.
 Transferir 0,5mL da amostra para o tubo de Folin Wu e adicionar 1mL de DNS.
Homogeneizar;
 Levar o tubo de Folin Wu a banho-maria por 5min a 100°C;
 Aferir o volume para 12,5mL com água destilada;
 Homogeneizar a amostra e realizar a leitura da Transmitância no
espectrofotômetro devidamente calibrado utilizando comprimento de onda λ=
540nm.
 Preparação do Branco: Repete-se o mesmo procedimento para a preparação da
amostra, entretanto a alíquota retirada deve ser água. Em seguida, realizam-se os
procedimentos para o teste com DNS.
21

(PREPARO DE MOSTO E FERMENTAÇÃO)
1. OBJETIVOS:
 Preparar um mosto com melaço

 Realizar um processo fermentativo em batelada para produção de etanol
2. PRINCÍPIOS
Os mostos (meios de cultura) utilizados em fermentações normalmente são

preparados com matéria-prima de baixo custo tais como: melaço, caldo-de-cana, que
contêm carboidratos suficientes para garantir à formação do etanol.
No entanto para que essas matéria primas se transformem em meio de cultura
é necessária a suplementação com nutrientes (fonte de nitrogênio e sais) e ajuste do
pH.
Balanças; potenciômetro; densímetro de 10 a 20 o Brix; termômetro; Béquer 500ml;

bastão de vidro; espátulas; provetas 250ml; fermentador (dorna); lâminas;
microscópio; câmara de Neubauer; Melaço; (NH4)H2PO4; MgSO4; H2SO4
concentrado.
 Preparar 1L de mosto de melaço com 18o Brix usando o esquema recomendado

por Cobenze para os cálculos da diluição do melaço até o brix desejado.
B M-A
A B–M
Onde: B = Brix do melaço; A = Brix do diluente; M = Brix do Mosto (desejado)

M - A = massa do melaço; B - M = massa do diluente
22
 Fazer conversão do resultado obtido em massa para volume usando para isso a
densidade do melaço e a da água.;
Obs.: Consultar a tabela para obter a densidade do melaço em função do brix;
 Calcular a proporção entre a água e o melaço;
 Com o auxílio da fórmula Vmosto = Vmelaço + Vágua + Vnutrientes
 Calcular o volume de melaço desejado;
 Pesar e dissolver o melaço na água;
 Pesar os nutrientes: (NH4)H2PO4 .................. 1g/L de mosto
MgSO 4 ........................... 0,5g/L de mosto
 Dissolver os nutrientes para suplementar o mosto;
 Ajustar o pH para 4 - 5 com H2SO4;
 Confirmar o brix pelo uso de um areômetro;
 Introduzir o mosto no biorreator;
 Inocular com fermento liofilizado (10g/litro de mosto) ou com o volume
produzido previamente, separando uma alíquota para avaliar a viabilidade celular
(prática subsequente);
 Acompanhar o processo por análises de pH, Brix, temperatura, biomassa e
produto;
 Registrar os dados na tabela fornecida na prática;
 Guardar na geladeira alíquotas de 50ml retiradas durante o processo fermentativo
para determinação do teor alcoólico e de 20ml para determinação do crescimento
da biomassa.
5. DETERMINAÇÃO DO TEOR ALCOÓLICO POR EBULIOMETRIA
5.1. MATERIAIS
Tubos de ensaio; ebuliômetro (lamparina, caldeira, condensador, régua, termômetro,

tubo específico).
5.2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
 Colocar água até o nível marcado na cuba (15ml);

 Adaptar o termômetro;
 Aquecer o aparelho;
 Fazer leitura quando a temperatura ficar estável;
 Graduar a régua que acompanha o ebuliômetro, fixando o zero com a tempertarua
de ebulição da água;
 Esvaziar a caldeira e resfriá-la;
 Remover o termômetro da caldeira;
 Colocar a amostra na cubeta até o 2o traço (50ml);
 Conectar o termômetro e encher o condensador com água;
 Acender a lamparina;
 Após estabilizar fazer a leitura da temperatura;
 Localizar na régua o teor alcoólico da amostra.
 Fazer a conversão do teor alcoólico de percentual em volume (ºGL) para grama
por litro(g/L).
23
Obs.: Após cada análise lavar a caldeira com água para evitar incrustação; mas caso
ocorra, deve-se ferver durante 5 minutos com uma solução a 20% de hidróxido de
sódio.
6. CONCENTRAÇÃO DA BIOMASSA
6.1. MATERIAL: Tubos de Falcon; Bequeres, Centrífuga
6.2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Transferir 20mL da amostra para tubos de Falcon específicos para centrífugas e

centrifugar durante 5 minutos a 5000rpm;
Colocar os tubos na centrífuga em lados opostos para efeito de balanceamento;

Obs.: Equilibrar os tubos contendo a amostra em balança analítica.
Remover o líquido e reservar;
Completar o volume para 20 mL com água destilada e em seguida homogeneizar e

centrifugar novamente para remover qualquer resquício de meio de cultura.
Desprezar novamente o líquido e completar o volume para 20mL com água estéril.
Remover 5 mL da suspensão microbiana com pipeta volumétrica e adicionar em 3

béqueres previamente tarados. Colocar os béqueres em estufa a 80-100ºC por 24 a 48
h ou até peso constante.
Após 48 horas, remover os béqueres da estufa cuidadosamente com o auxílio de uma

pinça, deixar esfriar em dessecador e pesar (P). Determinar a concentração inicial da
amostra (X0), através da expressão:
X 0 = (P – T)/ V (g/mL)
Onde: P = peso da amostra + peso do béquer (g)

T = peso do béquer (g)
V = volume de suspensão microbiana (5mL)
Converter os resultados da biomassa para g/L.
6.3. APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS
a) Preencher a tabela com os resultados obtidos, conforme o modelo descrito na

Tabela 5.
b) Fazer um gráfico de tempo x brix (concentração do substrato consumido) e um
gráfico tempo x teor alcoólico.
c) Discutir os resultados
24
d) Determinar os coeficientes de conversão de substrato em células (Yx/s) e
substrato em produto (Yp/s) e a eficiência da fermentação.
TABELA 5: RESULTADO DOS DADOS EXPERIMENTAIS
Fementador: Volume fermentado:

Hora da Tempo de pH Temperatura Substrato Biomassa Alcoólico Característica
análise Processo do mosto Brix do (g/L) (g/L) da espuma e
(h) (h) (oC) mosto outras
(oBrix) observações
25
PRÁTICA 07: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA PARA PRODUÇÃO DE

HIDROMEL
1. OBJETIVO:
Elaborar uma fermentação em batelada para produção de hidromel
2. PRINCÍPIOS
A produção de bebidas fermentadas a partir do processo fermentativo tem

sido explorada desde muitos anos. Embora o homem estivesse familiarizado com a
fermentação desde épocas pré-históricas, não havia descoberto o que a causava, até
cerca de 1860. Primeiramente o químico francês J.L. Gay-Lussac descreveu a
produção do álcool a partir de açúcar segundo a seguinte equação:
C6H12O6 2CO2
2CH3CH20H
Glicose gás
álcool etílico
( açúcar) carbônico
Durante 30 anos a discussão era de que a fermentação envolvia um

processo estritamente químico, e como neste processo não ocorre o consumo de
oxigênio, não se admitia na época a participação de organismos vivos. Em 1897,
Buchner descobriu o verdadeiro processo da fermentação e concluiu que este depende
não só de células vivas (leveduras) como também de todo um processo de ação
enzimática (processo químico) envolvendo a quebra incompleta do açúcar em álcool e
dióxido de carbono (gás carbônico). A partir deste fato houve ao interesse em repetir
e aprimorar o processo de fabricação onde micro-organismos participavam como
agentes de transformação. Desta forma iniciou-se a biotecnologia propriamente dita.
Atualmente inúmeros produtos podem ser obtidos pela ação microbiana como por
exemplo: o iogurte, a cerveja, o vinho, os queijos além dos vegetais fermentados
como picles, chucrutes etc. O hidromel é uma bebida alcoólica resultante da
fermentação do mel pela ação de leveduras. A elaboração desse produto de forma
higiênica em condições economicamente viáveis é muito importante para a indústria
química.
O objetivo desta prática é realizar um processo fermentativo em batelada
para produzir o hidromel. A matéria-prima será preparada de maneira adequada para
permitir uma atuação favorável do agente da fermentação (levedura) e com isso
26
elaborar um produto de qualidade com bom rendimento. Todo o processo deverá ser
acompanhado por análises químicas e microbiológicas. As análises químicas mais
importantes que serão usadas são: a) variação da concentração do substrato limitante
(açúcar); b) variação da temperatura; c) variação da acidez total e análise do pH; d)
desprendimento gasoso (CO2); e) aumento da concentração do produto da reação
(etanol). Os controles microbiológicos incluem exame do micro-organismo nas
diversas fases do mosto em fermentação.
- Micro-organismo: Saccharomyces cerevisiae (fermento liofilizado)
- Matérias-primas: Mel, Água: - Matéria -prima de grande importância, pois deve ser
de boa qualidade, (água mineral).
- Alcoómetro (Gay-Lussac e Cartier 20o C) - densímetro que serve para medir o teor
alcoólico.
- Sacarímetro (de 0 a 30 BRIX a 20o C) - densímetro que serve para medir sólidos
(açucares)..
- Termômetro (medindo de 0oC a 100oC) - necessário para medir a temperatura

ambiente e também a água do seu mosto (hidromel).
- Cuba de Fermentação – Balão de fundo chato de 2L com rolha de borracha com

orifício para dois tubos de vidro para remoção de gás proveniente da fermentação e
outro para retirada de amostra ou outro equipamento que você utilizará o que tiver
disponível desde que não fuja as regras para a confecção do mosto.
 Determine a concentração de sólidos solúveis (Brix) da matéria-prima (mel);
 Prepare o mosto para fermentação com uma concentração de sólidos 18-20 oBrix.
Para isso é necessário calcular a massa de mel e o volume de água necessário para
diluir a mesma. Utilize o esquema simplificado idealizado por Cobenze;
 Pese a massa calculada de mel;
 Aqueça o volume de água necessário para preparação do mosto a fermentar até

