Universidade do Estado de Santa Catarina – UDESC

Centro de Educação Superior do Oeste – CEO

Departamento de Engenharia de Alimentos e Engenharia Química
Curso de Engenharia de Alimentos
Disciplina de Microbiologia de Alimentos
Professora Liziane Schittler Moroni

AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA DE

ALIMENTOS

Pinhalzinho
I - PROCEDIMENTOS PARA O PREPARO, PESAGEM E DESCARTE DE AMOSTRAS

1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
1.1. A pesagem e o preparo de amostras são pontos críticos de controle do processo
analítico.
1.2. O local deve estar higienizado antes do início da pesagem, conforme norma
específica do laboratório.
1.3. Deve ser feito um controle do ambiente, conforme norma específica do laboratório.
1.4. O responsável pelo procedimento deve, antes do início dos trabalhos, realizar
assepsia das mãos e antebraços.
1.5. Deve ser usado uniforme de uso exclusivo para a área analítica e Equipamento de
Proteção Individual (EPI), conforme estabelecido em normas específicas do laboratório.
1.6. Devem ser aplicados os procedimentos de verificação de balanças, conforme
procedimento específico do laboratório.
1.7. O trabalho deve ser realizado perto da chama do bico de bunsen, no caso de uso de
bancada, ou em fluxo laminar específico para tal atividade.
1.8. A superfície de trabalho deve estar protegida por pano de campo embebido em
solução desinfetante não inflamável, previamente testada.
1.9. Todo o material deve estar organizado e em condições adequadas de uso antes do
início dos trabalhos.
1.10. Não deve ser permitida a entrada e a permanência de pessoas estranhas no local,
principalmente durante a pesagem das amostras.

2. INSTRUÇÕES PARA MANUTENÇÃO E DESCARTE DE AMOSTRAS NO

LABORATÓRIO

No laboratório, após o recebimento, as amostras devem ser estocadas até o momento

da análise, conforme abaixo:
2.1.1 Refrigeradas perecíveis: As refrigeradas perecíveis devem ser mantidas
sob refrigeração e analisadas o mais rapidamente possível. Aguardar no máximo até o dia seguinte.
2.1.2 Congeladas: As amostras congeladas devem ser mantidas no máximo a -18 °C e
analisadas em um prazo máximo de 7 dias da colheita.
2.1.3 Não perecíveis: Amostras não perecíveis devem ser estocadas em lugar fresco,
protegidas da umidade e da luz, de forma que suas características originais sejam mantidas, e
analisadas o mais rapidamente possível.

2.2 Registros: Manter registros completos sobre as amostras recebidas e analisadas,

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 conforme estabelecido em procedimento específico do laboratório.

2.3 Manutenção das amostras após a análise: Após a retirada das alíquotas para análise,
as amostras devem ser embaladas em sacos plásticos de primeiro uso, perfeitamente identificadas e
mantidas congeladas, conforme item 2.1.2.
As amostras estáveis em temperatura ambiente devem ser mantidas identificadas,
protegidas por saco plástico de primeiro uso ou adequadamente fechadas na embalagem
original, em temperatura ambiente e em local apropriado previamente estabelecido, conforme
item 2.1.3.
Todas as amostras, exceto água, leite e outros produtos líquidos, os quais devem ser
descartados logo após a realização do procedimento analítico, devem ser mantidas nas
condições acima especificadas por 10 dias. Após esse prazo, as amostras devem ser descartadas
conforme item 2.4.

2.4 Descarte de amostras analisadas: Todas as amostras que derem entrada no

laboratório de microbiologia devem ser descartadas conforme procedimento específico
estabelecido pelo laboratório.

3. PREPARO DA AMOSTRA
Quando a metodologia indicar diluentes diferentes, como por exemplo para provas de: Contagem
de Microrganismos, Pesquisa de Salmonella, Pesquisa de Listaria monocytogenes, Pesquisa de
Vibrlo cholerae, etc., fazer tantas pesagens por amostra quantas forem necessárias.

3.1 Enlatados

No recebimento de amostras de conservas enlatadas, verificar a integridade das

embalagens, observando se estão amassadas, levemente tufadas ou com microfugas aparentes.
Quando forem observadas quaisquer dessas alterações, proceder conforme estabelecido no
Capítulo 20 "Teste de Esterilidade Comercial para Alimentos de baixa acidez".
3.1.1 Pré-incubação de amostras visualmente normais: As amostras de conservas
visualmente normais devem ser incubadas a 36 ± 1°C por 10 dias a 55 ± 1°C por um período de 5
a 7 dias, conforme instruções abaixo:
- Retirar cuidadosamente a cinta de identificação;
- Lavar a lata com água e detergente, usando esponja;
- Secar com flanela limpa e seca;
- Identificar a amostra com o número de protocolo do laboratório;
- Recolocar a cinta de identificação usando fita adesiva para prendê-la na amostra;
- Forrar a prateleira das estufas com papel filtro e incubar as amostras de forma que a

3
recravação fique em contato com o papel filtro.
Verificar, após o período de pré-incubação a 36 ± 1°C e 55 ± 1°C, se os recipientes não
sofreram estufamento. Verificar se o papel filtro apresenta manchas que possam evidenciar a
presença de microfugas ou vazamentos.
Registrar como "sem alteração" quando não se observar qualquer alteração dos
recipientes e como "alterado" quando qualquer alteração for detectada. Descrever a alteração,
quando ocorrer.
3.1.2 Amostras que sofreram alteração durante a pré-incubação: Ao final da pré-
incubação, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver manchado,
evidenciando a presença de microfugas, submeter à respectiva amostra à análise de aeróbios e
anaeróbios, mesófilos ou termófilos, de acordo com a temperatura da pré-incubação.
3.1.3 Preparo das amostras após a pré-incubação:
Fazer desinfecção da embalagem com algodão embebido em solução desinfetante e etanol
70% ou etanol 70° GL.
Posicionar a lata com borda não codificada para cima e costura lateral voltada para o lado
oposto ao analista.
Usando um abridor de latas metálico, previamente esterilizado, abrir um pequeno
orifício. Abrir a lata e transferir porções do conteúdo para os meios de cultivo indicados.

3.2 Produtos UHT

No recebimento das amostras, verificar a integridade e alterações nas embalagens logo após
o recebimento.
As amostras que apresentarem qualquer alteração não devem ser analisadas. Fazer constar
do COA "amostra alterada", incluindo informações sobre o tipo de alteração detectada.
3.2.1 Pré-incubação das amostras visualmente normais: Após sofrerem limpeza e
desinfecção, as amostras devem ser incubadas sobre folhas de papel filtro, em estufa a 36 ± 1°C,
por um período de 7 dias.
As amostras cujas embalagens mostrarem qualquer alteração após o período de
incubação não devem ser analisadas. Emitir o resultado como "amostra alterada", incluindo
informações sobre o tipo de alteração observada.
3.2.2 Preparo das amostras após a pré-incubação:
Produtos UHT líquidos: Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes.
Antes da abertura da embalagem, proceder à assepsia da mesma usando algodão embebido em
solução desinfetante e em seguida etanol 70% ou etanol 70° GL. Deixar secar. Com auxílio de
tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e iniciar a análise conforme
indicado no Capítulo 3 "Contagem de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis capazes de
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causar alteração em produtos lácteos líquidos UHT".
Produtos UHT pastosos e viscosos: Antes da abertura da amostra, proceder à assepsia da
embalagem usando algodão embebido em solução desinfetante e em seguida etanol 70% ou etanol
70° GL.
Com auxílio de tesoura, previamente esterilizada, abrir a embalagem, e, usando
espátulas ou colheres estéreis, pesar, assepticamente, 25 ± 0,2 g da amostra e transferi-la para
sacos de "stomacher" ou para frascos estéreis apropriados.

3.3 Produtos sólidos

Antes da abertura da amostra, proceder à assepsia da embalagem usando algodão
embebido em solução desinfetante e etanol 70% ou etanol 70° GL.
Com auxílio de pinças, tesouras ou bisturis, previamente esterilizados, cortar e pesar,
assepticamente, 25 ± 0,2 g da amostra colhida de vários pontos (superfície e profundidade) em
sacos para "stomacher".
No caso de análise de mexilhões, antes de abrir as conchas, escová-las com água e sabão,
enxaguar bem em água corrente e após em água estéril. Secá-las com gaze esterilizada e abri-las
assepticamente com o auxílio de faca ou bisturi. Preparar uma amostra composta, em recipiente
estéril, misturando de 10 a 12 exemplares e incluindo o líquido das conchas. Pesar 50 g dessa
amostra composta e homogeneizar com 450 mL do diluente específico. Dividir em duas alíquotas
de 250 mL e transferir para recipientes estéreis.
Frango inteiro resfriado - Pesar, assepticamente, alíquotas dos seguintes locais para o
preparo da amostra: peito, coxas ou asas, proximidades da cloaca e dorso, até completar as 25 ±
0,2 g da amostra, em sacos para "stomacher".
Frango inteiro congelado - Antes da pesagem, as amostras devem ser descongeladas em
refrigerador por, no máximo, 18 horas.
Pesar da mesma forma que o frango inteiro resfriado.
Outros produtos cárneos congelados - Antes da pesagem, as amostras devem ser
descongeladas em refrigerador por, no máximo, 18 horas. Pesar, então, assepticamente, 25 ± 0,2
g da amostra em sacos para "stomacher".

3.4 Semi-conservas: Antes da abertura da amostra, proceder à assepsia da embalagem

usando algodão embebido em solução desinfetante e etanol 70% ou etanol 70° GL.
Com auxílio de pinças, tesouras, abridores metálicos ou bisturis, previamente
esterilizados, pesar assepticamente 25 ± 0,2 g da amostra, colhida de vários pontos, em sacos para
"stomacher".

3.5 Produtos pastosos e viscosos

5
 Antes da abertura da amostra, proceder à assepsia da embalagem usando algodão embebido
em solução desinfetante e etanol 70% ou etanol 70° GL.
Amostras de produtos pastosos: com auxílio de espátulas ou colheres, previamente
esterilizadas, pesar assepticamente 25 ± 0,2 g da amostra colhida de vários pontos (superfície e
profundidade), em frascos erlenmeyer estéreis ou em sacos para "stomacher".
Amostra de produtos líquidos densos (ex: iogurte): Agitar o recipiente que contém a
amostra para homogeneização. Realizar à assepsia da embalagem usando algodão embebido em
solução desinfetante e etanol 70% ou etanol 70° GL.
Com auxílio de espátulas ou colheres, previamente esterilizadas, pesar assepticamente 25
0,2 g em frasco erlenmeyer estéril ou em sacos plásticos para "stomacher".

3.6 Água
Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes, ou ainda aspirar o conteúdo
deste por 10 vezes com pipeta, auxiliado por pipetador, quando não houver espaço livre para a
homogeneização.
Antes da abertura da embalagem, proceder à assepsia da mesma usando algodão
embebido em solução desinfetante e etanol 70% ou etanol 70° GL
Para pesquisa de Salmonella em água usada em aqüicultura e em água de "chiller",
homogeneizar bem a amostra invertendo o recipiente por 25 vezes, e transferir 100 mL da
amostra para um frasco contendo 50 mL de água peptonada 1% tamponada em concentração tripla.

3.7 Outros Produtos Líquidos

Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes. Antes da abertura da
embalagem, proceder à assepsia da mesma usando algodão embebido em solução desinfetante e
etanol 70% ou etanol 70° GL.
Quando não houver espaço livre dentro do recipiente para homogeneização da amostra,
aspirar o conteúdo deste por 10 vezes com pipeta, auxiliado por pipetador.
Com auxílio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e
retirar a alíquota analítica.

3.8 Produtos gordurosos

Antes da abertura da embalagem, proceder à assepsia da mesma, usando algodão
embebido em desinfetante e etanol 70% ou etanol 70° GL.
Com auxílio de espátula estéril, pesar assepticamente 25 ± 0,2 g da amostra, retirando
alíquotas de vários pontos da superfície e profundidade, em frasco erlenmeyer previamente
esterilizado, ou em sacos "stomacher".
Colocar em banho-maria a 46 ±1°C, por um período máximo de 15 minutos. Somente após
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a liquefação da amostra, adicionar o diluente previamente aquecido a 46 ±1°C.
Agitar, de forma a obter uma suspensão homogênea.
Para amostras de produtos gordurosos, utilizar o diluente especificado na técnica,
adicionado de 1% de Tween 80.

3.9 Produtos em pó e granulados

Agitar ou inverter o produto por 25 vezes.

Antes da abertura da embalagem que contém a amostra, proceder à assepsia da mesma
usando algodão embebido em solução desinfetante e etanol 70% ou etanol 70° GL.
Pesar, assepticamente, 25 ± 0,2 g da amostra e transferir, cuidadosamente, para um frasco
erlenmeyer ou saco para "stomacher".
OBS: Quando as embalagens forem sacos de 25 kg ou mais, ou quando as amostras forem colhidas em
vidros onde não exista espaço livre para homogeneização, transferir cerca de 500g do produto para um saco
estéril, e em seguida agitar ou inverter o saco com a amostra por 25 vezes.
Com o auxílio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e em
seguida pesar, assepticamente, 25 ± 0,2 g da amostra em sacos para stomacher, utilizando espátula
ou colher estéril.

3.10 Ovos
Ovos com casca: Lavar a casca de 5 a 7 ovos com escova e secar bem. Colocá-los de
molho em solução de ácido peracético 0,02% por 15 minutos. Após, secar com algodão
embebido em etanol 70% ou etanol 70° GL.
Quebrar a casca assepticamente, transferindo a gema para recipiente estéril. Descartar as
claras. Misturar as gemas com auxílio de bastão de vidro estéril. Pesar 25 ± 0,2 g da mistura de
gemas em sacos para "stomacher".
No caso de ovos de codorna, pesar 25 ± 0,2 g de gema com a clara.
Ovo líquido integral e ovo em pó:
Pesar assepticamente 25 ± 0,2 g da amostra em frasco erlenmeyer ou saco para
"stomacher". 4.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

ANDREWS, J.R.; JUNE, G.A. Food Sampling and Preparation of Sample Homogenate. In:
Bacteriológica! Analytical Manual Online. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível
em: http:// www.cfsan.fda.gov.
BRASIL. Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária. Secretaria de

7
Defesa Agropecuária. Departamento de Defesa Animal. Manual de métodos microbiológicos para
alimentos. Coordenação Geral de Laboratório Animal. 1991/1992 2 a Revisão. 136p.

