Microbiologia Clinico Laboratorial I – Componente Prática

Princípios e métodos de esterilização

Introdução

Todos os trabalhos envolvidos na análise microbiológica e físico-química de

água exigem que se trabalhe em condições de assepsia, de forma a evitar a
introdução de contaminações, que conduziriam a falsos resultados.
Os métodos de esterilização mais frequentemente usados são físicos e incluem
a esterilização por calor seco (estufas de esterilização e incineração), por calor
húmido (autoclavagem e fervura), por filtração e por utilização de radiações. A
finalidade da esterilização é tornar inativos ou remover todos os
microrganismos vivos incluindo os esporos. A esterilização está sempre
dependente do tempo da exposição ao método selecionado.

1-Objetivos

Familiarização com diferentes métodos de esterilização e preparação de

material de colheita de amostras.

2- Material e equipamento
- Caixas de Petri;
- Pipetas de 1 e de 10 ml;
- Tubos de ensaio;
- Algodão cardado;
- Tesoura;
- Marcador;
- Membrana de filtração de 45 mm de Ø e 0,2 µm de porosidade;
- Bomba de vácuo e sistema de filtração;
- Estufa de incubação;
- Autoclave;

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3- Procedimento

Esterilização por calor seco

A esterilização por calor seco pode ser alcançada por diversos processos:

- Flambagem;
- Estufa de ar quente;
- Raios infravermelhos;

1. Fazer rolhas de algodão cardado e gaze para os tubos de ensaio e

frascos de preparação de meios;
2. Embrulhar devidamente as placas de Petri com o papel pardo e colocar
na estufa de esterilização.
3. Colocar as rolhas de algodão cardado nos bocais dos tubos e dos
frascos de preparação de meios;
4. Regular a temperatura da estufa para 170ºC durante 60 minutos.
5. Após o tempo de esterilização, desligar a estufa e deixar arrefecer o
material.

Esterilização por calor húmido

Para a esterilização pelo vapor, é necessário um esterilizador a vapor ou

autoclave. Este tipo de esterilização está direcionado para:

- Esterilização de meios de cultura e outros equipamentos bacteriológicos, por

ex., material de laboratório, membranas filtrantes e suportes, equipamentos
misturadores, etc.;
- Esterilização de materiais (descontaminação) contaminados.

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Fases da autoclavagem

1. Preparação do material a esterilizar;

2. Adicionar água esterilizada á autoclave para que a resistência fique coberta
e não excedendo a base de colocação do material a esterilizar;
3. Fechar a autoclave hermeticamente;
4. Ligar a autoclave
5. Esperar que comece a sair um volume residual de ar e fechar a válvula de
escape.
6. Quando tiver atingido os 121ºC o processo de esterilização começa,
devendo estar concluído passado 15 a 20 minutos dependendo da quantidade
de material a esterilizar.

Figura 1 : Esquema de autoclave.

Esterilização por filtração

1. Limpar a bancada com álcool e acender duas lamparinas;

2. Montar o sistema de filtração estéril na área de proteção das chamas;
3. Colocar a membrana filtrante no funil com uma pinça esterilizada;
4. Ligar a bomba de vácuo e verter a solução a esterilizar para o funil;
5. Transferir o filtrado para um recipiente esterilizado, com os devidos
cuidados de assepsia;

NOTA: Este processo de esterilização é indicado para soluções líquidas, por

ex., uma solução com carga bacteriana.

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Preparação e distribuição de meios de cultura

Introdução

A sobrevivência e o suporte de vida dos microrganismos dependem do

fornecimento adequado de nutrientes e convenientes condições para o seu
crescimento. Quanto aos nutrientes, grande parte dos microrganismos apenas
necessitam de substâncias solúveis de baixo peso molecular, usualmente
originadas pela degradação enzimática de outros nutrientes mais complexos.
Uma solução contendo estes nutrientes é designada como meio de cultura. Os
meios de cultura podem ser de vários tipos, conforme o objetivo a que se
destinam. Quanto ao seu estado físico, podem ser sólidos, semi-sólidos ou
líquidos. Os meios sólidos são usados para contagem de colónias de
microrganismos e para a multiplicação, isolamento e conservação de estirpes.
Utiliza-se meios líquidos para o enriquecimento de determinadas estirpes
contidas numa população mista, para estudos de crescimento e nutrição, e
para preparação de grandes volumes de uma cultura. Os meios semi-sólidos
são usados para observar a mobilidade de algumas bactérias.

Quanto à sua composição química, podem ser complexos ou definidos,

dependendo do conhecimento que se tem sobre as exigências nutricionais dos
microrganismos em estudo.