75oC; essa temperatura inibirá possíveis contaminações, principalmente pela
bactéria produtora do ácido acético (vinagre); espere a água esfriar até mais ou
menos 30oC; então coloque o mel e mexa de forma que fique bem misturado; com
o areômetro (sacarímetro) faça a medição do Brix, ela deverá marcar no número
20; se estiver menos que esse número então deve ser adicionado mais mel, se
ultrapassar esse número coloque então mais água,
 Introduza os nutrientes para enriquecer o mosto. Deverão ser utilizadas
substâncias que forneçam fontes de nitrogênio, fósforo, magnésio e enxofre.
Tais como: (NH4)H2PO4 - 1g/L de mosto e MgSO4 - 0,5g/L de mosto,
27
 Inocule com 0,5-1,0g do fermento diluído em 100 ml de água estéril e misture.
 Coloque o mosto na cuba de fermentação (Figura 3), nunca ultrapassando 2/3 do

mesmo; com uma mangueira de aproximadamente 1 metro, coloque 10cm dentro
da cuba e vede bem para que não entre o oxigênio, a outra ponta da mangueira
deverá estar mergulhada em um recipiente com uma solução de água e sal, ou
água e álcool ou água e metabissulfito de sódio.
 Com esse processo o mosto entrará em fermentação, que poderá ser mais lenta ou
mais rápida dependendo da temperatura ambiente, liberando o gás carbônico
através da mangueira; a atividade da levedura é observada pela freqüência das
bolhas de gás carbônico que escapam pela mangueira. A sua maior atividade
ocorre entre o terceiro e o quinto dia, a partir deste pico começa a ocorrer a
deposição de levedura devido ao grande aumento de sua população e também de
gerações mortas que já completaram o seu ciclo de vida.
 Após o sexto dia ocorrerá sedimentação da levedura, podendo iniciar a retirada de

amostra para se estabelecer o ponto em que se deverá interromper a fermentação.
A cuba pode ter uma torneira para ser retirada a amostra e posteriormente todo o
vinho ou pode ter outra mangueira como mostra o desenho.
Figura 3: Biorreator utilizado na fermentação
 Deixar a amostra em refrigerador no mínimo de 24 horas, para que ocorra a

parada do processo de fermentação e consequentemente a sedimentação das
partículas em suspensão, evitando assim que o resultado do teste de paladar e
também o teor alcoólico sejam mascarados.
 Se essa primeira amostra analisada não é a desejada, deixe o mosto na cuba por
mais uma semana e meça novamente até que se determinem os valores, e uma vez
que os valores estejam determinados, coloque agora o vinho em outro recipiente,
com cuidado, para que não se misture a levedura depositada no fundo da cuba,
como já exposto anteriormente; para se interromper o processo de fermentação
deve-se reduzir a atividade da levedura, confinando agora todo vinho em
geladeira.
 O mosto fermentado permanecerá na geladeira até que apresente um aspecto

límpido, e quando se perceber a total transparência, separa-se então o
sobrenadante podendo ser engarrafado.
28
 Determinar o teor alcoólico, extrato seco, a acidez total e o pH
PADRÕES FÍSICO-QUÍMICOS PARA O HIDROMEL
 A graduação alcoólica deverá ter valor mínimo de quatro e máximo de quatorze,

expressa em porcentagem de volume alcoólico a vinte graus Celsius;
 A acidez total, em miliequivalente por litro, deverá possuir um valor mínimo de

cinqüenta e um valor máximo de cento e trinta;
 A acidez fixa, em miliequivalente por litro, deverá possuir um valor mínimo de

trinta;
 A acidez volátil, expressa em ácido acético, deverá possuir um valor máximo de

vinte miliequivalentes por litro;
 A extrato seco reduzido deverá possuir um valor mínimo de sete gramas por litro.
 É vedada a adição de qualquer substância ou ingrediente que altere as

características sensoriais naturais do produto final, excetuados os casos previstos
no presente Regulamento Técnico.
29
PRÁTICA 08: PRODUÇÃO DE VINHO TINTO
1. OBJETIVOS:
Realizar uma fermentação alcoólica para produção de vinho tinto e branco.
2. PRINCÍPIO
O vinho é o resultado da fermentação alcoólica de uvas sadias seguida de um

envelhecimento. O vinho tinto é o produto obtido de uma vinificação em tinto,
quando uma parte da fermentação alcoólica é realizada na presença da casca da uva.
Nesse processo ocorrem três fenômenos principais: a fermentação alcoólica, a
maceração e a fermentação malolática.
O objetivo dessa prática é preparar um vinho em batelada de maneira
artesanal. Todo o processo será acompanhado por análises químicas e
microbiológicas. As análises químicas mais importantes que serão usadas são: a)
variação da concentração do substrato; b) variação da temperatura; c) variação da
acidez total, pela análise do pH; d) desprendimento gasoso; e) aumento da
concentração do produto da reação. Os controles microbiológicos incluem exame do
inóculo nas diversas fases do mosto em fermentação.
 Balanças; potenciômetro; termômetro; densímetro de 10 a 20 o Brix; termômetro;

Béquer 500ml; bastão de vidro; espátulas; provetas 250ml; lâminas; lamínulas;
microscópio; câmara de Neubauer.
 Uvas; Sacarose; Metabissulfito de potássio
 Fermentador (dorna): recipiente de vidro de capacidade para 5 a 10 litros. Pode
ser usado balão de fundo chato ou garrafões de vidro.
 Ebuliômetro
4.1. PREPARO DO INÓCULO
 Selecionar 1 a 2 kg de uvas roxas sadias (isentas de podridão), macerar e

desengaçar com ajuda de um pistilo ou com a própria mão. Essa operação provoca
o rompimento das bagas, dilacerando-as a fim de liberar o suco mais depressa e
permite a dissolução de materiais corantes e de taninos contidos na casca
dilacerada (vinificação em tinto);
30
 Colocar 100mL numa cuba sem tampa (Becker), ajustar o pH a 4-5 e adicionar 20
a 30 mg/L de metabissulfito de potássio (0,002-0,003g/100mL) e deixar fermentar
espontaneamente, por um período de aproximadamente 24-48 horas à temperatura
ambiente (28-30oC);
 O restante da uva esmagada e desengaçada é esgotado e prensado, e o mosto

obtido é sulfitado com 40 a 50 mg/L de metabissulfito. Esse mosto sulfitado
servirá para alimentar o mosto inicial, quando estiver em plena fermentação. A
adição deverá ser feita em pequenas quantidades diariamente para não interromper
a fermentação. O inóculo feito desta forma está pronto para ser usado em uma
cuba 3 a 6 litros de mosto a fermentar (3%).
4.2 PREPARO DO VINHO TINTO
 Preparar o mosto da uva, macerando e desengaçando, separar o suco com a ajuda

de uma peneira;
 Retire uma amostra de 10-20mL para determinação do pH, acidez, brix e
Açúcares redutores;
 Verificar o teor de sólidos (Brix) com um a ajuda de um areômetro (sacarímetro).
Efetuar as correções das leituras de Brix em função da temperatura do caldo. A
leitura deverá marcar no número 20; se estiver menos que esse número então deve
ser adicionado açúcar (sacarose) no mosto para fazer a correção do teor de sólidos
e aumentar o teor alcoólico do produto final (17-18g/L de sacarose eleva 1ºGL).
Esse processo é conhecido como Chaptalização também confere ao vinho uma
melhoria de qualidade, aumentando seu corpo e tornando-o mais “redondo” ao
paladar.
 Coloque o mosto na cuba de fermentação com as cascas que ficaram retidas na
peneira;
 Fazer a sulfitagem com 40 a 50 mg/L de metabissulfito de potássio. A sulfitagem

é indispensável a fermentação pois retarda o aparecimento de bactérias acéticas,
leveduras selvagens e mofos.
 Inocular o mosto com o micro-organismo preparado na etapa anterior; separando

uma alíquota para avaliar a viabilidade celular;
 Deixar a fermentação transcorrer na temperatura ambiente. Observar as suas fases
bem como a atenuação de Brix. Anotar a temperatura e o tempo de fermentação;
 Quando a fermentação ultrapassar a fase tumultuosa, densidade do mosto em

torno de 1,05 a 1,010 ( +12,4º Brix) efetuar uma descuba passando o vinho para
uma cuba fechada onde ocorrerar uma fermentação complementar ou onde será
conservado. O fermentador nesta etapa será um balão de fundo chato com uma
mangueira de aproximadamente 1 metro, coloque 10cm dentro da cuba e vede
bem para que não entre o oxigênio, a outra ponta da mangueira deverá estar
mergulhada em um recipiente com uma solução de água e sal, ou água e
metabissulfito de sódio.
31
 Transcorrido o tempo de fermentação, fazer a leitura do teor alcoólico, acidez e
do pH do vinho.
 Deixar o vinho sedimentar e efetuar a trafega que é a separação do vinho da borra.

