MICROBIOLOGIA VETERINÁRIA:

ATIVIDADES PRÁTICAS

Prof. Ariel Eurides Stella

1
 O autor

Possui graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de

Goiás (2001), mestrado (2006) e doutorado (2009) em Microbiologia Agropecuária
pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho-UNESP/Jaboticabal. Pós-
doutorado em Microbiologia pela Universidade de São Paulo-USP (2015). Professor
Associado da Universidade Federal de Jataí - UFJ. Orientador no programa de
Mestrado em Biociência Animal. Membro da Sociedade Brasileira de Microbiologia.
Tem experiência na área de Medicina Veterinária, com ênfase em Saúde Animal e
Microbiologia.

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 ÍNDICE

1. Introdução e Coleta de amostras para exame microbiológico (Atividade 1)..... 4

2. Isolamento e Identificação de Enterobactérias (Atividades 2 e 3) ................... 8

3. Isolamento e Identificação de coco Gram-positivos (Atividades 4 e 5) .......... 13

4. Bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) (Atividade 6) ................................... 19

5. Análise de leite mastítico e Antibiograma (Atividades 7, 8 e 9) ...................... 22

6. Microcultivo de Fungos (Atividades 10 e 11).................................................. 28

7. Microrganismos fermentadores (cerveja, pão) (Atividade 12) ........................ 33

8. Microbiologia do rúmen (Atividade 13) ........................................................... 35

9. Bactérias lácteas (Atividade 14) ..................................................................... 37

10. Contagem de Placas de Lise (Virologia) (Atividade 15) ................................. 41

11. Bibliografia ..................................................................................................... 45

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 1. Introdução
A microbiologia, ciência que estuda os microrganismos
ou a “vida” pequena, está presente em praticamente todas as
áreas de atuação do médico veterinário, seja na
biossegurança da produção animal, clínica médica veterinária,
inspeção de alimentos de origem animal, saúde pública,
epidemiologia e defesa animal, terapêutica veterinária, etc..,
enfim esta presente em muitas especialidades. O médico
veterinário que utiliza bem seus conhecimentos acerca da microbiologia sem sombra
de dúvida terá um melhor desempenho e rendimento em sua área específica. A
microbiologia tem sofrido enormes avanços desde as primeiras descobertas de
Pasteur e Koch a mais de 120 anos atrás, inúmeros microbiologistas veterinários sem
dúvida fazem parte destes avanços. Como uma ciência da área biológica básica, a
microbiologia também desenvolve ferramentas que analisam os fundamentos
primordiais da vida. Os microrganismos já existiam na terra a cerca de bilhões de
anos atrás, muito antes de plantas ou animais, e embora sejam as menores formas
de vida, conjuntamente formam a maior massa de matéria com vida na terra.
Hoje a Microbiologia Veterinária ocupa uma posição de destaque na grade
curricular, auxiliando o diagnóstico clínico ou a pesquisa, seja de forma clássica
(caracterização cultural e bioquímica) ou através de técnicas moleculares avançadas
usadas para detectar genes associados a fatores de virulência. Este manual se
destina primariamente aos estudantes do curso de medicina veterinária, que
necessitam de informações, sobre os agentes infecciosos importantes causadores de
doenças nos animais. O conteúdo reflete os grupos microbianos mais importantes ou
presentes na população animal no Brasil, bem como os microrganismos zoonóticos.
São atividades práticas que irão auxiliar os alunos a compreender as características
fenotípicas presentes entre os microrganismos, bem como utilizar estas para
diferenciar as espécies.
Ao final de cada atividade prática executada, os alunos deverão responder
algumas perguntas relacionadas ao grupo microbiano estudado, ou aos resultados
observados. Bom estudo a todos!

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Coleta de amostras para exame microbiológico

Uma das principais atividades da microbiologia veterinária, é a identificação

dos agentes que estão causando doenças infecciosas nos animais. A identificação
pode ser feita bioquimicamente, testando características fenotípicas dos
microrganismos, ou por meio de testes imunológicos (pesquisa de anticorpos e
antígenos) e moleculares (análise de DNA ou RNA). Portanto, o cultivo e o isolamento
de microrganismos, a partir de amostras de tecidos ou secreções do hospedeiro, são
etapas essenciais.
A coleta apropriada de uma amostra para exame, e o transporte adequado
para o laboratório, constituem etapas criticamente importantes para a confirmação
final de que um determinado microrganismo, é responsável pelo processo patológico
infeccioso. Uma amostra mal coletada pode resultar não só na incapacidade de se
identificarem agentes importantes, mas também pode levar a uma terapia incorreta ou
mesmo prejudicial, se o tratamento for direcionado para um agente comensal ou
contaminante.
Ao se coletarem amostras, devem ser considerados os seguintes fundamentos:

1. O material deve ser do local real da infecção, coletado com um mínimo de

contaminação de tecidos, órgãos ou secreções adjacentes;
▪ Coletar “swabs” de garganta evitando o contato com outras áreas da
boca.
▪ Limpar adequadamente o prepúcio nos machos quando se coleta urina
via sonda. Nas fêmeas fazer a limpeza do tecido periuretral e perineal.
Preferência pela coleta por cistocentese.
▪ Nas vacas higienizar os tetos antes de se coletar o leite, bem como
descartar os primeiros jatos.

2. Deve ser obtida uma quantidade suficiente da amostra para se realizarem os

testes necessários.
▪ Na maioria das infecções bacterianas, são produzidas quantidades
suficientes de pus ou secreções purulentas, de modo que o volume não
deve ser um problema.
5
 ▪ “Swab” seco ou com poucas secreções é inapropriado.

3. Devem ser usados vários dispositivos apropriados de coleta, para garantir o

isolamento do microrganismo.
▪ As amostras para exame microbiológico deverão ser acondicionadas em
recipientes limpos, estéreis e íntegros (sem perfurações, rachaduras
etc.).
▪ Os recipientes devem ter tampas bem fechadas, para evitar vazamentos
ou contaminações durante o transporte.
▪ “Swabs” em meios de transporte ou umedecidos podem ser utilizados
até no máximo 48 hs após a coleta.
▪ “Swabs” secos (sem meio conservador) devem ser processados
imediatamente.
▪ Amostras de fezes: “Swab” retal ou recipientes com tampa e boca
larga.
▪ Amostras de urina: recipientes com tampa e boca larga ou seringa
estéril (sonda).
▪ SNC: punção espinhal de líquido cefalorraquidiano em seringa estéril.
▪ Amostras de feridas e abscessos: “Swab”, curetagem ou aspiração.
- O local deve ser higienizado com sabão e enxaguado com
solução salina estéril.
▪ Infecções oculares: raspado e “swab”.
▪ Sangue: coletar um total de 10 mL, limpe o local com solução de iodo-
álcool antes da coleta.
▪ Tecidos e biópsias: recipiente vedado e estéril. Se for muito pequena a
amostra pode ser colocada em um pedaço de papel filtro estéril úmido.
▪ Raspados de pele para crescimento de fungos, devem ser enviados
secos em recipientes limpos para evitar o hiper crescimento bacteriano.
▪ A coleta por aspirado com uma agulha e seringa é melhor que por
“Swab”(principalmente para anaeróbios).
▪ Sempre após a coleta com seringa, colocar a tampa novamente na
agulha ou retirar a agulha da seringa e vedar a saída com esparadrapo.
▪ Quando necessário, a estocagem da amostra deve ser feita em
temperatura de refrigeração (geladeira).

