Considerações sobre

Coleta e Preparo de
Material para Ensaios
Microbiológicos em
Água
 Amostra é a
representação da
síntese do
comportamento do
universo estudado.
 Coleta de Amostras de Água

1- Planejamento da Coleta
- seleção de itinerários (acessos, tempo para coleta,
preservação de amostras e prazo para envio ao
Laboratório);
- verificação da existência de eventuais
características locais nos pontos de coleta que
exigem equipamentos ou cuidados especiais;
- preparação de check list da coleta.
2 - Considerações sobre Coleta:
2.1 Não é tarefa simples.
2.2 A amostra obtida tem que ser representativa.
2.3 Treinamento dos funcionários é fundamental
para:
a) observação e anotação de quaisquer fatos ou
anormalidades que possam interferir nas
características da amostra. (ex. cor, odor, presença
de algas, óleos, corantes, material sobrenadante,
peixes ou outros animais aquáticos mortos)
b) estabelecerem pontos de amostragem
alternativos e outros parâmetros complementares
para a caracterização das águas.
2.4 Depende da matriz a ser amostrada: água
superficial, subterrânea, rede de distribuição,
residuária, etc.

2.5 Tipo de amostragem – simples

(amostras compostas podem conter materiais
tóxicos ou nutritivos determinando resultados não
representativos da qualidade da água em um dado
momento).
 Cuidados a serem tomados em coletas para
ensaios microbiológicos:
- amostras não devem incluir partículas grandes, detritos, folhas
ou outro tipo de material acidental;
- para águas de superfície, coletar com a boca do frasco contra
corrente, mergulhando 15 a 30 cm;
- coletar volume suficiente de amostra para os ensaios que serão
realizados;
-deve ser a primeira coleta a ser realizada para evitar
contaminações;

- coletar, sempre, nos frascos específicos, observando a

preservação recomendada ao tipo de amostra;

- após coleta e preservação, colocar os frascos ao abrigo

da luz solar;

- acondicionar os frascos em caixas de isopor com gelo

(refrigeração);

- registrar as informações na ficha de coleta.

 Metodologia de coletas para
ensaios microbiológicos
As amostras podem ser coletadas em frascos ou em
bolsas plásticas estéreis (quando adequado seu uso):
a) Frascos - vidro neutro ou plástico autoclavável.

b) Sacos plásticos estéreis

Metodologia de coletas para ensaios
microbiológicos

a) Coleta com frasco:

- O frasco não deve ser completamente cheio na

coleta. Deixar um espaço vazio de cerca de 2,5 cm do
topo (ou 1/3) para facilitar a homogeinização da
amostra antes do início da análise.
-Manter o frasco fechado até o
momento da coleta.
-Remover a tampa e o papel
juntos.

-Cuidar para não haver contaminação da tampa, do

papel e do gargalo do frasco.
-Encher o frasco até o volume determinado, sem
enxaguar, colocar a tampa e fixar bem o papel
protetor imediatamente ao redor do gargalo.
-Identificar corretamente a amostra no frasco e na
ficha de coleta.
b) Coletas com bolsas (sacos) plásticos estéreis:

- Identificar no saco de coleta o número da bolsa

correspondente ao ponto de coleta.

- Remover o lacre do saco

de coleta. Evitar contato
dos dedos com a boca do
mesmo.

- Abrir puxando pelas

duas fitas laterais.
- Coletar a amostra enchendo o
saco de coleta até a segunda
marca.

- Fechar o saco de coleta e dobrar

a borda três vezes para frente.
- Dobrar as extremidades do arame
para trás.

Homogeneizar a amostra até

dissolver o comprimido de
tiossulfato de sódio contido
dentro do saco de coleta.
- Colocar amostra coletada no
suporte.

- Refrigerar.

- Preencher corretamente a
ficha de coleta.
 Metodologia para coletas
Águas potáveis:
Se a amostra coletada for de torneira do sistema de
distribuição:
- Selecionar torneira sem aeradores ou filtros, antes de
reservatórios e caixas d’água e que seja proveniente da
rede diretamente.
-Abrir bem torneira e deixar escoar durante 2 a 3
minutos ou durante tempo suficiente para eliminar
impurezas e água acumulada na canalização.
 - Reduzir o fluxo de água para permitir o enchimento do
frasco sem respingos;
 ATENÇÃO:

1 Se a limpeza da torneira for questionável, escolha outra.

2 Se isto não for viável, a desinfecção pode ser feita interna

e externamente, pela utilização de solução de hipoclorito de
sódio antes da amostragem. Após, deixar correr a água por
mais 2 ou 3 minutos antes da coleta.