Pois esta contém depósitos e micro-organismos indesejáveis,que podem dar
origem a produtos de odor desagradável, como H 2S ou mercaptanas, os quais
depreciam o vinho. A primeira trasfega ocorre uma semana após o término da
fermentação. A segunda 1,5 a 2 meses após a primeira. Ocorrerá a fermentação
malolática que deixará o vinho menos ácido.
 Deixar o vinho na geladeira e se necessário filtrar em membrana milipore.
32
PRÁTICA 09: FERMENTADOS DE FRUTAS
1. OBJETIVO
Elaborar uma fermentação alcoólica para produzir um fermentado de fruta
2. PRINCÍPIO
Fermentado de fruta, doce ou seco, é a bebida com graduação alcoólica de

quatorze a dezoito por cento em volume, a vinte graus Celsius, podendo ser
adicionado ou não de álcool etílico potável de origem agrícola, caramelo e sacarose.
O objetivo dessa prática é preparar um fermentado de frutas em batelada de
maneira artesanal. Todo o processo será acompanhado por análises químicas do
fermentado de frutas. As determinações físico-químicas do fermentado, como
densidade, teor alcoólico, acidez titulável, pH, açúcar redutor (Método do DNS)
serão feitos conforme metodologias descritas na literatura (ASCAR, 1985,
GARRUTTI, 2001).
 Balanças; potenciômetro; termômetro; densímetro de 10 a 20 o Brix; termômetro;

Béquer 500 ml; bastão de vidro; espátulas; provetas 250mL; lâminas; lamínulas;
microscópio; câmara de Neubauer.
 Frutas; sacarose; metabissulfito de potássio
 Fermentador (dorna): recipiente de vidro de capacidade para 1 litros. Pode ser
usado balão de fundo chato ou garrafões de vidro.
 Ebuliômetro
 Descascar cerca de 600g as frutas (maçã, abacaxi, cajá etc) separando as polpas
das cascas;
 Pesar 300g da polpa da fruta e diluir para um volume de 700mL com água e
triturar num liquidificador;
 Retirar uma amostra de 10mL para determinação do Brix, pH e açúcares

redutores pelo método do DNS (Miller, 1959).
33
 Corrigir o pH a 4,5±0,25 com carbonato de cálcio ou ácido orgânico.
 Verificar o teor de sólidos (Brix) com um a ajuda de um areômetro (sacarímetro).

Efetuar as correções das leituras de Brix em função da temperatura do caldo. A
leitura deverá marcar no número 20 a 24; se estiver menos que esse número então
deve ser adicionado açúcar (sacarose) no mosto para fazer a correção do teor de
sólidos e aumentar o teor alcoólico do produto final. Esse processo é conhecido
como Chaptalização também confere ao vinho uma melhoria de qualidade,
aumentando seu corpo e tornando-o mais “redondo” ao paladar.
 Coloque o mosto na cuba de fermentação e faça a sulfitagem com 20-50 mg/L de
metabissulfito de potássio. A sulfitagem é indispensável a fermentação pois
retarda o aparecimento de bactérias acéticas, leveduras selvagens e mofos.
 Inocular o mosto com 5-10 g/L de leveduras secas ativas (Saccharomyces

cerevisiae) ou usando o preparado na etapa anterior; separando uma alíquota para
avaliar a viabilidade celular;
 Deixar a fermentação transcorrer na temperatura ambiente (25-30 oC). Observar as
suas fases bem como a atenuação de Brix. Anotar a temperatura e o tempo de
fermentação;
 A fermentação alcoólica será conduzida em fraco de 2L contendo 1000L de mosto

a uma temperatura variando entre 27 e 31ºC, de acordo com o ideal da literatura
que especifica um valor entre 25 e 35ºC (DELANOE, 1989, REGULY, 1998;
AQUARONE et al., 2001), por um período de 5 dias, com o acompanhamento do
grau Brix e do teor alcoólico. O fermentador nesta etapa será um biorreator com
uma mangueira de aproximadamente 1 metro, coloque 10cm dentro da cuba e
vede bem para que não entre o oxigênio, a outra ponta da mangueira deverá estar
mergulhada em um recipiente com uma solução de água e sal, ou água e
metabissulfito de sódio.
 Quando a fermentação ultrapassar a fase tumultuosa, densidade do mosto em

torno de 10,5 a 10,10, efetuar uma descuba passando o fermentado para uma cuba
fechada onde deverá ocorrer uma fermentação complementar ou onde será
conservado. Fazer análises físico-químicas periodicamente (temperatura, sólido
solúveis (brix), pH).
 Ao final da fermentação, utilizar o processo de colagem (clarificação) com

albumina na concentração de 1g.L -1, que será adicionada ao mosto logo após a
fermentação. Depois, o fermentado será trasfegado, filtrado, pasteurizado e
engarrafado em garrafa escura e conservada a 5ºC.
 Fazer a medição da acidez titulável e volátil, açúcar residual (método do DNS),

teor alcoólico, cinzas, extrato seco e o pH do vinho.
34
PRÁTICA 10: PRODUÇÃO DE VINAGRE
1. OBJETIVO
 Elaborar um processo fermentativo para produção de vinagre
1. PRINCÍPIO
O vinagre é um produto não destilado obtido da fermentação acética de um

mosto contendo álcool etílico.
2 C2H5OH + 2O2  2 CH3COOH + 2 H2O
Esse produto é utilizado pelo homem desde a antiguidade com três finalidades
principais: condimento, conservante, agente de limpeza. Para obtenção de vinagres,
em princípio todas as matérias-primas utilizadas para a produção de álcool podem ser
usadas. Salienta-se, no entanto, que para a fabricação dos chamados vinagres de
álcool, a adição de nutrientes é indispensável.
No Brasil os vinagres mais comuns são os de frutas, principalmente de uva e

os de álcool. Três processos podem ser usados na fabricação dos vinagres: o lento
(Orleanense), o processo rápido (Alemão) e o processo submerso. A legislação
brasileira diz que o vinagre deve conter uma acidez volátil mínima de 40 g por litro
expresso em ácido acético (4%). Sua graduação alcoólica não pode exceder a 1 o GL e
deve ser obrigatoriamente pasteurizado.
Os métodos de obtenção são o processo lento (Orleanense), o processo rápido

(Alemão) e o processo submerso. Para obtenção de vinagres, em princípio todas as
matérias-primas utilizadas para a produção de álcool podem ser usadas. No Brasil os
vinagres mais comuns são os de frutas, principalmente de uva e os de álcool. Para a
fabricação dos chamados vinagres de álcool, a adição de nutrientes é indispensável.
- Micro-organismos: Bactérias acéticas (Acetobacter) contidas numa amostra de

vinagre não pasteurizado
- Equipamento: Gerador (Vinagreira) de 20 litros com enchimento de bagaço de cana
- Reagentes: Indicador de fenolftaleína a 1% ou timolftaleína a 2 % NaOH a 0,25N
35
- Diversos: Pipetas volumétricas de 25 ml, Balão volumétrico de 100 ml, Frasco de
Erlenmeyer de 500 ml, Bureta com capacidade para 25 ml
 Preparar 10 litros de mosto alcoólico com a seguinte composição:
COMPOSIÇÃO CONCENTRAÇÃO
Açúcar (melaço) ....................................0,9 g/ litro de mosto
(NH4)2HPO4 ..........................................0,5 g/ litro de mosto
MgSO4...................................................0,1 g/ litro de mosto
Citrato de potássio.................................0,1 g/ litro de mosto
Pantotenato de cálcio ............................0,001 g/ litro de mosto
Álcool etílico......................................... 50 a 120ml/litro de mosto
Acidez Inicial: 1 a 3% (obtida pela adição 25-30% de vinagre forte)

Temperatura: 25 - 30o C
 Encher o biorreator com o material de recheio (bagaço de cana),
 Lavar o material com água quente e vinagre até que sejam removidas todas as
substâncias que possam ser extraídas.
 Inocular através da passagem de vinagre forte não pasteurizado de boa qualidade

pelo material de suporte, recirculando-o vagarosamente várias vezes.
 Completada a inoculação deve-se iniciar a passagem do mosto alcoólico pelo

gerador.
 O mosto deverá recircular pelo biorreator até que a acidez desejada (4%) tenha
sido obtida.
OB.: Uma vez em funcionamento o biorreator (Figura 4), a retirada de um vinagre

pronto deve ser imediatamente seguida da adição de novo vinho, evitando-se a perda
da capacidade fermentativa das bactérias acéticas.
Figura 4: Biorreator com recheio de bagaço de cana
5. DETERMINAÇÕES ANALÍTICAS
36
5.1. ACIDEZ EM ÁCIDO ACÉTICO
 Pipete uma alíquota de 1 ml da solução original (amostra de vinagre); e passe para

um frasco de Erlenmeyer de 500 ml;
 Junte cerca de 20 ml de água destilada;
 Junte 4 gotas de indicador fenolftaleína a 1% (o melhor indicador para esta

titulação é a timolftaleína a 2%);
 Titule com NaOH até viragem para cor rosa claro (com timolftaleína a cor será
azul) anotando o gasto como B ml;
CONCENTRAÇÃO (g/l) = NNaOH .VNaOH . fNaOH PMac