II - PLANOS DE AMOSTRAGEM

Um plano de amostragem é uma relação de critérios de aprovação aplicados a um lote, o

qual é examinado por meio de um certo número de amostras analisadas por métodos específicos.
Ele consiste em um procedimento de amostragem e de decisão de critério, podendo ser um plano
de duas ou três classes.
Um plano de duas classes consiste nas seguintes especificações: n, c, m; um plano de três
classes necessita das especificações n, c, m e M, onde:
n: número de amostras (pacotes, bifes de hambúrgueres, etc.) de um lote que devem ser
examinadas para cumprir o plano de amostragem.
c: número máximo aceitável ou número máximo permitido de amostras que podem exceder
o critério microbiológico m. Quando este número é ultrapassado, o lote é rejeitado.
m: número máximo ou nível de relevância de bactérias por grama; valores acima deste nível
podem ser tanto marginalmente aceitáveis quanto inaceitáveis. Normalmente, esse número é
utilizado para separar alimentos aceitáveis de inaceitáveis em planos de duas classes; em planos de
três classes, ele é usado para separar alimentos de boa qualidade dos alimentos de qualidade
marginalmente aceitável. O nível aceitável ou alcançável de microrganismos em alimentos m. Em
situações de presença/ausência em planos de duas classes, é comum designar m = 0. Para planos de
três classes, m normalmente assume valores diferentes de zero.
M: a quantidade utilizada para separar alimentos de qualidade aceitável de alimentos com
qualidade inaceitável. É utilizado apenas em planos de três classes. Valores em torno de M ou
acima dele em qualquer amostra são inaceitáveis em relação a perigos de saúde, indicadores
sanitários ou potenciais de deterioração.
O plano de duas classes é o mais simples dos dois e, na sua forma mais elementar, pode ser
utilizado para decidir sobre aceitar ou rejeitar uma grande quantidade (um lote) de alimentos por
meio de um plano como n = 5 e c = 0; nesse plano, n = 5 significa que 5 unidades individuais do
lote serão examinadas microbiologicamente para, por exemplo, verificar a presença de
Salmonella, enquanto c = 0 significa que todas as cinco unidades devem estar livres deste
microrganismo, segundo um método de análise estipulado. Se alguma amostra for positiva para
Salmonella, o lote inteiro será rejeitado. Se for desejável que duas das cinco amostras possam ter
coliformes, em um teste de presença/ausência, por exemplo, o plano de amostragem pode ser n = 5
e c = 2. Por este plano, se três ou mais amostras apresentarem coliformes, o lote inteiro será

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rejeitado. Considerando-se que critérios de presença/ausência normalmente são aplicados para
Salmonella, um limite de tolerância maior, utilizando microrganismos indicadores como os
coliformes, ás vezes é necessário. Se for desejado permitir mais de 100 coliformes/g em duas das
cinco amostras, o plano de amostragem deverá ser n = 5, c = 2 e m = 102. Depois das cinco
amostras serem examinadas para coliformes, o lote será aceitável se não mais do que duas
amostras apresentarem mais de 102 coliformes/g, mas será rejeitado se três ou mais das cinco
amostras apresentarem contagens acima de 102 coliformes/g. Este plano de amostragem pode ser
mais rigoroso se n for aumentado (por exemplo, n = 10, c = 2 e m = 102 ) ou se o c for reduzido
(por exemplo, n = 5, c = 1 e m = 102). Por outro lado, ele pode se tornar mais tolerante para um
determinado número n se c for aumentado.
Enquanto um plano de duas classes pode ser utilizado para distinguir alimentos aceitáveis de
inaceitáveis, um plano de três classes é necessário para diferenciar alimentos aceitáveis,
marginalmente aceitáveis e inaceitáveis. Para ilustrar um plano de três classes típico, assume-se
que, para um determinado produto, a contagem padrão em placas (CPP) não deve exceder 106/g
(M) ou 105/g em três ou mais das cinco amostras examinadas. As especificações serão n = 5, c = 2,
m = 105 e M = 106. Se qualquer uma das amostras exceder 106/g, o lote inteiro será rejeitado
(inaceitável). Se não mais do que c amostras apresentarem resultados acima de m, o lote é
aceitável. Ao contrário do plano de duas classes, o de três classes distingue valores entre m e M
(marginalmente aceitável).
Tanto com plano de duas quanto com o de três classes, os números n e c podem ser
empregados para determinar a probabilidade de aceitação (Pa) de lotes alimentícios com o uso de
tabelas apropriadas. A decisão de empregar um plano de duas ou de três classes pose ser
determinada da seguinte forma: se forem desejados testes de presença/ausência, planos de duas
classes serão escolhidos; se forem desejadas contagens ou testes de concentração, um plano de três
classes será preferido. O plano de três classes oferece as vantagens de ser menos afetado por
variações não-randômicas entre as amostras e de ser capaz de medir a freqüência dos valores entre
m e M. O relatório da ICMSF e suas recomendações devem ser consultados para maiores detalhes
sobre a estrutura, uso e interpretações dos planos de amostragem.

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 CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS, COLIFORMES FECAIS E
ESCHERICHIA COLI

Introdução

Definição do grupo de coliformes totais. O grupo dos coliformes totais inclui as bactérias na
forma de bastonetes Gram negativos, não esporogênicos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, ca-
pazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas a 35°C. O grupo inclui cerca de
20 espécies, dentre as quais encontram-se tanto bactérias originárias do trato gastrintestinal de hu-
manos e outros animais de sangue quente, como também diversos gêneros e espécies de bactérias
não entéricas, como e Aeromonas, por exemplo. Por razão, sua enumeração em água e alimentos é
menos representativa, como indicação de contaminação fecal, do que a enume ração de coliformes
fecais ou E.coli. Porém, sua presença em alimentos processados é considerada uma indicação útil de
contaminação pós-sanitização ou pós-processo (principalmente no caso da pasteurização),
evidenciando práticas de higiene e sanificação aquém dos padrões requeridos para o processamento
de alimentos. Definição do grupo de coliformes fecais. A definição é a mesma de coliformes totais,
porém, restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24h a
44,5 -45,5°C. Esta definição objetivou, em princípio, selecionar apenas os coliformes originários do trato
gastrintestinal.
Atualmente sabe-se, entretanto, que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três
gêneros, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, dos quais dois (Enterobacter e Klebsiellà) incluem
cepas de origem não fecal. Por esse motivo, a presença de coliformes fecais em alimentos é menos re-
presentativa, como indicação de contaminação fecal, do que a enumeração direta de E.coli, porém,
muito mais significativa do que a presença de coliformes totais, dada a alta incidência de E.coli
dentro do grupo fecal. E.coli. Dentre as bactérias de habitat reconhecidamente fecal, dentro do grupo
dos coliformes fecais, E.coli é a mais conhecida e a mais facilmente diferenciada dos membros não
fecais. Todos os demais membros do grupo têm uma associação duvidosa com a contaminação fecal
e E.coli, embora também possa ser introduzida nos alimentos a partir de fontes não fecais, é o
melhor indicador de contaminação fecal conhecido até o momento.

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 AULA PRÁTICA N° 1

Atividade 1

Coliformes totais e Coliformes fecais (termotolerantes)

Método do Número Mais Provável (NMP) EM ÁGUA

Análise de água

O procedimento descrito a seguir é a metodologia da AMERICAN PUBLIS HEALTH OF

WATER AND WASTEWATER, 1985, recomendado para a análise de água destinada ao consumo
alimentar, para verificação da conformidade com padrões legais de potabilidade. No caso de
amostras não destinadas à verificação da conformidade com padrões legais de potabilidade, a
análise também pode ser efetuada seguindo-se o procedimento descrito para alimentos em geral.
Neste caso, os diluentes recomendados para a preparação de diluições seriadas da amostra são a
água peptonada 0,1% ou o tampão fosfato pH 7,2, suplementado com MgCl2.

a) Preparação da amostra: misturar bem o conteúdo da amostra, invertendo o frasco 25 vezes, em

arco de 30cm.

b) Inoculação: limpar a área externa do frasco com etanol 70%, abrir assepticamente e transferir 5
porções de 10ml de amostra para tubos com 10ml de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LTS), em
concentração dupla.

c) Incubação: incubar os tubos de LST a 35°C por 24 horas e observar se há crescimento com
produção de gás. Em caso positivo (crescimento e produção de gás), passar aos itens subseqüentes.
Em caso negativo (crescimento e/ou produção de gás), reincubar até completar 48 horas e repetir a
leitura, passando aos itens subseqüentes com todos os tubos de LST que positivarem em 48 horas.

d) Contagem de coliformes totais

Tomar todos os tubos de LST com produção de gás e transferir uma alçada bem carregada de cada
cultura para tubos de Caldo Verde Brilhante Bile (VB). Incubar a 35°C por 24-48 horas e observar
se há crescimento e produção de gás. Anotar o número de tubos de VB com gás, confirmativo da
presença de coliformes totais e determinar o Número Mais Provável (NMP)/g ou mL em uma tabela
apropriada para as diluições.

e) Coliformes fecais
Tomar todos os tubos de LST com produção de gás e transferir uma alçada bem carregada de cada
cultura para tubos de Caldo E. coli (EC). Incubar em banho-maria a 45,5°C por 24-48 horas e
observar se há crescimento e produção de gás. Anotar o número de tubos de EC com gás,
confirmativo da presença de coliformes fecais e determinar o Número Mais Provável (NMP)/g ou
mL em uma tabela apropriada para as diluições.

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Atividade 1.1

Análise de alimentos em geral (Número Mais Provável de Coliformes)

PROCEDIMENTO: conforme método American Public Health Association, descrita no

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (VANDERZANT &
SPLITTS-TOESSER, 1992).

a) Preparação das amostras e diluições seriadas conforme item 1.3.

Inoculação (teste presuntivo). Selecionar três diluições adequadas da amostra e, com uma pipeta de
no máximo l0mL, inocular uma série de três tubos de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) por
diluição, adicionando l,0ml da diluição por tubo com l0 mL de LST.
b) Incubação: Incubar os tubos de LST a 35°C por 24 horas e observar se há crescimento com
produção de gás. Em caso positivo (crescimento e produção de gás), passar aos itens subseqüentes.
Em caso negativo (crescimento e/ou produção de gás), reincubar até completar 48 horas e repetir a
leitura, passando para os itens subseqüentes em caso de crescimento com produção de gás.
c) Contagem de coliformes totais: Tomar todos os tubos de LST (ou LST-MUG) com produção de
gás e transferir uma alçada bem carregada de cada cultura para tubos de Caldo Verde Brilhante
Bile (VB). Incubar a 35°C por 24-48 horas e observar se há crescimento com produção de gás.
Anotar o número de tubos de VB com gás, confirmativo da presença de coliformes totais e
determinar o Número Mais Provável (NMP)/g ou ml em uma tabela de NMP apropriada às
diluições inoculadas (Apêndice 2).

d) Contagem de coliformes fecais: Tomar os tubos de LST (ou LST-MUG) com produção de gás
e transferir uma alçada bem carregada de cada cultura para tubos de caldo E. coli (EC). Incubar em
banho-maria a 45,5°C (maioria dos alimentos) ou 44,5°C (água, moluscos bivalves, peixes e
derivados de peixes) por 48 horas e observar se há crescimento com produção de gás. Anotar o
número de tubos de EC com produção de gás, confirmativo da presença de coliformes fecais e
determinar o NMP/g ou mL em uma tabela de NMP adequada às diluições inoculadas (Apêndice 2).
Para a incubação a 45,5°C, devem ser utilizados banhos com variação de temperatura não superior a
0,1°C. Na indisponibilidade de banhos com essa faixa de variação, é preferível que a incubação seja
feita a 44,5°C, para prevenir a ocorrência de falsos resultados negativos.

f) Contagem de E.coli (método tradicional) De cada tubo de EC com produção de gás em 24h ou
48h, estriar uma alçada da cultura em placas de Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB). Incubar as
placas a 35°C por 24 horas e observar se há desenvolvimento de colônias típicas de E. coli
(nucleadas com centro preto, com ou sem brilho metálico). Havendo colônias típicas, transferir
duas colônias bem isoladas de cada placa, para tubos de Ágar Padrão para Contagem (PCA)
inclinados e incubar os tubos a 35°C por 24 horas. A partir das culturas puras em PCA, fazer
coloração de Gram e inocular os meios teste abaixo, para realização de provas bioquímicas de
indol, VM, VP e citrato (IMVC). Observação: Todos os meios podem ser inoculados a partir de
uma única alçada de cultura, porém, o Caldo Citrato de Koser (ou o Ágar Citrato de Simmons)
deve ser inoculado em primeiro lugar, para evitar a introdução de compostos de carbono originários
dos demais meios-teste.
f1) Teste de citrato (caldo citrato de Koser): Inocular uma alçada com inóculo leve da cultura,
incubar a 35°C/72 a 96h e observar se há crescimento (teste positivo) ou não (teste negativo). As
cepas de E.coli são citrato-negativas. Alternativamente, pode-se utilizar o Ágar Citrato de Simmons
para o teste de citrato. Transferir um inóculo leve da cultura para a rampa dos tubos de Ágar Citrato
de Simmons e incubar a 35°C/48h. O crescimento com viragem alcalina, alterando a cor do meio
de verde para azul, é indicativo de teste positivo. O não crescimento e a não alteração da cor do
meio indicam teste negativo.
12
f2) Teste de Indol (caldo triptona 1%). Inocular uma alçada com inóculo leve da cultura e
incubar a 35°C/24h. Adicionar 5 gotas do reagente de Kovacs a cada 4,0ml de cultura e agitar
levemente. Observar se há desenvolvimento de um anel vermelho-violeta na superfície do meio de
cultura (teste positivo) ou se o anel permanece na cor amarela do reagente (teste negativo) As cepas
de E. coli podem ser indol positivas ou negativas.

f.3) Teste de vermelho de metila e Voges-Pros-kauer (caldo VM-VP). Inocular uma alçada com
inóculo leve da cultura e incubar a 35°C/48h. Para o teste de W, transferir assepticamente l,0ml da
cultura para um tubo de ensaio, adicionar 0,6ml de solução de cc-naftol 5% e agitar. Adicionar em
seguida 0,2ml de solução de KOH 40%, agitar e adicionar uma pitada leve de cristais de creatina,
para acelerar a reação. Deixar descansar e observar periodicamente, por até 1 hora, o
desenvolvimento de uma cor vermelha ou rósea no meio de cultura (teste positivo). A permanência
do meio na cor do reagente (amarelada ou ligeiramente esverdeada) indica teste negativo. As cepas
de E. coli são VP negativas. Reincubar a cultura remanescente no caldo VM-VP por 48horas
adicionais e realizar o teste de VM com 96 horas de incubação. Para a realização do teste, adicionar
a cada 2,5mL da cultura, 5 gotas da solução de vermelho de metila, observando imediatamente se o
meio adquire uma coloração vermelha (teste positivo) ou amarela (teste negativo). As cepas de
E. coli são VM positivas.