6
 ▪ Independentemente do tipo de transporte, a principal tarefa é diminuir a
um mínimo o tempo entre a coleta e a inoculação.

4. Sempre que possível, obter culturas antes da administração de antibióticos.

▪ A administração de antibióticos não necessariamente impede o
isolamento de microrganismos de amostras clínicas.
▪ Até mesmo uma amostra comprometida é melhor do que nenhuma,
entretanto os resultados devem ser vistos com cautela.

5. O frasco da amostra deve ser apropriadamente rotulado.

▪ Nome do animal.
▪ Fonte da amostra.
▪ Médico Veterinário.
▪ Data/hora da coleta.

6. Enviar também a requisição devidamente preenchida.

▪ As informações são úteis para se escolher a metodologia de isolamento.
▪ O telefone do Médico Veterinário requisitante é importante, pois se for o
caso deve-se informar imediatamente o resultado de alguns exames.

A colheita da amostra constitui a primeira fase da análise.

TIPOS DE AMOSTRAS OU PEDIDOS QUE SÃO REJEITADOS

1. Qualquer amostra recebida em formalina.

2. Um único “Swab” para vários fins.
3. Solicitação em recipiente impróprio, não-estéril, ou obviamente contaminado.
4. Quantidades muito pequenas de material (menos de 0.5 mL).
5. Amostras com tempo de coleta muito longo e sem refrigeração.
6. Amostra com ficha de pedido incompleta.

7
 2. Isolamento e Identificação de Enterobactérias

Entre os bastonetes Gram negativos, as enterobactérias são as que tem

merecido maior atenção em praticamente todos os países, não somente por serem
agentes etiológicos de infecções humanas e animais, como também pela sua
importância em problemas de saúde pública. As enterobactérias são bastonetes
Gram negativos, não esporulados, móveis ou imóveis, capsulados ou não
capsulados, cujo ambiente natural é na maioria das vezes, o trato gastrointestinal do
homem e dos animais.
Alguns gêneros são patogênicos exclusivos do homem como a Shigella sp.,
outros são patogênicos tanto para o homem como para animais como a Salmonella
sp.. A maioria tem existência saprofítica no trato intestinal, podendo, no entanto,
causar processos infecciosos de maior ou menor gravidade quando localizados em
outros órgãos do corpo (ex.: pielonefrites causadas por Proteus sp., celulite aviária
por Escherichia coli etc.). Além destes, existem gêneros encontrados em vida livre na
natureza como Serratia sp., Enterobacter sp. Também pertencem ao grupo das
enterobactérias: Edwardsiella sp., Citrobacter sp., Klebsiella sp., Yersinia sp.,
Providencia sp.
As enterobactérias constituem as bactérias isoladas com mais frequência de
amostras clínicas de animais doentes. Elas podem ser incriminadas em praticamente
qualquer tipo de doença infecciosa e isoladas de qualquer amostra recebida no
laboratório. Os animais imunossuprimidos ou debilitados, são altamente suscetíveis
às infecções, após colonização com cepas ambientais ou após procedimentos
invasivos. O choque endotóxico constitui uma manifestação potencialmente letal das
enterobactérias. A endotoxina é um lipopolissacarídeo (LPS) complexo e ativo contido
no interior da parede celular das espécies Gram negativas (Figuras 1 a e b). Os
efeitos desta toxina no organismo são, febre, leucopenia, hemorragia capilar,
hipotensão e colapso circulatório.
A identificação destas bactérias é baseada nas características morfológicas,
bioquímicas, antigênicas e do local de coleta. Algumas delas, no entanto, mesmo
após se valer de todos estes critérios, permanecem em situações indefinidas, sem se
enquadrar em perfeitamente nenhum dos grupos conhecidos. Como as
enterobactérias desenvolvem resistência frequente e às vezes múltipla aos

8
 antibióticos, quando se isola uma espécie considerada patogênica é aconselhável
fazer antibiograma.

Figuras 1 a e b. Antígenos mais comuns presentes em enterobactérias.

a b

• Objetivo: Isolamento e identificação de Escherichia coli e outras

enterobactérias (Enterobacter sp., Klebsiella sp., Citrobacter sp., Shigella sp.,
Proteus sp.)

• Materiais:
- Tubo de BHI com cultivo bacteriano (1 por grupo).
- Placa de agar nutriente com cultivos bacterianos (1 por grupo).
- Placa de agar MacConkey (2 por grupo).
- Placa de agar EMB (2 por grupo).
- Tubo com agar TSI (2 por grupo).
- Tubos com caldo uréia, citrato, Indol, VM, VP (2 por grupo).
- Corantes de Gram

• Execução: Semear, técnica de estrias por esgotamento, um repique do tubo

BHI para as placas tanto de E. coli como de outra enterobactéria. Inocular os
tubos a partir do cultivo das placas de agar nutriente. Identificar as placas e
tubos (meio, bactéria e grupo). Incubar em estufa a 37ºC por 24-48 horas.
• Leitura:
• Observar o crescimento nas placas e tubos. Observar os tipos de colônias
presentes. Anotar o que foi observado:
• Agar MacConkey (colônias lactose positivas-vermelhas e negativas-opacas).
• Agar EMB (colônias fermentadoras de lactose – verde brilhante).
• Tubos TSI: observar a reação.
9
 Fundo ácido (amarelo) e superfície ácida (amarelo) + intensa produção de gás → Klebsiella
sp.
Fundo ácido (amarelo) e superfície ácida (amarelo) → Escherichia coli, Enterobacter sp.
Fundo ácido (amarelo) e superfície alcalina (vermelho) → Shigella sp.; Enterobacter sp.
(sac+)
Fundo ácido (amarelo) e superfície alcalina (vermelho) + Produção de H2S → Salmonella
sp., Citrobacter sp., Proteus sp.
Fundo alcalino (vermelho) e superfície alcalina (vermelho) → Bacilos Gram negativos não
fermentadores como a Pseudomonas sp.

• Tubo uréia: Observar a coloração do caldo. Cor vermelha em todo o meio

indica alcalinização e hidrólise da uréia. A urease é uma enzima encontrada
em muitos microrganismos, que podem hidrolisar a uréia liberando amônia e
dióxido de carbono. A amônia reage em solução formando carbonato de
amônio, resultando na alcalinização e em aumento do pH do meio.
Consequentemente em pH maior que 8.0 ocorre a mudança de cor do
indicador fenoftaleína (incolor→ rosa/avermelhado).

• Tubo VM: Adicionar cerca de 4-5 gotas do indicador vermelho de metila,

agitar e observar a coloração final do meio. São positivos tubos que
desenvolvem a coloração vermelha, devido ao baixo pH do meio. Algumas
bactérias oxidam a glicose, e os produtos finais podem variar dependendo
das vias metabólicas presentes em cada microrganismo. Alguns
microrganismos produzem ácidos orgânicos (fórmico, acético, lático,
succínico) que reduzem o pH do meio. Em meios acidificados, com pH menor
que 4.0, o indicador torna-se vermelho.