Quanto ao seu objetivo funcional, os meios de cultura podem ser gerais

(crescimento de vários tipos de microrganismos), diferenciais (quando se
pretende distinguir diferentes tipos de microrganismos), seletivos (com o
objetivo de selecionar apenas um tipo de microrganismos a partir de uma
cultura mista), ou diferenciais e seletivos.

Os meios de cultura que se utilizam em laboratório e em condições

controladas, podem ser sólidos ou líquidos. A sua preparação é um processo
simples mas requer a aplicação de certas regras:

- O material de vidro utilizado deve estar bem lavado para evitar a

contaminação com detergentes ou outros químicos

- As espátulas utilizadas na pesagem de componentes devem estar limpas

- A água deve ser colocada previamente no recipiente e só depois se devem

adicionar os componentes para dissolução. Uma adição da água posterior à
colocação dos componentes pode originar a formação de agregados que se
colam ao fundo do frasco dificultando a sua dissolução.

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- Se o meio contém muitos componentes, estes devem ser dissolvidos

individualmente antes de efetuar a mistura. O agar só deve ser adicionado à
mistura após os outros componentes terem sido dissolvidos.

- Os meios só devem ser preparados no momento em que vão ser

esterilizados.

- Os frascos com meio de cultura para autoclavar não devem exceder a metade
da sua capacidade. As rolhas/ tampas devem estar pouco apertadas durante a
autoclavagem.

1- Objetivos

- Preparação de meios de cultura sólidos e líquidos por formulário e a partir de

preparado comercial desidratado e sua transferência para placas de Petri.

2- Material e reagentes

- Balança

- Erlenmeyer de 250 mL e de 25 mL

- Espátula

- Placa de aquecimento

- Autoclave

- Caixas de Petri esterilizadas

- Água destilada

- Meio de cultura desidratado

- Agar

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3- Procedimento 1

Preparação de 150 ml de meio de cultura não seletivo Plate Count Agar a

partir de preparado comercial desidratado.

3.1 Medir as quantidades de ingredientes correspondentes a 150 mL de caldo

nutritivo e transferir para um “erlenmeyer”.

3.2 Agitar com uma vareta de vidro até dissolver completamente.

3.3 Colocar a mistura em frasco Schot fornecido.

3.4 Tapar o frasco não rolhando completamente.

3.5 Esterilizar em autoclave a 121ºC (ou processo alternativo).

3.6 Retirar da autoclave e colocar o frasco Schot em banho de H2O 45 ºC.

3.7 Quanto atingir a temperatura de 45ºC distribuir 15 ml do meio em placas

Petri.

3.8 Efetuar o controlo de qualidade da preparação dos meios.

4- Procedimento 2

Preparação de 150 ml de meio de cultura seletivo Slanetz & Bartley a

partir de preparado comercial desidratado.

4.1 Medir as quantidades de ingredientes correspondentes a 50 mL de caldo

nutritivo e transferir para um “erlenmeyer”.

4.2 Agitar com uma vareta de vidro até dissolver completamente.

4.3 Colocar a mistura em frasco Schot fornecido.

4.4 Tapar o frasco não rolhando completamente.

4.5 Esterilizar em autoclave a 121ºC (ou processo alternativo).

4.6 Retirar da autoclave e colocar o frasco Schot em banho de H2O 45 ºC.

4.7 Quanto atingir a temperatura de 45ºC distribuir 15 ml do meio em placas

Petri.

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4.8 Efetuar o controlo de qualidade da preparação dos meios.

5- Anexo

Plate Count Agar

Triptona………………………….…………. 5,0 g.

Extrato de Levedura………………………. 2,5 g.

Glucose……………………………………….. 1 g.

Agar…………………………………………. 9,0 g.

Preparação: Suspender 17.5 gramas de meio liofilizado em 1000 ml de água

destilada.

Slanetz & Bartley

Triptose……………………………………… 20,0 g.

Extrato de Levedura…………………..…….. 5,0 g.

Glucose……………………………………..… 2,0 g.

K2HPO4.2H2O……………………………..... 4,0 g.

Sodium Azide……………………………..….. 0,4 g.

Tetrazolium chloride………………………..... 0,1 g.

Agar………………………………………...…... 10 g.

Preparação: Suspender 42 gramas de meio liofilizado em 1000 ml de água

destilada.

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Bibliografia

Alcântara, F.; Cunha, M.A.; Almeida, M.A. (2ª edição).Microbiologia: Práticas

Laboratoriais. Edições Universidade de Aveiro, Portugal.

Lopes, A. M. e Fonseca, A. (1996) Biologia Microbiana. Universidade Aberta;

Portugal.

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