Vvinagre
Ex: B = VNaOH = 8,5 ml (gasto na titulação)
Fator da solução 0,1N = 1

Vvinagre = 1 ml
Concentração (g/l) = 0,1 x 8,5 x 1 x 60 = 51 g/l ou

1
Concentração % ( m/v) = 5,1
5.2. TEOR ALCOÓLICO (VER PÁGINA 24)
PADRÃO DE IDENTIDADE E QUALIDADE PARA VINAGRE
37
PRÁTICA 11: FERMENTAÇÃO LÁTICA (PRODUÇÃO DE IOGURTE)
1.OBJETIVO
 Elaborar uma Fermentação Láctica para Produzir Iogurte Natural e Batido
2. PRINCÍPIOS
O iogurte é um produto fermentado do leite com um sabor ligeiramente azedo,

obtido a partir da ação combinada de duas espécies de bactérias, a Streptococcus
thermophilus e a Thermobacterium bulgaricum (Lactobacillus bulgaricus). Essas
bactérias consomem a lactose, para obterem energia e em contrapartida eliminam o
ácido lático.
Para ser iogurte é preciso que o leite contenha culturas vivas, estas culturas são
compostas de microorganismos exclusivos, que são responsáveis pelos diversos
benefícios à saúde e nutrição. O iogurte vivo pode estimular o sistema imune, e
também matar bactérias nocivas. As culturas do iogurte florescem no sistema
digestivo onde o seu efeito antibiótico age para combater inflamações, assim como
também pode proteger o intestino de toxinas. O leite coalhado preserva a gordura, os
minerais e o conteúdo de vitaminas do leite puro, mas apresenta bem menos lactose,
sendo então um alimento de mais fácil digestão que o leite.
3. MATERIAL
- Microrganismo
Cultura de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus
contidos em amostras de iogurtes
- Meio de cultura
1 Litro de leite pasteurizado suplementado com leite em pó, açúcar e outros
nutrientes (estabilizante)
- Equipamentos
Biorreator: Recipiente de 1 litros de capacidade, com tampa
Estufa de incubação
Sacarímetro (de 0 a 30 BRIX a 20o C) - densímetro que serve para medir sólidos
solúveis
38
Termômetro (medindo de 0oC a 100oC)
- Outros aditivos
Polpa de fruta ou doces de frutas em calda com pedaços de frutas, gelatina de
morango ou natural, açúcar.
 Adicionar 1-2 colheres de sopa de leite em pó desnatado (5-10g/L) ao leite

pasteurizado, com finalidade de aumentar o teor de sólidos do leite e com isso
aumentar a capacidade de retenção de água das proteínas do leite, prevenindo o
problema da sinerese, além de aumentar a consistência do produto final.
 Adicionar o açúcar (100 – 150g/L) e outros ingredientes (estabilizantes) antes do

tratamento térmico para garantir a destruição de microrganismos que
eventualmente possam estar presentes neles
 O teor de sólidos no final deve estar em torno de 15-16% ESD
 Aquecer o leite já pasteurizado a uma temperatura que pode variar de 90 oC, por
um tempo de 15 segundos ou 60-65ºC por 25-30min. A finalidade deste
tratamento é a destruição de 100% dos microrganismos patogênicos, destruição da
grande parte da flora banal, reduzindo à competição durante a fermentação, como
também garantir condições higiênico-sanitárias adequadas.
 Após o tratamento térmico, o leite com os outros ingredientes, deverá ser

resfriado a uma temperatura entre 38 a 40o C, sendo adicionadas as culturas
próprias do iogurte, preparadas anteriormente.
 Após a adição das culturas lácteas, realiza-se uma homogeneização com o

objetivo de distribuir os microrganismos no leite
 Incubar em estufa a uma temperatura que pode variar entre 40 a 45 o C, por um

tempo de 5-6 horas, para que ocorra a fermentação.
 Fazer um resfriamento do produto formado para inibir rapidamente o crescimento

da cultura láctea, visando prevenir a elevada produção de ácido lácteo e também a
separação da água. O resfriamento do iogurte pode ser feito em geladeira.
 O tratamento mecânico da quebra do coágulo para adição do preparado a base de

polpa de frutas representa uma fase importante no processo de fabricação do
iogurte. A quebra do gel é um processo físico. Entretanto, algumas mudanças
químicas podem ocorrer simultaneamente. O grau de quebra do gel depende do
tipo de iogurte. No caso de iogurte batido, as partículas do gel possuem um
diâmetro que variam de 0,01 – 0.4 mm, em quanto no iogurte líquido, as
partículas apresentam um diâmetro ao redor de 0,01 mm, sendo o limite visível
com relação ao tamanho das partículas entre 0,1- 0,001 mm ( 0,1 mm visível/0,01
mm invisível). A quebra do coágulo é uma etapa que deve ser bem controlada.
39
Pois uma agitação excessiva durante esta etapa pode levar a defeitos de
consistência e viscosidade, com formação de duas fases, pela separação do soro da
rede protéica. É sabido que o gel logo após a coagulação e com temperatura
próxima a 42 – 43o C, apresenta-se bastante frágil. Em virtude deste fato, é
recomendado fazer-se a quebra do gel em temperaturas próximas a 5 – 7 o C,
visando preservar a estrutura do gel. Normalmente, após a quebra e
homogeneização do gel deixa-se em repouso a 4o C por alguns minutos para
restabelecer a firmeza.
 Um iogurte mais firme (mais "durinho") pode ser obtido com a adição de alguns
outros ingredientes. Por exemplo, logo após preparar o iogurte natural, dissolva
um pouco (±1 colher de sopa) de agar ou gelatina (sabor de morango ou
flamboeza etc) e misture bem. Frutas frescas ou secas podem ser incluídas no
iogurte, nesse caso as frutas devem ser previamente esterilizadas através de um
rápido cozimento por uns 3 a 5 minutos.
5. 1. ACIDEZ TITULÁVEL
Acidez titulável (g/100mL) = VxMx92,07

10 x A
Onde:
V= volume de hidróxido de sódio gasto na titulação(mL)

M= molaridade ou normalidade
A=volume de amostra (g ou mL)
5.2. DETERMINAÇÃO DO PH PELO POTENCIÔMETRO
 Transferir 50ml da solução para um Béquer;

 Imergir o eletrodo na amostra, cobrindo a membrana;
 Fazer leitura do pH;
 Voltar o botão para a posição neutra;
 Retirar o eletrodo e lavar com água destilada.
5.3. DETERMINAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR PELA CONTAGEM

EM PLACAS
1o DIA - Pesar 25 grama de iogurte e suspender no Erlenmeyer que contém 225 mL

de água salina peptonada ( diluente). Agitar para obter uma suspensão dos
microrganismos existentes.
Transferir com pipeta estéril, 10 ml da suspensão para um dos frasco
contendo 90mL de diluente; agitar bem e deste retirar 10ml e transferir
40
para outro frasco 90 mL de diluente e assim sucessivamente sendo
realizada uma série de diluições 10-2, 10-3, 10-4,10-5,10-6.
De cada diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml,
depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de Rogosa fundido e
resfriado a 45oC.
Agitar para homogeneizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais

ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar à temperatura de 45ºC
durante 24 a 48 horas.
2o DIA - Realizar a contagem das bactérias lácticas nas placas da menor diluição,
em que a contagem aparecer com número de colônias entre 30 e 300.
Expressar o resultado em UFC/g (unidades formadoras de colônias por
grama de iogurte).
PADRÃO DE IDENTIDADE E QUALIDADE PARA LEITES

FERMENTADOS
41
42
PRÁTICA 12: PRODUÇÃO DE PICLES
1. OBJETIVO
Realizar um processo fermentativo para produção de picles
2. PRINCÍPIO
A fermentação láctica é um importante método de preservação de alimentos à
centenas de anos. Consiste na oxidação anaeróbica, parcial de hidratos de carbono,
com a produção final de ácido láctico além de várias outras substâncias orgânicas. É
processo microbiano de grande importância utilizado pelo homem na produção de
lacticínios, na produção de picles, entre outros. A produção de picles insere-se na
fermentação láctica (natural). Os vegetais submersos em sal de concentração
controlada (10%do volume) são sujeitos às ações das bactérias do gênero Leuconostoc
e Lactobacillus do próprio vegetal que transformam hidratos de carbono do vegetal
em ácido láctico originando os verdadeiros picles. A produção de compotas e picles
permite conservar os alimentos por longos períodos de tempo, pois os elevados teores
de açúcar e ácidos inibem o crescimento da maioria dos organismos contaminantes.
Para, além disso, a conservação dos picles é também devido ao pH ácido e à elevada
pressão osmótica do meio, que também são desfavoráveis para o crescimento de
micro-organismos. Portanto a conservação dá-se graças à ação conjugada do ácido
láctico formado e do sal adicionado, o qual inibe toda e qualquer atividade
microbiana. A preservação de alimentos pela acidificação é um procedimento muito
antigo. Os ácidos atuam de diferentes formas no processamento de alimentos, além de
contribuírem para melhorar a qualidade degustativa e estimular o consumo.
- Pepino, cebolas, cenouras, mangas verdes, vagens e abóboras, são todos bons para
os picles.
- Faca, panela grande de capacidade para 5 litros, pano de prato
- Garrafa de Refrigerante: que servirá de biorreator
 Faça o expurgo dos vegetais removendo a parte não comestível ou deteriorada dos
vegetais, como caroços, sementes e partes danificadas;
43
 Corte os vegetais em pedaços relativamente grandes; use cerca de dez xícaras
(chávenas) de legumes picados (use uma mistura de vários);
 Coloque em uma panela grande e aqueça por 3 a 5 minutos. Este procedimento

