UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

TAL 415 – Processos Bioquímicos Industriais

Prática 3 – Preparo de mosto e monitoramento de açúcares

1. Introdução

A fermentação pressupõe a utilização de uma base/formulado que serve como meio de

cultivo, devendo conter todos os componentes necessários ao processo fermentativo. Ele deve
possuir os macro e micronutrientes necessários ao metabolismo do micro-organismo e,
principalmente, a geração do produto de interesse. Os formulados podem ser sintéticos ou naturais.
Os sintéticos são preparados a partir de componentes químicos puros, orgânicos e inorgânicos. Para
o preparo deste tipo de base, devem ser observados, principalmente, a concentração de açúcares
totais, disponibilidade de nitrogênio e de sais minerais, disponibilidade de oxigênio gasoso, pH,
temperatura, dentre outros aspectos. Além disso, a inibição de contaminantes potenciais é essencial,
o que pode ser realizado pela adição de antimicrobianos ou por processos físicos, como filtração ou
pasteurização. Por outro lado, as bases naturais são aquelas cuja composição química não é
exatamente definida e os nutrientes são, em sua maioria, complexos. Em alguns casos, é necessário
preparação do formulado com o objetivo de disponibilizar/garantir compostos simples (menos
complexos) e mais facilmente utilizáveis pelos micro-organismos. Um exemplo deste tipo de
preparação é a mosturação utilizada na fabricação de cerveja. A preparação física dos grãos de malte
obtida pela moagem permite a disponibilização das proteínas e do amido presentes no interior dos
grãos. No entanto, apenas uma pequena parte destas substâncias é solúvel em água, o que faz
necessário uma preparação química do malte. Nesta etapa, os grãos de malte moídos são misturados
à água aquecida, em geral em torno de 65 ºC, de modo a ativar a ação de enzimas presentes nos
grãos. Estas enzimas promovem a hidrólise de substâncias complexas e insolúveis em outras
moléculas menores, mais simples e solúveis em água. Assim, as proteínas são convertidas em
peptídeos e em aminoácidos, enquanto os amidos são degradados a moléculas de glicose, maltose e
dextrinas, assimiláveis pelas leveduras que realizarão a fermentação posteriormente.
Seja na elaboração de meios naturais ou sintéticos para a elaboração de produtos
fermentados, a escolha de cada parâmetro do processo fermentativo deve considerar a composição
da matéria-prima, o produto de interesse e o micro-organismo que será utilizado no processo. Dessa
forma, pode-se avaliar sobre eventuais necessidades de correção, transformação ou suplementação
do meio antes da inoculação do fermento.

1.2. Método de quantificação de açúcares redutores

A avaliação da quantidade de açúcares no formulado e o monitoramento do consumo desses

substratos são essenciais para padronização e controle de um processo bioquímico. Açúcares
redutores apresentam em sua estrutura grupos carbonílicos ou cetônicos livres, que possuem
carbonos anoméricos capazes de reduzir cátions como cobre e prata, sendo simultaneamente
oxidados. A glicose e a frutose são dois açúcares redutores particularmente importantes para as
empresas que realizam bioprocessos, especialmente a indústria de alimentos. A sacarose, por sua
vez, contém em sua estrutura resíduos de glicose e frutose ligados entre si por ligações alfa-1,2. Isso
significa que esses açúcares comprometeram seus grupos anoméricos para a ligação, ou seja, esse
dissacarídeo não tem capacidade de promover tais reduções. A lactose é o principal carboidrato
presente no leite e é formada de monômeros de galactose e glicose unidas por ligação beta-1,4. A
lactose possui um carbono anomérico livre sendo, portanto, um açúcar redutor. A maltose é o
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principal produto da hidrólise do amido e consiste em um dímero de unidades de glicose unidas por
ligações alfa-1-4, e possui também uma extremidade redutora livre.
O método de quantificação de açúcares redutores pelo ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS) é
bastante aplicado na indústria para detecção desses carboidratos no mosto e durante todo o processo
de fermentação, até o produto final. O método se baseia na oxidação dos grupos aldeídos a grupos
carboxílicos, na presença do DNS (agente oxidante) e em meio alcalino. O DNS é reduzido a ácido
3-amino-5-nitrossalicílico, que apresenta coloração alaranjada (Figura 1). A intensidade de
coloração é medida a 540 nm e é proporcional à concentração de açúcar redutor na amostra (Figura
2).

Figura 1 – Reação de redução por DNS. Fonte: Vasconccelos et al., 2013, citado por DORNEMANN, 2016.

Figura 2 – Intensidade de coloração da reação do DNS. Fonte: MALDONADE et al., 2013, citado por DORNEMANN,
2016.