3 A torneira pode ser flambada, mas atualmente não é mais

utilizado este recurso. É opcional.
 Metodologia para coletas

Águas superficiais:

- Selecionar pontos representativos da amostra

examinada.
- Evitar coletas nas margens, remansos e áreas
estagnadas ou de pouca profundidade.
- Coletar o mais próximo possível do ponto de
captação ou de interesse.
- A coleta poderá ser feita com ou sem barco.
 Metodologia para coletas

Águas de recreação:

- Amostras devem refletir a qualidade da água

na área recreacional.

- Incluir áreas periféricas, áreas de descarga

de águas de chuva e esgotos sépticos e as
áreas de maior concentração populacional.
Metodologia para coletas

Águas subterrâneas:

- Se houver torneira que possibilite a coleta

diretamente do poço, proceder como já citado.

- Se não houver torneira, coletar na torneira mais

próxima.

- Se o poço for cavado ou aberto, esgotar todo o

poço ou um volume de água 4 x o contido.
- As análises microbiológicas devem ser iniciadas assim
que possível após a coleta para evitar mudanças na
população microbiana.

- Manter as amostras à temperatura < 10ºC durante o

transporte ao laboratório (refrigeração).

- Analisar as amostras no
dia da coleta quando
possível ou manter sob
refrigeração durante a
noite.
Prazo para início dos ensaios

Água potável

Análise de Coliformes - Não exceder 30 horas

entre a coleta e o início.

Análise de Bactérias Heterotróficas - Não

exceder 8 horas entre a coleta e o início.
Prazo para início dos ensaios

Água não potável

Tempo de transporte máximo até o

Laboratório 24 horas.
 APARELHAGEM

1- Suprimentos de Laboratório
2- Equipamentos
3- Reagentes e Soluções
1- Suprimentos de Laboratório
1.1 Vidraria ou Suprimentos Plásticos

a) Frascos para coleta - vidro neutro ou plástico

autoclavável, não tóxico, resistente, boca larga e tampa
à prova de vazamento

b) Sacos plásticos estéreis - adquiridos comercialmente

já esterilizados e com ou sem agente declorador.

Obs: A vidraria pode ser testada pela verificação do pH e a existência de

resíduos inibidores no vidro ou plástico. (St. Methods 20ª ed. Seção 9020
B – 4)
c) Pipetas graduadas - com bocal para tampão de
algodão e pontas resistentes.

d) Vidraria utilizada para preparo de meios de cultura, livre

de resíduos ou materiais estranhos que possam contaminar
o meio.

e) Frascos para Água de Diluição – vidro resistente

(borosilicato) com tampa de vidro ou plástico.

f) Tubos de ensaio – vidro resistente (borosilicato) com

tampa de metal, normalmente de 18 x 180 mm, 16 x 150
mm ou 12 x 120 mm.
g) Tubos de Inversão ou
Durham – tamanho variável,
diâmetro não inferior a 40 %
do diâmetro do tubo de
ensaio.

h) Placas de Petri – Vidro

ou plástico, sem bolhas de
ar nem ranhuras, para que
o meio se distribua
uniformemente na
superfície plana.
i) Palitos de madeira - para inoculação, esterilize por calor
seco. Não mergulhar mais de 2,5 cm no tubo de
fermentação.

j) Alça de Inoculação - de platina, platina-irídio, níquel-

cromo. Com aro de diâmetro mínimo de 3 mm e cabo de
metal. Esterilize por calor seco ou na chama. Não
mergulhar mais de 2,5 cm no tubo de fermentação.
 2 Equipamentos:

2.1 Incubadora Bacteriológica ou Estufa de Incubação

a) devem manter temperatura uniforme e constante em

todas as áreas por todo tempo. Variação de ± 0,5ºC;

b) Manter termômetro, rastreável ao NIST, com bulbo imerso

em líquido (glicerina, água ou óleo mineral).

c) Também pode ser mantido um termômetro de máxima e

mínima dentro da incubadora.
Com termostato, temperatura uniforme,
circulação de ar. (35 ± 0,5)ºC.

Verificar e registrar as temperaturas

obtidas duas vezes ao dia ou quando for
utilizá-la.

Termômetro de vidro imerso em água

ou glicerol.
 2.2 Estufa para Esterilização e Secagem

• Com termostato, temperatura uniforme, circulação de

ar. (160 à 180)ºC.

• O material deve ser colocado de modo que fique um

espaço entre o material e a parede da incubadora de 2,5
cm.

• Termômetro de vidro.

• Testar performance com Bacillus subtillis e registrar.

2.3 Medidor de pH
- Equipamento com precisão de 0,1 unidades de pH.
 2.4 Balança
- Analítica com sensibilidade de, no mínimo, 0,1 g até
150 g.