• Tubo VP: Adicionar 15 gotas de alfa-naftol, agitar e adicionar 5 gotas de

KOH (40%). Esperar 30 minutos e observar. O resultado será positivo se
uma faixa vermelha se formar na superfície do meio. Bactérias que
fermentam a glicose levam à produção de compostos não-acídicos, como a
acetoína. Adicionando-se os reagentes acima citados a acetoína, se
presente, é oxidada em diacetil, o que leva ao aparecimento da coloração
vermelha.

10
• Tubo indol: Adicionar 3-4 gotas de reativo de Kovacs. Este teste demonstra
que algumas bactérias degradam o aminoácido triptofano. Bactérias que
possuem a enzima triptofanase são capazes de hidrolizar o triptofano,
produzindo indol, piruvato e amônia. Os dois últimos são utilizados
diretamente no metabolismo da bactéria, enquanto o indol acumula-se no
meio. A presença do indol pode ser destacada pela adição do reativo de
Kovacs ao meio de cultura, que resultará na formação de uma coloração
vermelha na superfície. A ausência da coloração vermelha indica que o
triptofano não foi hidrolizado, e que a bactéria é negativa para o teste do
indol.

• Tubo citrato: Observar a reação no tubo. É considerado positivo o tubo que

desenvolve coloração azul, e negativo o tubo verde. Algumas bactérias
conseguem utilizar citrato como única fonte de carbono, pois possuem a
enzima citrato permease que facilita o transporte do citrato para dentro da
célula. No metabolismo deste elemento são produzidos piruvato e CO 2, este
último reage com o sódio formando o carbonato de sódio (alcalino). Com o
aumento do pH do meio, o azul de bromotimol (indicador que faz parte do
meio) apresenta coloração azul. Em meios com pH abaixo de 7.6 apresenta-
se verde.

• Questões:
a) Cite algumas doenças importantes que podem ser causadas por
enterobactérias (cite a doença e o microrganismo), em bovinos, aves e
suínos.
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b) Identifique os componentes da enterobactéria, bem como seus
antígenos de superfície.
a. Flagelo
b. Cápsula
c. Antígeno H
d. Membrana citoplasmática
e. DNA
f. Antígeno O
g. Fímbria
h. Antígeno K
i. Plasmídeo
j. Parede celular
k. Citoplasma

c) Encontre as respostas corretas:

a. Estado do genoma de um vírus temperado, que se replica em sincronia
com o genoma do hospedeiro, geralmente integrando-se a seu genoma.
b. Designação dada a uma célula que teve sua parede celular removida.
c. Microrganismo que apresenta crescimento ótimo em temperatura
variando de 45-80ºC.
d. Uma vacina que imuniza contra mais de uma doença.
e. Agente, geralmente inseto ou outro animal, capaz de transmitir
patógenos de um hospedeiro para outro.
f. Toxina modificada de maneira a perder a toxicidade, mas ainda capaz
de induzir imunidade.
g. Estudo das reações antígeno-anticorpo.
h. A medida da quantidade de anticorpos presentes no sangue.

12
3. Isolamento e Identificação de coco Gram-positivos.

Estafilococos
As bactérias Gram-positivas
constituem um grupo grande e diverso. O
estudo dos cocos Gram positivos é de grande
importância em Microbiologia Veterinária, sob
diferentes aspectos. Muitas espécies são
patogênicas para o homem e animais
causando diversos tipos de doenças e um
número ainda maior de espécies pode ser considerado componente da microbiota
normal da pele e cavidades abertas do corpo humano e animal. Em graus variáveis,
apresentam estes microrganismos, poder invasor acentuado, multiplicando-se no
hospedeiro e secretando produtos biológicos diversos (enzimas, toxinas etc.) Tudo
isso aliado a uma variação de resistência do hospedeiro decorrem as formas clínicas
da doença, que são geralmente de caráter agudo e esporadicamente sub-agudo ou
crônico. Normalmente estes microrganismos são sensíveis aos antibióticos e
quimioterápicos de uso comum, uma exceção importante é constituída pelo

13
Staphylococcus aureus, principalmente aqueles isolados de ambientes hospitalares,
que desenvolvem resistência múltipla.
Estafilococos são bactérias que se dividem em diversos planos para formar
cachos irregulares. Das inúmeras espécies, cinco são de importância veterinária: S.
aureus (agente piogênico comum em diversas espécies), S. pseudointermedius
(bactéria piogênica mais freqüente nos cães), S. epidermidis (encontrado
universalmente na pele e mucosas, raramente é patogênico), S. hycus (epidermite
exsudativa em suínos e mastite) e S. schleiferi (otite em cães).
São imóveis, não formadores de esporos e catalase-positivos. Na maioria
das vezes são anaeróbios facultativos. A morfologia, na coloração, pelo método de
Gram não pode ser utilizada para diferenciar os estafilococos de micrococos ou
planococos. As cepas de algumas espécies exibem uma considerável variação nos
tamanhos das colônias na mesma placa de cultura, dando a aparência de uma cultura
mista. Algumas cepas podem ter pigmento amarelo ou amarelo-alaranjado (daí a
designação “aureus” que significa dourado), enquanto outras cepas podem produzir
colônias esbranquiçadas ou cinzas.
Em humanos existem duas espécies importantes, o S. aureus (associado a
condições patológicas) e o S. epidermidis (não patogênico, encontrado na pele).

Estreptococos
Os estreptococos e os enterococos são bactérias Gram positivas e catalase
negativas que tendem a crescer aos pares e em cadeias. São anaeróbios facultativos,
embora algumas cepas cresçam melhor em condições anaeróbicas. Fermentam
glicose formando ácido láctico sem formação de gás. Os membros do gênero
Streptococcus crescem tipicamente em cadeias quando cultivados em caldo.
Algumas espécies de estreptococos, podem ser classificadas sorologicamente com
base nos carboidratos antigênicos da superfície celular. O trabalho pioneiro de
Rebecca Lancefield, estabeleceu o sistema de grupamentos de Lancefield para os
estreptococos beta-hemolíticos.
Os principais grupos causadores de doenças são os seguintes:
a. Infecções do trato respiratório superior com linfadenite
(eqüinos, suínos, gatos), particularmente nos jovens.
b. Infecções respiratórias e septicêmicas neonatais em potros,
leitões e cães jovens.

14
 c. Pneumonias e infecções secundárias (eqüinos, primatas,
pequenos carnívoros).
d. Infecções piogênicas não relacionadas ao trato respiratório
(infecções do trato genitourinário, mastite bovina).
Animais de sangue quente albergam uma microbiota de estreptococos nas
mucosas dos tratos respiratório superior, genital inferior e quase todo o trato digestivo
(enterococos).
A formação das cadeias é variável, apesar de que algumas espécies
(Streptococcus equi) as produzem constantemente. Muitas espécies notadamente S.
pneumoniae, são encapsuladas e algumas possuem fímbrias.
Exsudatos, leite, tecidos, urina, aspirados e líquido cefalorraquidiano são
cultivados diretamente no agar sangue de carneiro, incubados a 37ºC por 24 horas. A
identificação baseia-se na classificação de Lancefield e em testes bioquímicos.
Algumas espécies são importantes na produção de ácido lático (produção
de iogurte, queijos, silagem) como os Lactococcus sp., enquanto o gênero
Enterococcus sp. inclui os estreptococos predominantemente de origem fecal.

