UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARAN

PR

Universidade Tecnolgica Federal do Paran Departamento Acadmico de Qumica e Biologia Tecnologia em Processos Ambientais Disciplina: Microbiologia

AULA PRTICA 1: PREPARO DE SOLUES E MEIOS DE CULTIVO PREPARO DE SOLUES USADAS NA MICROBIOLOGIA a) Preparo da soluo de lugol:

Pesar 12,5 g de iodo metlico Pesar 20,0 g de iodeto de potssio Hidratar com 100 ml de gua destilada Filtrar com auxlio de papel filtro para um frasco conta gotas

Num copo de bcker transferir as 20g de iodeto de potssio e as 12,5g de iodo metlico. Hidratamos a mistura com 100 ml de gua destilada; homogeneizamos a soluo com basto de vidro e - com papel filtro adaptado a um funil de vidro - filtramos a soluo passando-a para recipientes com conta gotas (frasco escuro). b) Preparo do lcool etlico 70%:

Medir em proveta de 1L, 700 mL de lcool etlico comercial; Acrescentar 300 mL de gua destilada; Usar alcometro GL para verificar a concentrao verdadeira do lcool na soluo preparada, ou calcular considerando a porcentagem de hidratao do lcool comercial. - Guardar em frasco fechado.

c) Preparo da soluo de lcool iodado:

8 ml de lugol 300 ml de gua destilada lcool etlico 70% q.s.p. 1000 ml

Colocar os 8 ml de lugol e os 300 ml de gua destilada num balo volumtrico de 1000 ml - com uma pipeta e uma proveta respectivamente. Completar para o volume de 1000 ml com lcool 70%. PREPARO DE MEIOS DE CULTIVO DESIDRATADOS Meios Solidificados A tcnica empregada para reidratar os meios desidratados tem decisiva importncia na obteno de um meio de boa qualidade. De maneira geral, convm: 1. Dissolver o meio (quantidade especificada pelo fabricante e conforme a necessidade de uso), apenas numa parte do volume total de gua destilada; 2. Homogeneizar, evitando a formao de bolhas e de espuma; 3. Adicionar o restante da gua destilada, lavando as paredes do recipiente; 4. Dissolver o meio por aquecimento em banho-maria ou local adequado, sob constante agitao, de maneira a evitar a ebulio do meio de cultivo e/ou seu super-aquecimento. O meio apresenta-se completamente dissolvido quando est translcido e/ou quando as partculas de gar ou demais nutrientes no mais estiverem aderidas s paredes do recipiente; 5. Resfriar sem permitir solidificao; 6. Verificar o pH, ajustando-o caso necessrio;

7. Acondicionar corretamente em frascos e levar esterilizao em autoclave . 8. Resfriar a aproximadamente 45oC e dispensar de maneira assptica nos recipientes apropriados ao uso. Caldos meios lquidos 1. Dissolver o meio (quantidade especificada pelo fabricante e conforme a necessidade de uso), apenas numa parte do volume total de gua destilada; 2. Homogeneizar, evitando a formao de bolhas e de espuma; 3. Adicionar o restante da gua destilada, lavando as paredes do frasco 4. Verificar o pH, ajustando-o caso necessrio; 5. Acondicionar corretamente em frascos e levar esterilizao em autoclave. Armazenamento dos meios de cultivo Os meios aps esterilizao devem ser resfriados temperatura ambiente e armazenados em geladeira, preferencialmente dentro de sacos plsticos para diminuir a desidratao. Podem ser conservados por 15 dias no refrigerador.

ROTEIRO DA PRTICA
1. Preparar 1L de lcool 70% 2. Preparar 150 mL de gar __________________: - Pesar a quantidade necessria de gar - Colocar o meio desidratado e reidratar com a quantidade necessria de gua destilada; - Aquecer at ferver para completa dissoluo; - Esterilizar em autoclave por 15 min a 121oC; - Guardar o meio na geladeira para posterior utilizao ou distribuir em placas de Petri e armazenar na geladeira em sacos plsticos. 3. Preparar 150 mL de soluo salina: - Pesar a quantidade necessria de NaCl - Dissolver em 50 mL de gua destilada; - Pipetar em 5 tubos de ensaio mdios 9 mL de gua peptonada; - Colocar tampes de algodo nos tubos de ensaio; - Autoclavar por 15 min a 121oC; - Guardar na geladeira para posterior utilizao.
4.

Preparar 200 mL de caldo BHI e distribuir 6 mL em tubos de ensaio. Seguir as recomendaes do fabricante. Acondicionar adequadamente. Esterilizar. Preparo da Cabine de fluxo laminar (CSB) para distribuio de meios de cultivo em placas Seguir as normas de procedimento recomendadas para limpeza e desinfeco (fixado no equipamento) Preparo de pipetas graduadas para esterilizao: 1mL, 2mL; 5mL e 10mL.

5.

6.

