Coleta

Seção 9060 A PAGINA 1105

3.1.1- Água Potável
Ao analisar água potável para determinar se sua qualidade atende aos padrões da EPA
dos EUA, uma amostra de 100 mL deve ser analisada; use a técnica de fermentação com
10 tubos replicados, cada um contendo 10 mL, 5 tubos replicados, cada um contendo 20
mL, ou um único frasco contendo uma porção de amostra de 100 mL. Ao examinar a
água potável através da técnica de fermentação, processe todos os tubos ou garrafas que
demonstrem crescimento - com ou sem reação ácida ou gasosa positiva - durante a fase
confirmada (9221 B.4). Amostras de água potável positivas para coliformes totais
também devem ser testadas para coliformes termotolerantes (fecais) (9221 E) ou
Escherichia coli (9221 F).
3.1.2- Água Não Potável
Ao analisar águas não potáveis, inocular uma série de tubos com diluições decimais
apropriadas da água (múltiplos de 10 mL) com base na provável densidade de
coliformes. Use as fases presumivelmente confirmadas do procedimento de tubos
múltiplos. Use o teste concluído mais trabalhoso (9221 B.5) como medida de CQ em
10% (ou uma porcentagem definida) de amostras de água não potável positivas para
coliformes trimestralmente. Geralmente, o objetivo da análise de água não potável é
estimar a densidade bacteriana, determinar uma fonte de poluição, impor padrões de
qualidade da água ou rastrear a sobrevivência de microrganismos. A técnica de
fermentação em tubos múltiplos pode ser usada para obter estimativas estatisticamente
válidas de Teste do Número Mais Provável (NMP) da densidade de coliformes.
Examine um número suficiente de amostras de água para produzir resultados
representativos para a estação de amostragem. Geralmente, a média geométrica ou o
valor mediano dos resultados de um número de amostras produz um valor no qual o
efeito da variação de amostra para amostra é minimizado.

3.1.3- Amostras sólidas ou semissólidas

Pese a amostra e adicione diluente para fazer uma diluição de 10 -1. Por exemplo,
coloque 30 g de amostra em um copo misturador estéril, adicione 270 mL de solução
tamponada com fosfato estéril ou água de diluição com peptona a 0,1% e misture por 1
a 2 minutos em alta velocidade (8.000 rpm). Prepare as diluições decimais apropriadas
da pasta homogeneizada o mais rápido possível para minimizar a sedimentação.
3.1.4- Outras Amostras
A técnica de fermentação em tubos múltiplos aplica-se à análise de águas salgadas ou
salobras, bem como lamas, sedimentos. Colete amostras conforme indicado na Seção
9060 A, usando recipientes de amostras especificados na Seção 9030 B.19. Siga as
precauções fornecidas acima sobre o tamanho das porções e o número de tubos por
diluição.
Seção 9060 A.2 recipientes de amostra
d. Frascos de amostra: Use frascos de vidro borossilicato ou plástico de boca larga,
reutilizáveis, não reativos e autoclaváveis, com tampas de rosca sem forro ou com
forros inertes, ou então frascos plásticos esterilizados comercialmente preparados ou
sacos com laços de tamanho suficiente. Os frascos ou sacos devem ser grandes o
suficiente para coletar a amostra necessária e ainda ter um espaço livre adequado (1
pol.) para permitir que a amostra seja agitada no recipiente.
c. Garrafas de água de diluição: Use garrafas com capacidade de 99 mL e feitas de vidro
borossilicato não reativo e autoclavável ou plástico com tampas de rosca sem
revestimento ou com revestimentos inertes. Limpe antes de usar. Garrafas
comercialmente disponíveis pré-cheias com água de diluição são aceitáveis. Antes de
utilizar cada lote ou lote, realize teste de esterilidade (9020B.9d); verifique um por lote
ou uma porcentagem definida (por exemplo, 1 a 4%) para pH e volume (99,2 mL).
Examine as garrafas de água de diluição em busca de precipitado; descarte se estiver
presente. Limpe novamente as garrafas com ácido, se necessário, e refaça a água de
diluição. Se o precipitado se repetir, compre frascos de uma fonte diferente. Verifique
novamente o volume em intervalos regulares para determinar a taxa de perda de volume
sob condições de retenção. Descarte até a data de validade.
2. Descloração Adicionar agente redutor aos recipientes destinados à coleta de água contendo
cloro residual ou outros halogênios, a menos que contenham caldo para incubação direta da
amostra. O tiossulfato de sódio (Na2S2O3) é um agente de descloração satisfatório que
neutraliza qualquer halogênio residual e evita que a ação bactericida continue durante o
trânsito. Ao coletar amostras de efluentes de águas residuais cloradas, adicione Na2S2O3
suficiente a um frasco de amostra limpo para que a concentração final na amostra seja de 100
mg/L. Por exemplo, em um frasco de 120 mL, 0,1 mL de uma solução de Na2S2O3 a 10%
neutraliza uma amostra contendo até 15 mg/L de cloro residual. O agente de descloração pode
estar menos concentrado em amostras de água potável: 0,1 mL de uma solução de Na2S2O3 a
3% em um frasco de 120 mL neutraliza até 5 mg/L de cloro residual. Consulte a Tabela 9060:1
para preparação de soluções de Na2S2O3. Quando possível, determine o cloro residual típico
antes da amostragem em um novo local (por exemplo, a água da piscina pode conter um nível
de cloro mais alto do que a água da torneira) para que o laboratório possa preparar uma
quantidade adequada de agente de descloração por frasco de amostra. Descarte soluções
estoque de Na2S2O3 a 10% que estejam turvas devido ao crescimento bacteriano. Tampe
frouxamente o frasco e esterilize com calor seco ou úmido, conforme indicado (Seção 9040) e
realize verificações de esterilidade conforme indicado na Seção 9020 B.5d. Estão disponíveis
comercialmente sacos plásticos pré-esterilizados ou frascos contendo Na2S2O3 que
neutralizam até 15 mg/L de cloro residual. Verifique e registre a eficácia do agente de
descloração, um por lote ou lote (ver Seção 9020 B.5d). A eficácia do agente desclorante pode
ser verificada pelo uso de um controle de hipoclorito de sódio (NaOCl) a 5 ou 15 mg/L (ou
equivalente), por exemplo.

Seção 9030 B.19

19. Frascos de amostras
Use frascos de tamanho e formato adequados que possam conter amostra suficiente para
todos os testes necessários, com espaço de ar suficiente (pelo menos 1 pol.) para permitir a
mistura adequada e que possam ser tampados para manter as amostras não contaminadas até
que os exames sejam concluídos. .

Garrafas de boca larga são recomendadas.

Se preparar frascos de amostra internamente, use vidro não tóxico ou plástico adequado (por
exemplo, polipropileno ou polietileno linear).

Sacos ou frascos plásticos descartáveis pré-esterilizados (com ou sem agente anticloro) são
descartáveis e estão disponíveis comercialmente. A maioria dos recipientes de plástico possui
tampas plásticas sem forro, reduzindo o peso do transporte e diminuindo a possibilidade de
quebra durante o transporte.