• Objetivo: Isolamento e identificação de Staphylococcus sp. e Streptococcus

sp.
• Materiais:
- Placa de agar sangue/nutriente (2 por grupo).
- Placa de agar manitol (1 por grupo).
- Placas de cultivo de Staphylococcus sp. e Streptococcus sp.
- Bateria de Gram
- Suabe estéril (2 por grupo).
- Bateria para catalase (lâminas e peróxido de hidrogênio H2O2).

• Execução:
- Coloração de Gram
Fazer coloração de Gram da placa de estafilococos e de estreptococos.
Anotar e desenhar o que foi observado:

Estafilococos Estreptococos
15
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- Teste da Catalase
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H 2O2)
em água e oxigênio. O H2O2 se forma na célula bacteriana devido ao metabolismo
aeróbico dos carboidratos, que se acumulado ele se torna letal para a bactéria. O
teste da catalase é comumente aplicado para diferenciar membros das
Micrococcaceae dos membros de Streptococcaceae.
Com a alça bacteriológica transfira o material em crescimento da placa
(placa de estafilococos e de estreptococos) para uma lâmina e acrescente uma
gota de H2O2 , misture, observe a formação de bolhas.
Diferenciação de Staphylococcus sp. e Streptococcus
sp.:_______________________________________________________________
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- Isolamentos
Isolamento de estafilococos (colher com auxílio do suabe estéril, material
do nariz e semeá-lo no agar, incubar em estufa a 37ºC por 24-48h). Fazer
coloração de Gram das colônias suspeitas.
Inocular uma cultura de S. aureus em agar manitol.
Isolamento de estreptococos (colher com auxílio do suabe estéril, material
de garganta e semeá-lo no agar). Identificar as placas (grupo). Incubar em estufa
a 37ºC por 24-48h.

✓ Na próxima aula:
Leitura: Observar o crescimento nas placas. Observar os tipos de colônias
presentes. Fazer coloração de Gram das colônias. Fazer catalase das colônias.
Anotar o que foi observado:
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• Questões:
a) Cite as principais doenças infecciosas animais que podem ser causadas por
estafilococos e estreptococos (cite a espécie).
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b) Encontre as respostas:

18
 4. Bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR)
O grupo das Actinobacterias inclui: Corynebacterium,
Arthrobacter, Propionibacterium e Mycobacterium. São principalmente
bactérias saprófitas presentes no solo, entretanto o gênero
Mycobacterium pode causar a tuberculose no homem e nos anaimais.
O estudo das micobactérias apresenta grande importância em
Medicina Veterinária e humana (Tabela 1). O gênero Mycobacterium é composto por
bactérias em forma de bastonetes, entretanto são relativamente pleomórficas
podendo apresentar ramificações ou filamentos, que em certos estágios apresentam
ácido resistência. Esta característica da parede celular desse microrganismo é devido
a grande quantidade de ácidos micólicos ali encontrados. O famoso cientista
alemão Robert Koch isolou e descreveu o M. tuberculosis em 1882. A prevalência
mundial é de 10 milhões de novos casos todos os anos,
e a mortalidade está em torno de 1,5 milhões. A vacina do bacilo Calmette–Guérin (BCG) é
usada na prevenção da tuberculose. O bacilo
Atualmente o tratamento humano é baseado no uso de começou a ser desenvolvido em 1906
por Albert León Charles Calmette e Jean
isoniazida, no entanto a resistência do microrganismo a Marie Camille Guérin. A OMS considera
como um medicamento essencial e eficaz nos
este antibiótico vem aumentando, e cepas denominadas sistemas de saúde. Anualmente mais de 120
milhoes de crianças são vacinadas.
linhagens tuberculosas resistentes a múltiplos fármacos
(MDR TB) estão surgindo. Nos animais a espécie
predominante é o M. bovis, que entretanto pode causar uma tuberculose no homem,
principalmente pelo consumo de leite cru, denominada tuberculose zoonótica.
Neste gênero incluem-se o agente etiológico da tuberculose (M.
tuberculosis, M. bovis) e o da hanseníase/lepra (M. leprae), além de outras espécies,
algumas saprófitas e outras de patogenicidade peculiar. As espécies de
micobacterias se diferem, sob muitos aspectos, da maioria das bactérias conhecidas.
Assim, elas se distinguem por:
▪ Apresentarem uma replicação lenta, mesmo em condições ótimas
(seu período de geração é de 12-18 horas, enquanto o de outras
bactérias é de 20 minutos).
▪ Apresentarem características tintoriais próprias, que as fazem
conhecidas como “ bacilos álcool-ácido resistentes” (BAAR). Estas
características são reveladas pela coloração de Ziehl-Neelsen.

19
 ▪ São mais resistentes a agentes químicos, o que permite isolá-las de
material contaminado com outros microrganismos.
▪ Finalmente sua patogenicidade é peculiar: apresenta um parasitismo
intracelular, faz desenvolver lesões que tendem a cronificação, e nos
indivíduos afetados aparece um tipo diferente de hipersensibilidade
(tardia). Os anticorpos humorais não participam da imunidade que se
desenvolve contra o microrganismo.

Objetivo: Realizar coloração de Ziehl-Neelsen em esfregaços e observar

as células características de micobactérias.

Materiais:
- Lâminas
- Bateria de Ziehl-Neelsen

Execução:
- Fazer um esfregaço fino de BCG.
- Fixar pelo calor.
- Corar com Fucsina de Ziehl concentrada, aquecendo a lâmina até a
emissão de vapores, durante 5 minutos.
- Escorrer o corante e diferenciar com álcool-clorídrico.
- Lavar com água corrente.
- Corar rapidamente com solução de Azul de Metileno.
- Lavar e secar.
- Observar com objetiva de imersão.
- Tipo de bactéria a ser observado: Bacilos corados em vermelho.

Tabela 1. Micobacérias patogênicas para animais e humanos. Fonte: Quinn et

al., 2019.
Espécies de Mycobacterium Principais Espécies Doenças
Hospedeiros ocasionalmente
afetadas
M. bovis Bovinos Humanos, gatos, Tuberculose
animais silvestres.
M. caprae Caprinos e Bovinos Ovinos, Suínos, Javali Tuberculose
M. avium Aves Suínos e Bovinos Tuberculose
M. avium subsp. Bovinos, ovinos, Outros ruminantes Paratuberculose
paratuberculosis caprinos (Doença de Johne)
M. tuberculosis Homem, primatas Cães, bovinos, aves Tuberculose
M. leprae Humanos Tatus, chimpanzés Lepra

20
Comentários:
- O bacilo da tuberculose é de crescimento lento, exigindo meios de cultura
complexos e apropriados. No meio comumente usado (Loewenstein-Jensen) o
crescimento se dá após 12-15 dias, mas as culturas devem ser mantidas em
observação até 6 a 8 semanas.
- Para a semeadura do material, se este for contaminado com outras bactérias,
como é o caso do escarro, deve-se fazer a sua descontaminação (NaOH a
4%,ácido oxálico a 5%).
- Os tipos que se podem distinguir são: M. tuberculosis, M. bovis, M. avium,
saprófitas e micobactérias atípicas.

Questões:
a. Quais espécies de micobactérias podem causar doenças nos animais ?
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b. Desenhe e caracterize as células observadas ao microscópio.