Resultado de E.coli: Considerar como E. coli todas as culturas com as seguintes características:
bastonetes Gram negativos, indol (+) ou VM (+), VP (-) e citrato (-). Anotar quantos tubos de caldo
EC, estriados em EMB, foram confirmados como E. coli e determinar o NMP/g ou ml em uma ta-
bela de NMP adequada às diluições inoculadas (Apêndice 2).

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14
15
16
AULA PRÁTICA N° 2

Contagem Padrão em Placas

Método de plaqueamento em profundidade
Atenção: Na descrição abaixo foi incluído apenas o procedimento para a contagem total de
aeróbios mesófilos, porque, embora o método de plaqueamento em profundidade possa ser utilizado
para contagem total de aeróbios psicrotróficos e para a contagem de bolores e leveduras,
recomenda-se que estes grupos sejam enumerados pelo método de plaqueamento em superfície.
Esse cuidado evita a exposição das células ao calor do ágar fundido, benéfica para os psicrotróficos
(mais sensíveis às altas temperaturas) e permite uma máxima exposição ao ar, benéfica para os
bolores (aeróbios em sua maioria).

a) Preparação das amostras e diluições seriadas: seguir os procedimentos descritos na atividade

1.

b) Inoculação: selecionar 3 diluições adequadas da amostra e inocular 1,0ml de cada diluição em

placas de Petry separadas, estéreis e vazias, abrindo as placas apenas o suficiente para inserir a
pipeta, próximo ao bico de Bunsen.

c) Adição do meio de cultura: verter nas placas inoculadas, 15 a 20ml de Ágar Padrão para
Contagem (PCA), previamente fundido e resfriado a 45°C. Misturar o inóculo com o meio de
cultura movimentando suavemente as placas, numa superfície plana, em movimentos na forma de 8
ou em movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-
horário. A forma de movimentar as placas para a mistura do inóculo (em 8 ou em movimentos
circulares) deve ser mantida pelo analista durante toda a análise, não se devendo se alternar ora uma
prática, ora outra.

d) Incubação: aguardar a completa solidificação do meio de cultura distribuindo as placas numa

superfície plana. Após a solidificação, inverter as placas e incubar a 35°C/ 48 horas. No caso de
produtos lácteos, recomenda-se incubar a 32ºC/48 horas. No caso de produtos vegetais fermentados
ou acidificados não comercialmente estéreis recomenda-se incubar a 32ºC/ 3 dias cobrindo a
superfície das placas com sobrecamada do mesmo meio.

e) Contagem de colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 25 a 250 colônias e
contar as colônias com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias. Calcular o número de
unidades formadoras de colônias (UFC) por grama ou ml da amostra multiplicando o número de
colônias pelo inverso da diluição inoculada (UFC/g ou ml = número de colônias/diluição). Usar
notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula, na apresentação dos resultados.
Caso tenha sido utilizada, mais de uma placa por diluição (duplicata ou triplicata), considerar como
número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata ou
triplicata. Para a contagem de colônias e cálculo dos resultados em situação não usuais, seguir as
orientações descritas na tabela a seguir.

17
Contagem das colônias e cálculo dos resultados (consultar Tabela 3.l)
Com exemplos de cálculos em diferentes situações. Selecionar as placas com 25 a 250 colônias e
contar as colônias com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias. Calcular o número de
unidades formadoras de colônias (UFC) por grama ou mL da amostra multiplicando o número de
colônias pelo inverso da diluição inoculada (UFC/g ou ml = N° Colônias/ diluição) (Exemplo 1).
Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula, na apresentação dos
resultados. Caso tenham sido utilizadas mais de uma placa por diluição (duplicata ou triplicata),
considerar como número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das
placas da duplicata ou triplicata (Exemplo 2). Para a contagem de colônias e cálculo dos resultados
em situações não usuais, seguir as orientações descritas abaixo e os exemplos da Tabela 3.1.
Todas as placas apresentam mais de 250 colônias: Nestes casos, nunca apresente o resultado como
"incontável", pois há três alternativas para estimar o número de UFC/ g ou ml. Se for possível contar
todas as colônias da placa, deve-se contar e calcular o número de UFC a partir da contagem obtida
(Exemplo 3).
Se não for possível contar todas as colônias da placa, mas o número de colônias/cm2 estiver abaixo de
10, contar as colônias em 12 quadrados de l cm2, 6 quadrados consecutivos na horizontal e 6 quadrados
consecutivos na vertical, utilizando os quadrados demarcados no contador de colônias de colônias
(Exemplo 4). Calcular o número médio de colônias/cm2 e, a partir da média/cm2, determinar o número
total de colônias na placa, multiplicando a média pela área total da placa (65cm2, no caso das placas
de diâmetro externo l00mm).
Utilizar este número total de colônias para calcular o número de UFC. Se o número de colônias/cm2 for
maior do que 10, contar as colônias em quatro quadrados representativos da distribuição das
colônias nas placas e calcular o número de UFC da mesma forma ü&izsdano caso de 12 quadrados
(Exemplo 5). Se o número de colônias/cm2 for maior do que 100, apresentar o resultado como
maior que 6.500 / diluição (Exemplo 6). Em todos esses casos, o resultado deve ser apresentado
como contagem estimada (est).

Nenhuma placa atingiu 25 colônias: Contar as colônias nas placas com número mais próximo de
25, calcular o número de UFC (Exemplo 7) e apresentar o resultado como contagem estimada
(est).
Nenhuma placa com crescimento: Apresentar o resultado como menor do que l/ diluição, valor
estimado (Exemplo 8).
Placas em duplicata, uma com 25-250 colônias e outra com mais de 250 ou menos de 25
Considerar o número de colônias de ambas as placas, utilizando a média cara calcular o número
de UFC (Exemplos 9 e 10).
Duas diluições consecutivas com 25-250 colônias: Calcular o número de UFC de cada
diluição e comparar os resultados. Se um dos resultados for maior do que o dobro do outro,
considere apenas o menor (Exemplos 15 e 16). Se um dos resultados não ultrapassar o dobro
do outro, então considere ambos os resultados, apresentando a média como resultado final
(Exemplos 11, 12, 13 e 14).

Placas com espalhamento: Há dois tipos distintos de espalhamentos: espalhamentos resultantes

da desintegração de agrupamentos de células, durante a mistura do inóculo com o meio de cultura,
ou espalhamentos resultantes da inadequada mistura do inóculo com o meio, levando à formação
de filmes de umidade na superfície do meio ou entre o meio e o fundo da placa. A distinção entre
os dois tipos é facilmente visualizada, porque nos espalhamentos do primeiro tipo sempre se pode
observar crescimento de colônias individuais, enquanto no outro, a massa de crescimento é
contínua, não há ocorrência de colônias individuais. As placas com espalhamento poderão ser
contadas nas seguintes condições: se nenhuma das zonas de espalhamento individuais tiver
18
tamanho superior a 25% da área da placa e, ainda, se a área total coberta por zonas de
espalhamento não ultrapassar 50% da placa. Para contar placas com zonas de espalhamento do
primeiro tipo, cada zona deve ser contada como uma única UFC. Não conte as colônias
individualmente dentro dessas zonas. Para contar placas com zonas de espalhamento do segundo
tipo, selecionar uma região da placa, livre de espalhamentos e contar as colônias em diversos
quadrados de 1cm2. Calcular a média de colônias/cm2, multiplicar pela área total da placa (65cm2no
caso de placas com diâmetro externo de 100mm) e utilizar este valor estimado para calcular o
número de UFC. Apresentar o resultado como contagem estimada (est).
Placas em que o crescimento é proporcionalmente maior nas maiores diluições: Estas
situações são uma indicação da possível presença de substâncias inibidoras na amostra. Esta conclusão,
entretanto, depende de confirmação e, a menos que a confirmação seja feita, o resultado deve ser
apresentado como "acidente de laboratório", caso não seja possível repetir a análise. Pode ser também
decorrente de contaminação acidental da amostra durante o plaqueamento.

19
20
 AULA PRÁTICA N° 3

Atividade 1

Contagem de Bolores e Leveduras

Fundamentos
Baseia-se na verificação da capacidade desses microrganismos se desenvolvem em meios de
cultura com pH próximo a 3,5 e temperatura de 25ºC.

Procedimento

1. Preparo das placas

a) Fundir ágar batata glicose.
b) Resfriar em banho-maria 46-48ºC
c) Acidificar o meio até pH 3,5 por meio de adição de 1,5 mL de solução de ácido tartárico 10%
para cada 100 mL de meio.
d) Verter nas placas cerca de 15 a 20 mL.
e) Deixar solidificar em superfície plana .

2. Preparo da amostra
a) Pesar 25g de amostra;
b) Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%.
c) A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluição desejadas (10-2,10-3 e 10-4).

3. Inoculação nas placas

a) Inocular 0,1mL das diluições selecionadas sobre a superfície seca das placas de agar batata
glicose.
b) Com o auxílio da alça de Drigalski espalhar o inóculo cuidadosamente sobre a superfície do
meio, até sua completa absorção.

4. Incubação
Incubar as placas sem inverter, a 25 ºC, por 5 a 7 dias.

5. Contagem de colônias e cálculo dos resultados

Selecionar as placas com 15 a 150 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa, em
um contador de colônias. Calcular o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por
grama ou ml da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada
(UFC/g ou ml = número de colônias/diluição). Usar notação exponencial e apenas uma casa
decimal depois da vírgula, na apresentação dos resultados. Caso tenha sido utilizada, mais de
uma placa por diluição (duplicata ou triplicata), considerar como número de colônias a média
aritmética da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata ou triplicata. Para a
contagem de colônias e cálculo dos resultados em situação não usuais, seguir as orientações
descritas na tabela a seguir.

21
 AULA PRÁTICA N° 4

PESQUISA DE SALMONELLA

A técnica tradicional de detecção de Salmonella em alimentos é um método cultural

clássico, desenvolvido para garantir a detecção mesmo em situações extremamente desfavoráveis,
como é o caso de alimentos com uma microbiota competidora muito maior que a população de
Salmonella , e/ou alimentos em que as células de Salmonella se encontram em número muito
reduzido ou injuriadas pelo processo de preservação, como aplicação de calor, o congelamento e/ou
secagem, por exemplo. A metodologia recomendada, embora apresente algumas variações nos meio
de cultura e forma de preparação das amostras, segue basicamente 4 etapas que podem ser aplicadas
a quaisquer tipos de alimentos:

Pré-enriquecimento em caldo não seletivo. Objetiva a recuperação de células injuriadas,

conseguida encubando-se a amostra em condições não seletivas por pelo menos 18 horas. Há vários
meios disponíveis para utilização nesta etapa, recomendados por diferentes órgãos reguladores
nacionais e internacionais.

Enriquecimento em caldo seletivo. Objetiva inibir a multiplicação da microbiota

acompanhante e promover a elevação preferencial do número de células de Salmonella, incubando-
se a amostra pré-enriquecida em caldo seletivo, por 18 a 24 horas. Nesta etapa, recomenda-se a
utilização de dois diferentes meios de enriquecimento, porque a resistência da Salmonella aos
agentes seletivos varia de cepa para cepa. Os meios comumente usados são o caldo tetrationato e o
caldo seletivo cistina, recomendados pela AOAC, APHA, FDA, ICMSF e ABNT. O caldo
Rappaport-Vassiliadis modificado (RV), entretanto, vem ganhando cada vez maior aceitação, tendo
sido recentemente aprovado pela isso, como alternativa para o caldo tetrationato.

Plaqueamento seletivo diferencial. Objetiva promover o desenvolvimento preferencial de

colônias de Salmonella, com características típicas que as destingem de competidores, para
posterior confirmação sorológica e bioquímica. Assim como a etapa de enriquecimento seletivo,
recomenda-se que o plaqueamento diferencial seja feito em mais de um tipo de meio de cultura,
havendo vários meios disponíveis para utilização nesta etapa, como Ágar Bismuto Sulfito (BS), o
Ágar Entérico de Hectoen (HE), o Ágar Verde Brilhante (BG), o Ágar Salmonella-Shigella (SS) e o
Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). As recomendações dos órgãos nacionais e internacionais,
para a seleção dos meios, são as seguintes:
-AOAC, APHA, FDA recomendam BS, HE e XLD.
-ICMSF recomenda BS, BG e um terceiro meio, opcional.
-ISO recomenda BG (obrigatório) e um segundo meio, que pode ser o BS ou outro opcional.
-ABNT recomenda BS, HE e XLD ou, opcionalmente, BG e SS.

