Curso: Diagnóstico de Tuberculose – Método de Ogawa-Kudoh

Módulo 2: Preparando o meio de Ogawa-Kudoh

Curso

Diagnóstico de Tuberculose -
Método de Ogawa-Kudoh

Módulo 2

Preparando o meio de Ogawa-Kudoh

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Expediente

Produzido por
Núcleo de Doenças Infecciosas da
Universidade Federal do Espírito Santo
(NDI/UFES) - Vitória / ES

Equipe responsável
Moisés Palaci
Solange Alves Vinhas
Eunice Atsuko Totumi Cunha
Luiz Guilherme Schmidt Castellani
Rosalia Maia

Adaptação pedagógica
Lucy Maria Bez Birolo Parucker
Helena Cristina Franz
Darcita Buerger Rovaris
Breno Biagotti
Artemir Coelho de Brito
Nicole Menezes de Souza

Diagramação
Bruna Goddini de O. Ferreira

Apoio
OPAS/OMS - Organização Pan-Americana
da Saúde
Sumário
Preparo do meio de Ogawa-Kudoh 4
1. Preparo dos materiais 4
2. Preparo da base 5
3. Preparo do verde malaquita 5
4. Preparo de Ácido Para-Nitrobenzóico - PNB 7
5. Preparo de Hidrazida do
ÁcidoTiofeno-2-Carboxílico - TCH 7
6. Lavagem e assepsia dos ovos 8
7. Preparo do meio completo – com e sem PNB-TCH 8
9. Coagulação do meio 9
10. Referências 10
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Preparo do meio de Ogawa-Kudoh

O meio de Ogawa-Kudoh é um meio de cultura de alta qualidade, à
base de ovos e de grande praticidade para a rotina dos laboratórios de
micobacteriologia, utilizado para isolamento e identificação de micobactérias,
e para a detecção de resistência aos antimicrobianos utilizados nos esquemas
de tratamento da tuberculose.

1. Preparo dos materiais

A produção do meio de cultura de Ogawa-Kudoh, requer os seguintes
itens:
• Fosfato monopotássico (KH2PO4)
• Citrato de magnésio
• Glutamato de sódio
• Glicerol
• Verde-malaquita
• Água destilada
• Água destilada estéril
• Solução de Extran neutro
• Ovos frescos de galinha
• Etanol 77%
• Frascos de volume apropriado para preparo dos meios
• Frascos de volume apropriado para distribuição dos meios
• Frascos de volume apropriado para fazer o homogeneizado de ovos
• Becker estéril de 200 mL
• Batedeira com pás estéreis ou bastão de vidro grosso estéril
• Bastão de vidro grosso
• Bucha para lavar os ovos
• Panos estéreis
• Funil com gaze estéril
• Gaze
• Proveta estéril
• Distribuidor de meio ou pipetador automático

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• Pipetas sorológicas estéreis de 10 e 25 mL

• Capela de Segurança Biológica (opcional)
• Autoclave
• Balança analítica
• Sorocoagulador
• Estufa a 37°C
• Geladeira

A esterilização é uma etapa fundamental na produção dos meios de

cultura e deve ser submetida a rigoroso controle de qualidade. Para tanto, o
bom funcionamento da autoclave é condição indispensável para o sucesso da
produção do meio de cultura.
As superfícies de trabalho, incluindo a ​Cabine de Segurança Biológica​
devem ser cuidadosamente limpas e desinfetadas antes de iniciar o
procedimento. Todo material deve ser exclusivo para a produção do meio de
cultura e, por uma questão de organização, deve ser lavado e esterilizado com
24h de antecedência.

2. Preparo da base
A seguir, se apresenta a sequência para a organização do preparo da base
do Ogawa-Kudoh.

3. Preparo do verde malaquita

Inicia-se o preparo da base pela solução de verde malaquita 2%, que deve
ser preparado no dia em que será utilizado.
É necessário pesar o verde malaquita de acordo com o volume a ser
utilizado pelo laboratório. Dissolva o verde malaquita em pó já pesado em
água deionizada, com agitação e em placa aquecedora, tomando cuidado para
não superaquecer a solução.
Esta solução deve ser deixada sob agitação constante para garantir que todo
o corante seja dissolvido. Este passo é de extrema importância, pois cristais
de verde malaquita podem prejudicar o crescimento das micobactérias, no
meio de cultura. Para garantir que não haja cristais de verde malaquita nesta
solução, filtre-a com gaze.