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____________________________________________________________

21
c. Identifique as etapas da infecção produzida pelo Mycobacterium bovis e
identifique as células e estruturas presentes na lesão:

a. ( ) Células de Mycobacterium sp ativas

b. ( ) Adesão de leucócitos
c. ( ) Formação do granuloma
d. ( ) Endocitose pelo Macrófago
e. ( ) Disseminação e reativação
f. ( ) Insucesso na digestão pelo
macrófago.

• ( )Macrófagos
• ( )Necrose caseosa central
• ( )Linfócitos
• ( )Fibroblastos (início da formação da
cápsula)
• ( )Células epitelióides (macrófagos alterados)
• ( )Células gigantes (macrófagos fusionados)

22
 4. Análise de leite mastítico e antibiograma

Inúmeros tipos de microrganismos podem causar

mastite. Eles vivem na vaca ou em seu ambiente. Assim, a
mastite é o resultado da interação entre a vaca, e o seu meio
ambiente e os microrganismos (Figura 1). Esses microrganismos
são formas de vida microscópicas que podem ser bactérias,
leveduras, algas, fungos e, em raras ocasiões, vírus. Entretanto,
as bactérias são, certamente, as principais causadoras de Figura 1. Característica multifatorial da
mastite bovina.
infecções intramamárias em vacas leiteiras. Os microrganismos
que causam a mastite com maior freqüência podem ser agrupados em quatro
categorias: contagiosos, ambientais, oportunistas e outros.
Um patógeno é um microrganismo que causa uma reação adversa no
animal que está infectado. Alguns patógenos provocam uma forte reação inflamatória
no úbere, o que proporciona uma contagem de células somáticas (CCS) muito alta
(Figura 2). Outros patógenos são menos importantes porque causam simplesmente
uma pequena elevação na CCS. A maioria das infecções da glândula mamária são
causadas por apenas alguns tipos de bactérias, entre as quais estão: estreptococos,
estafilococos e coliformes.
Os patógenos contagiosos (Streptococcus agalactiae, Sthaphylococcus
aureus, Corynebaterium bovis, Mycoplasma bovis) se disseminam de quartos
infectados para quartos não infectados. A principal fonte destes microrganismos é o
leite de quartos infectados de vacas doentes. Eles são disseminados de vaca para
vaca durante o processo de ordenha, através do conjunto da ordenha mecânica, das
mãos do ordenhador e dos panos usados na limpeza dos tetos.
Os patógenos ambientais (Streptococcus uberis, Streptococcus
dysgalactiae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes,
Enterococcus faecallis e Enterococcus faecium) encontram-se no ambiente onde
vivem as vacas (camas, pastos, etc.). Invadem o úbere no intervalo entre ordenhas,
quando os tetos ficam expostos á lama, fezes e sujidades. A maioria dos patógenos
contagiosos e ambientais provoca uma elevação na CCS e são conhecidos como
patógenos principais.

23
 Dentre os microrganismos que são isolados nos quartos infectados, os
oportunistas (Sthaphylococcus coagulase-negativos, dentre os principais: S.
chromogenes, S. hycus) são os mais predominantes, mas causam apenas uma leve

Figura 2. Inflamação da glândula mamária durante a mastite. inflamação dos

tecidos do
úbere, sendo conhecidos como patógenos menos importantes. Encontram-se em
grande número na superfície do úbere e dos tetos e são, consequentemente, uma
fonte constante de infecção.
Outros microrganismos menos comuns também causam mastite: os fungos,
as leveduras e as algas.
É quase sempre desejável determinar os tipos de microrganismos
causadores da infecção no rebanho, para que sejam identificadas as soluções para o
problema da mastite, como fazer recomendações para terapia (antibiograma) ou
tomar decisões a respeito do descarte de vacas. Isso se faz através da cultura de
amostras do leite dos quartos dos animais doentes. A CCS, CMT e os casos clínicos
podem ser parâmetros para selecionarmos os animais ou rebanhos que serão
testados.
Quando se fazem coletas de amostras de leite dos quartos, dois a três jatos
devem ser descartados e o teto deve ser desinfetado com álcool 70%, antes da
coleta. Utilizar frascos coletores esterilizados e transportar as amostras em
refrigeração.
Objetivo: Isolar, identificar e fazer antibiograma de bactérias presentes no
leite de animais com mastite clínica e/ou subclínica.

24
 Materiais:
Primeira etapa:
- Placa de agar sangue/nutriente (1 por grupo)
- Placa de agar MacConkey (1 por grupo)
- Bateria de Gram
Segunda etapa:
- Bateria de Gram
- Tubo com água peptonada (5 mL)
- Agar Mueller-Hinton (2 por grupo)
- Suabe estéril (1 por grupo)
- Discos de antibiótico
- Bateria para identificação de bactérias Gram negativas (TSI, indol, VM, VP, Citrato e caldo uréia).
- Bateria para identificação de bactérias Gram positivas (catalase, coagulase, manitol).
Terceira etapa:
- Régua milimetrada para determinação do tamanho dos halos de inibição.

Execução:
Primeira etapa:
- Semear o leite nos meios de cultivo, agar sangue/nutriente, agar MacConkey e
agar Sabouraud, incubar em estufa microbiológica a 37ºC por 24 horas.
Segunda etapa:
- Observar as colônias formadas nas placas e realizar coloração de Gram.
- Se a bactéria for Gram-positiva utilizar catalase, coagulase e manitol.
- Se a bactéria for Gram-negativa utilizar TSI, indol, VM, VP, Citrato, caldo ureia
ou Rugai.
- Repicar algumas das colônias características no tubo com água peptonada,
agitar no vórtex. Com o suabe, semear deste caldo uma alíquota sobre toda a
superfície do agar Mueller-Hinton, esperar secar a superfície e logo em seguida
adicionar os discos com antibiótico, incubar a 37ºC por 24 horas.
Terceira etapa: leitura e interpretação dos testes (identificação do gênero ou
espécie bacteriana) e determinação do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos.

Questões:
a. Cite os resultados dos testes bioquímicos de identificação:
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________

25
 _________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
b. Qual foi o microrganismo identificado na amostra (leite da vaca com
mastite)? Este é um microrganismo contagioso, ambiental ou
oportunista ? _______________________________________________

c. Qual foi o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos deste isolado ?

_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
d. Identifique as estratégias adotadas pela célula bacteriana para ser
resistente aos antibióticos:

( ) Bloqueio da entrada.
( ) Modificação do alvo.
( ) Inativação enzimática.
( ) Superprodução do alvo.
( ) Bomba de efluxo.

e. Com base nos seus dados quais recomendações você faria ao

proprietário do animal ?
__________________________________________________________
__________________________________________________________
26
 __________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________

f. Encontre as respostas:

27
 g. Algumas bactérias também são conhecidas por serem multirresistente e
produtoras de biofilmes. Na figura abaixo indique a sequência correta da
formação de um biofilme.

a. ( ) Colonização primária
b. ( ) Dispersão das células
c. ( ) Adesão de células de
múltiplas espécies.
d. ( ) Maturação e formação de
mosaicos clonais.
e. ( ) Adesão
f. ( ) Crescimento, divisão celular
e produção de exopolissacarídeo.