Confirmação. Objetiva verificar se as colônias típicas obtidas nas placas são realmente de
Salmonella, através de provas bioquímicas e sorológicas. Inicialmente as colônias são submetidas
aos testes de descarboxilação da lisina, fermentação da lactose e/ou sacarose e produção de H 2S, no
Ágar Lisina Ferro e Ágar Tríplice Açúcar Ferro, que permitem eliminar das etapas subseq6uentes
boa parte das colônias de não Salmonella. Culturas características nesses meios devem ser
submetidas a uma bateria de testes bioquímicos adicionais para confirmação definitiva da
identidade.

PROCEDIMENTO

PRÉ -PROCEDIMENTO

22
 Transferir uma porção de 25 gramas ou 25 ml da amostra para um frasco de
homogeneização, previamente esterilizado e tarado. Adicionar 225 mL de caldo de pré-
enriquecimento e homogeneizar a amostra. Incubar os frascos a 35 °C/18-24h.
Nota 1) A adição de surfactantes ao diluente (Tween 80, Tergitol 7, Triton X-100), para
facilitar a homogeneização de amostras gordurosas, não é necessária e nem recomendável na análise
de Salmonella, exceto para amostras de leite de coco e coco ralado. O contato prolongado pode ser
prejudicial às células de Salmonella.
Nota 2) Alimentos “in natura” ou altamente contaminados, como carnes de bovinos, suínos,
aves e pescados, por exemplo, podem ser inoculados diretamente nos caldos de enriquecimento
seletivo, porém, a detecção de Salmonella nestes alimentos é sempre mais eficiente se a etapa de
pré-enriquecimentos não for suprimida.

Atenção: a preparação de certos tipos de alimentos segue procedimentos diferenciados,

descritos nos itens abaixo.

Ovo integral/gema de ovo e clara de ovo em pó. Adicionar aos 25g da amostra,
gradualmente e com constante agitação 225ml de Caldo Lactosado. Adicionar volumes iniciais de
15-20ml e recorrer ao auxílio de um agitador magnético, para facilitar a homogeneização,
esterilizando previamente a barra magnética. Continuar a agitação até obter uma suspensão livre de
grumos não hidratados, deixar descansar por uma hora, à temperatura ambiente, agitar bem, retirar
uma alíquota de volume conhecido e verificar o pH. Se necessário, acertar em 6,8 com NaOH ou
HCL 1N, verificando o volume de ácido ou base consumido na correção do pH da alíquota,
adicionando à amostra um volume proporcional da solução estéril. Incubar a 35°C/18-24h, com a
tampa do frasco ligeiramente afrouxada.

Leite em pó e misturas lácteas em pó. Adicionar 225ml de água destilada estéril aos 25g
da amostra e misturar bem. Deixar descansar por uma hora à temperatura ambiente, adicionar 4,5ml
de uma solução aquosa 0,1% de Verde Brilhante e misturar bem. Incubar a 35°C/18-24h, com a
tampa do frasco ligeiramente afrouxada.

Levedura desidratada ativa. Adicionar 225ml de Caldo Tripticase de Soja (TSB) aos 25g
da amostra, misturar bem e aguardar até que as leveduras formem uma suspensão homogênea.
Deixar descansar por uma hora à temperatura ambiente, misturar bem e, se necessário, ajustar o pH
em 6,8, seguindo o mesmo procedimento descrito para amostras de ovo em pó. Incubar a 35°C/18-
24h, com a tampa do frasco ligeiramente afrouxada.

Condimentos (pimenta-do-reino, pimenta branca, pimenta malagueta em pó, cominho,

páprica, salsa em flocos, alecrim, sementes de gergelim, tomilho, aipo em sementes, pó ou
flocos). Pesar 25 gramas da amostra, adicionar 225ml de caldo TSB e homogeneizar por agitação.
Deixar em repouso por 1 hora à temperatura ambiente, agitar bem e, se necessário, ajustar pH em
6,8, seguindo o mesmo procedimento descrito para ovo em pó. Incubar a 35ºC/18-24h, com a tampa
ligeiramente afrouxada.

Condimentos (alho e cebola em pó ou em flocos). Pesar 25g de amostra, adicionar 225ml

de caldo TSB suplementado com 0,5% de sulfito de potássio e homogeneizar por agitação. Deixar
descansar por uma hora à temperatura ambiente, agitar bem, verificar o pH e , se necessário, ajustar
em 6,8, seguindo o mesmo procedimento descrito para ovo em pó. Incubar a 35°C/18-24h, com a
tampa do frasco ligeiramente afrouxada.

Condimentos (pimenta-da-jamaica, canela e orégano). Pesar 1 grama da amostra,

adicionar 100 ml de caldo TSB e homogeneizar por agitação. Incubar a 35°C/18-24h.

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 Condimentos (cravo-da-índia). Pesar 0,5g da amostra, adicionar 500ml de caldo TSB,
agitar e incubar a 35°C/18-24h.

Condimentos em folha. Pesar 10 gramas da amostra, adicionar 200ml de caldo TSB, agitar
e incubar a 35°C/18-24h.

Caseína comestível. Adicionar aos 25g da amostra, 225ml de Caldo Lactosado,

homogeneizar a amostra em liquidificador (1-2 minutos), transferir para um frasco estéril e deixar
descansar por uma hora à temperatura ambiente. Inocular a 35°C/18-24h, com tampa do frasco
ligeiramente afrouxada.

Chocolate em barra ou em pó, balas e confeitos. Adicionar aos 25g da amostra, 225ml de
leite em pó desnatado reconstituído (100g de leite em pó/litro de água destilada) e homogeneizar a
amostra em liquidificador (chocolate em barra, balas e confeitos) ou por agitação manual (chocolate
em pó). Deixar descansar por uma hora à temperatura ambiente e adicionar 4,5ml de solução aquosa
0,1% de Verde Brilhante, misturando bem. Incubar a 35°C por 18-24 horas, com a tampa do frasco
ligeiramente afrouxada.

Glacês e outras coberturas para produtos de confeitaria. Pesar 25g da amostra, adicionar
225ml de Caldo Nutriente, agitar e incubar a 35ªC/18-24h.

Maionese e outras coberturas ácidas para saladas. Adicionar aos 25g da amostra, 225ml
de Caldo Lactosado e homogeneizar por 2 minutos em “stomacker”. Ajustar o pH em 6,8, seguindo
o mesmo procedimento descrito para ovo em pó e incubar a 35°C por 18-24 horas, com a tampa do
frasco ligeiramente afrouxada.

Amostras de esfregaço ou lavagem de superfície. Para análise de alimentos cuja

contaminação é predominantemente superficial, como carcaças e cortes de bovinos, suínos, aves e
peixes, pode-se coletar a contaminação superficial externa, em lugar de transferir uma unidade
analítica, transferindo-se também as partes internas, pouco contaminadas. Para efetuar a lavagem ou
o esfregaço da superfície, seguir os procedimentos descritos no item 2.4.3, utilizando como diluente
o Caldo Lactosado. Incubar os esfregaços ou o caldo de lavagem a 35°C por 18-24 horas, com as
tampas dos fracos afrouxadas.

ENRIQUECIMENTO SELETIVO

Agitar delicadamente o frasco com o caldo pré-enriquecido e transferir 1,0ml para 10 mL de

Caldo Tetrationato (TT) e 1,0mL para 10,mL de Caldo Selenito Cistina (SC). Incubar ambos os
caldos a 35°C por 24 horas.

PLAQUEAMENTO DIFERENCIAL

Agitar os tubos de enriquecimento seletivo em agitador tipo “vortex” e estriar uma alçada do
caldo TT em placas de Ágar Entérico de Hectoen (HE), Ágar Bismuto Sulfito (BS) e Ágar Xilose
Lisina Desoxiciolato (XLD). Repetir esse procedimento com o caldo SC. Incubar as placas
invertidas a 35°C por 24 horas e verificar se há desenvolvimento de colônias típicas de Salmonella.
Ágar HE. Colônias transparentes, verde-azuladas, com ou sem centro preto. Cepas
fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias inteiramente pretas. Colônias fermentadoras
de lactose ou sacarose são de cor salmão e não transparentes.
Ágar BS. Colônias marrons ou pretas com ou sem brilho metálico. O meio em redor das
colônias muda gradativamente para uma coloração marrom a preta, com o prolongamento do tempo

24
de incubação. Observações: As placas devem ser observadas com 24 horas de incubação e, na
ausência de colônias típicas, novamente observadas com 48 horas ou mais. Os fabricantes
recomendam que as placas de BS sejam preparadas no dia de uso, porém, diversos estudos têm
demonstrado que o meio recém-preparado é tóxico para várias cepas de Salmonella, sendo
recomendável a permanência das placas em geladeira, por pelo menos 5 dias, antes do uso.
Ágar XLD. Colônias transparentes, cor de rosa escuro, com ou sem centro preto. Cepas
fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias com centro preto grande e brilhante, ou
mesmo inteiramente pretas. Cepas fermentadoras de lactose ou sacarose produzem colônias
amarelas com ou sem centro preto. Diversas cepas de Salmonella podem apresentar colônias
transparentes amarelas, atípicas, com ou sem centro preto.

CONFIRMAÇÃO PRELIMINAR DAS COLÔNIAS TÍPICAS DE SALMONELLA

Com o auxílio de uma agulha de inoculação, remover uma porção da massa de células, do
centro da colônia típica e inocular em tubos inclinados de Ágar Lisina Ferro (LIA) e Ágar Tríplice
Açúcar Ferro (TSI). A inoculação deve ser feita por picadas e estrias na rampa, utilizando-se a
mesma alçada para inocular ambos os tubos. Não é necessário e nem recomendável flambar a
agulha e retirar outra porção da colônia, entre um tubo e outro. Recomenda-se submeter à
confirmação preliminar pelo menos duas colônias típicas de cada placa, nos tubos de LIA e TSI.
Incubar os tubos a 35°C por 24 horas e observar se há ocorrência de ração típica de Salmonella.

Reação típica de Salmonella em TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo),
com ou sem produção de H2S (escurecimento do ágar). Reação atípica em TSI, que não deve ser
descartada se as demais reações em LIA se apresentarem típicas; rampa e fundo ácidos (amarelos),
com ou sem produção de H2S.

Reação típica de Salmonella em LIA: fundo e rampa alcalinos (púrpura, sem alteração da
cor do meio), com ou sem produção de H2S (escurecimento do meio). Reação atípica em LIA, que
não deve ser descartada se as demais reações em TSI se apresentarem típicas: fundo amarelado com
rampa alcalina, com ou sem produção de H2S.

TESTES SOROLÓGICOS E BIOQUÍMICOS PARA CONFIRMAÇÃO DEFINITIVA

Teste sorológico somático polivalente. Marcar dois quadrados de aproximadamente 2cm2

em uma lâmina de vidro, usando um lápis de marcar vidro de material hidrofóbico. A partir da
cultura de 24 horas em TSI, transferir uma laçada para cada um dos quadrados demarcados.
Adicionar uma gota de solução salina fisiológica estéril a cada um dos quadrados e emulsionar bem
a cultura. Sobre um dos quadrados, adicionar uma gota de antisoro somático polivalente anti-
Salmonella e emulsionar bem. Segurando a lâmina contra um fundo preto bem iluminado, fazer
delicados movimentos de inclinação e rotação da lâmina, para movimentar a emulsão, observando
se ocorre aglutinação no quadrado com o anti-soro. Comparar com aparência da emulsão do
quadrado com salina (controle negativo), para não confundir a aparência turva da emulsão com
reação de aglutinação. Eventualmente pode ocorrer aglutinação em ambos os quadrados (reação
inespecífica), provavelmente causada por cepas rugosas e auto-aglutináveis.

Teste de urease. Transferir uma alçada com inóculo pesado da cultura em TSI, para um
tubo com Caldo Uréia de Chistensen e incubar a 35°C/24h. Incubar paralelamente um tubo não
inoculado para controle. Observar viragem alcalina do indicador, com alteração da cor do meio de
pêssego para cor de rosa escuro (teste positivo), ou permanência do meio na cor original (teste
negativo). A maioria das cepas de Salmonella são urease negativas.

Teste de fermentação do dulcitol. Transferir uma alçada do inóculo pesado da cultura em

25
TSI, para um tubo de Caldo Vermelho de Fenol suplementado com 0,5% de dulcitol. Incubar a
35°C/48h, com a tampa ligeiramente afrouxada, e observar a ocorrência de viragem ácida do
indicador, alterando a cor do meio de avermelhada para amarela (teste positivo). Viragem alcalina
do indicador (de avermelhado para rosa-escuro) ou não alteração da cor do meio indica teste
negativo. A maioria das cepas de Salmonella fermenta o dulcitol.

Teste de indol. Transferir uma alçada com inóculo leve da cultura em TSI, para tubos com
Caldo Triptona 1% e incubar 35°C/24h. Da cultura em Caldo Triptona, transferir uma alçada com
inóculo leve para Caldo Malonato modificado, para teste de malonato e então utilizar o Caldo
triptona pára a realização do teste de indol, procedendo da seguinte forma: adicionar 0,2 a 0,3ml do
reagente de Kovacs para cada 4,0 a 5,0ml de cultura em caldo triptona e agitar levemente. Observar
se há desenvolvimento de um anel vermelho-violeta na superfície do meio de cultura (teste
positivo), ou se o anel permanece amarelo, cor do reagente de Kovacs (teste negativo).
Desenvolvimento de vários tons entre vermelho e rosa indica teste indeterminado. As cepas de
Salmonella são indol-negativas.

