CENTRO PAULA SOUZA

ETEC RAPOSO TAVARES

ETIM Química

ANNA JULIA ANDRADE DA COSTA

BÁRBARA DOMINGUES DIAS
GABRIELA SANTOS DE ALMEIDA
JULIA FERNANDES DE OLIVEIRA
LUCAS DE OLIVEIRA QUINTÃO
MARIA FERNANDA ALVES COSTA
NATHALIA MANRIQUEZ DA PAZ

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS, FIXAÇÃO E COLORAÇÃO

GRAM

SÃO PAULO
2023
 ANNA JULIA ANDRADE DA COSTA
BÁRBARA DOMINGUES DIAS
GABRIELA SANTOS DE ALMEIDA
JULIA FERNANDES DE OLIVEIRA
LUCAS DE OLIVEIRA QUINTÃO
MARIA FERNANDA ALVES COSTA
NATHALIA MANRIQUEZ DA PAZ

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS, FIXAÇÃO E COLORAÇÃO

GRAM

Relatório apresentado para avaliação da

disciplina de Microbiologia do 3° ano do ensino
médio, turno integral da ETEC Raposo Tavares,
ministrado pelos professores: doutora Regina
Siqueira Haddad Carvalho e professor doutor Vitor
Amaral Sanches Lucas.

SÃO PAULO
2023
 ÍNDICE DE TABELAS

Figura 1: Bactéria 13 ................................................................................................... 9

Figura 2: Bactéria (Salmão) descartada ...................................................................... 9
Figura 3: Bactéria 22 ................................................................................................. 10
Figura 4: Bactéria (13) GRAM-Positiva ..................................................................... 10
Figura 5: Bactéria (22) Estreptobacilo GRAM-Negativa e Estafilococos GRAM-Positiva
.................................................................................................................................. 11
 SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 5

2. OBJETIVOS......................................................................................................... 6

2.1. OBJETIVO GERAL ........................................................................................ 6

2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO ............................................................................... 6

3. MATERIAL E MÉTODO ....................................................................................... 7

3.1. MATERIAL ..................................................................................................... 7

3.1.1. Materiais........................................................................................................ 7

3.1.2. Equipamentos .............................................................................. 7

3.1.3. Reagentes .................................................................................... 7

3.2. MÉTODO ....................................................................................................... 7

3.2.1. Isolamento Bacteriano ................................................................ 7

3.2.2. Coloração GRAM ......................................................................... 7

4. RESULTADOS ..................................................................................................... 9

4.1. ISOLAMENTO .............................................................................................. 9

4.2. COLORAÇÃO GRAM ..................................................................................... 10

5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 12

6. CONCLUSÃO .................................................................................................... 13

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 14

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1. INTRODUÇÃO
O isolamento bacteriano é realizado com o intuito de obtenção de uma cultura
pura, isto é, colônias isoladas de um único microrganismo, distinguindo-o de outros
que se encontram no mesmo material. Para isolar uma cultura, são utilizadas técnicas
de semeadura que permitem transferir inóculos microbiológicos de um meio de
cultura, ou material, para outro meio de cultura. A técnica de esgotamento, uma das
mais utilizadas na Microbiologia, permite isolar culturas puras em amostras com
múltiplas culturas, possibilitando a identificação de colônias isoladas.
Coloração Gram é um procedimento essencial utilizado na Microbiologia para
a caracterização e classificação bacteriológica, pois através de sua metodologia,
permite a visualização e identificação de bactérias no microscópico óptico, sendo
diferenciadas em dois grupos: as Gram-positivas, que retém o cristal violeta devido à
presença de uma espessa camada de peptidoglicano em suas paredes celulares,
apresentando-se na cor roxa e as Gram-Negativas, que possuem uma fina parede de
peptidoglicano, não retém o cristal violeta durante o processo de descoloração e
apresentam cor vermelha ao final do processo de coloração.
Fixação é uma etapa crucial que antecede a Coloração Gram pois é
responsável por facilitar a observação das bactérias. Consiste na coagulação do
protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem à lâmina. A
técnica de fixação por esfregaço deve estar seco e ser fixado com calor brando (50ºC),
no entanto, a fixação excessiva e o superaquecimento poderão distorcer a morfologia
celular enquanto uma fixação insuficiente permitirá a saída do material durante o
processo de coloração. É essencial o resfriamento da lâmina antes de iniciar a
coloração, visto que altas temperaturas podem ocasionar na explosão do núcleo
celular bacteriano e, desta forma, comprometer o procedimento.
 6

2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Praticar as técnicas de isolamento de micro-organismos, com ênfase em
bactérias e leveduras, e a coloração Gram destas.

2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO

• Selecionar as colônias desejadas, já inoculadas anteriormente, e anotar suas
respectivas características em tabelas;
• Realizar a técnica de isolamento por 4 estrias;
• Cultivar as colônias devidamente isoladas;
• Fixação da bactéria ao fogo brando;
• Colorir a lâmina com cristais de violeta;
• Aplicar lugol 2% (2/10);
• Descolorir com álcool 95%;
• Aguardar a secagem da lâmina em temperatura ambiente;
• Observação e interpretação dos resultados da lâmina no microscópio, com
óleo de imersão e lente 100x.
 7

3. MATERIAL E MÉTODO
3.1. MATERIAL
3.1.1. Materiais
• Alça em círculo;
• Alça de Drigalski;
• Água destilada;
• Lâminas;
• Placa de Petri 9mm.

