Nome da Disciplina: Bioquímica Experimental

Professor Responsável: Prof. Me. Kevin Felipe Ramos

HIDRÓLISE ÁCIDA E ENZIMÁTICA DE UM POLISSACARÍDEO

EMILLY SANCHEZ BARROS

LÍVIA GONZALEZ BRUNETTI
MARIA CLARA COSTA GOUVEIA

PRESIDENTE PRUDENTE
24 / 04 – 2023

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 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO 3
OBJETIVOS 5
PARTE EXPERIMENTAL 5
RESULTADOS E DISCUSSÃO 8
CONCLUSÕES 15
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 16
 1. INTRODUÇÃO

Partindo-se do princípio conceitual químico, as reações de hidrólise podem

ser definidas como todas as quais na qual a água é decomposta, ou seja, o
grupamento hidroxila (OH-) vai para um produto e o próton (H+) vai para o outro,
sendo empregado tanto em reações orgânicas quanto de proteínas e açúcares
(HIJAZIN; SIMÕES; SILVEIRA, 2010).
Embora este processo seja de grande importância para as atividades
biológicas, para que sua execução seja de fato prática e viável nos organismos vivos
é necessário a presença de catalisadores, podendo estes serem tanto de ordem
química como os ácidos e as bases, quanto de ordem biológica como as enzimas
(HIJAZIN; SIMÕES; SILVEIRA, 2010).
No caso das hidrólises ácidas são empregadas ácidos minerais como HCl e o
H2SO4, seja em sua forma concentrada ou diluída (HIJAZIN; SIMÕES; SILVEIRA,
2010). Por serem compostos químicos, as quebras das ligações constituintes tanto
da amilose quando da amilopectina acontecem de forma bem semelhante e
simultânea, podendo ser dificultada apenas pela disposição das estruturas mais
amorfas e cristalinas que as moléculas adquirem na estruturação do amido
(ROCHA, 2010).
O amido é um dos carboidratos mais importantes, sendo a forma de reserva
de glicose pelas plantas, por exemplo. A composição deste se dá pelas estruturas
da amilose, cuja principal característica é a estruturação praticamente linear com a
presença das ligações glicosídicas α(1→4), e da amilopectina a qual é formada por
uma estrutura com diversas ramificações, ou seja, possui tanto ligações α(1→4)
quanto α(1→6) (AMARAL et al., 2007).
As enzimas são proteínas estritamente específicas com a função de catalisar
reações biológicas, sendo de vital importância para um bom funcionamento dos
organismos (NELSON; COX, 2014). Assim, há algumas enzimas com a função de
hidrólise, em especial a α-amilase salivar cuja ação ocorre nas primeiras etapas da
digestão, em que ela realiza a hidrólise das grandes cadeias de carboidratos em
estruturas bem menores (MORIEL et al., 2010).
Comparativamente entre os dois processos, embora a hidrólise enzimática
seja mais cara que a por meio ácido, fazendo assim com que a última seja a mais

3
empregada industrialmente, ela apresenta algumas vantagens como cita Hijazinh,
Simões e Silveira (2010):

[...] estas vantagens seriam a especificidade, o controle do grau de hidrólise,

as condições moderadas de ação, a menor quantidade de sal no hidrolisado
obtido no final da reação e a possibilidade que as enzimas geralmente têm
de serem empregadas em concentrações muito baixas, sendo
desnecessária a sua remoção. (Hijazinh, Simões e Silveira; p. 92; 2010).

Desta forma, diversos estudos são realizados visando comparar a eficiência

de degradação destes dois tipos de processo. Para tal, uma das formas mais
empregadas é a realização do teste com o ácido 3,5-dinitro-salicílico (DNS), em que
os açúcares redutores do meio interagem com este ácido, de cor amarela, e geram o
ácido reduzido 3-amino-5-nitrosalicílico, que possui coloração laranja
(MALDONADE; CARVALHO; FERREIRA, 2013).
Como com a degradação do amido em estruturas menores origina as
denominadas dextroses, equivalentes a maltodextrina, a quantificação da presença
destas com seu caráter redutor no meio é de grande valia para processos
tecnológicos como detalha Carvalho et al. (2016):

[...] já que a quantidade de açúcares redutores modifica completamente as

propriedades do carboidrato, sendo que viscosidade, adesividade, poder de
retenção de água e poder anticristalizante são propriedades que aumentam
quanto menor for a dextrose equivalente, já a doçura, poder higroscópico,
fermentabilidade e escurecimento pelo calor são maiores quanto maior for a
dextrose equivalente. (CARVALHO et al., p.1, 2016)

Além da avaliação quantitativa, por meio de testes como do Iodo é possível a

observação visual da presença de amido devido a formação do complexo
amido-Iodo, já que o mesmo fica envolto pela estrutura do amido gerando a cor
característica observada durante os testes (LOUREIRO et al., 2019).
Assim, nesta prática o principal objetivo foi a observação da ocorrência dos
processos de hidrólise tanto ácido quanto enzimático e a quantificação das
dextroses obtidas por meio de análises espectroscópicas.