Teste de malonato. Incubar o Caldo Malonato Modificado (inoculado com a cultura em

Caldo triptona) a 35/C/48h, incluindo um tubo não inoculado como controle. Observar viragem
alcalina do indicador, alterando a cor do meio de verde para azul (teste positivo) ou permanência da
cor verde do meio inalterada (teste negativo). Eventualmente pode ocorrer viragem ácida do
indicador, alterando a cor do meio para amarelo, devido à fermentação da glucose presente (teste
negativo). A maioria das cepas de Salmonella são malonato-negativas.

Considerar como Salmonella as colônias que apresentam as seguintes caracteristicas:

reações típicas em LIA e TSI, teste sorológico somático polivalente (+), teste de urease (-), teste de
fermentação do dulcitol (+), teste de indol (-) e teste de malonato (-). Culturas com uma ou mais
reações atípicas devem ser submetidas a testes adicionais descritos a seguir:

TESTES ADICIONAIS

Teste de fermentação da lactose e sacarose. Seguir o mesmo procedimento descrito para o

teste de fermentação do dulcitol, substituindo o dulcitol por 1% de lactose ou sacarose. A maioria
das cepas de Salmonella fermenta lactose e a sacarose.

Teste de vermelho de metila e Voges-Proskauer. Transferir uma alçada com inóculo leve
da cultura em TSI, para um tubo com caldo VM-VP e incubar a 35°C/48h. Para o teste de VP,
transferir assepticamente 1,0ml da cultura para um tubo de ensaio, adicionar 0,6ml de solução de α-
naftol 5% e agitar. Adicionar em seguida 0,2ml de soluçaõ de KOH 40%, agitar e adicionar uma
pitada leve de cristais de creatina, para acelerar a reação. Deixar descansar e observar
periodicamente, por até1 hora, o desenvolvimento de uma cor vermelha ou rósea no meio de cultura
(teste positivo). A permanência do meio na cor do reagente (amarelo ou ligeiramente esverdeada)
indica teste negativo. Reincubar a cultura remanescente no caldo VM/VP por 48hs adicionais e
realizar o teste de VM com 96 h de incubação. Para a realização do teste, adicionar a cada 2,5ml de
cultura, 5 gotas da solução de vermelho de metila e observar imediatamente se o meio adquire uma
coloração vermelha (teste positivo) ou amarela (teste negativo ). A maioria das cepas de Salmonella
são VM positivas e VP negativas

Teste de citrato. Com uma agulha de inoculação, transferir um inóculo leve da cultura para
um tubo de Ágar Citrato de Simmons inclinado, estriando a rampa e picando o fundo. Incubar a
35°C/96h e observar se há crescimento com viragem alcalina do indicador, alterando a cor do meio
de verde para azul (teste positivo). A não ocorrência de crescimento, mantendo a cor do meio

26
inalterada, indica teste negativo. A maioria das cepas de Salmonella são citrato-positivas.

Teste de descarboxilação da lisina em caldo. Este teste é requerido para culturas cuja
reação em LIA não tenha sido satisfatória (atípicas com fundo amarelo e rampa alcalina, com ou
sem produção de H2S), porém não descartada em função da reação típica em TSI. Transferir uma
alçada com inóculo leve da cultura de TSI, para um tubo com Caldo Descarboxilase de moeller
previamente desaerado, suplementado com 15 de cloridrato de L (+) Lisina (2% se utilizar uma
mistura de isômeros D e L). cobrir a superfície do caldo com 2 a 3ml de parafina ou óleo mineral
estéril e incubar a 35°C/24-48hs, com a tampa bem fechada. Observar (com 24 e 48 h) viragem
alcalina do indicador, alterando a cor do meio de esverdeado para púrpura azulado (teste positivo)
ou viragem ácida para amarelo (teste negativo). As cepas de Salmonella são lisina-positivas.

Teste sorológico flagelar polivalente. Transferir uma alçada da cultura em TSI para um
tubo com 5,0ml de Caldo do Tripticase de Soja (TSB) e incubar a 35°C/24h. Adicionar aos 5,0ml
de cultura em TSB, 2,5ml de Solução Salina Formalinizada (Formalina), para a obtenção do
antígeno flagelar a ser detectado no teste. Transferir para um detectado no teste. Transferir para um
tubo de 10 x 75mm ou 10 x 100mm, 0,5ml da cultura formalinizada (antígeno) e 0,5ml de anti-soro
flagelar polivalente contra Salmonella (anticorpos). Preparar um tubo controle negativo, com 0,5ml
do antígeno (cultuta formalinizada) e 0,5ml de formalina e um tubo controle positivo, com 0,5ml do
anti-soro. Agitar vigorosamente os tubos, incubar a 50°C/1h, em banho, e observar os resultados de
15 em 15 minutos, manuseando delicadamente os tubos, para evitar agitação. A ocorrência de
floculação apenas no controle positivo, porém não no tubo-teste, indica teste negativo. A ocorrência
de floculação no tubo-teste e tubo controle positivo indica teste positivo. A ocorrência de floculção
nos três tubos indica reação não específica de auto-aglutinação. Neste caso, e persistindo dúvidas
sobre a identidade da cepa isolada, recomenda-se encaminhar a um laboratório credenciado, para
identificação.

27
 AULA PRÁTICA N° 5

Atividade 1

Contagem de Staphylococcus coagulase positiva

Fundamento:
Baseia-se na contagem direta em placas de Staphylococcus coagulase positiva.

Procedimentos

a) Preparação da amostra e diluições seriadas: Seguir os procedimentos descritos no item 1.3

b) Inoculação: Selecionar três diluições (10-1, 10-2, 10-3) adequadas da amostra, seguindo as
recomendações. Inocular 0,1 mL de cada diluição na superfície de placas de Ágar Baird-Parker
(BP), previamente preparadas e secadas. Espalhar o inóculo com uma alça de Drigalski, das placas
de maior para as placas de menor diluição, até que todo o excesso de líquido seja absorvido. Se as
contagens estimadas de S. aureus na amostra forem menores do que 100/g ou mL, inocular 1,0 mL
da primeira diluição, distribuindo o volume por três placas, 2 com 0,3 mL e uma 0,4 mL.

c) Incubação: Aguardar que as placas sequem completamente e incubar invertidas, a 36ºC por 48
horas.

d) Contagem das colônias presuntivas

Selecionar placas com 20 a 200 colônias e contar as colônias típicas de S. aureus: colônias
circulares, pretas, pequenas (máximo 1,5mm em diâmetro), lisa, convexas, com bordas perfeitas,
massa de células esbranquiçadas nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo
transparente se estendendo para além da zona opaca. Eventualmente, colônias atípicas podem
apresentar-se cinzentas, sem um ou ambos os halos típicos.

e) Confirmação das colônias típicas

Selecionar no mínimo cinco colônias típicas, para teste de coagulase, e havendo menos do que
cinco, tomar todas. Se a placa apresentar colônias suspeitas de mais de um tipo, típicas e atípicas,
selecionar pelo menos cinco de cada tipo, ou um número proporcional à distribuição dos diferentes
tipos na placa. Transferir cada colônia para um tubo de Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI),
emulsionar bem a massa de células com o caldo, transferir uma alçada para um tubo com Ágar
Tripticase de Soja (TSA) inclinado e incubar ambos os tubos a 36ºC/24h.

e.1) Teste de coagulase

Transferir 0,3mL de cada cultura obtida em BHI, para cada tubo de 10x100mm. Adicionar aos
0,3mL de cultura 0,3mL de Coagulase Plasma-EDTA (plasma de coelho com EDTA) e misturar
com movimentos de rotação, sem agitar os tubos, para não interferir na coagulação. Incubar em
banho-maria/estufa a 36ºC e observar a cada uma hora, se há formação de coágulo.
Verificar a presença de coágulos, considerando os critérios a seguir:
Reação negativa: não formação de coágulo;
Reação nível 1: coágulo pequeno e desorganizado;
Reação nível 2: coágulo pequeno e organizado;
Reação nível 3: coágulo grande e organizado;
Reação nível 4: coagulação de todo o conteúdo do tubo, que não se desprenderá quando o tubo for
invertido.

28
Reações positivas de nível 3 ou 4 são consideradas confirmativas da presença de S. Aureus.
Culturas com reações positivas de nível 1 ou 2 são consideradas negativas. Quando a reação for
duvidosa do nível 1 e 2 deve ser submetida à testes adicionais (termocuclease, catalase e coloração
de Gram), para posterior confirmação.

Testes complementares

f1) Teste de catalase

Adicionar 1,0 mL de água oxigenada (peróxido de hidrogênio) 3% à cultura, na rampa dos tubos de
TSA. Observar se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou não (teste negativo). Antes de
utilizar a cultura em TSA para o teste de catalase, preparar um esfregaço para coloração de Gram e
repicar uma alçada em caldo BHI, para repetições, se necessárias.

f2) Coloração de Gram

Preparar esfregaço e corar pelo método de Gram.
A ausência de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presença
de cocos Gram positivos indica a teste positivo, porém há necessidade de testes complementares.

f3) Pesquisa de termonuclease

Fazer orifícios eqüidistantes com cerca de 2mm de diâmetro no ágar para ensaio de termonuclease
ou no ágar azul de toluidina-DNA, em placas previamente preparadas. Colocar os tubos das
culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e
preencher completamente um orifício para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36º/4h ou 50°/2h.
O aparecimento, ao redor dos orifícios, de um halo rosa no ágar azul de toluidina ou de um halo de
clarificação no ágar para ensaio de DNAse com verde de metila, será indicativo de reação positiva
para termonuclease. Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de diâmetro
superior a 1mm.

g) Cálculo dos resultados

Considerar com S. aureus todas as culturas com reação de coagulase de níveis 3 e 4, ou as culturas
com reação de coagulase de níveis 1 e 2, porém, com reações de termonuclease e catalase positivas,
coloração de Gram positiva e forma de cocos em cachos.
Calcular o número de UFC/g ou mL em função do número de colônias típicas contadas, diluição
inoculada e porcentagem de colônias confirmadas.
Exemplo:
Diluição 10-2, 30 colônias suspeitas, 5 submetidas à confirmação, 3 confirmadas (60%)
UFC/g ou mL = 30x102x10x0,6 = 1,8x104.

29
 AULA PRÁTICA N° 6

Atividade 1

Contagem de Clostrídios Sulfito Redutores e Clostridium Perfringens

Introdução

Há vários meios de cultura disponíveis para a enumeração de C. Perfringens em alimentos,

como a Ágar Sangue Neomicina, o Ágar Sangue Cicloserina, o Ágar Sulfito Polimixina
Sulfadiazina (SPS), o Ágar Triptona Sulfito Neomicina (TSN), Ágar Shahidi Ferguson Perfringens
(SFP), o Ágar Tripticase de Soja Sangue de Carneiro (TSB) e o Ágar Triptose Sulfito Cicloserina
(TSC), que pode ser utilizado com ou sem gema de ovo.
A seletividade destes meios é resultante da incorporação de um ou mais antibióticos, para
inibir diversos anaeróbios e anaeróbios facultativos e, salvo no caso dos meios com sangue, a
característica diferencial comum a todos os demais é a presença de ferro e sulfito. Os clostrídios
reduzem sulfito a sulfeto, que reage com o ferro e precipita na forma de sulfeto de ferro, produzindo
colônias pretas. Dentre esses meios, o SPS e o TSN são considerados excessivamente seletivos e
pouco satisfatórios, pois podem inibir diversas cepas de C. Perfringens. O SFP e o Ágar Sangue
Neocimina, ao contrário, são considerados pouco seletivos e, portanto, mais adequados para
situações em que C. Perfringens constitui-se na microbiota predominante no alimento. O Ágar
Sangue Cicloserina parece adequado para a enumeração de C. Perfringens, porém, os dados
disponíveis para uma melhor avaliação do seu desempenho são limitados, uma vez que não tem
sido utilizado rotineiramente na análise de alimentos. O Ágar TSC tem sido utilizado rotineiramente
na análise de alimentos. Por esses motivos, o Ágar TSC tem sido o meio mais utilizado para a
enumeração de C. Perfringens por plaqueamento direto, constituindo-se também numa excelente
alternativa para a enumeração de clostrídios sulfito-redutores em geral, conseguindo suprimir o
crescimento de praticamente todos os anaeróbios facultativos que acompanham os clostrídios em
alimentos.
É importante ressaltar, entretanto, que o Ágar TSC (bem como os meios utilizados nas
etapas subseqüentes da análise) permite o crescimento e produção de toxina de C. Botulinum,
devendo ser observados cuidados durante a execução dos testes, para garantir a segurança do
analista e do laboratório.
Na enumeração de C. Perfringens, o TSC pode ser suplementado com gema de ovo, para
verificar a produção de lectinase, característica dessa espécie de Clostridium. A incorporação da
gema de ovo ao TSC na etapa inicial da análise, entretanto, não apresenta muita vantagem em
relação ao TSC sem gema de ovo, porque nem todas as cepas de C. Perfringens produzem halo de
reação de lectinase, não sendo possível descartar as colônias sem halo, na confirmação dos isolados.
Adicionalmente, o halo produzido por uma colônia pode ser obscurecido pelos halos de outras
colônias, sendo a reação com a gema de ovo melhor observada no teste de inibição da atividade da
lecitinase pela α-toxina de C. Perfringens (Reação de Nagler).
As colônias presuntivas de C. Perfringens em Ágar TSC devem ser confirmadas por testes
bioquímicos, sendo mais recomendadas as características de ausência de motilidade, habilidade de
fermentar a lactose e reduzir nitrato a nitrito e incapacidade de hidrolisar a gelatina.

30
MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE

Preparação da amostra e diluições seriadas

– Diluente: 225mL de água peptonada 0,1%

– Tubos de diluição: 3 a 5 com 9 mL de água peptonada por tubo
– Pipetas: 3 a 5 de 1 ou 2 mL

PROCEDIMENTO

Contagem de Clostrídios Sulfito-Redutores

O esquema geral de análise para contagem de clostrídios sulfito-redutores encontra-se

descrito na figura abaixo.