5. Microcultivo de fungos

Até o momento mais de 100 mil espécies de fungos já foram relatadas,

entretanto somente algumas centenas são conhecidas por serem patogênicas. A
micologia ou micetologia é a ciência que estuda os fungos. Os fungos unicelulares
são denominados de leveduras, e os multicelulares de bolores e cogumelos.
Podem possuir em sua parede celular substâncias como quitina, quitosana,
glucana e manana. Os bolores constituem uma das formas mais primitivas de
fungos. Seu sistema vegetativo consiste tipicamente de filamentos, septados ou
não, denominados hifas. O conjunto de hifas forma o micélio.
Os fungos se reproduzem de várias formas, sendo que os esporos de
origem assexuada representam a forma mais comum de multiplicação. Isto implica
que os fungos (bolores), em função das espécies, apresentam esporos e corpos de
frutificação com estruturas definidas. A classificação tem sido tradicionalmente
dependente de características morfológicas e de reprodutivas.
Possuem uma grande habilidade de se adaptar e crescer, nos mais
variados sistemas e meio ambientes. Já foram isolados, por exemplo, de
reservatórios de água destilada e tanques de combustíveis. Resistem a diferentes
variações de pH, sendo que algumas espécies toleram o crescimento em pH 2.0
ou 8.5, habitualmente os fungos crescem em pH mais ácido. É difícil encontrar um
28
 material que não tenha sido substrato para o crescimento de fungos. São capazes
de crescer em temperaturas de 22-30ºC, mas também existem os termófilos e até
psicrófilos que se desenvolvem em temperaturas de -10°C.
Estes fatos demonstram a grande versatilidade dos fungos, que podem ser
utilizados para fins benéficos (degradação da celulose; produção de aroma em
produtos cárneos a partir da degradação de lipídeos; panificação; indústria do
etanol, etc..), representar um risco a saúde do consumidor (micotoxinas) ou
mesmo causar doenças no animais, como as dermatofitoses (Tabela 1).

Tabela 1. Principais Grupos de fungos importantes em Medicina Veterinária.

Dermatófitos Fungos Dimórficos Espécies de Leveduras Produtores de Zigomicetos
Aspergillus sp. micotoxinas
Causam Filamentosos no Infecções Comensais na Micotoxinas em Saprófitos
dermatofitoses no ambiente e oportunistas e pele e mucosas. plantações, grãos, (decompositores
homem e nos leveduriformes no micotoxinas. Infecções ração , solo). Infecções
animais. hospedeiro. Infecções oportunistas. armazenada, oportunistas.
oportunistas no homem resíduos e
e nos animais. pastagens.

Objetivos
Cultivar uma espécie fúngica (bolor), e observar sua morfologia.
Materiais
• Placas de Agar Sabouraud
• Placas de Petri com papel filtro, suporte, lâmina e lamínula.
• Água destilada autoclavada
• Inóculo ou pêlos contaminados
• Lâmina de bisturi

Execução
a) Abrir a placa de petri com todos os materiais próximo ao bico de
bunsen.
b) Cortar o Agar sabouraud (quadrado) e colocar os pêlos ou inóculo.
c) Colocar o pedaço de Agar entre a lâmina e a lamínula (sanduiche).
Conforme o desenho abaixo.
d) Colocar a lâmina sobre o suporte da placa de petri, molhar o papel e
vedar. Incubar em temperatura ambiente, ao abrigo da luz, por até 30
dias. Após o crescimento adicionar um mL de formol ao papel e vedar
bem a placa por dois dias. O vapor inativa o fungo e fixa as estruturas
microscópicas.

29
 Figura 3. Esquematização de preparo do microcultivo de fungo.

Questões
1. Desenhe e identifique o que foi observado.

2. O que são conídeos? Como um conídeo difere de uma hifa? E de um micélio ?

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

30
 3. Identifique as seguintes estruturas indicadas abaixo:

A.______________________
B.______________________
C.______________________
D.______________________
E.______________________
F.______________________

A.______________________
B.______________________
C.______________________
D.______________________
E.______________________
F.______________________
G.______________________

31
4. Certas espécies fúngicas podem
se comportar como fungos
dimórficos, portanto indique a Blastomyces dermatidis

correspondência correta:

a. Fungo filamentoso
b. Levedura

Coccidiodes immitis

Histoplasma capsulatum

Paracoccidioides brasiliensis

32
4. Encontre as respostas corretas:

33
7. Microrganismos Fermentadores

Muitos alimentos são produzidos com o auxílio

de microrganismos (bactérias, fungos), principalmente
através da fermentação, por exemplo os pães e as bebidas
fermentadas (cerveja, vinho, vinagre etc.), além
logicamente da importante cadeia produtora do etanol
(Figura 1). Geralmente esta fermentação é realizada por
fungos unicelulares denominados de leveduras. As
linhagens de leveduras para a fabricação de cervejas
são de dois tipos: de fermentação alta (distribuem-se Figura 1. Microrganismos utilizados na produção
de alguns alimentos.
uniformemente no mosto em fermentação sendo levadas
para a superfície pelo CO2 gerado) e de fermentação baixa (depositam-se no fundo
do tanque).
• Saccharomyces carlsbergensis (fermentação baixa): produção de
cervejas claras.
• Saccharomyces cerevisiae (fermentação alta): produção de ales.
Outras diferenças são o tempo e a temperatura da fermentação.
A produção é realizada a partir de grãos maltados. Bebidas tipicamente
derivadas do malte incluem as cervejas e suas variações. É o processo
de fermentação que determina os perfis sensoriais e as particularidades de
cada tipo de cerveja. Tradicionalmente, agrupamos as cervejas em três grandes
famílias que contém estilos diferenciados: lager, ale e lambic. O malte é preparado
a partir de grãos de cevada germinados, e contém enzimas naturais que digerem o
amido dos grãos convertendo-o em açúcar. Portanto, a fabricação do mosto é feita
extraindo-se açúcares fermentáveis e nutrientes, para as leveduras, a partir de
malte, açúcar e lúpulo (sabor, antioxidante, bacteriostático). Em seguida é
realizada a fermentação pelas leveduras.

Objetivos
Observação microscópica de células de leveduras fermentadoras
(Saccharomyces cerevisiae) utilizadas na produção de cerveja.

34
 Materiais
• Azul de metileno
• Solução fisiológica estéril
• Mosto em fermentação
• Lâminas e lamínulas

Execução:
- Flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois lados,
cortando lentamente a chama do bico de Bunsen.
- Flambar a alça de repicagem ao rubro e, a seguir, deixá-la esfriar,
conservando-a perto da chama.
- Tomar o tubo com o mosto/malte, agitar, remover o tampão e flambar a boca
do tubo.
- Com a alça de repicagem pegar uma alíquota da suspensão e depositar no
centro de uma lâmina.
- Pingar uma gota de azul de metileno e sobre a lâmina colocar uma lamínula.
- Observar ao microscópio na objetiva de 40x.

Questões:
a. Desenhe abaixo os microrganismos visualizados e identifique as
estruturas morfológicas da célula:

( ) Membrana celular
( ) Mitocôndria
( ) Vacúolo
( ) Grânulo de gordura
( ) Complexo de Golgi
( ) Botão de brotamento
( ) Filamento de actina
( ) Retículo endoplasmático
( ) Núcleo
( ) Parede celular
( ) Vesículas

35
8. Microbiologia do Rúmen

Os ruminantes possuem um órgão digestório denominado rúmen, que é

especializado na digestão da celulose. Os microrganismos do rúmen (bactérias,
fungos e protozoários) produzem ácidos graxos voláteis (AGV) que são
utilizados pelos animais. Além disso, esses microrganismos produzem
vitaminas e aminoácidos essenciais, sendo também fontes importantes de
proteína para o animal (Figura 1).