2.5 Refrigerador
- Armazenamento de amostras, meios de cultura,
reagentes, etc.
Atenção:
a) Não estoque solventes voláteis, comidas ou
refrigerantes no refrigerador com meios de cultura.
b) Freezer - pode causar desidratação excessiva dos
meios, se estocados por mais de 1 semana.
2.6 Equipamento de Filtração
Escolher materiais como inox, vidro ou plástico
autoclavável.
2.7 Caixas de aço
inoxidável
(para esterilização de
pipetas e placas de Petri).
 2.8 Autoclave
Registrar itens esterilizados,
temperatura, pressão e tempo de
cada corrida.

Se possível, segregar
equipamentos para que efetuem
descarte de material ou
esterilização.
 Semanalmente, testar e
e tro registrar a temperatura
rmôm a
Te áx im de operação com
de M termômetro.

Mensalmente, testar performance

com Bacillus stearothermophilus e
registrar.
Anualmente, inspecionar os vasos de
pressão e calibrar o manômetro.
2.9 Lâmpada UV

Mensalmente desconectar do suporte e limpar com

pano macio com etanol.
 2.10 Banho-Maria

Deve manter a temperatura constante

(35 ± 0,5)ºC ou (44,5 ± 0,2)ºC.
Manter a cuba limpa.
2.11 Seladora de Cartelas para Método do
Substrato Enzimático

Borracha para adaptação das cartela é específica.

2.12 Bico de Bunsen

2.13 Tripé e Tela de Amianto

 2.14 Contador de Colônias

Com lupa e lâmpada que

auxiliam a contagem.

Com registrador para as

contagens.
 2.15 Bancada de Fluxo Laminar Vertical

Realizar controles ambientais com plaqueamento.

Registrar o número de horas de uso, porque o

filtro e a lâmpada possuem vida útil estabelecida
pelos fabricantes.
 3 Reagentes e Soluções

3.1 Agentes Decloradores

3.1.1 Solução a 10 % de Na2S2O3 – Tiossulfato de

Sódio

3.1.2 Solução a 3% de Na2S2O3

3.2 Detergente para limpeza do material

São substâncias orgânicas sintéticas com ação

limpadora.

Suas propriedades são:

- diminuem a tensão superficial
- ação umectante
- emulsificantes
- dispersantes na formação da espuma
 Para uso em bacteriologia, os detergentes:

Devem ser neutros.

Não devem ser tóxicos aos microrganismos.

Não devem ser nutritivos para favorecer o

desenvolvimento bacteriano.
 3.3 Agente Quelante - Solução de EDTA:

3.3.1 Preparo da solução estoque:

Pesar 0,372 g de EDTA e dissolver em um béquer contendo
cerca de 500 mL de água destilada. Ajustar o pH para 6,5.
Transferir para balão volumétrico e elevar a 1000 mL com
água destilada ou deionizada (decisão do laboratório).

3.3.2 Preparo da solução de uso:

Diluir 150 mL da solução estoque em 1000 mL de água
destilada ou deionizada.
Utilizar 0,3 mL da solução de uso para frascos de 120 mL
ou combinar com a sol. de Na2S2O3 antes da adição.
3.4 Água grau reagente utilizada em microbiologia

Deve ser livre de substâncias orgânicas e inorgânicas,

sejam tóxicas ou nutritivas, que possam influenciar no
ciclo de vida dos microrganismos.

Fatores que influenciam a qualidade da água:

- tipo de destilador / deionizador
- origem da água
- condições da coluna de troca iônica
- local de armazenamento da água antes do uso
Fontes prováveis de contaminação da água:

- íons metálicos do sistema de destilação

- hidróxido de amônio, ácido clorídrico e vapores
produzidos no Laboratório
- cloro
- microrganismos
- algas
Controles semanais:
- Condutividade específica - < 2 µmhos/cm à 25ºC
- pH - entre 5,5 e 7,5

Controles mensais:
- Contagem de bactérias heterotróficas - < 1000 UFC / mL
- Cloro residual livre - < 0,01 mg/L Cl2
- Nitrogênio amoniacal e orgânico - < 0,10 mg/L

Controles anuais:
- Metais pesados, total - < 0,10 mg/L
 ATENÇÃO
O Laboratório deve estabelecer critérios
para realização da limpeza dos
equipamentos de produção de água.

A limpeza deve abranger os recipientes

usados para receber e/ou armazenar a
água produzida.
3.5 Água de Diluição para Bacteriologia

3.5.1 Solução 1
Dissolver 34,0 g de KH2PO4 (dihidrogeno fosfato de
potássio) em 500 mL de água grau reagente. Ajuste o pH
para 7,2 ± 0,5 e diluir a 1 L com água.

3.5.2 Solução 2
Dissolver 81,1 g de MgCl2.6H2O (cloreto de magnésio hexa
hidratado) em 1000 mL de água grau reagente.
3.5.3 Solução de Uso
Adicionar 1,25 mL da solução 1 e 5,0 mL da solução 2
em 1 litro de água grau reagente.