Figura 1: Esquema geral de análise para contagem de clostrídios sulfito-redutores em alimentos.

a) Preparação das amostras e diluições seriadas.

b) Inoculação. Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular em placas de Ágar

Triptose Sulfito Cicloserina (TSC), plaqueamento em superfície ou em profundidade.
Aguardar que as placas sequem e cobrir a superfície com uma sobrecamada de TSC.

31
 c) Inoculação. Aguardar a completa solidificação da sobrecamada e incubar as placas sem
inverter, a 46º C por 18 a 24 horas, em atmosfera anaeróbia. Para obtenção da atmosfera
anaeróbia, pode-se utilizar o processo de exaustão de ar e introdução de 90 de gás nitrogênio
(99,995 % de pureza) e 10% de gás carbônico (99,9% de pureza), em incubadora anaeróbia
ou jarro tipo Baird & Taitlock, com uma válvula para admissão e outra para exaustão de
gases, procedendo à exaustão e introdução dos gases por 3 ou 4 vezes. Alternativamente,
pode-se utilizar sistemas geradores de anaerobiose, disponíveis comercialmente com os
seguintes códigos:

GasPak Anaerobic System (BBL 70304)

Gas Generating Kit (Oxoid BR 38)
Anaerocult A (Merck 13829)

d) Contagem das colônias presuntivas de clostrídios sulfito-redutores. Selecionar placas

com 20 a 200 colônias e contar apenas as colônias pretas, típicas de clostrídios sulfito-
redutores em Agar TSC. Cuidado: o Ágar TSC permite crescimento e produção de toxina
de C. botulinum, não havendo distinção entre suas colônias e as colônias dos demais
clostrídios sulfito-redutores. Por este motivo, recomenda-se que o manuseio e o descarte
dessas placas, bem como de todo o material envolvido nas etapas subseqüentes da análise
sejam feitos com o máximo cuidado, para evitar riscos de contaminação do analista e do
laboratório. Trabalhar sempre com o material sobre bandeja, não diretamente sobre a
bancada, nunca pipetar culturas com a boca, desinfetar todas as superfícies com solução de
NaOH 1N e esterilizar todo o material de descarte a 121ºC / 30 minutos.

e) Confirmação das colônias típicas de clostrídios sulfito-redutores. Selecionar várias

colônias típicas e transferir para os tubos de caldo Infusão Cérebro Coração (BHI),
previamente desaerados. Para a desaeração do meio, submeter os tubos a fervura em banho,
por 15 minutos, com as tampas afrouxadas, e resfriar imediatamente em banho de gelo.
Incubar os tubos inoculados a 36ºC/24h, preparar um esfregaço da cultura para coloração de
Gram e utilizar o caldo remanescente para teste de catalase.

e1) Teste da catalase: adicionar ao tubo de BHI, 1mL de peróxido de hidrogênio 3% e observar
se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou não (teste negativo). Os clostrídios sulfito-
redutores são bastonetes Gram positivos catalase negativos.

f) Cálculo dos resultados. Considerar como confirmadas todas as culturas de bastonetes

Gram positivos catalase negativos. Calcular o número de UFC/g ou mL em função do
número de colônias típicas, diluição inoculada e porcentagem de colônias confirmadas.
Exemplo: Plaqueamento em profundidade, diluição 10-2, 25 colônias típicas, 10 submetidas
à confirmação, 8 confirmadas (80%).
UFC/g ou mL = 25x102x0,8 = 2,0 x 103.

Atividade 2

CONTAGEM DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Contagem direta com placas

O esquema geral de análise para contagem de Clostridium perfringens por plaqueamento direto
encontra-se descrito na figura abaixo.

32
Figura 2: Esquema geral de análise para enumeração de C. perfringens em alimentos.

33
a) Preparação das amostras e diluições seriadas.

b) Inoculação. Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular em Ágar Triptose

Sulfito Cicloserina (TSC), plaqueamento em superfície ou em profundidade. Alternativamente,
pode-se utilizar o Ágar TSC com gema de ovo, plaqueamento em superfície. Aguardar que as
placas sequem e cobrir a superfície com uma sobrecamada de TSC, sem gema de ovo.

c) Incubação. Aguardar a completa solidificação da sobrecamada e incubar as placas, sem

inverter, a 35-37ºC por 18-20 horas, em atmosfera anaeróbia, obtida da mesma forma
recomendada para incubação de clostrídios sulfito-redutores.

d) Contagem das colônias presuntivas de C. perfringens. Selecionar placas com 20 a 200

colônias e contar as colônias típicas de C. perfringens: pretas e, no caso do TSC com gema de
ovo, podendo apresentar ou não um halo de precipitação, devido à reação de lecitinase com a
gema de ovo. Cuidado: não há distinção entre a toxina de C. botulinum, e as colônias de C.
perfringens.

e) Confirmação das colônias típicas de C. perfringens. Selecionar 5 a 10 colônias típicas e

transferir para Meio de Tioglicolato. Incubar a 35-37ºC/24h e inocular a cultura obtida nos
meios abaixo, para realização das provas bioquímicas de confirmação.

e1) Teste de fermentação da lactose e hidrólise da gelatina (meio de lactose gelatina).

Inocular uma alçada com inóculo pesado da cultura, em tubos de meio de lactose gelatina
previamente desaerados e incubar a 35-37ºC/24-48h. Observar se há formação de bolhas e
viragem ácida do indicador (vermelho de fenol), alterando a cor do meio de vermelha para
amarela (fermentação da lactose positiva), ou se o meio permanece com a cor inalterada
(fermentação da lactose negativa). Transferir os tubos para uma geladeira e manter sob
refrigeração por duas horas, observando em seguida se o meio permanece líquido (hidrólise da
gelatina positiva) ou se adquire uma consistência firme (hidrólise da gelatina negativa). As
cepas de C. perfringens hidrolisam a gelatina e fermentam a lactose.

e2) Teste de coagulação tempestuosa do leite (meio de leite ferro).

Inocular uma alçada da cultura em tubos de meio de leite ferro e incubar a 45ºC/18-24h.
Observar a ocorrência de coagulação tempestuosa do leite, com rompimento e deslocamento do
coágulo (teste positivo) ou a ocorrência de coagulação normal ou não coagulação do leite (teste
negativo). As cepas de C. perfringens provocam a fermentação tempestuosa do leite.

e3) Teste de redução do nitrato e teste de motilidade (Ágar Nitrato Motilidade).

Com o auxílio de uma agulha de inoculação, inocular a cultura por picada, no centro do Ágar
Nitrato Motilidade previamente desaerado, até uma profundidade distante 1cm do fundo do
tubo. Incubar a 35-37ºC/24 h e fazer a leitura do teste de motilidade, observando se houve
migração de células para regiões fora da linha de inoculação (motilidade positiva), ou se o
crescimento restringiu-se à região da picada (motilidade negativa). As cepas de C. perfringens
são imóveis.
Para a realização do teste de redução do nitrato, adicionar aos tubos de cultura 0,5 a 1 mL de
cada um dos reagentes para teste de nitrato (A= solução 0,8% de ácido sulfanílico; B= solução
0,5% de alfa-naftol). Observar imediatamente se há desenvolvimento de uma cor vermelha no
meio de cultura (teste positivo) e, em caso negativo, adicionar uma pitada de pó de zinco ao
meio, observando se ocorre alteração de cor. Se o meio continuar com a cor inalterada, não há
nitrato presente, indicando teste negativo. Se o meio adquirir cor vermelha, há nitrato presente,
indicando teste positivo. As cepas de C. perfringens reduzem o nitrato.
Considerar como C. perfringens todas as culturas com as seguintes características: fermentação

34
 da lactose (+), hidrólise da gelatina (+), coagulação tempestuosa do leite (+), redução do nitrato
(+), motilidade (-). Caso uma destas reações seja atípica, verificar adicionalmente a capacidade
de fermentação da rafinose e salicina, podendo-se ainda verificar, opcionalmente, a atividade
de lecitinase e a sua inibição pela antitoxina alfa de C. perfringens (Reação de Nagler).

e4) Teste de fermentação da rafinose e salicina.

A partir de uma cultura de 24 horas em Meio de Tioglicolato, inocular 0,15 mL em tubos de
Meio de fermentação para C. perfringens. Incubar a 35-37ºC/24h e, após a incubação, verificar
se houve produção de ácido, transferindo 1mL da cultura para um tubo de ensaio e adicionando
2 gotas de solução 0,04% de azul de bromotimol. O desenvolvimento de uma cor amarela no
meio de cultura indica teste positivo. Em caso negativo, reincubar a cultura e verificar
novamente com 48 e com 72 horas de incubação. As cepas de C. perfringens fermentam a
rafinose e não fermentam a salicina.

e5) Teste de atividade de lecitinase (-toxina) e inibição desta atividade pela antitoxina a
de C. perfringens. (Reação de Nagler).
Transferir as culturas a serem testadas para tubos de Meio de Carne Cozida e incubar a 35-
37ºC/24h, para obtenção do inoculo. Preparar uma placa de Ágar TSC com gema de ovo e
espalhar, na superfície de uma das metades da placa, 0,05mL de antitoxina alfa de C.
perfringens. Em seguida, inocular cada cultura na placa preparada, fazendo uma única estria,
perpendicular à linha que divide a placa em duas metades. Iniciar as estrias na extremidade sem
antitoxina e terminar na extremidade com antitoxina. Incubar a placa a 35-37ºC/24h, em
atmosfera anaeróbia. A formação de um halo opaco de atividade de lecitinase (-toxina) ao
redor das estrias, na metade da placa sem antitoxina, acompanhada da não formação (inibição)
desse halo na metade com antitoxina, indica teste positivo, característico de C. perfringens. A
não formação de halo, am ambas as metades da placa, indica teste negativo.

f)Cálculo dos resultados. Calcular o número de UFC/g ou mL em função do número de

colônias típicas, diluição inoculada e percentagem de colônias confirmadas.
Exemplo: Plaqueamento em profundidade, diluição 10-2, 25 colônias típicas, 10 submetidas à
confirmação, 8 confirmadas (80%).
UFC/g ou mL = 25x102x0,8= 2,0x103.

Teste de presença/ausência

Este método objetiva verificar a presença ou ausência de C. perfringens em amostras de

alimentos com baixas contagens e provável incidência de células injuriadas. O método não permite
a contagem.
Cuidado: Todas as etapas do teste de presença/ausência permitem o crescimento e a
produção de toxina de C. botulinum, não havendo distinção segura entre as culturas.

a) Inoculação. Inocular porções de aproximadamente 2,0 gramas da amostra em tubos com

15-20 mL de Caldo de Fígado, previamente desaerados. Cobrir a superfície do meio
inoculado com um selo de 2 cm de ágar 2%.
b) Incubação. Incubar os tubos a 35ºC por 24 horas e observar se ocorre crescimento e
produção de gás, com deslocamento do selo de ágar.
c) Confirmação. A partir dos tubos com crescimento e produção de gás, estriar a cultura
em placas de Ágar TSC com gema de ovo, incubar a 35ºC/24h e observar a presença de
colônias típicas. Selecionar uma ou mais colônias típicas, transferir para Meio de
Tioglicolato, incubar a 35º/24h e submeter aos mesmos testes de confirmação, descritos
para o método de contagem direta em placas.