Figura 1. Fisiologia e microbiota do rúmen.

Pelo fato de o ambiente neste local ser anóxico, os microrganismos

predominantes são anaeróbios. Muitas bactérias que estão no rúmen, como o
Fibrobacter succinogenes e o Ruminococcus albus hidrolisam a celulose
em açucares, fermentando-os em AGV. Fibrobacter succinogenes é um
bastonete Gram negativo e produz celulase periplasmática, dessa forma deve
permanecer aderida as folhas enquanto as digerem. Ruminococcus albus é
Gram positivo e excreta uma celulase (uma exoenzima) que degrada a celulose
externamente à célula bacteriana.
Quando se muda a dieta dos animais, de uma fonte de forragens para
uma dieta rica em amido (grãos), haverá o desenvolvimento de bactérias que
degradam o amido como o Ruminobacter amylophilus e Succinomonas
amylolytica. Se um animal é alimentado com feno de leguminosas, rico em
pectina, a bactéria que digere a pectina, Lachnospira multiparus, torna-se um
36
 membro abundante na comunidade microbiana ruminal. E assim como num
ciclo, muitos produtos da fermentação serão utilizados por outras bactérias, as
fermentadoras secundárias.
A alteração da microbiota do rúmen pode inclusive causar doenças e até
a morte do animal. Se a dieta de uma vaca leiteira altamente produtora for
modificada de forragens para grãos, de maneira abrupta, ocorre um
crescimento explosivo de uma bactéria chamada Streptococcus bovis. Esta é
uma bactéria láctica, ou seja seu metabolismo fermentativo eleva as
concentrações de ácido láctico no rúmen, causando acidificação (o pH diminui
para menos de 5,5) com inflamação do epitélio, sangramento e infecções por
outras bactérias, consequentemente ocorre a paralisação das atividades do
rúmen.

Objetivos
Observação microscópica a fresco e fixada simples da microbiota rumenal.

Materiais
• Azul de metileno
• Coloração de Gram
• Solução fisiológica estéril
• Lâminas e lamínulas

Execução:
- Flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois lados,
cortando lentamente a chama do bico de Bunsen.
- Flambar a alça de repicagem ao rubro e, a seguir, deixá-la esfriar,
conservando-a perto da chama.
- Tomar o tubo com o conteúdo rumenal, remover o tampão e flambar a boca
do tubo.
- Com a alça de repicagem pegar uma alíquota da suspensão e depositar no
centro de uma lâmina.
- Pingar uma gota de azul de metileno e sobre a lâmina colocar uma lamínula.
- Observar ao microscópio na objetiva de 40x.
- Fazer um esfregaço, fixar e corar pelo método de Gram. Observar na objetiva
de 100x.

37
 Questões:
a. Desenhe abaixo os microrganismos e estruturas visualizadas:

9. Bactérias lácteas

As bactérias ácido-láticas
(BAL) constituem um grupo diverso de
microrganismos associados a carnes,
leites e plantas. São bastante
empregadas na produção de alimentos
fermentados, como os laticínios
Figura 1. Produtos lácteos.
(iogurte, queijos, manteiga) (Figura 1,
Figura 2). São Gram-positivas e microaerófilas ou estritamente anaeróbias. Os mais
importantes gêneros desse grupo são Lactobacillus sp., Lactococcus sp.,
Streptococcus sp., Pediococcus sp., Leuconostoc sp., Bifidobacterium sp., dentre
outras.
As BAL são consideradas o maior grupo de bactérias com ação probiótica.
Presentes normalmente nos alimentos após o processamento, tendo uma ação
benéfica, pois contribuem para inibir ou retardar a multiplicação de bactérias
patogênicas ou deteriorantes. Esta bio-preservação é devido a produção de
substâncias chamadas de bacteriocinas pelas BAL, um peptídeo antimicrobiano que
apresenta atividade antimicrobiana sobre um amplo espectro de bactérias (Figura 3).
Esses microrganismos também compõem um importante grupo de
alimentos, os alimentos funcionais (suplementos alimentares que podem trazer
benefícios a saúde do hospedeiro). Um dos principais metabólitos produzido por elas

38
é o ácido láctico e ele é o responsável por diminuir o pH do meio, inibindo a
viabilidade de bactérias patogênicas. Devido à grande importância econômica das
bactérias lácticas para a indústria de fermentação, os estudos sobre a fisiologia,
bioquímica, genética e biologia molecular desses microrganismos tiveram um avanço
significativo.
De acordo com o produto do metabolismo da glicose, são classificadas em
homoláticas (processo no qual o ácido láctico é o único produto da fermentação da
glicose) ou heteroláticas (além de ácido lático produzem dióxido de carbono, ácido
acético e etanol; importantes na formação de aroma e sabor). Embora as BAL sejam,
geralmente, consideradas seguras, a sua capacidade de produção de compostos
tóxicos também deve ser levada em consideração, por exemplo o gênero
Enterococcus sp. é membro da comunidade de BAL e o seu emprego ainda é
controverso, devido à presença de genes virulência em algumas espécies.

Figura 2. Acidificação do leite e agregação da caseína.

A B

Figura 3. Mecanismo de ação das bacteriocinas. a Ação sobre bactérias Gram-positivas. b. Ação
39
sobre bactérias Gram-negativas.
Objetivos: Observar Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Bastonetes Gram-
positivos; homofermentativa) e Streptococcus thermophilus (Cocos Gram-positivos;
homofermentativa) no iogurte.
Materiais:
• Azul de metileno
• Iogurte
• Álcool
• Solução fisiológica estéril
• Lâminas e lamínulas
Execução:
• Coloque uma gota de iogurte em uma lâmina, em seguida coloque uma gota
de solução salina e espalhe. Fixe levemente na chama.
• Adicione uma gota de álcool e espere secar.
• Core com azul de metileno, aguarde 3 minutos e lave a lâmina.
• Espere secar naturalmente.
• Em seguida coloque uma gota de óleo e feche a lâmina com uma lamínula.
• Para visualizar observe na objetiva de maior aumento utilizando o óleo de
imersão em cima da lamínula.

Questões:
a. Desenhe abaixo os microrganismos e estruturas visualizadas:

b. São bactérias ácido láticas (BAL):

( ) Staphylococcus aureus ( ) Lactobacillus casei subsp

( ) Salmonella sp. casei
( ) Escherichia coli ( ) Brucella bovis
( ) Lactobacillus ( ) Leuconostoc sp.
delbrueckii subsp bulgaricus ( ) Lactococcus sp.
( ) Streptococcus thermophilus ( ) Clostridium tetani
( ) Streptococcus bovis ( ) Pediococcus sp.
( ) Pseudomonas aeruginosa ( ) Bifidobacterium sp.