4
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
- Realizar a hidrólise ácida e enzimática de um polissacarídeo.
2.2 Objetivos específicos
- Demonstrar que o amido (polissacarídeo) pode ser hidrolisado com a
produção de açúcares redutores;
- Verificar os diferentes tipos de catálise: por ação de ácido e enzima
específica (α-amilase salivar);
- Verificar através de reações específicas o desaparecimento do amido e o
concomitante aparecimento de açúcares redutores durante o curso da
hidrólise;
- Elaborar curvas de tempo para a hidrólise ácida como para a enzimática,
através da dosagem de açúcares redutores formados.

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1 Vidrarias e equipamentos:

- tubos de ensaio;
- béquer de 50 mL;
- béquer de 250 mL;
- béquer de 500 mL;
- banho-maria;
- cubeta de vidro;
- estante de tubos de ensaio.

3.2 Reagentes:
- solução padrão de glicose 2mg/mL;
- 3,5-di-nitrosalicilato;
- solução de amido 1%;
- HCl 50% v/v;
- solução de lugol;
- saliva bucal.
5
 3.3 Curva de calibração para dosagem de açúcar redutor pelo método
3-5-dinitrosalicilato
Nesta etapa foram utilizados 6 tubos de ensaio, os quais foram numerados de
1 a 6 e em cada um deles foram adicionados às respectivas quantidades de glucose
(2 mg/mL), água destilada e o DNS como descrito no quadro abaixo:

Quadro 1 - Preparação dos tubos para a curva de calibração

Tubo Solução padrão Água destilada Reativo DNS (mL)

Glucose (2 mg/mL) (mL)

1 --- 1,5 1,0

2 0,1 mL (0,2 mg) 1,4 1,0

3 0,2 mL (0,4 mg) 1,3 1,0

4 0,4 mL (0,8 mg) 1,1 1,0

5 0,8 mL (1,6 mg) 0,7 1,0

6 1,0 mL (2,0 mg) 0,5 1,0

Fonte: Adaptado de RAMOS, K. F

Após a adição de todos os reagentes, os tubos foram homogeneizados e

levados ao banho-maria fervente por 5 minutos. Depois do tempo estipulado os
mesmo foram resfriados à temperatura ambiente e foi adicionado a cada um 7,5 mL
de água destilada, sendo todos os tubos homogeneizados para a realização da
leitura de cada uma das amostras no comprimento de 540 nm e os dados de
absorbância foram coletados para a posterior construção do gráfico da curva de
calibração.

3.4 Hidrólise ácida do amido

Para esta técnica foram preparadas duas baterias com 7 tubos de ensaio
cada.
Na bateria 1 cada um dos tubos foi identificado como: Branco, T0, T5, T10,
T20, T40, T50, sendo que em cada tubo foram adicionadas 3 gotas de lugol
juntamente com 10 mL de água destilada.
Na bateria 2 os tubos foram numerados segundo o padrão da bateria 1,
porém nestes foi adicionado 1,3 mL de água destilada e 1,0 mL do reativo de DNS.
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Com as baterias prontas foi colocado 5 mL da solução de amido em um tubo de
ensaio e levado ao banho-maria por 5 minutos para homogeneizar a temperatura.
Após o tempo indicado o tubo com a solução de amido foi retirado do
banho-maria e a ele foram adicionados 0,2 mL de ácido clorídrico, sendo que logo
depois desta adição o sistema foi homogeneizado e rapidamente foram retirados
duas alíquotas de 0,2 mL desta solução para serem adicionadas aos tubos T0 de
ambas as baterias.
Desta forma, o tubo com a solução de amido e ácido clorídrico foi colocada
novamente no banho-maria (juntamente com a pipeta) permanecendo lá durante
toda a prática. Com o auxílio de um cronômetro novas alíquotas de 0,2 mL desta
solução foram retiradas nos tempos de 5, 10, 20, 40 e 50 minutos e adicionadas aos
seus respectivos tubos tanto da bateria 1 quanto da 2.
Depois de todas as adições, os tubos da segunda bateria foram aquecidos
em banho-maria fervente por 5 minutos. Após resfriá-los, adicionou-se 7,5 mL de
água destilada a cada tubo, homogeneizou e foi levado ao espectrofotômetro para
ler a absorbância em 540 nm.