35
 AULA PRÁTICA N° 7

1. Procedimento:

O esquema geral de análise para contagem de Bacillus cereus pelo método de plaqueamento
direto encontra-se descrito na Figura 7.1.
a) Preparação da amostra e diluições seriadas. Seguir os procedimentos descritos no
item 2.4.
b) Inoculação. Selecionar três diluições adequadas da amostra e, seguindo as
orientações do item 3.3.2., inocular 0,1ml de cada diluição em placas de Agar Manitol Gema
de Ovo Polimixina (MYP), previamente preparadas e secadas. Espalhar o inoculo com slças
de Drigaslski, até que todo o liquido seja absorvido pelo meio de cultura . Recomenda-se
que na contagem de B. cereus e outras bactérias esporogênicas, seja utilizada uma alça
estéril diferente para cad diluição, porque a flambagem em álcool elimina os esporos.
Havendo suspeita de contagem inferiores a 100UFC/g, inocular 0,1 ml. Havendo interessa
em contar exclusivamente os esporos, submeter a amostra a choque térmico por 15 minutos
a 70ºC.
c) Incubação. Aguardar que as placas sequem completamente e incubar invertidas a
30ºC por 24 horas.
d) Contagem das colônias presuntivas. Selecionar para a contagem placas com 10 a
100 colônias, contendo não mais do que 30 colônias típicas de B. cereus, pois estas colônias
são grandes e os halos característicos podem confundir-se em placas muito cheias. As
colônias típicas de B. cereus no Agar MYP são esféricas, com bordas perfeitas, planas, secas
e cerosas, rodeadas por um grande halo de precipitação, devido à reação com a gema de ovo.
Toda a região do meio ao redor das colônias apresenta uma coloração rósea (típica da não-
fermentação do manitol) que, combina com o material precipitado na reação com a gema de
ovo, adquire uma aparência rósea leitosa.Caso a coloração rósea e/ ou o halo de precipitação
não sejam evidentes com 24 horas de incubação, recomenda-se reincubar as placas por 24
horas adicionais.
e) Confirmação das colônias. Selecionar pelo menos 5 colônias típicas bem isoladas,
inocular em tubos de Ágar nutriente (NA) inclinado e incubar a 30ºC/24h, para a obtenção
do inoculo a ser utilizado nos testes de confirmação. Não havendo colônias suspeitas antes
da realização dos testes bioquímicos. Para a purificação, inocular uma alça da cultura,
tomada bem no centro da colônia, em placas de MYP, sem estriar. O inoculo deve ser
simplesmente depositado em um ponto da superfície do meio, sendo possível transferir até
seis colônias para uma mesma placa de MYP, inoculadas em ponto bem separados. Incubar
as placas a 30ºC/24-48h. Atenção: O Agar MYP pode permitir o crescimento de B.
anthracis, patogênico, com colônias indistinguíveis das colônias de B. cereus. Por esse
motivo, o manuseio dessas culturas deve ser feito com cuidado, para prevenir riscos de
contaminação do analista e do laboratório. Utilizar as culturas obtidas em NA ou purificadas
em MYP para inocular os meios-testes relacionados abaixo:
e1) Teste de utilização anaeróbio de glucose (caldo vermelho de fenol 1% glucose).
Inocular uma alçada da cultura no meio previamente desaerado (fervura por 15 minutos em
banho, com as tampas afrouxadas, seguida do imediato resfriamento em banho de gelo).
Cobrir a superficie do caldo com óleo mineral ou vaselina liquida estéril e incubar a
35ºC/24h. Alternativamente, em lugar de cobrir o meio com óleo ou vaselina, pode-se
incubar os tubos em atmosfera anaeróbia, obtida por um dos métodos relacionados no item
8.3.1 (c). Observar se há ocorrência de viragem ácida do indicador, alternando a cor do meio
do meio de vermelho para amarelo (teste positivo) ou se o meio permanece com a cor
inalterada (teste negativo). As cepas de B. cereus utilizam a glucose anaerobicamente.
e2) Teste de decomposição da tirosina (agar tirosina). Estriar uma alçada da cultura
na rampa dos tubos de Agar Tirosina inclinado e incubar a 35ºC por até 10 dias. Observar
36
periodicamente se há desenvolvimento de uma zona clara e transparente de decomposição e
dissolução dos cristais de tirosina, na região abaixo da rampa (teste positivo), ou não
formação dessa zona, mantendo o meio opaco inalterado (teste negativo). As cepas de B.
cereus decompõem a tirosina rapidamente, formando uma zona de 3 a 4mm de profundidade
em 48-72h. Observação: É comum o escurecimento, com desenvolvimento de uma
coloração castanha.
e3) Teste de Voges-Proskauer (caldo VP modificado) Inocular uma alçada com
inoculo leve da cultura nos tubos de caldo VP modificado e incubar a 35ºC/48h. Adicionar,
para cada1,0ml de cultura, 0,6ml de solução de α-naftol 5%, 0,2ml de solução de KOH 40%
e uma pitada de cristais de creatina, na ordem indicada. Agitar vigorosamente, deixar
descansar e observar periodicamente , por até 1 hora, o desenvolvimento de uma cor
vermelha no meio de cultura (teste positivo). A permanência do meio na cor amarelada dos
reagentes indica teste negativo. As cepas de B. cereus são VP positivas.
e4) Teste de redução do nitrato (caldo nitrato). Inocular uma alçada com inoculo
pesado da cultura nos tubos de Caldo Nitrato e incubar a 35ºC/24h. Após a incubação,
adicionar aos tubos de cultura 0,25ml de cada um dos reagentes para teste de nitrato (A =
Solução 0,8% de ácido sulfanílico, B = Solução 0,5% de α-naftol). Observar o
desenvolvimento de uma cor rósea avermelhada em no máximo dez minutos (teste positivo)
e, em caso negativo, adicionar uma pitada de pó de zinco, deixar em repouso por dez
minutos e observar se o meio permanece com a cor inalterada (teste positivo) ou adquire
uma coloração rósea avermelhada (teste negativo). A maioria das cepas de B. cereus reduz o
nitrato, sendo poucas as cepas de B. cereus reduz o nitrato, sendo poucas as cepas negativas
para essa característica.
e5) Teste hidrólise da gelatina (ágar gelatina) (opcional). Transferir uma alçada da
cultura para as placas da Agar Gelatina, fazendo uma única estria na superfície do meio.
Incubar a 30ºC/24h e, após a incubação, cobrir a superfície com o reagente de Frazier,
observando o desenvolvimento de um halo transparente em redor da estria da cultura (teste
positivo) ou a ausência deste halo (teste negativo). As cepas de B. cereus hidrolisam a
gelatina.
e6) Teste de resistência à lisozima (caldo nutriente 0,001% lisozima) (opcional).
Inocular uma alçada de cultura em um tubo de Caldo Nutriente suplementado com 0,001%
de lisozima, inoculando também um tubo de Caldo de Nutriente não suplementado
(controle). Incubar a 35º/24-48h e observar se ocorre crescimento nos dois tubos (teste
positivo) ou apenas no tubo-controle (teste negativo).
Considerar como pertencentes ao grupo do B. cereus as culturas com as seguintes
características: utilização anaeróbia da glucose positiva, decomposição da tirosina positiva,
teste de VP positivo, redução do nitrato positiva ou negativa, hidrólise da gelatina positiva
(opcional) e resistência a lisozima positiva (opcional). Para confirmação definitiva dos
isolados, é recomendada a inoculação dos seguintes meios de cultura, para realização dos
testes adicionais.
e7) Coloração de cristais de toxinas intracelulares (ágar nutriente inclinado). Inocular
uma alçada da cultura na rampa da um tubo de NA inclinado e incubar a 30ºC/24h. Manter o
tubo à temperatura ambiente por três dias, para envelhecer a cultura, permitir a formação de
esporos e a lise dos esporângios. Preparar um esfregaço da cultura, fixando levemente pelo
calor. Cobrir o esfregaço com metanol por 30 segundo, descartar

37
 PREPARO DE MEIOS E REAGENTES PARA ANÁLISES
ÁGAR TRIPTOSE SULFITO CICLOSERINA (TSC)

Aplicação: meio seletivo/diferencial para isolamento de clostrídios sulfito-redutores e Clostridium

perfringens.

Composição da Base

Triptose 15,0g
Peptona de soja 5,0g
Extrato de levedura 5,0g
Metabissulfito de sódio 1,0g
Citrato férrico amoniacal 1,0g
Agar 20,0g
Água destilada 1 litro
pH 7,6 121ºC/15min

Suplemento

Solução 4% de D-Cicloserina 10,0ml/lbase

Suspensão gema de ovo: salina(1:1)(opcional) 80,0ml/lbase

Preparação: esterilizar a base a 121ºC/15min, resfriar a 45-50ºC, adicionar assepticamente a

solução de cicloserina previamente preparada e plaquear imediatamente. Para a preparação do TSC
com gema de ovo, adicionar também a suspensão de gema de ovo/salina, antes do plaqueamento.
Solução aquosa de D-cicloserina 4%: esterilizar por filtração. Emulsão de gema de ovo:
mergulhar os ovos em etanol 70% por 10 minutos, flambar, abrir assepticamente e transferir as
gemas para um frasco estéril tarado. Adicionar às gemas uma quantidade de solução salina 0,85%
estéril, suficiente para diluição 1:1. Misturar o conteúdo por agitação ou com o auxílio de baguetas
estéreis, ate obter uma suspensão homogênea.

ÁGAR (CALDO) INFUSÃO CÉREBRO CORAÇÃO (BHI)

Aplicação: meio de enriquecimento e manutenção para uso geral.

Composição (Caldo)
Infusão de cérebro de bezerro 200,0g
Infusão de coração de boi 250,0g
Proteose peptona 10,0g
Dextrose 2,0g
Cloreto de sódio 5,0g
Fosfato dissódico(Na2HPO4) 2,5g
Água destilada 1litro
pH 7,4 121ºC/15min

Preparação: Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e esterilizar a 121ºC/15min. Para a preparação

do ágar, adicionar 15g para cada litro de caldo.

38
CALDO INFUSÃO CÉREBRO CORAÇÃO(BHI)

→ Vide ÁGAR INFUSÃO CÉREBRO CORAÇÃO

CALDO VERDE BRILHANTE BILE 2%

Aplicação: meio seletivo para contagem de coliformes totais (confirmação de teste presuntivo pelo
método do NMP ou plaqueamento direto).

Composição
Bile de boi (“oxgall”) 20,0g
Peptona 10,0g
Lactose 10,0g
Verde brilhante (13,3ml de solução aquosa 0,0133g
0,1%)
Água destilada 1litro
pH 7,2 121ºC/15min

Preparação: dissolver os ingredientes, acertar o pH, distribuir em tubos de 16X150mm com tubo
de Durhan (aproximadamente 6ml/tubo) e esterilizar a 121ºC/15min.

CALDO E.COLI (EC)

Aplicação: meio para contagem de coliformes fecais, confirmação de resultado presuntivo pelo
método do NMP.

Composição
Triptose 20,0g
Lactose 5,0g
Sais Biliares Nº 3 1,5g
Fosfato dipotássico(K2HPO4) 4,0g
Fosfato monopotássico(KH2PO4) 1,5g
Cloreto de sódio 5,0g
Água destilada 1litro
pH 6,9 121ºC/15min

CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSE (LST)

Aplicação: meio seletivo para detecção presuntiva de coliformes totais, coliformes fecais e E.coli
pelo método do NMP

Composição
Triptose 20,0g
Lactose 5,0g
Fosfato monopotássico 2,75g
Fosfato dipotássico 2,75g
NaCl 5,0g
Lauril sulfato de sódio 5,0g
Água destilada 1litro
pH 6,8 121ºC/15min

39
Preparação: dissolver os ingredientes, acertar o pH, distribuir em tubos de 16X150mm com tubo
de Durhan (10ml/tubo) e esterilizar a 121ºC/15min.

CALDO TETRATIONATO

Observação: formulação de Mueller (1923), modificada por Kauffmann(1933).

Aplicação: meio seletivo para enriquecimento de Salmonella

Composição da Base
Proteose peptona 5,0g
Sais biliares 1,0g
Tiossulfato de sódio 30,0g
Carbonato de cálcio 10,0g
Água destilada 1litro
pH 8,4

Suplemento
Solução de iodo 0,2ml/10ml base
Solução 0,1% de verde brilhante(opcional) 0,1ml/10ml base

Preparação: dissolver os ingredientes da base, acertar o pH, distribuir em tubos de

16X150mm(10ml/tubo) e ferver por 10 minutos. Não autoclavar. No momento do uso adicionar, a
cada tubo com 10,0ml base, 0,2ml de solução iodo e 0,1ml de solução 0,1% de verde brilhante.
Utilizar imediatamente, o meio completo não deve ser estocado.

SOLUÇÃO DE IODO

Iodo 6,0g
Iodeto de potássio (KI) 5,0g
Água destilada 20,0ml

Colocar o iodo e o iodeto de potássio num almofariz e homogeneizar com o pistilo. Adicionar,
consecutivamente, porções de 1ml, 5ml, e 10ml de água destilada, homogeneizando a solução após
cada adição. Em seguida, transferir a solução para um frasco escuro, lavando o almofariz e o pistilo
com o restante da água destilada.

SOLUÇÃO 0,1% DE VERDE BRILHANTE

Verde brilhante 0,1g

Água destilada 100,0ml

Dissolver 0,1g de verde brilhante em 100ml de água destilada, ferver por 10 minutos ou esterilizar
por filtração. Armazenar em frasco escuro, sob refrigeração.

40
CALDO SELENITO CISTINA (SC)

Aplicação: caldo para enriquecimento seletivo de Salmonella em alimentos.

Composição
Triptona 5,0g
Lactose 4,0g
Fosfato dissódico(NA2HPO4) 10,0g
Selenito ácido de sódio 4,0g
L-Cistina 0,01g
Água destilada 1litro
pH 7,0 Fervura/10min

Preparação: dissolver os ingredientes na água destilada, acertar o pH em 7,0, distribuir em tubos

de 16X150mm(10ml/tubo) e submeter à fervura por 10 minutos. Não autoclavar. A altura do meio
no tubo não deve ser inferior a 5cm, porque o meio é mais eficiente quando apresenta potencial de
óxido-redução reduzido. Cuidado: os sais de selenito são tóxicos quando inalados ou ingeridos.
Manusear com cuidado.

ÁGAR ENTÉRICO DE HECTOEN (HE)

Aplicação: meio seletivo diferencial para detecção presuntiva de Salmonella.

Composição
Proteose peptona 12,0g
Extrato de levedura 3,0g
Sais Biliares Nº3 9,0g
Lactose 12,0g
Sacarose 12,0g
Salicina 2,0g
Cloreto de sódio 5,0g
Tiossulfato de sódio 5,0g
Citrato férrico amoniacal 1,5g
Azul de bromotimol(32,5ml da solução 0,2%) 0,065g
Fucsina ácida 0,1g
Ágar 14,0g
Água destilada 1litro
pH 7,5

Preparação: dissolver os ingredientes e aquecer em banho, sob constante agitação, até a completa
dissolução do ágar. Não autoclavar. Plaquear imediatamente, não deve ser reaquecido.
Solução 0,2% de azul de bromotimol: dissolver 0,1g em 2,5ml de NaOH 0,1N e completar o
volume para 50ml com água destilada.

41
ÁGAR BISMUTO SULFITO (BS)

Aplicação: meio seletivo diferencial para detecção presuntiva de Salmonella.

Composição
Peptona 10,0g
Extrato de carne 5,0g
Dextrose 5,0g
Fosfato dissódico (Na2HPO4) 4,0g
Sulfito de bismuto 8,0g
Sulfato ferroso 0,3g
Verde brilhante (2,5ml da solução aquosa 1%) 0,025g
Ágar 20,0g
Água destilada 1litro
pH 7,7

Preparação: dissolver os ingredientes e aquecer em banho-maria apenas o tempo necessário para a

completa fusão do ágar. Não autoclavar. Distribuir em placas imediatamente, agitando
continuamente para suspender o precipitado que normalmente permanece após o aquecimento.
ATENÇÃO: embora os fabricantes recomendem que o meio seja preparado no dia do uso, diversos
estudos têm demonstrado que o meio recém preparado é tóxico para diversas cepas de Salmonella,
sendo recomendável a estocagem em geladeira por pelo menos cinco dias, antes do uso.

ÁGAR XILOSE LISINA DESOXICOLATO (XLD)

Aplicação: meio seletivo diferencial para isolamento presuntivo de Salmonella.