3.1.2. Equipamentos
• Bico de Bunsen;
• Microscópio;

3.1.3. Reagentes
• Álcool etílico 95%;
• Corante Fucsina;
• Corante violeta-de-metila;
• Lugol diluido 2%;
• Óleo de imersão.

3.2. MÉTODO
3.2.1. Isolamento Bacteriano
1) Após a observação do crescimento bacteriano analisou-se as
características morfológicas das colônias e isolou-se as 3 espécies escolhidas
utilizando a técnica do esgotamento em 4 estrias com a alça bacteriológica em círculo
previamente esterilizada (flambagem).

3.2.2. Coloração GRAM

1º etapa: fixação ao fogo brando
1) Selecionou-se a bactéria e fazer a tabela das características;
2) Limpou-se a lâmina de vidro com álcool e secar com um papel
cuidadosamente;
3) Pingou-se uma gota de água no centro da lâmina;
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4) Pegou-se a alça de platina circular (a mesma do isolamento) e flambou-se

no fogo, esperar esfriar por aproximadamente 10 segundos ao lado do bico
de bunsen, encostar levemente na bactéria e esfregou-se em cima da gota
de água;
5) Passou-se a lâmina rapidamente 3 vezes sobre o fogo, testou-ser
temperatura na mão, quando não queimar, passou-se mais 3 vezes até a
secagem da lâmina.

2º etapa: cristais de violeta

1) Pingou-se gotas de cristais de violeta e deixou-se agir por 1 minuto,
escorreu-se.

3º etapa: lugol 2%
1) Pingou-se gotas de lugol e deixou-se agir por 1 minuto, escorreu-se.

4º etapa: descoloração com álcool 95%

1) Lavou-se a lâmina com álcool 95% e água destilada.

5º etapa: fucsina/safranina (1 min)

1) Pingou-se gotas de fucsina e deixou-se agir por 1 min, escorreu-se e lavou-
se somente com água destilada

6º etapa: secagem da lâmina em temperatura ambiente

1) Acelerou-se o processo, segurando bem firme na ponta da lâmina e sacudindo
até a secagem da lâmina.

7º etapa: observação no microscópio com óleo de imersão (apenas uma

gota no foco de luz) e lente 100x (a preta)
1) Encostou-se a lente suavemente sobre a lâmina já com o óleo, formando uma
lente com o óleo;
2) Ajustou-se o microscópio focando a luz na borda da lâmina;
3) Visualizou-se e determinou-se o tipo (bacilo, coccus etc), arranjo (isolado,
strepto etc) e Gram negativo ou positiva (rosa: gram negativa/ roxa: gram
positiva).
 9

4. RESULTADOS
4.1. ISOLAMENTO
Figura 1: Bactéria 13

Fonte: Autoria própria.

Figura 2: Bactéria (Salmão) descartada

Fonte: Autoria própria.

 10

Figura 3: Bactéria 22

Fonte: Autoria própria.

4.2. COLORAÇÃO GRAM

Figura 4: Bactéria (13) GRAM-Positiva

Fonte: Autoria própria.

 11

Figura 5: Bactéria (22) Estreptobacilo GRAM-Negativa e Estafilococos GRAM-

Positiva

Fonte: Autoria própria.

 12

5. DISCUSSÃO
Após discussão em grupo, foi entendido que os resultados podem ser
considerados bons, e que foi atingido o esperado. O isolamento bacteriano foi bem-
sucedido, pois foi possível a realização do método com as colônias que cresceram
nas placas de petri realizadas, assim como a coloração gram, que foi exitosa, já que
a visualização das bactérias isoladas em um microscópio foi realizada sem problemas,
como também, a resolução de suas características através da técnica visual.
 13

6. CONCLUSÃO
Após as apresentações dos fatos acima, concluímos ao final da aula prática,
que a técnica por isolamento permitiu através de métodos eficientes, a obtenção de
culturas puras, ou seja, culturas as quais apresentam apenas uma única espécie de
organismo que por sua vez, auxiliaram na identificação do microorganismo trabalhado.
Já em análise da metodologia da Coloração Gram foi possível detectar as
características e comportamentos das bactérias, permitindo a identificação de grande
parte das mesmas chegando ao resultado se nas amostras elas são Gram-positivas
ou Gram-negativas
Podendo assim concluir que o isolamento e a Coloração Gram são muito
importantes para o diagnóstico das bactérias.
 14

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALVARENGA, L. M. Parte I - Técnicas de semeadura - Semeadura por

esgotamento em meios sólidos. [s.l: s.n.]. Disponível em: chrome-
extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www2.ifmg.edu.br/betim/ensino
-1/retorno-gradual/RoteiroAulaprticadeMicrobiologia.pdf

Coloração de Gram – O que é bactéria Gram-positiva e Gram-

negativa? Disponível em: <https://kasvi.com.br/bacteria-gram-positiva-gram-
negativa/>. Acesso em: 17 set. 2023.

Técnica de Gram. Disponível em:

<http://www.provida.ind.br/site/index.php/bacterias/bacterias/122-tecnica-de-
gram.html>. Acesso em: 17 set. 2023.