Na determinação de açúcares redutores por DNS, a elaboração simultânea de uma curva-

padrão de glicose é fundamental. Isso ocorre porque o método é sensível a pequenas alterações
metodológicas e o reagente DNS é susceptível à oxidação durante o armazenamento, causando erros
significativos.

2. Objetivos da aula prática

– Exemplificar a preparação de matéria-prima (mosto) utilizada em ambiente industrial;
– Monitorar o processo de degradação de carboidratos (processo enzimático).
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3. Materiais
– Equipamentos: balança, banho-maria, espectrofotômetro, chapa aquecedora, bico de Bunsen;
– Vidrarias e outros materiais: béquer, erlenmeyer, proveta, balão volumétrico, tubo de ensaio,
bastão de vidro, termômetro, pipeta, pipeta Pasteur, cubeta, espátula, tampão de algodão,
microtubo;
– Reagentes: água destilada, malte, glicose, solução de iodo 0,3 N, solução de DNS.

4. Metodologia
4.1. Preparo do mosto de cevada maltada
– Adicionar 40 g de malte moído a 120 mL de água destilada;
– Retirar uma amostra de 10 mL para o teste de iodo e de concentração de açúcares redutores DNS;
– Aquecer a mistura até 50 °C;
– Retirar outra amostra para o teste de iodo;
– Aumentar a temperatura para 73 ºC – temperatura de mosturação;
– Após 15 minutos, retirar uma amostra para o teste de iodo;
– Após 30 minutos, retirar uma amostra para o teste de iodo e uma amostra para a determinação da
concentração de açúcares redutores.

4.2. Teste de iodo

– Colocar em tubos de ensaio, alíquotas de 2 mL da amostra;
– Pipetar 4 gotas de iodo e verificar a coloração.

4.3. Determinação da concentração de açúcares redutores (DNS)

4.3.1. Preparo da curva padrão de glicose do método DNS
– Em um balão volumétrico (100 mL), diluir 100 mg de glucose anidra p.a. utilizando água
destilada. A glicose deve ser previamente mantida em estufa (60 ºC por 2 horas);
– A partir desta solução estoque, preparar soluções com as seguintes concentrações: 0,2; 0,4; 0,6;
0,8; 1,0; 2,0 e 3,0 mg/mL;
– Fazer a leitura em espectrofotômetro (a 540 nm) de todas as soluções preparadas;
– Plotar um gráfico de Absorvância a 540 nm x concentração de glicose e determinar a equação da
reta.

4.3.2. Dosagem de açúcares redutores

*Preparar o branco:
– Adicionar 100 µL de água destilada a 300 µL de DNS.
– Ferver durante 5 minutos e adicionar 1,6 mL de água destilada e homogeneizar;
– Fazer a leitura em espectrofotômetro a 540 nm

*Preparar e analisar a amostra:

– Em um balão volumétrico (100 mL), adicionar 1 mL da amostra; completar o volume com água
destilada;
– Transferir 100 µL da amostra diluída para um microtubo de 2 mL, acrescentar 300 µL do reagente
DNS e homogeneizar;
– Colocar em banho de água fervente durante 5 minutos e, em seguida, resfriar;
OBS.: Em caso de amostras com ácido e açúcares redutores na sua composição, é aconselhável que
o banho esteja na temperatura de 90 °C para evitar a degradação da amostra.
– Adicionar1,6 mL de água destilada no tubo e homogeneizar;
– Fazer a leitura no espectrofotômetro a 540 nm.
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5. Resultados
– Calcular a concentração em g/L por meio da fórmula da curva padrão:

Abs = a.C + b

Abs = absorbância a 540 nm; C = Concentração em g/L; a = coeficiente angular da reta; b =

coeficiente linear.

6. Referências
DORNEMANN, G. M. Comparação de métodos para determinação de açúcares redutores e não-
redutores. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Escola de Engenharia, 2016.
DOS SANTOS, A. A. et al. Dosagem de açúcares redutores com o reativo DNS em microplaca.
Brazilian Journal of Food Technology, v. 20, 2017.
GONÇALVES C. et al. Adaptation of dinitrosalicylic acid method to microtiter plates. Analytical
Methods, v. 2, p. 2046-2048, 2010.
MALDONADE et al. Protocolo para determinação de açúcares totais em hortaliças pelo método de
DNS. Embrapa Agroindústria de Alimentos, Brasília, 2013.
SUMNER J. B. Dinitrosalicylic acid: a reagent for the estimation of sugar in normal and diabetic
urine. The Journal of Biological Chemistry, v. 47, p. 5-9, 1921.
VASCONCELOS, N. M.; PINTO, G. A. S.; ARAGÃO, F. A. S. de. Determinação de Açúcares
Redutores pelo Ácido 3,5-Dinitrosalicílico: Histórico do Desenvolvimento do Método e
Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratório de Bioprocessos. Embrapa Agroindústria de
Alimentos, Fortaleza, 2013.