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Transfira para um frasco identificado e deixe aguardando o momento de

ser adicionado ao meio.
Pese todos os reagentes necessários para a produção da base e dissolva
em água destilada aquecida, sob agitação, na ordem do Quadro 1 e de acordo​
com o volume desejado. Acrescente um por vez, aguardando a sua dissolução.
Ainda no agitador, acrescente o glicerol e em seguida o verde malaquita já
preparado. Após a dissolução dos reagentes, transfira a base para um frasco
autoclavável de volume 3 vezes maior do que o volume da base.
Autoclavar a 127°C por 15 minutos.
O volume da base a ser produzida vai depender da demanda da instituição,
respeitando o número de amostras a serem processadas, semanalmente ou
mensalmente.
Todas as soluções não a ​ utoclaváveis​, como PNB, TCH e outros antibióticos
devem ser preparadas assepticamente dentro de uma c​ abine de segurança
biológica​de classe I ou II.
A seguir, o Quadro 1 apresenta os reagentes e as medidas a serem utilizadas
no preparo da base do Ogawa-Kudoh.

Quadro 1: Reagentes e medidas utilizadas no preparo da base do Ogawa-Kudoh

REAGENTES MEDIDAS
VOLUME DA BASE 300 mL 600 mL 1500 mL
Fosfato 6,0 g 12,0 g 30,0 g
monopotássico
Citrato de magnésio¹ 0,3 g 0,6 g 1,5 g

Glutamato de sódio 1,5 g 3,0 g 7,5 g

Glicerol² 12,0 mL 24,0 mL 60,0 mL
Água deionizada 300 mL 600 mL 1500 mL

¹ Citrato de magnésio não é essencial para a detecção, mas

melhora a viabilidade das micobactérias.
² Não​se deve adicionar glicerol para o cultivo de Mycobacterium​
bovis ou outros organismos que não toleram o glicerol.

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4. Preparo de Ácido Para-Nitrobenzóico - PNB

Nesse preparo, o PNB deve ser dissolvido em hidróxido de sódio 1N
(normal) adicionando 3 gotas de solução de fenolftaleína a 0,1% e gotejando
a solução de HCl 1N até que a coloração vermelha se torne amarelo claro.
Complete o volume da solução até 100 mL. Esta solução deve ser aliquotada e
armazenada em freezer a menos 70°C. A seguir, estão descritos os reagentes
e seus respectivos quantitativos.

Quadro 2. Reagentes e medidas a serem utilizadas no preparo de PNB

REAGENTES QUANTIDADES
PNB 2,5 g

Solução de NaOH 4% 15 mL

Solução de fenoftaleína 0,1% 3 gotas

Solução de HCl 1N Gotas

Água deionizada estéril q.s.p. 100 mL

5. Preparo de Hidrazida do Ácido Tiofeno-2-Carboxílico

- TCH
Em relação ao preparo da Hidrazida do Ácido Tiofeno-2-Carboxílico (TCH),
dissolva a quantidade necessária de TCH em água deionizada estéril. Esta
solução deve ser aliquotada e armazenada em freezer a menos 70°C.
Solução de uso: No momento do preparo do meio de cultura, 1 mL da
solução de estoque de TCH é diluído em 9 mL de água destilada estéril.
A seguir, no Quadro 3 se apresenta os reagentes e o quantitativo a ser
utilizado no preparo do TCH.

Quadro 3. Reagentes e medidas utilizadas no preparo do TCH.