Os frascos de amostra podem ter tampas de rosca de metal ou plástico com revestimento,
desde que nenhum composto tóxico seja produzido quando forem esterilizados.

Antes de esterilizar os frascos de amostra com tampa de vidro, cubra a parte superior e o
gargalo com papel alumínio ou papel kraft grosso.

Autoclave as tampas e os frascos separadamente. Consulte a Seção 9020 B.5d.

9060 B. Preservação e Armazenamento

1. Tempo de Conservação e Temperatura a. Geral: Inicie a análise microbiológica das amostras

de água o mais rápido possível após a coleta para evitar alterações imprevisíveis na população
microbiana. Não analise amostras comprometidas (por exemplo, vazamento, cloro residual)
submetidas ao laboratório; em vez disso, solicite uma reamostragem. Para obter resultados
mais precisos, congele as amostras durante o transporte para o laboratório se elas não
puderem ser processadas dentro de 1 hora após a coleta. Mantenha as amostras no escuro e
mantenha-as frescas, mas descongeladas (<10 °C) com gelo ou gelo azul. Não coloque as
amostras em contato direto com bolsas de gelo congeladas. Isole a amostra com plástico bolha,
papel amassado ou equivalente. As amostras que chegam rapidamente ao laboratório (dentro
de 1 hora após a coleta) podem não ter atingido esta temperatura. Após o recebimento,
verifique e registre a temperatura da amostra por meio de um frasco de amostra de água de
controle, termômetro infravermelho ou outros dispositivos equivalentes (por exemplo, botões
i). Observe os limites regulamentares de tempo de retenção, que variam para diferentes tipos
de amostras e em diferentes países. Caso os resultados possam ser utilizados em ações
judiciais, utilizar meios especiais (transporte rápido, correio expresso, serviço de correio
expresso) para entregar as amostras ao laboratório nos prazos especificados e manter a cadeia
de custódia. Se as amostras não puderem ser analisadas num laboratório dentro do tempo de
espera exigido, considere a possibilidade de criar um laboratório de campo móvel ou pré-
incubar a amostra. No parágrafo b abaixo estão exemplos de diretrizes e requisitos da EPA dos
EUA. b. Água potável para fins de conformidade: Para análises de coliformes totais e E. coli, o
tempo de espera desde a coleta até a análise é de 30 horas. Embora os regulamentos não
especifiquem uma temperatura de preservação, tente manter as amostras frias, mas
descongeladas (<10 °C) durante o transporte para o laboratório. Da mesma forma, mantenha
as amostras para análise de contagem de placas heterotróficas frias, mas descongeladas (<10
°C) e não exceda um tempo de retenção de 8 horas (coleta para análises). Não aceite nenhuma
amostra de água para análises microbiológicas que apresente evidências de congelamento.
Registre o tempo de recebimento da amostra (e a temperatura, se enviada em gelo) em um
arquivo de recebimento de amostra. Analise as amostras no dia do recebimento sempre que
possível. Se as amostras chegarem tarde demais para serem processadas no mesmo dia,
refrigere-as durante a noite se os limites de tempo de armazenamento ainda puderem ser
cumpridos. Para a análise de Cryptosporidium sp. e Giardia sp., um tempo de espera de 96
horas se aplica ao período entre a coleta e a eluição da amostra para amostras enviadas ao
laboratório a granel e ao período entre a filtração e a eluição da amostra para amostras
filtradas em campo. Certifique-se de que as amostras estejam <20 °C durante o transporte. c.
Água não potável para fins de conformidade: Mantenha água de origem, poluição de córregos,
água recreativa e amostras de águas residuais frias, mas descongeladas (<10 °C) durante o
transporte (<8 h entre a coleta e a análise laboratorial). Quando as amostras chegam ao
laboratório, refrigere-os, registre o tempo de recebimento e a temperatura em arquivos de
recebimento de amostras e processe as amostras dentro de 2 horas. Sempre que as condições
de transporte impedirem a entrega das amostras no prazo de 6 horas, considere utilizar
instalações laboratoriais de campo no local de colheita ou procedimentos de incubação
retardada. Para amostras bacterianas em lodo de águas residuais (coliformes fecais e
Salmonella sp.), o tempo de retenção regulamentar é de 24 horas. Para análises de
protozoários, ver parágrafo b acima. d. Outros tipos de água para fins de não conformidade:
Manter as amostras frias, mas descongeladas (<10 °C) entre a coleta e a análise (≤24 h).
Registre o tempo e a temperatura de recebimento da amostra nos arquivos de recebimento de
amostra.

Seção 9020 B.5d

Frascos de amostra

Use frascos de vidro borossilicato ou plástico de boca larga, reutilizáveis, não reativos e
autoclaváveis, com tampas de rosca sem forro ou com forros inertes, ou então frascos plásticos
esterilizados comercialmente preparados ou sacos com laços de tamanho suficiente.

Os frascos ou sacos devem ser grandes o suficiente para coletar a amostra necessária e ainda
ter um espaço livre adequado (1 pol.) para permitir que a amostra seja agitada no recipiente.
Limpe e esterilize os frascos antes de usar e, dependendo do uso, adicione agente de
descloração suficiente para neutralizar o cloro residual (Seção 9060A.2).

O recipiente de amostra pode ser adquirido com agente de descloração adicionado.

Teste a esterilidade em pelo menos um ou uma porcentagem definida (por exemplo, 1 a 4%) de
cada lote esterilizado em laboratório ou de cada lote pré-esterilizado adquirido de um
fornecedor. Documente os resultados. Se ocorrer crescimento, descarte todo o lote ou lote.
Verifique um por lote quanto à eficácia do agente de decloração, precisão da marca de 100 mL
(se presente) e propriedades de autofluorescência (se usado para testes de fluorescência).
Registre os resultados.