Dispensar em frascos para água de diluição volume

suficiente para, ao final da autoclavação, obter volume
de 99 ± 2,0 mL ou 9 ± 0,2 mL .
3.6 Água Peptonada

Preparar solução a 10 % de peptona em água destilada.

Dispensar em frascos para água de diluição volume

suficiente para, ao final da autoclavação, obter volume
de 99 ± 2,0 mL ou 9 ± 0,2 mL .

Não deixar qualquer suspensão de bactéria em

água de diluição por mais de 30 minutos. Pode
haver morte ou multiplicação.
3.7 Meios de Cultura

As especificações dos meios de cultura e as formas de

preparo, são descritas em cada técnica ou metodologia.
PREPARO DE MATERIAL

1- Preservação
2- Limpeza do material
3- Esterilização
 1- Preservação das amostras para
ensaios microbiológicos:

1.1 Objetivo - retardar a ação biológica e/ou

preservar organismos, evitando ou
minimizando alterações morfológicas e
fisiológicas.

Após a coleta, a refrigeração é requerida.

 1.2 Amostras com residual de cloro

Na2S2O3 como agente declorador - neutraliza

residuais de cloro livre e previne a continuação da
ação bactericida durante o transporte da amostra.

a) amostras de efluentes clorados - 0,1 mL de sol.

10% de Na2S2O3 , em frasco de 120 mL neutraliza
cerca de 15 mg/L de cloro.

b) amostras de água de rede de distribuição (ou

potáveis) - 0,1 mL de sol. 3% de Na2S2O3 em frasco
de 120 mL neutraliza mais de 5 mg/L de cloro
residual.
1.3 Amostras com metais acima de 1,0 mg/L
(cobre e zinco)
e
Amostras de esgoto com alta concentração de
metais pesados

Adicionar agente quelante (EDTA) para reduzir a

toxicidade dos metais.
Esta preservação é muito importante quando o prazo
para o início do ensaio é de 4 horas ou mais.
1.4 Após a adição dos preservantes, os frascos
devem ser fechados com as tampas de vidro
recobertas por papel alumínio ou papel Kraft.

1.5 Esterilizar em estufa a 170ºC por 1 hora.

1.6 Armazenar, no máximo, durante 2 semanas

após a esterilização em local limpo e livre de
poeira.
 2- Limpeza do Material

2.1 Descontaminação prévia do material -

realizada antes da lavagem dos materiais usados no
ensaio.
Garante segurança dos responsáveis pela lavagem e
evita a contaminação dos corpos receptores.

Usual é autoclavação a 121ºC por 30 minutos.

Materiais resistentes, escolher outro processo.

 2.2- Lavagem

Operação de limpeza que pode ser manual ou

mecânica.

Visa remover resíduos que permaneçam aderidos ao

material após o uso.

Deve-se testar o detergente a ser usado registrando

todos os testes realizados.
 2.3 Enxágüe

Após a lavagem do material, deve ser feito um

enxágüe bem eficiente do material, para
eliminar resíduos de detergente nos mesmos
 3 Esterilização do material

Processo pelo qual são destruídos todos os

organismos vivos presentes em um
determinado meio ou material (vírus,
protozoários e formas vegetativas ou
esporuladas de bactérias e fungos).
 3.1 Esterilização por
calor seco
Material exposto ao ar quente.

Microrganismos morrem por

desnaturação de proteínas.

Realizada em estufas de
esterilização.

Exposição do material por 1 ou

2 horas à (160 - 180) ºC.
3.2 Esterilização por calor úmido

Material exposto ao ar quente.

Microrganismos morrem por

desnaturação de proteínas.

Autoclavação.

Exposição do material por à

121 ºC e pressão de 1,0 atm.
3.3 Esterilização por radiações ultravioleta

Morte dos microrganismos por destruição

fotoquímica dos ácidos nucléicos.

Operação segundo
instruções do
fabricante.
 3.4 Esterilização por microondas

Material é exposto à freqüência de 2450 MHz.

 Referências Bibliográficas:

1 Standard Methods for Examination of Water

and Wastewater - 20ª edição - 1998 - AWWA

2 Guia de Coleta e Preservação de Amostras de

Água - 1ª edição - 1987 - CETESB

3 Manual de Ensaios Microbiológicos e

Metodologia de Análise - 1997 -
DMAE/CORSAN/FEPAM
 AGRADECIMENTOS

Aos Colegas do Setor de Biologia do DEAL

/ CORSAN, em especial à Solange Corrêa.
À Rede Metrológica do RS pelo convite.
 Contato:

Andréa Vidal dos Anjos

andrea.anjos@corsan.com.br
fone: (51) 33345794 ramal 5758