40
10. Virologia e Contagem de Placas de Lise
Os vírus são elementos genéticos incapazes de replicarem-se
independentemente de uma célula viva, denominada célula hospedeira. Os
vírus, portanto, são parasitas intracelulares obrigatórios, que dependem da
penetração em uma célula viva para realizarem seu ciclo de replicação.
Contudo, os vírus possuem sua própria informação genética, sendo, desse
modo, independentes do genoma da célula hospedeira. No entanto os vírus têm
forma extracelular, a partícula viral, que os permite sobreviver fora do
hospedeiro por longos períodos, facilitando sua transmissão.
Os vírus, assim como os plasmídeos, utilizam a maquinaria metabólica
da célula hospedeira. Portanto podem conferir novas propriedades à célula, esta
nova condição pode ser ruim a célula (destruição) ou até pode ser benéfica
(aquisição de genes produtores de toxinas, tabela 1). Os vírus são os
“microrganismos” mais numerosos em nosso planeta, infectando todos os tipos
de organismos celulares (mamíferos, plantas, insetos, bactérias). Os cientistas
estudam os vírus, devido as informações que eles podem fornecer em relação à
genética e bioquímica, e no caso de alguns deles ao desenvolvimento de
doenças nos animais e no homem.

Tabela 1. Alguns fatores de virulência carregados por fagos.

Fator de virulência Bacteriófago Bactéria
Toxina botulínica C1 Clostridium botulinum
Toxina shiga ɸ361 Escherichia coli
Enterotoxina A ɸ13 Staphylococcus aureus
Leucocidina PVL Staphylococcus aureus

Sabemos que todas as células contêm DNA de fita dupla como material
genético. Os vírus, por sua vez, são conhecidos por apresentarem material
genético constituído por RNA de fita simples, RNA de fita dupla, DNA de fita
simples ou DNA de fita dupla. São conhecidos muitos vírus que infectam
bactérias, eles são denominados bacteriófagos ou simplesmente fagos.
 Pelo fato de os vírus replicarem-se apenas no interior de células
vivas, seu cultivo requer o emprego de hospedeiros apropriados. A maioria
dos vírus de animais podem ser cultivados em culturas de tecidos, já para o
estudo de vírus bacterianos, são empregadas culturas puras (bactéria
receptora) em ágar semissólido (Top Agar).
Quando um vírion inicia uma infecção em uma camada de células
hospedeiras crescendo em uma superfície plana, uma zona de lise pode ser
observada na forma de uma área clara no tapete de células hospedeiras em
crescimento. Essa zona clara recebe a denominação de placa de lise, e
convencionou-se que cada placa de lise se origina a partir da replicação de
um único vírion. Contando-se o número de unidades formadoras de placas
de lise (UFP/ml) temos uma perspectiva da quantidade de partículas virais
em uma amostra.
Muitos vírus de importância veterinária, também podem ser
detectados através de exames de imunofuorescência, ou observação de
corpúsculos de inclusão no interior das células hospedeiras. Outras formas
de diagnóstico são as provas sorológicas, onde podemos detectar a
presença de anticorpos específicos no sangue dos animais.

Objetivos: Observar a replicação viral, através do cultivo em células

bacterianas receptoras, e contagem de bacteriófagos. Observação de
corpúsculos de inclusão e prova de IDGA.

Materiais:
• Top Ágar
• Pipetadores/ponteiras
• Placas de pertri com ágar nutriente/LB
• Cultura jovem de E. coli C600 (receptora)
• Cultura jovem de E. coli infectada (Bacteriófagos)
• Tubos vazios autoclavados

Execução:
1. Em um tubo vazio (autoclavado) transfira uma alíquota da cultura da
bactéria contendo o fago.
2. Em seguida transfira uma alíquota da bactéria receptora (E coli C600)
para o mesmo tubo, homogenize.
3. Agora transfira para o tubo uma alíquota de top ágar.
42
 4. Finalmente verta todo o conteúdo do tubo (E. coli doadora + E. coli
receptora + Top ágar) para uma placa de ágar nutriente, cobrindo
homogeneamente toda a superfície.
5. Incubar a 37ºC por 12 horas.

Leitura:
Após 12 horas de incubação observe a formação das placas de lise
produzidas pela multiplicação do fago.

Questões:
a. Desenhe abaixo o resultado da prática de contagem de placas de lise:

b. Desenhe abaixo as lâminas observadas:

•
Corpúsculos de Lentz em neutrófilo. Vírus Detecção do vírus da cinomose por
da Cinomose Canina. imunofluorescência em tecido do duodeno.

43
Corpúsculos de Negri. Vírus da raiva. Interprete a prova de Imunodifusão em Agar
Gel para o vírus da AIE.

c. Identifique as estruturas virais:

A. _________________________
B. _________________________
C. _________________________
D. _________________________
E. _________________________
F. _________________________
G. _________________________

44
 d. Identifique as etapas da replicação viral (bacteriófago):

A. ________________________
B. ________________________
C. ________________________
D. ________________________
E. ________________________
F. ________________________

e. Correlacione corretamente as etapas da replicação de um vírus icosaédrico não

envelopado:

( ) Liberação
( ) Tradução
( ) Adesão
( ) Desintegração
( ) Empacotamento
( ) Endocitose
( ) Transcrição
( ) Replicação do genoma

Bibliografia

BEER, J. (Coautor) Doenças infecciosas em animais domésticos. São Paulo:

Roca, 1999. 380 p.

CORRÊA, W. M.; CORRÊA, C. N. M. Enfermidades Infecciosas dos Mamíferos

Domésticos. 2º ed. Ed. Medsi, São Paulo, 1992.

HIRSH, D. C.; ZEE, Y. C. Microbiologia Veterinária. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2003. 464 p.

JAY, J. M. Microbiologia de alimentos. 6.ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. 711 p. v.

1.

KONEMAN, Elmer W.; ALLEN, Stephen. Koneman. Diagnostico

Microbiologico/Microbiological diagnosis: Texto Y Atlas En Color/Text and
Color Atlas. Ed. médica panamericana, 2008.
45
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; DUNLAP, P. V.; CLARK, D. P. 2010.
Microbiologia de Brock. 12º ed, Ed. Artmed, Porto Alegre.

MURRAY, P. R. (Coautor) Microbiologia médica. 4.ed. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2004. 762 p.

OKURA, M. H.; RENDE, J. C. 2008. Microbiologia: Roteiro de aulas práticas. Ed.

Tecmedd, São Paulo.

PANDEY, R. Microbiologia Veterinária: perspectivas clínicas e moleculares, 3.ed.

São Paulo: Roca, 1994. 214 p.

PELCZAR J. R., M. J.; CHAN E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia conceitos e

aplicações. 2.ed. Rio de Janeiro: Makron Books, 1997. 524 p. v.1. v.2.

QUINN, P. J. et al. Microbiologia Veterinária Essencial. Porto Alegre: Artmed,

2019. 2° ed. 197 p.

QUINN, P. J.; MARKEY, B.K.; CARTER, M.C.; DONNELLY, W. J.; LEONARD, F.C.
Microbiologia veterinária e doenças infecciosas.1ª ed. Porto Alegre: Ed. Artmed,
2005, 512p.

SCHAECHTER, M. et al. 2002. Microbiologia: Mecanismos de doenças

infecciosas. 3ºed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.

TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L. 2005. Microbiologia. 8º ed, Ed.

Artmed, Porto Alegre.

TRABULSI, L. R.; ALBERTHUM, F. (Eds.) Microbiologia. 5.ed. São Paulo: Atheneu,

2008, 760 p.

46