9050 pag 1103

Seção 9020 B.5

5. Suprimentos de Laboratório Guarde registros e certificados do

fabricante de análise, pureza ou nível de tolerância (se fornecido) para
todos os suprimentos de laboratório. a. Vidraria: Aqui, o termo vidraria
refere-se tanto ao vidro borossilicato quanto aos materiais plásticos
resistentes ao calor. As marcações devem ser legíveis. Vidrarias
volumétricas, pipetas, provetas graduadas e béqueres com marcas de
calibração devem ter precisão de acordo com as tolerâncias volumétricas
especificadas. Consulte os padrões estabelecidos24 para calibração de
aparelhos volumétricos de laboratório. A vidraria volumétrica é
geralmente Classe A ou Classe B (não designada); A classe A é mais
precisa. Determine a tolerância uma vez por lote ou em uma porcentagem
definida (por exemplo, 1 a 2,5%). Os cilindros graduados devem ter uma
precisão de 2,5%. Antes de cada uso, examine a vidraria e descarte itens
com bordas lascadas ou superfícies internas gravadas – especialmente
frascos de diluição com tampa de rosca e frascos com bordas lascadas que
podem vazar e contaminar a amostra, o analista e a área. Após a lavagem,
inspecione os vidros quanto a formação excessiva de gotas de água,
manchas e turvação e lave novamente ou descarte, se necessário.
Substitua os vidros com escrita excessiva se as marcas não puderem ser
removidas. Armazene os vidros cobertos ou de cabeça para baixo para
evitar que a poeira se acumule dentro deles. Se a vidraria estiver sendo
usada para detecção de fluorescência [ou seja, com meio EC 4-
metilumbeliferil-D-glicuronídeo (ECMUG)], verifique se há
autofluorescência antes de usar. Realize os seguintes testes para vidrarias
limpas: 1) pH—Como algumas soluções de limpeza são difíceis de remover
completamente, verifique lotes de vidrarias limpas quanto à reação do pH,
especialmente se estiverem embebidas em álcali ou ácido. (Um lote é
composto por toda a vidraria lavada na mesma carga.) Para testar a
vidraria limpa quanto a resíduos alcalinos ou ácidos, adicione algumas
gotas de azul de bromotimol 0,04% (BTB) ou outro indicador de pH à
vidraria seca e observe a reação da cor. Se não houver resíduo, a reação
deverá ser neutra (azul esverdeado para azul de bromotimol). No entanto,
se o indicador ficar amarelo (residual ácido) ou azul profundo (residual
alcalino), então a vidraria deverá ser lavada novamente e testada
novamente. Se o novo teste indicar um problema, revise o equipamento
de lavagem, os procedimentos e o detergente utilizado.
Use reagentes preparados comercialmente ou em laboratório para esta
verificação de pH. Para preparar solução de BTB a 0,04%, adicione 16 mL
de NaOH 0,01N a 0,1 g de BTB e dilua para 250 mL com água reagente. 2)
Resíduos inibitórios – O objetivo principal deste teste é determinar se o
procedimento de lavagem do laboratório deixa uma substância inibitória
na vidraria. Certos agentes umectantes ou detergentes podem conter
substâncias bacteriostáticas, inibitórias ou estimuladoras que podem levar
de 6 a 12 enxágues para serem removidas. Se cada lote de vidraria for
testado quanto ao pH, esse teste só será necessário ao alterar os
compostos ou procedimentos de lavagem. No entanto, se o pH dos
utensílios de vidro não for testado de forma consistente ou se o
detergente não for de qualidade laboratorial, realize o teste de resíduos
inibitórios imediatamente antes da primeira utilização e anualmente a
partir de então. Registre os resultados. O procedimento a seguir é
adequado tanto para placas de Petri quanto para outros materiais de
vidro. a) Procedimento – Lavar e enxaguar seis placas de Petri (Grupo A) de
acordo com a prática laboratorial habitual. Lave mais seis placas de Petri
(Grupo B) como acima e depois enxágue 12 vezes com porções sucessivas
de água reagente. Lave mais seis placas de Petri (Grupo C) com água
contendo o detergente (na concentração de uso) e seque ao ar sem
enxaguar mais. Esterilize as placas dos Grupos A, B e C pelo procedimento
usual. Para utensílios plásticos pré-esterilizados, configure seis placas de
Petri plásticas (Grupo D). Prepare e esterilize 200 mL de ágar de contagem
de placas e tempere em banho-maria a 44–46°C. Prepare uma cultura de
Enterobacter aerogenes ATCC® 13048 conhecida por conter 50 a 150
UFC/mL. Testes preliminares podem ser necessários para atingir esta faixa
de contagem. Inocular três pratos de cada grupo de teste com 0,1 mL de
cultura e os outros três com 1 mL de cultura. Siga o método de contagem
de placas heterotróficas (Secção 9215B) para todas as placas inoculadas e
incube a 35°C durante 48 h. Conte placas com 30 a 300 colônias e registre
os resultados como UFC/mL. b) Interpretação dos resultados – As
contagens médias nas placas dos Grupos A a D devem diferir em 15% se
não houver efeitos tóxicos ou inibitórios. Se as contagens médias diferirem
em 15% entre os Grupos A e B e 15% entre os Grupos A e C, então o
detergente de limpeza tem propriedades inibidoras que são eliminadas
durante a lavagem de rotina. Se as contagens médias diferirem em 15%
entre os Grupos A e B, então está ocorrendo inibição porque mais colônias
cresceram quando houve enxágue adicional. Se a diferença entre B e D for
de 15%, então um resíduo inibitório está presente após o processo normal
de lavagem e os utensílios de plástico não devem ser utilizados para
análises microbiológicas. Poderá ser necessário um novo procedimento de
lavagem, equipamento ou fornecimento de detergente. b. Utensílios e
recipientes para preparação de meios: Use utensílios e recipientes de vidro
borossilicato, aço inoxidável, alumínio ou outro material resistente à
corrosão (consulte a Seção 9030B.8). Não use utensílios de cobre. c.
Garrafas de água de diluição: Use garrafas com capacidade de 99 mL e
feitas de vidro borossilicato não reativo e autoclavável ou plástico com
tampas de rosca sem revestimento ou com revestimentos inertes. Limpe
antes de usar. Garrafas comercialmente disponíveis pré-cheias com água
de diluição são aceitáveis. Antes de utilizar cada lote ou lote, realize teste
de esterilidade (9020B.9d); verifique um por lote ou uma porcentagem
definida (por exemplo, 1 a 4%) para pH e volume (99,2 mL). Examine as
garrafas de água de diluição em busca de precipitado; descarte se estiver
presente. Limpe novamente os frascos com ácido, se necessário, e refaça a
água de diluição. Se o precipitado se repetir, compre frascos de uma fonte
diferente. Verifique novamente o volume em intervalos regulares para
determinar a taxa de perda de volume sob condições de retenção.
Descarte até a data de validade.
d. Frascos de amostra: Use frascos de vidro borossilicato ou plástico de
boca larga, reutilizáveis, não reativos e autoclaváveis, com tampas de rosca
sem forro ou com forros inertes, ou então frascos plásticos esterilizados
comercialmente preparados ou sacos com laços de tamanho suficiente. Os
frascos ou sacos devem ser grandes o suficiente para coletar a amostra
necessária e ainda ter um espaço livre adequado (1 pol.) para permitir que
a amostra seja agitada no recipiente. Limpe e esterilize os frascos antes de
usar e, dependendo do uso, adicione agente de descloração suficiente
para neutralizar o cloro residual (Seção 9060A.2). O recipiente de amostra
pode ser adquirido com agente de descloração adicionado. Teste a
esterilidade em pelo menos um ou uma porcentagem definida (por
exemplo, 1 a 4%) de cada lote esterilizado em laboratório ou de cada lote
pré-esterilizado adquirido de um fornecedor. Documente os resultados. Se
ocorrer crescimento, descarte todo o lote ou lote. Além disso, verifique
um por lote quanto à eficácia do agente de decloração, precisão da marca
de 100 mL (se presente) e propriedades de autofluorescência (se usado
para testes de fluorescência). Registre os resultados. e. Bandejas de
múltiplos poços* e selantes: Ao usar bandejas de múltiplos poços para
estudos de crescimento, verifique previamente a esterilidade de uma por
lote adicionando assepticamente 100 mL de caldo de soja tríptico estéril
ou outro meio não seletivo, selando e incubando a 35 0,5 °C por 24 e até
48 horas. Nenhum crescimento indica esterilidade. Se os poços ficarem