(branqueamento) é realizado para eliminar a flora patogênica e favorecer a
microbiota responsável pela fermentação
 Prepare uma salmoura com 10% de cloreto de sódio por peso hortaliça;
 Arrume em camadas pequenas intercalando com a salmoura;
 Coloque uma placa de Petri em cima das camadas das hortaliças fazendo uma
tampa móvel;
 Coloque a parte de cima cortada da garrafa recompondo a mesma;
 Deixe fermentar por 4 a 6 semanas a uma temperatura de 18 a 20oC,
 Após a fermentação faça a dessalga, envase a quente (82oC) com a salmoura;
 Faça uma pasteurização a 74oC por 15 minutos, utilizando uma panela grande com
o fundo forrado de pano.
OBS: A acidez final deverá estar em torno de 0,6 -0,8% e o pH = 3,5 a 3,6.
5.1. Acidez em ácido lático com NaOH 0,25 N (volumétrico)
 Pipete uma alíquota de 25 ml da solução original (amostra de salmoura) e

passe para um balão volumétrico de 100ml;
 Complete o volume com água destilada e agite;
 Pipete 25 ml desta solução diluída, para um frasco de Erlenmeyer de 500 ml;
 Junte cerca de 100 ml de água destilada;
 Junte 3 gotas de indicador fenolftaleína a 1% (o melhor indicador para esta

titulação é a timolftaleína a 2%) e titule com NaOH até viragem para a cor
rosa claro anotando o gasto com B mL
Acidez titulável (g/100mL) = VxMx92,07

10 x A
Onde:
44
V= volume de hidróxido de sódio gasto na titulação(mL)
M= molaridade ou normalidade
A=volume de amostra (g ou mL)
45
PRÁTICA 13: PRODUÇÃO DE BACITRACINA
1. OBJETIVOS:
 Verificar a capacidade de um micro-organismo produzir antibióticos em cultivo

submerso;
 Determinar a atividade antimicrobiana
2. PRINCÍPIOS
Antibiótico é uma substância possuidora de ação antagônica, capaz de eliminar

determinadas espécies. Alguns antibióticos de ação terapêutica como a penicilina,
bacitracina, tetraciclina e estreptomicina, podem ser produzidos por micro-
organismos como bactérias e fungos filamentosos. A capacidade do micro-organismo
em produzir antibióticos em diferentes meios de cultura pode ser avaliada em relação
ao crescimento celular durante o tempo de cultivo.
A produção do antibiótico pode ser relacionada com a evolução do
crescimento utilizando um cultivo submerso em batelada ou em batelada alimentada
em condições de incubação controladas.
O crescimento pode ser determinado pela pesagem de uma série de amostras
retiradas a intervalos de tempo regulares. Assim é possível confeccionar uma curva de
crescimento relacionando a concentração celular ou peso seco (ordenada) com o
tempo de cultivo (abcissa). Nesta curva são, então, identificadas as diferentes fases do
crescimento microbiano. Em condições de crescimento exponencial, massa celular e
número de células permanecem proporcionais, embora a relação entre estes dois
valores possa variar em determinadas condições de cultivo. O crescimento de um
micro-organismo pode ser avaliado pela determinação da massa celular que, por sua
vez, pode ser medida diretamente pelo peso seco. Durante a fase exponencial de
crescimento pode-se então determinar o tempo de geração (G) e a velocidade
específica máxima de crescimento (µMÁX.).
A produção do antibiótico pode ser detectada de uma série de amostras
retiradas a intervalos de tempo regulares e a atividade antimicrobiana pode ser testada
contra diferentes micro-organismos (bactérias, bolores, leveduras) usando a prova em
disco.
 Inóculo: suspensão de Bacillus subtilis ou Bacillus lincheniformis em água estéril

correspondente a escala 5 de Mac Farland
 Micro-organismos Teste:
46
Staphylococcus aureus (bactéria Gram +)
Bacillus subtilis (bactéria Gram + )
Escherichia coli (bactéria Gram - )
Mycobacterium smegmatis (bactéria alcool ácido resistente)
Candida albicans (levedura)
Aspergillus niger (bolor)
 Meio de cultura para o preparo do Inóculo
Meio de Agar Nutritivo

Extrato de carne .................................. 5g/L
Peptona................................................ 3g/L
Agar....................................................15-20g/L
Preparar 500mL e colocar 250mL em 2 frascos de Roux,.

Autoclavar a 120ºC/20min.
 Meio de cultura para a produção da bacitracina
Meio de Hendlin:
Ácido glutâmico ........................................10g/L

K2HPO4 ........................................................ 0,5 g/L
KH2PO4 ....................................... ................ 0,5 g/L
MgSO4. 7 H2O .............................................. 0,2 g/L
MnSO4. 7H2O................................................ 0,01 g/L
FeSO4. 7H2O.................................................. 0,01 g/L
pH.................................................................. 6,4-6,5
Autoclavar a 120ºC/20min
Meio Alternativo contendo Soro de Leite

K2HPO4 ........................................................ 0,5 g/L
KH2PO4 ........................................................ 0,5 g/L
MgSO4. 7 H2O .............................................. 0,2 g/L
MnSO4. 7H2O................................................ 0,01 g/L
FeSO4. 7H2O.................................................. 0,01 g/L
Soro de leite ................................................. 5 e 10%.
Glicose ........................................................... (5 – 10 -15%).
pH......................................................... 6,4-6,5
Preparar 1L de meio de soro de leite e distribuir 500 mL em 2 frascos de

Erlenmeyer de 1000ml de capacidade, adicionar no primeiro 2,5g de glicose e
no segundo 5g de glicose homogeneizar e esterilizar a vapor fluente por 20
minutos. Deixar esfriar.
Obs: O soro de leite pode ser obtido pela coagulação das proteínas do leite integral,
comercial tipo longa vida, após elevação da temperatura a 70 ºC, seguida da adição de
ácido lático até pH 4,5 e aquecimento até 94 ºC. Aguarda-se a decantação e
resfriamento da solução para posterior filtrar o soro.
47
 Meio para o teste da Atividade Antimicrobiana (prova de disco)
Meio AVP
Peptona.............................................. 5,0g
Glicose............................................... 5,0g
Extrato de carne................................. 5,0g
NaCl.................................................... 2,0g
Extrato de leveduras........................... 3,0g
Agar.....................................................15,0g
Água destilada.....................................1000mL
pH=7,0
Autoclavar a 120ºC/20min
 Equipamentos: Mesa agitadora (Shaker), Balança semi-analítica
 Diversos: 20 Pesa filtros ou beckers de 10ml (tarados), 20 Tubos de ensaio

estéreis, 3 frascos de Erlenmeyer de 1000ml de capacidade, 30 Ponteiras de 1 mL
e Pipetas automáticas de 1ml e 10ml, Discos de papel, Swabs ou Alças de
Drigalisk, Placas de Petri estéreis,
4.1. Preparo do Inóculo
 Inocular as bactérias Bacillus subtilis e Bacillus lincheniformes nos frascos de

Roux e incubar por 24-48horas a 35ºC.
 Colocar 50mL de água estéril no frasco de Roux e agitar. Recolher a suspensão

microbiana e ajustar à escala 0,5 de Mac Farland.
4.2. Produção da Bacitracina
 Retirar 5mL do meio de soro de leite e guardar na geladeira.
 Inocular esterilmente 5mL (1%) do inóculo preparado de acordo com o item 4.1.
 Retirar 10ml de amostra com uma pipeta estéril, imediatamente após a inoculação,
correspondente, portanto, ao tempo zero. Colocar a 5mL em 2 beckeres
previamente seco e tarado e colocar em estufa a 80 oC por 24 horas (até peso
constante). Anotar o resultado;
48
 Colocar os frascos de Erlenmeyer na mesa agitadora, tendo o cuidado de fixá-los
bem. Ligar a agitação a 180 - 200 rpm e ajustar a temperatura para 37ºC. Deixá-
los sob agitação durante todo o cultivo;
 Retirar amostras de 15ml a intervalos de 1 dia, durante 3 a 5 dias.
 Todas amostras serão centrifugadas a 5000rpm por 15minutos.
 O líquido após filtrado em membrana micropore de 0,4µm será utilizado para a

avaliação da atividade antibiótica utilizando o teste de difusão em disco (anotar o
diâmetro do halo de inibição);
 O sedimento será ressuspenso com água estéril no mesmo volume inicial e feita a
leitura da absorbância a 610 nm. A concentração da biomassa contida no
sedimento de cada amostra será determinada pela curva de calibração feita
previamente.
 Registrar os dados numa tabela.
 Construir um gráfico, colocando no eixo das ordenadas os valores do tempo (dias)

e no eixo das abcissas concentração em peso seco X (g/l) e a atividade
antimicrobiana;
 Verificar o momento em que ocorreu a produção do antibiótico. Calcular a

atividade máxima através da avaliação do maior diâmetro de halo
 Tirar conclusões a respeito do meio mais adequado ao crescimento.
5. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA (TESTE DO DISCO)
a) Preparo dos micro-organismos testes:
Preparar suspensões dos micro-organismos teste com solução salina fisiológica ou