Composição
Extrato de levedura 3,0g
L-Listina 5,0g
Xilose 3,75g
Lactose 7,5g
Sacarose 7,5g
Desoxicolato de sódio 2,5g
Citrato férrico amoniacal 0,8g
Tissulfato de sódio 6,8g
Cloreto de sódio 5,0g
Vermelho de fenol(40ml da solução 0,2%) 0,08g
Ágar 15,0g
Água destilada 1litro
pH 7,4

Preparação: dissolver os ingredientes, ajustar o pH e ferver em banho-maria, sob constante

agitação, até completa fusão do ágar. Não autoclavar. Plaquear imediatamente, não pode ser
reaquecido.
Solução 0,2% de vermelho de fenol: dissolver 0,1mg em 4ml de NaOH 0,1N e completar o
volume para 50ml com água destilada.

ÁGAR TRÍPLICE AÇÚCAR FERRO (TSI)

Aplicação: meio para prova bioquímica, testes de fermentação da glicose, lactose e sacarose, teste

42
de produção de H2S.

Composição
Extrato de carne 3,0g
Extrato de levedura 3,0g
Peptona 15,0g
Proteose peptona 5,0g
Dextrose 1,0g
Lactose 10,0g
Sacarose 10,0g
Sulfato ferroso 0,2g
Cloreto de sódio 5,0g
Tiossulfato de sódio 0,3g
Vermelho de fenol(12ml da solução 0,2%) 0,024g
Ágar 12,0g
Água destilada 1litro
pH 7,4 121ºC/15min

Preparação: dissolver os ingredientes, fundir o ágar, distribuir em tubos de 10X100mm (4-

5ml/tubo), esterilizar a 121ºC/15min e inclinar, mantendo fundo de no mínimo 2,5cm.
Solução 0,2% de vermelho fenol: dissolver 0,1g em 4ml de NAOH 0,1N e completar o volume
para 50ml com água destilada.

ÁGAR LISINA FERRO (LIA)

Aplicação: meio para provas bioquímicas, teste de descarboxilação da lisina e teste de produção de
H2S.

Composição
Peptona 5,0g
Extrato de levedura 3,0g
Dextrose 1,0g
Cloridrato de L-Lisina 10,0g
Citrato férrico amoniacal 0,5g
Tiossulfato de sódio 0,04g
Púrpura de bromocresol(2ml de solução 1%) 0,02g
Ágar 15,0g
Água destilada 1litro
pH 6,7

Preparação: dissolver os ingredientes, fundir o ágar e distribuir em tubos de 10X100mm

(5,0ml/tubo), esterilizar a 121 ºC/15min e inclinar, mantendo fundo de 2,5cm , no mínimo, porque a
reação de descarboxilação da lisina é mais eficiente em condições anaeróbias.
Solução 1% de púrpura de bromocresol: dissolver 1,0g em 1,9ml de NaOH 0,1N e completar o
volume para 10ml com água destilada.

43
CALDO URÉIA DE CHRISTENSEN (vide ÁGAR URÉIA DE CHRISTENSEN)

ÁGAR (CALDO) URÉIA DE CHRISTENSE-T

Aplicação: meio para prova bioquímica, teste de urease.

Composição (Caldo)
Peptona 1,0g
Dextrose 1,0g
Cloreto de sódio 5,0g
Fosfato monopotássico (KH2PO4) 2,0g
Uréia 20,0g
Vermelho de fenol (6ml de solução 0,2%) 0,012g
Água destilada 1 litro
pH 6,8/filtração

Preparação do caldo: dissolver os ingredientes em 1 litro de água destilada, ajustar o pH e

esterilizar por filtração. Não autoclavar. Distribuir assepticamente em tubos de 10X100mm
previamente esterilizados (3-4ml/tubo).
Preparação do ágar: dissolver os ingredientes em 100ml de água destilada e esterilizar por
filtração. Separadamente, preparar 900ml de ágar 1,5% e esterilizar a 121ºC/15min. Resfriar o ágar
a 50-55ºC e juntar aos 100ml de caldo estéril. Distribuir assepticamente em tubos de 10X100mm
previamente esterilizados (4ml/tubo) e inclinar com rampa longa e fundo curto.
Solução 0,2% de vermelho de fenol: dissolver 0,1g em 4ml de NaOH 0,1N e completar o volume
para 50ml com água destilada.

CALDO VERMELHO DE FENOL-CARBOIDRATOS

Aplicação: meio para prova bioquímica, teste de fermentação de carboidratos.

Composição da base
Proteose peptona 10,0g
Extrato de carne 1,0g
NaCl 5,0g
Vermelho de fenol(9ml da solução 0,2%) 0,018g
Água destilada 1litro
pH 7,4 121ºC/15min

Preparação: dissolver os ingredientes da base, acertar o pH em 7,4, distribuir em tubos de

10X100mm(4ml/tubo) com tubinhos de Durhan e esterilizar a 121ºC/15 minutos. Preparar e
esterilizar por filtração uma solução aquosa a 10% do carboidrato a ser testado e adicionar
assepticamente aos tubos de meio base, na quantidade necessária para atingir a concentração final
de 1% no meio completo (0,4ml de solução de carboidrato/4ml de base). Atenção: o dulcitol deve
ser adicionado na concentração final de 0,5% no meio completo (0,20ml/4ml de base).
Solução 0,2% de vermelho de fenol: dissolver 0,1g em 4ml de NaOH 0,1N e completar o volume
para 50ml com água destilada.

44
CALDO TRIPTONA 1%

Aplicação: meio para prova bioquímica, teste de indol.

Composição
Triptona 10,0g
NaCl 5,0g
Água destilada 1litro
pH 7,3 121ºC/15min

Preparação: dissolver os ingredientes na água destilada, distribuir em tubos de 10X100mm (4-

5ml/tubo) e esterilizar a 121ºC/15minutos

CALDO MALONATO MODIFICADO

Aplicação: meio para prova bioquímica, teste de utilização do malonato.

Composição
Sulfato de amônia 2,0g
Fosfato dipotássico (K2HPO4) 0,6g
Fosfato monopotássico 0,4g
Cloreto de sódio 2,0g
Malonato de sódio 3,0g
Extrato de levedura 1,0g
Dextrose 0,25g
Azul de bromotimol (12,5ml da solução 0,2%) 0,025g
Água destilada 1litro
pH 6,7 121ºC/15min

Preparação: dissolver os ingredientes, acertar o pH em 6,7, distribuir em tubos de 10X100mm (3-

4ml/tubo) e esterilizar a 121ºC/15min.
Solução 0,2% de azul de bromotimol: dissolver 0,1g em 2,5ml de NaOH 0,1N e completar o
volume para 50ml com água destilada.

CALDO VM VP

Aplicação: meio para prova bioquímica, testes de Vermelho de Metila e Voges-Proskauer.

Composição
Peptona 7,0g
Glicose 5,0g
Fosfato dipotássico(K2HPO4) 5,0g
Água destilada 1litro
pH 6,9 121ºC/15min

Preparação: dissolver os ingredientes na água destilada, acertar o pH em 6,9, distribuir em tubos

de 10X100mm (5ml/tubo) e esterilizar a 121ºC/15 minutos.

45
ÁGAR CITRATO DE SIMMONS

Aplicação: meio para prova bioquímica, teste de citrato.

Composição
Sulfato de magnésio 0,2g
Fosfato de amônia (NH4H2PO4) 1,0g
Fosfato de dipotássico(K2HPO4) 1,0g
Citrato de sódio 2,0g
Cloreto de sódio 5,0g
Ágar 13,0g
Azul de bromotimol(40ml da solução 0,2%) 0,08g
Água destilada 1litro
pH 6,6 121ºC/15min

Preparação: dissolver os ingredientes, fundir o ágar, distribuir em tubos de 10X100mm (4-

5ml/tubo), esterilizar a 121ºC/15min e inclinar.
Solução 0,2% de azul de bromotimol: dissolver 0,1g em 2,5ml de NaOH 0,1N e completar o
volume para 50ml com água destilada.

CALDO DESCARBOXILASE DE MÖELLER

Aplicação: meio para prova bioquímica, teste de descarboxilação de aminoácidos.

Composição (Base)
Peptona 5,0g
Extrato de carne 5,0g
Dextrose 0,5g
Púrpura de bromocresol(1ml da solução 1%) 0,01g
Vermelho de cresol(2,5ml da solução 0,2%) 0,005g
Piridoxal 0,005g
Água destilada 1litro

Preparação: dissolver os ingredientes do meio base, adicionar 1% do L-aminoácido (2% no caso

de usar uma mistura dos isômeros DL), acertar o pH em 6,8, distribuir em tubos de 10X100mm (4-
5ml/tubo) e esterilizar a 121ºC/10min.
Solução 1% de púrpura de bromocresol: dissolver 0,1g em 1,9ml de NaOH 0,1N e completar o
volume para 10ml com água destilada.
Solução 0,2% de vermelho cresol: dissolver 0,1g em 2,6ml de NaOH 0,1N e completar o volume
para 50ml com água destilada.

REAGENTE DE KOVACS PARA TESTE DE INDOL (SOLUÇÃO ALCOÓLICA 5% p-

DIMETILAMINOBENZALDEÍDO)

Aplicação: reagente para prova bioquímica , teste de indol. Não confundir com o reagente de
Kovacs para teste de oxidase.

Composição
p-dimetilaminobenzaldeído 5,0g
Álcool amílico, isoamílico ou butílico 75,0ml
Ácido clorídrico concentrado 25,0ml

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Preparação: em uma capela de exaustão, dissolver completamente o p-dimetilaminobenzaldeído
no álcool amílico, aquecendo levemente em banho-maria (50-60ºC), se necessário. Adicionar
cuidadosamente o ácido clorídrico concentrado á solução deixando o líquido escorrer lentamente
pela parede do frasco, sem provocar respingos. Descartar a pipeta em um frasco com água, lavando
todo o ácido das paredes. Estocar o reagente sob refrigeração, em frasco de vidro escuro com tampa
de vidro. Recomenda-se que, sempre que possível, seja preparado no momento do uso ou estocado
por não mais de uma semana, porque a estabilidade pode variar de alguns dias a semana, porque a
estabilidade pode variar de alguns dias a semanas. A cor deve ser amarela e o pH inferior a 6,0.
Dependendo da marca do álcool amílico utilizado, o reagente pode apresentar cor verde ou
esverdeada. Nesse caso, recomenda-se substituir o álcool por outro equivalente comercial. Cuidado:
o ácido clorídrico concentrado é extremamente corrosivo, podendo causar danos muito graves e
dolorosos à pele e aos olhos. Em caso de acidente, lavar com água em abundância. Nenhum dos
componentes, bem como reagente pronto, devem ser pipetados com a boca, devendo ser utilizada
uma pêra ou um pipetador.

SOLUÇÃO VERMELHO DE METILA PARA TESTE DE VM

Aplicação: reagente para prova bioquímica, teste de vermelho de metila.

Composição
Vermelho de metila 0,02g
Etanol 95% 60,0ml
Água destilada Completar para 100,0ml

Preparação: dissolver vermelho de metila nos 60,0ml de etanol e completar o volume para
100,0ml com água destilada. Estocar em frasco escuro, sob refrigeração.

REAGENTES DE BARRIT PARA TESTE DE VP

Aplicação: reagentes para prova bioquímica, teste de Voges-Proskauer.

Solução 5% de alfa-naftol
Alfa-naftol 5,0g
Etanol absoluto Completar para 100,0ml

Preparação: Dissolver o alfa-naftol em menos de 100ml de etanol, transferir para um balão

volumétrico e adicionar o etanol restante, completando o volume para 100ml. Estocar em geladeira.
Cuidado: o reagente não deve ser pipetado com a boca, utilizar uma pêra ou um pipetador.

SOLUÇÃO 40% DE HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO OU SÓDIO

KOH (ou NaOH) 40,0g

Água destilada Completar para 100,0ml

Preparação: Pesar o KOH rapidamente (é altamente higroscópico) e dissolver em menos de 100ml

de água destilada, em um béquer colocado em banho de água fria, para controlar a elevação da
temperatura durante a dissolução. Aguardar resfriar e completar o volume para 100ml com água
destilada. Estocar sob refrigeração, em frasco de polietileno ou em frasco de vidro com a boca e a
tampa parafinadas. Cuidado: a solução é extremamente cáustica, podendo causar queimaduras
dolorosas à pele. Manusear com cuidado e, em caso de acidente, lavar com água em abundância.

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SOLUÇÃO SALINA FORMALINIZADA (FORMALINA)

Aplicação: reagente para prova sorológica flagelar para Salmonella.

Composição
Formaldeído(solução 36-38%) 0,6ml
Cloreto de sódio 0,85g
Água destilada 100,0ml

Preparação: preparar 100ml de solução salina 0,85% e esterilizar a 121ºC/15min. Resfriar a

temperatura ambiente e adicionar o formaldeído assepticamente à solução salina estéril. Não
aquecer após a adição do formaldeído.

ÁGAR BATATA DEXTROSE ACIDIFICADO (PDA ACIDIFICADO)

Aplicação: meio seletivo para isolamento de bolores e leveduras.

Composição
Infusão de batatas 200,0g
Dextrose 20,0g
Ágar 15,0g
Água destilada 1litro
121ºC/15min

Preparação: preparar o meio e esterilizar a 121ºC/15min. No momento do uso, fundir o ágar,

resfriar a 45-50ºC e adicionar uma quantidade suficiente de solução aquosa de ácido tartárico 10%
estéril, para obter pH final de 3,5. Geralmente, a adição de 1,0ml de solução de ácido tartárico para
cada 100ml de meio é suficiente para a obtenção do pH requerido, porém, recomenda-se que seja
verificada, a cada novo frasco de meio colocado em uso, a quantidade exata de ácido consumida na
redução do pH. O meio acidificado deve ser utilizado imediatamente, não podendo ser reaquecido.
Solução de ácido tartárico 10%: Dissolver 10,0g do ácido em água destilada e completar o
volume para 100ml. Esterilizar por filtração.

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