7. Preparo de placas de Petri para esterilizao.

QUESTES 1. Quais os cuidados que se devem ter ao preparar meios de cultivo? 2. Por que se deve autoclavar o meio de cultura aps o seu preparo? 3. Porque se deve guardar o meio de cultura na geladeira? 4. Qual a diferena na preparao do meio slido para o meio lquido? 5. Como se sabe se um meio slido est totalmente dissolvido? 6. Para que serve a gua peptonada e a soluo salina? 7. Para que serve o Agar-Agar? Qual a sua constituio bsica? Porque o Agar-Agar um dos melhores agentes solidificante de meios de cultura? 9. Fale sobre os extratos usados na microbiologia. 10. Fale sobre as peptonas. 11. Fale sobre os meios de cultura desidratados. 12. Qual a temperatura em que o agar se liquefaz? 13. Porque se deve evitar a fervura do meio de cultivo? 14. Ao se retirar um meio de cultivo da geladeira necessrio sua prvia ambientao a temperatura do laboratrio, antes do uso. Porque? 15. Porque todo o trabalho dever ser feito ao redor do bico de Bunsen ou em Cmara de fluxo laminar? 16. O que teste de esterilidade do meio de cultura e qual a importncia deste procedimento? 17. Porque as placas de Petri devem ser guardadas invertidas na geladeira?

COMPOSIO DE MEIOS DE CULTIVOS PRTICA 1- CALDO SINTTICO preparar 50 mL e distribuir em tubos pequenos (mnimo 6) Glucose Sulfato de amnio Cloreto de sdio Fosfato cido de potssio 0,2 N gua destilada q.s.p. pH final 2- MEIO ISENTO DE CARBONO Base: preparar 60 mL e distribuir em 2 placas de petri estreis Este base para os itens 2.2 e 2.1 Sulfato de amnio Cloreto de sdio Fosfato cido de potssio 0,2 N Agar gua destilada q.s.p. pH final 4,8 g 5g 100mL 15g 1000 mL 7 2g 4,8 g 5g 100mL 1000 mL 7

2.1 adicionar glicose 2g/L - preparar 60 mL e distribuir em 2 placas de petri estreis 2.2 adicionar citrato de sdio2g/L - preparar 60 mL e distribuir em 2 placas de petri estreis 3- AGAR ENDO meio seletivo para Escherichia coli Preparar 60 mL, conforme especificado na embalagem, e distribuir em 2 placas de petri estreis.

4- CALDO SIMPLES ADICIONADO DE EXTRATO DE LEVEDURA - preparar 50 mL e distribuir em 6 tubos pequenos. Extrato de levedura Caldo simples q.s.p pH final 5- CALDO SIMPLES: Extrato de carne Peptona gua destilada q.s.p. pH final 3g 5g 1000 mL 6,8 5g 1000mL 6.6

6- AGAR CETRIMIDE meio seletivo para Pseudomonas. Preparar 60 mL, conforme especificado na embalagem, e distribuir em 2 placas de petri estreis. 7- AGAR GELATINA. - Preparar 60 mL e distribuir em tubos de ensaio pequenos (mnimo 6). Peptona de carne Extrato de carne Gelatina Agar gua destilada q.s.p. pH final 5g 3g 120 g 10g 1000 mL 7,0

8- MEIO BASE DE VERMELHO FENOL - este serve de base para os itens8.1 e 8.2. Peptona 10g Extrato de carne 1g Cloreto de sdio 5g Vermelho de fenol 2 mL gua destilada q.s.p. 1L pH 7,4 8.1- Teste da lactose : Lactose10g/L Preparar 80 mL e distribuir em tubos de ensaio grandes (mnimo 6). 8.2- Teste da glicose: Glicose 10g/L Preparar 80 mL e distribuir em tubos de ensaio grandes. Adicionar tubos de Durhan (mnimo 6 tubos grandes). 9- MEIO PARA TESTE PRODUO DE CIDO SULFDRICO - preparar 50 mL e distribuir em 6 tubos pequenos. Peptona Extrato de carne Sulfato frrico Tiossulfato de sdio Agar gua destilada q.s.p. 30g 3g 0,2g 0,025g 20g 1L

10- MEIO ISENTO DE NITROGNIO este serve de base para os itens 10.1 e 10.2 Base: preparar 60 mL e distribuir em 2 placas de petri estreis Glicose 2g Cloreto de sdio 5g Fosfato cido de potssio 0,2 N 100mL Agar 30g gua destilada q.s.p. 1000 mL pH final 7

10.1 adicionar KNO3 1g / 1L preparar 60 mL e distribuir em 2 placas de petri estreis 10.2- sulfato de amnio 1g/ 1L preparar 60 mL e distribuir em 2 placas de petri estreis 11- MEIO PARA O TESTE DE VERMELHO DE METILA preparar 50 mL e distribuir em tubos pequenos (mnimo 6). Peptona tamponada Fosfato dipotssico Glicose gua destilada q.s.p. pH final 7g 5g 5g 1L 7

12- TESTE DA UREASE Preparar 80 mL e distribuir em 6 tubos de ensaio grandes. Depois de esterilizado, inclinar para que solidifique desta forma A uria acrescentada aps a esterilizao por filtrao. Em 1L incorporar 50 mL de uma soluo de uria 40%. Peptona Glicose Cloreto de sdio Fosfato de potssio monobsico Vermelho de fenol Agar gua destilada q.s.p. 1g 1g 5g 2g 5 mL 20g 1L

pH final