água estéril até que a turbidez se ajuste a 10 8 bactérias/ml. Comparar as
suspensões contra um padrão de turvação 0,3 da escala de Mac Farland (0,3ml de
BaCl2.2H20 0,048M em 99,7ml de H2SO4 0,36N).
b) Inoculação:
Adicionar 0,1ml de micro-organismo teste em uma placa com meio de AVP e

espalhar uniformemente por toda a superfície da placa em diferentes sentidos,
assegurando uma semeadura uniforme.
Preparar 5 a 7 placas de cada micro-organismo teste
c) Aplicação dos discos:
Com uma pinça estéril, embeber os discos nas amostras com os meios
fermentados. Depositar com uma pinça estéril (imersa em álcool ou flambada na
49
chama) os discos embebidos com o antibiótico sobre a superfície da placa de
AVP preparada na etapa anterior. Em seguida, exercer uma leve pressão sobre
cada disco para se obter uma boa aderência, a fim de permitir um contato do disco
com a superfície do ágar. Colocar no máximo 9 discos por placa. Inverter as
placas e incubar na temperatura a 350C por 48 horas.
d) Resultado:
Com o auxílio de uma régua e luz refletida contra um fundo preto, medir os
diâmetros dos halos de inibição, incluindo o diâmetro dos discos. Anotar os
resultados encontrados na tabela abaixo. Interpretar a sensibilidade aos
antibióticos de acordo com o diâmetro do halo de inibição encontrado.
50
51
PRÁTICA 14: PRODUÇÃO DE CELULASE POR FERMENTAÇÃO EM

ESTADO SÓLIDO
1. OBJETIVO
Elaborar uma fermentação para produção de enzimas celulase por Aspergillus

niger
2. PRINCÍPIO
A celulase é uma enzima utilizada na hidrólise da celulose resultando em

açúcares fermentescíveis. Fungos como o Aspergillus niger possuem capacidade de
produzir celulases para a própria sobrevivência quando se encontram em meios
ricos em celulose. Esta prática consistirá na avaliação das melhores condições de
umidade na produção de celulase por fermentação em estado sólido.
A celulose é um polissacarídeo estrutural derivado da β-D-glicose de
fórmula (C6H10O5)n. A celulase é uma classe de enzimas que catalisa a reação de
hidrólise da celulose em glicose e outros açúcares. É dividida em três enzimas
principais: Endoglucanase, β-glicosidase e Exoglucanase. As endoglucanases são
responsáveis por iniciar a hidrólise e clivam as regiões internas da celulose liberando
oligossacarídeos. As Exoglucanases (celobiohidrolases e glucanohidrolases) catalisam
a hidrolize de oligossacarídeos em celobioses. As β-glicosidase catalisam a hidrólise
da celobiose e oligossacarídeos em glicose.
A atividade enzimática pode ser avaliada utilizando um cultivo em batelada
em condições de incubação controladas. Com leituras da densidade óptica de uma
série de amostras retiradas a intervalos de tempo regulares, e com auxílio da curva
padrão de calibração, é possível confeccionar uma curva de atividade enzimática
(ordenada) com o tempo de cultivo (abscissa). Nesta curva são, então, poderá ser
identificada onde ocorre a maior a produção enzimática e estimar a produtividade
máxima.
3.PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
3.1. PREPARO DO INÓCULO

 Inocular o fungo filamentoso Aspergillus niger em 150mL de meio CZ (Agar
Czapeck Dox) contidos em um frasco de Roux de capacidade de 500 mL. Incubar
por 7 dias a 30ºC.
52
 Após o período de inubação, remover os esporos do fungo com o auxílio de
50mL de solução de Tween 80 a 2%.
 Avaliar a concentração celular da solução pela contagem de esporos utilizando

uma câmara de Neubauer (Figura 3.1) com auxílio do microscópio binocular
conforme método de contagem. A concentração deverá ser ajustada para de 10 7
esporos/mL, que será a concentração utilizada neste estudo.
Figura 3.1 - CÂMARA DE NEUBAUER. Fonte: (PROTOCOLOS BIOMED, 2012).
3.2. FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO (FES)
 A produção de celulases será, realizada em frascos de Erlenmeyers de 125 mL

que serão utilizados como biorreatores contendo 10g de substrato seco (casca de
coco ou resíduo de fruticultura).
 As umidades dos biorreatores serão ajustadas com adição de meio de Czapeck

líquido com pH ajustado para 4,5 sem sacarose, fazendo assim um estudo
comparativo em umidades (50%, 60%, 70%) e substratos diferentes.
 Após o ajuste da umidade os meios serão inoculados com 5% do inóculo do

fungo Aspergillus niger preparado de acordo com o item 1.
 Após a inoculação, os frascos serão incubados a temperatura ambiente e sem

agitação.
 Após 48 horas adicionar de 50 mL de tampão acetato de sódio nos biorreatores

para extração do Extrato Enzimático Bruto (EEB) e posterior análise.
 Colocar em agitador com movimento orbital (mesa agitadora tipo Shaker)

durante 1 hora a 32 ºC com velocidade de 120 rpm. Após o tempo de agitação, as
suspensões de cada biorreator serão transferidas para tubos cônicos tipo Falcon e
centrifugadas a 5000 rpm durante 15 minutos para remover os sólidos ainda
existentes.
4. ANÁLISE DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA
53
 MATERIAL NECESSÁRIO: 9tubos de centrífuga, 11 tubos de Follim Wu, 11
pipetas de 1 mL, 2 pipetas de 5mL, 1 pipeta de 10mL, 1 Banho-maria regulado na
temperatura de 50ºC e 1 banho-maria a 100ºC, 11 tiras de papel Whatman nº1
cortadas na dimensão 1x6cm.
 SOLUÇÕES: Solução de tampão de citrato ou acetato pH 4,8, Solução de

carboximetil celulose 2% em tampão acetato de sódio pH 4,8, solução de DNS.
4.1. ATIVIDADE DA ENZIMA DA ENDOGLUCANASE CMCASE
 Em um tubo Follin-Wu será adicionada 0,5 mL de uma solução 2% (massa) de

carboximetil-celulose em tampão acetato de sódio com pH 4,8 e 0,5 mL de
extrato enzimático.
 Preparar um branco com 1,5 mL de solução tampão acetato de sódio com pH 4,8.
 Colocar os tubos em banho a 50°C por 30 minutos.
 Após o tempo de reação, acrescentou-se 3 mL de solução de DNS e o tubo foi

então levado a um banho de água fervente, 100°C, por 5 minutos,
 Em seguida, mergulhado em um banho de gelo para cessar a reação e ajustar com

água destilada em 25 mL
 Fazer a leitura da absorbância a 540 nm em espectrofotômetro.
4.2 ATIVIDADE DE CELULASES TOTAIS (FPASE)
 Colocar em um tubo de Follim Wu uma tira de papel filtro Whatman com

dimensão de 1x6 cm torcida em forma de aspiral. Acrescentar 1,0 mL de solução
tampão de acetato de sódio pH 4,8 e 0,5 mL de extrato enzimático bruto.
Certifique-se de que o papel esteja todo recoberto pelo líquido.
 Para o branco será adicionada 1,5 mL de solução tampão e uma tira de papel
filtro.
 Aquecer a amostra e o branco em banho-maria a 50°C por 1hora.
 Parar a reação pela adição de 3 mL de DNS e deixar a 100ºC por 5 minutos
54
 Aferir para o volume do tubo de Follim Wu para 25 mL com água destilada e
realizada a medição de absorbância a 540 nm em espectrofotômetro.
 Realizar a conversão da absorbância para concentração de glicose utilizando uma

curva de calibração previamente produzida (anexo 3)
4.3 UNIDADE DE CONCENTRAÇÃO ENZIMÁTICA
A quantidade de enzima é expressa em termos de sua atividade. A

determinação da atividade da enzima envolve a medida da velocidade de reação,
portanto, a Comissão de Enzima da União Internacional de Bioquímica, recomenda a
seguinte definição (DIXON; WEBB, 1979): “Uma unidade (U) de atividade é a
quantidade de enzima que catalisa a transformação de um micromol de substrato, ou a
formação de um micromol de produto por minuto”,
(3.1)
55
PRÁTICA 15: PRODUÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO
1. OBJETIVO
Elaborar uma fermentação cítrica com Aspergillus niger
2. PRINCÍPIO
Alguns ácidos orgânicos como o tartárico, fumárico, lático, oxálico, cítrico e

outros, muito usados nas indústrias alimentícias e farmacêuticas podem ser obtidos
por fermentação. O ácido cítrico pode ser obtido pela fermentação de um mosto
contendo sacarose, sendo os agentes responsáveis pelo processo os bolores
pertencentes ao gênero Aspergillus. Esses micro-organismos são fungos filamentosos,
com hifas curtas e grossas, septadas; apresentando reprodução assexuada por
conídios. A espécie mais usada é A. niger dotado de grande atividade bioquímica,
produz ácido cítrico, ácido oxálico, ácido glucônico, em condições variáveis; possui
amilases, sintetiza gorduras, digere proteínas etc.
Há três métodos gerais para obtenção de ácido cítrico: cultivo na superfície de
meios líquidos, cultivo sobre material sólido inerte e cultivo submerso.
- Micro-organismos: Aspergillus niger
- Reagentes: Indicador de fenolftaleína a 1% ou timolftaleína a 2 % NaOH a 0,25N

Cal hidratada (leite de cal), ou seja, hidróxido de cálcio (Ca(OH)2)a uma concentração
de 5 graus Baumé (°Bé).
- Preparo do leite de cal: 5 g de CaO e 60 mL de água destilada. Com auxílio de um

agitador magnético, mantém-se esta suspensão em constante agitação durante 20
minutos. Em seguida para permitir a hidratação máxima, a suspensão é levada a um
volume final de 250 mL correspondente a uma densidadede 1,036.
- Diversos: Pipetas volumétricas de 25 ml, Balão volumétrico de 100 ml, frasco de

Erlenmeyer de 500 ml, Bureta com capacidade para 25 ml
- Equipamentos (biorreatores): Cubas rasas, Bandejas com fundo falso ou Biorreator

de 2 litros
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:
Equipe A: Cultivo em superfície
 Pesar 150g de sacarose; 2 g de NH4NO3; 1g de KH2PO4; 0,2g de MgSO4.7H2O,

água para 1 litro e ácido clorídrico para pH de 3,0 ; esterilizar a vapor fluente por
20 minutos;
 Colocar em cubas rasas, esterilizadas;
56
 Semear com uma suspensão de esporos de A. niger (160 esporos/ml) com 5 dias
de formados, e de maneira que se distribuam uniformemente na superfície do
meio;
 Deixar fermentar por 10 dias. A produção é mais lenta, cessando por volta do
10odia. Remover o líquido fermentado. O micélio pode ser aproveitado,
introduzindo-se sem submergi-lo, igual volume de meio fresco.
Equipe B: Cultivo sobre material inerte
 Preparar um mosto igual ao da equipe A.