muito turvos (indicando condição não estéril), poderá haver produção de
gás e explosão concomitante entre os poços. Consulte 9020B.9d. Todos os
meses, avalie o desempenho do selador térmico adicionando uma a duas
gotas de corante alimentar a 100 mL de amostra de água deionizada,
passe a bandeja de múltiplos poços pelo selador e verifique visualmente
se há vazamentos em cada poço. Limpe e realize manutenção preventiva
no selador anualmente ou com mais frequência, se necessário. As placas
de microtitulação são usadas em uma variedade de procedimentos
analíticos (por exemplo, hibridização de DNA e estudos de imunoensaio) e
podem conter 96 poços. Examine a consistência dos poços da bandeja e
realize controles de CQ apropriados, conforme indicado pelo fabricante.
Use controles de um fornecedor certificado aprovado; estes podem ser
rotulados para o sistema que está sendo testado. O laboratório pode
necessitar de desintoxicar ou esterilizar as placas se a sua utilização assim
o exigir. f. Água de grau reagente: Use água de grau reagente para preparar
soluções e meios, e para enxágues finais de vidrarias. A água deve ser
comprovadamente isenta de substâncias inibidoras e bactericidas. A
qualidade da água obtida de um sistema de purificação de água depende
do sistema e de como ele é mantido (ver 9020B.4d e e). Consulte a Tabela
9020:II para obter os limites recomendados de qualidade da água dos
reagentes para o laboratório de microbiologia. Se estes limites não forem
cumpridos, investigue e corrija ou então mude a fonte de água. NOTA: O
pH da água reagente tende a variar, mas leituras extremas indicam
contaminação química. 1) Teste de qualidade bacteriológica25 – Este teste,
também chamado de teste de adequação da água, é baseado no
crescimento de Enterobacter aerogenes ATCC® 13048 em um meio de
crescimento mínimo quimicamente definido. A presença de um agente
tóxico ou de uma substância promotora de crescimento aumentará ou
diminuirá a população de 24 horas em 20% ou mais, em comparação com
um controlo. Realize o teste pelo menos uma vez por ano, sempre que a
fonte de água reagente estiver alterado e sempre que ocorrer um
problema analítico. Este teste de qualidade bacteriológica não é
necessário para água Tipo II ou melhor [conforme definido na Seção 1080C
dos Métodos Padrão (18ª e 19ª Edições)] ou água de qualidade média ou
melhor [conforme definido na Seção 1080C dos Métodos Padrão (21ª, 22ª
e Online Edições)]. Teste para garantir a qualidade contínua desta água
para atender aos padrões de crescimento da ATCC acima. Devido à sua
complexidade e porque a maioria dos laboratórios utiliza água Tipo II ou
melhor, este teste raramente é realizado, mas pode ser usado quando
ocorre um problema analítico. O teste é complexo, requer habilidade e
experiência e não é feito facilmente e com pouca frequência. Requer
trabalho superior a 4 dias, água ultrapura de uma fonte independente
como controle, reagentes de alta pureza e frascos de cultura
extremamente limpos, placas de Petri, tubos de ensaio, pipetas e outros
equipamentos. Um laboratório contratado familiarizado com o teste pode
ser usado. a) Aparelhos e materiais – Utilize vidro borossilicato; placas de
Petri de plástico pré-esterilizadas podem ser usadas nas etapas de
plaqueamento. Enxágue os vidros em água recém-redestilada de um
alambique de vidro e depois esterilize-os com calor seco (a esterilização a
vapor recontaminará esses itens especialmente limpos). A sensibilidade e
a reprodutibilidade do teste dependem em parte da limpeza dos
recipientes de amostra, frascos, tubos e pipetas. Muitas vezes é
conveniente reservar vidrarias novas para uso exclusivo neste teste. Use
qualquer cepa de coliforme com tipo IMViC – – (E. aerogenes) obtida de
uma amostra de água ambiente ou de águas residuais ou cultura de
referência.† b) Reagentes – Use apenas reagentes e produtos químicos de
grau ACS. A sensibilidade do teste é parcialmente controlada pela pureza
do reagente. Use água de qualidade médica ou água recém redestilada de
um alambique de vidro; a água pode ser comprada (ver Tabela 9020:III).
Prepare os reagentes da seguinte forma: • Solução de citrato de sódio:
Dissolva 0,29 g de citrato de sódio (Na3C6H6O7 · 2H2O) em 500 mL de
água. • Solução de sulfato de amônio: Dissolva 0,26 g (NH4)2SO4 em 500
mL de água. • Solução de mistura de sal: Dissolva 0,26 g de sulfato de
magnésio (MgSO4 7H2O), 0,17 g de cloreto de cálcio (CaCl2 2H2O), 0,23 g
de sulfato ferroso (FeSO4 7H e 2,50 g de cloreto de sódio (NaCl) em 500
mL de água.
• Solução tampão fosfato/água de diluição: Diluir a solução estoque
tampão fosfato (Seção 9050C.1a) 1:25 em água. Filtre, esterilize ou ferva
todas as soluções reagentes de 1 a 2 minutos para matar as células
vegetativas. Armazene as soluções em frascos esterilizados com rolha de
vidro, no escuro, a 5°C, durante vários meses, desde que sejam testadas
quanto à esterilidade antes de cada utilização. Como a solução de mistura
de sal desenvolverá uma leve turbidez dentro de 3 a 5 dias à medida que o
sal ferroso se converte no estado férrico, prepare a solução de mistura de
sal sem FeSO4 para armazenamento a longo prazo. Para usar a mistura,
adicione uma quantidade adequada de sal de ferro recém-preparado e
fervido. Quando as soluções ficarem turvas, descarte-as e prepare novas.
c) Amostras – Para preparar amostras de teste, colete 150 a 200 mL de
água reagente de laboratório e água controle (redestilada) em frascos de
vidro borossilicato estéreis e ferva por 1 a 2 min. Evite ferver por mais
tempo para evitar alterações químicas. d) Procedimento – Rotule dois
frascos ou tubos A e B. Adicione amostras de água, reagentes de meio e
água redestilada a cada frasco conforme indicado na Tabela 9020:III.
Adicione uma suspensão de E. aerogenes ATCC® 13048 (tipo IMViC – – ) de
densidade tal que cada frasco contenha 30 a 80 células/mL, preparada
conforme indicado abaixo. Densidades celulares abaixo desta faixa
resultam em proporções inconsistentes, enquanto densidades acima de
100 células/mL são menos sensíveis aos nutrientes na água de teste. e)
Preparação da suspensão bacteriana - No dia anterior ao teste de
adequação de água destilada, inocular uma cepa de E. aerogenes ATCC®
13048 em um ágar nutriente inclinado de aproximadamente 6,3 cm de
comprimento em uma tampa de rosca de 125-16 mm. tubo. Riscar toda a
superfície do ágar para desenvolver uma película de crescimento contínuo
e incubar 18 a 24 horas a 35°C. f) Colheita de células viáveis – Após a
incubação, pipete 1 a 2 mL de água de diluição estéril de um branco de
água de 99 mL para a cultura. Emulsionar o crescimento inclinado por
vórtex, sonicação suave ou agitação; em seguida, pipete a suspensão de
volta para o branco de água original de 99 mL. g) Diluição da suspensão
bacteriana - Faça uma diluição de 1:100 do frasco original em um segundo
branco de água, uma diluição adicional de 1:100 do segundo frasco em um
terceiro branco de água e uma diluição de 1:10 do terceiro frasco em um
quarto branco de água. branco, agitando vigorosamente 22 vezes após
cada transferência. Pipetar 1,0 mL da quarta diluição (1:105) nos frascos A
e B. Este procedimento deve produzir um diluição final na faixa de 30 a 80
células viáveis por mililitro de solução de teste. h) Verificação da
densidade bacteriana – Variações entre cepas de um determinado
organismo, diferentes organismos, meios e área de superfície das encostas
de ágar podem exigir que o procedimento de diluição seja ajustado para
atingir uma densidade celular apropriada. Para determinar a densidade
bacteriana para um organismo e meio específico, faça uma série de
contagens de placas a partir da terceira diluição. Em seguida, escolha o
volume adequado dessa diluição, que quando diluído nos 30 mL dos
Frascos A e B, conterá de 30 a 80 células viáveis/mL. Se os procedimentos
forem padronizados quanto à área superficial inclinada e à técnica
laboratorial, é possível reproduzir resultados em experimentos repetidos
com a mesma cepa de microrganismo. Execute testes em triplicado. i)
Dificuldades processuais – Os problemas neste método podem ser devidos