3.5 Hidrólise enzimática do amido

Devido a divisão feita no início da aula o presente grupo ficou responsável
apenas pelas hidrólise ácida, não realizando então este processo.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O amido é um polissacarídeo formado por outros dois homopolissacarídeos, a
amilose e a amilopectina. O amido é um carboidrato complexo, tendo funções de
armazenamento e uma importante fonte de energia.(MELLO, V. D.; FURUYA, W. M.;
MARCONCINI, J. M, 2017).
A degradação do amido pode ocorrer por processos de hidrólise enzimática
ou a partir da hidrólise enzimática, formando assim, açúcares fermentáveis, nesse
processo, o amido é tratado com um ácido forte, controlando a temperatura e o
tempo de incubação, quebrando as ligações glicosídicas α-1,4, formando dextrinas
(polissacarídeos de cadeia curta) e para segunda etapa há a quebra das ligações
α-1,6, produzindo açúcares menores ( ZHANG, Y.; CHEN, X.; WEI, D, 2018).

7
 4.1 Curva de calibração para dosagem de açúcar redutor pelo método
3,5-dinitrosalicílico (DNS)
Nesta prática, o experimento realizado ação da hidrólise realizada a partir do
tratamento do amido, utilizando o ácido clorídrico (HCL), a ação foi avaliada a partir
da quantidade e açúcares redutores após a hidrólise, quantificando a partir da
utilização do DNS, uma solução que reduz na presença dos açúcares de ácido 3,5-
dinitrosalicílico para ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, que possui grande interação com
a luz, possibilitando a quantificação dos açúcares totais por espectrofotometria
(VASCONCELOS; PINTO; ARAGÃO, 2013).
Para realização da prática, foi realizada uma curva de calibração a fim de
comparação de formação da glucose a partir da hidrólise ácida, com a reação do
DNS.
Figura 1: Soluções de padronização de DNS ( menor concentração
para a maior da concentração da esquerda para direita)

Fonte: autoria própria

Os seis tubos de ensaio contendo solução padrão de glucose e o reativo

DNS, foram levados a aquecimento por meio de banho maria durante 5 minutos,
para que ocorra o favorecimento da redução do açúcar. A fim da deterioração das
amostras, o reativo é adicionado e submetido ao aquecimento para evitar perdas de
açúcares em solução. Todas as amostras foram submetidas a análise de
espectrofotometria usando o comprimento de onda de 540 nm no filtro verde, já que
o ácido 3-amino-5-nitrosalicílico segundo Santos, A. A. et al. (2017) é “um composto
corado cuja absorção máxima de luz se dá a 540 nm”.

8
 Os dados recolhidos foram utilizados para a plotagem de uma representação
gráfica representada na Figura 2.

Figura 2: Representação gráfica da curva de calibração para dosagem de

açúcares redutor pelo método 3-5-dinitrosalicilato

Fonte: Autoria própria

A partir da leitura do gráfico plotado, pode se observar uma linearidade de

0,99797, indicando uma confiabilidade nos valores e uma uma relação com a lei de
Lambert-Beer, existindo uma correlação entre o aumento da glucose com o aumento
da absorbância observada. (FERRIER, Denise R).

4.2 Hidrólise ácida do amido

Para a realização dos experimento, um tubo de ensaio contendo 5 mL de
amido foi levado a banho maria 100 Cº a fim de homogeneizar a temperatura do
carboidrato a temperatura que a reação irá ocorrer, por tanto a pipeta utilizada para
retirar as alíquotas de 0,2mL para os testes, permanecerá dentro do tubo a fim de
permanecer aquecida.

9
 4.2.1 Teste do iodo
A primeira sequência de bateria preparada continha lugol e água
destilada a fim de homogeneizar a solução. Os tubos recebem alíquotas de 0,2 mL
de amido conforme o tempo de incubação para os tempos 0,5,10,20,40 e 50
minutos.
Como citado anteriormente o aquecimento do HCl em solução com amido,
quebra o mesmo em dextrinas e olissagaríeos de forma mais rápida e eficiente,
portanto é possível realizar um teste colorimétrico a partir da formação de um
complexo colorido, o lugol é um reativo utilizado como um dos testes de identificação
da presença de amido em solução.
Por conta da estrutura linear das dextrinas formadas da hidrólise ácida, a
coloração que a solução irá se apresentar de forma intensa, como um vermelho ou
até mesmo azul, com o passar do tempo e da degradação da molécula para
formação de açúcares redutores, a dextrina vai perdendo essa característica
apresentando uma coloração alaranjada até um marrom intenso para cada
concentração adicionada de açúcar. Isso se deve ao fato de que a grande
quantidade de ramificações presente dificulta a formação da conformação em hélice
gerando assim uma estrutura menos rígida para o “aprisionamento” do iodo,
ocasionando uma cor acastanhada como observado na Figura 3 (LOUREIRO et al.,
2019).
Como pode ser observado na figura, os tubos 2,3,4 e 5 da esquerda para
direito possuem uma coloração intensa de marrom avermelhado, evidenciando a má
degradação do amido, porém o último tubo, de maior tempo de incubação e resultou
em uma degradação quase total do amido.
Figura 3: Teste de coloração para identificação da presença de amido a partir
do lugol