 Encher a câmara com o material de recheio (bagaço de cana, polpa de beterraba,
ou de abacaxi);
 Lavar o material com água quente até que sejam removidas todas as substâncias
que possam ser extraídas.
 Imobilizar o micro-organismo no recheio através da passagem da suspensão de
esporos, com 5 dias de formados pelo material de suporte, recirculando-o
vagarosamente.
 Completada a inoculação deve-se iniciar a passagem do mosto pelo gerador.
 O mosto deverá recircular pelo gerador até que o processo tenha sido concluído.
 Obs.: Obtém-se o rendimento máximo em 4 dias (55%). O bagaço de cana pode

ser usado mais de uma vez, o de beterraba não.
4.1.TRATAMENTOS FINAIS
a. Obtenção de citrato de cálcio
Concentra-se o meio fermentado até 5o Bé e adiciona-se leite de cal para

neutralizar ¾ do ácido produzido, terminando de neutralizar com carbonato de cálcio
finamente dividido. Ferve-se e filtra-se à ebulição. Concentra-se e deixa cristalizar.
b. Obtenção do ácido cítrico
À solução de citrato de cálcio adiciona-se, agitando, ácido sulfúrico em ligeiro

excesso, ferve-se e filtra-se, lavando-se o precipitado. Os filtrados são concentrados
em vácuo até 28o Bé e deixa-se esfriar para precipitar o CaSO4 residual. Filtra-se e
evapora-se até 48 – 50o Bé, para cristalizar o ácido cítrico. Recristaliza’se em
recipiente de alumínio puríssimo, deixando-se 4 a 5 dias para cristalizar. Os cristais
são centrifugados, lavados com soluçào de ácido cítrico puro.
5.1. DETERMINAÇÃO DO CONSUMO DE SACAROSE PELO MÉTODO DO

DNS
5.2. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁCIDO COM NAOH 0,1 N
57
MATERIAIS/REAGENTES: Frasco de Erlenmeyer de 125; bureta de 10 mL;
indicador fenolftaleína a 1%; solução de hidróxido de sódio 0,1N.
METODOLOGIA:
 Preparar as soluções; padronizar a solução de NaOH 0,1N com biftalato de

potássio;
 Pesar 1 a 5g da amostra sólida (1 -5 mL de amostra líquida) em um frasco de
Erlenmeyer de 125 mL;
 Adicionar 25 mL de água destilada. Para amostras que contem acidez muito
baixa, pode-se colocar 5 a 10 g (5 –10 mL) de amostra em frasco de Erlenmeyer
de 250 mL e diluir com 50 mL de água destilada;
 Adicionar 2 gotas do indicador fenolftaleína a 1%.
 Titular com solução de hidróxido de sódio 0,1 N, até coloração rósea permanente
por 30 segundos.
CÁLCULO:
Acidez, solução normal % (v/p) = [V x N x f x100]/P

Acidez, em ácido cítrico % (v/p) = [V x eq.g ácido x 100] / P
Onde,
V = volume da solução de hidróxido de sódio gasto na titulação;
f = fator de correção da solução de hidróxido de sódio
P = g ou mL da amostra usado na titulação
Eq-grama do ácido cítrico = 0,064
58
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 ARAÚJO, José de Arimatéia de. Controle Físico e Químicos na Fabricação do

Álcool Etílico. Maceió. IAA/Planalsucar, 1982.
 Apostila Centro de Apicultura Tropical Pindamonhangaba 3ª edição 1993.
 BORGES DIAS, L. B. Apostila de Controle de Qualidade em Destilaria de Álcool
do ITEP, Recife-PE,1985.
 INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:
Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP,
1985. p.18.
 INSTITUTO ADOLFO LUTZ (São Paulo). Métodos físico-químicos para análise

de alimentos /coordenadores Odair Zenebon, Neus Sadocco Pascuet e Paulo
Tiglea -- São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. p. 1020 versão eletrônica 1.
Análise de alimentos 2. Alimentos / métodos 3. Serviços laboratoriais de saúde
pública. Disponível em:
http://www.crq4.org.br/sms/files/file/analisedealimentosial_2008.pdf
 TAMIME, A. Y; ROBINSON, R. K. Yogur, ciencia y tecnologia. Editora

Acribia. Zaragoza. España.1991.Conservas Ritter S.A. Av. Frederico Augusto
Ritter, 2700 - Granja Esperança - Cachoeirinha – RS. Fones: (51) 470-3800 / (51)
470-6011 - Caixa Postal: 1019 - Cep: 94.930-000
 RAPACCI, M ;Apostila do VI Encontro Regional Sul de Ciência e Tecnologia de

Alimentos. Leites Fermentados. Agosto 1999.
 TENCHINI DE MACEDO, N.L.; Apostila Tecnologia de Fabricação de Leites

Fermentados. Instituto de Laticínios Cândido Tostes. Novembro 2000.
 INDUSTRIA DE LATICINIOS. Nova legislação de produtos lácteos e de

alimentos pra fins especiais. Fonte Comunicações e Editora. São Paulo. 1998.
 www.ritter.com.br/foodservice/dir_arquivos/manual.pdf
59
ANEXOS
1. CÁLCULO DO VOLUME DE MELAÇO PARA O PREPARO DO MOSTO
Brix = Massa do soluto

Massa solução
Brixi Mi = Brixf Mf
Brixmelaço . Mmelaço = Brixfinal. Mfinal
Brixmelaço . Mmelaço = Brixfinal. (Mmelaço + MH2O)
Brixmelaço . Mmelaço = Brix.final . Mmelaço + Brixfinal . MH2O

Brixmelaço . Mmelaço - Brixfinal . Mmelaço = Brixfinal . MH2O
(Brixmelaço - Brixfinal ) Mmelaço = Brixfinal . MH2O
Mmelaço = Brixfinal________ = Brix mosto______
MH2O Brixmelaço - Brixfinal Brixmelaço – Brixmosto
Vmelaço. dmelaço = Brixfinal________ = Brix mosto______
VH2O Brixmelaço - Brixfinal Brixmelaço – Brixmosto
Vmelaço = Brix mosto___________
VH2O (Brixmelaço – Brixmosto). dmelaço
Vmosto = Vmelaço + VH20
Vmelaço = Vmosto - VH20 = Vmosto - (Brixmelaço – Brixmosto). Vmelaço .dmelaço
Brix mosto
Vmelaço = Vmosto. Brix mosto - (Brixmelaço – Brixmosto).Vmelaço. dmelaço
Brix mosto
Vmelaço.Brixmosto = Vmosto. Brix mosto - (Brixmelaço – Brixmosto).Vmelaço. dmelaço

Vmelaço.Brixmosto +(Brixmelaço – Brixmosto).Vmelaço. dmelaço= Vmosto. Brix mosto
Vmelaço.Brixmosto + Brixmelaço .Vmelaço. dmelaço - Brixmosto..Vmelaço. dmelaço = Vmosto. Brix mosto
Vmelaço.(Brixmosto + Brixmelaço .dmelaço - Brixmosto. dmelaço) = Vmosto. Brix mosto
Vmelaço = Vmosto..Brix mosto / ( Brixmosto + Brixmelaço .dmelaço - Brixmosto. dmelaço)
Ex: Calcular a massa de melaço necessária para preparar 2000mL de mosto a

20ºBrix partindo de um melaço com 80ºBrix, e densidade d=1,41g/mL.
Vmelaço = 2000x20 / ( 20 + 80 x1,41 - 20x1,41) = 382mL
Mmelaço = 382x1,41 = 538,62 = 539g
VH2O = 1618 mL
60
2. CONVERSÃO DE DENSIDADE OU A GRAVIDADE ESPECÍFICA (GE) DO
MOSTO PARA º BRIX
 A gravidade específica (GE) do mosto (DENSIDADE) é uma medida direta do seu

conteúdo de açúcar.
 Meça a densidade do mosto com um densímetro. Coloque o densímetro numa amostra

de mosto e leia o valor da escala na superfície. Suponha, para este exemplo, que a GE
do mosto é de 1,05.
 Calcule a porcentagem de açúcar no mosto, também conhecida como valor de Brix.