a: • amostras de água de teste armazenadas em recipientes de vidro
macio ou recipientes de vidro com tampas metálicas sem revestimento; •
reagentes preparados com produtos químicos que não sejam de grau
analítico ou de fabricação recente; • reagente contaminado por água
destilada contendo níveis de fundo de bactérias (para evitar isso, faça uma
contagem em placa heterotrófica de todos os meios e reagentes antes de
iniciar o teste de adequação, como verificação da contaminação da
solução estoque); • densidade bacteriana fora da faixa de 30 a 80 células
viáveis/mL (por exemplo, diluição incorreta escolhida para contagem de
placas de 24 horas); • mistura inconsistente; • demora no vazamento das
placas; ou • amostras incubadas por mais de 26 horas, dessensibilizando
assim a resposta de crescimento. j) Cálculo – Para substâncias inibidoras
de crescimento: Proporção contagem de colônias/mL, Frasco B contagem
de colônias/mL, Frasco A Se a proporção for 0,8 a 1,2 (inclusive), não há
presença de substâncias tóxicas; se a proporção for 0,8, existem
substâncias inibidoras do crescimento na amostra de água. Um valor 1,2
indica uma fonte de nutrientes disponível para o crescimento bacteriano;
no entanto, o teste é muito sensível e a proporção pode chegar a 3,0 sem
quaisquer consequências indesejáveis. Não calcule se a primeira
proporção indicar uma reação tóxica. k) Interpretação dos resultados – A
contagem de colônias do controle, Frasco A, após a incubação dependerá
da cepa de E. aerogenes utilizada e do número de organismos inicialmente
inoculados no frasco. Portanto, execute o Frasco A para cada série
individual de testes. Se a cepa de E. aerogenes ATCC® 13048, o inóculo
inicial e as condições ambientais forem iguais, a contagem terminal deverá
ser razoavelmente constante. Por outro lado, uma diferença na inoculação
inicial de 30 a 80 resultará numa contagem final cerca de três vezes maior
para os 80 organismos se a taxa de crescimento permanecer constante.
Assim, é essencial que a contagem inicial de colônias nos frascos A e B seja
aproximadamente igual. Medidas corretivas específicas não podem ser
recomendadas para todos os casos de aparelhos de destilação defeituosos.
Inspecione cuidadosamente o equipamento de destilação e revise os
processos de produção e manuseio de água destilada para ajudar a
localizar e corrigir a causa da dificuldade. A água de alimentação de um
destilador geralmente passa por uma coluna deionizante e um filtro de
carbono. Se estas colunas forem bem mantidas, a maioria dos
contaminantes inorgânicos e orgânicos serão removidos. Se a manutenção
for deficiente, a qualidade da água de alimentação poderá ser inferior à da
água bruta da torneira. O melhor sistema de destilação é feito de quartzo
ou vidro borossilicato com alto teor de sílica e resistência térmica especial.
Alambiques estanhados não são recomendados. Para conectar o
encanamento, use aço inoxidável, vidro borossilicato ou tubos de plástico
especiais feitos de cloreto de polivinila (PVC). Proteja os reservatórios de
armazenamento contra poeira. 2) Use teste para avaliar água reagente –
Antes de usar uma nova fonte de água reagente, os analistas devem
compará-la quanto à equivalência com o lote atual em uso (lote de
referência). NOTA: Pode não ser possível comparar fontes de água
reagente porque o sistema anterior pode já não estar disponível. a)
Procedimento – Use um único lote de água de controle (água redestilada
ou destilada polida por deionização), vidraria, filtros de membrana ou
outros materiais necessários para controlar todas as variáveis, exceto o
fator em estudo. Realize testes replicados de vazamento, espalhamento ou
placa de filtro de membrana em lotes de referência e de teste (consulte as
Seções 9215 e 9222). No mínimo, analise cinco amostras de água
diferentes reconhecidamente positivas para o organismo alvo ou controles
de cultura de densidade conhecida. Análises replicadas e amostras
adicionais podem ser testadas para detectar melhor quaisquer diferenças
entre os lotes de referência e de teste. Ao analisar a água reagente, realize
os testes bacterianos quantitativos em paralelo usando uma água
conhecida de alta qualidade como a controlar a água. Prepare água de
diluição/enxágue e meio com nova fonte de reagente e água de controle.
Teste a água para todos os usos (diluição, enxágue, preparação de meios,
etc.). b) Contagem e cálculos – Após a incubação, compare as colônias
bacterianas de ambos os lotes quanto ao tamanho e aparência. Se as
colônias nas placas do lote de teste forem atípicas ou visivelmente
menores do que aquelas nas placas do lote de referência, registre a
evidência de inibição ou outro problema, independentemente das
diferenças de contagem. Conte as placas e calcule a contagem individual
por 1 ou 100 mL. Transforme a contagem em logaritmos decimais e insira
os resultados transformados em log para ambos os lotes em colunas
paralelas. Calcule a diferença, d, entre os dois resultados transformados
para cada amostra, incluindo o sinal ou; a média, d; e o desvio padrão, sd,
dessas diferenças (ver Seção 1010B). Calcule a estatística t de Student: t d
sd n onde n é o número de amostras. Esses cálculos podem ser feitos
utilizando vários pacotes de software estatístico disponíveis para
computadores pessoais. c) Interpretação — Compare o valor t calculado
com o valor t crítico de uma tabela t de Student. No nível de significância
de 0,05, o t de Student é 2,78 para cinco amostras (quatro graus de
liberdade). Se o valor t calculado for 2,78, o lote de teste é aceitável (ou
seja, os resultados dos dois lotes não são significativamente diferentes). Se
o valor t calculado for 2,78, o lote de teste é inaceitável. Se as colônias
forem atípicas ou visivelmente menores no lote de teste ou se o t de
Student exceder 2,78, então revise as condições do teste e repita o teste
ou então rejeite o lote de teste e obtenha outro. g. Reagentes:26 Como os
reagentes são parte integrante das análises microbiológicas, sua qualidade
deve ser garantida. Use apenas produtos químicos de grau ACS ou
equivalentes, pois as impurezas podem inibir o crescimento bacteriano,
fornecer nutrientes ou não produzir a reação desejada. Mantenha todas as
fichas de dados de segurança (SDS) fornecidas com reagentes ou padrões
e disponibilize-as para todo o pessoal. Datar os produtos químicos e
reagentes quando recebidos e quando abertos para uso pela primeira vez.
Mantenha registros de recebimento, vencimento e preparação
subsequente. Durante a preparação, leve todos os reagentes à
temperatura ambiente, complete o volume dos reagentes, de preferência
em frascos volumétricos, e armazene-os em plástico inerte de boa
qualidade ou frascos de vidro borossilicato com rolhas ou tampas de
borossilicato, polietileno ou outros plásticos. Rotule os reagentes
preparados com nome, concentração, data de preparação, nome do
preparador e data de validade (se conhecida). Armazenar em condições
adequadas e descartar até a data de validade. Inclua culturas de controle
positivo e negativo em cada série de testes culturais ou bioquímicos. h.
Corantes e manchas: Em análises microbiológicas, produtos químicos
orgânicos são usados como agentes seletivos (por exemplo, verde
brilhante), indicadores (por exemplo, vermelho de fenol) e corantes (por
exemplo, coloração de Gram). Os corantes de fornecedores comerciais
variam de lote para lote em porcentagem de corante, complexo de
corante, insolúveis e materiais inertes. Como os corantes microbiológicos
devem ser fortes e estáveis o suficiente para produzir reações corretas,
utilize apenas aqueles certificados pela Biological Stain Commission.
Prepare quantidades mínimas e antes de usar, teste os corantes usando
pelo menos uma cultura de controle positiva e uma negativa. Registre os
resultados. Para manchas fluorescentes, teste positivo e negativo
reatividade a cada dia de uso. Não congele corantes ou manchas. Leia e
siga as informações do fabricante quanto ao tempo e temperatura de
armazenamento. eu. Filtros de membrana e almofadas: A qualidade e o
desempenho dos filtros de membrana variam de acordo com o fabricante,