Fonte: Autoria própria

10
 4.2.2 Dosagem para açúcares redutores
Para o teste, foi preparado uma bateria de sete tubos de ensaio contendo 1
mL do reativo DNS e 1,3 mL de água destilada a fim de homogeneizar, foi retirada
em tempos de 0,5,10,20,40 e 50 minutos uma alíquota de amido que estava em
aquecimento para a realização da dosagem a partir do espectrofotômetro, os dados
de absorbância foram coletados e utilizados para plotagem do gráfico a seguir.

Figura 4: Representação gráfica da curva entre os valores de tempo de

incubação e absorbâncias analisadas da hidrólise ácida.

Fonte: Autoria própria

A partir do gráfico plotado, temos os valores de de “a” e “b” para a equação da

reta representada a seguir na Figura 5. Respectivamente os pontos utilizados são o
intercept = 0,06075 e o slope = 0,5089.
Figura 5: Equação da reta

Fonte: Autoria própria

11
 Com os dados obtidos podemos encontrar as concentrações de do açúcar
redutor encontrado nas amostras, utilizando também os valores de “a” e “b” do
gráfico demonstrado na Figura 2.

Tabela 1 - Dados da leitura da absorbância do açúcar redutor

Tubos Absorbância
(nm)
2 0,081
3 0,134
4 0,147
5 0,209
6 0,245
7 0,324
Fonte:autoria própria

Para os cálculos do segundo tubo:

Realizando este mesmo procedimento para todos os outros tubos, lembrando

que o primeiro foi utilizado como branco, temos os seguintes valores de
concentração para o açúcar redutor em solução.

Tabela 1: Concentração de glucose em cada tubo de ensaio

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

0,040 mg/ml 0,144 mg/ml 0,167 mg/ml 0,3 mg/ml 0,362 mg/ml 0,517 mg/ml
Fonte: Autoria própria

Pode-se observar que não houve um padrão de aumento de concentração de

açúcar formado, já que há um pulo muito grande entre o tubo 3 e o tubo 4, isso pode

12
ser devido a um erro experimental ao preparar a solução que seria utilizada como
branco ou ao retirar os 0,2 mL de alíquota de açúcar que deveria ocorrer de forma
rápida para retornar ao banho maria.
Com os valores de concentração encontrados, um gráfico em relação ao
tempo de incubação com a concentração encontrada.

Figura 6 : Representação gráfica entre os valores de tempo de incubação e

concentração de açúcar redutor

Fonte: Autoria própria

Com o gráfico é possível observar que a hidrólise foi eficaz, porém com a
hidrólise total do amido não fica evidente, mas, é visível a correlação entre o tempo
de incubação e a consumição do amido, já que conforme o aumento do tempo, mais
açúcar redutor foi sendo formado.

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 5. CONCLUSÕES

Ao final dessa prática então podemos concluir que é possível observar a

formação da glucose, um açúcar redutor, a partir da hidrólise ácida com a reação do
DNS que age como agente oxidante, favorecendo a oxidação dos grupos aldeídos e
cetona presente no açúcar e isso pode ser graficamente representado através da
curva de calibração.

Para a realização do experimento de hidrólise ácida do amido, o teste de iodo

foi realizado para identificar a presença do amido. A coloração intensa de marrom
avermelhado, evidenciando a má degradação do amido, porém quando possui um
maior tempo de incubação e resulta em uma coloração mais clara que representa
uma degradação quase total do amido.

Em suma, os objetivos foram atingidos ao final da prática podendo observar

que os polissacarídeos podem ser hidrolisados e que também é possível elaborar
curvas de tempo para a hidrólise ácida através da dosagem de açúcares redutores
formados. Nesse experimento também foi possível perceber que a catálise ácida
não é a única, possui a catálise enzimática também, apesar de não ter realizado
essa parte é um experimento importante conhecê-la.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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15
HIJAZIN, C. A. H.; SIMÕES, A. T.; SILVEIRA, D. R. Hidrólise ácida, alcalina e
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