Buffers recomendados, soluções

Nota: Não use azida sódica nestes preparações. A azida de sódio inativa a enzima peroxidase de rábano.O Conjunto de Reagentes BD
OptEIA™ B (Nº de Cat. 550534) contendo Tampão de Revestimento, Ensaio Diluente, Substrato Reagentes A e B, Solução de Parada e
Concentrado de Tampão de Lavagem 20X é recomendado.

1. Tampão de Revestimento - Carbonato de Sódio 0,1 M, pH 9,5:

-0,713 g NaHCO3,
-0,159 g Na2CO3;
q.s. a 100 mL; pH a 9,5 com NaOH 10N.

Prepare na hora ou use dentro de 7 dias após a preparação, armazenado a 2-8°C.

2. Ensaio Diluente-PBS* com 10% FBS#, pH 7,0. O ensaio BD Pharmingen™Diluente (Cat. No. 555213) é recomendado.

*Soro fisiológico tamponado com fosfato(PBS):

- 80,0 g NaCl, 11,6 g Na2HPO4, 2,0 g KH2PO4, 2,0 g KCL, q.s. a 10 L; pH para 7,0.

#Soro Fetal Bovino: Hyclone Cat. Nº SH30088 (inativado pelo calor) recomendado.

Prepare na hora ou use dentro de 3 dias após a preparação, com armazenamento de 2-8°C.

PBS ----------- 100 mL

SFB -----------10 mL
3. Tampão de lavagem - PBS* com 0,05% de Tween-20. Prepare ou use no prazo de 3 dias após preparação, armazenada a 2-8°C.

PBS -------------- 500mL

Tween-20 -------- 250uL

4. Solução Substrato - Tetrametilbenzidina (TMB) e Peróxido de Hidrogênio. O BD Pharmingen™ TMB Substrate Reagent Set (Cat.
No. 555214) é recomendado.

Tem na geladeira da Milipore/magpix

5. Solução de Parada –

1 M H3PO4 ou 2 N H2SO4

Água destilada ---------- 80,4 mL

H2S04 ------------------------ 19,6 mL
Materiais Adicionais Necessários

1. Placas de fundo plano de poliestireno Maxisorp ELISA de 96 poços Nunc-Immuno™ (ThermoFisher Scientific Cat. No. 442404) são
recomendados

Informações de armazenamento

1. Armazene os reagentes fechados a 2-8°C. Não use reagentes após a data de validade ou se turbidez é evidente.
2. Antes de usar, leve todos os reagentes à temperatura ambiente (18-25°C). Imediatamente depois uso, retorne às condições adequadas de
armazenamento.
3. Os padrões liofilizados são estáveis até a data de validade. Veja abaixo para reconstituídos informações de armazenamento
padrão. Coleta e Manuseio de Amostras

As amostras devem ser límpidas, não hemolisadas e não lipêmicas.

Sobrenadantes de cultura celular: Remova qualquer material particulado por centrifugação e teste
imediatamente ou armazene as amostras a ≤ -20°C. Evite ciclos repetidos de congelamento
descongelamento.
Soro: Use um tubo separador de soro e deixe as amostras coagularem por 30 minutos, depois
centrifugar por 10 minutos a 1000 x g. Remova o soro e teste imediatamente ou armazene amostras a ≤
-20° C. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.

Plasma: Colete o plasma usando citrato, EDTA ou heparina como anticoagulante. Centrífuga por 10
minutos a 1000 x g dentro de 30 minutos após a coleta. Ensaie imediatamente ou armazene as amostras
a ≤ -20° C. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.

Preparação e manuseio de padrões

1. Reconstituição:

- Após aquecer o padrão liofilizado à temperatura ambiente, abra cuidadosamente o frasco para evitar perda de
material. - Reconstituir o padrão liofilizado com 1,0 mL de água desionizada para produzir um padrão de estoque.