tipo, marca e lote devido a diferenças nos métodos de fabricação,
materiais, controle de qualidade, condições de armazenamento e
aplicação.27 1) Especificações - Fabricantes de filtros de membrana e as
almofadas para análises de água devem atender às especificações padrão
de taxa de fluxo, retenção, porcentagem de recuperação e extraíveis
químicos inorgânicos e orgânicos.28,29 Alguns fabricantes também
relatam tamanho de poro, esterilidade e pH, e certificam que suas
membranas são satisfatórias para análise de água. Embora os testes
padrão de avaliação de filtros de membrana tenham sido desenvolvidos
para fabricantes, um laboratório pode realizar seus próprios testes, se
desejar. 2) Teste de utilização – Cada novo lote de filtros de membrana
deve ter um desempenho satisfatório no teste de utilização para garantir
que não produz baixas recuperações, fraca diferenciação ou malformação
de colónias devido a toxicidade, composição química ou defeitos
estruturais. Para o procedimento, consulte ¶ f2) acima. 3) Testes de uso
padronizados – Quando cada lote de membranas chegar ao laboratório,
registre o número do lote e a data de recebimento. Inspecione cada lote
antes do uso e durante o teste para garantir que as membranas sejam
redondas e flexíveis. Se o lote for guardado por um ou mais anos, verifique
cuidadosamente se há fragilidade e descarte os lotes que pareçam
quebradiços. Confirme a esterilidade antes da primeira utilização do lote,
colocando um filtro de membrana numa almofada saturada com caldo de
extrato de glicose triptona (ou caldo não seletivo equivalente ou ágar) e
incubando-o a 35-0,5°C durante 24 h; o filtro é estéril se não ocorrer
crescimento. Alternativamente, execute um controle de esterilidade com
cada teste analítico. Após a incubação da amostra, as colónias devem estar
bem desenvolvidas, com cor e formato apropriados, conforme definido
pelo procedimento de teste. A tinta da linha de grade não deve canalizar o
crescimento ao longo da linha de tinta nem restringir o desenvolvimento
da colônia. As colônias devem ser distribuídas uniformemente pela
superfície da membrana. Rejeite o lote de membrana se estes critérios não
forem atendidos e informe o fabricante. j. Meios de cultura: Como os
métodos de cultura dependem de meios de cultura adequadamente
preparados, utilize os melhores materiais disponíveis e técnicas
consistentes para preparar, armazenar e utilizar os meios e preparar o
meio correto para a aplicação pretendida. Para CQ, use meios a granel
preparados comercialmente sempre que disponíveis, mas observe que a
qualidade e a composição dos ingredientes desses meios podem variar
tanto de lote para lote quanto de fabricante para fabricante. Antes da
primeira utilização, compare a recuperação do crescimento de lotes de
meios a granel recentemente adquiridos com os de lotes comprovados,
utilizando culturas de referência positivas e negativas (de preferência),
isolados de cultura pura recentes ou amostras naturais [ver ¶ f2) acima].
Isso é conhecido como teste de uso aplicado à mídia. Teste utilizando
culturas cuja densidade estimada é semelhante às amostras normalmente
testadas em laboratório. Observe a mídia para promoção de crescimento,
propriedades inibitórias, aparência física e pH. Arquive qualquer mídia que
acompanhe a SDS. Encomende mídia em quantidades que deverão ser
usadas dentro de 1 ano (de preferência dentro de 6 meses) após a
abertura. Encomende meios preparados comercialmente em quantidades
que deverão ser utilizadas até a data de validade do fabricante. Use a
mídia primeiro que entra, primeiro que sai. Quando for prático, solicite a
mídia em recipientes menores (por exemplo, 0,25 lb ou 125 g) em vez de
frascos de 1 lb ou 500 g, para que a maior parte do suprimento permaneça
selada pelo maior tempo possível. Mantenha registros escritos ou digitais
do tipo, quantidade e aparência da mídia recebida, número do lote, data
de validade e datas de recebimento e abertura; além disso, marque os
recipientes com a data de validade e a data de abertura. Verifique o
estoque trimestralmente para novos pedidos. Cada lote de meio para
detecção de fluorescência deve ser verificado quanto à autofluorescência
antes do uso. Isto pode ser feito dissolvendo o meio em água reagente e
examinando-o com luz UV. 1) Preparação da mídia – Prepare a mídia em
recipientes limpos que tenham pelo menos o dobro do volume do meio
que está sendo preparado. Use água de grau reagente. Meça a água e o
meio com graduados ou pipetas que estejam em conformidade com os
padrões NIST e APHA, respectivamente. Use pipetas TD (para entregar),
NÃO as de sopro. Mexa a mídia, especialmente ágares, enquanto aquece.
Evite queimar ou ferver usando um banho de água fervente para
pequenos lotes de mídia e atendendo continuamente a volumes maiores
aquecidos em uma placa quente ou queimador de gás. De preferência, use
combinações de placa quente e agitador magnético. Rotular e datar a
mídia preparada. Após a esterilização, verifique e registre o pH de uma
porção de cada meio porque o pH especificado do meio é o pH real
necessário para um crescimento adequado. Se for necessário ajuste de pH,
use soluções 1N NaOH ou 1N HCl esterilizadas por filtro para fazer
pequenos ajustes para que o pH do meio atenda ao especificado na
formulação. (Os meios disponíveis comercialmente raramente necessitam
de ajuste de pH.) Se o meio necessitar de ajuste de pH, ajuste-o
adequadamente antes da esterilização e registe o pH final. Se a diferença
de pH for de 0,5 unidades, descarte o lote e verifique as instruções de
preparação e o pH da água reagente para resolver o problema. Valores de
pH incorretos podem ser devidos à qualidade da água reagente, à
deterioração do meio ou à preparação inadequada. Se o pH da água
reagente for insatisfatório, prepare um novo lote de meio utilizando água
de outra fonte (ver 9020B.4d e e). Se a água estiver satisfatória, refaça o
meio e verifique o pH; se o pH ainda estiver incorreto, prepare o meio
usando um lote ou fonte de meio diferente. NOTA: Certos meios de
isolamento específicos preparados com ácidos orgânicos ou graxos
apresentarão alterações marcantes no pH após a esterilização. Descarte a
mídia se for encontrada formação de cristais ou variações de cor. NOTA:
Um precipitado é normal em meios do tipo Endo. Documente as
atividades de preparação, como nome do meio, volume produzido,
formato, pH final, data de preparação e nome do preparador. Registre os
problemas de pH no livro de registro de mídia e informe o fabricante se o
meio for indicado como fonte de erro. Examine a mídia preparada em
busca de cor incomum, escurecimento ou precipitação e registre as
observações. Considere se as variações no tempo e na temperatura de
esterilização podem ser a causa dos problemas. Se alguma das situações
acima ocorrer, descarte o meio. 2) Esterilização – Esterilize a mídia a 121°C
com variação mínima de temperatura pelo tempo mínimo especificado.
Siga as instruções do fabricante para esterilizar meios específicos. O tempo
de exposição necessário varia com a forma e tipo de material, tipo de
meio, presença de carboidratos e volume. A Tabela 9020:IV fornece
diretrizes para itens típicos em unidades pequenas (por exemplo, tubos de
ensaio e frascos pequenos). Não exponha meios contendo carboidratos a
temperaturas elevadas por 45 min; alguns meios de comunicação não
podem ser expostos ao calor por tanto tempo. Por exemplo, meios de
presença-ausência não podem ser expostos ao calor por 30 minutos. O
tempo de exposição é o período desde a exposição inicial ao calor até a
remoção da autoclave. O superaquecimento da mídia pode resultar na
degradação de nutrientes. Mantenha registros de impressão da autoclave.
NOTA: Sempre que possível, evite esterilizar grandes quantidades de meios
de comunicação em recipientes porque levará mais tempo para os meios
de comunicação atingirem a temperatura de esterilização. Use uma sonda
de temperatura em um frasco de mídia para determinar o tempo
necessário para atingir a temperatura de esterilização. Remova o meio
esterilizado da autoclave assim que a pressão da câmara atingir zero ou, se