Reagentes Quantidades
TCH 0,1 g
Água deionizada estéril q.s.p. 10,0 mL

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6. Lavagem e assepsia dos ovos

Um cuidado especial deve-se ter com os ovos para o preparo do meio
de Ogawa-Kudoh. Os ovos para a produção do meio de cultura devem ser
de galinhas não alimentadas com antibióticos, recém-colhidos, ou seja, com
menos de 7 dias. Estes ovos devem ser lavados no dia anterior, sendo que a
lavagem deve ser feita com detergente neutro e uma bucha de uso exclusivo
para este fim.
Na lavagem deve ser observado se a casca de cada ovo está porosa
ou rachada. Os que estiverem assim, devem ser descartados. Depois de
enxaguados os ovos deverão ser secos.
No dia seguinte ou no momento em que os ovos serão utilizados, deve se
fazer antissepsia em álcool 92,8° INPM por 15 minutos, com volume suficiente
para cobrir todos os ovos.
A quantidade de ovos necessária é calculada levando-se em conta o
volume de cada ovo que é de aproximadamente 40 a 50 mL. Ressalta-se a
importância de lavar e fazer a antissepsia de alguns ovos extras para suprir
possíveis perdas. Por exemplo, para fazer 200 mL de base, serão necessários
400 mL de homogeneizado de ovos, que correspondem a aproximadamente
10 ovos. Acrescentando 10% do total de ovos para suprir as perdas, será feita
a antissepsia de 10 ovos.
Uma vez que poderá ser reutilizado em até 3 vezes, após a antissepsia dos
ovos, retorne todo o volume do álcool para seus frascos de origem.

7. Preparo do meio completo – com e sem PNB-TCH

Retire os ovos do álcool e coloque-os para secar sobre um tecido, papel
absorvente ou TNT (tecido não tecido de polipropileno) estéreis. Depois de
secos, os ovos são quebrados um a um e colocados num becker pequeno para
avaliar sua qualidade. A medida em que vão sendo quebrados, transfira os
ovos para um recipiente maior estéril, onde serão homogeneizados utilizando
bastões de vidro estéreis ou na batedeira, com batedores estéreis em baixa
velocidade. Filtre o material homogeneizado em funil com gaze. Misture o
filtrado do homogeneizado de ovos na base, de forma gradual, misturando
sempre até atingir uma cor homogênea.
Este é o chamado “meio completo” utilizado para isolamento e identificação
de micobacterias. Para isso, separamos a base produzida inicialmente em 3
frascos:

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Frasco Controle
Faça aliquotas de 50 mL da base em um frasco de 250 mL estéril. Acrescente
200 mL de homogeneizado de ovos filtrados e misture bem.

Frasco com PNB

Faça aliquotas de 50 mL da base em um frasco de 250 mL estéril. Acrescente
3 mL da solução ​Estoque​de PNB, homogeneize bem. Acrescente 200 mL de
homogeneizado de ovos filtrados e misture bem.

Frasco com TCH

Aliquote 50 mL da base em um frasco de 250 mL estéril. Acrescente 0,75
mL da solução de U ​ so​de TCH, homogenize bem. Acrescente 200 mL de
homogeneizado de ovos filtrados e misture bem.
Após essa separação, os meios completos estão prontos para distribuição
nos respectivos frascos.

8. Distribuição do meio
Utilizando o distribuidor automático que estará ajustado para o volume
correspondente a cada frasco, adicione o meio nos frascos esterilizados,
tomando todos os cuidados para manter a esterilidade dos meios e dos
procedimentos executados.

9. Coagulação do meio
Por fim, os frascos deverão ser incubados no sorocoagulador a 85°C por 50
minutos com a tampa aberta um quarto de volta. Um cuidado especial deve-se
ter com a temperatura, que não pode ser excessiva ou o tempo de exposição
ser prolongado, porque diminui a qualidade dos meios de cultura

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10. Referências
1. Costa, R.R. et al. Comparação entre os métodos de Ogawa-Kudoh
e Petroff modificado para o cultivo de micobactérias no diagnóstico da
tuberculose pulmonar. v. 16, n. 2, p. 1-5. São Paulo: Einstein, 2018.
2. Pedro, H.S.P. et al. Avaliação do desempenho dos meios de cultura
Ogawa-Kudoh e MGITTM para isolamento de micobactérias. BEPA, Bol.
epidemiol. paul. (Online). São Paulo, v. 8, n. 91, jul. 2011. Disponível em
http://periodicos.ses.sp.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-
42722011000700002&lng=pt&nrm=iso. Acesso em 10 ago. 2020.
3. Costa, R.R.; Silva, M.R.; Gonçalves, I.C. Diagnóstico laboratorial da
tuberculose: Revisão de literatura. Rev Med Minas Gerais 2018; 28 (Supl 5):
e-S280525.

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