- Deixe o padrão equilibrar por pelo menos 15 minutos antes de fazer as diluições.
- Vortex suavemente para misturar.
2. Armazenamento/manuseio do padrão reconstituído: - Após a reconstituição, imediatamente aliquote o estoque padrão em frascos
de polipropileno a 50 µl por frasco e congele em -80°C por até 6 meses. Se necessário, armazene a 2-8°C por até 8 horas antes de
aliquotar/congelar. Não deixe o padrão reconstituído à temperatura ambiente.

3. Preparação de Padrões para Ensaio:

a) Prepare um padrão de 250 pg/mL a partir do padrão de estoque. Adicionar 600 uL no primeiro tudo e adicionar 2,5uL da solução padrão.
Vortex para misturar. (Ver instruções de diluição no Certificado de Instrução/Análise.)
b) Adicione 300 µL de Diluente de Ensaio a 6 tubos. Marcar como 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,2pg/mL, 15,6 pg/mL, 7,8 pg/mL e 3,9
pg/mL.
c) Realize diluições em série adicionando 300 µL de cada padrão ao próximo tubo e vórtice entre cada transferência. Começa do padrão A,
no penúltimo jogar 300uL fora e deixar apenas o diluente de ensaio no ultimo. O Diluente de Ensaio serve como padrão zero (0 pg/mL)

Diluições em série dentro da placa também podem ser realizadas pipetando 100 µL de Diluente de Ensaio em cada poço padrão, exceto o
mais alto (250 pg/mL), em seguida, adicionar 100 µL do padrão de 250 pg/mL a esse poço e ao poço de 125 pg/mL, misturando o conteúdo
do poço enxaguando a ponta da pipeta, e adicionar 100 µL do padrão de 125 pg/mL ao poço de 62,5 pg/mL. Continue essas diluições para o
poço padrão de 3,9 pg/mL, do qual os 100 µL extras devem ser descartados.

Procedimento de ensaio recomendado

1º dia de experimento

1. Diluir o anticorpo de captura no coating buffer (1:250)

40 uL anticorpo --------- 10000uL de coating buffer

2. Revestir os micropoços com 100 µL por poço de anticorpo de captura diluído em Tampão de
Revestimento. - Selar a placa e incubar durante a noite (overnight) a 4°C.

2º dia de experimento

3. Aspire os poços e lave 3 vezes com tampão de lavagem ≥ 200 µL/poço.

-Depois do último lave, inverta a placa e seque em papel absorvente para remover qualquer tampão residual.

4. Bloqueie as placas com ≥ 200 µL/poço de Diluente de Ensaio.

- Incubar em temperatura ambiente por 1 hora.

5. Aspire/lave lave 3 vezes com tampão de lavagem ≥ 200 µL/poço.

 - Depois do último lave, inverta a placa e seque em papel absorvente para remover qualquer tampão

residual. 6. Prepare as diluições do padrão e da amostra em Diluente de Ensaio. Consulte “Padrões

Preparação e Manuseio”.

7. Pipete 100 µL de cada padrão, amostra e controle em poços apropriados. Selar a placa e incubar por 2 horas em temperatura

ambiente. 8. Aspirar/lavar como no passo 3, mas com 5 lavagens totais.

9. Adicione 100 µL de Anticorpo de Detecção diluído em Diluente de Ensaio a cada poço. Selar a placa e incubar por 1 hora em
temperatura ambiente.

6. Aspire/lave 5 vezes com tampão de lavagem ≥ 200 µL/poço.

- Depois do último lave, inverta a placa e seque em papel absorvente para remover qualquer tampão residual

10. Adicione 100 µL de Reagente Enzimático diluído em Diluente de Ensaio a cada poço.
Selar a placa e incubar por 30 min em temperatura ambiente.

11. Aspire/lave usando etapas de imersão de 30 segundos a 1 minuto com 7 lavagens no total.

12. Adicione 100 µL de Solução de Substrato a cada poço. Placa de incubação (sem placa
cimento) por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro.

13. Adicione 50 µL de Solução de Parada a cada poço. Esperar 15 min e fazer a leitura.

14. Leia a absorbância a 450 nm dentro de 30 minutos após a interrupção da reação. Se a correção do comprimento de onda estiver
disponível, subtraia a absorbância a 570 nm de absorbância 450 nm.