estiver usando um modelo totalmente automático, assim que a porta se
abrir. Tenha muito cuidado para evitar transbordar devido a líquidos
superaquecidos. Não autoclave novamente a mídia. Esterilize soluções ou
meios sensíveis ao calor por filtração através de um filtro com diâmetro de
poro de 0,2 m em um aparelho de filtração e recepção estéril. Filtre e
distribua o meio em uma capela de fluxo laminar ou em uma cabine de
segurança, se disponível. Esterilize vidraria (por exemplo, pipetas, placas
de Petri, frascos de amostra) em autoclave ou forno de esterilização de ar
quente (170 10°C por 2 h). Esterilize equipamentos, suprimentos e outros
materiais sólidos ou secos sensíveis ao calor, expondo-os ao óxido de
etileno em um esterilizador a gás. Use tiras ou suspensões de esporos
disponíveis comercialmente para verificar o calor seco e a esterilização por
óxido de etileno. 3) Uso de ágares e caldos – Tempere os ágares derretidos
em banho-maria a 50°C (de preferência 44 a 46°C) até serem usados, mas
por 3 horas. Para monitorar a temperatura do ágar, exponha uma garrafa
de água ou meio às mesmas condições de aquecimento e resfriamento do
ágar. Insira um termômetro no frasco de monitoramento para determinar
quando a temperatura é adequada para uso em placas de vazamento.
Adicione soluções sensíveis ao calor (por exemplo, antibióticos) ao ágar
temperado. Idealmente, prepare o meio 2 dias antes dos testes para
permitir tempo suficiente para que os testes de esterilidade e cultura de
controle positivo e negativo sejam concluídos. Se o meio de ágar for
solidificado para uso posterior, derreta em banho-maria fervente ou em
um béquer ou em uma unidade com fluxo de vapor (por exemplo, uma
autoclave ajustada a 100°C por 5 a 10 minutos, ou micro-ondas de baixa
potência30), use e, em seguida, descarte qualquer restante. Como as
microondas variam, execute testes de comparação para garantir que a
integridade do meio não foi comprometida. Alguns meios não são
adequados para derreter no microondas (ou seja, M-Endo/Endo LES). Não
autoclave novamente a mídia. O ágar pode ser derretido apenas uma vez e
alguns meios não podem ser derretidos no micro-ondas sem destruir sua
natureza seletiva. O volume dispensado depende do tamanho da placa de
Petri e do uso pretendido. Inverta as placas assim que o meio derramado
solidificar. Manuseie os tubos de meio de fermentação estéril com cuidado
para evitar aprisionamento de ar nos tubos Durham (internos), produzindo
assim reações falso-positivas. (Os tubos de Durham são tubos de ensaio
muito pequenos invertido em tubos de ensaio maiores para reter qualquer
gás produzido.) Examine os tubos recém-preparados para determinar se
não há bolhas de gás nos tubos Durham. 4) Armazenamento de mídia –
Armazene todas as mídias sob condições controladas para manter a
qualidade até a data de validade. Os meios desidratados são
higroscópicos; evite umidade excessiva. Armazene o meio desidratado em
um recipiente bem fechado, em uma sala fria (15 a 25°C), seca e com
temperatura controlada ou em um dessecador, longe da luz solar direta.
Descarte a mídia que endurecer, descolorir ou mostrar outros sinais de
deterioração. Descarte a mídia não utilizada dentro da data de validade do
fabricante. Um limite de tempo conservador para garrafas fechadas é de 2
anos à temperatura ambiente. Use frascos abertos de mídia, de
preferência dentro de 6 meses. Imediatamente após o uso, feche os
frascos o mais firmemente possível. Armazene os frascos abertos em
dessecador, se disponível. Prepare a mídia em quantidades que serão
utilizadas dentro dos limites de tempo indicados na Tabela 9020:V. É
necessário meio fresco para garantir que os microrganismos alvo sejam
isolados adequadamente, especialmente bactérias estressadas ou feridas
durante o tratamento. Proteja da luz meios preparados em laboratório e
comercialmente contendo corantes; se a cor mudar, descarte a mídia. Se o
meio comercial preparado e pronto para uso tiver uma data de validade
posterior à indicada na Tabela 9020:V, peça ao fabricante que forneça
evidências de qualidade do meio durante todo esse período. Verifique
semanalmente a usabilidade testando recuperações com densidades
conhecidas de controles de cultura que também atenderão aos requisitos
de verificação de CQ. O controle do teor de umidade é importante porque
o armazenamento prolongado e a subsequente desidratação podem
alterar a recuperação e a seletividade. Quando a mídia for usada para fins
de pesquisa, estabeleça datas de validade apropriadas e documente os
resultados. Proteja da luz meios preparados em laboratório e preparados
comprados contendo corantes; se ocorrerem alterações de cor, descarte a
mídia. Leve à geladeira todas as placas de ágar derramadas não utilizadas
no dia da preparação. Para evitar a desidratação, sele as placas de ágar em
sacos plásticos ou outro recipiente lacrado, caso sejam guardadas por 2
dias. Armazene as placas invertidas para evitar que a condensação caia no
meio. Se houver formação de condensação, considere colocar as placas
brevemente em uma incubadora de 35 a 37°C. Para meios em tubos de
ensaio, aperte as tampas antes de armazenar. Pese as placas ou marque o
nível de líquido em vários tubos (10% de cada lote) após a esterilização e
monitore a perda de líquido por peso ou volume quando armazenado por
2 semanas. Se a perda for de 10% ou mais, descarte o lote. Descartar
todas as placas de Petri com meios sólidos que tenham sido armazenadas
por 2 semanas; descarte mais cedo se estiverem secos (por exemplo,
enrugados, rachados ou sem caroço).
Se a mídia for refrigerada, deixe-a atingir a temperatura ambiente antes de
usar e rejeite o lote se ocorrer crescimento ou respostas falso-positivas.
Caldos e ágares estéreis preparados comercialmente podem oferecer
vantagens quando as análises são feitas de forma intermitente, quando a
equipe não está disponível para o trabalho de preparação ou quando o
custo pode ser equilibrado com outros fatores operacionais do laboratório.
Verifique o desempenho dessas mídias conforme descrito nos parágrafos
5)–7) abaixo. 5) Teste de uso – Submeta a mídia preparada em laboratório
ao teste de uso. Para o procedimento, consulte ¶ f2) acima. 6) Controle de
qualidade de meios preparados em laboratório – Compare lotes novos e
lotes anteriormente aceitáveis [¶ 5) acima] quanto às suas recuperações
quantitativas do microrganismo em questão. Incluir verificações de
esterilidade dos meios e verificações de culturas de controle positivo e
negativo para determinar a especificidade de todos os meios, conforme
descrito abaixo. Os controles de cultura podem ser usados para detectar a
promoção do crescimento e a seletividade do meio, bem como monitorar
a técnica do analista. Mantenha as informações em um livro encadernado.
Uma boa prática laboratorial é desafiar periodicamente o meio preparado
com números baixos de um microrganismo apropriado. O crescimento
seria afetado pela qualidade do meio, preparação, esterilização, tempo de
armazenamento e condições de armazenamento. 7) Controle de qualidade
da mídia preparada comercialmente – O envio desta mídia não deve
invalidar nenhum dos tempos ou condições de retenção da mídia descritos
acima. O fabricante deverá fornecer informações de validação se as
condições de envio forem diferentes. Contudo, o laboratório deve realizar
o seu próprio teste enumerativo, desafiando meios com baixos números
de um microrganismo apropriado. Registre as datas de recebimento e
vencimento, o número do lote e, em seguida, meça e registre o meio
utilizado. Armazene conforme indicado pelo fabricante e descarte até a
data de validade. Recomenda-se a comparação de recuperações
quantitativas com meios preparados em laboratório, conforme indicado no
¶ 5) acima. Teste cada novo lote quanto à esterilidade e com verificações
de cultura de controle positivo e negativo (organismos de controle
sugeridos podem ser encontrados na Tabela 9020:VI). Se o meio
preparado comercialmente tiver uma vida útil mais longa do que a versão
preparada em laboratório, realize estes testes com mais frequência.