Esta é dada pela equação Brix = 261,3 x (1 - 1/GE). Neste exemplo, o Brix = 261,3 x
(1 - 1/1.05) = 12,4. Um mosto com uma GE de 1,05 tem, portanto, 12,4% de açúcar.
Um tipo especial de hidrômetro conhecido como um sacarômetro irá executar
automaticamente a conversão para você.
 Determine o valor de Brix do GE desejado. Os produtores de vinho normalmente

precisam de um mosto com 1,1 de GE, de modo que o valor de Brix desejado neste
exemplo seria 261,3 x (1 - 1/1.1) = 23,75. O valor de Brix desejado é portanto, 23,75.
 Meça o volume do mosto. Alguns garrafões terão marcações de medidas, que

permitem medir o volume diretamente. Também é possível calcular o volume por
meio da soma do volume dos ingredientes do mosto. Em outros casos, pode ser
preciso despejar o mosto em um recipiente de medida. Para este exemplo, o mosto terá
um volume de um litro.
 Calcular a quantidade de açúcar a ser adicionada ao mosto. Esta é dada pela equação
M = V x (GE) x (Bf - Bi) / (100 - Bf) em que M é a quantidade de açúcar a ser
adicionada, em quilogramas; V é o volume do mosto, em litros; GE representa a
gravidade específica do mosto; Bf é o valor Brix desejado, como no passo 3; e Bi é
o valor Brix como no passo 2. Neste exemplo, M = 1 x 1,05 x (23,75-12,4) /
(100-23,75) = 0,157 kg. Seria, portanto, necessário adicionar 157 g de açúcar a
um litro de mosto para elevar a GE de 1,05 para 1,1.
3. CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA USO NO MÉTODO DO DNS
Introdução:
Os açúcares redutores das amostras podem ser determinados pelo método do

DNS. Este método consiste na redução, em meio alcalino, do ácido 3,5 –
dinitrossalicílico em ácido 3- amino-5-nitrossalícilico por ação dos açúcares
redutores, dando origem a um composto acastanhado que obedece a lei de Lambert-
Beer, ou seja, a transmitância é proporcional à concentração da substância dissolvida,
neste caso, os açúcares redutores.
61
1.
REAGENTE
Componentes e quantidades
Ácido 3,5-dinitrossalicílico 1,0 g
Solução 2N de NaOH 20,0 mL
Sal de Rochellle (ver nota A) 30,0g
Água destilada até 100,0 mL
MODO DE PREPARO
Dissolver à temperatura ambiente (ver nota B) 1,0 g de ácido 3,5- dinitrossalicílico

em 50 mL de água destilada (ocorre dissolução parcial do ácido). Aos poucos,
adicionar os 20 mL da solução 2N de NaOH, agitando sempre, até a dissolução
completa do ácido. Adicionar 30g de sal de Rochelle; dissolver e completar o volume
até 100 mL. (ver nota C).
Notas
A: O sal de Rochelle é o tartarato de potássio e sódio tetrahidratado. Sua função é

proteger o reagente e, consequentemente, o açúcar da amostra, da ação do oxigênio
dissolvido.
B: Essa dissolução é demorada, necessitando de agitação constante. Para favorecer o

processo, ela pode ser feita a uma temperatura próxima a 300 C.
C: Proteger o reagente da ação do CO2; hidróxido de sódio na solução.
Curva de Calibração do DNS
62
1. Em um copo de Béquer de 50ml pesar, em balança semi-analítica, 20g de glicose,
anotando o valor exato. Diluir em um pouco de água e transferir, analiticamente,
para um balão de 1000ml. Completar o volume e homogeneizar;
2. A partir da concentração da suspensão padrão escolher os valores para as

concentrações, de forma a cobrir uma determinada faixa de concentrações;
3. Realizar uma série de diluições com um conjunto de pipetas e balões volumétricos

adequados. Utilizar como sugestão os valores da tabela abaixo.
Suspensão número Conc. da diluição, Fator de diluição Modo de preparo
X (g/l) (ml da susp.
padrão)
1 0,2 100x 5 até 500
2 0,4 50x 1 até 500
3 0,6 33,3x 15 até 500
4 0,8 25x 2 até 50
5 1,0 20x 2,5 até 50
6 1,2 16,67x 3,0 até 50
7 1,5 13,33x 19 até 250
8 1,6 12,5x 20 até 250
1. Homogeneizar cada suspensão e transferir para um tubo de espectrofotômetro

previamente ajustado ao comprimento de onda de 540 nm.
2. Realizar, pelo menos, duas leituras do valor da absorbância para cada

concentração. O espectrofotômetro é calibrado antes de cada leitura, com um
“branco” de água destilada.
3. Construir um gráfico, colocando no eixo das ordenadas os valores da concentração

de glicose X (g/l) e no eixo das abscissas os valores da absorbância (D.O).
4. Fazer uma regressão linear com o auxílio de um programa de computador ou

utilizando o método dos mínimos quadrados.
5. Calcular o coeficiente de correlação, r, e determinar o intervalo de concentrações,

X1  X2, no qual a expressão é válida.
OBSERVAÇÃO: A curva de calibração obtida pelos pontos descritos é válida apenas

para o DNS do utilizado na sua confecção.
63
64

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PROCESSOS

PRÁTICA 01: PREPARO DE INÓCULOS.................................................................3

PRÁTICA 02: CURVA DE CALIBRAÇÃO.................................................................6

PRÁTICA 03: CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO...................................9

PRÁTICA 04: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA (DETERMINAÇÕES DE BRIX E

PRÁTICA 05: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA (DETERMINAÇÕES DE

PRÁTICA 06: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA (PREPARO DE MOSTO E

PRÁTICA 07: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA PARA PRODUÇÃO DE

PRÁTICA 08: PRODUÇÃO DE VINHO TINTO......................................................30

PRÁTICA 09: FERMENTADOS DE FRUTAS........................................................33

PRÁTICA 10: PRODUÇÃO DE VINAGRE..............................................................35

PRÁTICA 11: FERMENTAÇÃO LÁTICA (PRODUÇÃO DE IOGURTE)............38

PRÁTICA 12: PRODUÇÃO DE PICLES..................................................................43

PRÁTICA 13: PRODUÇÃO DE BACITRACINA.....................................................46

PRÁTICA 14: PRODUÇÃO DE CELULASE POR FERMENTAÇÃO EM

PRÁTICA 15: PRODUÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO..................................................56

Roteiro de aulas PRÁTICAS DE processos

PRÁTICA 01: PREPARO DE INÓCULOS

 Preparar meios de cultura para o cultivo de inóculos;

Denomina-se inóculo, pé-de-cuba ou pé de fermentação um volume de células

 Balanças; Potenciômetro; Béquer 2000ml; Tubos de Ensaio e Frascos de

 Microrganismos: Levedura: Saccharomyces cerevisiae

Meio 1 (CALDO NUTRITIVO COM GLICOSE)

Glicose ........................................................ 0,5%, 1,0%, 1,5%

Meio 2 (CALDO COM MELAÇO)

Melaço......................................................... 0,5%, 1,0%, 1,5%

Meio 3 (CALDO NUTRITIVO COM LACTOSE)

Figura 1: Esquema do preparo do inóculo (a) em meio líquido (b) em meio

 Incubar na temperatura adequada ao crescimento do microrganismo.

PRÁTICA 02: CURVA DE CALIBRAÇÃO

 Determinar uma curva de calibração para a determinação da concentração celular

A partir do conhecimento da absorbância de uma amostra é possível

As diluições adequadas são obtidas através de tentativas de forma a abranger

1a.) Deve haver uma correlação linear entre a concentração e o logaritmo da

 A partir da suspensão de micro-organismo previamente cultivada em meio

 Remover 5 mL da suspensão microbiana com pipeta volumétrica e adicionar em 3

 Faça uma série de diluições (cerca de 6 diluições) com um conjunto de pipetas e

 Realizar, pelo menos, duas leituras do valor da absorbância para cada

 Após 48 horas, remover os béqueres da estufa cuidadosamente com o auxílio de

Onde: P = peso da amostra + peso do béquer (g)

 Determinar a concentração de cada amostra (Xi) com o auxílio da seguinte

Onde: X0 = concentração da suspensão inicial (g/mL)

 Construir um gráfico, colocando no eixo das ordenadas os valores da

 Fazer uma regressão linear com o auxílio de um programa de computador ou

 Observação: A curva de calibração obtida pelos pontos descritos é válida apenas

PRÁTICA 03: CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO

 Avaliar o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisae em diferentes meios

O crescimento microbiano pode ser definido em termos, tanto da massa, como

PX= (Xmáx - Xo)/(tf - to) )

Onde: Xo = Concentração celular inicial, (g/l)

- Micro-organismo: Saccharomyces cerevisiae

Equipamentos: Espectrofotômetro; Mesa agitadora (Shaker); Balança semi-analítica

 Preparar 1 litros de caldo mineral, distribuir 500ml em 2 frascos de Erlenmeyer

 Colocar os frascos de Erlenmeyer na balança semi-analítica e inocular

 Colocar os frascos de Erlenmeyer na mesa agitadora, tendo o cuidado de fixá-los

 Retirar amostras de 3ml a intervalos de 1 hora, até que se observe um mínimo

 Calcular a velocidade específica máxima de crescimento (µ máx) o tempo de

 Comparar os resultados obtidos e tirar conclusões a respeito do meio mais

TABELA 1. RESULTADO DOS DADOS EXPERIMENTAIS

TABELA 2. RESULTADO DOS DADOS EXPERIMENTAIS

Universidade Federal de Pernambuco

 Determinar Brix, pH de uma matéria-prima açúcarada

A produção de etanol a partir do processo fermentativo por ação de leveduras