9223 B. Enzyme Substrate Test – pag. 1179

Colete amostras conforme indicado na Seção 9060 A, usando recipientes de amostras
especificados na Seção 9030 B.19. Ao coletar amostras de água clorada, use tiossulfato
de sódio conforme descrito na Seção 9060 A.2. Siga as diretrizes de controle de
qualidade (CQ) para frascos de amostra descritas na Seção 9020 B.5d. Siga os tempos e
condições de retenção de amostras conforme descrito na Seção 9060 B ou exigido pelos
regulamentos. Tenha cuidado para garantir que as amostras sejam mantidas na
temperatura apropriada e analisadas o mais rápido possível após a coleta da amostra,
pois o não cumprimento desta recomendação pode comprometer os resultados.
Certifique-se de que as amostras atendam aos critérios de aceitação do laboratório no
momento do recebimento.

2. Controle de Qualidade
Os usuários do Método de devem aderir às diretrizes de garantia de qualidade (GQ)/CQ
na Seção 9020, incluindo, mas não se limitando a, CQ analítico (Seção 9020 B.9),
instrumentação e equipamentos (Seções 9020 B.4 e 9030 B) e suprimentos (Seção 9020
B.5). Consulte a Tabela 9020:1 para obter os principais procedimentos de CQ. Antes de
utilizar cada lote de meio novo, verifique o seu desempenho através de organismos de
controlo positivo e negativo. Para realizar controles de cultura, inocule o meio com 3
bactérias de controle: E. coli, uma cepa de coliformes totais diferente de E. coli (por
exemplo, Enterobacter cloacae) e uma não coliforme (ver Tabela 9020:6). Analise
também um controle negativo não inoculado. Além disso, teste o meio e os recipientes
(frascos, bandejas multipoços, tubos) para confirmar a esterilidade e a falta de
autofluorescência.